Antibody, antigen-binding fragment and medical use thereof

Abstract

Provided are an antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to claudin family protein, and a pharmaceutical use thereof. The antibodies or antigen-binding fragment thereof have high specificity and affinity to claudin family protein. In addition, provided are a preparation method and application of the antibodies.

Description

ANTIBODY, ANTIGEN-BINDING FRAGMENT AND MEDICAL USE THEREOFFIELD OF THE INVENTION

[0001] The present invention relates to the field of therapeutic monoclonal antibodies, in particular antibodies specific to claudin-6, and to use thereof in the treatment of diseases.BACKGROUND ART

[0002] Claudin-6 (CLDN6) is a type 2 membrane protein containing 220 amino acids. It belongs to Claudin family, which has 27 distinct proteins characterized by 4 transmembrane domains and 2 extracellular loops. Various claudin (CLDN) family members are located at tight junctions between epithelial cells. Recently, Claudin-6 has also been implicated in some critical intracellular signaling pathways and promoting tumor progression in cancers. Claudin-6 is expressed at elevated levels in multiple human cancers including ovarian and endometrial malignancies, with little or no detectable expression in normal adult tissue. In both ovarian and endometrial cancer patients, high level of Claudin-6 expression in malignant tissue is an independent prognostic marker for poorer progression-free and overall survival. The composite data demonstrating high cancer versus normal tissue expression in adults makes Claudin-6 an attractive target for the development of therapeutics against cancer.

[0003] Anti-CLDN6 antibodies have been described in WO2022096700A1, WO2021006328A1, WO2020168059A1, WO2023285560A1. There are several bispecific antibodies and antibody-drug conjugates targeting CLDN6 moved into clinical trials, such as AMG-794, SAIL66, TORL-1-23, and DS9606a.

[0004] There is a high degree of homology between CLDN6 and its family members, such as CLDN9, CLDN4 and CLDN3. It is challenging to develop CLDN6-specific antibodies. Due to the low number of available CLDN6-specific monoclonal antibodies, there is a need in the art for better anti-CLDN6 antibodies that have efficient internalization or other functional properties not possessed by the known antibody. There is also a need for additional diagnostic tools for detecting CLDN6 expressions in CLDN6-related disease conditions. The instant invention is directed to addressing these and other needs.SUMMARY OF THE INVENTION

[0005] An object of the present invention is to provide a novel antibody or an antigen-binding fragment of the antibody (hereinafter, also referred to as an antibody, etc. ) which binds to claudin-6, a molecule comprising the antibody, and a pharmaceutical composition having cytotoxic activity, etc. which includes the antibody, etc. or the molecule as an active ingredient.

[0006] The present inventors have conducted extensive research to achieve this object and have realized the present invention by developing a novel anti-claudin-6 antibody and a molecule comprising this antibody.

[0007] In one aspect, the present invention provides an antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to CLDN6, wherein, the antibody comprises:

[0008] a heavy chain variable region comprising a HCDR1, HCDR2 and HCDR3 of the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 12, 14, 15 or 16, and,

[0009] a light chain variable region comprising a LCDR1, LCDR2 and LCDR3 of the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 13;

[0010] The CDRs are defined according to the numbering system of Kabat, IMGT, Chothia, AbM or Contact.

[0011] In some embodiment, the antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to CLDN6, comprising a heavy chain variable region comprising HCDR1, HCDR2 and HCDR3 and a light chain variable region comprising LCDR1, LCDR2 and LCDR3, wherein:

[0012] (a) a heavy chain variable region comprising a HCDR1, HCDR2 and HCDR3 of the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 12, and,

[0013] a light chain variable region comprising a LCDR1, LCDR2 and LCDR3 of the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 13;

[0014] (b) a heavy chain variable region comprising a HCDR1, HCDR2 and HCDR3 of the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 14, and,

[0015] a light chain variable region comprising a LCDR1, LCDR2 and LCDR3 of the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 13;

[0016] (c) a heavy chain variable region comprising a HCDR1, HCDR2 and HCDR3 of the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 15, and,

[0017] a light chain variable region comprising a LCDR1, LCDR2 and LCDR3 of the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 13; or

[0018] (d) a heavy chain variable region comprising a HCDR1, HCDR2 and HCDR3 of the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 16, and,

[0019] a light chain variable region comprising a LCDR1, LCDR2 and LCDR3 of the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 13;

[0020] In one aspect, the present invention provides novel antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to CLDN6, comprising: a heavy chain variable region comprising HCDR1, HCDR2 and HCDR3 regions and a light chain variable region comprising LCDR1, LCDR2 and LCDR3 regions, wherein: a) HCDR1 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 01 or SEQ ID NO: 07; b) HCDR2 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 02, SEQ ID NO: 08 or SEQ ID NO: 11; c) HCDR3 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 03, SEQ ID NO: 09 or SEQ ID NO: 10; d) LCDR1 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 04; e) LCDR2 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 05; f) LCDR3 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 06.

[0021] In some embodiment, the heavy chain variable region sequence comprises HCDR1 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 01, HCDR2 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 02, and HCDR3 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 03, respectively; or  HCDR1 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 07, HCDR2 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 08, and HCDR3 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 09 respectively; or HCDR1 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 07, HCDR2 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 08, and HCDR3 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 10 respectively; or HCDR1 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 01, HCDR2 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 11, and HCDR3 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 03 respectively.

[0022] In some embodiment, the light chain variable region sequence comprises LCDR1 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 04, LCDR2 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 05, and LCDR3 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 06, respectively.

[0023] In some embodiment, the antibody or antigen-binding fragment thereof comprising: a) a heavy chain variable region sequence comprises HCDR1, HCDR2 and HCDR3 as shown in SEQ ID NO: 01, SEQ ID NO: 02 and SEQ ID NO: 03, respectively; and a light chain variable region sequence comprises LCDR1, LCDR2 and LCDR3 as shown in SEQ ID NO: 04, SEQ ID NO: 05 and SEQ ID NO: 06, respectively; or b) a heavy chain variable region sequence comprises HCDR1, HCDR2 and HCDR3 as shown in SEQ ID NO: 07, SEQ ID NO: 08 and SEQ ID NO: 09, respectively; and a light chain variable region sequence comprises LCDR1, LCDR2 and LCDR3 as shown in SEQ ID NO: 04, SEQ ID NO: 05 and SEQ ID NO: 06, respectively; or c) a heavy chain variable region sequence comprises HCDR1, HCDR2 and HCDR3 as shown in SEQ ID NO: 07, SEQ ID NO: 08 and SEQ ID NO: 10, respectively; and a light chain variable region sequence comprises LCDR1, LCDR2 and LCDR3 as shown in SEQ ID NO: 04, SEQ ID NO: 05 and SEQ ID NO: 06, respectively; or d) a heavy chain variable region sequence comprises HCDR1, HCDR2 and HCDR3 as shown in SEQ ID NO:01, SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 03, respectively; and a light chain variable region sequence comprises LCDR1, LCDR2 and LCDR3 as shown in SEQ ID NO: 04, SEQ ID NO: 05 and SEQ ID NO: 06, respectively.

