Anti-gamma delta tcr antibodies and uses thereof

Abstract

Provided are molecules including antibodies binding T cell receptor (TCR). In particular, provided are antibodies binding human γδ TCR, wherein the human γδ T cells can be activated and modulated. Also provided are bispecific tumor-targeting immunomodulators binding to a tumor-associated antigen and γδ T cell receptors simultaneously and enhancing cell-mediated immune response in the treatment of cancer. Methods of making the antibodies, and methods of using the antibodies to kill cancer cells, are also provided.

Description

ANTI-GAMMA DELTA TCR ANTIBODIES AND USES THEREOF

[0001] CROSS REFERENCE TO RELATED APPLICATION

[0002] This application claims priority benefits of International Application No. PCT / CN2023 / 116291 filed August 31, 2023, and International Application No. PCT / CN2023 / 123953 filed October 11, 2023, the contents of which are incorporated herein by reference in their entirety.

[0003] SEQUENCE STATEMENT

[0004] The content of the following submission on XML file is incorporated herein by reference in its entirety: a computer readable form (CRF) of the Sequence Listing (file name: IEC240451PCT_SEQUENCE LISTING. xml, date recorded: August 26, 2024, size: 239, 106 bytes) .TECHNICAL FIELD

[0005] The disclosure relates to molecules including antibodies binding T cell receptors (TCRs) . In particular, the disclosure relates to antibodies binding human γδ TCR, wherein the human γδ T cells can be activated and modulated. The disclosure also relates to bispecific tumor-targeting immunomodulators binding to a tumor-associated antigen and γδ T cell receptors simultaneously and enhancing cell-mediated immune response in the treatment of cancer. Methods of making the antibodies, and methods of using the antibodies to kill cancer cells, are also provided.BACKGROUND

[0006] Human γδ T cells are a unique subset of immune cells, accounting for 0.5–5%of lymphocytes in peripheral blood. In contrast to αβ T cells, γδ T cells expresses T cell receptors (TCRs) consist of γ chains and δ chains and recognize an antigen independent of MHC restriction. Generally, human γδ T cells can be divided into four major groups, Vδ1, Vδ2, Vδ3 and Vδ5 γδ T cells, based on TCR δ-chain. Vδ1 can co-express with various Vγ chains (Vγ2, Vγ3, Vγ4, Vγ5, Vγ8 and Vγ10) to form different Vδ1 γδ T cell subsets, which are mainly distributed in the skin, small intestine and other mucosal tissues. Vδ1 γδ T cells are also found in small amounts in the liver and spleen. Vδ2 is almost exclusively co-expressed with Vγ9 to form Vγ9Vδ2 T cells, which are the main γδT cells in blood circulation. Vδ3 γδ T cells mainly exist in the liver and small intestine epithelium. Vδ5 γδ T cells mainly exist in the peripheral blood (Liu and Zhang, Cells (2020) 9 (5) : 1206) .

[0007] γδ T cells recognize tumor cells through γδ TCRs and natural killer cell receptors (NKRs) . Vγ9Vδ2 TCR recognizes non-peptide phosphoantigens (such as isopentenyl pyrophosphate, IPP)  depending on butyrophilin 3A1 (BTN3A1) and butyrophilin 2A1 (BTN2A1) . Besides, Vγ9Vδ2 T cells also recognize tumor cells through NKG2D and DNAM-1, which engage with their ligands (MICA / B, ULBPs and Nectin-2, PVR) (Liu and Zhang, Cells (2020) 9 (5) : 1206) . Vδ1 T cells recognize lipid antigen-presented by CD1d through Vδ1 TCR. NKG2D and natural cytotoxicity receptors (NCRs, NKp30, NKp44, NKp46) with their ligands are involved in the tumor cell recognition by Vδ1 T cells. Vδ1 T cells, under the continuous stimulation of TCR agonists in the presence of IL-15 or IL-2, can express NCRs (Mikulak et al. JCI Insight (2019) 19; 4 (24) : e125884, Almeida et al. Clin. Cancer Res (2016) 22: 5795-5804) , which have a stronger anti-tumor activity against tumor cells and exert high ability to secrete IFNγ. Studies about Vδ3 and Vδ5 TCR ligands are rare, and the anti-tumor mechanism of these cells is largely unknown.

[0008] Currently, the major of clinical trials focus on autologous γδ T cells, because of the unique features of γδ T cells, such as non-MHC restriction and no risk of graft-versus-host disease (GVHD) , and have demonstrated that adoptive transfer of autologous Vγ9Vδ2 T cells were well tolerated and could trigger antitumor immunity. Most strategies that are currently under evaluation incorporate tumor-targeting mechanisms, e.g., chimeric antigen receptors (CARs) or bispecific T cell engagers (bsTCEs) , which might be key to obtain more robust and consistent clinical responses. Initial results from these targeted approaches, both cell and antibody-based, show great promise and confirm the safety of Vγ9Vδ2 and Vδ1 T cell-based strategies. However, cell-based products present challenges that are not shared by antibody-based therapies, such as high cost, difficulty of production or need of specialized facilities, and preparatory lymphodepleting chemotherapy regimens. Therefore, the current disclosure relates to the development of antibodies that can effectively activate and engage γδ T cells.SUMMARY

[0009] Provided herein is a VHH that binds a γδ TCR, comprising a CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15, 19, 23, 27, 31, 35, 38, 42, 46, 50, 54, 58, 62, 66, 70, 74, 78, 85, 89, 93, 121, 125, 140, 150, 154, 158, 162, 178, 182, or 186; a CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16, 20, 24, 28, 32, 39, 43, 47, 51, 55, 59, 63, 67, 71, 75, 79, 82, 86, 90, 94, 122, 126, 137, 141, 151, 155, 159, 179, 183, or 187; and a CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17, 21, 25, 29, 33, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72, 76, 80, 83, 87, 91, 95, 123, 127, 138, 142, 152, 156, 160, 163, 180, 184, or 188.

[0010] In some embodiments, the VHH comprising a CDR1, a CDR2, and a CDR3, respectively comprising the amino acid sequences of: (1) SEQ ID NOs: 15, 16, and 17; or (2) SEQ ID NOs: 19, 20, and 21; or (3) SEQ ID NOs: 23, 24, and 25; or (4) SEQ ID NOs: 27, 28, and 29; or (5) SEQ ID NOs: 31, 32, and 33; or (6) SEQ ID NOs: 35, 24, and 36; or (7) SEQ ID NOs: 38, 39, and 40;  or (8) SEQ ID NOs: 42, 43, and 44; or (9) SEQ ID NOs: 46, 47, and 48; or (10) SEQ ID NOs: 50, 51, and 52; or (11) SEQ ID NOs: 54, 55, and 56; or (12) SEQ ID NOs: 58, 59, and 60; or (13) SEQ ID NOs: 62, 63, and 64; or (14) SEQ ID NOs: 66, 67, and 68; or (15) SEQ ID NOs: 70, 71, and 72; or (16) SEQ ID NOs: 74, 75, and 76; or (17) SEQ ID NOs: 78, 79, and 80; or (18) SEQ ID NOs: 46, 82, and 83; or (19) SEQ ID NOs: 85, 86, and 87; or (20) SEQ ID NOs: 89, 90, and 91; or (21) SEQ ID NOs: 93, 94, and 95; or (22) SEQ ID NOs: 121, 122, and 123; or (23) SEQ ID NOs: 125, 126, and 127; or (24) SEQ ID NOs: 54, 137, and 138; or (25) SEQ ID NOs: 140, 141, and 142; or (26) SEQ ID NOs: 150, 151, and 152; or (27) SEQ ID NOs: 154, 155, and 156; or (28) SEQ ID NOs: 158, 159, and 160; or (29) SEQ ID NOs: 162, 59, and 163; or (30) SEQ ID NOs: 178, 179, and 180; or (31) SEQ ID NOs: 182, 183, and 184; or (32) SEQ ID NOs: 186, 187, and 188.

[0011] In some embodiments, the VHH comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14, 18, 22, 26, 30, 34, 37, 41, 45, 49, 53, 57, 61, 65, 69, 73, 77, 81, 84, 88, 92, 120, 124, 136, 139, 149, 153, 157, 161, 177, 181, or 185, or an amino acid sequence having at least 80%, 85%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%sequence identity thereto.

[0012] In some embodiments, the VHH is humanized. In some embodiments, the VHH comprising the amino acid sequence of SEQ ID NOs: 199, 200, 201, 202, 203, or 204, or an amino acid sequence having at least 80%, 85%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%sequence identity thereto.

[0013] Also provided herein is a polypeptide construct that binds a γδ TCR, comprising the VHH disclosed herein above and an immunoglobulin Fc region.

[0014] In some embodiments, the immunoglobulin Fc region is an IgG Fc region, e.g., an IgG1, IgG2, IgG3, or IgG4 Fc region.

[0015] Also provided herein is an antibody or antigen-binding fragment thereof that binds a γδ TCR, comprising:

[0016] a) a heavy chain variable region (VH) comprising:

[0017] i) HCDR1 comprising the sequence of SEQ ID NO: 97, 105, 113, 129, 144, 165, 171, 190, or 209;

[0018] ii) HCDR2 comprising the sequence of SEQ ID NO: 98, 106, 114, 130, 145, 166, 172, 206, 191, or 210; and

[0019] iii) HCDR3 comprising the sequence of SEQ ID NO: 99, 107, 115, 131, 146, 167, 173, 192, or 211; and / or

[0020] b) a light chain variable region (VL) comprising:

[0021] i) LCDR1 comprising the sequence of SEQ ID NO: 101, 109, 117, 133, 175, 194, or 213;

[0022] ii) LCDR2 comprising the sequence of SEQ ID NO: 102, 110, 118, 134, or 214; and

[0023] iii) LCDR3 comprising the sequence of SEQ ID NO: 103, 111, 119, 135, 148, 169, 176, 195, or 215.

[0024] In some embodiments, the antibody or antigen-binding fragment thereof comprising:

[0025] (1) HCDR1, HCDR2 and HCDR3 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 97, 98, and 99, respectively; and / or, LCDR1, LCDR2 and LCDR3 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 101, 102, and 103, respectively;

[0026] (2) HCDR1, HCDR2 and HCDR3 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 105, 106, and 107, respectively; and / or, LCDR1, LCDR2 and LCDR3 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 109, 110, and 111, respectively;

[0027] (3) HCDR1, HCDR2 and HCDR3 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 113, 114, and 115, respectively; and / or, LCDR1, LCDR2 and LCDR3 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 117, 118, and 119, respectively;

[0028] (4) HCDR1, HCDR2 and HCDR3 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 129, 130, and 131, respectively; and / or, LCDR1, LCDR2 and LCDR3 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 133, 134, and 135, respectively;

[0029] (5) HCDR1, HCDR2 and HCDR3 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 144, 145, and 146, respectively; and / or, LCDR1, LCDR2 and LCDR3 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 109, 110, and 148, respectively;

[0030] (6) HCDR1, HCDR2 and HCDR3 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 165, 166, and 167, respectively; and / or, LCDR1, LCDR2 and LCDR3 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 109, 110, and 169, respectively;

[0031] (7) HCDR1, HCDR2 and HCDR3 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 171, 172, and 173, respectively; and / or, LCDR1, LCDR2 and LCDR3 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 175, 118, and 176, respectively;

[0032] (8) HCDR1, HCDR2 and HCDR3 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 171, 206, and 173, respectively; and / or, LCDR1, LCDR2 and LCDR3 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 175, 118, and 176, respectively;

[0033] (9) HCDR1, HCDR2 and HCDR3 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 190, 191, and 192, respectively; and / or, LCDR1, LCDR2 and LCDR3 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 194, 110, and 195, respectively; or

[0034] (10) HCDR1, HCDR2 and HCDR3 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 209, 210, and 211, respectively; and / or, LCDR1, LCDR2 and LCDR3 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 213, 214, and 215, respectively.

[0035] In some embodiments, the antibody or antigen-binding fragment thereof comprising a VH comprising the amino acid sequence of 96, 104, 112, 128, 143, 164, 170, 189, 205, or 208, or an  amino acid sequence having at least 80%, 85%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%sequence identity thereto; and / or, a VL comprising the amino acid sequence of 100, 108, 116, 132, 147, 168, 174, 193, 207, or 212, or an amino acid sequence having at least 80%, 85%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%sequence identity thereto.

[0036] In some embodiments, the antibody or antigen-binding fragment thereof comprising:

[0037] (1) a VH comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 96 or an amino acid sequence having at least 80%, 85%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%sequence identity thereto; and / or, a VL comprising the sequence of SEQ ID NO: 100 or an amino acid sequence having at least 80%, 85%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%sequence identity thereto;

[0038] (2) a VH comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 104 or an amino acid sequence having at least 80%, 85%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%sequence identity thereto; and / or, a VL comprising the sequence of SEQ ID NO: 108 or an amino acid sequence having at least 80%, 85%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%sequence identity thereto;

[0039] (3) a VH comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 112 or an amino acid sequence having at least 80%, 85%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%sequence identity thereto; and / or, a VL comprising the sequence of SEQ ID NO: 116 or an amino acid sequence having at least 80%, 85%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%sequence identity thereto;

[0040] (4) a VH comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 128 or an amino acid sequence having at least 80%, 85%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%sequence identity thereto; and / or, a VL comprising the sequence of SEQ ID NO: 132 or an amino acid sequence having at least 80%, 85%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%sequence identity thereto;

[0041] (5) a VH comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 143 or an amino acid sequence having at least 80%, 85%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%sequence identity thereto; and / or, a VL comprising the sequence of SEQ ID NO: 147 or an amino acid sequence having at least 80%, 85%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%sequence identity thereto;

[0042] (6) a VH comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 164 or an amino acid sequence having at least 80%, 85%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%sequence identity thereto; and / or, a VL comprising the sequence of SEQ ID NO: 168 or an amino acid sequence having at least 80%, 85%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%,  or 99%sequence identity thereto;

[0043] (7) a VH comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 170 or an amino acid sequence having at least 80%, 85%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%sequence identity thereto; and / or, a VL comprising the sequence of SEQ ID NO: 174 or an amino acid sequence having at least 80%, 85%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%sequence identity thereto;

[0044] (8) a VH comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 189 or an amino acid sequence having at least 80%, 85%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%sequence identity thereto; and / or, a VL comprising the sequence of SEQ ID NO: 193 or an amino acid sequence having at least 80%, 85%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%sequence identity thereto; or

[0045] (9) a VH comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 208 or an amino acid sequence having at least 80%, 85%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%sequence identity thereto; and / or, a VL comprising the sequence of SEQ ID NO: 212 or an amino acid sequence having at least 80%, 85%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%sequence identity thereto.

[0046] In some embodiments, the antibody or antigen-binding fragment thereof is humanized. In some embodiments, the antibody or antigen-binding fragment thereof comprising a VH comprising the sequence of SEQ ID NO: 205 or an amino acid sequence having at least 80%, 85%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%sequence identity thereto; and / or a VL comprising the sequence of SEQ ID NO: 207 or an amino acid sequence having at least 80%, 85%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%sequence identity thereto.

[0047] In some embodiments, the antibody or antigen-binding fragment thereof further comprising: a heavy chain constant region (CH) comprising an amino acid sequence derived from a human immunoglobulin heavy chain constant region. preferably, the heavy chain constant region is an IgG heavy chain constant region, such as an IgG1, IgG2, IgG3 or IgG4 heavy chain constant region. preferably, the antibody or antigen-binding fragment thereof further comprises: a light chain constant region (CL) comprising an amino acid sequence derived from a human immunoglobulin light chain constant region, such as a kappa light chain constant region.

[0048] In some embodiments, the antibody or antigen-binding fragment thereof is selected from scFv, Fab, Fab', (Fab') 2, a Fv fragment, a diabody, a bispecific antibody, a multispecific antibody, a chimeric antibody, or a humanized antibody.

[0049] Also provided is a multispecific molecule comprising a γδ TCR-binding domain which comprises the VHH disclosed herein above and an additional binding domain that binds to a target other than γδ TCR; preferably the multispecific molecule is a bispecific antibody.

[0050] Also is provided is a multispecific molecule comprising a γδ TCR-binding domain which comprises the VH and VL regions of the antibody or antigen-binding fragment thereof disclosed herein above and an additional binding domain that binds to a target other than γδ TCR; preferably the multispecific molecule is a bispecific antibody. In some embodiments, the γδ TCR-binding domain is a scFv, e.g., comprising a structure of VL-Linker-VH or VH-Linker-VL.

[0051] In some embodiments, the target other than γδ TCR is a cancer antigen, e.g., a tumor-specific antigen or tumor-associated antigen.

[0052] In some embodiments, the cancer antigen is an antigen for hematological cancer, e.g., acute myeloid leukemia (AML) , chronic myeloid leukemia, acute lymphoblastic leukemia, chronic lymphocytic leukemia, Hodgkin's lymphoma, Non-Hodgkin's lymphoma or multiple myeloma.

[0053] In some embodiments, the cancer antigen is an antigen for solid tumor, e.g., ovarian cancer, endometrial cancer, breast cancer, lung cancer (small cell or non-small cell) , colon cancer, prostate cancer, cervical cancer, pancreatic cancer, gastric cancer, esophageal cancer, hepatocellular carcinoma (liver cancer) , renal cell carcinoma (kidney cancer) , head-and-neck tumors, mesothelioma, melanoma, sarcomas, or brain tumors (e.g., gliomas, such as glioblastomas) .

