Multispecific antibodies targeting cd3, cd19 and cd20 and uses thereof

Abstract

Provided in the present disclosure are multispecific antibodies, the nucleic acid molecules encoding the same, expression vectors and host cells used for the expression of the multispecific antibodies. The disclosure further provides the methods for preventing and treating cancers by administering the multispecific antibodies.

Description

MULTISPECIFIC ANTIBODIES TARGETING CD3, CD19 AND CD20 AND USES THEREOFCROSS REFERENCE

[0001] This application claims the benefit of International Application No. PCT / CN2024 / 073617, filed January 23, 2024, which is incorporated herein by reference in its entirety. SEQUENCE LISTING

[0002] The instant application contains a Sequence Listing in electronic format. The Sequence Listing is provided as a file entitled 69143-717_602_SL. xml, created on January 17, 2025, which is 58, 402 bytes in size. The information in the electronic format of the Sequence Listing is incorporated by reference in its entirety.SUMMARY

[0003] Disclosed herein, in one aspect, is antibody or antigen-binding portion thereof, comprising a CD19 binding moiety, a CD3 binding moiety and a CD20 binding moiety, wherein: (a) the CD19 binding moiety comprises a heavy chain complementarity determining region (HCDR) 1, a HCDR2 and a HCDR3 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1, 2 and 3, respectively, and a light chain complementarity determining region (LCDR) 1, a LCDR2 and a LCDR3 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 4, 5 and 6, respectively; (b) the CD3 binding moiety comprises a HCDR1, a HCDR2 and a HCDR3 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 7, 8 and 9, respectively, and a LCDR1, a LCDR2 and a LCDR3 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 10, 11 and 12, respectively; and (c) the CD20 binding moiety comprises a HCDR1, a HCDR2 and a HCDR3 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 13, 14 and 15, respectively, and a LCDR1, a LCDR2 and a LCDR3 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 16, 17 and 18, respectively.

[0004] In some aspects, (a) the CD19 binding moiety comprises a heavy chain variable region (CD19VH) and a light chain variable region (CD19VL) ; (b) the CD3 binding moiety comprises a heavy chain variable region (CD3VH) and a light chain variable region (CD3VL) ; and (c) the CD20 binding moiety comprises a heavy chain variable region (CD20VH) or a light chain variable region (CD20VL) . In some aspects, the antibody or antigen-binding portion thereof further comprises a first binding arm and a second binding arm, wherein the first binding arm comprises the CD19 binding moiety and the CD3 binding moiety and the second binding arm comprises the CD20 binding moiety. In some aspects, (a) the CD19VH comprises an amino acid sequence with at least 90%sequence identity to SEQ ID NO: 19; (b) the CD19VL comprises an amino acid sequence with at least 90%sequence identity to SEQ ID NO: 20; (c) the CD3VH comprises an amino acid sequence with at least 90%sequence identity to SEQ ID NO: 21; (d) the CD3VL comprises an amino acid sequence with at least 90%sequence identity to SEQ ID NO: 22; (e) the CD20VH comprises an amino acid sequence with at least 90%sequence identity to SEQ ID NO: 23; or (f) the CD20VL comprises an amino acid sequence with at least 90%sequence identity to SEQ ID NO: 24. In some aspects, (a) the CD19VH comprises an amino acid sequence with at least 90%sequence identity to SEQ ID NO: 19; (b) the CD19VL comprises an amino acid sequence with at least 90%sequence identity to SEQ ID NO: 20; (c) the CD3VH comprises an amino acid sequence with at least 90%sequence identity to SEQ ID NO: 21; (d) the CD3VL comprises an amino acid sequence with at least 90%sequence identity to SEQ ID NO: 22; (e) the CD20VH comprises an amino acid sequence with at least 90%sequence identity to SEQ ID NO: 23; and (f) the CD20VL comprises an amino acid sequence with at least 90%sequence identity to SEQ ID NO: 24. In some aspects, (a) the CD19VH comprises an amino acid sequence with at least 95%sequence identity to SEQ ID NO: 19; (b) the CD19VL comprises an amino acid sequence with at least 95%sequence identity to SEQ ID NO: 20; (c) the CD3VH comprises an amino acid sequence with at least 95%sequence identity to SEQ ID NO: 21; (d) the CD3VL comprises an amino acid sequence with at least 95%sequence identity to SEQ ID NO: 22; (e) the CD20VH comprises an amino acid sequence with at least 95%sequence identity to SEQ ID NO: 23; or (f) the CD20VL comprises an amino acid sequence with at least 95%sequence identity to SEQ ID NO: 24. In some aspects, (a) the CD19VH comprises an amino acid sequence with at least 95%sequence identity to SEQ ID NO: 19; (b) the CD19VL comprises an amino acid sequence with at least 95%sequence identity to SEQ ID NO: 20; (c) the CD3VH comprises an amino acid sequence with at least 95%sequence identity to SEQ ID NO: 21; (d) the CD3VL comprises an amino acid sequence with at least 95%sequence identity to SEQ ID NO: 22; (e) the CD20VH comprises an amino acid sequence with at least 95%sequence identity to SEQ ID NO: 23; and (f) the CD20VL comprises an amino acid sequence with at least 95%sequence identity to SEQ ID NO: 24. In some aspects, (a) the CD19VH comprises an amino acid sequence with at least 99%sequence identity to SEQ ID NO: 19; (b) the CD19VL comprises an amino acid sequence with at least 99%sequence identity to SEQ ID NO: 20; (c) the CD3VH co mprises an amino acid sequence with at least 99%sequence identity to SEQ ID NO: 21; (d) the CD3VL comprises an amino acid sequence with at least 99%sequence identity to SEQ ID NO: 22; (e) the CD20VH comprises an amino acid sequence with at least 99%sequence identity to SEQ ID NO: 23; or (f) the CD20VL comprises an amino acid sequence with at least 99%sequence identity to SEQ ID NO: 24. In some aspects, (a) the CD19VH comprises an amino acid sequence with at least 99%sequence identity to SEQ ID NO: 19; (b) the CD19VL comprises an amino acid sequence with at least 99%sequence identity to SEQ ID NO: 20; (c) the CD3VH co mprises an amino acid sequence with at least 99%sequence identity to SEQ ID NO: 21; (d) the CD3VL comprises an amino acid sequence with at least 99%sequence identity to SEQ ID NO: 22; (e) the CD20VH comprises an amino acid sequence with at least 99%sequence identity to SEQ ID NO: 23; and (f) the CD20VL comprises an amino acid sequence with at least 99%sequence identity to SEQ ID NO: 24. In some aspects, (a) the CD19VH comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19; (b) the CD19VL comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20; (c) the CD3VH comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21; (d) the CD3VL comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22; (e) the CD20VH comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 23; or (f) the CD20VL comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 24. In some aspects, (a) the CD19VH comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19; (b) the CD19VL comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20; (c) the CD3VH comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21; (d) the CD3VL comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22; (e) the CD20VH comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 23; and (f) the CD20VL comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 24.

[0005] In some aspects, (a) the CD19VH is operably linked to a first heavy chain constant domain (C1H) ; (b) the CD19VL is operably linked to a first light chain constant domain (C1L) ; (c) the CD3VH is operably linked to a second heavy chain constant domain (C2H) ; (d) the CD3VL is operably linked to a second light chain constant domain (C2L) ; (e) the CD20VH is operably linked to a third heavy chain constant domain (C3H) ; or (f) the CD20VL is operably linked to a third light chain constant domain (C3L) . In some aspects, (a) the CD19VH is operably linked to a first heavy chain constant domain (C1H) ; (b) the CD19VL is operably linked to a first light chain constant domain (C1L) ; (c) the CD3VH is operably linked to a second heavy chain constant domain (C2H) ; (d) the CD3VL is operably linked to a second light chain constant domain (C2L) ; (e) the CD20VH is operably linked to a third heavy chain constant domain (C3H) ; and (f) the CD20VL is operably linked to a third light chain constant domain (C3L) . In some aspects, (a) the C1H and C1L comprise a T cell receptor (TCR) α chain constant domain (Cα) and a TCR β chain constant domain (Cβ) , respectively; (b) the C1H and C1L comprise Cβ and Cα, respectively; or (c) the C1H and C1L comprise an antibody heavy chain constant region CH1 domain and an antibody light chain constant region CL domain, respectively. In some aspects, the C1H and the C1L comprise Cα and Cβ, respectively. In some aspects, the C1H and the C1L comprise Cβ and Cα, respectively. In some aspects, the C1H and the C1L comprise CH1 domain and CL domain, respectively. In some aspects, (a) the C2H and the C2L comprise Cα and Cβ, respectively; (b) the C2H and the C2L comprise Cβ and Cα, respectively; or (c) the C2H and the C2L comprise CH1 domain and CL domain, respectively. In some aspects, the C2H and the C2L comprise Cα and Cβ, respectively. In some aspects, the C2H and the C2L comprise Cβ and Cα, respectively. In some aspects, the C2H and the C2L comprise CH1 domain and CL domain, respectively. In some aspects, (a) the C3H and the C3L comprise Cα and Cβ, respectively; (b) the C3H and the C3L comprise Cβ and Cα, respectively; or (c) the C3H and the C3L comprise CH1 domain and CL domain, respectively. In some aspects, the C3H and the C3L comprise Cα and Cβ, respectively. In some aspects, the C3H and the C3L comprise Cβ and Cα, respectively. In some aspects, wherein the C3H and the C3L comprise CH1 domain and CL domain, respectively. In some aspects, (a) the C1H and the C1L comprise Cβ and Cα, respectively; (b) the C2H and the C2L comprise Cβ and Cα, respectively, and (c) the C3H and the C3L comprise CH1 domain and CL domain, respectively.

[0006] In some aspects, (a) Cα comprises an amino acid sequence with at least 90%sequence identity to SEQ ID NO: 35; (b) Cβ comprises an amino acid sequence with at least 90%sequence identity to SEQ ID NO: 34; (c) CH1 domain comprises an amino acid sequence with at least 90%sequence identity to SEQ ID NO: 44; or (d) CL domain comprises an amino acid sequence with at least 90%sequence identity to SEQ ID NO: 45. In some aspects, (a) Cα comprises an amino acid sequence with at least 90%sequence identity to SEQ ID NO: 35; (b) Cβ comprises an amino acid sequence with at least 90%sequence identity to SEQ ID NO: 34; (c) CH1 domain comprises an amino acid sequence with at least 90%sequence identity to SEQ ID NO: 44; and (d) CL domain comprises an amino acid sequence with at least 90%sequence identity to SEQ ID NO: 45. In some aspects, (a) Cα comprises an amino acid sequence with at least 95%sequence identity to SEQ ID NO: 35; (b) Cβ comprises an amino acid sequence with at least 95%sequence identity to SEQ ID NO: 34; (c) CH1 domain comprises an amino acid sequence with at least 95%sequence identity to SEQ ID NO: 44; or (d) CL domain comprises an amino acid sequence with at least 95%sequence identity to SEQ ID NO: 45. In some aspects, (a) Cα comprises an amino acid sequence with at least 95%sequence identity to SEQ ID NO: 35; (b) Cβ comprises an amino acid sequence with at least 95%sequence identity to SEQ ID NO: 34; (c) CH1 domain comprises an amino acid sequence with at least 95%sequence identity to SEQ ID NO: 44; and (d) CL domain comprises an amino acid sequence with at least 95%sequence identity to SEQ ID NO: 45. In some aspects, (a) Cα comprises an amino acid sequence with at least 99%sequence identity to SEQ ID NO: 35; (b) Cβ comprises an amino acid sequence with at least 99%sequence identity to SEQ ID NO: 34; (c) CH1 domain comprises an amino acid sequence with at least 99%sequence identity to SEQ ID NO: 44; or (d) CL domain comprises an amino acid sequence with at least 99%sequence identity to SEQ ID NO: 45. In some aspects, (a) Cα comprises an amino acid sequence with at least 99%sequence identity to SEQ ID NO: 35; (b) Cβ comprises an amino acid sequence with at least 99%sequence identity to SEQ ID NO: 34; (c) CH1 domain comprises an amino acid sequence with at least 99%sequence identity to SEQ ID NO: 44; and (d) CL domain comprises an amino acid sequence with at least 99%sequence identity to SEQ ID NO: 45. In some aspects, (a) Cα comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 35; (b) Cβ comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 34; (c) CH1 domain comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 44; or (d) CL domain comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 45. In some aspects, (a) Cα comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 35; (b) Cβ comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 34; (c) CH1 domain comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 44; and (d) CL domain comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 45.

[0007] In some aspects, (a) the C1H comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 34; (b) the C1L comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 35; (c) the C2H comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 34; (d) the C2L comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 35; (e) the C3H comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 44; and (f) the C3L comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 45. In some aspects, (a) the CD19VH is covalently linked to the C1H directly or via a peptide linker; (b) the CD19VL is covalently linked to the C1L directly or via a peptide linker; (c) the CD3VH is covalently linked to the C2H directly or via a peptide linker; (d) the CD3VL is covalently linked to the C2L directly or via a peptide linker; (e) the CD20VH is covalently linked to the C3H directly or via a peptide linker; or (f) the CD20VL is covalently linked to the C3L directly or via a peptide linker. In some aspects, (a) the CD19VH is covalently linked to the C1H directly; (b) the CD19VL is covalently linked to the C1L directly; (c) the CD3VH is covalently linked to the C2H directly; (d) the CD3VL is covalently linked to the C2L directly; (e) the CD20VH is covalently linked to the C3H directly; or (f) the CD20VL is covalently linked to the C3L directly. In some aspects, (a) the CD19VH is covalently linked to the C1H directly; (b) the CD19VL is covalently linked to the C1L directly; (c) the CD3VH is covalently linked to the C2H directly; (d) the CD3VL is covalently linked to the C2L directly; (e) the CD20VH is covalently linked to the C3H directly; and (f) the CD20VL is covalently linked to the C3L directly. In some aspects, (a) the CD19VH is covalently linked to the C1H via a peptide linker; (b) the CD19VL is covalently linked to the C1L via a peptide linker; (c) the CD3VH is covalently linked to the C2H via a peptide linker; (d) the CD3VL is covalently linked to the C2L via a peptide linker; (e) the CD20VH is covalently linked to the C3H via a peptide linker; or (f) the CD20VL is covalently linked to the C3L via a peptide linker. In some aspects, (a) the CD19VH is covalently linked to the C1H via a peptide linker; (b) the CD19VL is covalently linked to the C1L via a peptide linker; (c) the CD3VH is covalently linked to the C2H via a peptide linker; (d) the CD3VL is covalently linked to the C2L via a peptide linker; (e) the CD20VH is covalently linked to the C3H via a peptide linker; and (f) the CD20VL is covalently linked to the C3L via a peptide linker.

[0008] In some aspects, the antibody or antigen-binding portion thereof further comprises a first heavy chain (HC1) , a second heavy chain (HC2) , a first light chain (LC1) , a second light chain (LC2) , or a third light chain (LC3) . In some aspects, the antibody or antigen-binding portion thereof further comprises the first heavy chain (HC1) , the second heavy chain (HC2) , the first light chain (LC1) , the second light chain (LC2) , and the third light chain (LC3) . In some aspects, the antibody or antigen-binding portion thereof further comprises a fragment crystallizable (Fc) region. In some aspects, the antibody or antigen-binding portion thereof further comprises an immunoglobulin (Ig) G, IgA, IgM, IgE, or IgD. In some aspects, the antibody or antigen-binding portion thereof further comprising an IgG1, IgG2, IgG3, or IgG4. In some aspects, the antibody or antigen-binding portion thereof further comprises a human IgG1, IgG2, IgG3, or IgG4. In some aspects, the antibody or antigen-binding portion thereof further comprises an IgG4. In some aspects, the antibody or antigen-binding portion thereof further comprises a human IgG4. In some aspects, the CD19 binding moiety, the CD3 binding moiety, or the CD20 binding moiety comprises a fragment antigen-binding (Fab) region, a Fab’ , a F (ab’ ) 2, or single chain variable fragment (scFv) . In some aspects, the CD19 binding moiety, the CD3 binding moiety, or the CD20 binding moiety comprises a Fab region. In some aspects, the CD19 binding moiety, the CD3 binding moiety, and the CD20 binding moiety each comprises a Fab region.

[0009] In some aspects, HC1, HC2, LC1, LC2 and LC3 comprise domains operably linked, from the amino terminus to the carboxyl terminus, in the following formats: (a) CD19VH-Cβ-CD3VL-Cα-Fc, CD20VH-CH1-Fc, CD19VL-Cα, CD3VH-Cβ, and CD20VL-CL, respectively; (b) CD19VL-Cα-CD3VH-Cβ-Fc, CD20VH-CH1-Fc, CD19VH-Cβ, CD3VL-Cα, and CD20VL-CL, respectively; (c) CD3VH-Cβ-CD19VL-Cα-Fc, CD20VH-CH1-Fc, CD3VL-Cα, CD19VH-Cβ, and CD20VL-CL, respectively; or (d) CD3VL-Cα-CD19VH-Cβ-Fc, CD20VH-CH1-Fc, CD3VH-Cβ, CD19VL-Cα, and CD20VL-CL, respectively. In some aspects, HC1, HC2, LC1, LC2 and LC3 comprise domains operably linked, from the amino terminus to the carboxyl terminus, in the following formats: CD19VH-Cβ-CD3VL-Cα-Fc, CD20VH-CH1-Fc, CD19VL-Cα, CD3VH-Cβ, and CD20VL-CL, respectively. In some aspects, (a) CD19VH-Cβ is covalently linked to CD3VL-Cα-Fc directly or via a peptide linker; (b) CD19VL-Cα is covalently linked to CD3VH-Cβ-Fc directly or via a peptide linker; (c) CD3VH-Cβ is covalently linked to CD19VL-Cα-Fc directly or via a peptide linker; or (d) CD3VL-Cα is covalently linked to CD19VH-Cβ-Fc directly or via a peptide linker. In some aspects, CD19VH-Cβ is covalently linked to CD3VL-Cα-Fc directly. In some aspects, CD19VH-Cβ is covalently linked to CD3VL-Cα-Fc via the peptide linker. In some aspects, the peptide linker comprises 1 to 40 amino acids in length. In some aspects, the peptide linker comprises glycine (G) and serine (S) . In some aspects, the peptide linker comprises a glycine (G) and serine (S) linker comprising (GS) n (SEQ ID NO: 46) , (GGS) n (SEQ ID NO: 47) , (GGGS) n (SEQ ID NO: 48) , (GGGGS) n (SEQ ID NO: 49) , (GGSG) n (SEQ ID NO: 50) , or (GGGSS) n (SEQ ID NO: 51) , wherein n is an integer of 1-9. In some aspects, the peptide linker comprises SEQ ID NO: 38. In some aspects, CD19VH-Cβ is covalently linked to CD3VL-Cα-Fc via the peptide linker comprising SEQ ID NO: 38. In some aspects, (a) CD19VH-Cβ-CD3VL-Cα is covalently linked to the Fc region directly or via a hinge region; (b) CD20VH-CH1 is covalently linked to the Fc region directly or via a hinge region; (c) CD19VL-Cα-CD3VH-Cβ is covalently linked to the Fc region directly or via a hinge region; (d) CD3VH-Cβ-CD19VL-Cα is covalently linked to the Fc region directly or via a hinge region; or (e) CD3VL-Cα-CD19VH-Cβ is covalently linked to the Fc region directly or via a hinge region. In some aspects, CD19VH-Cβ-CD3VL-Cα is covalently linked to the Fc region via the hinge region. In some aspects, CD20VH-CH1 is covalently linked to the Fc region via the hinge region. In some aspects, (a) CD19VH-Cβ-CD3VL-Cα is covalently linked to the Fc region via the hinge region; and (b) CD20VH-CH1 is covalently linked to the Fc region via the hinge region. In some aspects, the hinge region comprises SEQ ID NO: 37. In some aspects, CD19VH-Cβ-CD3VL-Cα is covalently linked to the Fc region via the hinge region comprising SEQ ID NO: 37. In some aspects, CD20VH-CH1 is covalently linked to the Fc region via the hinge region comprising SEQ ID NO: 37. In some aspects, (a) CD19VH-Cβ-CD3VL-Cα is covalently linked to the Fc region via the hinge region comprising SEQ ID NO: 37; and (b) CD20VH-CH1 is covalently linked to the Fc region via the hinge region comprising SEQ ID NO: 37.

[0010] In some aspects, (a) CD19VH-Cβ associates with CD19VL-Cα to form the CD19 binding moiety; (b) CD3VL-Cα associates with CD3VH-Cβ to form the CD3 binding moiety; (c) CD20VH-CH1 associates with CD20VL-CL to form the CD20 binding moiety; (d) CD19VL-Cα associates with CD19VH-Cβ to form the CD19 binding moiety; or € CD3VH-Cβ associates with CD3VL-Cα to form the CD3 binding moiety. In some aspects, (a) CD19VH-Cβ associates with CD19VL-Cα to form the CD19 binding moiety; (b) CD3VL-Cα associates with CD3VH-Cβ to form the CD3 binding moiety; and (c) CD20VH-CH1 associates with CD20VL-CL to form the CD20 binding moiety. In some aspects, Cα and Cβ associate to form a dimer via a bond or an interaction between Cα and Cβ. In some aspects, Cα or Cβ comprises an amino acid modification that results in a disulfide bond formed between Cα and Cβ, wherein the disulfide bond improves the stability of the interface between Cα and Cβ. In some aspects, the Fc region of the antibody or antigen-binding portion thereof comprises a first amino acid mutation that reduces or eliminates antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC) , complement-dependent cytotoxicity (CDC) or binding of the antibody or antigen-binding portion thereof to a Fc-gamma receptor (FcγR) . In some aspects, the first amino acid mutation comprises a substitution of phenylalanine (F) with alanine (A) at amino acid 234 according to the EU numbering (F234A) . In some aspects, the first amino acid mutation comprises a substitution of leucine (L) with alanine (A) at amino acid 235 according to the EU numbering (L235A) . In some aspects, the first amino acid mutation comprises F234A and L235A. In some aspects, the Fc region of the first heavy chain (HC1) comprises the first amino acid mutation comprising F234A and L235A. In some aspects, the Fc region of the second heavy chain (HC2) comprises the first amino acid mutation comprising F234A and L235A. In some aspects, (a) the Fc region of the first heavy chain (HC1) comprises the first amino acid mutation comprising F234A and L235A; and (b) the Fc region of the second heavy chain (HC2) comprises the first amino acid mutation comprising F234A and L235A.

[0011] In some aspects, the Fc region of the first heavy chain (HC1) or second heavy chain (HC2) comprises a second amino acid mutation that results in knob-into-hole substitution in the first heavy chain (HC1) or second heavy chain (HC2) . In some aspects, the second amino acid mutation of the Fc region comprises: (a) a substitution of serine (S) with cysteine (C) at amino acid residue 354 according to the EU numbering (S354C) ; (b) a substitution of threonine (T) with tryptophan (W) at amino acid residue 366 according to the EU numbering (T366W) ; (c) a substitution of tyrosine (Y) with cysteine (C) at amino acid residue 349 according to the EU numbering (Y349C) ; (d) a substitution of threonine (T) with serine (S) at amino acid residue 366 according to the EU numbering (T366S) ; (e) a substitution of leucine (L) with alanine (A) at amino acid residue 368 according to the EU numbering (L368A) ; or (f) a substitution of tyrosine (Y) with valine (V) at amino acid residue 407 according to the EU numbering (Y407V) . In some aspects, (a) the Fc region of the first heavy chain (HC1) comprises the second amino acid mutation comprising S354C or T366W; and (b) the Fc region of the second heavy chain (HC2) comprises the second amino acid mutation comprising Y349C, T366S, L368A, or Y407V. In some aspects, (a) the Fc region of the first heavy chain (HC1) comprises the second amino acid mutation comprising Y349C, T366S, L368A, or Y407V; and (b) the Fc region of the second heavy chain (HC2) comprises the second amino acid mutation comprising S354C or T366W. In some aspects, (a) the Fc region of the first heavy chain (HC1) comprises the second amino acid mutation comprising S354C and T366W; and (b) the Fc region of the second heavy chain (HC2) comprises the second amino acid mutation comprising Y349C, T366S, L368A, and Y407V. In some aspects, (a) the Fc region of the first heavy chain (HC1) comprises the second amino acid mutation comprising Y349C, T366S, L368A, and Y407V; and (b) the Fc region of the second heavy chain (HC2) comprises the second amino acid mutation comprising S354C and T366W. In some aspects, (a) the Fc region of the first heavy chain (HC1) comprises the first amino acid mutation comprising F234A and L235A and the second amino acid mutation comprising S354C and T366W; and (b) the Fc region of the second heavy chain (HC2) comprises the first amino acid mutation comprising F234A and L235A and the second amino acid mutation comprising Y349C, T366S, L368A, and Y407V. In some aspects, (a) the Fc region of the first heavy chain (HC1) comprises the first amino acid mutation comprising F234A and L235A and the second amino acid mutation comprising Y349C, T366S, L368A, and Y407V; and (b) the Fc region of the second heavy chain (HC2) comprises the first amino acid mutation comprising F234A and L235A and the second amino acid mutation comprising S354C and T366W. In some aspects, the Fc region of the first heavy chain (HC1) or second heavy chain (HC2) comprises a third amino acid mutation comprising: (a) a substitution of serine (S) with proline (P) at amino acid residue 228 according to the EU numbering (S228P) ; (b) a substitution of methionine (M) with tyrosine (Y) at amino acid residue 252 according to the EU numbering (M252Y) ; (c) a substitution of serine (S) with threonine (T) at amino acid residue 254 according to the EU numbering (S254T) ; or (d) a substitution of threonine (T) with glutamic acid (E) at amino acid residue 256 according to the EU numbering (T256E) . In some aspects, the Fc region of the first heavy chain (HC1) comprises a third amino acid mutation comprising S228P, M252Y, S254T, or T256E. In some aspects, the Fc region of the second heavy chain (HC1) comprises a third amino acid mutation comprising S228P, M252Y, S254T, or T256E.

[0012] In some aspects, (a) the Fc region of the first heavy chain (HC1) comprises an amino acid sequence with at least 90%sequence identity to SEQ ID NO: 36; or (b) the Fc region of the second heavy chain (HC2) comprises an amino acid sequence with at least 90%sequence identity to SEQ ID NO: 43. In some aspects, (a) the Fc region of the first heavy chain (HC1) comprises an amino acid sequence with at least 90%sequence identity to SEQ ID NO: 36; and (b) the Fc region of the second heavy chain (HC2) comprises an amino acid sequence with at least 90%sequence identity to SEQ ID NO: 43. In some aspects, (a) the Fc region of the first heavy chain (HC1) comprises an amino acid sequence with at least 95%sequence identity to SEQ ID NO: 36; or (b) the Fc region of the second heavy chain (HC2) comprises an amino acid sequence with at least 95%sequence identity to SEQ ID NO: 43. In some aspects, (a) the Fc region of the first heavy chain (HC1) comprises an amino acid sequence with at least 95%sequence identity to SEQ ID NO: 36; and (b) the Fc region of the second heavy chain (HC2) comprises an amino acid sequence with at least 95%sequence identity to SEQ ID NO: 43. In some aspects, (a) the Fc region of the first heavy chain (HC1) comprises an amino acid sequence with at least 99%sequence identity to SEQ ID NO: 36; or (b) the Fc region of the second heavy chain (HC2) comprises an amino acid sequence with at least 99%sequence identity to SEQ ID NO: 43. In some aspects, (a) the Fc region of the first heavy chain (HC1) comprises an amino acid sequence with at least 99%sequence identity to SEQ ID NO: 36; and (b) the Fc region of the second heavy chain (HC2) comprises an amino acid sequence with at least 99%sequence identity to SEQ ID NO: 43. In some aspects, (a) the Fc region of the first heavy chain (HC1) comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 36; or (b) the Fc region of the second heavy chain (HC2) comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 43. In some aspects, (a) the Fc region of the first heavy chain (HC1) comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 36; and (b) the Fc region of the second heavy chain (HC2) comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 43.

[0013] In some aspects, (a) HC1 comprises an amino acid sequence with at least 90%sequence identity to SEQ ID NO: 25; (b) HC2 comprises an amino acid sequence with at least 90%sequence identity to SEQ ID NO: 26; (c) LC1 comprises an amino acid sequence with at least 90%sequence identity to SEQ ID NO: 27; (d) LC2 comprises an amino acid sequence with at least 90%sequence identity to SEQ ID NO: 28; or (e) LC3 comprises an amino acid sequence with at least 90%sequence identity to SEQ ID NO: 29. In some aspects, (a) HC1 comprises an amino acid sequence with at least 90%sequence identity to SEQ ID NO: 25; (b) HC2 comprises an amino acid sequence with at least 90%sequence identity to SEQ ID NO: 26; (c) LC1 comprises an amino acid sequence with at least 90%sequence identity to SEQ ID NO: 27; (d) LC2 comprises an amino acid sequence with at least 90%sequence identity to SEQ ID NO: 28; and (e) LC3 comprises an amino acid sequence with at least 90%sequence identity to SEQ ID NO: 29. In some aspects, (a) HC1 comprises an amino acid sequence with at least 95%sequence identity to SEQ ID NO: 25; (b) HC2 comprises an amino acid sequence with at least 95%sequence identity to SEQ ID NO: 26; (c) LC1 comprises an amino acid sequence with at least 95%sequence identity to SEQ ID NO: 27; (d) LC2 comprises an amino acid sequence with at least 95%sequence identity to SEQ ID NO: 28; or (e) LC3 comprises an amino acid sequence with at least 95%sequence identity to SEQ ID NO: 29. In some aspects, (a) HC1 comprises an amino acid sequence with at least 95%sequence identity to SEQ ID NO: 25; (b) HC2 comprises an amino acid sequence with at least 95%sequence identity to SEQ ID NO: 26; (c) LC1 comprises an amino acid sequence with at least 95%sequence identity to SEQ ID NO: 27; (d) LC2 comprises an amino acid sequence with at least 95%sequence identity to SEQ ID NO: 28; and (e) LC3 comprises an amino acid sequence with at least 95%sequence identity to SEQ ID NO: 29. In some aspects, (a) HC1 comprises an amino acid sequence with at least 99%sequence identity to SEQ ID NO: 25; (b) HC2 comprises an amino acid sequence with at least 99%sequence identity to SEQ ID NO: 26; (c) LC1 comprises an amino acid sequence with at least 99%sequence identity to SEQ ID NO: 27; (d) LC2 comprises an amino acid sequence with at least 99%sequence identity to SEQ ID NO: 28; or (e) LC3 comprises an amino acid sequence with at least 99%sequence identity to SEQ ID NO: 29. In some aspects, (a) HC1 comprises an amino acid sequence with at least 99%sequence identity to SEQ ID NO: 25; (b) HC2 comprises an amino acid sequence with at least 99%sequence identity to SEQ ID NO: 26; (c) LC1 comprises an amino acid sequence with at least 99%sequence identity to SEQ ID NO: 27; (d) LC2 comprises an amino acid sequence with at least 99%sequence identity to SEQ ID NO: 28; and (e) LC3 comprises an amino acid sequence with at least 99%sequence identity to SEQ ID NO: 29. In some aspects, (a) HC1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 25; (b) HC2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26; (c) LC1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 27; (d) LC2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 28; or (e) LC3 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 29. In some aspects, (a) HC1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 25; (b) HC2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26; (c) LC1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 27; (d) LC2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 28; and (e) LC3 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 29. In some aspects, the antibody or antigen-binding portion thereof further comprising HC1, HC2, LC1, LC2, and LC3, wherein: (a) HC1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 25; (b) HC2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26; (c) LC1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 27; (d) LC2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 28; and (e) LC3 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 29.

[0014] In some aspects, disclosed herein is a nucleic acid sequence encoding the antibody or antigen-binding portion thereof. In some aspects, disclosed herein is a nucleic acid sequence encoding the HC1, HC2, LC1, LC2, or LC3 of the antibody or antigen-binding portion thereof. In some aspects, disclosed herein is a nucleic acid sequence encoding the HC1, HC2, LC1, LC2, and LC3 of the antibody or antigen-binding portion thereof. In some aspects, disclosed herein is a vector comprising the nucleic acid sequence. In some aspects, disclosed herein is a host cell comprising the nucleic acid sequence or the vector. In some aspects, disclosed herein is a pharmaceutical composition comprising the antibody or antigen-binding portion thereof and a pharmaceutically acceptable carrier. In some aspects, disclosed herein is a method for producing the antibody or antigen-binding portion thereof, comprising the steps of: (a) culturing a host cell comprising a nucleic acid sequence encoding the antibody or antigen-binding portion thereof under suitable conditions; and (b) isolating the antibody or antigen-binding portion thereof from the host cell. In some aspects, disclosed herein is a method for producing the antibody or antigen-binding portion thereof, comprising the steps of: (a) culturing a host cell comprising a nucleic acid sequence encoding the HC1, HC2, LC1, LC2, or LC3 of the antibody or antigen-binding portion thereof under suitable conditions; and (b) isolating the antibody or antigen-binding portion thereof from the host cell. In some aspects, disclosed herein is a method for producing the antibody or antigen-binding portion thereof, comprising the steps of: (a) culturing a host cell comprising a nucleic acid sequence encoding the HC1, HC2, LC1, LC2, and LC3 of the antibody or antigen-binding portion thereof under suitable conditions; and (b) isolating the antibody or antigen-binding portion thereof from the host cell. In some aspects, disclosed herein is a method for modulating a CD19 or CD20 related immune response in a subject, comprising administering to the subject the antibody or antigen-binding portion thereof or the pharmaceutical composition. In some aspects, disclosed herein is a method for inhibiting growth of tumor cells in a subject, comprising administering an effective amount of the antibody or antigen-binding portion thereof or the pharmaceutical composition to the subject. In some aspects, disclosed herein is a method for preventing or treating cancer in a subject, comprising administering an effective amount the antibody or antigen-binding portion thereof or the pharmaceutical composition to the subject. In some aspects, the cancer comprises a cell expressing CD19 or CD20. In some aspects, the cancer comprises a cell expressing CD19 and CD20. In some aspects, the cancer comprises a B cell lymphoma. In some aspects, the cancer is selected from diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL) , non-Hodgkin lymphoma, mantle cell lymphoma (MCL) , marginal zone lymphoma (MZL) , follicular lymphoma (FL) , chronic lymphocytic leukemia, Waldenstrom macroglobulinemia (WM) , B-cell chronic lymphocytic leukemia, non-T acute lymphoblastic leukemia, acute lymphoblastic leukemia (ALL) , and chronic lymphoid lymphoma. In some aspects, the cancer comprises B-cell non-Hodgkin lymphoma (B-NHL) . In some aspects, the antibody or antigen-binding portion thereof is for use in diagnosing, treating or preventing cancer. In some aspects, disclosed herein is a use of the antibody or antigen-binding portion thereof in the manufacture of a medicament for treating or preventing a cancer. In some aspects, the cancer comprises a cell expressing CD19 or CD20. In some aspects, the cancer comprises a cell expressing CD19 and CD20. In some aspects, disclosed herein is a kit, wherein the kit comprises a container comprising the antibody or antigen-binding portion thereof.

[0015] In some aspects, disclosed herein is a method of depleting a B cell in a monkey comprising administering to the monkey the antibody or antigen-binding portion thereof, thereby depleting the B cell. In some aspects, the B cell expresses CD19. In some aspects, the B cell expresses CD20. In some aspects, the B cell is from blood, bone marrow, spleen, mesenteric lymph node, or mandibular lymph node. In some aspects, the antibody or antigen-binding portion thereof provides a half maximum plasma concentration in about 40.9 h to about 92.9 h (T1 / 2) in a monkey 5 days after intravenous administration at a dose of about 1.5 mg / kg. In some aspects, the antibody or antigen-binding portion thereof provides a maximum plasma concentration (Cmax) of about 50.8 μg / ml to about 74.4 μg / ml in a monkey 5 days after intravenous administration at a dose of about 1.5 mg / kg. In some aspects, the antibody or antigen-binding portion thereof provides an area under the curve up to the last quantifiable time-point (AUC0-t) of about 2051 h*μg / ml to about 3225 h*ug / ml in a monkey 5 days after intravenous administration at a dose of about 1.5 mg / kg. In some aspects, the antibody or antigen-binding portion thereof provides a clearance rate of about 8.8 ml to about 13.3 ml per day per kilogram in a monkey 5 days after intravenous administration at a dose of about 1.5 mg / kg. In some aspects, the antibody or antigen-binding portion thereof provides a half maximum plasma concentration in about 22.3 h to about 61.2 h (T1 / 2) in a monkey 7 days after intravenous administration at a dose of about 1.5 mg / kg. In some aspects, the antibody or antigen-binding portion thereof provides a maximum plasma concentration (Cmax) of about 50.8 ug / ml to about 74.4 μg / ml in a monkey 7 days after intravenous administration at a dose of about 1.5 mg / kg. In some aspects, the antibody or antigen-binding portion thereof provides an area under the curve up to the last quantifiable time-point (AUC0-t) of about 2202 h*μg / ml to about 3331 h*ug / ml in a monkey 7 days after intravenous administration at a dose of about 1.5 mg / kg. In some aspects, the antibody or antigen-binding portion thereof provides a clearance rate of about 10.8 ml to about 16.1 ml per day per kilogram in a monkey 7 days after intravenous administration at a dose of about 1.5 mg / kg. In some aspects, the intravenous administration is intravenous infusion over about 45 min. In some aspects, the monkey is a cynomolgus monkey. In some aspects, the antibody or antigen-binding portion thereof provides a half maximum plasma concentration in about 145 h (T1 / 2) in a rat after intravenous administration at a dose of about 10 mg / kg. In some aspects, the antibody or antigen-binding portion thereof provides a maximum plasma concentration (Cmax) of about 227 μg / ml in a rat after intravenous administration at a dose of about 10 mg / kg. In some aspects, the antibody or antigen-binding portion thereof provides an area under the curve up to the last quantifiable time-point (AUC0-t) of about 20173 h*ug / ml in a rat after intravenous administration at a dose of about 10 mg / kg. In some aspects, the antibody or antigen-binding portion thereof provides a clearance rate of about 10.9 ml per day per kilogram in rat after intravenous administration at a dose of about 10 mg / kg.

[0016] The foregoing is a summary and thus contains, by necessity, simplifications, generalizations, and omissions of detail; consequently, those skilled in the art will appreciate that the summary is illustrative only and is not intended to be in any way limiting. This summary is not intended to identify key features or essential features of the claimed subject matter, nor is it intended to be used as an aid in determining the scope of the claimed subject matter. BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES

[0017] FIG. 1 shows a schematic representation of the trispecific antibodies disclosed herein (I27 format) . The CD19 binding moiety, the CD3 binding moiety and the CD20 binding moiety are exemplified in Fab formats, including chimeric Fabs comprising TCR constant domains instead of antibody constant domains fused with variable regions of an antibody. The rectangles indicate TCR constant domains, and the ovals indicate variable and constant domains of an antibody.

[0018] FIGs. 2-3 show SDS-PAGE (Fig. 2) and analytic SEC result (Fig. 3) of purified W333021 antibody.

[0019] FIGs. 4-8 show FACS binding result of the antibodies to Jurkat (Fig. 4) , WBP701-CHOK1-hpro1. B4 (Fig. 5) , WT1028-CHOK1-hPro1. FL. F7 (Fig. 6) , Raji (Fig. 7) , WBP701. cPro1. CHO-K1. C9 (Fig. 8, left panel) and WT1028-CHOK1-cPro1. FL. E4 (Fig. 8, right panel) cells. CD3 x CD20 (REGN1979) is the bispecific control antibody REGN1979. CD3 x CD19 (WuXi) is an internal bispecific control antibody. W333021 (mute CD19) is W333021-U0T3W2. I27-61. uIgG4V9; W333021 (mute CD20) is W333021-U8T3W0. I27-61. uIgG4V9.

[0020] FIG. 9 shows antibody induced T lymphocytes-mediated killing on Raji and Nalm-6 cells.

[0021] FIGs. 10-11 show antibody induced T cell activation on Raji cells (Fig. 10) and Nalm-6 cells (Fig. 11) , evaluated by the release of cytokines.

[0022] FIGs. 12-14 show DSF (Fig. 12) , HIC-HPLC (Fig. 13) and DLS-kD (Fig. 14) results of the W333021 antibody.

[0023] FIG. 15 shows the concentration curve of W333021 antibody in rat plasma.

[0024] FIG. 16 shows a summary of tumor volume during treatment with different antibodies. Arrows indicate the dosing time.

