Multiplex PCR method for detecting microorganisms and use thereof

Abstract

The invention relates to a method for amplifying at least two distinct nucleic acid sequences present in a sample using a pair of primers (1) and a pair of primers (2). In particular, the first primer of the pair of primers (2) also comprises, in the (5') position, the sequence of the first primer of the pair of primers (1), and the second primer of the pair of primers (2) also comprises, in the (5') position, the sequence of the second primer of the pair of primers (1). The invention also relates to a kit and a detection kit capable of implementing said method and the uses thereof.

Description

PROCEDE DE PCR MULTIPLEXE POUR LA DETECTION DE MICROORGANISMES ET SON UTILISATION Domaine de l'invention L'invention se rapporte au domaine de la détection et de l'amplification d'au moins un acide nucléique d'intérêt, en particulier dans le diagnostic infectieux. L'invention concerne ainsi un procédé pour amplifier au moins deux séquences d'acides nucléiques distinctes présentes dans un échantillon à partir d'un couple d'amorces 1 amplifiant un premier acide nucléique (A) et d'au moins un couple d'amorces hybrides ou chimères 2 amplifiant un deuxième acide nucléique (B). En particulier, la première amorce telle qu'une amorce sens du couple d'amorces 2 comprend en outre en 5' la séquence de la première amorce du couple d'amorces 1, et la deuxième amorce du couple d'amorces 2 comprend en outre en 5' la séquence de la première ou de la deuxième amorce du couple d'amorces 1. L'invention concerne également les amorces, un kit apte à mettre en œuvre ledit procédé et ses utilisations. État de la technique Ces dernières années, le diagnostic infectieux a fortement évolué, notamment par l'utilisation des méthodes de biologie moléculaire telles que l'amplification génomique ou Polymerase Chain Reaction (PCR). La PCR remplace de plus en plus les méthodes sérologiques et microbiologiques classiques, telles que la mise en culture des bactéries ou les tests ELISA. Les avantages de la PCR sont nombreux, le test est rapide, sensible et spécifique. Malgré un coût encore assez important et donc réservé aux analyses difficiles ou à certains laboratoires d'analyse, la spécificité et la sensibilité du diagnostic par PCR remplacera à terme les analyses classiques qui sont mises en œuvre en première intention. La PCR standard permet d'amplifier un acide nucléique d'intérêt à partir d'un couple d'amorces déterminé. Dans le diagnostic infectieux, par exemple, lors d'une suspicion d'infection à E. Coli, un couple d'amorce permettant l'amplification d'un acide nucléique spécifique à E. Coli peut être utilisé. Lorsque l'origine de l'infection n'est pas connue, il est nécessaire d'utiliser des couples d'amorces spécifiques à chacun des pathogènes que l'on souhaite détecter. Dans une approche PCR dite simplex, un seul couple d'amorce est utilisé et il faut reproduire autant de fois que nécessaire une réaction PCR vis à vis du nombre de virus, bactéries ou levures que l'on souhaite identifier comme responsables de l'infection. Dans une approche PCR dite multiplexe, tous les couples d'amorces sont ajoutés en une seule réaction et tous les pathogènes recherchés seront identifiés en une seule fois. La PCR multiplexe est une PCR permettant d'amplifier simultanément plusieurs séquences d'acides nucléiques différentes à partir d'un même échantillon biologique. Elle permet d'effectuer plusieurs amplifications ciblées dans une seule et même réaction. La PCR multiplexe est donc particulièrement adaptée dans le diagnostic infectieux. Lors du diagnostic infectieux, des couples d'amorces différents sont utilisés pour cibler plusieurs bactéries, virus ou levures lors d'une même réaction PCR en présence de l'échantillon biologique cible. Toutefois, les couples amorces utilisés en PCR multiplexe nécessitent d'être fortement optimisées afin que toutes les amorces puissent travailler à la même température pendant la PCR, permettant notamment d'éviter le phénomène de réactions croisées. À titre d'exemple, la PCR multiplexe est capable de révéler au moins un pathogène lors de pneumonie communautaire chez 77 % des patients hospitalisés, par rapport à 39 % par culture (NJ Gadsby CD Russell MP McHugh Comprehensive molecular testing for respiratory pathogens in community-acquired pneumonia. Clin Infect Dis 2016). Lors de diarrhées, elle permet de détecter jusqu'à trois fois plus de pathogènes dans les selles que les méthodes traditionnelles (CR Stensvold HV Nielsen Comparison of microscopy and PCR for detection of intestinal parasites in Danish patients supports an incentive for molecular screening platforms. J Clin Microbiol 2012). Ainsi, un seul test peut mettre en évidence la présence dans l'échantillon de plusieurs agents infectieux en moins de deux heures. Aujourd'hui, des panels sont déjà proposés aux cliniciens pour les méningites, les infections sexuellement transmissibles, les infections respiratoires et l'entérocolite infectieuse. Néanmoins, la PCR multiplexe est limitée à la détection d'une quantité de pathogènes prédéfinie, dont les couples d'amorces ciblant au moins un fragment d'un gène spécifique desdits pathogènes sont inclus dans le panel. Afin d'étendre le panel de détection, le kit de détection peut comprendre un nombre très important d'amorces permettant donc de détecter une grande quantité de microorganismes. Ainsi, plus on souhaite augmenter le nombre de pathogènes ciblés dans un panel, plus on aura tendance à augmenter le nombre de couples d'amorces. De manière générale, un pathogène est détecté par un couple d'amorce dont l'amplicon est spécifique audit pathogène. Or, une forte concentration d'amorces différentes dans un unique test engendre un effet délétère contradictoire. Ainsi, il apparaît un phénomène de compétition entre les amorces ayant pour conséquence une inhibition des amorces. De plus les amplifications aspécifiques sont beaucoup plus probables par la multitude d'amorces utilisées. Par conséquent, des multiplexages trop élevés induisent une très mauvaise sensibilité de détection. Il est également connu par les travaux d'I. Afonina et al. en 2007 (Primers with 5' flaps improve real-time PCR) que l'ajout en 5' d'une séquence non complémentaire de la cible de l'amorce améliore l'efficacité d'amplifications PCR. Cependant, ces ajouts de séquence ne règlent pas le problème d'amplification aspécifique ou de perte de sensibilité liées aux fortes concentrations d'amorces utilisées classiquement lors de PCR multiplexes. L'invention vise à résoudre les problématiques et inconvénients de l'art antérieur et notamment éviter ou limiter la dégradation de la sensibilité de la PCR multiplexe qui peut se traduire par la non-amplification ou une mauvaise amplification d'acides nucléiques ciblés à cause du phénomène de compétition entre les amorces lorsqu'elles sont présentes dans un seul et même test en trop grande quantités ainsi que de supprimer ou limiter la dégradation de la sensibilité de la PCR multiplexe liée aux amplifications aspécifiques qui consomment de façon non-désirée les réactifs d'amplification. Description de l'invention Ainsi, selon un premier aspect, l'invention concerne un procédé pour amplifier au moins deux séquences d'acides nucléiques d'intérêt distinctes présentes dans un échantillon à partir d'un couple d'amorces 1 apte à amplifier une première séquence d'acides nucléiques d'intérêt (A) et d'au moins un couple d'amorces hybrides 2 apte à amplifier une deuxième séquence d'acides nucléiques d'intérêt (B), ledit procédé comprenant les étapes suivantes : a. la mise en contact de l'échantillon avec le couple d'amorces 1 apte à amplifier la première séquence d'acides nucléiques (A) et le couple d'amorces 2 apte à amplifier la deuxième séquence d'acides nucléiques (B), le couple d'amorces 1 étant constitué d'une première amorce et d'une deuxième amorce apte à amplifier un acide nucléique correspondant à la première séquence d'acide nucléique (A), . le couple d'amorces 2 étant constitué d'une première amorce et d'une deuxième amorce apte à amplifier un acide nucléique correspondant à la deuxième séquence d'acide nucléique (B), b. l'ajout de réactifs sélectionnés et de conditions permettant une amplification PCR, et c. l'amplification de la première et deuxième séquence d'acide nucléique (A et B), en réalisant une réaction d'amplification basée sur une transcription spécifique de la séquence d'acides nucléiques (A) et de la séquence d'acides nucléiques (B) présent dans l'échantillon, caractérisé en ce que, la séquence de la première amorce du couple d'amorces 2 comprend en outre en 5' la séquence de la première amorce du couple d'amorce 1 et la séquence de la deuxième amorce du couple d'amorces 2 comprend en outre en 5' la séquence de la deuxième amorce du couple d'amorces 1. Selon une variante, la séquence de la première amorce du couple d'amorces 2 (dit chimère ou hybride) comprend en outre en 5' la séquence de la première ou de la deuxième amorce du couple d'amorce 1 et la séquence de la deuxième amorce du couple d'amorces 2 comprend en outre en 5' la séquence de la première ou de la deuxième amorce du couple d'amorces 1. Préférentiellement, la concentration du couple d'amorces 2 est inférieure ou égale à celle du couple d'amorces 1, plus préférentiellement inférieure. Le procédé selon l'invention peut également comprendre un troisième couple d'amorces 3, un quatrième couple d'amorces 4 etc., comprenant chacun une première amorce dont la séquence comprend en outre en 5' la séquence de la première ou de la deuxième amorce du couple d'amorces 1 et une deuxième amorce dont la séquence comprend en outre en 5' la séquence de la première ou de la deuxième amorce du couple d'amorces 1. Selon une autre variante, la deuxième amorce ciblant la première séquence d'acide nucléique (A) peut lui aussi contenir en sa région 5' la séquence de la première amorce ciblant ce même acide nucléique (A). Par exemple, le premier oligonucléotide du couple d'amorces 1, 2, 3 ou 4 peut être une amorce sens ou antisens et le deuxième oligonucléotide du couple d'amorces 1, 2, 3 ou 4 peut être une amorce antisens ou sens. Préférentiellement, le procédé selon l'invention est une PCR multiplexe et permet de réaliser des amplifications quantitatives différentielles, c'est-à-dire que les cibles ne sont pas amplifiées de la même manière conduisant à des différences de quantités produites pour un même nombre de cycle entre les cibles. Ladite PCR selon l'invention est également dénommée PCR Relais ou PCR selon l'invention dans la suite de la description. La PCR selon l'invention permet notamment de détecter et identifier des microorganismes tels que des bactéries, virus, levures impliquées dans des maladies infectieuses. Les maladies peuvent être détectées chez un sujet tel qu'un animal ou un humain, ou chez un végétal. Selon un second aspect, l'invention