[0024] In some embodiment, the antibody or antigen-binding fragment thereof is selected from murine antibody, chimeric antibody, humanized antibody, human antibody or the antigen-binding fragment thereof.

[0025] In some embodiment, the antibody or antigen-binding fragment thereof comprising: a heavy chain variable region comprising an amino acid sequence selected from: SEQ ID NOs: 12, 14-16, or sequence having at least 80%, 85%, 90%, 95%or 99%sequence identity therewith; and / or a light chain variable region comprising an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 13, or sequence having at least 80%, 85%, 90%, 95%or 99%sequence identity therewith.

[0026] In some embodiment, the antibody or antigen-binding fragment thereof comprising: a) the heavy chain variable region as shown in SEQ ID NO: 12, or having at least 80%, 85%, 90%, 95%or 99%sequence identity therewith; and / or the light chain variable region as shown in SEQ ID NO: 13, or having at least 80%, 85%, 90%, 95%or 99%sequence identity therewith; or b) the heavy chain variable region as shown in SEQ ID NO: 14, or having at least 80%, 85%, 90%, 95%or 99%sequence identity therewith; and / or the light chain variable region as shown in SEQ ID NO: 13, or having at least 80%, 85%, 90%, 95%or 99%sequence identity therewith; or c) the heavy chain variable region as shown in SEQ ID NO: 15, or having at least 80%, 85%, 90%, 95%or 99%sequence identity therewith; and / or the light chain variable region as shown in SEQ ID NO: 13, or having at least 80%, 85%, 90%, 95%or 99%sequence identity therewith; or d) the heavy chain variable region as shown in SEQ ID NO: 16, or having at least 80%, 85%, 90%, 95%or 99%sequence identity therewith; and / or the light chain variable region as shown in SEQ ID NO: 13, or having at least 80%, 85%, 90%, 95%or 99%sequence identity therewith.

[0027] In some embodiment, the antibody or antigen-binding fragment thereof comprising: a) the heavy chain variable region as shown in SEQ ID NO: 12, and / or the light chain variable region as shown in SEQ ID NO: 13;or b) the heavy chain variable region as shown in SEQ ID NO: 14, and / or the light chain variable region as shown in SEQ ID NO: 13; or c) the heavy chain variable region as shown in SEQ ID NO: 15, and / or the light chain variable region as shown in SEQ ID NO: 13; or d) the heavy chain variable region as shown in SEQ ID NO: 16, and / or the light chain variable region as shown in SEQ ID NO: 13.

[0028] In some embodiment, the antibody or antigen-binding fragment thereof comprising: a) the heavy chain variable region as shown in SEQ ID NO: 12, and the light chain variable region as shown in SEQ ID NO: 13; or b) the heavy chain variable region as shown in SEQ ID NO: 14, and the light chain variable region as shown in SEQ ID NO: 13; or c) the heavy chain variable region as shown in SEQ ID NO: 15, and the light chain variable region as shown in SEQ ID NO: 13; or d) the heavy chain variable region as shown in SEQ ID NO: 16, and the light chain variable region as shown in SEQ ID NO: 13.

[0029] In some embodiment, the antibody further comprising human antibody constant regions; preferably, the heavy chain constant region of the human antibody constant regions is selected from constant regions of human IgG1, IgG2, IgG3 and IgG4 and conventional variants thereof, and the light chain constant region of the human antibody constant regions is selected from κ and λ chain constant regions of human antibody and conventional variants thereof; more preferably, the antibody comprises the heavy chain constant region of SEQ ID NO: 17 and a human light chain constant region of SEQ ID NO: 18.

[0030] In some embodiment, the antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to CLDN6 comprising: a) a heavy chain having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 19 and a light chain having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 20; or b) a heavy chain having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 21 and a light chain having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO:20; or c) a heavy chain having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 22 and a light chain having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 20; or d) a heavy chain having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 23 and a light chain having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO:20.

[0031] In some embodiment, the antigen-binding fragment is selected from the group consisting of Fab, Fab', F(ab') 2, variable fragment (Fv) , single chain variable fragment (scFv) , sdAb, sdFv dimerized domain V (diabody) , disulfide stabilized Fv (dsFv) and CDR-containing peptides.

[0032] The present invention also provides a multispecific antibody comprising the abovementioned antibody or the antigen-binding fragment thereof, preferably, the multispecific antibody is a bispecific antibody, trispecific antibody or tetraspecific antibody.

[0033] The present invention also provides an immunoconjugate comprising the abovementioned antibody or the antigen-binding fragment thereof, wherein the antibody or the antigen-binding fragment thereof is conjugated with one or more therapeutic agents; preferably, the therapeutic agent is a cytotoxic agent.

[0034] The present invention also provides a chimeric antigen receptor comprising: (a) the abovementioned antigen-binding site of the antibody or antigen-binding fragment or the abovementioned multispecific antibody; (b) a transmembrane domain; and (c) an intracellular signaling domain.

[0035] The present invention also provides an isolated nucleic acid molecule encoding the abovementioned antibody or the antigen-binding fragment thereof or the abovementioned multispecific antibody.

[0036] The present invention also provides an expression vector comprising the above mentioned isolated nucleic acid molecule.

[0037] The present invention also provides a host cell comprising the above-mentioned nucleic acid molecule, or the vector, wherein the host cell is selected from the group consisting of a prokaryotic cell and a eukaryotic cell, preferably a eukaryotic cell, more preferably a mammalian cell.

[0038] The present invention also provides a pharmaceutical composition, which comprises the above-mentioned antibody or antigen-binding fragment, or multispecific antibody, and one or more pharmaceutically acceptable carriers, diluents, or excipients.

[0039] The present invention also provides a therapeutic conjugate comprising the above-mentioned antibody or the antigen-binding fragment thereof or the above-mentioned multispecific antibody, wherein the antibody or the antigen-binding fragment thereof or the multispecific antibody is conjugated with one or more therapeutic agents; preferably, the therapeutic agent is a cytotoxic agent.

[0040] The present invention also provides a diagnostic conjugate comprising the above-mentioned antibody or the antigen-binding fragment thereof or the above-mentioned multispecific antibody, wherein the antibody or the antigen-binding fragment thereof or the  multispecific antibody is conjugated with one or more diagnostic agents; preferably, the diagnostic agent is selected from the group consisting of a detectable label, enzyme or metal containing substance, fluorescent substance, luminescent substance, colored substance.

[0041] The present invention also provides a method for immunologically detecting or measuring CLDN6, wherein the method comprises detecting or measuring the CLDN6 by contacting with the above-mentioned antibody or antigen-binding fragment thereof or multispecific antibody.