[0025] FIG. 17 shows body weight in control and W333021 antibody treated groups.

[0026] FIG. 18 shows an example of the PK &ELISA method for CD3 and CD19.

[0027] FIGs. 19A-19B depict the antibody concentration (ug / mL) over five days.

[0028] FIGs. 20A-20B depict the antibody concentration (ug / mL) over seven days.

[0029] FIG. 21 shows an example of the method of capturing the antibody concentration of cyno blood.

[0030] FIG. 22A depicts the antibody concentration of CD3 on cynomolgus monkey blood mean MFI.

[0031] FIG. 22B depicts the antibody concentration of CD20 on cynomolgus monkey blood mean MFI.

[0032] FIGs. 23A-B show an example of gating of B cells in blood before and after treatment.

[0033] FIGs. 24A-B show an example of gating of B cells in bone marrow before and after treatment.

[0034] FIGs. 25A-B show an example of gating of B cells in mesenteric lymph node before and after treatment.

[0035] FIGs. 26A-B shows an example of gating of B cells in mandibular lymph node before and after treatment.

[0036] FIGs. 27A-B show an example of gating of B cells in the spleen before and after treatment.

[0037] FIGs. 28A-B show an example of gating of T cells in blood before and after treatment.

[0038] FIGs. 29A-B show an example of gating of T cells in bone marrow before and after treatment.

[0039] FIGs. 30A-B show an example of gating of T cells in mesenteric lymph node before and after treatment.

[0040] FIGs. 31A-B show an example of gating of T cells in the mandibular lymph node before and after treatment.

[0041] FIGs. 32A-B show an example of gating of T cells in the spleen before and after treatment.

[0042] FIGs. 33A-B depict cell count of in blood after RBC lysis before and after treatment.

[0043] FIGs. 34A-B depict cell count in bone marrow after RBC lysis before and after treatment.

[0044] FIG. 35 depicts cell count of lymphocytes, T cells, and B cells seven days after treatment.

[0045] FIGs. 36A-B depict cell count in blood after RBC lysis before and after treatment.

[0046] FIGs. 37A-B depicts cell count in bone marrow after RBC lysis before and after treatment.

[0047] FIG. 38 depicts the concentration of cytokine profile after treatment.

[0048] FIG. 39 depicts the steps for preparing the tissue for H&E staining.

[0049] FIG. 40 depicts normal spleen tissue via H&E staining.

[0050] FIG. 41 depicts normal lymph node tissue via H&E staining.

[0051] FIG. 42 depicts normal spleen tissue via H&E staining.

[0052] FIG. 43 depicts normal lymph node tissue via H&E staining.

[0053] FIG. 44 depicts the steps for preparing normal tissue for IHC staining.

[0054] FIG. 45 depicts normal cynomolgus monkey spleen using IHC with anti-CD20 antibodies.

[0055] FIG. 46 depicts the steps for preparing treated tissue for IHC staining.

[0056] FIG. 47 depicts treated cynomolgus monkey spleen using IHC with anti-CD20 antibodies.

[0057] FIG. 48 depicts the steps for preparing tissue for CD20 IHC staining.

[0058] FIG. 49 depicts normal cynomolgus monkey spleen and lymph nodes using IHC with anti-CD20 antibodies.

[0059] FIG. 50 depicts treated cynomolgus monkey spleen and lymph nodes using IHC with anti-CD20 antibodies.

[0060] FIG. 51 depicts the steps for preparing tissue for CD19 IHC staining.

[0061] FIG. 52 depicts normal cynomolgus monkey spleen and lymph node using IHC with anti-CD19 antibodies.

[0062] FIG. 53 depicts treated cynomolgus monkey spleen and lymph node in monkey #1 using IHC with anti-CD19 antibodies.

[0063] FIG. 54 depicts treated cynomolgus monkey spleen and lymph node in monkey #2 using IHC with anti-CD19 antibodies.

[0064] FIG. 55 depicts the yield and purity of the antibody.

[0065] FIG. 56 shows a graphical illustration of antibody radius over DLS temperature.

[0066] FIG. 57 shows an example of antibody stability at Day 0, Day 14, and Day 28.

[0067] FIG. 58 shows an example of antibody stability after 0 freeze -thaw cycles.

[0068] FIG. 59 shows an example of antibody stability after 5 freeze-thaw cycles.

[0069] FIG. 60 shows a graphical illustration of the DOHH-2 cell line tested for cytotoxicity, IFN-y, TBNF-a, and IL-6.

[0070] FIG. 61 shows a graphical illustration of WSU-DLCL2 cell line tested for cytotoxicity, IFN-y, TNF-a, and IL-6.

[0071] FIG. 62 shows a graphical illustration of Raji cell line tested for cytotoxicity, IFN-y, TNF-a, and IL-6

[0072] FIG. 63 shows a graphical illustration of Nalm-6 cell line tested for cytotoxicity, IFN-y, TNF-a, and IL-6.

[0073] FIG. 64 shows a graphical illustration of the DOHH-2 cell line tested for cytotoxicity, IFN-y, TNF-a, and IL-6.

[0074] FIG. 65 shows a graphical illustration of WSU-DLCL2 cell line tested for cytotoxicity, IFN-y, TNF-a, and IL-6.

[0075] FIG. 66 shows a graphical illustration of Raji cell line tested for cytotoxicity, IFN-y, TNF-a, and IL-6.

[0076] FIG. 67 shows a graphical illustration of Nalm-6 cell line tested for cytotoxicity, IFN-y, TNF-a, and IL-6

[0077] FIG. 68 shows a graphical illustration of the DOHH-2 cell line tested for cytotoxicity, IFN-y, TNF-a, and IL-6

[0078] FIG. 69 shows a graphical illustration of WSU-DLCL2 cell line tested for cytotoxicity, IFN-y, TNF-a, and IL-6.

[0079] FIG. 70 shows a graphical illustration of Raji cell line tested for cytotoxicity, IFN-y, TNF-a, and IL-6.

[0080] FIG. 71 shows a graphical illustration of Nalm-6 cell line tested for cytotoxicity, IFN-y, TNF-a, and IL-6.

[0081] FIGs. 72A-B show a graphical illustration of a primary human PBMC cytotoxicity assay.

[0082] FIG. 73 shows a graphical illustration of a primary cynomolgus monkey PBMC cytotoxicity assay.

[0083] FIG. 74 shows a graphical illustration of a cytotoxicity assay for CD20 low and CD19 low expression.

[0084] FIG. 75 shows a graphical illustration of a cytotoxicity assay for CD20 high and CD19 null expression.

[0085] FIG. 76 shows a graphical illustration of PBMC cytotoxicity assay at varying E: T ratios.

[0086] FIG. 77 shows graphical illustrations of Donor 1, Donor 2, and Donor 3 up to 14 days after treatment with antibody and Mosunetzumab.

[0087] FIGs. 78A-B shows a graphical illustration of human and cynomolgus monkey CD19 / CD20 expression by FACS.

[0088] FIG. 79 shows graphical illustrations of binding to Raji (CD19+CD20+) and Jurkat (CD3+) cells.DETAILED DESCRIPTION

[0089] This application generally relates to antibodies. More specifically, the application relates to multi-specific antibodies and polypeptide complexes that bind cluster of differentiation 3 (CD3) , cluster of differentiation 19 (CD19) and cluster of differentiation 20 (CD20) , a method of preparing the same, and the uses thereof.

[0090] Human CD19 is a type I transmembrane protein belonging to the immunoglobulin superfamily (Carter et al., Curr Dir Autoimmun, 7: 4–32 (2004) ) . It is expressed on most B cells, but not detected on plasma cells, stem cells, or on normal myeloid lineage (Tedder, Nat Rev Rheumatol, 5 (10) : 572–577 (2009) ) . CD19 is critically involved in establishing intrinsic B cell signaling thresholds through modulating both B cell receptor (BCR) -dependent and independent signaling (Wang et al., Experimental Hematology &Oncology, 1: 36 (2012) ) . CD19 has broader expression than CD20. The pattern of CD19 expression is maintained in B-cell malignancies, covering all subtypes of B-cell lymphoma, from indolent to aggressive forms, as well as B-cell chronic lymphocytic leukemia and non-T acute lymphoblastic leukemia, and allows the targeting of tumor indications of early B cells, such as acute lymphoblastic leukemia (ALL) , which cannot be targeted by Rituximab. Several CD19 monoclonal antibodies have been explored for lymphoma therapy (U.S. Patent Application Publication No. 20140072587 A1, U.S. Patent No. 8,242,252 B2, and U.S. Patent No. 8,097,703 B2) .

[0091] The human CD20 is an activated-glycosylated phosphoprotein expressed on the surface of B lymphocytes. Antibody therapy with Rituximab, a chimeric anti-CD20 monoclonal antibody approved by FDA in 1997, represents one of the most important progresses in the treatment of lymphoproliferative disorders in the last 30 years. Particularly, in combination with various chemotherapy / radiotherapy regimes, Rituximab has significantly improved all aspects of the survival statistics of B cell lymphoma and chronic lymphoid lymphoma (CLL) patients (Chu et al., Theranostics, 5 (8) : 834-46 (2015) ) .

[0092] The CD3 T-cell co-receptor is a protein complex composed of four distinct chains, a CD3gamma chain, a CD3delta chain, and two CD3epsilon chains. The four chains associate with a molecule known as T-cell receptor (TCR) and the zeta-chain to generate activation signal in T lymphocytes. The TCR, zeta chain, and CD3 molecules compose the TCR complex, in which TCR as a subunit recognizes and binds to antigen, and CD3 as a subunit transfer and conveys the antigen stimulation to signaling pathway, and ultimately regulates T-cell activity. The CD3 protein is present in virtually all T cells. The CD3-TCR complex modulates T cell functions in both innate and adoptive immune response, as well as cellular and humoral immune functions. These include eliminating pathogenic organisms and controlling tumor growth by broad range of cytotoxic effects. Mouse monoclonal antibodies specific for human CD3, such as OKT3 (Kung et al., Science, 206: 347-9 (1979) ) , were the first generation CD3 antibodies developed for treatment. Although OKT3 has strong immunosuppressive potency, its clinical use was hampered by serious side effects linked to its immunogenic and mitogenic potentials (Chatenoud, Nature Reviews, 3: 123-132 (2003) ) . OKT3 induced an anti-globulin response, promoting its own rapid clearance and neutralization (Chatenoud et al., Eur. J. Immunol., 12: 979-82 (1982) ) . In addition, OKT3 induced T-cell proliferation and cytokine production in vitro, led to a large-scale release of cytokine in vivo (Hirsch et al., J. Immunol, 142: 737-43 (1989) ) . Such serious side effects limited the more widespread use of OKT3 in transplantation as well as the extension of its use to other clinical fields such as autoimmunity.

[0093] A trispecific antibody targeting CD3 and CD19 / CD20 can bind to T cells and B cells simultaneously. Once the trispecific antibody binds to a CD3-positive T cell and a CD19 / CD20-positive B cell, a cytolytic synapse is formed. Cytotoxicity is then induced by the release of perforin and granzymes from granules in the cytotoxic T cell, the latter inducing apoptosis and lysis of the malignant B cell. Therefore, there is a strong need for such trispecific antibodies.

[0094] While the present disclosure may be embodied in many different forms, disclosed herein are specific illustrative embodiments thereof that exemplify the principles of the invention. It should be emphasized that the present invention is not limited to the specific embodiments illustrated. Moreover, any section headings used herein are for organizational purposes only and are not to be construed as limiting the subject matter described.

[0095] Unless otherwise defined herein, scientific and technical terms used in connection with the present disclosure shall have the meanings that are commonly understood by those of ordinary skill in the art. Further, unless otherwise required by context, singular terms shall include pluralities and plural terms shall include the singular. More specifically, as used in this specification and the appended claims, the singular forms “a” , “an” and “the” include plural referents unless the context clearly dictates otherwise. Thus, for example, reference to “a protein” includes a plurality of proteins; reference to “a cell” includes mixtures of cells, and the like. In this application, the use of “or” means “and / or” unless stated otherwise. Furthermore, the use of the term “comprising, ” as well as other forms, such as “comprises" and “comprised, ” is not limiting. In addition, ranges provided in the specification and appended claims include both end points and all points between the end points.

[0096] Generally, nomenclature used in connection with, and techniques of, cell and tissue culture, molecular biology, immunology, microbiology, genetics and protein and nucleic acid chemistry and hybridization described herein are those well-known and commonly used in the art. The methods and techniques of the present disclosure are generally performed according to conventional methods well known in the art and as described in various general and more specific references that are cited and discussed throughout the present specification unless otherwise indicated. See, e.g., Abbas et al., Cellular and Molecular Immunology, 6th ed., W.B. Saunders Company (2010) ; Sambrook J. &Russell D. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2000) ; Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, John &Sons, Inc. (2002) ; Harlow and Lane Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1998) ; and Coligan et al., Short Protocols in Protein Science, Wiley, John &Sons, Inc. (2003) . The nomenclature used in connection with, and the laboratory procedures and techniques of, analytical chemistry, synthetic organic chemistry, and medicinal and pharmaceutical chemistry described herein are those well-known and commonly used in the art. Definitions

[0097] In order to better understand the disclosure, the definitions and explanations of the relevant terms are provided as follows.

[0098] The terms “antibody” and “polypeptide complex” can be used interchangeably herein and encompass various antibody structures, including but not limited to monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, humanized antibodies, fully human antibodies, chimeric antibodies, multi-specific antibodies and antibody fragments, so long as they exhibit the desired antigen-binding activity. Antibody generally comprises heavy (H) and light (L) polypeptide chains held together by covalent disulfide bonds and non-covalent interactions. Light chains of an antibody may be classified into κ and λ light chain. Heavy chains may be classified into μ, δ, γ, α and ε, which define isotypes of an antibody as IgG (e.g., IgG1, IgG2, IgG3 or IgG4 subtype) , IgA1, IgA2, IgD, IgE or IgM, respectively. For a classical antibody, each heavy chain comprises a heavy chain variable region (VH) and a heavy chain constant region (CH) , and each light chain comprises a light chain variable region (VL) and a light chain constant region (CL) . VH and VL regions can further be divided into hypervariable regions (called complementary determining regions (CDR) ) , which are interspaced by relatively conservative regions (called framework region (FR) ) . Each VH and VL consists of 3 CDRs and 4 FRs in the following order: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4 from N-terminal to C-terminal. The variable region (VH and VL) of each heavy / light chain pair forms antigen binding sites, respectively. A heavy chain constant region comprises 3 domains (CH1, CH2 and CH3) . A light chain constant region comprises a CL domain. When constructing a multispecific (e.g. trispecific or bispecific) antibody, depending on the format, it is not always for the VH region to be in the heavy chain and the VL region to be in the light chain of the polypeptide complex. As used herein, a heavy chain of the polypeptide complex refers to the Fc comprising chain, a light chain of the polypeptide complex refers to the chain without a Fc domain which is much shorter than the heavy chain. In some embodiments, the heavy chain comprises a VH of the first antigen-binding moiety and a VL of the second antigen-binding moiety. In some embodiments, the heavy chain comprises a VL of the first antigen-binding moiety and a VH of the second antigen-binding moiety.

[0099] The term “antigen-binding portion” or “antigen-binding fragment” of an antibody or polypeptide complex refers to polypeptides comprising fragments of a full-length antibody, which retain the ability of specifically binding to an antigen (s) that the full-length antibody specifically binds to, and / or compete with the full-length antibody for binding to the same antigen (s) . Generally, see Fundamental Immunology, Ch. 7 (Paul, W., ed., the second edition, Raven Press, N. Y. (1989) , incorporated herein by reference for all purposes. Antigen binding fragments of an antibody may be produced by recombinant DNA techniques or by enzymatic or chemical cleavage of an intact antibody. Under some conditions, antigen binding fragments include Fab, Fab', Fab'-SH, F (ab') 2, Fd, Fv, dAb and complementary determining region (CDR) fragments, single chain antibody (e.g. scFv) , chimeric antibody, diabody and such polypeptides that comprise at least part of antibody sufficient to confer the specific antigen binding ability on the polypeptides. Antigen binding fragments of an antibody may be obtained from a given antibody (e.g., the multi-specific anti-CD3 x CD19 x CD20 antibody provided herein) by conventional techniques known by a person skilled in the art (e.g., recombinant DNA technique or enzymatic or chemical cleavage methods) , and may be screened for specificity in the same manner by which intact antibodies are screened.

[0100] The term “antigen-binding moiety” as used herein refers to an antibody fragment formed from a portion of an antibody comprising one or more CDRs, or any other antibody fragment that binds to an antigen but does not comprise an intact native antibody structure. Examples of antigen-binding moiety include, without limitation, a variable domain, a variable region, a diabody, a Fab, a Fab', a F (ab') 2, an Fv fragment, a single chain Fv fragment (scFv) , a disulfide stabilized Fv fragment (dsFv) , a (dsFv) 2, a bispecific dsFv (dsFv-dsFv') , a disulfide stabilized diabody (ds diabody) , a multispecific antibody, a camelized single domain antibody, a single variable domain (i.e. VHH) , a nanobody, a domain antibody, and a bivalent domain antibody. An antigen-binding moiety is capable of binding to the same antigen to which the parent antibody binds. More detailed formats of antigen-binding moiety are described in Spiess et al, (2015) Molecular Immunology 67: 95-106, and Brinkman et al., mAbs, 9 (2) , pp. 182–212 (2017) , which are incorporated herein by their entirety. The terms “CD3 binding moiety” and “anti-CD3 moiety” and similar terminology have the meaning herein.

[0101] “Fab” with regard to an antibody refers to that portion of the antibody consisting of a single light chain (both variable and constant regions) associating to the variable region and first constant region of a single heavy chain by a disulfide bond. In certain embodiments, the constant regions of both the light chain and heavy chain of the Fab may be replaced with TCR constant regions Cα and Cβ or engineered variants thereof.

[0102] “Fc” (short for fragment, crystallizable) with regard to an antibody refers to that portion of the antibody comprising the second (CH2) and third (CH3) constant regions of a first heavy chain bound to the second and third constant regions of a second heavy chain via disulfide bonding. Fc is a specific dimerization domain. The Fc region as used herein may also comprise part or whole of the hinge region. The Fc region of the antibody is responsible for various effector functions such as ADCC and CDC, but generally does not function in antigen binding. The capacity of antibodies to initiate and regulate effector functions through their Fc domain is a key component of their in vivo protective activity. Although the neutralizing activity of antibodies has been previously considered to be solely the outcome of Fab-antigen interactions, it has become apparent that their in vivo activity is highly dependent on interactions of the IgG Fc domain with its cognate receptors, Fcγ receptors (FcγRs) , expressed on the surface of effector leukocytes.

[0103] The terms “operably link” and “operably linked” refer to a juxtaposition, with or without a spacer or linker, of two or more biological sequences of interest in such a way that they are in a relationship permitting them to function in an intended manner. When used with respect to polypeptides, it is intended to mean that the polypeptide sequences are linked in such a way that permits the linked product to have the intended biological function. For example, an antibody variable region may be operably linked to a constant region so as to provide for a stable product with antigen-binding activity. The term may also be used with respect to polynucleotides. For one instance, when a polynucleotide encoding a polypeptide is operably linked to a regulatory sequence (e.g., promoter, enhancer, silencer sequence, etc. ) , it is intended to mean that the polynucleotide sequences are linked in such a way that permits regulated expression of the polypeptide from the polynucleotide. The term operably linked, when used herein to describe domains linked to form a polypeptide, can be represented by a “-” , and can refer to a direct linkage between domains or linkage via a linker comprising 1-30 amino acids in length, such as a single amino acid or a series of (G4S) n linker, with n=1-5 (1, 2, 3, 4, or 5) (SEQ ID NO: 52) .

[0104] The term “chimeric antibody” , as used herein, refers to an antibody in which the variable region sequences are derived from one species and the constant region sequences are derived from another species, such as an antibody in which the variable region sequences are derived from mouse germline and the constant region sequences are derived from human germline.

[0105] The term “humanized antibody” , as used herein, refers to antibodies in which CDR sequences derived from the germline of another mammalian species, such as a rat or mouse, have been grafted onto human framework sequences. Additional framework region modifications may be made within the human framework sequences. The humanized antibody optionally will also comprise at least a portion of an immunoglobulin constant region (Fc) , typically that of a human immunoglobulin.

[0106] The term “human antibody” or “fully human antibody, ” as used herein, is intended to include antibodies having variable regions in which both the framework and CDR regions are derived from human germline immunoglobulin sequences. Furthermore, if the antibody contains a constant region, the constant region also is derived from human germline immunoglobulin sequences.

[0107] The term “CD3 x CD19 x CD20 antibody” or “anti-CD3 x CD19 x CD20 antibody” , as used herein, refers to a trispecific antibody that comprises three different antigen-binding moieties, binding specifically to the antigen CD3, CD19 and CD20, respectively.

[0108] The term “cluster of differentiation 3” or “CD3” , as used herein, refers to any native CD3 from any vertebrate source, including mammals such as primates (e.g. humans) and rodents (e.g., mice and rats) , unless otherwise indicated, including, for example, CD3ε, CD3γ, CD3δ, and CD3ζ chains. The term encompasses “full-length” unprocessed CD3 (e.g., unprocessed or unmodified CD3E or CD3y) , as well as any form of CD3 that results from processing in the cell and naturally occurring variants of CD3, including, for example, splice variants or allelic variants.

[0109] The term “cluster of differentiation 20” or “CD20” as used herein is also called human B-lymphocyte-restricted differentiation antigen (Bp35) . It is a hydrophobic transmembrane protein located on pre-B and mature B lymphocytes (Valentine et al. J. Biol. Chem. 264 (19) : 11282-11287 (1989) ; and Einfeld et al. EMBO J. 7 (3) : 711-717 (1988) ) . The antigen is also expressed on greater than 90%of B-cell non-Hodgkin's lymphomas (NHL) . CD20 regulates an early step (s) in the activation process for cell cycle initiation and differentiation and possibly functions as a calcium ion channel. The term encompasses “full-length” unprocessed CD20, as well as any form of CD20 that results from processing in the cell and naturally occurring variants of CD20, including, for example, splice variants or allelic variants.

[0110] The term “cluster of differentiation 19” or “CD19” as used herein is a transmembrane protein that in humans is expressed in all B lineage cells. CD19 is a biomarker for normal and neoplastic B cells, as well as follicular dendritic cells. CD19 is critically involved in establishing intrinsic B cell signaling thresholds through modulating both B cell receptor-dependent and independent signaling. CD19 functions as the dominant signaling component of a multimolecular complex on the surface of mature B cells, alongside complement receptor CD21, and the tetraspanin membrane protein CD81 (TAPA-1) , as well as CD225. Due to its presence on all B cells, it is a biomarker for B lymphocyte development, lymphoma diagnosis and can be utilized as a target for leukemia immunotherapies.

[0111] The term “Ka” , as used herein, is intended to refer to the association rate of a particular antibody-antigen interaction, whereas the term “Kd” as used herein, is intended to refer to the dissociation rate of a particular antibody-antigen interaction. The term “KD” as used herein, is intended to refer to the dissociation constant of a particular antibody-antigen interaction, which is obtained from the ratio of Kd to Ka (i.e., Kd / Ka) and is expressed as a molar concentration (M) . A preferred method for determining the KD of an antibody is by using surface plasmon resonance, preferably using a biosensor system such as a  system.

[0112] The term “EC50, ” as used herein, which is also termed as “half maximal effective concentration” refers to the concentration of a drug, antibody or toxicant which induces a response halfway between the baseline and maximum after a specified exposure time. In the context of the application, EC50 is expressed in the unit of “nM” or “M” .

[0113] The term “isolated, ” as used herein, refers to a state obtained from natural state by artificial means. If a certain “isolated” substance or component is present in nature, it is possible because its natural environment changes, or the substance is isolated from natural environment, or both. For example, a certain un-isolated polynucleotide or polypeptide naturally exists in a certain living animal body, and the same polynucleotide or polypeptide with a high purity isolated from such a natural state is called isolated polynucleotide or polypeptide. The term “isolated” excludes neither the mixed artificial or synthesized substance nor other impure substances that do not affect the activity of the isolated substance.

[0114] The term “vector, ” as used herein, refers to a nucleic acid vehicle which can have a polynucleotide inserted therein. When the vector allows for the expression of the protein encoded by the polynucleotide inserted therein, the vector is called an expression vector. The vector can have the carried genetic material elements expressed in a host cell by transformation, transduction, or transfection into the host cell. Vectors are well known by a person skilled in the art, including, but not limited to plasmids, phages, cosmids, artificial chromosome such as yeast artificial chromosome (YAC) , bacterial artificial chromosome (BAC) or P1-derived artificial chromosome (PAC) ; phage such as λ phage or M13 phage and animal virus. The animal viruses that can be used as vectors, include, but are not limited to, retrovirus (including lentivirus) , adenovirus, adeno-associated virus, herpes virus (such as herpes simplex virus) , pox virus, baculovirus, papillomavirus, papova virus (such as SV40) . A vector may comprise multiple elements for controlling expression, including, but not limited to, a promoter sequence, a transcription initiation sequence, an enhancer sequence, a selection element and a reporter gene. In addition, a vector may comprise origin of replication.

[0115] The term “host cell, ” as used herein, refers to a cellular system which can be engineered to generate proteins, protein fragments, or peptides of interest. Host cells include, without limitation, cultured cells, e.g., mammalian cultured cells derived from rodents (rats, mice, guinea pigs, or hamsters) such as CHO, BHK, NSO, SP2 / 0, YB2 / 0; or human tissues or hybridoma cells, yeast cells, and insect cells, and cells comprised within a transgenic animal or cultured tissue. The term encompasses not only the particular subject cell but also the progeny of such a cell. Because certain modifications may occur in succeeding generations due to either mutation or environmental influences, such progeny may not be identical to the parent cell, but are still included within the scope of the term “host cell. ”

[0116] The term “identity, ” as used herein, refers to a relationship between the sequences of two or more polypeptide molecules or two or more nucleic acid molecules, as determined by aligning and comparing the sequences. “Percent identity” means the percent of identical residues between the amino acids or nucleotides in the compared molecules and is calculated based on the size of the smallest of the molecules being compared. For these calculations, gaps in alignments (if any) are preferably addressed by a particular mathematical model or computer program (i.e., an “algorithm” ) . Methods that can be used to calculate the identity of the aligned nucleic acids or polypeptides include those described in Computational Molecular Biology, (Lesk, A.M., ed. ) , 1988, New York: Oxford University Press; Biocomputing Informatics and Genome Projects, (Smith, D.W., ed. ) , 1993, New York: Academic Press; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, (Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds. ) , 1994, New Jersey: Humana Press; von Heinje, G., 1987, Sequence Analysis in Molecular Biology, New York: Academic Press; Sequence Analysis Primer, (Gribskov, M. and Devereux, J., eds. ) , 1991, New York: M. Stockton Press; and Carillo et al, 1988, SIAMJ. Applied Math. 48: 1073.

[0117] Unless indicated otherwise, the “percent sequence identity” between a reference amino acid sequence and a query amino sequence (i.e., the amino sequence being analyzed to determine whether it is within a particular percent sequence identity with the reference amino acid sequence) is determined by optimally aligning the sequences using the Needleman-Wunsch alignment algorithm with a gap existence penalty of 11 and a gap extension penalty of 1 and comparing the sequences. The number of exact matches, divided by the total number of positions in the alignment (which corresponds with the number of amino acids in the reference sequence plus any gaps in the reference sequence when aligned with the query sequence) is determined and expressed as a percentage. This is the percent sequence identity between the query amino acid sequence and the reference amino acid sequence (i.e., percent sequence identity = (#of exact matches /  (total #of positions in alignment) *100) . An alignment using the Needleman-Wunsch alignment algorithm (with a gap existence penalty of 11 and a gap extension penalty of 1) can be generated using the “Global Align” BLAST program available at https:  / / blast. ncbi. nlm. nih. gov / Blast. cgi.

[0118] Unless indicated otherwise, the “percent sequence identity” between a reference nucleic acid sequence and a query nucleic acid sequence (i.e., the nucleic acid sequence being analyzed to determine whether it is within a particular percent sequence identity with the reference nucleic acid sequence) is determined by optimally aligning the sequences using the Needleman-Wunsch alignment algorithm (with match / mismatch scores of 2, -3, a gap existence penalty of 5, and a gap extension penalty of 2) and comparing the aligned nucleic acids. The number of exact matches divided by the total number of nucleotides in the alignment (which corresponds with the number of nucleotides in the reference sequence plus any gaps in the reference sequence when aligned with the query sequence) is determined and expressed as a percentage. This is the percent sequence identity between the query nucleic acid sequence and the reference nucleic acid sequence (i.e., percent sequence identity = (#of exact matches)  /  (total #of nucleotides in the alignment) *100) . An alignment using the Needleman-Wunsch alignment algorithm (with match / mismatch scores of 2, -3, a gap existence penalty of 5, and a gap ex-tension penalty of 2) can be generated using the “Global Align” BLAST program available at https:  / / blast. ncbi. nlm. nih. gov / Blast. cgi.

[0119] The term “immunogenicity, ” as used herein, refers to ability of stimulating the formation of specific antibodies or sensitized lymphocytes in organisms. It not only refers to the property of an antigen to stimulate a specific immunocyte to activate, proliferate and differentiate so as to finally generate immunologic effector substance such as antibody and sensitized lymphocyte, but also refers to the specific immune response that antibody or sensitized T lymphocyte can be formed in immune system of an organism after stimulating the organism with an antigen. Immunogenicity is the most important property of an antigen. Whether an antigen can successfully induce the generation of an immune response in a host depends on three factors, properties of an antigen, reactivity of a host, and immunization means.

[0120] The term “transfection, ” as used herein, refers to the process by which nucleic acids are introduced into eukaryoticcells, particularly mammalian cells. Protocols and techniques for transfection include but not limited to lipid transfection and chemical and physical methods such as electroporation. A number of transfection techniques are well known in the art and are disclosed herein. See, e.g., Graham et al., 1973, Virology 52: 456; Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, supra; Davis et al., 1986, Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier; Chu et al, 1981, Gene 13: 197. In a specific embodiment of the invention, human CD3 gene was transfected into CHO cells.

[0121] The term “fluorescence-activated cell sorting” or “FACS, ” as used herein, refers to a specialized type of flow cytometry. It provides a method for sorting a heterogeneous mixture of biological cells into two or more containers, one cell at a time, based upon the specific light scattering and fluorescent characteristics of each cell (FlowMetric. “Sorting Out Fluorescence Activated Cell Sorting” . Retrieved 2017-11-09. ) . Instruments for carrying out FACS are known to those of skill in the art and are commercially available to the public. Examples of such instruments include FACS Star Plus, FACScan and FACSort instruments from Becton Dickinson (Foster City, Calif. ) Epics C from Coulter Epics Division (Hialeah, Fla. ) and MoFlo from Cytomation (Colorado Springs, Colo. ) .

[0122] The terms “subject” and “patient” are used interchangeably and include mammals such as humans and non-human primates, as well as rabbits, rats, mice, goats, pigs, and other mammalian species. The term does not necessarily indicate that the subject has been diagnosed with a particular disease, but typically refers to an individual under medical supervision.

[0123] The term “prevent, ” “prevention” or “preventing, ” as used herein, with reference to a certain disease condition in a mammal, refers to preventing or delaying the onset of the disease, or preventing the manifestation of clinical or subclinical symptoms thereof.

[0124] The term “treatment, ” “treating” or “treated, ” as used herein in the context of treating a condition, pertains generally to treatment and therapy, whether of a human or an animal, in which some desired therapeutic effect is achieved, for example, the inhibition of the progress of the condition, and includes a reduction in the rate of progress, a halt in the rate of progress, regression of the condition, amelioration of the condition, and cure of the condition. For cancer, “treating” may refer to dampen or slow the tumor or malignant cell growth, proliferation, or metastasis, or some combination thereof.

[0125] The term “an effective amount, ” as used herein, pertains to that amount of an active compound, or a material, composition or dosage form comprising an active compound, which is effective for producing some desired therapeutic effect, commensurate with a reasonable benefit / risk ratio, when administered in accordance with a desired treatment regimen. For instance, the “an effective amount, ” when used in connection with treatment of a disease or condition, refers to an antibody or antigen-binding portion thereof in an amount or concentration effective to treat the said disease or condition.

[0126] The term “pharmaceutically acceptable, ” as used herein, means that the vehicle, diluent, excipient and / or salts thereof, are chemically and / or physically is compatible with other ingredients in the formulation, and the physiologically compatible with the recipient.

[0127] As used herein, the term “a pharmaceutically acceptable carrier and / or excipient” refers to a carrier and / or excipient pharmacologically and / or physiologically compatible with a subject and an active agent, which is well known in the art (see, e.g., Remington's Pharmaceutical Sciences. Edited by Gennaro AR, 19th ed. Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1995) , and includes, but is not limited to pH adjuster, surfactant, adjuvant and ionic strength enhancer. For example, the pH adjuster includes, but is not limited to, phosphate buffer; the surfactant includes, but is not limited to, cationic, anionic, or non-ionic surfactant, e.g., Tween-80; the ionic strength enhancer includes, but is not limited to, sodium chloride.

[0128] As used herein, the term “adjuvant” refers to a non-specific immunopotentiator, which can enhance immune response to an antigen or change the type of immune response in an organism when it is delivered together with the antigen to the organism or is delivered to the organism in advance. There are a variety of adjuvants, including, but not limited to, aluminium adjuvants (for example, aluminum hydroxide) , Freund’s adjuvants (for example, Freund’s complete adjuvant and Freund’s incomplete adjuvant) , coryne bacterium parvum, lipopolysaccharide, cytokines, and the like. Freund's adjuvant is the most commonly used adjuvant in animal experiments now. Aluminum hydroxide adjuvant is more commonly used in clinical trials. Multispecific Antibody

[0129] In some embodiments, disclosed herein, is an antibody or antigen-binding portion thereof that acts as T cell engager. In some embodiments, disclosed herein, is an antibody or antigen-binding portion thereof that targets B cells and T cells. In some embodiments, disclosed herein, is an antibody or antigen-binding portion thereof that binds to cluster of differentiation (CD) 19, CD3 and CD20.

[0130] In some embodiments, disclosed herein, is an antibody or antigen-binding portion thereof, comprising a CD19 binding moiety, a CD3 binding moiety and a CD20 binding moiety, wherein: (a) the CD19 binding moiety comprises a heavy chain complementarity determining region (HCDR) 1, a HCDR2 and a HCDR3 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1, 2 and 3, respectively, and a light chain complementarity determining region (LCDR) 1, a LCDR2 and a LCDR3 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 4, 5 and 6, respectively; (b) the CD3 binding moiety comprises a HCDR1, a HCDR2 and a HCDR3 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 7, 8 and 9, respectively, and a LCDR1, a LCDR2 and a LCDR3 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 10, 11 and 12, respectively; and (c ) the CD20 binding moiety comprises a HCDR1, a HCDR2 and a HCDR3 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 13, 14 and 15, respectively, and a LCDR1, a LCDR2 and a LCDR3 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 16, 17 and 18, respectively. In some embodiments, (a) the CD19 binding moiety comprises a heavy chain variable region (CD19VH) and a light chain variable region (CD19VL) ; (b) the CD3 binding moiety comprises a heavy chain variable region (CD3VH) and a light chain variable region (CD3VL) ; and (c) the CD20 binding moiety comprises a heavy chain variable region (CD20VH) and a light chain variable region (CD20VL) . In some embodiments, the antibody or antigen-binding portion thereof further comprises a first binding arm and a second binding arm, wherein the first binding arm comprises the CD19 binding moiety and the CD3 binding moiety and the second binding arm comprises the CD20 binding moiety.

