Antibodies against FOLR1 and uses thereof

Abstract

A monoclonal antibody capable of specifically binding human FOLR1, or an antigen-binding portion thereof. Also provided is an immunoconjugate comprising the antibody or the antigen-binding portion thereof.

Description

ANTIBODIES AGAINST FOLR1 AND USES THEREOF

[0001] This application claims priority to US provisional application No. 63 / 742, 982 filed January 8, 2025.FIELD OF THE INVENTION

[0002] The present disclosure relates generally to a monoclonal antibody, particularly a fully human monoclonal antibody, or an antigen-binding portion thereof, that binds to FOLR1, with high affinity and functionality. A nucleic acid molecule encoding the antibody or the antigen-binding portion thereof, an expression vector, a host cell and a method for expressing the antibody or the antigen-binding portion thereof are also provided. The present disclosure further provides a treatment method using the antibody or antigen-binding portion thereof of the disclosure. SEQUENCE STATEMENT

[0003] The instant application contains a Sequence Listing XML labeled “55532-00185SL” which was created on January 4, 2026 and is 21 kb.BACKGROUND OF THE INVENTION

[0004] Folate, or vitamin B9, is vital for several biological functions, including DNA and RNA synthesis, and cell division and growth. The cellular uptake of the folate or N5-methyltetrahydrofolate (5-mTHF) as the most biologically active folic acid form requires the folate receptors, where the folate receptors bind the folate molecules, carry them to the cytoplasm, and recycle back to the cell surface (Rothberg KG et al., (1990) The glycophospholipid-linked folate receptor internalizes folate without entering the clathrin-coated pit endocytic pathway. J Cell Biol. 110 (3) : 637-49) .

[0005] The folate receptor family has four members, namely FOLR1 (or FRα) , FOLR2 (or FRβ) , FOLR3 (or FRγ) and FOLR4 (or FRδ) , with the former three having high affinity for folate, and the last without folate binding ability. FOLR1 and FOLR2 are glycosylphophatidylinositol (GPI) -anchored cell-membrane proteins, and play important roles in importing folate and derivatives into cells. While FOLR3 is a secretory protein, its role in folate transport remains to be elucidated (Yoshitomi R, et al., (2020) Plasma Homocysteine Concentration is Associated with the Expression Level of Folate Receptor 3. Sci Rep. 10 (1) : 10283; Shen F et al., (1995) Folate receptor type gamma is primarily a secretory protein due to lack of an efficient signal for glycosylphosphatidylinositol modification: protein characterization and cell type specificity. Biochemistry. 34 (16) : 5660-5) .

[0006] The folate receptors, especially FOLR1, are expressed at very low levels in most tissues, but significantly upregulated on many carcinomas, including ovary, kidney, endometrium, lung, breast, bladder and pancreas cancers, to meet the folate demand of the rapidly dividing cells (Kelemen LE. (2006) The role of folate receptor alpha in cancer development, progression and treatment: cause, consequence or innocent bystander? Int J Cancer. 119 (2) : 243-50; Parker N, et al., (2003) Folate receptor expression in carcinomas and normal tissues determined by a quantitative radioligand binding assay. Anal Biochem. 338 (2) : 284-93) . FOLR1 overexpression in e.g., breast tumors was even found to correlate with poor prognosis. For example, FOLR1 expression is especially enriched in triple-negative breast cancer and is linked to increased cancer progression and worse clinical outcome (Paula S. et al., (2017) Folate Receptor Alpha Expression Is Associated With Increased Risk of Recurrence in Triple-negative Breast Cancer, Clinical Breast Cancer, 17 (7) : 544-549) . In addition to assisting in folate uptake, FOLR1 may also promote cancer growth by modulating apoptosis-related molecules and thus suppressing cytotoxic agent-induced apoptosis (Chen YL et al., (2012) Serous ovarian carcinoma patients with high alpha-folate receptor had reducing survival and cytotoxic chemo-response. Mol Oncol 6 (3) : 360-369) .

[0007] In view of its restricted tissue-specific expression pattern and involvement in cancers, FOLR1 has been identified as a potential therapeutic target. M9346A (also known as huMov19) , a humanized anti-FOLR1 IgG1 / κ monoclonal antibody as developed by ImmunoGen, was reported to induce antibody-dependent cell mediated cytotoxicity (ADCC) against ovarian cancer cells. When made as antibody-drug conjugates (ADCs) by linking to cytotoxic agents, M9346A can be internalized into FOLR1+ cells with cytotoxic agents and cause death of both the FOLR1+ cells and nearby FOLR1-cells by bystander killing effect. Mirvetuximab soravtansine (also known as ELAHERE or IMGN853) , a M9346A ADC, has been approved by FDA for the treatment of ovarian cancer with medium to high FOLR1-positive platinum-resistant lesions.

[0008] Despite of the advancement in this field, the choice for the patients is limited so far and there is a need for additional monoclonal antibodies with improved pharmaceutical characteristics.

[0009] Citation or identification of any document in this application is not an admission that such document is available as prior art to the present invention.SUMMARY OF THE INVENTION

[0010] The present disclosure provides a fully human monoclonal antibody, or an antigen-binding portion thereof, that is able to specifically bind to FOLR1 (e.g., human FOLR1, and / or monkey FOLR1) and has i) comparable, if not higher, binding affinity / capability to recombinant human FOLR1 protein, ii) comparable, if not higher, binding affinity / capability to recombinant monkey FOLR1 protein, iii) comparable, if not higher, binding capability to cells expressing human FOLR1, iv) is able to be internalized by FOLR1-expressing cells, at comparable, if not higher, rate, and / or v) has comparable, if not better, in vivo anti-tumor efficacy, as compared to prior art anti-FOLR1 antibodies such as M9346A. The antibody or antigen-binding portion thereof has a high binding specificity to FOLR1, especially human FOLR1, without cross-reaction to FOLR2, FOLR3 or FOLR4.

[0011] The antibody or antigen-binding portion of the disclosure can be used for a variety of applications, including the detection of human and / or monkey FOLR1 proteins in vitro, and treatment of diseases associated with FOLR1 (e.g., FOLR1 over-expression) , such as cancers (e.g., FOLR1+ cancers) .

[0012] Accordingly, in one aspect, the disclosure pertains to a monoclonal antibody, or an antigen-binding portion thereof, that is able to bind FOLR1 (e.g., human and / or monkey FOLR1 protein (s) ) , comprising (i) a heavy chain variable region that may comprise a VH CDR1 region, a VH CDR2 region and a VH CDR3 region, wherein the VH CDR1 region, the VH CDR2 region and the VH CDR3 region may comprise amino acid sequences having at least 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%sequence identity to SEQ ID NOs: 1, 2 and 3, respectively; or (ii) a light chain variable region that may comprise a VL CDR1 region, a VL CDR2 region and a VL CDR3 region, wherein the VL CDR1 region, the VL CDR2 region and the VL CDR3 region may comprise amino acid sequences having at least 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%sequence identity to SEQ ID NOs: 4, 5 and 6, respectively.

[0013] The monoclonal antibody or the antigen-binding portion thereof of the disclosure may comprise a heavy chain variable region and a light chain variable region, wherein the VH CDR1 region, the VH CDR2 region, the VH CDR3 region, the VL CDR1 region, the VL CDR2 region and the VL CDR3 region may comprise amino acid sequences having at least 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%sequence identity to SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5 and 6, respectively.

[0014] The heavy chain variable region may comprise an amino acid sequence having at least 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%sequence identity to SEQ ID NO: 7.

[0015] The light chain variable region may comprise an amino acid sequence having at least 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%sequence identity to SEQ ID NO: 8.

[0016] The monoclonal antibody or the antigen-binding portion thereof of the disclosure may comprise a heavy chain variable region and a light chain variable region comprising amino acid sequences having at least 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%sequence identity to SEQ ID NOs: 7 and 8.

[0017] The monoclonal antibody, or the antigen-binding portion thereof, of the present disclosure may comprise a heavy chain and a light chain linked by disulfide bonds, the heavy chain may comprise a heavy chain variable region and a heavy chain constant region, the light chain may comprise a light chain variable region and a light chain constant region, wherein the C terminus of the heavy chain variable region is linked to the N terminus of the heavy chain constant region, and the C terminus of the light chain variable region is linked to the N terminus of the light chain constant region.

[0018] The heavy chain constant region may be with or without FcR and / or complement system protein binding affinity, or with high or low FcR and / or complement system protein binding affinity. The heavy chain constant region may function to provide enhanced antibody stability. The heavy chain constant region may function to provide prolonged serum half-life of the antibody or the antigen-binding portion thereof. The heavy chain constant region may be IgG1, IgG2, or IgG4 heavy chain constant region, or a functional fragment thereof, such as the Fc fragment. In certain embodiments, the heavy chain constant region may be human heavy chain constant region comprising the amino acid sequence of e.g., SEQ ID NOs: 9 or 10. The light chain constant region may be kappa constant region, such as human kappa light chain constant region comprising the amino acid sequence of e.g., SEQ ID NO: 11, or a functional fragment thereof.

[0019] The antibody or antigen-binding portion thereof of the present disclosure in certain embodiments may comprise or consist of two heavy chains and two light chains. The antibody or the antigen-binding portion thereof of the present disclosure in other embodiments may be a single chain variable fragment (scFv) antibody, or antibody fragments, such as Fab or F (ab’ ) 2 fragments.

[0020] The disclosure also provides a bispecific molecule that may comprise the antibody, or the antigen-binding portion thereof, of the disclosure, linked to a second functional moiety (e.g., a second antibody or its antigen binding portion thereof) having a different binding specificity than the antibody, or the antigen-binding portion thereof of the disclosure. The antibody or the antigen binding portion thereof of the present disclosure can be made into part of a chimeric antigen receptor (CAR) . Also provided is an immune cell that may comprise the antigen chimeric receptor, such as a T cell and a NK cell. The antibody or the antigen binding portion thereof of the disclosure can also be encoded by or used in conjunction with an oncolytic virus.

[0021] The disclosure also provides an immunoconjugate, that may comprise an antibody or antigen-binding portion thereof, of the disclosure, linked to an effector molecule, directly or via a linker. The effector molecule may be a therapeutic agent such as a cytotoxic agent, or a radioactive atom. The cytotoxic agent may be a recombinant protein termed DT3C comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19. The antibody or antigen-binding portion thereof of the disclosure may be conjugated to the DT3C directly without a linker. The cytotoxic agent may be a chemical entity, e.g., monomethyl auristatin E (MMAE) . The chemical entity may be linked to the antibody or antigen-binding portion thereof of the disclosure via a linker. The linker may be a cleavable linker, such as MC-VC-PAB.

