Polypeptide conjugates and methods of uses

Abstract

Provided is a conjugated GLP-1 polypeptide with improved potency and half-life. Pharmaceutical compositions comprising the polypeptide and methods of using the polypeptide for treating diseases are also provided.

Description

POLYPEPTIDE CONJUGATES AND METHODS OF USESFIELD OF THE INVENTION

[0001] The present invention relates to polypeptide conjugates, pharmaceutical compositions thereof, and methods of using such to prevent and / or treat diseases.BACKGROUND

[0002] Major biologically active fragment of Glucagon-Like Peptide-1 (GLP-1) is a 30 or 31 amino acid peptide fragment (amino acid 7-36 or 7-37 of GLP-1) deriving from the posttranslational processing of the proglucagon peptide. The initial GLP-1 product GLP-1 stimulates insulin synthesis and secretion and has been shown to prevent hyperglycemia in diabetics, especially type 2 diabetes. However, endogenous GLP-1 only has a half-life of approximately 2 minutes, which results in fasting plasma levels of GLP-1 of only 0-15 pmol / L.

[0003] It is reported in the art that conjugation of a CRM to a GLP-1 may prolong the plasma half-life of GLP-1, however, it is also found that CRM (or fatty acid) conjugation to GLP-1 can adversely affect the biological activity of the GLP-1, rendering it less active than its non-conjugated counterpart in the presence of HSA.

[0004] Therefore, there is a need for an improved GLP-1 polypeptide conjugate with both improved potency and extended half-life.SUMMARY OF THE INVENTION

[0005] Provided herein are polypeptide conjugates, and pharmaceutical compositions comprising the same and methods of use for treating / preventing disorders.

[0006] In a first aspect, the present disclosure provides a polypeptide conjugate comprising: a GLP-1 peptide comprises the amino acid sequence of X7X8EGTFTSDVSSYLEEX23AAX26X27FIX30WLVX34GX36G (SEQ ID NO: 2) , wherein: X7 is H, X8 is G or Aib, the X23 is Q or K, the X26 is K, or R; the X27 is E or K; the X30 is A or K, the X34 is K or R and the X36 is R or G; and a clearance-reducing moiety (CRM) conjugated to the GLP-1 peptide through a CRM  residue, wherein the CRM residue is lysine residue selected from the group consisting of K23, K26, K27, K30 and K34; the CRM comprise an albumin-binding moiety, wherein the albumin-binding moiety  comprises a structure of: *-A-B-C-D, wherein A, B, C and D are interconnected via amide bonds, and the *end of A is connected to a reactive group of the conjugatable residue in the polypeptide complex, and wherein: A is selected from a bond,  a, b, c  and d are independently an integer from 0 to 4, R1 is hydrogen or –COOH; B is selected from a bond,  e is an integer from 1 to 4, wherein position α is linked to position α’, C is a bond or R2 is –CH2SO3H or –COOH, f is an integer from 1 to 4, n  is an integer from 1 to 25, wherein when B is not bond, then position β’ is linked to position β, or when B is bond, then position β’ is linked to position α’; D is an acidic group having a formula: wherein g is 18, R6 is hydroxyl; and wherein: when C is not a bond, then position δ is linked to position γ, when B is not a bond, C is a bond, then position δ is linked to position β, when A is not a bond, and both of B and C are bond, then position δ is linked to position α’.

[0007] In certain embodiments, the CRM residue is K26.

[0008] In certain embodiments, the GLP-1 comprises an amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NOs: 3-16.

[0009] In certain embodiments, the CRM comprises the structure of below formula:

[0010] In certain embodiments, the polypeptide conjugate comprising the structure of below formula:

[0011] In some of these embodiments, the polypeptide conjugates provided herein has increased GLP-1 activity in the presence of human serum albumin (HSA) , relative to its 22G counterpart that is otherwise identical to the polypeptide conjugate except for having glycine residue at position 22 (the numbering is relative to natural GLP-1 (7-37) ) . In certain embodiments, the polypeptide conjugates provided herein has at least 5%, 10%, 15, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, or 50%increase in GLP-1 activity in the presence of HSA, relative to its 22G counterpart, as measured under equivalent assay conditions.

[0012] In some of these embodiments, the polypeptide conjugates provided herein has a longer-acting efficacy relative to its C18 counterpart that is otherwise identical to the polypeptide conjugate except that CRM in the conjugate comprise an acidic group having a formula:  wherein g is an integer of 16. In certain embodiments, the efficacy of polypeptide conjugates provided herein lasts for at least 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200%of the period during which its C18 counterpart shows a comparable efficacy profile.

[0013] In some of these embodiments, the polypeptide conjugates provided herein has both i) comparable or increased GLP-1 activity in the presence of human serum albumin (HSA) and ii) longer-acting efficacy, relative to its 22G and C18 counterpart that is otherwise identical to the polypeptide conjugate except for: i) having glycine residue at position 22 (the numbering is relative to natural GLP-1 (7-37) ) and ii) comprising an acidic group having a formula:  wherein g is an integer of 16. In certain embodiments, relative to its 22G and C18 counterpart, the polypeptide conjugates provided herein has at least 5%, 10%, 15, or 20%increase in GLP-1 activity in the presence of HSA and has an efficacy that lasts for at least 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200%of the period during which its 22G and C18 counterpart shows a comparable efficacy profile.

[0014] In some of these embodiments, the polypeptide conjugates provided herein has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3. In some of these embodiments, the polypeptide conjugates provided herein has the CRM comprising the structure of below formula:

[0015] In some of these embodiments, the polypeptide conjugates provided herein comprise the structure of the following formula, and its 22G and C18 counterpart is semaglutide:

[0016] In certain embodiments, HSA is present in the in vitro assay for GLP-1 receptor activation at a suitable amount that allows assessment of impact of HSA binding to the GLP-1 receptor activation.

[0017] In certain embodiments, the polypeptide conjugates provided herein binds to HSA at a binding affinity (KD) comparable to (e.g. from about 70%to about 500%of) that of semaglutide, as determined in the same or comparable assay.

[0018] In certain embodiments, the polypeptide conjugates provided herein has blood or plasma or serum concentrations that remain within therapeutic window for the polypeptide conjugate for a period at least about 20%longer (30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 120%, 150%, 180%, 200%, 300%, or 400%longer) that of a comparative polypeptide conjugate having a CRM with a shorter fatty acid chain, such as semaglutide, as determined under comparable in vivo study conditions and in the same type of experimental animals. In certain embodiments, the polypeptide conjugates provided herein has enhanced pharmacokinetic properties in comparison to a comparative polypeptide conjugate having a CRM with a shorter fatty acid chain, such as semaglutide, wherein the pharmacokinetic properties are determined by measuring blood concentration of the polypeptide conjugate after administration of a therapeutically effective dose to a subject.

[0019] In certain embodiments, the polypeptide conjugates provided herein has an increase in terminal half-life by at least about 20%longer (30%, 40%, 50%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 120%, 150%, 180%, 200%, 300%, or 400%longer) that of a comparative polypeptide conjugate having a CRM with a shorter fatty acid chain, such as semaglutide, as determined under comparable in vivo study conditions and in the same type of experimental animals. Suitable animals for terminal half-life determination include for example rats, minipigs, dogs or monkeys. In certain embodiments, the terminal half-life is determined in a suitable animal after a single dose intravenous administration at a dose suitable for providing therapeutic efficacy.

[0020] In certain embodiments, the polypeptide conjugates provided herein provides for an extended duration of therapeutic efficacy in comparison with a comparative polypeptide conjugate having a CRM with a shorter fatty acid chain, such as semaglutide, as determined under comparable in vivo study conditions and in the same type of experimental animals. In certain embodiments, the extended duration of therapeutic efficacy can be characterized by area under curve (AUC) for time-response curve, which can be plotted after a single dose that are suitable for providing an intended therapeutic effect. The extended therapeutic efficacy duration can also be characterized by the duration or intensity of the therapeutic response (e.g. reduction in body weight, or reduction in glucose level) , which can be plotted after a single dose or after repeated doses that are suitable for providing an intended therapeutic effect in a subject in need thereof.

[0021] In certain embodiments, the therapeutic response comprises reduction in body weight, reduction in food intake, or reduction in glucose level (fasting glucose level or non-fasting glucose level) .

[0022] In certain embodiments, the AUC is for the curve of time versus blood glucose level, or the curve of time versus food intake level. In such embodiments, the polypeptide conjugates provided herein has an decrease in the AUC for the time-response curve by at least 30%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 120%, 150%, 180%, 200%than that of a comparative polypeptide conjugate having a CRM with a shorter fatty acid chain, such as semaglutide, as determined under comparable in vivo study conditions and in the same type of experimental animals. In certain embodiments, the AUC is for the curve of time versus body weight reduction level (delta body weight) . In such embodiments, the polypeptide conjugates provided herein has an increase in the AUC for the time-response curve by at least 30%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 120%, 150%, 180%, 200%than that of a comparative polypeptide conjugate having a CRM with a shorter fatty acid chain, such as semaglutide, as determined under comparable in vivo study conditions and in the same type of experimental animals. In certain embodiments, the polypeptide conjugates provided herein has an increase in duration or intensity of the therapeutic response by at least 30%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 120%, or 150%, 180%, 200%, 300%, or 400%than that of a comparative polypeptide conjugate having a CRM with a shorter fatty acid chain, such as semaglutide, as determined under comparable in vivo study conditions and in the same type of experimental animals.

[0023] In a second aspect, the present disclosure provides a polynucleotide encoding the polypeptide portion (or fragment thereof) of the polypeptide conjugate of the first aspect.

[0024] In a third aspect, the present disclosure provides a vector comprising the polynucleotide of the second aspect.

[0025] In a fourth aspect, the present disclosure provides a host cell comprising the vector of the third aspect.

[0026] In some embodiments, the host cell is a prokaryotic cell or eukaryotic cell.

[0027] In a fifth aspect, the present disclosure provides a method of producing the polypeptide conjugate of the first aspect, comprising culturing the host cell of the fourth aspect under a condition that allows expression of the polynucleotide of the second aspect to obtain the polypeptide portion of the polypeptide conjugate, and conjugating the CRM defined in the first aspect to the GLP-1 peptide at the CRM residue defined in the first aspect.

[0028] In some embodiments, the host cell is prokaryotic cell or a eukaryotic cell.

[0029] In some embodiments, the polypeptide portion is expressed as soluble proteins.

[0030] In some embodiments, the method further comprises conjugating the CRM to the polypeptide portion.

[0031] In a sixth aspect, the present disclosure provides a method of improving potency of a GLP-1 peptide conjugate, the method comprising introducing a mutation of 22E to the amino acid sequence of the GLP-1 peptide conjugate, wherein the numbering is relative to natural GLP-1 (7-37) , and wherein the GLP-1 peptide conjugate comprises a GLP-1 peptide and a clearance-reducing moiety (CRM) conjugated to the GLP-1 peptide through a CRM residue, wherein the CRM residue is lysine residue selected from the group consisting of K23, K26, K27, K30 and K34; and wherein the CRM comprises the structure of below formula:

[0032] In a seventh aspect, the present disclosure provides a pharmaceutical composition comprising the polypeptide conjugate according to the first aspect and a pharmaceutically acceptable salt.

[0033] In an eighth aspect, the present disclosure provides a method of preventing or treating a metabolic disorder in a subject in need thereof, comprising administering a therapeutically effective amount of the polypeptide conjugate of the first aspect.

[0034] In a ninth aspect, the present disclosure provides a method of managing body weight in a subject in need thereof, comprising administering a therapeutically effective amount of the polypeptide conjugate provided herein, thereby managing body weight of the subject.

[0035] In a tenth aspect, the present disclosure provides a method of reducing food intake in a subject in need thereof, comprising administering a therapeutically effective amount of the polypeptide conjugate provided herein, thereby reducing food intake of the subject.

[0036] In an eleventh aspect, the present disclosure provides a method of reducing body weight in a subject in need thereof, comprising administering a therapeutically effective amount of the polypeptide conjugate provided herein, thereby reducing body weight of the subject.

[0037] In certain embodiments, the metabolic disorder is diabetes, obesity, overweight, non-alcoholic steatohepatitis (NASH) , cardiovascular like dyslipidemia, artherosclerosis, alcoholic steatohepatitis (ASH) , diabetic nephropathy, metabolic syndrome such as metabolic syndrome X, nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD) , end-stage liver disease, hepatic steatosis (fatty liver) , liver cirrhosis, or primary biliary cirrhosis (PBC) .

[0038] In certain embodiments, the diabetes can any form of diabetes, including without limitation, hyperglycemia, type 2 diabetes, impaired glucose tolerance, type 1 diabetes, non-insulin dependent diabetes, MODY (maturity onset diabetes of the young) , gestational diabetes, and elevated level of HbA1C.

[0039] In a twelfth aspect, the present disclosure provides a method of preventing or treating Alzheimer's disease in a subject in need thereof, comprising administering a therapeutically effective amount of the polypeptide conjugate provided herein.

[0040] In certain embodiments, the subject is human.

[0041] In certain embodiments, the subject has a fasting blood glucose level of 125 mg / dL or greater.

[0042] In certain embodiments, the subject has a body mass index (BMI) of at least 25.

[0043] In certain embodiments, the polypeptide conjugate is administered at a dosing regimen that is no more frequently than once daily, once every 3 days, or once weekly, once every two weeks, once every three weeks, or once monthly.

[0044] In certain embodiments, the polypeptide conjugate is administered twice-weekly, once-weekly, once bi-weekly, once every three weeks, once monthly, or once every two months.