[0042] The present invention also provides a method for diagnosing a disease related to a human CLDN6 positive cell, wherein the method comprises detecting or measuring the CLDN6 positive cell by contacting with the above-mentioned antibody or antigen-binding fragment thereof, multispecific antibody or the diagnostic conjugate.

[0043] The present invention also provides a method of treatment or prevention of a CLDN6-expressing cancer, comprising a step of administering a therapeutically effective amount of the above-mentioned antibody or antigen-binding fragment, or the multipecific antibody, or the pharmaceutical composition, or the chimeric antigen receptor, to a subject in need of treatment or prevention of the CLDN6-expressing cancer.

[0044] In some embodiment, the CLDN6-expressing cancer is selected from the group consisting of ovarian cancer, lung cancer, gastric cancer, breast cancer, hepatic cancer, pancreatic cancer, skin cancer, malignant melanoma, head and neck cancer, sarcoma, bile duct cancer, cancer of the urinary bladder, kidney cancer, colon cancer, small bowel cancer, testicular embryonal carcinoma, placental choriocarcinoma, cervical cancer, testicular cancer, uterine cancer, a germ cell tumor disease, and the metastatic forms thereof.

[0045] Advantages of the present invention:

[0046] Compared with the prior art, the present invention has the following advantageous Effects:

[0047] (1) The antibody of the invention can specifically recognize / bind claudin-6 with high affinity (single digit nM) and specificity.

[0048] (2) The antibody of the invention can be efficiently internalized via claudin-6 mediated endocytosis.

[0049] (3) Some of the antibodies of the invention are fully human antibodies, and thus can be safely administered to a subject without triggering an immunogenic response. Therefore, the antibody of the invention is of great clinical value.

[0050] BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES

[0051] Figure 1. In vitro binding characterization of recombinant anti-claudin-6 antibodies to Claudin-6-CHO (A), Claudin-9-CHO (B) , Claudin-4-CHO (C) , Claudin-3-CHO (D) , PA-1 (E) and CHO K1 (F) cells.

[0052] Figure 2. Dose-response curves of recombinant anti-claudin-6 antibodies internalization in PA-1 cells by indirect-killing assay.DETAILED DESCRIPTION

[0053] In the present invention, unless otherwise defined, the scientific and technical terms used herein have the meanings generally understood by those skilled in the art. In addition, the laboratory operations of cell culture, molecular genetics, nucleic acid chemistry and immunology used herein are the routine procedures widely used in the corresponding fields. Meanwhile, in order to better understand the present invention, the definitions and explanations of the relevant terms are provided below.

[0054] DEFINITIONS OF TERMS

[0055] Before the present invention is detailed below, it is to be understood that the present invention is not limited to the particular methodologies, protocols and reagents described herein, as those may vary. It is also to be understood that the terminology used herein is for the purpose of describing the particular embodiments only, and is not intended to limit the scope of the invention, which will be limited only by the appended claims. Unless defined otherwise, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which the invention pertains.

[0056] For interpretation of the specification, the following definitions will be applied and wherever appropriate, terms used in the singular may also include the plural and vice versa. It is to be understood that the terminology used herein is for the purpose of describing specific embodiments only and is not intended to be limiting.

[0057] The term "claudin-6" and "claudin-6 antigen" are used interchangeably herein, and include any variants, isoforms and species homologs of human claudin-6 which are naturally expressed by cells or are expressed on cells transfected with the human claudin-6 gene.

[0058] The term "antibody" as referred to herein includes whole antibodies and any antigen binding fragment (i. e., "antigen-binding portion") or single chain thereof.

[0059] An "antibody" refers to a glycoprotein comprising at least two heavy (H) chains and two light (L) chains inter-connected by disulfide bonds, or an antigen binding portion thereof. Each heavy chain is comprised of a heavy chain variable region (abbreviated herein as VH) and a heavy chain constant region. Each light chain is comprised of a light chain variable region (abbreviated herein as VL) and a light chain constant region. The VH and VL regions can be further subdivided into regions of hypervariability, termed complementarity determining regions (CDR) , interspersed with regions that are more conserved, termed framework regions (FR) . Each VH and VL is composed of three CDRs and four FRs, arranged from amino-terminus to carboxy-terminus in the following order: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. The variable regions of the heavy and light chains contain a binding domain that interacts with an antigen. The constant regions of the antibodies may mediate the binding of the immunoglobulin to host tissues or factors, including various cells of the immune system (e.g., effector cells) and the first component (Clq) of the classical complement system.

[0060] The term "antigen-binding fragment" of an antibody, as used herein, refers to one or more fragments of an antibody that retain the ability to specifically bind to an antigen (e.g., CD3) . It has been shown that the antigen-binding function of an antibody can be performed by fragments of a full-length antibody. Examples of binding fragments encompassed within the term" antigen-binding fragment " of an antibody include (i) a Fab fragment, a monovalent fragment consisting of the VL, VH, CL and CHI domains; (ii) a F (ab') 2 fragment, a bivalent fragment comprising two Fab fragments linked by a disulfide bridge at the hinge region; (iii) a Fd fragment consisting of the VH and CHI domains; (iv) a Fv fragment consisting of the VL and VH domains of a single arm of an antibody, (v) a dAb fragment (Ward et al., (1989) Nature 341: 544-546) , which consists of a VH domain; (vi) an isolated complementarity determining region (CDR) , and (vii) a combination of two or more isolated CDRs which may optionally be joined by a synthetic linker. Furthermore, although the two domains of the Fv fragment, VL and VH, are coded for by separate genes, they can be joined, using recombinant methods, by a synthetic linker that enables them to be made as a single protein chain in which the VL and VH regions pair to form monovalent molecules (known as single chain Fv (scFv) ; see e.g., Bird et al. (1988) Science 242 : 423-426 ; and Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci.  85 : 5879-5883) . Such single chain antibodies are also intended to be encompassed within the term"antigen-binding portion"of an antibody.

[0061] The term "human antibody", as used herein, is intended to include antibodies having variable and constant regions derived from human germline immunoglobulin sequences. The human antibodies of the invention may include amino acid residues not encoded by human germline immunoglobulin sequences (e.g., mutations introduced by random or site-specific mutagenesis in vitro or by somatic mutation in vivo) . However, the term"human antibody", as used herein, is not intended to include antibodies in which CDR sequences derived from the germline of another mammalian species, such as a mouse, have been grafted onto human framework sequences.

[0062] The term "recombinant human antibody", as used herein, includes all human antibodies that are prepared, expressed, created or isolated by recombinant means, such as (a) antibodies isolated from an animal (e.g., a mouse) that is transgenic or transchromosomal for human immunoglobulin genes or a hybridoma prepared therefrom (described further in Section I, below) , (b) antibodies isolated from a host cell transformed to express the antibody, e.g., from a transfectoma, (c) antibodies isolated from a recombinant, combinatorial human antibody library, and (d) antibodies prepared, expressed, created or isolated by any other means that involve splicing of human immunoglobulin gene sequences to other DNA sequences. Such recombinant human antibodies have variable and constant regions derived from human germline immunoglobulin sequences. In certain embodiments, however, such recombinant human antibodies can be subjected to in vitro mutagenesis (or, when an animal transgenic for human Ig sequences is used, in vivo somatic mutagenesis) and thus the amino acid sequences of the VH and VL regions of the recombinant antibodies are sequences that, while derived from and related to human germline VH and VL sequences, may not naturally exist within the human antibody germline repertoire in vivo.

