Low-leakiness and highly inducible hypoxia-responsive promoter and use thereof

Abstract

Provided is a low-leakiness and highly inducible hypoxia-responsive promoter and use thereof. Specifically, provided is a polynucleotide construct comprising at least one hypoxia-responsive element operably linked to a promoter, which can be used for expressing therapeutic genes in target cells under hypoxic conditions such as tumors. In addition, also provided is a recombinant vector, a host cell, a modified immune cell, a pharmaceutical composition, and a kit related to the polynucleotide construct, as well as methods and uses related thereto.

Description

LOW-LEAKINESS AND HIGHLY INDUCIBLE HYPOXIA-RESPONSIVE PROMOTER AND USE THEREOFFIELD OF THE INVENTION

[0001] The present application relates to the field of biotechnology and biomedicine, and in particular, to a low-leakiness and highly inducible hypoxia-responsive promoter and use thereof.BACKGROUND

[0002] In recent years, cell immunotherapies such as CAR-T and CAR-NK have made significant breakthroughs in hematological tumors. However, compared with hematological tumors, cell immunotherapies such as CAR-T and CAR-NK have not been successfully applied to the treatment of solid tumors. The reasons lie in that on the one hand, it is difficult for CAR-T and CAR-NK cells to enter solid tumors, and on the other hand, an immunosuppressive microenvironment of solid tumors has an inhibitory effect on immune cells. Currently, the structural design of a new generation of CARs, comprising armored cell factors, often starts from activating immune cells in the tumor microenvironment to promote anti-tumor effects. However, the armored cell factors typically have relatively severe toxic side effects. Therefore, how to overcome the above treatment barrier has become the key to applying cell therapies to tumor treatment, especially solid tumor treatment.

[0003] Under hypoxic conditions, the expression level of hypoxia-inducible factor-1 (HIF-1) in cells increases, and the binding activity of the HIF-1 to target genes increases, leading to a series of cellular responses to hypoxia. More than 60 target genes of HIF-1 have been discovered, all of which have hypoxia-responsive elements (HREs) . Therefore, HREs may be used for manufacturing a vector that can exhibit high-efficiency expression under hypoxic conditions in tumors and exhibit low-leakiness expression under normoxic conditions in normal tissues, so as to provide an effective tool for applying and developing cell therapies in solid tumors.

[0004] It should be noted that methods described in this section may not necessarily be the methods previously envisioned or adopted. Unless otherwise specified, it should not be assumed that any method described in this section constitutes prior art merely by virtue of its inclusion herein. Similarly, unless otherwise specified, problems mentioned in this section should not be presumed to be universally acknowledged in any prior art.SUMMARY

[0005] The present application provides a polynucleotide construct, which can be used for efficiently expressing therapeutic genes in target cells under hypoxic conditions such as tumors, thereby improving the efficacy and safety of cell therapies in solid tumor treatment.

[0006] In one aspect, the present application provides a polynucleotide construct comprising a regulatory sequence operably linked to a promoter, wherein the regulatory sequence comprises at least one hypoxia-responsive element (HRE) , and the promoter comprises the nucleotide sequence as set forth in SEQ ID NO: 10.

[0007] In another aspect, the present disclosure provides a recombinant vector comprising the polynucleotide construct as provided herein.

[0008] In another aspect, the present disclosure provides a host cell comprising the polynucleotide construct as provided herein, or the recombinant vector as provided herein.

[0009] In another aspect, the present disclosure provides a modified immune cell comprising the polynucleotide construct as provided herein, or the recombinant vector as provided herein.

[0010] In another aspect, the present disclosure provides a pharmaceutical composition comprising the polynucleotide construct, the recombinant vector, the host cell, or the modified immune cell as provided herein, and one or more pharmaceutically acceptable carriers.

[0011] In another aspect, the present disclosure provides a kit comprising the polynucleotide construct, the recombinant vector, the host cell, the modified immune cell, or the pharmaceutical composition as provided herein.

[0012] In another aspect, the present disclosure provides a method for detecting, preventing, alleviating, or treating a disease, wherein the method comprises administering the polynucleotide construct, the recombinant vector, the host cell, the modified immune cell, the pharmaceutical composition, or the kit as provided herein to a subject in need thereof.

[0013] It should be understood that the content described in this section is not intended to identify key or important features of examples of the present application, nor is it intended to limit the scope of the present application. Other features of the present application will be easily understood through the following specification.BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

[0014] The accompanying drawings exemplarily illustrate examples and form a part of the specification, which, together with textual description of the specification, are used for explaining exemplary embodiments of the examples. The examples illustrated are for illustrative purposes only and do not limit the scope of the claims. In all drawings, the same reference numerals refer to similar but not necessarily identical elements.

[0015] FIG. 1 shows a schematic diagram of a self-inactivating LTR retroviral vector pRFFu-mini described in Example 1.

[0016] FIG. 2 shows a schematic diagram of a non-self-inactivating retroviral vector pCigar-V2 (LTR) described in Example 1.

[0017] FIG. 3 shows a schematic diagram of a self-inactivating LTR lentiviral vector pSF-AQ (EF1A-HTLV) described in Example 1.

[0018] FIG. 4 shows schematic diagrams illustrating the arrangements of structural elements in plasmid vectors described in Example 1.

[0019] FIG. 5 shows the transcriptional activity of the polynucleotide construct 6×PGK-HRE-MinP, 6×PGK-HRE-Mini-SV40, 3×PGK-HRE-Mini-SV40, 6×VEGF-HRE-Mini-SV40, or 6×HSP-HRE-Mini-SV40 in NK cells, as described in Example 4.

[0020] FIG. 6 shows the transcriptional activity of the polynucleotide construct 6×PGK-HRE-MinP, 6×PGK-HRE-Mini-SV40, 3×PGK-HRE-Mini-SV40, 6×VEGF-HRE-Mini-SV40, or 6×HSP-HRE-Mini-SV40 in T cells, as described in Example 4.

[0021] FIG. 7 shows the transcriptional activity of the polynucleotide construct 6×PGK-HRE-MinP, 6×PGK-HRE-Mini-SV40, 3×PGK-HRE-Mini-SV40, 6×VEGF-HRE-Mini-SV40, or 6×HSP-HRE-Mini-SV40 in iNKT cells, as described in Example 4.

