Systems and methods for assessing cell layer integrityand screening ophthalmic formulations or devices

Abstract

The present invention provides a method for assessing cell layer integrity and screening ophthalmic formulations or devices using an in vitro dry eye disease model. The method comprises the steps of applying the ophthalmic formulation or device to a dry eye disease model either before or after stress induction, and comparing the resulting morphological indices and integrity metrics with those of untreated control models to evaluate the protective or restorative efficacy of the formulation or device.

Description

SYSTEMS AND METHODS FOR ASSESSING CELL LAYER INTEGRITYAND SCREENING OPHTHALMIC FORMULATIONS OR DEVICESInventors: Chau-Minh PHAN; Brandon HO; Ka-Ying WONG; and Liping ZHOUCross-Reference to Related Applications:

[0001] The present application claims priority from U.S. Provisional Utility Patent application no. 63 / 743,219 filed January 08, 2025; the disclosure of which is incorporated herein by reference in its entirety.Field of the Invention:

[0002] The present invention generally relates to the field of ophthalmolog. More specifically the present invention relates to methods and systems for assessing cell layer integrity and screening ophthalmic formulations or devices using a dry eye disease model that simulates desiccation and hyperosmolar stress conditions in ocular surface cells.Background of the Invention:

[0003] Dry eye disease affects more than 344 million people worldwide, and its prevalence continues to rise annually. The condition leads to desiccating stress and elevated salt concentrations (hyperosmolarity) on the ocular surface, resulting in patient discomfort and potential complications such as infection and inflammation.

[0004] Current treatments for dry eye, including artificial tears, ophthalmic lubricants, and eye drops, provide temporary relief but often fail to address underlying stress on ocular surface cells. In vitro cell-based evaluation methods offer valuable insights into how ophthalmic formulations or devices interact with ocular tissues, thereby guiding and accelerating research and development toward more effective products.

[0005] Conventional assays, such as cell viability assays, assess only whether cells remain alive or dead by measuring metabolic activity. However, such assays cannot capture sub-lethal cellular stress responses that occur under desiccating or hyperosmotic conditions. In these cases, cells may remain viable but experience impaired physiological function, which is not reflected in standard viability measurements.

[0006] The integrity of the cell layer is a key indicator of tear film stability, as a smooth and continuous epithelial surface is essential for maintaining ocular health. Disruptions in this cell layer contribute to tear film instability, a common feature of dry eye disease that can be clinically detected using non-invasive tear breakup time or fluorescein staining tests.

[0007] Accordingly, there remains a need for an advanced in vitro analytical method capable of evaluating cell layer integrity and detecting subtle cellular stress responses beyond basic viability. Such a model would enable a more comprehensive assessment of the effectiveness of ophthalmic formulations and devices in maintaining or restoring ocular surface health. The present invention addresses this need.Summary of the Invention:

[0008] It is an objective of the present invention to provide methods and systems to solve the aforementioned technical problems.

[0009] In accordance with a first aspect of the present invention, a method for assessing cell layer integrity and screening ophthalmic formulations or devices utilizing an in vitro dry eye disease model. Specifically, the method includes the following steps: establishing a dry eye disease model comprising a cultured cell layer; inducing a dry eye condition in the dry eye disease model; capturing time-lapse, cell-level images of the dry eye disease model for quantifying real-time cellular changes, wherein the real-time cellular changes comprise measurements of cell size, cell shape, and morphology indices; measuring a disruption and regeneration rate of the cultured cell layer by calculating changes in surface area coverage over time; and generating an indication of morphology indices and layer integrity metrics changes based on the measurements.

[0010] The method further includes applying an ophthalmic formulation or placing an ophthalmic device onto the dry eye disease model before or after the induction of the dry eye condition to evaluate the intervention of the ophthalmic formulation or device, and comparing the resulting morphology indices and layer integrity metrics with those of an untreated dry eye disease model to evaluate the protective or restorative efficacy of the ophthalmic formulation or device.

[0011] In accordance with another embodiment, inducing the dry eye condition includes the steps of: culturing ocular surface cells under standard conditions; subjecting the ocular surface cells to a desiccation stress condition or a hyperosmolar stress condition; and returning the ocular surface cells to standard conditions to obtain the dry eye disease model.

[0012] In accordance with yet another embodiment, the ocular surface cells comprise human corneal epithelial cells (HCECs) , keratocytes, corneal endothelial cells, conjunctival epithelial cells, or goblet cells.

[0013] In accordance with yet another embodiment, the standard culture conditions comprise a temperature of 35-37℃, a CO2 concentration of approximately 5%, and a humidity above 80%.

[0014] In accordance with yet another embodiment, the desiccation stress condition comprises culturing the ocular surface cells under humidity of 10-50%for 5-20 minutes.

[0015] In accordance with yet another embodiment, the hyperosmolar stress condition comprises culturing the ocular surface cells under an osmolarity of 350-550 mOsm.

[0016] In accordance with yet another embodiment, the ocular surface cells are genetically modified to express fusion-tagged proteins for fluorescence imaging to facilitate real-time tracking of morphological and subcellular changes.

[0017] In accordance with yet another embodiment, the regenerative capacity of the cell layer is evaluated by measuring the rate of surface area restoration following injury, with temporal comparisons of morphology indices and integrity metrics to determine treatment efficacy.

