Anti-CD3 single domain antibodies and uses thereof

Abstract

Provided are anti-CD3 single domain antibodies and their use to activate CD3+ T-cells and enhance cell-mediated immune response in the treatment of cancer.

Description

ANTI-CD3 SINGLE DOMAIN ANTIBODIES AND USES THEREOF

[0001] CROSS REFERENCE

[0002] This application claims benefit of priority of International Patent Application No. PCT / CN2024 / 131824 filed on November 13, 2024, the content of which is incorporated herein by reference in its entirety.

[0003] SEQUENCE LISTING

[0004] This application incorporates by reference a Sequence Listing submitted with this application as XML file format, entitled “CD3 sdAbs Sequence list. xml, ” created on September 23, 2025 having a size of 17, 593 bytes.TECHNICAL FIELD

[0005] The present disclosure provides anti-CD3 single domain antibodies and their use to activate CD3+ T-cells and enhance cell-mediated immune responses in the treatment of diseases, especially cancer.BACKGROUND

[0006] Cluster of differentiation 3 (CD3) is a multimeric protein complex comprising three different subunits: CD3δε, CD3γε and a CD3ζζ dimer. CD3δε and CD3γε are heterodimers with single extracellular immunoglobulin domains that interact with TCR α and β chains and have relatively short intracellular signaling domains. The ζζ homodimer has a negligibly short ectodomain but an elaborate cytoplasmic domain essential for T cell signaling and activation. CD3 molecules are mainly distributed on the membrane of mature T cells. A CD3 complex provides the first signal sensed by the TCR of a lymphocyte to trigger its activation. Thus, CD3 complex becomes a very attractive receptor to determine the fate of the immune response in different contexts from tolerance induction to immune activation. CD3-related monoclonal antibodies (mAbs) , such as otelixizumab, teplizumab, and visilizumab, are mainly used in the treatment of autoimmune diseases.

[0007] Most bispecific antibodies in clinical trials are used in tumor therapy. One of the most promising anti-tumor biomacromolecule formats is bispecific tumor-targeting immunomodulators binding to a tumor-associated antigen and an immunomodulating receptor, such as CD3, simultaneously. However, with the advent of these potent immunotherapeutic agents, there has been increasing awareness of their inherent adverse effects, especially cytokine release syndrome (CRS) . One proposed pathomechanism of CRS is the undesirable activation of T cells or lysis of immune cells inducing a release of IFN-γ or TNF-α. This leads to the activation of macrophages, dendritic cells, other immune cells, and endothelial cells. These cells further release proinflammatory cytokines. Importantly, macrophages and endothelial cells produce large amounts of interleukin 6 (IL-6) which in a positive feedback loop manner activates T cells and other immune cells leading to a cytokine storm.

[0008] Therefore, a new generation of CD3 antibodies that do not have the undesirable characteristics is needed for the treatment of various cancers or other diseases.SUMMARY

[0009] Given the shortcomings of the prior art, one of the main objects of the present disclosure is to provide antibodies that specifically bind to CD3 with potentially reduced toxicity of cytokine release syndrome (CRS) . The present disclosure also provides nucleic acids encoding these antibodies, vectors, and host cells for making these antibodies, and methods of treating a subject using, and pharmaceutical compositions comprising these antibodies as well as vectors or cells of the present invention. The antibodies of the present disclosure can also be used for detection and / or treatment of a disease or disorder.

[0010] In one aspect, the present disclosure provides an anti-CD3 (Cluster of differentiation 3) single domain antibody (sdAb) or antigen binding fragment thereof comprising a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of the CDR1, CDR2, and CDR3, respectively, as set forth in SEQ ID NO: 4.

[0011] In certain embodiments, the CDR1, CDR2 and / or CDR3 are determined according to the AbM numbering scheme, the IMGT numbering scheme, the Kabat numbering scheme, the Chothia numbering scheme, the Contact numbering scheme, or any combination thereof.

[0012] In certain embodiments, the CDR1, CDR2 and / or CDR3 are determined according to the AbM numbering scheme.

[0013] In certain embodiments, the anti-CD3 sdAb or antigen binding fragment thereof comprises: a CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, a CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, and a CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7.

[0014] In certain embodiments, the anti-CD3 sdAb or antigen binding fragment thereof comprises framework regions (FRs) .

[0015] In certain embodiments, the anti-CD3 sdAb or antigen binding fragment thereof comprises framework regions (FRs) derived from a human immunoglobulin heavy chain variable region sequence.

[0016] In certain embodiments, the anti-CD3 sdAb or antigen binding fragment thereof comprises the amino acid sequence of any one of SEQ ID NO: 4, 11, 12, 13, 14, 15, 16, or an amino acid sequence having at least 80% (for example, at least 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%) sequence identity to the amino acid sequence of any one of SEQ ID NO: 4, 11, 12, 13, 14, 15, 16.

[0017] In another aspect, the present disclosure provides an anti-CD3 (Cluster of differentiation 3) single domain antibody (sdAb) or antigen binding fragment thereof comprises a CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, a CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, and a CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7.

[0018] In certain embodiments, the CDRs described above may be defined according to the AbM numbering system.

[0019] In certain embodiments, the sdAb may comprise framework regions (FRs) .

[0020] In certain embodiments, the sdAb may comprise framework regions (FRs) derived from a human immunoglobulin heavy chain variable region sequence.

[0021] In certain embodiments, the sdAb may comprise the amino acid sequence of any one of SEQ ID NO: 4, 11, 12, 13, 14, 15, 16, or an amino acid sequence having at least 80% (for example, at least 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%) sequence identity to the amino acid sequence of any one of SEQ ID NO: 4, 11, 12, 13, 14, 15, 16.

[0022] In some embodiments, the anti-CD3 sdAb is a camelid antibody. In some embodiments, the anti-CD3 sdAb is a chimeric antibody. In some embodiments, the anti-CD3 sdAb is humanized. In some embodiments, the anti-CD3 sdAb is a VHH fragment.

[0023] In some embodiments, the anti-CD3 sdAb or antigen binding fragment thereof specifically recognizing CD3 is fused to an Fc fragment via an optional linker to form a heavy chain-only antibody (HCAb) . In some embodiments, the HCAb is monomeric. In some embodiments, the HCAb is dimeric. In some embodiments, the Fc fragment is a human IgG1 (hIgG1) Fc, effectorless (inert) hIgG1 Fc, hIgG4 Fc, or hIgG4 Fc (S228P) .

[0024] In another aspect, the present disclosure provides an immunoconjugate, comprising the anti-CD3 sdAb or antigen binding fragment thereof of the present disclosure, and an effector molecule.

[0025] In certain embodiments, wherein the effector molecule is a therapeutic agent selected from the group consisting of a drug, a toxin, a radioisotope, a protein, a peptide, and a nucleic acid.

[0026] In some embodiments according to any one of the anti-CD3 sdAb or antigen binding fragment thereof described above, the anti-CD3 sdAb or antigen binding fragment thereof can be used for forming bispecific or multispecific antibodies. The bispecific or multispecific antibody, comprising the anti-CD3 sdAb or antigen binding fragment thereof described above, wherein the bispecific or multispecific antibody further comprises a second antibody moiety specifically recognizing a second antigen.

[0027] In some embodiments, the second antibody moiety is a full-length antibody, a Fab, a Fab’ , a (Fab’ ) 2, an Fv, a single chain Fv (scFv) , an scFv-scFv, a minibody, a diabody, or an sdAb.

[0028] In certain embodiments, the second antigen is selected from the group consisting of CD33, CD19, CD20, CD22, CD30, CD70, CLL-1, BCMA, DLL-3, Claudin 6, Claudin 18.2, GPC3, GPC2, GPRC5D, CD229, FcRH5, GUCY2C, mesothelin, HER2, PSMA, and PSCA.

[0029] In certain embodiments, the second antigen is CD33.

[0030] In certain embodiments, the bispecific or multispecific antibody of the present disclosure, comprising: (a) a first component comprising an antibody or antigen-binding fragment thereof that binds to CD33 and (b) a second component comprising the sdAb or antigen binding fragment thereof that specifically binds to CD3 of the present disclosure; optionally, the bispecific or multispecific antibody further comprises (c) a third component for antibody half-life extension.

[0031] In certain embodiments, the bispecific or multispecific antibody comprises in order of N-terminus to C-terminus the first component, the second component, and the third component.

[0032] In certain embodiments, the first component comprises the sequence of SEQ ID NO: 9.

[0033] In certain embodiments, the third component comprises the sequence of SEQ ID NO: 10.

[0034] In another aspect, the present disclosure provides a nucleic acid molecule, comprising a nucleotide sequence encoding the anti-CD3 sdAb or antigen binding fragment thereof of the present disclosure, or the bispecific or multispecific antibody of the present disclosure.

[0035] In another aspect, the present disclosure provides a vector, which comprises the nucleic acid molecule as described above.

[0036] In another aspect, the present disclosure provides a host cell, which comprises the nucleic acid molecule or vector as described above.