[0022] FIG. 8 shows the transcriptional activity of the polynucleotide construct 6×PGK-HRE-MinP, 6×PGK-HRE-Mini-SV40, 6×PGK-HRE-Mini-IL2, 6×PGK-HRE-Mini-CMV, 6×PGK-HRE-Mini-TK, or 6×PGK-HRE-Mini-Ade in NK cells, as described in Example 4.

[0023] FIG. 9 shows the transcriptional activity of the polynucleotide construct 6×PGK-HRE-MinP, 6×PGK-HRE-Mini-SV40, 6×PGK-HRE-Mini-IL2, 6×PGK-HRE-Mini-CMV, 6×PGK-HRE-Mini-TK, or 6×PGK-HRE-Mini-Ade in T cells, as described in Example 4.

[0024] FIG. 10 shows the transcriptional activity of the polynucleotide construct 6×PGK-HRE-MinP, 6×PGK-HRE-Mini-SV40, 6×PGK-HRE-Mini-IL2, 6×PGK-HRE-Mini-CMV, 6×PGK-HRE-Mini-TK, or 6×PGK-HRE-Mini-Ade in iNKT cells, as described in Example 4.

[0025] FIG. 11 and FIG. 12 show the transcriptional activity of the polynucleotide construct 6×ERSE-MinP, 6×UPRE-MinP, 6×PGK-HRE-MinP, or 6×HSE-MinP in NK cells, as described in Example 4.

[0026] FIG. 13 and FIG. 14 show the transcriptional activity of the polynucleotide construct 6×ERSE-MinP, 6×UPRE-MinP, 6×PGK-HRE-MinP, or 6×HSE-MinP in T cells, as described in Example 4.

[0027] FIG. 15 shows flow cytometry analysis results of the cytotoxicity of NK cells on CLDN18.2 CXCL9-AsPC-1 cells, as described in Example 5, wherein NK-HRE refers to NK cells transduced with 6×PGK-HRE-MinP virus, NK-HSE refers to NK cells transduced with 6×HSE-MinP virus, NK-NR4A refers to NK cells transduced with 8×NR4A-MinP virus, and NK-LTR refers to NK cells transduced with a control virus vector pCigar-V2 (LTR) that does not comprise the polynucleotide construct of the present disclosure.

[0028] FIG. 16 shows flow cytometry analysis results of NK cells on day 12 (denoted as NK-D12) or T cells on day 10 (denoted as T-D10) transduced with the polynucleotide construct 6×PGK-HRE-MinP (denoted as HRE) , 8×NR4A-MinP (denoted as NR4A) or a control virus vector pCigar-V2 (LTR) that does not comprise the polynucleotide construct of the present disclosure (denoted as LTR) , as described in Example 5.

[0029] FIG. 17 shows the results of in vivo imaging analysis demonstrating the expression of the polynucleotide constructs in NK cells and T cells in mice, as described in Example 5. The cells were transduced with 6×PGK-HRE-MinP (denoted as HRE) , 8×NR4A-MinP (denoted as NR4A) or a control virus vector pCigar-V2 (LTR) that does not comprise the polynucleotide construct of the present disclosure (denoted as LTR) . Blank refers to the control group of mice that were not injected with a mixed solution of NK and T cells.

[0030] FIG. 18 shows an example of flow cytometry analysis results demonstrating the expression of the polynucleotide constructs in NK cells and T cells in tumor and spleen tissues of mice, as described in Example 5. The cells were transduced with 6×PGK-HRE-MinP (denoted as HRE) , 8×NR4A-MinP (denoted as NR4A) or a control virus vector pCigar-V2 (LTR) that does not comprise the polynucleotide construct of the present disclosure (denoted as LTR) .

[0031] FIG. 19 shows flow cytometry analysis statistics demonstrating the expression of the polynucleotide constructs in NK cells and T cells in tumor and spleen tissues of mice, as described in Example 5. The cells were transduced with 6×PGK-HRE-MinP (denoted as HRE) , 8×NR4A-MinP (denoted as NR4A) or a control virus vector pCigar-V2 (LTR) that does not comprise the polynucleotide construct of the present disclosure (denoted as LTR) .

[0032] FIG. 20 shows the transcriptional activity of the polynucleotide construct 6×PGK-HRE-MinP, 6×hPGK-HRE-MinP, 6×hEnolase-HRE-MinP, 6×hAldolase-HRE-MinP, 6×hVEGF-HRE-MinP, or 6×hEPO-HRE-MinP in T cells, as described in Example 6.

[0033] FIG. 21 shows the transcriptional activity of the polynucleotide construct 6×PGK-HRE-MinP, 6×hPGK-HRE-MinP, 6×hEnolase-HRE-MinP, 6×hAldolase-HRE-MinP, 6×hVEGF-HRE-MinP, or 6×hEPO-HRE-MinP in iNKT cells, as described in Example 6.DETAILED DESCRIPTION

[0034] Unless otherwise specified, all numbers used in this specification and the claims to indicate content, concentration, proportion, mass, volume, time, temperature, thickness, technical effect, and the like shall be understood as being modified by terms "about" or "approximately" in any case. Therefore, unless otherwise indicated, numerical parameters listed in the following specification and the appended claims are approximate values. For those skilled in the art, the numerical parameters may vary based on expected properties and effects sought through the present disclosure, and each numerical parameter should be interpreted based on the number of significant figures and conventional rounding methods or in a way understood by those skilled in the art.

[0035] Although a broad range of numerical values and parameters in the present disclosure are described as approximate values, the numerical values described in specific examples are provided as accurately as possible. However, any numerical value inherently contains certain errors, which are inevitably caused by standard deviation found in corresponding tests and measurements. Each numerical range provided in this specification will comprise every narrower numerical range that falls within the wider range, as if the narrower numerical ranges are explicitly stated herein.

[0036] Unless otherwise specified or contradictory to the context, terms or expressions used in herein should be read in conjunction with the overall content herein and as understood by one of ordinary skill in the art. Unless otherwise limited, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art.

[0037] When used herein, the expression "A and / or B" includes three situations: (1) A; (2) B; and (3) A and B. The expression "A, B, and / or C" includes seven situations: (1) A; (2) B; (3) C; (4) A and B; (5) A and C; (6) B and C; and (7) A, B, and C. The meanings of similar expressions can be inferred in this way.

[0038] When used herein, the expressions "comprise" , "include" , and "contain" indicate that elements other than those listed are not excluded.

