Antibodies binding btn3a1 and uses thereof

Abstract

An isolated monoclonal antibody that specifically binds human BTN3A1, or an antigen-binding portion thereof. A nucleic acid molecule encoding the antibody or the antigen-binding portion thereof, an expression vector, a host cell and a method for expressing the antibody or the antigen-binding portion thereof are also provided. Further provided is a bispecific molecule and a pharmaceutical composition comprising the antibody or the antigen-binding portion thereof, as well as a treatment method using the anti-BTN3A1 antibody or the antigen-binding portion thereof.

Description

ANTIBODIES BINDING BTN3A1 AND USES THEREOF

[0001] This application claims priority to US provisional patent application Serial No. 63 / 535, 618 filed on August 31, 2023.FIELD OF THE INVENTION

[0002] The present disclosure relates generally to an isolated monoclonal antibody, particularly a mouse, chimeric or humanized monoclonal antibody, or an antigen-binding portion thereof, that binds to BTN3A1, with high affinity and functionality. A nucleic acid molecule encoding the antibody or the antigen-binding portion thereof, an expression vector, a host cell and a method for expressing the antibody or the antigen-binding portion thereof are also provided. The present disclosure further provides a bispecific molecule, an oncolytic virus, and a pharmaceutical composition which may comprise the antibody or the antigen-binding portion thereof, as well as a treatment method using the antibody or antigen-binding portion thereof of the disclosure.

[0003] SEQUENCE STATEMENT

[0004] The instant application contains a Sequence Listing XML labeled “55532-00145SequenceListingXML” which was created on August 30, 2023, modified on August 23, 2024, and is 37 kb. The entire content of the sequence listing is incorporated herein by reference in its entirety.BACKGROUND OF THE INVENTION

[0005] In humans, approximately 1%to 10%of CD3+ T cells are γδ T cells, which are able to recognize conserved danger-associated determinants that are up-regulated after inflammation, infection, or cell transformation (Saura-Esteller J et al., (2022) Front Immunol. 13: 915837; Harly C et al., (2012) Blood. 120: 2269–2279) . Vγ9Vδ2 T cells represent the predominant γδ T-cell subset (95%) in peripheral blood, and show considerably functional plasticity, including differentiation into antigen-presenting or phagocytosing cells, and regulating immune responses by crosstalk with other immune cells (Hinz T et al., (1997) Int Immunol 9 (8) : 1065–1072) .

[0006] Vγ9Vδ2 T cells can sense and respond to small phosphorylated metabolites (phosphoantigens or pAgs) accumulated in cells with microbial infection or abnormal metabolism, including certain tumor cells, via a protein called BTN3A. The BTN3A protein, also known as CD277, has three isoforms, namely BTN3A1, BTN3A2, and BTN3A3. The three isoforms share 95%homology in the extracellular region, with each containing an extracellular N-terminal IgV domain and a membrane proximal IgC domain connected to a single-pass transmembrane domain, but contain quite different intracellular regions, with BTN3A1 and BTN3A3 having a B30.2 domain which is absent from BTN3A2’s short cytoplasmic tail. The BTN3A protein is broadly expressed, and its overexpression has been found in a number of solid tumors (e.g., bladder, colorectal, melanoma, ovarian, pancreatic, lung) and hematologic cancers (e.g., leukemia &lymphoma) (Gassart AD et al., (2021) Sci Transl Med. 13 (616) : eabj0835) .

[0007] When the pAgs are increased in cells under stress conditions, they may bind to the B30.2 domain of BTN3A1, to induce BTN3A1’ conformational change, re-distribution and anchoring, and  association with BTN2A1 that interacts directly with the Vγ9 chain on the Vγ9Vδ2 T cells, resulting in Vγ9Vδ2 T-cell activation and target killing of the cells with high pAg levels (Saura-Esteller J et al., (2022) , cited supra; Chen S et al., (2021) J Cancer. 12 (15) : 4505-4512) . BTN3A2 and BTN3A3 are reported to promote Vγ9Vδ2 T cell activation by increasing BTN3A1 levels, and their extracellular domains may undergo similar conformational change as BTN3A1 does when treated with anti-BTN3A antibodies (Wang H et al., (2019) J Immunol. 203: 607-626) . Therapeutics targeting BTN3A have been or are being developed. ICT01 is a humanized anti-BTN3A monoclonal antibody developed by Imcheck that binds to all three BTN3A isoforms to induce Vγ9Vδ2 T-cell activation and enhance cytotoxicity against BTN3A+ tumor cell lines from diverse origins (Harly C et al., (2012) , cited supra) .

[0008] Despite of the advancement in this field, the choice for the patients is limited so far and there is a need for additional monoclonal antibodies with improved pharmaceutical characteristics.

[0009] Citation or identification of any document in this application is not an admission that such document is available as prior art to the present invention.SUMMARY OF THE INVENTION

[0010] The present disclosure provides an isolated monoclonal antibody, for example, a mouse, chimeric or humanized antibody, or an antigen-binding portion thereof, that is able to specifically bind to BTN3A1 (e.g., human BTN3A1, and monkey BTN3A1) and has i) comparable, if not higher, binding affinity / capability to human and monkey BTN3A1 proteins, ii) comparable, if not higher, binding capability to cells expressing human BTN3A1, iii) comparable, if not higher, cross-reaction to human BTN3A2 and BTN3A3 proteins, iv) comparable, if not better, ability to trigger target cell killing by γδT cells, and / or v) comparable, if not higher, in vivo anti-tumor efficacy, as compared to prior art anti-BTN3A1 antibodies such as ICT01.

[0011] Without wishing to be bound by the theory, the inventors of the present application believe that the antibody or the antigen binding portion thereof of the disclosure, upon binding to the BTN3A protein, e.g., BTN3A1, BTN3A2 or BTN3A3, may enable conformational change of the extracellular domain of that BTN3A protein, especially BTN3A1 and possibly also BTN3A2 and / or BTN3A3, thus inducing γδ T cell activation and target cell killing by γδ T cells in a pAg-independent manner. The target cell may be a BTN3A+ cell, such as a BTN3A1+ cell. The antibody or the antigen binding portion thereof of the disclosure, when provided with a heavy chain constant region with FcR or complement system component binding affinity, may also kill BTN3A+ cells, such as BTN3A1+ cells via antibody dependent cell mediated cytotoxicity (ADCC) , antibody dependent cellular phagocytosis (ADCP) , complement dependent cytotoxicity (CDC) or the like.

[0012] The antibody or antigen-binding portion of the disclosure can be used for a variety of applications, including the detection of human and / or monkey BTN3A1 proteins in vitro, and the enhancement of immune responses in pathological conditions such as cancers and infectious disorders.

[0013] Accordingly, in one aspect, the disclosure pertains to an isolated monoclonal antibody, or an antigen-binding portion thereof, that is able to bind BTN3A1 (e.g., human and monkey BTN3A1 proteins) , comprising (i) a heavy chain variable region that may comprise a VH CDR1 region, a VH CDR2 region and a VH CDR3 region, wherein the VH CDR1 region, the VH CDR2 region and the  VH CDR3 region may comprise amino acid sequences having at least 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%sequence identity to (1) SEQ ID NOs: 1 (X=Y) , 2 (X1=N, X2=T; X1=N, X2=A; or X1=A, X2=T) and 3 (X=T) , respectively; (2) SEQ ID NOs: 1 (X=Y) , 12 and 3 (X=S) , respectively; or (3) SEQ ID NOs: 1 (X=H) , 15 (X=G or X=S) and 3 (X=S) , respectively; or (ii) a light chain variable region that may comprise a VL CDR1 region, a VL CDR2 region and a VL CDR3 region, wherein the VL CDR1 region, the VL CDR2 region and the VL CDR3 region may comprise amino acid sequences having at least 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%sequence identity to SEQ ID NOs: 4 (X1=N, X2=N; X1=A, X2=A; X1=S, X2=S; or X1=V, X2=V) , 5 and 6, respectively.

[0014] The isolated monoclonal antibody or the antigen-binding portion thereof of the disclosure may comprise a heavy chain variable region and a light chain variable region, wherein the VH CDR1 region, the VH CDR2 region, the VH CDR3 region, the VL CDR1 region, the VL CDR2 region and the VL CDR3 region may comprise amino acid sequences having at least 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%sequence identity to (1) SEQ ID NOs: 1 (X=Y) , 2 (X1=N, X2=T) , 3 (X=T) , 4 (X1=N, X2=N) , 5 and 6, respectively; (2) SEQ ID NOs: 1 (X=Y) , 2 (X1=N, X2=T) , 3 (X=T) , 4 (X1=A, X2=A) , 5 and 6, respectively; (3) SEQ ID NOs: 1 (X=Y) , 2 (X1=N, X2=T) , 3 (X=T) , 4 (X1=S, X2=S) , 5 and 6, respectively; (4) SEQ ID NOs: 1 (X=Y) , 2 (X1=N, X2=T) , 3 (X=T) , 4 (X1=V, X2=V) , 5 and 6, respectively; (5) SEQ ID NOs: 1 (X=Y) , 2 (X1=N, X2=A) , 3 (X=T) , 4 (X1=V, X2=V) , 5 and 6, respectively; (6) SEQ ID NOs: 1 (X=Y) , 2 (X1=A, X2=T) , 3 (X=T) , 4 (X1=A, X2=A) , 5 and 6, respectively; (7) SEQ ID NOs: 1 (X=Y) , 2 (X1=A, X2=T) , 3 (X=T) , 4 (X1=V, X2=V) , 5 and 6, respectively; (8) SEQ ID NOs: 1 (X=Y) , 12, 3 (X=S) , 4 (X1=N, X2=N) , 5 and 6, respectively; (9) SEQ ID NOs: 1 (X=H) , 15 (X=G) , 3 (X=S) , 4 (X1=N, X2=N) , 5 and 6, respectively; or (10) SEQ ID NOs: 1 (X=H) , 15 (X=S) , 3 (X=S) , 4 (X1=N, X2=N) , 5 and 6, respectively.

[0015] The heavy chain variable region may comprise an amino acid sequence having at least 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%sequence identity to SEQ ID NOs: 7 (X1=N, X2=T; X1=N, X2=A; or X1=A, X2=T) , 8, 9 (X1=L, X2=A, X3=K, X4=F; X1=L, X2=T, X3=K, X4=F; X1=M, X2=T, X3=K, X4=F; X1=L, X2=T, X3=T, X4=F; or X1=L, X2=T, X3=K, X4=Y) , 13 or 16 (X1=G, X2=I, X3=G; X1=G, X2=T, X3=S; or X1=E, X2=T, X3=S) .

[0016] The light chain variable region may comprise an amino acid sequence having at least 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%sequence identity to SEQ ID NOs: 10 (X1=N, X2=N; X1=A, X2=A; X1=S, X2=S; or X1=V, X2=V) , 11 (X1=V, X2=L, X3=V; X1=V, X2=V, X3=L; or X1=I, X2=V, X3=L) or 14 (X=T or X=Q) .

[0017] The isolated monoclonal antibody or the antigen-binding portion thereof of the disclosure may comprise a heavy chain variable region and a light chain variable region comprising amino acid sequences having at least 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%sequence identity to (1) SEQ ID NOs: 7 (X1=N, X2=T) and 10 (X1=N, X2=N) , respectively; (2) SEQ ID NOs: 7 (X1=N, X2=T) and 10 (X1=A, X2=A) , respectively; (3) SEQ ID NOs: 7 (X1=N, X2=T) and 10 (X1=S, X2=S) , respectively; (4) SEQ ID NOs: 7 (X1=N, X2=T) and 10 (X1=V, X2=V) , respectively; (5) SEQ ID NOs: 7 (X1=N, X2=A) and 10 (X1=V, X2=V) , respectively; (6) SEQ ID NOs: 7 (X1=A, X2=T) and 10 (X1=A, X2=A) , respectively; (7) SEQ ID NOs: 7 (X1=A, X2=T) and  10 (X1=V, X2=V) , respectively; (8) SEQ ID NOs: 8 and 11 (X1=V, X2=L, X3=V) , respectively; (9) SEQ ID NOs: 9 (X1=L, X2=A, X3=K, X4=F) and 11 (X1=V, X2=V, X3=L) , respectively; (10) SEQ ID NOs: 9 (X1=L, X2=T, X3=K, X4=F) and 11 (X1=V, X2=V, X3=L) , respectively; (11) SEQ ID NOs: 9 (X1=M, X2=T, X3=K, X4=F) and 11 (X1=V, X2=V, X3=L) , respectively; (12) SEQ ID NOs: 9 (X1=L, X2=T, X3=T, X4=F) and 11 (X1=V, X2=V, X3=L) , respectively; (13) SEQ ID NOs: 9 (X1=L, X2=T, X3=K, X4=Y) and 11 (X1=V, X2=V, X3=L) , respectively; (14) SEQ ID NOs: 9 (X1=L, X2=A, X3=K, X4=F) and 11 (X1=I, X2=V, X3=L) , respectively; (15) SEQ ID NOs: 9 (X1=L, X2=T, X3=K, X4=F) and 11 (X1=I, X2=V, X3=L) , respectively; (16) SEQ ID NOs: 13 and 14 (X=T) , respectively; (17) SEQ ID NOs: 16 (X1=G, X2=I, X3=G) and 14 (X=Q) , respectively; (18) SEQ ID NOs: 16 (X1=G, X2=T, X3=S) and 14 (X=Q) , respectively; or (19) SEQ ID NOs: 16 (X1=E, X2=T, X3=S) and 14 (X=Q) , respectively.

[0018] The isolated monoclonal antibody, or the antigen-binding portion thereof, of the present disclosure may comprise a heavy chain and a light chain linked by disulfide bonds, the heavy chain may comprise a heavy chain variable region and a heavy chain constant region, the light chain may comprise a light chain variable region and a light chain constant region, wherein the C terminus of the heavy chain variable region is linked to the N terminus of the heavy chain constant region, and the C terminus of the light chain variable region is linked to the N terminus of the light chain constant region, wherein the heavy chain variable region and the light chain variable region may comprise amino acid sequences described above, and the antibody or the antigen-binding portion thereof can bind to BTN3A1.