[0037] In another aspect, the present disclosure provides a method for producing the anti-CD3 sdAb or antigen binding fragment thereof of the disclosure, or the bispecific or multispecific antibody of the disclosure, wherein the method comprises culturing a host cell comprising the nucleic acid molecule of the disclosure or the vector of the disclosure or the host cell of the disclosure under a condition allowing expression of the anti-CD3 sdAb or antigen binding fragment thereof or the bispecific or multispecific antibody, and recovering the anti-CD3 sdAb or antigen binding fragment thereof or the bispecific or multispecific antibody from a culture of the cultured host cell.

[0038] In one aspect, the present disclosure provides a pharmaceutical composition, comprising the anti-CD3 sdAb or antigen binding fragment thereof of the disclosure, or the immunoconjugate of the disclosure, the bispecific or multispecific antibody of the disclosure, or the nucleic acid molecule of the disclosure, or the vector of the disclosure, or the host cell of the disclosure, and a pharmaceutically acceptable carrier and / or excipient.

[0039] In certain embodiments, the pharmaceutical composition further comprises an additional therapeutic agent.

[0040] In certain embodiments, the additional therapeutic agent is an anti-tumor agent.

[0041] In certain embodiments, the additional therapeutic agent is an additional immune checkpoint inhibitor, such as anti-PD-1 antibody, anti-PD-L1 antibody, anti-TIM-3 antibody, anti-LAG-3 antibody, or anti-CTLA-4 antibody.

[0042] In certain embodiments, the additional therapeutic agent is a cytotoxic agent, such as an alkylating agent, an anti-mitotic agent, an antitumor antibiotic, an antimetabolite, a topoisomerase inhibitor, a tyrosine kinase inhibitor, or a radionuclide.

[0043] In another aspect, the present disclosure provides use of the anti-CD3 sdAb or antigen binding fragment thereof, the immunoconjugate, the bispecific or multispecific antibody, the nucleic acid molecule, the vector, the host cell, or the pharmaceutical composition disclosed herein in manufacture of a medicament for use in preventing and / or treating a disease or disorder in a subject.

[0044] In another aspect, the present disclosure provides the anti-CD3 sdAb or antigen binding fragment thereof, the immunoconjugate, the bispecific or multispecific antibody, the nucleic acid molecule, the vector, the host cell, or the pharmaceutical composition disclosed herein for use in preventing and / or treating a disease or disorder in a subject.

[0045] In another aspect, the present disclosure provides a method for preventing and / or treating a disease or disorder in a subject, the method comprising administering to a subject in need thereof an effective amount of the anti-CD3 sdAb or antigen binding fragment thereof, the immunoconjugate, the bispecific or multispecific antibody, the nucleic acid molecule, the vector, the host cell, or the pharmaceutical composition disclosed herein.

[0046] In certain embodiments, the disease or disorder is autoimmune disease or cancer (tumor) .

[0047] In certain embodiments, the cancer expresses CD3.

[0048] In certain embodiments, the cancer is a solid tumor, e.g., ovarian cancer, endometrial cancer, breast cancer, lung cancer (small cell or non-small cell) , colon cancer, prostate cancer, cervical cancer, pancreatic cancer, gastric cancer, esophageal cancer, hepatocellular carcinoma (liver cancer) , renal cell carcinoma (kidney cancer) , head-and-neck tumors, mesothelioma, melanoma, sarcomas, or brain tumors (e.g., gliomas, such as glioblastomas) .

[0049] In certain embodiments, the cancer is a hematological malignancy, e.g., leukemia, lymphoma or myeloma, including acute myeloid leukemia, adult T-cell leukemia, T-cell large granula lymphocyte leukemia, acute lymphoblastic leukemia, chronic lymphocytic leukemia, chronic myelogenous leukemia, acute monocytic leukemia, Hodgkin's or Non-Hodgkin's lymphoma, or multiple myeloma.

[0050] In certain embodiments, the subject is a mammal, such as a human.

[0051] In certain embodiments, the anti-CD3 sdAb or antigen binding fragment thereof, the immunoconjugate, the bispecific or multispecific antibody, or the pharmaceutical composition is used in combination with an additional therapeutic agent or an additional therapy.

[0052] In certain embodiments, the additional therapeutic agent is an anti-tumor agent.

[0053] In certain embodiments, the additional therapeutic agent is an additional immune checkpoint inhibitor, such as anti-PD-1 antibody, anti-PD-L1 antibody, anti-TIM-3 antibody, anti-LAG-3 antibody, or anti-CTLA-4 antibody.

[0054] In certain embodiments, the additional therapeutic agent is a cytotoxic agent, such as an alkylating agent, an anti-mitotic agent, an antitumor antibiotic, an antimetabolite, a topoisomerase inhibitor, a tyrosine kinase inhibitor, or a radionuclide.

[0055] In certain embodiments, the additional therapy is a standard cancer treatment, such as surgery, chemotherapy, radiation therapy, targeted therapy, immunotherapy, hormone therapy, gene therapy or palliative care.

[0056] Beneficial effects:

[0057] The antibodies, especially anti-CD3 single-domain antibodies (sdAbs) of the present disclosure specifically bind to CD3 (e.g., human CD3, in particular human and cynomolgus CD3δε) , with potentially reduced toxicity of cytokine release syndrome (CRS) .

[0058] The bispecific antibodies (e.g., CD33-targeting BiTE-HLE) of the present disclosure lead to redirected tumor cell killing, in which cytotoxic effector cells (such as T cells) can specifically bind to target tumor cells, and lead to reduced cytokine release (reduced cytokines such as IFN-γ, TNF-α, and / or IL-2) .

[0059] The bispecific antibodies of the present application are further humanized, which retain the specific binding affinity to human CD3δε, and the ability to reduce toxicity of CRS, thereby producing effective T cell activation, specific tumor cell killing, and good safety.BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

[0060] FIG. 1: Detection results of T cell activation, tumor cell killing, and cytokine release induced by CD33 targeting BiTE-HLE molecule CD33xAS39678-HLE.DETAILED DESCRIPTION

[0061] VHH OF THE PRESENT DISCLOSURE

[0062] In one aspect, the present disclosure provides an anti-CD3 (Cluster of differentiation 3) single domain antibody (sdAb) or antigen binding fragment thereof comprising a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of the CDR1, CDR2, and CDR3, respectively, as set forth in SEQ ID NO: 4.

[0063] The CDRs described above may be determined according to the AbM numbering scheme, the IMGT numbering scheme, the Kabat numbering scheme, the Chothia numbering scheme, the Contact numbering scheme, or any combination thereof.

[0064] The CDRs described above may be defined according to the AbM numbering system.

[0065] The sdAb may comprise: a CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, a CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, and a CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7.

[0066] The sdAb may comprise framework regions (FRs) .

[0067] The sdAb may comprise framework regions (FRs) derived from a human immunoglobulin heavy chain variable region sequence.

[0068] The sdAb may comprise the amino acid sequence of any one of SEQ ID NO: 4, 11, 12, 13, 14, 15, 16, or an amino acid sequence having at least 80% (for example, at least 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%) sequence identity to the amino acid sequence of any one of SEQ ID NO: 4, 11, 12, 13, 14, 15, 16.

[0069] In another aspect, the present disclosure provides an anti-CD3 (Cluster of differentiation 3) single domain antibody (sdAb) or antigen binding fragment thereof comprises a CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, a CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, and a CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7.

[0070] The CDRs described above may be defined according to the AbM numbering system.

[0071] The sdAb may comprise framework regions (FRs) .

[0072] The sdAb may comprise framework regions (FRs) derived from a human immunoglobulin heavy chain variable region sequence.

[0073] The sdAb may comprise the amino acid sequence of any one of SEQ ID NO: 4, 11, 12, 13, 14, 15, 16, or an amino acid sequence having at least 80% (for example, at least 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%) sequence identity to the amino acid sequence of any one of SEQ ID NO: 4, 11, 12, 13, 14, 15, 16.

[0074] Those skilled in the art should understand that the aforementioned CDR sequences can be modified to include substitution of one or more amino acids, thereby obtaining improved biological activity such as improved binding affinity to CD3. For example, the phage display technology can be used to produce and express an antibody variant library, and then screen for an antibody that has affinity with CD3. In another example, computer software can be used to simulate the binding of the antibody to CD3 and identify the amino acid residues on the antibody that form the binding interface. The substitution of these residues may be avoided to prevent a decrease in binding affinity, or these residues can be targeted for substitution to form stronger binding. At least one (or all) substitution in the CDR sequences is conservative substitution.

[0075] IMMUNOCONJUGATES

[0076] In another aspect, the present disclosure provides an immunoconjugate, comprising the anti-CD3 sdAb or antigen binding fragment thereof of the present disclosure, and an effector molecule.

[0077] The effector molecule may be a therapeutic agent selected from the group consisting of a drug, a toxin, a radioisotope, a protein, a peptide, and a nucleic acid.