[0039] The terms "nucleic acid" and "polynucleotide" in the present application can be used interchangeably to refer to an aggregated form of nucleotides of any length, including deoxyribonucleotides, ribonucleotides, combinations thereof, and analogues thereof.

[0040] The terms "polypeptide" and "peptide" in the present application can be used interchangeably to refer to amino acid polymers of any length. Therefore, the terms polypeptide, oligopeptide, protein, antibody, and enzyme are all included in the definition of polypeptide.

[0041] The terms "operably linked" and "operable linkage" in the present application can be used interchangeably, referring to a functional linkage between a nucleic acid sequence and a regulatory sequence in a manner that allows expression (e.g., in a cis-acting manner) . The term “regulatory sequence” used herein refers to a nucleic acid molecule capable of directing or modulating the transcription of a target gene. Non-limiting examples of the regulatory sequence include promoters, enhancers, responsive elements, protein recognition sites, induction elements, promoter control elements, protein binding sequences, 5' and 3' untranslated regions, transcription start sites, terminator sequences, polyadenylation sequences, and / or introns. In some embodiments, the regulatory sequence includes at least one hypoxia-responsive element.

[0042] The term "promoter" in the present application refers to a polynucleotide sequence that can control the transcription of a coding sequence. A promoter sequence comprises a specific sequence sufficient to enable the recognition, binding, and transcription initiation of RNA polymerase, and may optionally comprise a sequence that regulates the activity of the recognition, binding, and transcription initiation of the RNA polymerase. A promoter may affect the transcription of a gene located on the same nucleic acid molecule (e.g., in a cis-acting manner) .

[0043] In the present application, "upstream" refers to the direction towards the 5' end of a gene or the N-terminus of a protein, "downstream" refers to the direction towards the 3' end of a gene or the C-terminus of a protein, and "from upstream to downstream" refers to the direction from the 5' end to the 3' end or from the N-terminus to the C-terminus.

[0044] The term "chimeric antigen receptor" or "CAR" in the present application refers to a group of polypeptides that, when present in an immune effector cell, provide specificity for a target cell (e.g., a cancer cell) and generate intracellular signals. In some examples, the CAR at least comprises an extracellular antigen binding domain, a transmembrane domain, and an intracellular signaling domain.

[0045] The term "vector" in the present application refers to a self-replicating DNA molecule that transfers an exogenous target gene into a host organism, and is often in the form of a circular double-stranded DNA molecule. Typical vectors comprise plasmids, viruses, bacteriophages, cosmids, and microchromosomes. Plasmids are the most common form of the vector, referring to a circular double-stranded DNA that can accept an exogenous nucleic acid fragment and can replicate in a prokaryotic or eukaryotic cell.

[0046] The terms "expression vector" and "recombinant vector" in the present application can be used interchangeably to refer to a vector that contains an exogenous gene and also contains regulatory elements operably linked to the exogenous gene to allow for its expression in a designated host organism. When introduced into an appropriate host organism, an expression vector can express an inserted target gene.

[0047] The terms "exogenous" or "heterologous" in the present application can be used interchangeably to refer to a source that is different from a native (or endogenous) organism, for example, an organism derived from another species. The term "heterologous gene" or "exogenous gene" in the present application refers to a gene that does not naturally exist in a host organism and is introduced into the host organism through gene transfer.

[0048] The term "transform" in the present application refers to the transfer of an exogenous gene into a host organism such as a host cell, causing stable genetic inheritance. A transformed gene may be in the form of plasmids retained in a host organism or may be integrated into the genome of the host organism. A host organism containing a transformed gene is referred to as a "transgenic" or "recombinant" or "transformed" organism or an "engineered" organism. A host organism may be transformed by an expression vector using a conventional technique well-known to those skilled in the art. When a host is a prokaryotic organism, competent cells capable of absorbing DNA can be harvested after an exponential growth phase and treated with the CaCl2 method, the steps of which are well known in the art. If necessary, methods such as microinjection, electroporation, or liposome packaging may also be used, which are well-known techniques in the art and will not be described in detail here.

[0049] The terms "alleviate" , "treat" , and synonyms thereof in the present application refer to improvement of diseases, disorders, and / or conditions. "Alleviate" and "treat" may be improvement in at least one measurable physical parameter, and this parameter may not be recognizable by a patient. "Alleviate" and "treat" may also refer to inhibition of development of diseases, disorders, and / or conditions physically (e.g., stabilization of recognizable symptoms) , physiologically (e.g., stabilization of physical parameters) , or both. "Alleviate" and "treat" may also refer to slowing down or reversing the development of diseases, disorders, and / or conditions.

[0050] The term "prevent" and synonyms thereof in the present application refer to delaying the onset of specific diseases, disorders, and / or conditions, delaying the onset of symptoms related to the diseases, disorders, and / or conditions, or reducing the risk of acquiring the diseases, disorders, and / or conditions.

[0051] To better illustrate the objectives, features, and advantages of the present application, the specific embodiments of the present application are described in detail below.

[0052] Polynucleotide construct

[0053] In one aspect, the present application provides a polynucleotide construct comprising a regulatory sequence operably linked to a promoter. The regulatory sequence comprises at least one hypoxia-responsive element (HRE) , and the promoter comprises the nucleotide sequence as set forth in SEQ ID NO: 10.

[0054] The term "hypoxia-responsive element" or "HRE" as used herein refers to a cis-acting transcriptional regulatory element that mediates gene expression in response to low oxygen levels (hypoxia) . Structurally, an HRE typically comprises a consensus core sequence (e.g., 5'-RCGTG-3', wherein R is a purine) that could be recognized and bound by Hypoxia-Inducible Factors (HIFs) , such as the HIF-1 complex or HIF-2 complex. In the context of the present disclosure, the at least one HRE is operably linked to a promoter to confer hypoxia responsiveness, thereby initiating or enhancing the transcription of the downstream target gene under hypoxic conditions. The HRE may be derived from a natural source, such as a human, mouse, or rat sequence, or may be a synthetic or artificial sequence. Exemplary HREs include, but are not limited to, those derived from the regulatory regions of hypoxia-inducible genes such as Phosphoglycerate Kinase (PGK) , Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) , Erythropoietin (EPO) , Enolase, Aldolase, Lactate Dehydrogenase A (LDHA) , Glucose Transporter 1 (GLUT1) , Carbonic Anhydrase IX (CA9) , and Heat Shock Proteins (HSP) . The term "hypoxia-responsive element" or "HRE" further encompasses functional variants of the naturally occurring or synthetic HRE sequences described herein. As used herein, a "variant" refers to a nucleic acid sequence having at least about 80%, at least about 85%, at least about 90%, at least about 91%, at least about 92%, at least about 93%, at least about 94%, at least about 95%, at least about 96%, at least about 97%, at least about 98%, or at least about 99%sequence identity to a reference HRE sequence (e.g., the PGK-HRE sequence set forth in SEQ ID NO: 1) , provided that the variant retains the ability to bind HIFs and mediate transcriptional activation under hypoxic conditions. Such variants may comprise one or more nucleotide substitutions, additions, or deletions relative to the reference sequence, typically occurring in the regions flanking the core consensus motif (e.g., 5'-RCGTG-3') while preserving the core motif essential for HIF binding.