[0022] The disclosure further provides a nucleic acid molecule encoding the antibody or the antigen-binding portion thereof of the disclosure, as well as an expression vector comprising such a nucleic acid molecule and a host cell comprising such an expression vector or having the nucleic acid molecule integrated into its genome. A method for preparing the anti-FOLR1 antibody or antigen binding portion thereof using the host cell of the disclosure is provided, comprising steps of (i) expressing the antibody or antigen binding portion thereof in the host cell, and (ii) isolating the antibody or antigen binding portion thereof from the host cell or its cell culture.

[0023] The disclosure provides a composition comprising the antibody or antigen binding portion thereof, the bispecific molecule, the immunoconjugate, the CAR, the immune cell carrying the CAR, the oncolytic virus, the nucleic acid molecule, the expression vector, or the host cell of the disclosure. The composition may be a pharmaceutical composition further comprising a pharmaceutically acceptable carrier.

[0024] In yet another aspect, the disclosure provides a method for treating a disease associated with FOLR1 (e.g., FOLR1 over-expression) in a subject in need thereof, which may comprise administering to the subject a therapeutically effective amount of the pharmaceutical composition of the present disclosure.

[0025] The disease may be a tumor or cancer, e.g., a FOLR1+ tumor or cancer. The tumor or cancer may be a solid one or a hematologic one, including, but not limited to, ovarian tumor, endometrial carcinoma, breast cancer, cervical cancer, fallopian tube carcinoma, primary peritoneal carcinoma, non-small cell lung cancer, pancreatic ductal adenocarcinoma, or acute myeloid leukemia. In certain embodiments, the cancer is ovarian cancer. In certain embodiments, the subject is human.

[0026] The disclosure may provide a method for diagnosis, disease monitoring, and / or prognosis of a cancer associated with FOLR1 (e.g., FOLR1 over-expression) in a subject in need thereof, comprising i) collecting a sample from the subject, and ii) detecting the presence or expression level of FOLR1 using the antibody or antigen binding portion thereof of the disclosure, wherein the presence or increased expression level of FOLR1 may indicate the subject may be with a cancer, with disease progression, or with bad outcome. In certain embodiments, the subject is human.

[0027] The disclosure also provides the use of the antibody or antigen binding portion thereof, or the composition of the disclosure in diagnosis, disease monitoring, prognosis, or treatment of a disease associated with FOLR1, or in preparation of a medicament for treating a disease associated with FOLR1. In certain embodiments, the disease is a cancer, such as a solid cancer or a hematologic cancer.

[0028] Other features and advantages of the instant disclosure will be apparent from the following detailed description and examples, which should not be construed as limiting. The contents of all references, Genbank entries, patents and published patent applications cited throughout this application are expressly incorporated herein by reference.

[0029] Accordingly, it is an object of the invention not to encompass within the invention any previously known product, process of making the product, or method of using the product such that Applicants reserve the right and hereby disclose a disclaimer of any previously known product, process, or method. It is further noted that the invention does not intend to encompass within the scope of the invention any product, process, or making of the product or method of using the product, which does not meet the written description and enablement requirements of the USPTO (35 U.S.C. §112, first paragraph) or the EPO (Article 83 of the EPC) , such that Applicants reserve the right and hereby disclose a disclaimer of any previously described product, process of making the product, or method of using the product. It may be advantageous in the practice of the invention to be in compliance with Art. 53 (c) EPC and Rule 28 (b) and (c) EPC. All rights to explicitly disclaim any embodiments that are the subject of any granted patent (s) of applicant in the lineage of this application or in any other lineage or in any prior filed application of any third party is explicitly reserved. Nothing herein is to be construed as a promise.

[0030] It is noted that in this disclosure and particularly in the claims and / or paragraphs, terms such as "comprises", "comprised", "comprising"and the like can have the meaning attributed to it in U.S. Patent law; e.g., they can mean "includes", "included", "including", and the like; and that terms such as "consisting essentially of"and "consists essentially of"have the meaning ascribed to them in U.S. Patent law, e.g., they allow for elements not explicitly recited, but exclude elements that are found in the prior art or that affect a basic or novel characteristic of the invention.BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

[0031] The following detailed description, given by way of example, but not intended to limit the invention solely to the specific embodiments described, may best be understood in conjunction with the accompanying drawings.

[0032] FIG. 1 shows the binding capability of A1E2D1A1 to human FOLR1 in an indirect ELISA.

[0033] FIG. 2 shows the binding capability of A1E2D1A1 to cynomolgus FOLR1 in an indirect ELISA.

[0034] FIG. 3 shows the binding capability of A1E2D1A1 to CHOK1-FOLR1 cells expressing human FOLR1 in a cell-based binding FACS assay.

[0035] FIG. 4 shows the ability of A1E2D1A1 to block benchmark-human FOLR1 binding in a competitive ELISA.

[0036] FIG. 5 shows the ability of the DT3C conjugate of A1E2D1A1 to induce cellular toxicity against CHOK1-FOLR1 cells.

[0037] FIG. 6 shows the ability of the VcMMAE conjugate of A1E2D1A1-G1-9 to induce cellular toxicity against IGR-OV1 cells.

[0038] FIG. 7 shows the ability of the VcMMAE conjugate of A1E2D1A1-G1-9 to induce cellular toxicity against Ishikawa cells.

[0039] FIG. 8 shows the ability of the VcMMAE conjugate of A1E2D1A1-G1-9 to induce cellular toxicity against T47D cells.

[0040] FIG. 9 shows the body weight change of NCG mice treated by A1E2D1A1-G1-9-VcMMAE conjugate.

[0041] FIG. 10 shows the tumor size change in NCG mice treated by A1E2D1A1-G1-9-VcMMAE conjugate.

[0042] FIG. 11 shows the tumor weight in NCG mice on Day 28 treated by A1E2D1A1-G1-9-VcMMAE conjugate.

[0043] FIG. 12 is a schematic diagram of the structure of the antibody-VcMMAE conjugate of the disclosure.DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

[0044] To ensure that the present disclosure may be more readily understood, certain terms are first defined. Additional definitions are set forth throughout the detailed description.

[0045] The term “FOLR” refers to folate receptor. The folate receptor family has four members, namely FOLR1, FOLR2 FOLR3 and FOLR4, also named as FRα, FRβ, FRγ and FRδ, respectively.

[0046] The term “human FOLR1” refers to a FOLR1 protein having the amino acid sequence from human, such as part of the amino acid sequence of SEQ ID NOs: 14 or 15. The term “cynomolgus FOLR1” refers to a FOLR1 protein having the amino acid sequence from cynomolgus monkey, such as part of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16.

[0047] The term “human FOLR2” refers to a FOLR2 protein having the amino acid sequence from human, while the term “human FOLR3” refers to a FOLR3 protein having the amino acid sequence from human. The term “human FOLR4” refers to a FOLR4 protein having the amino acid sequence from human.

[0048] The term “antibody” as used herein refers to an immunoglobulin molecule that recognizes and specifically binds a target, such as FOLR1, through at least one antigen-binding site wherein the antigen-binding site is usually within the variable region of the immunoglobulin molecule. As used herein, the term encompasses intact polyclonal antibodies, intact monoclonal antibodies, single-chain Fv (scFv) antibodies, heavy chain antibodies (HCAbs) , light chain antibodies (LCAbs) , multi-specific antibodies, bispecific antibodies, monospecific antibodies, monovalent antibodies, fusion proteins comprising an antigen-binding site of an antibody, and any other modified immunoglobulin molecule comprising an antigen-binding site (e.g., dual variable domain immunoglobulin molecules) as long as the antibodies exhibit the desired biological activity. Antibodies also include, but are not limited to, mouse antibodies, chimeric antibodies, humanized antibodies, and human antibodies. An antibody can be any of the five major classes of immunoglobulins: IgA, IgD, IgE, IgG, and IgM, or subclasses (isotypes) thereof (e.g., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 and IgA2) , based on the identity of their heavy-chain constant domains referred to as alpha, delta, epsilon, gamma, and mu, respectively. The different classes of immunoglobulins have different and well-known subunit structures and three-dimensional configurations. Unless expressly indicated otherwise, the term “antibody” as used herein include “antigen-binding portion” of the intact antibodies. An IgG antibody is a glycoprotein which may comprise two heavy (H) chains and two light (L) chains inter-connected by disulfide bonds. Each heavy chain may be comprised of a heavy chain variable region (abbreviated herein as VH) and a heavy chain constant region. The heavy chain constant region may be comprised of three domains, CH1, CH2 and CH3. Each light chain may be comprised of a light chain variable region (abbreviated herein as VL) and a light chain constant region. The light chain constant region may be comprised of one domain, CL. The VH and VL regions can be further subdivided into regions of hypervariability, termed complementarity determining regions (CDR) , interspersed with regions that are more conserved, termed framework regions (FR) . Each VH or VL is composed of three CDRs and four FRs, arranged from amino-terminus to carboxy-terminus in the following order: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. The variable regions of the heavy and light chains contain a binding domain that interacts with an antigen. The constant regions of the antibodies can mediate the binding of the immunoglobulin to host tissues or factors, including various cells of the immune system (e.g., effector cells) and the first component (C1q) of the classical complement system. A “functional fragment” of a heavy chain constant region refers to a part of the heavy chain constant region that retains desirable characteristics, e.g., the ability to bind to host tissues or factors, to stabilize the antibody structure, or to prolong antibody’s half-life. A “functional fragment” of a light chain constant region refers to a part of the light chain constant region that retains desirable characteristics, e.g., the ability to stabilize antibody structure.

[0049] The term “antigen-binding portion” or “antigen-binding fragment” of an antibody (or simply “antibody portion” ) , as used herein, refers to one or more fragments of an antibody that retain the ability to specifically bind to an antigen (e.g., a FOLR1 protein) . It has been shown that the antigen-binding function of an antibody can be performed by fragments of a full-length antibody. Examples of binding fragments encompassed within the term “antigen-binding portion” of an antibody include (i) a Fab fragment, a monovalent fragment consisting of the VL, VH, CL and CH1 domains; (ii) a F (ab') 2 fragment, a bivalent fragment which may comprise two Fab fragments linked by a disulfide bridge at the hinge region; (iii) a Fd fragment consisting of the VH and CH1 domains; (iv) a Fv fragment consisting of the VL and VH domains of a single arm of an antibody, (v) a dAb fragment, which consists of a VH domain; and (vi) an isolated complementarity determining region (CDR) . Furthermore, although the two domains of the Fv fragment, VL and VH, are coded by separate genes, they can be joined, using recombinant methods, by a synthetic linker that enables them to be made as a single protein chain in which the VL and VH regions pair to form monovalent molecules (known as single chain Fv (scFv) ) . Such single chain antibodies are also intended to be encompassed within the term “antigen-binding portion” of an antibody. These antibody fragments are obtained using conventional techniques known to those with skill in the art, and the fragments are screened for utility in the same manner as are intact antibodies.