[0078] The immunoconjugate of the disclosure may be an antibody-drug conjugate (ADC) in which the anti-CD3 sdAb or antigen binding fragment thereof as described herein is conjugated to one or more drugs, including but not limited to a maytansinoid (see U.S. Patent Nos. 5,208,020, 5,416,064 and European Patent EP0425235B1) ; an auristatin such as monomethylauristatin drug moieties DE and DF (MMAE and MMAF) (see U.S. Patent Nos. 5,635,483 and 5,780,588, and 7,498,298) ; a dolastatin; a calicheamicin or derivative thereof (see U.S. Patent Nos. 5,712,374, 5,714,586, 5,739,116, 5,767,285, 5,770,701, 5,770,710, 5,773,001, and 5, 877, 296; Hinman et al., Cancer Res. 53: 3336-3342 (1993) ; and Lode et al., Cancer Res. 58: 2925-2928 (1998) ) ; an anthracycline such as daunomycin or doxorubicin (see Kratz et al., Current Med. Chem. 13: 477-523 (2006) ; Jeffrey et al., Bioorganic &Med. Chem. Letters 16: 358-362 (2006) ; Torgov et al., Bioconj. Chem. 16: 717-721 (2005) ; Nagy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 829-834 (2000) ; Dubowchik et al., Bioorg. &Med. Chem. Letters 12: 1529-1532 (2002) ; King et al., J. Med. Chem. 45: 4336-4343 (2002) ; and U.S. Patent No. 6,630,579) ; methotrexate; vindesine; a taxane such as docetaxel, paclitaxel, larotaxel, tesetaxel, and ortataxel; a trichothecene; and CC1065.

[0079] The immunoconjugate of the disclosure may comprise the anti-CD3 sdAb or antigen binding fragment thereof as described herein conjugated to an enzymatically active toxin or fragment thereof, including but not limited to diphtheria A chain, nonbinding active fragments of diphtheria toxin, exotoxin A chain (from Pseudomonas aeruginosa) , ricin A chain, abrin A chain, modeccin A chain, alpha-sarcin, Aleurites fordii proteins, dianthin proteins, Phytolaca americana proteins (PAPI, PAPII, and PAP-S) , momordica charantia inhibitor, curcin, crotin, sapaonaria officinalis inhibitor, gelonin, mitogellin, restrictocin, phenomycin, enomycin, and the tricothecenes.

[0080] The immunoconjugate of the disclosure may comprise the anti-CD3 sdAb or antigen binding fragment thereof as described herein conjugated to a radioactive atom to form a radioconjugate. A variety of radioactive isotopes are available for the production of radioconjugates. Examples include At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 and radioactive isotopes of Lu. When the radioconjugate is used for detection, it may comprise a radioactive atom for scintigraphic studies, for example Tc-99m or I-123, or a spin label for nuclear magnetic resonance (NMR) imaging (also known as magnetic resonance imaging, “MRI” ) , such as iodine-123, iodine-131, indium-111, fluorine-19, carbon-13, nitrogen-15, oxygen-17, gadolinium, manganese or iron.

[0081] Conjugates of an antibody and cytotoxic agent may be made using a variety of bifunctional protein coupling agents such as N-succinimidyl-3- (2-pyridyldithio) propionate (SPDP) , succinimidyl-4- (N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate (SMCC) , iminothiolane (IT) , bifunctional derivatives of imidoesters (such as dimethyl adipimidate HCl) , active esters (such as disuccinimidyl suberate) , aldehydes (such as glutaraldehyde) , bis-azido compounds (such as bis (p-azidobenzoyl) hexanediamine) , bis-diazonium derivatives (such as bis- (p-diazoniumbenzoyl) -ethylenediamine) , diisocyanates (such as toluene 2, 6-diisocyanate) , or bis-active fluorine compounds (such as 1, 5-difluoro-2, 4-dinitrobenzene) . For example, a ricin immunotoxin can be prepared as described in Vitetta et al., Science 238: 1098 (1987) . Carbon-14-labeled 1-isothiocyanatobenzyl-3-methyldiethylene triaminepentaacetic acid (MX-DTPA) is an exemplary chelating agent for conjugation of radionucleotide to the antibody. See WO94 / 11026. The linker may be a “cleavable linker” facilitating release of a cytotoxic drug in the cell. For example, an acid-labile linker, peptidase-sensitive linker, photolabile linker, dimethyl linker or disulfide-containing linker (Chari et al., Cancer Res. 52: 127-131 (1992) ; U.S. Patent No. 5,208,020) may be used.

[0082] The immunoconjugates or ADCs herein expressly contemplate, but are not limited to such conjugates prepared with cross-linker reagents including, but not limited to, BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC, and sulfo-SMPB, and SVSB (succinimidyl- (4-vinylsulfone) benzoate) which are commercially available (e.g., from Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., U.S.A) .

[0083] BISPECIFIC OR MULTISPECIFIC ANTIBODIES

[0084] The anti-CD3 sdAb or antigen binding fragment thereof of the disclosure can be used for forming bispecific or multispecific antibodies. The sdAb or antigen binding fragment thereof of the disclosure may be a part of a bispecific or multispecific antibody that includes a second functional module (e.g., a second antibody) having a binding specificity different from that of the sdAb or antigen binding fragment thereof of the disclosure, so that it is capable of binding to at least two different binding sites and / or target molecules. For example, the sdAb or antigen binding fragment thereof of the disclosure can be linked to a second antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to any protein that can be used as a potential target (or antigen) for combination therapy. To generate the bispecific or multispecific antibody, the sdAb or antigen binding fragment thereof of the disclosure can be linked (e.g., by chemical coupling, gene fusion, non-covalent association, or other means) to one or more other binding molecules (e.g., additional antibodies, antibody fragments, peptides, or binding mimics) .

[0085] Accordingly, in another aspect, the present disclosure provides a bispecific or multispecific antibody, comprising the anti-CD3 sdAb or antigen binding fragment thereof of the present disclosure.

[0086] The bispecific or multispecific molecule specifically binds to CD3, and additionally specifically binds to one or more other antigens.

[0087] The bispecific or multispecific molecule may comprise at least one molecule having a second binding specificity for a second antigen (for example, a second antibody) .

[0088] The second antigen is selected from the group consisting of CD33, CD19, CD20, CD22, CD30, CD70, CLL-1, BCMA, DLL-3, Claudin 6, Claudin 18.2, GPC3, GPC2, GPRC5D, CD229, FcRH5, GUCY2C, mesothelin, HER2, PSMA, and PSCA.

[0089] The bispecific or multispecific antibody specifically binds to CD3 and CD33.

[0090] The bispecific or multispecific antibody of the present disclosure may comprise: (a) a first component comprising an antibody or antigen-binding fragment thereof that binds to CD33 and (b) a second component comprising the anti-CD3 sdAb of the present disclosure; optionally, the bispecific or multispecific antibody further comprises (c) a third component for antibody half-life extension.

[0091] The bispecific or multispecific antibody may comprise in order of N-terminus to C-terminus the first component, the second component and the third component.

[0092] The first component may comprise the sequence of SEQ ID NO: 9.

[0093] The third component may comprise the sequence of SEQ ID NO: 10.

[0094] PRODUCTION OF ANTIBODIES

[0095] The anti-CD3 sdAb or antigen binding fragment thereof can be prepared by various methods known in the art, for example, obtained by genetic engineering recombination technology. For example, a DNA molecule encoding the anti-CD3 sdAb or antigen binding fragment thereof of the present disclosure can be obtained by chemical synthesis or PCR amplification. The resulting DNA molecule is inserted into an expression vector and then transfected into a host cell. Then, the transfected host cell is cultured under a specific condition, and the anti-CD3 sdAb of the present disclosure is expressed.

[0096] In another aspect, the present disclosure provides a nucleic acid molecule, comprising a nucleotide sequence encoding the anti-CD3 sdAb or antigen binding fragment thereof of the present disclosure, or the bispecific or multispecific antibody of the present disclosure.

[0097] In another aspect, the present disclosure provides a vector (for example, cloning vector or expression vector) , which comprises the nucleic acid molecule as described above. The vector of the present disclosure may be a plasmid, cosmid, bacteriophage, or the like.

[0098] In another aspect, the present disclosure provides a host cell, which comprises the nucleic acid molecule or vector as described above. The host cell may be a mammalian cell. The host cell may be a human, murine, sheep, horse, dog, or cat cell. The host cell may be a Chinese hamster ovary cell.

[0099] In another aspect, the present disclosure provides a method for producing the anti-CD3 sdAb or antigen binding fragment thereof of the disclosure, or the bispecific or multispecific antibody of the disclosure, wherein the method comprises culturing a host cell comprising the nucleic acid molecule of the disclosure or the vector of the disclosure or the host cell of the disclosure under a condition allowing expression of the anti-CD3 sdAb or antigen binding fragment thereof or the bispecific or multispecific antibody, and recovering the anti-CD3 sdAb or antigen binding fragment thereof or the bispecific or multispecific antibody from a culture of the cultured host cell.