concerne également les amorces et kits comprenant des amorces spécifiques, un kit de détection apte à mettre en œuvre le procédé de l'invention et son utilisation pour détecter les microorganismes présents lors de maladies infectieuses. L'invention est à présent décrite en détails en regard des figures décrites ci-après. Les figures ne sont qu'illustratives de certains modes de réalisation de l'invention et ne sont pas limitatives. Figures La Figure 1 représente le principe de la PCR Relais selon l'invention. La Figure 2A représente un essai de PCR Duplex (multiplex à 2 cibles) standard avec un couple d'amorces 1 ciblant Staphylococcus aureus et un couple d'amorces 2 ciblant Escherichia coli. Le ratio couple d'amorces 1:couple d'amorces 2 est égal à 1:1. En noir : courbes d'amplification ciblant un gène spécifique de Escherichia coli. En gris : courbes d'amplification ciblant un gène spécifique de Staphylococcus aureus. La Figure 2B représente un essai de PCR Relais selon l'invention comprenant un couple d'amorces 1 ciblant Staphylococcus aureus et un couple d'amorces 2 ciblant Escherichia coli. Le ratio couple d'amorces 1:couple d'amorces 2 est égal à 10:1. En noir : courbes d'amplification ciblant un gène spécifique de Escherichia coli. En gris : courbes d'amplification ciblant un gène spécifique de Staphylococcus aureus. La Figure 2C représente un essai de PCR Relais selon l'invention comprenant un couple d'amorces 1 ciblant Staphylococcus aureus et un couple d'amorces 2 ciblant Escherichia coli. Le ratio couple d'amorces 1:couple d'amorces 2 est égal à 1:1. En noir : courbes d'amplification ciblant un gène spécifique de Escherichia coli. En gris : courbes d'amplification ciblant un gène CA spécifique de Staphylococcus aureus. La Figure 3A représente un essai de PCR Duplex standard avec un couple d'amorces 1 ciblant Klebsiella pneumoniae et un couple d'amorces 2 ciblant Staphylococcus aureus. Le ratio couple d'amorces 1:couple d'amorces 2 est égal à 1:1. En noir : courbes d'amplification ciblant un gène spécifique de Klebsiella pneumoniae. En gris : courbes d'amplification ciblant un gène spécifique de Staphylococcus aureus. La Figure 3B représente un essai de PCR Relais selon l'invention comprenant un couple d'amorces 1 ciblant Klebsiella pneumoniae et un couple d'amorces 2 ciblant Staphylococcus aureus. Le ratio couple d'amorces 1:couple d'amorces 2 est égal à 10:1. En noir : courbes d'amplification ciblant un gène spécifique de Klebsiella pneumoniae. En gris : courbes d'amplification ciblant un gène spécifique de Staphylococcus aureus. La Figure 3C représente un essai de PCR Relais selon l'invention comprenant un couple d'amorces 1 ciblant Klebsiella pneumoniae et un couple d'amorces 2 ciblant Staphylococcus aureus. Le ratio couple d'amorces 1:couple d'amorces 2 est égal à 1:1. En noir : courbes d'amplification ciblant un gène spécifique de Klebsiella pneumoniae. En gris : courbes d'amplification ciblant un gène spécifique de Staphylococcus aureus. La Figure 4 représente la structure d'un couple d'amorces utilisé en PCR standard apte à amplifier une séquence cible, par exemple A comprenant une amorce sens de séquence sens FW1 et une amorce antisens de séquence RT1 ; et la structure d'un couple d'amorces hybrides ou chimères selon l'invention utilisé en PCR Relais apte à amplifier une séquence cible, par exemple B. Le couple d'amorces hybrides ou chimères comprend une amorce sens de séquence FW1+FW2 et une amorce antisens de séquence RT1+RT2. La séquence FW2 est apte à s'hybrider avec une région de la séquence cible B, la séquence FW1 correspond à la séquence de l'amorce sens du couple d'amorce 1 présente en plus grande concentration dans le mélange, et les dites séquences FW1 et FW2 sont contigües pour former une seule amorce sens d'une longueur comprise entre 12 et 140 nucléotides. Le couple d'amorces hybrides ou chimères comprend aussi une amorce antisens de séquence RT1+RT2, la séquence RT2 est complémentaire d'une région de la séquence cible B, la séquence RT1 correspond à la séquence de l'amorce antisens du couple d'amorce 1 présente en plus grande concentration dans le mélange, lesdites séquences FW1 et FW2 sont contiguës pour former une seule amorce d'une longueur comprise entre 12 et 140 nucléotides. À partir du second cycle de PCR, C# le couple d'amorces 1 présent en plus grande concentration dans le mélange est capable d'amplifier l'amplicon généré par le couple d'amorce 2, lors du premier cycle, et donc d'amplifier également la séquence cible B. Ainsi, le couple d'amorces 1 est capable d'amplifier la séquence cible A mais également la séquence cible B à partir du second cycle de PCR. La Figure 5 représente la séquence du gène 16S bactérien. Ladite séquence comprend : 9 régions variables et spécifiques à chaque espèce, et 10 régions conservées entre les espèces, contiguës auxdites régions variables. Les régions variables sont numérotées V1 à V9. Les régions conservées permettent de définir, selon les connaissances de l'homme du métier, la séquence nucléotidique des amorces sens et antisens aptes à s'hybrider sur ces régions conservées entourant au moins une région variable d'intérêt (par exemple V1 à V2). La Figure 6 est un gel d'agarose représentant des résultats de PCR selon la méthode Duplex (multiplex à 2 cibles) standard ou selon le procédé de la présente invention Duplex Relais. Dans toutes les conditions, 100 copies de génome de Klebsiella pneumoniae ont été ajoutées. Ligne 1: amplicon de la région 5' du gène 16S (amplicon couvrant les zones variables V1 à V2) obtenus avec des amorces ciblant des zones conservées contigües auxdites zones variables en forte concentration (PCR contrôle). 2 : amplicon de la région centrale du gène 16S (amplicon couvrant les zones variables V4 à V6) obtenus avec des amorces ciblant des zones conservées contigües auxdites zones variables en forte concentration (PCR contrôle). 3 : amplicon en PCR multiplexe standard des régions 5' (V1-V2) et centrale (V4-V6) du gène 16S avec deux couples d'amorces ciblant respectivement chaque zone variable, les amorces étant en forte concentrations. 4 : amplicon des 2 régions du gène 16S selon le procédé de la présente invention en Duplex Relais où le premier couple d'amorces cible la région 5' (V1-V2) et le 2nd couple d'amorces hybrides ou chimères comprend une séquence apte à cibler la région centrale (V4-V6) mais également la séquence du premier couple d'amorce, lesdites amorces sont utilisées à des hautes (premier couple d'amorce) et basses concentrations (deuxième couple d'amorces) respectivement. Les flèches indiquent l'amplification ou la non- amplification d'amplicon d'intérêt (ici la région V1-V2 du gène 16S). La Figure 7 est un gel d'agarose représentant des résultats de PCR selon la méthode Triplex (multiplex à 3 cibles) standard ou selon le procédé de la présente invention (Triplex Relais). Dans toutes les conditions 100 copies de génome de Klebsiella pneumoniae ont été ajoutées. 1 : amplicons obtenus avec une PCR Triplex standard, les amorces étant à 1mM chacune. 2 : C# amplicons obtenus avec une PCR Triplex Relais où les amorces chimères ou hybrides ont été utilisés à une faible concentration de 0,04 mM. Les amplicons V4-V6 et V7-V9 de la Triplex Relais sont légèrement plus grands que leur correspondant en Triplex standard à cause de la longueur des amorces chimères qui augmentent leur taille après polymérisation. La Figure 8 est un gel d'agarose représentant des résultats de PCR selon la méthode PCR multiplexe Relais comprenant une seule amorce standard en forte concentration. Dans toutes les conditions 100 copies de génome de Klebsiella pneumoniae ont été ajoutées. 1 : amplicons obtenus avec une PCR Duplex Relais comprenant un couple d'amorce 1 en forte concentration ciblant la région V1-V2 du gène 16S et un couple d'amorce 2 hybrides ou chimères en faible concentration ciblant la région V7-V9 du gène 16S. 2 : amplicons obtenus avec une PCR Duplex Relais comprenant un couple d'amorce 1 ciblant la région V1-V2 du gène 16S constitué d'une amorce sens en forte concentration et d'une amorce antisens hybride ou chimère en faible concentration comprenant en 5' la séquence de l'amorce sens et un couple d'amorce 2 hybrides ou chimères en faible concentration ciblant la région V7-V9 du gène 16S. Ainsi, l'amorce antisens du premier couple ainsi que les amorces sens et antisens du deuxième couple sont des amorces hybrides ou chimères. Seule l'amorce sens du couple d'amorce 1 est présente en forte concentration. Définitions Par « patient », on entend au sens de l'invention un sujet qui peut être un être humain ou un animal, de préférence un être humain ou un mammifère. De préférence, le sujet est un patient humain, quel que soit son âge ou son sexe. Les nouveau-nés, les nourrissons et les enfants sont également inclus. Par « diagnostic », on entend au sens de l'invention un test qui vise à détecter et identifier une ou des pathologie(s), en particulier la détection et l'identification de maladies infectieuses chez un sujet ou un végétal afin d'être en mesure d'administrer au sujet ou au végétal un traitement correspondant à la pathologie. Par « couple d'amorces » ou « couple d'oligonucléotides » on entend au sens de l'invention deux oligonucléotides permettant d'amplifier une séquence cible dans le cadre d'une PCR. Par « amorce » ou « oligonucléotide » ou « primer », on entend au sens de l'invention un court segment d'acides nucléiques de un à quelques dizaines de nucléotides. Les dites amorces sont CA aptes à s'hybrider avec une séquence complémentaire. Dans le cadre de l'invention, ils sont aptes à s'hybrider avec un fragment de la séquence cible. La séquence cible peut être une séquence d'acides nucléiques (ADN ou ARN). Par « séquence FW1 », on entend au sens de l'invention la séquence d'un oligonucléotide de une à quelques dizaines de nucléotides, en particulier la séquence d'une amorce sens apte à s'hybrider avec la séquence complémentaire de la séquence d'intérêt. Par « séquence RT1 » on entend au sens de l'invention la séquence d'un oligonucléotide de une à quelques dizaines de nucléotides, en particulier la séquence d'une amorce antisens apte à s'hybrider avec la séquence complémentaire de la séquence d'intérêt. Par « couple d'amorces apte à amplifier une séquence d'acides nucléiques d'intérêt » on entend au sens de l'invention un couple d'amorces comprenant une amorce sens et une amorce antisens apte à amplifier une séquence déterminée d'intérêt par PCR. À titre d'exemple, la séquence nucléique d'intérêt peut être une séquence présente dans la partie variable du gène 16S d'une bactérie. Lesdites amorces étant dessinées pour cibler ladite séquence d'intérêt selon les connaissances générales de l'homme du métier. Par « amplification », on entend au sens de l'invention, l'amplification de la séquence cible lors d'une réaction PCR et donc l'augmentation du nombre de copies de la