[0054] In some embodiments, the cancer antigen is selected from CD33, CD19, CD20, CD22, CD30, CD70, CLL-1, BCMA, DLL-3, Claudin 6, Claudin 18.2, GPC3, GPC2, GPRC5D, CD229, FcRH5, GUCY2C, mesothelin, HER2, PSMA, or PSCA.

[0055] In some embodiments, the additional binding domain is a monovalent antibody fragment, e.g., a Fab, an Fv, a scFv, or a VHH.

[0056] In some embodiments, the multispecific molecule futher comprising an immunoglobulin Fc domain composed of a first and a second subunit; preferably the Fc domain is an IgG Fc domain, e.g., an IgGl Fc domain or an IgG4 Fc domain.

[0057] In some embodiments, the Fc domain comprises one or more amino acid substitution that reduces the binding affinity to an Fc receptor and / or effector function, improves stability (e.g., prevents Fab-arm exchange) , and / or promote heterodimerization (e.g., form a knob-into-hole) .

[0058] In some embodiments, the Fc domain comprises a knob-into-hole structure, e.g., with substitution T366W in the first subunit of the Fc domain and with substitutions T366S and L368A in the second subunit of the Fc domain (numbering according to Kabat EU index) .

[0059] In some embodiments, the Fc domain is of human IgG4 isotype with the amino acid substitutions S228P, L234A and L235A (numbering according to Kabat EU index) .

[0060] In some embodiments, the γδ TCR-binding domain is a VHH or a scFv, the additional binding domain is a Fab composed of a light chain (VL-CL) and a heavy chain (VH-CH1) , and wherein the heavy chain of Fab is fused to one of the Fc domain subunits and the VHH or scFv is fused to the other of the Fc domain subunits.

[0061] In some embodiments, the multispecific molecule comprising:

[0062] a first polypeptide chain comprising a VL of the additional binding domain and a light chain constant domain (CL) ;

[0063] a second polypeptide chain comprising a VH of the additional binding domain, a first heavy chain constant domain 1 (CH1) and a first Fc subunit;

[0064] a third polypeptide chain comprising the γδ TCR-binding domain and a second Fc subunit; preferably the first and second Fc subunits comprise a knob-into-hole structure.

[0065] In some embodiments, an amino acid sequence of the first CH1 and the first Fc subunit is shown in SEQ ID NO: 197, and an amino acid sequence of the second Fc subunit is shown in SEQ ID NO: 198.

[0066] In some embodiments, an amino acid sequence of the CL is shown in SEQ ID NO: 196.

[0067] In some embodiments, the additional binding domain is a Fab that binds CD33, comprising a VH and a VL. In some embodiments, the VH comprises the sequence of SEQ ID NO: 216 or an amino acid sequence having at least 80%sequence identity thereto; and the VL comprises the sequence of SEQ ID NO: 217 or an amino acid sequence having at least 80%sequence identity thereto.

[0068] Also provided is an isolated nucleic acid molecule comprising a nucleotide sequence encoding the VHH, the polypeptide construct, the antibody or antigen-binding fragment thereof, or the multispecific molecule as disclosed herein above.

[0069] Also provided is a vector comprising the nucleic acid molecule disclosed herein above.

[0070] Also provided is a cell comprising the nucleic acid molecule or the vector as disclosed herein above.

[0071] Also provided is a method of producing the VHH, the polypeptide construct, the antibody or antigen-binding fragment thereof, or the multispecific molecule as disclosed herein above, comprising: culturing a host cell comprising the isolated nucleic acid molecule or the vector as disclosed herein above, or the host cell disclosed herein above under a condition that allows protein expression, and recovering the VHH, the polypeptide construct, the antibody or antigen-binding fragment thereof, or the multispecific molecule from a culture of the cultured host cell.

[0072] Also provided is a pharmaceutical composition comprising the VHH, the polypeptide construct, the antibody or antigen-binding fragment thereof, or the multispecific molecule as disclosed herein above, and a pharmaceutically acceptable carrier and / or excipient.

[0073] In some embodiments, the pharmaceutical composition further comprises an additional therapeutic agent.

[0074] In some embodiments, the additional therapeutic agent is an anti-cancer agent, e.g., immune checkpoint inhibitor (e.g., anti-PD-1 antibody, anti-PD-L1 antibody, anti-TIM-3 antibody, anti- LAG-3 antibody, or anti-CTLA-4 antibody) or cytotoxic agent (e.g., an alkylating agent, an anti-mitotic agent, an antitumor antibiotic, an antimetabolite, a topoisomerase inhibitor, a tyrosine kinase inhibitor, or a radionuclide) or a cytokine (e.g, an immune cell activating cytokine, such as IL-2, IL-15, IL-7, IL-6, IL-12, IL-18, IFNα, ΙFΝβ, or IFNγ) .

[0075] Also provided is a method of treating cancer in a subject, comprising administering to a subject in need thereof an effective amount of the VHH, the polypeptide construc, the antibody or antigen-binding fragment thereof, or the multispecific molecule, or the pharmaceutical composition as disclosed herein above.

[0076] In some embodiments, the cancer is a hematological cancer, e.g., acute myeloid leukemia (AML) , chronic myeloid leukemia, acute lymphoblastic leukemia, chronic lymphocytic leukemia, Hodgkin's lymphoma, Non-Hodgkin's lymphoma or multiple myeloma.

[0077] In some embodiments, the cancer is a solid tumor, e.g., ovarian cancer, endometrial cancer, breast cancer, lung cancer (small cell or non-small cell) , colon cancer, prostate cancer, cervical cancer, pancreatic cancer, gastric cancer, esophageal cancer, hepatocellular carcinoma (liver cancer) , renal cell carcinoma (kidney cancer) , head-and-neck tumors, mesothelioma, melanoma, sarcomas, or brain tumors (e.g., gliomas, such as glioblastomas) .

[0078] In some embodiments, the method comprising administering the multispecific molecule for treating cancer which is characterized by a cancer antigen targted by the multispecific molecule.

[0079] In some embodiments, the cancer is characterized by a cancer antigen selected from CD33, CD19, CD20, CD22, CD30, CD70, CLL-1, BCMA, DLL-3, Claudin 6, Claudin 18.2, GPC3, GPC2, GPRC5D, CD229, FcRH5, GUCY2C, mesothelin, HER2, PSMA, or PSCA.

[0080] In some embodiments, the subject is a mammal, such as a human.

[0081] In some embodiments, the VHH, the polypeptide construct, the antibody or antigen-binding fragment thereof, or the multispecific molecule, or the pharmaceutical composition is for administration in combination with an additional therapeutic agent or an additional therapy. In some embodiments, the additional therapeutic agent or an additional therapy is an anti-cancer agent or therapy; preferably, the additional therapeutic agent is an immune checkpoint inhibitor or a cytotoxic agent or cytokine; preferably, the additional therapy is a standard cancer treatment, such as surgery, chemotherapy, radiation therapy, targeted therapy, immunotherapy, hormone therapy, gene therapy or palliative care.

[0082] Also provided is a method of activating γδ T cell or increasing γδ T cell proliferation comprising contacting T cells with the VHH, the polypeptide construct, the antibody or antigen-binding fragment thereof, or the multispecific molecule, or the pharmaceutical composition as disclosed herein above.

[0083] Also provided is use of the VHH, the polypeptide construct, the antibody or antigen-binding  fragment thereof, or the multispecific molecule, or the pharmaceutical composition as disclosed herein above, in manufacture of a medicament for treating cancer in a subject.

[0084] Further features and advantages of certain embodiments of the present disclosure will become more fully apparent in the following description of the embodiments and drawings thereof, and from the claims.BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

[0085] Figure 1. Construct design and sequence IDs of soluble human and cynomolgus γ9δ2 TCRs.

[0086] Figure 2. Construct design and sequence IDs of 5 artificial human TCR proteins.

[0087] Figure 3. Construct design and sequence IDs of CD33 targeting TCE-KIH. Anti-γδ TCR VHH (Fig. 3a) or anti-γδ TCR scFv (Fig. 3b) was assembled into CD33 targeting TCE-KIH BsAb molecule. The linker between VL and VH of scFv is (G4S) 3.

[0088] Figure 4. CD33×γδ TCR TCE-KIH BsAbs redirected killing of AML-193 cells. γ9δ2 T cells were used as effector cells at an effector to-target cell ratio of 2: 1 (Fig. 4a, 4b, 4c and 4d) or 1: 1 (Fig. 4e, 4f and 4g) . In total, 35 BsAbs were tested and 5E7-KIH was used as positive control in both experiments.

[0089] Figure 5. CD33×γδ TCR TCE-KIH BsAbs redirected killing of CD33+ AML-193 cells. AS281876-KIH and AS282152-KIH are shown in Fig. 5a. AS288170-KIH and AS282067-KIH are shown in Fig. 5b. AS282116-KIH and AS287963-KIH are shown in Fig. 5c. 5E7-KIH, 5C8-KIH, 6H1-KIH, 6H4-KIH and 7A5-KIH were used as positive controls.

[0090] Figure 6. CD33×γδ TCR TCE-KIH BsAbs redirected killing of CD33+ MOLM-13 cells. AS281876-KIH and AS282152-KIH are shown in Fig. 6a. AS288170-KIH and AS282067-KIH are shown in Fig. 6b. AS282116-KIH and AS287963-KIH are shown in Fig. 6c. 5E7-KIH, 5C8-KIH, 6H1-KIH, 6H4-KIH and 7A5-KIH were used as positive controls.

[0091] Figure 7. CD33×γδ TCR TCE-KIH BsAbs redirected killing of CD33+ KG-1A cells. AS281876-KIH and AS282152-KIH are shown in Fig. 7a. AS288170-KIH and AS282067-KIH are shown in Fig. 7b. AS282116-KIH and AS287963-KIH are shown in Fig. 7c. 5E7-KIH, 5C8-KIH, 6H1-KIH, 6H4-KIH and 7A5-KIH were used as positive controls.

[0092] Figure 8. CD33×γδ TCR TCE-KIH BsAbs redirected killing of CD33+ NALM6 cells. AS281876-KIH and AS282152-KIH are shown in Fig. 8a. AS288170-KIH and AS282067-KIH are shown in Fig. 8b. AS282116-KIH and AS287963-KIH are shown in Fig. 8c. 5E7-KIH, 5C8-KIH, 6H1-KIH, 6H4-KIH and 7A5-KIH were used as positive controls.

[0093] Figure 9. CD33×γδ TCR TCE-KIH BsAbs redirected killing of CD33-CCRF-CEM. AS281876-KIH and AS282152-KIH are shown in Fig. 9a. AS288170-KIH and AS282067-KIH are shown in Fig. 9b. AS282116-KIH and AS287963-KIH are shown in Fig. 9c. 5E7-KIH, 5C8- KIH, 6H1-KIH, 6H4-KIH and 7A5-KIH were used as positive controls.

[0094] Figure 10. Figs a-e show the cell expansion fold (Fig. 10a) , viability (Fig. 10b) , purity (Fig. 10c) , cell subtype percentages (Fig. 10d) , and CAR positive rate (Fig. 10e) of γδ T cells produced using different antibodies.

[0095] Figure 11. Figs a-c show the cytotoxicity (Fig. 11a) , total T cell expansion (Fig. 11b) and CAR+ T expansion upon tumor cell killing (Fig. 11c) of γδ T cells produced using different antibodies.DETAILED DESCRIPTION

[0096] DEFINITIONS

[0097] In the present disclosure, the scientific and technical terms used herein have the meanings commonly understood by those skilled in the art, unless otherwise stated. For better understanding of the present disclosure, definitions and explanations of terms are provided below.

[0098] As used herein, the term "antibody" refers to an immunoglobulin molecule capable of specific binding to a target through at least one antigen recognition site, located in the variable region of the immunoglobulin molecule. Unless otherwise indicated or clear from the context, the term "antibody" as used to herein may include whole antibodies and any antigen binding fragments (i.e., "antigen-binding portions" ) or single chains thereof. The term "antibody" may refer to conventional antibodies typically comprising at least one heavy chain and at least one light chain. Antibody light chains can be classified as κ and λ light chains. Heavy chains can be classified as μ, δ, γ, α, or ε, and the isotypes of antibody are defined as IgM, IgD, IgG, IgA, and IgE, respectively. Within the light and heavy chains, variable region and constant region are joined by a "J" region of about 12 or more amino acids, and the heavy chain further comprises a "D" region of about 3 or more amino acids. Each heavy chain consists of a heavy chain variable region (VH) and a heavy chain constant region (CH) . The heavy chain constant region consists of three domains (CH1, CH2 and CH3) . Each light chain consists of a light chain variable region (VL) and a light chain constant region (CL) . The light chain constant region consists of one domain CL. The VH and VL regions can also be subdivided into hypervariable regions (referred to as complementarity determining regions (CDRs) ) interspaced with relatively conservative regions called framework regions (FR) . Each of VH and VL consists of three CDRs and four FRs arranged in the following order: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4 from the amino terminus to the carboxy terminus. The variable regions (VH and VL) of each heavy / light chain pair form an antibody binding site, respectively. The term "antibody" is not limited by any particular method for producing the antibody.

[0099] As used herein, the term “VHH” or “VHH domain” refers to the antigen-binding portion of a  single-domain antibody, such as a camelid heavy-chain antibody or shark heavy-chain antibody. A VHH may comprise three CDRs and four framework regions, designated FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, and FR4. A VHH may be truncated at the N-terminus or C-terminus such that it comprises only a partial FR1 and / or FR4, or lacks one or both of those framework regions, so long as the VHH substantially maintains antigen binding and specificity. A “humanized VHH” as used herein refers to a VHH in which one or more framework regions have been substantially replaced with human framework regions. In some instances, certain framework region (FR) residues of the human immunoglobulin are replaced by corresponding non-human residues. Furthermore, the humanized VHH can comprise residues that are found neither in the original VHH nor in the human framework sequences, but are included to further refine and optimize the performance of VHH. As will be appreciated, a humanized sequence can be identified by its primary sequence and does not necessarily denote the process by which the antibody was created.

[0100] As used herein, the term "complementarity determining region" or "CDR" refers to the amino acid residues in the variable region of an antibody that are responsible for antigen binding. The precise boundaries of these amino acid residues can be defined according to various numbering systems known in the art, for example, according to the definitions in the Kabat numbering system (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991) , Chothia numbering system (Chothia & Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196: 901-917; Chothia et al. (1989) Nature 342: 878-883) , AbM numbering system (Martin, in Antibody Engineering, Vol. 2, Chapter 3, Springer Verlag) or IMGT numbering system (Lefranc et al., Dev. Comparat. Immunol. 27: 55-77, 2003) . For a given antibody, those skilled in the art can easily identify the CDRs defined by each numbering system. Moreover, the correspondence between different numbering systems is well known to those skilled in the art (e.g., see Lefranc et al., Dev. Comparat. Immunol. 27: 55-77, 2003) . The CDRs of the antibodies of the disclosure may be defined according to Kabat, AbM, IMGT, or Chothia numbering system, or any combination thereof. Unless otherwise indicated or clear from the context, the CDRs of the antibodies of the disclosure are preferably defined according to AbM numbering system.

[0101] As used herein, the term "framework region" or "FR" residues refers to those amino acid residues other than the CDR residues as defined above in the variable regions of antibody.

[0102] As used herein, the term "antigen-binding fragment" of an antibody refers to a polypeptide comprising a fragment of a full-length antibody, which retains the ability to specifically bind to the same antigen to which the full-length antibody binds, and / or competes with the full-length antibody to specifically bind to the antigen, and which is also referred to as an "antigen-binding portion" . An antigen-binding fragment of an antibody can be produced by recombinant DNA techniques or by enzymatic or chemical cleavage of the intact antibody. The antigen-binding  fragment may comprise Fab, Fab', F (ab') 2, Fd, Fv, dAb and fragments of complementarity determining regions (CDRs) , single chain antibodies (e.g., scFv) , chimeric antibodies, diabodies, and polypeptides comprising at least a portion of the antibody that is sufficient to confer the specific antigen binding ability to the polypeptide.

[0103] As used herein, the term "Fd fragment" refers to an antibody fragment consisting of VH and CH1 domains; the term "dAb fragment" refers to an antibody fragment consisting of VH domain; the term "Fab fragment" refers to an antibody fragment consisting of VL, VH, CL and CH1 domains; the term "F (ab') 2 fragment" refers to an antibody fragment comprising two Fab fragments linked by a disulfide bridge at the hinge region.

[0104] As used herein, the term "Fv fragment" refers to an antibody fragment consisting of VL and VH domains of a single arm of an antibody. An Fv fragment is generally considered to be the smallest antibody fragment that can form a complete antigen binding site. It is believed that six CDRs confer the antigen binding specificity to the antibody. However, even one variable region (e.g., an Fd fragment, which contains only three CDRs specific for an antigen) is able to recognize and bind an antigen, albeit with less affinity than that of the entire binding site.

[0105] As used herein, the term "scFv" refers to a single polypeptide chain comprising VL and VH domains, having a general structure of NH2-VL-linker-VH-COOH or NH2-VH-linker-VL-COOH. A suitable linker of prior art consists of a repeated G4S amino acid sequence or variants thereof. In some cases, there may also be a disulfide bond between the VH and VL of scFv.

[0106] As used herein, the term "diabody" refers to a dimer of scFv which consists of VH and VL domains connected by a short peptide linker. The linker is too short to form intrachain pairing of VH and VL domains. Instead, two such scFv fragments are co-expressed to form multimers by inter-chain pairing (cross-over pairing) of VH and VL domains.