[0050] An “isolated antibody” , as used herein, is intended to refer to an antibody that is substantially free of other antibodies having different antigenic specificities (e.g., an isolated antibody that specifically binds a FOLR1 protein is substantially free of antibodies that specifically bind antigens other than FOLR1 proteins) . An isolated antibody that specifically binds a human FOLR1 protein may, however, have cross-reactivity to other antigens, such as FOLR1 proteins from other species. Moreover, an isolated antibody can be substantially free of other cellular material and / or chemicals.

[0051] The term “monoclonal antibody” as used herein refers to an antibody obtained from a population of substantially homogeneous antibodies, i.e., the individual antibodies comprising the population are identical except for possible naturally occurring mutations and / or post-translation modifications (e.g., isomerizations, amidations) that may be present in minor amounts. Monoclonal antibodies are highly specific, being directed against a single antigenic site. In contrast to polyclonal antibody preparations which typically include different antibodies directed against different determinants (epitopes) , each monoclonal antibody is directed against a single determinant on the antigen. In addition to their specificity, the monoclonal antibodies are advantageous in that they are synthesized by the hybridoma culture, uncontaminated by other immunoglobulins.

[0052] The term “human antibody” or “fully human antibody” , as used herein, is intended to include antibodies having variable regions in which both the framework and CDR regions are derived from human germline immunoglobulin sequences. Furthermore, if the antibody contains a constant region, the constant region also is derived from human germline immunoglobulin sequences. The human antibodies of the disclosure can include amino acid residues not encoded by human germline immunoglobulin sequences (e.g., mutations introduced by random or site-specific mutagenesis in vitro or by somatic mutation in vivo) . However, the term “human antibody” , as used herein, is not intended to include antibodies in which CDR sequences derived from the germline of another mammalian species have been grafted onto human framework sequences.

[0053] As used herein, an antibody that “specifically binds to human FOLR1” is intended to refer to an antibody that binds to human FOLR1 protein (and possibly a FOLR1 protein from one or more non-human species) but does not substantially bind to non-FOLR1 proteins. Preferably, the antibody binds to human FOLR1 protein with “high affinity” , namely with a KD of 5.0 ×10-8 M or less.

[0054] The term “Kassoc” or “Ka” , as used herein, is intended to refer to the association rate of a particular antibody-antigen interaction, whereas the term “Kdis” or “Kd” , as used herein, is intended to refer to the dissociation rate of a particular antibody-antigen interaction. The term “KD” , as used herein, is intended to refer to the dissociation constant, which is obtained from the ratio of Kd to Ka (i.e., Kd / Ka) and is expressed as a molar concentration (M) . KD values for antibodies can be determined using methods well established in the art. A preferred method for determining the KD of an antibody is by using surface plasmon resonance, preferably using a biosensor system such as a BiacoreTM system.

[0055] The term “EC50” , also known as half maximal effective concentration, refers to the concentration of a molecule, e.g., an antibody or an antigen-binding portion thereof, or an immunoconjugate, which induces a response halfway between the baseline and maximum after a specified exposure time.

[0056] The term “IC50” , also known as half maximal inhibitory concentration, refers to the concentration of a molecule, e.g., an antibody or an antigen-binding portion thereof, or an immunoconjugate, which inhibits a specific biological or biochemical function by 50%relative to the absence of the molecule.

[0057] The term "sequence identity"as used in the present invention refers to sequence similarity between two polynucleotide sequences or between two amino acid sequences. The percent identity can be measured using sequence comparison software or algorithms or by visual inspection. Various algorithms and software that can be used to obtain alignments of amino acid or nucleotide sequences are well-known in the art. These include, but are not limited to, BLAST, ALIGN, Megalign, BestFit, GCG Wisconsin Package, and variants thereof.

[0058] The term “subject” includes any human or nonhuman animal. The term “nonhuman animal” includes all vertebrates, e.g., mammals and non-mammals, such as non-human primates, sheep, dogs, cats, cows, horses, chickens, amphibians, and reptiles, although mammals are preferred, such as non-human primates, sheep, dogs, cats, cows and horses.

[0059] The term “therapeutically effective amount” means an amount of a molecule, e.g., the antibody or the antigen binding portion, or the immunoconjugate, of the present disclosure sufficient to prevent or ameliorate the symptoms associated with a disease or condition (such as cancers) and / or lessen the severity of the disease or condition. A therapeutically effective amount is understood to be in context to the condition being treated, where the actual effective amount is readily discerned by those of skill in the art.

[0060] As used herein, the term “treatment / treating” refers to a method that is carried out to obtain a beneficial or desired clinical outcome. For the purpose of the disclosure, the beneficial or desired clinical outcome includes, but not limited to, easing symptom, narrowing the scope of disease, stabilizing (i.e., not aggravating) the state of disease, delaying or slowing the progress of disease, and alleviating symptoms (either partially or completely) , no matter detectable or not detectable. In addition, “treatment” also refers to a prolonged survival period compared to the expected survival period (if no treatment is accepted) . The beneficial or desired clinical outcome described herein may include, but not limited to, slowing of tumor progression, cancer regression, enhancement of anti-tumor immune response, a reduction in tumor growth or size, necrosis of the tumor, a decrease in severity of at least one disease symptom, an increase in frequency and duration of disease symptom-free periods, a prevention of impairment or disability due to the disease affliction, or otherwise amelioration of disease symptoms in the patient.

[0061] Various aspects of the disclosure are described below in further detail.

[0062] The antibody, or the antigen-binding portion thereof, of the disclosure specifically binds to human and / or monkey FOLR1 and has i) comparable, if not higher, binding affinity / capability to human and / or monkey FOLR1, ii) comparable, if not higher, binding capability to cells expressing human FOLR1, and / or iii) is able to be internalized by FOLR1-expressing cells, at comparable, if not higher, rate, as compared to prior art anti-FOLR1 antibodies such as M9346A. Most importantly, the antibody or antigen-binding portion thereof of the disclosure has comparable, if not better, in vivo anti-tumor efficacy, as compared to prior art anti-FOLR1 antibodies such as M9346A. Further, the antibody or antigen-binding portion thereof has a high binding specificity to FOLR1, especially human FOLR1, without cross-reaction to FOLR2, FOLR3 or FOLR4.

[0063] The antibody or antigen binding portion thereof of the disclosure may be a human antibody or antigen binding portion thereof.

[0064] The antibody or antigen binding portion thereof of the disclosure is structurally and chemically characterized below. The amino acid sequence ID numbers of the heavy / light chain variable regions and CDRs of the antibodies or antigen binding portions thereof of the disclosure are summarized in Table 6 below.

[0065] The heavy chain variable region CDRs and the light chain variable region CDRs in Table 6 have been defined by the Kabat numbering system. However, as is well known in the art, CDR regions can also be determined by other systems such as Chothia, and IMGT, AbM, or Contact numbering system / method, based on heavy chain / light chain variable region sequences.

[0066] An antibody of the disclosure may comprise a heavy and / or light chain variable region sequences of CDR1, CDR2 and CDR3 sequences which differ from those of the anti-FOLR1 antibodies of the present disclosure by one or more conservative modifications. It is understood in the art that certain conservative sequence modification can be made which do not remove antigen binding.

[0067] Accordingly, in one embodiment, the antibody may comprise a heavy chain variable region which may comprise CDR1, CDR2, and CDR3 sequences and / or a light chain variable region which may comprise CDR1, CDR2, and CDR3 sequences, wherein: (a) the heavy chain variable region CDR1 sequence may comprise a sequence listed in Table 6, and / or conservative modifications thereof; and / or (b) the heavy chain variable region CDR2 sequence may comprise a sequence listed in Table 6, and / or conservative modifications thereof; and / or (c) the heavy chain variable region CDR3 sequence may comprise a sequence listed in Table 6, and conservative modifications thereof; and / or (d) the light chain variable region CDR1, and / or CDR2, and / or CDR3 sequences may comprise the sequence (s) listed in Table 6; and / or conservative modifications thereof; and (e) the antibody specifically binds human FOLR1.

[0068] As used herein, the term “conservative sequence modifications” is intended to refer to amino acid modifications that do not significantly affect or alter the binding characteristics of the antibody containing the amino acid sequence. Such conservative modifications include amino acid substitutions, additions and deletions. Modifications can be introduced into an antibody of the disclosure by standard techniques known in the art, such as site-directed mutagenesis and PCR-mediated mutagenesis. Conservative amino acid substitutions are ones in which the amino acid residue is replaced with an amino acid residue having a similar side chain. Families of amino acid residues having similar side chains have been defined in the art. These families include amino acids with basic side chains (e.g., lysine, arginine, histidine) , acidic side chains (e.g., aspartic acid, glutamic acid) , uncharged polar side chains (e.g., glycine, asparagine, glutamine, serine, threonine, tyrosine, cysteine, tryptophan) , nonpolar side chains (e.g., alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, methionine) , beta-branched side chains (e.g., threonine, valine, isoleucine) and aromatic side chains (e.g., tyrosine, phenylalanine, tryptophan, histidine) . Thus, one or more amino acid residues within the CDR regions of an antibody of the disclosure can be replaced with other amino acid residues from the same side chain family and the altered antibody can be tested for retained function (i.e., the functions set forth above) using the functional assays described herein.

[0069] Antibodies of the disclosure can be prepared using an antibody having one or more of the VH / VL sequences of the anti-FOLR1 antibody of the present disclosure as the starting material to engineer a modified antibody. An antibody can be engineered by modifying one or more residues within one or both variable regions (i.e., VH and / or VL) , for example within one or more CDR regions and / or within one or more framework regions. Additionally or alternatively, an antibody can be engineered by modifying residues within the constant region (s) , for example to alter the effector function (s) of the antibody.

[0070] In certain embodiments, CDR grafting can be used to engineer variable regions of antibodies. Antibodies interact with target antigens predominantly through amino acid residues that are located in the six heavy and light chain complementarity determining regions (CDRs) . For this reason, the amino acid sequences within CDRs are more diverse between individual antibodies than sequences outside of CDRs. Because CDR sequences are responsible for most antibody-antigen interactions, it is possible to express recombinant antibodies that mimic the properties of specific naturally occurring antibodies by constructing expression vectors that include CDR sequences from the specific naturally occurring antibody grafted onto framework sequences from a different antibody with different properties.