[0019] The heavy chain constant region may be with or without FcR and / or complement system protein binding affinity. The heavy chain constant region may be IgG1, IgG2, or IgG4 heavy chain constant region, or a functional fragment thereof, such as the Fc fragment. In certain embodiments, the heavy chain constant region may be human heavy chain constant region comprising the amino acid sequence of e.g., SEQ ID NO: 20, or mouse heavy chain constant region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NOs: 17 or 18. The light chain constant region may be kappa constant region, such as human kappa light chain constant region comprising the amino acid sequence of e.g., SEQ ID NO: 21, or mouse kappa light chain constant region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19, or a functional fragment thereof.

[0020] The antibody of the present disclosure in certain embodiments may comprise or consist of two heavy chains and two light chains, wherein each heavy chain may comprise the heavy chain constant region, heavy chain variable region or CDR sequences mentioned above, and each light chain may comprise the light chain constant region, light chain variable region or CDR sequences mentioned above, wherein the antibody binds to BTN3A1. The antibody or the antigen-binding portion thereof of the present disclosure in other embodiments may be a single chain variable fragment (scFv) antibody, or antibody fragments, such as Fab or F (ab’) 2 fragments.

[0021] The disclosure also provides a bispecific molecule that may comprise the antibody, or the antigen-binding portion thereof, of the disclosure, linked to a second functional moiety (e.g., a second antibody or its antigen binding portion thereof) having a different binding specificity than the antibody, or the antigen-binding portion thereof of the disclosure. The antibody or the antigen binding portion thereof of the disclosure can also be encoded by or used in conjunction with an oncolytic virus.

[0022] The disclosure further provides a nucleic acid molecule encoding the antibody or the antigen-binding portion thereof of the disclosure, as well as an expression vector comprising such a nucleic acid molecule and a host cell comprising such an expression vector or having the nucleic acid molecule integrated into its genome. A method for preparing the anti-BTN3A1 antibody or antigen binding portion thereof using the host cell of the disclosure is provided, comprising steps of (i) expressing the antibody or antigen binding portion thereof in the host cell, and (ii) isolating the antibody or antigen binding portion thereof from the host cell or its cell culture.

[0023] The disclosure provides a composition comprising the antibody or antigen binding portion thereof, the bispecific molecule, the oncolytic virus, the nucleic acid molecule, the expression vector, or the host cell of the disclosure. The composition may be a pharmaceutical composition further comprising a pharmaceutically acceptable carrier. In certain embodiments, the pharmaceutical composition may further contain a therapeutic agent, such as an anti-tumor agent, or an anti-infectious agent.

[0024] In yet another aspect, the disclosure provides a method for treating a disease where BTN3A-mediated T cell activation, e.g., BTN3A1-mediated T activation, is beneficial, which may comprise administering to a subject a therapeutically effective amount of the pharmaceutical composition of the present disclosure. The BTN3A-mediated T cell activation may be BTN3A-mediated γδ T cell activation. The BTN3A-mediated γδ T cell activation may be BTN3A-mediated Vγ9Vδ2 T cell activation. The disease may be with an increased BTN3A level, especially BTN3A level. The disease may be with BTN3A overexpression, e.g., BTN3A1 overexpression.

[0025] The method may comprise delivering the active component (s) in the pharmaceutical composition to a lesion site where BTN3A+ cells, e.g., BTN3A1+ cells, are located. In certain embodiments, the method may be carried out by local administration, so that the active component (s) in the pharmaceutical composition can be delivered to the lesion site.

[0026] The disease may be a tumor or cancer, e.g., a BTN3A+ (e.g., BTN3A1+) tumor or cancer comprising BTN3A+ (e.g., BTN3A1+) tumor or cancer cells. The tumor or cancer may be a solid one or a hematologic one. Exemplary examples of the solid cancer include, but not limited to, colon cancer, breast cancer, lung cancer, prostate cancer, head and neck cancer, pancreatic cancer, bladder cancer, colorectal cancer, cervical cancer, ovarian cancer, liver cancer, esophageal cancer, thyroid cancer, kidney cancer, and stomach cancer. Exemplary examples of the hematologic cancer include, but not limited to, chronic lymphocytic leukemia (CLL) , non-Hodgkin lymphoma (NHL) , lymphoid neoplasm, small lymphocytic lymphoma (SLL) , mantle cell lymphoma (MCL) and myeloid cell lineage neoplasm. In certain embodiments, the disease may be a T cell leukemia. In certain embodiments, the subject is human.

[0027] The disease may be an infectious disorder. The infectious disorder may be with an increased BTN3A (e.g., BTN3A1) expression level in the lesion site. Examples of the infectious disorder include, but not limited to, viral, bacterial, parasitic or fungal infections, such as a chronic lung infection, a lower respiratory tract infection, bronchitis, and pneumoniae. In certain embodiments, the subject is human.

[0028] In yet another aspect, the disclosure provides a method for killing a BTN3A+ cell in a subject in need thereof, comprising administering the pharmaceutical composition of the disclosure. The  BTN3A+ cell may be a BTN3A1+ cell.

[0029] In yet another aspect, the disclosure provides a method for inducing BTN3A-mediated T cell activation (e.g., BTN3A1-mediated T cell activation) in a subject in need thereof, comprising administering to the subject the pharmaceutical composition of the disclosure. In certain embodiments, the subject is human.

[0030] The disclosure also provides a method for inducing or restoring an immune cell’s activity to kill a BTN3A+ cell. The BTN3A+ cell may be a BTN3A1+ cell. In certain embodiments, the disclosure provides a method for inducing or restoring an immune cell’s activity to kill a BTN3A+ cell, e.g., a BTN3A1+ cell in a subject in need thereof, comprising administering to the subject the pharmaceutical composition of the disclosure. The immune cell may be a γδ T cell. In certain embodiments, the immune cell may be a Vγ9Vδ2 T cell. In certain embodiments, the subject is human.

[0031] The disclosure also provides the use of the pharmaceutical composition of the disclosure in treating a disease where BTN3A-mediated T cell activation, e.g., BTN3A1-mediated T activation, is beneficial, killing a BTN3A+ cell, inducing BTN3A-mediated T cell activation (e.g., BTN3A1-mediated T cell activation) and / or inducing or restoring an immune cell’s activity to kill a BTN3A+cell, and the use of the pharmaceutical composition of the disclosure in preparation of a medicament for treating a disease where BTN3A-mediated T cell activation, e.g., BTN3A1-mediated T activation, is beneficial, killing a BTN3A+ cell, inducing BTN3A-mediated T cell activation (e.g., BTN3A1-mediated T cell activation) and / or an immune cell’s activity to kill a BTN3A+ cell.

[0032] Other features and advantages of the instant disclosure will be apparent from the following detailed description and examples, which should not be construed as limiting. The contents of all references, Genbank entries, patents and published patent applications cited throughout this application are expressly incorporated herein by reference.BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

[0033] The following detailed description, given by way of example, but not intended to limit the invention solely to the specific embodiments described, may best be understood in conjunction with the accompanying drawings.

[0034] FIG. 1 shows the binding capability of mouse antibodies C7E12B1B4, C7B9C8A8, C6G10H1A1, C1D6F1A3, and C2G4F7C7 to human BTN3A1 in a capture ELISA.

[0035] FIG. 2 shows the binding capability of mouse antibodies C7E12B1B4, C7B9C8A8, C6G10H1A1, C1D6F1A3, and C2G4F7C7 to cynomolgus BTN3A1 in an indirect ELISA.

[0036] FIG. 3 shows the binding capability of mouse antibodies C7E12B1B4, C7B9C8A8, C6G10H1A1, C1D6F1A3, and C2G4F7C7 to Daudi cells expressing human BTN3A1 in a cell-based binding FACS assay.

[0037] FIG. 4 shows the ability of mouse antibodies C7E12B1B4, C7B9C8A8, C6G10H1A1, C1D6F1A3, and C2G4F7C7 to block benchmark-human BTN3A1 binding.

[0038] FIG. 5 shows the capability of mouse antibodies C7E12B1B4, C7B9C8A8, C6G10H1A1, C1D6F1A3, and C2G4F7C7 to induce Jurkat cell killing by γδ T cell s in a cell based functional assay.

[0039] FIGs. 6A-6B show the binding capability of chimeric antibodies C2G4F7C7-CDRV7,  C2G4F7C7-CDRV8, C2G4F7C7-CDRV13 (A) , C2G4F7C7-CDRV23, C2G4F7C7-CDRV27, and C2G4F7C7-CDRV33 (B) to human BTN3A1 in a capture ELISA.

[0040] FIGs. 7A-7B show the binding capability of chimeric antibodies C2G4F7C7-CDRV7, C2G4F7C7-CDRV8, C2G4F7C7-CDRV13 (A) , C2G4F7C7-CDRV23, C2G4F7C7-CDRV27, and C2G4F7C7-CDRV33 (B) to human BTN3A2 in an indirect ELISA.

[0041] FIGs. 8A-8B show the binding capability of chimeric antibodies C2G4F7C7-CDRV7, C2G4F7C7-CDRV8, C2G4F7C7-CDRV13 (A) , C2G4F7C7-CDRV23, C2G4F7C7-CDRV27, and C2G4F7C7-CDRV33 (B) to human BTN3A3 in an indirect ELISA.

[0042] FIGs. 9A-9B show the binding capability of chimeric antibodies C2G4F7C7-CDRV7, C2G4F7C7-CDRV8, C2G4F7C7-CDRV13 (A) , C2G4F7C7-CDRV23, C2G4F7C7-CDRV27, and C2G4F7C7-CDRV33 (B) to Daudi cells expressing human BTN3A1 in a cell-based binding FACS assay.

[0043] FIG. 10 shows the capability of chimeric antibodies C2G4F7C7-CDRV7, C2G4F7C7-CDRV8, C2G4F7C7-CDRV13, C2G4F7C7-CDRV23, C2G4F7C7-CDRV27, and C2G4F7C7-CDRV33 to induce Jurkat cell killing by γδ T cells in a cell based functional assay.

[0044] FIGs. 11A-11C show the binding capability of humanized antibodies huC2G4F7C7-CDRV33-V1, huC2G4F7C7-CDRV33-V2, huC2G4F7C7-CDRV33-V3, huC2G4F7C7-CDRV33-V4 (A) , huC2G4F7C7-CDRV33-V5, huC2G4F7C7-CDRV33-V6, huC2G4F7C7-CDRV33-V7 (B) , and huC2G4F7C7-CDRV33-V8 (C) to human BTN3A1 in a capture ELISA.

[0045] FIGs. 12A-12C show the ability of humanized antibodies huC2G4F7C7-CDRV33-V1, huC2G4F7C7-CDRV33-V2, huC2G4F7C7-CDRV33-V3, huC2G4F7C7-CDRV33-V4 (A) , huC2G4F7C7-CDRV33-V5, huC2G4F7C7-CDRV33-V6, huC2G4F7C7-CDRV33-V7 (B) , and huC2G4F7C7-CDRV33-V8 (C) to block benchmark-human BTN3A1 binding.

[0046] FIG. 13 shows the capability of humanized C2G4F7C7-CDRV33 antibodies to induce Jurkat cell killing by γδ T cells in a cell based functional assay.

[0047] FIG. 14 shows the binding capability of huC2G4F7C7-CDRV33-V1 to Jurkat cells expressing human BTN3A1 in a cell-based binding FACS assay.

[0048] FIG. 15 shows the binding capability of huC2G4F7C7-CDRV33-V1 to human BTN3A2 in an indirect ELISA.

[0049] FIG. 16 shows the binding capability of huC2G4F7C7-CDRV33-V1 to human BTN3A3 in an indirect ELISA.

[0050] FIG. 17 shows the binding capability of huC2G4F7C7-CDRV33-V1 to rhesus BTN3A1 in an indirect ELISA.

[0051] FIG. 18 shows the binding capability of huC2G4F7C7-CDRV33-V1 to cynomolgus BTN3A1 in an indirect ELISA.

[0052] FIG. 19 shows the capability of huC2G4F7C7-CDRV33-V1 to induce OVCAR3 cell killing by γδ T cells in a cell based functional assay.

[0053] FIG. 20 shows the capability of huC2G4F7C7-CDRV33-V1 to induce SKOV3 cell killing by γδ T cells in a cell based functional assay.

[0054] FIG. 21 shows the capability of huC2G4F7C7-CDRV33-V1 to induce MDA-MB-231 cell  killing by γδ T cells in a cell based functional assay.

[0055] FIG. 22A and 22B show the tumor growth, as measured by tumor cell signal intensity, in B-NDG mice treated by the antibodies of the disclosure (A) , and the tumor size, as measured by tumor cell signal intensity, in animals on Day 17 (B) .DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

[0056] To ensure that the present disclosure may be more readily understood, certain terms are first defined. Additional definitions are set forth throughout the detailed description.

[0057] The term “BTN3A” refers to butyrophilin subfamily 3, also named as CD277. It has three isoforms, namely BTN3A1, BTN3A2 and BTN3A3.

[0058] The term “human BTN3A1” refers to a BTN3A1 protein having the amino acid sequence from human, such as the amino acid sequence of Uniprot number no. O00481. The term “rhesus BTN3A1” refers to a BTN3A1 protein having the amino acid sequence from rhesus macaque, such as the amino acid sequence of Genbank Accession No. XP_014991222.2. The term “cynomolgus BTN3A1” refers to a BTN3A1 protein having the amino acid sequence from cynomolgus monkey, such as the amino acid sequence of Uniprot number no. A0A330KVC6.

[0059] The term “human BTN3A2” refers to a BTN3A2 protein having the amino acid sequence from human, such as the amino acid sequence of Uniprot number no. P78410-1, while the term “human BTN3A3” refers to a BTN3A3 protein having the amino acid sequence from human, such as the amino acid sequence of Uniprot number no. O00478.