[0018] In accordance with yet another embodiment, the morphology indices are computed using a custom algorithm based on pixel intensity segmentation and normalized measurements of cell area and perimeter.

[0019] In accordance with yet another embodiment, the morphology indices are correlated with trans-epithelial electrical resistance (TEER) values to provide a combined indicator of epithelial barrier integrity.

[0020] In accordance with yet another embodiment, the ophthalmic formulation comprises a tear film stabilizer, osmoprotectant, lubricant polymer, or anti-inflammatory compound.

[0021] In accordance with yet another embodiment, the ophthalmic device comprises a hydrogel contact lens, ocular insert, or bioresorbable patch containing a moisturizing or bioactive agent.

[0022] In accordance with a second aspect of the present invention, a system for assessing cell layer integrity and screening ophthalmic formulations or devices is provided. Particularly, the system includes the following components: a cell culture chamber comprising a dry eye disease model with a cell layer and a stress induction module, in which the dry eye disease model is established by: culturing ocular surface cells under standard conditions; subjecting the ocular surface cells to a desiccation stress condition or a hyperosmolar stress condition; and returning the ocular surface cells to standard conditions to obtain the dry eye disease model; an imaging system comprising brightfield and fluorescence imaging capabilities and live-cell imaging chambers configured to acquire time-lapse images of the dry eye disease model at intervals of 5 minutes to 5 hours; a computational analysis unit configured to perform real-time segmentation of the time-lapse images and quantify cellular morphology, size, shape, and morphology indices; and an integrity measurement module configured to analyze surface area disruptions and regeneration over time of the cell layer and provide quantitative metrics for evaluating treatment efficacy.

[0023] In accordance with one embodiment, the integrity measurement module provides a graphical user interface displaying temporal plots of morphology indices, recovery rates, and layer integrity scores for each treatment condition.

[0024] In accordance with another embodiment, the stress induction module is configured to control environmental parameters including humidity, temperature, osmolarity, and CO2 concentration to reproduce dry eye conditions.

[0025] In accordance with yet another embodiment, the system further includes a data storage module configured to record and archive image data, computed morphology indices, and corresponding treatment metadata.

[0026] In accordance with yet another embodiment, the imaging system is configured to simultaneously acquire brightfield and fluorescence images for co-registration and multimodal analysis.

[0027] In accordance with yet another embodiment, the ocular surface cells comprise HCECs, keratocytes, corneal endothelial cells, conjunctival epithelial cells, or goblet cells.

[0028] In accordance with yet another embodiment, the desiccation stress condition comprises culturing the ocular surface cells under humidity of 10-50%for 5-20 minutes.

[0029] In accordance with yet another embodiment, the hyperosmolar stress condition comprises culturing the ocular surface cells under an osmolarity of 350-550 mOsm.Brief Description of the Drawings:

[0030] Embodiments of the invention are described in more details hereinafter with reference to the drawings, in which:

[0031] FIGs. 1A-1B depict the models of simulating dry eye conditions using desiccation (FIG. 1A) and high osmolarity (FIG. 1B) conditions;

[0032] FIGs. 2A-2C depict an example of changes in cell morphology over time and how to utilize the image data to generate a morphology index;

[0033] FIG. 3 depicts, in accordance with one embodiment of the present invention, a method for assessing the disruption or breakage of cell layer integrity;

[0034] FIGs. 4A-4E depict that biocompatible ATS products can affect HCEC cell morphology, in which: FIG. 4A depicts the cell viability of HCECs following 15-minute treatment with PBS control and indicated ATS products; FIG. 4B depicts the representative brightfield time-lapse micrographs of HCECs during treatment with PBS control or OPTASE Intense with arrows indicating cells that are undergoing significant cellular morphology changes during exposure to the ATS product; FIG. 4C depicts the computational quantification cellular length changes during incubation with ATS products of interest; FIG. 4D depicts the distributions and boxplots of HCEC cell lengths with and without treatment with the indicated ATS products of interest; and FIG. 4E shows the representative images of HCECs and their cellular morphology before and after desiccation conditions (low humidity, 45%) with and without pre-treatment of indicated ATS products;

[0035] FIGs. 5A-5D depict that ATS products protect HCECs from desiccation-induced stress, in which: FIG. 5A depicts the experimental workflow for establishing desiccation stress as an in vitro model of DED; FIG. 5B shows HCEC viability in cells that do not receive ATS pre-treatment and are incubated under low-humidity conditions (45%relative humidity) for varying durations ranging from 1 to 10 minutes with open circles indicating individual biological replicate measurements; FIG. 5C shows the quantified cell viability before and after desiccation stress, comparing cells with and without pre-treatment using the indicated ATS products, with open circles below the graph denoting cells maintained under hydrated conditions (no desiccation stress) , whereas closed circles representing cells subjected to 5 minutes of desiccation at 37℃ and 5%CO2; and FIG. 5D depicts the HCEC viability before and after the 5-minute desiccation challenge, with and without ATS pre-treatment, and the quantification of the effect of the specified number of PBS wash steps applied after ATS treatment and prior to low-humidity exposure;