séquence cible. Les amorces s'hybrident avec la séquence complémentaire préalablement dénaturée, suivi de l'élongation des brins par l'action de la polymérase. La réaction se poursuit avec plusieurs cycles successifs permettant d'augmenter le nombre de copies de l'amplicon. Par « amplicon », on entend au sens de l'invention, un fragment d'acide nucléique correspondant à la séquence amplifiée lors de la PCR et délimité par les deux amorces utilisées. L'amplicon est donc une copie de la séquence cible. Par « amorce hybride » ou « amorce chimère », on entend au sens de l'invention une amorce comprenant une séquence d'acides nucléiques apte à s'hybrider avec un brin complémentaire de la séquence cible et en 5' une séquence d'acides nucléiques correspondant à la séquence d'une amorce appartenant à un autre couple d'amorce, par exemple la séquence d'une amorce sens ou antisens d'un autre couple d'amorce. Dans le cadre de l'invention, le couple d'amorces 2, 3 et 4 est constitué d'amorces hybrides ou chimères. Selon une variante de l'invention, le couple d'amorce 1 comprend une amorce « standard » et une amorce hybride ou chimère. CA Par exemple, le premier oligonucléotide du couple d'amorces 2 comprend une séquence apte à s'hybrider avec une séquence d'acides nucléiques spécifique (cible B) et en 5' une séquence d'acides nucléiques correspondant à la séquence du premier oligonucléotide du couple d'amorces 1 apte à s'hybrider avec une autre séquence d'acides nucléiques spécifique (cible A). Par « ratio de concentration », on entend au sens de l'invention, le rapport de concentration du couple d'amorces 1 par rapport à un deuxième couple d'amorces tel que le couple d'amorces 2. Par exemple, un ratio de 1:1 correspond à une concentration identique du premier couple et du deuxième couple et un ratio de 10:1 correspond à une concentration 10 fois plus importante du premier couple par rapport au deuxième. Description détaillée de l'invention L'invention a donc pour objet un nouveau procédé de PCR dite multiplexe. Il est connu des PCR multiplexes dites standard qui permettent d'identifier un très grand nombre de séquences cibles. De telles PCR multiplexes standard nécessitent la présence en forte concentration de chaque couple d'amorces ciblant un acide nucléique particulier. En PCR multiplexe standard, chaque couple d'amorces est donc présent à la même forte concentration lors de la réaction PCR multiplexe. À partir d'au moins 4 ou 5 couples d'amorces différents, les conditions de réaction commencent à se dégrader. En outre, l'apparition d'un phénomène de compétition entre les amorces a pour conséquence une inhibition des hybridations spécifiques des amorces. De plus, des amplifications aspécifiques peuvent survenir par la multiplicité des amorces utilisées. Il en résulte que les PCR multiplexes standard ont une très mauvaise sensibilité de détection. L'invention concerne un nouveau procédé PCR multiplexe dit PCR multiplexe Relais (ou PCR Relais). Dans la PCR multiplexe Relais, soit le procédé selon l'invention, un seul couple d'amorces ou une seule amorce est utilisée en forte concentration, toutes les autres amorces sont en très faible concentration. Grâce à l'invention, il est possible de conserver une sensibilité extrême pour tous les acides nucléiques ciblés. Il est aussi possible de favoriser l'amplification de certains acides nucléiques par rapport à d'autres (asymétrie d'amplification quantitative ou amplification quantitative différentielle), en particulier les acides nucléiques de la cible A, par rapport aux autres. Ces acides nucléiques CA amplifiés de façon préférentielle seront ainsi présents en plus grande quantité. En diagnostic, privilégier certains acides nucléiques présente un avantage médical du fait que certains acides nucléiques sont plus informatifs que d'autres. Ainsi, l'invention concerne un procédé pour amplifier au moins deux séquences d'acides nucléiques d'intérêt distinctes présentes dans un échantillon à partir d'un couple d'amorces 1 apte à amplifier une première séquence d'acides nucléiques d'intérêt (A) et d'au moins un couple d'amorces 2 apte à amplifier une deuxième séquence d'acides nucléiques d'intérêt (B), ledit procédé comprenant les étapes suivantes : a. la mise en contact de l'échantillon avec le couple d'amorces 1 apte à amplifier la première séquence d'acides nucléiques (A) et le couple d'amorces 2 apte à amplifier la deuxième séquence d'acides nucléiques (B), i. le couple d'amorces 1 étant constitué d'une première amorce et d'une deuxième amorce apte à amplifier un acide nucléique correspondant à la première séquence d'acide nucléique (A), ii. le couple d'amorces 2 étant constitué d'une première amorce et d'une deuxième amorce apte à amplifier un acide nucléique correspondant à la deuxième séquence d'acide nucléique (B), b. l'ajout de réactifs sélectionnés et de conditions permettant une amplification PCR, et c. l'amplification de la première et deuxième séquence d'acide nucléique (A et B), caractérisée en ce que, la séquence de la première amorce du couple d'amorces 2 comprend en outre en 5' la séquence de la première amorce du couple d'amorce 1 et la séquence de la deuxième amorce du couple d'amorces 2 comprend en outre en 5' la séquence de la deuxième amorce du couple d'amorces 1. Lors de l'étape c., l'amplification de la première et deuxième séquence d'acide nucléique (A et B), est réalisée par une réaction d'amplification basée sur une polymérisation (élongation) de la séquence d'acides nucléiques (A) et de la séquence d'acides nucléiques (B) présent dans l'échantillon Selon une variante, la séquence de la première amorce du couple d'amorces 2 comprend en outre en 5' la séquence de la première amorce ou de la deuxième amorce du couple d'amorce С 1 et la séquence de la deuxième amorce du couple d'amorces 2 comprend en outre en 5' la séquence de la première ou de la deuxième amorce du couple d'amorces 1. Préférentiellement, la séquence de la première amorce du couple d'amorce 2 et la séquence de la première ou de la deuxième amorce du couple d'amorces 1 sont contigües et la séquence de la deuxième amorce du couple d'amorce 2 et la séquence de la première ou de la deuxième amorce du couple d'amorces 1 sont contigües. Selon une variante, lesdites séquences ne sont pas contiguës mais espacées de quelques nucléotides avec un espaceur (ou « linker » ou « spacer ») d'une taille comprise entre 1 et 12 nucléotides. Selon une autre variante, le procédé selon l'invention est caractérisé en ce que : _ la séquence de la deuxième amorce du couple d'amorces 1 comprend en outre en 5' la séquence de la première amorce dudit couple d'amorce 1, les dites séquences sont contiguës et _ la séquence de la première amorce du couple d'amorces 2 comprend en outre en 5' la séquence de la première amorce du couple d'amorce 1 et la séquence de la deuxième amorce du couple d'amorces 2 comprend en outre en 5' la séquence de la première amorce du couple d'amorces 1, lesdites séquences sont contiguës. Selon une autre variante, la séquence de la deuxième amorce du couple d'amorces 1 comprend en outre en 5' la séquence de la première amorce dudit couple d'amorce 1 et / ou la séquence de la première amorce du couple d'amorces 2 comprend en outre en 5' la séquence de la première amorce du couple d'amorce 1 et la séquence de la deuxième amorce du couple d'amorces 2 comprend en outre en 5' la séquence de la première amorce du couple d'amorces 1, les dites séquences sont espacées de quelques nucléotides avec un espaceur (ou « linker » ou « spacer ») d'une taille comprise entre 3 et 12 nucléotides. Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, le procédé met en œuvre : _ au moins un couple d'amorces 1 apte à amplifier une séquence cible A comprenant : une amorce sens de séquence FW1 complémentaire à un fragment de la séquence cible A, ladite amorce étant d'une taille comprise entre 6 et 70 nuclétoides, et une amorce antisens de séquence RT1 complémentaire à un fragment de la CA séquence cible A, ladite amorce étant d'une taille comprise entre 6 et 70 nuclétoides, et _ au moins un couple d'amorces 2 apte à amplifier une séquence cible B comprenant : une amorce sens de séquence FW1 ou RT1 et de séquence FW2, la séquence FW2 étant complémentaire d'un fragment de la séquence cible B, lesdites séquences FW1 ou RT1 et FW2 étant contigües pour former une seule amorce d'une taille comprise entre 12 et 140 nuclétoides, et une amorce antisens de séquence FW1 ou RT1 et de séquence RT2, la séquence RT2 étant complémentaire d'un fragment de la séquence cible B, lesdites séquences FW1 ou RT1 et RT2 étant contigües pour former une seule amorce d'une taille comprise entre 12 et 140 nuclétoides. Ainsi, l'invention se rapporte également à un couple d'amorces hybrides ou chimères comprenant: une amorce sens (ou premier oligonucléotide) de séquence FW1 ou RT1 et de séquence FW2, la séquence FW2 est complémentaire d'un fragment de la séquence cible B, la séquence FW1 ou RT1 correspond respectivement à la séquence de l'amorce sens ou antisens du couple d'amorce 1 présente en plus grande concentration dans le mélange, lesdites séquences FW1 ou RT1 et FW2 sont contigües pour former une seule amorce sens d'une longueur comprise entre 12 et 140 nucléotides, et _ une amorce antisens (ou deuxième oligonucléotide) de séquence FW1 ou RT1 et de séquence RT2, la séquence RT2 est complémentaire d'un fragment de la séquence cible B, la séquence RT1 ou FW1 correspond respectivement à la séquence de l'amorce antisens ou sens du couple d'amorce 1 présente en concentration égale ou supérieur dans le mélange, lesdites séquences FW1 ou RT1 et FW2 sont contiguës pour former une seule amorce d'une longueur comprise entre 12 et 140 nucléotides. Selon une variante, l'invention se rapporte également à un couple d'amorces hybrides ou chimères comprenant : une amorce sens ou antisens (ou premier oligonucléotide) de séquence FW1 CA ou RT1, la séquence FW1 ou RT1 est complémentaire d'un fragment de la séquence cible A, présente en plus grande concentration dans le mélange, lesdites séquences sont d'une longueur comprise entre 6 et 70 nucléotides, et _ une amorce sens ou antisens hybride ou chimère (ou deuxième oligonucléotide) de séquence FW1 et de séquence RT1 ou de séquence RT1 et de séquence FW1, lesdites amorces étant présente en plus faible concentration par rapport au premier oligonucléotide de séquence FW1 ou RT1 dans le mélange, lesdites séquences FW1 et RT1 ou RT1 et FW1 sont contiguës pour former une seule amorce d'une longueur comprise entre 12 et 140 nucléotides. Lors d'une PCR Duplex Relais, selon la présente invention, la réaction de PCR s'opère dans un mélange comprenant un couple d'amorces 1 apte à s'hybrider et amplifier une première séquence d'acides nucléiques (A) et un couple d'amorces 2 apte à s'hybrider et amplifier une deuxième séquence d'acides nucléiques (B) comme cela est le cas pour une PCR Duplex