[0131] In some embodiments, the CD19VH comprises an amino acid sequence with about 70%to about 100%sequence identity to SEQ ID NO: 19, e.g., about 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or about 100%sequence identity, or any percentage there between. In some embodiments, the CD19VL comprises an amino acid sequence with about 70%to about 100%sequence identity to SEQ ID NO: 20, e.g., about 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or about 100%sequence identity, or any percentage there between. In some embodiments, the CD3VH comprises an amino acid sequence with about 70%to about 100%sequence identity to SEQ ID NO: 21, e.g., about 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or about 100%sequence identity, or any percentage there between. In some embodiments, the CD3VL comprises an amino acid sequence with about 70%to about 100%sequence identity to SEQ ID NO: 22, e.g., about 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or about 100%sequence identity, or any percentage there between. In some embodiments, the CD20VH comprises an amino acid sequence with about 70%to about 100%sequence identity to SEQ ID NO: 23, e.g., about 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or about 100%sequence identity, or any percentage there between. In some embodiments, the CD20VL comprises an amino acid sequence with about 70%to about 100%sequence identity to SEQ ID NO: 24, e.g., about 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or about 100%sequence identity, or any percentage there between. In some embodiments, (a) the CD19VH comprises an amino acid sequence with at least 70%sequence identity to SEQ ID NO: 19; (b) the CD19VL comprises an amino acid sequence with at least 70%sequence identity to SEQ ID NO: 20; (c) the CD3VH comprises an amino acid sequence with at least 70%sequence identity to SEQ ID NO: 21; (d) the CD3VL comprises an amino acid sequence with at least 70%sequence identity to SEQ ID NO: 22; (e) the CD20VH comprises an amino acid sequence with at least 70%sequence identity to SEQ ID NO: 23; or (f ) the CD20VL comprises an amino acid sequence with at least 70%sequence identity to SEQ ID NO: 24. In some embodiments, (a) the CD19VH comprises an amino acid sequence with at least 70%sequence identity to SEQ ID NO: 19; (b) the CD19VL comprises an amino acid sequence with at least 70%sequence identity to SEQ ID NO: 20; (c) the CD3VH comprises an amino acid sequence with at least 70%sequence identity to SEQ ID NO: 21; (d) the CD3VL comprises an amino acid sequence with at least 70%sequence identity to SEQ ID NO: 22; (e) the CD20VH comprises an amino acid sequence with at least 70%sequence identity to SEQ ID NO: 23; and (f ) the CD20VL comprises an amino acid sequence with at least 70%sequence identity to SEQ ID NO: 24. In some embodiments, (a) the CD19VH comprises an amino acid sequence with at least 75%sequence identity to SEQ ID NO: 19; (b) the CD19VL comprises an amino acid sequence with at least 75%sequence identity to SEQ ID NO: 20; (c) the CD3VH comprises an amino acid sequence with at least 75%sequence identity to SEQ ID NO: 21; (d) the CD3VL comprises an amino acid sequence with at least 75%sequence identity to SEQ ID NO: 22; (e) the CD20VH comprises an amino acid sequence with at least 75%sequence identity to SEQ ID NO: 23; or (f ) the CD20VL comprises an amino acid sequence with at least 75%sequence identity to SEQ ID NO: 24. In some embodiments, (a) the CD19VH comprises an amino acid sequence with at least 75%sequence identity to SEQ ID NO: 19; (b) the CD19VL comprises an amino acid sequence with at least 75%sequence identity to SEQ ID NO: 20; (c) the CD3VH comprises an amino acid sequence with at least 75%sequence identity to SEQ ID NO: 21; (d) the CD3VL comprises an amino acid sequence with at least 75%sequence identity to SEQ ID NO: 22; (e) the CD20VH comprises an amino acid sequence with at least 75%sequence identity to SEQ ID NO: 23; and (f ) the CD20VL comprises an amino acid sequence with at least 75%sequence identity to SEQ ID NO: 24. In some embodiments, (a) the CD19VH comprises an amino acid sequence with at least 80%sequence identity to SEQ ID NO: 19; (b) the CD19VL comprises an amino acid sequence with at least 80%sequence identity to SEQ ID NO: 20; (c) the CD3VH comprises an amino acid sequence with at least 80%sequence identity to SEQ ID NO: 21; (d) the CD3VL comprises an amino acid sequence with at least 80%sequence identity to SEQ ID NO: 22; (e) the CD20VH comprises an amino acid sequence with at least 80%sequence identity to SEQ ID NO: 23; or (f ) the CD20VL comprises an amino acid sequence with at least 80%sequence identity to SEQ ID NO: 24. In some embodiments, (a) the CD19VH comprises an amino acid sequence with at least 80%sequence identity to SEQ ID NO: 19; (b) the CD19VL comprises an amino acid sequence with at least 80%sequence identity to SEQ ID NO: 20; (c) the CD3VH comprises an amino acid sequence with at least 80%sequence identity to SEQ ID NO: 21; (d) the CD3VL comprises an amino acid sequence with at least 80%sequence identity to SEQ ID NO: 22; (e) the CD20VH comprises an amino acid sequence with at least 80%sequence identity to SEQ ID NO: 23; and (f ) the CD20VL comprises an amino acid sequence with at least 80%sequence identity to SEQ ID NO: 24. In some embodiments, (a) the CD19VH comprises an amino acid sequence with at least 85%sequence identity to SEQ ID NO: 19; (b) the CD19VL comprises an amino acid sequence with at least 85%sequence identity to SEQ ID NO: 20; (c) the CD3VH comprises an amino acid sequence with at least 85%sequence identity to SEQ ID NO: 21; (d) the CD3VL comprises an amino acid sequence with at least 85%sequence identity to SEQ ID NO: 22; (e) the CD20VH comprises an amino acid sequence with at least 85%sequence identity to SEQ ID NO: 23; or (f ) the CD20VL comprises an amino acid sequence with at least 85%sequence identity to SEQ ID NO: 24. In some embodiments, (a) the CD19VH comprises an amino acid sequence with at least 85%sequence identity to SEQ ID NO: 19; (b) the CD19VL comprises an amino acid sequence with at least 85%sequence identity to SEQ ID NO: 20; (c) the CD3VH comprises an amino acid sequence with at least 85%sequence identity to SEQ ID NO: 21; (d) the CD3VL comprises an amino acid sequence with at least 85%sequence identity to SEQ ID NO: 22; (e) the CD20VH comprises an amino acid sequence with at least 85%sequence identity to SEQ ID NO: 23; and (f ) the CD20VL comprises an amino acid sequence with at least 85%sequence identity to SEQ ID NO: 24. In some embodiments, (a) the CD19VH comprises an amino acid sequence with at least 86%sequence identity to SEQ ID NO: 19; (b) the CD19VL comprises an amino acid sequence with at least 86%sequence identity to SEQ ID NO: 20; (c) the CD3VH comprises an amino acid sequence with at least 86%sequence identity to SEQ ID NO: 21; (d) the CD3VL comprises an amino acid sequence with at least 86%sequence identity to SEQ ID NO: 22; (e) the CD20VH comprises an amino acid sequence with at least 86%sequence identity to SEQ ID NO: 23; or (f ) the CD20VL comprises an amino acid sequence with at least 86%sequence identity to SEQ ID NO: 24. In some embodiments, (a) the CD19VH comprises an amino acid sequence with at least 86%sequence identity to SEQ ID NO: 19; (b) the CD19VL comprises an amino acid sequence with at least 86%sequence identity to SEQ ID NO: 20; (c) the CD3VH comprises an amino acid sequence with at least 86%sequence identity to SEQ ID NO: 21; (d) the CD3VL comprises an amino acid sequence with at least 86%sequence identity to SEQ ID NO: 22; (e) the CD20VH comprises an amino acid sequence with at least 86%sequence identity to SEQ ID NO: 23; and (f ) the CD20VL comprises an amino acid sequence with at least 86%sequence identity to SEQ ID NO: 24. In some embodiments, (a) the CD19VH comprises an amino acid sequence with at least 87%sequence identity to SEQ ID NO: 19; (b) the CD19VL comprises an amino acid sequence with at least 87%sequence identity to SEQ ID NO: 20; (c) the CD3VH comprises an amino acid sequence with at least 87%sequence identity to SEQ ID NO: 21; (d) the CD3VL comprises an amino acid sequence with at least 87%sequence identity to SEQ ID NO: 22; (e) the CD20VH compri ses an amino acid sequence with at least 87%sequence identity to SEQ ID NO: 23; or (f ) the CD20VL comprises an amino acid sequence with at least 87%sequence identity to SEQ ID NO: 24. In some embodiments, (a) the CD19VH comprises an amino acid sequence with at least 87%sequence identity to SEQ ID NO: 19; (b) the CD19VL comprises an amino acid sequence with at least 87%sequence identity to SEQ ID NO: 20; (c) the CD3VH comprises an amino acid sequence with at least 87%sequence identity to SEQ ID NO: 21; (d) the CD3VL comprises an amino acid sequence with at least 87%sequence identity to SEQ ID NO: 22; (e) the CD20VH comprises an amino acid sequence with at least 87%sequence identity to SEQ ID NO: 23; and (f ) the CD20VL comprises an amino acid sequence with at least 87%sequence identity to SEQ ID NO: 24. In some embodiments, (a) the CD19VH comprises an amino acid sequence with at least 88%sequence identity to SEQ ID NO: 19; (b) the CD19VL comprises an amino acid sequence with at least 88%sequence identity to SEQ ID NO: 20; (c) the CD3VH comprises an amino acid sequence with at least 88%sequence identity to SEQ ID NO: 21; (d) the CD3VL comprises an amino acid sequence with at least v%sequence identity to SEQ ID NO: 22; (e) the CD20VH comprises an amino acid sequence with at least 88%sequence identity to SEQ ID NO: 23; or (f ) the CD20VL comprises an amino acid sequence with at least 88%sequence identity to SEQ ID NO: 24. In some embodiments, (a) the CD19VH comprises an amino acid sequence with at least 88%sequence identity to SEQ ID NO: 19; (b) the CD19VL comprises an amino acid sequence with at least 88%sequence identity to SEQ ID NO: 20; (c) the CD3VH comprises an amino acid sequence with at least 88%sequence identity to SEQ ID NO: 21; (d) the CD3VL comprises an amino acid sequence with at least 88%sequence identity to SEQ ID NO: 22; (e ) the CD20VH comprises an amino acid sequence with at least 88%sequence identity to SEQ ID NO: 23; and (f) the CD20VL comprises an amino acid sequence with at least 88%sequence identity to SEQ ID NO: 24. In some embodiments, (a) the CD19VH comprises an amino acid sequence with at least 89%sequence identity to SEQ ID NO: 19; (b) the CD19VL comprises an amino acid sequence with at least 89%sequence identity to SEQ ID NO: 20; (c) the CD3VH comprises an amino acid sequence with at least 89%sequence identity to SEQ ID NO: 21; (d) the CD3VL comprises an amino acid sequence with at least 89%sequence identity to SEQ ID NO: 22; (e) the CD20VH comprises an amino acid sequence with at least 89%sequence identity to SEQ ID NO: 23; or (f ) the CD20VL comprises an amino acid sequence with at least 89%sequence identity to SEQ ID NO: 24. In some embodiments, (a) the CD19VH comprises an amino acid sequence with at least 89%sequence identity to SEQ ID NO: 19; (b) the CD19VL comprises an amino acid sequence with at least 89%sequence identity to SEQ ID NO: 20; (c) the CD3VH comprises an amino acid sequence with at least 89%sequence identity to SEQ ID NO: 21; (d) the CD3VL comprises an amino acid sequence with at least 89%sequence identity to SEQ ID NO: 22; (e ) the CD20VH comprises an amino acid sequence with at least 89%sequence identity to SEQ ID NO: 23; and (f) the CD20VL comprises an amino acid sequence with at least 89%sequence identity to SEQ ID NO: 24. In some embodiments, (a) the CD19VH comprises an amino acid sequence with at least 90%sequence identity to SEQ ID NO: 19; (b) the CD19VL comprises an amino acid sequence with at least 90%sequence identity to SEQ ID NO: 20; (c) the CD3VH comprises an amino acid sequence with at least 90%sequence identity to SEQ ID NO: 21; (d) the CD3VL comprises an amino acid sequence with at least 90%sequence identity to SEQ ID NO: 22; (e) the CD20VH comprises an amino acid sequence with at least 90%sequence identity to SEQ ID NO: 23; or (f) the CD20VL comprises an amino acid sequence with at least 90%sequence identity to SEQ ID NO: 24. In some embodiments, (a) the CD19VH comprises an amino acid sequence with at least 90%sequence identity to SEQ ID NO: 19; (b) the CD19VL comprises an amino acid sequence with at least 90%sequence identity to SEQ ID NO: 20; (c) the CD3VH comprises an amino acid sequence with at least 90%sequence identity to SEQ ID NO: 21; (d) the CD3VL comprises an amino acid sequence with at least 90%sequence identity to SEQ ID NO: 22; (e ) the CD20VH comprises an amino acid sequence with at least 90%sequence identity to SEQ ID NO: 23; and (f) the CD20VL comprises an amino acid sequence with at least 90%sequence identity to SEQ ID NO: 24. In some embodiments, (a) the CD19VH comprises an amino acid sequence with at least 91%sequence identity to SEQ ID NO: 19; (b) the CD19VL comprises an amino acid sequence with at least 91%sequence identity to SEQ ID NO: 20; (c) the CD3VH comprises an amino acid sequence with at least 91%sequence identity to SEQ ID NO: 21; (d) the CD3VL comprises an amino acid sequence with at least 91%sequence identity to SEQ ID NO: 22; (e) the CD20VH comprises an amino acid sequence with at least 91%sequence identity to SEQ ID NO: 23; or (f) the CD20VL comprises an amino acid sequence with at least 91%sequence identity to SEQ ID NO: 24. In some embodiments, (a) the CD19VH comprises an amino acid sequence with at least 91%sequence identity to SEQ ID NO: 19; (b) the CD19VL comprises an amino acid sequence with at least 91%sequence identity to SEQ ID NO: 20; (c) the CD3VH comprises an amino acid sequence with at least 91%sequence identity to SEQ ID NO: 21; (d) the CD3VL comprises an amino acid sequence with at least 91%sequence identity to SEQ ID NO: 22; (e ) the CD20VH comprises an amino acid sequence with at least 91%sequence identity to SEQ ID NO: 23; and (f) the CD20VL comprises an amino acid sequence with at least 91%sequence identity to SEQ ID NO: 24. In some embodiments, (a) the CD19VH comprises an amino acid sequence with at least 92%sequence identity to SEQ ID NO: 19; (b) the CD19VL comprises an amino acid sequence with at least 92%sequence identity to SEQ ID NO: 20; (c) the CD3VH comprises an amino acid sequence with at least 92%sequence identity to SEQ ID NO: 21; (d) the CD3VL comprises an amino acid sequence with at least 92%sequence identity to SEQ ID NO: 22; (e) the CD20VH comprises an amino acid sequence with at least 92%sequence identity to SEQ ID NO: 23; or (f) the CD20VL comprises an amino acid sequence with at least 92%sequence identity to SEQ ID NO: 24. In some embodiments, (a) the CD19VH comprises an amino acid sequence with at least 92%sequence identity to SEQ ID NO: 19; (b) the CD19VL comprises an amino acid sequence with at least 92%sequence identity to SEQ ID NO: 20; (c) the CD3VH comprises an amino acid sequence with at least 92%sequence identity to SEQ ID NO: 21; (d) the CD3VL comprises an amino acid sequence with at least 92%sequence identity to SEQ ID NO: 22; (e) the CD20VH comprises an amino acid sequence with at least 92%sequence identity to SEQ ID NO: 23; and (f) the CD20VL comprises an amino acid sequence with at least 92%sequence identity to SEQ ID NO: 24. In some embodiments, (a) the CD19VH comprises an amino acid sequence with at least 93%sequence identity to SEQ ID NO: 19; (b) the CD19VL comprises an amino acid sequence with at least 93%sequence identity to SEQ ID NO: 20; (c) the CD3VH comprises an amino acid sequence with at least 93%sequence identity to SEQ ID NO: 21; (d) the CD3VL comprises an amino acid sequence with at least 93%sequence identity to SEQ ID NO: 22; (e) the CD20VH comprises an amino acid sequence with at least 93%sequence identity to SEQ ID NO: 23; or (f) the CD20VL comprises an amino acid sequence with at least 93%sequence identity to SEQ ID NO: 24. In some embodiments, (a) the CD19VH comprises an amino acid sequence with at least 93%sequence identity to SEQ ID NO: 19; (b) the CD19VL comprises an amino acid sequence with at least 93%sequence identity to SEQ ID NO: 20; (c) the CD3VH comprises an amino acid sequence with at least 93%sequence identity to SEQ ID NO: 21; (d) the CD3VL comprises an amino acid sequence with at least 93%sequence identity to SEQ ID NO: 22; (e) the CD20VH comprises an amino acid sequence with at least 93%sequence identity to SEQ ID NO: 23; and (f) the CD20VL comprises an amino acid sequence with at least 93%sequence identity to SEQ ID NO: 24. In some embodiments, (a) the CD19VH comprises an amino acid sequence with at least 94%sequence identity to SEQ ID NO: 19; (b) the CD19VL comprises an amino acid sequence with at least 94%sequence identity to SEQ ID NO: 20; (c) the CD3VH comprises an amino acid sequence with at least 94%sequence identity to SEQ ID NO: 21; (d) the CD3VL comprises an amino acid sequence with at least 94%sequence identity to SEQ ID NO: 22; (e) the CD20VH comprises an amino acid sequence with at least 94%sequence identity to SEQ ID NO: 23; or (f) the CD20VL comprises an amino acid sequence with at least 94%sequence identity to SEQ ID NO: 24. In some embodiments, (a) the CD19VH comprises an amino acid sequence with at least 94%sequence identity to SEQ ID NO: 19; (b) the CD19VL comprises an amino acid sequence with at least 94%sequence identity to SEQ ID NO: 20; (c) the CD3VH comprises an amino acid sequence with at least 94%sequence identity to SEQ ID NO: 21; (d) the CD3VL comprises an amino acid sequence with at least 94%sequence identity to SEQ ID NO: 22; (e) the CD20VH comprises an amino acid sequence with at least 94%sequence identity to SEQ ID NO: 23; and (f) the CD20VL comprises an amino acid sequence with at least 94%sequence identity to SEQ ID NO: 24. In some embodiments, (a) the CD19VH comprises an amino acid sequence with at least 95%sequence identity to SEQ ID NO: 19; (b) the CD19VL comprises an amino acid sequence with at least 95%sequence identity to SEQ ID NO: 20; (c) the CD3VH comprises an amino acid sequence with at least 95%sequence identity to SEQ ID NO: 21; (d) the CD3VL comprises an amino acid sequence with at least 95%sequence identity to SEQ ID NO: 22; (e) the CD20VH comprises an amino acid sequence with at least 95%sequence identity to SEQ ID NO: 23; or (f) the CD20VL comprises an amino acid sequence with at least 95%sequence identity to SEQ ID NO: 24. In some embodiments, (a) the CD19VH comprises an amino acid sequence with at least 95%sequence identity to SEQ ID NO: 19; (b) the CD19VL comprises an amino acid sequence with at least 95%sequence identity to SEQ ID NO: 20; (c) the CD3VH comprises an amino acid sequence with at least 95%sequence identity to SEQ ID NO: 21; (d) the CD3VL comprises an amino acid sequence with at least 95%sequence identity to SEQ ID NO: 22; (e) the CD20VH comprises an amino acid sequence with at least 95%sequence identity to SEQ ID NO: 23; and (f) the CD20VL comprises an amino acid sequence with at least 95%sequence identity to SEQ ID NO: 24. In some embodiments, (a) the CD19VH comprises an amino acid sequence with at least 96%sequence identity to SEQ ID NO: 19; (b) the CD19VL comprises an amino acid sequence with at least 96%sequence identity to SEQ ID NO: 20; (c) the CD3VH comprises an amino acid sequence with at least 96%sequence identity to SEQ ID NO: 21; (d) the CD3VL comprises an amino acid sequence with at least 96%sequence identity to SEQ ID NO: 22; (e) the CD20VH comprises an amino acid sequence with at least 96%sequence identity to SEQ ID NO: 23; or (f) the CD20VL comprises an amino acid sequence with at least 96%sequence identity to SEQ ID NO: 24. In some embodiments, (a) the CD19VH comprises an amino acid sequence with at least 96%sequence identity to SEQ ID NO: 19; (b) the CD19VL comprises an amino acid sequence with at least 96%sequence identity to SEQ ID NO: 20; (c) the CD3VH comprises an amino acid sequence with at least 96%sequence identity to SEQ ID NO: 21; (d) the CD3VL comprises an amino acid sequence with at least 96%sequence identity to SEQ ID NO: 22; (e) the CD20VH comprises an amino acid sequence with at least 96%sequence identity to SEQ ID NO: 23; and (f) the CD20VL comprises an amino acid sequence with at least 96%sequence identity to SEQ ID NO: 24. In some embodiments, (a) the CD19VH comprises an amino acid sequence with at least 97%sequence identity to SEQ ID NO: 19; (b) the CD19VL comprises an amino acid sequence with at least 97%sequence identity to SEQ ID NO: 20; (c) the CD3VH comprises an amino acid sequence with at least 97%sequence identity to SEQ ID NO: 21; (d) the CD3VL comprises an amino acid sequence with at least 97%sequence identity to SEQ ID NO: 22; (e) the CD20VH comprises an amino acid sequence with at least 97%sequence identity to SEQ ID NO: 23; or (f) the CD20VL comprises an amino acid sequence with at least 97%sequence identity to SEQ ID NO: 24. In some embodiments, (a) the CD19VH comprises an amino acid sequence with at least 97%sequence identity to SEQ ID NO: 19; (b) the CD19VL comprises an amino acid sequence with at least 97%sequence identity to SEQ ID NO: 20; (c) the CD3VH comprises an amino acid sequence with at least 97%sequence identity to SEQ ID NO: 21; (d) the CD3VL comprises an amino acid sequence with at least 97%sequence identity to SEQ ID NO: 22; (e) the CD20VH comprises an amino acid sequence with at least 97%sequence identity to SEQ ID NO: 23; and (f) the CD20VL comprises an amino acid sequence with at least 97%sequence identity to SEQ ID NO: 24. In some embodiments, (a) the CD19VH comprises an amino acid sequence with at least 98%sequence identity to SEQ ID NO: 19; (b) the CD19VL comprises an amino acid sequence with at least 98%sequence identity to SEQ ID NO: 20; (c) the CD3VH comprises an amino acid sequence with at least 98%sequence identity to SEQ ID NO: 21; (d) the CD3VL comprises an amino acid sequence with at least 98%sequence identity to SEQ ID NO: 22; (e) the CD20VH comprises an amino acid sequence with at least 98%sequence identity to SEQ ID NO: 23; or (f) the CD20VL comprises an amino acid sequence with at least 98%sequence identity to SEQ ID NO: 24. In some embodiments, (a) the CD19VH comprises an amino acid sequence with at least 98%sequence identity to SEQ ID NO: 19; (b) the CD19VL comprises an amino acid sequence with at least 98%sequence identity to SEQ ID NO: 20; (c) the CD3VH comprises an amino acid sequence with at least 98%sequence identity to SEQ ID NO: 21; (d) the CD3VL comprises an amino acid sequence with at least 98%sequence identity to SEQ ID NO: 22; (e) the CD20VH comprises an amino acid sequence with at least 98%sequence identity to SEQ ID NO: 23; and (f) the CD20VL comprises an amino acid sequence with at least 98%sequence identity to SEQ ID NO: 24. In some embodiments, (a) the CD19VH comprises an amino acid sequence with at least 99%sequence identity to SEQ ID NO: 19; (b) the CD19VL comprises an amino acid sequence with at least 99%sequence identity to SEQ ID NO: 20; (c) the CD3VH comprises an amino acid sequence with at least 99%sequence identity to SEQ ID NO: 21; (d) the CD3VL comprises an amino acid sequence with at least 99%sequence identity to SEQ ID NO: 22; (e) the CD20VH comprises an amino acid sequence with at least 99%sequence identity to SEQ ID NO: 23; or (f) the CD20VL comprises an amino acid sequence with at least 99%sequence identity to SEQ ID NO: 24. In some embodiments, (a) the CD19VH comprises an amino acid sequence with at least 99%sequence identity to SEQ ID NO: 19; (b) the CD19VL comprises an amino acid sequence with at least 99%sequence identity to SEQ ID NO: 20; (c) the CD3VH comprises an amino acid sequence with at least 99%sequence identity to SEQ ID NO: 21; (d) the CD3VL comprises an amino acid sequence with at least 99%sequence identity to SEQ ID NO: 22; (e) the CD20VH comprises an amino acid sequence with at least 99%sequence identity to SEQ ID NO: 23; and (f) the CD20VL comprises an amino acid sequence with at least 99%sequence identity to SEQ ID NO: 24.

[0132] In some embodiments, (a) the CD19VH comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19; (b) the CD19VL comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20; (c) the CD3VH comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21; (d) the CD3VL comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22; (e) the CD20VH comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 23; or (f) the CD20VL comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 24. In some embodiments, (a) the CD19VH comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19; (b) the CD19VL comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20; (c) the CD3VH comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21; (d) the CD3VL comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22; (e) the CD20VH comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 23; and (f) the CD20VL comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 24.

[0133] In some embodiments, (a) the CD19VH is operably linked to a first heavy chain constant domain (C1H) ; (b) the CD19VL is operably linked to a first light chain constant domain (C1L) ; (c) the CD3VH is operably linked to a second heavy chain constant domain (C2H) ; (d) the CD3VL is operably linked to a second light chain constant domain (C2L) ; (e) the CD20VH is operably linked to a third heavy chain constant domain (C3H) ; or (f) the CD20VL is operably linked to a third light chain constant domain (C3L) . In some embodiments, (a) the CD19VH is operably linked to a first heavy chain constant domain (C1H) ; (b) the CD19VL is operably linked to a first light chain constant domain (C1L) ; (c) the CD3VH is operably linked to a second heavy chain constant domain (C2H) ; (d) the CD3VL is operably linked to a second light chain constant domain (C2L) ; (e) the CD20VH is operably linked to a third heavy chain constant domain (C3H) ; and (f) the CD20VL is operably linked to a third light chain constant domain (C3L) . In some embodiments, (a) the C1H and C1L comprise a T cell receptor (TCR) α chain constant domain (Cα) and a TCR β chain constant domain (Cβ) , respectively; (b) the C1H and C1L comprise Cβ and Cα, respectively; or (c) the C1H and C1L comprise an antibody heavy chain constant region CH1 domain and an antibody light chain constant region CL domain, respectively. In some embodiments, the C1H and the C1L comprise Cαand Cβ, respectively. In some embodiments, the C1H and the C1L comprise Cβ and Cα, respectively. In some embodiments, the C1H and the C1L comprise CH1 domain and CL domain, respectively. In some embodiments, (a) the C2H and the C2L comprise Cα and Cβ, respectively; (b) the C2H and the C2L comprise Cβ and Cα, respectively; or (c) the C2H and the C2L comprise CH1 domain and CL domain, respectively. In some embodiments, the C2H and the C2L comprise Cα and Cβ, respectively. In some embodiments, the C2H and the C2L comprise Cβ and Cα, respectively. In some embodiments, the C2H and the C2L comprise CH1 domain and CL domain, respectively. In some embodiments, (a) the C3H and the C3L comprise Cα and Cβ, respectively; (b) the C3H and the C3L comprise Cβ and Cα, respectively; or (c) the C3H and the C3L comprise CH1 domain and CL domain, respectively. In some embodiments, the C3H and the C3L comprise Cα and Cβ, respectively. In some embodiments, the C3H and the C3L comprise Cβ and Cα, respectively. In some embodiments, the C3H and the C3L comprise CH1 domain and CL domain, respectively. In some embodiments, (a) the C1H and the C1L comprise Cβ and Cα, respectively; (b) the C2H and the C2L comprise Cβ and Cα, respectively; or (c) the C3H and the C3L comprise CH1 domain and CL domain, respectively. In some embodiments, (a) the C1H and the C1L comprise Cβ and Cα, respectively; (b) the C2H and the C2L comprise Cβ and Cα, respectively and (c) the C3H and the C3L comprise CH1 domain and CL domain, respectively. In some embodiments, (a) the C1H and the C1L comprise Cα and Cβ, respectively; (b) the C2H and the C2L comprise Cα and Cβ, respectively; or (c) the C3H and the C3L comprise CH1 domain and CL domain, respectively. In some embodiments, (a) the C1H and the C1L comprise Cα and Cβ, respectively; (b) the C2H and the C2L comprise Cα and Cβ, respectively; and (c) the C3H and the C3L comprise CH1 domain and CL domain, respectively.

[0134] In some embodiments, Cα comprises an amino acid sequence with about 70%to about 100%sequence identity to SEQ ID NO: 35, e.g., about 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or about 100%sequence identity, or any percentage there between. In some embodiments, Cβcomprises an amino acid sequence with about 70%to about 100%sequence identity to SEQ ID NO: 34, e.g., about 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or about 100%sequence identity, or any percentage there between. In some embodiments, CH1 domain comprises an amino acid sequence with about 70%to about 100%sequence identity to SEQ ID NO: 44, e.g., about 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or about 100%sequence identity, or any percentage there between. In some embodiments, CL domain comprises an amino acid sequence with about 70%to about 100%sequence identity to SEQ ID NO: 45, e.g., about 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or about 100%sequence identity, or any percentage there between. In some embodiments, (a) Cα comprises an amino acid sequence with at least 70%sequence identity to SEQ ID NO: 35; (b) Cβ comprises an amino acid sequence with at least 70%sequence identity to SEQ ID NO: 34; (c) CH1 domain comprises an amino acid sequence with at least 70%sequence identity to SEQ ID NO: 44;or (d) CL domain comprises an amino acid sequence with at least 70%sequence identity to SEQ ID NO: 45. In some embodiments, (a) Cα comprises an amino acid sequence with at least 75%sequence identity to SEQ ID NO: 35; (b) Cβ comprises an amino acid sequence with at least 75%sequence identity to SEQ ID NO: 34; (c) CH1 domain comprises an amino acid sequence with at least 75%sequence identity to SEQ ID NO: 44; or (d) CL domain comprises an amino acid sequence with at least 75%sequence identity to SEQ ID NO: 45. In some embodiments, (a) Cα comprises an amino acid sequence with at least 80%sequence identity to SEQ ID NO: 35; (b) Cβ comprises an amino acid sequence with at least 80%sequence identity to SEQ ID NO: 34; (c) CH1 domain comprises an amino acid sequence with at least 80%sequence identity to SEQ ID NO: 44; or (d) CL domain comprises an amino acid sequence with at 80%sequence identity to SEQ ID NO: 45. In some embodiments, (a) Cα comprises an amino acid sequence with at least 80%sequence identity to SEQ ID NO: 35; (b) Cβ comprises an amino acid sequence with at least 80%sequence identity to SEQ ID NO: 34; (c) CH1 domain comprises an amino acid sequence with at least 80%sequence identity to SEQ ID NO: 44; and (d) CL domain comprises an amino acid sequence with at 80%sequence identity to SEQ ID NO: 45. In some embodiments, (a) Cα comprises an amino acid sequence with at least 85%sequence identity to SEQ ID NO: 35; (b) Cβ comprises an amino acid sequence with at least 85%sequence identity to SEQ ID NO: 34; (c) CH1 domain comprises an amino acid sequence with at least 85%sequence identity to SEQ ID NO: 44; or (d) CL domain comprises an amino acid sequence with at least 85%sequence identity to SEQ ID NO: 45. In some embodiments, (a) Cα comprises an amino acid sequence with at least 85%sequence identity to SEQ ID NO: 35; (b) Cβ comprises an amino acid sequence with at least 85%sequence identity to SEQ ID NO: 34; (c) CH1 domain comprises an amino acid sequence with at least 85%sequence identity to SEQ ID NO: 44; and (d) CL domain comprises an amino acid sequence with at least 85%sequence identity to SEQ ID NO: 45. In some embodiments, (a) Cαcomprises an amino acid sequence with at least 86%sequence identity to SEQ ID NO: 35; (b) Cβ comprises an amino acid sequence with at least 86%sequence identity to SEQ ID NO: 34; (c) CH1 domain comprises an amino acid sequence with at least 86%sequence identity to SEQ ID NO: 44; or (d) CL domain comprises an amino acid sequence with at least 86%sequence identity to SEQ ID NO: 45. In some embodiments, (a) Cα comprises an amino acid sequence with at least 87%sequence identity to SEQ ID NO: 35; (b) Cβcomprises an amino acid sequence with at least 87%sequence identity to SEQ ID NO: 34; (c) CH1 domain comprises an amino acid sequence with at least 87%sequence identity to SEQ ID NO: 44; or (d) CL domain comprises an amino acid sequence with at least 87%sequence identity to SEQ ID NO: 45. In some embodiments, (a) Cα comprises an amino acid sequence with at least 88%sequence identity to SEQ ID NO: 35; (b) Cβ comprises an amino acid sequence with at least 88%sequence identity to SEQ ID NO: 34; (c) CH1 domain comprises an amino acid sequence with at least 88%sequence identity to SEQ ID NO: 44; or (d) CL domain comprises an amino acid sequence with at least 88%sequence identity to SEQ ID NO: 45. In some embodiments, (a) Cα comprises an amino acid sequence with at least 89%sequence identity to SEQ ID NO: 35; (b) Cβ comprises an amino acid sequence with at least 89%sequence identity to SEQ ID NO: 34; (c) CH1 domain comprises an amino acid sequence with at least 89%sequence identity to SEQ ID NO: 44; or (d) CL domain comprises an amino acid sequence with at least 89%sequence identity to SEQ ID NO: 45. In some embodiments, (a) Cα comprises an amino acid sequence with at least 90%sequence identity to SEQ ID NO: 35; (b) Cβ comprises an amino acid sequence with at least 90%sequence identity to SEQ ID NO: 34; (c) CH1 domain comprises an amino acid sequence with at least 90%sequence identity to SEQ ID NO: 44; or (d) CL domain comprises an amino acid sequence with at least 90%sequence identity to SEQ ID NO: 45. In some embodiments, (a) Cα comprises an amino acid sequence with at least 90%sequence identity to SEQ ID NO: 35; (b) Cβ comprises an amino acid sequence with at least 90%sequence identity to SEQ ID NO: 34; (c) CH1 domain comprises an amino acid sequence with at least 90%sequence identity to SEQ ID NO: 44; and (d) CL domain comprises an amino acid sequence with at least 90%sequence identity to SEQ ID NO: 45. In some embodiments, (a) Cα comprises an amino acid sequence with at least 91%sequence identity to SEQ ID NO: 35; (b) Cβ comprises an amino acid sequence with at least 91%sequence identity to SEQ ID NO: 34; (c) CH1 domain comprises an amino acid sequence with at least 91%sequence identity to SEQ ID NO: 44; or (d) CL domain comprises an amino acid sequence with at least 91%sequence identity to SEQ ID NO: 45. In some embodiments, (a) Cα comprises an amino acid sequence with at least 91%sequence identity to SEQ ID NO: 35; (b) Cβ comprises an amino acid sequence with at least 91%sequence identity to SEQ ID NO: 34; (c) CH1 domain comprises an amino acid sequence with at least 91%sequence identity to SEQ ID NO: 44; and (d) CL domain comprises an amino acid sequence with at least 91%sequence identity to SEQ ID NO: 45. In some embodiments, (a) Cαcomprises an amino acid sequence with at least 92%sequence identity to SEQ ID NO: 35; (b) Cβ comprises an amino acid sequence with at least 92%sequence identity to SEQ ID NO: 34; (c) CH1 domain comprises an amino acid sequence with at least 92%sequence identity to SEQ ID NO: 44; or (d) CL domain comprises an amino acid sequence with at least 92%sequence identity to SEQ ID NO: 45. In some embodiments, (a) Cα comprises an amino acid sequence with at least 92%sequence identity to SEQ ID NO: 35; (b) Cβcomprises an amino acid sequence with at least 92%sequence identity to SEQ ID NO: 34; (c) CH1 domain comprises an amino acid sequence with at least 92%sequence identity to SEQ ID NO: 44; and (d) CL domain comprises an amino acid sequence with at least 92%sequence identity to SEQ ID NO: 45. In some embodiments, (a) Cα comprises an amino acid sequence with at least 93%sequence identity to SEQ ID NO: 35; (b) Cβ comprises an amino acid sequence with at least 93%sequence identity to SEQ ID NO: 34; (c) CH1 domain comprises an amino acid sequence with at least 93%sequence identity to SEQ ID NO: 44; or (d) CL domain comprises an amino acid sequence with at least 93%sequence identity to SEQ ID NO: 45. In some embodiments, (a) Cα comprises an amino acid sequence with at least 93%sequence identity to SEQ ID NO: 35; (b) Cβ comprises an amino acid sequence with at least 93%sequence identity to SEQ ID NO: 34; (c) CH1 domain comprises an amino acid sequence with at least 93%sequence identity to SEQ ID NO: 44; and (d) CL domain comprises an amino acid sequence with at least 93%sequence identity to SEQ ID NO: 45. In some embodiments, (a) Cα comprises an amino acid sequence with at least 94%sequence identity to SEQ ID NO: 35; (b) Cβ comprises an amino acid sequence with at least 94%sequence identity to SEQ ID NO: 34; (c) CH1 domain comprises an amino acid sequence with at least 94%sequence identity to SEQ ID NO: 44; or (d) CL domain comprises an amino acid sequence with at least 94%sequence identity to SEQ ID NO: 45. In some embodiments, (a) Cα comprises an amino acid sequence with at least 94%sequence identity to SEQ ID NO: 35; (b) Cβ comprises an amino acid sequence with at least 94%sequence identity to SEQ ID NO: 34; (c) CH1 domain comprises an amino acid sequence with at least 94%sequence identity to SEQ ID NO: 44; and (d) CL domain comprises an amino acid sequence with at least 94%sequence identity to SEQ ID NO: 45. In some embodiments, (a) Cα comprises an amino acid sequence with at least 95%sequence identity to SEQ ID NO: 35; (b) Cβ comprises an amino acid sequence with at least 95%sequence identity to SEQ ID NO: 34; (c) CH1 domain comprises an amino acid sequence with at least 95%sequence identity to SEQ ID NO: 44; or (d) CL domain comprises an amino acid sequence with at least 95%sequence identity to SEQ ID NO: 45. In some embodiments, (a) Cαcomprises an amino acid sequence with at least 95%sequence identity to SEQ ID NO: 35; (b) Cβ comprises an amino acid sequence with at least 95%sequence identity to SEQ ID NO: 34; (c) CH1 domain comprises an amino acid sequence with at least 95%sequence identity to SEQ ID NO: 44; and (d) CL domain comprises an amino acid sequence with at least 95%sequence identity to SEQ ID NO: 45. In some embodiments, (a) Cα comprises an amino acid sequence with at least 96%sequence identity to SEQ ID NO: 35; (b) Cβ comprises an amino acid sequence with at least 96%sequence identity to SEQ ID NO: 34; (c) CH1 domain comprises an amino acid sequence with at least 96%sequence identity to SEQ ID NO: 44; or (d) CL domain comprises an amino acid sequence with at least 96%sequence identity to SEQ ID NO: 45. In some embodiments, (a) Cα comprises an amino acid sequence with at least 96%sequence identity to SEQ ID NO: 35; (b) Cβ comprises an amino acid sequence with at least 96%sequence identity to SEQ ID NO: 34; (c) CH1 domain comprises an amino acid sequence with at least 96%sequence identity to SEQ ID NO: 44; and (d) CL domain comprises an amino acid sequence with at least 96%sequence identity to SEQ ID NO: 45. In some embodiments, (a) Cα comprises an amino acid sequence with at least 97%sequence identity to SEQ ID NO: 35; (b) Cβ comprises an amino acid sequence with at least 97%sequence identity to SEQ ID NO: 34; (c) CH1 domain comprises an amino acid sequence with at least 97%sequence identity to SEQ ID NO: 44; or (d) CL domain comprises an amino acid sequence with at least 97%sequence identity to SEQ ID NO: 45. In some embodiments, (a) Cα comprises an amino acid sequence with at least 97%sequence identity to SEQ ID NO: 35; (b) Cβ comprises an amino acid sequence with at least 97%sequence identity to SEQ ID NO: 34; (c) CH1 domain comprises an amino acid sequence with at least 97%sequence identity to SEQ ID NO: 44; and (d) CL domain comprises an amino acid sequence with at least 97%sequence identity to SEQ ID NO: 45. In some embodiments, (a) Cα comprises an amino acid sequence with at least 98%sequence identity to SEQ ID NO: 35; (b) Cβ comprises an amino acid sequence with at least 98%sequence identity to SEQ ID NO: 34; (c) CH1 domain comprises an amino acid sequence with at least 98%sequence identity to SEQ ID NO: 44; or (d) CL domain comprises an amino acid sequence with at least 98%sequence identity to SEQ ID NO: 45. In some embodiments, (a) Cαcomprises an amino acid sequence with at least 98%sequence identity to SEQ ID NO: 35; (b) Cβ comprises an amino acid sequence with at least 98%sequence identity to SEQ ID NO: 34; (c) CH1 domain comprises an amino acid sequence with at least 98%sequence identity to SEQ ID NO: 44; and (d) CL domain comprises an amino acid sequence with at least 98%sequence identity to SEQ ID NO: 45. In some embodiments, (a) Cα comprises an amino acid sequence with at least 99%sequence identity to SEQ ID NO: 35; (b) Cβ comprises an amino acid sequence with at least 99%sequence identity to SEQ ID NO: 34; (c) CH1 domain comprises an amino acid sequence with at least 99%sequence identity to SEQ ID NO: 44; or (d) CL domain comprises an amino acid sequence with at least 99%sequence identity to SEQ ID NO: 45. In some embodiments, (a) Cα comprises an amino acid sequence with at least 99%sequence identity to SEQ ID NO: 35; (b) Cβ comprises an amino acid sequence with at least 99%sequence identity to SEQ ID NO: 34; (c) CH1 domain comprises an amino acid sequence with at least 99%sequence identity to SEQ ID NO: 44; and (d) CL domain comprises an amino acid sequence with at least 99%sequence identity to SEQ ID NO: 45. In some embodiments, (a) Cα comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 35; (b) Cβ comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 34; (c) CH1 domain comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 44; or (d) CL domain comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 45. In some embodiments, (a) Cα comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 35; (b) Cβcomprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 34; (c) CH1 domain comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 44; and (d) CL domain comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 45. In some embodiments, (a) the C1H comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 34; (b) the C1L comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 35; (c) the C2H comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 34; (d) the C2L comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 35; (e) the C3H comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 44; or (f) the C3L comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 45. In some embodiments, (a) the C1H comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 34; (b) the C1L comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 35; (c) the C2H comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 34; (d) the C2L comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 35; (e) the C3H comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 44; and (f) the C3L comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 45. In some embodiments, (a) the C1H comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 35; (b) the C1L comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 34; (c) the C2H comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 35; (d) the C2L comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 34; (e) the C3H comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 44; or (f) the C3L comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 45. In some embodiments, (a) the C1H comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 35; (b) the C1L comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 34; (c) the C2H comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 35; (d) the C2L comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 34; (e) the C3H comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 44; and (f) the C3L comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 45.

[0135] In some embodiments, (a) the CD19VH is covalently linked to the C1H directly or via a peptide linker; (b) the CD19VL is covalently linked to the C1L directly or via a peptide linker; (c) the CD3VH is covalently linked to the C2H directly or via a peptide linker; (d) the CD3VL is covalently linked to the C2L directly or via a peptide linker; (e) the CD20VH is covalently linked to the C3H directly or via a peptide linker; or (f) the CD20VL is covalently linked to the C3L directly or via a peptide linker. In some embodiments, (a) the CD19VH is covalently linked to the C1H directly or via a peptide linker; (b) the CD19VL is covalently linked to the C1L directly or via a peptide linker; (c) the CD3VH is covalently linked to the C2H directly or via a peptide linker; (d) the CD3VL is covalently linked to the C2L directly or via a peptide linker; (e) the CD20VH is covalently linked to the C3H directly or via a peptide linker; and (f) the CD20VL is covalently linked to the C3L directly or via a peptide linker. In some embodiments, (a) the CD19VH is covalently linked to the C1H directly; (b) the CD19VL is covalently linked to the C1L directly; (c) the CD3VH is covalently linked to the C2H directly; (d) the CD3VL is covalently linked to the C2L directly; (e) the CD20VH is covalently linked to the C3H directly; or (f) the CD20VL is covalently linked to the C3L directly. In some embodiments, (a) the CD19VH is covalently linked to the C1H directly; (b) the CD19VL is covalently linked to the C1L directly; (c) the CD3VH is covalently linked to the C2H directly; (d) the CD3VL is covalently linked to the C2L directly; (e) the CD20VH is covalently linked to the C3H directly; and (f) the CD20VL is covalently linked to the C3L directly. In some embodiments, (a) the CD19VH is covalently linked to the C1H via a peptide linker; (b) the CD19VL is covalently linked to the C1L via a peptide linker; (c) the CD3VH is covalently linked to the C2H via a peptide linker; (d) the CD3VL is covalently linked to the C2L via a peptide linker; (e) the CD20VH is covalently linked to the C3H via a peptide linker; or (f) the CD20VL is covalently linked to the C3L via a peptide linker. In some embodiments, (a) the CD19VH is covalently linked to the C1H via a peptide linker; (b) the CD19VL is covalently linked to the C1L via a peptide linker; (c) the CD3VH is covalently linked to the C2H via a peptide linker; (d) the CD3VL is covalently linked to the C2L via a peptide linker; (e) the CD20VH is covalently linked to the C3H via a peptide linker; and (f) the CD20VL is covalently linked to the C3L via a peptide linker.