[0036] FIGs. 6A-6E depict that ATS products provide protective effects to HCECs under hyperosmotic stress, in which: FIG. 6A depicts the experimental workflow for inducing desiccation stress as an in vitro model of DED; FIG. 6B shows the viability of HCECs that do not undergo pre-treatment with the indicated ATS products and are subsequently exposed to low-, medium-, or high-salt hyperosmotic conditions for 16-24 hours at 37℃ with 5%CO2; FIG. 6C depicts the representative brightfield micrographs of HCECs cultured as a monolayer under standard conditions (left) and under hyperosmolar stress with or without ATS pre-treatment (right) with the dotted lines highlighting regions within the monolayer where visible gaps form due to structural disruption; FIG. 6D shows the quantification percentage of the microscope field of view occupied by HCECs in each treatment condition relative to untreated controls; and FIG. 6E depicts the total area (in pixel2) corresponding to gaps or monolayer breakage under hyperosmolar stress for the indicated treatment conditions.Detailed Description:

[0037] In the following description, the methods and / or systems of assessing cell layer integrity and screening ophthalmic formulations or devices and the likes are set forth as preferred examples. It will be apparent to those skilled in the art that modifications, including additions and / or substitutions may be made without departing from the scope and spirit of the invention. Specific details may be omitted so as not to obscure the invention; however, the disclosure is written to enable one skilled in the art to practice the teachings herein without undue experimentation.

[0038] As used herein, the term “dry eye disease model” refers to an in vitro or ex vivo biological system designed to replicate one or more pathological conditions associated with dry eye disease (DED) . The model mimics the physiological and cellular stress conditions that occur on the ocular surface of patients with dry eye, including but not limited to desiccation stress, hyperosmolarity, tear film instability, and epithelial barrier disruption.

[0039] As used herein, the term “morphology indices” refers to quantitative descriptors derived from image-based cellular analysis that characterize the geometric and structural features of individual cells or a confluent cell layer. These indices may include, but are not limited to, parameters such as average cell area, perimeter, aspect ratio, circularity, solidity, elongation, and orientation uniformity. Morphology indices may further include derived metrics calculated from these parameters, such as the variance of cell size distribution or the ratio of cell perimeter squared to cell area. In some embodiments, morphology indices are computed using a custom image-processing algorithm based on pixel intensity segmentation and shape recognition, allowing precise quantification of cellular responses such as contraction, elongation, spreading, or detachment under stress or treatment conditions. These indices collectively serve as sensitive indicators of cellular health, cytoskeletal organization, and epithelial barrier integrity.

[0040] As used herein, the term “disruption and regeneration rate” refers to a time-dependent quantitative measure describing the degree and speed of structural damage and subsequent recovery within a confluent cellular monolayer. The disruption rate may be determined by calculating the percentage loss of cell coverage area within a defined region of interest following induction of stress (e.g., desiccation or hyperosmotic stress) , whereas the regeneration rate reflects the percentage recovery of that coverage area over a defined time interval under restorative or treatment conditions. The disruption and regeneration rate can be computed from sequential image frames captured in time-lapse microscopy by tracking changes in pixel-classified cell-covered versus cell-free regions. These rates provide objective indicators of epithelial resilience, barrier restoration kinetics, and the effectiveness of ophthalmic formulations or devices in maintaining or promoting ocular surface integrity.

[0041] As used herein, the term “layer integrity metrics” refers to a composite set of quantitative parameters representing the overall structural and functional integrity of a cellular monolayer in the in vitro dry eye disease model. These metrics may include cell coverage ratio, continuity index (proportion of connected cell-covered area) , mean morphology index, and correlation with biophysical properties such as trans-epithelial electrical resistance (TEER) . In some embodiments, the layer integrity metrics are generated by integrating morphological, temporal, and electrical data into a unified numerical or graphical output that reflects the degree of epithelial damage, repair, and barrier function. Layer integrity metrics thus serve as standardized indicators for comparing untreated and treated models, enabling the quantitative evaluation of the protective or regenerative efficacy of ophthalmic formulations or devices.

[0042] In accordance with a first aspect of the present invention, a method for assessing cell layer integrity and screening ophthalmic formulations or devices by utilizing an in vitro dry eye disease model is provided. The method begins with the establishment of a dry eye disease model including a cultured cell layer representative of the human ocular surface. Once the cell layer is established under standard culture conditions, a dry eye condition is induced within the model. The induction of the dry eye condition may be achieved by exposing the cells to desiccation stress or hyperosmolar stress to simulate tear film instability and dehydration observed in clinical dry eye disease.

[0043] To establish the model, ocular surface cells-such as HCECs, keratocytes, corneal endothelial cells, conjunctival epithelial cells, or goblet cells-are cultured under standard conditions, typically at 35-37℃, with 5%CO2 and humidity above 80%. The culture medium can include DMEM / F12, keratinocyte serum-free medium, or other appropriate formulations supplemented with fetal bovine serum and antibiotics. Once the cells form a confluent monolayer, they are subjected to controlled dry eye–inducing conditions. In one embodiment, a desiccation stress condition is created by exposing the cultured cells to a low-humidity environment ranging from 10%to 50%for 5-20 minutes. Alternatively, a hyperosmolar stress condition is achieved by culturing the cells in media adjusted to an osmolarity of 350-550 mOsm, typically by adding sodium chloride. After the exposure period, the cells are returned to the standard culture environment, thereby generating an in vitro dry eye disease model suitable for analysis.