[0045] In certain embodiments, the dosing regimen has a dosing interval ranging from about once every 3 days to about once per month, or from about once weekly to about once per month.

[0046] In certain embodiments, the polypeptide conjugate is administered subcutaneously or intravenously or orally.

[0047] Throughout the present disclosure, the articles “a, ” “an, ” and “the” are used herein to refer to one or to more than one (i.e., to at least one) of the grammatical object of the article. By way of example, “a fusion polypeptide” means one fusion polypeptide or more than one fusion polypeptides.

[0048] In all occurrences in this application where there are a series of recited numerical values, it is to be understood that any of the recited numerical values may be the upper limit or lower limit of a numerical range. It is to be further understood that the invention encompasses all such numerical ranges, i.e., a range having a combination of an upper numerical limit and a lower numerical limit, wherein the numerical value for each of the upper limit and the lower limit can be any numerical value recited herein. Ranges provided herein are understood to include all values within the range. For example, 1-10 is understood to include all of the values 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, and 10, and fractional values as appropriate. Similarly, ranges delimited by “at least” are understood to include the lower value provided and all higher numbers.

[0049] As used herein, “about” is understood to include within three standard deviations of the mean or within standard ranges of tolerance in the specific art. In certain embodiments, about is understood a variation of no more than 0.5.

[0050] The articles “a” and “an” are used herein to refer to one or more than one (i.e. to at least one) of the grammatical object of the article. By way of example, “an element” means one element or more than one element.

[0051] The term “including” is used herein to mean, and is used interchangeably with, the phrase “including but not limited to” . Similarly, “such as” is used herein to mean, and is used interchangeably, with the phrase “such as but not limited to” .

[0052] The term “or” is used inclusively herein to mean, and is used interchangeably with, the term “and / or, ” unless context clearly indicates otherwise. BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES

[0053] Figures 1A to 1E show oral glucose tolerance test (OGTT) results for 6 hours (1A) , 30 hours (1B) , 54 hours (1C) , 78 hours (1D) and 102 hours (1E) after administration of MLC#7. Data are indicated as mean values and standard error (SEM) . Semaglutide (sema) was tested in parallel as a comparative control.

[0054] Figures 2A to 2D show dose-dependent efficacy of MLC#7 on glucose control (Figures 2A-2B) , weight control (Figure 2C) and food intake (Figure 2D) in db / db mice. Data are indicated as mean values and standard error (SEM) . Semaglutide (sema) was tested in parallel as a comparative control.

[0055] Figures 3A to 3B show in vivo efficacy of MLC#7 in Diet Induced Obese (DIO) mice. Data are expressed as mean values and standard error (SEM) . Semaglutide was tested in parallel as a comparative control.

[0056] Figure 4 shows all the sequences disclosed in the present disclosure.DETAILED DESCRIPTION

[0057] The following description of the invention is merely intended to illustrate various embodiments of the invention. As such, the specific modifications discussed are not to be construed as limitations on the scope of the invention. It will be apparent to one skilled in the art that various equivalents, changes, and modifications may be made without departing from the scope of the invention, and it is understood that such equivalent embodiments are to be included herein. All references cited herein, including publications, patents and patent applications are incorporated herein by reference in their entirety.

[0058] Definitions

[0059] The term “amino acid” as used herein refers to an organic compound containing amine (-NH2) and carboxyl (-COOH) functional groups, along with a side chain specific to each amino acid.

[0060] The term "naturally occurring" amino acid residue, as used herein, refers to an amino acid residue found in native proteins or peptides, all in their D and L stereoisomers if their structure allows such stereoisomeric forms. Examples of naturally occurring amino acid residues include, but not limited to, 20 standard amino acids, including, glycine (Gly or G) , alanine (Ala or A) , valine (Val or V) , leucine (Leu or L) , isoleucine (Ile or I) , serine (Ser or S) , cysteine (Cys or C) , threonine (Thr or T) , methionine (Met or M) , proline (Pro or P) , phenylalanine (Phe or F) , tyrosine (Tyr or Y) , tryptophan (Trp or W) , histidine (His or H) , lysine (Lys or K) , arginine (Arg or R) , aspartate (Asp or D) , glutamate (Glu or E) , asparagine (Asn or N) , and glutamine (Gln or Q) , and their natural analogs, such as canavanine, pyrrolysine (PYL) , selenocysteine, pyrroline-carboxy-lysine (PCL) , Sarcosine, beta-Alanine, phosphoserine, γ-carboxyglutamate, and ornithine. Examples of naturally occurring amino acid residues in their D stereoisomer include, for example, D-aspartate, D-Serine, D-Cysteine, D-Alanine, D-glutamate and so on.

[0061] An "amino acid analog" is a compound that has the same basic chemical structure as a naturally occurring amino acid, i.e., a carbon that is bound to a hydrogen, a carboxyl group, an amino group, and an R group, e.g., homoserine, norleucine, methionine sulfoxide, methionine methyl sulfonium. Such analogs can have modified R groups (e.g., norleucine) or modified peptide backbones, but will retain the same basic chemical structure as a naturally occurring amino acid.

[0062] A "non-natural" amino acid residue, as used herein, refers to any amino acid residues that are not found in nature, including without limitation, a modified amino acid residue, and / or an amino acid mimetic, which is not one of the known naturally occurring amino acids, yet functions in a manner similar to the naturally occurring amino acids. Modified amino acid or a mimetic can be generated by addition of a chemical entity such as a carbohydrate group, a phosphate group, a farnesyl group, an isofamesyl group, a fatty acid group, a linker for conjugation, functionalization, or other modification, etc. A non-natural amino acid can also refer to an amino acid manufactured by chemical synthesis. Exemplary non-natural amino acids include, but not limited to, 2-Aminoisobutyric acid (Aib) , imidazole-4-acetate (IA) , imidazolepropionic acid (IPA) , a-aminobutyric acid (Abu) , tert-butylglycine (Tle) , b-alanine, 3-aminomethyl benzoic acid, anthranilic acid, des-amino-histidine (abbreviated DesaminoHis, alternative name imidazopropionic acid, abbreviated lmpr) , the beta analogues of amino acids such as β-alanine, 2-amino-histidine, β-hydroxy-histidine, homohistidine, Nα-acetyl-histidine, α-fluoro-methyl-histidine, α-methyl-histidine, α,α-dimethyl-glutamic acid, m-CF3-phenylalanine, α, β-diaminopropionic acid (abbreviated Dap) , 3-pyridylalanine, 2-pyridylalanine or 4-pyridylalanine, (1-aminocyclopropyl) carboxylic acid, (1-aminocyclobutyl) -carboxylic acid, (1-aminocyclopentyl) carboxylic acid, (1-aminocyclohexyl) carboxylic acid, (1-aminocycloheptyl) carboxylic acid, and (1-aminocyclooctyl) carboxylic acid.

[0063] Introduction of non-natural amino acids into a polypeptide may be realized by the technology described in Wang et al., Science 292: 498-500, 2001; Deiters et al., J Am Chem Soc 125: 1 1782-1 1783, 2003; Wang and Schultz, Science 301 : 964-967, 2003; Zhang et al., Science 303: 371-373, 2004 or in US Patent No. 7, 083, 970. Briefly, some of these expression systems involve site-directed mutagenesis to introduce a stop codon, such as an amber (UAG) , ochre (UAA) , and opal (UGA) codons) into the open reading frame encoding a fusion polypeptide of the present disclosure. Other codons, such as a four-base codon (e.g. AGGA, AGGU, CGGU, CGCU, CGAU, CCCU, CUCU, CUAU, and GGGU) , a five-base codon, a six-base codon, etc. can also be introduced into the expression systems for non-natural amino acids. Such expression vectors are then introduced into a host that can utilize a tRNA specific for the introduced stop codon or other codons and carried with the non-natural amino acid of choice. For another example, non-natural amino acid can be chemically synthesized and inserted into or attached to a polypeptide by chemical reaction such as acylation.

[0064] “Percent (%) sequence identity” is defined as the percentage of amino acid (or nucleic acid) residues in a candidate sequence that are identical to the amino acid (or nucleic acid) residues in a reference sequence, after aligning the sequences and, if necessary, introducing gaps, to achieve the maximum number of identical amino acids (or nucleic acids) . In other words, percent (%) sequence identity of an amino acid sequence (or nucleic acid sequence) can be calculated by dividing the number of amino acid residues (or bases) that are identical relative to the reference sequence to which it is being compared by the total number of the amino acid residues (or bases) in the candidate sequence or in the reference sequence, whichever is shorter. Conservative substitution of the amino acid residues is not considered as identical residues. Alignment for purposes of determining percent amino acid (or nucleic acid) sequence identity can be achieved, for example, using publicly available tools such as BLASTN, BLASTp (available on the website of U.S. National Center for Biotechnology Information (NCBI) , see also, Altschul S.F. et al, J. Mol. Biol., 215: 403–410 (1990) ; Stephen F. et al, Nucleic Acids Res., 25: 3389–3402 (1997) ) , ClustalW2 (available on the website of European Bioinformatics Institute, see also, Higgins D.G. et al, Methods in Enzymology, 266: 383-402 (1996) ; Larkin M. A. et al, Bioinformatics (Oxford, England) , 23 (21) : 2947-8 (2007) ) , and ALIGN or Megalign (DNASTAR) software. Those skilled in the art may use the default parameters provided by the tool, or may customize the parameters as appropriate for the alignment, such as for example, by selecting a suitable algorithm.

[0065] A “conservative substitution” with reference to amino acid sequence refers to replacing an amino acid residue with a different amino acid residue having a side chain with similar physiochemical properties. For example, conservative substitutions can be made among amino acid residues with hydrophobic side chains (e.g. Met, Ala, Val, Leu, and Ile) , among residues with neutral hydrophilic side chains (e.g. Cys, Ser, Thr, Asn and Gln) , among residues with acidic side chains (e.g. Asp, Glu) , among amino acids with basic side chains (e.g. His, Lys, and Arg) , or among residues with aromatic side chains (e.g. Trp, Tyr, and Phe) . As known in the art, conservative substitution usually does not cause significant change in the protein conformational structure, and therefore could retain the biological activity of a protein.

[0066] The term “functional form” as used herein, refers to different forms (such as variants, fragments, fusions, derivatives and mimetics) of the parent molecule, which, despite of having difference in amino acid sequences or in chemical structures, still retains substantial biological activity of the parent molecule. The expression “retain substantial biological activity” , as used herein, means exhibiting at least part of (for example, no less than about 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, or 90%) or all of the biological activity of the parent molecule. A functional form of a parent polypeptide may include both naturally-occurring variant forms and non-naturally occurring forms such as those obtained by recombinant methods or chemical synthesis. The functional forms may contain non-natural amino acid residues.

[0067] The term "variant" as used herein refers to a polypeptide having at least 70%sequence identity to the parent polypeptide. A variant may differ from the parent peptide by one or more amino acid residues. For example, a variant may have substitutions, additions, deletions, insertions, or truncations of one more amino acid residue of the parent polypeptide.

[0068] The term "fragment" as used herein refers to partial sequence of the parent polypeptide of any length. A fragment can still retain at least partial function of the parent polypeptide.

[0069] The term "derivative" as used herein refers to a chemically modified polypeptide or fusion polypeptide, in which one or more well-defined number of substituent groups have been covalently attached to one or more specific amino acid residues of the polypeptide or fusion polypeptide. Exemplary chemical modification can be, e.g. alkylation, acylation, esterification, amidation, phosphorylation, glycosylation, labeling, methylation of one or more amino acids, or conjugation with one or more moieties.

[0070] The term "mimetics" as used herein refers to molecular structures that serve as substitutes for amino acids, peptides, polypeptides, or fusion polypeptide. For example, amino acid mimetics, as used herein, can be synthetic structures (either known or yet unknown) , which may or may not be an amino acid, but retain the functional features of the parent amino acids while the structure of the amino acid mimetic is different from the structure of the parent amino acid. Examples include a methacryloyl or acryloyl derivative of an amide, β-, γ-, δ-imino acids (such as piperidine-4-carboxylic acid) and the like.

[0071] “Treating” or “treatment” of a condition as used herein includes preventing or alleviating a condition, slowing the onset or rate of development of a condition, reducing the risk of developing a condition, preventing or delaying the development of symptoms associated with a condition, reducing or ending symptoms associated with a condition, generating a complete or partial regression of a condition, curing a condition, or some combination thereof.