[0071] Accordingly, another embodiment of the disclosure pertains to an isolated monoclonal antibody, or antigen binding portion thereof, which may comprise a heavy chain variable region that may comprise CDR1, CDR2, and CDR3 sequences which may comprise the sequences of the present disclosure, as described above, and / or a light chain variable region which may comprise CDR1, CDR2, and CDR3 sequences which may comprise the sequences of the present disclosure, as described above. While these antibodies contain the VH and VL CDR sequences of the monoclonal antibody of the present disclosure, they can contain different framework sequences.

[0072] Such framework sequences can be obtained from public DNA databases or published references that include germline antibody gene sequences. For example, germline DNA sequences for human heavy and light chain variable region genes can be found in the “VBase” human germline sequence database. As another example, the germline DNA sequences for human heavy and light chain variable region genes can be found in the Genbank database.

[0073] Antibody protein sequences are compared against a compiled protein sequence database using one of the sequence similarity searching methods called the Gapped BLAST (Altschul et al., (1997) , supra) , which is well known to those skilled in the art.

[0074] Preferred framework sequences for use in the antibodies of the disclosure are those that are structurally similar to the framework sequences used by antibodies of the disclosure. The VH CDR1, CDR2, and CDR3 sequences can be grafted onto framework regions that have the identical sequence as that found in the germline immunoglobulin gene from which the framework sequence derives, or the CDR sequences can be grafted onto framework regions that contain one or more mutations as compared to the germline sequences. For example, it has been found that in certain instances it is beneficial to mutate residues within the framework regions to maintain or enhance the antigen binding ability of the antibody.

[0075] Another type of variable region modification is to mutate amino acid residues within the VH and / or VL CDR1, CDR2 and / or CDR3 regions to thereby improve one or more binding properties (e.g., affinity) of the antibody of interest. Site-directed mutagenesis or PCR-mediated mutagenesis can be performed to introduce the mutation (s) and the effect on antibody binding, or other functional property of interest, can be evaluated in in vitro or in vivo assays as known in the art. Preferably conservative modifications (as known in the art) are introduced. The mutations can be amino acid substitutions, additions or deletions, but are preferably substitutions. Moreover, typically no more than one, two, three, four or five residues within a CDR region are altered.

[0076] Accordingly, in another embodiment, the disclosure provides isolated anti-FOLR1 monoclonal antibodies, or antigen binding portions thereof, which may comprise a heavy chain variable region that may comprise: (a) a VH CDR1 region which may comprise the sequence of the present disclosure, or an amino acid sequence having one, two, three, four or five amino acid substitutions, deletions or additions; (b) a VH CDR2 region which may comprise the sequence of the present disclosure, or an amino acid sequence having one, two, three, four or five amino acid substitutions, deletions or additions; (c) a VH CDR3 region which may comprise the sequence of the present disclosure, or an amino acid sequence having one, two, three, four or five amino acid substitutions, deletions or additions; (d) a VL CDR1 region which may comprise the sequence of the present disclosure, or an amino acid sequence having one, two, three, four or five amino acid substitutions, deletions or additions; (e) a VL CDR2 region which may comprise the sequence of the present disclosure, or an amino acid sequence having one, two, three, four or five amino acid substitutions, deletions or additions; and (f) a VL CDR3 region which may comprise the sequence of the present disclosure, or an amino acid sequence having one, two, three, four or five amino acid substitutions, deletions or additions.

[0077] Engineered antibodies of the disclosure include those in which modifications have been made to framework residues within VH and / or VL, e.g., to improve the properties of the antibody.

[0078] Another type of framework modification involves mutating one or more residues within the framework region, or even within one or more CDR regions, to remove T cell epitopes to thereby reduce the potential immunogenicity of the antibody. This approach is also referred to as “deimmunization” and is described in further detail in U.S. Patent Publication No.20030153043.

[0079] In addition, or as an alternative to modifications made within the framework or CDR regions, antibodies of the disclosure can be engineered to include modifications within the Fc region, typically to alter one or more functional properties of the antibody, such as serum half-life, complement fixation, Fc receptor binding, and / or antigen-dependent cellular cytotoxicity. Furthermore, an antibody of the disclosure can be chemically modified (e.g., one or more chemical moieties can be attached to the antibody) or be modified to alter its glycosylation, again to alter one or more functional properties of the antibody.

[0080] In one embodiment, the hinge region of CH1 is modified in such that the number of cysteine residues in the hinge region is altered, e.g., increased or decreased. This approach is described further in U.S. Pat. No. 5,677,425. The number of cysteine residues in the hinge region of CH1 is altered to, for example, facilitate assembly of the light and heavy chains or to increase or decrease the stability of the antibody.

[0081] In another embodiment, the Fc hinge region of an antibody is mutated to increase or decrease the biological half-life of the antibody. More specifically, one or more amino acid mutations are introduced into the CH2-CH3 domain interface region of the Fc-hinge fragment such that the antibody has impaired Staphylococcyl protein A (SpA) binding relative to native Fc-hinge domain SpA binding. This approach is described in further detail in U.S. Pat. No. 6,165,745.

[0082] In still another embodiment, the glycosylation of an antibody is modified. For example, an aglycosylated antibody can be made (i.e., the antibody lacks glycosylation) . Glycosylation can be altered to, for example, increase the affinity of the antibody for antigen. Such carbohydrate modifications can be accomplished by, for example, altering one or more sites of glycosylation within the antibody sequence.

[0083] Additionally or alternatively, an antibody can be made that has an altered type of glycosylation, such as a hypofucosylated antibody having reduced amounts of fucosyl residues or an antibody having increased bisecting GlcNac structures. Such altered glycosylation patterns have been demonstrated to increase or reduce the ADCC ability of antibodies. Such carbohydrate modifications can be accomplished by, for example, expressing the antibody in a host cell with altered glycosylation machinery. Cells with altered glycosylation machinery have been described in the art and can be used as host cells in which to express recombinant antibodies of the disclosure to thereby produce an antibody with altered glycosylation. For example, the cell lines Ms704, Ms705, and Ms709 lack the fucosyltransferase gene, FUT8 (α(1, 6) -fucosyltransferase) , such that antibodies expressed in the Ms704, Ms705, and Ms709 cell lines lack fucose on their carbohydrates. The Ms704, Ms705, and Ms709 FUT8- / -cell lines were created by the targeted disruption of the FUT8 gene in CHO / DG44 cells using two replacement vectors (see U. S. Patent Publication No. 20040110704 and Yamane-Ohnuki et al., (2004) Biotechnol Bioeng 87: 614-22) .

[0084] Another modification of the antibodies herein that is contemplated by this disclosure is pegylation. An antibody can be pegylated to, for example, increase the biological (e.g., serum) half-life of the antibody. To pegylate an antibody, the antibody, or fragment thereof, typically is reacted with polyethylene glycol (PEG) , such as a reactive ester or aldehyde derivative of PEG, under conditions in which one or more PEG groups become attached to the antibody or antibody fragment. Preferably, the pegylation is carried out via an acylation reaction or an alkylation reaction with a reactive PEG molecule (or an analogous reactive water-soluble polymer) . As used herein, the term “polyethylene glycol” is intended to encompass any of the forms of PEG that have been used to derivatize other proteins, such as mono (C1-C10) alkoxy-or aryloxy-polyethylene glycol or polyethylene glycol-maleimide.

[0085] Antibodies of the disclosure can be characterized by their various physical properties, to detect and / or differentiate different classes thereof. In a preferred embodiment, the antibodies do not contain asparagine (symbol N) or aspartic acid (symbol D) sites. The deamidation of asparagine may occur on N-G or N-Ssequences, and the isomerization of aspartic acid may occur on D-G or D-Ssequences and result in the creation of an isoaspartic acid residue that introduces a link into the polypeptide chain and decreases its stability (isoaspartic acid effect) .

[0086] In another aspect, the disclosure provides a nucleic acid molecule that encodes the heavy and / or light chain variable regions, or CDRs, of the antibody or antigen-binding portion thereof of the disclosure. The nucleic acid molecule can be present in whole cells, in a cell lysate, or in a partially purified or substantially pure form. A nucleic acid molecule is “isolated” or “rendered substantially pure” when purified away from other cellular components or other contaminants, e.g., other cellular nucleic acids or proteins, by standard techniques. A nucleic acid molecule of the disclosure can be, e.g., DNA or RNA and may or may not contain intronic sequences.

[0087] The nucleic acid molecule of the disclosure can be obtained using standard molecular biology techniques. For antibodies expressed by hybridomas (e.g., hybridomas prepared from transgenic mice carrying human immunoglobulin genes as described further below) , cDNAs encoding the light and heavy chains of the antibody made by the hybridoma can be obtained by standard PCR amplification or cDNA cloning techniques. For antibodies obtained from an immunoglobulin gene library (e.g., using phage display techniques) , a nucleic acid molecule encoding such antibodies can be recovered from the gene library.

[0088] Preferred nucleic acids molecules of the disclosure include those encoding the VH and VL sequences of the FOLR1 monoclonal antibody or the CDRs. Once DNA fragments encoding VH and VL segments are obtained, these DNA fragments can be further manipulated by standard recombinant DNA techniques, for example to convert the variable region genes to full-length antibody chain genes, to Fab fragment genes or to a scFv gene. In these manipulations, a VL-or VH-encoding DNA fragment is operatively linked to another DNA fragment encoding another protein, such as an antibody constant region or a flexible linker. The term “operatively linked” , as used in this context, is intended to mean that the two DNA fragments are joined such that the amino acid sequences encoded by the two DNA fragments remain in-frame.

[0089] The isolated DNA encoding the VH region can be converted to a full-length heavy chain gene by operatively linking the VH-encoding DNA to another DNA molecule encoding heavy chain constant regions (CH1, CH2 and CH3) . The sequences of human heavy chain constant region genes are known in the art and DNA fragments encompassing these regions can be obtained by standard PCR amplification. The heavy chain constant region can be an IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM or IgD constant region, but most preferably is an IgG4 constant region. For a Fab fragment heavy chain gene, the VH-encoding DNA can be operatively linked to another DNA molecule encoding only the heavy chain CH1 constant region.

[0090] The isolated DNA encoding the VL region can be converted to a full-length light chain gene (as well as a Fab light chain gene) by operatively linking the VL-encoding DNA to another DNA molecule encoding the light chain constant region, CL. The sequences of human light chain constant region genes are known in the art and DNA fragments encompassing these regions can be obtained by standard PCR amplification. In preferred embodiments, the light chain constant region can be a kappa or lambda constant region.

[0091] To create a scFv gene, the VH-and VL-encoding DNA fragments are operatively linked to another fragment encoding a flexible linker, e.g., encoding the amino acid sequence (Gly4-Ser) 3, such that the VH and VL sequences can be expressed as a contiguous single-chain protein, with the VL and VH regions joined by the flexible linker.