standard. Toutefois, la PCR Duplex Relais se distingue de la PCR Duplex standard par le fait d'utiliser des amorces hybrides ou chimères pour le deuxième couple d'amorces, et éventuellement pour une amorce sens ou antisens du premier couple d'amorces. Ainsi, à partir du second cycle de PCR, le couple d'amorce 1 est apte à amplifier également l'amplicon généré par le couple d'amorce 2 et donc la séquence cible B. La PCR Duplex Relais comprend notamment la mise en contact de l'échantillon avec le mélange réactionnel comprenant le couple d'amorces 1 apte à amplifier la séquence d'acides nucléiques (A) et le couple d'amorces 2 apte à amplifier la deuxième séquence d'acides nucléiques (B). Le couple d'amorces 1 est constitué d'une première amorce sens (par exemple de séquence FW1) et d'une deuxième amorce antisens (par exemple de séquence RT1) capable de s'hybrider chacune à la séquence complémentaire d'un des brins de l'acide nucléique (A) et à amplifier la séquence correspondant à la séquence du brin complémentaire entre les deux amorces. Ladite séquence complémentaire étant la séquence cible (A). Le couple d'amorces 2 est constitué d'une première amorce sens (par exemple de séquence FW1-FW2) et d'une deuxième amorce antisens (par exemple de séquence RT1-RT2) capable de s'hybrider chacune à la séquence complémentaire d'un des brins de l'acide nucléique (B) CA et à amplifier la séquence correspondant à la séquence du brin complémentaire entre les deux amorces. Ladite séquence complémentaire étant la séquence cible (B). En outre, le mélange réactionnel comprend l'ensemble des réactifs et conditions nécessaires pour réaliser une amplification PCR. Les dits réactifs pouvant être initialement présents dans le mélange réactionnel ou ajoutés après la mise en contact de l'échantillon. Les réactifs nécessaires comprennent notamment des dNTPs et la polymérase que l'homme du métier sera en mesure de choisir en fonction de la PCR et des conditions de la réaction. Préférentiellement, la polymérase est la polymérase de Thermophilus aquaticus ou le fragment dit Klenow de cette polymérase. Une fois l'ensemble des constituants présent dans le mélange réactionnel, l'amplification peut débuter. Il est connu de l'homme du métier les différentes étapes d'une réaction PCR. Un cycle de PCR comprend une étape de dénaturation qui vise à séparer le double brin afin d'obtenir deux simples brins suivis de l'étape d'hybridation. Lors de cette étape, les amorces vont reconnaître la séquence complémentaire présente sur un des simples brins préalablement dénaturés et vont alors s'hybrider. S'ensuit une étape d'élongation qui permet aux polymérases de synthétiser le brin complémentaire du simple brin. Ce brin est synthétisé à partir des dNTPs libres présents dans le milieu réactionnel. La durée de cette étape dépend de la longueur de la séquence à amplifier. La réaction PCR se poursuit avec un deuxième cycle, troisième etc. qui comprennent chacun les mêmes étapes. À la fin de la PCR, on obtient ainsi une amplification de la séquence comprise entre les amorces. Ladite séquence correspondant à l'amplicon. Ainsi, l'amplification de la première et deuxième séquence d'acides nucléiques est basée sur une amplification de la séquence d'acides nucléiques cible (A) et de la séquence d'acides nucléiques cible (B) présent dans l'échantillon, préférentiellement une amplification simultanée de la séquence d'acides nucléiques cible (A) et de la séquence d'acides nucléiques cible (B) présent dans l'échantillon. Le procédé selon l'invention est caractérisé en ce que la première amorce du couple d'amorces 2 comprend en outre en 5' la séquence de la première amorce du couple d'amorces 1, et la deuxième amorce du couple d'amorces 2 comprend en outre en 5' la séquence de la deuxième C amorce du couple d'amorces 1. Les séquences de la première amorce du couple 2 et de la première amorce du couple 1 sont contigües et les séquences de la deuxième amorce du couple 2 et de la deuxième amorce du couple 1 sont également contigües. Selon une variante, la deuxième amorce du couple d'amorces 2 comprend en outre en 5' la séquence de la première ou de la deuxième amorce du couple d'amorces 1. Les séquences de la première amorce du couple 2 et de la première amorce du couple 1 sont contigües et les séquences de la première ou de la deuxième amorce du couple 2 et de la deuxième amorce du couple 1 sont également contigües. Préférentiellement, la première amorce du couple d'amorces 2 comprend une séquence d'acides nucléiques apte à s'hybrider avec la séquence complémentaire de la séquence à amplifier, telle que la séquence cible (B) et en outre en 5' la séquence de la première ou deuxième amorce du couple d'amorces 1, et la deuxième amorce du couple d'amorces 2 comprend une séquence d'acides nucléiques apte à s'hybrider avec la séquence complémentaire de la séquence à amplifier, telle que la séquence cible (B) et en outre en 5' la séquence de la première ou deuxième amorce du couple d'amorces 1. La séquence d'acides nucléiques apte à s'hybrider avec la séquence complémentaire à amplifier, telle que la séquence cible (B) étant distincte pour l'amorce 1 et l'amorce 2. En particulier l'amorce 1 peut être une amorce sens et l'amorce 2 une amorce antisens. Préférentiellement, le premier couple d'amorces est apte à amplifier la première séquence (A) et la deuxième séquence (B) à partir du deuxième cycle de PCR. En effet lors du premier cycle de PCR, le premier couple d'amorces est apte à amplifier la première séquence (A) et le deuxième couple d'amorces est apte à amplifier la deuxième séquence (B). À la fin du premier cycle de PCR, il est généré des séquences d'acides nucléiques comprenant la séquence de la première amorce du premier couple et la séquence complémentaire de la séquence (A), des séquences d'acides nucléiques comprenant la séquence de la deuxième amorce du premier couple et la séquence complémentaire de la séquence (A), des séquences d'acides nucléiques comprenant la séquence de la première amorce du deuxième couple et la séquence complémentaire de la séquence (B), et des séquences d'acides nucléiques comprenant la séquence de la deuxième amorce du deuxième couple et la séquence complémentaire de la séquence (B). Or, la première amorce du deuxième couple comprend la séquence de la première amorce du C / premier couple et d'une séquence apte à s'hybrider à la séquence (B) et la deuxième amorce du deuxième couple comprend la séquence de la deuxième amorce du premier couple et d'une séquence apte à s'hybrider à la séquence (B). Ainsi, lors du deuxième cycle, le couple d'amorces 1 est apte à amplifier les séquences d'acides nucléiques générées lors du premier cycle (Figure 1). Selon un mode de réalisation, la séquence de la première amorce du premier couple est choisie parmi la SEQ ID NO :1, SEQ ID NO :3 ou SEQ ID NO :5, la séquence de la deuxième amorce du premier couple est choisie parmi la SEQ ID NO :2, SEQ ID NO :4 ou SEQ ID NO :6, la séquence de la première amorce du deuxième couple est choisie parmi la SEQ ID NO :7 ou la SEQ ID NO :9, la séquence de la deuxième amorce du deuxième couple est choisie parmi la SEQ ID NO :8 ou la SEQ ID NO :10. Les dites séquences étant listées dans le tableau 1 ci-dessous. [Tableau 1A] [Image disponible dans le document PDF, Image available in the PDF document] À des fins de diagnostic, il est d'intérêt de cibler les régions variables du gène 16S présent chez toutes les bactéries. Le gène 16S comprend des régions conservées et des régions variables, en particulier 9 régions variables et 10 régions conservées (cf. Figure 5). Les régions variables sont numérotées de V1 à V9 et sont toutes entourées par des régions conservées. L'homme du métier de par ses connaissances générales est parfaitement en mesure de déterminer lesdites régions sur le gène 16S. Tremblay et al. 2015 (Frontiers in Microbiology) décrit par exemple une de ces nombreuses méthodes pour amplifier et séquencer ces régions afin d'identifier les bactéries présentes dans un échantillon. Aussi, selon un mode de réalisation préféré, les séquences d'intérêts correspondent à des séquences variables d'un gène unique ou d'au moins deux gènes distincts, plus préférentiellement les séquences d'intérêts correspondent aux séquences variables du gène 16S et les dites amorces sont apte à s'hybrider avec au moins une dizaine de nucléotides d'une séquence conservée du gène 16S. Préférentiellement, l'amorce sens peut s'hybrider avec au moins une dizaine de nucléotides d'une séquence conservée du gène 16S en 5' d'une séquence variable dudit gène 16S et l'amorce antisens peut s'hybrider avec au moins une dizaine de nucléotides d'une séquence conservée du gène 16S en 3' d'une séquence variable dudit gène 16S. Dans le cadre de la présente invention, les inventeurs ont dessiné des amorces permettant de s'hybrider spécifiquement sur les régions conservées contiguës aux régions variables d'intérêt tel que V1-V2, V3, V4-V6 et V7-V9. Ainsi l'amplicon généré correspond aux séquences des régions variables V1-V2 ou V3 ou V4-V6 ou V7-V9, dont la séquence est spécifique à un pathogène. Selon un mode de réalisation préféré, la séquence de la première amorce (amorce sens) du premier couple est choisie parmi la SEQ ID NO :14, SEQ ID NO :15, SEQ ID NO :18, SEQ ID NO :20, SEQ ID NO :21 et SEQ ID NO :24 ; la séquence de la deuxième amorce (amorce antisens) du premier couple est choisie parmi la SEQ ID NO :16, SEQ ID NO :17, SEQ ID NO :19, SEQ ID NO :22, SEQ ID NO :23, SEQ ID NO :25, SEQ ID NO :26 et SEQ ID NO :27. Préférentiellement, la séquence de la première amorce (amorce sens) du premier couple est la SEQ ID NO :14 ou SEQ ID NO :15 et la séquence de la deuxième amorce (amorce antisens) C / du premier couple est choisie parmi la SEQ ID NO :16, SEQ ID NO :17, SEQ ID NO :26 et la SEQ ID NO :27. La séquence de la première amorce (amorce sens) du deuxième couple est choisie parmi la SEQ ID NO :28, SEQ ID NO :29, SEQ ID NO :30, SEQ ID NO :34 ou SEQ ID NO :35 ; la séquence 5 de la deuxième amorce du deuxième couple est choisie parmi la SEQ ID NO :31, SEQ ID NO :32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, ou SEQ ID NO:38. Lesdites séquences étant listées dans le tableau 1B ci-dessous. [Tableau 1B] [Image disponible dans le document PDF, Image available in the PDF document] [Image disponible dans le document PDF, Image available in the PDF document] Préférentiellement, le premier couple d'amorces ciblant les régions variables V1-V2 du gène 16S est constitué : _ d'une amorce sens ayant au moins 70% d'homologie de séquence avec la SEQ ID NO :14 ou SEQ ID NO :15, et _ d'une amorce antisens ayant au moins 70% d'homologie de séquence avec la SEQ ID NO :16 ou SEQ ID NO :17 ou SEQ ID NO :26 ou SEQ ID NO :27. Préférentiellement, le deuxième couple d'amorces hybrides ou chimères ciblant les régions variables V4 à V6 du gène 16S est constitué : _ d'une amorce sens ayant au moins 