[0055] The promoter of the present disclosure is especially suitable for transcription of the target gene under hypoxia conditions. In some embodiments, the promoter is a minimal promoter comprising fundamental promoter elements but exhibiting minimal or negligible basal transcriptional activity in the absence of upstream activation. When operably linked to the HRE as described herein, the promoter functions to maintain a "silent" state under normoxic conditions (low leakiness) to ensure safety, while mediating high-level transcription of the target gene upon binding of HIFs to the HRE under hypoxic conditions (high inducibility) . The promoter of the present disclosure comprises the nucleotide sequence as set forth in SEQ ID NO: 10.

[0056] In some embodiments, the HRE is selected from the group consisting of phosphoglycerate kinase hypoxia-responsive element (PGK-HRE) , enolase hypoxia-responsive element (Enolase-HRE) , aldolase hypoxia-responsive element (Aldolase-HRE) , vascular endothelial growth factor hypoxia-responsive element (VEGF-HRE) , and erythropoietin hypoxia-responsive element (EPO-HRE) . In some embodiments, the PGK-HRE comprises the nucleotide sequence as set forth in SEQ ID NO: 37 or 1. In some embodiments, the Enolase-HRE comprises the nucleotide sequence as set forth in SEQ ID NO: 38. In some embodiments, the Aldolase-HRE comprises the nucleotide sequence as set forth in SEQ ID NO: 39. In some embodiments, the VEGF-HRE comprises the nucleotide sequence as set forth in SEQ ID NO: 40. In some embodiments, the EPO-HRE comprises the nucleotide sequence as set forth in SEQ ID NO: 41. In preferred embodiments, the HRE is PGK-HRE. In preferred embodiments, the PGK-HRE comprises the nucleotide sequence as set forth in SEQ ID NO: 37 or 1.

[0057] In some embodiments, the regulatory sequence comprises at least one HRE, at least two HREs, at least three HREs, at least four HREs, at least five HREs, at least six HREs, at least seven HREs, at least eight HREs, at least nine HREs, at least ten HREs. In some embodiments, the regulatory sequence comprises at least six HREs. In preferred embodiments, the regulatory sequence comprises six HREs.

[0058] In some embodiments, the regulatory sequence comprises six PGK-HREs (6×PGK-HRE) . In some embodiments, the regulatory sequence comprises six Enolase-HREs (6×Enolase-HRE) . In some embodiments, the regulatory sequence comprises six Aldolase-HREs (6×Aldolase-HRE) . In some embodiments, the regulatory sequence comprises six VEGF-HREs (6×VEGF-HRE) . In some embodiments, the regulatory sequence comprises six EPO-HREs (6×EPO-HRE) . In preferred embodiments, the regulatory sequence comprises six PGK-HREs (6×PGK-HRE) .

[0059] In some embodiments, the adjacent HREs are linked via a first spacer sequence. In some embodiments, each first spacer sequence comprises at least six nucleotides. In some embodiments, each first spacer sequence independently comprises the nucleotide sequence TCTAGT or GCTAGC.

[0060] In preferred embodiments, the regulatory sequence comprises six PGK-HREs, the adjacent PGK-HREs are linked via a first spacer sequence, and each first spacer sequence comprises the nucleotide sequence TCTAGT or GCTAGC.

[0061] In some embodiments, the regulatory sequence comprises, in order from the 5’ to the 3' end: HRE, the first spacer sequence, HRE, the first spacer sequence, HRE, the first spacer sequence, HRE, the first spacer sequence, HRE, the first spacer sequence, HRE, and the first spacer sequence.

[0062] In preferred embodiments, the regulatory sequence comprises, in order from the 5’ to the 3' end: PGK-HRE, the first spacer sequence TCTAGT, PGK-HRE, the first spacer sequence TCTAGT, PGK-HRE, the first spacer sequence GCTAGC, PGK-HRE, the first spacer sequence TCTAGT, PGK-HRE, the first spacer sequence TCTAGT, PGK-HRE, and the first spacer sequence GCTAGC.

[0063] In some embodiments, the regulatory sequence further comprises the sequence GAGCTC, and the sequence GAGCTC is located at the 5' end of the regulatory sequence.

[0064] In some embodiments, the regulatory sequence comprises the nucleotide sequence as set forth in any one of SEQ ID NOs: 2 and 42-46.

[0065] In preferred embodiments, the regulatory sequence comprises the nucleotide sequence as set forth in SEQ ID NO: 42 or 2.

[0066] In some embodiments, the regulatory sequence is located upstream of the promoter. In some embodiments, the regulatory sequence is operably linked to the promoter via a second spacer sequence. In some embodiments, the polynucleotide construct comprises, in order from the 5’ to the 3' end: the regulatory sequence, the second spacer sequence, and the promoter.

[0067] In some embodiments, the second spacer sequence comprises at least 12 nucleotides. In preferred embodiments, the second spacer sequence comprises 12 nucleotides. In preferred embodiments, the second spacer sequence comprises the nucleotide sequence as set forth in SEQ ID NO: 30.

[0068] In some embodiments, the polynucleotide construct comprises the nucleotide sequence as set forth in any one of SEQ ID NOs: 20 and 47-51. In preferred embodiments, the polynucleotide construct comprises the nucleotide sequence as set forth in SEQ ID NO: 47 or 20.

[0069] In some embodiments, the polynucleotide construct provided herein further comprises a nucleotide sequence encoding a chimeric antigen receptor (CAR) .