[0136] In some embodiments, the antibody or antigen-binding portion thereof further comprises a first heavy chain (HC1) , a second heavy chain (HC2) , a first light chain (LC1) , a second light chain (LC2) , or a third light chain (LC3) . In some embodiments, the antibody or antigen-binding portion thereof further comprising the first heavy chain (HC1) , the second heavy chain (HC2) , the first light chain (LC1) , the second light chain (LC2) , and the third light chain (LC3) . In some embodiments, the antibody or antigen-binding portion thereof further comprises a fragment crystallizable (Fc) region. In some embodiments, the antibody or antigen-binding portion thereof further comprises an immunoglobulin (Ig) G, IgA, IgM, IgE, or IgD. In some embodiments, the antibody or antigen-binding portion thereof further comprises an IgG. In some embodiments, the antibody or antigen-binding portion thereof further comprises an IgA. In some embodiments, the antibody or antigen-binding portion thereof further comprises an IgM. In some embodiments, the antibody or antigen-binding portion thereof further comprises an IgE. In some embodiments, the antibody or antigen-binding portion thereof further comprises an IgD. In some embodiments, the antibody or antigen-binding portion thereof further comprises an IgG1, IgG2, IgG3, or IgG4. In some embodiments, the antibody or antigen-binding portion thereof further comprises an IgG1. In some embodiments, the antibody or antigen-binding portion thereof further comprises an IgG2. In some embodiments, the antibody or antigen-binding portion thereof further comprises an IgG3. In some embodiments, the antibody or antigen-binding portion thereof further comprises an IgG4. In some embodiments, the antibody or antigen-binding portion thereof further comprises a human IgG1, IgG2, IgG3, or IgG4. In some embodiments, the antibody or antigen-binding portion thereof further comprises a human IgG1. In some embodiments, the antibody or antigen-binding portion thereof further comprises a human IgG2. In some embodiments, the antibody or antigen-binding portion thereof further comprises a human IgG3. In some embodiments, the antibody or antigen-binding portion thereof further comprises a human IgG4. In some embodiments, the CD19 binding moiety, the CD3 binding moiety, or the CD20 binding moiety comprises a fragment antigen-binding (Fab) region, a Fab’ , a F (ab’ ) 2, or single chain variable fragment (scFv) . In some embodiments, the CD19 binding moiety, the CD3 binding moiety, or the CD20 binding moiety comprises a single chain variable fragment (scFv) . In some embodiments, the CD19 binding moiety, the CD3 binding moiety, or the CD20 binding moiety comprises a Fab’ . In some embodiments, the CD19 binding moiety, the CD3 binding moiety, or the CD20 binding moiety comprises a F(ab’ ) 2. In some embodiments, the CD19 binding moiety, the CD3 binding moiety, or the CD20 binding moiety comprises a Fab region. In some embodiments, the CD19 binding moiety, the CD3 binding moiety, and the CD20 binding moiety each comprises a Fab region.

[0137] In some embodiments, HC1, HC2, LC1, LC2 and LC3 comprise domains operably linked, from the amino terminus to the carboxyl terminus, in the following formats: (a) CD19VH-Cβ-CD3VL-Cα-Fc, CD20VH-CH1-Fc, CD19VL-Cα, CD3VH-Cβ, and CD20VL-CL, respectively; (b) CD19VL-Cα-CD3VH-Cβ-Fc, CD20VH-CH1-Fc, CD19VH-Cβ, CD3VL-Cα, and CD20VL-CL, respectively; (c) CD3VH-Cβ-CD19VL-Cα-Fc, CD20VH-CH1-Fc, CD3VL-Cα, CD19VH-Cβ, and CD20VL-CL, respectively; or (d) CD3VL-Cα-CD19VH-Cβ-Fc, CD20VH-CH1-Fc, CD3VH-Cβ, CD19VL-Cα, and CD20VL-CL, respectively. In some embodiments, HC1, HC2, LC1, LC2 and LC3 comprise domains operably linked, from the amino terminus to the carboxyl terminus, in the following formats: CD19VH-Cβ-CD3VL-Cα-Fc, CD20VH-CH1-Fc, CD19VL-Cα, CD3VH-Cβ, and CD20VL-CL, respectively. In some embodiments, (a) CD19VH-Cβ is covalently linked to CD3VL-Cα-Fc directly or via a peptide linker; (b) CD19VL-Cα is covalently linked to CD3VH-Cβ-Fc directly or via a peptide linker; (c) CD3VH-Cβ is covalently linked to CD19VL-Cα-Fc directly or via a peptide linker; or (d) CD3VL-Cα is covalently linked to CD19VH-Cβ-Fc directly or via a peptide linker. In some embodiments, CD19VH-Cβ is covalently linked to CD3VL-Cα-Fc directly. In some embodiments, CD19VH-Cβ is covalently linked to CD3VL-Cα-Fc via the peptide linker. In some embodiments, the peptide linker comprises 1 to 40 amino acids in length. In some embodiments, the peptide liner comprises 1 amino acid in length, 2 amino acids in length, 3 amino acids in length, 4 amino acids in length, 5 amino acids in length, 6 amino acids in length, 7 amino acids in length, 8 amino acids in length, 9 amino acids in length, 10 amino acids in length, 11 amino acids in length, 12 amino acids in length, 13 amino acids in length, 14 amino acids in length, 15 amino acids in length, 16 amino acids in length, 17 amino acids in length, 18 amino acids in length, 19 amino acids in length, 20 amino acids in length, 21 amino acids in length, 22 amino acids in length, 23 amino acids in length, 24 amino acids in length, 25 amino acids in length, 26 amino acids in length, 27 amino acids in length, 28 amino acids in length, 29 amino acids in length, 30 amino acids in length, 31 amino acids in length, 32 amino acids in length, 33 amino acids in length, 34 amino acids in length, 35 amino acids in length, 36 amino acids in length, 37 amino acids in length, 38 amino acids in length, 39 amino acids in length, or 40 amino acids in length. In some embodiments, the peptide linker comprises glycine (G) and serine (S) . In some embodiments, the peptide linker comprises a glycine (G) and serine (S) linker comprising (GS) n (SEQ ID NO: 46) , (GGS) n (SEQ ID NO: 47) , (GGGS) n (SEQ ID NO: 48) , (GGGGS) n (SEQ ID NO: 49) , (GGSG) n (SEQ ID NO: 50) , or (GGGSS) n (SEQ ID NO: 51) , and n is an integer of 1-9. In some embodiments, the peptide linker comprises a glycine (G) and serine (S) linker comprising (GS) n (SEQ ID NO: 46) , and n is an integer of 1-9. In some embodiments, the peptide linker comprises a glycine (G) and serine (S) linker comprising (GGS) n (SEQ ID NO: 47) , and n is an integer of 1-9. In some embodiments, the peptide linker comprises a glycine (G) and serine (S) linker comprising (GGGS) n (SEQ ID NO: 48) , and n is an integer of 1-9. In some embodiments, the peptide linker comprises a glycine (G) and serine (S) linker comprising (GGGGS) n (SEQ ID NO: 49) , and n is an integer of 1-9. In some embodiments, the peptide linker comprises a glycine (G) and serine (S) linker comprising (GGSG) n (SEQ ID NO: 50) , and n is an integer of 1-9. In some embodiments, the peptide linker comprises a glycine (G) and serine (S) linker comprising (GGGSS) n (SEQ ID NO: 51) , and n is an integer of 1-9, and n is an integer of 1-9. In some embodiments, n is an integer of 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, or 9. In some embodiments, the peptide linker comprises SEQ ID NO: 38. In some embodiments, CD19VH-Cβ is covalently linked to CD3VL-Cα-Fc via the peptide linker comprising SEQ ID NO: 38. In some embodiments, (a) CD19VH-Cβ-CD3VL-Cα is covalently linked to the Fc region directly or via a hinge region; (b) CD20VH-CH1 is covalently linked to the Fc region directly or via a hinge region; (c) CD19VL-Cα-CD3VH-Cβ is covalently linked to the Fc region directly or via a hinge region; (d) CD3VH-Cβ-CD19VL-Cα is covalently linked to the Fc region directly or via a hinge region; or (e) CD3VL-Cα-CD19VH-Cβ is covalently linked to the Fc region directly or via a hinge region. In some embodiments, CD19VH-Cβ-CD3VL-Cα is covalently linked to the Fc region via the hinge region. In some embodiments, CD20VH-CH1 is covalently linked to the Fc region via the hinge region. In some embodiments, (a) CD19VH-Cβ-CD3VL-Cα is covalently linked to the Fc region via the hinge region; and (b) CD20VH-CH1 is covalently linked to the Fc region via the hinge region. In some embodiments, (a) CD19VH-Cβ-CD3VL-Cα is covalently linked to the Fc region via the hinge region; or (b) CD20VH-CH1 is covalently linked to the Fc region via the hinge region. In some embodiments, the hinge region comprises SEQ ID NO: 37. In some embodiments, CD19VH-Cβ-CD3VL-Cα is covalently linked to the Fc region via the hinge region comprising SEQ ID NO: 37. In some embodiments, CD20VH-CH1 is covalently linked to the Fc region via the hinge region comprising SEQ ID NO: 37. In some embodiments, (a) CD19VH-Cβ-CD3VL-Cα is covalently linked to the Fc region via the hinge region comprising SEQ ID NO: 37; and (b) CD20VH-CH1 is covalently linked to the Fc region via the hinge region comprising SEQ ID NO: 37. In some embodiments, (a) CD19VH-Cβ-CD3VL-Cα is covalently linked to the Fc region via the hinge region comprising SEQ ID NO: 37; or (b) CD20VH-CH1 is covalently linked to the Fc region via the hinge region comprising SEQ ID NO: 37.

[0138] In some embodiments, (a) CD19VH-Cβ associates with CD19VL-Cα to form the CD19 binding moiety; (b) CD3VL-Cα associates with CD3VH-Cβ to form the CD3 binding moiety; (c) CD20VH-CH1 associates with CD20VL-CL to form the CD20 binding moiety; (d) CD19VL-Cα associates with CD19VH-Cβ to form the CD19 binding moiety; or (e) CD3VH-Cβ associates with CD3VL-Cα to form the CD3 binding moiety. In some embodiments, (a) CD19VH-Cβ associates with CD19VL-Cα to form the CD19 binding moiety; (b) CD3VL-Cα associates with CD3VH-Cβ to form the CD3 binding moiety; (c) CD20VH-CH1 associates with CD20VL-CL to form the CD20 binding moiety; (d) CD19VL-Cα associates with CD19VH-Cβ to form the CD19 binding moiety; and (e) CD3VH-Cβ associates with CD3VL-Cα to form the CD3 binding moiety. In some embodiments, (a) CD19VH-Cβ associates with CD19VL-Cα to form the CD19 binding moiety; (b) CD3VL-Cα associates with CD3VH-Cβ to form the CD3 binding moiety; and (c) CD20VH-CH1 associates with CD20VL-CL to form the CD20 binding moiety. In some embodiments, (a) CD19VH-Cβ associates with CD19VL-Cα to form the CD19 binding moiety; (b) CD3VL-Cα associates with CD3VH-Cβ to form the CD3 binding moiety; or (c) CD20VH-CH1 associates with CD20VL-CL to form the CD20 binding moiety.

[0139] In some embodiments, Cα and Cβ associate to form a dimer via a bond or an interaction between Cα and Cβ. In some embodiments, Cα or Cβ comprises an amino acid modification that results in a disulfide bond formed between Cα and Cβ, and the disulfide bond improves the stability of the interface between Cαand Cβ. In some embodiments, the Fc region of the antibody or antigen-binding portion thereof comprises a first amino acid mutation that reduces or eliminates antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC) , complement-dependent cytotoxicity (CDC) or binding of the antibody or antigen-binding portion thereof to a Fc-gamma receptor (FcγR) . In some embodiments, the Fc region of the antibody or antigen-binding portion thereof comprises a first amino acid mutation that reduces or eliminates antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC) , complement-dependent cytotoxicity (CDC) and binding of the antibody or antigen-binding portion thereof to a Fc-gamma receptor (FcγR) . In some embodiments, the first amino acid mutation comprises a substitution of phenylalanine (F) with alanine (A) at amino acid 234 according to the EU numbering (F234A) . In some embodiments, the first amino acid mutation comprises a substitution of leucine (L) with alanine (A) at amino acid 235 according to the EU numbering (L235A) . In some embodiments, the first amino acid mutation comprises F234A and L235A. In some embodiments, the Fc region of the first heavy chain (HC1) comprises the first amino acid mutation comprising F234A and L235A. In some embodiments, the Fc region of the second heavy chain (HC2) comprises the first amino acid mutation comprising F234A and L235A. In some embodiments, the Fc region of the first heavy chain (HC1) comprises the first amino acid mutation comprising F234A and L235A and the Fc region of the second heavy chain (HC2) comprises the first amino acid mutation comprising F234A and L235A.

[0140] In some embodiments, the Fc region of the first heavy chain (HC1) or second heavy chain (HC2) comprises a second amino acid mutation that results in knob-into-hole substitution in the first heavy chain (HC1) or second heavy chain (HC2) . In some embodiments, the Fc region of the first heavy chain (HC1) and second heavy chain (HC2) each comprises a second amino acid mutation that results in knob-into-hole substitution in the first heavy chain (HC1) and second heavy chain (HC2) . In some embodiments, the second amino acid mutation of the Fc region comprises: (a) a substitution of serine (S) with cysteine (C) at amino acid residue 354 according to the EU numbering (S354C) ; (b) a substitution of threonine (T) with tryptophan (W) at amino acid residue 366 according to the EU numbering (T366W) ; (c) a substitution of tyrosine (Y) with cysteine (C) at amino acid residue 349 according to the EU numbering (Y349C) ; (d) a substitution of threonine (T) with serine (S) at amino acid residue 366 according to the EU numbering (T366S) ; (e) a substitution of leucine (L) with alanine (A) at amino acid residue 368 according to the EU numbering (L368A) ; or (f) a substitution of tyrosine (Y) with valine (V) at amino acid residue 407 according to the EU numbering (Y407V) . In some embodiments, the second amino acid mutation of the Fc region comprises S354C, T366W, Y349C, T366S, L368A, and Y407V. In some embodiments, the second amino acid mutation of the Fc region comprises S354C. In some embodiments, the second amino acid mutation of the Fc region comprises T366W. In some embodiments, the second amino acid mutation of the Fc region comprises Y349C. In some embodiments, the second amino acid mutation of the Fc region comprises T366S. In some embodiments, the second amino acid mutation of the Fc region comprises L368A. In some embodiments, the second amino acid mutation of the Fc region comprises Y407V. In some embodiments, (a) the Fc region of the first heavy chain (HC1) comprises the second amino acid mutation comprising Y349C, T366S, L368A, or Y407V; or (b) the Fc region of the second heavy chain (HC2) comprises the second amino acid mutation comprising S354C or T366W. In some embodiments, (a) the Fc region of the first heavy chain (HC1) comprises the second amino acid mutation compri sing S354C or T366W; and (b) the Fc region of the second heavy chain (HC2) comprises the second amino acid mutation comprising Y349C, T366S, L368A, or Y407V. In some embodiments, (a) the Fc region of the first heavy chain (HC1) comprises the second amino acid mutation comprising Y349C, T366S, L368A, or Y407V; and (b) the Fc region of the second heavy chain (HC2) comprises the second amino acid mutation comprising S354C or T366W. In some embodiments, (a) the Fc region of the first heavy chain (HC1) comprises the second amino acid mutation comprising S354C and T366W; and (b) the Fc region of the second heavy chain (HC2) comprises the second amino acid mutation comprising Y349C, T366S, L368A, and Y407V. In some embodiments, (a) the Fc region of the first heavy chain (HC1) comprises the second amino acid mutation comprising Y349C, T366S, L368A, and Y407V; and (b) the Fc region of the second heavy chain (HC2) comprises the second amino acid mutation comprising S354C and T366W. In some embodiments, (a) the Fc region of the first heavy chain (HC1) comprises the first amino acid mutation comprising F234A and L235A and the second amino acid mutation comprising S354C and T366W; and (b) the Fc region of the second heavy chain (HC2) comprises the first amino acid mutation comprising F234A and L235A and the second amino acid mutation comprising Y349C, T366S, L368A, and Y407V. In some embodiments, (a) the Fc region of the first heavy chain (HC1) comprises the first amino acid mutation comprising F234A and L235A and the second amino acid mutation comprising Y349C, T366S, L368A, and Y407V; and (b) the Fc region of the second heavy chain (HC2) comprises the first amino acid mutation comprising F234A and L235A and the second amino acid mutation comprising S354C and T366W. In some embodiments, the Fc region of the first heavy chain (HC1) or second heavy chain (HC2) comprises a third amino acid mutation comprising: (a) a substitution of serine (S) with proline (P) at amino acid residue 228 according to the EU numbering (S228P) ; (b) a substitution of methionine (M) with tyrosine (Y) at amino acid residue 252 according to the EU numbering (M252Y) ; (c) a substitution of serine (S) with threonine (T) at amino acid residue 254 according to the EU numbering (S254T) ; or (d) a substitution of threonine (T) with glutamic acid (E) at amino acid residue 256 according to the EU numbering (T256E) . In some embodiments, the Fc region of the first heavy chain (HC1) or second heavy chain (HC2) comprises a third amino acid mutation comprising S228P, M252Y, S254T and T256E. In some embodiments, the Fc region of the first heavy chain (HC1) comprises a third amino acid mutation comprising S228P, M252Y, S254T, or T256E. In some embodiments, the Fc region of the first heavy chain (HC1) comprises a third amino acid mutation comprising S228P. In some embodiments, the Fc region of the first heavy chain (HC1) comprises a third amino acid mutation comprising M252Y. In some embodiments, the Fc region of the first heavy chain (HC1) comprises a third amino acid mutation comprising S254T. In some embodiments, the Fc region of the first heavy chain (HC1) comprises a third amino acid mutation comprising T256E. In some embodiments, the Fc region of the second heavy chain (HC1) comprises a third amino acid mutation comprising S228P, M252Y, S254T, or T256E. In some embodiments, the Fc region of the second heavy chain (HC1) comprises a third amino acid mutation comprising S228P. In some embodiments, the Fc region of the second heavy chain (HC1) comprises a third amino acid mutation comprising M252Y. In some embodiments, the Fc region of the second heavy chain (HC1) comprises a third amino acid mutation comprising S254T. In some embodiments, the Fc region of the second heavy chain (HC1) comprises a third amino acid mutation comprising T256E.

[0141] In some embodiments, the Fc region of the first heavy chain (HC1) comprises an amino acid sequence with about 70%to about 100%sequence identity to SEQ ID NO: 36, e.g., about 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or about 100%sequence identity, or any percentage there between. In some embodiments, the Fc region of the second heavy chain (HC2) comprises an amino acid sequence with about 70%to about 100%sequence identity to SEQ ID NO: 43, e.g., about 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or about 100%sequence identity, or any percentage there between. In some embodiments, (a) the Fc region of the first heavy chain (HC1) comprises an amino acid sequence with at least 70%sequence identity to SEQ ID NO: 36; or (b) the Fc region of the second heavy chain (HC2) comprises an amino acid sequence with at least 70%sequence identity to SEQ ID NO: 43. In some embodiments, (a) the Fc region of the first heavy chain (HC1) comprises an amino acid sequence with at least 70%sequence identity to SEQ ID NO: 36; and (b) the Fc region of the second heavy chain (HC2) comprises an amino acid sequence with at least 70%sequence identity to SEQ ID NO: 43. In some embodiments, (a) the Fc region of the first heavy chain (HC1) comprises an amino acid sequence with at least 75%sequence identity to SEQ ID NO: 36; or (b) the Fc region of the second heavy chain (HC2) comprises an amino acid sequence with at least 75%sequence identity to SEQ ID NO: 43. In some embodiments, (a) the Fc region of the first heavy chain (HC1) comprises an amino acid sequence with at least 75%sequence identity to SEQ ID NO: 36; and (b) the Fc region of the second heavy chain (HC2) comprises an amino acid sequence with at least 75%sequence identity to SEQ ID NO: 43. In some embodiments, (a) the Fc region of the first heavy chain (HC1) comprises an amino acid sequence with at least 80%sequence identity to SEQ ID NO: 36; or (b) the Fc region of the second heavy chain (HC2) comprises an amino acid sequence with at least 80%sequence identity to SEQ ID NO: 43. In some embodiments, (a) the Fc region of the first heavy chain (HC1) comprises an amino acid sequence with at least 80%sequence identity to SEQ ID NO: 36; and (b) the Fc region of the second heavy chain (HC2) comprises an amino acid sequence with at least 80%sequence identity to SEQ ID NO: 43. In some embodiments, (a) the Fc region of the first heavy chain (HC1) comprises an amino acid sequence with at least 85%sequence identity to SEQ ID NO: 36; or (b) the Fc region of the second heavy chain (HC2) comprises an amino acid sequence with at least 85%sequence identity to SEQ ID NO: 43. In some embodiments, (a) the Fc region of the first heavy chain (HC1) comprises an amino acid sequence with at least 85%sequence identity to SEQ ID NO: 36; and (b) the Fc region of the second heavy chain (HC2) comprises an amino acid sequence with at least 85%sequence identity to SEQ ID NO: 43. In some embodiments, (a) the Fc region of the first heavy chain (HC1) comprises an amino acid sequence with at least 86%sequence identity to SEQ ID NO: 36; or (b) the Fc region of the second heavy chain (HC2) comprises an amino acid sequence with at least 86%sequence identity to SEQ ID NO: 43. In some embodiments, (a) the Fc region of the first heavy chain (HC1) comprises an amino acid sequence with at least 86%sequence identity to SEQ ID NO: 36; and (b) the Fc region of the second heavy chain (HC2) comprises an amino acid sequence with at least 86%sequence identity to SEQ ID NO: 43. In some embodiments, (a) the Fc region of the first heavy chain (HC1) comprises an amino acid sequence with at least 87%sequence identity to SEQ ID NO: 36; or (b) the Fc region of the second heavy chain (HC2) comprises an amino acid sequence with at least 87%sequence identity to SEQ ID NO: 43. In some embodiments, (a) the Fc region of the first heavy chain (HC1) comprises an amino acid sequence with at least 87%sequence identity to SEQ ID NO: 36; and (b) the Fc region of the second heavy chain (HC2) comprises an amino acid sequence with at least 87%sequence identity to SEQ ID NO: 43. In some embodiments, (a) the Fc region of the first heavy chain (HC1) comprises an amino acid sequence with at least 88%sequence identity to SEQ ID NO: 36; or (b) the Fc region of the second heavy chain (HC2) comprises an amino acid sequence with at least 88%sequence identity to SEQ ID NO: 43. In some embodiments, (a) the Fc region of the first heavy chain (HC1) comprises an amino acid sequence with at least 88%sequence identity to SEQ ID NO: 36; and (b) the Fc region of the second heavy chain (HC2) comprises an amino acid sequence with at least 88%sequence identity to SEQ ID NO: 43. In some embodiments, (a) the Fc region of the first heavy chain (HC1) comprises an amino acid sequence with at least 89%sequence identity to SEQ ID NO: 36; or (b) the Fc region of the second heavy chain (HC2) comprises an amino acid sequence with at least 89%sequence identity to SEQ ID NO: 43. In some embodiments, (a) the Fc region of the first heavy chain (HC1) comprises an amino acid sequence with at least 89%sequence identity to SEQ ID NO: 36; and (b) the Fc region of the second heavy chain (HC2) comprises an amino acid sequence with at least 89%sequence identity to SEQ ID NO: 43. In some embodiments, (a) the Fc region of the first heavy chain (HC1) comprises an amino acid sequence with at least 90%sequence identity to SEQ ID NO: 36; or (b) the Fc region of the second heavy chain (HC2) comprises an amino acid sequence with at least 90%sequence identity to SEQ ID NO: 43. In some embodiments, (a) the Fc region of the first heavy chain (HC1) comprises an amino acid sequence with at least 90%sequence identity to SEQ ID NO: 36; and (b) the Fc region of the second heavy chain (HC2) comprises an amino acid sequence with at least 90%sequence identity to SEQ ID NO: 43. In some embodiments, (a) the Fc region of the first heavy chain (HC1) comprises an amino acid sequence with at least 91%sequence identity to SEQ ID NO: 36; or (b) the Fc region of the second heavy chain (HC2) comprises an amino acid sequence with at least 91%sequence identity to SEQ ID NO: 43. In some embodiments, (a) the Fc region of the first heavy chain (HC1) comprises an amino acid sequence with at least 91%sequence identity to SEQ ID NO: 36; and (b) the Fc region of the second heavy chain (HC2) comprises an amino acid sequence with at least 91%sequence identity to SEQ ID NO: 43. In some embodiments, (a) the Fc region of the first heavy chain (HC1) comprises an amino acid sequence with at least 92%sequence identity to SEQ ID NO: 36; or (b) the Fc region of the second heavy chain (HC2) comprises an amino acid sequence with at least 92%sequence identity to SEQ ID NO: 43. In some embodiments, (a) the Fc region of the first heavy chain (HC1) comprises an amino acid sequence with at least 92%sequence identity to SEQ ID NO: 36; and (b) the Fc region of the second heavy chain (HC2) comprises an amino acid sequence with at least 92%sequence identity to SEQ ID NO: 43. In some embodiments, (a) the Fc region of the first heavy chain (HC1) comprises an amino acid sequence with at least 93%sequence identity to SEQ ID NO: 36; or (b) the Fc region of the second heavy chain (HC2) comprises an amino acid sequence with at least 93%sequence identity to SEQ ID NO: 43. In some embodiments, (a) the Fc region of the first heavy chain (HC1) comprises an amino acid sequence with at least 93%sequence identity to SEQ ID NO: 36; and (b) the Fc region of the second heavy chain (HC2) comprises an amino acid sequence with at least 93%sequence identity to SEQ ID NO: 43. In some embodiments, (a) the Fc region of the first heavy chain (HC1) comprises an amino acid sequence with at least 94%sequence identity to SEQ ID NO: 36; or (b) the Fc region of the second heavy chain (HC2) comprises an amino acid sequence with at least 94%sequence identity to SEQ ID NO: 43. In some embodiments, (a) the Fc region of the first heavy chain (HC1) comprises an amino acid sequence with at least 94%sequence identity to SEQ ID NO: 36; and (b) the Fc region of the second heavy chain (HC2) comprises an amino acid sequence with at least 94%sequence identity to SEQ ID NO: 43. In some embodiments, (a) the Fc region of the first heavy chain (HC1) comprises an amino acid sequence with at least 95%sequence identity to SEQ ID NO: 36; or (b) the Fc region of the second heavy chain (HC2) comprises an amino acid sequence with at least 95%sequence identity to SEQ ID NO: 43. In some embodiments, (a) the Fc region of the first heavy chain (HC1) comprises an amino acid sequence with at least 95%sequence identity to SEQ ID NO: 36; and (b) the Fc region of the second heavy chain (HC2) comprises an amino acid sequence with at least 95%sequence identity to SEQ ID NO: 43. In some embodiments, (a) the Fc region of the first heavy chain (HC1) comprises an amino acid sequence with at least 96%sequence identity to SEQ ID NO: 36; or (b) the Fc region of the second heavy chain (HC2) comprises an amino acid sequence with at least 96%sequence identity to SEQ ID NO: 43. In some embodiments, (a) the Fc region of the first heavy chain (HC1) comprises an amino acid sequence with at least 96%sequence identity to SEQ ID NO: 36; and (b) the Fc region of the second heavy chain (HC2) comprises an amino acid sequence with at least 96%sequence identity to SEQ ID NO: 43. In some embodiments, (a) the Fc region of the first heavy chain (HC1) comprises an amino acid sequence with at least 97%sequence identity to SEQ ID NO: 36; or (b) the Fc region of the second heavy chain (HC2) comprises an amino acid sequence with at least 97%sequence identity to SEQ ID NO: 43. In some embodiments, (a) the Fc region of the first heavy chain (HC1) comprises an amino acid sequence with at least 97%sequence identity to SEQ ID NO: 36; and (b) the Fc region of the second heavy chain (HC2) comprises an amino acid sequence with at least 97%sequence identity to SEQ ID NO: 43. In some embodiments, (a) the Fc region of the first heavy chain (HC1) comprises an amino acid sequence with at least 98%sequence identity to SEQ ID NO: 36; or (b) the Fc region of the second heavy chain (HC2) comprises an amino acid sequence with at least 98%sequence identity to SEQ ID NO: 43. In some embodiments, (a) the Fc region of the first heavy chain (HC1) comprises an amino acid sequence with at least 98%sequence identity to SEQ ID NO: 36; and (b) the Fc region of the second heavy chain (HC2) comprises an amino acid sequence with at least 98%sequence identity to SEQ ID NO: 43. In some embodiments, (a) the Fc region of the first heavy chain (HC1) comprises an amino acid sequence with at least 99%sequence identity to SEQ ID NO: 36; or (b) the Fc region of the second heavy chain (HC2) comprises an amino acid sequence with at least 99%sequence identity to SEQ ID NO: 43. In some embodiments, (a) the Fc region of the first heavy chain (HC1) comprises an amino acid sequence with at least 99%sequence identity to SEQ ID NO: 36; and (b) the Fc region of the second heavy chain (HC2) comprises an amino acid sequence with at least 99%sequence identity to SEQ ID NO: 43. In some embodiments, (a) the Fc region of the first heavy chain (HC1) comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 36; or (b) the Fc region of the second heavy chain (HC2) comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 43. In some embodiments, (a) the Fc region of the first heavy chain (HC1) comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 36; and (b) the Fc region of the second heavy chain (HC2) comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 43.

[0142] In some embodiments, the HC1 comprises an amino acid sequence with about 70%to about 100%sequence identity to SEQ ID NO: 25, e.g., about 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or about 100%sequence identity, or any percentage there between. In some embodiments, the HC2 comprises an amino acid sequence with about 70%to about 100%sequence identity to SEQ ID NO: 26 , e.g., about 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or about 100%sequence identity, or any percentage there between. In some embodiments, the LC1 comprises an amino acid sequence with about 70%to about 100%sequence identity to SEQ ID NO: 27, e.g., about 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or about 100%sequence identity, or any percentage there between. In some embodiments, the LC2 comprises an amino acid sequence with about 70%to about 100%sequence identity to SEQ ID NO: 28, e.g., about 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or about 100%sequence identity, or any percentage there between. In some embodiments, the LC3 comprises an amino acid sequence with about 70%to about 100%sequence identity to SEQ ID NO: 29, e.g., about 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or about 100%sequence identity, or any percentage there between.