[0044] In certain embodiments, the ocular surface cells may be genetically modified to express fluorescent or luminescent fusion-tagged proteins, enabling real-time visualization of subcellular processes such as cytoskeletal rearrangement, tight junction integrity, or apoptosis under dry eye stress. This facilitates live-cell imaging and tracking of morphological changes, providing high-resolution temporal data on cellular adaptation and recovery dynamics.

[0045] Time-lapse imaging is then employed to capture cell-level changes within the model. Using automated microscopy systems, brightfield and fluorescence images are recorded at defined intervals-typically every 5 minutes to 5 hours-over the course of the experiment. The captured images are analyzed to quantify cellular parameters including cell size, shape, and morphology indices. Morphology indices are computed using custom-developed image-processing algorithms based on pixel intensity segmentation and normalized geometric measurements, such as cell area-to-perimeter ratios. These indices reflect alterations in cell structure and are correlated with physiological indicators of ocular surface health.

[0046] Disruptions and regeneration of the cell layer are measured by calculating changes in surface area coverage over time. When the epithelial monolayer is damaged by desiccation or hyperosmotic stress, gaps or discontinuities appear, indicating compromised barrier integrity. The rate at which these gaps are repaired during recovery provides a quantitative measure of regenerative capacity. By comparing treated and untreated samples, the system can determine how effectively a given ophthalmic formulation or device restores normal morphology and confluence. For instance, the regenerative capacity of the cell layer can be quantified as the rate of surface coverage restoration following injury, with temporal comparisons of morphology indices and integrity metrics serving as indicators of treatment efficacy.

[0047] In some embodiments, morphology indices are correlated with electrophysiological data such as TEER to provide a combined assessment of epithelial barrier function. TEER values offer an independent measure of cell-cell junction integrity, and their correlation with morphological parameters enhances the accuracy of the overall analysis.

[0048] The method further includes applying an ophthalmic formulation or placing an ophthalmic device, such as a hydrogel insert or contact lens, onto the dry eye disease model either before or after the induction of the dry eye condition. The effects of such interventions are determined by comparing morphology indices and integrity metrics obtained from treated samples with those of untreated dry eye disease controls. This comparison enables evaluation of the protective or restorative efficacy of the ophthalmic formulation or device, providing a reproducible and quantitative framework for therapeutic screening.

[0049] Representative ophthalmic formulations include tear film stabilizers, osmoprotectants, lubricant polymers, or anti-inflammatory compounds. Ophthalmic devices suitable for testing include hydrogel contact lenses, ocular inserts, and bioresorbable patches that contain moisturizing or bioactive agents. The model thereby enables comparative evaluation of pharmacological and device-based interventions under identical experimental conditions.

[0050] By integrating time-lapse imaging, computational morphology analysis, and regenerative capacity measurements, the present invention provides a robust and quantitative framework for assessing ocular surface health. This in vitro method captures subtle cellular stress responses beyond viability, accurately modeling the pathophysiology of dry eye disease. The resulting data enable objective comparison of therapeutic performance across candidate ophthalmic products, reducing reliance on animal models and accelerating the development of next-generation dry eye treatments.

[0051] In accordance with a second aspect of the present invention, a system for assessing cell layer integrity and screening ophthalmic formulations or devices under simulated dry eye conditions is provided. The system integrates a biological model, imaging and analytical components, and computational modules into a unified platform designed to evaluate ocular surface health and therapeutic efficacy with high precision and reproducibility.

[0052] In one embodiment, the system includes a cell culture chamber having a dry eye disease model established with a confluent cell layer of ocular surface cells. The chamber includes a stress induction module that allows controlled simulation of dry eye conditions. The dry eye disease model is generated by first culturing ocular surface cells under standard physiological conditions, including a temperature range of 35-37℃, a CO2 concentration of approximately 5%, and humidity maintained above 80%. Once the cells form a stable epithelial monolayer, they are subjected to one or more stress conditions. These stress conditions can include a desiccation stress condition, wherein the cells are cultured under low humidity between 10-50%for a period of 5-20 minutes, or a hyperosmolar stress condition, in which the culture medium is adjusted to a hyperosmolar range of 350-550 mOsm. Following exposure, the ocular surface cells are returned to the standard culture conditions, thus establishing a reproducible in vitro dry eye disease model. The ocular surface cells suitable for this model include, but are not limited to, HCECs, keratocytes, corneal endothelial cells, conjunctival epithelial cells, and goblet cells.

[0053] The stress induction module within the culture chamber is equipped to precisely regulate environmental parameters such as humidity, temperature, osmolarity, and CO2 concentration, ensuring stable and repeatable experimental conditions. This feature allows accurate reproduction of various stages of dry eye pathophysiology, from mild tear film instability to severe epithelial desiccation and barrier disruption.