70% d'homologie de séquence avec la SEQ ID NO:28 ou SEQ ID NO:29 ou SEQ ID NO:30 et - d'une amorce antisens ayant au moins 70% d'homologie de séquence avec la SEQ ID NO:31 ou SEQ ID NO:32 ou SEQ ID NO:33. Préférentiellement, le deuxième couple ou le troisième couple d'amorces ciblant les régions variables V7 à V9 du gène 16S est constitué : _ d'une amorce sens ayant au moins 70% d'homologie de séquence avec la SEQ ID NO:34 ou SEQ ID NO:35 et _ d'une amorce antisens ayant au moins 70% d'homologie de séquence avec la SEQ ID NO:36 ou SEQ ID NO:37 ou SEQ ID NO:38. Préférentiellement, l'homologie de séquence de 70% concerne, en particulier les dix premiers nucléotides en 3' de ladite séquence. Plus préférentiellement, le premier couple d'amorces ciblant les régions variables V1-V2 du gène 16S est constitué : d'une amorce sens de SEQ ID NO :14 ou SEQ ID NO :15, et d'une amorce antisens SEQ ID NO :16 ou SEQ ID NO :17 ou SEQ ID NO :26 ou SEQ ID NO :27. Préférentiellement, le deuxième couple d'amorces hybrides ou chimères ciblant les régions variables V4 à V6 du gène 16S est constitué : d'une amorce sens de SEQ ID NO :28 ou SEQ ID NO :29 ou SEQ ID NO :30 et d'une amorce antisens SEQ ID NO :31 ou SEQ ID NO :32 ou SEQ ID NO :33. Préférentiellement, le deuxième couple ou le troisième couple d'amorces ciblant les régions variables V7 à V9 du gène 16S est constitué : d'une amorce sens de SEQ ID NO :34 ou SEQ ID NO :35 et d'une amorce antisens SEQ ID NO :36 ou SEQ ID NO :37 ou SEQ ID NO :38. Lors du procédé selon l'invention, la concentration du couple d'amorces 2 peut être inférieure, supérieure ou égale à celle du couple d'amorces 1. Il est ainsi possible de favoriser ou non un couple d'amorces par rapport à un autre et donc l'amplification d'une séquence d'intérêt. Selon un mode de réalisation particulièrement préféré de l'invention, la concentration du couple d'amorces 2 est inférieure ou égale à celle du couple d'amorces 1, plus préférentiellement inférieure. Lorsque, la concentration du couple d'amorces 2 est inférieure à celle du couple d'amorces 1, le couple d'amorces 2 est défavorisé par rapport au premier couple. Les amplicons générés par le couple d'amorces 1 vont ainsi être présents en plus grande quantité. Lorsqu'un séquençage est ensuite réalisé, les amplicons de la cible A seront surreprésentés et seront donc séquencés de façon préférentielle. L'obtention de leur séquence en sera alors plus rapide. Le procédé selon l'invention permet de générer une quantité d'amplicons par le couple d'amorces 1 au moins 4 fois plus importante que les amplicons générés par le couple d'amorces 2. Les amplicons générés par le deuxième couple seront donc présents en plus faible quantité et sortiront moins vite lors du séquençage. Préférentiellement, le ratio de concentration entre le couple d'amorces 1 et le couple d'amorces 2 est compris entre 1:1 et 1000:1, encore plus préférentiellement entre 1:1 et 100:1. CA Selon un mode particulièrement avantageux, le ratio de concentration entre le couple d'amorces 1 et le couple d'amorces 2 est égal à 10:1, plus préférentiellement égal à 25 :1. Un tel ratio peut par exemple correspondre à une concentration du couple d'amorces 1 égale à 1mM et une concentration du couple d'amorces 2 égale à 0,1mM ou 0,04mM. Selon un autre mode de réalisation, le procédé selon l'invention peut comprendre en outre la mise en contact de l'échantillon avec un 3ème couple d'amorces apte à amplifier une 3ème séquence d'acides nucléiques (C). La première amorce du couple d'amorces 3 comprend une séquence d'acides nucléiques capable de s'hybrider avec la séquence complémentaire (C) et en outre en 5' la séquence correspondant à la séquence de la première amorce ou de la deuxième amorce du couple d'amorces 1. La deuxième amorce du couple d'amorces 3 comprend une séquence d'acides nucléiques capable de s'hybrider avec la séquence complémentaire (C) et en outre en 5' la séquence correspondant à la séquence de la première ou de la deuxième amorce du couple d'amorces 1. Le procédé selon l'invention comprend ainsi 3 couples d'amorces différents permettant d'amplifier 3 séquences d'acides nucléiques cibles différentes notamment une séquence A, une séquence B et une séquence C. Ledit procédé est une PCR dites Triplex Relais. Les séquences B et C sont préférentiellement amplifiées par des amorces sens et antisens hybrides ou chimères comprenant chacune la séquence de l'amorce sens du couple d'amorce 1 présent en plus grande concentration et la séquence de l'amorce sens ou antisens du couple d'amorce 1 présent en plus grande concentration. Ainsi, le procédé selon l'invention met en œuvre : _ au moins un couple d'amorces 1 apte à amplifier une séquence cible A comprenant : une amorce sens de séquence FW1 complémentaire à un fragment de la séquence cible A, ladite amorce étant d'une taille comprise entre 6 et 70 nuclétoides, et une amorce antisens de séquence RT1 complémentaire à un fragment de la séquence cible A, ladite amorce étant d'une taille comprise entre 6 et 70 nuclétoides, et _ au moins un couple d'amorces hybrides ou chimères 2 apte à amplifier une séquence cible B comprenant : une amorce sens de séquence FW1 ou RT1 et de séquence FW2, la séquence CA FW2 étant complémentaire d'un fragment de la séquence cible B, ladite séquence FW1 ou RT1 et FW2 étant contigües pour former une seule amorce d'une taille comprise entre 12 et 140 nuclétoides, et une amorce antisens de séquence FW1 ou RT1 et de séquence RT2, la séquence RT2 étant complémentaire d'un fragment de la séquence cible B, ladite séquence FW1 ou RT1 et RT2 étant contigües pour former une seule amorce d'une taille comprise entre 12 et 140 nuclétoides, et _ au moins un couple d'amorces 3 apte à amplifier une séquence cible C comprenant : une amorce sens de séquence FW1 et de séquence FW3, la séquence FW3 étant complémentaire d'un fragment de la séquence cible C, ladite séquence FW1 et FW3 étant contigües pour former une seule amorce d'une taille comprise entre 12 et 140 nuclétoides, et une amorce antisens de séquence FW1 ou RT1 et de séquence RT3, la séquence RT3 étant complémentaire d'un fragment de la séquence cible C, ladite séquence FW1 ou RT1 et RT3 étant contigües pour former une seule amorce d'une taille comprise entre 12 et 140 nuclétoides. Lors du procédé, la concentration du couple d'amorce 3 est inférieure ou supérieure ou égale à celle du couple d'amorces 1 et / ou la concentration du couple d'amorces 2 est inférieure ou supérieure ou égale à celle du couple d'amorces 1. Il est ainsi possible de favoriser ou non un couple d'amorces par rapport à un autre. Préférentiellement, la concentration du couple d'amorce 3 est inférieure à celle du couple d'amorces 1 et / ou la concentration du couple d'amorces 2 est inférieure à celle du couple d'amorces 1. Préférentiellement, la concentration du couple d'amorces 1 est supérieure à celle du deuxième et / ou du troisième couple d'amorces et la concentration du couple d'amorces 2 est égale à celle du couple d'amorces 3. Selon un mode de réalisation, la concentration du couple d'amorces 1 est supérieure à celle du deuxième et troisième couple d'amorces et la concentration du couple d'amorces 2 est supérieure à celle du couple d'amorces 3. Ainsi, le premier couple est favorisé par rapport au deuxième et le deuxième est également favorisé par rapport au troisième. Selon un autre mode de réalisation, le procédé selon l'invention peut comprendre en outre la CA mise en contact de l'échantillon avec un quatrième couple d'amorces dites hybrides ou chimères apte à amplifier une quatrième séquence d'acides nucléiques (D). La première amorce du couple d'amorces 4 comprend une séquence d'acides nucléiques capable de s'hybrider avec la séquence complémentaire (D) et en outre en 5' la séquence correspondant à la séquence de la première ou de la deuxième amorce du couple d'amorces 1. La deuxième amorce du couple d'amorces 4 comprend une séquence d'acides nucléiques capable de s'hybrider avec la séquence complémentaire (D) et en outre en 5' la séquence correspondant à la séquence de la première ou de la deuxième amorce du couple d'amorces 1. Préférentiellement, la concentration du quatrième couple d'amorces est inférieure ou égale à la concentration du couple d'amorces 1 et la concentration du deuxième, du troisième et du quatrième couple est identique. Selon un autre mode de réalisation, le procédé selon l'invention peut comprendre en outre la mise en contact de l'échantillon avec un nième couple d'amorces apte à amplifier une nième séquence d'acides nucléiques. La première amorce du couple d'amorces n comprend une séquence d'acides nucléiques capable de s'hybrider avec la séquence complémentaire cible et en outre en 5' la séquence correspondant à la séquence de la première ou de la deuxième amorce du couple d'amorces 1. La deuxième amorce du couple d'amorces n comprend une séquence d'acides nucléiques capable de s'hybrider avec la séquence complémentaire cible et en outre en 5' la séquence correspondant à la séquence de la première ou de la deuxième amorce du couple d'amorces 1. Préférentiellement, la concentration du nième couple d'amorces est inférieure ou égale à la concentration du couple d'amorces 1 et la concentration du deuxième, du troisième, du quatrième couple et du nième couple est identique. Par « n », on entend au sens de l'invention un entier naturel qui est un nombre positif permettant de dénombrer des objets comptant chacun pour un. Ainsi, un nombre entier a un successeur unique, c'est-à-dire un entier qui lui est immédiatement supérieur, et la liste des entiers naturels est infinie. En outre, le milieu réactionnel permettant de mettre en œuvre le procédé selon l'invention peut comprendre une ou plusieurs sonde(s) spécifique(s) couplée(s) à un fluorophore dont le spectre d'émission est différent des autres. Ainsi, chaque produit de la réaction PCR est mesuré CA en temps réel par la ou lesdites sonde(s) spécifique(s). Ainsi, selon un mode de réalisation, le procédé selon l'invention comprend en outre une étape de quantification des amplicons par l'utilisation de sondes couplées à un fluorophore, préférentiellement des sondes dites TaqMan. De telles sondes selon l'invention sont listées dans le tableau 2 ci-dessous. [Tableau 2] [Image disponible dans le document PDF, Image available in the PDF document] Selon un autre mode de réalisation, le procédé selon l'invention comprend une étape de détection des amplicons et donc des microorganismes par sondes fluorescentes, marquage fluorescent, courbe de fusion, PCR nichée, PCR quantitative, Reverse-transcription PCR ou par séquençage d'ADN. Lorsque la détection des amplicons est faite par séquençage, le procédé comprend en outre une étape de séquençage des acides nucléiques amplifiés ou amplicons. Selon un mode de réalisation particulièrement préféré, le procédé selon l'invention permet de détecter et identifier des microorganismes (bactéries, levures, virus etc.) impliqués dans au moins une maladie infectieuse, préférentiellement des bactéries. Le procédé selon l'invention peut aussi être utilisé pour le diagnostic des maladies génétiques, en oncologie et de façon générale en biologie moléculaire. Selon un autre aspect, l'invention concerne un kit comprenant un couple d'amorces 1 comprenant la SEQ ID N°1 et la SEQ ID N°2 ou la SEQ ID N°3 et la SEQ ID N°4 ou la SEQ ID N°5 et la SEQ ID N°6 et un couple d'amorces 2 comprenant la SEQ ID N°7 et la SEQ ID N°8 ou la SEQ ID N°9 et la SEQ ID N°10. Selon un mode de réalisation préféré, l'invention concerne un kit comprenant : un couple d'amorces 1 ciblant les régions variables V1-V2 du gène 16S constitué : CA d'une amorce sens ayant au moins 70% d'homologie de séquence avec la SEQ ID NO :14 ou SEQ ID NO :15, et d'une amorce antisens ayant au moins 70% d'homologie de séquence avec la SEQ ID NO:16 ou SEQ ID NO:17 ou SEQ ID NO:26 ou SEQ ID NO:27, un couple d'amorces 2 ciblant les régions variables V4-V6 du gène 16S constitué : d'une amorce sens ayant au moins 70% d'homologie de séquence avec la SEQ ID NO :28 ou SEQ ID NO :29 ou SEQ ID NO :30 et d'une amorce antisens ayant au moins 70% d'homologie de séquence avec la SEQ ID NO:31 ou SEQ ID NO:32 ou SEQ ID NO:33. Selon un autre mode de réalisation préféré, l'invention concerne un kit comprenant : _ un couple d'amorces 1 ciblant les régions variables V1-V2 du gène 16S constitué : d'une amorce sens ayant au moins 70% d'homologie de séquence avec la SEQ ID NO :14 ou SEQ ID NO :15, et d'une amorce antisens ayant au moins 70% d'homologie de séquence avec la SEQ ID NO :16 ou SEQ ID NO :17 ou SEQ ID NO :26 ou SEQ ID NO :27, un couple d'amorces 2 ciblant les régions variables V7-V9 du gène 16S constitué : . d'une amorce sens ayant au moins 70% d'homologie de séquence avec la SEQ ID NO :34 ou SEQ ID NO :35 et d'une amorce antisens ayant au moins 70% d'homologie de séquence avec la SEQ ID NO :36 ou SEQ ID NO :37 ou SEQ ID NO :38, Selon un autre mode de réalisation, l'invention concerne un kit comprenant : un couple d'amorces 1 ciblant les régions variables V1-V2 du gène 16S constitué : . d'une amorce sens ayant au moins 70% d'homologie de séquence avec la SEQ ID NO :14 ou SEQ ID NO :15, et d'une amorce antisens ayant au moins 70% d'homologie de séquence CA avec la SEQ ID NO:16 ou SEQ ID NO:17 ou SEQ ID NO:26 ou SEQ ID NO:27, un couple d'amorces 2 ciblant les régions variables V4-V6 du gène 16S constitué : d'une amorce sens ayant au moins 70% d'homologie de séquence avec la SEQ ID NO :28 ou SEQ ID NO :29 ou SEQ ID NO :30 et d'une amorce antisens ayant au moins 70% d'homologie de séquence avec la SEQ ID NO :31 ou SEQ ID NO :32 ou SEQ ID NO :33, un couple d'amorces 3 ciblant les régions variables V7-V9 du gène 16S constitué : d'une amorce sens ayant au moins 70% d'homologie de séquence avec la SEQ ID NO :34 ou SEQ ID NO :35, et d'une amorce antisens ayant au moins 70% d'homologie de séquence avec la SEQ ID NO :36 ou SEQ ID NO :37 ou SEQ ID NO :38. Préférentiellement, le kit selon l'un des quelconques modes de réalisation précédents comprend des amorces dont l'homologie de séquence de 70% concerne, en particulier les dix premiers nucléotides en 3' de ladite séquence. Selon un mode de réalisation particulièrement préféré, l'invention concerne un kit comprenant : un couple d'amorces 1 ciblant les régions variables V1-V2 du gène 16S constitué : d'une amorce sens de SEQ ID NO :14 ou SEQ ID NO :15, et d'une amorce antisens SEQ ID NO:16 ou SEQ ID NO:17 ou SEQ ID NO :26 ou SEQ ID NO :27, un couple d'amorces 2 ciblant les régions variables V4-V6 du gène 16S constitué : d'une amorce sens de SEQ ID NO :28 ou SEQ ID NO :29 ou SEQ ID NO :30 et . d'une amorce antisens SEQ ID NO:31 ou SEQ ID NO:32 ou SEQ ID NO:33, CA Selon un mode de réalisation particulièrement préféré, l'invention concerne un kit comprenant: _ un couple d'amorces 1 ciblant les régions variables V1-V2 du gène 16S constitué : d'une amorce sens de SEQ ID NO :14 ou SEQ ID NO :15, et d'une amorce antisens SEQ ID NO :16 ou SEQ ID NO :17 ou SEQ ID NO :26 ou SEQ ID NO :27, _ un couple d'amorces 2 ciblant les régions variables V7-V9 du gène 16S constitué : d'une amorce sens de SEQ ID NO :34 ou SEQ ID NO :35 et d'une amorce antisens SEQ ID NO:36 ou SEQ ID NO:37 ou SEQ ID NO :38, Selon un autre mode réalisation particulièrement préféré, l'invention concerne un kit comprenant: _ un couple d'amorces 1 ciblant les régions variables V1-V2 du gène 16S constitué : d'une amorce sens de SEQ ID NO :14 ou SEQ ID NO :15, et . d'une amorce antisens SEQ ID NO:16 ou SEQ ID NO:17 ou SEQ ID NO :26 ou SEQ ID NO :27, un couple d'amorces 2 ciblant les régions variables V4-V6 du gène 16S constitué : d'une amorce sens de SEQ ID NO :28 ou SEQ ID NO :29 ou SEQ ID NO :30 et . d'une amorce antisens SEQ ID NO:31 ou SEQ ID NO:32 ou SEQ ID NO:33, un couple d'amorces 3 ciblant les régions variables V7-V9 du gène 16S constitué : d'une amorce sens de SEQ ID NO :34 ou SEQ ID NO :35, et . d'une amorce antisens SEQ ID NO:36 ou SEQ ID NO:37 ou SEQ ID NO :38. CA Préférentiellement, le kit selon l'invention est apte à mettre en œuvre le procédé selon l'invention. L'invention concerne également l'utilisation du kit selon l'invention pour détecter les microorganismes présents lors de maladies infectieuses, tels des bactéries, des virus ou des levures. Préférentiellement, l'invention concerne l'utilisation du kit pour diagnostiquer une maladie infectieuse chez un sujet ou un végétal. L'invention concerne également l'utilisation du kit selon l'invention pour détecter au moins une maladie génétique ou au moins un cancer. Exemple Exemple 1 du procédé selon l'invention pour l'amplification de deux séquences d'un gène spécifique de Staphylococcus aureus et d'Escherichia coli (figures 2A / 2B / 2C) Matériels et méthode Les réactions de PCR Relais ont été effectuées de la manière suivante : 0,2mM de dNTP, 4mM de MgCl2, 0,05 unité de FastStart™ polymérase (Roche) et le tampon selon les conditions du fournisseur. Les sondes TaqMan™ pour le couple d'amorces 1 étaient à 0,25mM alors que celles pour le couple d'amorces 2 à 0,1mM. Les couples d'amorces étaient mis à différentes concentrations: 1mM pour les Duplex standard, 1mM pour le couple d'amorces 1 dans les Duplex-Relais et 0,1mM ou 1mM pour le couple d'amorces 2 dans les Duplex-Relais. Les cyclages étaient les suivants : une dénaturation à 95°C 10min puis 55 cycles à 95°C 15sec / 55°C 15sec / 68°C 15sec. Environ 100 copies génomes équivalents de chacune des bactéries testées étaient ajoutées aux mix pour réaliser les amplifications. Résultats L'amplification des deux séquences d'intérêt a été réalisée par une PCR standard en duplex, par PCR Relais selon l'invention avec un ratio couple d'amorces 1: couple d'amorces 2 égale à 10:1 et par PCR Relais selon l'invention avec un ratio couple d'amorces 1:couple d'amorces 2 égale à 1:1. Dans le cadre de la PCR Duplex standard, les deux couples d'amorces ont été mis en forte concentration. Le couple d'amorces permettant d'amplifier la séquence spécifique du gène Staphylococcus aureus est constitué des amorces de séquence SEQ ID NO :3 et SEQ ID NO :4 et le couple permettant d'amplifier Escherichia coli est constitué des amorces de séquence SEQ ID NO :1 et SEQ ID NO :2. Les résultats sont représentés dans la Figure 2A et le Tableau 3. Les inventeurs ont ainsi observé une superposition des Cq (nombre de cycles initiant une détection du signal de fluorescence) signifiant qu'une quantité identique de génome bactérien à bien été ajoutée au mix PCR. De plus, autant de quantité d'amplicons Escherichia coli et Staphylococcus aureus ont été générés. Lors de la PCR Duplex-Relais avec un ratio 10:1, le couple d'amorces 1 est constitué des amorces de séquences SEQ ID NO:2 et SEQ ID NO:3 et le couple d'amorces 2 constitué des amorces de séquences SEQ ID NO:7 et SEQ ID NO:8. Le premier couple d'amorces permet d'amplifier la séquence spécifique du gène Staphylococcus aureus et le deuxième couple d'amorces hybride ou chimères permet d'amplifier la séquence spécifique du gène d'Escherichia coli. Les résultats sont représentés dans la Figure 2B et le Tableau 3. Les inventeurs ont ainsi observé un décalage de Cq des courbes entre les amplicons Staphylococcus aureus et Escherichia coli. Ce retard engendré par la PCR Duplex-Relais était de 2,09 cycles (35.27-33.18) pour un ratio d'amorce 10:1 soit environ un facteur 4 (2^1.99). Il conduit à un différentiel de quantité d'environ 4 fois moins d'amplicons relatifs au gène d'Escherichia coli par rapport aux amplicons de Staphylococcus aureus. Lors de la PCR Relais avec un ratio 1:1, les couples d'amorces utilisés sont identiques à ceux utilisés dans la PCR Relais (ratio 10:1). Les résultats sont présentés dans la Figure 2C et le Tableau 3. Les inventeurs ont également observé un décalage de Cq des courbes entre les amplicons Staphylococcus aureus et Escherichia coli. Ce retard engendré par la PCR Duplex- Relais était de 1,79 cycles (35.68-33.89), soit environ un facteur 3,5 (2^1,79). La quantité différentielle d'amplicons était là encore observée pour des facteurs similaires. [Tableau 3] [Image disponible dans le document PDF, Image available in the PDF document] M. Cq= moyenne des Cq. SD. Cq= déviation standard de Cq. SA: valeurs pour Staphylococcus aureus 5 EC : valeurs pour Escherichia coli. Exemple 2 du procédé selon l'invention pour l'amplification de deux séquences d'un gène spécifique de Klebsiella pneumoniae et de Staphylococcus aureus (figures 3A / 3B / 3C) Le matériel et méthode est identique à celui décrit en Example 1. L'amplification des deux séquences d'intérêt a été réalisée par une PCR Duplex standard, et par PCR Duplex-Relais selon l'invention avec un ratio couple d'amorces 1: couple d'amorces 2 égale à 10:1 et par PCR Duplex-Relais selon l'invention avec un ratio couple d'amorces 1: couple d'amorces 2 égale à 1:1. 