[0143] In embodiments, (a) the HC1 comprises an amino acid sequence with at least 70%sequence identity to SEQ ID NO: 25; (b) HC2 comprises an amino acid sequence with at least 70%sequence identity to SEQ ID NO: 26; (c) LC1 comprises an amino acid sequence with at least 70%sequence identity to SEQ ID NO: 27; (d) LC2 comprises an amino acid sequence with at least 70%sequence identity to SEQ ID NO: 28; or (e) LC3 comprises an amino acid sequence with at least 70%sequence identity to SEQ ID NO: 29. In some embodiments, (a) HC1 comprises an amino acid sequence with at least 70%sequence identity to SEQ ID NO: 25; (b) HC2 comprises an amino acid sequence with at least 70%sequence identity to SEQ ID NO: 26; (c) LC1 comprises an amino acid sequence with at least 70%sequence identity to SEQ ID NO: 27; (d) LC2 comprises an amino acid sequence with at least 70%sequence identity to SEQ ID NO: 28; and (e) LC3 comprises an amino acid sequence with at least 70%sequence identity to SEQ ID NO: 29. In embodiments, (a) the HC1 comprises an amino acid sequence with at least 75%sequence identity to SEQ ID NO: 25; (b) HC2 comprises an amino acid sequence with at least 75%sequence identity to SEQ ID NO: 26; (c) LC1 comprises an amino acid sequence with at least 75%sequence identity to SEQ ID NO: 27; (d) LC2 comprises an amino acid sequence with at least 75%sequence identity to SEQ ID NO: 28; or (e) LC3 comprises an amino acid sequence with at least 75%sequence identity to SEQ ID NO: 29. In some embodiments, (a) HC1 comprises an amino acid sequence with at least 75%sequence identity to SEQ ID NO: 25; (b) HC2 comprises an amino acid sequence with at least 75%sequence identity to SEQ ID NO: 26; (c) LC1 comprises an amino acid sequence with at least 75%sequence identity to SEQ ID NO: 27; (d) LC2 comprises an amino acid sequence with at least 75%sequence identity to SEQ ID NO: 28; and (e) LC3 comprises an amino acid sequence with at least 75%sequence identity to SEQ ID NO: 29. In some embodiments, (a) the HC1 comprises an amino acid sequence with at least 80%sequence identity to SEQ ID NO: 25; (b) HC2 comprises an amino acid sequence with at least 80%sequence identity to SEQ ID NO: 26; (c) LC1 comprises an amino acid sequence with at least 80%sequence identity to SEQ ID NO: 27; (d) LC2 comprises an amino acid sequence with at least 80%sequence identity to SEQ ID NO: 28; or (e) LC3 comprises an amino acid sequence with at least 80%sequence identity to SEQ ID NO: 29. In some embodiments, (a) HC1 comprises an amino acid sequence with at least 80%sequence identity to SEQ ID NO: 25; (b) HC2 comprises an amino acid sequence with at least 80%sequence identity to SEQ ID NO: 26; (c) LC1 comprises an amino acid sequence with at least 80%sequence identity to SEQ ID NO: 27; (d) LC2 comprises an amino acid sequence with at least 80%sequence identity to SEQ ID NO: 28; and (e) LC3 comprises an amino acid sequence with at least 80%sequence identity to SEQ ID NO: 29. In some embodiments, (a) the HC1 comprises an amino acid sequence with at least 85%sequence identity to SEQ ID NO: 25; (b) HC2 comprises an amino acid sequence with at least 85%sequence identity to SEQ ID NO: 26; (c) LC1 comprises an amino acid sequence with at least 85%sequence identity to SEQ ID NO: 27; (d) LC2 comprises an amino acid sequence with at least 85%sequence identity to SEQ ID NO: 28; or (e) LC3 comprises an amino acid sequence with at least 85%sequence identity to SEQ ID NO: 29. In some embodiments, (a) HC1 comprises an amino acid sequence with at least 85%sequence identity to SEQ ID NO: 25; (b) HC2 comprises an amino acid sequence with at least 85%sequence identity to SEQ ID NO: 26; (c) LC1 comprises an amino acid sequence with at least 85%sequence identity to SEQ ID NO: 27; (d) LC2 comprises an amino acid sequence with at least 85%sequence identity to SEQ ID NO: 28; and (e) LC3 comprises an amino acid sequence with at least 85%sequence identity to SEQ ID NO: 29. In some embodiments, (a) the HC1 comprises an amino acid sequence with at least 86%sequence identity to SEQ ID NO: 25; (b) HC2 comprises an amino acid sequence with at least 86%sequence identity to SEQ ID NO: 26; (c) LC1 comprises an amino acid sequence with at least 86%sequence identity to SEQ ID NO: 27; (d) LC2 comprises an amino acid sequence with at least 86%sequence identity to SEQ ID NO: 28; or (e) LC3 comprises an amino acid sequence with at least 86%sequence identity to SEQ ID NO: 29. In some embodiments, (a) HC1 comprises an amino acid sequence with at least 86%sequence identity to SEQ ID NO: 25; (b) HC2 comprises an amino acid sequence with at least 86%sequence identity to SEQ ID NO: 26; (c) LC1 comprises an amino acid sequence with at least 86%sequence identity to SEQ ID NO: 27; (d) LC2 comprises an amino acid sequence with at least 86%sequence identity to SEQ ID NO: 28; and (e) LC3 comprises an amino acid sequence with at least 86%sequence identity to SEQ ID NO: 29. In some embodiments, (a) the HC1 comprises an amino acid sequence with at least 87%sequence identity to SEQ ID NO: 25; (b) HC2 comprises an amino acid sequence with at least 87%sequence identity to SEQ ID NO: 26; (c) LC1 comprises an amino acid sequence with at least 87%sequence identity to SEQ ID NO: 27; (d) LC2 comprises an amino acid sequence with at least 87%sequence identity to SEQ ID NO: 28; or (e) LC3 comprises an amino acid sequence with at least 87%sequence identity to SEQ ID NO: 29. In some embodiments, (a) HC1 comprises an amino acid sequence with at least 87%sequence identity to SEQ ID NO: 25; (b) HC2 comprises an amino acid sequence with at least 87%sequence identity to SEQ ID NO: 26; (c) LC1 comprises an amino acid sequence with at least 87%sequence identity to SEQ ID NO: 27; (d) LC2 comprises an amino acid sequence with at least 87%sequence identity to SEQ ID NO: 28; and (e) LC3 comprises an amino acid sequence with at least 87%sequence identity to SEQ ID NO: 29. In some embodiments, (a) the HC1 comprises an amino acid sequence with at least 88%sequence identity to SEQ ID NO: 25; (b) HC2 comprises an amino acid sequence with at least 88%sequence identity to SEQ ID NO: 26; (c) LC1 comprises an amino acid sequence with at least 88%sequence identity to SEQ ID NO: 27; (d) LC2 comprises an amino acid sequence with at least 88%sequence identity to SEQ ID NO: 28; or (e) LC3 comprises an amino acid sequence with at least 88%sequence identity to SEQ ID NO: 29. In some embodiments, (a) HC1 comprises an amino acid sequence with at least 88%sequence identity to SEQ ID NO: 25; (b) HC2 comprises an amino acid sequence with at least 88%sequence identity to SEQ ID NO: 26; (c) LC1 comprises an amino acid sequence with at least 88%sequence identity to SEQ ID NO: 27; (d) LC2 comprises an amino acid sequence with at least 88%sequence identity to SEQ ID NO: 28; and (e) LC3 comprises an amino acid sequence with at least 88%sequence identity to SEQ ID NO: 29. In some embodiments, (a) the HC1 comprises an amino acid sequence with at least 89%sequence identity to SEQ ID NO: 25; (b) HC2 comprises an amino acid sequence with at least 89%sequence identity to SEQ ID NO: 26; (c) LC1 comprises an amino acid sequence with at least 89%sequence identity to SEQ ID NO: 27; (d) LC2 comprises an amino acid sequence with at least 89%sequence identity to SEQ ID NO: 28; or (e) LC3 comprises an amino acid sequence with at least 89%sequence identity to SEQ ID NO: 29. In some embodiments, (a) HC1 comprises an amino acid sequence with at least 89%sequence identity to SEQ ID NO: 25; (b) HC2 comprises an amino acid sequence with at least 89%sequence identity to SEQ ID NO: 26; (c) LC1 comprises an amino acid sequence with at least 89%sequence identity to SEQ ID NO: 27; (d) LC2 comprises an amino acid sequence with at least 89%sequence identity to SEQ ID NO: 28; and (e) LC3 comprises an amino acid sequence with at least 89%sequence identity to SEQ ID NO: 29. In some embodiments, (a) the HC1 comprises an amino acid sequence with at least 90%sequence identity to SEQ ID NO: 25; (b) HC2 comprises an amino acid sequence with at least 90%sequence identity to SEQ ID NO: 26; (c) LC1 comprises an amino acid sequence with at least 90%sequence identity to SEQ ID NO: 27; (d) LC2 comprises an amino acid sequence with at least 90%sequence identity to SEQ ID NO: 28; or (e) LC3 comprises an amino acid sequence with at least 90%sequence identity to SEQ ID NO: 29. In some embodiments, (a) HC1 comprises an amino acid sequence with at least 90%sequence identity to SEQ ID NO: 25; (b) HC2 comprises an amino acid sequence with at least 90%sequence identity to SEQ ID NO: 26; (c) LC1 comprises an amino acid sequence with at least 90%sequence identity to SEQ ID NO: 27; (d) LC2 comprises an amino acid sequence with at least 90%sequence identity to SEQ ID NO: 28; and (e) LC3 comprises an amino acid sequence with at least 90%sequence identity to SEQ ID NO: 29. In some embodiments, (a) the HC1 comprises an amino acid sequence with at least 91%sequence identity to SEQ ID NO: 25; (b) HC2 comprises an amino acid sequence with at least 91%sequence identity to SEQ ID NO: 26; (c) LC1 comprises an amino acid sequence with at least 91%sequence identity to SEQ ID NO: 27; (d) LC2 comprises an amino acid sequence with at least 91%sequence identity to SEQ ID NO: 28; or (e) LC3 comprises an amino acid sequence with at least 91%sequence identity to SEQ ID NO: 29. In some embodiments, (a) HC1 comprises an amino acid sequence with at least 91%sequence identity to SEQ ID NO: 25; (b) HC2 comprises an amino acid sequence with at least 91%sequence identity to SEQ ID NO: 26; (c) LC1 comprises an amino acid sequence with at least 91%sequence identity to SEQ ID NO: 27; (d) LC2 comprises an amino acid sequence with at least 91%sequence identity to SEQ ID NO: 28; and (e) LC3 comprises an amino acid sequence with at least 91%sequence identity to SEQ ID NO: 29. In some embodiments, (a) the HC1 comprises an amino acid sequence with at least 92%sequence identity to SEQ ID NO: 25; (b) HC2 comprises an amino acid sequence with at least 92%sequence identity to SEQ ID NO: 26; (c) LC1 comprises an amino acid sequence with at least 92%sequence identity to SEQ ID NO: 27; (d) LC2 comprises an amino acid sequence with at least 92%sequence identity to SEQ ID NO: 28; or (e) LC3 comprises an amino acid sequence with at least 92%sequence identity to SEQ ID NO: 29. In some embodiments, (a) HC1 comprises an amino acid sequence with at least 92%sequence identity to SEQ ID NO: 25; (b) HC2 comprises an amino acid sequence with at least 92%sequence identity to SEQ ID NO: 26; (c) LC1 comprises an amino acid sequence with at least 92%sequence identity to SEQ ID NO: 27; (d) LC2 comprises an amino acid sequence with at least 92%sequence identity to SEQ ID NO: 28; and (e) LC3 comprises an amino acid sequence with at least 92%sequence identity to SEQ ID NO: 29. In some embodiments, (a) the HC1 comprises an amino acid sequence with at least 93%sequence identity to SEQ ID NO: 25; (b) HC2 comprises an amino acid sequence with at least 93%sequence identity to SEQ ID NO: 26; (c) LC1 comprises an amino acid sequence with at least 93%sequence identity to SEQ ID NO: 27; (d) LC2 comprises an amino acid sequence with at least 93%sequence identity to SEQ ID NO: 28; or (e) LC3 comprises an amino acid sequence with at least 93%sequence identity to SEQ ID NO: 29. In some embodiments, (a) HC1 comprises an amino acid sequence with at least 93%sequence identity to SEQ ID NO: 25; (b) HC2 comprises an amino acid sequence with at least 93%sequence identity to SEQ ID NO: 26; (c) LC1 comprises an amino acid sequence with at least 93%sequence identity to SEQ ID NO: 27; (d) LC2 comprises an amino acid sequence with at least 93%sequence identity to SEQ ID NO: 28; and (e) LC3 comprises an amino acid sequence with at least 93%sequence identity to SEQ ID NO: 29. In some embodiments, (a) the HC1 comprises an amino acid sequence with at least 94%sequence identity to SEQ ID NO: 25; (b) HC2 comprises an amino acid sequence with at least 94%sequence identity to SEQ ID NO: 26; (c) LC1 comprises an amino acid sequence with at least 94%sequence identity to SEQ ID NO: 27; (d) LC2 comprises an amino acid sequence with at least 94%sequence identity to SEQ ID NO: 28; or (e) LC3 comprises an amino acid sequence with at least 94%sequence identity to SEQ ID NO: 29. In some embodiments, (a) HC1 comprises an amino acid sequence with at least 94%sequence identity to SEQ ID NO: 25; (b) HC2 comprises an amino acid sequence with at least 94%sequence identity to SEQ ID NO: 26; (c) LC1 comprises an amino acid sequence with at least 94%sequence identity to SEQ ID NO: 27; (d) LC2 comprises an amino acid sequence with at least 94%sequence identity to SEQ ID NO: 28; and (e) LC3 comprises an amino acid sequence with at least 94%sequence identity to SEQ ID NO: 29. In some embodiments, (a) the HC1 comprises an amino acid sequence with at least 95%sequence identity to SEQ ID NO: 25; (b) HC2 comprises an amino acid sequence with at least 95%sequence identity to SEQ ID NO: 26; (c) LC1 comprises an amino acid sequence with at least 95%sequence identity to SEQ ID NO: 27; (d) LC2 comprises an amino acid sequence with at least 95%sequence identity to SEQ ID NO: 28; or (e) LC3 comprises an amino acid sequence with at least 95%sequence identity to SEQ ID NO: 29. In some embodiments, (a) HC1 comprises an amino acid sequence with at least 95%sequence identity to SEQ ID NO: 25; (b) HC2 comprises an amino acid sequence with at least 95%sequence identity to SEQ ID NO: 26; (c) LC1 comprises an amino acid sequence with at least 95%sequence identity to SEQ ID NO: 27; (d) LC2 comprises an amino acid sequence with at least 95%sequence identity to SEQ ID NO: 28; and (e) LC3 comprises an amino acid sequence with at least 95%sequence identity to SEQ ID NO: 29. In some embodiments, (a) the HC1 comprises an amino acid sequence with at least 96%sequence identity to SEQ ID NO: 25; (b) HC2 comprises an amino acid sequence with at least 96%sequence identity to SEQ ID NO: 26; (c) LC1 comprises an amino acid sequence with at least 96%sequence identity to SEQ ID NO: 27; (d) LC2 comprises an amino acid sequence with at least 96%sequence identity to SEQ ID NO: 28; or (e) LC3 comprises an amino acid sequence with at least 96%sequence identity to SEQ ID NO: 29. In some embodiments, (a) HC1 comprises an amino acid sequence with at least 96%sequence identity to SEQ ID NO: 25; (b) HC2 comprises an amino acid sequence with at least 96%sequence identity to SEQ ID NO: 26; (c) LC1 comprises an amino acid sequence with at least 96%sequence identity to SEQ ID NO: 27; (d) LC2 comprises an amino acid sequence with at least 96%sequence identity to SEQ ID NO: 28; and (e) LC3 comprises an amino acid sequence with at least 96%sequence identity to SEQ ID NO: 29. In some embodiments, (a) the HC1 comprises an amino acid sequence with at least 97%sequence identity to SEQ ID NO: 25; (b) HC2 comprises an amino acid sequence with at least 97%sequence identity to SEQ ID NO: 26; (c) LC1 comprises an amino acid sequence with at least 97%sequence identity to SEQ ID NO: 27; (d) LC2 comprises an amino acid sequence with at least 97%sequence identity to SEQ ID NO: 28; or (e) LC3 comprises an amino acid sequence with at least 97%sequence identity to SEQ ID NO: 29. In some embodiments, (a) HC1 comprises an amino acid sequence with at least 97%sequence identity to SEQ ID NO: 25; (b) HC2 comprises an amino acid sequence with at least 97%sequence identity to SEQ ID NO: 26; (c) LC1 comprises an amino acid sequence with at least 97%sequence identity to SEQ ID NO: 27; (d) LC2 comprises an amino acid sequence with at least 97%sequence identity to SEQ ID NO: 28; and (e) LC3 comprises an amino acid sequence with at least 97%sequence identity to SEQ ID NO: 29. In some embodiments, (a) the HC1 comprises an amino acid sequence with at least 98%sequence identity to SEQ ID NO: 25; (b) HC2 comprises an amino acid sequence with at least 98%sequence identity to SEQ ID NO: 26; (c) LC1 comprises an amino acid sequence with at least 98%sequence identity to SEQ ID NO: 27; (d) LC2 comprises an amino acid sequence with at least 98%sequence identity to SEQ ID NO: 28; or (e) LC3 comprises an amino acid sequence with at least 98%sequence identity to SEQ ID NO: 29. In some embodiments, (a) HC1 comprises an amino acid sequence with at least 98%sequence identity to SEQ ID NO: 25; (b) HC2 comprises an amino acid sequence with at least 98%sequence identity to SEQ ID NO: 26; (c) LC1 comprises an amino acid sequence with at least 98%sequence identity to SEQ ID NO: 27; (d) LC2 comprises an amino acid sequence with at least 98%sequence identity to SEQ ID NO: 28; and (e) LC3 comprises an amino acid sequence with at least 98%sequence identity to SEQ ID NO: 29. In some embodiments, (a) the HC1 comprises an amino acid sequence with at least 99%sequence identity to SEQ ID NO: 25; (b) HC2 comprises an amino acid sequence with at least 99%sequence identity to SEQ ID NO: 26; (c) LC1 comprises an amino acid sequence with at least 99%sequence identity to SEQ ID NO: 27; (d) LC2 comprises an amino acid sequence with at least 99%sequence identity to SEQ ID NO: 28; or (e) LC3 comprises an amino acid sequence with at least 99%sequence identity to SEQ ID NO: 29. In some embodiments, (a) HC1 comprises an amino acid sequence with at least 99%sequence identity to SEQ ID NO: 25; (b) HC2 comprises an amino acid sequence with at least 99%sequence identity to SEQ ID NO: 26; (c) LC1 comprises an amino acid sequence with at least 99%sequence identity to SEQ ID NO: 27; (d) LC2 comprises an amino acid sequence with at least 99%sequence identity to SEQ ID NO: 28; and (e) LC3 comprises an amino acid sequence with at least 99%sequence identity to SEQ ID NO: 29. In some embodiments, (a) HC1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 25; (b) HC2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26; (c) LC1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 27; (d) LC2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 28; or (e) LC3 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 29. In some embodiments, (a) HC1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 25; (b) HC2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26; (c) LC1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 27; (d) LC2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 28; and (e) LC3 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 29.

[0144] In some embodiments, disclosed herein is a nucleic acid sequence encoding the antibody or antigen-binding portion that targets CD19, CD3 and CD20 disclosed herein. In some embodiments, disclosed herein is a nucleic acid sequence encoding the antibody or antigen-binding portion. In some embodiments, disclosed herein is a nucleic acid sequence encoding the HC1, HC2, LC1, LC2, or LC3 of the antibody or antigen-binding portion thereof. In some of the embodiments, disclosed herein a nucleic acid sequence encoding the HC1, HC2, LC1, LC2, and LC3 of the antibody or antigen-binding portion thereof. In some embodiments, disclosed herein is a vector comprising the nucleic acid sequence. In some embodiments, disclosed herein is a host cell comprising the nucleic acid sequence or the vector. In some embodiments, disclosed herein is a pharmaceutical composition comprising the antibody or antigen-binding portion and a pharmaceutically acceptable carrier. In some embodiments, disclosed herein is a method for producing the antibody or antigen-binding portion thereof disclosed herein, comprising the steps of: (a) culturing a host cell comprising a nucleic acid sequence encoding the antibody or antigen-binding portion thereof under suitable conditions; and (b) isolating the antibody or antigen-binding portion thereof from the host cell. In some embodiments, disclosed herein is a method for producing the antibody or antigen-binding portion thereof, comprising the steps of: (a) culturing a host cell comprising a nucleic acid sequence encoding the HC1, HC2, LC1, LC2, or LC3 of the antibody or antigen-binding portion thereof under suitable conditions; and (b) isolating the antibody or antigen-binding portion thereof from the host cell. In some embodiments, disclosed herein is a method for producing the antibody or antigen-binding portion thereof, comprising the steps of: (a) culturing a host cell comprising a nucleic acid sequence encoding the HC1, HC2, LC1, LC2, and LC3 of the antibody or antigen-binding portion thereof under suitable conditions; and (d) isolating the antibody or antigen-binding portion thereof from the host cell.

[0145] In some embodiments, disclosed herein is a method for modulating a CD19 or CD20 related immune response in a subject, comprising administering to the subject the antibody or antigen-binding portion thereof or the pharmaceutical composition. In some embodiments, disclosed herein is a method for inhibiting growth of tumor cells in a subject, comprising administering an effective amount of the antibody or antigen-binding portion thereof or the pharmaceutical composition. In some embodiments, disclosed herein is a method for preventing or treating cancer in a subject, comprising administering an effective amount the antibody or antigen-binding portion thereof or the pharmaceutical composition to the subject. In some embodiments, the cancer comprises a cell expressing CD19 or CD20. In some embodiments, the cancer comprises a cell expressing CD19 and CD20. In some embodiments, the cancer comprises a B cell lymphoma. In some embodiments, the cancer is diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL) . In some embodiments, the cancer is non-Hodgkin lymphoma. In some embodiments, the cancer is mantle cell lymphoma (MCL) . In some embodiments, the cancer is marginal zone lymphoma (MZL) . In some embodiments, the cancer is follicular lymphoma (FL) . In some embodiments, the cancer is chronic lymphocytic leukemia. In some embodiments, the cancer is Waldenstrom macroglobulinemia (WM) . In some embodiments, the cancer is B-cell chronic lymphocytic leukemia. In some embodiments, the cancer is non-T acute lymphoblastic leukemia. In some embodiments, the cancer is acute lymphoblastic leukemia (ALL) . In some embodiments, the cancer is chronic lymphoid lymphoma. In some embodiments, the cancer is B-cell non-Hodgkin lymphoma (B-NHL) . In some embodiments, the cancer is selected from diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL) , non-Hodgkin lymphoma, mantle cell lymphoma (MCL) , marginal zone lymphoma (MZL) , follicular lymphoma (FL) , chronic lymphocytic leukemia, Waldenstrom macroglobulinemia (WM) , B-cell chronic lymphocytic leukemia, non-T acute lymphoblastic leukemia, acute lymphoblastic leukemia (ALL) , and chronic lymphoid lymphoma. In some embodiments, disclosed herein is an antibody or antigen-binding portion for use in diagnosing, treating or preventing cancer. In some embodiments, disclosed herein is a use of the antibody or antigen-binding portion thereof in the manufacture of a medicament for treating or preventing a cancer. In some embodiments, the cancer comprises a cell expressing CD19 or CD20. In some embodiments, the cancer comprises a cell expressing CD19 and CD20. In some embodiments, disclosed herein is a kit and the kit comprises a container comprising the antibody or antigen-binding portion thereof. In some embodiments, disclosed herein is a method of depleting a B cell in a monkey comprising administering to the monkey the antibody or antigen-binding portion thereof, thereby depleting the B cell. In some embodiments, the B cell expresses CD19. In some embodiments, the B cell expresses CD20. In some embodiments, the B cell is from blood, bone marrow, spleen, mesenteric lymph node, or mandibular lymph node.

[0146] In some embodiments, the antibody or antigen-binding portion thereof provides a half maximum plasma concentration in about 40.9 h to about 92.9 h (T1 / 2) in a monkey 5 days after intravenous administration at a dose of about 1.5 mg / kg. In some embodiments, the antibody or antigen-binding portion thereof provides a maximum plasma concentration (Cmax) of about 50.8 μg / ml to about 74.4 μg / ml in a monkey 5 days after intravenous administration at a dose of about 1.5 mg / kg. In some embodiments, the antibody or antigen-binding portion thereof provides an area under the curve up to the last quantifiable time-point (AUC0-t) of about 2051 h*μg / ml to about 3225 h*ug / ml in a monkey 5 days after intravenous administration at a dose of about 1.5 mg / kg. In some embodiments, the antibody or antigen-binding portion thereof provides a clearance rate of about 8.8 ml to about 13.3 ml per day per kilogram in a monkey 5 days after intravenous administration at a dose of about 1.5 mg / kg. In some embodiments, the antibody or antigen-binding portion thereof provides a half maximum plasma concentration in about 22.3 h to about 61.2 h (T1 / 2) in a monkey 7 days after intravenous administration at a dose of about 1.5 mg / kg. In some embodiments, the antibody or antigen-binding portion thereof provides a maximum plasma concentration (Cmax) of about 50.8 ug / ml to about 74.4 μg / ml in a monkey 7 days after intravenous administration at a dose of about 1.5 mg / kg. In some embodiments, the antibody or antigen-binding portion thereof provides an area under the curve up to the last quantifiable time-point (AUC0-t) of about 2202 h*μg / ml to about 3331 h*ug / ml in a monkey 7 days after intravenous administration at a dose of about 1.5 mg / kg. In some embodiments, the antibody or antigen-binding portion thereof provides a clearance rate of about 10.8 ml to about 16.1 ml per day per kilogram in a monkey 7 days after intravenous administration at a dose of about 1.5 mg / kg. In some embodiments, the intravenous administration is intravenous infusion over about 45 min. In some embodiments, the monkey is a cynomolgus monkey. In some embodiments, the antibody or antigen-binding portion thereof provides a half maximum plasma concentration in about 145 h (T1 / 2) in a rat after intravenous administration at a dose of about 10 mg / kg. In some embodiments, the antibody or antigen-binding portion thereof provides a maximum plasma concentration (Cmax) of about 227 μg / ml in a rat after intravenous administration at a dose of about 10 mg / kg. In some embodiments, the antibody or antigen-binding portion thereof provides an area under the curve up to the last quantifiable time-point (AUC0-t) of about 20173 h*ug / ml in a rat after intravenous administration at a dose of about 10 mg / kg. In some embodiments, the antibody or antigen-binding portion thereof provides a clearance rate of about 10.9 ml per day per kilogram in rat after intravenous administration at a dose of about 10 mg / kg. Additional Embodiments

[0147] These and other objectives are provided for by the present disclosure which, in a broad sense, is directed to compounds, methods, compositions and articles of manufacture that provide antibodies with improved efficacy. The benefits provided by the present disclosure are broadly applicable in the field of antibody therapeutics and diagnostics. The present disclosure provides multispecific antibodies or polypeptide complexes that bind CD3, CD19 and CD20 and multi-specific antigen binding fragments thereof. The CD3, CD19 and CD20 antigens may be human, mouse or cynomolgus monkey derived CD3, CD19 and CD20 proteins. The multi-specific antibodies may be chimeric, humanized or human monoclonal antibodies. In some embodiments, the multi-specific antibody or antigen-binding fragment is a trispecific polypeptide complex ( “CD3 x CD19 x CD20 trispecific antibody” ) or trispecific antigen-binding portion thereof. Specifically, the polypeptide complex or antigen-binding portion thereof comprises a CD19 binding moiety, a CD3 binding moiety and a CD20 binding moiety. In some embodiments, the polypeptide complex or antigen-binding portion thereof comprises two binding arms, wherein: (a) the first binding arm comprises the CD19 binding moiety operably linked to the CD3 binding moiety, and the second binding arm comprises the CD20 binding moiety; (b) the first binding arm comprises the CD20 binding moiety operably linked to the CD3 binding moiety, and the second binding arm comprises the CD19 binding moiety; or (c) the first binding arm comprises the CD19 binding moiety operably linked to the CD20 binding moiety, and the second binding arm comprises the CD3 binding moiety. In some embodiments, the CD19 binding moiety comprises a heavy chain complementarity determining region (HCDR) 1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, a HCDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, a HCDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, a light chain complementarity determining region (LCDR) 1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, a LCDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, and a LCDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6. In some embodiments, the CD3 binding moiety comprises a HCDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, a HCDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8, a HCDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9, a LCDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10, a LCDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11, and a LCDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12. In some embodiments, the CD20 binding moiety comprises a HCDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13, a HCDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14, a HCDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15, a LCDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16, a LCDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17, and a LCDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18. In some embodiments, the CD19 binding moiety comprises a heavy chain variable (CD19VH) region and a light chain variable (CD19VL) region, wherein the CD19VH region comprises the HCDR1, HCDR2 and HCDR3 of SEQ ID NO: 19, and the CD19VL region comprises the LCDR1, LCDR2 and LCDR3 of SEQ ID NO: 20. In some embodiments, the CD3 binding moiety comprises a heavy chain variable (CD3VH) region and a light chain variable (CD3VL) region, wherein the CD3VH region comprises the HCDR1, HCDR2 and HCDR3 of SEQ ID NO: 21, and the CD3VL region comprises the LCDR1, LCDR2 and LCDR3 of SEQ ID NO: 22. In some embodiments, the CD20 binding moiety comprises a heavy chain variable (CD20VH) region and a light chain variable (CD20VL) region, wherein the CD20VH region comprises the HCDR1, HCDR2 and HCDR3 of SEQ ID NO: 23, and the CD20VL region comprises the LCDR1, LCDR2 and LCDR3 of SEQ ID NO: 24. In some embodiments, the CD19VH region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19 or an amino acid sequence at least 85%, 90%or 95%identical to SEQ ID NO: 19, and the CD19VL region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20 or an amino acid sequence at least 85%, 90%or 95%identical to SEQ ID NO: 20. In some embodiments, the CD3VH region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21 or an amino acid sequence at least 85%, 90%or 95%identical to SEQ ID NO: 21, and the CD3VL region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22 or an amino acid sequence at least 85%, 90%or 95%identical to SEQ ID NO: 22. In some embodiments, the CD20VH region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 23 or an amino acid sequence at least 85%, 90%or 95%identical to SEQ ID NO: 23, and the CD20VL region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 24 or an amino acid sequence at least 85%, 90%or 95%identical to SEQ ID NO: 24. In some embodiments, the CD19 binding moiety, the CD3 binding moiety and the CD20 binding moiety are selected from the following formats: Fab, Fab’ , F (ab) ’ 2, Fv and scFv.

[0148] In some embodiments, the polypeptide complex or antigen binding portion thereof comprises one or more CD19 binding moiety, one or more CD3 binding moiety and one or more CD20 binding moiety. Thus, the polypeptide complex or antigen binding portion thereof is at least trivalent. In some embodiments, the CD19 binding moiety, the CD3 binding moiety and the CD20 binding moiety are all in Fab formats, wherein the CD19 binding moiety comprises a heavy chain variable domain (CD19VH) operably linked to a first heavy chain constant domain (C1H) and a light chain variable domain (CD19VL) operably linked to a first light chain constant domain (C1L) , the CD3 binding moiety comprises a heavy chain variable domain (CD3VH) operably linked to a second heavy chain constant domain (C2H) and a light chain variable domain (CD3VL) operably linked to a second light chain constant domain (C2L) , the CD20 binding moiety comprises a heavy chain variable domain (CD20VH) operably linked to a third heavy chain constant domain (C3H) and a light chain variable domain (CD20VL) operably linked to a third light chain constant domain (C3L) , and wherein C1H and C1L domains, C2H and C2L domains, C3H and C3L domains associate and form pairs respectively, and the pairs are selected from a pair of T cell receptor (TCR) β chain constant region (Cβ) and TCR α chain constant region (Cα) and a pair of antibody CH1 domain and CL domain, wherein Cα and Cβ are capable of forming a dimer via its inter-chain bonds and interactions. Preferably, Cα and Cβ are engineered to comprise one or more non-native interchain disulfide bond (s) that improves the stability of the interface between Cα and Cβ. In some embodiments, the Cα and Cβ are engineered TCR α chain and β chain constant regions respectively, comprising introduced cysteine residues to form one or more non-native interchain disulfide bond (s) . In some embodiments, the C1H and C1L domains are Cβ and Cα, the C2H and C2L domains are Cβ and Cα, and the C3H and C3L domains are CH1 and CL, respectively. In some embodiments, the C1H and C1L domains are Cβ and Cα, the C2H and C2L domains are CH1 and CL, and the C3H and C3L domains are Cβ and Cα, respectively. In some embodiments, the C1H and C1L domains are CH1 and CL, the C2H and C2L domains are Cβ and Cα, and the C3H and C3L domains are Cβ and Cα, respectively. The Cβs or Cαs in different domains may not necessarily have an identical sequence. In some further embodiments, the CD19VH and C1H regions of the CD19 binding moiety are operably linked to the CD3VL and C2L regions of the CD3 binding moiety in the first binding arm, and the CD20 binding moiety are present in the second binding arm, wherein the C1H and C1L constant regions are Cβ and Cα respectively, the C2H and C2L constant regions are Cβ and Cα respectively, and the C3H and C3L constant regions are CH1 and CL domains respectively. In some embodiments, the heavy chains of the polypeptide complex or antigen-binding portion thereof further comprise an immunoglobulin Fc region, such as a human IgG Fc, more specifically a human IgG1, IgG2, IgG3 or IgG4 Fc, or a Fc variant. The Fc variant may comprise one or more mutations which promote heterodimerization of the Fc region. For example, the Fc variant may comprise mutations that form a “knob into hole (KIH) ” structure and specifically, the Fc variant comprises mutations selected from T366S, L368A and Y407V in one chain and T366W in the other chain. In some further embodiments, the Fc variant comprises one or more mutations which reduce Fc binding to a Fcγreceptor. For example, the Fc variant may comprise one or more mutations selected from F234A, L235A and D265S mutations. In some embodiments, the polypeptide complex comprises two heavy chains HC1 and HC2, and three light chains LC1, LC2, LC3, wherein from N terminus to C terminus: (a) HC1, HC2, LC1, LC2 and LC3 comprise domains operably linked in the following formats: CD19VH-Cβ-CD3VL-Cα-Fc, CD20VH-CH1-Fc, CD19VL-Cα, CD3VH-Cβ, CD20VL-CL, respectively; (b) HC1, HC2, LC1, LC2 and LC3 comprise domains operably linked in the following formats: CD19VL-Cα-CD3VH-Cβ-Fc, CD20VH-CH1-Fc, CD19VH-Cβ, CD3VL-Cα, CD20VL-CL, respectively; (c) HC1, HC2, LC1, LC2 and LC3 comprise domains operably linked in the following formats: CD3VH-Cβ-CD19VL-Cα-Fc, CD20VH-CH1-Fc, CD3VL-Cα, CD19VH-Cβ, CD20VL-CL, respectively; (d) HC1, HC2, LC1, LC2 and LC3 comprise domains operably linked in the following formats: CD3VL-Cα-CD19VH-Cβ-Fc, CD20VH-CH1-Fc, CD3VH-Cβ, CD19VL-Cα, CD20VL-CL, respectively; (e) HC1, HC2, LC1, LC2 and LC3 comprise domains operably linked in the following formats: CD19VH-Cβ-CD20VL-Cα-Fc, CD3VH-CH1-Fc, CD19VL-Cα, CD20VH-Cβ, CD3VL-CL, respectively; (f) HC1, HC2, LC1, LC2 and LC3 comprise domains operably linked in the following formats: CD19VL-Cα-CD20VH-Cβ-Fc, CD3VH-CH1-Fc, CD19VH-Cβ, CD20VL-Cα, CD3VL-CL, respectively; (g) HC1, HC2, LC1, LC2 and LC3 comprise domains operably linked in the following formats: CD20VH-Cβ-CD19VL-Cα-Fc, CD3VH-CH1-Fc, CD20VL-Cα, CD19VH-Cβ, CD3VL-CL, respectively; (h) HC1, HC2, LC1, LC2 and LC3 comprise domains operably linked in the following formats: CD20VL-Cα-CD19VH-Cβ-Fc, CD3VH-CH1-Fc, CD20VH-Cβ, CD19VL-Cα, CD3VL-CL, respectively; (i) HC1, HC2, LC1, LC2 and LC3 comprise domains operably linked in the following formats: CD3VH-Cβ-CD20VL-Cα-Fc, CD19VH-CH1-Fc, CD3VL-Cα, CD20VH-Cβ, CD19VL-CL, respectively; (j) HC1, HC2, LC1, LC2 and LC3 comprise domains operably linked in the following formats: CD3VL-Cα-CD20VH-Cβ-Fc, CD19VH-CH1-Fc, CD3VH-Cβ, CD20VL-Cα, CD19VL-CL, respectively; (k) HC1, HC2, LC1, LC2 and LC3 comprise domains operably linked in the following formats: CD20VH-Cβ-CD3VL-Cα-Fc, CD19VH-CH1-Fc, CD20VL-Cα, CD3VH-Cβ, CD19VL-CL, respectively; or (l) HC1, HC2, LC1, LC2 and LC3 comprise domains operably linked in the following formats: CD20VL-Cα-CD3VH-Cβ-Fc, CD19VH-CH1-Fc, CD20VH-Cβ, CD3VL-Cα, CD19VL-CL, respectively. The term “operably linked” or “-” herein refers to a direct linkage or via a peptide linker comprising 1-40 amino acids in length.

[0149] In some embodiments, Cβ comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 34 or an amino acid sequence with at least 85%, 90%, or 95%identity to SEQ ID NO: 34, and Cα comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 35 or an amino acid sequence with at least 85%, 90%, or 95%identity to SEQ ID NO: 35. In some embodiments, the peptide linker comprised in the polypeptide complex or antigen-binding portion thereof is an immunoglobulin partial or whole hinge region, or a GS linker, for example (GS) n (SEQ ID NO: 46) , (GGS) n (SEQ ID NO: 47) , (GGGS) n (SEQ ID NO: 48) , (GGGGS) n (SEQ ID NO: 49) , (GGSG) n (SEQ ID NO: 50) , or (GGGSS) n (SEQ ID NO: 51) , wherein n is an integer of 1-9. In some embodiments, the CD19 binding moiety is operably linked to the CD3 binding moiety in the heavy chain via a GS linker (e.g. as set forth in SEQ ID NO: 38) . In some embodiments, each of the CD3 binding moiety and the CD20 binding moiety is operably linked to the Fc region via a hinge region (e.g. as set forth in SEQ ID NO: 37) . In some embodiments, the polypeptide complex comprises a first and a second heavy chain that comprise SEQ ID NOs: 25 and 26 respectively, and a first, second and third light chain that comprise SEQ ID NOs: 27, 28 and 29 respectively.

[0150] The polypeptide complex or antigen-binding portion thereof disclosed herein may be a multispecific antibody such as a trispecific antibody; a chimeric antibody, a humanized antibody, or a fully human antibody; a multivalent antibody such as a trivalent antibody or a tetravalent antibody. In some aspects, provided herein is a nucleic acid molecule, comprising a nucleic acid sequence encoding the heavy chain (s) and / or the light chain (s) of the polypeptide complex or antigen-binding portion thereof as disclosed herein. In some aspects, provided herein is a vector comprising the nucleic acid molecule as disclosed herein. In some aspects, provided herein is a host cell comprising the nucleic acid molecule or the vector as disclosed herein. The host cell may be a prokaryotic cell (e.g., an E. coli cell) or a eukaryotic cell, such as a mammalian cell (e.g., a Chinese hamster ovary (CHO) cell) . In some aspects, provided herein is a pharmaceutical composition comprising the polypeptide complex or antigen-binding portion thereof or the nucleic acid molecule as disclosed herein, and a pharmaceutically acceptable carrier. In some aspects, provided herein is a method for producing the polypeptide complex or antigen-binding portion thereof as disclosed herein, comprising the steps of: -culturing a host cell comprising a nucleic acid sequence (s) encoding the heavy chains and the light chains of the polypeptide complex or antigen-binding portion thereof under suitable conditions; and -isolating the polypeptide complex or antigen-binding portion thereof from the host cell. In some aspects, provided herein is a method for modulating a CD3, CD19 and / or CD20 related immune response in a subject, comprising administering to the subject the polypeptide complex or antigen-binding portion thereof or the pharmaceutical composition as disclosed herein to the subject. In some aspects, provided herein is a method for inhibiting growth or proliferation of tumor cells, comprising administering an effective amount of the polypeptide complex or antigen-binding portion thereof or the pharmaceutical composition as disclosed herein to the cells. Optionally, the tumor cells are CD19 and / or CD20 expressing tumor cells. The tumor cells may be in a subject and the administration is conducted in vivo. In some aspects, provided herein is a method for preventing, alleviating or treating cancer (e.g., CD19 and / or CD20 expressing cancer) in a subject, comprising administering an effective amount of the polypeptide complex or antigen-binding portion thereof or the pharmaceutical composition as disclosed herein to the subject. In some embodiments, the cancer is a hematological cancer, such as a CD19 and / or CD20-expressing B cell cancer, such as B cell lymphoma or a non-Hodgkin lymphoma. Said cancer may be selected from diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL) , mantle cell lymphoma (MCL) , marginal zone lymphoma (MZL) , follicular lymphoma (FL) , chronic lymphocytic leukemia (CLL) , or Waldenstrom macroglobulinemia (WM) , B-cell lymphoma, B-cell chronic lymphocytic leukemia and non-T acute lymphoblastic leukemia, including acute lymphoblastic leukemia (ALL) , chronic lymphoid lymphoma (CLL) . In some embodiments, the cancer is relapsed, refractory, or malignant cancer, or any combination thereof. In one embodiment, the cancer is B-cell non-Hodgkin lymphoma (B-NHL) . In some aspects, provided herein is a method for diagnosing or monitoring CD19 and / or CD20-expressing cancer progression, regression or stability comprising contacting the polypeptide complex or antigen-binding portion thereof with a sample from a subject. In some aspects, provided herein is use of the polypeptide complex or antigen-binding portion thereof or the pharmaceutical composition as disclosed herein in the manufacture of a medicament for preventing, alleviating or treating cancer (e.g., CD19 and / or CD20 expressing cancer) in a subject. In some aspects, provided herein is the polypeptide complex or antigen-binding portion thereof or the pharmaceutical composition as disclosed herein for use in preventing, alleviating or treating cancer (e.g., CD19 and / or CD20 expressing cancer) in a subject, comprising administering an effective amount of the polypeptide complex or antigen-binding portion thereof or the pharmaceutical composition to the subject. In some aspects, the present disclosure provides kits or devices that comprise the polypeptide complex or antigen-binding portion thereof as disclosed herein in one or more containers. Anti-CD3 antibodies and CD3-binding moieties

[0151] CD3 is part of the T-cell receptor (TCR) which recognizes abnormal cells by binding antigens. The binding of CD3 by an antibody drives T-cell activation (without requiring antigen recognition by the TCR) , which leads to the killing of cancer cells and the production and release of toxic cytokine molecules.

[0152] The disclosure herein provides a CD3-binding moiety capable of binding CD3 (such as human, mouse or cyno CD3) , and a polypeptide complex or antigen-binding portion thereof comprising the CD3-binding moiety. The format of the CD3-binding moiety may be selected from Fab, Fab’ , F (ab’ ) 2, scFv, VHH and diabody.

[0153] In some embodiments, the CD3-binding moiety is derived from a parental anti-CD3 antibody. The parental antibodies may be already developed and known to the public or developed de novo. There are a wide variety of known and useful anti-CD3 antibodies with varying binding affinity. By “derived from” , it is meant herein that the antigen-binding moiety comprises the CDR sequences or highly homologous CDR sequences of the parental antibody, and preferably, comprises the variable regions of the parental antibody. The antigen-binding moiety may also comprise variations in the CDR regions, framework regions and / or constant regions of the parental antibody while retaining the antigen-binding specificity. For example, compared to the original CDR sequences of parental antibody, one or two amino acids in the CDR or framework regions of the derived antigen-binding moiety may be modified to e.g. reduce the risk of glycosylation and deamidation.

[0154] Specifically, the CD3-binding moiety as disclosed herein comprises: A) one or more heavy chain CDRs (HCDRs) selected from the group consisting of: (i) a HCDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 or an amino acid sequence with addition, deletion and / or substitution of no more than 1, 2 or 3 amino acids compared with SEQ ID NO: 7; (ii) a HCDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8 or an amino acid sequence with addition, deletion and / or substitution of no more than 1, 2 or 3 amino acids compared with SEQ ID NO: 8; and (iii) a HCDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9 or an amino acid sequence with addition, deletion and / or substitution of no more than 1, 2 or 3 amino acids compared with SEQ ID NO: 9; B) one or more light chain CDRs (LCDRs) selected from the group consisting of: (i) a LCDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10 or an amino acid sequence with addition, deletion and / or substitution of no more than 1, 2 or 3 amino acids compared with SEQ ID NO: 10; (ii) a LCDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11 or an amino acid sequence with addition, deletion and / or substitution of no more than 1, 2 or 3 amino acids compared with SEQ ID NO: 11; and (iii) a LCDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12 or an amino acid sequence with addition, deletion and / or substitution of no more than 1, 2 or 3 amino acids compared with SEQ ID NO: 12; or C) one or more HCDRs of A) and one or more LCDRs of B) .

[0155] In some embodiments, the substitution in the CDR is a conservative substitution. In some embodiments, the CD3-binding moiety comprises at least one, two, three, four, five, or six CDRs selected from: (a) HCDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7; (b) HCDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8; (c) HCDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9; (d) LCDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10; (e) LCDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11; and (f) LCDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12. In some embodiments, the CD3-binding moiety comprises SEQ ID NOs: 7-9 in the heavy chain and SEQ ID NOs: 10-12 in the light chain.

[0156] In some embodiments, the CD3-binding moiety has a heavy chain variable (VH) region comprising an amino acid sequence having at least 85%, at least 90%or at least 95%sequence identity (e.g., at least 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%sequence identity) to SEQ ID NO: 21 and / or a light chain variable (VL) region comprising an amino acid sequence having at least 85%, at least 90%or at least 95%sequence identity (e.g., at least 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%sequence identity) to SEQ ID NO: 22. In some embodiments, the CD3-binding moiety has a VH region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21 and a VL region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22.

[0157] In some embodiments, the CD3-binding moiety comprises at least one, at least two, or all three HCDRs of the VH region as set forth in SEQ ID NO: 21, and at least one, at least two, or all three LCDRs of the VL region as set forth in SEQ ID NO: 22.

[0158] In some embodiments, the CD3-binding moiety comprises (a) a VH region comprising at least one, at least two, or all three HCDRs selected from HCDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, HCDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8, and HCDR3 comprising the amino acid sequence selected of SEQ ID NO: 9; and (b) a VL region comprising at least one, at least two, or all three LCDR sequences selected from LCDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10, LCDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11, and LCDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12.

[0159] Further, the CD3-binding moiety may comprise at least one, two, three or four of heavy chain framework regions (designated as FR-H1, FR-H2, FR-H3 and FR-H4) same as those of the VH region as set forth in SEQ ID NO: 21, and / or at least one, two, three, four of the light chain framework regions (designated as FR-L1, FR-L2, FR-L3 and FR-L4) same as those of the VL region as set forth in SEQ ID NO: 22.

[0160] In some embodiments, the framework (FR) regions are derived from human germline, e.g. a human immunoglobulin. In some embodiments, the FR regions may include one or more individual FR residue modifications that improve antibody performance, such as stability, binding affinity, isomerization, immunogenicity, etc. For example, the FR regions may comprise a PTM-removal modification to avoid post-translational modification (PTM) . PTMs mainly include isomerization, deamination, glycosylation and oxidation in antibody discovery, all of them have a typical amino acid site, e.g. “DG” for isomerization, “NG” for deamination, “N*T / S” (*stand for other amino acid except P or D) for glycosylation and “M” or “C” for oxidation. Once the PTM sites are found in antibody sequence, especially in key regions like CDR3, PTM removal may be needed to avoid the potential risk of PTM modification while minimally affecting the binding compared to the parental antibody.

[0161] Unless indicated otherwise, the CDRs of the antigen-binding moieties as disclosed herein are identified according to IMGT-Kabat definition. As familiar to a skilled person, variable regions and CDRs in an antibody sequence can be identified according to general rules that have been developed in the art or by aligning the sequences against a database of known variable regions. CDRs have been described by Kabat et al., J. Biol. Chem. 252: 6609-6616 (1977) ; Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, “Sequences of proteins of immunological interest” (1991) ; by Chothia et al., J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987) ; and MacCallum et al., J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996) , where the definitions include overlapping or subsets of amino acid residues when compared against each other. Methods for identifying these regions are also described in e.g., Kontermann and Dubel, eds., Antibody Engineering, Springer, New York, NY, 2001 and Dinarello et al., Current Protocols in Immunology, John Wiley and Sons Inc., Hoboken, NJ, 2000. Exemplary databases of antibody sequences are described in, and can be accessed through, the “Abysis” website at www. bioinf. org. uk / abs (maintained by A. C. Martin in the Department of Biochemistry &Molecular Biology University College London, London, England) and the VBASE2 website at www. vbase2. org, as described in Retter et al., Nucl. Acids Res., 33 (Database issue) : D671 -D674 (2005) . The Abysis database integrates sequence data from Kabat, IMGT and the Protein Data Bank (PDB) with structural data from the PDB. See Dr. Andrew C. R. Martin's book chapter Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains. In: Antibody Engineering Lab Manual (Ed.: Duebel, S. and Kontermann, R., Springer-Verlag, Heidelberg, ISBN-13: 978-3540413547, also available on the website bioinforg. uk / abs) . The Abysis database website further includes general rules that have been developed for identifying CDRs which can be used in accordance with the teachings herein. As would be readily appreciated, application of any definition to refer to a CDR of the antibody as disclosed herein is intended to be within the scope of present application. Although CDRs indicated in Table 11 below are defined by the Kabat and IMGT numbering system, the Contact, Chothia, MacCallum, and other schemes known in the art could also be used to define the CDRs.