[0054] The system further includes an imaging system configured with both brightfield and fluorescence imaging capabilities, as well as live-cell imaging chambers. This imaging system enables acquisition of time-lapse images of the dry eye disease model at intervals ranging from 5 minutes to 5 hours. By capturing cellular and subcellular dynamics under controlled environmental conditions, the imaging system provides continuous visual data on the cell layer’s morphology, integrity, and recovery behavior. In some embodiments, the imaging system is capable of simultaneously acquiring brightfield and fluorescence images, allowing multimodal analysis and co-registration of morphological and biochemical signals.

[0055] A computational analysis unit is also included in the system and is configured to perform real-time image segmentation and quantitative analysis of cellular parameters. The computational unit extracts and quantifies features such as cell morphology, size, shape, and derived morphology indices from the time-lapse images. Advanced algorithms are implemented to process pixel-level data, segment individual cells, and track their morphological evolution over time. These quantitative outputs serve as digital biomarkers for assessing stress response and recovery efficiency in the cell layer.

[0056] Complementing the analysis unit is an integrity measurement module, which evaluates surface area disruptions and regeneration in the epithelial layer. The module calculates changes in surface coverage over time to determine the extent of damage caused by the dry eye conditions and the rate of cellular regeneration. From these measurements, the module generates quantitative metrics such as morphology indices, recovery rates, and layer integrity scores that reflect the performance of tested ophthalmic formulations or devices. In certain embodiments, the integrity measurement module provides an interactive graphical user interface (GUI) that displays temporal plots of morphology indices, recovery trends, and integrity scores for each treatment condition. This interface allows real-time visualization of data and comparative analysis among multiple experimental groups.

[0057] Additionally, the system may include a data storage module configured to record, archive, and manage experimental datasets. The stored data can include raw and processed image files, computed morphology indices, treatment metadata, and environmental condition logs. This allows traceability, long-term data management, and large-scale cross-experiment analysis for drug screening or device validation studies.

[0058] Through the integration of biological modeling, automated imaging, computational quantification, and data management, the present system provides a robust, scalable, and quantitative tool for evaluating ophthalmic formulations and devices. It enables high-throughput and physiologically relevant screening of treatments for dry eye disease, offering objective, reproducible metrics for cell layer integrity, morphology, and recovery kinetics. The system’s modular design allows adaptation to different ocular cell types and environmental stimuli, providing a versatile platform for preclinical evaluation of next-generation dry eye therapeutics and bio-interactive ophthalmic devices.

[0059] EXAMPLES

[0060] Example 1. Development and Application of Dry Eye Disease Models

[0061] A cell-based dry eye disease model is first established using HCECs. These cells are cultured until confluence in either conventional multi-well plates or microfluidic devices designed for dynamic perfusion studies. The model is not limited to HCECs; other ocular surface cells, including corneal endothelial cells, keratocytes, conjunctival epithelial cells, or goblet cells, may also be utilized depending on the study objective. In certain embodiments, cells are genetically engineered to express fluorescently tagged proteins, allowing visualization of stress-related markers or junctional proteins in real time.

[0062] The cells are maintained under standard culture conditions-37℃, 5%CO2, and humidity above 80%-using growth media such as DMEM / F12 or Keratinocyte Serum-Free Medium (KSFM) , optionally supplemented with fetal bovine serum (0.5-10%) and antibiotics (0.5-5%) . The system can be implemented in traditional tissue culture plates, T-flasks, or customized live-cell imaging chambers compatible with time-lapse microscopy.

[0063] To simulate desiccation stress, the medium is removed, and the cultures are exposed to low-humidity conditions (10-50%) for 5-20 minutes, as shown in FIG. 1A.This can be achieved in a controlled desiccation chamber, a humidity-monitored biosafety hood, or a sterilized 37℃ oven. After exposure, cells are returned to standard humidity conditions to evaluate the effects of desiccation to the model.

[0064] Alternatively, to mimic hyperosmolar stress, the cell model is exposed to increased osmolarity (350-550 mOsm) by supplementing the culture medium with sodium chloride, as depicted in FIG. 1B. This exposure, lasting up to 48 hours, replicates the osmotic imbalance characteristic of dry eye disease and induces measurable cellular stress responses such as shrinkage, detachment, or altered junctional organization.

[0065] Once the stress-induced conditions are established, the resulting in vitro dry eye model is used to assess changes in cell morphology, viability, and barrier function. The system enables real-time imaging and quantitative analysis of morphological and fluorescence-based parameters to evaluate cell layer integrity under varying environmental stresses.

[0066] In one embodiment, an automated fluorescence microscope captures sequential brightfield or fluorescent images every 5 minutes to 5 hours over a 24-hour period, under controlled temperature and CO2 conditions (FIG. 2A) . Focus-stacked images ensure accurate assessment across the cell layer. The model supports testing both preventive and therapeutic treatments, where test formulations, ophthalmic drugs, or lubricating materials are applied either before or after induction of dry eye conditions.

[0067] Image analysis is performed using custom computational scripts (e.g., Python or R) to segment single cells based on pixel intensity. Quantitative parameters such as cell area, perimeter, roundness, and morphology index are extracted to measure stress responses. Additional fluorescence intensity measurements can track redistribution of cytoskeletal proteins, tight-junction markers (e.g., ZO-1, occludin) , or reactive oxygen species production.