[0092] Monoclonal antibodies (mAbs) of the present disclosure can be produced using the well-known somatic cell hybridization (hybridoma) technique of Kohler and Milstein (1975) Nature 256: 495. Other embodiments for producing monoclonal antibodies include viral or oncogenic transformation of B lymphocytes and phage display techniques.

[0093] Antibodies of the disclosure also can be produced in a host cell transfectoma using, for example, a combination of recombinant DNA techniques and gene transfection methods as is well known in the art (e.g., Morrison, S. (1985) Science 229: 1202) . In one embodiment, DNA encoding partial or full-length light and heavy chains obtained by standard molecular biology techniques is inserted into one or more expression vectors such that the genes are operatively linked to transcriptional and translational regulatory sequences. In this context, the term “operatively linked” is intended to mean that an antibody gene is ligated into a vector such that transcriptional and translational control sequences within the vector serve their intended function of regulating the transcription and translation of the antibody gene.

[0094] The term “regulatory sequence” is intended to include promoters, enhancers and other expression control elements (e.g., polyadenylation signals) that control the transcription or translation of the antibody genes. Such regulatory sequences are described, e.g., in Goeddel (Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990) ) . Preferred regulatory sequences for mammalian host cell expression include viral elements that direct high levels of protein expression in mammalian cells, such as promoters and / or enhancers derived from cytomegalovirus (CMV) , Simian Virus 40 (SV40) , adenovirus, e.g., the adenovirus major late promoter (AdMLP) and polyomavirus enhancer. Alternatively, non-viral regulatory sequences can be used, such as the ubiquitin promoter or β-globin promoter. Still further, regulatory elements composed of sequences from different sources, such as the SRα promoter system, which contains sequences from the SV40 early promoter and the long terminal repeat of human T cell leukemia virus type 1 (Takebe et al., (1988) Mol. Cell. Biol. 8: 466-472) . The expression vector and expression control sequences are chosen to be compatible with the expression host cell used.

[0095] The antibody light chain gene and the antibody heavy chain gene can be inserted into the same or separate expression vectors. In preferred embodiments, the variable regions are used to create full-length antibody genes of any antibody isotype by inserting them into expression vectors already encoding heavy chain constant and light chain constant regions of the desired isotype such that the VH segment is operatively linked to the CH segment (s) within the vector and the VL segment is operatively linked to the CL segment within the vector. Additionally or alternatively, the recombinant expression vector can encode a signal peptide that facilitates secretion of the antibody chain from a host cell. The antibody chain gene can be cloned into the vector such that the signal peptide is linked in-frame to the amino terminus of the antibody chain gene. The signal peptide can be an immunoglobulin signal peptide or a heterologous signal peptide (i.e., a signal peptide from a non-immunoglobulin protein) .

[0096] In addition to the antibody chain genes and regulatory sequences, the recombinant expression vectors of the disclosure can carry additional sequences, such as sequences that regulate replication of the vector in host cells (e.g., origins of replication) and selectable marker genes. The selectable marker gene facilitates selection of host cells into which the vector has been introduced (see, e.g., U.S. Pat. Nos. 4,399,216; 4,634,665 and 5,179,017) . For example, typically the selectable marker gene confers resistance to drugs, such as G418, hygromycin or methotrexate, on a host cell into which the vector has been introduced. Preferred selectable marker genes include the dihydrofolate reductase (DHFR) gene (for use in dhfr-host cells with methotrexate selection / amplification) and the neo gene (for G418 selection) .

[0097] For expression of the light and heavy chains, the expression vector (s) encoding the heavy and light chains is transfected into a host cell by standard techniques. The various forms of the term “transfection” are intended to encompass a wide variety of techniques commonly used for the introduction of exogenous DNA into a prokaryotic or eukaryotic host cell, e.g., electroporation, calcium-phosphate precipitation, DEAE-dextran transfection and the like. Although it is theoretically possible to express the antibodies of the disclosure in either prokaryotic or eukaryotic host cells, expression of antibodies in eukaryotic cells, and most preferably mammalian host cells, is the most preferred because such eukaryotic cells, and in particular mammalian cells, are more likely than prokaryotic cells to assemble and secrete a properly folded and immunologically active antibody.

[0098] Preferred mammalian host cells for expressing the recombinant antibodies of the disclosure include Chinese Hamster Ovary (CHO cells) (including dhfr-CHO cells) , NSO myeloma cells, COS cells and SP2 cells. In particular for use with NSO myeloma cells, another preferred expression system is the GS gene expression system disclosed in WO 87 / 04462, WO 89 / 01036 and EP 338, 841. When recombinant expression vectors encoding antibody genes are introduced into mammalian host cells, the antibodies are produced by culturing the host cells for a period of time sufficient to allow for expression of the antibody in the host cells or, more preferably, secretion of the antibody into the culture medium in which the host cells are grown. Antibodies can be recovered from the culture medium using standard protein purification methods.

[0099] In another aspect, the present disclosure features bispecific molecules which may comprise one or more antibodies of the disclosure linked to at least one other functional molecule, e.g., another peptide or protein (e.g., another antibody or ligand for a receptor) to generate a bispecific molecule that binds to at least two different binding sites or target molecules. Thus, as used herein, “bispecific molecule” includes molecules that have three or more specificities.

[0100] Bispecific molecules may be in many different formats and sizes. At one end of the size spectrum, a bispecific molecule retains the traditional antibody format, except that, instead of having two binding arms of identical specificity, it has two binding arms each having a different specificity. At the other extreme are bispecific molecules consisting of two single-chain antibody fragments (scFv's ) linked by a peptide chain, a so-called Bs (scFv) 2 construct. Intermediate-sized bispecific molecules include two different F (ab) fragments linked by a peptidyl linker.

[0101] The present disclosure may provide an immunoconjugate, comprising the antibody or antigen-binding portion thereof of the disclosure, and an effector molecule. The effector molecule may be a therapeutic agent selected from the group consisting of a drug, a toxic agent (e.g., a cytotoxic agent) , a radioisotope, a protein, a peptide, and a nucleic acid.

[0102] The immunoconjugate of the disclosure may be an antibody-drug conjugate (ADC) in which the the antibody or antigen-binding portion thereof is conjugated to one or more drugs, including but not limited to a maytansinoid; an auristatin such as monomethylauristatin drug moieties DE and DF; a dolastatin; a calicheamicin or derivative thereof; an anthracycline such as daunomycin or doxorubicin; methotrexate; vindesine; a taxane such as docetaxel, paclitaxel, larotaxel, tesetaxel, and ortataxel; a trichothecene; and CC1065.

[0103] The immunoconjugate of the disclosure may comprise the antibody or antigen-binding portion thereof conjugated to an enzymatically active toxin or fragment thereof, including but not limited to diphtheria A chain, nonbinding active fragments of diphtheria toxin, exotoxin A chain (from Pseudomonas aeruginosa) , ricin A chain, abrin A chain, modeccin A chain, alpha-sarcin, Aleurites fordii proteins, dianthin proteins, Phytolaca americana proteins (PAPI, PAPII, and PAP-S) , momordica charantia inhibitor, curcin, crotin, sapaonaria officinalis inhibitor, gelonin, mitogellin, restrictocin, phenomycin, enomycin, and tricothecenes.

[0104] The immunoconjugate of the disclosure may comprise the antibody or antigen-binding portion thereof conjugated to a radioactive atom to form a radio-conjugate. A variety of radioactive isotopes are available for the production of radio-conjugates. Examples include At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 and radioactive isotopes of Lu. When the radio-conjugate is used for detection, it may comprise a radioactive atom for scintigraphic studies, for example Tc-99m or I-123, or a spin label for nuclear magnetic resonance (NMR) imaging (also known as magnetic resonance imaging, “MRI” ) , such as iodine-123, iodine-131, indium-111, fluorine-19, carbon-13, nitrogen-15, oxygen-17, gadolinium, manganese or iron.

[0105] The immunoconjugates or ADCs herein expressly contemplate, but are not limited to such conjugates prepared with cross-linker reagents including, but not limited to, BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC, and sulfo-SMPB, and SVSB (succinimidyl- (4-vinylsulfone) benzoate) which are commercially available (e.g., from Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., U. S. A) .

[0106] The immunoconjugate of the disclosure may be used to target FOLR1+ cells and mark or kill these cells.

[0107] An oncolytic virus preferentially infects and kills cancer cells. The antibody or antigen binding portion thereof of the disclosure may be used in conjunction with the oncolytic virus. Alternatively, an oncolytic virus encoding the antibody or antigen binding portion thereof of the disclosure can be introduced into human body.

[0108] Also provided herein are a chimeric antigen receptor (CAR) containing an anti-FOLR1 scFv, the anti-FOLR1 scFv may comprise CDRs and heavy / light chain variable regions described herein. The anti-FOLR1 CAR may comprise (a) an extracellular antigen binding domain which may comprise an anti-FOLR1 scFv; (b) a transmembrane domain; and (c) an intracellular signaling domain.

[0109] Also provided are engineered immune effector cells, which may comprise the CAR provided herein. In certain embodiments, the immune effector cell is a T cell, an NK cell, a peripheral blood mononuclear cell (PBMC) , a hematopoietic stem cell, a pluripotent stem cell, or an embryonic stem cell. In certain embodiments, the immune effector cell is a T cell.

[0110] In another aspect, the present disclosure provides a pharmaceutical composition comprising the antibody or antigen binding portion thereof, the bispecific molecule, the immunoconjugate, the CAR -carrying immune cell, the oncolytic virus, the nucleic acid molecule, the expression vector, and / or the host cell of the present disclosure formulated together with a pharmaceutically acceptable carrier. The composition may optionally contain one or more additional pharmaceutically active ingredients, such as an anti-tumor agent, or an agent for immunity enhancement.

[0111] A “pharmaceutically acceptable carrier” means a carrier that is useful in preparing a pharmaceutical composition that is generally safe, non-toxic and neither biologically nor otherwise undesirable, and includes a carrier that is acceptable for veterinary use as well as human pharmaceutical use. The pharmaceutical composition may comprise any number of carriers or excipients. Carriers that can be used include carriers, surface active agents, thickening or emulsifying agents, solid binders, dispersion or suspension aids, solubilizers, colorants, flavoring agents, coatings, disintegrating agents, lubricants, sweeteners, preservatives, isotonic agents, and combinations thereof. The selection and use of suitable excipients are taught in Gennaro, ed., Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Ed. (Lippincott Williams &Wilkins 2003) , the disclosure of which is incorporated herein by reference.