[0072] The term “vector” as used herein refers to a vehicle into which a polynucleotide encoding a protein may be operably inserted so as to bring about the expression of that protein. A vector may be used to transform, transduce, or transfect a host cell so as to bring about expression of the genetic element it carries within the host cell. Examples of vectors include plasmids, phagemids, cosmids, artificial chromosomes such as yeast artificial chromosome (YAC) , bacterial artificial chromosome (BAC) , or P1-derived artificial chromosome (PAC) , bacteriophages such as lambda phage or M13 phage, and animal viruses. Categories of animal viruses used as vectors include retrovirus (including lentivirus) , adenovirus, adeno-associated virus, herpesvirus (e.g., herpes simplex virus) , poxvirus, baculovirus, papillomavirus, and papovavirus (e.g., SV40) . A vector may contain a variety of elements for controlling expression, including promoter sequences, transcription initiation sequences, enhancer sequences, selectable elements, and reporter genes. In addition, the vector may contain an origin of replication. A vector may also include materials to aid in its entry into the cell, including but not limited to a viral particle, a liposome, or a protein coating. A vector can be an expression vector or a cloning vector. The present disclosure provides vectors (e.g., expression vectors) containing the nucleic acid sequence provided herein encoding the fusion polypeptide, at least one promoter (e.g., SV40, CMV, EF-1α) operably linked to the nucleic acid sequence, and at least one selection marker. Examples of vectors include, but are not limited to, retrovirus (including lentivirus) , adenovirus, adeno-associated virus, herpesvirus (e.g., herpes simplex virus) , poxvirus, baculovirus, papillomavirus, papovavirus (e.g., SV40) , lambda phage, and M13 phage, plasmid pcDNA3.3, pMD18-T, pOptivec, pCMV, pEGFP, pIRES, pQD-Hyg-GSeu, pALTER, pBAD, pcDNA, pCal, pL, pET, pGEMEX, pGEX, pCI, pEGFT, pSV2, pFUSE, pVITRO, pVIVO, pMAL, pMONO, pSELECT, pUNO, pDUO, Psg5L, pBABE, pWPXL, pBI, p15TV-L, pPro18, pTD, pRS10, pLexA, pACT2.2, pCMV-SCRIPT. RTM., pCDM8, pCDNA1.1 / amp, pcDNA3.1, pRc / RSV, PCR 2.1, pEF-1, pFB, pSG5, pXT1, pCDEF3, pSVSPORT, pEF-Bos etc.

[0073] The phrase “host cell” as used herein refers to a cell into which an exogenous polynucleotide and / or a vector has been introduced.

[0074] The term “pharmaceutically acceptable” indicates that the designated carrier, vehicle, diluent, excipient (s) , and / or salt is generally chemically and / or physically compatible with the other ingredients comprising the formulation, and physiologically compatible with the recipient thereof.

[0075] The term “subject” or “individual” or “animal” or “patient” as used herein refers to human or non-human animal, including a mammal or a primate, in need of diagnosis, prognosis, amelioration, prevention and / or treatment of a disease or disorder. Mammalian subjects include humans, domestic animals, farm animals, and zoo, sports, or pet animals such as dogs, cats, guinea pigs, rabbits, rats, mice, horses, swine, cows, bears, and so on.

[0076] Polypeptide Conjugates

[0077] In one aspect, the present disclosure provides a polypeptide conjugate comprising: a GLP-1 peptide and a clearance-reducing moiety (CRM) conjugated to a CRM residue in the GLP-1 peptide.

[0078] The term “peptide” and "polypeptide" are used interchangeably herein and refer a polymer of amino acid residues linked by covalent bonds such as peptide bonds. A peptide or polypeptide as provided herein can comprise naturally occurring or non-natural amino acid residues, or both. Polypeptides and peptides provided herein can comprise any suitable length of amino acid residues, for example, from at least 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, or more amino acid residues in length.

[0079] The term “clearance-modifying moiety” or “CRM” as used herein refers to moiety that can alter one or more pharmacokinetic (PK) properties (for example, to increase the half-life in vivo) . Examples of CRMs can include, without limitation, fatty acid, polyethylene glycol (PEG) , glucuronic acid or other sugar based linkers, polar, positively or negatively charged groups that can increase the rates of hydrolysis of a succinimidyl ring and reduce or minimize the rate of reverse Michael reaction, therefore reduce or minimize the rate of loss of drug and the linker group from the biologically active peptide to other thiol-containing proteins and small molecules.

[0080] “CRM residue” as used herein refers to the amino acid residue that is conjugated to a CRM.

[0081] The term “conjugate” as used herein refers to a compound as a result of two or more molecules joined together to form one physical entity. For example, the conjugate of the present disclosure means a compound as a result of the polypeptide and one or more clearance-modifying moieties joined together. The molecules may attach together by covalent, non-covalent bonds, linkers, chemical modification, or protein fusion or by any means known to one skilled in the art. Preferably, the molecules may attach together by covalent bonds. The joining may be permanent or reversible. In some embodiments, certain cleavable or non-cleavable linkages may be included.

[0082] While conjugation of a CRM to a GLP-1 peptide may extend half-life of the GLP-1 peptide, it could also adversely affect the biological activity of the GLP-1 peptide, rendering it less active than the unconjugated counterpart. For example, semaglutide, a conjugated GLP-1 derivative which has a C18 fatty acid conjugated to K26 of GLP-1 (8Aib, 36R) , has a significantly extended half-life, but suffers from a 939-fold loss in GLP-1 receptor binding in presence of human serum albumin (HSA) relative to its unconjugated counterpart (J. Med. Chem. 2015, 58, 7370-7380) . Since HSA is present in human blood and is unavoidable under physiological conditions, reduction in GLP-1 receptor agonist activity in the presence of HSA is believed to compromise therapeutic activity of the protein conjugates.

[0083] It is unexpectedly found by the inventors that, the compromised GLP-1 receptor binding and / or activation can be enhanced by introducing a mutation of 22E to the amino acid sequence of the GLP-1 peptide. This finding is surprising because such effect of 22E mutation has not been reported, and is not observed for many GLP-1 peptide conjugates such as semaglutide. The inventors unexpected found that, certain CRM-conjugated polypeptide comprising GLP-1 peptide conjugated to C20 fatty acids can have both an extended half-life and retained biological activity, after introducing a mutation of 22E to the amino acid sequence of the GLP-1 peptide.

[0084] Such unexpected effects are found to be associated with certain CRMs. The inventors tested GLP-1 peptides conjugated to fatty acids of various chain lengths (e.g. C16 fatty acid, C18 fatty acid, C20 fatty acid, C22 fatty acid) and found surprisingly that, the improved GLP-1 activity due to 22E mutation only happened with the CRM conjugation having a C20 fatty acid chain.

[0085] In certain embodiments, the polypeptide conjugates provided herein comprise a C20 fatty acid chain. In certain embodiments, the C20 fatty acid chain comprise the structure below:

[0086] In such embodiments, the polypeptide conjugates provided herein have a mutation of 22E (the numbering is relative to natural GLP-1 (7-37) ) .

[0087] In certain embodiments, the polypeptide conjugates provided herein can retain most of the GLP-1 activity in the presence of HSA despite of CRM conjugation.

[0088] In some embodiments, the GLP-1 in the polypeptide conjugates provided herein comprises an amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NOs: 3-16. In certain embodiments, the GLP-1 in the polypeptide conjugates comprises or consists of an amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 (8Aib, 22E, 34R) .

[0089] In certain embodiments, the polypeptide conjugates provided herein binds to HSA at a binding affinity (KD) comparable to (e.g. from about 70%to about 150%of) that of semaglutide, as determined in the same or comparable assay.

[0090]

[0091] In some of these embodiments, the polypeptide conjugates provided herein has increased GLP-1 activity in the presence of human serum albumin (HSA) , relative to its 22G counterpart that is otherwise identical to the polypeptide conjugate except for having glycine residue at position 22 (the numbering is relative to natural GLP-1 (7-37) ) . In certain embodiments, the polypeptide conjugates provided herein has at least 5%, 10%, 15, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, or 50%increase in GLP-1 activity in the presence of HSA, relative to its 22G counterpart, as measured under equivalent assay conditions.

[0092] In some of these embodiments, the polypeptide conjugates provided herein has a longer-acting efficacy relative to its C18 counterpart that is otherwise identical to the polypeptide conjugate except that CRM in the conjugate comprise an acidic group having a formula:  wherein g is an integer of 16. In certain embodiments, the efficacy of polypeptide conjugates provided herein lasts for at least 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200%of the period during which its C18 counterpart shows a comparable efficacy profile.

[0093] In some of these embodiments, the polypeptide conjugates provided herein have both i) comparable or increased GLP-1 activity in the presence of human serum albumin (HSA) and ii) longer-acting efficacy, relative to its 22G and C18 counterpart that is otherwise identical to the polypeptide conjugate except for: i) having glycine residue at position 22 (the numbering is relative to natural GLP-1 (7-37) ) and ii) comprising an acidic group having a formula:  wherein g is an integer of 16. In certain embodiments, relative to its 22G and C18 counterpart, the polypeptide conjugates provided herein has at least 5%, 10%, 15, or 20%increase in GLP-1 activity in the presence of HSA and has an efficacy that lasts for at least 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200%of the period during which its 22G and C18 counterpart shows a comparable efficacy profile.

[0094] In some of these embodiments, the polypeptide conjugates provided herein has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3. In some of these embodiments, the polypeptide conjugates provided herein has the CRM comprising the structure of below formula:

[0095] In some of these embodiments, the polypeptide conjugates provided herein comprise the structure of the following formula, and its 22G and C18 counterpart is semaglutide:

[0096] In certain embodiments, the polypeptide conjugates provided herein has blood or plasma or serum concentrations that remain within therapeutic window for the polypeptide conjugate for a period at least about 50%longer (60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 120%, 150%, 180%, 200%, 300%, or 400%longer) that of a comparative polypeptide conjugate having a CRM with a shorter fatty acid chain, such as semaglutide, as determined under comparable in vivo study conditions and in the same type of experimental animals.

[0097] In certain embodiments, the polypeptide conjugates provided herein has enhanced pharmacokinetic properties in comparison to a comparative polypeptide conjugate having a CRM with a shorter fatty acid chain, such as semaglutide, wherein the pharmacokinetic properties are determined by measuring blood concentration of the polypeptide conjugate after administration of a therapeutically effective dose to a subject.

[0098] In certain embodiments, the polypeptide conjugates provided herein has an increase in terminal half-life by at least about 20%longer (30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 120%, 150%, 180%, 200%, 300%, or 400%longer) that of a comparative polypeptide conjugate having a CRM with a shorter fatty acid chain, such as semaglutide, as determined under comparable in vivo study conditions and in the same type of experimental animals. Suitable animals for terminal half-life determination include for example rats, minipigs, dogs or monkeys. In certain embodiments, the terminal half-life is determined in a suitable animal after a single dose intravenous administration at a dose suitable for providing therapeutic efficacy.

[0099] In certain embodiments, the polypeptide conjugates provided herein provides for an extended duration of therapeutic efficacy in comparison with a comparative polypeptide conjugate having a CRM with a shorter fatty acid chain, such as semaglutide, as determined under comparable in vivo study conditions and in the same type of experimental animals. In certain embodiments, the extended duration of therapeutic efficacy can be characterized by area under curve (AUC) for time-response curve, which can be plotted after a single dose that are suitable for providing an intended therapeutic effect. The extended therapeutic efficacy duration can also be characterized by the duration or intensity of the therapeutic response (e.g. reduction in body weight, or reduction in glucose level) , which can be plotted after a single dose or after repeated doses that are suitable for providing an intended therapeutic effect in a subject in need thereof.

[0100] In certain embodiments, the therapeutic response comprises reduction in body weight, reduction in food intake, or reduction in glucose level (fasting glucose level or non-fasting glucose level) .

[0101] In certain embodiments, the AUC is for the curve of time versus blood glucose level, or the curve of time versus food intake level. In such embodiments, the polypeptide conjugates provided herein has an decrease in the AUC for the time-response curve by at least 30%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 120%, 150%, 180%, 200%than that of a comparative polypeptide conjugate having a CRM with a shorter fatty acid chain, such as semaglutide, as determined under comparable in vivo study conditions and in the same type of experimental animals. In certain embodiments, the AUC is for the curve of time versus body weight reduction level (delta body weight) . In such embodiments, the polypeptide conjugates provided herein has an increase in the AUC for the time-response curve by at least 30%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 120%, 150%, 180%, 200%than that of a comparative polypeptide conjugate having a CRM with a shorter fatty acid chain, such as semaglutide, as determined under comparable in vivo study conditions and in the same type of experimental animals. In certain embodiments, the polypeptide conjugates provided herein has an increase in duration or intensity of the therapeutic response by at least 30%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 120%, 150%, 180%, 200%, 300%, or 400%than that of a comparative polypeptide conjugate having a CRM with a shorter fatty acid chain, such as semaglutide, as determined under comparable in vivo study conditions and in the same type of experimental animals.

[0102] In certain embodiments, the experimental animals for therapeutic response are disease model animals such as db / db mice, or diet-induced obese (DIO) animals.

[0103] GLP-1 peptide

[0104] The term "Glucagon-like peptide-1” or “GLP-1” as used herein is intended to broadly encompasses native GLP-1 peptide and all its functional forms such as its functional variants, fragments, fusions, derivatives and mimetics.

[0105] The term "native GLP-1 peptide" as used herein refers to the native human Glucagon-Like Peptide-1 (GLP-1 (7-37) ) , the sequence of which is set forth in SEQ ID NO: 1. As used herein, when referring to a particular amino acid residue in SEQ ID NO: 1 (i.e. GLP-1 (7-37) ) , the numbering of the GLP-1 (1-37) is followed. In other words, SEQ ID NO: 1 corresponds to GLP-1 (7-37) , and therefore the 1st residue (which is Histidine (H) ) in SEQ ID NO: 1 is referred to as 7H, meaning that it corresponds to the 7th residue in GLP (1-37) ; and the 31st residue (which is Glycine (G) ) in SEQ ID NO: 1 is referred to as 37G, meaning corresponds to the 37th residue in GLP (1-37) .

[0106] A functional form of the native GLP-1 peptide is capable of activating the GLP-1 receptor at a level comparable to, or no less than about 20% (or no less than 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%) of, that of the native GLP-1 peptide. Activation of the GLP-1 receptor typically initiates signal transduction pathway resulting in insulinotropic action or other physiological effects as is known in the art. Functional forms of the native GLP-1 peptide can contain one or more substitutions, additions, or deletions relative to SEQ ID NO: 1. Many functional forms of native GLP-1 peptide are known in the art, for example, without limitation, liraglutide, semaglutide, dulaglutide, albiglutide, and those disclosed in WO2000055203A1, WO 98 / 08871, WO 2006 / 097537, the disclosure of which is incorporated herein to its entirety.