[0063] The term "CDR" refers to one of the six hypervariable regions within the variable domain of an antibody that primarily contributes to antigen binding. One of the most commonly used definitions for the six CDRs is provided by Kabat E. A. et al. (1991) Sequences of proteins of immunological interest. NIH Publication 91-3242. As used herein, the Kabat definition of CDR only applies to CDR1, CDR2 and CDR3 of the light chain variable domain (LCDR1, LCDR2, LCDR3 or L1, L2, L3) , as well as CDR1, CDR2 and CDR3 of heavy chain variable domain (HCDR1, HCDR2, HCDR3 or H1, H2, H3) . Also, CDRs can be defined according to other various numbering systems known in the art, for example, Chothia numbering system (Chothia &Lesk (1987) J.Mol. Biol. 196: 901-917; Chothia et al. (1989) Nature 342: 878-883) , IMGT numbering system (Lefranc et al., Dev. Comparat. Immunol. 27: 55-77, 2003) , or the definition of Martin's related research (Martin ACR, Cheetham JC, Rees AR (1989) Modelling antibody hypervariable loops: A combined algorithm. Proc Natl Acad Sci USA 86: 9268-9272) , the correspondence between different numbering systems is well known to those skilled in the art (for example, refer to Lefranc et al., Dev. Comparat. Immunol. 27: 55-77, 2003) . Those skilled in the art can easily identify the CDRs defined by each numbering system.

[0064] Methods and techniques for identifying CDRs within HCVR and LCVR amino acid sequences are well known in the art and can be used to identify CDRs within the specified HCVR and / or LCVR amino acid sequences disclosed herein. Exemplary conventions that can be used to identify the boundaries of CDRs including, e.g., Chothia based on the three-dimensional structure of antibodies and the topology of the CDR loops (Chothia et al. (1989) Nature 342: 877-883) , Kabat based on antibody sequence variability (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th edition, US Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987) ) , AbM (University of Bath) , Contact (University College London) , International ImMunoGeneTics database (IMGT) (imgt. cines. fr / on the World Wide Web) , and North CDR definition based on the affinity propagation clustering using a large number of crystal structures. Those skilled in the art can easily identify the CDRs defined by each numbering system.

[0065] A useful comparison of CDR numbering is as below:

[0066] Note 1: some of these definitions (particularly for Chothia loops) vary depending on the individual publication examined; Note2: any of the numbering schemes can be used for these CDR defintions, except the contact definition uses the Chothia or Martin (enhanced Chothia) definition; Note 3: the end of the Chothia HCDR1 loop when numbered using the Kabat numbering convention varies between H32 and H34 depending on the length of the loop. This is because the Kabat numbering scheme places the insertions at H35A and H35B.

[0067] The term "Conservative modification" or "conservative replacement or substitution" refers to substitutions of amino acids in a protein with other amino acid having similar characteristics (e.g., charge, side chain size, hydrophobicity / hydrophilicity, backbone conformation and rigidity, etc. ) , such that the changes can be frequently made without altering the biological activity of the protein. It will be appreciated by those skilled in the art that, in general, a single amino acid substitution in a non-essential region of polypeptide does not substantially alter biological activity (see, for example, Watson et al. (1987) Molecular Biology of the Gene, The Benjamin / Cummings Pub. Co., Page 224, (4th edition) ) . In addition, substitutions with structurally or functionally similar amino acids are unlikely to disrupt biological activity.

[0068] In some embodiments, an anti-claudin-6 antibody or fragment thereof of the invention encompasses an antibody or fragment thereof having a post-translational modification on a light chain variable region, a heavy chain variable region, a light chain or a heavy chain.

[0069] In certain embodiments, an antibody provided herein is altered to increase or decrease the extent to which the antibody is glycosylated. Addition or deletion of glycosylation sites to an antibody may be conveniently accomplished by altering the amino acid sequence such that one or more glycosylation sites is created or removed. In some applications, modifications that remove unwanted glycosylation sites may be useful, for example, modifications that remove fucose modules so as to enhance the antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC) function (see Shield et al. (2002) JBC 277: 26733) . In other applications, galactosylation modification may be performed to modify complement-dependent cytotoxicity (CDC) .

[0070] In certain embodiments, one or more amino acid modifications may be introduced into the Fc region of an antibody provided herein, thereby generating an Fc region variant, so as to enhance the efficiency of the antibody, for example, in the treatment of cancer or cell proliferation disease. The Fc region variant may comprise human Fc region sequence (e.g., human IgG1, IgG2, IgG3 or IgG4 Fc region) comprising an amino acid modification (e. g. a substitution) at one or more amino acid positions.

[0071] The term "nucleic acid molecule"as used herein refers to a DNA molecule and a RNA molecule. The nucleic acid molecule may be single stranded or double stranded but is preferably a double stranded DNA. A nucleic acid is “effectively linked” when it is placed into functional relationship with another nucleic acid sequence. For example, if a promoter or enhancer affects transcription of a coding sequence, the promoter or enhancer is effectively linked to the coding sequence.

[0072] The preparation method of the nucleic acid is a conventional preparation method in the art. Preferably, it comprises the following steps: obtaining the nucleic acid molecule encoding the above-mentioned protein by gene cloning technology, or obtaining the nucleic acid molecule encoding the above-mentioned protein by the method of artificial full-length sequence synthesis.

[0073] Those skilled in the art know that the base sequence encoding the amino acid sequence of the protein can be replaced, deleted, changed, inserted or added appropriately to provide a polynucleotide homolog. The homolog of the polynucleotide of the present invention can be prepared by replacing, deleting or adding one or more bases of the gene encoding the protein sequence within the scope of maintaining the activity of the antibody.

[0074] The term "vector" refers to a nucleic acid molecule capable of transporting another nucleic acid to that it has been linked. In one embodiment, the vector is a “plasmid” that refers to a circular double stranded DNA loop into which additional DNA segment can be ligated. In another embodiment, the vector is a viral vector, wherein an additional DNA segment can be ligated into viral genome. The vectors disclosed herein are capable of self-replicating in a host cell into which they have been introduced (for example, a bacterial vector having a bacterial replication origin and a episomal mammalian vector) or can be integrated into the genome of a host cell upon introduction into host cell, thereby is replicated along with the host genome (e.g., a non-episomal mammalian vector) .

[0075] The recombinant expression vector can be obtained by conventional methods in the art, that is, by connecting the nucleic acid molecule of the present invention to various expression vectors, thus being constructed. The expression vector is one of a variety of conventional vectors in the art, as long as it can carry the above-mentioned nucleic acid molecule. The vector preferably includes: various plasmids, cosmids, phage or virus vectors and the like.