[0107] Each of the antigen-binding fragments maintains the ability to specifically bind to the same antigen to which the full-length antibody binds, and / or compete with the full-length antibody for specific binding to the antigen. An antigen-binding fragment can be obtained from a given antibody (e.g., an intact antibody provided herein) using conventional techniques known to those skilled in the art (e.g., recombinant DNA techniques or enzymatic or chemical cleavage methods) , and can be screened for specificity in the same manner by which intact antibodies are screened.

[0108] As used herein, the term “Fc region” refers to a portion of a heavy chain constant region comprising CH2 and CH3. An Fc region may comprise a hinge, CH2, and CH3. An Fc region may be of any antibody heavy chain constant region isotype discussed herein. An Fc region may be an IgGl, IgG2, IgG3, or IgG4.

[0109] As used herein, the term “chimeric antibody” refers to such an antibody wherein a part of its light chain and / or heavy chain is derived from an antibody (which may be originated from a  specific species or belongs to a specific antibody type or subtype) , and the other part of its light chain and / or heavy chain is derived from another antibody (which may be originated from an identical or different species or belongs to an identical or different antibody type or subtype) , provided that the antibody still retains the activity of binding to the antigen of interest. For example, the term “chimeric antibody” may include such an antibody (e.g., a human-camelid chimeric antibody) , wherein the heavy chain and light chain variable region of the antibody are from a first antibody (e.g., a camelid antibody) , while the heavy chain and light chain constant region of the antibody are from a second antibody (e.g., a human antibody) .

[0110] As used herein, the term "humanized antibody" refers to a genetically engineered non-human antibody of which the amino acid sequence has been modified to increase its homology to the sequence of a human antibody. Generally, all or part of the CDR regions of a humanized antibody are derived from a non-human antibody (donor antibody) , and all or part of the non-CDR regions (e.g., variable region FR and / or constant region) are derived from a human immunoglobulin (receptor antibody) . The humanized antibody typically retains the expected properties of the donor antibody, including, but not limited to, the ability of specifically binding to γδ TCR, the ability of activating γδ T cells.

[0111] As used herein, the term “specifically bind” or “specifically binding” refers to the binding of two molecules in a non-random manner, such as the reaction between an antibody and the antigen it directs to. An antibody that specifically binds to an antigen (or an antibody specific for an antigen) may refer to an antibody that binds to the antigen with an affinity (KD) of less than about 10-5 M, e.g., less than about 10-6 M, 10-7 M, 10-8 M, 10-9 M, or 10-10 M or less.

[0112] As used herein, the term “KD” refers to a dissociation constant of a specific antibody-antigen interaction, which is used to describe the binding affinity of an antibody to an antigen. The smaller the dissociation constant, the more tightly bound the antibody is, and the higher the affinity between antibody and antigen. Generally, an antibody (e.g., the antibody of the disclosure) binds to an antigen (e.g., human γδ TCR) with a KD of less than about 10-5 M, e.g., less than about 10-6 M, 10-7 M, 10-8 M, 10-9 M, or 10-10 M or less, determined by, for example, surface plasmon resonance (SPR) in BIACORE device.

[0113] As used herein, an “isolated nucleic acid” is a nucleic acid, for example, an RNA, DNA, or a mixed nucleic acids, which is substantially separated from other genome DNA sequences as well as proteins or complexes such as ribosomes and polymerases, which naturally accompany a native sequence. An “isolated” nucleic acid molecule is one which is separated from other nucleic acid molecules which are present in the natural source of the nucleic acid molecule. Moreover, an “isolated” nucleic acid molecule, such as a cDNA molecule, can be substantially free of other cellular material, or culture medium when produced by recombinant techniques, or substantially  free of chemical precursors or other chemicals when chemically synthesized. One or more nucleic acid molecules encoding a chimeric construct as described herein may be isolated or purified. The term embraces nucleic acid sequences that have been removed from their naturally occurring environment, and includes recombinant or cloned DNA isolates and chemically synthesized analogues or analogues biologically synthesized by heterologous systems. A substantially pure molecule may include isolated forms of the molecule.

[0114] As used herein, the term “vector” refers to a nucleic acid vehicle which can have a polynucleotide inserted therein. When the vector allows for the expression of the protein encoded by the polynucleotide inserted therein, the vector is called an expression vector. The vector can have the carried genetic material elements expressed in a host cell by transformation, transduction, or transfection into the host cell. Vectors are well known by a person skilled in the art, including, but not limited to plasmids, phages, cosmids, artificial chromosome such as yeast artificial chromosome (YAC) , bacterial artificial chromosome (BAC) or P1-derived artificial chromosome (PAC) ; phage such as λ phage or M13 phage and animal virus. The animal viruses that can be used as vectors, include, but are not limited to, retrovirus (including lentivirus) , adenovirus, adeno-associated virus, herpes virus (such as herpes simplex virus) , pox virus, baculovirus, papillomavirus, papova virus (such as SV40) . A vector may comprise multiple elements for controlling expression, including, but not limited to, a promoter sequence, a transcription initiation sequence, an enhancer sequence, a selection element, and a reporter gene. In addition, a vector may comprise origin of replication.

[0115] As used herein, the term “host cell” refers to a cell into which a vector can be introduced or transformed, including, but not limited to, prokaryotic cells such as E. coli or Bacillus subtilis, and eukaryotic cells such as mammal cells (e.g., mouse cell or human cell) , insect cells or yeast cells. Suitable eukaryotic cells include, but not limited to, NS0 cells, Vero cells, Hela cells, COS cells, CHO cells, HEK293 cells, BHK cells or MDCKII cells.

[0116] As used herein, the culture medium may comprise a base medium. Any suitable mammalian cell culture medium such as AIM-VTM, X-VIVO, TexMACS, RPMI 1640, OPTMIZER CTSTM (Gibco, Life Technologies) , XVIVO-10, XVIVO-15 or XVIVO-20 (Lonza) may be used as the base medium. The cell culture medium may comprise L-glutamine, streptomycin sulfate, and gentamicin sulfate. The cell culture medium may comprise L-glutamine, 50 μg / mL streptomycin sulfate, and 10 μg / mL gentamicin sulfate. The mammalian cell culture medium may comprise serum or plasma. The cell culture medium may contain a base medium in an amount that is about 10%, about 20%, about 30%, about 40%, about 50%, about 60%, about 70%, about 80%, about 90%, or about 95%by volume. The cell culture medium may contain a base medium in an amount that is more than 10%, more than 20%, more than 30%, more than 40%, more than 50%, more  than 60%, more than 70%, more than 80%, more than 90%, or more than 95%by volume. The cell culture medium may contain a base medium in an amount that is less than 10%, less than 20%, less than 30%, less than 40%, less than 50%, less than 60%, less than 70%, less than 80%, less than 90%, or less than 95%by volume.

[0117] As used herein, the term “identity” refers to the match degree between two polypeptides or between two nucleic acids. When two sequences for comparison have the same monomer sub-unit of base or amino acid at a certain site (e.g., each of two DNA molecules has an adenine at a certain site, or each of two polypeptides has a lysine at a certain site) , the two molecules are identical at the site. The percent identity between two sequences is a function of the number of identical sites shared by the two sequences over the total number of sites for comparison × 100. For example, if 6 of 10 sites of two sequences are matched, these two sequences have an identity of 60%. For example, DNA sequences: CTGACT and CAGGTT share an identity of 50% (3 of 6 sites are matched) . Generally, the comparison of two sequences is conducted in a manner to produce maximum identity. Such alignment can be conducted by using a computer program such as Align program (DNAstar, Inc. ) which is based on the method of Needleman, et al. (J. Mol. Biol. 48: 443-453, 1970) . The percent identity between two amino acid sequences can also be determined using the algorithm of E. Meyers and W. Miller (Comput. Appl. Biosci., 4: 11-17 (1988) ) which has been incorporated into the ALIGN program (version 2.0) , using a PAM120 weight residue table, a gap length penalty of 12 and a gap penalty of 4. In addition, the percentage of identity between two amino acid sequences can be determined by the algorithm of Needleman and Wunsch (J. Mol. Biol. 48:444-453 (1970) ) which has been incorporated into the GAP program in the GCG software package (available at http:  / / www. gcg. com) , using either a Blossum 62 matrix or a PAM250 matrix, and a gap weight of 16, 14, 12, 10, 8, 6, or 4 and a length weight of 1, 2, 3, 4, 5, or 6.

[0118] As used herein, the term "pharmaceutically acceptable carrier and / or excipient" refers to a carrier and / or excipient that is pharmacologically and / or physiologically compatible with a subject and an active ingredient, which includes, but is not limited to: pH adjusting agents, surfactants, adjuvants, ionic strength enhancers, diluents, agents to maintain osmotic pressure, agents to delay absorption, preservatives. For example, pH adjusting agents include, but are not limited to, phosphate buffered saline. Surfactants include, but are not limited to, cationic, anionic or non-ionic surfactants, such as Tween-80. Ionic strength enhancers include, but are not limited to, sodium chloride. Preservatives include, but are not limited to, various antibacterial and antifungal agents, such as parabens, trichloro-t-butanol, phenol, sorbic acid, and the like. Agents to maintain osmotic pressure include, but are not limited to, sugar, NaCl, and the like. Agents to delay absorption include, but are not limited to, monostearate and gelatin. Diluents include, but are not limited to, water, aqueous buffers (e.g., buffered saline) , alcohols and polyols (e.g., glycerol) , and the like.  Stabilizers have the meaning commonly understood by those skilled in the art, which can stabilize the desired activity of active ingredient in drug, including but not limited to sodium glutamate, gelatin, SPGA, saccharides (e.g., sorbitol, mannitol, starch, sucrose, lactose, dextran, or glucose) , amino acids (e.g., glutamic acid, glycine) , proteins (e.g., dried whey, albumin, or casein) or degradation products thereof (e.g., lactalbumin hydrolysate) , etc. The pharmaceutically acceptable carrier or excipient may include a sterile injectable liquid (e.g., an aqueous or non-aqueous suspension or solution) . Such sterile injectable liquid may be selected from the group consisting of water for injection (WFI) , bacteriostatic water for injection (BWFI) , sodium chloride solution (e.g., 0.9% (w / v) NaCl) , glucose solution (e.g., 5%glucose) , surfactant-containing solution (e.g., 0.01%polysorbate 20) , pH buffer solution (e.g., phosphate buffer solution) , Ringer's solution, and any combination thereof.

[0119] As used herein, the term “treatment / treating” refers to a method that is carried out in order to obtain a beneficial or desired clinical outcome. For the purpose of the disclosure, the beneficial or desired clinical outcome includes, but is not limited to, easing symptom, narrowing the scope of disease, stabilizing (i.e., not aggravating) the state of disease, delaying or slowing the progress of disease, and alleviating symptoms (either partially or completely) , no matter detectable or not detectable. In addition, “treatment” also refers to a prolonged survival period compared to the expected survival period (if no treatment is accepted) . The beneficial or desired clinical outcome described herein may include, but not limited to, slowing of tumor progression, cancer regression, enhancement of anti-tumor immune response, a reduction in tumor growth or size, necrosis of the tumor, a decrease in severity of at least one disease symptom, an increase in frequency and duration of disease symptom-free periods, a prevention of impairment or disability due to the disease affliction, or otherwise amelioration of disease symptoms in the patient.

[0120] As used herein, the term “subject” refers to any human or non-human animal that receives treatment. The term "non-human animal" includes all vertebrates, e.g., mammals and non-mammals, such as non-human primates, sheep, dog, cow, chickens, amphibians, reptiles, etc.

[0121] As used herein, the term “an effective amount” refers to an amount that is sufficient to achieve or at least partially achieve the expected effect. For example, an effective amount for treating a disease refers to an amount effective for curing or at least partially blocking a disease and its complication in a patient having the disease. The determination of such an effective amount is within the ability of a person skilled in the art. For example, an amount effective for a therapeutic use depends on severity of a disease to be treated, general state of the immune system in a patient, general conditions of a patient, such as age, weight and gender, administration routes of drugs, additional therapies used simultaneously, and the like.

[0122] As used herein, the terms "cancer" and "tumor" are used interchangeably and refer to a large  group of diseases characterized by the uncontrolled growth of abnormal cells in the body. Unregulated cell division may lead to the formation of malignant tumors or cells that invade adjacent tissues, and may metastasize to distant parts of the body through the lymphatic system or bloodstream. Cancers include benign and malignant cancers as well as dormant tumors or micrometastasis. Cancers also include hematological malignancies.

[0123] VHH antibodies that bind γδ TCR

[0124] In one aspect, VHHs that bind a γδ TCR, heavy chain antibodies or polypeptide constructs comprising the VHHs are provided. The terms “VHH” or “VHH domain” are used interchangeably herein to refer to the antigen-binding portion of a single-domain antibody, such as a camelid heavy-chain antibody or shark heavy-chain antibody. A VHH typically comprises three CDRs and four framework regions, designated FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, and FR4. In some cases, a VHH may be truncated at the N-terminus or C-terminus such that it comprises only a partial FR1 and / or FR4, or lacks one or both of those framework regions, so long as the VHH substantially maintains antigen binding and specificity.

[0125] The term “heavy chain-only antibody” or “HCAb” refers to a functional antibody, which comprises heavy chains, but lacks the light chains usually found in 4-chain antibodies. Camelid animals (such as camels, llamas, or alpacas) are known to produce HCAbs. The HCAb may comprise a sdAb that is fused with a Fc region. The HCAb may comprise a sdAb that is fused with a human IgG1 hinge and Fc region.

[0126] The VHHs, heavy chain antibodies or polypeptide constructs provided herein may particularly bind γ9δ2 TCR (e.g., human γ9δ2 TCR comprising γ-chain of SEQ ID NO: 1 and δ-chain of SEQ ID NO: 2) .

[0127] In one aspect, provided herein is a VHH that binds a γδ TCR (e.g., γ9δ2 TCR) , comprising a CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15, 19, 23, 27, 31, 35, 38, 42, 46, 50, 54, 58, 62, 66, 70, 74, 78, 85, 89, 93, 121, 125, 140, 150, 154, 158, 162, 178, 182, or 186; a CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16, 20, 24, 28, 32, 39, 43, 47, 51, 55, 59, 63, 67, 71, 75, 79, 82, 86, 90, 94, 122, 126, 137, 141, 151, 155, 159, 179, 183, or 187; and a CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17, 21, 25, 29, 33, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72, 76, 80, 83, 87, 91, 95, 123, 127, 138, 142, 152, 156, 160, 163, 180, 184, or 188. The CDRs described above may be defined according to the AbM numbering system.

[0128] In one aspect, provided herein is a VHH that binds a γδ TCR (e.g., γ9δ2 TCR) , comprising the three CDRs contained in the VHH shown in any one of SEQ ID NO: 14, 18, 22, 26, 30, 34, 37, 41, 45, 49, 53, 57, 61, 65, 69, 73, 77, 81, 84, 88, 92, 120, 124, 136, 139, 149, 153, 157, 161, 177, 181, 185, 199, 200, 201, 202, 203, or 204. The CDRs may be defined according to Kabat, AbM,  IMGT, or Chothia numbering system, or any combination thereof.

[0129] The VHH may comprise a CDR1, a CDR2, and a CDR3, respectively comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 15, 16, and 17. The VHH may comprise a CDR1, a CDR2, and a CDR3, respectively comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 19, 20, and 21. The VHH may comprise a CDR1, a CDR2, and a CDR3, respectively comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 23, 24, and 25. The VHH may comprise a CDR1, a CDR2, and a CDR3, respectively comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 27, 28, and 29. The VHH may comprise a CDR1, a CDR2, and a CDR3, respectively comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 31, 32, and 33. The VHH may comprise a CDR1, a CDR2, and a CDR3, respectively comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 35, 24, and 36. The VHH may comprise a CDR1, a CDR2, and a CDR3, respectively comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 38, 39, and 40. The VHH may comprise a CDR1, a CDR2, and a CDR3, respectively comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 42, 43, and 44. The VHH may comprise a CDR1, a CDR2, and a CDR3, respectively comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 46, 47, and 48. The VHH may comprise a CDR1, a CDR2, and a CDR3, respectively comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 50, 51, and 52. The VHH may comprise a CDR1, a CDR2, and a CDR3, respectively comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 54, 55, and 56. The VHH may comprise a CDR1, a CDR2, and a CDR3, respectively comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 58, 59, and 60. The VHH may comprise a CDR1, a CDR2, and a CDR3, respectively comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 62, 63, and 64. The VHH may comprise a CDR1, a CDR2, and a CDR3, respectively comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 66, 67, and 68. The VHH may comprise a CDR1, a CDR2, and a CDR3, respectively comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 70, 71, and 72. The VHH may comprise a CDR1, a CDR2, and a CDR3, respectively comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 74, 75, and 76. The VHH may comprise a CDR1, a CDR2, and a CDR3, respectively comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 78, 79, and 80. The VHH may comprise a CDR1, a CDR2, and a CDR3, respectively comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 46, 82, and 83. The VHH may comprise a CDR1, a CDR2, and a CDR3, respectively comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 85, 86, and 87. The VHH may comprise a CDR1, a CDR2, and a CDR3, respectively comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 89, 90, and 91. The VHH may comprise a CDR1, a CDR2, and a CDR3, respectively comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 93, 94, and 95. The VHH may comprise a CDR1, a CDR2, and a CDR3, respectively comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 121, 122, and 123. The VHH may comprise a CDR1, a CDR2, and a CDR3, respectively comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 125, 126, and 127. The VHH may comprise  a CDR1, a CDR2, and a CDR3, respectively comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 54, 137, and 138. The VHH may comprise a CDR1, a CDR2, and a CDR3, respectively comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 140, 141, and 142. The VHH may comprise a CDR1, a CDR2, and a CDR3, respectively comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 150, 151, and 152. The VHH may comprise a CDR1, a CDR2, and a CDR3, respectively comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 154, 155, and 156. The VHH may comprise a CDR1, a CDR2, and a CDR3, respectively comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 158, 159, and 160. The VHH may comprise a CDR1, a CDR2, and a CDR3, respectively comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 162, 59, and 163. The VHH may comprise a CDR1, a CDR2, and a CDR3, respectively comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 178, 179, and 180. The VHH may comprise a CDR1, a CDR2, and a CDR3, respectively comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 182, 183, and 184. The VHH may comprise a CDR1, a CDR2, and a CDR3, respectively comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 186, 187, and 188.