[0060] The term “antibody” as used herein refers to an immunoglobulin molecule that recognizes and specifically binds a target, such as BTN3A1, through at least one antigen-binding site wherein the antigen-binding site is usually within the variable region of the immunoglobulin molecule. An antibody can be any of the five major classes of immunoglobulins: IgA, IgD, IgE, IgG, and IgM, or subclasses (isotypes) thereof (e.g., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 and IgA2) , based on the identity of their heavy-chain constant domains referred to as alpha, delta, epsilon, gamma, and mu, respectively. The different classes of immunoglobulins have different and well-known subunit structures and three-dimensional configurations. Unless expressly indicated otherwise, the term “antibody” as used herein include “antigen-binding portion” of the intact antibodies. An IgG is a glycoprotein which may comprise two heavy (H) chains and two light (L) chains inter-connected by disulfide bonds. Each heavy chain may be comprised of a heavy chain variable region (abbreviated herein as VH) and a heavy chain constant region. The heavy chain constant region may be comprised of three domains, CH1, CH2 and CH3. Each light chain may be comprised of a light chain variable region (abbreviated herein as VL) and a light chain constant region. The light chain constant region may be comprised of one domain, CL. The VH and VL regions can be further subdivided into regions of hypervariability, termed complementarity determining regions (CDR) , interspersed with regions that are more conserved, termed framework regions (FR) . Each VH or VL is composed of three CDRs and four FRs, arranged from amino-terminus to carboxy-terminus in the following order: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. The variable regions of the heavy and light chains contain a binding domain that interacts with an antigen. The constant regions of the antibodies can mediate the binding of the immunoglobulin to host tissues or  factors, including various cells of the immune system (e.g., effector cells) and the first component (C1q) of the classical complement system. A “functional fragment” of a heavy chain constant region refers to a part of the heavy chain constant region that retains the ability to e.g., bind to host tissues or factors or to prolong antibody’s half-life. A “functional fragment” of a light chain constant region refers to a part of the light chain constant region that retains the ability to e.g., stabilize antibody structure.

[0061] The term “antigen-binding portion” of an antibody (or simply “antibody portion” ) , as used herein, refers to one or more fragments of an antibody that retain the ability to specifically bind to an antigen (e.g., a BTN3A1 protein) . It has been shown that the antigen-binding function of an antibody can be performed by fragments of a full-length antibody. Examples of binding fragments encompassed within the term “antigen-binding portion” of an antibody include (i) a Fab fragment, a monovalent fragment consisting of the VL, VH, CL and CH1 domains; (ii) a F (ab') 2 fragment, a bivalent fragment which may comprise two Fab fragments linked by a disulfide bridge at the hinge region; (iii) a Fd fragment consisting of the VH and CH1 domains; (iv) a Fv fragment consisting of the VL and VH domains of a single arm of an antibody, (v) a dAb fragment (Ward et al., (1989) Nature 341: 544-546) , which consists of a VH domain; (vi) an isolated complementarity determining region (CDR) ; and (viii) a nanobody, which consists of a VHH domain. Furthermore, although the two domains of the Fv fragment, VL and VH, are coded by separate genes, they can be joined, using recombinant methods, by a synthetic linker that enables them to be made as a single protein chain in which the VL and VH regions pair to form monovalent molecules (known as single chain Fv (scFv) .

[0062] An “isolated antibody” , as used herein, is intended to refer to an antibody that is substantially free of other antibodies having different antigenic specificities (e.g., an isolated antibody that specifically binds a BTN3A1 protein is substantially free of antibodies that specifically bind antigens other than BTN3A1 proteins) . An isolated antibody that specifically binds a human BTN3A1 protein may, however, have cross-reactivity to other antigens, such as BTN3A1 proteins from other species. Moreover, an isolated antibody can be substantially free of other cellular material and / or chemicals.

[0063] The term “monoclonal antibody” as used herein refers to an antibody obtained from a population of substantially homogeneous antibodies, i.e., the individual antibodies comprising the population are identical except for possible naturally occurring mutations and / or post-translation modifications (e.g., isomerizations, amidations) that may be present in minor amounts. Monoclonal antibodies are highly specific, being directed against a single antigenic site. In contrast to polyclonal antibody preparations which typically include different antibodies directed against different determinants (epitopes) , each monoclonal antibody is directed against a single determinant on the antigen. In addition to their specificity, the monoclonal antibodies are advantageous in that they are synthesized by the hybridoma culture, uncontaminated by other immunoglobulins.

[0064] The term “mouse antibody” , as used herein, is intended to include antibodies having variable regions in which both the framework and CDR regions are derived from mouse germline immunoglobulin sequences. Furthermore, if the antibody contains a constant region, the constant region also is derived from mouse germline immunoglobulin sequences. The mouse antibodies of the disclosure can include amino acid residues not encoded by mouse germline immunoglobulin sequences (e.g., mutations introduced by random or site-specific mutagenesis in vitro or by somatic mutation in  vivo) . However, the term “mouse antibody” , as used herein, is not intended to include antibodies in which CDR sequences derived from the germline of another mammalian species have been grafted onto mouse framework sequences.

[0065] The term “chimeric antibody” refers to an antibody made by combining genetic material from a nonhuman source with genetic material from a human being. Or more generally, a chimeric antibody is an antibody having genetic material from a certain species with genetic material from another species.

[0066] The term “humanized antibody” , as used herein, refers to an antibody from non-human species whose protein sequences have been modified to increase similarity to antibody variants produced naturally in humans.

[0067] As used herein, an antibody that “specifically binds to human BTN3A1” is intended to refer to an antibody that binds to human BTN3A1 protein (and BTN3A2 and BTN3A3 proteins sharing high homology with the BTN3A1 protein) but does not substantially bind to non-BTN3A1 proteins. Preferably, the antibody binds to human BTN3A1 protein with “high affinity” , namely with a KD of 2.0 ×10-7 M or less, more preferably 5.0 ×10-8 M or less, more preferably 5.0 ×10-9 M or less.

[0068] The term “Kassoc” or “Ka” , as used herein, is intended to refer to the association rate of a particular antibody-antigen interaction, whereas the term “Kdis” or “Kd” , as used herein, is intended to refer to the dissociation rate of a particular antibody-antigen interaction. The term “KD” , as used herein, is intended to refer to the dissociation constant, which is obtained from the ratio of Kd to Ka (i.e., Kd / Ka) and is expressed as a molar concentration (M) . KD values for antibodies can be determined using methods well established in the art. A preferred method for determining the KD of an antibody is by using surface plasmon resonance, preferably using a biosensor system such as a BiacoreTM system.

[0069] The term “EC50” , also known as half maximal effective concentration, refers to the concentration of an antibody or an antigen-binding portion thereof which induces a response halfway between the baseline and maximum after a specified exposure time.

[0070] The term “IC50” , also known as half maximal inhibitory concentration, refers to the concentration of an antibody or an antigen-binding portion thereof which inhibits a specific biological or biochemical function by 50%relative to the absence of the antibody or the antigen binding portion thereof.

[0071] The term "sequence identity" as used in the present invention refers to sequence similarity between two polynucleotide sequences or between two amino acid sequences. The percent identity can be measured using sequence comparison software or algorithms or by visual inspection. Various algorithms and software that can be used to obtain alignments of amino acid or nucleotide sequences are well-known in the art. These include, but are not limited to, BLAST, ALIGN, Megalign, BestFit, GCG Wisconsin Package, and variants thereof.

[0072] The term “subject” includes any human or nonhuman animal. The term “nonhuman animal” includes all vertebrates, e.g., mammals and non-mammals, such as non-human primates, sheep, dogs, cats, cows, horses, chickens, amphibians, and reptiles, although mammals are preferred, such as non-human primates, sheep, dogs, cats, cows and horses.

[0073] The term “therapeutically effective amount” means an amount of the antibody or the antigen binding portion of the present disclosure sufficient to prevent or ameliorate the symptoms associated  with a disease or condition (such as a tumor or a chronic infection) and / or lessen the severity of the disease or condition. A therapeutically effective amount is understood to be in context to the condition being treated, where the actual effective amount is readily discerned by those of skill in the art.

[0074] Various aspects of the disclosure are described below in further detail.

[0075] The antibody, or the antigen-binding portion thereof, of the disclosure specifically binds to human and / or monkey BTN3A1 and has i) comparable, if not higher, binding affinity / capability to human and monkey BTN3A1, ii) comparable, if not higher, binding capability to cells expressing human BTN3A1, iii) comparable, if not higher, binding affinity / capability to human BTN3A2 and BTN3A3, and / or iv) comparable, if not better, ability to induce target cell killing by γδ T cells, as compared to prior art anti-BTN3A1 antibodies such as ICT01. The antibody or antigen binding portion thereof of the disclosure may be mouse, chimeric or humanized.

[0076] The antibody or antigen binding portion thereof of the disclosure is structurally and chemically characterized below. The amino acid sequence ID numbers of the heavy / light chain variable regions and CDRs of the antibodies or antigen binding portions thereof of the disclosure are summarized in Table 1 and Table 6 below, some antibodies sharing the same VH or VL.

[0077] The heavy chain variable region CDRs and the light chain variable region CDRs in Table 1 have been defined by the Kabat numbering system. However, as is well known in the art, CDR regions can also be determined by other systems such as Chothia, and IMGT, AbM, or Contact numbering system / method, based on heavy chain / light chain variable region sequences.

[0078] The VH and VL sequences (or CDR sequences) of other anti-BTN3A1 antibodies which bind to human BTN3A1 can be “mixed and matched” with the VH and VL sequences (or CDR sequences) of the anti-BTN3A1 antibody of the present disclosure. Preferably, when VH and VL chains (or the CDRs within such chains) are mixed and matched, a VH sequence from a particular VH / VL pairing is replaced with a structurally similar VH sequence. Likewise, preferably a VL sequence from a particular VH / VL pairing is replaced with a structurally similar VL sequence.

[0079] Accordingly, in one embodiment, an antibody of the disclosure, or an antigen binding portion thereof, may comprise:

[0080] (a) a heavy chain variable region which may comprise an amino acid sequence listed above in Table 1; and

[0081] (b) a light chain variable region which may comprise an amino acid sequence listed above in Table 1, or the VL of another Anti-BTN3A1 antibody, wherein the antibody specifically binds human BTN3A1.

[0082] In another embodiment, an antibody of the disclosure, or an antigen binding portion thereof, may comprise:

[0083] (a) the CDR1, CDR2, and CDR3 regions of the heavy chain variable region listed above in Table 1; and

[0084] (b) the CDR1, CDR2, and CDR3 regions of the light chain variable region listed above in Table 1 or the CDRs of another anti-BTN3A1 antibody, wherein the antibody specifically binds human BTN3A1.

[0085] In yet another embodiment, the antibody, or antigen binding portion thereof, includes the heavy chain variable CDR2 region of anti-BTN3A1 antibody combined with CDRs of other antibodies which bind human BTN3A1, e.g., CDR1 and / or CDR3 from the heavy chain variable region, and / or CDR1, CDR2, and / or CDR3 from the light chain variable region of a different anti-BTN3A1 antibody.

[0086] In another embodiment, an antibody of the disclosure may comprise a heavy and / or light chain variable region sequences of CDR1, CDR2 and CDR3 sequences which differ from those of the anti-BTN3A1 antibodies of the present disclosure by one or more conservative modifications. It is understood in the art that certain conservative sequence modification can be made which do not remove antigen binding.

[0087] Accordingly, in one embodiment, the antibody may comprise a heavy chain variable region which may comprise CDR1, CDR2, and CDR3 sequences and / or a light chain variable region which may comprise CDR1, CDR2, and CDR3 sequences, wherein:

[0088] (a) the heavy chain variable region CDR1 sequence may comprise a sequence listed in Table 1 above, and / or conservative modifications thereof; and / or

[0089] (b) the heavy chain variable region CDR2 sequence may comprise a sequence listed in Table 1 above, and / or conservative modifications thereof; and / or

[0090] (c) the heavy chain variable region CDR3 sequence may comprise a sequence listed in Table 1 above, and conservative modifications thereof; and / or

[0091] (d) the light chain variable region CDR1, and / or CDR2, and / or CDR3 sequences may comprise the sequence (s) listed in Table 1 above; and / or conservative modifications thereof; and

[0092] (e) the antibody specifically binds human BTN3A1.

[0093] As used herein, the term “conservative sequence modifications” is intended to refer to amino acid modifications that do not significantly affect or alter the binding characteristics of the antibody containing the amino acid sequence. Such conservative modifications include amino acid substitutions, additions and deletions. Modifications can be introduced into an antibody of the disclosure by standard techniques known in the art, such as site-directed mutagenesis and PCR-mediated mutagenesis. Conservative amino acid substitutions are ones in which the amino acid residue is replaced with an amino acid residue having a similar side chain. Families of amino acid residues having similar side chains have been defined in the art. These families include amino acids with basic side chains (e.g., lysine, arginine, histidine) , acidic side chains (e.g., aspartic acid, glutamic acid) , uncharged polar side chains (e.g., glycine, asparagine, glutamine, serine, threonine, tyrosine, cysteine, tryptophan) , nonpolar side chains (e.g., alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, methionine) , beta-branched side chains (e.g., threonine, valine, isoleucine) and aromatic side chains (e.g., tyrosine, phenylalanine, tryptophan, histidine) . Thus, one or more amino acid residues within the CDR regions of an antibody of the disclosure can be replaced with other amino acid residues from the same side chain family and  the altered antibody can be tested for retained function (i.e., the functions set forth above) using the functional assays described herein.

[0094] Antibodies of the disclosure can be prepared using an antibody having one or more of the VH / VL sequences of the anti-BTN3A1 antibody of the present disclosure as the starting material to engineer a modified antibody. An antibody can be engineered by modifying one or more residues within one or both variable regions (i.e., VH and / or VL) , for example within one or more CDR regions and / or within one or more framework regions. Additionally or alternatively, an antibody can be engineered by modifying residues within the constant region (s) , for example to alter the effector function (s) of the antibody.

[0095] In certain embodiments, CDR grafting can be used to engineer variable regions of antibodies. Antibodies interact with target antigens predominantly through amino acid residues that are located in the six heavy and light chain complementarity determining regions (CDRs) . For this reason, the amino acid sequences within CDRs are more diverse between individual antibodies than sequences outside of CDRs. Because CDR sequences are responsible for most antibody-antigen interactions, it is possible to express recombinant antibodies that mimic the properties of specific naturally occurring antibodies by constructing expression vectors that include CDR sequences from the specific naturally occurring antibody grafted onto framework sequences from a different antibody with different properties.

[0096] Accordingly, another embodiment of the disclosure pertains to an isolated monoclonal antibody, or antigen binding portion thereof, which may comprise a heavy chain variable region that may comprise CDR1, CDR2, and CDR3 sequences which may comprise the sequences of the present disclosure, as described above, and / or a light chain variable region which may comprise CDR1, CDR2, and CDR3 sequences which may comprise the sequences of the present disclosure, as described above. While these antibodies contain the VH and VL CDR sequences of the monoclonal antibody of the present disclosure, they can contain different framework sequences.