[0107] In certain embodiments, the GLP-1 provided herein comprises an amino acid sequence having at least 70% (e.g. at least 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%) sequence identity to SEQ ID NO: 1 while retaining substantial biological activity of SEQ ID NO: 1.

[0108] In certain embodiments, the GLP-1 comprises no more than 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, or 2 mutations (e.g. addition, deletion, substitution) relative to SEQ ID NO: 1 while retaining substantial biological activity of SEQ ID NO: 1. In certain embodiments, the GLP-1 comprises at least 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, or 9 mutations (e.g. addition, deletion, substitution) relative to SEQ ID NO: 1 while retaining substantial biological activity of SEQ ID NO: 1.

[0109] One of ordinary skill in the art will appreciate that various amino acid substitutions, e.g., conservative amino acid substitutions, may be made in the sequence of any of the polypeptide fragment described herein, without necessarily decreasing its activity. Examples of amino acid substitutions include substituting an L-amino acid for its corresponding D-amino acid, substituting cysteine for homocysteine or other non-natural amino acids having a thiol-containing side chain, substituting a lysine for homolysine, diaminobutyric acid, diaminopropionic acid, ornithine or other non-national amino acids having an amino containing side chain, or substituting an alanine for norvaline or the like.

[0110] Various substitutions have been introduced to native GLP-1 peptide, and have been shown to be capable of retaining or even improving its biological activities. In certain embodiments, the GLP-1 comprises or consists of one or more mutations at a position selected from the group consisting of: A8, G22, Q23, E27, K26, A30, K34, R36, and H7, and or any combination thereof. In certain embodiments, the one or more substitutions comprises a conservative substitution. As used herein, the numbering of the residues in GLP-1 is referred to with reference to the 31 amino-acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, which is also known as GLP-1 (7-37) , where residue 7 is Histidine (H7, i.e. the first residue in SEQ ID NO: 1) and residue 37 is Glycine (G37, i.e. the last residue in SEQ ID NO: 1) .

[0111] In certain embodiments, the GLP-1 comprises or consists of one or more substitutions selected from the group consisting of: A8Aib, K26R, G22E, E27K, K34R, and R36G, or any combination thereof.

[0112] In certain embodiments, the GLP-1 comprises an amino acid sequence of X7X8EGTFTSDVSSYLEEX23AAX26X27FIX30WLVX34GX36G (SEQ ID NO: 2) , wherein: X7 is H, X8 is G or Aib, the X23 is Q or K, the X26 is K, or R; the X27 is E or K; the X30 is A or K, the X34 is K or R and the X36 is R or G.

[0113] In certain embodiments, the GLP-1 comprises an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 3-16.

[0114] In certain embodiments, the GLP-1 comprises no more than one lysine residue.

[0115] In certain embodiments, the GLP-1 comprises an amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 3 (8Aib, 22E, 34R) , SEQ ID NO: 4 (8Aib, 22E, 34R, 36G) , SEQ ID NO: 5 (8Aib, 22E, 26R, 27K, 34R, 36G) , SEQ ID NO: 6 (8Aib, 22E, 26R, 34R, 36G) , SEQ ID NO: 7 (8Aib, 22E, 26R, 27K, 34R, ) , SEQ ID NO: 8 (8Aib, 22E, 26R, 34R, ) , SEQ ID NO: 9 (8G, 22E, 34R, 36G) , SEQ ID NO: 10 (8G, 22E, 26R, 27K, 34R, 36G) , SEQ ID NO: 11 (8G, 22E, 26R, 34R, 36G) , SEQ ID NO: 12 (8G, 22E, 34R) , SEQ ID NO: 13 (8G, 22E, 27K, 34R) , SEQ ID NO: 14 (8G, 22E, 26R, 34R) , SEQ ID NO: 15 (8G, 22E, 26R, 36G) , SEQ ID NO: 16 (8G, 22E, 36G) .

[0116] In certain embodiments, the GLP-1 comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 3.

[0117] CRM residue

[0118] In certain embodiments, the CRM residue is lysine residue, and the polypeptide conjugate comprises only one lysine residue.

[0119] In certain embodiments, the CRM residue is selected from the group consisting of K23, K26, K27, K30 and K34.

[0120] In certain embodiments, the naturally occurring residue found in the native GLP-1 sequence, namely K26 and K34, can be substituted to non-lysine residues. In certain embodiments, the GLP-1 comprises substitution of K26, which is selected from the group consisting of K26R, K26Q, K26A, K26G, K26H, K26S, and K26T. In certain embodiments, the GLP-1 comprises, or further comprises, substitution of K34 which is selected from the group consisting of K34R, K34Q, K34A, K34G, K34H, K34S, and K34T. In certain embodiments, the substitution of K26 is selected from K26R and K26Q, and / or the substitution at K34 is selected from K34R and K34Q. Throughout the specification, when K residue is present in GLP-1, the position of K is identified in reference to the amino acid sequence of GLP-1 (1-37) . For example, K26 indicates that the 26th position in reference to the amino acid sequence of GLP-1 (1-37) (which corresponds to the 20th position in reference to the amino acid sequence of GLP-1 (7-37) , i.e. SEQ ID NO: 1) is K. Similarly, K34 indicates that the 34th position in reference to the amino acid sequence of GLP-1 (1-37) (which corresponds to the 28th position in reference to the amino acid sequence of GLP-1 (7-37) , i.e. SEQ ID NO: 1) is K.

[0121] In certain embodiments, the CRM residue is K26.

[0122] In certain embodiments, the GLP-1 may further comprises one or more additional mutations at a position selected from the group consisting of: A8, G22, E27, R36, and H7, and or any combination thereof. In certain embodiment, the GLP-1 comprises K26R and K34R. In certain embodiments, the GLP-1 comprises an amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 3 (8Aib, 22E, 34R) , SEQ ID NO: 4 (8Aib, 22E, 34R, 36G) , SEQ ID NO: 5 (8Aib, 22E, 26R, 27K, 34R, 36G) , SEQ ID NO: 6 (8Aib, 22E, 26R, 34R, 36G) , SEQ ID NO: 7 (8Aib, 22E, 26R, 27K, 34R, ) , SEQ ID NO: 8 (8Aib, 22E, 26R, 34R, ) , SEQ ID NO: 9 (8G, 22E, 34R, 36G) , SEQ ID NO: 10 (8G, 22E, 26R, 27K, 34R, 36G) , SEQ ID NO: 11 (8G, 22E, 26R, 34R, 36G) , SEQ ID NO: 12 (8G, 22E, 34R) , SEQ ID NO: 13 (8G, 22E, 27K, 34R) , SEQ ID NO: 14 (8G, 22E, 26R, 34R) , SEQ ID NO: 15 (8G, 22E, 26R, 36G) , SEQ ID NO: 16 (8G, 22E, 36G) .

[0123] In certain embodiments, the CRM residue is a non-natural amino acid residue, and the polypeptide conjugate comprises only one non-natural amino acid residue as the CRM residue. Non-natural amino acid can contain a variety of functional groups or reactive groups, which can provide for additional functions and / or reactivity. Particular non-natural amino acids that are beneficial for purpose of conjugating moieties to the fusion polypeptides of the present disclosure include those with a side chain having azide, alkyne, alkene, cycloalkyne or halide.

[0124] CRM

[0125] In certain embodiments, the CRM comprises a plasma protein-binding moiety, a polymer, Fc, human serum albumin (HSA) and functional fragments thereof, Xten sequence, or PAS sequence. In certain embodiments, the Xten sequence is an extended recombinant polypeptide sequence with an amino acid sequence described in WO2007103515, WO2009023270, WO2010091122, WO2011123813, WO2013130683, WO2017146979, WO2011084808, WO2013040093, WO2013122617, WO2014011819, WO2013184216, WO2014164568, WO2015023891, WO2016077505 and WO2017040344, disclosures of which have been incorporated by their entirety. In certain embodiments, the term “PAS” , which can also be used interchangeable with the term “APS” , refers to an amino acid repeats consisting of Ala, Ser, and Pro residues, as described in US8563521 B2, disclosure of which has been incorporated by its entirety.

[0126] In certain embodiments, the CRM comprises an albumin-binding moiety. The term “albumin-binding moiety” refers to any functional moiety that is capable of binding albumin (e.g. human serum albumin) or any functional fragment thereof with sufficient specificity, preferably non-covalently. The albumin-binding moiety attached to a therapeutic fusion polypeptide, polypeptide, or polypeptide complex typically has an affinity below 10 μM to human serum albumin and preferably below 1 pM. The albumin-binding moiety can include, without limitation, an albumin-binding domain, an albumin-binding sequences from synthetic peptides, and an albumin-binding chemical moiety. For example, the albumin-binding moiety is selected from an albumin-binding domain from streptococcal protein G, an albumin-binding domain from Peptostreptococcus magnus protein PAB. A number of small peptides which are albumin binding moieties have been described in J. Biol Chem. 277, 38 (2002) 35035-35043. For another example, the albumin-binding moiety is selected from linear and branched lipohophillic moieties containing 4-40 carbon atoms, compounds with a cyclopentanophenanthrene skeleton etc. For example, the albumin-binding moiety is a group of the formula CH3 (CH2) vCO-NHCH (COOH) (CH2) 2CO-, wherein v is an integer of from 10 to 24.

[0127] In certain embodiments, the albumin-binding moiety comprises a structure of: *-A-B-C-D, wherein A, B, C and D are interconnected via amide bonds, and the *end of A is connected to a reactive group of the conjugatable residue in the polypeptide complex, and wherein: A is selected from a bond,  a, b, c  and d are independently an integer from 0 to 4, R1 is hydrogen or –COOH; B is selected from a bond,  e is an integer from 1 to 4, wherein position α is linked to position α’ , C is a bond or R2 is –CH2SO3H or –COOH, f is an integer from 1 to 4, n  is an integer from 1 to 25, wherein when B is not bond, then position β’ is linked to position β, or when B is bond, then position β’ is linked to position α’; D is an acidic group having a formula: wherein g is 18, R6 is hydroxyl; and wherein: when C is not a bond, then position δ is linked to position γ, when B is not a bond, C is a bond, then position δ is linked to position β, when A is not a bond, and both of B and C are bond, then position δ is linked to position α’.

[0128] In such embodiments, the CRM comprises the structure of below formula (also referred to as HOOC- (CH2) 18-CO-gGlu-2XADO) :

[0129] Conjugates

[0130] In certain embodiments, the polypeptide conjugate comprises or consists of an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 3-16.

[0131] In certain embodiments, the polypeptide conjugate provided herein comprises an amino acid sequence selected from a group consisting of: SEQ ID NOs: 3-16, and a CRM attached to the lysine residue. In certain embodiments, the CRM comprises the structure of HOOC- (CH2) 18-CO-gGlu-2XADO.

[0132] In certain embodiments, the polypeptide conjugate provided herein comprises an amino acid sequence of: SEQ ID NO: 3, and a CRM attached to the lysine residue, the CRM comprises the structure of HOOC- (CH2) 18-CO-gGlu-2XADO.

[0133] In certain embodiments, the polypeptide conjugate comprises a structure shown below, where the amino acid residues are represented as one letter abbreviations in circles:

[0134] Method of improving potency

[0135] The present disclosure provides a method of improving potency of a GLP-1 peptide conjugate, the method comprising introducing a mutation of 22E to the amino acid sequence of the GLP-1 peptide conj ugate, wherein the numbering is relative to natural GLP-1 (7-37) , and wherein the GLP-1 peptide conjugate comprises a GLP-1 peptide and a clearance-reducing moiety (CRM) conjugated to the GLP-1 peptide through a CRM residue, wherein the CRM residue is lysine residue selected from the group consisting of K23, K26, K27, K30 and K34; and wherein the CRM comprises the structure of below formula:

[0136] In certain embodiments, the GLP-1 peptide comprises or consists of an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 3-16.

[0137] In certain embodiments, the polypeptide conjugate provided herein comprises an amino acid sequence of: SEQ ID NO: 3.

[0138] In certain embodiments, the CRM residue is K26.

[0139] In certain embodiments, the polypeptide conjugates provided herein has a comparable or acceptable GLP-1 activity in the presence of HSA, compared to a comparative polypeptide conjugate having a CRM with a shorter fatty acid chain, such as semaglutide, as determined under comparable in vivo study conditions and in the same type of experimental animals.

[0140] In certain embodiments, the polypeptide conjugates provided herein has an increase in terminal half-life by at least 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 120%, 150%, 180%, 200%, 300%, 400%than that of a comparative polypeptide conjugate having a CRM with a shorter fatty acid chain, such as semaglutide, as determined under comparable in vivo study conditions and in the same type of experimental animals.

[0141] Method of preparation

[0142] The present disclosure provides isolated nucleic acids or polynucleotides that encode the polypeptide portion (or a fragment thereof) of the polypeptide conjugates provided herein.