[0068] The morphological and fluorescence data are further analyzed to derive metrics for cellular resilience and barrier recovery. For example: (1) Size (area and perimeter) : Measures of cell area and perimeter to track swelling, shrinking, or other size-related responses to stress. (2) Shape metrics (aspect ratio and circularity) : Calculations of aspect ratio (length-to-width ratio) and roundness help assess cellular health. Stress may cause cells to become more rounded, indicating loss of structural integrity. (3) Morphology index calculation (FIG. 2B) : A morphology index is derived by normalizing measurements of the cell’s longest axis with its overall area, providing insights into shape changes under treatment.

[0069] Changes in morphology index can be measured between cells treated with different formulations, or cells exposed to different materials and / or devices. This can be accomplished by means of comparing absolute morphology index values of the population of cells at a particular time point or measuring the rate of change of this value between conditions.

[0070] Referring to FIG. 2C, the developed model enables comparison between treatment conditions. For instance, artificial tear formulations containing trehalose or hyaluronic acid demonstrated improved morphology index stability under desiccation, while cyclosporine A–treated cells exhibited enhanced recovery of tight-junction fluorescence after hyperosmolar stress. Similarly, prototype hydrogel inserts and nanoparticle-based lubricants can be tested for their capacity to restore or maintain epithelial integrity.

[0071] Collectively, this in vitro dry eye model provides a reproducible, quantifiable, and physiologically relevant platform for evaluating the efficacy and cytocompatibility of new ophthalmic formulations, medical devices, and therapeutic agents, enabling faster and more predictive preclinical screening.

[0072] Example 2. Cell layer integrity assessment

[0073] To assess cell layer integrity, computational image analysis is performed to quantify the area occupied by cells in each image frame over time. At the initial injury time point (t = 0) , the total surface area of the confluent cell layer within the field of view is measured. Subsequent images captured at defined intervals are analyzed to track variations in cell coverage, allowing quantification of disruptions such as gaps or breaks in the epithelial layer. These temporal changes in surface coverage serve as a direct indicator of cell layer integrity.

[0074] For regeneration and repair analysis, the extent of cellular recovery or reformation of the monolayer is evaluated by measuring the change in cell-covered area over time. The rate of gap closure provides a quantitative metric of cellular resilience and regenerative capacity-key factors in assessing the efficacy of ophthalmic treatments. Physical injury to the confluent monolayer can be introduced using controlled abrasion or scratching, followed by monitoring the repair process under different treatment conditions.

[0075] Both single and multi–time point analyses are conducted to compare cell layer integrity and morphology indices between treated and untreated groups. Parameters such as cell size, shape, and confluence are quantified and plotted over time to visualize trends in healing and stress response. Comparative plots across treatment groups enable direct visual and statistical evaluation of therapeutic performance. Quantitative data, including morphology indices, recovery ratios, and repair rates, are generated using computational platforms such as Python or R, providing high-resolution temporal and statistical analysis of cell layer dynamics.

[0076] Example 3. Evaluation of ophthalmic formulations using the dry eye disease model

[0077] The in vitro dry eye disease model developed in Example 1 is further utilized to evaluate the efficacy of candidate ophthalmic formulations and therapeutic interventions. This model provides a reproducible and physiologically relevant platform for screening a wide spectrum of drug classes, including anti-inflammatory agents, osmoprotectants, tear film stabilizers, and lubricant polymers, under precisely controlled desiccation and hyperosmotic stress conditions. The integration of quantitative image-based analysis enables simultaneous monitoring of cellular morphology, migration, and layer integrity in real time.

[0078] In one embodiment of the invention, a series of in-vitro studies is conducted to evaluate the performance of commercially available artificial tear substitute (ATS) formulations under controlled dry eye disease (DED) conditions. All ATS formulations utilized in this embodiment are obtained as preservative-free commercial products.

[0079] HCECs are used as a biological model to assess cellular responses to ATS formulations. The HCECs, which are HPV-immortalized, are maintained in DMEM / F12 culture medium supplemented with 1%fetal bovine serum (FBS) and 1%penicillin / streptomycin (P / S) . Cultures are incubated at 37℃ under standard humidified conditions (95%humidity, 5%CO2) . Cells are routinely passaged at approximately 90%confluency and seeded into 96-well or 6-well plates at densities of 15,000 cells per well or 250, 000 cells per well, respectively, and allowed to adhere for 16-24 hours prior to DED induction. As shown in FIGs. 4A-4E, biocompatible ATS products are able to affect HCEC cell morphology.

[0080] To model desiccation-induced DED, confluent HCECs are rinsed with phosphate-buffered saline (PBS) and exposed to drying stresses consistent with established protocols. For ATS treatment conditions, the culture medium is removed, the monolayer is rinsed once with PBS, and a minimal volume of the selected ATS formulation-sufficient to form a thin layer across the cell surface-is gently added (typically around 40–50 μL per well in a 96-well format) . Cells are incubated with ATS for 15 minutes at 37℃. Where blinking simulation is required, ATS-treated cells are subsequently rinsed with PBS using gentle aspiration. After the final rinse, the plates are immediately transferred into a controlled desiccation chamber maintained at 37℃, 5%CO2, and 45%humidity for the specified duration. At the completion of desiccation exposure, HCECs are incubated in alamarBlueTM reagent to assess cellular metabolic activity. As shown in FIGs. 5A-5D, ATS protects HCECs from desiccation stress.