[0097] Such framework sequences can be obtained from public DNA databases or published references that include germline antibody gene sequences. For example, germline DNA sequences for human heavy and light chain variable region genes can be found in the “VBase” human germline sequence database. As another example, the germline DNA sequences for human heavy and light chain variable region genes can be found in the Genbank database.

[0098] Antibody protein sequences are compared against a compiled protein sequence database using one of the sequence similarity searching methods called the Gapped BLAST (Altschul et al., (1997) , supra) , which is well known to those skilled in the art.

[0099] Preferred framework sequences for use in the antibodies of the disclosure are those that are structurally similar to the framework sequences used by antibodies of the disclosure. The VH CDR1, CDR2, and CDR3 sequences can be grafted onto framework regions that have the identical sequence as that found in the germline immunoglobulin gene from which the framework sequence derives, or the CDR sequences can be grafted onto framework regions that contain one or more mutations as compared to the germline sequences. For example, it has been found that in certain instances it is beneficial to mutate residues within the framework regions to maintain or enhance the antigen binding ability of the antibody (see e.g., U.S. Pat. Nos. 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 and 6,180,370) .

[0100] Another type of variable region modification is to mutate amino acid residues within the VH and / or VL CDR1, CDR2 and / or CDR3 regions to thereby improve one or more binding properties (e.g., affinity) of the antibody of interest. Site-directed mutagenesis or PCR-mediated mutagenesis can be performed to introduce the mutation (s) and the effect on antibody binding, or other functional property of interest, can be evaluated in in vitro or in vivo assays as known in the art. Preferably conservative modifications (as known in the art) are introduced. The mutations can be amino acid substitutions, additions or deletions, but are preferably substitutions. Moreover, typically no more than one, two, three, four or five residues within a CDR region are altered.

[0101] Accordingly, in another embodiment, the disclosure provides isolated anti-BTN3A1 monoclonal antibodies, or antigen binding portions thereof, which may comprise a heavy chain variable region that may comprise: (a) a VH CDR1 region which may comprise the sequence of the present disclosure, or an amino acid sequence having one, two, three, four or five amino acid substitutions, deletions or additions; (b) a VH CDR2 region which may comprise the sequence of the present disclosure, or an amino acid sequence having one, two, three, four or five amino acid substitutions, deletions or additions; (c) a VH CDR3 region which may comprise the sequence of the present disclosure, or an amino acid sequence having one, two, three, four or five amino acid substitutions, deletions or additions; (d) a VL CDR1 region which may comprise the sequence of the present disclosure, or an amino acid sequence having one, two, three, four or five amino acid substitutions, deletions or additions; (e) a VL CDR2 region which may comprise the sequence of the present disclosure, or an amino acid sequence having one, two, three, four or five amino acid substitutions, deletions or additions; and (f) a VL CDR3 region which may comprise the sequence of the present disclosure, or an amino acid sequence having one, two, three, four or five amino acid substitutions, deletions or additions.

[0102] Engineered antibodies of the disclosure include those in which modifications have been made to framework residues within VH and / or VL, e.g., to improve the properties of the antibody. Typically, such framework modifications are made to decrease the immunogenicity of the antibody. For example, one approach is to “back-mutate” one or more framework residues to the corresponding germline sequence. More specifically, an antibody that has undergone somatic mutation can contain framework residues that differ from the germline sequence from which the antibody is derived. Such residues can be identified by comparing the antibody framework sequences to the germline sequences from which the antibody is derived.

[0103] Another type of framework modification involves mutating one or more residues within the framework region, or even within one or more CDR regions, to remove T cell epitopes to thereby reduce the potential immunogenicity of the antibody. This approach is also referred to as “deimmunization” and is described in further detail in U.S. Patent Publication No. 20030153043.

[0104] In addition, or as an alternative to modifications made within the framework or CDR regions, antibodies of the disclosure can be engineered to include modifications within the Fc region, typically to alter one or more functional properties of the antibody, such as serum half-life, complement fixation, Fc receptor binding, and / or antigen-dependent cellular cytotoxicity. Furthermore, an antibody of the disclosure can be chemically modified (e.g., one or more chemical moieties can be attached to the antibody) or be modified to alter its glycosylation, again to alter one or more functional properties of  the antibody.

[0105] In one embodiment, the hinge region of CH1 is modified in such that the number of cysteine residues in the hinge region is altered, e.g., increased or decreased. This approach is described further in U.S. Pat. No. 5,677,425. The number of cysteine residues in the hinge region of CH1 is altered to, for example, facilitate assembly of the light and heavy chains or to increase or decrease the stability of the antibody.

[0106] In another embodiment, the Fc hinge region of an antibody is mutated to increase or decrease the biological half-life of the antibody. More specifically, one or more amino acid mutations are introduced into the CH2-CH3 domain interface region of the Fc-hinge fragment such that the antibody has impaired Staphylococcyl protein A (SpA) binding relative to native Fc-hinge domain SpA binding. This approach is described in further detail in U.S. Pat. No. 6,165,745.

[0107] In still another embodiment, the glycosylation of an antibody is modified. For example, an aglycosylated antibody can be made (i.e., the antibody lacks glycosylation) . Glycosylation can be altered to, for example, increase the affinity of the antibody for antigen. Such carbohydrate modifications can be accomplished by, for example, altering one or more sites of glycosylation within the antibody sequence. For example, one or more amino acid substitutions can be made that result in elimination of one or more variable region framework glycosylation sites to thereby eliminate glycosylation at that site. Such aglycosylation may increase the affinity of the antibody for antigen. See, e.g., U.S. Pat. Nos. 5,714,350 and 6,350,861.

[0108] Additionally or alternatively, an antibody can be made that has an altered type of glycosylation, such as a hypofucosylated antibody having reduced amounts of fucosyl residues or an antibody having increased bisecting GlcNac structures. Such altered glycosylation patterns have been demonstrated to increase or reduce the ADCC ability of antibodies. Such carbohydrate modifications can be accomplished by, for example, expressing the antibody in a host cell with altered glycosylation machinery. Cells with altered glycosylation machinery have been described in the art and can be used as host cells in which to express recombinant antibodies of the disclosure to thereby produce an antibody with altered glycosylation. For example, the cell lines Ms704, Ms705, and Ms709 lack the fucosyltransferase gene, FUT8 (α (1, 6) -fucosyltransferase) , such that antibodies expressed in the Ms704, Ms705, and Ms709 cell lines lack fucose on their carbohydrates. The Ms704, Ms705, and Ms709 FUT8- / -cell lines were created by the targeted disruption of the FUT8 gene in CHO / DG44 cells using two replacement vectors (see U.S. Patent Publication No. 20040110704 and Yamane-Ohnuki et al., (2004) Biotechnol Bioeng 87: 614-22) . As another example, EP 1, 176, 195 describes a cell line with a functionally disrupted FUT8 gene, which encodes a fucosyl transferase, such that antibodies expressed in such a cell line exhibit hypofucosylation by reducing or eliminating the α-1, 6 bond-related enzyme. EP 1, 176, 195 also describes cell lines which have a low enzyme activity for adding fucose to the N-acetylglucosamine that binds to the Fc region of the antibody or does not have the enzyme activity, for example the rat myeloma cell line YB2 / 0 (ATCC CRL 1662) . PCT Publication WO 03 / 035835 describes a variant CHO cell line, Lec13 cells, with reduced ability to attach fucose to Asn (297) -linked carbohydrates, also resulting in hypofucosylation of antibodies expressed in that host cell (see also Shields et al., (2002) J. Biol. Chem. 277: 26733-26740) . Antibodies with a modified glycosylation  profile can also be produced in chicken eggs, as described in PCT Publication WO 06 / 089231. Alternatively, antibodies with a modified glycosylation profile can be produced in plant cells, such as Lemna. Methods for production of antibodies in a plant system are disclosed in the U.S. patent application corresponding to Alston &Bird LLP attorney docket No. 040989 / 314911, filed on Aug. 11, 2006. The fucose residues of the antibody can be cleaved off using a fucosidase enzyme; e.g., the fucosidase α-L-fucosidase removes fucosyl residues from antibodies (Tarentino et al., (1975) Biochem. 14: 5516-23) .

[0109] Another modification of the antibodies herein that is contemplated by this disclosure is pegylation. An antibody can be pegylated to, for example, increase the biological (e.g., serum) half-life of the antibody. To pegylate an antibody, the antibody, or fragment thereof, typically is reacted with polyethylene glycol (PEG) , such as a reactive ester or aldehyde derivative of PEG, under conditions in which one or more PEG groups become attached to the antibody or antibody fragment.

[0110] Antibodies of the disclosure can be characterized by their various physical properties, to detect and / or differentiate different classes thereof.

[0111] For example, antibodies can contain one or more glycosylation sites in either the light or heavy chain variable region. Such glycosylation sites may result in increased immunogenicity of the antibody or an alteration of the pK of the antibody due to altered antigen binding. Glycosylation has been known to occur at motifs containing an N-X-S / T sequence. In some instances, it is preferred to have an anti-BTN3A1 antibody that does not contain variable region glycosylation. This can be achieved either by selecting antibodies that do not contain the glycosylation motif in the variable region or by mutating residues within the glycosylation region.

[0112] In a preferred embodiment, the antibodies do not contain asparagine isomerism sites. The deamidation of asparagine may occur on N-G or D-G sequences and result in the creation of an isoaspartic acid residue that introduces a link into the polypeptide chain and decreases its stability (isoaspartic acid effect) .

[0113] Each antibody will have a unique isoelectric point (pI) , which generally falls in the pH range between 6 and 9.5. The pI for an IgG1 antibody typically falls within the pH range of 7-9.5 and the pI for an IgG4 antibody typically falls within the pH range of 6-8. There is speculation that antibodies with a pI outside the normal range may have some unfolding and instability under in vivo conditions. Thus, it is preferred to have an anti-BTN3A1 antibody that contains a pI value that falls in the normal range. This can be achieved either by selecting antibodies with a pI in the normal range or by mutating charged surface residues.

[0114] In another aspect, the disclosure provides a nucleic acid molecule that encodes the heavy and / or light chain variable regions, or CDRs, of the antibody or antigen-binding portion thereof of the disclosure. The nucleic acid molecule can be present in whole cells, in a cell lysate, or in a partially purified or substantially pure form. A nucleic acid molecule is “isolated” or “rendered substantially pure” when purified away from other cellular components or other contaminants, e.g., other cellular nucleic acids or proteins, by standard techniques. A nucleic acid molecule of the disclosure can be, e.g., DNA or RNA and may or may not contain intronic sequences.

[0115] The nucleic acid molecule of the disclosure can be obtained using standard molecular biology  techniques. For antibodies expressed by hybridomas (e.g., hybridomas prepared from transgenic mice carrying human immunoglobulin genes as described further below) , cDNAs encoding the light and heavy chains of the antibody made by the hybridoma can be obtained by standard PCR amplification or cDNA cloning techniques. For antibodies obtained from an immunoglobulin gene library (e.g., using phage display techniques) , a nucleic acid molecule encoding such antibodies can be recovered from the gene library.

[0116] Preferred nucleic acids molecules of the disclosure include those encoding the VH and VL sequences of the BTN3A1 monoclonal antibody or the CDRs. Once DNA fragments encoding VH and VL segments are obtained, these DNA fragments can be further manipulated by standard recombinant DNA techniques, for example to convert the variable region genes to full-length antibody chain genes, to Fab fragment genes or to a scFv gene. In these manipulations, a VL-or VH-encoding DNA fragment is operatively linked to another DNA fragment encoding another protein, such as an antibody constant region or a flexible linker. The term “operatively linked” , as used in this context, is intended to mean that the two DNA fragments are joined such that the amino acid sequences encoded by the two DNA fragments remain in-frame.

[0117] The isolated DNA encoding the VH region can be converted to a full-length heavy chain gene by operatively linking the VH-encoding DNA to another DNA molecule encoding heavy chain constant regions (CH1, CH2 and CH3) . The sequences of human heavy chain constant region genes are known in the art and DNA fragments encompassing these regions can be obtained by standard PCR amplification. The heavy chain constant region can be an IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM or IgD constant region, but most preferably is an IgG4 constant region. For a Fab fragment heavy chain gene, the VH-encoding DNA can be operatively linked to another DNA molecule encoding only the heavy chain CH1 constant region.

[0118] The isolated DNA encoding the VL region can be converted to a full-length light chain gene (as well as a Fab light chain gene) by operatively linking the VL-encoding DNA to another DNA molecule encoding the light chain constant region, CL. The sequences of human light chain constant region genes are known in the art and DNA fragments encompassing these regions can be obtained by standard PCR amplification. In preferred embodiments, the light chain constant region can be a kappa or lambda constant region.

[0119] To create a scFv gene, the VH-and VL-encoding DNA fragments are operatively linked to another fragment encoding a flexible linker, e.g., encoding the amino acid sequence (Gly4-Ser) 3, such that the VH and VL sequences can be expressed as a contiguous single-chain protein, with the VL and VH regions joined by the flexible linker (see e.g., Bird et al., (1988) Science 242: 423-426; Huston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883; McCafferty et al., (1990) Nature 348: 552-554) .

[0120] Monoclonal antibodies (mAbs) of the present disclosure can be produced using the well-known somatic cell hybridization (hybridoma) technique of Kohler and Milstein (1975) Nature 256: 495. Other embodiments for producing monoclonal antibodies include viral or oncogenic transformation of B lymphocytes and phage display techniques. Chimeric or humanized antibodies are also well known in the art.

[0121] Antibodies of the disclosure also can be produced in a host cell transfectoma using, for  example, a combination of recombinant DNA techniques and gene transfection methods as is well known in the art (e.g., Morrison, S. (1985) Science 229: 1202) . In one embodiment, DNA encoding partial or full-length light and heavy chains obtained by standard molecular biology techniques is inserted into one or more expression vectors such that the genes are operatively linked to transcriptional and translational regulatory sequences. In this context, the term “operatively linked” is intended to mean that an antibody gene is ligated into a vector such that transcriptional and translational control sequences within the vector serve their intended function of regulating the transcription and translation of the antibody gene.