[0076] The term "transfectoma", as used herein, includes recombinant eukaryotic host cell expressing the antibody, such as CHO cells, NS / 0 cells, HEK293 cells, plant cells, or fungi, including yeast cells.

[0077] The sequence of the DNA molecule for the antibody or a fragment thereof according to the present invention can be obtained by conventional techniques, for example, methods such as PCR amplification or genomic library screening. In addition, the sequences encoding light chain and heavy chain can be fused together, to form a single-chain antibody.

[0078] Once a relevant sequence is obtained, the relevant sequence can be obtained in bulk using a recombination method. This is usually carried out by cloning the sequence into a vector, transforming a cell with the vector, and then separating the relevant sequence from the proliferated host cell by conventional methods.

[0079] In addition, a relevant sequence can be synthesized artificially, especially when the fragment is short in length. Usually, several small fragments are synthesized first, and then are linked together to obtain a fragment with a long sequence.

[0080] At present, it is possible to obtain a DNA sequence encoding the antibody of the present invention (or fragments thereof, or derivatives thereof) completely by chemical synthesis. The DNA sequence can then be introduced into a variety of existing DNA molecules (or, for example, vectors) and cells known in the art. In addition, mutations can also be introduced into the protein sequences of the present invention by chemical synthesis.

[0081] In general, under conditions suitable for expression of the antibody according to the present invention, the host cell obtained is cultured. Then, the antibody of the present invention is purified by using conventional immunoglobulin purification steps, for example, the conventional separation and purification means well known to those skilled in the art, such as protein A-Sepharose, hydroxyapatite chromatography, gel electrophoresis, dialysis, ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, molecular sieve chromatography or affinity chromatography.

[0082] The monoclonal antibody obtained can be identified by conventional means. For example, the binding specificity of a monoclonal antibody can be determined by immunoprecipitation or an in vitro binding assay (such as radioimmunoassay (RIA) or enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) ) . The binding affinity of a monoclonal antibody can be determined by, for example, the Scatchard analysis (Munson et al., Anal. Biochem., 107: 220 (1980)) .

[0083] The antibody according to the present invention can be expressed in a cell or on the cell membrane, or is secreted extracellularly. If necessary, the recombinant protein can be separated and purified by various separation methods according to its physical, chemical, and other properties. These methods are well known to those skilled in the art. The examples of these methods comprise, but are not limited to, conventional renaturation treatment, treatment by protein precipitant (such as salt precipitation) , centrifugation, cell lysis by osmosis, ultrasonic treatment, supercentrifugation, molecular sieve chromatography (gel chromatography) , adsorption chromatography, ion exchange chromatography, high performance liquid chromatography (HPLC) , and any other liquid chromatography, and the combination thereof.

[0084] As used herein, the term "kd" (sec -1) , as used herein, is intended to refer to the dissociation rate constant of a particular antibody-antigen interaction. Said value is also referred to as the koff value.

[0085] The term "ka" (M-1 x sec -1) , as used herein, is intended to refer to the association rate constant of a particular antibody-antigen interaction.

[0086] The term "KD" (M) , as used herein, is intended to refer to the dissociation equilibrium constant of a particular antibody-antigen interaction. “KD” refers to the dissociation constant, which is obtained from the ratio of Kd to Ka (i.e., Kd / Ka) and is expressed as a molar concentration (M) . KD values for antibodies can be determined using methods in the art in view of the present disclosure. For example, the KD of an antibody can be determined by using surface plasmon resonance, such as by using a biosensor system, e.g., a system, or by using bio-layer interferometry technology, such as an Octet RED96 system.

[0087] The term "epitope"or “antigenic determinant” refers to a site on an antigen to that an immunoglobulin or antibody specifically binds (e.g., a specific site on claudin-6 molecule) . Epitopes typically include at least 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 or 15 contiguous or non-contiguous amino acids in a unique spatial conformation. See, for example, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996) .

[0088] The terms "specific binding", "selective binding", "selectively bind" and "specifically bind"refer to the binding of an antibody to an epitope on a predetermined antigen. Typically, the antibody binds with an affinity (KD) of less than about 10-7 M, such as approximately less than about 10-8 M, 10-9 M or 10-10 M or less.

[0089] The term "Pharmaceutical composition", as used herein, is intended to refer to a mixture containing one or more of the compounds or a physiological / pharmaceutically acceptable salt or prodrug thereof described herein with other chemical components, such as physiological / pharmaceutically acceptable carriers and excipients. The purpose of the pharmaceutical composition is to promote the administration to the organism, which is beneficial to the absorption of the active ingredient and exerts the biological activity.

[0090] "Administration"and "treatment, "when applied to an animal, human, experimental subject, cell, tissue, organ, or biological fluid, refer to contact with an exogenous pharmaceutical, therapeutic, diagnostic reagent, or composition with the animal, human, subject, cell, tissue, organ, or biological fluid. "Administration"and "treatment"can refer, e.g., to therapeutic, pharmacokinetic, diagnostic, research, and experimental methods. Treatment of a cell encompasses contacting the cell with a reagent, as well as contacting a fluid with a reagent, wherein the fluid is in contact with the cell. "Administration"and "treatment"also mean in vitro and ex vivo treatments, e.g., of a cell, by a reagent, diagnostic, binding composition or by another cell. "Treatment, "when applied to a human, veterinary, or research subject, refers to therapeutic treatment, prophylactic or preventative measures, research and diagnostic applications.

[0091] In addition, the present disclosure includes a medicament for treating a disease associated with claudin-6, comprising an antibody or an antigen-binding fragment thereof of the present disclosure as an active ingredient.

[0092] There is no limitation on the diseases related to claudin-6, as long as it is a disease associated with claudin-6, for example, the therapeutic response induced by the molecules disclosed in the present disclosure can be reduced by binding human claudin-6. Therefore, the molecules of the present disclosure are very useful for those who suffer a tumor, cancer or infectious disease when in preparations and formulations suitable for therapeutic applications.

[0093] In addition, the present disclosure relates to a method for immunologically detecting or measuring claudin-6, a reagent for immunologically detecting or measuring claudin-6, a method for immunologically detecting or measuring cells expressing claudin-6, and a diagnostic reagent for diagnosis of disease related to claudin-6 positive cells, comprising the antibody or antigen-binding fragment of the present disclosure that specifically recognizes human claudin-6, as an active ingredient.

[0094] In the present disclosure, the method for detecting or determining the amount of claudin-6 may be any known method. For example, it includes immunodetection or assay.

[0095] The immunodetection or assay is a method of detecting or determining the amount of antibody or antigen by using labeled antigen or antibody. Examples of immunodetection or assay include a radioactive substance labeled immunological antibody method (RIA) , an enzyme immunoassay (EIA or ELISA) , a fluorescent immunoassay (FIA) , a luminescent immunoassay, a western blotting method, physicochemical methods, etc.