[0162] The CD3-binding moiety as exemplified herein is in Fab format, but it is not restricted to a Fab format. The Fab format of the CD3-binding moiety comprises a first VH operably linked to an antibody heavy chain CH1 domain (VH1-CH1) , and a first VL operably linked to an antibody light chain constant (CL) domain (VL1-CL) . The CD3-binding moieties herein also encompass engineered or chimeric Fabs in which e.g. the CH1 and CL of the CD3-binding moieties are replaced by a pair of TCR (T cell receptor) constant regions, to distinguish between the CD3-binding Fabs and other antigen-binding Fabs.

[0163] TCR is a heterodimeric T cell surface protein that belongs to the immunoglobulin superfamily and is similar to a half antibody with a single heavy chain and a single light chain. A native TCR has an extracellular portion, a transmembrane portion, and an intracellular portion. The extracellular domain of a TCR has a membrane-proximal constant region and a membrane-distal variable region. The introduction of TCR constant regions to replace the commonly used CH1 and CL domains have been shown to increase the stability and expression level of the generated antibody. A detailed description of the utility of TCR constant regions in assembling two parental antibodies into a bispecific molecule with desired valency and functionality have been disclosed in WO2019 / 057122, the full content of which is herein incorporated by reference. In some embodiments, the CD3 binding Fab comprises a TCR beta chain constant region (Cβ) that replaces the CH1 domain and a TCR alpha chain constant region (Cα) that replaces the CL domain. The positions of Cβ and Cα may also be exchanged, with Cβ in the light chain and Cα in the heavy chain. The replacement by TCR constant region (Cβ / Cα) results in a chimeric Fab that possesses a unique light-heavy chain interface orthogonal to that of a regular antibody Fab. The assembly of the chimeric and regular Fabs in different formats can create various multi-specific molecules with different structures and valences.

[0164] The sequences of constant regions of wild type human TCR beta and alpha chain can be found in NCBI accession number A0A5B9 (www. uniprot. org / uniprot / A0A5B9) and NCBI accession number P01848 (www. uniprot. org / uniprot / P01848) . Preferably, the pair of TCR constant regions for constructing the antibodies herein are derived from wild type TCR constant regions, but further comprises one or more substitutions, additions or deletions of one or more amino acids that improve the association of the two TCR constant regions. In some embodiments, the CD3-binding moiety may comprise an engineered TCR beta chain constant region and an engineered TCR alpha chain constant region. As illustrated in the present application, the CD3-binding moiety may comprise a Cβ region with the sequence as shown in SEQ ID NO: 34 and a Cα region with the sequence as shown in SEQ ID NO: 35. Multiple TCR constant region variants which can find use in constructing multi-specific antibody formats have been disclosed in PCT / CN2021 / 072601, the full content of which is incorporated herein by reference. In some embodiments, the CD3-binding moiety may comprise a Cβ region having at least 90%sequence identity (e.g., at least 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%sequence identity) to SEQ ID NO: 34 and a Cα region having at least 90%sequence identity (e.g., at least 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%sequence identity) to SEQ ID NO: 35.

[0165] The two TCR constant regions in the moieties are associated via interchain disulfide bonds. Preferably, the TCR constant regions may be engineered to comprise one or more cysteine amino acids to form one or more non-native disulfide bonds, so that the dimer formed by the two constant regions has a better stability, expression and heterodimerization. Anti-CD19 Antibodies and CD19-binding moieties

[0166] The disclosure herein provides a CD19-binding moiety capable of binding CD19 (such as human, mouse or cyno CD19) , and a polypeptide complex or antigen-binding portion thereof comprising the CD19-binding moiety. The format of the CD19-binding moiety may be selected from Fab, Fab’ , F (ab’ ) 2, scFv, VHH and diabody.

[0167] In some embodiments, the CD19-binding moiety is derived from a parental anti-CD19 antibody. The parental antibodies may be already developed and known to the public or developed de novo. There are a wide variety of known and useful anti-CD19 antibodies with varying binding affinity. The CD19-binding moiety may comprise same CDR sequences or highly homologous CDR sequences of the parental antibody, and preferably, comprises the variable regions of the parental antibody. The CD19-binding moiety may also comprise variations in the CDR regions, framework regions and / or constant regions of the parental antibody while retaining the antigen-binding specificity. For example, compared to the original CDR sequences of parental antibody, one or two amino acids in the CDR or framework regions of the derived antigen-binding moiety may be modified to e.g. reduce the risk of glycosylation and deamidation.

[0168] Specifically, the CD19-binding moiety as disclosed herein comprises: A) one or more heavy chain CDRs (HCDRs) selected from the group consisting of: (i) a HCDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or an amino acid sequence with addition, deletion and / or substitution of no more than 1, 2 or 3 amino acids compared with SEQ ID NO: 1; (ii) a HCDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or an amino acid sequence with addition, deletion and / or substitution of no more than 1, 2 or 3 amino acids compared with SEQ ID NO: 2; and (iii) a HCDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 or an amino acid sequence with addition, deletion and / or substitution of no more than 1, 2 or 3 amino acids compared with SEQ ID NO: 3; B) one or more light chain CDRs (LCDRs) selected from the group consisting of: (i) a LCDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 or an amino acid sequence with addition, deletion and / or substitution of no more than 1, 2 or 3 amino acids compared with SEQ ID NO: 4; (ii) a LCDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 or an amino acid sequence with addition, deletion and / or substitution of no more than 1, 2 or 3 amino acids compared with SEQ ID NO: 5; and (iii) a LCDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 or an amino acid sequence with addition, deletion and / or substitution of no more than 1, 2 or 3 amino acids compared with SEQ ID NO: 6; or C) one or more HCDRs of A) and one or more LCDRs of B) .

[0169] In some embodiments, the substitution in the CDR is a conservative substitution. In some embodiments, the CD19-binding moiety comprises at least one, two, three, four, five, or six CDRs selected from: (a) HCDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1; (b) HCDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2; (c) HCDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3; (d) LCDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4; (e) LCDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5; and (f) LCDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6. In some embodiments, the CD19-binding moiety comprises SEQ ID NOs: 1-3 in the heavy chain and SEQ ID NOs: 4-6 in the light chain.

[0170] In some embodiments, the CD19-binding moiety has a heavy chain variable (VH) region comprising an amino acid sequence having at least 85%, at least 90%or at least 95%sequence identity (e.g., at least 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%sequence identity) to SEQ ID NO: 19 and / or a light chain variable (VL) region comprising an amino acid sequence having at least 85%, at least 90%or at least 95%sequence identity (e.g., at least 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%sequence identity) to SEQ ID NO: 20. In some embodiments, the CD19-binding moiety has a VH region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19 and a VL region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20.

[0171] In some embodiments, the CD19-binding moiety comprises at least one, at least two, or all three HCDRs of the VH region as set forth in SEQ ID NO: 19, and at least one, at least two, or all three LCDRs of the VL region as set forth in SEQ ID NO: 20.

[0172] In some embodiments, the CD19-binding moiety comprises (a) a VH region comprising at least one, at least two, or all three HCDRs selected from HCDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, HCDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, and HCDR3 comprising the amino acid sequence selected of SEQ ID NO: 3; and (b) a VL region comprising at least one, at least two, or all three LCDR sequences selected from LCDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, LCDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, and LCDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6.

[0173] Further, the CD19-binding moiety may comprise at least one, two, three or four of heavy chain framework regions (designated as FR-H1, FR-H2, FR-H3 and FR-H4) same as those of the VH region as set forth in SEQ ID NO: 19, and / or at least one, two, three, four of the light chain framework regions (designated as FR-L1, FR-L2, FR-L3 and FR-L4) same as those of the VL region as set forth in SEQ ID NO: 20.

[0174] The CD19-binding moiety as exemplified herein is in Fab format, but it is not restricted to a Fab format. The Fab format of the CD19-binding moiety comprises a first VH operably linked to an antibody heavy chain CH1 domain (VH1-CH1) , and a first VL operably linked to an antibody light chain constant (CL) domain (VL1-CL) . The CD19-binding moieties herein also encompass engineered Fabs in which e.g. the CH1 and CL of the CD19-binding moieties are replaced by a pair of TCR (T cell receptor) constant regions, to distinguish between the CD19-binding Fabs and other antigen-binding Fabs. Preferably, the pair of TCR constant regions for constructing the antibodies herein are derived from wild type TCR constant regions, but further comprises one or more substitutions, additions or deletions of one or more amino acids that improve the association of the two TCR constant regions. In some embodiments, the CD19-binding moiety may comprise an engineered TCR beta chain constant region and an engineered TCR alpha chain constant region. As illustrated in the present application, the CD19-binding moiety may comprise a Cβ region with the sequence as shown in SEQ ID NO: 34 and a Cα region with the sequence as shown in SEQ ID NO: 35. Multiple TCR constant region variants which can find use in constructing multi-specific antibody formats have been disclosed in PCT / CN2021 / 072601, the full content of which is incorporated herein by reference. Preferably, the TCR constant regions may be engineered to comprise one or more cysteine amino acids to form one or more non-native disulfide bonds, so that the dimer formed by the two constant regions has a better stability, expression and heterodimerization. In some embodiments, the CD19-binding moiety may comprise a Cβ region having at least 90%sequence identity (e.g., at least 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%sequence identity) to SEQ ID NO: 34 and a Cαregion having at least 90%sequence identity (e.g., at least 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%sequence identity) to SEQ ID NO: 35. Anti-CD20 Antibodies and CD20-binding moieties

[0175] The disclosure herein provides a CD20-binding moiety capable of binding CD20 (such as human, mouse or cyno CD20) , and a polypeptide complex or antigen-binding portion thereof comprising the CD20-binding moiety. The format of the CD20-binding moiety may be selected from Fab, Fab’ , F (ab’ ) 2, scFv, VHH and diabody.

[0176] In some embodiments, the CD20-binding moiety is derived from a parental anti-CD20 antibody. The parental antibodies may be already developed and known to the public or developed de novo. There are a wide variety of known and useful anti-CD20 antibodies with varying binding affinity. The CD20-binding moiety may comprise same CDR sequences or highly homologous CDR sequences of the parental antibody, and preferably, comprises the variable regions of the parental antibody. The CD20-binding moiety may also comprise variations in the CDR regions, framework regions and / or constant regions of the parental antibody while retaining the antigen-binding specificity. For example, compared to the original CDR sequences of parental antibody, one or two amino acids in the CDR or framework regions of the derived antigen-binding moiety may be modified to e.g. reduce the risk of glycosylation and deamidation.

[0177] Specifically, the CD20-binding moiety as disclosed herein comprises: A) one or more heavy chain CDRs (HCDRs) selected from the group consisting of: (i) a HCDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13 or an amino acid sequence with addition, deletion and / or substitution of no more than 1, 2 or 3 amino acids compared with SEQ ID NO: 13; (ii) a HCDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14 or an amino acid sequence with addition, deletion and / or substitution of no more than 1, 2 or 3 amino acids compared with SEQ ID NO: 14; and (iii) a HCDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15 or an amino acid sequence with addition, deletion and / or substitution of no more than 1, 2 or 3 amino acids compared with SEQ ID NO: 15; B) one or more light chain CDRs (LCDRs) selected from the group consisting of: (i) a LCDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16 or an amino acid sequence with addition, deletion and / or substitution of no more than 1, 2 or 3 amino acids compared with SEQ ID NO: 16; (ii) a LCDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17 or an amino acid sequence with addition, deletion and / or substitution of no more than 1, 2 or 3 amino acids compared with SEQ ID NO: 17; and (iii) a LCDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18 or an amino acid sequence with addition, deletion and / or substitution of no more than 1, 2 or 3 amino acids compared with SEQ ID NO: 18; or C) one or more HCDRs of A) and one or more LCDRs of B) .

[0178] In some embodiments, the substitution in the CDR is a conservative substitution. In some embodiments, the CD20-binding moiety comprises at least one, two, three, four, five, or six CDRs selected from: (a) HCDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13; (b) HCDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14; (c) HCDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15; (d) LCDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16; (e) LCDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17; and (f) LCDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18. In some embodiments, the CD20-binding moiety comprises SEQ ID NOs: 13-15 in the heavy chain and SEQ ID NOs: 16-18 in the light chain.

[0179] In some embodiments, the CD20-binding moiety has a heavy chain variable (VH) region comprising an amino acid sequence having at least 85%, at least 90%or at least 95%sequence identity (e.g., at least 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%sequence identity) to SEQ ID NO: 23 and / or a light chain variable (VL) region comprising an amino acid sequence having at least 85%, at least 90%or at least 95%sequence identity (e.g., at least 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%sequence identity) to SEQ ID NO: 24. In some embodiments, the CD20-binding moiety has a VH region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 23 and a VL region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 24.

[0180] In some embodiments, the CD20-binding moiety comprises at least one, at least two, or all three HCDRs of the VH region as set forth in SEQ ID NO: 23, and at least one, at least two, or all three LCDRs of the VL region as set forth in SEQ ID NO: 24.

[0181] In some embodiments, the CD20-binding moiety comprises (a) a VH region comprising at least one, at least two, or all three HCDRs selected from HCDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13, HCDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14, and HCDR3 comprising the amino acid sequence selected of SEQ ID NO: 15; and (b) a VL region comprising at least one, at least two, or all three LCDR sequences selected from LCDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16, LCDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17, and LCDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18.

[0182] Further, the CD20-binding moiety may comprise at least one, two, three or four of heavy chain framework regions (designated as FR-H1, FR-H2, FR-H3 and FR-H4) same as those of the VH region as set forth in SEQ ID NO: 23, and / or at least one, two, three, four of the light chain framework regions (designated as FR-L1, FR-L2, FR-L3 and FR-L4) same as those of the VL region as set forth in SEQ ID NO: 24.

[0183] The CD20-binding moiety as exemplified herein is in Fab format, but it is not restricted to a Fab format. The Fab format of the CD20-binding moiety comprises a first VH operably linked to an antibody heavy chain CH1 domain (VH1-CH1) , and a first VL operably linked to an antibody light chain constant (CL) domain (VL1-CL) . The CD20-binding moieties herein also encompass engineered Fabs in which e.g. the CH1 and CL of the CD20-binding moieties are replaced by a pair of TCR (T cell receptor) constant regions, to distinguish between the CD20-binding Fabs and other antigen-binding Fabs. Preferably, the pair of TCR constant regions for constructing the antibodies herein are derived from wild type TCR constant regions, but further comprises one or more substitutions, additions or deletions of one or more amino acids that improve the association of the two TCR constant regions. In some embodiments, the CD20-binding moiety may comprise an engineered TCR beta chain constant region and an engineered TCR alpha chain constant region. As illustrated in the present application, the CD20-binding moiety may comprise a Cβ region with the sequence as shown in SEQ ID NO: 34 and a Cα region with the sequence as shown in SEQ ID NO: 35. Preferably, the TCR constant regions may be engineered to comprise one or more cysteine amino acids to form one or more non-native disulfide bonds, so that the dimer formed by the two constant regions has a better stability, expression and heterodimerization. In some embodiments, the CD19-binding moiety may comprise a Cβ region having at least 90%sequence identity (e.g., at least 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%sequence identity) to SEQ ID NO: 34 and a Cαregion having at least 90%sequence identity (e.g., at least 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%sequence identity) to SEQ ID NO: 35.

[0184] Preferably, an amino acid sequence at least 85%, at least 90%, or at least 95%identical to any of SEQ ID NOs: 19-24 has the same CDR sequences as those of SEQ ID NOs: 19-24, and the amino acid changes only take place in the framework regions. The percent identity between two amino acid sequences can be determined using the algorithm of E. Meyers and W. Miller (Comput. Appl. Biosci., 4: 11-17 (1988) ) which has been incorporated into the ALIGN program (version 2.0) , using a PAM120 weight residue table, a gap length penalty of 12 and a gap penalty of 4. In addition, the percentage of identity between two amino acid sequences can be determined by the algorithm of Needleman and Wunsch (J. Mol. Biol. 48: 444-453 (1970) ) which has been incorporated into the GAP program in the GCG software package (available at http:  / / www. gcg. com) , using either a Blossum 62 matrix or a PAM250 matrix, and a gap weight of 16, 14, 12, 10, 8, 6, or 4 and a length weight of 1, 2, 3, 4, 5, or 6.

[0185] Additionally or alternatively, the protein sequences of the present disclosure can further be used as a “query sequence” to perform a search against public databases to, for example, identify related sequences. Such searches can be performed using the XBLAST program (version 2.0) of Altschul, et al. (1990) J. MoI. Biol. 215: 403-10. BLAST protein searches can be performed with the XBLAST program, score = 50, wordlength = 3 to obtain amino acid sequences homologous to the antibody molecules of the present disclosure. To obtain gapped alignments for comparison purposes, Gapped BLAST can be utilized as described in Altschul et al, (1997) Nucleic Acids Res. 25 (17) : 3389-3402. When utilizing BLAST and Gapped BLAST programs, the default parameters of the respective programs (e.g., XBLAST and NBLAST) can be used. See www. ncbi. nlm. nih. gov.

[0186] The amino acid sequences of the heavy chain variable region and / or the light chain variable regions can be at least 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%or 99%, preferable, at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%or 99%, more preferably, at least 95%, 96%, 97%, 98%or 99%, identical to the respective sequences set forth above.

[0187] In some further embodiments, the antibody or the antigen-binding portion thereof may contain conservative substitution or modification of amino acids in the variable regions of the heavy chain and / or light chain. It is understood in the art that certain conservative sequence modification can be made which do not remove antigen binding. See, e.g., Brummell et al. (1993) Biochem 32: 1180-8; de Wildt et al. (1997) Prot. Eng. 10: 835-41; Komissarov et al. (1997) J. Biol. Chem. 272: 26864-26870; Hall et al. (1992) J. Immunol. 149: 1605-12; Kelley and O’ Connell (1993) Biochem. 32: 6862-35; Adib-Conquy et al. (1998) Int. Immunol. 10: 341-6 and Beers et al. (2000) Clin. Can. Res. 6: 2835-43.

[0188] As described above, the term “conservative substitution” refers to amino acid substitutions which would not disadvantageously affect or change the essential properties of a protein / polypeptide comprising the amino acid sequence. For example, a conservative substitution may be introduced by standard techniques known in the art such as site-directed mutagenesis and PCR-mediated mutagenesis. Conservative amino acid substitutions include substitutions wherein an amino acid residue is substituted with another amino acid residue having a similar side chain, for example, a residue physically or functionally similar (such as, having similar size, shape, charge, chemical property including the capability of forming covalent bond or hydrogen bond, etc. ) to the corresponding amino acid residue. The families of amino acid residues having similar side chains have been defined in the art. These families include amino acids having alkaline side chains (for example, lysine, arginine and histidine) , amino acids having acidic side chains (for example, aspartic acid and glutamic acid) , amino acids having uncharged polar side chains (for example, glycine, asparagine, glutamine, serine, threonine, tyrosine, cysteine, tryptophan) , amino acids having nonpolar side chains (for example, alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, methionine) , amino acids having β-branched side chains (such as threonine, valine, isoleucine) and amino acids having aromatic side chains (for example, tyrosine, phenylalanine, tryptophan, histidine) . Therefore, a corresponding amino acid residue is preferably substituted with another amino acid residue from the same side-chain family. Methods for identifying amino acid conservative substitutions are well known in the art (see, for example, Brummell et al., Biochem. 32: 1180-1187 (1993) ; Kobayashi et al., Protein Eng. 12 (10) : 879-884 (1999) ; and Burks et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 412-417 (1997) , which are incorporated herein by reference) . Multispecific Polypeptide Complexes

[0189] Multispecific (including bispecific) antibodies that co-engage CD3 and a tumor antigen target (s) have been designed and used to redirect T cells to attack and lyse targeted tumor cells. The CD3 binding moiety, CD19 binding moiety and CD20 binding moiety as described above with different specificities can be combined into multi-specific antibodies that interact with CD3, CD19 and CD20. The engagement of CD3 affords efficient T cell stimulation, whereas the anti-CD19 and anti-CD20 moieties direct T cells to B cells, especially B malignancy cells, as well as to certain lymphomas and leukemias. While the CD3-targeting approach has shown considerable promise, a common side effect of such therapies is the associated production of cytokines, often leading to toxic cytokine release syndrome (CRS) . Because the CD3 binding of the antibody engages all T cells, the high cytokine-producing CD4 T cell subset is recruited. Moreover, the CD4 T cell subset includes regulatory T cells, whose recruitment and expansion can potentially lead to immune suppression and have a negative impact on long-term tumor suppression. One such possible way to reduce cytokine production and possibly reduce the activation of CD4 T cells is by reducing the affinity of the CD3 binding domain for CD3.

[0190] In some aspects, provided herein are polypeptide complexes and antigen-binding portions thereof that have a first specificity for CD3 (e.g., human, cynomolgus monkey and mouse CD3) , a second specificity for CD19 (e.g., human, cynomolgus monkey and mouse CD19) and a third specificity for CD20 (e.g., human, cynomolgus monkey and mouse CD20) . The polypeptide complexes preferably bind to CD3 with a moderate or even low affinity. Specifically, the CD3 x CD19 x CD20 trispecific polypeptide complexes are superior for inducing T-cell-specific cytotoxicity and cytokine production against CD19+ and / or CD20+ tumor cells compared to bispecific antibodies, and demonstrate significantly enhanced antitumor efficacy and the ability to overcome immune escape compared with the corresponding BsAbs alone or in combination. The novel approach herein provides unique insight into the structural optimization of T-cell-redirected multispecific antibodies using site-specific recombination and may be broadly applicable to heterogeneous and resistant tumor populations as well as solid tumors. The therapeutic advantage of the trispecific antibody over corresponding bispecific antibodies includes reduced toxic cytokine release and better tumor inhibition in xenograft tumor mouse models. Thus, the trispecific antibody not only showed the capacity to replace the bispecific antibodies, but also added value by enhancing the retargeting potency on tumor cells expressing both antigens. Structure and Format

[0191] In some embodiments, the polypeptide complex or antigen binding fragment thereof comprises one or more CD19 binding moiety, one or more CD3 binding moiety and one or more CD20 binding moiety that are covalently linked or non-covalently associated together in one or more polypeptide chains. For example, the polypeptide complex or antigen binding fragment thereof may comprise: two CD19 binding moieties, one CD3 binding moiety and one CD20 binding moiety; one CD19 binding moiety, two CD3 binding moieties and one CD20 binding moiety; or one CD19 binding moiety, one CD3 binding moiety and two CD20 binding moieties. When there are more than one moiety targeting the same antigen, they can be same or different in sequence. Preferably, the more than one moiety targeting a certain antigen are the same.

[0192] In some embodiments, the polypeptide complex or antigen binding fragment thereof comprises one CD19 binding moiety, one CD3 binding moiety and one CD20 binding moiety. Similar to an ordinary IgG antibody, the polypeptide complex or antigen binding fragment thereof comprises a first binding arm and a second binding arm that stem from the Fc region, with each arm binding to one or more antigen (s) . In some embodiments, the first binding arm comprises the CD19 binding moiety operably linked to the CD3 binding moiety and the second binding arm comprises the CD20 binding moiety. In some other embodiments, the first binding arm comprises the CD20 binding moiety operably linked to the CD3 binding moiety and the second binding arm comprises the CD19 binding moiety. Still in some other embodiments, the first binding arm comprises the CD19 binding moiety operably linked to the CD20 binding moiety and the second binding arm comprises the CD3 binding moiety.

[0193] In embodiments where there are two CD19 binding moieties per molecule, the two CD19 binding moieties may be constructed on the same binding arm or on different binding arms. For example, the first binding arm comprises the CD20 binding moiety operably linked to the CD3 binding moiety and the second binding arm comprises the two CD19 binding moieties operably linked together; alternatively, the first binding arm comprises the CD20 binding moiety operably linked to the CD19 binding moiety and the second binding arm comprises the CD3 binding moiety operably linked to the CD19 binding moiety.

[0194] In embodiments where there are two CD3 binding moieties per molecule, the two CD3 binding moieties may be constructed on the same binding arm or on different binding arms. For example, the first binding arm comprises the CD20 binding moiety operably linked to the CD19 binding moiety and the second binding arm comprises the two CD3 binding moieties operably linked together; alternatively, the first binding arm comprises the CD20 binding moiety operably linked to the CD3 binding moiety and the second binding arm comprises the CD19 binding moiety operably linked to the CD3 binding moiety.

[0195] In embodiments where there are two CD20 binding moieties per molecule, the two CD20 binding moieties may be constructed on the same binding arm or on different binding arms. For example, the first binding arm comprises the CD3 binding moiety operably linked to the CD19 binding moiety and the second binding arm comprises the two CD20 binding moieties operably linked together; alternatively, the first binding arm comprises the CD20 binding moiety operably linked to the CD3 binding moiety and the second binding arm comprises the CD20 binding moiety operably linked to the CD19 binding moiety.

[0196] In some embodiments, the polypeptide complex or antigen binding fragment thereof comprises, from N terminus to C terminus: (a) the CD19 binding moiety operably linked to the CD3 binding moiety in the heavy chain of the first binding arm, and the CD20 binding moiety in the second binding arm; (b) the CD3 binding moiety operably linked to the CD19 binding moiety in the heavy chain of the first binding arm, and the CD20 binding moiety in the second binding arm; (c) the CD19 binding moiety in the first binding arm, and the CD20 binding moiety operably linked to the CD3 binding moiety in the heavy chain of the second binding arm; (d) the CD19 binding moiety in the first binding arm, and the CD3 binding moiety operably linked to the CD20 binding moiety in the heavy chain of the second binding arm; (e) the CD19 binding moiety operably linked to the CD20 binding moiety in the heavy chain of the first binding arm, and the CD3 binding moiety in the second binding arm; or (f) the CD20 binding moiety operably linked to the CD19 binding moiety in the heavy chain of the first binding arm, and the CD3 binding moiety in the second binding arm.

[0197] In some embodiments, the polypeptide complex or the antigen-binding portion thereof comprises two heavy chains and three light chains, wherein each light chain corresponds to one chain of the CD19 binding moiety, the CD3 binding moiety or the CD20 binding moiety, and the three light chains associate with corresponding heavy chain to form the three antigen-binding moieties. Preferably, each moiety has different constant regions integrated into the heavy chain of the polypeptide complex and has different constant regions for the light chain of the polypeptide complex, so as to facilitate correct matching and association of the light chains and heavy chains. In some embodiments, the constant regions of the CD19 binding moiety, the CD3 binding moiety and the CD20 binding moiety in the heavy chain of the polypeptide complex are Cβ, Cα and CH1 respectively, or Cα, Cβ and CH1 respectively.

[0198] In some embodiments, the multi-specific polypeptide complex comprises two heterologous heavy chains and 3 light chains associated non-covalently to form three antigen binding moieties targeting CD3, CD19 and CD20, respectively.

[0199] In some embodiments, the polypeptide complex or the antigen-binding portion thereof comprises a CD19 binding moiety, a CD3 binding moiety and a CD20 binding moiety, and the polypeptide complex comprises two heavy chains (HC1 and HC2) and three light chains (LC1, LC2, LC3) , wherein from N terminus to C terminus, HC1, HC2, LC1, LC2 and LC3 comprise domains operably linked as in the following formats, respectively, as set forth in any of the following groups: (a) CD19VH-Cβ-CD3VL-Cα-Fc, CD20VH-CH1-Fc, CD19VL-Cα, CD3VH-Cβ, CD20VL-CL; (b) CD19VL-Cα-CD3VH-Cβ-Fc, CD20VH-CH1-Fc, CD19VH-Cβ, CD3VL-Cα, CD20VL-CL; (c) CD3VH-Cβ-CD19VL-Cα-Fc, CD20VH-CH1-Fc, CD3VL-Cα, CD19VH-Cβ, CD20VL-CL; (d) CD3VL-Cα-CD19VH-Cβ-Fc, CD20VH-CH1-Fc, CD3VH-Cβ, CD19VL-Cα, CD20VL-CL; (e) CD19VH-Cβ-CD20VL-Cα-Fc, CD3VH-CH1-Fc, CD19VL-Cα, CD20VH-Cβ, CD3VL-CL; (f) CD19VL-Cα-CD20VH-Cβ-Fc, CD3VH-CH1-Fc, CD19VH-Cβ, CD20VL-Cα, CD3VL-CL; (g) CD20VH-Cβ-CD19VL-Cα-Fc, CD3VH-CH1-Fc, CD20VL-Cα, CD19VH-Cβ, CD3VL-CL; (h) CD20VL-Cα-CD19VH-Cβ-Fc, CD3VH-CH1-Fc, CD20VH-Cβ, CD19VL-Cα, CD3VL-CL; (i) CD3VH-Cβ-CD20VL-Cα-Fc, CD19VH-CH1-Fc, CD3VL-Cα, CD20VH-Cβ, CD19VL-CL; (j) CD3VL-Cα-CD20VH-Cβ-Fc, CD19VH-CH1-Fc, CD3VH-Cβ, CD20VL-Cα, CD19VL-CL; (k) CD20VH-Cβ-CD3VL-Cα-Fc, CD19VH-CH1-Fc, CD20VL-Cα, CD3VH-Cβ, CD19VL-CL; and (l) CD20VL-Cα-CD3VH-Cβ-Fc, CD19VH-CH1-Fc, CD20VH-Cβ, CD3VL-Cα, CD19VL-CL; wherein CD19VH and CD19VL are the VH and VL regions of the CD19-binding moiety, CD3VH and CD3VL are the VH and VL regions of the CD3-binding moiety, CD20VH and CD20VL are the VH and VL regions of the CD20-binding moiety, and “-” represents a direct linkage or an indirect linkage via a peptide linker.

[0200] In some embodiments, HC1, HC2, LC1, LC2 and LC3 comprise domains operably linked as in the following formats: CD19VH-Cβ-CD3VL-Cα-Fc, CD20VH-CH1-Fc, CD19VL-Cα, CD3VH-Cβ, CD20VL-CL, respectively.

[0201] In some embodiments, each heavy chain of the polypeptide complex is operably linked to the Fc region directly or via a peptide linker, such as an immunoglobulin whole or partial hinge region (indicated as “hinge” herein) , or a conventionally used artificial linker, such as a GS linker. The GS linker as used herein may be (GS) n (SEQ ID NO: 46) , (GGS) n (SEQ ID NO: 47) , (GGGS) n (SEQ ID NO: 48) , (GGGGS) n (SEQ ID NO: 49) , (GGSG) n (SEQ ID NO: 50) , or (GGGSS) n (SEQ ID NO: 51) , wherein n is an integer of 1-9.

[0202] In some embodiments, two antigen binding moieties such as the CD19 binding moiety and the CD3 binding moiety are operably linked via a GS linker in the heavy chain of the polypeptide complex. The GS linker may be (GS) n (SEQ ID NO: 46) , (GGS) n (SEQ ID NO: 47) , (GGGS) n (SEQ ID NO: 48) , (GGGGS) n (SEQ ID NO: 49) , (GGSG) n (SEQ ID NO: 50) , or (GGGSS) n (SEQ ID NO: 51) , wherein n is an integer of 1-9.

[0203] The trispecific antibodies as disclosed herein may be trivalent, comprising 3 Fabs each targeting CD3, CD19 and CD20, respectively. The trispecific antibodies bind CD19 and have a variable region comprising a VH having the sequence of SEQ ID NO: 19 and a VL having the sequence of SEQ ID NO: 20. In addition, the trispecific antibodies bind CD3 and have a variable region comprising a VH having the sequence of SEQ ID NO: 21 and a VL having the sequence of SEQ ID NO: 22. In addition, the trispecific antibodies bind CD20 and have a variable region comprising a variable heavy domain having the sequence of SEQ ID NO: 23 and a variable light domain having the sequence of SEQ ID NO: 24. Specifically, the polypeptide complex as disclosed herein comprises a first and a second heavy chain that comprise SEQ ID NOs: 25 and 26 respectively, and a first, second and third light chain that comprise SEQ ID NOs: 27, 28 and 29 respectively (W333021-U8T3W2. I27-61. uIgG4V9) .

[0204] In some alternative embodiments, one or more of the antigen-binding moieties of the polypeptide complex are in scFv format. scFv contains a VH domain from the parental antibody connected by a short linker to the VL domain of the parental antibody, adopting the VL-VH or VH-VL configuration, wherein “-” represents an operable linkage. Fc region

[0205] The Fc region of the multispecific antibodies disclosed herein is preferably a human IgG Fc region. The IgG Fc region may be of any isotype, including, but not limited to, IgG1, IgG2, IgG3 or IgG4. In certain embodiments, the Fc region is of the IgG4 isotype. The IgG class is divided in four isotypes: IgG1, IgG2, IgG3 and IgG4 in humans.

[0206] In the context of the present disclosure, the Fc region may comprise one or more amino acid changes (e.g., insertions, deletions or substitutions) as compared to wild-type Fc region. An Fc variant can possess at least about 80%homology with a native sequence Fc region, or at least about 90%homology therewith, for example, at least about 95%homology therewith. The disclosure encompasses polypeptide complexes comprising one or more modifications in the Fc region to obtain the desired functionality, e.g., a “knob into hole” structure to promote heterodimerization, or a modified Fc region to change the binding interaction between Fc and FcRn or FcγR.

[0207] The term “knob into hole” , as used herein, refers to engineering the CH3 domain of antibody Fc region to create either a “knob” or a “hole” in each heavy chain to promote heterodimerization. A knob can be obtained by replacement of a small amino acid residue with a larger one in the first CH2 / CH3 polypeptide, and a hole can be obtained by replacement of a large residue with a smaller one. For details of the mutation sites for knobs into holes please see Spiess et al., 2015, supra and Brinkmann et al., 2017, supra; US patent application US2003078385A1. Generally, a “knob” is created by replacing T366 with a bulky residue W on one heavy chain, and the corresponding “hole” is made by triple mutations of T366S, L368A and Y407V on the other heavy chain, according to EU numbering as in Kabat et al. In some embodiments, a “hole” mutation is Y349C, T366S, L368A, and / or Y407V, and a “knob” mutation is S354C and / or T366W. In some embodiments, the heavy chain of the multispecific antibodies comprising the CD19 binding moiety and CD3 binding moiety has the “hole” structure, while the heavy chain comprising the CD20 binding moiety has the “knob” structure. Alternatively, the heavy chain of the multispecific antibodies comprising the CD19 binding moiety and CD3 binding moiety has the “knob” structure, while the heavy chain comprising the CD20 binding moiety has the “hole” structure.

[0208] In certain embodiments, the first heavy chain of the polypeptide complex comprises a Fc region of IgG1 isotype that comprises S354C and T366W substitutions (knob) , and the second heavy chain of the polypeptide complex comprises a Fc region of IgG1 isotype that comprises Y349C, T366S, L368A and Y407V substitutions (hole) . In some other embodiments, the first heavy chain of the polypeptide complex comprises a Fc region of IgG4 isotype, wherein the Fc region comprises S354C and T366W substitutions (knob) , and the second heavy chain of the polypeptide complex comprises a Fc region of IgG4 isotype, wherein the Fc region comprises Y349C, T366S, L368A and Y407V substitutions (hole) .

[0209] In addition, the Fc region may comprise one or more amino acid modification (e.g., Leu234Ala / Leu235Ala, i.e. LALA, or F234A / L235A, i.e. FALA) that alters the antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC) or other effector functions. In certain embodiments, the Fc modification comprise a FALA mutation, i.e., mutations of F234A and L235A, according to EU numbering as in Kabat et al. LALA and FALA mutations are commonly used for disrupting antibody effector function, e.g., eliminate Fc binding to specific FcγRs, reduce ADCC activity mediated by PBMCs and monocytes. Additionally, it has been found that therapeutic potential may be enhanced by the introduction of YTE (M252Y / S254T / T256E) and LS (M428L / N434S) in the Fc regions, as a consequence of increased half-lives and prolonged duration of protection. The S228P mutation has also been found to prevent in vivo and in vitro IgG4 Fab-arm exchange as demonstrated using a combination of novel quantitative immunoassays and physiological matrix preparation (J Biol Chem 2015 Feb 27; 290 (9) : 5462-9) .

[0210] The polypeptide complex as disclosed herein may comprise a Fc region having one of the following: a “knob into hole” structure, a S228P mutation, a FALA mutation, a LALA mutation and M252Y / S254T / T256E mutations.

[0211] The “EU numbering system” or “EU index” is generally used when referring to a residue in an immunoglobulin heavy chain constant region (e.g., the EU index reported in Kabat et al., supra) . The “EU numbering as in Kabat” or “EU index as in Kabat” refers to the residue numbering of the human IgG1 EU antibody. Unless stated otherwise herein, references to residue numbers in the constant domain of antibodies means residue numbering by the EU numbering system. Linker

[0212] The heavy chains of the antigen-binding moieties are operably linked with each other, and the heavy chains of the antigen-binding moieties are operably linked to the Fc region. The term “operably linked” includes a direct linkage without any linker, and an indirect linkage using a linker such as a peptide linker. The peptide linker should have a length that is adequate to link two portions in such a way that they assume the correct conformation relative to one another so that they retain the desired activity.

[0213] In one embodiment, the linker is from about 1 to 50 amino acids in length, preferably about 1 to 30 amino acids in length. In one embodiment, linkers of 1 to 20 amino acids in length may be used, with from about 5 to about 10 amino acids finding use in some embodiments. Useful linkers include glycine-serine polymers, including for example (GS) n (SEQ ID NO: 46) , (GSGGS) n (SEQ ID NO: 53) , (GGGGS) n (SEQ ID NO: 49) , and (GGGS) n (SEQ ID NO: 48) , where n is an integer of at least one (and generally from 3 to 4) , glycine-alanine polymers, alanine-serine polymers, and other flexible linkers. Alternatively, a variety of nonproteinaceous polymers, including but not limited to polyethylene glycol (PEG) , polypropylene glycol, polyoxyalkylenes, or copolymers of polyethylene glycol and polypropylene glycol, may find use as linkers.

[0214] Linkers can be derived from immunoglobulins and other proteins such as Ig-like proteins (e.g. TCR, FcR, KIR) , hinge region-derived sequences, and other natural sequences from other proteins. Immunoglobin hinge region that links the Fab with the Fc region also belongs to a peptide linker. Properties of the polypeptide complex

[0215] The polypeptide complex of the disclosure is capable of binding to CD3, CD19 and CD20. The binding of an antibody to antigen (s) can be assessed using one or more techniques well established in the art, for instance, ELISA or FACS, which measures binding of the antibody to antigen protein (s) solubilized in solution or expressed on cell surfaces, respectively. For example, an antibody can be tested by a flow cytometry assay in which the antibody is reacted with a cell line that expresses human CD3, CD19 and / or CD20, such as CHO cells that have been transfected to express CD3, CD19 or CD20 on their cell surface, or a CD3, CD19 and / or CD20 positive cell line, such as Jurkat (CD3 positive) and Raji (CD19 and CD20 positive) cells. Additionally or alternatively, the binding of the antibody, including the binding kinetics (e.g., KD value) can be tested in BIAcore binding assays.

[0216] In some embodiments, the trispecific polypeptide complexes of the disclosure could bind to human CD3 expressing cells with a significantly lower affinity than anti-CD3 control antibodies (such as REGN1979) , as shown in MFI (mean fluorescence intensity) measured by FACS. Still, the CD3 binding of the trispecific polypeptide complexes is stronger than a negative control. Reduced CD3 binding is advantageous for CRS mitigation, which includes excessive release of cytokines, for example of proinflammatory cytokines, e.g. IL-6, TNF-alpha or IL-8, that may result in adverse effects like fever, nausea, vomiting and chills. Thus, despite the anti-tumor activity of bispecific antibodies such as REGN1979, their immunological mode of action may trigger unwanted “side” effects, i.e. in the induction of unwanted inflammatory reactions.

[0217] In some embodiments, the trispecific polypeptide complexes of the disclosure could bind to human CD19 expressing cells with an affinity comparable to or better than anti-CD19 control antibodies (such as REGN1979) , as measured by FACS. In some embodiments, the trispecific polypeptide complexes of the disclosure could bind to human CD20 expressing cells with an affinity comparable to or better than anti-CD20 control antibodies (such as REGN1979) , as measured by FACS.