[0100] PHARMACEUTICAL COMPOSITION

[0101] In one aspect, the present disclosure provides a pharmaceutical composition, comprising the anti-CD3 sdAb or antigen binding fragment thereof of the disclosure, or the immunoconjugate of the disclosure, the bispecific or multispecific antibody of the disclosure, or the nucleic acid molecule of the disclosure, or the vector of the disclosure, or the host cell of the disclosure, and a pharmaceutically acceptable carrier and / or excipient.

[0102] The pharmaceutical composition may comprise the anti-CD3 sdAb or antigen binding fragment thereof of the disclosure. The pharmaceutical composition may comprise an effective amount of the anti-CD3 sdAb or antigen binding fragment thereof of the disclosure. The anti-CD3 sdAb or antigen binding fragment thereof of the disclosure may be the only active ingredient included in the pharmaceutical composition.

[0103] The pharmaceutical composition may comprise the immunoconjugate of the disclosure. The pharmaceutical composition may comprise an effective amount of the immunoconjugate of the disclosure. The immunoconjugate may be the only active ingredient included in the pharmaceutical composition.

[0104] The pharmaceutical composition may comprise the bispecific or multispecific antibody of the disclosure. The pharmaceutical composition may comprise an effective amount of the bispecific or multispecific antibody of the disclosure. The bispecific or multispecific antibody may be the only active ingredient included in the pharmaceutical composition.

[0105] The pharmaceutical composition of the disclosure may further comprise an additional therapeutic agent. The additional therapeutic agent may be an anti-tumor agent. The additional therapeutic agent may be an additional immune checkpoint inhibitor, such as anti-PD-1 antibody, anti-PD-L1 antibody, anti-TIM-3 antibody, anti-LAG-3 antibody, or anti-CTLA-4 antibody. The additional therapeutic agent may be a cytotoxic agent, such as an alkylating agent, an anti-mitotic agent, an antitumor antibiotic, an antimetabolite, a topoisomerase inhibitor, a tyrosine kinase inhibitor, or a radionuclide.

[0106] The anti-CD3 sdAb or antigen binding fragment thereof of the disclosure or the immunoconjugate of the disclosure or the bispecific or multispecific antibody of the disclosure, and the additional therapeutic agent may be provided as separate components or as components of a single composition. The anti-CD3 sdAb or antigen binding fragment thereof of the disclosure or the immunoconjugate of the disclosure or the bispecific or multispecific antibody of the disclosure may be used in combination with the other agents simultaneously, separately, or successively.

[0107] The pharmaceutical composition can be provided in unit dosage form (i.e., the dosage for a single administration) .

[0108] The pharmaceutical composition can be formulated using one or more pharmaceutically acceptable carriers and / or excipients. The formulation depends on the route of administration chosen. For parenteral administration, the pharmaceutical composition is preferably sterile and substantially isotonic and manufactured under GMP conditions. By way of example, the anti-CD3 sdAb or antigen binding fragment thereof disclosed herein can be formulated in aqueous solutions for injection, preferably in physiologically compatible buffers, such as water for injection (WFI) , bacteriostatic water for injection (BWFI) , sodium chloride solution (e.g., 0.9%(w / v) NaCl) , glucose solution (e.g., 5%glucose) , surfactant-containing solution (e.g., 0.01%polysorbate 20) , pH buffered solution (e.g., phosphate buffered solution) , Ringer's solution. The solution can contain formulatory agents such as suspending, stabilizing and / or dispersing agents. Alternatively, VHH domains can be in lyophilized form for constitution with a suitable vehicle, e.g., sterile pyrogen-free water, before use.

[0109] THERAPEUTIC METHODS AND USES

[0110] In another aspect, the present disclosure provides use of the anti-CD3 sdAb or antigen binding fragment thereof, the bispecific or multispecific antibody, the nucleic acid molecule, the vector, the host cell, or the pharmaceutical composition disclosed herein in manufacture of a medicament for use in preventing and / or treating a disease or disorder in a subject.

[0111] The disease or disorder is autoimmune disease or cancer (tumor) .

[0112] The tumor may express CD3.

[0113] The tumor may be a solid tumor, e.g., ovarian cancer, endometrial cancer, breast cancer, lung cancer (small cell or non-small cell) , colon cancer, prostate cancer, cervical cancer, pancreatic cancer, gastric cancer, esophageal cancer, hepatocellular carcinoma (liver cancer) , renal cell carcinoma (kidney cancer) , head-and-neck tumors, mesothelioma, melanoma, sarcomas, or brain tumors (e.g., gliomas, such as glioblastomas) .

[0114] The tumor may be a hematological malignancy, e.g., leukemia, lymphoma or myeloma, including acute myeloid leukemia, adult T-cell leukemia, T-cell large granula lymphocyte leukemia, acute lymphoblastic leukemia, chronic lymphocytic leukemia, chronic myelogenous leukemia, acute monocytic leukemia, Hodgkin's or Non-Hodgkin's lymphoma, or multiple myeloma.

[0115] The subject may be a mammal, such as a human.

[0116] The anti-CD3 sdAb or antigen binding fragment thereof, the immunoconjugate, the bispecific or multispecific antibody, or the pharmaceutical composition may be used in combination with an additional therapeutic agent or an additional therapy.

[0117] The additional therapeutic agent may be an anti-tumor agent.

[0118] The additional therapeutic agent may be an additional immune checkpoint inhibitor, such as anti-PD-1 antibody, anti-PD-L1 antibody, anti-TIM-3 antibody, anti-LAG-3 antibody, or anti-CTLA-4 antibody.

[0119] The additional therapeutic agent may be a cytotoxic agent, such as an alkylating agent, an anti-mitotic agent, an antitumor antibiotic, an antimetabolite, a topoisomerase inhibitor, a tyrosine kinase inhibitor, or a radionuclide.

[0120] The additional therapy may be a standard cancer treatment, such as surgery, chemotherapy, radiation therapy, targeted therapy, immunotherapy, hormone therapy, gene therapy or palliative care.

[0121] In another aspect, the present disclosure provides the anti-CD3 sdAb or antigen binding fragment thereof, the bispecific or multispecific antibody, the nucleic acid molecule, the vector, the host cell, or the pharmaceutical composition disclosed herein for use in preventing and / or treating a disease or disorder in a subject.

[0122] The disease or disorder is autoimmune disease or cancer (tumor) .

[0123] The tumor may express CD3.

[0124] The tumor may be a solid tumor, e.g., ovarian cancer, endometrial cancer, breast cancer, lung cancer (small cell or non-small cell) , colon cancer, prostate cancer, cervical cancer, pancreatic cancer, gastric cancer, esophageal cancer, hepatocellular carcinoma (liver cancer) , renal cell carcinoma (kidney cancer) , head-and-neck tumors, mesothelioma, melanoma, sarcomas, or brain tumors (e.g., gliomas, such as glioblastomas) .

[0125] The tumor may be a hematological malignancy, e.g., leukemia, lymphoma or myeloma, including acute myeloid leukemia, adult T-cell leukemia, T-cell large granula lymphocyte leukemia, acute lymphoblastic leukemia, chronic lymphocytic leukemia, chronic myelogenous leukemia, acute monocytic leukemia, Hodgkin's or Non-Hodgkin's lymphoma, or multiple myeloma.

[0126] The subject may be a mammal, such as a human.

[0127] The anti-CD3 sdAb or antigen binding fragment thereof, the immunoconjugate, the bispecific or multispecific antibody, or the pharmaceutical composition may be used in combination with an additional therapeutic agent or an additional therapy.

[0128] The additional therapeutic agent may be an anti-tumor agent.

[0129] The additional therapeutic agent may be an additional immune checkpoint inhibitor, such as anti-PD-1 antibody, anti-PD-L1 antibody, anti-TIM-3 antibody, anti-LAG-3 antibody, or anti-CTLA-4 antibody.

[0130] The additional therapeutic agent may be a cytotoxic agent, such as an alkylating agent, an anti-mitotic agent, an antitumor antibiotic, an antimetabolite, a topoisomerase inhibitor, a tyrosine kinase inhibitor, or a radionuclide.

[0131] The additional therapy may be a standard cancer treatment, such as surgery, chemotherapy, radiation therapy, targeted therapy, immunotherapy, hormone therapy, gene therapy or palliative care.

[0132] DEFINITIONS

[0133] In the present disclosure, the scientific and technical terms used herein have the meanings commonly understood by those skilled in the art, unless otherwise stated. For better understanding of the present disclosure, definitions and explanations of terms are provided below.