[0143] The term “nucleic acid” or “polynucleotide” as used herein refers to deoxyribonucleic acids (DNA) or ribonucleic acids (RNA) and polymers thereof in either single-or double-stranded form. Unless specifically limited, the term encompasses polynucleotides containing known analogues of natural nucleotides that have similar binding properties as the reference nucleic acid and are metabolized in a manner similar to naturally occurring nucleotides. Unless otherwise indicated, a particular polynucleotide sequence also implicitly encompasses conservatively modified variants thereof (e.g., degenerate codon substitutions) , alleles, orthologs, SNPs, and complementary sequences as well as the sequence explicitly indicated. Specifically, degenerate codon substitutions may be achieved by generating sequences in which the third position of one or more selected (or all) codons is substituted with mixed-base and / or deoxyinosine residues (see Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19: 5081 (1991) ; Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260: 2605-2608 (1985) ; and Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8: 91-98 (1994) ) .

[0144] The nucleic acids or polynucleotides encoding the polypeptide provided herein (or fragment thereof) can be constructed using recombinant techniques. To this end, DNA encoding the GLP-1 receptor agonist (such as GLP-1) can be obtained and operably linked to allow transcription and expression in a host cell to produce the polypeptide. If needed, polynucleotide sequences encoding for one or more linkers are also operably linked to allow expression of the desired product.

[0145] The encoding polynucleotide sequences can be further operably linked to one or more regulatory sequences, optionally in an expression vector, such that the expression or production of the fusion polypeptides or polypeptide complexes is feasible and under proper control.

[0146] The encoding polynucleotide sequence (s) can be inserted into a vector for further cloning (amplification of the DNA) or for expression, using recombinant techniques known in the art. Many vectors are available. The vector components generally include, but are not limited to, one or more of the following: a signal sequence, an origin of replication, one or more marker genes, an enhancer element, a promoter (e.g. prokaryotic promoters such as T7, T7lac, Sp6, araBAD, trp, lac, tac, pLm, A3, lac, lpp, npr, pac, syn, trc and T3, or eukaryotic promoters such as SV40, CMV, and EF-1α) , and a transcription termination sequence.

[0147] Vectors and host cells

[0148] In another aspect, the present disclosure provides a vector comprising the polynucleotide provided herein.

[0149] Vectors comprising the polynucleotide sequence (s) provided herein can be introduced to a host cell for cloning or gene expression. The phrase “host cell” as used herein refers to a cell into which an exogenous polynucleotide and / or a vector has been introduced. In other embodiments, the vectors are extra-chromosomal. The host cells can be isolated if desired. In certain embodiments, the host cell is a prokaryotic cell or eukaryotic cell.

[0150] Suitable host cells for cloning or expressing the DNA in the vectors herein are mainly prokaryotes. Suitable prokaryotes for this purpose include eubacteria, such as Gram-negative or Gram-positive organisms, for example, Enterobacteriaceae such as Escherichia, e.g., E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, e.g., Salmonella typhimurium, Serratia, e.g., Serratia marcescans, and Shigella, as well as Bacilli such as B. subtilis and B. licheniformis, Pseudomonas such as P. aeruginosa, and Streptomyces. In some embodiments, host cells are eukaryotes, such as yeast and mammalian cells (e.g., immortalized mammalian cells) .

[0151] A vector comprising the polynucleotide sequence (s) provided herein can be introduced into a host cell using any suitable method known to a skilled person in the art, e.g., transformation, transfection or transduction. In one example, the polynucleotide sequence encoding the GLP-1 polypeptide can be subcloned into an expression vector, which is expressed as inclusion bodies in the host cells. The vector can be a viral vector, and any suitable viral vector can be used in this capacity.

[0152] In another aspect, the present disclosure provides a host cell comprising the vector provided herein. The host cell is prokaryotic cell or a eukaryotic cell. Host cells transformed with the above-described expression or cloning vectors can be cultured in conventional nutrient media modified as appropriate for inducing promoters, selecting transformants, or amplifying the cloning vectors.

[0153] In another aspect, the present disclosure provides a method of producing the polypeptide conjugates provided herein, comprising culturing the host cell provided herein under a condition that allows expression of the polynucleotide provided herein to obtain the polypeptide portion of the polypeptide conjugate.

[0154] For production of the polypeptide portion provided herein, the host cells transformed with the expression vector may be cultured in a variety of media. Commercially available bacteria growth media such as Terrific Broth, LB Broth, LB Agar, M9 minimal media, MagiaMedia Medium, and ImMedia Medium (ThermoFisher) are suitable for culturing the bacterial host cells. Commercially available media such as Ham's F10 (Sigma) , Minimal Essential Medium (MEM) , (Sigma) , RPMI-1640 (Sigma) , and Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) , Sigma) are suitable for culturing the eukaryotic host cells. Any of these media may be supplemented as necessary with hormones and / or other growth factors (such as insulin, transferrin, or epidermal growth factor) , salts (such as sodium chloride, calcium, magnesium, and phosphate) , buffers (such as HEPES) , nucleotides (such as adenosine and thymidine) , antibiotics (such as GENTAMYCINTM drug) , trace elements (defined as inorganic compounds usually present at final concentrations in the micromolar range) , and glucose or an equivalent energy source. Any other necessary supplements may also be included at appropriate concentrations that would be known to those skilled in the art. The culture conditions, such as temperature, pH, and the like, are those previously used with the host cell selected for expression, and will be apparent to the ordinarily skilled artisan.

[0155] In one aspect, the present disclosure provides a method of expressing the polypeptide portion of the polypeptide conjugates provided herein, comprising culturing the host cell provided herein under the condition at which the polypeptide portion is expressed. In certain embodiments, the polypeptide portion is expressed as a soluble polypeptide.

[0156] When using recombinant techniques, the polypeptide provided herein can be produced intracellularly, in the periplasmic space, or directly secreted into the medium. If the product is produced intracellularly, as a first step, the particulate debris, either host cells or lysed fragments, is removed, for example, by centrifugation or ultrafiltration. Carter et al., Bio / Technology 10: 163-167 (1992) describe a procedure for isolating proteins which are secreted to the periplasmic space of E. coli. Briefly, cell paste is thawed in the presence of sodium acetate (pH 3.5) , EDTA, and phenylmethylsulfonylfluoride (PMSF) over about 30 min. Cell debris can be removed by centrifugation. Where the product is secreted into the medium, supernatants from such expression systems are generally first concentrated using a commercially available protein concentration filter, for example, an Amicon or Millipore Pellicon ultrafiltration unit. A protease inhibitor such as PMSF may be included in any of the foregoing steps to inhibit proteolysis and antibiotics may be included to prevent the growth of adventitious contaminants.

[0157] In certain embodiments, the method further comprises isolating the polypeptide.

[0158] The polypeptide provided herein prepared from the cells can be purified using, for example, hydroxylapatite chromatography, gel electrophoresis, dialysis, DEAE-cellulose ion exchange chromatography, ammonium sulfate precipitation, salting out, and affinity chromatography.

[0159] Other techniques for protein purification such as fractionation on an ion-exchange column, ethanol precipitation, Reverse Phase HPLC, chromatography on silica, chromatography on heparin SEPHAROSETM chromatography on an anion or cation exchange resin (such as a polyaspartic acid column) , chromatofocusing, SDS-PAGE, and ammonium sulfate precipitation are also available depending on the protein to be recovered.

[0160] In certain embodiments, the method further comprises conjugating the CRM to the polypeptide. The polypeptide can be conjugated at, for example, the lysine residue, or the non-natural amino acid by a suitable conjugation reaction.

[0161] For example, the polypeptide having one or more CRM residues such as lysine may be reacted with an amino-reactive agent. In certain embodiments, the CRM is conjugated to the lysine residue via an acyl group in an acylation reaction. Exemplary methods of acylation reaction is described in, for example, WO2009083549 and WO2010029159, the content of which is incorporated herein to its entirety. The CRM to be conjugated in an acylation reaction may contain a carboxylic acid group, an α, ω-fatty diacid residue, an activated ester, or an activated N-hydroxy imide ester, among others. Examples of activated esters include, O-succinimide reagents like N-hydroxysuccinimidyl (NHS) or sulfo-NHS esters and imido ester compounds like Traut’s reagent, which can react with the ε-amino group of a conjugatable lysine residue to form amide or amidine bonds. Additional examples of suitable amino-reactive agent include, O-acylisourea, N-hydroxy trialzole esters, anhydride, phenyl active esters, P-hydroxamic active esters, acylimidazoles, acylbenzotriazoles, acyl azides, acid hylides, phophonium salts, aminium / uronium salts.

[0162] For example, the polypeptide having one or more CRM residues such as non-natural amino acid residue (NNAA) can be conjugated to a CRM such that a stable linkage can be formed between the NNAA of the fusion polypeptide and the CRM. For example, NNAAs containing keto group or aldehyde or β-diketomoieties can react with a hydrazide-or O-alkylhydroxylamine-, hydroxylamine-containing agents to form a hydrazone or an O-alkylated oxime linkage. For another example, NNAAs containing an azide group can react with an alkyne derivative to form a stable triazole linker by copper (I) catalyzed [3+2] cycloaddition (and vice versa) . For another example, NNAAs containing an azide group can be ligated with an appropriate water soluble phosphine-containing agent to form an amide linkage by a Staudinger ligation. Further, a thioester moiety in an NNAA can react with an amine-containing agent to form amide linkage. The fusion polypeptides provided herein incorporated with an NNAA can be conjugated with an agent via cycloaddition reactions, such as (4+2) cycloaddition between diene and dienophile (Diels-Alder reaction) , (3+2) cycloaddtion via 1, 3-dipolar Huisgen cycloaddition, and (3+2) cycloaddtion via Nitrone-olefin cycloaddition. Cycloaddition methods suitable for antibody conjugation have been described in, for example, WO05003294, US20120004183, WO06009901, WO07130453 and US Pat. 6,737,236.

[0163] For another example, the polypeptide may be conjugated to biotin, then indirectly conjugated to CRM that is conjugated to avidin. For still another example, the fusion polypeptide or the polypeptide complex may be linked to a coupling agent which further links to the CRM. Examples of the coupling agents include bifunctional moieties such as N-succinimidyl-3- (2-pyridyldithio) propionate (SPDP) , succinimidyl-4- (N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate (SMCC) , iminothiolane (IT) , bifunctional derivatives of imidoesters (such as dimethyl adipimidate HCl) , active esters (such as disuccinimidyl suherate) , aldehydes (such as glutaraldehyde) , bis-azido compounds (such as bis (p-azidobenzoyl) hexanediamine) , bis-diazonium derivatives (such as bis- (p-diazoniumbenzoyl) -ethylenediamine) , diisocyanates (such as toluene 2, 6-diisocyanate) , and his-active fluorine compounds (such as 1, 5-difluoro-2, 4-dinitrobenzene) . Particularly preferred coupling agents include N-succinimidyl-3- (2-pyridyldithio) propionate (SPDP) (Carlsson et al., Biochem. J. 173: 723-737 (1978) ) and N-succinimidyl-4- (2-pyridylthio) pentanoate (SPP) to provide for a disulphide linkage.

[0164] Additional methods for the conjugation of CRM to the polypeptides are found, for example, in U.S. Pat. No. 5,208,020; U.S. Pat. No. 6,4411,163; WO2005037992; WO2005081711; and WO2006 / 034488, which are incorporated herein by reference to the entirety. Specific examples of methods of preparing the conjugates of the present disclosure are also included in the experimental part of the present disclosure.

[0165] Pharmaceutical composition

[0166] In another aspect, the present disclosure also provides a pharmaceutical composition comprising the polypeptide conjugate provided herein and a pharmaceutically acceptable carrier.

[0167] The term “pharmaceutically acceptable” indicates that the designated carrier, vehicle, diluent, excipient (s) , and / or salt is generally chemically and / or physically compatible with the other ingredients comprising the formulation, and physiologically compatible with the recipient thereof.

[0168] A “pharmaceutically acceptable carrier” refers to an ingredient in a pharmaceutical formulation, other than an active ingredient, which is bioactivity acceptable and nontoxic to a subject. Pharmaceutical acceptable carriers for use in the pharmaceutical compositions disclosed herein may include, for example, pharmaceutically acceptable liquid, gel, or solid carriers, aqueous vehicles, nonaqueous vehicles, antimicrobial agents, isotonic agents, buffers, antioxidants, anesthetics, suspending / dispending agents, sequestering or chelating agents, diluents, adjuvants, excipients, or non-toxic auxiliary substances, other components known in the art, or various combinations thereof.

[0169] Suitable components may include, for example, antioxidants, fillers, binders, disintegrants, buffers, preservatives, lubricants, flavorings, thickeners, coloring agents, emulsifiers or stabilizers such as sugars and cyclodextrins. Suitable antioxidants may include, for example, methionine, ascorbic acid, EDTA, sodium thiosulfate, platinum, catalase, citric acid, cysteine, thioglycerol, thioglycolic acid, thiosorbitol, butylated hydroxanisol, butylated hydroxytoluene, and / or propyl gallate. As disclosed herein, inclusion of one or more antioxidants such as methionine in a pharmaceutical composition provided herein decreases oxidation of the polypeptide complex or the bispecific polypeptide complex. This reduction in oxidation prevents or reduces loss of binding affinity, thereby improving protein stability and maximizing shelf-life. Therefore, in certain embodiments, compositions are provided that comprise the fusion polypeptide, the polypeptide complex or the conjugate disclosed herein and one or more antioxidants such as methionine.