[0070] Recombinant vector, host cell, and modified immune cell

[0071] In another aspect, the present disclosure provides a recombinant vector comprising the polynucleotide construct as provided herein.

[0072] The recombinant vector suitable for the polynucleotide construct as provided herein is well known in the art and is not limited here. Both viral and non-viral expression vectors can be used for delivering the polynucleotide construct as provided herein to host cells. Non-viral vectors and systems comprise, but are not limited to, plasmids, episomal vectors (typically with expression cassettes for expressing proteins or RNA) , and human artificial chromosomes (see, for example, Harrington et al., Nat Genet. [Natural Genetics] 15: 345, 1997, the content of which is hereby incorporated herein by reference) . Viral vectors comprise, but are not limited to, lentiviral vectors, retroviral vectors, adenoviral vectors, adeno-associated viral vectors, poxviral vectors, and herpesviral vectors. In some embodiments, the expression vector comprises a plasmid vector, a retroviral vector, a lentiviral vector, an adenoviral vector, an adeno-associated viral vector, a transposon vector, a CRISPR / Cas gene editing delivery vector, or an RNA vector.

[0073] The recombinant vector in the present disclosure may be constructed using well-known methods in the art. For example, suitable restriction sites may be added to both ends of the polynucleotide in the present application based on restriction sites contained in a backbone vector used, and then the polynucleotide is loaded into the backbone vector.

[0074] In another aspect, the present disclosure provides a host cell comprising the polynucleotide construct as provided herein, or the recombinant vector as provided herein. In some embodiments, the host cell as provided herein is a microorganism cell, a yeast cell, or a mammalian cell. In some embodiments, the host cell is a tumor cell.

[0075] In another aspect, the present disclosure provides a modified immune cell comprising the polynucleotide construct as provided herein, or the recombinant vector as provided herein. In some embodiments, the immune cell is a human immune cell. In some embodiments, the immune cell is selected from T cells (including CD8+ T cells, CD4+ T cells (e.g., Th1, Th2, Th17, and Foxp3+ cells) , memory T cells (such as T memory stem cells, central, and effector memory cells) , terminally differentiated effector T cells, γδ T cells, and regulatory T cells (Tregs) ) , natural killer (NK) cells, NKT cells (e.g., iNKT cells) , tumor infiltrating lymphocytes (TILs) , cytotoxic T lymphocytes (CTLs) , and dendritic cells (DCs) . In preferred embodiments, the immune cells is a T cell, a NK cell or an iNKT cell.

[0076] In some embodiments, the modified immune cell provided herein comprises the polynucleotide construct of the present disclosure configured to direct the expression of a CAR. Specifically, the modified immune cell comprises a nucleotide sequence encoding a CAR that is operably linked to the regulatory sequence and promoter described herein. Accordingly, the modified immune cell is capable of expressing the CAR in a manner regulated by the hypoxic environment, for example, in a tumor microenvironment.

[0077] In some embodiments, the CAR comprises an extracellular antigen binding domain targeting an antigen of interest, a transmembrane domain, and an intracellular signal transduction domain. In some embodiments, the CAR provided herein further comprises one or more costimulatory domains. In some embodiments, the CAR provided herein further comprises a hinge domain between the extracellular binding domain and the transmembrane domain. In some embodiments, the CAR further comprises a signal peptide linked to the extracellular binding domain. In some embodiments, the extracellular binding domain further comprises an additional binding domain. In some embodiments, the additional binding domain binds to an additional antigen of interest.

[0078] In further embodiments, the modified immune cells provided herein are categorized as "Fourth Generation" CAR-T cells, also referred to in the art as "Armored CARs" or TRUCKs (T cells Redirected for Universal Cytokine-mediated Killing) . These cells are engineered to co-express a CAR and one or more immune-modulatory payloads. Unlike conventional second-or third-generation CAR-T cells that rely primarily on intracellular costimulatory signaling domains (e.g., CD28 or 4-1BB) for activation and persistence, the Fourth Generation CAR-T cells are designed to actively remodel the tumor microenvironment through the targeted delivery of said payloads.

[0079] The polynucleotide construct may be delivered into the host cell or immune cells by any suitable method known in the art, which is not limited herein.

[0080] Pharmaceutical composition and kit

[0081] In another aspect, the present application provides a pharmaceutical composition comprising the polynucleotide construct as provided herein, the recombinant vector as provided herein, the host cell as provided herein, or the modified immune cell as provided herein, and one or more pharmaceutically acceptable carriers.

[0082] In some embodiments, the carrier may be any compatible and physiologically acceptable non-toxic substance suitable for delivering the polypeptide, the polynucleotide, or the recombinant vector as provided herein into mammals (e.g., humans) .

[0083] The "pharmaceutically acceptable carrier" refers to a carrier, a diluent, or an adjuvant used for the medicament manufacture or administration of the polypeptide, the polynucleotide, or the recombinant vector as provided herein, which is not an essential active ingredient and does not have excessive toxicity after administration. Suitable pharmaceutically acceptable carriers are well known to one of ordinary skill in the art.

[0084] The "physiologically acceptable carrier" refers to a carrier, a diluent, or an adjuvant that does not cause significant irritation to an organism and does not eliminate the pharmacological activity or property of the polypeptide, the polynucleotide, or the recombinant vector as provided herein. Suitable physiologically acceptable carriers are also well known to one of ordinary skill in the art.

[0085] In some embodiments, the pharmaceutical composition further comprises a pharmaceutically acceptable auxiliary material. In some embodiments, the auxiliary material comprises at least one of a solubilizer, a disintegrant, a wetting agent, a stabilizer, a thickener, a diluent, a buffering agent, and a corrigent.

[0086] In some non-limiting embodiments, the carrier and / or the auxiliary material used in the pharmaceutical composition in the present application may comprise, for example, a liquid, gel or solid carrier, an aqueous vehicle, a non-aqueous vehicle, an antimicrobial agent, an isotonic agent, a buffering agent, an antioxidant, a suspension agent, a dispersant, a chelating agent, a diluent, an adjuvant, an excipient or non-toxic auxiliary substance, other components known in the art, or various combinations thereof.

[0087] In another aspect, the present application provides a kit comprising the polynucleotide construct as provided herein, the recombinant vector as provided herein, the host cell as provided herein, the modified immune cell as provided herein, or the pharmaceutical composition as provided herein.