[0096] The above-mentioned diseases related to claudin-6 positive cells can be diagnosed by detecting or measuring cells expressing claudin-6 by using the antibodies or antibody fragments thereof of the present invention.

[0097] In order to detect cells expressing the polypeptide, a known immunodetection can be used, and preferably immunoprecipitation, fluorescent cell staining or immunohistochemical staining etc. can be used. Furthermore, a fluorescent antibody staining method etc. using FMAT8100HTS system (Applied Biosystem) can be used.

[0098] EXAMPLES

[0099] The invention is further illustrated by the following specific examples. It is to be understood that these examples are for illustrative purposes only and are not intended to limit the scope of the invention. The experimental methods without detailed conditions in the following examples are generally in accordance with the conditions described in the conventional conditions such as Sambrook. J et al. "Guide to Molecular Cloning Laboratory" (translated by Huang Peitang et al., Beijing: Science Press, 2002) , or in accordance with the conditions recommended by the manufacturer (for example, product manuals) . Percentages and parts are by weight unless otherwise stated. The experimental materials and reagents used in the following examples are commercially available unless otherwise specified.

[0100] The room temperature described in the examples is a conventional room temperature in the art, and is generally 10-30℃.

[0101] EXAMPLE 1 Immunization and Screening of Antibody

[0102] Immunization

[0103] 20 B-CLDN6 KO mice (RenLite) were immunized with 60 μL of full length human CLDN6 plasmid pDNA-h-CLDN6-V5-PADRE (150 μg) and CpG adjuvant for 3 times, Day 0, 14, and 28. Serum titer were checked by flow cytometry using CLDN6 overexpressing cells KOP293-hCLDN6 (T) -V5 (P) . Mice were boosted with full length human CLDN6 plasmid pDNA-h-CLDN6-V5-PADRE (150 μg) and KOP293-hCLDN6 (T) -V5 (P) cells (1×107) on Day 42.

[0104] Sequencing and Screening

[0105] Plasma B cells secreting CLDN6-specific antibodies were screened by Beacon platform. Reverse transcription and PCR amplification were performed to get the sequences of VH and VL. VH and VL regions were cloned to human IgG1 and Kappa constant region expression vectors, respectively. The vectors were transfected to CHO-S cells in 24 well plates using Expi CHO-STM Cells expression system. After 3-5 days incubation, the supernatant was collected. The specificity of the antibodies in the supernatant was characterized by FACS. 4 antibodies specifically bind to human CLDN6 were identified.

[0106] The amino acid sequence of heavy chain variable and light chain variable regions and CDR sequence of each antibody are as the following tables (Table 1 to Table 3) . The amino acid residues of the CDRs in VH / VL are numbered and annotated according to the Kabat numbering system.

[0107] Table 1. CDR sequence of heavy chain variable domain for clones from B cell sequencing.

[0108] Table 2. CDR sequence of light chain variable domain for clones from B cell sequencing.

[0109] Table 3. Sequences of heavy chain and light chain variable domains for clones from B cell sequencing.

[0110] EXAMPLE 2 Expression, Purification and Binding Affinity Detection of Recombinant Antibody

[0111] The cDNA sequences that encode VH and VL regions of the selected 4 clones were directly synthesized as DNA fragments with 5’ -end in-frame leader sequence (MGWSCIILFLVATATGVHS) . These DNA fragments were cloned into selected vectors using NEBuilder DNA Assembly Cloning Kit (New England Biolabs) . VH region was cloned into pFUSE-CHIg_hG1 vector (InvivoGen #pfuse-hchg1) , which in-frame with constant region of hIgG1 heavy chain in the vector. VL region was cloned into pFUSE2-CLIg_hk vector (InvivoGen, #pfuse2-hclk) , which in-frame with constant region of hIg kappa light chain in the vector. The amino acid sequences of the constant region of hIgG1 heavy chain and the constant region of hIg kappa light chain are as follow:

[0112] >Heavy chain constant region (SEQ ID NO: 17) :

[0113] >Light chain constant region (SEQ ID NO: 18) :

[0114] Table 4. Sequences of heavy chain and light chain for clones from B cell sequencing.

[0115] The heavy chain expression plasmid and light chain plasmids were co-transfected into Expi293F cells (ThermoFisher, #A14527) using ExpiFectamine 293 Transfection Kit (ThermoFisher, A14524) , or into ExpiCHO-S cells (ThermoFisher #A29127) using ExpiFectamine CHO Transfection Kit (ThermoFisher, A29129) . Based on the manufacturer’s instructions, plasmid DNA concentration reached 1.0 ug per ml of suspended cells, with LC: HC vector ratio 1: 1. The transfected cells were cultured 5 to 7 days on an orbital shaker at 37 ℃, 8%CO2. Conditioned medium was collected and antibodies were purified using HiTrap MabSelect SuRe column (Cytiva, #17549112) on AKTA Pure 25 machine (Cytiva) . Eluted antibodies were neutralized with Tris Buffer (pH 9.0) and subjected to PBS buffer exchange. Product concentration was measured by UV absorption, and quality was determined by SDS-PAGE and HPLC.

[0116] Binding of the hIgGl mAbs to the cell surface claudin-6 was determined by FACS analysis using overexpressing CHO cells (Claudin-6-CHO, Claudin-9-CHO, Claduin-4-CHO, and Claudin-3-CHO) , PA-1 ovarian cancer cells, and non-overexpressing CHO K1 cells.

[0117] Overexpressing CHO cells were maintained in F12K medium supplemented with 10%FBS, 1%penicillin and streptomycin, and selective antibiotics. PA-1 cells were maintained in EMEM medium supplemented with 10%FBS and 1%penicillin and streptomycin. All cell lines were cultured at 37℃ with 5%CO2 in humidified atmosphere.

[0118] To determine the binding of hIgG1 mAbs to cell surface claudin receptors, cells were first harvested and resuspended in cell staining buffer (BioLegend) at 2×106 cells / mL. Then, the cells were treated with human Fc receptor blocking reagent (BioLegend) on the ice for 10 min. The resulting cell suspension was aliquoted into 50 μL aliquots. 50 μL of hIgG1 mAbs at various concentrations were mixed with the cell aliquots, the final concentration of hIgG1 mAbs in the mixture ranged from 0.4 pM to 22.2 nM, or 10 pM to 600 nM. The cells were incubated on the ice for 1 hour and then washed with cell staining buffer twice. 50 μL of secondary antibody (PE conjugated goat anti-human Fc, eBioscienceTM, 1: 400 dilution) was added to each sample to resuspend the cells. The cells were incubated on the ice for another 30 min. Cells were subsequently washed twice with cell staining buffer and resuspended in 4%PFA to fix the cells. The samples were analyzed using iQue3 to measure the median fluorescence intensity using corresponding channels. TORL-3-7 (the mAb of TORL-1-23, refer to WO2020191342) was a positive control. The VH and VL of TORL-3-7 were shown below. The result was disclosed in Figure 1A-F and Table 5. As a result, it was confirmed that the anti-claudin-6 antibody of the present invention specifically binds to the claudin-6 as originally expressed in cancer cells or overexpressed in CHO cells in a concentration-dependent pattern. While minimum binding to claudin-9, claudin-4, and claudin-3 were observed.