[0170] To further illustrate, pharmaceutical acceptable carriers may include, for example, aqueous vehicles such as sodium chloride injection, Ringer's injection, isotonic dextrose injection, sterile water injection, or dextrose and lactated Ringer's injection, nonaqueous vehicles such as fixed oils of vegetable origin, cottonseed oil, corn oil, sesame oil, or peanut oil, antimicrobial agents at bacteriostatic or fungistatic concentrations, isotonic agents such as sodium chloride or dextrose, buffers such as phosphate or citrate buffers, antioxidants such as sodium bisulfate, local anesthetics such as procaine hydrochloride, suspending and dispersing agents such as sodium carboxymethylcelluose, hydroxypropyl methylcellulose, or polyvinylpyrrolidone, emulsifying agents such as Polysorbate 80 (TWEEN-80) , sequestering or chelating agents such as EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) or EGTA (ethylene glycol tetraacetic acid) , ethyl alcohol, polyethylene glycol, propylene glycol, sodium hydroxide, hydrochloric acid, citric acid, or lactic acid. Antimicrobial agents utilized as carriers may be added to pharmaceutical compositions in multiple-dose containers that include phenols or cresols, mercurials, benzyl alcohol, chlorobutanol, methyl and propyl p-hydroxybenzoic acid esters, thimerosal, benzalkonium chloride and benzethonium chloride. Suitable excipients may include, for example, water, saline, dextrose, glycerol, or ethanol. Suitable non-toxic auxiliary substances may include, for example, wetting or emulsifying agents, pH buffering agents, stabilizers, solubility enhancers, or agents such as sodium acetate, sorbitan monolaurate, triethanolamine oleate, or cyclodextrin.

[0171] The pharmaceutical compositions can be a liquid solution, suspension, emulsion, pill, capsule, tablet, sustained release formulation, or powder. Oral formulations can include standard carriers such as pharmaceutical grades of mannitol, lactose, starch, magnesium stearate, polyvinyl pyrollidone, sodium saccharine, cellulose, magnesium carbonate, etc.

[0172] In embodiments, the pharmaceutical compositions are formulated into an injectable composition. The injectable pharmaceutical compositions may be prepared in any conventional form, such as for example liquid solution, suspension, emulsion, or solid forms suitable for generating liquid solution, suspension, or emulsion. Preparations for injection may include sterile and / or non-pyretic solutions ready for injection, sterile dry soluble products, such as lyophilized powders, ready to be combined with a solvent just prior to use, including hypodermic tablets, sterile suspensions ready for injection, sterile dry insoluble products ready to be combined with a vehicle just prior to use, and sterile and / or non-pyretic emulsions. The solutions may be either aqueous or nonaqueous.

[0173] In certain embodiments, unit-dose parenteral preparations are packaged in an ampoule, a vial or a syringe with a needle. All preparations for parenteral administration should be sterile and not pyretic, as is known and practiced in the art.

[0174] In certain embodiments, a sterile, lyophilized powder is prepared by dissolving the polypeptide conjugate as disclosed herein in a suitable solvent. The solvent may contain an excipient which improves the stability or other pharmacological components of the powder or reconstituted solution, prepared from the powder. Excipients that may be used include, but are not limited to, water, dextrose, sorbital, fructose, corn syrup, xylitol, glycerin, glucose, sucrose or other suitable agent. The solvent may contain a buffer, such as citrate, sodium or potassium phosphate or other such buffer known to those of skill in the art at, in one embodiment, about neutral pH. Subsequent sterile filtration of the solution followed by lyophilization under standard conditions known to those of skill in the art provides a desirable formulation. In one embodiment, the resulting solution will be apportioned into vials for lyophilization. Each vial can contain a single dosage or multiple dosages of the fusion polypeptide, the polypeptide complex, or the conjugate provided herein or composition thereof. Overfilling vials with a small amount above that needed for a dose or set of doses (e.g., about 10%) is acceptable so as to facilitate accurate sample withdrawal and accurate dosing. The lyophilized powder can be stored under appropriate conditions, such as at about 4 ℃ to room temperature.

[0175] Reconstitution of a lyophilized powder with water for injection provides a formulation for use in parenteral administration. In one embodiment, for reconstitution the sterile and / or non-pyretic water or other liquid suitable carrier is added to lyophilized powder. The precise amount depends upon the selected therapy being given, and can be empirically determined.

[0176] Administration of the pharmaceutical composition as described herein may be via any route known to be effective by the physician of ordinary skill. One example is peripheral parenteral administration by a sterile syringe or some other mechanical device such as an infusion pump. In certain embodiments, peripheral parenteral route is intravenous, intramuscular, subcutaneous, or intraperitoneal routes of administration.

[0177] In certain embodiments, the polypeptide conjugates described herein is formulated in a form suitable for non-parenteral routes administration, such as oral, rectal, nasal, or lower respiratory routes administration.

[0178] In certain embodiments, the polypeptide conjugates described herein is formulated in a solid formulation such as lyophilization or spray drying, which is then reconstituted in a suitable diluent solution prior to administration. Standard pharmaceutical formulation techniques, such as those described in Remington: The Science and Practice of Pharmacy (D.B. Troy, Editor, 21st Edition, Lippincott, Williams &Wilkins, 2006) , may be employed. Alternatively, the polypeptide conjugates described herein can be formulated for administration through the lingual, sublingual, buccal, in the mouth, oral, in the stomach and intestine, nasal, pulmonary, for example, through the bronchioles and alveoli or a combination thereof, epidermal, dermal, transdermal, vaginal, rectal, ocular, for examples through the conjunctiva, uretal, transdermal, or pulmonary route. As a still further option, the polypeptide conjugates described herein can be formulated for administration through transdermal administration, for example, by needle-free injection or from a patch, optionally an iontophoretic patch, or transmucosal, for example, buccal, administration.

[0179] Method of treatment

[0180] In another aspect, the present disclosure provides a method of preventing or treating a metabolic disorder in a subject in need thereof, comprising administering a therapeutically effective amount of the polypeptide conjugate provided herein.

[0181] Therapeutic methods are also provided, comprising: administering a therapeutically effective amount of the polypeptide conjugate provided herein to a subject in need thereof, thereby treating or preventing a condition or a disorder. In certain embodiments, the subject has been identified as having a disorder or condition likely to respond to the polypeptide conjugate provided herein.

[0182] In certain embodiments, the metabolic disorder is diabetes, obesity, overweight, non-alcoholic steatohepatitis (NASH) , cardiovascular like dyslipidemia, artherosclerosis, alcoholic steatohepatitis (ASH) , diabetic nephropathy, metabolic syndrome such as metabolic syndrome X, nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD) , end-stage liver disease, hepatic steatosis (fatty liver) , liver cirrhosis, or primary biliary cirrhosis (PBC) .

[0183] In certain embodiments, the condition diabetes includes all forms of diabetes, such as hyperglycemia, type 2 diabetes, impaired glucose tolerance, gestational diabetes, type 1 diabetes, non-insulin dependent diabetes, MODY (maturity onset diabetes of the young) , gestational diabetes, and / or an elevated level of HbA1 C.

[0184] In certain embodiments, the condition diabetes includes diabetic complications such as angiopathy.

[0185] In another aspect, the present disclosure provides a method of managing body weight in a subject in need thereof, comprising administering a therapeutically effective amount of the polypeptide conjugate provided herein.

[0186] In another aspect, the present disclosure provides a method of reducing food intake in a subject in need thereof, comprising administering a therapeutically effective amount of the polypeptide conjugate provided herein.

[0187] In another aspect, the present disclosure provides a method of reducing body weight in a subject in need thereof, comprising administering a therapeutically effective amount of the polypeptide conjugate provided herein.

[0188] In certain embodiments, the condition or metabolic disorder that can be treated or ameliorated using the polypeptide conjugate provided herein, includes a condition where a human subject has a fasting blood glucose level of 125 mg / dL or greater, for example 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200 or greater than 200 mg / dL. Blood glucose levels can be determined in the fed or fasted state, or at random. The metabolic condition or disorder can also comprise a condition in which a subject is at increased risk of developing a metabolic condition. For a human subject, such conditions include a fasting blood glucose level of 100 mg / dL.

[0189] In certain embodiments, the condition or metabolic disorder that can be treated or ameliorated using the polypeptide conjugate provided herein, includes a condition where a human subject has a body mass index (BMI) of at least or higher than 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 or 40. In certain embodiments, the human subject has an BMI ranging from 25 to 30, 26 to 30, 27 to 30, 28 to 30, 25 to 29, or 25 to 28.

[0190] The therapeutically effective amount of the polypeptide conjugate provided herein will depend on various factors known in the art, such as for example body weight, age, past medical history, present medications, state of health of the subject and potential for cross-reaction, allergies, sensitivities and adverse side-effects, as well as the administration route and extent of disease development. Dosages may be proportionally reduced or increased by one of ordinary skill in the art (e.g., physician or veterinarian) as indicated by these and other circumstances or requirements. The therapeutically effective amount can be an amount of the fusion polypeptide, the polypeptide complex and the conjugate provided herein, that elicits a biological or medicinal response in a tissue system, animal, or human being sought by a researcher, medical doctor, or other clinician, which includes alleviation or amelioration of the symptoms of the disease or disorder being treated, i.e., an amount that supports an observable level of one or more desired biological or medicinal response, for example lowering blood glucose, insulin, triglyceride, or cholesterol levels; reducing body weight; or improving glucose tolerance, energy expenditure, or insulin sensitivity.

[0191] In certain embodiments, the polypeptide conjugate provided herein may be administered at a therapeutically effective dosage of about 0.01 mg / kg to about 100 mg / kg (e.g., about 0.01 mg / kg, about 0.5 mg / kg, about 1 mg / kg, about 2 mg / kg, about 5 mg / kg, about 10 mg / kg, about 15 mg / kg, about 20 mg / kg, about 25 mg / kg, about 30 mg / kg, about 35 mg / kg, about 40 mg / kg, about 45 mg / kg, about 50 mg / kg, about 55 mg / kg, about 60 mg / kg, about 65 mg / kg, about 70 mg / kg, about 75 mg / kg, about 80 mg / kg, about 85 mg / kg, about 90 mg / kg, about 95 mg / kg, or about 100 mg / kg) . In certain of these embodiments, the polypeptide conjugate provided herein is administered at a dosage of about 50 mg / kg or less, and in certain of these embodiments the dosage is 10 mg / kg or less, 5 mg / kg or less, 1 mg / kg or less, 0.5 mg / kg or less, or 0.1 mg / kg or less. In certain embodiments, the administration dosage may change over the course of treatment. For example, in certain embodiments the initial administration dosage may be higher than subsequent administration dosages. In certain embodiments, the administration dosage may vary over the course of treatment depending on the reaction of the subject.

[0192] In certain embodiments, the polypeptide conjugate provided herein may be administered to the subject (e.g. human) at a dosing regimen that is no more frequently than once daily, once every 3 days, once weekly, once every two weeks, once every three weeks, or once monthly. In certain embodiments, the polypeptide conjugate provided herein may be administered to the subject (e.g. human) at a dosing interval of once weekly, once every two weeks, once every three weeks, or once monthly. Therapeutic efficacy with low dosing frequency have the potential to improve a patient's adherence and long-term treatment success. The currently available treatment semaglutide is dosed once weekly. Without wishing to be bound by any theory, it is believed that certain polypeptide conjugate provided herein have significantly extended half life and are suitable for less frequent dosing than semaglutide for treating a metabolic condition, for example, less frequent than once weekly dosing (e.g. once every 8 days, once every 9 days, once every 10 days, once every 11 days, once every 12 days, once every 13 days, once every 14 days, once every 18 days, once every three weeks, once every 24 days, once every 4 weeks, or once every month) . In certain embodiments, the dosing regimen is a continuous dosing regimen selected from twice-weekly dosing, once-weekly dosing, once bi-weekly dosing, once every three weeks dosing, once monthly dosing, or once every two months dosing. In certain embodiments, the dosing regimen has a dosing interval ranging from about once every 3 days to about once per month, or from about once weekly to about once per month.

[0193] Dosage regimens may be adjusted to provide the optimum desired response (e.g., a therapeutic response) . For example, a single dose may be administered, or several divided doses may be administered over time.

[0194] The polypeptide conjugate provided herein may be administered by any route known in the art, such as parenteral (e.g., subcutaneous, intraperitoneal, intravenous, including intravenous infusion, intramuscular, or intradermal injection) or non-parenteral (e.g., oral, intranasal, intraocular, sublingual, rectal, or topical) routes. In certain embodiments, the polypeptide conjugate provided herein is administered subcutaneously, intravenously, intramuscularly or intradermally.

[0195] The polypeptide conjugate may be administered alone or in combination with one or more additional therapeutic means or agents.

[0196] In certain embodiments, when used for treating a metabolic disease, the polypeptide conjugate provided herein may be administered in combination with any other therapeutic agent for use in the treatment of a metabolic disease or any medical disorder that related. “Administered in combination” as used herein includes administration simultaneously as part of the same pharmaceutical composition, simultaneously as separate compositions, or at different timings as separate compositions. A composition administered prior to or after another agent is considered to be administered “in combination” with that agent as the phrase is used herein, even if the composition and the second agent are administered via different routes. Where possible, additional therapeutic agents administered in combination with the fusion polypeptide, the polypeptide complex or the conjugate provided herein are administered according to the schedule listed in the product information sheet of the additional therapeutic agent, or according to the Physicians'Desk Reference (Physicians'Desk Reference, 70th Ed (2016) ) or protocols well known in the art. A non-limiting list of examples of compounds that can be administered in combination with a pharmaceutical composition comprising the polypeptide conjugates provided herein, include rosiglitizone, pioglitizone, repaglinide, nateglitinide, metformin, exenatide, stiagliptin, pramlintide, glipizide, glimeprirideacarbose, and miglitol.