[0112] The pharmaceutical composition is suitable for intravenous, intramuscular, subcutaneous, parenteral, spinal or epidermal administration (e.g., by injection or infusion) . Depending on the route of administration, the active ingredient can be coated in a material to protect it from the action of acids and other natural conditions that may inactivate it. The phrase “parenteral administration” as used herein means modes of administration other than enteral and topical administration, usually by injection, and includes, without limitation, intravenous, intramuscular, intra-arterial, intrathecal, intracapsular, intraorbital, intracardiac, intradermal, intraperitoneal, transtracheal, subcutaneous, subcuticular, intra-articular, subcapsular, subarachnoid, intraspinal, epidural and intrasternal injection and infusion. Alternatively, an antibody of the disclosure can be administered via a non-parenteral route, such as a topical, epidermal or mucosal route of administration, e.g., intranasally, orally, vaginally, rectally, sublingually or topically.

[0113] Pharmaceutical compositions can be in the form of sterile aqueous solutions or dispersions. They can also be formulated in a microemulsion, liposome, or other ordered structure suitable to high drug concentration.

[0114] The amount of active ingredient which can be combined with a carrier material to produce a single dosage form will vary depending upon the subject being treated and the particular mode of administration and will generally be that amount of the composition which produces a therapeutic effect. Generally, out of one hundred percent, this amount will range from about 0.01%to about 99%of active ingredient in combination with a pharmaceutically acceptable carrier.

[0115] Dosage regimens are adjusted to provide the optimum desired response (e.g., a therapeutic response) . For example, a single bolus can be administered, several divided doses can be administered over time or the dose can be proportionally reduced or increased as indicated by the exigencies of the therapeutic situation. It is especially advantageous to formulate parenteral compositions in dosage unit form for ease of administration and uniformity of dosage. Dosage unit form as used herein refers to physically discrete units suited as unitary dosages for the subjects to be treated; each unit contains a predetermined quantity of active ingredient calculated to produce the desired therapeutic effect in association with the required pharmaceutical carrier. Alternatively, antibody can be administered as a sustained release formulation, in which case less frequent administration is required.

[0116] For administration of the composition, the dosage may range from about 0.0001 to 100 mg / kg. An exemplary treatment regime entails administration once per week.

[0117] A “therapeutically effective dose” of the composition of the disclosure preferably results in a decrease in severity of disease symptoms, an increase in frequency and duration of disease symptom-free periods, or a prevention of impairment or disability due to the disease affliction. For example, for the treatment of tumor-bearing subjects, a “therapeutically effective dosage” preferably inhibits tumor growth by at least about 20%, more preferably by at least about 40%, even more preferably by at least about 60%, and still more preferably by at least about 80%relative to untreated subjects. A therapeutically effective amount of a therapeutic antibody can decrease tumor size, or otherwise ameliorate symptoms in a subject, which is typically a human or can be another mammal.

[0118] The pharmaceutical composition can be a controlled release formulation, including implants, transdermal patches, and microencapsulated delivery systems. Biodegradable, biocompatible polymers can be used, such as ethylene vinyl acetate, polyanhydrides, polyglycolic acid, collagen, polyorthoesters, and polylactic acid. See, e.g., Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978.

[0119] In certain embodiments, the monoclonal antibodies or antigen binding portions thereof of the disclosure can be formulated to ensure proper distribution in vivo. For example, to ensure that the therapeutic antibody of the disclosure cross the blood-brain barrier, they can be formulated in liposomes, which may additionally comprise targeting moieties to enhance selective transport to specific cells or organs.

[0120] The pharmaceutical composition of the present disclosure may have numerous in vitro and in vivo utilities involving, for example, treatment of cancers associated with FOLR1.

[0121] The disclosure provides a method for treating a disease associated with FOLR1 in a subject in need thereof, which may comprise administering to a subject a therapeutically effective amount of the pharmaceutical composition of the present disclosure.

[0122] The disease may be a tumor or cancer. The tumor or cancer may be a solid one or a hematologic one including, but not limited to, ovarian tumor, endometrial carcinoma, breast cancer, cervical cancer, fallopian tube carcinoma, primary peritoneal carcinoma, non-small cell lung cancer, pancreatic ductal adenocarcinoma, or acute myeloid leukemia.

[0123] In another aspect, the disclosure provides methods of combination therapy in which the pharmaceutical composition of the present disclosure is co-administered with one or more additional antibodies that are effective in inhibiting tumor growth in a subject.

[0124] The combination of therapeutic agents discussed herein can be administered concurrently as a single composition in a pharmaceutically acceptable carrier, or concurrently as separate compositions with each agent in a pharmaceutically acceptable carrier. In another embodiment, the combination of therapeutic agents can be administered sequentially.

[0125] Furthermore, if more than one dose of the combination therapy is administered sequentially, the order of the sequential administration can be reversed or kept in the same order at each time point of administration, sequential administrations can be combined with concurrent administrations, or any combination thereof.

[0126] The present disclosure is further illustrated by the following examples, which should not be construed as further limiting. The contents of all figures and all references, Genbank sequences, patents and published patent applications cited throughout this application are expressly incorporated herein by reference. ExamplesExample 1. Generation of anti-FOLR1 Monoclonal Antibodies Using Hybridoma Technology Immunization

[0127] A transgenic mice platform from a domestic supplier was used to generate fully human antibodies targeting FOLR1. The transgenic mice were immunized according to the method as described in E Harlow, D. Lane, Antibody: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 1998. An in house made recombinant human FOLR1 protein with Fc tag (amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 14) was used as the immunogen, and an in house made recombinant human FOLR1-his protein (amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 15) was used for determining anti-sera titers and for screening hybridomas secreting antigen-specific antibodies.

[0128] Immunizing dosages contained 50 μg recombinant human FOLR1-Fc protein per mouse per injection for primary immunization, and 25 μg per mouse per injection for boost immunizations. To increase immune responses, complete Freud's adjuvant and incomplete Freud's adjuvant (Sigma, St. Louis, Mo., USA) were used respectively for primary and boost immunizations. Briefly, the adjuvant-immunogen mixtures were prepared as follows. First, the adjuvant was gently shaken in a vial using a vortex, and the desired amount of adjuvant was transferred to an autoclaved 1.5 mL micro-centrifuge tube. The immunogen was prepared in PBS or saline with the concentration ranging from 0.25 to 0.5 mg / ml, and added at a calculated amount to the micro-centrifuge tube with the adjuvant. The resulting adjuvant-antigen mixtures were mixed by gently vortexing for 2 minutes to generate water-in-oil emulsions, and the emulsions were then drawn into a proper syringe for animal injection. A total of 50 or 25 μg of immunogen was injected in a volume of 150-200 μl. Each animal was immunized, and then boosted for 3 to 4 times depending on the anti-sera titers. Animals with good titers, as measured by ELISA, were given a final boost by intraperitoneal injection before hybridoma fusion. Hybridoma fusion and screening

[0129] Cells of murine myeloma cell line (SP2 / 0-Ag14, ATCC#CRL-1581) were cultured to reach the log phase stage right before hybridoma fusion. Spleen cells from immunized mice with good titers were prepared sterilely and fused with myeloma cells according to the method as described in Kohler G, and Milstein C, "Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity, " Nature, 256: 495-497 (1975) . Fused "hybrid cells" were subsequently dispensed into 96-well cell culture plates in DMEM / 20%FCS / HAT media. Surviving hybridoma colonies were observed under the microscope seven to ten days post fusion. After two weeks, the supernatant from each well was subjected to Indirect ELISA using human FOLR1-his protein. Positive hybridomas secreting antibodies that bound to the human FOLR1-his protein were selected and transferred to 24-well plates. Hybridoma clones producing antibodies that showed high specific human FOLR1 binding were subcloned by limited dilution to ensure the clonality of the cell line, and then monoclonal antibodies from the monoclonal hybridoma cell lines were purified respectively. Briefly, Protein A sepharose columns (bestchrom (Shanghai) Biosciences, Cat#AA0273) were washed using PBS buffer in 5 to 10 column volumes. Cell supernatants from the monoclonal hybridomas of the disclosure were passed through the columns, and then the columns were washed using PBS buffer until the absorbance for protein reached the baseline. The columns were eluted with elution buffer (0.1 M Glycine-HCl, pH 2.7) , which was immediately collected into tubes with neutralizing buffer (1 M Tris-HCl, pH 9.0) . Fractions containing immunoglobulins were pooled and dialyzed in PBS overnight at 4℃.Example 2. Binding Affinity Determination of anti-FOLR1 Monoclonal Antibodies Using BIACORE Surface Plasmon Resonance Technology

[0130] The purified anti-FOLR1 monoclonal antibodies (mAbs) generated in Example 1, including A1E2D1A1, were characterized for their binding affinity and binding kinetics by Biacore T200 system (GE healthcare, Pittsburgh, PA, USA) . M9346A analogues were prepared with the heavy chain and light chain amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 12 and 13 respectively, in Chinese hamster ovary (CHO) cells, and used as the positive control or benchmark.

[0131] Briefly, a Protein A chip (Cytiva, Cat#29127556) was used for affinity determination. The anti-FOLR1 antibodies of the disclosure and the positive control each at the concentration of 2 μg / ml were respectively flowed onto the chip at a flow rate of 10 μl / min. Then, serially diluted recombinant human FOLR1-his (in house made with SEQ ID NO: 15, starting at 80 nM with a 2-fold serial dilution) or cynomolgus monkey FOLR1-TSA protein (in house made with SEQ ID NO: 16, starting at 80 nM with a 2-fold serial dilution) in HBS-EP+ buffer (provided by Biacore) was flowed onto the chip at a flow rate of 30 μl / min. The antigen-antibody association kinetics was followed for 2 minutes and the dissociation kinetics was followed for 10 minutes. The association and dissociation curves were fit to a 1: 1 Langmuir binding model using Biacore evaluation software. The KD, Ka and Kd values were determined and summarized in Table 1 below. Table 1. Binding Affinity of anti-FOLR1 Monoclonal Antibodies to FOLR1

[0132] All the antibodies of the disclosure, including A1E2D1A1, specifically bound to human FOLR1 and cynomolgus monkey FOLR1.Example 3. Binding Activity of anti-FOLR1 Monoclonal Antibodies

[0133] The binding activity of the anti-FOLR1 antibodies of the disclosure to FOLR1 was further determined by Indirect ELISA and Flow Cytometry (FACS) . 3.1 Indirect ELISA

[0134] The anti-FOLR1 antibodies’ binding activity to the human FOLR1 protein was measured in an Indirect ELISA. Briefly, 96-well ELISA plates were coated with 2 μg / ml human FOLR1-his proteins (in house made with SEQ ID NO: 15) in 100 μl carbonate / bicarbonate buffer (pH 9.6) , for 2 hours at 37℃. ELISA plates were washed once with wash buffer (PBS+0.05%Tween-20, PBST) and then blocked with 200 μl / well blocking buffer (5%w / v non-fatty milk in PBST) overnight at 4℃. Plates were washed again and incubated with 100 μl / well serially diluted anti-FOLR1 antibodies of the disclosure or the benchmark (starting at 66.7 nM, 5-fold serial dilution in PBST with 2.5%non-fatty milk) for 40 minutes at 37℃. ELISA plates were washed 4 times and incubated with Peroxidase AffiniPure F (ab') 2 Fragment Goat Anti-Human IgG, Fcγ fragment specific (1: 5000 dilution in PBST buffer, Jackson Immunoresearch, Cat#109-036-098, 100 μl / well) for 40 minutes at 37℃. After a final wash, plates were incubated with 100 μl / well TMB (Innoreagents, Cat#TMB-S-002) at room temperature. The reaction was stopped 3 minutes later with 50 μl / well 1M H2SO4. Absorbance of each well was read on a microplate reader using the dual wavelength mode with 450 nm for TMB and 630 nm as the reference wavelength, and the OD (450-630) values were plotted against antibody concentration. Data was analyzed using Graphpad Prism and EC50 values were reported. The results were shown FIG. 1. It can be seen the anti-FOLR1 antibodies of the disclosure, including A1E2D1A1, specifically bound to human FOLR1 with comparable EC50 and Bmax (maximal binding) as compared to the benchmark.