15 Dans le cadre de la PCR Duplex standard, les deux couples d'amorces ont été mis en forte CA concentration. Le couple d'amorces permettant d'amplifier la séquence spécifique du gène Klebsiella pneumoniae est constitué des amorces de séquence SEQ ID NO :5 et SEQ ID NO :6 et le couple permettant d'amplifier Staphylococcus aureus est constitué des amorces de séquences SEQ ID NO :3 et SEQ ID NO :4. Les résultats sont représentés dans la Figure 3A et le Tableau 4. Les inventeurs ont ainsi observé une superposition des Cq (nombre de cycles initiant une détection du signal de fluorescence) signifiant qu'une quantité identique de génome bactérien a bien été ajoutée au mix PCR. De plus, autant de quantité d'amplicons Klebsiella pneumoniae et Staphylococcus aureus ont été générés. Lors de la PCR Relais avec un ratio 10:1, le couple d'amorces 1 est constitué des amorces de séquences SEQ ID NO :5 et SEQ ID NO :6 et le couple d'amorces 2 constitué des amorces de séquences SEQ ID NO :9 et SEQ ID NO :10. Le premier couple d'amorces permet d'amplifier la séquence spécifique du gène Klebsiella pneumoniae et le deuxième couple d'amorces chimères permet d'amplifier la séquence spécifique du gène Staphylococcus aureus. Les résultats sont représentés dans la Figure 3B et le Tableau 4. Les inventeurs ont ainsi observé un décalage de Cq des courbes entre les amplicons Klebsiella pneumoniae et Staphylococcus aureus. Le retard engendré par la PCR Duplex-Relais était de 1,99 cycles (35.35-33.36) pour le ratio d'amorce 10:1 soit environ un facteur 4 (2^1.99). Il conduit à un différentiel de quantité d'environ 4 fois moins d'amplicons relatifs au gène Staphylococcus aureus par rapport aux amplicons de Klebsiella pneumoniae. Lors de la PCR Relais avec un ratio 1:1, les couples d'amorces utilisés sont identiques à ceux utilisés dans la PCR Relais (ratio 10:1). Les résultats sont présentés dans la Figure 3C et le Tableau 4. Les inventeurs ont également observé un décalage de Cq des courbes entre les amplicons Klebsiella pneumoniae et Staphylococcus aureus. Le retard engendré par la PCR Duplex-Relais était de 2,59 cycles (36.43-33.84), soit environ un facteur 6 (2^2,59). Il conduit à un différentiel de quantité d'environ 6 fois moins d'amplicons relatifs au gène Staphylococcus aureus par rapport aux amplicons de Klebsiella pneumoniae. CA [Tableau 4] [Image disponible dans le document PDF, Image available in the PDF document] M. Cq= moyenne des Cq. SD. Cq= déviation standard de Cq. KP : valeurs pour Klebsiella pneumoniae SA: valeurs pour Staphylococcus aureus Exemple 3 du procédé selon l'invention comparé à une PCR multiplexe standard pour l'amplification de deux séquences d'un gène 16S de Klebsiella pneumoniae (figure 6) Matériel & Méthode Les réactions de PCR Relais ont été effectuées de la manière suivante : 0,2mM de dNTP, 4mM de MgCl2, 0,05 unité de FastStart polymérase (Roche) et le tampon selon les conditions du fournisseur. Les couples d'amorces étaient mis à différentes concentrations : 1mM pour les simplex standard, 1mM pour les Duplex standard, 1mM pour le couple d'amorces 1 dans les Duplex Relais et 0,04mM pour le couple d'amorces 2 dans les Duplex Relais. Les cyclages étaient les suivants : une dénaturation à 95°C 10min puis 65 cycles à 95°C 15sec / 55°C 15sec / 68°C 30sec. Environ 100 copies génomes équivalents de Klebsiella pneumoniae étaient CA ajoutés aux mix pour réaliser les amplifications. Résultats L'amplification des deux séquences d'intérêt a été réalisée par une PCR Duplex standard (Figure 6, ligne 3), et par PCR Duplex-Relais selon l'invention (Figure 6, ligne 4) avec un ratio couple d'amorces 1: couple d'amorces 2 égale à 25:1. La ligne 1 représente l'amplicon de la région 5' du gène 16S (recouvrant les zones variables V1 à V2) (PCR contrôle). La ligne 2 représente l'amplicon de la région centrale du gène 16S (recouvrant les zones variables V4 à V6) (PCR contrôle). La ligne 3 représente les amplicons en PCR multiplexe standard des régions V1-V2 et V4-V6 du gène 16S. La ligne 4 représente les amplicons des régions V1-V2 et V4-V6 du gène 16S avec la méthode selon la présente invention (PCR multiplexe Relais), Dans le cadre de la PCR Duplex standard, les deux couples d'amorces ont été mis en forte concentration (Ligne 3). Le couple d'amorces permettant d'amplifier la séquence V1V2 du gène 16S de Klebsiella pneumoniae est constitué des amorces de séquence SEQ ID NO :14 et SEQ ID NO :16 et le couple permettant d'amplifier la séquence V4-V6 du gène 16S de Klebsiella pneumoniae est constitué des amorces de séquences SEQ ID NO :20 et SEQ ID NO :23. Les résultats sont représentés dans la Figure 6. Les inventeurs ont observé (ligne 3 et flèche de gauche) qu'il n'y a pas d'amplicon de la région V1-V2 du gène 16S démontrant que les conditions standard de PCR multiplexe ne sont pas compatibles avec l'amplification simultanée des 2 régions du gène 16S. Lors de la PCR Relais avec un ratio 25 :1, le couple d'amorces 1 est constitué des amorces de séquences SEQ ID NO :14 et SEQ ID NO :16 et le couple d'amorces 2 constitué des amorces de séquences SEQ ID NO :28 et SEQ ID NO :33. Le premier couple d'amorces permet d'amplifier la région V1-V2 du gène 16S de Klebsiella pneumoniae et le deuxième couple d'amorces chimères permet d'amplifier la régionV4-V6 du gène 16S de Klebsiella pneumoniae. Les résultats sont représentés dans la Figure 6. Les inventeurs ont ainsi observé que les conditions de la PCR relais permettent de co-amplifier simultanément les 2 régions du gène 16S (Ligne 4) et que les amplicons de la région V1-V2 sont en plus grande quantité que ceux de la région CA central (signal plus intense pour l'amplicon V1-V2 alors que sa taille est plus petite). Par conséquent, la méthode selon la présente invention permet de co-amplifier les deux régions ciblées à l'inverse d'une PCR multiplexe standard. La structure particulière des amorces chimères selon la présente invention permet ainsi de surmonter les problématiques de l'art antérieur, en particulier de la PCR multiplexe. Exemple 4 du procédé selon l'invention comparé à une PCR multiplexe standard pour l'amplification de trois séquences du gène 16S de Klebsiella pneumoniae (figure 7) Matériel & Méthode Les réactions de PCR Relais ont été effectuées de la manière suivante : 0,2mM de dNTP, 4mM de MgCl2, 0,05 unité de FastStart polymérase (Roche) et le tampon selon les conditions du fournisseur. Les couples d'amorces étaient mis à différentes concentrations : 1mM pour les Triplex standard, 1mM pour le couple d'amorces 1 dans les Triplex Relais et 0,04mM pour le couple d'amorces 2 et le couples d'amorces 3 dans les Triplex Relais. Les cyclages étaient les suivants: une dénaturation à 95°C 10min puis 65 cycles à 95°C 15sec / 55°C 15sec / 68°C 18sec. Environ 100 copies génomes équivalents de Klebsiella pneumoniae étaient ajoutés aux mix pour réaliser les amplifications. Résultats Dans le cadre de la PCR Triplex standard, les trois couples d'amorces ont été mis en forte concentration (Ligne 1). Le couple d'amorces permettant d'amplifier la séquence spécifique (V1-V2) du gène 16S de Klebsiella pneumoniae est constitué des amorces de séquence SEQ ID NO :14 et SEQ ID NO :16, le couple permettant d'amplifier la séquence spécifique (V4-V6) du gène 16S de Klebsiella pneumoniae est constitué des amorces de séquences SEQ ID NO :20 et SEQ ID NO :23 et le couple permettant d'amplifier la séquence spécifique (V7-V9) du gène 16S de Klebsiella pneumoniae est constitué des amorces de séquences SEQ ID NO :24 et SEQ ID NO :25. Dans le cadre de la PCR Triplex Relais (ligne 2), le couple d'amorces permettant d'amplifier la séquence spécifique (V1V2) du gène 16S de Klebsiella pneumoniae est constitué des amorces de séquence SEQ ID NO :14 et SEQ ID NO :16, le couple permettant d'amplifier la séquence spécifique (V4-V6) du gène 165 de Klebsiella pneumoniae est constitué des amorces de CA séquences SEQ ID NO :28 et SEQ ID NO :33 et le couple permettant d'amplifier la séquence spécifique (V7-V9) du gène 16S de Klebsiella pneumoniae est constitué des amorces de séquences SEQ ID NO :34 et SEQ ID NO :36. Les amorces du couple ciblant la région V1-V2 sont mises en forte concentration alors que les amorces hybrides ou chimères des autres couples sont mises en faible concentration. Les résultats sont représentés dans la Figure 7. Les inventeurs ont observé que les régions ciblées étaient mal amplifiées par la Triplex stan- dard, notamment les régions variables V1 et V2 du gène 16S de Klebsiella pneumoniae. A l'in- verse, la Triplex Relais est capable d'amplifier les 3 régions du gène 16S de Klebsiella pneumo- niae à savoir la région V1 à V2 (343pb), la région V7 à V9 (413 bp en PCR Duplex standard et 447 bp en PCR Duplex Relais)et la région V4 à V6 (509 bp en PCR Duplex standard et 543 bp en PCR Duplex relais). Par conséquent, la méthode selon la présente invention permet de co-amplifier les trois ré- gions ciblées. Exemple 5 du procédé selon l'invention avec un couple d'amorce 1 comprenant une amorce en forte concentration et une amorce hybride ou chimère en faible concentration (figure 8). Matériel & Méthode Les deux réactions de PCR Relais ont été effectuées de la manière suivante : 0,2mM de dNTP, 4mM de MgCl2, 0,05 unité de FastStart polymérase (Roche) et le tampon selon les conditions du fournisseur. Dans la première condition de Duplex Relais les amorces étaient mises à différentes concentrations : 1mM pour les deux amorces du couple 1 et 0,04mM pour le couple d'amorces 2. Dans la deuxième condition de Duplex Relais les amorces étaient mises à différentes concentrations : 1mM pour la première amorce standard du couple 1, 0,04mM pour la deuxième amorce chimère du couple 1, et 0.04mM pour les amorces chimères du couple 2. Les cyclages étaient les suivants : une dénaturation à 95°C 10min puis 55 cycles à 95°C 15sec / 55°C 15sec / 68°C 45sec. Environ 100 copies génomes équivalents de Klebsiella pneumoniae étaient ajoutés aux mix pour réaliser les amplifications. Résultats Dans le cadre de la première PCR Duplex Relais (Ligne 1), le couple d'amorces permettant d'amplifier la région V1-V2 du gène 16S de Klebsiella pneumoniae est constitué des amorces de séquence SEQ ID NO :14 et SEQ ID NO :16 en forte concentration, le couple permettant d'amplifier la région V7-V9 du gène 16S de Klebsiella pneumoniae est constitué des amorces chimères de séquences SEQ ID NO :34 et SEQ ID NO :36 en faible concentration. Dans le cadre de la deuxième PCR Duplex Relais (Ligne 2), une seule amorce du couple 1 a été mise en forte concentration, SEQ ID NO:14, l'autre amorce étant une amorces hybrides mises en faible concentration SEQ ID NO :26. Le couple d'amorces permettant d'amplifier la région V1V2 du gène 16S de Klebsiella pneumoniae est constitué des amorces de séquence SEQ ID NO :14 et SEQ ID NO :26, le couple permettant d'amplifier la région V7-V9 du gène 16S de Klebsiella pneumoniae est constitué des amorces de séquences SEQ ID NO :34 et SEQ ID NO :37. Les résultats sont représentés dans la Figure 8. Les inventeurs ont observé que dans les 2 conditions, les amplicons correspondant aux régions V1-V2 (343 bp pour la première PCR Duplex Relais (ligne 1) e t349pb pour la deuxième PCR Duplex relais (ligne 2) et V7-V9 (447 bp pour la première PCR Duplex Relais (ligne 1) et 453pb pour la deuxième PCR Duplex relais (ligne 2) sont bien amplifiées. Toutefois on remarque que le fait d'utiliser une seule amorce du couple 1 en forte concentration semble encore plus faciliter la PCR Relais selon la présente invention. De plus, la brillance de la bande des amplicons V1-V2 identique à celle de la bande V7-V9 suggère que la quantité d'amplicon V1- V2 est bien supérieure à celle des amplicons V7-V9, les amplicons V1-V2 étant plus petits. Cette variation du procédé de l'invention conserve donc l'amplification privilégiée de la région pour laquelle une amorce en forte concentration est utilisée.