[0130] The VHH disclosed herein may further comprise framework regions (FRs) .

[0131] The VHH may comprise framework regions (FRs) derived from a camelid heavy-chain antibody.

[0132] The VHH may comprise the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14, 18, 22, 26, 30, 34, 37, 41, 45, 49, 53, 57, 61, 65, 69, 73, 77, 81, 84, 88, 92, 120, 124, 136, 139, 149, 153, 157, 161, 177, 181, or 185, or an amino acid sequence having at least 80% (e.g., at least 85%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%) sequence identity thereto.

[0133] Alternatively, the VHH may be a humanized VHH, in which one or more framework regions have been substantially replaced with human framework regions. The VHH may comprise framework regions (FRs) derived from a human immunoglobulin heavy chain variable region, in which one or several framework residues can be mutated back to their camelid counterparts (i.e., backmutation) .

[0134] The VHH may comprise the amino acid sequence of SEQ ID NO: 199, 200, 201, 202, 203, or 204, or an amino acid sequence having at least 80% (e.g., at least 85%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%) sequence identity thereto.

[0135] The VHH may be selected from AS282152 (comprising CDR1, CDR2, and CDR3 respectively comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 66, 67, and 68) , AS281876 (comprising CDR1, CDR2, and CDR3 respectively comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 27, 28, and 29) , AS282067 (comprising CDR1, CDR2, and CDR3 respectively  comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 50, 51, and 52) , which recognizes an epitope located at Vγ9 and constant region of γδ TCR.

[0136] The VHH may be selected from AS282116 (comprising CDR1, CDR2, and CDR3 respectively comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 58, 59, and 60) , or AS287963 (comprising CDR1, CDR2, and CDR3 respectively comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 162, 59, and 163) , which recognizes an epitope located at constant region of γδ TCR.

[0137] In one aspect, also provided herein is a heavy chain antibody that binds a γδ TCR (e.g., γ9δ2 TCR) , comprising the VHH as described herein. The heavy chain antibody may be a dimer of two polypeptides wherein each polypeptide comprises at least one VHH domain and an Fc region. The heavy chain antibody may encompass polypeptides that comprise multiple VHH domains.

[0138] In one aspect, also provided herein is a polypeptide construct that binds a γδ TCR (e.g., γ9δ2 TCR) , comprising the VHH as described herein and an immunoglobulin Fc region.

[0139] The immunoglobulin Fc region may be an IgG Fc region, e.g., an IgG1, IgG2, IgG3, or IgG4 Fc region. The immunoglobulin Fc region may further be a human IgG Fc region, e.g., a human IgG1, IgG2, IgG3, or IgG4 Fc region.

[0140] The immunoglobulin Fc region may be a native sequence Fc region comprising an amino acid sequence identical to the amino acid sequence of an Fc region found in nature.

[0141] Alternatively, the immunoglobulin Fc region may be a variant Fc region comprising an amino acid sequence which differs from that of a native sequence Fc region by virtue of at least one amino acid mutation. Mutation (s) (e.g., one or more amino acid substitutions) can be introduced into the Fc region of constant region to alter (increase, reduce or eliminate) the effector function (s) of the antibody, such as ADCC, CDC or ADCP compared with the same antibody without the mutation (s) . The immunoglobulin Fc region may possesse reduced or eliminated effector function (s) .

[0142] The VHH may be fused (e.g., at its C-terminus) to the N-terminus of the immunoglobulin Fc region without a linker.

[0143] Alternatively, the VHH may be fused (e.g., at its C-terminus) to the N-terminus of the immunoglobulin Fc region with a linker. The linker may be selected from a cleavable linker, a non-cleavable linker, a peptide linker, a flexible linker, a rigid linker, a helical linker, and a non-helical linker. The linker may be a peptide linker. The linker may comprise the sequence of (GmS) n, wherein m is selected from integer of 1-6, e.g., 1, 2, 3, or 4, n is selected from integer of 1-6, e.g., 1, 2, or 3.

[0144] In all of these aspects described herein before, the VHH, heavy chain antibody or polypeptide construct disclosed herein can activate γδ T cells and / or increase γδ T cell proliferation, potentially resulting in effective antitumour response.

[0145] Conventional antibodies that bind γδ TCR

[0146] In one aspect, conventional antibodies that bind a γδ TCR are provided. The term “conventional antibody” refers to an antibody typically comprising at least one heavy chain and at least one light chain. In some cases, it refers to the conventional Y-shaped antibody composed of two heavy and two light chains. In some cases, the conventional antibodies provided herein particularly binds γ9δ2 TCR (e.g., human γ9δ2 TCR comprising γ-chain of SEQ ID NO: 1 and δ-chain of SEQ ID NO: 2) .

[0147] CDRs and Variable regions

[0148] In one aspect, provided herein is an antibody or antigen-binding fragment thereof that binds a γδ TCR (e.g., γ9δ2 TCR) , comprising:

[0149] a) a heavy chain variable region (VH) comprising:

[0150] i) HCDR1 comprising the sequence of SEQ ID NO: 97, 105, 113, 129, 144, 165, 171, 190, or 209;

[0151] ii) HCDR2 comprising the sequence of SEQ ID NO: 98, 106, 114, 130, 145, 166, 172, 206, 191, or 210; and

[0152] iii) HCDR3 comprising the sequence of SEQ ID NO: 99, 107, 115, 131, 146, 167, 173, 192, or 211; and / or

[0153] b) a light chain variable region (VL) comprising:

[0154] i) LCDR1 compri sing the sequence of SEQ ID NO: 101, 109, 117, 133, 175, 194, or 213;

[0155] ii) LCDR2 comprising the sequence of SEQ ID NO: 102, 110, 118, 134, or 214; and

[0156] iii) LCDR3 comprising the sequence of SEQ ID NO: 103, 111, 119, 135, 148, 169, 176, 195, or 215. The CDRs may be defined according to AbM numbering system.

[0157] In one aspect, provided herein is an antibody or antigen-binding fragment thereof that binds a γδ TCR (e.g., γ9δ2 TCR) , comprising the three heavy chain CDRs contained in the VH shown in any one of SEQ ID NO: 96, 104, 112, 128, 143, 164, 170, 205, 189, or 208; and / or, the three light chain CDRs contained in the VL shown in any one of SEQ ID NO: 100, 108, 116, 132, 147, 168, 174, 207, 193, or 212. The CDRs may be defined according to Kabat, AbM, IMGT, or Chothia numbering system, or any combination thereof.

[0158] The antibody or antigen-binding fragment thereof may comprise: HCDR1, HCDR2 and HCDR3 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 97, 98, and 99, respectively; and / or, LCDR1, LCDR2 and LCDR3 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 101, 102, and 103, respectively. The antibody or antigen-binding fragment thereof may comprise: HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 and LCDR3 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 97, 98, 99, 101, 102, and 103, respectively.

[0159] The antibody or antigen-binding fragment thereof may comprise: HCDR1, HCDR2 and  HCDR3 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 105, 106, and 107, respectively; and / or, LCDR1, LCDR2 and LCDR3 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 109, 110, and 111, respectively. The antibody or antigen-binding fragment thereof may comprise: HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 and LCDR3 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 105, 106, 107, 109, 110, and 111, respectively.

[0160] The antibody or antigen-binding fragment thereof may comprise: HCDR1, HCDR2 and HCDR3 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 113, 114, and 115, respectively; and / or, LCDR1, LCDR2 and LCDR3 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 117, 118, and 119, respectively. The antibody or antigen-binding fragment thereof may comprise: HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 and LCDR3 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 113, 114, 115, 117, 118, and 119, respectively.

[0161] The antibody or antigen-binding fragment thereof may comprise: HCDR1, HCDR2 and HCDR3 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 129, 130, and 131, respectively; and / or, LCDR1, LCDR2 and LCDR3 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 133, 134, and 135, respectively. The antibody or antigen-binding fragment thereof may comprise: HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 and LCDR3 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 129, 130, 131, 133, 134, and 135, respectively.

[0162] The antibody or antigen-binding fragment thereof may comprise: HCDR1, HCDR2 and HCDR3 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 144, 145, and 146, respectively; and / or, LCDR1, LCDR2 and LCDR3 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 109, 110, and 148, respectively. The antibody or antigen-binding fragment thereof may comprise: HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 and LCDR3 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 144, 145, 146, 109, 110, and 148, respectively.

[0163] The antibody or antigen-binding fragment thereof may comprise: HCDR1, HCDR2 and HCDR3 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 165, 166, and 167, respectively; and / or, LCDR1, LCDR2 and LCDR3 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 109, 110, and 169, respectively. The antibody or antigen-binding fragment thereof may comprise: HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 and LCDR3 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 165, 166, 167, 109, 110, and 169, respectively.

[0164] The antibody or antigen-binding fragment thereof may comprise: HCDR1, HCDR2 and HCDR3 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 171, 172, and 173, respectively; and / or, LCDR1, LCDR2 and LCDR3 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 175, 118, and 176, respectively. The antibody or antigen-binding fragment thereof may comprise: HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 and LCDR3 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 171, 172, 173, 175, 118, and 176 respectively.

[0165] The antibody or antigen-binding fragment thereof may comprise: HCDR1, HCDR2 and HCDR3 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 171, 206, and 173, respectively; and / or, LCDR1, LCDR2 and LCDR3 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 175, 118, and 176, respectively. The antibody or antigen-binding fragment thereof may comprise: HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 and LCDR3 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 171, 206, 173, 175, 118, and 176, respectively.

[0166] The antibody or antigen-binding fragment thereof may comprise: HCDR1, HCDR2 and HCDR3 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 190, 191, and 192, respectively; and / or, LCDR1, LCDR2 and LCDR3 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 194, 110, and 195, respectively. The antibody or antigen-binding fragment thereof may comprise: HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 and LCDR3 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 190, 191, 192, 194, 110, and 195, respectively.

[0167] The antibody or antigen-binding fragment thereof may comprise: HCDR1, HCDR2 and HCDR3 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 209, 210, and 211, respectively; and / or, LCDR1, LCDR2 and LCDR3 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 213, 214, and 215, respectively. The antibody or antigen-binding fragment thereof may comprise: HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 and LCDR3 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 209, 210, 211, 213, 214, and 215, respectively.

[0168] The conventional antibody may be AS288170 (comprising HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 and LCDR3 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 171, 172 or 206, 173, 175, 118, and 176, respectively) , which recognizes an epitope located at Vγ9 and constant region of γδ TCR.

[0169] The antibody or antigen-binding fragment thereof disclosed herein may further comprise framework regions (FRs) . The antibody or antigen-binding fragment thereof may comprise framework regions (FRs) derived from a mammalian (e.g., camelid or human) immunoglobulin.

[0170] The antibody or antigen-binding fragment thereof may comprise framework regions (FRs) derived from a camelid conventional antibody.

[0171] The antibody or antigen-binding fragment thereof may comprise a VH comprising the amino acid sequence of 96, 104, 112, 128, 143, 164, 170, 189, or 208, or an amino acid sequence having at least 80% (e.g., at least 85%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%) sequence identity thereto.

[0172] The antibody or antigen-binding fragment thereof may comprise a VL comprising the amino acid sequence of 100, 108, 116, 132, 147, 168, 174, 193, or 212, or an amino acid sequence having at least 80% (e.g., at least 85%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%) sequence identity thereto.

[0173] The antibody or antigen-binding fragment thereof may comprise: a VH comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 96 or an amino acid sequence having at least 80% (e.g., at least 85%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%) sequence identity thereto; and / or, a VL comprising the sequence of SEQ ID NO: 100 or an amino acid sequence having at least 80% (e.g., at least 85%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%) sequence identity thereto. The antibody or antigen-binding fragment thereof may comprise: a VH comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 96; and a VL comprising the sequence of SEQ ID NO: 100.

[0174] The antibody or antigen-binding fragment thereof may comprise: a VH comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 104 or an amino acid sequence having at least 80% (e.g., at least 85%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%) sequence identity thereto; and / or, a VL comprising the sequence of SEQ ID NO: 108 or an amino acid sequence having at least 80% (e.g., at least 85%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%) sequence identity thereto. The antibody or antigen-binding fragment thereof may comprise: a VH comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 104; and a VL comprising the sequence of SEQ ID NO: 108.

[0175] The antibody or antigen-binding fragment thereof may comprise: a VH comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 112 or an amino acid sequence having at least 80% (e.g., at least 85%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%) sequence identity thereto; and / or, a VL comprising the sequence of SEQ ID NO: 116 or an amino acid sequence having at least 80% (e.g., at least 85%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%) sequence identity thereto. The antibody or antigen-binding fragment thereof may comprise: a VH comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 112; and a VL comprising the sequence of SEQ ID NO: 116.

[0176] The antibody or antigen-binding fragment thereof may comprise: a VH comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 128 or an amino acid sequence having at least 80% (e.g., at least 85%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%) sequence identity thereto; and / or, a VL comprising the sequence of SEQ ID NO: 132 or an amino acid sequence having at least 80% (e.g., at least 85%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%) sequence identity thereto. The antibody or antigen-binding fragment thereof may comprise: a VH comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 128;  and a VL comprising the sequence of SEQ ID NO: 132.

[0177] The antibody or antigen-binding fragment thereof may comprise: a VH comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 143 or an amino acid sequence having at least 80% (e.g., at least 85%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%) sequence identity thereto; and / or, a VL comprising the sequence of SEQ ID NO: 147 or an amino acid sequence having at least 80% (e.g., at least 85%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%) sequence identity thereto. The antibody or antigen-binding fragment thereof may comprise: a VH comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 143; and a VL comprising the sequence of SEQ ID NO: 147.

[0178] The antibody or antigen-binding fragment thereof may comprise: a VH comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 164 or an amino acid sequence having at least 80% (e.g., at least 85%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%) sequence identity thereto; and / or, a VL comprising the sequence of SEQ ID NO: 168 or an amino acid sequence having at least 80% (e.g., at least 85%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%) sequence identity thereto. The antibody or antigen-binding fragment thereof may comprise: a VH comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 164; and a VL comprising the sequence of SEQ ID NO: 168.

[0179] The antibody or antigen-binding fragment thereof may comprise: a VH comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 170 or an amino acid sequence having at least 80% (e.g., at least 85%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%) sequence identity thereto; and / or, a VL comprising the sequence of SEQ ID NO: 174 or an amino acid sequence having at least 80% (e.g., at least 85%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%) sequence identity thereto. The antibody or antigen-binding fragment thereof may comprise: a VH comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 170; and a VL comprising the sequence of SEQ ID NO: 174.

[0180] The antibody or antigen-binding fragment thereof may comprise: a VH comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 189 or an amino acid sequence having at least 80% (e.g., at least 85%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%) sequence identity thereto; and / or, a VL comprising the sequence of SEQ ID NO: 193 or an amino acid sequence having at least 80% (e.g., at least 85%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%) sequence identity thereto. The antibody or antigen-binding  fragment thereof may comprise: a VH comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 189; and a VL comprising the sequence of SEQ ID NO: 193.

[0181] The antibody or antigen-binding fragment thereof may comprise: a VH comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 208 or an amino acid sequence having at least 80% (e.g., at least 85%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%) sequence identity thereto; and / or, a VL comprising the sequence of SEQ ID NO: 212 or an amino acid sequence having at least 80% (e.g., at least 85%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%) sequence identity thereto. The antibody or antigen-binding fragment thereof may comprise: a VH comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 208; and a VL comprising the sequence of SEQ ID NO: 212.

[0182] Alternatively, the antibody or antigen-binding fragment thereof may be humanized, in which the amino acid sequence has been modified to increase its homology to the sequence of a human antibody. Typically, camelid CDR regions can be grafted onto a human framework sequence to produce humanized antibody. In case of affinity loss of these straight-graft antibodies, several framework residues can be mutated back to their camelid counterparts (i.e., backmutation) to restore the binding affinity of antibody.

[0183] The antibody or antigen-binding fragment thereof may comprise framework regions (FRs) derived from a human immunoglobulin, optionally comprising one or more back mutations from human residues to camelid residues. The antibody or antigen-binding fragment thereof may comprise heavy chain FRs derived from a human immunoglobulin heavy chain variable region sequence. The antibody or antigen-binding fragment thereof may comprise light chain FRs derived from a human immunoglobulin light chain variable region sequence.

[0184] The antibody or antigen-binding fragment thereof may comprise a VH comprising the sequence of SEQ ID NO: 205 or an amino acid sequence having at least 80% (e.g., at least 85%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%) sequence identity thereto; and / or a VL comprising the sequence of SEQ ID NO: 207 or an amino acid sequence having at least 80% (e.g., at least 85%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%) sequence identity thereto. The antibody or antigen-binding fragment thereof may comprise a VH comprising the sequence of SEQ ID NO: 205; and a VL comprising the sequence of SEQ ID NO: 207.