[0088] Use and method

[0089] In another aspect, the present application provides a method for detecting, preventing, alleviating, or treating a disease. The method comprises administering the polynucleotide construct as provided herein, the recombinant vector as provided herein, the host cell as provided herein, the modified immune cell as provided herein, the pharmaceutical composition as provided herein, or the kit as provided herein to a subject in need thereof.

[0090] In another aspect, the present application provides use of the polynucleotide construct as provided herein, the recombinant vector as provided herein, the host cell as provided herein, the modified immune cell as provided herein, the pharmaceutical composition as provided herein, or the kit as provided herein in the manufacture of a medicament or a reagent for detecting, preventing, alleviating, or treating a disease.

[0091] In another aspect, the present application provides the polynucleotide construct as provided herein, the recombinant vector as provided herein, the host cell as provided herein, the modified immune cell as provided herein, the pharmaceutical composition as provided herein, or the kit as provided herein for use in detecting, preventing, alleviating, or treating a disease.

[0092] In some embodiments, the disease comprises tumors or cancers. In some embodiments, the disease is a solid tumor. In some embodiments, the cancer is selected from the group consisting of: gastric cancer, pancreatic cancer, hepatocellular carcinoma (liver cancer) , lung cancer (e.g., non-small cell lung cancer or small cell lung cancer) , head and neck squamous cell carcinoma, prostate cancer, colorectal cancer (colon cancer) , breast cancer, lymphoma, gallbladder cancer, renal cell carcinoma (kidney cancer) , bladder cancer, melanoma, esophageal cancer, ovarian cancer, cervical cancer, leukemia, myeloma, and brain tumors.

[0093] In the use or method according to the present application, the administration dosage of the polynucleotide construct as provided herein, the recombinant vector as provided herein, the host cell as provided herein, the modified immune cell as provided herein, the pharmaceutical composition as provided herein, and / or the kit as provided herein may depend on several factors, including the severity and responsiveness of symptoms, the route of administration, the duration of treatment (several days to several months to several years) , and the time to the improvement of symptoms. Those skilled in the art can adjust a dosage regimen according to the specific situation of patients to provide treatment response. For example, a single dose can be administered, or several separate doses can be administered within a predetermined time period, or the dosage can be reduced or increased as indicated by the treatment situation. The dosage is determined by specific treatment effects to be achieved. The dosage can also vary with the type and the severity of conditions to be alleviated. For any specific subject, a specific dosage regimen can be adjusted over time based on individual needs and professional determination of a clinician.

[0094] The various embodiments and preferred options disclosed above can be combined with each other (as long as they are not inherently contradictory to each other) , and various embodiments formed by such combination are considered as a part of the disclosure of the present application.

[0095] Exemplary examples of the present application are explained below in conjunction with the accompanying drawings, which include various details of the examples of the present application to help understanding. It should be understood that the examples are considered merely exemplary and are not intended to limit the scope of protection of the present application. The scope of protection of the present application is limited only by the claims. Therefore, one of ordinary skill in the art should know that various changes and modifications can be made to the examples described herein without departing from the scope of the present application. Moreover, for clarity and conciseness, descriptions of well-known functions and structures are omitted in the following description.

[0096] Examples

[0097] If specific techniques or conditions are not specified in this example, the techniques or conditions described in literature in the art or product manuals are followed. The reagents or instruments used without specifying the manufacturer are conventional products that can be obtained through commercial purchase.

[0098] Example 1: Plasmid construction

[0099] The polynucleotide construct comprised the regulatory sequence 6×PGK-HRE (the nucleotide sequence as set forth in SEQ ID NO: 2) , and the regulatory sequence 6×PGK-HRE comprised 6 phosphoglycerate kinase hypoxia-responsive elements (PGK-HRE, the nucleotide sequence as set forth in SEQ ID NO: 1) and also comprised first spacer sequences (the nucleotide sequence of TCTAGT or GCTAGC) . In addition, the regulatory sequences as set forth in SEQ ID NOs: 3 to 9 were also used in this example, for example: the tandem sequences (3×PGK-HRE, 6×VEGF-HRE, and 6×HSP-HRE) of hypoxia-responsive elements, the tandem sequences (6×ERSE and 6×UPRE) of endoplasmic reticulum stress elements, the tandem sequence (6×HSE) of a heat stress element, the tandem sequence (8×NR4A) of a T cell activation response element, and the like. The nucleotide sequences of the above regulatory sequences are set forth in Table 1 below. Table 1 Nucleotide sequences of hypoxia-responsive elements

[0100] The polynucleotide constructs as provided herein further comprise a promoter MinP (the sequence as set forth in SEQ ID NO: 10) . In addition, several minimal promoters from different genes as set forth in any one of SEQ ID NOs: 11 to 15 were also used in this example. The nucleotide sequences of the above promoters are set forth in Table 2 below. Table 2 Nucleotide sequences of promoters

[0101] The sequences of the polynucleotide constructs as provided herein are set forth in Table 3 below, and the polynucleotide constructs comprise the regulatory sequences set forth in Table 1 above and the promoters set forth in Table 2 above, and also comprise the second spacer sequence (the nucleotide sequence as set forth in SEQ ID NO: 30) . Based on the sequence information in Table 3, nucleotide sequences were synthesized (Nanjing GenScript Biotech Corporation) and cloned between restriction sites XholI and EcoRI of a sin LTR retroviral vector pRFFu-mini (with the vector structure shown in FIG. 1, and the nucleotide sequence as set forth in SEQ ID NO: 31) , which carries a PpyRE9-Clover firefly luciferase (with the nucleotide sequence as set forth in SEQ ID NO: 29) and a green fluorescent protein fusion reporter gene system, to obtain corresponding retroviral plasmids (with the plasmid structure shown in FIG. 4) , wherein PGKp is a mouse phosphoglycerate kinase (PGK) promoter (the sequence as set forth in SEQ ID NO: 35) , and Puro is a puromycin resistance gene (the sequence as set forth in SEQ ID NO: 36) .