[0134] The term "antibody" in the present disclosure includes any immunoglobulin, monoclonal antibody, polyclonal antibody, multispecific antibody or bispecific (bivalent) antibody that can bind to a specific antigen. A natural intact antibody contains two heavy chains and two light chains. Each heavy chain is composed of one variable region and first, second and third constant regions; each light chain is composed of one variable region and one constant region. The mammalian heavy chains can be divided into α, δ, ε, γ and μ, and the mammalian light chains can be divided into λ or κ. The antibody is presented in "Y" type, and the neck of the Y-type structure is composed of the second and third constant regions of the two heavy chains, which are linked by disulfide bonds. Each arm of the "Y" type structure contains the variable region and the first constant region of one of the heavy chains, which are linked with the variable region and constant region of one light chain. The variable regions of the light and heavy chains determine antigen-binding. The variable region of each chain contains three hypervariable regions, called complementarity determining regions (CDRs) . The CDRs of the light chain (L) include LCDR1, LCDR2, and LCDR3, and the CDRs of the heavy chain (H) include HCDR1, HCDR2, and HCDR3. The CDR boundaries of the antibody and antigen-binding fragment thereof disclosed in the present disclosure can be named or identified by Kabat, Chothia, AbM, IMGT or Al-Lazikani numbering system. (Al-Lazikani, B., Chothia, C., Lesk, AM, J. Mol. Biol., 273(4) : 927 (1997) ; Chothia, C., etc., J. Mol. Biol., 186 (3 ) : 651-63 (1985) ; Chothia, C. and Lesk, AM, J. Mol. Biol., 196: 901 (1987) ; Chothia, C. et al., Nature, 342 (6252) : 877-83 (1989 ) ; Kabat, EA, etc., National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991) ) . Wherein, the three CDRs are separated by a continuous side part called framework region (FR) . The framework region is more highly conserved than the CDRs and forms a scaffold to support the hypervariable loop. The constant regions of heavy and light chains are not related to the antigen-binding, but have multiple effector functions. Antibodies can be divided into several categories based on the amino acid sequence of the constant region of the heavy chain. According to whether they contain α, δ, ε, γ and μ heavy chains, antibodies can be divided into five main categories or isomers: IgA, IgD, IgE, IgG, and IgM. Several major antibody categories can further be divided into subclasses, such as IgG1 (γ1 heavy chain) , IgG2 (γ2 heavy chain) , IgG3 (γ3 heavy chain) , IgG4 (γ4 heavy chain) , IgA1 (α1 heavy chain) or IgA2 (α2 heavy chain) and so on.

[0135] The term "antigen binding fragment" in the present disclosure refers to an antibody fragment formed by an antibody portion containing one or more CDRs or any other antibody fragment that binds to an antigen but does not have a complete antibody structure. Examples of antigen-binding fragment include, but are not limited to, such as diabody, Fab, Fab' , F (ab' ) 2, Fv fragment, disulfide bond-stabilized Fv fragment (dsFv) , (dsFv) 2, dual-specific dsFv (dsFv-dsFv' ) , disulfide bond-stabilized difunctional antibody (ds diabody) , single-chain antibody molecule (scFv) , scFv dimer (bivalent bifunctional antibody) , bivalent single-chain antibody (BsFv) , multispecific antibody, camelized single domain antibody, nanobody, domain antibody and bivalent domain antibody. The antigen-binding fragment can bind to the same antigen as the parent antibody. The antigen-binding fragment may contain one or more CDRs from a specific human antibody, which are grafted into a framework region derived from one or more different human antibodies.

[0136] As used herein, the term "complementarity determining region" or "CDR" refers to the amino acid residues in the variable region of an antibody that are responsible for antigen binding. The precise boundaries of these amino acid residues can be defined according to various numbering systems known in the art, for example, according to the definitions in the Kabat numbering system (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991) , Chothia numbering system (Chothia &Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196: 901-917; Chothia et al. (1989) Nature 342: 878-883) , AbM numbering system (Martin, in Antibody Engineering, Vol. 2, Chapter 3, Springer Verlag) or IMGT numbering system (Lefranc et al., Dev. Comparat. Immunol. 27: 55-77, 2003) . For a given antibody, those skilled in the art can easily identify the CDRs defined by each numbering system. Moreover, the correspondence between different numbering systems is well known to those skilled in the art (e.g., see Lefranc et al., Dev. Comparat. Immunol. 27: 55-77, 2003) . The CDRs of the antibodies of the disclosure may be defined according to Kabat, AbM, IMGT, or Chothia numbering system, or any combination thereof. The CDRs described in the disclosure may be defined according to the AbM numbering system.

[0137] The following general rules disclosed in www. bioinf. org. uk: Prof. Andrew C. R. Martin's Group and reproduced below may be used to define the CDRs in an antibody sequence that includes those amino acids that specifically interact with the amino acids comprising the epitope in the antigen to which the antibody binds. There are rare examples where these generally constant features do not occur; however, the Cys residues are the most conserved feature.

[0138] As used herein, the term "framework region" or "FR" residues refers to those amino acid residues other than the CDR residues as defined above in the variable regions of antibody.

[0139] As used herein, the term "Fd fragment" refers to an antibody fragment consisting of VH and CH1 domains; the term "dAb fragment" refers to an antibody fragment consisting of VH domain; the term "Fab fragment" refers to an antibody fragment consisting of VL, VH, CL and CH1 domains; the term "F (ab' ) 2 fragment" refers to an antibody fragment comprising two Fab fragments linked by a disulfide bridge at the hinge region.

[0140] As used herein, the term "Fv fragment" refers to an antibody fragment consisting of VL and VH domains of a single arm of an antibody. An Fv fragment is generally considered to be the smallest antibody fragment that can form a complete antigen binding site. It is believed that six CDRs confer the antigen binding specificity to the antibody. However, even one variable region (e.g., an Fd fragment, which contains only three CDRs specific for an antigen) is able to recognize and bind an antigen, albeit with less affinity than that of the entire binding site.

[0141] As used herein, the term "scFv" refers to a single polypeptide chain comprising VL and VH domains, having a general structure of NH2-VL-linker-VH-COOH or NH2-VH-linker-VL-COOH. A suitable linker of prior art consists of a repeated GGGGS amino acid sequence or variants thereof. For example, a linker having amino acid sequence (GGGGS) 3 can be used, but variants thereof can also be used. Other linkers applicable to the present disclosure are described by Alfthan et al. (1995) , Protein Eng. 8: 725-731, Choi et al. (2001) , Eur. J. Immunol. 31: 94-106, Hu et al. (1996) , Cancer Res. 56: 3055-3061, Kipriyanov et al. (1999) , J. Mol. Biol. 293: 41-56 and Roovers et al. (2001) , Cancer Immunol. In some cases, there may also be a disulfide bond between the VH and VL of scFv.

[0142] As used herein, the term "diabody" refers to a dimer of scFv which consists of VH and VL domains connected by a short peptide linker. The linker is too short to form intrachain pairing of VH and VL domains. Instead, two such scFv fragments are co-expressed to form multimers by inter-chain pairing (cross-over pairing) of VH and VL domains.

[0143] As used herein, the term “single-domain antibody” or “sdAb” refers to a single antigen-binding polypeptide having three complementary determining regions (CDRs) . The sdAb alone is capable of binding to the antigen without pairing with a corresponding CDR-containing polypeptide. In some cases, single-domain antibodies are engineered from camelid HCAbs, and their heavy chain variable domains are referred herein as “VHHs” (Variable domain of heavy chain antibody) . Camelid sdAb is one of the smallest known antigen-binding antibody fragments (see, e.g., Hamers-Casterman et al., Nature 363: 446-8 (1993) ; Greenberg et al., Nature 374: 168-73 (1995) ; Hassanzadeh-Ghassabeh et al., Nanomedicine (Lond) , 8: 1013-26 (2013) ) . A basic VHH has the following structure from the N-terminus to the C-terminus: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4, in which FR1 to FR4 refer to framework regions 1 to 4, respectively, and in which CDR1 to CDR3 refer to the complementarity determining regions 1 to 3.

[0144] Each of the antigen-binding fragments maintains the ability to specifically bind to the same antigen to which the full-length antibody binds, and / or compete with the full-length antibody for specific binding to the antigen. An antigen-binding fragment can be obtained from a given antibody (e.g., an intact antibody provided herein) using conventional techniques known to those skilled in the art (e.g., recombinant DNA techniques or enzymatic or chemical cleavage methods) , and can be screened for specificity in the same manner by which intact antibodies are screened.

[0145] As used herein, the terms “mAb” and “monoclonal antibody” refer to an antibody or a fragment of an antibody from a population of highly homologous antibody molecules, i.e., a population of completely identical antibody molecules except for natural mutation that may occur spontaneously. A monoclonal antibody has a high specificity for a single epitope of an antigen. Polyclonal antibody, relative to monoclonal antibody, generally comprises at least two or more different antibodies which generally recognize different epitopes on an antigen.

[0146] Monoclonal antibodies can be obtained by hybridoma technique which relies on fusing B cells from an immunized animal (e.g., mouse) with immortal myeloma cells and growing the cells under conditions in which only the fused cells can survive. The resultant fused cells that grow out are called hybridomas. Each hybridoma makes only one immunoglobulin, derived from one B cell from the immunized animal. The antibodies secreted by many hybridoma clones are screened for binding to the antigen of interest, and the clone with the desired specificity is selected and expanded. The products of these individual clones are monoclonal antibodies, and each monoclonal antibody is specific for a single epitope on the antigen used to immunize the animal.