[0185] Constant regions

[0186] The antibody or antigen-binding fragment thereof disclosed herein may further comprise a constant region sequence derived from a mammalian (e.g., camelid or human) immunoglobulin.  The antibody or antigen-binding fragment thereof of the present disclosure may comprise a constant region sequence derived from a human immunoglobulin.

[0187] Any immunoglobulin constant region can be used in the antibodies disclosed herein. The heavy chain constant region can be a human IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, or IgY immunoglobulin molecule, any class (e.g., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, and IgA2) , or any subclass (e.g., IgG2a and IgG2b) of immunoglobulin molecule. Light chain constant region can be lambda or kappa. The heavy chain constant region may further be an IgG heavy chain constant region, such as an IgG1, IgG2, IgG3 or IgG4 heavy chain constant region. The light chain constant region may further be kappa.

[0188] The choice of constant region depends, in part, whether antibody-dependent complement and / or cellular mediated cytotoxicity is desired. The heavy chain constant region with less or reduced effector function may be preferred. Alternatively, the heavy chain constant region with effector function (e.g., ADCC) or enhanced effector function may be preferred.

[0189] The heavy chain of the antibody or antigen-binding fragment thereof disclosed herein may comprise a heavy chain constant region (CH) comprising an amino acid sequence derived from a human immunoglobulin heavy chain constant region.

[0190] The antibody or antigen-binding fragment thereof disclosed herein may comprise a heavy chain constant region that is a wild-type heavy chain constant region.

[0191] Alternatively, the antibody or antigen-binding fragment thereof disclosed herein may comprise a heavy chain constant region that is a variant of a wild-type heavy chain constant region. Mutation (s) (e.g., one or more amino acid substitutions) can be introduced into the Fc region of constant region to alter (increase, reduce or eliminate) the effector function (s) of the antibody, such as ADCC, CDC or ADCP compared with the same antibody without the mutation (s) .

[0192] The light chain of the antibody or antigen-binding fragment thereof disclosed herein may comprise a light chain constant region (CL) comprising an amino acid sequence derived from a human immunoglobulin light chain constant region.

[0193] Antigen-binding fragments

[0194] The antigen-binding fragment disclosed herein may be any type of fragment of an antibody having a conventional "Y" type structure, which substantially retains the ability to specifically bind to γδ TCR and promote the activation or proliferation of γδ T cells.

[0195] The antibody or antigen-binding fragment thereof disclosed herein may be selected from the group consisting of scFv, Fab, Fab', (Fab') 2, Fv fragments, diabodies, bispecific antibodies, multispecific antibodies, chimeric antibodies, or humanized antibodies.

[0196] In all of these aspects described herein before, the antibody or antigen-binding fragment thereof disclosed herein can activate γδ T cells and / or increase γδ T cell proliferation, potentially  resulting in effective antitumour response.

[0197] Also provided are "conservative sequence modifications" to the antibody sequence (including VHH, heavy chain antibodies and conventional antibodies) provided herein, i.e., nucleotide and amino acid sequence modifications that do not abrogate the binding of the antibody encoded by the nucleotide sequence or containing the amino acid sequence, to the antigen. For example, modifications can be introduced by standard techniques known in the art, such as site-directed mutagenesis and PCR-mediated mutagenesis. The resulting modified antibodies can be screened for its binding activity.

[0198] Conservative sequence modifications include conservative amino acid substitutions, in which the amino acid residue is replaced with an amino acid residue having a similar side chain. Families of amino acid residues having similar side chains have been defined in the art. These families include amino acids with basic side chains (e.g., lysine, arginine, histidine) , acidic side chains (e.g., aspartic acid, glutamic acid) , uncharged polar side chains (e.g., glycine, asparagine, glutamine, serine, threonine, tyrosine, cysteine, tryptophan) , nonpolar side chains (e.g., alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, methionine) , beta-branched side chains (e.g., threonine, valine, isoleucine) and aromatic side chains (e.g., tyrosine, phenylalanine, tryptophan, histidine) . Thus, a predicted nonessential amino acid residue in the antibodies disclosed herein coule be preferably replaced with another amino acid residue from the same side chain family. Methods of identifying nucleotide and amino acid conservative substitutions that do not eliminate antigen binding are well-known in the art. See, e.g., Brummell et al., Biochem. 32: 1180-1187 (1993) ; Kobayashi et al. Protein Eng. 12 (10) : 879-884 (1999) ; and Burks et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 412-417 (1997) ) .

[0199] Multispecific molecules that bind γδ TCR

[0200] In another aspect, multispecific molecules that bind γδ TCR are provided. As used herein, a “multispecific” molecule refers to molecule, e.g., a polypeptide, that has at least two binding specificities.

[0201] The multispecific molecule may be a bispecific antibody having two binding specificities.

[0202] The multispecific molecule may comprise a γδ TCR-binding domain comprising the VHH as described herein.

[0203] The multispecific molecule may comprise a γδ TCR-binding domain comprising the VH and VL regions of the antibody or antigen-binding fragment thereof as described herein. The γδ TCR-binding domain may be a scFv. The γδ TCR-binding domain may have a structure of VL-Linker-VH. Alternatively, the γδ TCR-binding domain may have a structure of VH-Linker-VL. The linker may comprise the sequence of (GmS) n, wherein m is selected from integer of 1-6, e.g., 1, 2, 3, or  4, n is selected from integer of 1-6, e.g., 1, 2, or 3. The linker may comprise the sequence of (G4S) 3.

[0204] The multispecific molecule may comprise an additional binding domain that binds to a target other than γδ TCR.

[0205] Cancer antigen

[0206] The target other than γδ TCR may be a cancer antigen, e.g., a tumor-specific antigen or tumor-associated antigen.

[0207] The cancer antigen may be an antigen for hematological cancer. The hematological cancer may be selected from, e.g., acute myeloid leukemia (AML) , chronic myeloid leukemia, acute lymphoblastic leukemia, chronic lymphocytic leukemia, Hodgkin's lymphoma, Non-Hodgkin's lymphoma or multiple myeloma.

[0208] The cancer antigen may be an antigen for solid tumor. The solid tumor may be selected from, e.g., ovarian cancer, endometrial cancer, breast cancer, lung cancer (small cell or non-small cell) , colon cancer, prostate cancer, cervical cancer, pancreatic cancer, gastric cancer, esophageal cancer, hepatocellular carcinoma (liver cancer) , renal cell carcinoma (kidney cancer) , head-and-neck tumors, mesothelioma, melanoma, sarcomas, or brain tumors (e.g., gliomas, such as glioblastomas) .

[0209] The cancer antigen may be selected from CD33, CD19, CD20, CD22, CD30, CD70, CLL-1, BCMA, DLL-3, Claudin 6, Claudin 18.2, GPC3, GPC2, GPRC5D, CD229, FcRH5, GUCY2C, mesothelin, HER2, PSMA, or PSCA.

[0210] The multispecific molecule may comprise a CD33-binding domain comprising a VH and a VL.The CD33-binding domain may comprise a VH comprising the sequence of SEQ ID NO: 216 and a VL comprising the sequence of SEQ ID NO: 217.

[0211] Structural format

[0212] The multispecific molecule provided herein may be of several different structural formats known in the art.

[0213] The additional binding domain that binds to a target other than γδ TCR may comprise a monovalent antibody fragment. The monovalent antibody fragment may be selected from a Fab, an Fv, a scFv, or a VHH.

[0214] The multispecific molecule as described herein may further comprise an immunoglobulin Fc domain. Exemplary Fc domains can be chosen from the heavy chain constant regions of IgG (e.g., IgGl, IgG2, IgG3 or IgG4) ; more particularly, the heavy chain constant region of human IgG (e.g., IgGl, IgG2, IgG3 or IgG4) .

[0215] The Fc domain may be composed of a first and a second subunit. The γδ TCR-binding domain and the additional binding domain may be each fused to the first and second Fc subunits. The γδTCR-binding domain may be fused (e.g., at its C-terminus) to the N-terminus of one of the Fc  subunits, with or without a linker (e.g., a peptide linker) . The additional binding domain may be fused (e.g., at its C-terminus) to the N-terminus of the other of the Fc subunits, with or without a linker (e.g., a peptide linker) .

[0216] The first and second Fc subunits may be engineered for heterodimerization.

[0217] Heterodimerization of non-identical polypeptides in multispecific molecule can be facilitated by methods known in the art, including without limitation, heterodimerization by the knob-into-hole technology. This technology was developed by introducing a “knob” (or a protuberance) by replacing a small amino acid residue with a large one in the CH3 domain of one Fc, and introducing a “hole” (or a cavity) in the CH3 domain of the other Fc by replacing one or more large amino acid residues with smaller ones. One chain of the Fc fragment in the fusion protein may comprise a knob, and the second chain of the Fc fragment may comprise a hole.

[0218] The preferred residues for the formation of a knob are generally naturally occurring amino acid residues having a large side chain volume and are preferably selected from arginine (R) , phenylalanine (F) , tyrosine (Y) and tryptophan (W) . Most preferred are tryptophan (W) and tyrosine (Y) . Exemplary amino acid substitutions in the CH3 domain for forming the knob include without limitation the T366W, T366Y or F405W substitution.

[0219] The preferred residues for the formation of a hole are usually naturally occurring amino acid residues having a small side chain volume and are preferably selected from alanine (A) , serine (S) , threonine (T) and valine (V) . Exemplary amino acid substitutions in the CH3 domain for generating the hole include without limitation the T366S, L368A, F405A, Y407A, Y407T and Y407V substitutions.

[0220] In some cases, the knob comprises T366W substitution, and the hole comprises the T366S / L368A substitutions.

[0221] It is understood that other modifications to the Fc region known in the art that facilitate heterodimerization are also contemplated and encompassed by the present disclosure.

[0222] In some cases, the multispecific molecule comprises a Fc domain comprising a knob-into-hole structure, e.g., with substitution T366W in the first subunit of the Fc domain and with substitutions T366S and L368A in the second subunit of the Fc domain.

[0223] In general, the numbering of the residues in an immunoglobulin heavy chain is that of the EU index as in Kabat.

[0224] In other cases, the Fc domain is altered, e.g., mutated, to increase or decrease one or more of: Fc receptor binding, antibody glycosylation, the number of cysteine residues, effector cell function, or complement function. In some cases, the Fc domain comprises one or more amino acid substitution that reduces the binding affinity to an Fc receptor and / or effector function. In some cases, the Fc domain comprises one or more amino acid substitution that improves stability (e.g.,  prevents Fab-arm exchange) . In some cases, the Fc domain is of human IgG4 isotype with the amino acid substitutions S228P, L234A and L235A (numbering according to Kabat EU index) .

[0225] Further, the multifunctional molecule may include a half-life extender, e.g, a human serum albumin or an antibody against human serum albumin.

[0226] The Fc subunit containing the knob may comprise the sequence of SEQ ID NO: 197.

[0227] The Fc subunit containing the hole may comprise the sequence of SEQ ID NO: 198.

[0228] The γδ TCR-binding domain may be a VHH or a scFv, and the additional binding domain may be a Fab composed of a light chain (VL-CL) and a heavy chain (VH-CH1) . The heavy chain of Fab may be fused to one of the Fc domain subunits (e.g., its N-terminus) and the VHH or scFv may be fused to the other of the Fc domain subunits (e.g., its N-terminus) .

[0229] As described herein, the multispecific molecule may comprise:

[0230] a first polypeptide chain comprising a VL of the additional binding domain and a light chain constant domain (CL) ;

[0231] a second polypeptide chain comprising a VH of the additional binding domain, a first heavy chain constant domain 1 (CH1) and a first Fc subunit;

[0232] a third polypeptide chain comprising the γδ TCR-binding domain and a second Fc subunit.

[0233] It is understood by persons skilled in the art that CH1 typically pairs with CL, and the first and second Fc subunits act as dimerization domains to form a dimer. The first and second Fc subunits may comprise a knob-into-hole structure.

[0234] The Fc domain may comprise CH2 and CH3. Alternatively, the Fc domain may comprise a hinge, CH2 and CH3.

[0235] The VL of the additional binding domain may be fused (e.g., at its C-terminus) to the N-terminus of the CL.

[0236] The VH of the additional binding domain may be fused (e.g., at its C-terminus) to the N-terminus of CH1, which is in turn fused to the N-terminus of the first Fc subunit. Alternatively, the VH of the additional binding domain may be fused to (e.g., at its C-terminus) to the N-terminus of a full-length heavy chain constant domain (CH) comprising CH1, hinge, CH2 and CH3.

[0237] The γδ TCR-binding domain (e.g., VHH or scFv) may be fused (e.g., at its C-terminus) to the N-terminus of the second Fc subunit.

[0238] The multispecific molecule may further comprise: a linker between the CL and the VL of the additional binding domain, a linker between the CH1 and the VH of the additional binding domain, a linker between the CH1 and the first Fc subunit, a linker between the γδ TCR-binding domain and the second Fc subunit, or a combination thereof. The linker may be selected from a cleavable linker, a non-cleavable linker, a peptide linker, a flexible linker, a rigid linker, a helical linker, and a non-helical linker. The linker may be a peptide linker. The linker may comprise the sequence of  (GmS) n, wherein m is selected from integer of 1-6, e.g., 1, 2, 3, or 4, n is selected from integer of 1-6, e.g., 1, 2, or 3.

[0239] The multispecific molecule may comprise a first binding arm for γδ TCR and a second binding arm for a target other than γδ TCR (e.g., cancer antigen) , comprising Chains 1, 2 and 3, wherein:

[0240] Chain 1 is the light chain of second arm with a structure of VL-CL;

[0241] Chain 2 is the heavy chain of second arm with a structure of VH-CH1-hinge-CH2-CH3; wherein the VH and the VL form the binding site for the target other than γδ TCR;

[0242] Chain 3 is the γδ T cell binding arm with a structure of anti-γδ TCR VHH / scFv-hinge-CH2-CH3.

[0243] Chain 1 may comprise the VL of the second binding arm and a CL comprising the sequence of SEQ ID NO: 196. Chain 2 may comprise the VH of the second binding arm and a CH comprising the sequence of SEQ ID NO: 197. Chain 3 may comprise the VHH or scFv of the first binding arm and a Fc fragment comprising the sequence of SEQ ID NO: 198.

[0244] In all of these aspects described herein before, the multispecific molecule disclosed herein can be a T-cell engager, which binds concomitantly to γδ TCR on T-cells and cancer antigen on cancer cells. By creating a physical link between T-cells and cancer cells, the T-cell engager redirects the T cell to the cancer cell, activates T-cells against cancer cells, potentially resulting in effective antitumour response.

[0245] Antibody Production

[0246] In a further aspect, nucleic acid molecules, vectors and host cells for producing the VHHs, heavy chain antibodies, polypeptide constructs, conventional antibodies, or multispecific molecules disclosed herein, are provided.

[0247] Provided is an isolated nucleic acid molecule, comprising a nucleotide sequence encoding the VHH as described herein.

[0248] Also provided is an isolated nucleic acid molecule, comprising a nucleotide sequence encoding the heavy chain antibody as described herein.

[0249] Also provided is an isolated nucleic acid molecule, comprising a nucleotide sequence encoding the polypeptide construct as described herein.

[0250] Also provided is an isolated nucleic acid molecule, comprising a nucleotide sequence encoding the conventional antibody or antigen-binding fragment thereof as described herein, or its heavy chain variable region and / or light chain variable region. The isolated nucleic acid molecule may comprise a first nucleotide sequence and a second nucleotide sequence encoding the heavy chain variable region / heavy chain and the light chain variable region / light chain of the antibody  or antigen-binding fragment thereof disclosed herein, respectively.

[0251] Also provided is an isolated nucleic acid molecule, comprising a nucleotide sequence encoding the multispecific molecule as described herein. The isolated nucleic acid molecule may comprise different nucleotide sequences encoding different polypeptide chains of the multispecific molecule respectively.

[0252] Also provided is a vector (e.g., a cloning vector or an expression vector) , comprising the isolated nucleic acid molecule disclosed herein.

[0253] The vector disclosed herein may be, for example, a plasmid, a cosmid, a phage.

[0254] The vector may comprise a nucleotide sequence encoding the VHH disclosed herein.

[0255] The vector may comprise a nucleotide sequence encoding the heavy chain antibody as described herein.

[0256] The vector may comprise a nucleotide sequence encoding the polypeptide construct disclosed herein.

[0257] The vector may comprise a first nucleotide sequence and a second nucleotide sequence encoding the heavy chain variable region / heavy chain and the light chain variable region / light chain of the conventional antibody or antigen-binding fragment thereof disclosed herein, respectively. The first and second nucleotide sequences can be located on same or different vectors.

[0258] The vector may comprise different nucleotide sequences encoding different polypeptide chains of the multispecific molecule respectively. The different nucleotide sequences can be located on same or different vectors.

[0259] Also provided is a host cell comprising or is transformed with the isolated nucleic acid molecule or the vector disclosed herein. Such host cells include, but are not limited to, prokaryotic cell such as E. coli cell, and eukaryotic cell such as yeast cell, insect cell, plant cell and animal cell (e.g., mammalian cell, such as mouse cell and human cell) .

[0260] Also provided is a method for producing the VHH, the heavy chain antibody, the polypeptide construct, the conventional antibody or antigen-binding fragment thereof, or the multispecific molecule disclosed herein, comprising, culturing a host cell comprising the isolated nucleic acid molecule or the vector disclosed herein, or the host cell disclosed herein under a condition allowing protein expression, and recovering the VHH, the heavy chain antibody, the polypeptide construct, the conventional antibody or antigen-binding fragment thereof, or the multispecific molecule from a culture of the cultured host cell.