[0119] >VH of TORL-3-7

[0120] >VL of TORL-3-7

[0121] Table 5. KD values of anti-claudin-6 recombinant antibodies binding to claudin-6 positive PA-1 cells and claudin-6-CHO cells

[0122] EXAMPLE 3 Characterization of anti-claudin-6 recombinant antibody cell internalization in PA-1 cells by indirect killing assay

[0123] To evaluate the endocytosis of the antibodies induced by anti-claudin-6 antibodies binding, an indirect killing assay was used to characterize the antibody internalization. Fab anti-human IgG Fc-MMAF conjugates with cleavable linker (Moradec, AH-202AF) was incubated and complexed with the recombinant anti-CLDN6 antibodies. TORL-3-7 as a positive control. The formed complexes were then incubated with claudin-6 expressing cells. Upon binding to the cell surface claudin-6 receptors, the complexes were internalized and release the conjugated MMAF after lysosomal cleavage of the linker. The released MMAF subsequently inhibited the cell division by blocking the polymerization of tubulin. Briefly, a claudin-6 expressing cell line PA-1 cells were seeded in 96-well plate at 2, 500 cells / well and incubated overnight. The recombinant anti-claudin-6 antibodies were mixed with the Fab anti-human IgG Fc-MMAF conjugates with cleavable linker at 1:6 ratio (mol / mol) and incubated for 10 min to form the complex. Then, a series dilution of the complexes, 1.5 pM to 10 nM, were added to each well and incubate for 72 hours. The cell viability was measured by Cell Titer Glo 2.0 assay (Promega, G9243) . The dose-response curves were plotted and fitted by GraphPad Prism 9.As shown in the Figure 2 and Table 6, all the anti-claudin-6 antibodies of the present invention have a potent cytotoxicity, indicating MMAF was delivered into the cells efficiently. The anti-claudin-6 antibodies have sufficient internalization.

[0124] Table 6. IC50 of indirect killing assay to evaluate the internalization of recombinant anti-claudin-6 antibodies in PA-1 cells.

[0125] Note: “NA” IC50 not measurable.

[0126] Although specific embodiments of the invention have been described in detail, those skilled in the art will understand that various modifications and changes may be made to the details in accordance with all the published teachings, which are also included in the scope of the invention. The protection scope of the invention is defined by the appended claims and any equivalents thereof.