[0218] In some embodiments, the trispecific polypeptide complexes of the disclosure could bind to human CD19 and CD20 expressing cells (e.g. Raji cells) with an affinity comparable to or better than control antibodies (such as REGN1979) , as measured by FACS.

[0219] In some embodiments, the trispecific polypeptide complexes of the disclosure could induce a stronger or comparable T-cell mediated killing effect on CD19 and CD20 expressing tumor cells, such as Raji and Nalm-6 cells, compared to control antibodies (such as REGN1979) , as measured by FACS.

[0220] In some embodiments, the trispecific polypeptide complexes of the disclosure could induce a milder T-cell mediated stimulation of cytokines than control antibodies (such as REGN1979) , thus less prone to lead to toxic cytokine release.

[0221] Each antibody has a characteristic melting temperature, with a higher melting temperature indicating greater overall stability in vivo (Krishnamurthy R and Manning MC (2002) Curr Pharm Biotechnol 3: 361-71) . Generally, it is preferred that the Tm1 (the temperature of initial unfolding) be greater than 60 ℃, preferably greater than 65 ℃. The melting point of an antibody can be measured using differential scanning calorimetry (Chen et al (2003) Pharm Res 20: 1952-60; Ghirlando et al (1999) Immunol Lett 68: 47-52) or circular dichroism (Murray et al. (2002) J. Chromatogr Sci 40: 343-9) .

[0222] In some preferred embodiments, the antibodies as disclosed herein have minimal or low aggregation effects, which can lead to the triggering of an unwanted immune response and / or altered or unfavorable pharmacokinetic properties. Aggregation can be measured by several techniques, including size-exclusion column (SEC) , high performance liquid chromatography (HPLC) , and light scattering.

[0223] In summary, the polypeptide complexes as disclosed herein are characterized by particular functional features or properties and have one or more of the following properties: (a) a milder binding to CD3 and thus reduced T cell stimulation level and reduced risk of CRS, compared with positive control antibodies; (b) a comparable or better binding to CD19 and CD20, compared with positive control antibodies; (c) bind tumor cells that express both CD19 and CD20, mediating more potent killing, and significantly improved potency to CD19 and / or CD20 expressing tumor cells with lower cytokine release; (d) have no cross-activity to paralog proteins of CD3, CD19 and CD20; (e) show stronger or comparable T-cell mediated killing effect on CD19 and CD20 expressing tumor cells, could redirect T cell to effectively kill escaped tumor cells (either CD19-CD20+ or CD19+CD20-) , achieving broader coverage to tumors with lower CD20 (or CD19) expression; (f) have good antibody developability, including thermal stability, solubility, hydrophobicity and low aggregation propensity; (g) significantly improved efficacy in treating CD19 and / or CD20 expressing cancer, as demonstrated in in vivo mouse model; and (i) have acceptable pharmacokinetic profiles in rats. Preparation of the multispecific polypeptide complexes or antibodies

[0224] A variety of recombinant methods can be used to produce multi-specific antibodies and antibody fragments as described above. In general, multi-specific antibodies are made by including genes for each heavy and light chain into the host cells. There are a number of mechanisms that can be used to generate the heterodimers of the present invention. In addition, these mechanisms can be combined to ensure high heterodimerization. Thus, amino acid variants that lead to the production of heterodimers are referred to as "heterodimerization variants" . As known by those in the art, heterodimerization variants can include steric variants (e.g. the "knobs and holes" or "skew" variants described below and the "charge pairs" variants) as well as "pi variants" , which allows purification of homodimers away from heterodimers. As is generally described in WO2014 / 145806, hereby incorporated by reference in its entirety and specifically as below for the discussion of "heterodimerization variants" , useful mechanisms for heterodimerization include "knobs and holes" ( "KIH" ; sometimes herein as "skew" variants (see discussion in WO2014 / 145806) , "electrostatic steering" or "charge pairs" as described in WO2014 / 145806. DI variants as described in WO2014 / 145806, and general additional Fc variants as outlined in WO2014 / 145806.

[0225] Another important mechanism is the usage of engineered TCR constant regions to replace CH1 and CL regions in the Fab. The TCR constant regions may be engineered to incorporate one or more cysteine amino acids to form one or more non-native disulfide bonds between C and C, so that the dimer formed by the two constant regions has a better stability, expression and heterodimerization. Nucleic acid molecules encoding antibodies

[0226] In some aspects, the disclosure is directed to an isolated nucleic acid molecule, comprising a nucleic acid sequence encoding one or more chains of the polypeptide complexes or antigen-binding portion thereof.

[0227] Nucleic acids of the present disclosure can be obtained using standard molecular biology techniques. For antibodies expressed by hybridomas (e.g., hybridomas prepared from transgenic mice carrying human immunoglobulin genes as described further below) , cDNAs encoding the light and heavy chains of the antibody made by the hybridoma can be obtained by standard PCR amplification or cDNA cloning techniques. For antibodies obtained from an immunoglobulin gene library (e.g., using phage display techniques) , a nucleic acid encoding such antibodies can be recovered from the gene library.

[0228] The isolated nucleic acid encoding the VH region can be converted to a full-length heavy chain gene by operatively linking the VH-encoding nucleic acid to another DNA molecule encoding heavy chain constant regions (CH1, CH2 and CH3, or TCR beta constant region) . The sequences of human heavy chain constant region genes are known in the art (see e.g., Kabat et al. (1991) , supra) and DNA fragments encompassing these regions can be obtained by standard PCR amplification. The heavy chain constant region can be an IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM or IgD constant region, but more preferably is an IgG1 or IgG4 constant region.

[0229] The isolated nucleic acid encoding the VL region can be converted to a full-length light chain gene (as well as a Fab light chain gene) by operatively linking the VL-encoding DNA to another DNA molecule encoding the light chain constant region, CL, or TCR alpha constant region. The sequences of human light chain constant region genes are known in the art (see e.g., Kabat et al., supra) and DNA fragments encompassing these regions can be obtained by standard PCR amplification. In some embodiments, the light chain constant region can be a kappa or lambda constant region.

[0230] Once DNA fragments encoding VH and VL segments are obtained, these DNA fragments can be further manipulated by standard recombinant DNA techniques, for example to convert the variable region genes to full-length antibody chain genes, to Fab fragment genes or to a scFv gene. In these manipulations, a VL-or VH-encoding DNA fragment is operatively linked to another DNA fragment encoding another protein, such as an antibody constant region or a flexible linker. The term “operatively linked” , as used in this context, is intended to mean that the two DNA fragments are joined such that the amino acid sequences encoded by the two DNA fragments remain in-frame.

[0231] In some specific embodiments, the isolated nucleic acid molecule comprises one or more nucleic acid sequence (s) selected from the group consisting of: (A) a nucleic acid sequence that encodes the heavy chain sequence of the CD19-binding moiety and the light chain sequence of the CD3-binding moiety; (B) a nucleic acid sequence that encodes the heavy chain sequence of the CD20-binding moiety; (C) a nucleic acid sequence that encodes the light chain sequence of the CD19-binding moiety; (D) a nucleic acid sequence that encodes a heavy chain sequence of the CD3-binding moiety; (E) a nucleic acid sequence that encodes the light chain sequence of the CD20-binding moiety; (F) any combinations of (A) - (E) ; and (G) a nucleic acid sequence that hybridized under high stringency conditions to the complementary strand of the nucleic acid sequence of (A) - (F) .

[0232] In some specific embodiments, the isolated nucleic acid molecule comprises a nucleic acid sequence encoding SEQ ID NO: 25. In some specific embodiments, the isolated nucleic acid molecule comprises a nucleic acid sequence encoding SEQ ID NO: 26. In some specific embodiments, the isolated nucleic acid molecule comprises a nucleic acid sequence encoding SEQ ID NO: 27. In some specific embodiments, the isolated nucleic acid molecule comprises a nucleic acid sequence encoding SEQ ID NO: 28. In some specific embodiments, the isolated nucleic acid molecule comprises a nucleic acid sequence encoding SEQ ID NO: 29.

[0233] Exemplary high stringency conditions include hybridization at 45℃ in 5X SSPE and 45%formamide, and a final wash at 65℃ in 0.1 X SSC. It is understood in the art that conditions of equivalent stringency can be achieved through variation of temperature and buffer, or salt concentration as described Ausubel, et al. (Eds. ) , Protocols in Molecular Biology, John Wiley &Sons (1994) , pp. 6.0.3 to 6.4.10. Modifications in hybridization conditions can be empirically determined or precisely calculated based on the length and the percentage of guanosine / cytosine (GC) base pairing of the probe. The hybridization conditions can be calculated as described in Sambrook, et al, (Eds. ) , Molecular Cloning: A laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, New York (1989) , pp. 9.47 to 9.51. Vectors and Host cells

[0234] The nucleic acid molecules that encodes the polypeptide complexes can be inserted into a vector for further cloning (amplification of the DNA) or for expression, using recombinant techniques known in the art. In some embodiments, the antibody may be produced by homologous recombination known in the art. DNA encoding the monoclonal antibody is readily isolated and sequenced using conventional procedures (e.g., by using oligonucleotide probes that are capable of binding specifically to genes encoding the heavy chain of the antibody) . Many vectors are available. The vector components generally include, but are not limited to, one or more of the following: a signal sequence, an origin of replication, one or more marker genes, an enhancer element, a promoter (e.g., SV40, CMV, EF-1α) , and a transcription termination sequence. The selectable marker gene facilitates selection of host cells into which the vector has been introduced (see, e.g., U.S. Pat. Nos. 4,399,216; 4,634,665 and 5,179,017) . For example, typically the selectable marker gene confers resistance to drugs, such as G418, hygromycin or methotrexate, on a host cell into which the vector has been introduced. Selectable marker genes may include the dihydrofolate reductase (DHFR) gene (for use in dhfr-host cells with methotrexate selection / amplification) and the neo gene (for G418 selection) .

[0235] In some embodiments, the vector system includes mammalian, bacterial, yeast systems, etc, and comprises plasmids such as, but not limited to, pALTER, pBAD, pcDNA, pCal, pL, pET, pGEMEX, pGEX, pCI, pCMV, pEGFP, pEGFT, pSV2, pFUSE, pVITRO, pVIVO, pMAL, pMONO, pSELECT, pUNO, pDUO, Psg5L, pBABE, pWPXL, pBI, p15TV-L, pPro18, pTD, pRS420, pLexA, pACT2.2 etc, and other laboratorial and commercially available vectors. Suitable vectors may include, plasmid, or viral vectors (e.g., replication defective retroviruses, adenoviruses and adeno-associated viruses) . In one embodiment of the disclosure, the vector may be pET, for instance, pETbac containing genes of hexa-histidine-and c-Myc-tag ( “hexa-histidine” disclosed as SEQ ID NO: 56) .

[0236] Vectors comprising the nucleic acid sequence encoding the polypeptide complexes can be introduced to a host cell for cloning or gene expression. Thus, the present disclosure also relates to a recombinant eukaryotic or prokaryotic host cell which produces a polypeptide complex of the present disclosure, such as a transfectoma.

[0237] Suitable host cells for cloning or expressing the DNA in the vectors herein are the prokaryote, yeast, or higher eukaryote cells, such as mammalian cells. Mammalian host cells for expressing the antibodies of the present disclosure include Chinese Hamster Ovary (CHO cells) (including dhfr CHO cells, described in Urlaub and Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. ScL USA 77: 4216-4220, used with a DHFR selectable marker, e.g., as described in R. J. Kaufman and P. A. Sharp (1982) J. MoI. Biol. 159: 601-621) , COS cells and SP2 cells. In particular, for use with NSO myeloma cells, another expression system is the GS gene expression system disclosed in WO 87 / 04462, WO 89 / 01036 and EP 338,841. Also included are monkey kidney CV1 line transformed by SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651) ; human embryonic kidney line (293 or 293 cells subcloned for growth in suspension culture, Graham et al., J. Gen Virol. 36: 59 (1977) ) ; baby hamster kidney cells (BHK, ATCC CCL 10) ; Chinese hamster ovary cells / -DHFR (CHO, Urlaub et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216) ; mouse sertoli cells (TM4, Mather, 1980, Biol. Reprod. 23: 243-251) ; monkey kidney cells (CV1 ATCC CCL 70) ; African green monkey kidney cells (VERO-76, ATCC CRL-1587) ; human cervical carcinoma cells (HELA, ATCC CCL 2) ; canine kidney cells (MDCK, ATCC CCL 34) ; buffalo rat liver cells (BRL 3A, ATCC CRL 1442) ; human lung cells (W138, ATCC CCL 75) ; human liver cells (Hep G2, HB 8065) ; mouse mammary tumor (MMT 060562, ATCC CCL51) ; TRI cells (Mather et al., 1982, Annals N. Y. Acad. Sci. 383: 44-68) ; MRC 5 cells; FS4 cells; mouse myeloma cells, such as NSO (e.g. RCB0213, 1992, Bio / Technology 10: 169) and SP2 / 0 cells (e.g. SP2 / 0-Ag14 cells, ATCC CRL 1581) ; rat myeloma cells, such as YB2 / 0 cells (e.g. YB2 / 3HL. P2. G11.16Ag. 20 cells, ATCC CRL 1662) ; PER. C6 cells; and a human hepatoma line (Hep G2) . CHO cells are one of the cell lines that can be used herein, with CHO-K1, DUK-B11, CHO-DP12, CHO-DG44 (Somatic Cell and Molecular Genetics 12: 555 (1986) ) , and Lec13 being exemplary host cell lines. In the case of CHO-K1, DUK-B11, DG44 or CHO-DP12 host cells, these may be altered such that they are deficient in their ability to fucosylate proteins expressed therein.

[0238] Suitable prokaryotes for this purpose include eubacteria, such as Gram-negative or Gram-positive organisms, for example, Enterobacteriaceae such as Escherichia, e.g., E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, e.g., Salmonella typhimurium, Serratia, e.g., Serratia marcescans, and Shigella, as well as Bacilli such as B. subtilis and B. licheniformis, Pseudomonas such as P. aeruginosa, and Streptomyces.

[0239] In addition to prokaryotes, eukaryotic microbes such as filamentous fungi or yeast are suitable cloning or expression hosts for trispecific antibody-encoding vectors. Saccharomyces cerevisiae, or common baker’s yeast, is the most commonly used among lower eukaryotic host microorganisms. However, a number of other genera, species, and strains are commonly available and useful herein, such as Schizosaccharomyces pombe; Kluyveromyces hosts such as, e.g., K. lactis, K. fragilis (ATCC 12, 424) , K.bulgaricus (ATCC 16, 045) , K. wickeramii (ATCC 24, 178) , K. waltii (ATCC 56, 500) , K. drosophilarum (ATCC 36, 906) , K. thermotolerans, and K. marxianus; yarrowia (EP 402, 226) ; Pichia pastoris (EP 183, 070) ; Candida; Trichoderma reesia (EP 244, 234) ; Neurosporacrassa; Schwanniomyces such as Schwanniomycesoccidentalis; and filamentous fungi such as, e.g., Neurospora, Penicillium, Tolypocladium, and Aspergillus hosts such as A. nidulans and A. niger.

[0240] Other suitable host cells for the expression of the trispecific polypeptide complexes provided here are derived from multicellular organisms. Examples of invertebrate cells include plant and insect cells. Numerous baculoviral strains and variants and corresponding permissive insect host cells from hosts such as Spodopterafrugiperda (caterpillar) , Aedes aegypti (mosquito) , Aedesalbopictus (mosquito) , Drosophila melanogaster (fruiffly) , and Bombyx mori have been identified. A variety of viral strains for transfection are publicly available, e.g., the L-1 variant of Autographacalifornica NPV and the Bm-5 strain of Bombyx mori NPV, and such viruses may be used as the virus herein according to the present disclosure, particularly for transfection of Spodopterafrugiperda cells. Plant cell cultures of cotton, corn, potato, soybean, petunia, tomato, and tobacco can also be utilized as hosts.

[0241] Host cells are transformed with the above-described expression or cloning vectors for antibody production and cultured in conventional nutrient media modified as appropriate for inducing promoters, selecting transformants, or amplifying the genes encoding the desired sequences.

[0242] The host cells used to produce the polypeptide complexes provided herein may be cultured in a variety of media. Commercially available media such as Ham's F10 (Sigma) , Minimal Essential Medium (MEM) , (Sigma) , RPMI-1640 (Sigma) , and Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) , Sigma) are suitable for culturing the host cells. In addition, any of the media described in Ham et al., Meth. Enz. 58: 44 (1979) , Barnes et al., Anal. Biochem. 102: 255 (1980) , U.S. Pat. No. 4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; 4,560,655; or 5,122,469; WO 90 / 03430; WO 87 / 00195; or U.S. Pat. Re. 30,985 may be used as culture media for the host cells. Any of these media may be supplemented as necessary with hormones and / or other growth factors (such as insulin, transferrin, or epidermal growth factor) , salts (such as sodium chloride, calcium, magnesium, and phosphate) , buffers (such as HEPES) , nucleotides (such as adenosine and thymidine) , antibiotics (such as GENTAMYCINTM drug) , trace elements (defined as inorganic compounds usually present at final concentrations in the micromolar range) , and glucose or an equivalent energy source. Any other necessary supplements may also be included at appropriate concentrations that would be known to those skilled in the art. The culture conditions, such as temperature, pH, and the like, are those previously used with the host cell selected for expression, and will be apparent to the ordinarily skilled artisan.

[0243] When using recombinant techniques, the antibody can be produced intracellularly, in the periplasmic space, or directly secreted into the medium. If the antibody is produced intracellularly, as a first step, the particulate debris, either host cells or lysed fragments, is removed, for example, by centrifugation or ultrafiltration. Carter et al., Bio / Technology 10: 163-167 (1992) describe a procedure for isolating antibodies which are secreted to the periplasmic space of E. coli. Briefly, cell paste is thawed in the presence of sodium acetate (pH 3.5) , EDTA, and phenylmethylsulfonylfluoride (PMSF) over about 30 min. Cell debris can be removed by centrifugation. Where the antibody is secreted into the medium, supernatants from such expression systems are generally first concentrated using a commercially available protein concentration filter, for example, an Amicon or Millipore Pellicon ultrafiltration unit. A protease inhibitor such as PMSF may be included in any of the foregoing steps to inhibit proteolysis and antibiotics may be included to prevent the growth of adventitious contaminants.

[0244] The antibody prepared from the cells can be purified using, for example, hydroxylapatite chromatography, gel electrophoresis, dialysis, DEAE-cellulose ion exchange chromatography, ammonium sulfate precipitation, salting out, and affinity chromatography, with affinity chromatography being the preferred purification technique.

[0245] Following any preliminary purification step (s) , the mixture comprising the antibody of interest and contaminants may be subjected to low pH hydrophobic interaction chromatography using an elution buffer at a pH between about 2.5-4.5, preferably performed at low salt concentrations (e.g., from about 0-0.25M salt) . Pharmaceutical Compositions

[0246] In some aspects, the disclosure is directed to a pharmaceutical composition comprising at least one antibody or antigen-binding portion thereof as disclosed herein and a pharmaceutically acceptable carrier. In some aspects, the present disclosure provides a pharmaceutical composition comprising a nucleic acid (DNA or RNA) encoding the antibody as disclosed herein and a pharmaceutically acceptable carrier. In some aspects, the present disclosure provides a pharmaceutical composition comprising a cell expressing the antibody as disclosed herein and a pharmaceutically acceptable carrier. Components of the compositions

[0247] The pharmaceutical composition may optionally contain one or more additional pharmaceutically active ingredients, such as another antibody or a drug. The pharmaceutical compositions of the disclosure also can be administered in a combination therapy with, for example, another immune-stimulatory agent, anti-cancer agent, an antiviral agent, or a vaccine. A pharmaceutically acceptable carrier can include, for example, a pharmaceutically acceptable liquid, gel or solid carriers, an aqueous medium, a non-aqueous medium, an anti-microbial agent, isotonic agents, buffers, antioxidants, anesthetics, suspending / dispersing agent, a chelating agent, a diluent, adjuvant, excipient or a nontoxic auxiliary substance, other known in the art various combinations of components or more.

[0248] Suitable components may include, for example, antioxidants, fillers, binders, disintegrating agents, buffers, preservatives, lubricants, flavorings, thickening agents, coloring agents, emulsifiers or stabilizers such as sugars and cyclodextrin. Suitable anti-oxidants may include, for example, methionine, ascorbic acid, EDTA, sodium thiosulfate, platinum, catalase, citric acid, cysteine, mercapto glycerol, thioglycolic acid, mercapto sorbitol, butyl methyl anisole, butylated hydroxy toluene and / or propyl gallate. As disclosed in the present disclosure, in a solvent containing an antibody or an antigen-binding fragment of the present disclosure discloses compositions include one or more anti-oxidants such as methionine, reducing antibody or antigen binding fragment thereof may be oxidized. The oxidation reduction may prevent or reduce a decrease in binding affinity, thereby enhancing antibody stability and extended shelf life. Thus, in some embodiments, the present disclosure provides a composition comprising one or more antibodies or antigen binding fragment thereof and one or more anti-oxidants such as methionine. The present disclosure further provides a variety of methods, wherein an antibody or antigen binding fragment thereof is mixed with one or more anti-oxidants, such as methionine, so that the antibody or antigen binding fragment thereof can be prevented from oxidation, to extend their shelf life and / or increased activity.

[0249] To further illustrate, pharmaceutical acceptable carriers may include, for example, aqueous vehicles such as sodium chloride injection, Ringer's injection, isotonic dextrose injection, sterile water injection, or dextrose and lactated Ringer's injection, nonaqueous vehicles such as fixed oils of vegetable origin, cottonseed oil, corn oil, sesame oil, or peanut oil, antimicrobial agents at bacteriostatic or fungistatic concentrations, isotonic agents such as sodium chloride or dextrose, buffers such as phosphate or citrate buffers, antioxidants such as sodium bisulfate, local anesthetics such as procaine hydrochloride, suspending and dispersing agents such as sodium carboxymethylcelluose, hydroxypropyl methylcellulose, or polyvinylpyrrolidone, emulsifying agents such as Polysorbate 80 (TWEEN-80) , sequestering or chelating agents such as EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) or EGTA (ethylene glycol tetraacetic acid) , ethyl alcohol, polyethylene glycol, propylene glycol, sodium hydroxide, hydrochloric acid, citric acid, or lactic acid. Antimicrobial agents utilized as carriers may be added to pharmaceutical compositions in multiple-dose containers that include phenols or cresols, mercurials, benzyl alcohol, chlorobutanol, methyl and propyl p-hydroxybenzoic acid esters, thimerosal, benzalkonium chloride and benzethonium chloride. Suitable excipients may include, for example, water, saline, dextrose, glycerol, or ethanol. Suitable non-toxic auxiliary substances may include, for example, wetting or emulsifying agents, pH buffering agents, stabilizers, solubility enhancers, or agents such as sodium acetate, sorbitan monolaurate, triethanolamine oleate, or cyclodextrin. Administration, Formulation and Dosage

[0250] The pharmaceutical composition of the disclosure may be administered in vivo, to a subject in need thereof, by various routes, including, but not limited to, oral, intravenous, intra-arterial, subcutaneous, parenteral, intranasal, intramuscular, intracranial, intracardiac, intraventricular, intratracheal, buccal, rectal, intraperitoneal, intradermal, topical, transdermal, and intrathecal, or otherwise by implantation or inhalation. The subject compositions may be formulated into preparations in solid, semi-solid, liquid, or gaseous forms; including, but not limited to, tablets, capsules, powders, granules, ointments, solutions, suppositories, enemas, injections, inhalants, and aerosols. The appropriate formulation and route of administration may be selected according to the intended application and therapeutic regimen.

[0251] Suitable formulations for enteral administration include hard or soft gelatin capsules, pills, tablets, including coated tablets, elixirs, suspensions, syrups or inhalations and controlled release forms thereof.

[0252] Formulations suitable for parenteral administration (e.g., by injection) , include aqueous or non-aqueous, isotonic, pyrogen-free, sterile liquids (e.g., solutions, suspensions) , in which the active ingredient is dissolved, suspended, or otherwise provided (e.g., in a liposome or other microparticulate) . Such liquids may additional contain other pharmaceutically acceptable ingredients, such as anti-oxidants, buffers, preservatives, stabilizers, bacteriostats, suspending agents, thickening agents, and solutes which render the formulation isotonic with the blood (or other relevant bodily fluid) of the intended recipient. Examples of excipients include, for example, water, alcohols, polyols, glycerol, vegetable oils, and the like. Examples of suitable isotonic carriers for use in such formulations include Sodium Chloride Injection, Ringer's Solution, or Lactated Ringer's Injection. Similarly, the particular dosage regimen, including dose, timing and repetition, will depend on the particular individual and that individual's medical history, as well as empirical considerations such as pharmacokinetics (e.g., half-life, clearance rate, etc. ) .

[0253] Frequency of administration may be determined and adjusted over the course of therapy, and is based on reducing the number of proliferative or tumorigenic cells, maintaining the reduction of such neoplastic cells, reducing the proliferation of neoplastic cells, or delaying the development of metastasis. In some embodiments, the dosage administered may be adjusted or attenuated to manage potential side effects and / or toxicity. Alternatively, sustained continuous release formulations of a subject therapeutic composition may be appropriate.

[0254] It will be appreciated by one of skill in the art that appropriate dosages can vary from patient to patient. Determining the optimal dosage will generally involve the balancing of the level of therapeutic benefit against any risk or deleterious side effects. The selected dosage level will depend on a variety of factors including, but not limited to, the activity of the particular compound, the route of administration, the time of administration, the rate of excretion of the compound, the duration of the treatment, other drugs, compounds, and / or materials used in combination, the severity of the condition, and the species, sex, age, weight, condition, general health, and prior medical history of the patient. The amount of compound and route of administration will ultimately be at the discretion of the physician, veterinarian, or clinician, although generally the dosage will be selected to achieve local concentrations at the site of action that achieve the desired effect without causing substantial harmful or deleterious side-effects.

[0255] In general, the antibody or the antigen binding portion thereof of the disclosure may be administered in various ranges. These include about 5 μg / kg body weight to about 40 mg / kg body weight per dose; about 50 μg / kg body weight to about 5 mg / kg body weight per dose; about 100 μg / kg body weight to about 10 mg / kg body weight per dose. Other ranges include about 100 μg / kg body weight to about 20 mg / kg body weight per dose and about 0.5 mg / kg body weight to about 20 mg / kg body weight per dose. In certain embodiments, the dosage is at least about 100 μg / kg body weight, at least about 250 μg / kg body weight, at least about 750 μg / kg body weight, at least about 3 mg / kg body weight, at least about 5 mg / kg body weight, at least about 10 mg / kg body weight.

[0256] In any event, the antibody or the antigen binding portion thereof of the disclosure is preferably administered as needed to subjects in need thereof. Determination of the frequency of administration may be made by persons skilled in the art, such as an attending physician based on considerations of the condition being treated, age of the subject being treated, severity of the condition being treated, general state of health of the subject being treated and the like.

[0257] In certain preferred embodiments, the course of treatment involving the antibody or the antigen-binding portion thereof of the present disclosure will comprise multiple doses of the selected drug product over a period of weeks or months. More specifically, the antibody or the antigen-binding portion thereof of the present disclosure may be administered once every day, every two days, every four days, every week, every ten days, every two weeks, every three weeks, every month, every six weeks, every two months, every ten weeks or every three months. In this regard, it will be appreciated that the dosages may be altered or the interval may be adjusted based on patient response and clinical practices.

[0258] Dosages and regimens may also be determined empirically for the disclosed therapeutic compositions in individuals who have been given one or more administration (s) . For example, individuals may be given incremental dosages of a therapeutic composition produced as described herein. In selected embodiments, the dosage may be gradually increased or reduced or attenuated based respectively on empirically determined or observed side effects or toxicity. To assess efficacy of the selected composition, a marker of the specific disease, disorder or condition can be followed as described previously. For cancer, these include direct measurements of tumor size via palpation or visual observation, indirect measurement of tumor size by x-ray or other imaging techniques; an improvement as assessed by direct tumor biopsy and microscopic examination of the tumor sample; the measurement of an indirect tumor marker (e.g., PSA for prostate cancer) or a tumorigenic antigen identified according to the methods described herein, a decrease in pain or paralysis; improved speech, vision, breathing or other disability associated with the tumor; increased appetite; or an increase in quality of life as measured by accepted tests or prolongation of survival.

[0259] Compatible formulations for parenteral administration (e.g., intravenous injection) may comprise the antibody or antigen-binding portion thereof as disclosed herein in concentrations of from about 10 μg / ml to about 100 mg / ml. It will be apparent to one of skill in the art that the dosage of the antibody or antigen-binding portion thereof as disclosed herein may vary depending on the individual, the type of neoplastic condition, the stage of neoplastic condition, whether the neoplastic condition has begun to metastasize to other location in the individual, the past and concurrent treatments being used, and the dosage of therapeutic agents used in combination with the antibody as disclosed herein. Applications of the Disclosure

[0260] The antibodies, antibody compositions, nucleic acids encoding the antibodies and methods of the present disclosure have numerous in vitro and in vivo diagnostic and therapeutic utilities involving the diagnosis and treatment of CD19 and / or CD20 related disorders, such as B cell lymphomas. For example, these molecules can be administered to cells in culture, in vitro or ex vivo, or to human subjects, to treat, prevent and to diagnose a variety of disorders. Hence, the method in accordance with the invention further comprises the treatment of B-NHL, wherein said B-NHL is selected from the group consisting of diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL) , high-grade B-cell lymphoma (HGBCL) , primary mediastinal large B-cell lymphoma (PMBCL) , mantle cell lymphoma (MCL) , follicular lymphoma (FL) , marginal-zone lymphoma (MZL) and small lymphocytic lymphoma (SLL) .

[0261] Non-Hodgkin Lymphoma's (NHLs) represent a disease entity characterized by malignant transformation of the cells from lymphoid tissue. NHLs of B-cell origin ( “B-NHL” or “B-cell NHL” ) as defined herein constitute a diverse set of neoplasms within the larger context of NHL. These are diagnosed, and distinction of B-NHL subtypes determined, using standard classification criteria by a pathologist (based on tissue biopsy) , including morphologic features by histology, surface markers (immunohistochemistry / flow cytometry) , chromosomal abnormalities / translocations (karyotyping, fluorescence in situ hybridization (FISH) ) , and molecular (gene mutation) findings. B-NHLs are diagnosed and classified based on WHO classification, which is included herein by reference (Swerdlow SH, Campo E, Harris NL, et al. WHO Classification of Tumours of Haematopoietic and Lymphoid Tissues (Revised ed. 4th) ) .

[0262] Briefly, B-NHLs are typically divided into indolent (slow-growing) and aggressive subtypes. Aggressive B-NHLs have high Ki67 expression, whereas indolent B-NHLs have relatively low Ki67 expression. Aggressive B-NHL includes: Diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL) , high-grade B-cell lymphoma (HGBCL) , primary mediastinal large B-cell lymphoma (PMBCL) , mantle cell lymphoma (MCL) . Indolent B-NHL includes follicular lymphoma (FL) , marginal-zone lymphoma (MZL) and small lymphocytic lymphoma (SLL) . Diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL) is the most common type of NHL accounting for approximately 30%to 40%of all NHL diagnoses, followed by FL (20%to 25%of all NHL diagnoses) . The majority of the B-cell lymphomas express B-cell markers, such as CD19, CD20, CD22, and CD79b.

[0263] In some embodiments, the cancer is selected from a class of mature B-Cell cancers excluding Hodgkin's Lymphoma but including germinal-center B-cell-like (GCB) DLBCL, activated B-cell-like (ABC) DLBCL, follicular lymphoma (FL) , mantle cell lymphoma (MCL) , acute myeloid leukemia (AML) , chronic lymphoid leukemia (CLL) , marginal zone lymphoma (MZL) , small lymphocytic leukemia (SLL) , lymphoplasmacytic lymphoma (LL) , Waldenstrom macroglobulinemia (WM) , central nervous system lymphoma (CNSL) , Burkitt's lymphoma (BL) , B-cell prolymphocytic leukemia, Splenic marginal zone lymphoma, Hairy cell leukemia, Splenic lymphoma / leukemia, unclassifiable, Splenic diffuse red pulp small B-cell lymphoma, Hairy cell leukemia variant, Waldenstrom macroglobulinemia, Heavy chain diseases, a Heavy chain disease, γ Heavy chain disease, μ Heavy chain disease, Plasma cell myeloma, Solitary plasmacytoma of bone, Extraosseous plasmacytoma, Extranodal marginal zone lymphoma of mucosa-associated lymphoid tissue (MALT lymphoma) , Nodal marginal zone lymphoma, Pediatric nodal marginal zone lymphoma, Pediatric follicular lymphoma, Primary cutaneous follicle centre lymphoma, T-cell / histiocyte rich large B-cell lymphoma, Primary DLBCL of the CNS, Primary cutaneous DLBCL, leg type, EBV-positive DLBCL of the elderly, DLBCL associated with chronic inflammation, Lymphomatoid granulomatosis, Primary mediastinal (thymic) large B-cell lymphoma, Intravascular large B-cell lymphoma, ALK-positive large B-cell lymphoma, Plasmablastic lymphoma, Large B-cell lymphoma arising in HHV8-associated multicentric Castleman disease, Primary effusion lymphoma: B-cell lymphoma, unclassifiable, with features intermediate between diffuse large B-cell lymphoma and Burkitt lymphoma, and B-cell lymphoma, unclassifiable, with features intermediate between diffuse large B-cell lymphoma and classical Hodgkin lymphoma.

[0264] Other examples of cancer include but are not limited to, carcinoma, lymphoma, blastoma, sarcoma, and leukemia or lymphoid malignancies. More particular examples of such cancers include, but not limited to, squamous cell cancer (e.g., epithelial squamous cell cancer) , lung cancer including small-cell lung cancer, non-small cell lung cancer, adenocarcinoma of the lung and squamous carcinoma of the lung, cancer of the peritoneum , hepatocellular cancer, gastric or stomach cancer including gastrointestinal cancer and gastrointestinal stromal cancer, pancreatic cancer, glioblastoma, cervical cancer, ovarian cancer, liver cancer, bladder cancer, cancer of the urinary tract, hepatoma, breast cancer, colon cancer, rectal cancer, colorectal cancer, endometrial or uterine carcinoma, salivary gland carcinoma, kidney or renal cancer, prostate cancer, vulval cancer, thyroid cancer, hepatic carcinoma, anal carcinoma, penile carcinoma, melanoma, superficial spreading melanoma, lentigo maligna melanoma, acral lentiginous melanomas, nodular melanomas, multiple myeloma and B-cell lymphoma (including low grade / follicular non-Hodgkin's lymphoma (NHL) ; small lymphocytic (SL) NHL; intermediate grade / follicular NHL; intermediate grade diffuse NHL; high grade immunoblastic NH L; high grade lymphoblastic NH L; high grade small non-cleaved cell NHL; bulky disease NHL; mantle cell lymphoma; AIDS-related lymphoma; and Waldenstrom's Macroglobulinemia) ; chronic lymphocytic leukemia (CLL) ; acute lymphoblastic leukemia (ALL) ; hairy cell leukemia; chronic myeloblastic leukemia; and post-transplant lymphoproliferative disorder (PTLD) , as well as abnormal vascular proliferation associated with phakomatoses, edema (such as that associated with brain tumors) , Meigs's yndrome, brain, as well as head and neck cancer, and associated metastases. Stimulation of an immune response

[0265] In some aspects, the disclosure also provides a method of modulating (for example, stimulating) an immune response in a subject comprising administering an antibody or an antigen binding portion thereof of the disclosure to the subject such that an immune response in the subject is modulated, e.g. enhanced. For example, the subject is a mammal. In a specific embodiment, the subject is a human.

[0266] The term “modulating an immune response” or its grammatical variations, means stimulating, evoking, increasing, reducing, improving, mitigating or augmenting any response of a mammal’s immune system. The immune response may be a cellular response (i.e. cell-mediated, such as cytotoxic T lymphocyte mediated) or a humoral response (i.e. antibody mediated response) , and may be a primary or secondary immune response. The enhancement or decrease of immune response can be assessed using a number of in vitro or in vivo measurements known to those skil...