[0122] The term “regulatory sequence” is intended to include promoters, enhancers and other expression control elements (e.g., polyadenylation signals) that control the transcription or translation of the antibody genes. Such regulatory sequences are described, e.g., in Goeddel (Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990) ) . Preferred regulatory sequences for mammalian host cell expression include viral elements that direct high levels of protein expression in mammalian cells, such as promoters and / or enhancers derived from cytomegalovirus (CMV) , Simian Virus 40 (SV40) , adenovirus, e.g., the adenovirus major late promoter (AdMLP) and polyomavirus enhancer. Alternatively, non-viral regulatory sequences can be used, such as the ubiquitin promoter or β-globin promoter. Still further, regulatory elements composed of sequences from different sources, such as the SRα promoter system, which contains sequences from the SV40 early promoter and the long terminal repeat of human T cell leukemia virus type 1 (Takebe et al., (1988) Mol. Cell. Biol. 8: 466-472) . The expression vector and expression control sequences are chosen to be compatible with the expression host cell used.

[0123] The antibody light chain gene and the antibody heavy chain gene can be inserted into the same or separate expression vectors. In preferred embodiments, the variable regions are used to create full-length antibody genes of any antibody isotype by inserting them into expression vectors already encoding heavy chain constant and light chain constant regions of the desired isotype such that the VH segment is operatively linked to the CH segment (s) within the vector and the VL segment is operatively linked to the CL segment within the vector. Additionally or alternatively, the recombinant expression vector can encode a signal peptide that facilitates secretion of the antibody chain from a host cell. The antibody chain gene can be cloned into the vector such that the signal peptide is linked in-frame to the amino terminus of the antibody chain gene. The signal peptide can be an immunoglobulin signal peptide or a heterologous signal peptide (i.e., a signal peptide from a non-immunoglobulin protein) .

[0124] In addition to the antibody chain genes and regulatory sequences, the recombinant expression vectors of the disclosure can carry additional sequences, such as sequences that regulate replication of the vector in host cells (e.g., origins of replication) and selectable marker genes. The selectable marker gene facilitates selection of host cells into which the vector has been introduced (see, e.g., U.S. Pat. Nos. 4,399,216; 4,634,665 and 5,179,017) . For example, typically the selectable marker gene confers resistance to drugs, such as G418, hygromycin or methotrexate, on a host cell into which the vector has been introduced. Preferred selectable marker genes include the dihydrofolate reductase (DHFR) gene (for use in dhfr-host cells with methotrexate selection / amplification) and the neo gene (for G418 selection) .

[0125] For expression of the light and heavy chains, the expression vector (s) encoding the heavy and light chains is transfected into a host cell by standard techniques. The various forms of the term “transfection” are intended to encompass a wide variety of techniques commonly used for the introduction of exogenous DNA into a prokaryotic or eukaryotic host cell, e.g., electroporation, calcium-phosphate precipitation, DEAE-dextran transfection and the like. Although it is theoretically possible to express the antibodies of the disclosure in either prokaryotic or eukaryotic host cells, expression of antibodies in eukaryotic cells, and most preferably mammalian host cells, is the most preferred because such eukaryotic cells, and in particular mammalian cells, are more likely than prokaryotic cells to assemble and secrete a properly folded and immunologically active antibody.

[0126] Preferred mammalian host cells for expressing the recombinant antibodies of the disclosure include Chinese Hamster Ovary (CHO cells) (including dhfr-CHO cells, described in Urlaub and Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216-4220, used with a DHFR selectable marker, e.g., as described in R. J. Kaufman and P. A. Sharp (1982) J. Mol. Biol. 159: 601-621) , NSO myeloma cells, COS cells and SP2 cells. In particular for use with NSO myeloma cells, another preferred expression system is the GS gene expression system disclosed in WO 87 / 04462, WO 89 / 01036 and EP 338, 841. When recombinant expression vectors encoding antibody genes are introduced into mammalian host cells, the antibodies are produced by culturing the host cells for a period of time sufficient to allow for expression of the antibody in the host cells or, more preferably, secretion of the antibody into the culture medium in which the host cells are grown. Antibodies can be recovered from the culture medium using standard protein purification methods.

[0127] In another aspect, the present disclosure features bispecific molecules which may comprise one or more antibodies of the disclosure linked to at least one other functional molecule, e.g., another peptide or protein (e.g., another antibody or ligand for a receptor) to generate a bispecific molecule that binds to at least two different binding sites or target molecules. Thus, as used herein, “bispecific molecule” includes molecules that have three or more specificities.

[0128] Bispecific molecules may be in many different formats and sizes. At one end of the size spectrum, a bispecific molecule retains the traditional antibody format, except that, instead of having two binding arms of identical specificity, it has two binding arms each having a different specificity. At the other extreme are bispecific molecules consisting of two single-chain antibody fragments (scFv's) linked by a peptide chain, a so-called Bs (scFv) 2 construct. Intermediate-sized bispecific molecules include two different F (ab) fragments linked by a peptidyl linker. Bispecific molecules of these and other formats can be prepared by genetic engineering, somatic hybridization, or chemical methods.

[0129] An oncolytic virus preferentially infects and kills cancer cells. The antibody or antigen binding portion thereof of the disclosure may be used in conjunction with the oncolytic virus. Alternatively, an oncolytic virus encoding the antibody or antigen binding portion thereof of the disclosure can be introduced into human body.

[0130] In another aspect, the present disclosure provides a pharmaceutical composition comprising the antibody or antigen binding portion thereof, the bispecific molecule, the oncolytic virus, the nucleic acid molecule, the expression vector, and / or the host cell of the present disclosure formulated together with a pharmaceutically acceptable carrier. The composition may optionally contain one or more  additional pharmaceutically active ingredients, such as an anti-tumor agent, an anti-infective agent, or an agent for immunity enhancement. The pharmaceutical composition of the disclosure may be administered in a combination therapy with, for example, an anti-tumor agent, an anti-infective agent, or an agent for immunity enhancement.

[0131] The pharmaceutical composition may comprise any number of excipients. Excipients that can be used include carriers, surface active agents, thickening or emulsifying agents, solid binders, dispersion or suspension aids, solubilizers, colorants, flavoring agents, coatings, disintegrating agents, lubricants, sweeteners, preservatives, isotonic agents, and combinations thereof. The selection and use of suitable excipients are taught in Gennaro, ed., Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Ed. (Lippincott Williams &Wilkins 2003) , the disclosure of which is incorporated herein by reference.

[0132] Particularly, the pharmaceutical composition is suitable for intravenous, intramuscular, subcutaneous, parenteral, spinal or epidermal administration (e.g., by injection or infusion) . Depending on the route of administration, the active ingredient can be coated in a material to protect it from the action of acids and other natural conditions that may inactivate it. The phrase “parenteral administration” as used herein means modes of administration other than enteral and topical administration, usually by injection, and includes, without limitation, intravenous, intramuscular, intra-arterial, intrathecal, intracapsular, intraorbital, intracardiac, intradermal, intraperitoneal, transtracheal, subcutaneous, subcuticular, intra-articular, subcapsular, subarachnoid, intraspinal, epidural and intrasternal injection and infusion. Alternatively, an antibody of the disclosure can be administered via a non-parenteral route, such as a topical, epidermal or mucosal route of administration, e.g., intranasally, orally, vaginally, rectally, sublingually or topically.

[0133] Pharmaceutical compositions can be in the form of sterile aqueous solutions or dispersions. They can also be formulated in a microemulsion, liposome, or other ordered structure suitable to high drug concentration.

[0134] The amount of active ingredient which can be combined with a carrier material to produce a single dosage form will vary depending upon the subject being treated and the particular mode of administration and will generally be that amount of the composition which produces a therapeutic effect. Generally, out of one hundred percent, this amount will range from about 0.01%to about ninety-nine percent of active ingredient in combination with a pharmaceutically acceptable carrier.

[0135] Dosage regimens are adjusted to provide the optimum desired response (e.g., a therapeutic response) . For example, a single bolus can be administered, several divided doses can be administered over time or the dose can be proportionally reduced or increased as indicated by the exigencies of the therapeutic situation. It is especially advantageous to formulate parenteral compositions in dosage unit form for ease of administration and uniformity of dosage. Dosage unit form as used herein refers to physically discrete units suited as unitary dosages for the subjects to be treated; each unit contains a predetermined quantity of active ingredient calculated to produce the desired therapeutic effect in association with the required pharmaceutical carrier. Alternatively, antibody can be administered as a sustained release formulation, in which case less frequent administration is required.

[0136] For administration of the composition, the dosage may range from about 0.0001 to 100 mg / kg.  An exemplary treatment regime entails administration once per week.

[0137] A “therapeutically effective dosage” of the composition of the disclosure preferably results in a decrease in severity of disease symptoms, an increase in frequency and duration of disease symptom-free periods, or a prevention of impairment or disability due to the disease affliction. For example, for the treatment of tumor-bearing subjects, a “therapeutically effective dosage” preferably inhibits tumor growth by at least about 20%, more preferably by at least about 40%, even more preferably by at least about 60%, and still more preferably by at least about 80%relative to untreated subjects.

[0138] The pharmaceutical composition can be a controlled release formulation, including implants, transdermal patches, and microencapsulated delivery systems. Biodegradable, biocompatible polymers can be used, such as ethylene vinyl acetate, polyanhydrides, polyglycolic acid, collagen, polyorthoesters, and polylactic acid. See, e.g., Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978.

[0139] Therapeutic compositions can be administered via medical devices such as (1) needleless hypodermic injection devices (e.g., U.S. Pat. Nos. 5,399,163; 5,383,851; 5,312,335; 5,064,413; 4,941,880; 4,790,824; and 4,596,556) ; (2) micro-infusion pumps (U.S. Pat. No. 4,487,603) ; (3) transdermal devices (U.S. Pat. No. 4,486,194) ; (4) infusion apparatuses (U.S. Pat. Nos. 4,447,233 and 4,447,224) ; and (5) osmotic devices (U.S. Pat. Nos. 4,439,196 and 4,475,196) ; the disclosures of which are incorporated herein by reference.

[0140] In certain embodiments, the monoclonal antibodies or antigen binding portions thereof of the disclosure can be formulated to ensure proper distribution in vivo. For example, to ensure that the therapeutic antibody of the disclosure cross the blood-brain barrier, they can be formulated in liposomes, which may additionally comprise targeting moieties to enhance selective transport to specific cells or organs. See, e.g. U.S. Pat. Nos. 4,522,811; 5,374,548; 5,416,016; and 5,399,331; V.V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29: 685; Umezawa et al., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153: 1038; Bloeman et al., (1995) FEBS Lett. 357: 140; M. Owais et al., (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39: 180; Briscoe et al., (1995) Am. J. Physiol. 1233: 134; Schreier et al., (1994) J. Biol. Chem. 269: 9090; Keinanen and Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346: 123; and Killion and Fidler (1994) Immunomethods 4: 273.

[0141] The pharmaceutical composition of the present disclosure may have numerous in vitro and in vivo utilities involving, for example, treatment of infectious disorders, and cancers where BTN3A1-mediated T cell activation is beneficial.

[0142] The disclosure provides a method for treating a disease where BTN3A1-mediated T cell activation is beneficial, which may comprise administering to a subject a therapeutically effective amount of the pharmaceutical composition of the present disclosure.

[0143] The disease may be a tumor or cancer. The disease may be a BTN3A+ (e.g., BTN3A1+) tumor or cancer comprising BTN3A+ (e.g., BTN3A1+) tumor or cancer cells. The disease may be with an increased BTN3A+ (e.g., BTN3A1+) level (e.g., expression level) . The tumor or cancer may be a solid one or a hematologic one. Examples of solid cancer include, but not limited to, colon cancer, breast cancer, lung cancer, prostate cancer, head and neck cancer, pancreatic cancer, bladder cancer, colorectal cancer, cervical cancer, ovarian cancer, liver cancer, esophageal cancer, thyroid cancer, kidney cancer,  and stomach cancer. Examples of hematologic cancer include, but not limited to, chronic lymphocytic leukemia (CLL) , non-Hodgkin lymphoma (NHL) , lymphoid neoplasm, small lymphocytic lymphoma (SLL) , mantle cell lymphoma (MCL) and myeloid cell lineage neoplasm.

[0144] The disease may be infectious disorders. The infectious disorder may be with an increased BTN3A (e.g., BTN3A1) expression level in the lesion site. Examples of infectious disorders include, but not limited to, viral, bacterial, parasitic or fungal infections.

[0145] In yet another aspect, the disclosure provides a method of inducing BTN3A-mediated T cell activation (e.g., BTN3A1-mediated T cell activation) in a subject comprising administering to the subject the pharmaceutical composition of the disclosure. The composition may comprise the antibody, or the antigen-binding portion thereof, with weak or no FcR binding heavy chain constant regions, the bispecific molecule, the nucleic acid molecule, or the expression vector of the disclosure.

[0146] The disclosure also provides a method for inducing or restoring an immune cell’s activity to kill a BTN3A+ cell, comprising contacting an immune cell with the composition of the disclosure at the presence of a BTN3A+ cell, e.g., a BTN3A1+ cell. Alternatively, the disclosure provides a method for inducing or restoring an immune cell’s activity to kill a BTN3A+ cell in a subject in need thereof, comprising administering to the subject the pharmaceutical composition of the disclosure. The immune cell may be a γδ T cell. In certain embodiments, the immune cell may be a Vγ9Vδ2 T cell.

[0147] In yet another aspect, the disclosure provides a method for killing a BTN3A+ cell, comprising contacting the BTN3A+ cell with a composition of the disclosure in the presence of a T cell, such as a γδ T cell, e.g., a Vγ9Vδ2 T cell. In certain embodiments, the composition of the disclosure may contain a T cell, such as a γδ T cell, e.g., a Vγ9Vδ2 T cell. The disclosure may provide a method for killing a BTN3A+ cell in a subject in need thereof, comprising administering the pharmaceutical composition of the disclosure. The BTN3A+ cell may be a BTN3A1+ cell.

[0148] In another aspect, the disclosure provides methods of combination therapy in which the pharmaceutical composition of the present disclosure is co-administered with one or more additional antibodies that are effective in inhibiting tumor growth or lowering viral loads in a subject. In one embodiment, the disclosure provides a method for inhibiting tumor growth in a subject which may comprise administering to the subject the pharmaceutical composition of the disclosure and one or more additional antibodies, such as an anti-VEGF antibody, an anti-OX40 antibody, an anti-TIM-3 antibody, an anti-CD137 antibody, an anti-GITR antibody, an anti-LAG-3 antibody, and an anti-PD-L1 antibody. In certain embodiments, the subject is human. The anti-BTN3A1 admimistration can also be further combined with standard cancer treatments.