[0147] Monoclonal antibodies can also be obtained by genetic engineering recombinant techniques. A DNA molecule encoding the heavy chain and light chain genes of a monoclonal antibody can be isolated from a hybridoma cell by PCR amplification using a primer that is specific to the genes. The obtained DNA molecule is inserted into an expression vector, and then transfected into a host cell (such as E. coli cells, COS cells, CHO cells, or other myeloma cells that do not produce immunoglobulin) , and cultured under appropriate conditions, thereby obtaining the desired recombinant antibody.

[0148] As used herein, the term “chimeric antibody” refers to such an antibody wherein a part of its light chain and / or heavy chain is derived from an antibody (which may be originated from a specific species or belongs to a specific antibody type or subtype) , and the other part of its light chain and / or heavy chain is derived from another antibody (which may be originated from an identical or different species or belongs to an identical or different antibody type or subtype) , provided that the antibody still retains the activity of binding to the antigen of interest. For example, the term “chimeric antibody” may include such an antibody (e.g., a human-mouse chimeric antibody) , wherein the heavy chain and light chain variable region of the antibody are from a first antibody (e.g., a mouse antibody) , while the heavy chain and light chain constant region of the antibody are from a second antibody (e.g., a human antibody) .

[0149] The chimeric antibody of the present disclosure can be prepared based on the sequence of the murine monoclonal antibody prepared above. The DNA encoding the heavy and light chains can be obtained from the target murine hybridoma and engineered using standard molecular biology techniques to contain non-mouse (e.g., human) immunoglobulin sequences. To prepare a chimeric antibody, a variable region of murine immunoglobulin can be linked to a constant region of human immunoglobulin using a method known in the art. For example, a DNA encoding VH is operably linked to another DNA molecule encoding heavy chain constant region so as to obtain a full-length heavy chain gene. The sequence of human heavy chain constant region gene is known in the art (see, for example, Kabat, EA et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242) , a DNA fragment containing these regions can be obtained by standard PCR amplification. The heavy chain constant region may be an IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM or IgD constant region, but is generally preferably an IgG (e.g., IgG1 or IgG4) constant region. For example, a DNA encoding VL is operably linked to another DNA molecule encoding light chain constant region CL so as to obtain a full-length light chain gene (as well as a Fab light chain gene) . The sequence of human light chain constant region gene is known in the art (see, for example, Kabat, EA et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, US Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242) , a DNA fragment containing these regions can be obtained by standard PCR amplification. The light chain constant region may be a κ or λ constant region but is generally preferably a κ constant region.

[0150] As used herein, the term "humanized antibody" refers to a genetically engineered non-human antibody of which the amino acid sequence has been modified to increase its homology to the sequence of a human antibody. Generally, all or part of the CDR regions of a humanized antibody are derived from a non-human antibody (donor antibody) , and all or part of the non-CDR regions (e.g., variable region FR and / or constant region) are derived from a human immunoglobulin (receptor antibody) . The humanized antibody typically retains the expected properties of the donor antibody, including, but not limited to, the ability of specifically binding to CD3 (e.g., human CD3) , and the like. The donor antibody can be an antibody of mouse, rat, rabbit, or non-human primate (e.g., cynomolgus monkey) that has the expected properties.

[0151] The humanized antibody of the present disclosure can be prepared based on the sequence of the murine monoclonal antibody prepared above. The DNA encoding the heavy and light chains can be obtained from the target murine hybridoma and engineered using standard molecular biology techniques to contain non-mouse (e.g., human) immunoglobulin sequences. To prepare a humanized antibody, murine CDR regions can be grafted onto a human framework sequence by using any methods known in the art. In case of affinity loss of these straight-graft antibodies, several framework residues can be mutated back to their murine counterparts (i.e., backmutation) to restore the binding affinity of antibody. In the meantime, some CDR residues can also be either mutated to their human counterparts to increase the humanness of the antibody or to some other residues to remove potential post-translational modification spot or both.

[0152] As used herein, the term “specifically bind” or “specifically binding” refers to the binding of two molecules in a non-random manner, such as the reaction between an antibody and the antigen it directs to. As used herein, the term “KD” refers to a dissociation constant of a specific antibody-antigen interaction, which is used to describe the binding affinity of an antibody to an antigen.

[0153] As used herein, a “nucleic acid” is an isolated nucleic acid, for example, an RNA, DNA, or a mixed nucleic acids, which is substantially separated from other genome DNA sequences as well as proteins or complexes such as ribosomes and polymerases, which naturally accompany a native sequence. An “isolated” nucleic acid molecule is one which is separated from other nucleic acid molecules which are present in the natural source of the nucleic acid molecule. Moreover, an “isolated” nucleic acid molecule, such as a cDNA molecule, can be substantially free of other cellular material, or culture medium when produced by recombinant techniques, or substantially free of chemical precursors or other chemicals when chemically synthesized. One or more nucleic acid molecules encoding a chimeric construct as described herein may be isolated or purified. The term embraces nucleic acid sequences that have been removed from their naturally occurring environment, and includes recombinant or cloned DNA isolates and chemically synthesized analogues or analogues biologically synthesized by heterologous systems. A substantially pure molecule may include isolated forms of the molecule.

[0154] As used herein, the term “vector” refers to a nucleic acid vehicle which can have a polynucleotide inserted therein. When the vector allows for the expression of the protein encoded by the polynucleotide inserted therein, the vector is called an expression vector. The vector can have the carried genetic material elements expressed in a host cell by transformation, transduction, or transfection into the host cell. Vectors are well known by a person skilled in the art, including, but not limited to plasmids, phages, cosmids, artificial chromosome such as yeast artificial chromosome (YAC) , bacterial artificial chromosome (BAC) or P1-derived artificial chromosome (PAC) ; phage such as λ phage or M13 phage and animal virus. The animal viruses that can be used as vectors, include, but are not limited to, retrovirus (including lentivirus) , adenovirus, adeno-associated virus, herpes virus (such as herpes simplex virus) , pox virus, baculovirus, papillomavirus, papova virus (such as SV40) . A vector may comprise multiple elements for controlling expression, including, but not limited to, a promoter sequence, a transcription initiation sequence, an enhancer sequence, a selection element, and a reporter gene. In addition, a vector may comprise origin of replication.

[0155] As used herein, the term “host cell” refers to a cell into which a vector can be introduced or transformed, including, but not limited to, prokaryotic cells such as E. coli or Bacillus subtilis, and eukaryotic cells such as mammal cells (e.g., mouse cell or human cell) , insect cells or yeast cells. Suitable eukaryotic cells include, but not limited to, NS0 cells, Vero cells, Hela cells, COS cells, CHO cells, HEK293 cells, BHK cells or MDCKII cells.

[0156] As used herein, the term “identity” refers to the match degree between two polypeptides or between two nucleic acids. When two sequences for comparison have the same monomer sub-unit of base or amino acid at a certain site (e.g., each of two DNA molecules has an adenine at a certain site, or each of two polypeptides has a lysine at a certain site) , the two molecules are identical at the site. The percent identity between two sequences is a function of the number of identical sites shared by the two sequences over the total number of sites for comparison × 100. For example, if 6 of 10 sites of two sequences are matched, these two sequences have an identity of 60%. For example, DNA sequences: CTGACT and CAGGTT share an identity of 50% (3 of 6 sites are matched) . Generally, the comparison of two sequences is conducted in a manner to produce maximum identity. Such alignment can be conducted by using a computer program such as Align program (DNAstar, Inc. ) which is based on the method of Needleman, et al. (J. Mol. Biol. 48: 443-453, 1970) . The percent identity between two amino acid sequences can also be determined using the algorithm of E. Meyers and W. Miller (Comput. Appl. Biosci., 4: 11-17 (1988) ) which has been incorporated into the ALIGN program (version 2.0) , using a PAM120 weight residue table, a gap length penalty of 12 and a gap penalty of 4. In addition, the percentage of identity between two amino acid sequences can be determined by the algorithm of Needleman and Wunsch (J. Mol. Biol. 48: 444-453 (1970) ) which has been incorporated into the GAP program in the GCG software package (available at http:  / / www. gcg. com) , using either a Blossum 62 matrix or a PAM250 matrix, and a gap weight of 16, 14, 12, 10, 8, 6, or 4 and a length weight of 1, 2, 3, 4, 5, or 6.