[0081] Particularly, live-cell morphological changes are monitored using automated brightfield microscopy. HCECs cultured in 96-well plates are subjected to the desired conditions, and time-lapse imaging was performed for 15-30 minutes at one-minute intervals using the Cytation 5 instrument maintained at 37℃.

[0082] Computational analysis of the resulting time-lapse image sets is conducted using CellProfiler software (version 4.2.8) . A custom image-processing pipeline is developed to segment individual cells based on brightfield contrast and pixel intensity. For each cell identified, CellProfiler calculats the major-axis length, and this metric is used as a proxy for cell morphology and health. Elongated morphologies are considered characteristic of normal HCECs, whereas more rounded shapes are associated with stress. All image datasets are analyzed using an identical pipeline, and quantitative outputs are processed and visualized using the R computing environment (version 4.5.1) .

[0083] Cellular viability following treatment is assessed using alamarBlueTM. HCECs are seeded at 15, 000 cells per well in 96-well plates, treated according to the specified ATS and DED-inducing conditions, and incubated with alamarBlueTM for 2-4 hours at 37℃. Fluorescence measurements are collected using the Cytation 5 multimode plate reader with excitation at 540 nm and emission at 590 nm.

[0084] In an alternative embodiment, hyperosmolar stress is used to induce DED-like conditions. HCECs at ～90%confluency are rinsed with PBS, exposed to ATS formulations or PBS controls for 15 minutes, rinsed again, and subsequently treated with hyperosmotic medium (approximately 500 mOsM) for 16-24 hours. The hyperosmotic medium is prepared by supplementing serum-free DMEM / F12 containing 1%P / Swith sodium chloride (1 mL of 5 M NaCl added to 49 mL medium) . Control cells are maintained in serum-free isosmotic medium. Following hyperosmotic exposure, HCECs are imaged under brightfield illumination using a Cytation 5 plate reader. As illustrated in FIGs. 6A-6E, ATS formulations confer protective effects against hyperosmotic stress, preserving cellular morphology and viability.

[0085] Collectively, these results demonstrate that the system of the present invention provides a robust and reliable platform for assessing the performance and biological effects of ophthalmic and biomedical formulations under dry eye-mimicking stress conditions.

[0086] In some embodiments, the dry eye disease model is subjected to controlled desiccation stress by exposing the cultured corneal epithelial layer to low humidity (for example, 20%relative humidity for 15 minutes) to induce epithelial barrier disruption. Following the induction of stress, test formulations or therapeutic agents are applied to the cell layer, and cellular recovery is quantitatively monitored using automated live-cell imaging coupled with computational analysis of cell morphology and barrier integrity.

[0087] In another embodiment, the model is employed to evaluate ophthalmic devices such as hydrogel contact lenses or ocular inserts containing moisturizing or bioactive agents. For example, a hydrogel insert can be positioned directly on the HCEC layer during desiccation exposure to assess morphological preservation and trans-epithelial electrical resistance (TEER) as indicators of epithelial integrity, hydration retention, and biocompatibility.

[0088] The model is also suitable for comparative drug screening. For instance, novel small-molecule anti-inflammatory or antioxidant compounds may be tested alongside established treatments such as cyclosporine A or lifitegrast. Quantitative imaging and computational analysis can be used to measure restoration of tight junction proteins (e.g., ZO-1) and reductions in stress-related biomarkers, thereby providing objective evaluation of therapeutic efficacy under dry eye–mimicking conditions.

[0089] Accordingly, the dry eye disease model described herein serves as a predictive and quantitative platform for evaluating both chemical and device-based ophthalmic interventions. It faithfully replicates the physiological stress conditions of the ocular surface, enabling concurrent assessment of barrier restoration, anti-inflammatory efficacy, and cytocompatibility. Furthermore, the model’s integration with automated image analysis and computational quantification substantially enhances sensitivity and reproducibility compared to conventional assays, reducing reliance on animal testing and accelerating the preclinical screening and optimization of next-generation dry eye therapeutics.

[0090] The present invention introduces a novel analytical approach for evaluating ocular surface integrity. The core innovation lies in its ability to directly assess and quantify ocular surface health through real-time cellular layer analysis under precisely controlled conditions. This approach integrates advanced imaging with computational quantification, enabling detailed monitoring of cell morphology, alignment, and regeneration dynamics.

[0091] In particular, the invention incorporates proprietary algorithms designed for high-accuracy analysis of cellular morphology. These algorithms automatically quantify parameters such as cell shape, size, alignment, and migration in real time, thereby providing objective and reproducible insights into cellular responses to desiccation and osmotic stress. By combining image-based analysis with computational quantification, the present invention enables highly sensitive detection of subtle cellular stress responses that traditional assays fail to capture.

[0092] Accordingly, the present invention provides a powerful and precise platform for assessing ocular surface integrity, facilitating the evaluation of ophthalmic formulations, devices, and treatments with enhanced sensitivity and reliability. This approach allows comprehensive characterization of cell behavior under dry eye–related stress and significantly advances current methodologies for in vitro ocular research.