[0102] Meanwhile, the company's non-self-inactivating retroviral vector pCigar-V2 (LTR) (with the vector structure shown in FIG. 2 and the nucleotide sequence as set forth in SEQ ID NO: 32) and lentiviral vector pSF-AQ (EF1A-HTLV) (with the vector structure shown in FIG. 3 and the nucleotide sequence as set forth in SEQ ID NO: 33) were used as controls for promoter activity strength in subsequent experiments. Table 3 Sequences of polynucleotide constructs

[0103] Example 2: Virus packaging

[0104] A virus was packaged according to 14 retroviral plasmids carrying reporter genes (Nanjing GenScript Biotech Corporation) , as well as the company's existing pCigar-V2 and pSF-AQ plasmids as described in Example 1. Except for pSF-AQ, which is lentiviral, all others are retroviral. The packaging method is briefly described as follows:

[0105] The 6th to 10th generation 293T cells (from the cell bank of Chinese Academy of Sciences, SCSP-502) were inoculated at the density of 1×106 and cultured in a 6-well plate at 37℃ with 5%CO2 overnight to be used for transfection, and the culture medium was DMEM containing 10%fetal bovine serum (Gibco) .

[0106] 1.5 μg of retroviral plasmids that express the regulatory elements 6×PGK-HRE-Mini-SV40, 3×PGK-HRE-Mini-SV40, 6×VEGFHRE-Mini-SV40, 6×HSPHRE-Mini-SV40, 6×PGK-HRE-MinP, 6×PGK-HRE-Mini-IL2, 6×PGK-HRE-Mini-Ade, 6×PGK-HRE-Mini-TK, 6×PGK-HRE-Mini-CMV, 6×ERSE-MinP, 6×UPRE-MinP, 6×HSE-MinP, or 8×NR4A-MinP (with the sequences as set forth in Table 3) , 1.5 μg of the control plasmids pCigar-V2, as well as 1.5 μg of packaging plasmids pCL-10A1 (Novus Biologicals, NBP2-29542) were dissolved in 150 μL of Opti-MEM (Gibco) culture medium respectively. 6 μg of PEI (1 μg / μL) was dissolved in 150 μL of Opti-MEM culture medium and mixed well. The lentivirus was packaged using a 3-plasmid system, with 0.6 μg of pMD2. G, 1.2 μg of psPAX2, and 1.2 μg of pSF-AQ dissolved in 150 μL of Opti-MEM. 6 μg of PEI (1 μg / μL) was dissolved in 150 μL of Opti-MEM culture medium and mixed well.

[0107] The plasmid mixed solution was added to the PEI mixed solution, mixed well, and incubated at room temperature for 20 min to form a transfection complex. 300 μL of the transfection complex was dropwise added into the 6-well plate of the DMEM culture medium containing 2 mL of 10%FBS. After 6 h to 8 h, the solution of the transfected 293T cells was replaced with the DMEM culture medium containing 10%FBS, the 293T cells were incubated at 37℃ for 48 h, and the virus supernatant was collected.

[0108] Example 3: Construction of immune cells (iNKT cells, T cells, and NK cells) carrying various hypoxia-responsive promoters, endoplasmic reticulum stress promoters, and heat stress promoters

[0109] 3.1 Construction of iNKT cells containing hypoxia-responsive promoters, endoplasmic reticulum stress promoters, and heat stress promoters

[0110] 1) A 12-well plate was coated with retronectin: 1 mL of a retronectin solution (25 μg / mL) (PBS) was added per well and incubated overnight at 4℃. iNKT cells were sorted and cultured from the peripheral blood mononuclear cells (Zhejiang Free Trade Zone Maishun Biotechnology Co., Ltd., item number PB100C-W) according to the method disclosed herein (CD62L+ NKT cells have prolonged persistence and antitumor activity in vivo. J Clin Invest. 2016 Jun 1; 126 (6) : 2341-55. ) . iNKT cells (5×105 cells per well) was cultured for 10 days, and inoculated into the 12-well plate coated with the retronectin in 1 mL of culture medium per well. An X-VIVO-15 (Lonza) culture medium containing 10%FBS and IL-2 (200 IU / mL) was used.

[0111] 2) 1 mL of retrovirus supernatant was added per well, and the 12-well plate was centrifuged at 2500 rpm and 32℃ for 90 min and transferred to a cell culture incubator.

[0112] 3) The cells were collected after overnight incubation, centrifuged at 300 g for 5 min to remove the virus supernatant, and transferred to a 6-well plate at 4 mL / well.

[0113] 4) Puromycin (0.5 μg / mL) was added to the cells after 48 h infection. After drug screening for 48 h, the transduction efficiency was analyzed by flow cytometry (an FITC channel) using Becman CytoFLEX instrument. Subsequently, the culture medium was replaced with a puromycin-free culture medium for continued expansion.

[0114] 3.2 Manufacture of T cells containing hypoxia-responsive promoters, endoplasmic reticulum stress promoters, and heat stress promoters

[0115] 1) A 12-well plate was coated with retronectin: 1 mL of a retronectin solution (25 μg / mL) (PBS) was added per well and incubated overnight at 4℃. T cells were positively selected from PBMCs (Maishun Biotechnology) using CD3 magnetic beads (Miltenyi) , and activated by CD3 / CD28 magnetic beads (Thermofisher) for 2 days. Subsequently, the activated T cells (5×105 cells per well) were inoculated into the 12-well plate coated with the retronectin in 1 mL of culture medium per well. An XVIVO-15 culture medium (Lonza) containing 10%FBS and IL-2 (200 IU / mL) was used.

[0116] 2) 1 mL of retrovirus supernatant was added per well, and the 12-well plate was centrifuged at 2500 rpm and 32℃ for 90 min and transferred to a cell culture incubator.

[0117] 3) The cells were collected after overnight incubation, centrifuged at 300 g for 5 min to remove the virus supernatant, and transferred to a 6-well plate at 4 mL / well.

[0118] 4) Puromycin (0.5 μg / mL) was added to the cells 48 h after infection. After drug screening for 48 h, the transduction efficiency was analyzed by flow cytometry (an FITC channel) using Becman CytoFLEX instrument. Subsequently, the culture medium was replaced with a puromycin-free culture medium for continued expansion.