[0197] Kit

[0198] Also provided are kits for practicing the disclosed methods. Such kits can comprise a pharmaceutical composition such as those described herein, including nucleic acids encoding the polypeptide conjugate provided herein, vectors and cells comprising such nucleic acids, and pharmaceutical compositions comprising such nucleic acid-containing compounds, which can be provided in a sterile container. Optionally, instructions on how to employ the provided pharmaceutical composition in the treatment of a metabolic disorder can also be included or be made available to a patient or a medical service provider.

[0199] In one aspect, a kit comprises (a) a pharmaceutical composition comprising a therapeutically effective amount of the polypeptide conjugate provided herein or a mutant form thereof; and (b) one or more containers for the pharmaceutical composition. Such a kit can also comprise instructions for the use thereof; the instructions can be tailored to the precise metabolic disorder being treated. The instructions can describe the use and nature of the materials provided in the kit. In certain embodiments, kits include instructions for a patient to carry out administration to treat a metabolic disorder, such as elevated glucose levels, elevated insulin levels, diabetes, obesity, non-alcoholic steatohepatitis (NASH) , cardiovascular like dyslipidemia, artherosclerosis, alcoholic steatohepatitis (ASH) , diabetic nephropathy, metabolic syndrome such as metabolic syndrome X, nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD) , end-stage liver disease, hepatic steatosis (fatty liver) , liver cirrhosis, or primary biliary cirrhosis (PBC) .

[0200] Instructions can be printed on a substrate, such as paper or plastic, etc., and can be present in the kits as a package insert, in the labeling of the container of the kit or components thereof (e.g., associated with the packaging) , etc. In other embodiments, the instructions are present as an electronic storage data file present on a suitable computer readable storage medium, e.g., CD-ROM, diskette, etc. In yet other embodiments, the actual instructions are not present in the kit, but means for obtaining the instructions from a remote source, such as over the internet, are provided. An example of this embodiment is a kit that includes a web address where the instructions can be viewed and / or from which the instructions can be downloaded. Often it will be desirable that some or all components of a kit are packaged in suitable packaging to maintain sterility. The components of a kit can be packaged in a kit containment element to make a single, easily handled unit, where the kit containment element, e.g., box or analogous structure, may or may not be an airtight container, e.g., to further preserve the sterility of some or all of the components of the kit.

[0201] Example 1: Recombinant expression and purification of GLP-1 proteins

[0202] The GLP-1 protein of the molecules as shown in Table 1 below were produced from bacterial E. coli expression system, using BL21 (DE3) derivative strain. The DNA coding for the GLP-1 precursors was codon optimized for E. coli expression, de novo synthesized and subcloned into PET derivative expression vectors (Novagen) . Amino acid substitutions were accomplished by modification of the corresponding genetic codons. Overexpression of GLP-1 precursor was induced with 0.5 mM isopropyl b-d-thiogalactoside (IPTG) when the cell density reached an OD600 of 2.0 in Terrific Broth (TB) medium. The cells were harvested after protein induction at 37 ℃ for 20-22 hours. Cells were harvested and lysed in 20mM Tris pH8.0, 0.15M NaCl buffer by cell disruptor (900 bar, for twice) . The soluble fractions, containing the GLP-1 proteins, were collected by centrifugation (8,000 X g, for 30min) . After removing tag by protease, the proteins were purified by reverse phase chromatography. The samples in each step were characterized by LC / MS to confirm the correct molecular weight.

[0203] Example 2: Incorporation of non-proteogenic amino acid in recombinant protein

[0204] The N-terminal His-Aib-Glu-Gly tetrapeptide or His-Aib dipeptide was dissolved in organic solvent and was added into a solution of GLP-1 protein in organic solvent. The reaction was stirred at room temperature for 3 h. Then the piperidine was added into the reaction solution to remove Fmoc-protecting group.

[0205] Example 3: Preparation of GLP-1 compounds with CRMs

[0206] Two GLP-1 analogs were produced. One has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17, characterized in having 8Aib and 34R, wherein the numbering the numbering is relative to natural GLP-1 (7-37) . The other has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, characterized in having 8Aib, 22E and 34R, wherein the numbering the numbering is also relative to natural GLP-1 (7-37) .

[0207] The GLP-1 analogs were further conjugated with a series of CRM reagents having increasing length of the fatty acid chain, including HOOC- (CH2) 20-CO-gGlu-2XADO (referred to in the Examples as “C22” ) , HOOC- (CH2) 18-CO-gGlu-2XADO (referred to in the Examples as “C20” ) , HOOC- (CH2) 16-CO-gGlu-2XADO (referred to in the Examples as “C18” ) , and HOOC- (CH2) 14-CO-gGlu-2XADO (referred to in the Examples as “C16” ) . Briefly, to a solution of a GLP-1 protein in NaOH was added with the respective CRM reagent in organic solvent dropwise. The reaction was stirred at room temperature for 1 h. Then the product was applied to reverse phase chromatography. This provided the conjugated GLP-1 proteins as shown in Table 1.

[0208] The conjugated GLP-1 proteins were detected and characterized by LC-MS method with Waters BioAccord LC-MS system, or by UPLC with Waters Acquity UPLC system, using conditions optimized for different conjugates, following the supplier’s manuals.

[0209] Table 1. Conjugated GLP-1 proteins

[0210] Example 4: In vitro activities

[0211] Method: The in vitro GLP-1 activities were measured in the presence of 1%human serum albumin (HSA) , using a CHO cell line overexpressing human GLP-1 receptor and CRE luciferase reporter. Conjugated fusion proteins of Table 1 were measured at 12000 nM as top concentration with 4-fold serial dilutions. After the cells were treated with the conjugated fusion proteins for 5 hours, luciferase activities were measured by Bright-Glo luciferase assay system kit (Promega, E2620) .

[0212] The activity of each conjugated fusion proteins was represented by EC50, derived from non-linear regression analysis.

[0213] As shown in Table 2, in the context of the (8Aib, 34R) GLP-1 analog, as the number of carbon atoms in the fatty acid chain (i.e. the length of the fatty acid chain) in the CRM of the conjugated fusion proteins increased from C16 to C22, in particular, from C18 to C22, the potency in GLP-1R activation significantly decreased (i.e. EC50 increased from about 11 nM to about 153 nM, see, EC50 for Control#3, semaglutide, Control#2, and Control#5 in Table 2) . This is consistent with earlier findings by Knudsen et al (see, for details, Knudsen et al., Frontiers in Endocrinology, 10: article 155, April 2019) , where it was shown that there was a trend of increasing GLP-1R potency with increasing carbon atoms from C12 to C18, but such trend was reversed when longer carbon atoms (e.g >C18) were used.

[0214] Next, inventors tested how substitution of 22E would impact on the potency of GLP-1R activation. When the length of the fatty acid chain is C16, introduction of mutation at 22E did not substantially change the GLP-1R activation. see, comparison of EC50 for Control#3 and Control #4. The same was observed when the length of the fatty acid chain is C18, see, comparison of EC50 for Control#1 and semaglutide.

[0215] Based on the above trend observed for these molecules with C16 and C18 fatty acid chains, it appears that introduction of 22E substitution may not substantially change the potency in GLP-1R activation. As the potency in GLP-1R activation significantly decreased with the increase in length of the fatty acid chain, it was expected that 22E substituted conjugated fusion proteins with longer fatty acid chains would also follow this trend.

[0216] Indeed, when the length of the fatty acid chain is C22, the conjugated fusion protein showed much lower potency than its C18 counterpart. See, comparison of EC50 for semaglutide (20nM) and Control #5 (153nM) . Interestingly, 22E substitution even made the potency in GLP-1R activation much lower than the counterpart without 22E substitution. see, comparison of EC50 for Control#5 (153nM) and Control #6 (264nM) .

[0217] In contrast, and to the inventors’ great surprise, when the length of the fatty acid chain is C20, introduction of mutation at 22E significantly increased the potency in GLP-1R activation relative to its counterpart without 22E substitution. See, comparison of EC50 for Control #2 (90nM) and MLC#7 (39nM) . This was totally unexpected. The significantly increased potency of MLC#7 (i.e. 22E substituted fusion protein conjugated C20 fatty acid chain) was almost comparable to the C18 conjugated fusion protein, which made it advantageous in providing the activity needed for biological efficacy. In addition, as the assay was carried out in the presence of 1%HSA, the results could be indicative of the in vivo situation.

[0218] Table 2. In vitro GLP-1R activation by GLP-1 polypeptide conjugates in the presence of 1%HSA.

[0219] Example 5: OGTT test in C57 lean mice (single dose)

[0220] Method: 10 week old male C57BL / 6 mice were injected subcutaneously (s.c. ) with Molecule MLC#7 and semaglutide once, where semaglutide was used as control. Five animals were used for each treatment group. 6 hours, 30 hours, 54 hours, 78 hours and 102 hours after dosing, all mice were given glucose solution (2 g / kg, 10 mL / kg) via oral. Subsequently, the blood glucose of mice was measured at 0 min, 15 min, 30 min, 60 min, and 120 min after glucose administration. Data are indicated as mean values and standard error (SEM) . The area under the curve for glucose AUC from 0 until 120 min (AUC0-120 min) was calculated. OGTT AUC inhibition %= (Vehicle AUC0-120 min -AUC0-120 min)  /  (Vehicle AUC0-120 min) *100.

[0221] Conclusion: molecule MLC#7 showed dose-dependent efficacy on glucose control (Figures 1A-1E and Table 3) . As shown in Figures 1C-1E and Table 3, molecule MLC#7 demonstrated more sustainable efficacy compared to semaglutide at an equal dosage after single dose, as evidenced by the superior AUC inhibition%at 54 hours post-injection, 78 hours post-injection and 102 hours post-injection.

[0222] Table 3:

[0223] Example 6: In vivo activities in db / db mice (single dose)

[0224] Method: 10 weeks old male db / db mice were injected subcutaneously with Molecule MLC#7 and semaglutide once, where semaglutide was used as control. Random blood glucose, weight, food intake were measured on different times and five animals were used for each group. Delta weight is weight subtracted by baseline level. Data are indicated as mean values and standard error (SEM) .

[0225] Conclusion: molecule MLC#7 showed dose-dependent efficacy on glucose control (Figure 2A-B) , weight control (Figure 2C) and food intake (Figure 2D) . Molecule MLC#7 exhibited more sustainable efficacy than semaglutide after single dose, as evidenced by the lower glucose AUC 0-72h and more effective body weight reduction and food intake reduction.

[0226] Example 7: In vivo activities in DIO mice (long-term treatment)

[0227] Method: 22 week old DIO male C57BL / 6 mice (～45g) were injected once daily (QD) subcutaneously with Molecule MLC#7 and semaglutide for 28 days. Body weight was measured daily and fasting blood glucose was measured once a week. Five animals were used for each treatment group. Day 1 and Day 28 are first day and last day of molecule dosage. Body weight was monitored for each individual animal. %Delta body weight=100* (BW on Day n-BW on Day 1)  /  (BW on Day 1) . Data are indicated as mean values and standard error (SEM) . Statistical analysis was performed by One-way ANOVA.

[0228] Conclusion: in DIO mice study, molecule MLC#7 showed dose-dependent efficacy on body weight reduction. As shown in Figures 3A and 3B, molecule MLC#7 exhibited significantly better efficacy than semaglutide after long-term treatment.

[0229] Example 8: Pharmacokinetic measurement

[0230] The pharmacokinetics of molecular MLC#7 were evaluated in Sprague Dawley rats, Bama minipigs, and Cynomolgus monkeys following intravenous administration.

[0231] PK study in rats

[0232] Method: 6～8-week-old Sprague Dawley rats (180～200g) were administrated with a single intravenous dose of 11.87 nmol / kg MLC#7 (n=10) and a single intravenous dose of 10 nmol / kg semaglutide (n=3) , respectively. Plasma samples for MLC#7 group were collected pre-dose (-5 min) , 0.0833 hr, 0.33 hr, 1 hr, 2 hr, 6 hr, 12 hr, 24 hr, 48 hr, and 60 hr after intravenous administration. Plasma samples for Semaglutide group were collected pre-dose (-5 min) , 0.0833 hr, 0.5 hr, 1 hr, 2 hr, 4 hr, 6 hr, 8 hr, 24 hr, 48 hr, 72 hr, and 96 hr after intravenous administration.

[0233] PK study in minipigs

[0234] Method: 6～10-month-old male Bama minipigs (20～25kg) were administrated with a single intravenous dose of 12 nmol / kg MLC#7 (n=2) and a single intravenous dose of 12 nmol / kg semaglutide (n=2) , respectively. Plasma samples for MLC#7 and semaglutide group were collected pre-dose (-5 min) , 0.0833 hr, 0.5 hr, 1 hr, 3 hr, 8 hr, 24 hr, 48 hr, 72 hr, 96 hr, 168 hr, 336 hr, and 504 hr after intravenous administration.

[0235] PK study in monkeys

[0236] Method: 3～6-year-old Cynomolgus monkeys (2～5kg) were administrated with a single intravenous dose of 2.37 nmol / kg MLC#7 (n=6) and a single intravenous dose of 4.16 nmol / kg semaglutide (n=2) , respectively. Plasma samples for MLC#7 group were collected pre-dose (-5 min) , 0.03 hr, 0.17 hr, 0.5 hr, 1 hr, 2 hr, 4 hr, 8 hr, 24 hr, 48 hr, 72 hr, 144 hr, 216 hr, and 336 hr after intravenous administration. Plasma samples for semaglutide group were collected pre-dose (-5 min) , 0.083 hr, 1 hr, 2 hr, 4 hr, 8 hr, 24 hr, 36 hr, 48 hr, 72 hr, 96 hr, 120 hr, 144 hr and 168 hr after intravenous administration.