Claims

1.An antibody or antigen-binding portion thereof, comprising a CD19 binding moiety, a CD3 binding moiety and a CD20 binding moiety, wherein:(a) the CD19 binding moiety comprises a heavy chain complementarity determining region (HCDR) 1, a HCDR2 and a HCDR3 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1, 2 and 3, respectively, and a light chain complementarity determining region (LCDR) 1, a LCDR2 and a LCDR3 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 4, 5 and 6, respectively;(b) the CD3 binding moiety comprises a HCDR1, a HCDR2 and a HCDR3 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 7, 8 and 9, respectively, and a LCDR1, a LCDR2 and a LCDR3 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 10, 11 and 12, respectively; and(c) the CD20 binding moiety comprises a HCDR1, a HCDR2 and a HCDR3 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 13, 14 and 15, respectively, and a LCDR1, a LCDR2 and a LCDR3 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 16, 17 and 18, respectively.2.The antibody or antigen-binding portion thereof of claim 1, wherein:(a) the CD19 binding moiety comprises a heavy chain variable region (CD19VH) and a light chain variable region (CD19VL) ;(b) the CD3 binding moiety comprises a heavy chain variable region (CD3VH) and a light chain variable region (CD3VL) ; and(c) the CD20 binding moiety comprises a heavy chain variable region (CD20VH) and a light chain variable region (CD20VL) .3.The antibody or antigen-binding portion thereof of any one of the preceding claims, further comprising a first binding arm and a second binding arm, wherein the first binding arm comprises the CD19 binding moiety and the CD3 binding moiety and the second binding arm comprises the CD20 binding moiety.4.The antibody or antigen-binding portion thereof of any one of the preceding claims, wherein:(a) the CD19VH comprises an amino acid sequence with at least 90%sequence identity to SEQ ID NO: 19;(b) the CD19VL comprises an amino acid sequence with at least 90%sequence identity to SEQ ID NO: 20;(c) the CD3VH comprises an amino acid sequence with at least 90%sequence identity to SEQ ID NO: 21;(d) the CD3VL comprises an amino acid sequence with at least 90%sequence identity to SEQ ID NO: 22;(e) the CD20VH comprises an amino acid sequence with at least 90%sequence identity to SEQ ID NO: 23; or(f) the CD20VL comprises an amino acid sequence with at least 90%sequence identity to SEQ ID NO: 24.5.The antibody or antigen-binding portion thereof of any one of the preceding claims, wherein:(a) the CD19VH comprises an amino acid sequence with at least 90%sequence identity to SEQ ID NO: 19;(b) the CD19VL comprises an amino acid sequence with at least 90%sequence identity to SEQ ID NO: 20;(c) the CD3VH comprises an amino acid sequence with at least 90%sequence identity to SEQ ID NO: 21;(d) the CD3VL comprises an amino acid sequence with at least 90%sequence identity to SEQ ID NO: 22;(e) the CD20VH comprises an amino acid sequence with at least 90%sequence identity to SEQ ID NO: 23; and(f) the CD20VL comprises an amino acid sequence with at least 90%sequence identity to SEQ ID NO: 24.6.The antibody or antigen-binding portion thereof of any one of the preceding claims, wherein:(a) the CD19VH comprises an amino acid sequence with at least 95%sequence identity to SEQ ID NO: 19;(b) the CD19VL comprises an amino acid sequence with at least 95%sequence identity to SEQ ID NO: 20;(c) the CD3VH comprises an amino acid sequence with at least 95%sequence identity to SEQ ID NO: 21;(d) the CD3VL comprises an amino acid sequence with at least 95%sequence identity to SEQ ID NO: 22;(e) the CD20VH comprises an amino acid sequence with at least 95%sequence identity to SEQ ID NO: 23; or(f) the CD20VL comprises an amino acid sequence with at least 95%sequence identity to SEQ ID NO: 24.7.The antibody or antigen-binding portion thereof of any one of the preceding claims, wherein:(a) the CD19VH comprises an amino acid sequence with at least 95%sequence identity to SEQ ID NO: 19;(b) the CD19VL comprises an amino acid sequence with at least 95%sequence identity to SEQ ID NO: 20;(c) the CD3VH comprises an amino acid sequence with at least 95%sequence identity to SEQ ID NO: 21;(d) the CD3VL comprises an amino acid sequence with at least 95%sequence identity to SEQ ID NO: 22;(e) the CD20VH comprises an amino acid sequence with at least 95%sequence identity to SEQ ID NO: 23; and(f) the CD20VL comprises an amino acid sequence with at least 95%sequence identity to SEQ ID NO: 24.8.The antibody or antigen-binding portion thereof of any one of the preceding claims, wherein:(a) the CD19VH comprises an amino acid sequence with at least 99%sequence identity to SEQ ID NO: 19;(b) the CD19VL comprises an amino acid sequence with at least 99%sequence identity to SEQ ID NO: 20;(c) the CD3VH comprises an amino acid sequence with at least 99%sequence identity to SEQ ID NO: 21;(d) the CD3VL comprises an amino acid sequence with at least 99%sequence identity to SEQ ID NO: 22;(e) the CD20VH comprises an amino acid sequence with at least 99%sequence identity to SEQ ID NO: 23; or(f) the CD20VL comprises an amino acid sequence with at least 99%sequence identity to SEQ ID NO: 24.9.The antibody or antigen-binding portion thereof of any one of the preceding claims, wherein:(a) the CD19VH comprises an amino acid sequence with at least 99%sequence identity to SEQ ID NO: 19;(b) the CD19VL comprises an amino acid sequence with at least 99%sequence identity to SEQ ID NO: 20;(c) the CD3VH comprises an amino acid sequence with at least 99%sequence identity to SEQ ID NO: 21;(d) the CD3VL comprises an amino acid sequence with at least 99%sequence identity to SEQ ID NO: 22;(e) the CD20VH comprises an amino acid sequence with at least 99%sequence identity to SEQ ID NO: 23; and(f) the CD20VL comprises an amino acid sequence with at least 99%sequence identity to SEQ ID NO: 24.10.The antibody or antigen-binding portion thereof of any one of the preceding claims, wherein:(a) the CD19VH comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19;(b) the CD19VL comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20;(c) the CD3VH comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21;(d) the CD3VL comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22;(e) the CD20VH comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 23; or(f) the CD20VL comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 24.11.The antibody or antigen-binding portion thereof of any one of the preceding claims, wherein:(a) the CD19VH comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19;(b) the CD19VL comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20;(c) the CD3VH comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21;(d) the CD3VL comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22;(e) the CD20VH comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 23; and(f) the CD20VL comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 24.12.The antibody or antigen-binding portion thereof of any one of the preceding claims, wherein:(a) the CD19VH is operably linked to a first heavy chain constant domain (C1H) ;(b) the CD19VL is operably linked to a first light chain constant domain (C1L) ;(c) the CD3VH is operably linked to a second heavy chain constant domain (C2H) ;(d) the CD3VL is operably linked to a second light chain constant domain (C2L) ;(e) the CD20VH is operably linked to a third heavy chain constant domain (C3H) ; or(f) the CD20VL is operably linked to a third light chain constant domain (C3L) .13.The antibody or antigen-binding portion thereof of any one of the preceding claims, wherein:(a) the CD19VH is operably linked to a first heavy chain constant domain (C1H) ;(b) the CD19VL is operably linked to a first light chain constant domain (C1L) ;(c) the CD3VH is operably linked to a second heavy chain constant domain (C2H) ;(d) the CD3VL is operably linked to a second light chain constant domain (C2L) ;(e) the CD20VH is operably linked to a third heavy chain constant domain (C3H) ; and(f) the CD20VL is operably linked to a third light chain constant domain (C3L) .14.The antibody or antigen-binding portion thereof of any one of the preceding claims, wherein:(a) the C1H and C1L comprise a T cell receptor (TCR) α chain constant domain (Cα) and a TCR β chain constant domain (Cβ) , respectively;(b) the C1H and C1L comprise Cβ and Cα, respectively; or(c) the C1H and C1L comprise an antibody heavy chain constant region CH1 domain and an antibody light chain constant region CL domain, respectively.15.The antibody or antigen-binding portion thereof of any one of the preceding claims, wherein the C1H and the C1L comprise Cα and Cβ, respectively.16.The antibody or antigen-binding portion thereof of any one of the preceding claims, wherein the C1H and the C1L comprise Cβ and Cα, respectively.17.The antibody or antigen-binding portion thereof of any one of the preceding claims, wherein the C1H and the C1L comprise CH1 domain and CL domain, respectively.18.The antibody or antigen-binding portion thereof of any one of the preceding claims, wherein:(a) the C2H and the C2L comprise Cα and Cβ, respectively;(b) the C2H and the C2L comprise Cβ and Cα, respectively; or(c) the C2H and the C2L comprise CH1 domain and CL domain, respectively.19.The antibody or antigen-binding portion thereof of any one of the preceding claims, wherein the C2H and the C2L comprise Cα and Cβ, respectively.20.The antibody or antigen-binding portion thereof of any one of the preceding claims, wherein the C2H and the C2L comprise Cβ and Cα, respectively.21.The antibody or antigen-binding portion thereof of any one of the preceding claims, wherein the C2H and the C2L comprise CH1 domain and CL domain, respectively.22.The antibody or antigen-binding portion thereof of any one of the preceding claims, wherein:(a) the C3H and the C3L comprise Cα and Cβ, respectively;(b) the C3H and the C3L comprise Cβ and Cα, respectively; or(c) the C3H and the C3L comprise CH1 domain and CL domain, respectively.23.The antibody or antigen-binding portion thereof of any one of the preceding claims, wherein the C3H and the C3L comprise Cα and Cβ, respectively.24.The antibody or antigen-binding portion thereof of any one of the preceding claims, wherein the C3H and the C3L comprise Cβ and Cα, respectively.25.The antibody or antigen-binding portion thereof of any one of the preceding claims, wherein the C3H and the C3L comprise CH1 domain and CL domain, respectively.26.The antibody or antigen-binding portion thereof of any one of the preceding claims, wherein:(a) the C1H and the C1L comprise Cβ and Cα, respectively;(b) the C2H and the C2L comprise Cβ and Cα, respectively. and(c) the C3H and the C3L comprise CH1 domain and CL domain, respectively.27.The antibody or antigen-binding portion thereof of any one of the preceding claims, wherein:(a) Cα comprises an amino acid sequence with at least 90%sequence identity to SEQ ID NO: 35;(b) Cβ comprises an amino acid sequence with at least 90%sequence identity to SEQ ID NO: 34;(c) CH1 domain comprises an amino acid sequence with at least 90%sequence identity to SEQ ID NO: 44; or(d) CL domain comprises an amino acid sequence with at least 90%sequence identity to SEQ ID NO: 45.28.The antibody or antigen-binding portion thereof of any one of the preceding claims, wherein:(a) Cα comprises an amino acid sequence with at least 90%sequence identity to SEQ ID NO: 35;(b) Cβ comprises an amino acid sequence with at least 90%sequence identity to SEQ ID NO: 34;(c) CH1 domain comprises an amino acid sequence with at least 90%sequence identity to SEQ ID NO: 44; and(d) CL domain comprises an amino acid sequence with at least 90%sequence identity to SEQ ID NO: 45.29.The antibody or antigen-binding portion thereof of any one of the preceding claims, wherein:(a) Cα comprises an amino acid sequence with at least 95%sequence identity to SEQ ID NO: 35;(b) Cβ comprises an amino acid sequence with at least 95%sequence identity to SEQ ID NO: 34;(c) CH1 domain comprises an amino acid sequence with at least 95%sequence identity to SEQ ID NO: 44; or(d) CL domain comprises an amino acid sequence with at least 95%sequence identity to SEQ ID NO: 45.30.The antibody or antigen-binding portion thereof of any one of the preceding claims, wherein:(a) Cα comprises an amino acid sequence with at least 95%sequence identity to SEQ ID NO: 35;(b) Cβ comprises an amino acid sequence with at least 95%sequence identity to SEQ ID NO: 34;(c) CH1 domain comprises an amino acid sequence with at least 95%sequence identity to SEQ ID NO: 44; and(d) CL domain comprises an amino acid sequence with at least 95%sequence identity to SEQ ID NO: 45.31.The antibody or antigen-binding portion thereof of any one of the preceding claims, wherein:(a) Cα comprises an amino acid sequence with at least 99%sequence identity to SEQ ID NO: 35;(b) Cβ comprises an amino acid sequence with at least 99%sequence identity to SEQ ID NO: 34;(c) CH1 domain comprises an amino acid sequence with at least 99%sequence identity to SEQ ID NO: 44; or(d) CL domain comprises an amino acid sequence with at least 99%sequence identity to SEQ ID NO: 45.32.The antibody or antigen-binding portion thereof of any one of the preceding claims, wherein:(a) Cα comprises an amino acid sequence with at least 99%sequence identity to SEQ ID NO: 35;(b) Cβ comprises an amino acid sequence with at least 99%sequence identity to SEQ ID NO: 34;(c) CH1 domain comprises an amino acid sequence with at least 99%sequence identity to SEQ ID NO: 44; and(d) CL domain comprises an amino acid sequence with at least 99%sequence identity to SEQ ID NO: 45.33.The antibody or antigen-binding portion thereof of any one of the preceding claims, wherein:(a) Cα comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 35;(b) Cβ comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 34;(c) CH1 domain comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 44; or(d) CL domain comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 45.34.The antibody or antigen-binding portion thereof of any one of the preceding claims, wherein:(a) Cα comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 35;(b) Cβ comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 34;(c) CH1 domain comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 44; and(d) CL domain comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 45.35.The antibody or antigen-binding portion thereof of any one of the preceding claims, wherein:(a) the C1H comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 34;(b) the C1L comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 35;(c) the C2H comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 34;(d) the C2L comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 35;(e) the C3H comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 44; and(f) the C3L comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 45.36.The antibody or antigen-binding portion thereof of any one of the preceding claims, wherein:(a) the CD19VH is covalently linked to the C1H directly or via a peptide linker;(b) the CD19VL is covalently linked to the C1L directly or via a peptide linker;(c) the CD3VH is covalently linked to the C2H directly or via a peptide linker;(d) the CD3VL is covalently linked to the C2L directly or via a peptide linker;(e) the CD20VH is covalently linked to the C3H directly or via a peptide linker; or(f) the CD20VL is covalently linked to the C3L directly or via a peptide linker.37.The antibody or antigen-binding portion thereof of any one of the preceding claims, wherein:(a) the CD19VH is covalently linked to the C1H directly;(b) the CD19VL is covalently linked to the C1L directly;(c) the CD3VH is covalently linked to the C2H directly;(d) the CD3VL is covalently linked to the C2L directly;(e) the CD20VH is covalently linked to the C3H directly; or(f) the CD20VL is covalently linked to the C3L directly.38.The antibody or antigen-binding portion thereof of any one of the preceding claims, wherein:(a) the CD19VH is covalently linked to the C1H directly;(b) the CD19VL is covalently linked to the C1L directly;(c) the CD3VH is covalently linked to the C2H directly;(d) the CD3VL is covalently linked to the C2L directly;(e) the CD20VH is covalently linked to the C3H directly; and(f) the CD20VL is covalently linked to the C3L directly.39.The antibody or antigen-binding portion thereof of any one of the preceding claims, wherein:(a) the CD19VH is covalently linked to the C1H via a peptide linker;(b) the CD19VL is covalently linked to the C1L via a peptide linker;(c) the CD3VH is covalently linked to the C2H via a peptide linker;(d) the CD3VL is covalently linked to the C2L via a peptide linker;(e) the CD20VH is covalently linked to the C3H via a peptide linker; or(f) the CD20VL is covalently linked to the C3L via a peptide linker.40.The antibody or antigen-binding portion thereof of any one of the preceding claims, wherein:(a) the CD19VH is covalently linked to the C1H via a peptide linker;(b) the CD19VL is covalently linked to the C1L via a peptide linker;(c) the CD3VH is covalently linked to the C2H via a peptide linker;(d) the CD3VL is covalently linked to the C2L via a peptide linker;(e) the CD20VH is covalently linked to the C3H via a peptide linker; and(f) the CD20VL is covalently linked to the C3L via a peptide linker.41.The antibody or antigen-binding portion thereof of any one of the preceding claims, further comprising a first heavy chain (HC1) , a second heavy chain (HC2) , a first light chain (LC1) , a second light chain (LC2) , or a third light chain (LC3) .42.The antibody or antigen-binding portion thereof of any one of the preceding claims, further comprising the first heavy chain (HC1) , the second heavy chain (HC2) , the first light chain (LC1) , the second light chain (LC2) , and the third light chain (LC3) .43.The antibody or antigen-binding portion thereof of any one of the preceding claims, further comprising a fragment crystallizable (Fc) region.44.The antibody or antigen-binding portion thereof of any one of the preceding claims, further comprising an immunoglobulin (Ig) G, IgA, IgM, IgE, or IgD.45.The antibody or antigen-binding portion thereof of any one of the preceding claims, further comprising an IgG1, IgG2, IgG3, or IgG4.46.The antibody or antigen-binding portion thereof of any one of the preceding claims, further comprising a human IgG1, IgG2, IgG3, or IgG4.47.The antibody or antigen-binding portion thereof of any one of the preceding claims, further comprising an IgG4.48.The antibody or antigen-binding portion thereof of any one of the preceding claims, further comprising a human IgG4.49.The antibody or antigen-binding portion thereof of any one of the preceding claims, wherein the CD19 binding moiety, the CD3 binding moiety, or the CD20 binding moiety comprises a fragment antigen-binding (Fab) region, a Fab’, a F (ab’) 2, or single chain variable fragment (scFv) .50.The antibody or antigen-binding portion thereof of any one of the preceding claims, wherein the CD19 binding moiety, the CD3 binding moiety, or the CD20 binding moiety comprises a Fab region.51.The antibody or antigen-binding portion thereof of any one of the preceding claims, wherein the CD19 binding moiety, the CD3 binding moiety, and the CD20 binding moiety each comprises a Fab region.52.The antibody or antigen-binding portion thereof of any one of the preceding claims, wherein HC1, HC2, LC1, LC2 and LC3 comprise domains operably linked, from the amino terminus to the carboxyl terminus, in the following formats:(a) CD19VH-Cβ-CD3VL-Cα-Fc, CD20VH-CH1-Fc, CD19VL-Cα, CD3VH-Cβ, and CD20VL-CL, respectively;(b) CD19VL-Cα-CD3VH-Cβ-Fc, CD20VH-CH1-Fc, CD19VH-Cβ, CD3VL-Cα, and CD20VL-CL, respectively;(c) CD3VH-Cβ-CD19VL-Cα-Fc, CD20VH-CH1-Fc, CD3VL-Cα, CD19VH-Cβ, and CD20VL-CL, respectively; or(d) CD3VL-Cα-CD19VH-Cβ-Fc, CD20VH-CH1-Fc, CD3VH-Cβ, CD19VL-Cα, and CD20VL-CL, respectively.53.The antibody or antigen-binding portion thereof of any one of the preceding claims, wherein HC1, HC2, LC1, LC2 and LC3 comprise domains operably linked, from the amino terminus to the carboxyl terminus, in the following formats: CD19VH-Cβ-CD3VL-Cα-Fc, CD20VH-CH1-Fc, CD19VL-Cα, CD3VH-Cβ, and CD20VL-CL, respectively.54.The antibody or antigen-binding portion thereof of any one of the preceding claims, wherein:(a) CD19VH-Cβ is covalently linked to CD3VL-Cα-Fc directly or via a peptide linker;(b) CD19VL-Cα is covalently linked to CD3VH-Cβ-Fc directly or via a peptide linker;(c) CD3VH-Cβ is covalently linked to CD19VL-Cα-Fc directly or via a peptide linker; or(d) CD3VL-Cα is covalently linked to CD19VH-Cβ-Fc directly or via a peptide linker.55.The antibody or antigen-binding portion thereof of any one of the preceding claims, wherein CD19VH-Cβ is covalently linked to CD3VL-Cα-Fc directly.56.The antibody or antigen-binding portion thereof of any one of the preceding claims, wherein CD19VH-Cβ is covalently linked to CD3VL-Cα-Fc via the peptide linker.57.The antibody or antigen-binding portion thereof of any one of the preceding claims, wherein the peptide linker comprises 1 to 40 amino acids in length.58.The antibody or antigen-binding portion thereof of any one of the preceding claims, wherein the peptide linker comprises glycine (G) and serine (S) .59.The antibody or antigen-binding portion thereof of any one of the preceding claims, wherein the peptide linker comprises a glycine (G) and serine (S) linker comprising (GS) n (SEQ ID NO: 46) ,(GGS) n (SEQ ID NO: 47) , (GGGS) n (SEQ ID NO: 48) , (GGGGS) n (SEQ ID NO: 49) , (GGSG) n (SEQ ID NO: 50) , or (GGGSS) n (SEQ ID NO: 51) , wherein n is an integer of 1-9.60.The antibody or antigen-binding portion thereof of any one of the preceding claims, wherein the peptide linker comprises SEQ ID NO: 38.61.The antibody or antigen-binding portion thereof of any one of the preceding claims, wherein CD19VH-Cβ is covalently linked to CD3VL-Cα-Fc via the peptide linker comprising SEQ ID NO: 38.62.The antibody or antigen-binding portion thereof of any one of the preceding claims, wherein:(a) CD19VH-Cβ-CD3VL-Cα is covalently linked to the Fc region directly or via a hinge region;(b) CD20VH-CH1 is covalently linked to the Fc region directly or via a hinge region;(c) CD19VL-Cα-CD3VH-Cβ is covalently linked to the Fc region directly or via a hinge region;(d) CD3VH-Cβ-CD19VL-Cα is covalently linked to the Fc region directly or via a hinge region; or(e) CD3VL-Cα-CD19VH-Cβ is covalently linked to the Fc region directly or via a hinge region.63.The antibody or antigen-binding portion thereof of any one of the preceding claims, wherein CD19VH-Cβ-CD3VL-Cα is covalently linked to the Fc region via the hinge region.64.The antibody or antigen-binding portion thereof of any one of the preceding claims, wherein CD20VH-CH1 is covalently linked to the Fc region via the hinge region.65.The antibody or antigen-binding portion thereof of any one of the preceding claims, wherein:(a) CD19VH-Cβ-CD3VL-Cα is covalently linked to the Fc region via the hinge region; and(b) CD20VH-CH1 is covalently linked to the Fc region via the hinge region.66.The antibody or antigen-binding portion thereof of any one of the preceding claims, wherein the hinge region comprises SEQ ID NO: 37.67.The antibody or antigen-binding portion thereof of any one of the preceding claims, wherein CD19VH-Cβ-CD3VL-Cα is covalently linked to the Fc region via the hinge region comprising SEQ ID NO: 37.68.The antibody or antigen-binding portion thereof of any one of the preceding claims, wherein CD20VH-CH1 is covalently linked to the Fc region via the hinge region comprising SEQ ID NO: 37.69.The antibody or antigen-binding portion thereof of any one of the preceding claims, wherein:(a) CD19VH-Cβ-CD3VL-Cα is covalently linked to the Fc region via the hinge region comprising SEQ ID NO: 37; and(b) CD20VH-CH1 is covalently linked to the Fc region via the hinge region comprising SEQ ID NO: 37.70.The antibody or antigen-binding portion thereof of any one of the preceding claims, wherein:(a) CD19VH-Cβ associates with CD19VL-Cα to form the CD19 binding moiety;(b) CD3VL-Cα associates with CD3VH-Cβ to form the CD3 binding moiety;(c) CD20VH-CH1 associates with CD20VL-CL to form the CD20 binding moiety;(d) CD19VL-Cα associates with CD19VH-Cβ to form the CD19 binding moiety; or(e) CD3VH-Cβ associates with CD3VL-Cα to form the CD3 binding moiety.71.The antibody or antigen-binding portion thereof of any one of the preceding claims, wherein:(a) CD19VH-Cβ associates with CD19VL-Cα to form the CD19 binding moiety;(b) CD3VL-Cα associates with CD3VH-Cβ to form the CD3 binding moiety; and(c) CD20VH-CH1 associates with CD20VL-CL to form the CD20 binding moiety.72.The antibody or antigen-binding portion thereof of any one of the preceding claims, wherein Cα and Cβ associate to form a dimer via a bond or an interaction between Cα and Cβ.73.The antibody or antigen-binding portion thereof of any one of the preceding claims, wherein Cα or Cβ comprises an amino acid modification that results in a disulfide bond formed between Cα and Cβ, wherein the disulfide bond improves the stability of the interface between Cα and Cβ.74.The antibody or antigen-binding portion thereof of any one of the preceding claims, wherein the Fc region of the antibody or antigen-binding portion thereof comprises a first amino acid mutation that reduces or eliminates antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC) , complement-dependent cytotoxicity (CDC) or binding of the antibody or antigen-binding portion thereof to a Fc-gamma receptor (FcγR) .75.The antibody or antigen-binding portion thereof of any one of the preceding claims, wherein the first amino acid mutation comprises a substitution of phenylalanine (F) with alanine (A) at amino acid 234 according to the EU numbering (F234A) .76.The antibody or antigen-binding portion thereof of any one of the preceding claims, wherein the first amino acid mutation comprises a substitution of leucine (L) with alanine (A) at amino acid 235 according to the EU numbering (L235A) .77.The antibody or antigen-binding portion thereof of any one of the preceding claims, wherein the first amino acid mutation comprises F234A and L235A.78.The antibody or antigen-binding portion thereof of any one of the preceding claims, wherein the Fc region of the first heavy chain (HC1) comprises the first amino acid mutation comprising F234A and L235A.79.The antibody or antigen-binding portion thereof of any one of the preceding claims, wherein the Fc region of the second heavy chain (HC2) comprises the first amino acid mutation comprising F234A and L235A.80.The antibody or antigen-binding portion thereof of any one of the preceding claims, wherein:(a) the Fc region of the first heavy chain (HC1) comprises the first amino acid mutation comprising F234A and L235A; and(b) the Fc region of the second heavy chain (HC2) comprises the first amino acid mutation comprising F234A and L235A.81.The antibody or antigen-binding portion thereof of any one of the preceding claims, wherein the Fc region of the first heavy chain (HC1) or second heavy chain (HC2) comprises a second amino acid mutation that results in knob-into-hole substitution in the first heavy chain (HC1) or second heavy chain (HC2) .82.The antibody or antigen-binding portion thereof of any one of the preceding claims, wherein the second amino acid mutation of the Fc region comprises:(a) a substitution of serine (S) with cysteine (C) at amino acid residue 354 according to the EU numbering (S354C) ;(b) a substitution of threonine (T) with tryptophan (W) at amino acid residue 366 according to the EU numbering (T366W) ;(c) a substitution of tyrosine (Y) with cysteine (C) at amino acid residue 349 according to the EU numbering (Y349C) ;(d) a substitution of threonine (T) with serine (S) at amino acid residue 366 according to the EU numbering (T366S) ;(e) a substitution of leucine (L) with alanine (A) at amino acid residue 368 according to the EU numbering (L368A) ; or(f) a substitution of tyrosine (Y) with valine (V) at amino acid residue 407 according to the EU numbering (Y407V) .83.The antibody or antigen-binding portion thereof of any one of the preceding claims, wherein:(a) the Fc region of the first heavy chain (HC1) comprises the second amino acid mutation comprising S354C or T366W; and(b) the Fc region of the second heavy chain (HC2) comprises the second amino acid mutation comprising Y349C, T366S, L368A, or Y407V.84.The antibody or antigen-binding portion thereof of any one of the preceding claims, wherein:(a) the Fc region of the first heavy chain (HC1) comprises the second amino acid mutation comprising Y349C, T366S, L368A, or Y407V; and(b) the Fc region of the second heavy chain (HC2) comprises the second amino acid mutation comprising S354C or T366W.85.The antibody or antigen-binding portion thereof of any one of the preceding claims, wherein:(a) the Fc region of the first heavy chain (HC1) comprises the second amino acid mutation comprising S354C and T366W; and(b) the Fc region of the second heavy chain (HC2) comprises the second amino acid mutation comprising Y349C, T366S, L368A, and Y407V.86.The antibody or antigen-binding portion thereof of any one of the preceding claims, wherein:(a) the Fc region of the first heavy chain (HC1) comprises the second amino acid mutation comprising Y349C, T366S, L368A, and Y407V; and(b) the Fc region of the second heavy chain (HC2) comprises the second amino acid mutation comprising S354C and T366W.87.The antibody or antigen-binding portion thereof of any one of the preceding claims, wherein:(a) the Fc region of the first heavy chain (HC1) comprises the first amino acid mutation comprising F234A and L235A and the second amino acid mutation comprising S354C and T366W; and(b) the Fc region of the second heavy chain (HC2) comprises the first amino acid mutation comprising F234A and L235A and the second amino acid mutation comprising Y349C, T366S, L368A, and Y407V.88.The antibody or antigen-binding portion thereof of any one of the preceding claims, wherein:(a) the Fc region of the first heavy chain (HC1) comprises the first amino acid mutation comprising F234A and L235A and the second amino acid mutation comprising Y349C, T366S, L368A, and Y407V; and(b) the Fc region of the second heavy chain (HC2) comprises the first amino acid mutation comprising F234A and L235A and the second amino acid mutation comprising S354C and T366W.89.The antibody or antigen-binding portion thereof of any one of the preceding claims, wherein the Fc region of the first heavy chain (HC1) or second heavy chain (HC2) comprises a third amino acid mutation comprising:(a) a substitution of serine (S) with proline (P) at amino acid residue 228 according to the EU numbering (S228P) ;(b) a substitution of methionine (M) with tyrosine (Y) at amino acid residue 252 according to the EU numbering (M252Y) ;(c) a substitution of serine (S) with threonine (T) at amino acid residue 254 according to the EU numbering (S254T) ; or(d) a substitution of threonine (T) with glutamic acid (E) at amino acid residue 256 according to the EU numbering (T256E) .90.The antibody or antigen-binding portion thereof of any one of the preceding claims, wherein the Fc region of the first heavy chain (HC1) comprises a third amino acid mutation comprising S228P, M252Y, S254T, or T256E.91.The antibody or antigen-binding portion thereof of any one of the preceding claims, wherein the Fc region of the second heavy chain (HC1) comprises a third amino acid mutation comprising S228P, M252Y, S254T, or T256E.92.The antibody or antigen-binding portion thereof of any one of the preceding claims, wherein:(a) the Fc region of the first heavy chain (HC1) comprises an amino acid sequence with at least 90%sequence identity to SEQ ID NO: 36; or(b) the Fc region of the second heavy chain (HC2) comprises an amino acid sequence with at least 90%sequence identity to SEQ ID NO: 43.93.The antibody or antigen-binding portion thereof of any one of the preceding claims, wherein:(a) the Fc region of the first heavy chain (HC1) comprises an amino acid sequence with at least 90%sequence identity to SEQ ID NO: 36; and(b) the Fc region of the second heavy chain (HC2) comprises an amino acid sequence with at least 90%sequence identity to SEQ ID NO: 43.94.The antibody or antigen-binding portion thereof of any one of the preceding claims, wherein:(a) the Fc region of the first heavy chain (HC1) comprises an amino acid sequence with at least 95%sequence identity to SEQ ID NO: 36; or(b) the Fc region of the second heavy chain (HC2) comprises an amino acid sequence with at least 95%sequence identity to SEQ ID NO: 43.95.The antibody or antigen-binding portion thereof of any one of the preceding claims, wherein:(a) the Fc region of the first heavy chain (HC1) comprises an amino acid sequence with at least 95%sequence identity to SEQ ID NO: 36; and(b) the Fc region of the second heavy chain (HC2) comprises an amino acid sequence with at least 95%sequence identity to SEQ ID NO: 43.96.The antibody or antigen-binding portion thereof of any one of the preceding claims, wherein:(a) the Fc region of the first heavy chain (HC1) comprises an amino acid sequence with at least 99%sequence identity to SEQ ID NO: 36; or(b) the Fc region of the second heavy chain (HC2) comprises an amino acid sequence with at least 99%sequence identity to SEQ ID NO: 43.97.The antibody or antigen-binding portion thereof of any one of the preceding claims, wherein:(a) the Fc region of the first heavy chain (HC1) comprises an amino acid sequence with at least 99%sequence identity to SEQ ID NO: 36; and(b) the Fc region of the second heavy chain (HC2) comprises an amino acid sequence with at least 99%sequence identity to SEQ ID NO: 43.98.The antibody or antigen-binding portion thereof of any one of the preceding claims, wherein:(a) the Fc region of the first heavy chain (HC1) comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 36; or(b) the Fc region of the second heavy chain (HC2) comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 43.99.The antibody or antigen-binding portion thereof of any one of the preceding claims, wherein:(a) the Fc region of the first heavy chain (HC1) comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 36; and(b) the Fc region of the second heavy chain (HC2) comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 43.100.The antibody or antigen-binding portion thereof of any one of the preceding claims, wherein:(a) HC1 comprises an amino acid sequence with at least 90%sequence identity to SEQ ID NO: 25;(b) HC2 comprises an amino acid sequence with at least 90%sequence identity to SEQ ID NO: 26;(c) LC1 comprises an amino acid sequence with at least 90%sequence identity to SEQ ID NO: 27;(d) LC2 comprises an amino acid sequence with at least 90%sequence identity to SEQ ID NO: 28; or(e) LC3 comprises an amino acid sequence with at least 90%sequence identity to SEQ ID NO: 29.101.The antibody or antigen-binding portion thereof of any one of the preceding claims, wherein:(a) HC1 comprises an amino acid sequence with at least 90%sequence identity to SEQ ID NO: 25;(b) HC2 comprises an amino acid sequence with at least 90%sequence identity to SEQ ID NO: 26;(c) LC1 comprises an amino acid sequence with at least 90%sequence identity to SEQ ID NO: 27;(d) LC2 comprises an amino acid sequence with at least 90%sequence identity to SEQ ID NO: 28; and(e) LC3 comprises an amino acid sequence with at least 90%sequence identity to SEQ ID NO: 29.102.The antibody or antigen-binding portion thereof of any one of the preceding claims, wherein:(a) HC1 comprises an amino acid sequence with at least 95%sequence identity to SEQ ID NO: 25;(b) HC2 comprises an amino acid sequence with at least 95%sequence identity to SEQ ID NO: 26;(c) LC1 comprises an amino acid sequence with at least 95%sequence identity to SEQ ID NO: 27;(d) LC2 comprises an amino acid sequence with at least 95%sequence identity to SEQ ID NO: 28; or(e) LC3 comprises an amino acid sequence with at least 95%sequence identity to SEQ ID NO: 29.103.The antibody or antigen-binding portion thereof of any one of the preceding claims, wherein:(a) HC1 comprises an amino acid sequence with at least 95%sequence identity to SEQ ID NO: 25;(b) HC2 comprises an amino acid sequence with at least 95%sequence identity to SEQ ID NO: 26;(c) LC1 comprises an amino acid sequence with at least 95%sequence identity to SEQ ID NO: 27;(d) LC2 comprises an amino acid sequence with at least 95%sequence identity to SEQ ID NO: 28; and(e) LC3 comprises an amino acid sequence with at least 95%sequence identity to SEQ ID NO: 29.104.The antibody or antigen-binding portion thereof of any one of the preceding claims, wherein:(a) HC1 comprises an amino acid sequence with at least 99%sequence identity to SEQ ID NO: 25;(b) HC2 comprises an amino acid sequence with at least 99%sequence identity to SEQ ID NO: 26;(c) LC1 comprises an amino acid sequence with at least 99%sequence identity to SEQ ID NO: 27;(d) LC2 comprises an amino acid sequence with at least 99%sequence identity to SEQ ID NO: 28; or(e) LC3 comprises an amino acid sequence with at least 99%sequence identity to SEQ ID NO: 29.105.The antibody or antigen-binding portion thereof of any one of the preceding claims, wherein:(a) HC1 comprises an amino acid sequence with at least 99%sequence identity to SEQ ID NO: 25;(b) HC2 comprises an amino acid sequence with at least 99%sequence identity to SEQ ID NO: 26;(c) LC1 comprises an amino acid sequence with at least 99%sequence identity to SEQ ID NO: 27;(d) LC2 comprises an amino acid sequence with at least 99%sequence identity to SEQ ID NO: 28; and(e) LC3 comprises an amino acid sequence with at least 99%sequence identity to SEQ ID NO: 29.106.The antibody or antigen-binding portion thereof of any one of the preceding claims, wherein:(a) HC1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 25;(b) HC2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26;(c) LC1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 27;(d) LC2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 28; or(e) LC3 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 29.107.The antibody or antigen-binding portion thereof of any one of the preceding claims, wherein:(a) HC1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 25;(b) HC2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26;(c) LC1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 27;(d) LC2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 28; and(e) LC3 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 29.108.The antibody or antigen-binding portion thereof of any one of the preceding claims, further comprising HC1, HC2, LC1, LC2, and LC3, wherein:(a) HC1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 25;(b) HC2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26;(c) LC1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 27;(d) LC2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 28; and(e) LC3 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 29.109.A nucleic acid sequence encoding the antibody or antigen-binding portion thereof of any one of the preceding claims.110.A nucleic acid sequence encoding the HC1, HC2, LC1, LC2, or LC3 of the antibody or antigen-binding portion thereof of any one of the preceding claims.111.A nucleic acid sequence encoding the HC1, HC2, LC1, LC2, and LC3 of the antibody or antigen-binding portion thereof of any one of the preceding claims.112.A vector comprising the nucleic acid sequence of any one of the preceding claims.113.A host cell comprising the nucleic acid sequence of any one of the preceding claims or the vector of any one of the preceding claims.114.A pharmaceutical composition comprising the antibody or antigen-binding portion thereof of any one of the preceding claims and a pharmaceutically acceptable carrier.115.A method for producing the antibody or antigen-binding portion thereof of any one of the preceding claims, comprising the steps of:(a) culturing a host cell comprising a nucleic acid sequence encoding the antibody or antigen-binding portion thereof under suitable conditions; and(b) isolating the antibody or antigen-binding portion thereof from the host cell.116.A method for producing the antibody or antigen-binding portion thereof of any one of the preceding claims, comprising the steps of:(a) culturing a host cell comprising a nucleic acid sequence encoding the HC1, HC2, LC1, LC2, or LC3 of the antibody or antigen-binding portion thereof under suitable conditions; and(b) isolating the antibody or antigen-binding portion thereof from the host cell.117.A method for producing the antibody or antigen-binding portion thereof of any one of the preceding claims, comprising the steps of:(a) culturing a host cell comprising a nucleic acid sequence encoding the HC1, HC2, LC1, LC2, and LC3 of the antibody or antigen-binding portion thereof under suitable conditions; and(b) isolating the antibody or antigen-binding portion thereof from the host cell.118.A method for modulating a CD19 or CD20 related immune response in a subject, comprising administering to the subject the antibody or antigen-binding portion thereof of any one of the preceding claims or the pharmaceutical composition of any one of the preceding claims.119.A method for inhibiting growth of tumor cells in a subject, comprising administering an effective amount of the antibody or antigen-binding portion thereof of any one of the preceding claims or the pharmaceutical composition of any one of the preceding claims to the subject.120.A method for preventing or treating cancer in a subject, comprising administering an effective amount the antibody or antigen-binding portion thereof of any one of the preceding claims or the pharmaceutical composition of any one of the preceding claims to the subject.121.The method of any one of the preceding claims, wherein the cancer comprises a cell expressing CD19 or CD20.122.The method of any one of the preceding claims, wherein the cancer comprises a cell expressing CD19 and CD20.123.The method of any one of the preceding claims, wherein the cancer comprises a B cell lymphoma.124.The method of any one of the preceding claims, wherein the cancer is selected from diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL) , non-Hodgkin lymphoma, mantle cell lymphoma (MCL) , marginal zone lymphoma (MZL) , follicular lymphoma (FL) , chronic lymphocytic leukemia, Waldenstrom macroglobulinemia (WM) , B-cell chronic lymphocytic leukemia, non-T acute lymphoblastic leukemia, acute lymphoblastic leukemia (ALL) , and chronic lymphoid lymphoma.125.The method of any one of the preceding claims, wherein the cancer comprises B-cell non-Hodgkin lymphoma (B-NHL) .126.The antibody or antigen-binding portion thereof of any one of the preceding claims for use in diagnosing, treating or preventing cancer.127.Use of the antibody or antigen-binding portion thereof of any one of the preceding claims in the manufacture of a medicament for treating or preventing a cancer.128.The use of any one of the preceding claims, wherein the cancer comprises a cell expressing CD19 or CD20.129.The use of any one of the preceding claims, wherein the cancer comprises a cell expressing CD19 and CD20.130.A kit, wherein the kit comprises a container comprising the antibody or antigen-binding portion thereof of any one of the preceding claims.131.A method of depleting a B cell in a monkey comprising administering to the monkey the antibody or antigen-binding portion thereof of any one of the preceding claims, thereby depleting the B cell.132.The method of any one of the preceding claims, wherein the B cell expresses CD19.133.The method of any one of the preceding claims, wherein the B cell expresses CD20.134.The method of any one of the preceding claims, wherein the B cell is from blood, bone marrow, spleen, mesenteric lymph node, or mandibular lymph node.135.The antibody or antigen-binding portion thereof of any one of the preceding claims, wherein the antibody or antigen-binding portion thereof provides a half maximum plasma concentration in about 40.9 h to about 92.9 h (T1 / 2) in a monkey 5 days after intravenous administration at a dose of about 1.5 mg / kg.136.The antibody or antigen-binding portion thereof of any one of the preceding claims, wherein the antibody or antigen-binding portion thereof provides a maximum plasma concentration (Cmax) of about 50.8 μg / ml to about 74.4 μg / ml in a monkey 5 days after intravenous administration at a dose of about 1.5 mg / kg.137.The antibody or antigen-binding portion thereof of any one of the preceding claims, wherein the antibody or antigen-binding portion thereof provides an area under the curve up to the last quantifiable time-point (AUC0-t) of about 2051 h*μg / ml to about 3225 h*ug / ml in a monkey 5 days after intravenous administration at a dose of about 1.5 mg / kg.138.The antibody or antigen-binding portion thereof of any one of the preceding claims, wherein the antibody or antigen-binding portion thereof provides a clearance rate of about 8.8 ml to about 13.3 ml per day per kilogram in a monkey 5 days after intravenous administration at a dose of about 1.5 mg / kg.139.The antibody or antigen-binding portion thereof of any one of the preceding claims, wherein the antibody or antigen-binding portion thereof provides a half maximum plasma concentration in about 22.3 h to about 61.2 h (T1 / 2) in a monkey 7 days after intravenous administration at a dose of about 1.5 mg / kg.140.The antibody or antigen-binding portion thereof of any one of the preceding claims, wherein the antibody or antigen-binding portion thereof provides a maximum plasma concentration (Cmax) of about 50.8 ug / ml to about 74.4 μg / ml in a monkey 7 days after intravenous administration at a dose of about 1.5 mg / kg.141.The antibody or antigen-binding portion thereof of any one of the preceding claims, wherein the antibody or antigen-binding portion thereof provides an area under the curve up to the last quantifiable time-point (AUC0-t) of about 2202 h*μg / ml to about 3331 h*ug / ml in a monkey 7 days after intravenous administration at a dose of about 1.5 mg / kg.142.The antibody or antigen-binding portion thereof of any one of the preceding claims, wherein the antibody or antigen-binding portion thereof provides a clearance rate of about 10.8 ml to about 16.1 ml per day per kilogram in a monkey 7 days after intravenous administration at a dose of about 1.5 mg / kg.143.The antibody or antigen-binding portion thereof of any one of the preceding claims, wherein the intravenous administration is intravenous infusion over about 45 min.144.The antibody or antigen-binding portion thereof of any one of the preceding claims, wherein the monkey is a cynomolgus monkey.145.The antibody or antigen-binding portion thereof of any one of the preceding claims, wherein the antibody or antigen-binding portion thereof provides a half maximum plasma concentration in about 145 h (T1 / 2) in a rat after intravenous administration at a dose of about 10 mg / kg.146.The antibody or antigen-binding portion thereof of any one of the preceding claims, wherein the antibody or antigen-binding portion thereof provides a maximum plasma concentration (Cmax) of about 227 μg / ml in a rat after intravenous administration at a dose of about 10 mg / kg.147.The antibody or antigen-binding portion thereof of any one of the preceding claims, wherein the antibody or antigen-binding portion thereof provides an area under the curve up to the last quantifiable time-point (AUC0-t) of about 20173 h*ug / ml in a rat after intravenous administration at a dose of about 10 mg / kg.148.The antibody or antigen-binding portion thereof of any one of the preceding claims, wherein the antibody or antigen-binding portion thereof provides a clearance rate of about 10.9 ml per day per kilogram in rat after intravenous administration at a dose of about 10 mg / kg.

Images