[0157] As used herein, the term "pharmaceutically acceptable carrier and / or excipient" refers to a carrier and / or excipient that is pharmacologically and / or physiologically compatible with a subject and an active ingredient, which is well known in the art (see, for example, Remington's Pharmaceutical Sciences. Edited by Gennaro AR, 19th ed. Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1995) and includes, but is not limited to: pH adjusting agents, surfactants, adjuvants, ionic strength enhancers, diluents, agents to maintain osmotic pressure, agents to delay absorption, preservatives. For example, pH adjusting agents include, but are not limited to, phosphate buffered saline. Surfactants include, but are not limited to, cationic, anionic or non-ionic surfactants, such as Tween-80. Ionic strength enhancers include, but are not limited to, sodium chloride. Preservatives include, but are not limited to, various antibacterial and antifungal agents, such as parabens, trichloro-t-butanol, phenol, sorbic acid, and the like. Agents to maintain osmotic pressure include, but are not limited to, sugar, NaCl, and the like. Agents to delay absorption include, but are not limited to, monostearate and gelatin. Diluents include, but are not limited to, water, aqueous buffers (e.g., buffered saline) , alcohols and polyols (e.g., glycerol) , and the like. Preservatives include, but are not limited to, various antibacterial and antifungal agents, such as thimerosal, 2-phenoxyethanol, parabens, trichloro-t-butanol, phenol, sorbic acid, and the like. Stabilizers have the meaning commonly understood by those skilled in the art, which can stabilize the desired activity of active ingredient in drug, including but not limited to sodium glutamate, gelatin, SPGA, saccharides (e.g., sorbitol, mannitol, starch, sucrose, lactose, dextran, or glucose) , amino acids (e.g., glutamic acid, glycine) , proteins (e.g., dried whey, albumin, or casein) or degradation products thereof (e.g., lactalbumin hydrolysate) , etc. The pharmaceutically acceptable carrier or excipient may include a sterile injectable liquid (e.g., an aqueous or non-aqueous suspension or solution) . Such sterile injectable liquid may be selected from the group consisting of water for injection (WFI) , bacteriostatic water for injection (BWFI) , sodium chloride solution (e.g., 0.9% (w / v) NaCl) , glucose solution (e.g., 5%glucose) , surfactant-containing solution (e.g., 0.01%polysorbate 20) , pH buffer solution (e.g., phosphate buffer solution) , Ringer's solution, and any combination thereof.

[0158] As used herein, the term “treatment / treating” refers to a method that is carried out in order to obtain a beneficial or desired clinical outcome. For the purpose of the disclosure, the beneficial or desired clinical outcome includes, but is not limited to, easing symptom, narrowing the scope of disease, stabilizing (i.e., not aggravating) the state of disease, delaying or slowing the progress of disease, and alleviating symptoms (either partially or completely) , no matter detectable or not detectable. In addition, “treatment” also refers to a prolonged survival period compared to the expected survival period (if no treatment is accepted) . The beneficial or desired clinical outcome described herein may include, but not limited to, slowing of tumor progression, cancer regression, enhancement of anti-tumor immune response, a reduction in tumor growth or size, necrosis of the tumor, a decrease in severity of at least one disease symptom, an increase in frequency and duration of disease symptom-free periods, a prevention of impairment or disability due to the disease affliction, or otherwise amelioration of disease symptoms in the patient.

[0159] As used herein, the term “subject” refers to any human or non-human animal that receives either prophylactic or therapeutic treatment. The term "non-human animal" includes all vertebrates, e.g., mammals and non-mammals, such as non-human primates, sheep, dog, cow, chickens, amphibians, reptiles, etc.

[0160] As used herein, the term “an effective amount” refers to an amount that is sufficient to achieve or at least partially achieve the expected effect. For example, an effective amount for treating a disease refers to an amount effective for curing or at least partially blocking a disease and its complication in a patient having the disease. The determination of such an effective amount is within the ability of a person skilled in the art. For example, an amount effective for a therapeutic use depends on severity of a disease to be treated, general state of the immune system in a patient, general conditions of a patient, such as age, weight and gender, administration routes of drugs, additional therapies used simultaneously, and the like.

[0161] As used herein, the term "effector function" refers to those biological activities attributable to the Fc region of an antibody (Fc region of a natural sequence or an amino acid sequence variant) , which varies as the isotype of an antibody. Examples of antibody effector functions include, but are not limited to, Fc receptor binding affinity, antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC) , complement dependent cytotoxicity (CDC) , antibody-dependent cellular phagocytosis (ADCP) , downregulation of cell surface receptors (e.g., B cell receptors) , B cell activation, cytokine secretion, half-life / clearance of antibodies and antigen-antibody complexes, and the like. Methods for altering the effector function of an antibody are known in the art, for example by introducing a mutation in the Fc region.

[0162] As used herein, the term "antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC) " refers to a form of cytotoxicity, in which cytotoxic effector cells specifically bind to the target cells to which the antigen is attached, through the binding of Ig to an Fc receptor (FcR) presented on cytotoxic cells (e.g., natural killer (NK) cells, neutrophils or macrophages) , and then kills the target cells by secreting cytotoxins.

[0163] As used herein, the term "tumor" or “cancer” refers to a large group of diseases characterized by the uncontrolled growth of abnormal cells in the body. Unregulated cell division may lead to the formation of malignant tumors or cells that invade adjacent tissues, and may metastasize to distant parts of the body through the lymphatic system or bloodstream. Tumors include benign and malignant cancers as well as dormant tumors or micrometastasis. Tumors also include hematological malignancies.

[0164] EXAMPLES

[0165] The examples provided below are for purposes of illustration only, and are not intended to be limiting unless otherwise specified. Thus, the disclosure should in no way be construed as being limited to the following examples, but rather, should be construed to encompass any and all variations which become evident as a result of the teaching provided herein.

[0166] EXAMPLE 1: Anti-CD3 Antibody Generation and Characterization

[0167] One camel was successively immunized with human CD3 antigens in different forms under all current animal welfare regulations. For DNA immunization, pcDNA3.4-human CD3δ (NM_000732.6, SEQ ID NO: 1) and pcDNA3.4-human CD3ε (NM_000733.4, SEQ ID NO: 2) were mixed in equal amount and delivered by electroporation. For protein immunization, Fc fused N terminal peptide of the mature human CD3ε (SEQ ID NO: 3) or 6xHis tagged human CD3ε protein (ACRO, Cat. #CDE-H5223) was formulated as an emulsion with incomplete Freund's adjuvant (IFA) . The antigen emulsion was administered by double-spot injections intramuscularly at the neck. The animal received 4 injections of the 2 mg plasmid mixture and 7 subsequent emulsion injections containing 200 μg of Fc fused N terminal peptide or 100 μg of 6xHis tagged human CD3ε protein at weekly intervals.

[0168] Three days after the final boost, 150 mL blood sample was collected from the camel. About 3×108 peripheral blood lymphocytes (PBLs) , as the genetic source of the heavy chain immunoglobulins, were isolated from the blood.

[0169] Total RNA was extracted from lymphocytes of the immunized camel using  Reagent. cDNA was synthesized based on RNA template using PRIMESCRIPTTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit with an oligo (dT) 20 primer. DNAs encoding VHH were amplified from camel cDNA, purified and inserted into GenScript’s in house phagemid vector (see Figure 1 of Patent No. US20170089914A1) . The ligation product was used to transform SS320 electrocompetent cells. The resulting sdAb libraries were supplemented with 20%glycerol and stored at -80℃.

[0170] The sdAb phage libraries were rescued and stored after filter sterilization at 4℃ for further use. Binders were isolated from the above-mentioned phage libraries using protein-based panning as well as cell-based panning. At least two rounds of panning were carried out for both protein-and cell-based panning approaches using both libraries until the percentage of CD3-specific phage clones reached 30%. Total number of output clones, percentage of CD3 positive clones evaluated by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and sequence diversity of CD3-specific clones of the output phage were assessed. Based on these results the best panning outputs were selected for subsequent high-throughput screening.

[0171] The selected output phages were used to infect exponentially growing E. coli cells. The double-strand DNA of the output was extracted. The sdAb inserts were cut from the phagemid vector and inserted into an antibody fragment expression vector for high-throughput screening. The resulting plasmid was used to transform exponentially growing E. coli cells, which were then plated and grown overnight at 37℃. Thousands of colonies were picked individually and grown in 96 deep well plates containing 1 mL 2YT medium. The expression of antibody fragment was induced by adding 1.0 mM IPTG. The sdAb proteins in the supernatant were analyzed for their ability to bind to human and cynomolgus CD3δε proteins (ACRO, Cat. # CDD-C52W4) by ELISA and CD3 expressing cell line Jurkat, Clone E6-1 (American Type Culture Collection   TIB-152TM) by FACS. The positive binder with unique sequence was selected for further characterization (Table 1) . The IDs of full-length VHH and CDR sequences were listed in Table 2. The CDRs were defined according to AbM numbering system.

[0172] Table 1. Anti-CD3 antibody binding to recombinant CD3 proteins and Jurkat cell

[0173] Table 2. Camel anti-CD3 antibody sequence IDs

[0174]

[0175] EXAMPLE 2: Generation of CD33 Targeting BiTE-HLE

[0176] To test the binding affinity and functional activity of selected anti-CD3 antibody, the camel anti-CD3 sdAb was assembled into CD33 targeting half-life extended (HLE) bispecific T-cell engager (BiTE) molecules. BiTE-HLE comprises three functional moieties: from N-terminal to C-terminal, the first moiety is the scFv (SEQ ID NO: 9) targeting CD33 derived from AMG 330 for antigen recognition, the second moiety is a sdAb obtained in Example 1, which targets human CD3ε for T cell engaging, the third moiety is a single chain human crystalizable fragment (SEQ ID NO: 10) for antibody half-life extension in vivo containing mutations to minimize antibody-mediated effector functions. Wherein, the first moiety and the second moiety are linked by a linker (SEQ ID NO: 8) . One BiTE-HLE molecule was produced by FreeStyle 293-F cells and purified using Protein A Agarose column (Genscript, Cat. #L00464) , followed by size-exclusion chromatography (Citiva,  16 / 600  200 pg, Cat. #GE28-9893-35) .