Claims

1.An antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to CLDN6, wherein, the antibody comprises:a heavy chain variable region comprising a HCDR1, HCDR2 and HCDR3 of the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 12, 14, 15 or 16, and,a light chain variable region comprising a LCDR1, LCDR2 and LCDR3 of the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 13.2.An antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to CLDN6, comprising: a heavy chain variable region comprising HCDR1, HCDR2 and HCDR3 regions and a light chain variable region comprising LCDR1, LCDR2 and LCDR3 regions, wherein:a) HCDR1 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 01 or SEQ ID NO: 07;b) HCDR2 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 02, SEQ ID NO: 08 or SEQ ID NO: 11;c) HCDR3 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 03, SEQ ID NO: 09 or SEQ ID NO: 10;d) LCDR1 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 04;e) LCDR2 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 05;f) LCDR3 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 06.3.The antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to CLDN6 according to any one of claims 1-2, wherein the heavy chain variable region sequence comprisesHCDR1 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 01,HCDR2 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 02, andHCDR3 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 03, respectively;orHCDR1 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 07,HCDR2 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 08, andHCDR3 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 09 respectively;orHCDR1 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 07,HCDR2 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 08, andHCDR3 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 10 respectively;orHCDR1 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 01,HCDR2 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 11, andHCDR3 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 03 respectively.and / orthe light chain variable region sequence comprisesLCDR1 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 04,LCDR2 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 05, andLCDR3 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 06, respectively.4.The antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to CLDN6 according to any one of claims 1-3, wherein:a) a heavy chain variable region sequence comprises HCDR1, HCDR2 and HCDR3 as shown in SEQ ID NO: 01, SEQ ID NO: 02 and SEQ ID NO: 03, respectively; and a light chain variable region sequence comprises LCDR1, LCDR2 and LCDR3 as shown in SEQ ID NO: 04, SEQ ID NO: 05 and SEQ ID NO: 06, respectively;orb) a heavy chain variable region sequence comprises HCDR1, HCDR2 and HCDR3 as shown in SEQ ID NO: 07, SEQ ID NO: 08 and SEQ ID NO: 09, respectively; and a light chain variable region sequence comprises LCDR1, LCDR2 and LCDR3 as shown in SEQ ID NO: 04, SEQ ID NO: 05 and SEQ ID NO: 06, respectively;orc) a heavy chain variable region sequence comprises HCDR1, HCDR2 and HCDR3 as shown in SEQ ID NO: 07, SEQ ID NO: 08 and SEQ ID NO: 10, respectively; and a light chain variable region sequence comprises LCDR1, LCDR2 and LCDR3 as shown in SEQ ID NO: 04, SEQ ID NO: 05 and SEQ ID NO: 06, respectively;ord) a heavy chain variable region sequence comprises HCDR1, HCDR2 and HCDR3 as shown in SEQ ID NO: 01, SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 03, respectively; and a light chain variable region sequence comprises LCDR1, LCDR2 and LCDR3 as shown in SEQ ID NO: 04, SEQ ID NO: 05 and SEQ ID NO: 06, respectively.5.The antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to CLDN6 according to any one of claims 1-4, wherein the antibody or antigen-binding fragment thereof is selected from murine antibody, chimeric antibody, humanized antibody, human antibody or the antigen-binding fragment thereof.6.The antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to CLDN6 according to any one of claims 1-5, wherein the antibody or antigen-binding fragment thereof comprising: a heavy chain variable region comprising an amino acid sequence selected from: SEQ ID NOs: 12, 14-16, or sequence having at least 80%, 85%, 90%, 95%or 99%sequence identity therewith; and / or a light chain variable region comprising an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 13, or sequence having at least 80%, 85%, 90%, 95%or 99%sequence identity therewith.7.The antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to CLDN6 according to any one of claims 1-6, wherein the antibody or antigen-binding fragment thereof comprising:a) the heavy chain variable region as shown in SEQ ID NO: 12, or having at least 80%, 85%, 90%, 95%or 99%sequence identity therewith; and / or the light chain variable region as shown in SEQ ID NO: 13, or having at least 80%, 85%, 90%, 95%or 99%sequence identity therewith;orb) the heavy chain variable region as shown in SEQ ID NO: 14, or having at least 80%, 85%, 90%, 95%or 99%sequence identity therewith; and / or the light chain variable region as shown in SEQ ID NO: 13, or having at least 80%, 85%, 90%, 95%or 99%sequence identity therewith;orc) the heavy chain variable region as shown in SEQ ID NO: 15, or having at least 80%, 85%, 90%, 95%or 99%sequence identity therewith; and / or the light chain variable region as shown in SEQ ID NO: 13, or having at least 80%, 85%, 90%, 95%or 99%sequence identity therewith;ord) the heavy chain variable region as shown in SEQ ID NO: 16, or having at least 80%, 85%, 90%, 95%or 99%sequence identity therewith; and / or the light chain variable region as shown in SEQ ID NO: 13, or having at least 80%, 85%, 90%, 95%or 99%sequence identity therewith.8.The antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to CLDN6 according to any one of claims 1-7, wherein the antibody or antigen-binding fragment thereof comprising:a) the heavy chain variable region as shown in SEQ ID NO: 12, and / or the light chain variable region as shown in SEQ ID NO: 13;orb) the heavy chain variable region as shown in SEQ ID NO: 14, and / or the light chain variable region as shown in SEQ ID NO: 13;orc) the heavy chain variable region as shown in SEQ ID NO: 15, and / or the light chain variable region as shown in SEQ ID NO: 13;ord) the heavy chain variable region as shown in SEQ ID NO: 16, and / or the light chain variable region as shown in SEQ ID NO: 13.9.The antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to CLDN6 according to any one of claims 1-8, wherein the antibody or antigen-binding fragment thereof comprising:a) the heavy chain variable region as shown in SEQ ID NO: 12, and the light chain variable region as shown in SEQ ID NO: 13;orb) the heavy chain variable region as shown in SEQ ID NO: 14, and the light chain variable region as shown in SEQ ID NO: 13;orc) the heavy chain variable region as shown in SEQ ID NO: 15, and the light chain variable region as shown in SEQ ID NO: 13;ord) the heavy chain variable region as shown in SEQ ID NO: 16, and the light chain variable region as shown in SEQ ID NO: 13.10.The antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to CLDN6 according to any one of claims 1-9, wherein the antibody further comprising human antibody constant regions; preferably, the heavy chain constant region of the human antibody constant regions is selected from constant regions of human IgG1, IgG2, IgG3 and IgG4 and conventional variants thereof, and the light chain constant region of the human antibody constant regions is selected from κ and λ chain constant regions of human antibody and conventional variants thereof; more preferably, the antibody comprises the heavy chain constant region of SEQ ID NO: 17 and a human light chain constant region of SEQ ID NO: 18.11.The antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to CLDN6 according to any one of claims 1-10, wherein the antibody or antigen-binding fragment thereof comprising:a) a heavy chain having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 19 and a light chain having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 20; orb) a heavy chain having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 21 and a light chain having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 20; orc) a heavy chain having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 22 and a light chain having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 20; ord) a heavy chain having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 23 and a light chain having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 20.12.The antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to CLDN6 according to any one of claims 1-11, wherein the antigen-binding fragment is selected from the group consisting of Fab, Fab', F (ab') 2, variable fragment (Fv) , single chain variable fragment (scFv) , sdAb, sdFv, dimerized domain V (diabody) , disulfide stabilized Fv (dsFv) and CDR-containing peptides.13.A multispecific antibody comprising the antibody or the antigen-binding fragment thereof according to any one of claims 1-12, preferably, the multispecific antibody is a bispecific antibody, trispecific antibody or tetraspecific antibody.14.An immunoconjugate comprising the antibody or the antigen-binding fragment thereof according to any one of claims 1-12 or the multispecific antibody according to claim 13, wherein the antibody or the antigen-binding fragment thereof or the multispecific antibody is conjugated with one or more therapeutic agents; preferably, the therapeutic agent is a cytotoxic agent.15.A chimeric antigen receptor comprising: (a) the antigen-binding site of the antibody or antigen-binding fragment thereof according to any one of claims 1-12 or the multispecific antibody according to claim 13;(b) a transmembrane domain; and(c) an intracellular signaling domain.16.An isolated nucleic acid molecule encoding the antibody or the antigen-binding fragment thereof according to any one of claims 1-12 or the multispecific antibody according to claim 13.17.An expression vector comprising the isolated nucleic acid molecule of claim 16.18.A host cell comprising the nucleic acid molecule of claim 16, or the vector of claim17, wherein the host cell is selected from the group consisting of a prokaryotic cell and a eukaryotic cell, preferably a eukaryotic cell, more preferably a mammalian cell.19.A pharmaceutical composition, which comprises antibody or antigen-binding fragment according to any one of claim 1-12, or multispecific antibody according to claim 14, and one or more pharmaceutically acceptable carriers, diluents, or excipients.20.A therapeutic conjugate comprising the antibody or the antigen-binding fragment thereof according to any one of claims 1-12 or multispecific antibody according to claim13, wherein the antibody or the antigen-binding fragment thereof or the multispecific antibody is conjugated with one or more therapeutic agents; preferably, the therapeutic agent is a cytotoxic agent.21.A diagnostic conjugate comprising the antibody or the antigen-binding fragment thereof according to any one of claims 1-12 or multispecific antibody according to claim 13, wherein the antibody or the antigen-binding fragment thereof or the multispecific antibody is conjugated with one or more diagnostic agents; preferably, the diagnostic agent is selected from the group consisting of a detectable label, enzyme or metal containing substance, fluorescent substance, luminescent substance, colored substance.22.A method for immunologically detecting or measuring CLDN6, wherein the method comprises detecting or measuring the CLDN6 by contacting with the antibody or antigen-binding fragment thereof of any one of claims 1-12 or multispecific antibody according to claim13.23.A method for diagnosing a disease related to a human CLDN6 positive cell, wherein the method comprises detecting or measuring the CLDN6 positive cell by contacting with the antibody or antigen-binding fragment thereof of any one of claims 1-12, multispecific antibody according to claim 13, or the diagnostic conjugate according to claim 21.24.A method of treatment or prevention of a CLDN6-expressing cancer, comprising a step of administering a therapeutically effective amount of the antibody or antigen-binding fragment according to any one of claims 1-12, or the multipecific antibody according to claim13, or the pharmaceutical composition of claim19, or the chimeric antigen receptor of claim 15 to a subject in need of treatment or prevention of the CLDN6-expressing cancer.25.The method of treatment or prevention of a CLDN6-expressing cancer according to claim 24, wherein the CLDN6-expressing cancer is selected from the group consisting of ovarian cancer, lung cancer, gastric cancer, breast cancer, hepatic cancer, pancreatic cancer, skin cancer, malignant melanoma, head and neck cancer, sarcoma, bile duct cancer, cancer of the urinary bladder, kidney cancer, colon cancer, small bowel cancer, testicular embryonal carcinoma, placental choriocarcinoma, cervical cancer, testicular cancer, uterine cancer, a germ cell tumor disease, and the metastatic forms thereof.

Images