[0261] Pharmaceutical Composition

[0262] In a further aspect, a pharmaceutical composition comprising the VHH, the heavy chain antibody, the polypeptide construct, the conventional antibody or antigen-binding fragment thereof,  or the multispecific molecule disclosed herein is provided.

[0263] The pharmaceutical composition may further comprise a pharmaceutically acceptable carrier and / or excipient.

[0264] Provided is a pharmaceutical composition comprising the VHH as described herein. The pharmaceutical composition may comprise an effective amount of the VHH. The VHH may be the only active ingredient included in the pharmaceutical composition.

[0265] Also provided is a pharmaceutical composition comprising the heavy chain antibody as described herein. The pharmaceutical composition may comprise an effective amount of the heavy chain antibody. The heavy chain antibody may be the only active ingredient included in the pharmaceutical composition.

[0266] Also provided is a pharmaceutical composition comprising the polypeptide construct as described herein. The pharmaceutical composition may comprise an effective amount of the polypeptide construct. The polypeptide construct may be the only active ingredient included in the pharmaceutical composition.

[0267] Also provided is a pharmaceutical composition comprising the conventional antibody or antigen-binding fragment thereof as described herein. The pharmaceutical composition may comprise an effective amount of the conventional antibody or antigen-binding fragment thereof. The conventional antibody or antigen-binding fragment thereof may be the only active ingredient included in the pharmaceutical composition.

[0268] Also provided is a pharmaceutical composition comprising the multispecific molecule as described herein. The pharmaceutical composition may comprise an effective amount of the multispecific molecule. The multispecific molecule may be the only active ingredient included in the pharmaceutical composition.

[0269] The pharmaceutical composition disclosed herein may further comprise an additional therapeutic agent. The additional therapeutic agent may be an anti-cancer agent. Alternatively, the additional therapeutic agent may be an immune checkpoint inhibitor, such as anti-PD-1 antibody, anti-PD-L1 antibody, anti-TIM-3 antibody, anti-LAG-3 antibody, or anti-CTLA-4 antibody. Alternatively, the additional therapeutic agent may be a cytotoxic agent, such as an alkylating agent, an anti-mitotic agent, an antitumor antibiotic, an antimetabolite, a topoisomerase inhibitor, a tyrosine kinase inhibitor, or a radionuclide. Alternatively, the additional therapeutic agent may be a cytokine (e.g, an immune cell activating cytokine, such as IL-2, IL-15, IL-7, IL-6, IL-12, IL-18, IFNα, ΙFΝβ, or IFNγ) .

[0270] The VHH, the heavy chain antibody, the polypeptide construct, the conventional antibody or antigen-binding fragment thereof, or the multispecific molecule disclosed herein, and the additional therapeutic agent may be provided as separate components or as components of a single  composition. The VHH, the heavy chain antibody, the polypeptide construct, the conventional antibody or antigen-binding fragment thereof, or the multispecific molecule disclosed herein may be used in combination with the other agents simultaneously, separately, or successively.

[0271] The pharmaceutical composition can be provided in unit dosage form (i.e., the dosage for a single administration) .

[0272] The pharmaceutical composition can be formulated using one or more pharmaceutically acceptable carriers and / or excipients. The formulation depends on the route of administration chosen. For parenteral administration, the pharmaceutical composition is preferably sterile and substantially isotonic and manufactured under GMP conditions. By way of example, the VHH, the heavy chain antibody, the polypeptide construct, the conventional antibody or antigen-binding fragment thereof, or the multispecific molecule disclosed herein can be formulated in aqueous solutions for injection, preferably in physiologically compatible buffers, such as water for injection (WFI) , bacteriostatic water for injection (BWFI) , sodium chloride solution (e.g., 0.9% (w / v) NaCl) , glucose solution (e.g., 5%glucose) , surfactant-containing solution (e.g., 0.01%polysorbate 20) , pH buffered solution (e.g., phosphate buffered solution) , Ringer's solution. The solution can contain formulatory agents such as suspending, stabilizing and / or dispersing agents. Alternatively, the VHH, the polypeptide construct, the conventional antibody or antigen-binding fragment thereof, or the multispecific molecule disclosed herein can be in lyophilized form for constitution with a suitable vehicle, e.g., sterile pyrogen-free water, before use.

[0273] Pharmaceutical compositions described herein can be useful in promoting the activation and / or proliferation of γδ T cells, and / or treating a disease, such as cancer.

[0274] Methods or uses of treating diseases

[0275] In a further aspect, methods or uses of treating diseases using the VHH, the heavy chain antibody, the polypeptide construct, the conventional antibody or antigen-binding fragment thereof, or the multispecific molecule as described herein are provided.

[0276] In one aspect, provided is a method of treating a disease in a subject comprising administering to a subject in need thereof, an effective amount of the VHH, the heavy chain antibody, the polypeptide construct, the conventional antibody or antigen-binding fragment thereof, or the multispecific molecule as described herein. Such diseases include any disease that would benefit from increased proliferation and activation of T cells, such as γδ T cells.

[0277] As described herein, the disease may be cancer.

[0278] Provided is a method of treating cancer comprising increasing proliferation and / or activation of γδ T-cells by administering the VHH, the heavy chain antibody, the polypeptide construct or the conventional antibody or antigen-binding fragment thereof that targets γδ TCR disclosed herein.

[0279] Also provided is a method of treating cancer may comprise increasing proliferation and / or activation of γδ T-cells by administering the multispecific molecule disclosed herein that binds γδTCR and a cancer antigen. The cancer may be characterized by the cancer antigen targted by the multispecific molecule.

[0280] The γδ TCR-binding domain employed by the multispecific molecule may be derived from the following antibodies: AS282152 (comprising CDR1, CDR2, and CDR3 respectively comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 66, 67, and 68) , AS281876 (comprising CDR1, CDR2, and CDR3 respectively comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 27, 28, and 29) , AS282067 (comprising CDR1, CDR2, and CDR3 respectively comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 50, 51, and 52) , or AS288170 (comprising HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 and LCDR3 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 171, 172 or 206, 173, 175, 118, and 176 respectively) , which recognizes an epitope located at Vγ9 and constant region of γδ TCR. Vγ9 is a part of γδ TCR that participates in the non-peptide phosphoantigen recognition, therefore by blocking the interaction between γδ TCR and its phosphoantigen, the killing of tumor cells may be inhibited. Hence, the multispecific molecule employing these antibodies as the γδ T cell engaging arm had inhibition effect on tumor cell killing in cases where the tumor does not express the tumor antigen targeted by the multispecific molecule.

[0281] The γδ TCR-binding domain employed by the multispecific molecule may be derived from the following antibodies: AS282116 (comprising CDR1, CDR2, and CDR3 respectively comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 58, 59, and 60) , or AS287963 (comprising CDR1, CDR2, and CDR3 respectively comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 162, 59, and 163) , which recognizes an epitope located at constant region of γδ TCR that does not participate in the non-peptide phosphoantigen recognition. Hence, the multispecific molecule employing these antibodies as the γδ T cell engaging arm had little, if any, inhibition effect on tumor cell killing in cases where the tumor does not express the tumor antigen targeted by the multispecific molecule.

[0282] In one aspect, provided is use of the VHH, the heavy chain antibody, the polypeptide construct, the conventional antibody or antigen-binding fragment thereof, or the multispecific molecule as described herein, in manufacture of a medicament for use in treating a disease in a subject. Such diseases may include any disease that would benefit from increased proliferation and activation of T cells, such as γδ T cells. As described herein, the disease may be cancer.

[0283] The cancer involved in the methods or uses of treatment described herein may include, without limitation, solid tumors and hematological cancers. The cancer may be a hematological cancer, e.g., acute myeloid leukemia (AML) , chronic myeloid leukemia, acute lymphoblastic leukemia, chronic lymphocytic leukemia, Hodgkin's lymphoma, Non-Hodgkin's lymphoma or  multiple myeloma. The cancer may be a solid tumor, e.g., ovarian cancer, endometrial cancer, breast cancer, lung cancer (small cell or non-small cell) , colon cancer, prostate cancer, cervical cancer, pancreatic cancer, gastric cancer, esophageal cancer, hepatocellular carcinoma (liver cancer) , renal cell carcinoma (kidney cancer) , head-and-neck tumors, mesothelioma, melanoma, sarcomas, or brain tumors (e.g., gliomas, such as glioblastomas) .

[0284] The cancer involved in the methods or uses of treatment described herein may be characterized by a cancer antigen selected from CD33, CD19, CD20, CD22, CD30, CD70, CLL-1, BCMA, DLL-3, Claudin 6, Claudin 18.2, GPC3, GPC2, GPRC5D, CD229, FcRH5, GUCY2C, mesothelin, HER2, PSMA, or PSCA.

[0285] The subject involved in the methods or uses of treatment described herein may be a mammal, particularly a human.

[0286] In any of the methods or uses of treatment described herein, the VHH, heavy chain antibody, or polypeptide construct disclosed herein may activate γδ T cells and / or increase γδ T cell proliferation, potentially resulting in effective antitumour response.

[0287] In any of the methods or uses of treatment described herein, the antibody or antigen-binding fragment thereof disclosed herein may activate γδ T cells and / or increase γδ T cell proliferation, potentially resulting in effective antitumour response.

[0288] In any of the methods or uses of treatment described herein, the multispecific molecule disclosed herein may act as a T-cell engager, which binds concomitantly to γδ on T-cells and cancer antigen on cancer cells. By creating a physical link between T-cells and cancer cells, the T-cell engager redirects the T cell to the cancer cell, activates T-cells against cancer cells, potentially resulting in effective antitumour response.

[0289] In any of the methods or uses of treatment described herein, the VHH, the heavy chain antibody, the polypeptide construct, the antibody or antigen-binding fragment thereof, or the multispecific molecule, or the pharmaceutical composition disclosed herein may be used alone.

[0290] Alternatively, the VHH, the heavy chain antibody, the polypeptide construct, the antibody or antigen-binding fragment thereof, or the multispecific molecule, or the pharmaceutical composition disclosed herein may be for administration in combination with an additional therapeutic agent or an additional therapy. The additional therapeutic agent may be an anti-cancer agent, such as an immune checkpoint inhibitor or a cytotoxic agent or a cytokine. The additional therapy may be a standard cancer treatment, such as surgery, chemotherapy, radiation therapy, targeted therapy, immunotherapy, hormone therapy, gene therapy or palliative care.

[0291] In any of the methods or uses of treatment described herein, the VHH, the heavy chain antibody, the polypeptide construct, the antibody or antigen-binding fragment thereof, or the multispecific molecule, or the pharmaceutical composition disclosed herein can be formulated into  any dosage form known in the medical field, for example, tablets, pills, suspensions, emulsions, solutions, gels, capsules, powders, granules, elixirs, lozenges, suppositories, injections (including injection liquids, sterile powders for injection and concentrated solutions for injection) , inhalants, sprays, etc. The preferred dosage form depends on the intended route of administration and therapeutic use. One preferred dosage form is an injection. Such injection may be a sterile injectable solution. Alternatively, the sterile injectable solution can be prepared as a sterile lyophilized powder (e.g., by vacuum drying or freeze drying) for the convenience of storage and use.

[0292] In any of the methods or uses of treatment described herein, the VHH, the heavy chain antibody, the polypeptide construct, the antibody or antigen-binding fragment thereof, or the multispecific molecule, or the pharmaceutical composition disclosed herein can be administrated by any suitable method known in the art, including, but not limited to, oral, buccal, sublingual, eyeball, topical, parenteral, rectal, intrathecal, intracytoplasmic, groin, intravesical, local (e.g., powder, ointment or drops) , or nasal route. However, for many therapeutic uses, the preferred route / mode of administration is parenteral administration (e.g., intravenous injection or bolus, subcutaneous injection, intraperitoneal injection, intramuscular injection) . The skilled person will understand that the route and / or mode of administration will vary depending on the intended purpose. The VHH, the heavy chain antibody, the polypeptide construct, the antibody or antigen-binding fragment thereof, or the multispecific molecule, or the pharmaceutical composition disclosed herein may be given by intravenous injection or bolus.

[0293] In another aspect, also provided is a method of activating γδ T cell and / or increasing γδ T cell proliferation, which comprising contacting T cells (e.g., a T cell population) with the VHH, the heavy chain antibody, the polypeptide construct, the antibody or antigen-binding fragment thereof, or the multispecific molecule, or the pharmaceutical composition disclosed herein. The T cells may be in vivo. The T cells may be in vitro.

[0294] Activition of γδ T-cell may be determined by any method in the art, such as for example, the method provided in the Example 3 herein, e.g., by measuring CD25 and / or CD107a expression. Increased expression of CD25 and / or CD107a indicates activation.

[0295] EXAMPLES

[0296] The examples provided below are for purposes of illustration only and are not intended to be limiting unless otherwise specified. Thus, the disclosure should in no way be construed as being limited to the following examples, but rather, should be construed to encompass any and all variations which become evident as a result of the teaching provided herein.

[0297] EXAMPLE 1 Anti-γδ TCR Antibody Generation and Characterization

[0298] Soluble γδ TCR proteins were generated in house for animal immunization. To facilitate TCR heterodimerization, a pair of charge-complementary leucine zipper (LZ) sequences were connected to the C-terminus of TCRγ and TCRδ chain through a flexible (G4S) 3 linker. Additionally, a 6xHis-tag was added to γ-chain and a flag-tag to δ-chain C-terminus for the purposes of both purification and detection. TCRγ chain and TCRδ chain plasmids were prepared and used for soluble γδ TCR production. Soluble TCRs (sTCRs) were produced by FreeStyle 293-F cells and purified by Anti-DYKDDDDK G1 Affinity Resin (Genscript, Cat. #L00432) . The constructs of human and cynomolgus γ9δ2 TCR proteins were depicted in Figure 1.

[0299] One camel was immunized with γ9δ2 TCR protein under all current animal welfare regulations. γ9δ2 TCR protein was formulated as an emulsion with complete Freund's adjuvant (CFA) for primary immunization or with incomplete Freund's adjuvant (IFA) for boosting immunization. The antigen emulsion was administered by double-spot injections intramuscularly at the neck. The animal received 3 injections of 100-200 μg of human γ9δ2 TCR protein at 2-week interval and subsequently 2 injections of 100 μg of cynomolgus γ9δ2 TCR protein at weekly interval. Final boost was given to the animal with 50 μg of human γ9δ2 TCR protein. Five days afterwards, 150 mL blood sample was collected and ～ 3×108 peripheral blood lymphocytes (PBLs) , as the genetic source of the conventional and heavy chain immunoglobulins, were isolated from the blood.

[0300] Total RNA was extracted from lymphocytes of the immunized camel using  Reagent (InvitrogenTM, Cat. #15596026) . cDNA was synthesized based on RNA template using PRIMESCRIPTTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit with an oligo (dT) 20 primer (Takara, Cat. #6110A) . DNAs encoding VHH (variable region of heavy chain-only antibody, also known as single domain antibody, sdAb) , VH and VL were amplified from camel cDNA, purified and ligated in an in house phagemid vector (see Patent No. US20170089914A1 Fig. 1) . The ligation product was used to transform SS320 electrocompetent cells (Lucigen, Cat. #60512-1) . The resulting sdAb and scFv libraries were supplemented with 20%glycerol and stored at -80■C.

[0301] Both sdAb and scFv phage libraries were rescued and stored after filter sterilization at 4■C for further use. Binders were isolated from the above-mentioned phage libraries using protein-based panning as well as cell-based panning. One round of panning was carried out for both protein-and cell-based panning approaches. Percentage of γ9δ2 TCR positive clones identified by ELISA reached at least 50%and the sequence diversity of γ9δ2 TCR-specific clones was high for all output phages. These outputs were used for subsequent high-throughput screening.

[0302] The selected output phages were used to infect exponentially growing E. coli cells. The double-strand DNA of the output was extracted. The sdAb / scFv inserts were cut from the  phagemid vector and inserted into an antibody fragment expression vector for high-throughput screening. The resulting plasmid was used to transform exponentially growing E. coli cells, which were then plated and grown overnight at 37℃. Thousands of colonies were picked individually and grown in 96-deep-well plates containing 1 mL 2YT medium. The expression of antibody fragment was induced by adding 1.0 mM IPTG. The sdAb / scFv proteins in the supernatant were analyzed for their ability to bind to human γ9δ2 TCR proteins by ELISA and human γ9δ2 T cells by flow cytometry. Totally, 33 VHH and 9 scFv binders with unique sequences were selected for further characterization. The IDs of full-length VHH / VH, VL and CDR sequences were listed in Table 1.

[0303] Table 1. Camelid anti-γδTCR antibody sequence IDs

[0304] To assess the cross-species reactivity and the specificity of the selected clones, ELISA was performed on cynomolgus γ9δ2 TCR and human αβ TCR proteins (SEQ ID NO: 5-6) produced in house (Table 2) . To classify binders based on the γδ TCR domain / region they recognize, 5 artificial TCR proteins were designed by replacing γ9δ2 TCR domains with their counterparts from αβ TCR or sequences from other γδ TCRs and produced in house (Figure 2) . ELISA was performed using all recombinant TCR proteins as antigens to find the antigen domains that were crucial for antigen-antibody interaction. For example, the fact that AS281795 binds human γ9δ2 TCR, but not human γ9δ1 TCR suggests that the epitope of AS281795 is located at Vδ2 domain. Based on their binding epitope, the selected binders were classified into 8 groups (Table 2) . According to the result, almost all binders recognize both human and cynomolgus γ9δ2 TCRs, and the epitopes of these antibodies are largely diversified.