[0177] EXAMPLE 3: Affinity Determination of BiTE-HLE to Human and Cynomolgus CD3δε Proteins

[0178] The binding affinity of selected BiTE-HLE molecule to human and cynomolgus CD3δε proteins was determined by surface plasmon resonance (SPR) on a BIAcore T200 instrument (GE Healthcare) . The experiment was carried out as follows: Recombinant human or cynomolgus CD3δε heterodimer protein was covalently immobilized on a CM5 sensor chip using amine coupling method. Increasing concentrations, ranging from 5 nM to 640 nM, of selected BiTE-HLE molecule were injected over the CD3δε heterodimer surface and were allowed to bind the antibody for 100 seconds followed by injection of running buffer to allow dissociation of the complex for 300 seconds. After each cycle the surfaces were regenerated by an injection of 10 mM glycine-HCl buffer pH2.0. On-rate (ka) and off-rate (kd) were calculated based on association and dissociation curve and were used to calculate the equilibrium dissociation constant (KD) . The affinity data were summarized in Table 3.

[0179] Table 3. Binding affinity of purified BiTE-HLE protein to human and cynomolgus CD3δε

[0180] EXAMPLE 4: CD33-Targeting BiTE-HLE Redirected Tumor Cell Killing

[0181] Redirected T-cell cytotoxicity was assessed by flow cytometry using human pan-T cells as effector cells and CD33+ human AML cell line, THP-1, as target cells. Briefly, human Pan-T cells were isolated from human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) using Pan T Cell Isolation Kit (Miltenyi Biotec, Cat. #130-096-535) . THP-1 cells were labeled with CellTraceTM Violet (Thermo Fisher Scientific, Cat. #C34557) and were plated in round-bottom 96-well plates (1×105 tumor cells / well) with pan-T cells at 2: 1 effector-to-target ratio (E: T = 2: 1) . A serial 5x dilutions of BiTE-HLE molecules were added to cells and incubated at 37℃ for 48 hours. Cell lysis was assessed by flow cytometry as loss of target-cell membrane integrity, which is reflected by nuclear uptake of propidium iodide (Sigma, Cat. #P4170-10MG) . Activation of pan-T cells was reflected by CD25 and CD69 surface expression using an APC / CY7 conjugated anti-CD25 and PE conjugated anti-CD69 antibodies. Samples were analyzed by flow cytometry on BD FACSCelestaTM Flow Cytometer and data were processed using the BD FACS Diva software version 8.0.1.1.

[0182] To quantify BiTE-HLE-induced cytokine release, cytokine levels of supernatants were determined using the human IFN-γ, human TNF-α and human IL2 quantification kits (Cisbio, Cat. #62HIFNGPEH, 62HTNFAPEH and 62HIL02PEH, respectively) following the manufacturer’s protocols.

[0183] The functional activity of selected BiTE-HLE molecule was summarized in FIG. 1 and Table 4. CD33xAS39678-BiTE-HLE molecule induced pan-T cell activation and show well killing efficacy against CD33-expressing THP-1.

[0184] Table 4. BiTE-HLE redirected tumor cell killing, T cell activation and cytokine release

[0185] EXAMPLE 5: Humanization of Anti-CD3 Antibody Fragments

[0186] Humanization of the camel antibody was performed using CDR grafting method (Winter G, Harris WJ 1993) . The VHH sequence of the selected camel antibody was BLASTed against NCBI human germline V gene database so human VH germline sequence with the highest identity to camel antibody (i.e. human acceptor) was identified. In the CDR grafting approach, CDRs of the human acceptors were replaced by those of the camel antibody, which makes the straight-graft sequences. Straight-graft antibody usually loses binding activity, which needs to be restored by replacing the framework residues that are critical for the activity of the antibody with camel residues. A series of humanized variants were designed using this method (Table 5) .

[0187] Table 5. Humanized anti-CD3 VHH antibody and CDR sequence IDs

[0188] The camel and humanized VHH sequences were used to construct heavy chain only antibodies (HCAbs) . Heavy chain plasmids were prepared and used to transfected HEK293 cells. Supernatants of transfected HEK293 cells were collected and were subjected to SPR assay on a BIAcore T200 instrument. The SPR assay was carried out as follows: antibodies secreted to the medium were captured onto the sensorchip pre-coated with goat-anti-human pAb (Jackson ImmunoResearch, Cat. #109-005-098) through the interaction between polyclonal antibody and human Fc. Increasing concentrations (ranging from 2.5 nM to 1.28 μM) of human CD3δε were injected over the sensorchip surface and were allowed to bind the captured anti-CD3 antibody for 100 s followed by injection of the running buffer to allow dissociation of the complex. Steady-state model was used to fit experimental data. After humanization, a series of humanized antibodies were generated (Table 6) .

[0189] Table 6. Binding affinity and humanness of humanized clones

[0190] SEQUENCES

Claims

1.An anti-CD3 (Cluster of differentiation 3) single domain antibody (sdAb) or antigen binding fragment thereof comprising a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of the CDR1, CDR2, and CDR3, respectively, as set forth in SEQ ID NO: 4.2.The anti-CD3 sdAb or antigen binding fragment thereof of claim 1, wherein the CDR1, CDR2 and / or CDR3 are determined according to the AbM numbering scheme, the IMGT numbering scheme, the Kabat numbering scheme, the Chothia numbering scheme, the Contact numbering scheme, or any combination thereof.3.The anti-CD3 sdAb or antigen binding fragment thereof of claim 1 or 2, wherein the CDR1, CDR2 and / or CDR3 are determined according to the AbM numbering scheme.4.An anti-CD3 sdAb or antigen binding fragment thereof comprises a CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, a CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, and a CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7.5.The anti-CD3 sdAb or antigen binding fragment thereof of any one of claims 1-4, further comprising framework regions (FRs) .6.The anti-CD3 sdAb or antigen binding fragment thereof of claim 5, wherein the framework regions are derived from a human immunoglobulin heavy chain variable region sequence.7.The anti-CD3 sdAb or antigen binding fragment thereof of any one of claims 1-6, wherein the sdAb or antigen binding fragment thereof comprises the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 4, 11, 12, 13, 14, 15, and 16, or an amino acid sequence having at least 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%sequence identity to the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 4, 11, 12, 13, 14, 15, and 16.8.The anti-CD3 sdAb or antigen binding fragment thereof of any one of claims 1-7, wherein the sdAb or antigen binding fragment thereof is fused to an Fc fragment via an optional linker.9.A bispecific or multispecific antibody, comprising the anti-CD3 sdAb or antigen binding fragment thereof of any one of claims 1-8, wherein the bispecific or multispecific antibody further comprises a second antibody moiety specifically recognizing a second antigen.10.The bispecific or multispecific antibody of claim 9, wherein the second antigen is selected from the group consisting of CD33, CD19, CD20, CD22, CD30, CD70, CLL-1, BCMA, DLL-3, Claudin 6, Claudin 18.2, GPC3, GPC2, GPRC5D, CD229, FcRH5, GUCY2C, mesothelin, HER2, PSMA, and PSCA.11.The bispecific or multispecific antibody of claim 9 or 10, wherein the bispecific or multispecific antibody comprises: (a) a first component comprising an antibody or antigen binding fragment thereof that binds to CD33, and (b) a second component comprising the anti-CD3 sdAb or antigen binding fragment thereof of any one of claims 1-8.12.The bispecific or multispecific antibody of claim 11, wherein the bispecific or multispecific antibody further comprises (c) a third component for antibody half-life extension.13.A nucleic acid, comprising a nucleotide sequence encoding the anti-CD3 sdAb or antigen binding fragment thereof of any one of claims 1-8, or the bispecific or multispecific antibody of any one of claims 9-12.14.A vector, comprising the nucleic acid of claim 13.15.A host cell, comprising the nucleic acid of claim 13 or the vector of claim 14.16.A pharmaceutical composition, comprising the anti-CD3 sdAb or antigen binding fragment thereof of any one of claims 1-8, the bispecific or multispecific antibody of any one of claims 9-12, or the nucleic acid of the claim 13, or the vector of the claim 14, or the host cell of the claim 15, and a pharmaceutically acceptable carrier and / or excipient.17.A method for preventing and / or treating a disease or disorder in a subject, the method comprising administering to a subject in need thereof an effective amount of the anti-CD3 sdAb or antigen binding fragment thereof of any one of claims 1-8, the bispecific or multispecific antibody of claim 9-12, or the pharmaceutical composition of claim 16.18.The method of claim 17, wherein the disease or disorder is autoimmune disease or cancer.19.The method of claim 17 or 18, wherein the subject is a mammal, such as a human.

Images