[0237] Validated bioanalytical methods (LC-MS / MS) were used to quantify the amount of MLC#7 and semaglutide in plasma during single dose studies. The pharmacokinetic parameters were calculated by WinNonlin.

[0238] Knudsen et al (supra) previously reported pharmacokinetic studies of the derivative of semaglutide with C20 fatty acid (as opposed to C18 fatty acid in semaglutide) . Knudsen et al reported that while the C20 derivative showed longer half-life in rats than semaglutide (7 hours) , but Knudsen et al indicated that PK data in rats are not always reflective of those in humans. Knudsen et al thus used mini pigs to test the most promising derivatives, and found the results were not consistent with those in rats, which showed the half-life of the C20 fatty acid derivative in mini pigs (55 hours) was merely similar to (but not longer than) semaglutide.

[0239] The present study tested MLC#7 with semaglutide as a control. Consistent with the findings of Knudsen et al, semaglutide also showed a half-life of about 7.6 hours in rats, and about 53 hours in mini pigs. However, the inventors surprisingly found that the terminal half-life of MLC#7 was at least 50%longer than that of semaglutide in rats, in mini pigs as well as in monkeys. As mini pigs and monkeys are better models to reflect pharmacokinetic properties in humans, the data showed that MLC#7 would likely have longer half-life than semaglutide in humans. Preliminary studies on humans are in progress and early results are promising.

[0240] Table 4: Data in rat, minipig and monkey are presented as arithmetic means.

[0241] Example 9: Human serum albumin binding

[0242] Method: Binding of molecules to serum albumin was characterized by surface plasmon resonance in a Biacore 8K instrument. Serum albumin from different species was covalently bound to CM5 sensor chips surface until 4000 RU was reached. The chip was blocked by 1 M ethanolamine with flowrate of 10 μL / min for 420 s. Each molecule sample was diluted and injected at a flow rate of 30 μL / min to allow for binding to chip-bound albumin for 120 s and for dissociation for 300 s. Binding buffer without molecule was sent over the chip at the flow rate of 20 seconds to allow spontaneous dissociation of bound molecule for 30 seconds.

[0243] Conclusion: Molecule MLC#7 showed comparable binding affinity to human serum albumin with semaglutide (Table 5) .

[0244] Table 5: HSA binding affinity

[0245] Example 10: Clinical Study of MLC#7

[0246] Safety, tolerability, pharmacokinetics characterization and immunogenicity of MLC#7 and the food effects in healthy, overweight or obese subjects are evaluated. Effects of MLC#7 on fasting glucose, insulin, C-peptide, lipids (total cholesterol, triglycerides, Low Density Lipoproteins [LDL] , High Density Lipoproteins [HDL] ) , body weight and QT interval of the subjects are also evaluated.

[0247] Study Population

[0248] Healthy, overweight or obese subjects aged 18-55 years (both inclusive) , male or female, with a body mass index of 19.0-35.0 kg / m2. (19.0 and 35.0 kg / m2 both inclusive) . Men weight >50.0 kg and women weight >45.0 kg.

[0249] Study Design

[0250] I. Single Ascending Dose (SAD)

[0251] SAD study adopts a double-blind, randomized, placebo-controlled, single ascending dose, continuous cohort design. Subjects are divided into five dose cohorts. Two subjects with placebo are included in each group. Each subject will participate in only 1 dose cohort.

[0252] II. Multiple Ascending Dose (MAD)

[0253] MAD study adopts a double-blind, randomized, placebo-controlled, multiple ascending dose design. Subjects are divided into four dose cohorts, including healthy subject groups and overweight or obese subject groups. Four subjects with placebo are included in each group. Each subject will participate in only 1 dose cohort. Each dose cohort will be administered for several weeks using a gradient of escalating doses.

[0254] III. Food Effect (FE)

[0255] Subjects in SAD study (one of five groups) are enrolled in the second phase of the Food Effects study after completing the first phase of the SAD study, evaluating the safety, tolerability, pharmacokinetics and pharmacodynamics of MLC#7 for single administration after a high-fat meal in healthy subjects.

[0256] Pharmacokinetic Evaluation

[0257] SAD Study

[0258] PK blood samples are collected at: 0h before administration (within 60 min before administration) , 30 min, 1 h, 1.5h, 2h, 3h, 6h, 12h, 24h, 36h, 48h, 72h, 96h, 120h, 144h, 168h, 336h, 504h, 672h, 840h, 1008h after administration, or early withdrawal or termination.

[0259] Pharmacokinetic (PK) parameters are measured, including area under the blood concentration-time curve (AUC, such as AUC0-∞, AUC0-last) , peak blood concentration (Cmax) , time to peak (tmax) , elimination half-life (t1 / 2) , clearance (CL / F) , volume of distribution (Vz / F) , etc.

[0260] FE Study

[0261] The FE study consists of two phases, the first phase and the second phase. The first phase of blood collection time-point is the same as in the SAD study. In the second phase, PK blood samples are collected at: 0h before administration (within 60 min before administration) , 30 min, 1h, 1.5, 2h, 3h, 6h, 12h, 24h, 36h, 48, 72h, 96h, 120h, 144h, 168h, 336h, 504h, 672h, 840h, 1008h after administration, or early withdrawal or termination.

[0262] Pharmacokinetic (PK) parameters are measured, including AUC0-∞, AUC0-last, Cmax, tmax, t1 / 2, CL / F, Vz / F, etc.

[0263] MAD Study

[0264] PK blood samples are collected at 0h before administration (within 60 min before administration) and several time-points after administration for different doses, respectively.

[0265] PK parameters are measured, including AUC0-∞, AUC0-last, Cmax, tmax, t1 / 2, CL / F, Vz / F, etc., for the first dose; and area under the drug-time curve during the dosing interval (τ) after reach steady-state (AUC0-τ, SS) , area under the blood concentration-time curve at steady-state administration from time 0 (pre-dose) to infinity (AUC0-∞, SS) , AUC0-last, ss, steady-state peaking time (tmax, ss) , steady-state peak concentration (Cmax_ss) , steady-state minimum concentration (Cmin_s) , average steady-state blood concentration (Cav_ss) , steady-state fluctuation factor (DF) , steady-state elimination rate constant (λz, ss) , steady-state half-life (t1 / 2, ss) , steady-state apparent clearance (CLss / F) , steady-state apparent volume of distribution (Vd, ss / F) , dose-corrected accumulation factor (Rac) , etc., for steady state.

[0266] Safety Evaluation

[0267] The safety and tolerability observational indicators during the study period include physical examination, vital signs, 12-lead electrocardiograms (ECG) , laboratory tests (hematology, biochemistry, urinalysis, coagulation function) and adverse events.

[0268] Immunogenicity Evaluation

[0269] SAD Study

[0270] Immunogenic blood samples are collected at D1 0h before administration (within 60 min before dosing) , D8, D15 (±1d) , D29 (±1d) and D43 (±1d) after administration, or early withdrawal or termination.

[0271] MAD Study

[0272] Immunogenic blood samples are collected at D1 0h before the 1st administration (within 60 min before administration) , D8, D36 (±1d) , D49 (±1d) , D77 (±1d) after administration, or early withdrawal or termination.

[0273] Statistical Analysis

[0274] Unless otherwise specified, SAS software (version 9.4 and above) or WinNonlin software (version 8.2 and above) is used for statistical analysis. Descriptive statistics on measurement data are calculated, usually including the number of subjects (n) , arithmetic mean (Mean) , standard deviation (SD) , median (Median) and minimum value (Minimum, Min) and Maximum (Maximum, Max) . For the partial measurement data, the statistical coefficient of variation (%CV) , geometric mean (GeoMean) , geometric coefficient of variation (%CVb) . Counting data generally counts the number of subjects (n) and percentage (%) . Summarize safety, PK, and immunogenicity data using appropriate statistical graphs. Describe the distribution of subjects based on the screening population, summarize the inclusion and dropout of enrolled subjects in each analysis set, and perform descriptive statistical analysis on the baseline characteristics of enrolled subjects.

Claims

1.A polypeptide conjugate comprising:a GLP-1 peptide comprises the amino acid sequence of X7X8EGTFTSDVSSYLEEX23AAX26X27FIX30WLVX34GX36G (SEQ ID NO: 2) , wherein: X7 is H, X8 is G or Aib, the X23 is Q or K, the X26 is K, or R; the X27 is E or K; the X30 is A or K, the X34 is K or R and the X36 is R or G; anda clearance-reducing moiety (CRM) conjugated to the GLP-1 peptide through a CRM residue, wherein the CRM residue is lysine residue selected from the group consisting of K23, K26, K27, K30 and K34;the CRM comprise an albumin-binding moiety, wherein the albumin-binding moiety comprises a structure of: *-A-B-C-D, wherein A, B, C and D are interconnected via amide bonds, and the *end of A is connected to a reactive group of the conjugatable residue in the polypeptide complex, and wherein:A is selected from a bond, a, b, c and d are independently an integer from 0 to 4, R1 is hydrogen or –COOH;B is selected from a bond, e is an integer from 1 to 4, wherein position α is linked to position α’,C is a bond orR2 is –CH2SO3H or –COOH, f is an integer from 1 to 4, n is an integer from 1 to 25, wherein when B is not bond, then position β’ is linked to position β, or when B is bond, then position β’ is linked to position α’;D is an acidic group having a formula:wherein g is 18,R6 is hydroxyl;and wherein:when C is not a bond, then position δ is linked to position γ,when B is not a bond, C is a bond, then position δ is linked to position β,when A is not a bond, and both of B and C are bond, then position δ is linked to position α’.2.The polypeptide conjugate of claim 1, wherein the CRM residue is K26.3.The polypeptide conjugate of claim 1, wherein the GLP-1 comprises an amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NOs: 3-16.4.The polypeptide conjugate of claim 1 or 2, wherein the CRM comprises the structure of below formula: 5.A polypeptide conjugate comprising the structure of below formula: 6.A method of improving potency of a GLP-1 peptide conjugate, the method comprising introducing a mutation of 22E to the amino acid sequence of the GLP-1 peptide conjugate, wherein the numbering is relative to natural GLP-1 (7-37) , and wherein the GLP-1 peptide conjugate comprises a GLP-1 peptide and a clearance-reducing moiety (CRM) conjugated to the GLP-1 peptide through a CRM residue, wherein the CRM residue is lysine residue selected from the group consisting of K23, K26, K27, K30 and K34; and wherein the CRM comprises the structure of below formula: 7.A method of producing the polypeptide conjugate of any of claims 1-5, comprising culturing a host cell comprising a polynucleotide encoding the GLP-1 peptide defined in any of claims 1-5, under a condition that allows expression of the polynucleotide and conjugating the CRM defined in any of claims 1-5 to the GLP-1 peptide at the CRM residue defined in any of claims 1-5.8.A pharmaceutical composition comprising the polypeptide conjugate of any of claims 1-5, and a pharmaceutically acceptable carrier.9.A method of preventing or treating a metabolic disorder in a subject in need thereof, comprising administering a therapeutically effective amount of the polypeptide conjugate of any of claims 1-5.10.The method of claim 9, wherein the metabolic disorder is diabetes, obesity, overweight, non-alcoholic steatohepatitis (NASH) , cardiovascular like dyslipidemia, artherosclerosis, alcoholic steatohepatitis (ASH) , diabetic nephropathy, metabolic syndrome such as metabolic syndrome X, nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD) , end-stage liver disease, hepatic steatosis (fatty liver) , liver cirrhosis, or primary biliary cirrhosis (PBC) .11.The method of claim 10, wherein diabetes include one or more conditions selected from the group consisting of hyperglycemia, type 2 diabetes, impaired glucose tolerance, gestational diabetes, type 1 diabetes, non-insulin dependent diabetes, MODY (maturity onset diabetes of the young) , gestational diabetes, and elevated level of HbA1 C.12.A method of preventing or treating Alzheimer's disease in a subject in need thereof, comprising administering a therapeutically effective amount of the polypeptide conjugate of any of claims 1-5.13.A method of managing body weight in a subject in need thereof, comprising administering a therapeutically effective amount of the polypeptide conjugate of any of claims 1-5.14.A method of reducing food intake in a subject in need thereof, comprising administering a therapeutically effective amount of the polypeptide conjugate of any of claims 1-5.15.A method of reducing body weight in a subject in need thereof, comprising administering a therapeutically effective amount of the polypeptide conjugate of any of claims 1-5.16.The method of any one of claims 9-15, wherein the subject is human.17.The method of claim 14, wherein the subject has a fasting blood glucose level of 125 mg / dL or greater.18.The method of claim 16 or 17, wherein the subject has a body mass index (BMI) of at least or higher than 25.19.The method of any of claims 9-18, wherein the polypeptide conjugate is administered at a dosing regimen that is no more frequently than once daily, once every 3 days, or once weekly, once every two weeks, once every three weeks, or once monthly.20.The method of any one of claims 9-18, wherein the polypeptide conjugate is administered twice-weekly, once-weekly, once bi-weekly, once every three weeks, once monthly, or once every two months.21.The method of any of claims 9-18, wherein the dosing regimen has a dosing interval ranging from about once every 3 days to about once per month, or from about once weekly to about once per month.22.The method of any of claims 9-18, wherein the polypeptide conjugate is administered subcutaneously or intravenously or orally.