[0305] Table 2. Binding activity, specificity and binding epitope of anti-γδ TCR antibodies

[0306] EXAMPLE 2 Affinity Determination of Heavy Chain Antibodies

[0307] The camelid VHH / VH and VL sequences were used to construct heavy chain only antibodies (HCAbs) or conventional IgG heavy and light chains. Heavy chain and light chain plasmids were prepared and used for HCAb and IgG production by HEK293 cells. Antibodies were purified using Protein A Agarose column (Genscript, Cat. #L00464) , followed by size-exclusion  chromatography (Citiva, Cat. #GE28-9893-35) . Anti-γ9δ2 TCR HCAb, 6H1 (from patent No. US20190263908A1, SEQ ID NO.: 49) , was prepared as positive control.

[0308] The binding affinity of selected molecules to human and cynomolgus γ9δ2 TCR proteins was determined by surface plasmon resonance (SPR) on a BIAcore T200 instrument (GE Healthcare) . The experiment was carried out as follows: Antibodies were captured onto the sensorchip pre-coated with goat-anti-human pAb (Jackson ImmunoResearch, Cat. #109-005-098) through the interaction between polyclonal antibody and human Fc. Increasing concentrations (ranging from 40 nM to 2.56 μM) of human or cynomolgus γ9δ2 TCR were injected over the sensorchip surface, and were allowed to bind the captured antibody for 100 s followed by injection of the running buffer to allow dissociation of the complex for 300 s. After each cycle the surfaces were regenerated by an injection of 10 mM glycine-HCl buffer, pH2.0. Langmuir model, which describes a simple 1: 1 interaction where one ligand molecule interacts with one analyte, was used to fit the experimental data to obtain the kinetic values of the on-rate (ka) and off-rate (kd) , which were used to calculate the equilibrium dissociation constant (KD) . According to the result summarized in Table 3, the antibodies bind γ9δ2 TCR with a wide range of affinity (KD) from ～200 nM to 1 nM (to human γ9δ2 TCR) and ～3 μM to 5 nM (to cynomolgus γ9δ2 TCR) .

[0309] Table 3. Binding affinity of purified antibodies to human and cynomolgus γ9δ2 TCR proteins

[0310] EXAMPLE 3 Activation of γ9δ2 T Cells Induced by HCAbs

[0311] Flat bottom 96-well cell culture plates were coated overnight with 100 μL 2 μg / mL goat-anti-human IgG Fc (Thermo Scientific, Cat. #31125) at 4℃. Wells were washed with PBS and blocked with 200 μL 4%BSA / PBS at room temperature for 30 minutes. Block was discarded and wells were incubated with 100 μL HCAbs (0.5 nM, 5 nM and 50 nM) in PBS for 2 hours at 37℃. Human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were used for the expansion of γ9δ2 T cells as described previously (Makoto Kondo et al. 2011 Sep 9; (55) : 3182) . The resulting γ9δ2 T cells were resuspended using AIM-V medium (Gibco, Cat. #A3830801) and added to 96-well cell culture plates (1×105 γ9δ2 T cells in 200 μL AIM-V per well) and incubated at 37℃. Flowcytometry was then used to evaluate γδ T cell degranulation after 4 hours of incubation and γδ T cell activation after 24 hours of incubation. As shown in Table 4, all HCAbs tested were shown to have comparable or better capabilities than 6H1 HCAb to drive γ9δ2 T cells activation and degranulation, which was reflected by increase in CD25 and CD107a expression, respectively.

[0312] Table 4. Activation of γ9δ2 T cells induced by HCAbs

[0313] EXAMPLE 4 TCE-KIH-Redirected Killing of AML-193 Cells

[0314] To test the functional activity of anti-γδ TCR antibodies, 29 anti-γδ TCR VHHs and 6 anti-γδTCR scFvs were assembled into CD33 targeting TCE (T cell engaging) -KIH (knobs-into-holes)  bispecific antibody (BsAb) molecules (Figure 3) . The BsAb comprises three chains: 1 light chain and 2 heavy chains. Correct pairing of heavy chains is achieved through knobs-into-holes technology. Chain 1 is the light chain of CD33 arm with a structure of VL-CL. Chain 2 is the heavy chain of CD33 arm with a structure of VH-CH1-hinge-CH2-CH3. Chain 3 is the γδ T cell binding arm with a structure of anti-γδ TCR VHH / scFv-hinge-CH2-CH3. Heavy chain constant regions of chain 2 and chain 3 contain mutations to abolish arm exchange, reduce effector function and support heavy chain heterodimeration. These BsAbs were produced by FreeStyle 293-F cells and purified using CH1-XL Affinity Matrix (Thermoscientific, Cat. #1094462010) . As a positive control, 5E7 (from patent No. US20190263908A1, SEQ ID NO.: 60) , was also used to produce 5E7-KIH BsAb.

[0315] T cell redirected cytotoxicity was assessed by flow cytometry using human γ9δ2 T cells as effector cells and CD33+ human AML cell line, AML-193 (ATCC, Cat. #CRL-9589TM) , as target cells. Briefly, AML-193 cells were labeled with CellTraceTM Violet (Thermo Fisher Scientific, Cat. #C34557) and were plated in round-bottom 96-well plates (5×104 tumor cells / well) with γ9δ2 T cells at 1: 1 or 2: 1 effector-to-target ratio (E: T) . A serial of 5x dilutions of BsAbs were added to wells and incubated at 37℃ for 48 hours. Cell lysis was assessed by flow cytometry as loss of target cell membrane integrity, which is reflected by nuclear uptake of propidium iodide (Sigma, Cat. #P4170-10MG) . Samples were analyzed by flow cytometry on BD FACSCelestaTM Flow Cytometer and data were processed using the BD FACS Diva software version 8.0.1.1. To quantify BsAb induced killing, specific lysis was calculated using the following formula: %Killing= (1-%live AML cells÷%total AML cells) ×100

[0316] The killing assay was done in two experiments, with E: T of 2: 1 for the first experiment and 1: 1 for the second experiment. As shown in Table 5, there is obvious baseline killing of AML-193 cells by γ9δ2 T cells, ～ 45%of AML-193 cells were killed. The EC50 values of positive control BsAb 5E7-KIH were different in two experiments, probability due to difference in E: T. Of 35 BsAbs, almost all showed comparable or better killing efficacy and potency than 5E7-KIH, except AS281940-KIH, AS281949-KIH, AS281991-KIH and AS287895-KIH which were inferior in EC50 values (Figure 4 and Table 5) .

[0317] Table 5. CD33 targeting TCE-KIH induced tumor cell killing

[0318] EXAMPLE 5 TCE-KIH-Redirected Killing of Multiple Cancer Cell Lines

[0319] Cytotoxicity assay was carried out on 6 BsAbs with the highest AML-193 killing efficacy and potency, namely AS281876-KIH, AS282067-KIH, AS282116-KIH, AS282152-KIH, AS287963-KIH and AS288170-KIH using 5 cancer cell lines with different CD33 expression levels as target cells. Of these target cell lines, AML-193 and MOLM-13 (DSMZ, Cat. #ACC 554) are high-expression AML lines; KG-1A (ATCC, Cat. #CCL-246.1) and NALM6 (ATCC, Cat. #CRL-3273) low-expression cell lines, and CCRF-CEM (ATCC, Cat. #CCL-119) , CD33-acute lymphoblastic leukemia cell line. The killing assay was carried out as described in EXAMPLE 4. In addition to the positive control 5E7-KIH, 3 anti-Vγ9Vδ2 sdAbs, i.e. 5C8, 6H1, 6H4 (from patent No. US20190263908A1, SEQ ID NOs: 59 and 49 and patent No. US20220098301A1, SEQ ID NO: 54, respectively) and 1 anti-Vγ9Vδ2 scFv 7A5 (from patent No. WO2020227457A1, VH SEQ ID NO: 65, VL SEQ ID NO: 66) were used to produce TCE-KIH BsAb controls as described in EXAMPLE 4.

[0320] Of all 6 BsAbs, AS281876-KIH and AS282152-KIH are superior to all 5 positive control BsAbs and showed the best tumor cell killing activity against all CD33+ cancer cell lines, as reflected by the high maximum killing and the lowest EC50 values (Fig. 5a, Fig. 6a, Fig. 7a and Fig. 8a, Table 6) . AS288170-KIH and AS282067-KIH are either comparable to or slightly better than all 5 positive control BsAbs (Fig. 5b, Fig. 6b, Fig. 7b and Fig. 8b, Table 6) . AS282116-KIH and AS287963-KIH are comparable to positive control BsAbs 5C8-KIH, 5E7-KIH, 6H1-KIH and 6H4-KIH, in killing CD33 high-expression cell lines like AML-193 and MOLM-13, but showed  lower potency than 5C8-KIH, 5E7-KIH, 6H1-KIH and 6H4-KIH in killing CD33 low-expression cell lines like KG-1A and NALM6, as reflected by higher EC50 values. However, the efficacy of AS282116-KIH and AS287963-KIH are the highest regarding killing KG-1A and NALM6, as reflected by the highest maximum killing of all 11 BsAbs (Fig. 5c, Fig. 6c, Fig. 7c and Fig. 8c, Table 6) .

[0321] Since CCRF-CEM does not express CD33 molecule on its surface, BsAb-dependent cancer cell killing was not observed (Fig. 9) . One can only observe the killing of cancer cells depending on the non-peptide phosphoantigen recognition by γ9δ2 TCR. However, for most BsAbs, tumor cell killing was inhibited to some extent by high concentration of BsAbs, probably because these antibodies bind γδ TCR and block the non-peptide phosphoantigen recognition. In particular, AS282152-KIH showed the highest killing inhibition. 5C8-KIH, 5E7-KIH, 6H1-KIH, 6H4-KIH, AS281876-KIH, AS288170-KIH and AS282067-KIH showed similar killing inhibition. 7A5-KIH showed much lower killing inhibition, probably due to the low-affinity binding of 7A5 to γ9δ2 TCR (data not shown, submicromolar affinity to both human and cynomolgus γ9δ2 TCR) . The only 2 antibodies that showed little or no inhibition to cancer cell killing are AS282116-KIH and AS287963-KIH. The difference in the inhibition activity of these antibodies can be explained by the difference in the epitopes they recognize. The epitopes of AS282152, AS281876, AS288170 and AS282067 are located at Vγ9 and constant region of γδ TCR. Vγ9 is a part of γδ TCR that participates in the non-peptide phosphoantigen recognition, therefore by blocking the interaction between γδ TCR and its cognate antigen, the killing of tumor cells is inhibited. On the other hand, AS282116 and AS287963 bind constant domain of γδ TCR, which does not participate in the antigen recognition. Hence, BsAbs employing these antibodies as the γδ T cell engaging arm had little, if any, inhibition effect on tumor cell killing.

[0322] Table 6. CD33 targeting TCE-KIH induced tumor cell killing on AML cell lines with high and low CD33 expression level

[0323] EXAMPLE 6 Humanization of Anti-γδ TCR Antibody Fragments

[0324] Humanization of 6 camel antibodies (5 sdAbs and 1 scFv) was performed using CDR grafting method (Winter G, Harris WJ 1993) . The VHH / VH and VL sequences of the selected camel antibodies were BLASTed against NCBI human germline V gene database so human VH and VL germline sequences with the highest identity to camel antibodies (i.e. human acceptor) were identified. In the CDR grafting approach, CDRs of the human acceptors were replaced by those of the camel antibodies, which makes the straight-graft sequences. Straight-graft antibody usually loses binding activity, which needs to be restored by replacing the framework residues that are critical for the activity of the antibody with camel residues.

[0325] The camel and humanized VHH / VH and VL sequences were used to construct chain 3 of TCE-KIH and expressed with the method described in Example 4. After humanization, all antibodies have at least one humanized variant retaining comparable binding affinity (Table 7) . The sequence IDs of humanized antibodies were listed in Table 8.

[0326] Table 7. Affinities of humanized anti-γδ TCR antibodies

[0327] Table 8. Sequence IDs of humanized antibodies

[0328] EXAMPLE 7 Production Polyclonal γδT Cells by Anti-γδ TCR Antibodies and in vitro Efficacy Thereof

[0329] In order to activate and expand polyclonal γδT cells from PBMCs, four antibodies specifically binding γδTCR were tested, including AS281850, AS287435, AS288180 and AS287963. These antibodies were coated onto the cell culture plates, and CAR-polyclonal γδT cells were generated using the media shown in Table 9. Both Medium I and Medium II contain base medium, human serum replacement (e.g. human platelet lysate) supplemented with different cytokines and Akt inhibitor MK-2206. Cell performance was evaluated afterwards.

[0330] Table 9

[0331] Briefly, polyclonal γδT cells were generated from PBMCs as follows: PBMCs were activated using the aforementioned antibodies in Medium Ⅰ for 3-9 days. Then the activated cells were transduced with lentivirus or retrovirus expressing an anti-BCMA CAR (SEQ ID NO: 62, WO2023020558A1) at a proper multiplicity of infection (MOI) . After 1-5 days of transduction, the cells were cultured in Medium Ⅱ for another 6-12 days before CAR-polyclonal γδT cells were harvested. Cell number and viability were analyzed by Cellometer (Nexcelom, K2) . For phenotype and CAR positive rate detection, the harvested cells were stained with fluorescent-labeled antibodies (CD3-BV785 [BioLegend, Cat. #344842] , TCRVδ1-APC [Invitrogen, Cat. #344842] , TCRVδ2-BV421 [Biolegend, Cat. #331428] and Alexa Fluor 488-labeled anti-mouse sdAb antibodies [GenScript] ) and analyzed by flow cytometry.

[0332] To further evaluate the correlation between different stimulators and killing potency, the expanded CAR-γδT cells were evaluated in a repetitive tumor challenge assay. Briefly, 2×105 CAR+ γδT cells were co-cultured with 2×105 NCI-H929 cells (ATCC, Cat. #CRL-3580) in a 24 well plate. Two days later, cells were harvested to determine the relative ratio of viable T cells and tumor cells. CAR+ γδT cells were counted and re-plated with fresh NCI-H929 cells at a ratio of 1: 1 for the next round of tumor cell challenge.

[0333] With all 4 antibodies, γδT cells expanded well with at least 900-fold expansion and > 90%cell viability (Figs. 10a-b) . The purity of γδT cells produced using all 4 antibodies is high, > 98%(Fig. 10c) , and the composition of different γδT cell subtypes are similar: the percentage of Vδ2 T cells is the highest (～ 65%) and Vδ1-Vδ2-T cells, the lowest (～10%) (Fig. 10d) . The percentages of CAR-positive cells were also similar amongst 4 groups (Fig. 10e) . As depicted in Fig. 11a, polyclonal γδT cells which activated by different antibodies mediated effective elimination of H929 cells until round 7, the total γδT expansion fold and CAR γδT expansion fold of all groups during long term killing were similar (Figs. 11b-c) .