[0135] The binding activity of the anti-FOLR1 antibodies to cynomolgus FOLR1 was also tested following the protocol above, using cynomolgus monkey FOLR1-TSA (in house made with SEQ ID NO: 16) instead of the human FOLR1-his protein. The results were shown in FIG. 2. It can be seen that the anti-FOLR1 antibodies of the disclosure, including A1E2D1A1 specifically bound to the cynomolgus FOLR1, with similar EC50 and Bmax (maximal binding) as compared to the benchmark

[0136] The antibodies’ cross-reactions with human FOLR2, FOLR3 and FOLR4 proteins were tested following the protocol above, respectively using human FOLR2-his-TS (prepared in-house with SEQ ID NO: 17) , human FOLR3-his-TS (prepared in-house with SEQ ID NO: 18) and human FOLR4-his (Acro biosystems Inc., Cat#FO4-H52H3) instead of the human FOLR1-his protein. The results showed that the anti-FOLR1 antibodies of the disclosure and benchmark were unable to bind human FOLR2, FOLR3 or FOLR4, , indicating the binding specificity of anti-FOLR1 antibodies of the disclosure. 3.2 Cell based binding FACS

[0137] The binding activity of the anti-FOLR1 antibodies to the cell surface human FOLR1 was evaluated by flow cytometry (FACS) , using an in house-prepared CHOK1-FOLR1 cell line expressing cell-surface human FOLR1. Briefly, the cell line was prepared by transfecting CHOK1 cells (Chinese hamster ovary K1 cells) with pCDNA3.1 plasmid constructs with the nucleotide sequence encoding human FOLR1 (Uniprot#P15328) between NotI and XbaI sites.

[0138] The CHOK1-FOLR1 cells were harvested from cell culture flasks, washed twice and resuspended in phosphate buffered saline (PBS) containing 2%v / v Fetal Bovine Serum (FACS buffer) . Then, 1 × 105 CHOK1-FOLR1 cells in 100 μl FACS buffer were incubated with 100 μl serially diluted anti-FOLR1 antibodies of the disclosure or the benchmark (starting from 133.3 nM, 5-fold serial dilution) in FACS buffer in 96 well-plates for 50 minutes on ice. Cells were washed twice with FACS buffer, and added with 100 μl R-Phycoerythrin AffiniPure Goat Anti-Human IgG, Fcγ fragment specific (Cat#109-115-098) (Jackson Immuno Research, 1: 1000 dilution in FACS buffer) . Following an incubation of 50 minutes at 4℃ in dark, the cells were washed three times and resuspended in FACS buffer. Fluorescence was measured using Becton Dickinson FACS Canto II-HTS, and the MFI (mean fluorescence intensity) was plotted against the antibody concentration. Data was analyzed using Graphpad Prism and EC50 values were reported. The results were shown in FIG. 3.

[0139] The antibodies of the disclosure, including A1E2D1A1, exhibited high binding activity to the CHOK1-FOLR1 cells.Example 4. Blocking Activity of anti-FOLR1 Antibodies on FOLR1-Benchmark Binding

[0140] The ability of the anti-FOLR1 antibodies of the disclosure to block benchmark binding to human FOLR1-his protein was measured in a competitive ELISA assay. Briefly, 100 μl 2 μg / mL benchmark in PBS was coated on 96-well ELISA plates overnight at 4℃. ELISA plates were washed once with wash buffer (PBST, PBS+0.05%Tween-20) and then blocked with 200 μl / well blocking buffer (5%w / v non-fatty milk in PBST) overnight at 4℃. While blocking, the anti-FOLR1 antibodies of the disclosure or the benchmark were diluted in and incubated with biotin labeled human FOLR1-his protein (prepared in-house with SEQ ID NO: 15, 17 ng / ml in 2.5%non-fatty milk in PBST) , 4-fold serial dilution starting at 666.7 nM, at room temperature for 40 minutes. After plate washing, the antibody / human FOLR1-his protein mixtures were added to the benchmark coated plates, 100 μl per well. After incubation at 37℃for 40 minutes, the plates were washed using wash buffer, added and incubated for 40 minutes at 37℃ with 100 μl / well Peroxidase Streptavidin (1: 5000 dilution in PBST) . Plates were washed again using wash buffer. Finally, TMB was added and the reaction was stopped using 1M H2SO4. The absorbance was read on a microplate reader using the dual wavelength mode with 450 nm for TMB and 630 nm as the reference wavelength, and the OD (450-630) values were plotted against the antibody concentrations. Data was analyzed using Graphpad Prism and IC50 values were reported. The results were shown in FIG. 4.

[0141] It can be seen A1E2D1A1 did not block benchmark-FOLR1 binding, suggesting that the epitope A1E2D1A1 bound might be different from that of the benchmark, and the benchmark’s binding to FOLR1 did not sterically hinder A1E2D1A1’s .Example 5. Thermal stability of anti-FOLR1 Antibodies

[0142] The antibodies of the disclosure, including A1E2D1A1 were also tested for their Tm (melting temperature) in a protein thermal shift assay using a GloMeltTM Thermal Shift Protein Stability Kit (Cat#33022-T, Biotium) . Briefly, the GloMeltTM dye was allowed to thaw and reach room temperature. The vial containing the dye was vortexed and centrifuged. Then, 10×dye was prepared by adding 5 μL 200× dye to 95 μL buffer (50 mM acetic acid / sodium acetate buffer supplemented with 100mM arginine and 4%sucrose, pH5.5) . Then, 2 μL 10× dye and 10 μg antibodies were added, and buffer was added to a total reaction volume of 20 μL. The tubes containing the dye and antibodies were briefly spun and placed in real-time PCR thermocycler (Roche, LightCycler 480 II) set up with a melt curve program having the parameters in Table 2. Table 2. Parameters for Melt Curve Program Table 3. Melting temperatures of anti-FOLR1 antibodies

[0143] The results were shown in Table 3, suggesting that A1E2D1A1 had good thermal stability.Example 6. Cell-Based Internalization Assay of anti-FOLR1 Antibodies

[0144] The anti-FOLR1 antibodies of the disclosure, including A1E2D1A1, were conjugated with DT3C, a recombinant cytotoxic protein composed of i) diphtheria toxin (DT) without receptor-binding domain and ii) the C1, C2 and C3 domains of Streptococcus protein G (3C) that can reduce cell viability when internalized into cells with the antibodies, and tested for their internalization efficiency in a cell-based internalization assay.

[0145] Briefly, the recombinant protein DT3C was prepared in house with SEQ ID NO: 19. Then, 4,000 CHOK1-FOLR1 cells in 150 μL F-12K (Cat#21127022, Gibco) supplemented with 10%FBS (Cat#10091-148, Gibco) were plated onto each well of 96 well-plates (Cat#062096, In Vitro Scientific) , and incubated in a 5%CO2 incubator at 37℃. Meanwhile, the anti-FOLR1 antibodies of the disclosure or the benchmark, 267 nM in F-12K buffer, were mixed with the DT3C proteins, 588 nM in F-12K buffer, at 1: 1 volume ratio, and incubated at room temperature for 30 minutes. Then, 50 μl / well serially diluted antibody / DT3C mixtures (5-fold serial dilution in culture medium) were added to the cell plates with the CHOK1-FOLR1 cells, and incubated in a CO2 incubator at 37℃ for 72 hours. The plates were added with 50 μl / well Cell Titer Glo reagent (Cat#DD1101-02, Vazyme Biotech Co., Ltd) and incubated for 5 minutes. The cell culture plates were then analyzed by Tecan infinite 200Pro plate-reader. Data were analyzed using Graphpad prism and IC50 values were reported as the antibody concentrations that achieved 50%of maximal inhibition on cell viability.

[0146] The result was shown in FIG. 5. The antibody-DT3C conjugates, including A1E2D1A1-DT3C conjugates, caused cell death with lower IC50 values than the benchmark-DT3C conjugate, meaning the antibodies of the disclosure were more efficiently internalized by the target cells.Example 7. Preparation of anti-FOLR1 Antibodies with heavy chain constant region modification

[0147] The anti-FOLR1 antibodies of the disclosure, including A1E2D1A1, were engineered to contain an IgG1 heavy chain constant region with AQQ-YTE-K447Del modification, and designated as antibody-G1-9, e.g., A1E2D1A1-G1-9, wherein the IgG1 constant region with the mentioned modification had reduced Fcγ receptor binding affinity and can enhance antibody stability and prolong antibody serum half-life.

[0148] Specifically, the heavy and light chain variable regions of the anti-FOLR1 antibodies were cloned in frame to human IgG1 (AQQ, YTE, K447Del) heavy chain constant region (SEQ ID NO: 10) and human kappa light chain constant region (SEQ ID NO: 11) , respectively, wherein the C terminus of the variable region was linked to the N terminus of the respective constant region.

[0149] The vectors each containing a nucleotide encoding a heavy chain variable region linked to human IgG1 heavy chain constant region (AQQ, YTE, K447Del) , and the vectors each containing a nucleotide encoding a light chain variable region linked to human kappa light chain constant region, were transiently transfected into 50 ml of ExpiCHO-Scells in a 1.1: 1 light to heavy chain construct ratio, with 1 mg / mL PEI.Example 8. Preparation and Characterization of Antibody-Drug Conjugates

[0150] The anti-FOLR1 antibodies of the disclosure, including A1E2D1A1-G1-9, were respectively linked to MMAE via MC-VC-PAB (the linker) to generate ADC constructs. The linker-toxin conjugate was abbreviated as VcMMAE herein. FIG. 12 is the schematic diagram of the structure of the resultant antibody-VcMMAE conjugates.