[0149] The combination of therapeutic agents discussed herein can be administered concurrently as a single composition in a pharmaceutically acceptable carrier, or concurrently as separate compositions with each agent in a pharmaceutically acceptable carrier. In another embodiment, the combination of therapeutic agents can be administered sequentially.

[0150] Furthermore, if more than one dose of the combination therapy is administered sequentially, the order of the sequential administration can be reversed or kept in the same order at each time point of administration, sequential administrations can be combined with concurrent administrations, or any combination thereof.

[0151] The present disclosure is further illustrated by the following examples, which should not be construed as further limiting. The contents of all figures and all references, Genbank sequences, patents and published patent applications cited throughout this application are expressly incorporated herein by reference.

[0152] Examples

[0153] Example 1. Generation of Anti-BTN3A1 Monoclonal Antibodies Using Hybridoma Technology

[0154] Immunization

[0155] Mice were immunized according to the method described in E Harlow, D. Lane, Antibody: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 1998. A recombinant human BTN3A1-Fc protein (Acro biosystems, Cat#BT1-H5255) was used as the immunogen, and a recombinant human BTN3A1-his protein (SinoBiological, Cat#15973-H08H) was used for determining anti-sera titers and for screening hybridomas secreting antigen-specific antibodies.

[0156] Immunizing dosages contained 50 μg recombinant human BTN3A1-Fc protein per mouse per injection for primary immunization, and 25 μg per mouse per injection for boost immunizations. To increase immune responses, the complete Freud's adjuvant and incomplete Freud's adjuvant (Sigma, St. Louis, Mo., USA) were used respectively for primary and boost immunizations. Briefly, the adjuvant-immunogen mixture was prepared as follows. First, the adjuvant was gently shaken in a vial using a vortex, and the desired amount of adjuvant was transferred to an autoclaved 1.5 mL micro-centrifuge tube. The immunogen was prepared in PBS or saline with the concentration ranging from 0.25 to 0.5 mg / ml, and added at a calculated amount to the micro-centrifuge tube with the adjuvant. The resulting adjuvant-antigen mixture was mixed by gently vortexing for 2 minutes to generate a water-in-oil emulsion, and the emulsion was then drawn into a proper syringe for animal injection. A total of 50 or 25 μg of immunogen was injected in a volume of 150-200 μl. Each animal was immunized, and then boosted for 3 to 4 times depending on the anti-sera titer. Animals with good titers, as measured by ELISA, were given a final boost by intraperitoneal injection before hybridoma fusion.

[0157] Hybridoma fusion and screening

[0158] Cells of murine myeloma cell line (SP2 / 0-Ag14, ATCC#CRL-1581) were cultured to reach the log phase stage right before hybridoma fusion. Spleen cells from immunized mice were prepared sterilely and fused with myeloma cells according to the method as described in Kohler G, and Milstein C, "Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity, " Nature, 256: 495-497(1975) . Fused "hybrid cells" were subsequently dispensed into 96-well cell culture plates in DMEM / 20%FCS / HAT media. Surviving hybridoma colonies were observed under the microscope seven to ten days post fusion. After two weeks, the supernatant from each well was subjected to Indirect ELISA using human BTN3A1-his protein. Positive hybridomas secreting antibodies that bound to the human BTN3A1-his protein were selected and transferred to 24-well plates. Hybridoma clones producing antibodies that showed high specific human BTN3A1 binding were subcloned by limited dilution to ensure the clonality of the cell line, and then monoclonal antibodies were purified. Briefly, Protein A sepharose columns (bestchrom (Shanghai) Biosciences, Cat#AA0273) were washed using PBS buffer in 5 to 10 column volumes. Cell supernatants from the monoclonal hybridomas of the disclosure were passed through the columns, and then the columns were washed using PBS buffer until  the absorbance for protein reached the baseline. The columns were eluted with elution buffer (0.1 M Glycine-HCl, pH 2.7) , which was immediately collected into tubes with neutralizing buffer (1 M Tris-HCl, pH 9.0) . Fractions containing immunoglobulins were pooled and dialyzed in PBS overnight at 4℃. Subsequently, in vitro and in vivo functional activity of purified mouse monoclonal antibodies was characterized as follows.

[0159] Example 2. Binding Affinity Determination of Mouse Anti-BTN3A1 Monoclonal Antibodies Using BIACORE Surface Plasmon Resonance Technology

[0160] The purified anti-BTN3A1 mouse monoclonal antibodies (mAbs) generated in Example 1 were characterized for their binding affinity and binding kinetics by Biacore T200 system (GE healthcare, Pittsburgh, PA, USA) . ICT01, an anti-BTN3A1 antibody developed by Imcheck Therapeutics with the heavy chain and light chain amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 27 and 28 respectively, was used as the positive control or benchmark.

[0161] Briefly, goat anti-mouse IgGs (Cytiva, Cat#BR100838, Mouse Antibody Capture Kit) were covalently linked to a CM5 chip (carboxy methyl dextran coated chip, Cytiva, Cat#BR100530) via primary amines using a standard amine coupling kit (Cytiva, Cat#BR100050) provided by Biacore. Un-reacted moieties on the biosensor surface were blocked with ethanolamine. A Protein A chip (Cytiva, Cat#29127556) was used for the positive control’s affinity determination. The anti-BTN3A1 antibodies of the disclosure and the positive control each at the concentration of 2 μg / ml were respectively flowed onto the chip at a flow rate of 10 μl / min. Then, serially diluted recombinant human BTN3A1-his proteins (SinoBiological, Cat#15973-H08H) , 2-fold dilution in HBS-EP+ buffer (provided by Biacore) starting at 80 nM, were respectively flowed onto the chips at a flow rate of 30 μl / min. The antigen-antibody association kinetics was followed for 2 minutes and the dissociation kinetics was followed for 10 minutes. The association and dissociation curves were fit to a 1: 1 Langmuir binding model using Biacore evaluation software. The KD, Ka and Kd values were determined and summarized in Table 2 below.

[0162] Table 2. Binding Affinity of Mouse anti-BTN3A1 Monoclonal Antibodies to Human BTN3A1

[0163] All the mouse antibodies of the disclosure specifically bound to human BTN3A1 with comparable binding affinity as compared to the benchmark.

[0164] Example 3. Binding Activity of Mouse Anti-BTN3A1 Antibodies

[0165] The binding activity of mouse anti-BTN3A1 antibodies of the disclosure to BTN3A1 was further determined by Capture ELISA, Indirect ELISA and Flow Cytometry (FACS) methods.

[0166] 3.1 Capture ELISA

[0167] Briefly, 96-well ELISA plates were coated with 100 μl 2 μg / ml AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG, F (ab') 2 fragment specific (Cat#115-005-072, Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. ) or AffiniPure F (ab') 2 Fragment Goat Anti-Human IgG, Fcγ fragment specific (for the benchmark, Cat#109-006-008, Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. ) in PBS overnight at 4℃. Plates were washed once with wash buffer (PBST, PBS+0.05%Tween-20) and then blocked with 200 μl / well blocking buffer (5%w / v non-fatty milk in PBST) overnight at 4℃. Plates were washed again, respectively incubated with 100 μl / well serially diluted anti-BTN3A1 antibodies of the disclosure, the benchmark and a negative control hIgG (human immunoglobulin (pH4) for intravenous injection, Hualan Biological Engineering Inc. ) , 5-fold dilution in PBST with 2.5%non-fatty milk starting at 66.7 nM, for 40 minutes at 37℃, and then washed for 4 times. Plates containing the captured anti-BTN3A1 antibodies were added and incubated for 40 minutes at 37℃ with biotin-labeled human BTN3A1-his proteins (SinoBiological, Cat#15973-H08H, 124 ng / mL in 2.5%non-fatty milk in PBST, 100 μl / well) , washed for 4 times, and incubated with Peroxidase Streptavidin (1: 5000 dilution in PBST, Cat#016-030-084, Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., 100 μl / well) for 40 minutes at 37℃. After a final wash, the plates were incubated with 100 μl / well TMB (Cat#TMB-S-002, Innoreagents) at room temperature. The reaction was stopped 3-10 minutes later with 50 μl / well 1M H2SO4, and the absorbance was read on a microplate reader using a dual wavelength mode with 450 nm for TMB and 630 nm as the reference wavelength. The OD (450-630) values were plotted against the antibody concentrations. Data was analyzed using GraphPad Prism and EC50 values were reported. The results were shown in FIG. 1.

[0168] 3.2 Indirect ELISA

[0169] The anti-BTN3A1 antibodies of the disclosure were tested for their cross-reaction with the cynomolgus BTN3A1 protein. Briefly, 96-well ELISA plates were coated with 100 μl 2 μg / ml cynomolgus BTN3A1-TSA proteins (prepared in-house with SEQ ID NO: 22) in carbonate / bicarbonate buffer (pH 9.6) and incubated overnight at 4℃. Plates were washed once with wash buffer (PBS+0.05%Tween-20, PBST) and then blocked with 200 μl blocking buffer (5%w / v non-fatty milk in PBST) overnight at 4℃. Plates were washed again and incubated with 100 μl / well serially diluted anti-BTN3A1 antibodies of the disclosure (starting at 66.7 nM, 5-fold serial dilution in PBST with 2.5%w / v non-fatty milk) for 40 minutes at 37℃. ELISA plates were washed for 4 times and incubated with Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG, Fcγ Fragment Specific (1: 5000 dilution in PBST buffer, Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., Cat#115-035-071, 100 μl / well) for 40 minutes at 37℃. After a final wash, plates were incubated with 100 μl / well TMB (Innoreagents, Cat#TMB-S-002) at room temperature. The reaction was stopped 3-10 minutes later with 50 μl / well 1M H2SO4, and the absorbance was read on a microplate reader using the dual wavelength mode with 450 nm for TMB and 630 nm as the reference wavelength. Then the OD (450-630) values were plotted against the antibody concentrations. Data was analyzed using GraphPad Prism and EC50 values were reported. The results were shown respectively in FIG. 2.

[0170] 3.3 Cell based binding FACS

[0171] The binding activity of the anti-BTN3A1 antibodies to the cell surface human BTN3A1 was  evaluated by flow cytometry (FACS) , using Daudi cell line (ahuman Burkitt’s lymphoma cell line, purchased from Cell Bank, Chinese Academy of Sciences, Shanghai) endogenously expressing human BTN3A1. The cells were harvested from cell culture flasks, washed twice and resuspended in phosphate buffered saline (PBS) containing 2%v / v Fetal Bovine Serum (FACS buffer) . Then, 1 × 106 cells in 100 μl FACS buffer in 96 well-plates were incubated with 100 μl serially diluted anti-BTN3A1 antibodies or the controls (starting from 66.7 nM, 5-fold serial dilution) in FACS buffer for 50 minutes on ice. Cells were washed twice with FACS buffer, and added with 100 μl R-Phycoerythrin AffiniPure F (ab’) 2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG (H+L) (Cat#115-116-146) or R-Phycoerythrin AffiniPure Goat Anti-Human IgG, Fcγ fragment specific (Cat#109-115-098) (Jackson Immuno Research, 1: 1000 dilution in FACS buffer) . Following an incubation of 50 minutes at 4℃ in dark, cells were washed three times and resuspended in FACS buffer. Fluorescence was measured using a Becton Dickinson FACS Canto II-HTS equipment, and the MFI (mean fluorescence intensity) was plotted against the antibody concentration. Data was analyzed using Graphpad Prism and EC50 values were reported. The results were shown in FIG. 3.

[0172] It can be seen from FIG. 1 and FIG. 2 that the anti-BTN3A1 antibodies of the disclosure specifically bound to human BTN3A1 with higher Bmax (maximal binding) and lower EC50 than the benchmark, and cross-reacted with cynomolgus BTN3A1. Further, as shown in FIG. 3, the antibodies of the disclosure exhibited high binding activity to Daudi cells in the cell based binding FACS test, with C2G4F7C7’s binding activity being higher than the other antibodies of the disclosure.

[0173] Example 4. Blocking Activity of Mouse Anti-BTN3A1 Antibodies on BTN3A1-Benchmark Binding

[0174] The ability of the anti-BTN3A1 antibodies of the disclosure to block benchmark binding to human BTN3A1-his protein was measured in a competitive ELISA assay. Briefly, 100 μl 2 μg / mL benchmark in PBS was coated on 96-well ELISA plates overnight at 4℃. ELISA plates were washed once with wash buffer (PBST, PBS+0.05%Tween-20) and then blocked with 200 μl / well blocking buffer (5%w / v non-fatty milk in PBST) overnight at 4℃. While blocking, the anti-BTN3A1 antibodies of the disclosure or controls were diluted and incubated with biotin labeled human BTN3A1-his protein (SinoBiological, Cat#15973-H08H, 124 ng / ml in 2.5%non-fatty milk in PBST) , starting at 66.7 nM with a 5-fold serial dilution, at room temperature for 40 minutes. After plate washing, the antibody / human BTN3A1-his protein mixtures were added to benchmark coated plates, 100 μl per well. After incubation at 37℃ for 40 minutes, the plates were washed using wash buffer, added and incubated for 40 minutes at 37℃ with 100 μl / well Peroxidase Streptavidin (1: 5000 dilution in PBST) . Plates were washed again using wash buffer. Finally, TMB was added and the reaction was stopped using 1M H2SO4. The absorbance was read on a microplate reader using the dual wavelength mode with 450 nm for TMB and 630 nm as the reference wavelength, and the OD (450-630) values were plotted against the antibody concentrations. Data was analyzed using Graphpad Prism software and IC50 values were reported. The results were shown in FIG. 4.

[0175] It can be seen from FIG. 4 that the anti-BTN3A1 antibodies of the disclosure were able to at least partially block human BTN3A1 binding to the benchmark, suggesting that the epitopes they bound and the epitope bound by the benchmark may overlap to some extent.

[0176] Example 5. Cell-Based Functional Activity of Anti-BTN3A1 Antibodies

[0177] Jurkat cells endogenously expressing BTN3As were chosen as the target cells to evaluate the activity of the anti-BTN3A1 antibodies of the disclosure to trigger target cell killing by human γδ T cells.