[0334] SEQUENCES

Claims

1.A VHH that binds a γδ TCR, comprising a CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15, 19, 23, 27, 31, 35, 38, 42, 46, 50, 54, 58, 62, 66, 70, 74, 78, 85, 89, 93, 121, 125, 140, 150, 154, 158, 162, 178, 182, or 186; a CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16, 20, 24, 28, 32, 39, 43, 47, 51, 55, 59, 63, 67, 71, 75, 79, 82, 86, 90, 94, 122, 126, 137, 141, 151, 155, 159, 179, 183, or 187; and a CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17, 21, 25, 29, 33, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72, 76, 80, 83, 87, 91, 95, 123, 127, 138, 142, 152, 156, 160, 163, 180, 184, or 188.2.The VHH of claim 1, comprising a CDR1, a CDR2, and a CDR3, respectively comprising the amino acid sequences of:(1) SEQ ID NOs: 15, 16, and 17; or (2) SEQ ID NOs: 19, 20, and 21; or(3) SEQ ID NOs: 23, 24, and 25; or (4) SEQ ID NOs: 27, 28, and 29; or(5) SEQ ID NOs: 31, 32, and 33; or (6) SEQ ID NOs: 35, 24, and 36; or(7) SEQ ID NOs: 38, 39, and 40; or (8) SEQ ID NOs: 42, 43, and 44; or(9) SEQ ID NOs: 46, 47, and 48; or (10) SEQ ID NOs: 50, 51, and 52; or(11) SEQ ID NOs: 54, 55, and 56; or (12) SEQ ID NOs: 58, 59, and 60; or(13) SEQ ID NOs: 62, 63, and 64; or (14) SEQ ID NOs: 66, 67, and 68; or(15) SEQ ID NOs: 70, 71, and 72; or (16) SEQ ID NOs: 74, 75, and 76; or(17) SEQ ID NOs: 78, 79, and 80; or (18) SEQ ID NOs: 46, 82, and 83; or(19) SEQ ID NOs: 85, 86, and 87; or (20) SEQ ID NOs: 89, 90, and 91; or(21) SEQ ID NOs: 93, 94, and 95; or (22) SEQ ID NOs: 121, 122, and 123; or(23) SEQ ID NOs: 125, 126, and 127; or (24) SEQ ID NOs: 54, 137, and 138; or(25) SEQ ID NOs: 140, 141, and 142; or (26) SEQ ID NOs: 150, 151, and 152; or(27) SEQ ID NOs: 154, 155, and 156; or (28) SEQ ID NOs: 158, 159, and 160; or(29) SEQ ID NOs: 162, 59, and 163; or (30) SEQ ID NOs: 178, 179, and 180; or(31) SEQ ID NOs: 182, 183, and 184; or (32) SEQ ID NOs: 186, 187, and 188.3.The VHH of claim 1 or 2, comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14, 18, 22, 26, 30, 34, 37, 41, 45, 49, 53, 57, 61, 65, 69, 73, 77, 81, 84, 88, 92, 120, 124, 136, 139, 149, 153, 157, 161, 177, 181, or 185, or an amino acid sequence having at least 80%, 85%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%sequence identity thereto.4.The VHH of any one of claims 1-3, which is humanized.5.The VHH of claim 4, comprising the amino acid sequence of SEQ ID NOs: 199, 200, 201, 202, 203, or 204, or an amino acid sequence having at least 80%, 85%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%sequence identity thereto.6.A polypeptide construct that binds a γδ TCR, comprising the VHH of any one of claims 1 to 5 and an immunoglobulin Fc region.7.The polypeptide construct of claim 6, wherein the immunoglobulin Fc region is an IgG Fc region, e.g., an IgG1, IgG2, IgG3, or IgG4 Fc region.8.An antibody or antigen-binding fragment thereof that binds a γδ TCR, comprising:a) a heavy chain variable region (VH) comprising:i) HCDR1 comprising the sequence of SEQ ID NO: 97, 105, 113, 129, 144, 165, 171, 190, or 209;ii) HCDR2 comprising the sequence of SEQ ID NO: 98, 106, 114, 130, 145, 166, 172, 206, 191, or 210; andiii) HCDR3 comprising the sequence of SEQ ID NO: 99, 107, 115, 131, 146, 167, 173, 192, or 211; and / orb) a light chain variable region (VL) comprising:i) LCDR1 compri sing the sequence of SEQ ID NO: 101, 109, 117, 133, 175, 194, or 213;ii) LCDR2 comprising the sequence of SEQ ID NO: 102, 110, 118, 134, or 214; andiii) LCDR3 comprising the sequence of SEQ ID NO: 103, 111, 119, 135, 148, 169, 176, 195, or 215.9.The antibody or antigen-binding fragment thereof of claim 8, comprising:(1) HCDR1, HCDR2 and HCDR3 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 97, 98, and 99, respectively; and / or, LCDR1, LCDR2 and LCDR3 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 101, 102, and 103, respectively;(2) HCDR1, HCDR2 and HCDR3 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 105, 106, and 107, respectively; and / or, LCDR1, LCDR2 and LCDR3 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 109, 110, and 111, respectively;(3) HCDR1, HCDR2 and HCDR3 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 113, 114, and 115, respectively; and / or, LCDR1, LCDR2 and LCDR3 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 117, 118, and 119, respectively;(4) HCDR1, HCDR2 and HCDR3 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 129, 130, and 131, respectively; and / or, LCDR1, LCDR2 and LCDR3 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 133, 134, and 135, respectively;(5) HCDR1, HCDR2 and HCDR3 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 144, 145, and 146, respectively; and / or, LCDR1, LCDR2 and LCDR3 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 109, 110, and 148, respectively;(6) HCDR1, HCDR2 and HCDR3 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 165, 166, and 167, respectively; and / or, LCDR1, LCDR2 and LCDR3 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 109, 110, and 169, respectively;(7) HCDR1, HCDR2 and HCDR3 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 171, 172, and 173, respectively; and / or, LCDR1, LCDR2 and LCDR3 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 175, 118, and 176, respectively;(8) HCDR1, HCDR2 and HCDR3 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 171, 206, and 173, respectively; and / or, LCDR1, LCDR2 and LCDR3 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 175, 118, and 176, respectively;(9) HCDR1, HCDR2 and HCDR3 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 190, 191, and 192, respectively; and / or, LCDR1, LCDR2 and LCDR3 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 194, 110, and 195, respectively; or(10) HCDR1, HCDR2 and HCDR3 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 209, 210, and 211, respectively; and / or, LCDR1, LCDR2 and LCDR3 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 213, 214, and 215, respectively.10.The antibody or antigen-binding fragment thereof of claim 8 or 9, comprising a VH comprising the amino acid sequence of 96, 104, 112, 128, 143, 164, 170, 189, 205, or 208, or an amino acid sequence having at least 80%, 85%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%sequence identity thereto; and / or, a VL comprising the amino acid sequence of 100, 108, 116, 132, 147, 168, 174, 193, 207, or 212, or an amino acid sequence having at least 80%, 85%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%sequence identity thereto.11.The antibody or antigen-binding fragment thereof of any one of claims 8 to 10, comprising:(1) a VH comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 96 or an amino acid sequence having at least 80%sequence identity thereto; and / or, a VL comprising the sequence of SEQ ID NO: 100 or an amino acid sequence having at least 80%sequence identity thereto;(2) a VH comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 104 or an amino acid sequence having at least 80%sequence identity thereto; and / or, a VL comprising the sequence of SEQ ID NO: 108 or an amino acid sequence having at least 80%sequence identity thereto;(3) a VH comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 112 or an amino acid sequence having at least 80%sequence identity thereto; and / or, a VL comprising the sequence of SEQ ID NO: 116 or an amino acid sequence having at least 80%sequence identity thereto;(4) a VH comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 128 or an amino acid sequence having at least 80%sequence identity thereto; and / or, a VL comprising the sequence of SEQ ID NO: 132 or an amino acid sequence having at least 80%sequence identity thereto;(5) a VH comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 143 or an amino acid sequence having at least 80%sequence identity thereto; and / or, a VL comprising the sequence of SEQ ID NO: 147 or an amino acid sequence having at least 80%sequence identity thereto;(6) a VH comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 164 or an amino acid sequence having at least 80%sequence identity thereto; and / or, a VL comprising the sequence of SEQ ID NO: 168 or an amino acid sequence having at least 80%sequence identity thereto;(7) a VH comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 170 or an amino acid sequence having at least 80%sequence identity thereto; and / or, a VL comprising the sequence of SEQ ID NO: 174 or an amino acid sequence having at least 80%sequence identity thereto;(8) a VH comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 189 or an amino acid sequence having at least 80%sequence identity thereto; and / or, a VL comprising the sequence of SEQ ID NO: 193 or an amino acid sequence having at least 80%sequence identity thereto;(9) a VH comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 208 or an amino acid sequence having at least 80%sequence identity thereto; and / or, a VL comprising the sequence of SEQ ID NO: 212 or an amino acid sequence having at least 80%sequence identity thereto; or(10) a VH comprising the sequence of SEQ ID NO: 205 or an amino acid sequence having at least 80%sequence identity thereto; and / or a VL comprising the sequence of SEQ ID NO: 207 or an amino acid sequence having at least 80%sequence identity thereto.12.The antibody or antigen-binding fragment thereof of any one of claims 8 to 11, further comprising: a heavy chain constant region (CH) comprising an amino acid sequence derived from a human immunoglobulin heavy chain constant region;preferably, the heavy chain constant region is an IgG heavy chain constant region, such as an IgG1, IgG2, IgG3 or IgG4 heavy chain constant region;preferably, the antibody or antigen-binding fragment thereof further comprises: a light chain constant region (CL) comprising an amino acid sequence derived from a human immunoglobulin light chain constant region, such as a kappa light chain constant region.13.The antibody or antigen-binding fragment thereof of any one of claims 8 to 12, which is selected from scFv, Fab, Fab', (Fab') 2, a Fv fragment, a diabody, a bispecific antibody, a multispecific antibody, a chimeric antibody, or a humanized antibody.14.A multispecific molecule comprising a γδ TCR-binding domain which comprises the VHH of any one of claims 1 to 5 and an additional binding domain that binds to a target other than γδTCR; preferably the multispecific molecule is a bispecific antibody.15.A multispecific molecule, comprising a γδ TCR-binding domain which comprises the VH and VL regions of the antibody or antigen-binding fragment thereof of any one of claims 8 to 13 and an additional binding domain that binds to a target other than γδ TCR; preferably the multispecific molecule is a bispecific antibody.16.The multispecific molecule of claim 15, wherein the γδ TCR-binding domain is a scFv, e.g., comprising a structure of VL-Linker-VH or VH-Linker-VL.17.The multispecific molecule of any one of claims 14 to 16, wherein the target other than γδ TCR is a cancer antigen, e.g., a tumor-specific antigen or tumor-associated antigen.18.The multispecific molecule of claim 17, wherein the cancer antigen is an antigen for hematological cancer, e.g., acute myeloid leukemia (AML) , chronic myeloid leukemia, acute lymphoblastic leukemia, chronic lymphocytic leukemia, Hodgkin's lymphoma, Non-Hodgkin's lymphoma or multiple myeloma.19.The multispecific molecule of claim 17, wherein the cancer antigen is an antigen for solid tumor, e.g., ovarian cancer, endometrial cancer, breast cancer, lung cancer (small cell or non-small cell) , colon cancer, prostate cancer, cervical cancer, pancreatic cancer, gastric cancer, esophageal cancer, hepatocellular carcinoma (liver cancer) , renal cell carcinoma (kidney cancer) , head-and-neck tumors, mesothelioma, melanoma, sarcomas, or brain tumors (e.g., gliomas, such as glioblastomas) .20.The multispecific molecule of any one of claims 17-19, wherein the cancer antigen is selected from CD33, CD19, CD20, CD22, CD30, CD70, CLL-1, BCMA, DLL-3, Claudin 6, Claudin 18.2, GPC3, GPC2, GPRC5D, CD229, FcRH5, GUCY2C, mesothelin, HER2, PSMA, or PSCA.21.The multispecific molecule of any one of claims 14 to 20, wherein the additional binding domain is a monovalent antibody fragment, e.g., a Fab, an Fv, a scFv, or a VHH.22.The multispecific molecule of any one of claims 14 to 21, futher comprising an immunoglobulin Fc domain composed of a first and a second subunit; preferably the Fc domain is an IgG Fc domain, e.g., an IgGl Fc domain or an IgG4 Fc domain.23.The multispecific molecule of claim 22, wherein the Fc domain comprises one or more amino acid substitution that reduces the binding affinity to an Fc receptor and / or effector function, improves stability (e.g., prevents Fab-arm exchange) , and / or promote heterodimerization (e.g., form a knob-into-hole) .24.The multispecific molecule of claim 23, wherein the Fc domain comprises a knob-into-hole structure, e.g., with substitution T366W in the first subunit of the Fc domain and with substitutions T366S and L368A in the second subunit of the Fc domain (numbering according to Kabat EU index) .25.The multispecific molecule of claim 23 or 24, wherein the Fc domain is of human IgG4 isotype with the amino acid substitutions S228P, L234A and L235A (numbering according to Kabat EU index) .26.The multispecific molecule of any one of claims 22 to 25, wherein the γδ TCR-binding domain is a VHH or a scFv, the additional binding domain is a Fab composed of a light chain (VL-CL) and a heavy chain (VH-CH1) , and wherein the heavy chain of Fab is fused to one of the Fc domain subunits and the VHH or scFv is fused to the other of the Fc domain subunits.27.The multispecific molecule of claim 26, comprising:a first polypeptide chain comprising a VL of the additional binding domain and a light chain constant domain (CL) ;a second polypeptide chain comprising a VH of the additional binding domain, a first heavy chain constant domain 1 (CH1) and a first Fc subunit;a third polypeptide chain comprising the γδ TCR-binding domain and a second Fc subunit; preferably the first and second Fc subunits comprise a knob-into-hole structure.28.The multispecific molecule of claim 27, wherein an amino acid sequence of the first CH1 and the first Fc subunit is shown in SEQ ID NO: 197, and an amino acid sequence of the second Fc subunit is shown in SEQ ID NO: 198.29.The multispecific molecule of claim 27 or 28, wherein an amino acid sequence of the CL is shown in SEQ ID NO: 196.30.The multispecific molecule of any one of claims 14 to 29, wherein the additional binding domain is a Fab that binds CD33.31.The multispecific molecule of claim 30, wherein the Fab comprises a VH and a VL, wherein the VH comprises the sequence of SEQ ID NO: 216 or an amino acid sequence having at least 80%sequence identity thereto; and the VL comprises the sequence of SEQ ID NO: 217 or an amino acid sequence having at least 80%sequence identity thereto.32.An isolated nucleic acid molecule comprising a nucleotide sequence encoding the VHH of any one of claims 1 to 5, the polypeptide construct of claim 6 or 7, the antibody or antigen-binding fragment thereof of any one of claims 8 to 13, or the multispecific molecule of any one of claims 14 to 31.33.A vector comprising the nucleic acid molecule of claim 32.34.A cell comprising the nucleic acid molecule of claim 32, or the vector of claim 33.35.A method of producing the VHH of any one of claims 1 to 5, the polypeptide construct of claim 6 or 7, the antibody or antigen-binding fragment thereof of any one of claims 8 to 13, or the multispecific molecule of any one of claims 14 to 31, comprising: culturing a host cell comprising the isolated nucleic acid molecule of claim 32 or the vector of claim 33, or the cell of claim 34 under a condition that allows protein expression, and recovering the VHH, the polypeptide construct, the antibody or antigen-binding fragment thereof, or the multispecific molecule from a culture of the cultured cell.36.A pharmaceutical composition comprising the VHH of any one of claims 1 to 5, the polypeptide construct of claim 6 or 7, the antibody or antigen-binding fragment thereof of any one of claims 8 to 13, or the multispecific molecule of any one of claims 14 to 31, and a  pharmaceutically acceptable carrier and / or excipient.37.The pharmaceutical composition of claim 36, wherein further comprises an additional therapeutic agent.38.The pharmaceutical composition of claim 37, wherein the additional therapeutic agent is an anti-cancer agent, e.g., immune checkpoint inhibitor (e.g., anti-PD-1 antibody, anti-PD-L1 antibody, anti-TIM-3 antibody, anti-LAG-3 antibody, or anti-CTLA-4 antibody) or cytotoxic agent (e.g., an alkylating agent, an anti-mitotic agent, an antitumor antibiotic, an antimetabolite, a topoisomerase inhibitor, a tyrosine kinase inhibitor, or a radionuclide) or a cytokine (e. g, an immune cell activating cytokine, such as IL-2, IL-15, IL-7, IL-6, IL-12, IL-18, IFNα, ΙFΝβ, or IFNγ) .39.A method of treating a disease (e.g., cancer) in a subject, comprising administering to a subject in need thereof an effective amount of the VHH of any one of claims 1 to 5, the polypeptide construct of claim 6 or 7, the antibody or antigen-binding fragment thereof of any one of claims 8 to 13, or the multispecific molecule of any one of claims 14 to 31, or the pharmaceutical composition of any one of claims 36 to 38.40.The method of claim 39, wherein the cancer is a hematological cancer, e.g., acute myeloid leukemia (AML) , chronic myeloid leukemia, acute lymphoblastic leukemia, chronic lymphocytic leukemia, Hodgkin's lymphoma, Non-Hodgkin's lymphoma or multiple myeloma.41.The method of claim 39, wherein the cancer is a solid tumor, e.g., ovarian cancer, endometrial cancer, breast cancer, lung cancer (small cell or non-small cell) , colon cancer, prostate cancer, cervical cancer, pancreatic cancer, gastric cancer, esophageal cancer, hepatocellular carcinoma (liver cancer) , renal cell carcinoma (kidney cancer) , head-and-neck tumors, mesothelioma, melanoma, sarcomas, or brain tumors (e.g., gliomas, such as glioblastomas) .42.The method of claim 39, comprising administering the multispecific molecule for treating cancer which is characterized by a cancer antigen targted by the multispecific molecule.43.The method of any one of claims 39-42, wherein the cancer is characterized by a cancer antigen selected from CD33, CD19, CD20, CD22, CD30, CD70, CLL-1, BCMA, DLL-3, Claudin 6, Claudin 18.2, GPC3, GPC2, GPRC5D, CD229, FcRH5, GUCY2C, mesothelin, HER2, PSMA,  or PSCA.44.The method of any one of claims 39 to 43, wherein the subject is a mammal, such as a human.45.The method of any one of claims 39 to 44, wherein the VHH, the polypeptide construct, the antibody or antigen-binding fragment thereof, or the multispecific molecule, or the pharmaceutical composition is for administration in combination with an additional therapeutic agent or an additional therapy.46.The method of claim 45, wherein the additional therapeutic agent or an additional therapy is an anti-cancer agent or therapy;preferably, the additional therapeutic agent is an immune checkpoint inhibitor or a cytotoxic agent or cytokine;preferably, the additional therapy is a standard cancer treatment, such as surgery, chemotherapy, radiation therapy, targeted therapy, immunotherapy, hormone therapy, gene therapy or palliative care.47.A method of activating γδ T cell or increasing γδ T cell proliferation or producing polyclonal γδT cells comprising contacting T cells with the VHH of any one of claims 1 to 5, the polypeptide construct of claim 6 or 7, the antibody or antigen-binding fragment thereof of any one of claims 8 to 13, or the multispecific molecule of any one of claims 14 to 31, or the pharmaceutical composition of any one of claims 36 to 38.48.Use of the VHH of any one of claims 1 to 5, the polypeptide construct of claim 6 or 7, the antibody or antigen-binding fragment thereof of any one of claims 8 to 13, or the multispecific molecule of any one of claims 14 to 31, or the pharmaceutical composition of any one of claims 36 to 38, in the manufacture of(i) a medicament for treating a disease (e.g., cancer) in a subject; or(ii) polyclonal γδT cells.

Images