[0151] Briefly, 10 mg / ml anti-FOLR1 antibodies and the benchmark in PBS 6.0 / EDTA (5 mM EDTA in DPBS, pH 6.0, Cat#BC-BPBS-08, Bio-Channerl Inc. ) were adjusted to pH 7.0 ± 0.1 with 1M K2HPO4 aqueous solution, added and incubated with 2.5 equivalents of tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride (TCEP-HCl, Cat#PG82080, Thermo, 5 mM in PBS 6.0 / EDTA) at 37℃ for 2 hours, and then added and incubated with 4.4 equivalents of VcMMAE (Cat#C225, WaterStone Pharmaceuticals (Wuhan) Co., Ltd., 10 mM in DMSO) at room temperature for 2 hours. The obtained ADC constructs were purified using Amersham NAP-25 Columns (Cat#17085202, Cytiva) according to manufacturer’s instruction, and their concentrations were measured using Thermo NanoDrop One spectrophotometer. The number of the VcMMAE molecules conjugated to each antibody, or alternatively the DAR (Drug-to-Antibody Ratio) , was determined by hydrophobic interaction chromatography (HIC) and summarized in Table 4. Table 4. Characterization of ADC Constructs

[0152] The in vitro activity of the ADC constructs to cause cell death was evaluated on a panel of human cancer cell lines, including IGR-OV1 ovarian cancer cell line (Cat#ZQ1019, Shanghai Zhong Qiao Xin Zhou Biotechnology Co., Ltd. ) , Ishikawa endometrial cancer cell line (Cat#ZQ0472, Shanghai Zhong Qiao Xin Zhou Biotechnology Co., Ltd. ) and T47D breast ductal cancer cell line (Cat#ZQ0377, Shanghai Zhong Qiao Xin Zhou Biotechnology Co., Ltd. ) , in a cell-based internalization assay.

[0153] Briefly, 1,000 IGR-OV1 cells were added to 96-well cell culture plates in 150 μL RPMI-1640 medium (Cat#A10491-01, Gibco) supplemented with 10%FBS (Cat#10091-148, Gibco) , and incubated in a 5%CO2 incubator at 37℃. On the next day, 50 μl / well serially diluted ADC constructs (starting at 800 nM (calculated based on the antibody concentration) , 5-fold serial dilution in RPMI-1640 medium) were added to the plates, and the plates were incubated in a 5%CO2 incubator at 37℃ for 6 days. The plates were then added and incubated with 50 μL / well Cell Counting-Lite 2.0 reagent (Cat#DD1101-02, Vazyme) for 5 minutes, and subject to luminescence signal measurement by Tecan infinite 200Pro plate-reader. The luminescence signals were analyzed using Graphpad prism. The results were shown in FIG. 6.

[0154] The test was also performed on the Ishikawa cells following the protocol above. The results were shown in FIG. 7.

[0155] The T47D cells were tested following the protocol above with the following minor modifications. In particular, 1, 500 T47D cells were added to 96-well cell culture plates in 150 μL DMEM medium (Cat#12430-054, Gibco) supplemented with 10%FBS. The ADC constructs were 5-fold serially diluted in DMEM medium, starting at 800 nM, and added to the plates at 50 μl / well. The results were shown in FIG. 8.

[0156] Generally, the ADC constructs of the disclosure, including A1E2D1A1-G1-9-VcMMAE, showed comparable or slightly higher in vitro cytotoxicity as compared to the benchmark-VcMMAE construct against multiple tumor cell lines.Example 9. In Vivo anti-tumor Efficacy of anti-FOLR1 ADCs in Cell-derived Xenograft Ovarian Tumor Model

[0157] The in vivo anti-tumor activity of the ADC constructs of the disclosure were tested in NCG mice (Strain number: T001475, Gempharmatech Co., Ltd. ) implanted with ovarian tumor cells.

[0158] Briefly, the mice were subcutaneously injected with 1×107 OVCAR-3 cells (Cat#HTB-161, ATCC) at the right flank. When the tumors reached an average volume of about 169.73 mm3, 21 tumor-bearing mice were randomized into three groups (n=7 for each group) , and respectively intravenously injected once with vehicle control (10 μL / g body weight, Dulbecco's phosphate-buffered saline, DPBS, Cat#SH30028.02, Cytiva) , the ADC constructs of the disclosure (2.5 mg / kg body weight) or the benchmark-VcMMAE construct (2.5 mg / kg body weight) , the day doing animal grouping and administration was designated as Day 0. Tumor volumes were measured twice a week for four weeks using an electronic caliper and calculated as (length × width2)  / 2, and mice body weights were also measured twice a week.

[0159] The mice were euthanized on Day 28 and tumors were collected and weighed. Tumor growth rate (T / C%= (Vt (the tumor volume measured at Day t) -V0 (the tumor volume measured at Day 0) in each treatment group)  /  (Vt -V0 in vehicle control group) × 100%) , tumor growth inhibition rate (TGITV%= 100%-T / C%) and tumor weight inhibition rate (TGITW%= (tumor weight in vehicle control group) –tumor weight in each treatment group)  / tumor weight in vehicle control group × 100%) were determined. The results were shown in Tables 5, 6 and 7 and FIGs. 9-11. Table 5. Mice body weights a: Mean±SEM; b: Statistical analysis via One-way ANOVA analysis and Dunnett test based on mice weight data on Day 28, compared with the vehicle control group. Table 6. Tumor sizes Table 7. Tumor weights a: Mean±SEM; b: Statistical analysis via One-way ANOVA analysis and Dunnett test based on tumor weight on Day 28, compared with G1.

[0160] All treatments were well tolerated by the tumor-bearing animals. The ADC constructs significantly suppressed tumor growth, and A1E2D1A1-G1-9-VcMMAE showed even higher efficacy than the benchmark-VcMMAE conjugate.

[0161] The sequences in the present application were summarized below.

[0162] VH CDR1 of A1E2D1A1

[0163]

[0164] VH CDR2 of A1E2D1A1

[0165]

[0166] VH CDR3 of A1E2D1A1

[0167]

[0168] VL CDR1 of A1E2D1A1

[0169]

[0170] VL CDR2 of A1E2D1A1

[0171]

[0172] VL CDR3 of A1E2D1A1

[0173]

[0174] VH of A1E2D1A1

[0175]

[0176] VL of A1E2D1A1

[0177]

[0178] IgG1 heavy chain constant region

[0179]

[0180] IgG1 heavy chain constant region (AQQ+YTE+K447 Del)

[0181]

[0182] Light chain constant region

[0183]

[0184] Heavy chain of M9346A

[0185]

[0186] Light chain of M9346A

[0187]

[0188] human FOLR1-Fc

[0189]

[0190] human FOLR1-his

[0191]

[0192] cynomolgus FOLR1-TSA

[0193]

[0194] human FOLR2-his-TS

[0195]

[0196] human FOLR3-his-TS

[0197]

[0198] DT3C

[0199] ***

[0200] While the disclosure has been described above in connection with one or more embodiments, it should be understood that the disclosure is not limited to those embodiments, and the description is intended to cover all alternatives, modifications, and equivalents, as may be included within the spirit and scope of the appended claims. All referenced cited herein are further incorporated by reference in their entirety.

Claims

1.An antibody, or an antigen-binding portion thereof, capable of binding to FOLR1, comprising (i) a heavy chain variable region comprising a VH CDR1, a VH CDR2 and a VH CDR3, and (ii) a light chain variable region comprising a VL CDR1, a VL CDR2 and a VL CDR3, wherein the VH CDR1, the VH CDR2, the VH CDR3, the VL CDR1, the VL CDR2 and the VL CDR3 comprise amino acid sequences of SEQ ID NOs: SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5 and 6, respectively.2.The antibody, or the antigen-binding portion thereof, of claim 1, wherein the heavy chain variable region comprises an amino acid sequence having at least 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%sequence identity to SEQ ID NO: 7.3.The antibody, or the antigen-binding portion thereof, of claim 1, wherein the light chain variable region comprises an amino acid sequence having at least 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%sequence identity to SEQ ID NO: 8.4.The antibody, or the antigen-binding portion thereof, of claim 2, wherein the heavy chain variable region and the light chain variable region comprise amino acid sequences having at least 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%sequence identity to SEQ ID NOs: 7 and 8, respectively.5.The antibody, or the antigen-binding portion thereof, of claim 1, which is an IgG1, IgG2 or IgG4 isotype.6.The antibody, or the antigen-binding portion thereof, of claim 1, comprising a heavy chain constant region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NOs: 9 or 10, linked to the heavy chain variable region, and / or a light chain constant region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11, linked to the light chain variable region.7.The antibody, or the antigen-binding portion thereof, of claim 1, which (a) is able to bind recombinant human FOLR1; (b) is able to bind recombinant monkey FOLR1; (c) is able to bind human FOLR1-expressing cells, (d) is able to be internalized by FOLR1-expressing cells, and / or (e) has in vivo anti-tumor activity.8.The antibody, or the antigen-binding portion thereof, of claim 1, which is a fully human antibody, or antigen-binding portion thereof.9.A nucleic acid molecule encoding the antibody or the antigen-binding portion thereof of claim 1.10.An expression vector comprising the nucleic acid molecule of claim 9.11.A host cell comprising the expression vector of claim 10 or having the nucleic acid molecule of claim 9 incorporated into its genome.12.An immunoconjugate comprising the antibody or the antigen-binding portion thereof of any one of claims 1 to 8 linked to an effector molecule.13.The immunoconjugate of claim 12, wherein the effector molecule is a cytotoxic agent.14.The immunoconjugate of claim 13, wherein the cytotoxic agent is a recombinant protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19 or monomethyl auristatin E (MMAE) .15.The immunoconjugate of claim 13, wherein the cytotoxic agent is linked to the antibody or antigen-binding portion thereof via a linker.16.A composition comprising the antibody or antigen-binding portion thereof of any one of claims 1 to 8, the nucleic acid molecule of claim 9, the expression vector of claim 10, the host cell of claim 11, or the immunoconjugate of any one of claims 12 to 15.17.The composition of claim 16, which is a pharmaceutical composition further comprising a pharmaceutically acceptable carrier.18.A method for treating a cancer associated with FOLR1 over-expression in a subject in need thereof, comprising administering to the subject a therapeutically effective amount of the composition of claim 17.19.The method of claim 18, wherein the cancer is ovarian tumor, endometrial carcinoma, breast cancer, cervical cancer, fallopian tube carcinoma, primary peritoneal carcinoma, non-small cell lung cancer, pancreatic ductal adenocarcinoma, or acute myeloid leukemia.

Images