[0178] Briefly, 20,000 Jurkat cells (purchased from ATCC, Cat#TIB152) in 50 μL RPMI1640 (Gibco, Cat#A1049101) with 10%FBS (Gibco, Cat#10099-141C) and 1%PS (Gibco, Cat#15140122) , and 50 μL serially diluted anti-BTN3A1 antibodies of the disclosure or controls (starting from 20 nM, 3-fold serial dilution in RPMI1640 with 10%FBS and 1%PS) were added to 96-well U bottom plates and incubated at room temperature for 1 hour. Then, the plates were added with 30,000 human γδ T cells (Milestone Biotechnologies, Cat#P121070503C) in 100 μL RPMI1640 with 10%FBS and 1%PS, and incubated in a 5%CO2 incubator at 37℃ for 24 hours. At the end of assay, the plates were centrifuged at 200 g for 5 minutes at room temperature, and the supernatants were discarded. The plates were added and incubated for 5 minutes with 100 μL Cell Counting-Lite reagent (Vazyme Inc., Cat#DD1101-02) . Luminescence signals were measured using Tecan Infinite F200 Flex microplate reader. Data was analyzed using Graphpad Prism. The result was shown in FIG. 5.

[0179] According to FIG. 5, all mouse anti-BTN3A1 mAbs of the disclosure triggered Jurkat cell killing by activated human γδT cells with lower IC50s than the benchmark, with C2G4F7C7 showing the highest activity.

[0180] Example 6. Antibody Engineering at Deamidation Site (s)

[0181] Deamidation occurs at asparagine residues, especially those followed by a glycine residue, resulting in antibody degradation. To avoid amino acid deamidation during production, storage, and in vivo metabolism of the antibodies of the disclosure, the CDR sequences may be optimized for better stability.

[0182] In particular, there are two high risk sites of deamidation at Asn28 and Asn30 in the CDR1 region of the light chain and one at Asn56 in the CDR2 region of the heavy chain of C2G4F7C7, at which sites mutations were made. A total of 34 CDR-modified C2G4F7C7 antibodies were obtained, and the heavy and light chain variable region and CDR sequences of exemplary ones, including C2G4F7C7-CDRV7, C2G4F7C7-CDRV8, C2G4F7C7-CDRV13, C2G4F7C7-CDRV23, C2G4F7C7-CDRV27 and C2G4F7C7-CDRV33, were set forth in Table 6.

[0183] Example 7. Construction and Preparation of Chimeric Anti-BTN3A1 Antibodies

[0184] The heavy and light chain variable regions of the anti-BTN3A1 mAb C2G4F7C7, including those with CDR modifications, were cloned in frame to human IgG1 (AQQ, YTE, K447Del) heavy chain constant region (SEQ ID NO: 20) and human kappa light chain constant region (SEQ ID NO: 21) , respectively, wherein the C terminus of the variable region was linked to the N terminus of the respective constant region.

[0185] The vectors each containing a nucleotide encoding a heavy chain variable region linked to human IgG1 heavy chain constant region, and the vectors each containing a nucleotide encoding a light chain variable region linked to human kappa light chain constant region, were transiently transfected into 50 ml of 293F suspension cell cultures in a 1.1: 1 light to heavy chain construct ratio, with 1 mg / mL PEI.

[0186] Example 8. Characterization of Chimeric Antibodies

[0187] The chimeric antibodies as obtained in Example 7 were tested in BIAcore test for their binding affinity to human BTN3A1-his protein, following the protocol of Example 2 (using Protein A chips) . Based on the BIAcore data, the top 6 chimeric antibodies, namely C2G4F7C7-CDRV7, C2G4F7C7-CDRV8, C2G4F7C7-CDRV13, C2G4F7C7-CDRV23, C2G4F7C7-CDRV27, and C2G4F7C7-CDRV33, were purified as described above.

[0188] The purified chimeric antibodies were tested in the capture ELISA, Indirect ELISA, cell based binding FACS, and cell-based functional assay following the protocols in the foregoing Examples, with or without minor modifications, as well as the protocols described below.

[0189] For the capture ELISA, AffiniPure F (ab') 2 Fragment Goat Anti-Human IgG, Fcγ fragment specific (Jackson Immuno Research Laboratories, Inc., Cat#109-006-008) was used instead of AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG, F (ab') 2 fragment specific, 100 μl / well. The results were shown in FIGs. 6A-6B.

[0190] For the indirect ELISA for testing the antibodies’ cross-reaction with human BTN3A2 or BTN3A3, the human BTN3A2-TSA protein (prepared in-house with SEQ ID NO: 24) or human BTN3A3-TSA protein (prepared in-house with SEQ ID NO: 25) was used respectively instead of the cynomolgus BTN3A1-TSA protein, and Peroxidase AffiniPure F (ab') 2 Fragment Goat Anti-Human IgG, Fcγ fragment specific (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., Cat#109-036-098) was used instead of Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG, Fcγ Fragment Specific, 100 μl / well. The results were shown respectively in FIGs. 7A-7B and 8A-8B.

[0191] In the cell-based binding FACS, R-Phycoerythrin AffiniPure Goat Anti-Human IgG, Fcγfragment specific (Jackson Immunoresearch Laboratories, Inc., Cat#109-115-098) was used instead of R-Phycoerythrin AffiniPure F (ab') 2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG (H+L) , 100 μl / well. The results were shown in FIGs. 9A-9B.

[0192] The cell-based functional assay of the chimeric antibodies was performed according to the protocol of Example 5, and the results were shown in FIG. 10.

[0193] It can be seen from FIGs. 6A-6B and 9A-9B that the chimeric C2G4F7C7 antibodies with CDR modification (s) showed higher binding capability than the benchmark to the human BTN3A1 protein in both the capture ELISA and the cell-based binding FACS test.

[0194] According to FIGs. 7A-7B and 8A-8B, these chimeric C2G4F7C7 antibodies specifically bound the human BTN3A2 protein and the human BTN3A3 protein with comparable binding activity to the benchmark.

[0195] According to FIG. 10, all of the chimeric C2G4F7C7 antibodies induced Jurkat cell killing by activated human γδ T cells with lower or comparable IC50s compared to the benchmark. Especially, the IC50 of C2G4F7C7-CDRV33 was 6-fold lower than that of the benchmark.

[0196] Example 9. Humanization of C2G4F7C7-CDRV33

[0197] The anti-BTN3A1 chimeric antibody C2G4F7C7-CDRV33 was humanized and further characterized. Humanization was conducted using the well-established CDR-grafting method as described in detail below.

[0198] To select acceptor frameworks for humanization of the antibody C2G4F7C7-CDRV33, the light and heavy chain variable region sequences of the antibody were blasted against the human  immunoglobulin gene database. The human germlines with the highest homology were selected as the acceptor frameworks for humanization. The antibody heavy / light chain variable region CDRs were inserted into the selected frameworks, and certain residue (s) in the frameworks was / were further back-mutated to obtain more candidate heavy chain / light chain variable regions. A total of 8 exemplary humanized C2G4F7C7-CDRV33 antibodies, namely huC2G4F7C7-CDRV33-V1 to huC2G4F7C7-CDRV33-V8, were obtained, whose heavy / light chain variable region sequence ID numbers were set forth in Table 1.

[0199] The vectors each containing a nucleotide encoding the heavy chain variable region of one of huC2G4F7C7-CDRV33-V1 to huC2G4F7C7-CDRV33-V8 linked to human IgG1 (AQQ, YTE, K447Del) heavy chain constant region (SEQ ID NO: 20) , and the vectors each containing a nucleotide encoding a humanized light chain variable region linked to human kappa light chain constant region (SEQ ID NO: 21) were transiently transfected into 50 ml of 293F suspension cell cultures in a 1.1: 1 light to heavy chain construct ratio, with 1 mg / mL PEI.

[0200] Example 10. Characterization of Humanized C2G4F7C7-CDRV33 Antibodies

[0201] Cell supernatants containing the humanized C2G4F7C7-CDRV33 antibodies were harvested after six days of cell culture in shaking flasks, from which antibodies were purified. The humanized antibodies, huC2G4F7C7-CDRV33-V1 to huC2G4F7C7-CDRV33-V8, were tested in Capture ELISA, benchmark blocking ELISA, and cell-based functional assay, following the protocols in the foregoing Examples with minor modifications described below.

[0202] For the Capture ELISA, AffiniPure Goat Anti-Human IgG, Fcγ fragment specific (Jackson Immuno Research, Cat#109-005-008) and biotin-labeled human BTN3A1-TSA protein (prepared in-house with SEQ ID NO: 23, 76 ng / mL in 2.5%non-fatty milk in PBST) were used, 100 μl / well. The results were shown in FIGs. 11A-11C.

[0203] The benchmark blocking ELISA of humanized antibodies was performed according to the protocol as described in Example 4, using biotin labeled BTN3A1-TSA protein (prepared in-house with SEQ ID NO: 23, 152 ng / ml in 2.5%non-fatty milk in PBST) instead of the biotin labeled human BTN3A1-his protein, and the results were shown in FIGs. 12A-12C.

[0204] The cell-based functional assay of the humanized antibodies was performed according to the protocol as described in Example 5, and the results were shown in FIG. 13.

[0205] According to FIGs. 11A-11C, all of the humanized C2G4F7C7-CDRV33 antibodies of the disclosure specifically bound to human BTN3A1 with lower EC50 than the benchmark.

[0206] It can be seen from FIGs. 12A-12C that all of the humanized antibodies of the disclosure at least partially blocked benchmark-BTN3A1 binding, suggesting that the epitope (s) they bound and that bound by the benchmark may overlap to some extent.

[0207] It can be seen from FIG. 13 that all of the humanized antibodies triggered Jurkat cell killing by activated human γδ T cells with lower IC50s than the benchmark. Especially, the IC50 of huC2G4F7C7-CDRV33-V1 was 6-fold lower than that of the benchmark.

[0208] The humanized antibodies, huC2G4F7C7-CDRV33-V1, huC2G4F7C7-CDRV33-V3 and huC2G4F7C7-CDRV33-V4, were also tested for their binding affinity to human BTN3A1, rhesus BTN3A1 and cynomolgus BTN3A1 in Biacore test following the protocol of Example 2 respectively  using serially diluted recombinant human BTN3A1-his (SinoBiological, Cat#15973-H08H, starting at 80 nM) , rhesus BTN3A1-TSA (prepared in-house with SEQ ID NO: 26, starting at 80 nM) and cynomolgus BTN3A1-TSA (prepared in-house with SEQ ID NO: 22, starting at 200 nM) , 2-fold dilution in HBS-EP+ buffer (provided by Biacore) . The results were shown in Table 3 and Table 4.

[0209] Table 3. Binding Affinity of Humanized mAbs to Human BTN3A1

[0210] The data indicated that these three humanized antibodies specifically bound to human BTN3A1, rhesus BTN3A1 and cynomolgus BTN3A1, at comparable binding affinity to the benchmark. Especially, huC2G4F7C7-CDRV33-V1 showed the highest binding affinity to human BTN3A1, rhesus BTN3A1 and cynomolgus BTN3A1 among the humanized C2G4F7C7-CDRV33 antibodies.

[0211] Table 4. Binding Affinity of Humanized mAbs to Rhesus and Cynomolgus BTN3A1s

[0212] The antibody huC2G4F7C7-CDRV33-V1 was further tested in the cell-based binding FACS, the indirect ELISA and the cell-based functional assay, following the protocols in the foregoing Examples with minor modifications described below.

[0213] For the cell-based binding FACS, the Jurkat cell line (endogenously expressing human BTN3A1, purchased from ATCC) was used, and R-Phycoerythrin AffiniPure Goat Anti-Human IgG, Fcγ fragment specific (Jackson Immunoresearch Laboratories, Inc., Cat#109-115-098) was used instead of R-Phycoerythrin AffiniPure F (ab') 2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG (H+L) , 1: 1000 dilution in FACS buffer, 100 μl / well. The results were shown in FIG. 14.

[0214] In the indirect ELISA, the human BTN3A2-TSA protein (prepared in-house with SEQ ID NO: 24) , human BTN3A3-TSA protein (prepared in-house with SEQ ID NO: 25) , rhesus BTN3A1-TSA protein (prepared in-house with SEQ ID NO: 26) and cynomolgus BTN3A1-TSA (prepared in-house with SEQ ID NO: 22) were respectively used, and Peroxidase AffiniPure F (ab') 2 Fragment Goat Anti-Human IgG, Fcγ fragment specific (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., Cat#109-036-098)  was used instead of Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG, Fcγ Fragment Specific, 100 μl / well. The results were shown in FIGs. 15-18.

[0215] The activity of huC2G4F7C7-CDRV33-V1 to trigger target cell killing by human γδ T cells was evaluated on a panel of human cancer cell lines, including OVCAR3 ovarian cancer cell line (Cat#HTB-161, purchased from ATCC) , SKOV3 ovarian cancer cell line (Cat#HTB-77, purchased from ATCC) and MDA-MB-231 breast cancer cell line (Cat#SCSP-5043, purchased from Cell Bank, Chinese Academy of Sciences, Shanghai) , according to the protocol as described in Example 5 with minor modifications.

[0216] Briefly, 10,000 OVCAR3 cells, SKOV3 cells or MDA-MB-231 cells were added to 96-well U bottom plates in 50 μL RPMI1640 (Gibco, Cat#A1049101) with 10%FBS (Gibco, Cat#10099-141C) and 1%PS (Gibco, Cat#15140122) , and then 50 μL serially diluted huC2G4F7C7-CDRV33-V1 or controls (starting from 20 nM, 4-fold serial dilution in RPMI1640 with 10%FBS and 1%PS) were added. The plates were incubated at room temperature for 1 hour, added with 45,000 human γδ T cells (Milestone Biotechnologies, Cat#P121070503C) in 100 μL RPMI1640 with 10%FBS and 1%PS, and incubated in a 5%CO2 incubator at 37℃ for 24 hours. The results were shown in FIGs. 19-21.

[0217] According to FIG. 14, huC2G4F7C7-CDRV33-V1 showed significantly higher binding capability than the benchmark in the cell based binding FACS test.

[0218] According to FIGs. 15-17, huC2G4F7C7-CDRV33-V1 specifically bound to human BTN3A2, human BTN3A3, and rhesus BTN3A1 with comparable EC50s and Bmaxs (maximum binding) to the benchmark. According to FIGs. 18, huC2G4F7C7-CDRV33-V1 bound to cynomolgus BTN3A1 with significantly lower EC50 and higher Bmax than the benchmark.