[0093] The foregoing description of the present invention has been provided for the purposes of illustration and description. It is not intended to be exhaustive or to limit the invention to the precise forms disclosed. Many modifications and variations will be apparent to the practitioner skilled in the art.

[0094] The embodiments were chosen and described in order to best explain the principles of the invention and its practical application, thereby enabling others skilled in the art to understand the invention for various embodiments and with various modifications that are suited to the particular use contemplated.

Claims

1.A method for assessing cell layer integrity and screening ophthalmic formulations or devices utilizing an in vitro dry eye disease model, comprising:establishing a dry eye disease model comprising a cultured cell layer;inducing a dry eye condition in the dry eye disease model;capturing time-lapse, cell-level images of the dry eye disease model for quantifying real-time cellular changes, wherein the real-time cellular changes comprise measurements of cell size, cell shape, and morphology indices;measuring a disruption and regeneration rate of the cultured cell layer by calculating changes in surface area coverage over time; andgenerating an indication of morphology indices and layer integrity metrics changes based on the measurements;wherein the method further comprises applying an ophthalmic formulation or placing an ophthalmic device onto the dry eye disease model before or after the induction of the dry eye condition to evaluate the intervention of the ophthalmic formulation or device, and comparing the resulting morphology indices and layer integrity metrics with those of an untreated dry eye disease model to evaluate the protective or restorative efficacy of the ophthalmic formulation or device.2.The method of claim 1, wherein inducing the dry eye condition comprises:culturing ocular surface cells under standard conditions;subjecting the ocular surface cells to a desiccation stress condition or a hyperosmolar stress condition; andreturning the ocular surface cells to standard conditions to obtain the dry eye disease model.3.The method of claim 2, wherein the ocular surface cells comprise human corneal epithelial cells (HCECs) , keratocytes, corneal endothelial cells, conjunctival epithelial cells, or goblet cells.4.The method of claim 2, wherein the standard culture conditions comprise a temperature of 35-37℃, a CO2 concentration of approximately 5%, and a humidity above 80%.5.The method of claim 2, wherein the desiccation stress condition comprises culturing the ocular surface cells under humidity of 10-50%for 5-20 minutes.6.The method of claim 2, wherein the hyperosmolar stress condition comprises culturing the ocular surface cells under an osmolarity of 350-550 mOsm.7.The method of claim 2, wherein the ocular surface cells are genetically modified to express fusion-tagged proteins for fluorescence imaging to facilitate real-time tracking of morphological and subcellular changes.8.The method of claim 1, wherein the regenerative capacity of the cell layer is evaluated by measuring the rate of surface area restoration following injury, with temporal comparisons of morphology indices and integrity metrics to determine treatment efficacy.9.The method of claim 1, wherein the morphology indices are computed using a custom algorithm based on pixel intensity segmentation and normalized measurements of cell area and perimeter.10.The method of claim 9, wherein the morphology indices are correlated with trans-epithelial electrical resistance (TEER) values to provide a combined indicator of epithelial barrier integrity.11.The method of claim 1, wherein the ophthalmic formulation comprises a tear film stabilizer, osmoprotectant, lubricant polymer, or anti-inflammatory compound.12.The method of claim 1, wherein the ophthalmic device comprises a hydrogel contact lens, ocular insert, or bioresorbable patch containing a moisturizing or bioactive agent.13.A system for assessing cell layer integrity and screening ophthalmic formulations or devices, comprising:a cell culture chamber comprising a dry eye disease model with a cell layer and a stress induction module, wherein the dry eye disease model is established by:culturing ocular surface cells under standard conditions;subjecting the ocular surface cells to a desiccation stress condition or a hyperosmolar stress condition; andreturning the ocular surface cells to standard conditions to obtain the dry eye disease model;an imaging system comprising brightfield and fluorescence imaging capabilities and live-cell imaging chambers configured to acquire time-lapse images of the dry eye disease model at intervals of 5 minutes to 5 hours;a computational analysis unit configured to perform real-time segmentation of the time-lapse images and quantify cellular morphology, size, shape, and morphology indices; andan integrity measurement module configured to analyze surface area disruptions and regeneration over time of the cell layer and provide quantitative metrics for evaluating treatment efficacy.14.The system of claim 13, wherein the integrity measurement module provides a graphical user interface displaying temporal plots of morphology indices, recovery rates, and layer integrity scores for each treatment condition.15.The system of claim 13, wherein the stress induction module is configured to control environmental parameters including humidity, temperature, osmolarity, and CO2 concentration to reproduce dry eye conditions.16.The system of claim 13, wherein the system further comprises a data storage module configured to record and archive image data, computed morphology indices, and corresponding treatment metadata.17.The system of claim 13, wherein the imaging system is configured to simultaneously acquire brightfield and fluorescence images for co-registration and multimodal analysis.18.The system of claim 13, wherein the ocular surface cells comprise HCECs, keratocytes, corneal endothelial cells, conjunctival epithelial cells, or goblet cells.19.The system of claim 13, wherein the desiccation stress condition comprises culturing the ocular surface cells under humidity of 10-50%for 5-20 minutes.20.The system of claim 13, wherein the hyperosmolar stress condition comprises culturing the ocular surface cells under an osmolarity of 350-550 mOsm.

Images