Claims

1. Procédé pour amplifier au moins deux séquences d'acides nucléiques d'intérêt distinctes présentes dans un échantillon à partir d'un couple d'amorces 1 apte à amplifier une première séquence d'acides nucléiques d'intérêt (A) et d'au moins un couple d'amorces 2 apte à amplifier une deuxième séquence d'acides nucléiques d'intérêt (B), ledit procédé comprenant les étapes suivantes : a. la mise en contact de l'échantillon avec le couple d'amorces 1 apte à amplifier la séquence d'acides nucléiques (A) et le couple d'amorces 2 apte à amplifier la deuxième séquence d'acides nucléiques (B), İ. le couple d'amorces 1 étant constitué d'une première amorce et d'une deuxième amorce aptes à amplifier un acide nucléique correspondant à la première séquence (A), İİ. le couple d'amorces 2 étant constitué d'une première amorce et d'une deuxième amorce aptes à amplifier un acide nucléique correspondant à la deuxième séquence (B), b. l'ajout de réactifs sélectionnés et de conditions permettant une amplification PCR, et c. l'amplification de la première et deuxième séquence d'acides nucléiques (A et B), où la séquence de la première amorce du couple d'amorces 2 comprend en outre en 5' la séquence de la première ou de la deuxième amorce du couple d'amorces 1 et la séquence de la deuxième amorce du couple d'amorces 2 comprend en outre en 5' la séquence de la première ou de la deuxième amorce du couple d'amorces 1.

2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel la séquence de la première amorce du couple d'amorce 2 et la séquence de la première ou de la deuxième amorce du couple d'amorces 1 sont contigües et la séquence de la deuxième amorce du couple d'amorce 2 et la séquence de la première ou de la deuxième amorce du couple d'amorces 1 sont contigües.

3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, dans lequel la deuxième amorce du couple 1 est une amorce hybride comprenant en 5' la séquence de la première amorce du couple 1, lesdites séquences sont contiguës.

4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans lequel la concentration du couple d'amorces 2 est inférieure ou égale à celle du couple d'amorces 1.

5. Procédé selon la revendication 4, dans lequel le ratio de concentration entre le couple d'amorces 1 et le couple d'amorces 2 est compris entre 1:1 et 1000:1.

6. Procédé selon la revendication 5, dans lequel le ratio de concentration entre le couple d'amorces 1 et le couple d'amorces 2 est compris entre 1:1 et 100:1.

7. Procédé selon la revendication 6, dans lequel le ratio de concentration entre le couple d'amorces 1 et le couple d'amorces 2 est 25:1.

8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, comprenant en outre la mise en contact de l'échantillon avec un couple d'amorces 3 apte à amplifier un acide nucléique correspondant à une 3ème séquence d'acides nucléiques (C), où la séquence de la première amorce du couple d'amorces 3 comprend en outre en 5' la séquence de la première ou de la deuxième amorce du couple d'amorces 1 et la séquence de la deuxième amorce du couple d'amorces 3 comprend en outre en 5' la séquence de la première ou de la deuxième amorce du couple d'amorces 1.

9. Procédé selon la revendication 8, dans lequel la concentration du couple d'amorces 1 est supérieure à la concentration du deuxième et / ou troisième couple.

10. Procédé selon la revendication 9, dans lequel la concentration du couple d'amorces 2 est égale à celle du couple d'amorces 3.

11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 8 à 10, comprenant en outre la mise en contact de l'échantillon avec un couple d'amorces 4 apte à amplifier une 4ème séquence d'acides nucléiques (D), où la séquence de la première amorce du couple d'amorces 4 comprend en outre en 5' la séquence de la première ou de la deuxième amorce du couple d'amorces 1 et la séquence de la deuxième amorce du couple d'amorces 4 comprend en outre en 5' la séquence de la première ou de la deuxième amorce du couple d'amorces 1.

12. Procédé selon la revendication 11, dans lequel la concentration du couple d'amorces 4 est inférieure à la concentration du couple d'amorces 1.

13. Procédé selon la revendication 12, dans lequel la concentration du couple d'amorces 2, du couple d'amorces 3 et du couple d'amorces 4 est identique.

14. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, comprenant en outre une étape de séquençage des acides nucléiques amplifiés.

15. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 14, dans lequel l'amplification des séquences d'acide nucléique d'intérêt permet de détecter et identifier au moins un microorganisme impliqué dans au moins une maladie infectieuse.

16. Procédé selon la revendication 15, dans lequel le au moins un microorganisme est identifié par sonde fluorescente, marquage fluorescent, courbe de fusion, PCR nichée, PCR quantitative, Reverse-transcription PCR ou par séquençage d'ADN.

17. Kit comprenant: - un couple d'amorces 1 ciblant les régions variables V1-V2 du gène 16S constitué : d'une amorce sens de SEQ ID NO :14 ou SEQ ID NO :15, et d'une amorce antisens SEQ ID NO :16 ou SEQ ID NO :17 ou SEQ ID NO:26 ou SEQ ID NO:27, et _ un couple d'amorces 2 ciblant les régions variables V4-V6 du gène 16S constitué : d'une amorce sens de SEQ ID NO :28 ou SEQ ID NO :29 ou SEQ ID NO :30 et d'une amorce antisens SEQ ID NO :31 ou SEQ ID NO :32 ou SEQ ID NO :33.

18. Kit comprenant: - un couple d'amorces 1 ciblant les régions variables V1-V2 du gène 16S constitué : d'une amorce sens de SEQ ID NO :14 ou SEQ ID NO :15, et d'une amorce antisens SEQ ID NO :16 ou SEQ ID NO :17 ou SEQ ID NO :26 ou SEQ ID NO :27, et _ un couple d'amorces 2 ciblant les régions variables V7-V9 du gène 16S constitué : d'une amorce sens de SEQ ID NO :34 ou SEQ ID NO :35 et d'une amorce antisens SEQ ID NO :36 ou SEQ ID NO :37 ou SEQ ID NO :38.

19. Kit comprenant: _ un couple d'amorces 1 ciblant les régions variables V1-V2 du gène 16S constitué : d'une amorce sens de SEQ ID NO :14 ou SEQ ID NO :15, et d'une amorce antisens SEQ ID NO :16 ou SEQ ID NO :17 ou SEQ ID NO :26 ou SEQ ID NO :27, - un couple d'amorces 2 ciblant les régions variables V4-V6 du gène 16S constitué : d'une amorce sens de SEQ ID NO :28 ou SEQ ID NO :29 ou SEQ ID NO :30 et d'une amorce antisens SEQ ID NO :31 ou SEQ ID NO :32 ou SEQ ID NO:33, et - un couple d'amorces 3 ciblant les régions variables V7-V9 du gène 16S constitué : d'une amorce sens de SEQ ID NO :34 ou SEQ ID NO :35 et d'une amorce antisens SEQ ID NO :36 ou SEQ ID NO :37 ou SEQ ID NO :38.

20. Utilisation d'un kit selon l'une quelconque des revendications 17 à 19 pour mettre en œuvre le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 16 et détecter au moins un microorganisme présent lors d'au moins une maladie infectieuse.