[0219] As shown in FIGs. 19-21, huC2G4F7C7-CDRV33-V1 triggered OVCAR3, SKOV3 and MDA-MB-231 cell killing by activated human γδT cells with lower IC50s than the benchmark.

[0220] Example 11. In Vivo Anti-tumor Efficacy of Anti-BTN3A1 Antibody in Mouse Tumor Model

[0221] The in vivo anti-tumor activity of the antibody huC2G4F7C7-CDRV33-V1 was tested in highly immunodeficient B-NDG mice (Biocytogen Pharmaceuticals (Beijing) Co., Ltd) .

[0222] Jurkat cells were purchased from ATCC and genetically engineered by Biocytogen Pharmaceuticals (Beijing) Co., Ltd to express luciferase (termed as B-Luc-Jurkat cells) . B-NDG mice were injected intravenously in the tail vein with 5×105 B-Luc-Jurkat cells per mouse. Six days after the cell injection, according to the bioluminescence signal emitted by B-Luc-Jurkat cells with the intraperitoneally injected D-luciferin, the mice were randomized into five groups with eight mice per group, and this day was designated as Day 0. The mice were intravenously injected with PBS (only for Group 1) or a mixture of 0.25 μg rhIL-15 (R&D Systems, Cat#BT-015) , 1.5 μg rhIL-15R (R&D Systems, Cat#7194-IR) and in vitro expanded 3×106 human Vγ9Vδ2 T cells on Day 0, 7 and 14. The mice from Group 1 to 5 were also respectively intravenously administered with PBS, an isotype control (10 mg / kg, an anti-HEL monoclonal antibody expressed with the same constant regions as huC2G4F7C7-CDRV33-V1) , ICT01 (10 mg / kg, with the heavy chain and light chain amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 27 and 28 respectively) , huC2G4F7C7-CDRV33-V1 (5 mg / kg) and huC2G4F7C7-CDRV33-V1 (10 mg / kg) on Day 0, 3, 7, 10 and 14. Bioluminescence signal emitted by B-Luc-Jurkat cells in each animal was measured on Day 0, 3, 7, 10, 14 and 17 by a PerkinElmer IVIS Lumina imaging  system, to monitor in vivo tumor growth. The study was terminated on Day 17. Tumor growth inhibition (TGI) was evaluated according to the measured bioluminescence signal.

[0223] The results were shown in Table 5 and FIGs. 22A-22B. Compared to the PBS control group, huC2G4F7C7-CDRV33-V1 at both 5 mg / kg and 10 mg / kg significantly suppressed tumor growth, with TGIs of 64.0%and 71.1%, respectively. Even at the relatively low dose, i.e., 5 mg / kg, huC2G4F7C7-CDRV33-V1 showed superior anti-tumor activity than ICT01.

[0224] Table 5. Tumor Growth Inhibition

[0225] a: Mean ± SEM

[0226] b: Statistical analysis via One-way ANOVA with Dunnett’s test on bioluminescence signal intensity of all treatment groups versus G1. **p < 0.01

[0227] c: Statistical analysis via unpaired t-test on bioluminescence signal intensity of G4 or G5 versus G3. *p < 0.05; **p < 0.01

[0228] The sequences in the present application were summarized below in Table 6.

[0229] Table 6. Sequences

[0230] ***

[0231] While the disclosure has been described above in connection with one or more embodiments, it should be understood that the disclosure is not limited to those embodiments, and the description is intended to cover all alternatives, modifications, and equivalents, as may be included within the spirit and scope of the appended claims. All referenced cited herein are further incorporated by reference in their entirety.

Claims

1.An isolated monoclonal antibody, or an antigen-binding portion thereof, capable of binding to BTN3A1, comprising (i) a heavy chain variable region comprising a VH CDR1, a VH CDR2 and a VH CDR3, and (ii) a light chain variable region comprising a VL CDR1, a VL CDR2 and a VL CDR3, wherein the VH CDR1, the VH CDR2, the VH CDR3, the VL CDR1, the VL CDR2 and the VL CDR3 comprise the amino acid sequences of(1) SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5 and 6, respectively;wherein X in SEQ ID NO: 1 is Y, X1 and X2 in SEQ ID NO: 2 are A and T respectively, X in SEQ ID NO: 3 is T, X1 and X2 in SEQ ID NO: 4 are V and V respectively;wherein X in SEQ ID NO: 1 is Y, X1 and X2 in SEQ ID NO: 2 are A and T respectively, X in SEQ ID NO: 3 is T, X1 and X2 in SEQ ID NO: 4 are A and A respectively;wherein X in SEQ ID NO: 1 is Y, X1 and X2 in SEQ ID NO: 2 are N and T respectively, X in SEQ ID NO: 3 is T, X1 and X2 in SEQ ID NO: 4 are N and N respectively;wherein X in SEQ ID NO: 1 is Y, X1 and X2 in SEQ ID NO: 2 are N and T respectively, X in SEQ ID NO: 3 is T, X1 and X2 in SEQ ID NO: 4 are A and A respectively;wherein X in SEQ ID NO: 1 is Y, X1 and X2 in SEQ ID NO: 2 are N and T respectively, X in SEQ ID NO: 3 is T, X1 and X2 in SEQ ID NO: 4 are S and S respectively;wherein X in SEQ ID NO: 1 is Y, X1 and X2 in SEQ ID NO: 2 are N and T respectively, X in SEQ ID NO: 3 is T, X1 and X2 in SEQ ID NO: 4 are V and V respectively; orwherein X in SEQ ID NO: 1 is Y, X1 and X2 in SEQ ID NO: 2 are N and A respectively, X in SEQ ID NO: 3 is T, X1 and X2 in SEQ ID NO: 4 are V and V respectively;(2) SEQ ID NOs: 1, 12, 3, 4.5 and 6, respectively,wherein X in SEQ ID NO: 1 is Y, X in SEQ ID NO: 3 is S, X1 and X2 in SEQ ID NO: 4 are N and N respectively; or(3) SEQ ID NOs: 1, 15, 3, 4, 5 and 6, respectively,wherein X in SEQ ID NO: 1 is H, X in SEQ ID NO: 15 is G, X in SEQ ID NO: 3 is S, X1 and X2 in SEQ ID NO: 4 are N and N respectively; orwherein X in SEQ ID NO: 1 is H, X in SEQ ID NO: 15 is S, X in SEQ ID NO: 3 is S, X1 and X2 in SEQ ID NO: 4 are N and N respectively.2.The isolated monoclonal antibody, or the antigen-binding portion thereof, of claim 1, wherein the heavy chain variable region comprises an amino acid sequence having at least 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%sequence identity to SEQ ID NOs: 7, 8, 9, 13 or 16,wherein X1 and X2 in SEQ ID NO: 7 are A and T respectively; N and T respectively; or N and A respectively,wherein X1, X2, X3 and X4 in SEQ ID NO: 9 are L, A, K and F respectively; L, T, K and F respectively; M, T, K and F respectively; L, T, T and F respectively; L, T, K and Y respectively; L, A, K and F respectively; or L, T, K and F respectively,wherein X1, X2 and X3 in SEQ ID NO: 16 are G, I and G respectively; G, T and S respectively; or E, T and S, respectively.3.The isolated monoclonal antibody, or the antigen-binding portion thereof, of claim 1, wherein the light chain variable region comprises an amino acid sequence having at least 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%sequence identity to SEQ ID NOs: 10, 11 or 14,wherein X1 and X2 in SEQ ID NO: 10 are V and V respectively; A and A respectively; N and N respectively; or S and S respectively,wherein X1, X2 and X3 in SEQ ID NO: 11 are V, L and V respectively; V, V and L respectively; or I, V and L respectively;wherein X in SEQ ID NO: 14 is T or Q.4.The isolated monoclonal antibody, or an antigen-binding portion thereof, of claim 2, wherein the heavy chain variable region and the light chain variable region comprise amino acid sequences having at least 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%sequence identity to(1) SEQ ID NOs: 7 and 10, respectively, wherein X1 and X2 in SEQ ID NO: 7 are A and T respectively, wherein X1 and X2 in SEQ ID NO: 10 are V and V respectively;(2) SEQ ID NOs: 8 and 11, respectively, wherein X1, X2 and X3 in SEQ ID NO: 11 are V, L and V respectively;(3) SEQ ID NOs: 9 and 11, respectively, wherein X1, X2, X3 and X4 in SEQ ID NO: 9 are L, A, K and F respectively, wherein X1, X2 and X3 in SEQ ID NO: 11 are V, V and L respectively;(4) SEQ ID NOs: 9 and 11, respectively, wherein X1, X2, X3 and X4 in SEQ ID NO: 9 are L, T, K and F respectively, wherein X1, X2 and X3 in SEQ ID NO: 11 are V, V and L respectively;(5) SEQ ID NOs: 9 and 11, respectively, wherein X1, X2, X3 and X4 in SEQ ID NO: 9 are M, T, K and F respectively, wherein X1, X2 and X3 in SEQ ID NO: 11 are V, V and L respectively;(6) SEQ ID NOs: 9 and 11, respectively, wherein X1, X2, X3 and X4 in SEQ ID NO: 9 are L, T, T and F respectively, wherein X1, X2 and X3 in SEQ ID NO: 11 are V, V and L respectively;(7) SEQ ID NOs: 9 and 11, respectively, wherein X1, X2, X3 and X4 in SEQ ID NO: 9 are L, T, K and Y respectively, wherein X1, X2 and X3 in SEQ ID NO: 11 are V, V and L respectively;(8) SEQ ID NOs: 9 and 11, respectively, wherein X1, X2, X3 and X4 in SEQ ID NO: 9 are L, A, K and F respectively, wherein X1, X2 and X3 in SEQ ID NO: 11 are I, V and L respectively;(9) SEQ ID NOs: 9 and 11, respectively, wherein X1, X2, X3 and X4 in SEQ ID NO: 9 are L, T, K and F respectively, wherein X1, X2 and X3 in SEQ ID NO: 11 are I, V and L respectively;(10) SEQ ID NOs: 7 and 10, respectively, wherein X1 and X2 in SEQ ID NO: 7 are A and T respectively, wherein X1 and X2 in SEQ ID NO: 10 are A and A respectively;(11) SEQ ID NOs: 7 and 10, respectively, wherein X1 and X2 in SEQ ID NO: 7 are N and T respectively, wherein X1 and X2 in SEQ ID NO: 10 are N and N respectively;(12) SEQ ID NOs: 7 and 10, respectively, wherein X1 and X2 in SEQ ID NO: 7 are N and T respectively, wherein X1 and X2 in SEQ ID NO: 10 are A and A respectively;(13) SEQ ID NOs: 7 and 10, respectively, wherein X1 and X2 in SEQ ID NO: 7 are N and T respectively, wherein X1 and X2 in SEQ ID NO: 10 are S and S respectively;(14) SEQ ID NOs: 7 and 10, respectively, wherein X1 and X2 in SEQ ID NO: 7 are N and T respectively, wherein X1 and X2 in SEQ ID NO: 10 are V and V respectively;(15) SEQ ID NOs: 7 and 10, respectively, wherein X1 and X2 in SEQ ID NO: 7 are N and A respectively, wherein X1 and X2 in SEQ ID NO: 10 are V and V respectively;(16) SEQ ID NOs: 13 and 14, respectively, wherein X in SEQ ID NO: 14 is T;(17) SEQ ID NOs: 16 and 14, respectively, wherein X1, X2 and X3 in SEQ ID NO: 16 are G, I and G respectively, wherein X in SEQ ID NO: 14 is Q;(18) SEQ ID NOs: 16 and 14, respectively, wherein X1, X2 and X3 in SEQ ID NO: 16 are G, T and S respectively, wherein X in SEQ ID NO: 14 is Q; or(19) SEQ ID NOs: 16 and 14, respectively, wherein X1, X2 and X3 in SEQ ID NO: 16 are E, T and S, respectively, wherein X in SEQ ID NO: 14 is Q.5.The isolated monoclonal antibody, or the antigen-binding portion thereof, of claim 1, which is an IgG1, IgG2 or IgG4 isotype.6.The isolated monoclonal antibody, or the antigen-binding portion thereof, of claim 1, comprising a heavy chain constant region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NOs: 17, 18 or 20, linked to the heavy chain variable region, and / or a light chain constant region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 23 or 25, linked to the light chain variable region.7.The isolated monoclonal antibody, or the antigen-binding portion thereof, of claim 1, which (a) is able to bind human BTN3A1; (b) is able to bind cynomolgus monkey BTN3A1; (c) is able to bind rhesus macaque BTN3A1; (d) is able to bind human BTN3A2; (e) is able to bind human BTN3A3; (f) is able to induce target cell killing by γδ T cells, and / or (f) has in vivo anti-tumor activity.8.The isolated monoclonal antibody, or the antigen-binding portion thereof, of claim 1, which is mouse, chimeric or humanized.9.A nucleic acid molecule encoding the isolated monoclonal antibody or the antigen-binding portion thereof of claim 1.10.An expression vector comprising the nucleic acid molecule of claim 9.11.A host cell comprising the expression vector of claim 10 or having the nucleic acid molecule of claim 9 incorporated into its genome.12.A pharmaceutical composition comprising the isolated monoclonal antibody, or antigen-binding portion thereof, of any one of claims 1 to 8, the nucleic acid molecule of claim 9, the expression vector of claim 10, or the host cell of claim 11, and a pharmaceutically acceptable carrier.13.A method for treating a disease where BTN3A-mediated T cell activation is beneficial in a subject  in need thereof, comprising administering to the subject a therapeutically effective amount of the pharmaceutical composition of claim 12.14.The method of claim 13, wherein the disease is a BTN3A+ cancer.15.The method of claim 14, wherein the cancer is colon cancer, breast cancer, lung cancer, prostate cancer, head and neck cancer, pancreatic cancer, bladder cancer, colorectal cancer, cervical cancer, ovarian cancer, liver cancer, esophageal cancer, thyroid cancer, kidney cancer, stomach cancer, chronic lymphocytic leukemia (CLL) , non-Hodgkin lymphoma (NHL) , lymphoid neoplasm, small lymphocytic lymphoma (SLL) , mantle cell lymphoma (MCL) or myeloid cell lineage neoplasm.16.The method of claim 13, wherein the disease is an infectious disorder.17.A method for killing a BTN3A+ cell in a subject in need thereof, comprising administering to the subject the pharmaceutical composition of claim 12.

Images