[0119] 3.3 Manufacture of NK cells containing hypoxia-responsive promoters, endoplasmic reticulum stress promoters, and heat stress promoters

[0120] 1) A 12-well plate was coated with retronectin: 1 mL of a retronectin solution (25 μg / mL) (PBS) was added per well and incubated overnight at 4℃. NK cells were cultured from the peripheral blood mononuclear cells (Zhejiang Free Trade Zone Maishun Biotechnology Co., Ltd., item number PB100C-W) according to the method disclosed herein (A robust platform for expansion and genome editing of primary human natural killer cells. Huang R S, et al., Journal of Experimental Medicine, 2021 (3) ) . NK cells (5×105 cells per well) cultured for 1 week were then inoculated into the 12-well plate coated with the retronectin in 1 mL of culture medium per well. A CTS NK-Xpander culture medium containing IL-2 (1000 IU / mL) and IL-15 (10 ng / mL) was used.

[0121] 2) 1 mL of retrovirus supernatant was added per well, and the 12-well plate was centrifuged at 2500 rpm and 32℃ for 90 min and transferred to a cell culture incubator.

[0122] 3) The cells were collected after overnight incubation, centrifuged at 300 g for 5 min to remove the virus supernatant, and transferred to a 6-well plate at 4 mL / well.

[0123] 4) Puromycin (0.5 μg / mL) was added to the cells 48 h after infection. After drug screening for 48 h, the transduction efficiency was analyzed by flow cytometry (an FITC channel) using Becman CytoFLEX instrument. Subsequently, the culture medium was replaced with a puromycin-free culture medium to continue culture.

[0124] Example 4: In vitro testing of response effects of different hypoxia-responsive promoters, endoplasmic reticulum stress promoters, and heat stress promoters in immune cells (iNKT cells, T cells, and NK cells)

[0125] 4.1 In vitro testing of response effects of different promoters carrying different hypoxia-responsive elements in immune cells (iNKT cells, T cells, and NK cells)

[0126] 1) The cells harboring promoters with different elements prepared by corresponding methods as described in Example 3 were plated in a 24-well plate at the density of 2×105 cells / mL. The total volume was 1 mL, and CoCl2 with the final concentration of 100 μM was added and cultured for 24 h.

[0127] 2) The cells were collected into a 1.5 mL EP tube and centrifuged at 350 g for 5 min, the supernatant was discarded, the cells were washed with 1 mL of PBS and centrifuged at 350 g for 5 min, and the supernatant was discarded. Cell pellets were resuspended with 200 μL of PBS, and an FITC channel was detected by a flow cytometer. The GFP MFI value of the group without CoCl2 induction was taken as the minimum value Min, and the GFP MFI value of the group with CoCl2 induction was taken as the maximum value Max, and the activity of the hypoxia-responsive promoters before induction (Min) and after induction (Max) were compared. Through combinations of the different HRE elements and SV40 minimal promoters, it was found that 6×PGK-HRE had the best effect, while the combination of 6×PGK-HRE and the MinP minimal promoter had a superior effect than that of 6×PGK-HRE-Mini-SV40. Compared with the expression intensity of the constitutive LTR promoter and EF1a-HTLV promoter, 6×PGK-HRE-MinP after induction showed significant advantages over other groups. Namely, 6×PGK-HRE-MinP had very low activity in a normoxic environment without CoCl2 treatment, but had significant induction activity on the transcription of downstream genes in a CoCl2 induced hypoxic environment (FIG. 5: NK cells; FIG. 6: T cells; and FIG. 7: iNKT cells) .

[0128] 4.2 In vitro testing of response effects of combinations of hypoxia-responsive element (PGK-HRE) with different minimal promoters in immune cells (iNKT cells, T cells, and NK cells)

[0129] 1) The cells harboring promoters with different elements manufactured by corresponding methods described in Example 3 were plated in a 24-well plate at the density of 2×105 cells / mL. The total volume was 1 mL, and CoCl2 with the final concentration of 100 μM was added and cultured for 24 h.

[0130] 2) The cells were collected into a 1.5 mL EP tube and centrifuged at 350 g for 5 min, the supernatant was discarded, the cells were washed with 1 mL of PBS and centrifuged at 350 g for 5 min, and the supernatant was discarded. Cell pellets were resuspended with 200 μL of PBS, and an FITC channel was detected by a flow cytometer. The GFP MFI value of the group without CoCl2 induction was taken as the minimum value Min, and the GFP MFI value of the group with CoCl2 induction was taken as the maximum value Max, and the activity of the hypoxia-responsive promoters before induction (Min) and after induction (Max) was compared. Through the combinations of the 6×PGK-HRE element with the different minimal promoters, it was found that 6×PGK-HRE-MinP exhibited the optimal results in the T cells, the NK cells, and the iNKT cells (with the highest high induction (Max)  / low leakiness (Min) values) . Namely, 6×PGK-HRE-MinP had very low activity in a normoxic environment without CoCl2 treatment, but had significant induction activity on the transcription of downstream genes in a CoCl2 induced hypoxic environment (FIG. 8: NK cells; FIG. 9: T cells; and FIG. 10: iNKT cells) .

[0131] 4.3 In vitro comparison of promoter activity of hypoxia-responsive promoter (6×PGK-HRE-MinP) , endoplasmic reticulum stress promoters (6×ERSE-MinP and 6×UPRE-MinP) , and heat stress promoter (6×HSE-MinP) in immune cells (NK cells and T cells)

[0132] 1) The cells harboring promoters with different elements manufactured by corresponding methods described in Example 3, were plated in a 24-well plate at the density of 2×105 cells / mL. The total volume was 1 mL. The cells were treated with 100 μM of CoCl2, 2.5 μM of tunicamycin, 5 μM of sulforaphane, 2.5 mM of histidinol, and 100 μM H2O2 for 24 h, respectively, in order to mimic hypoxia, oxidation, and endoplasmic reticulum stress within tumor microenvironment. HSE elements under heat stress were additionally treated at 42℃ for 1 h, followed by 6 h of normal culture and detection.

[0133] 2) The cells were collected into a 1.5 mL EP tube and centrifuged at 350 g for 5 min, the supernatant was discarded, the cells were washed with 1 mL of PBS and centrifuged at 350 g for 5 min, and the supernatant was discarded. Cell pellets were resuspended with 200 μL of PBS, and an FITC channel was detected on a machine by a flow cytometer, and the activity of different stress promoters before induction (Min) and after induction (Max) was compared. It was found that the 6×PGK-HRE-MinP promoter exhibited the best performance, and showed low activity in various normoxic environments but significant induction activity on the transcription of downstream genes in a CoCl2-induced hypoxic environment (FIG. 11 and FIG. 12: NK cells; FIG. 13 and FIG. 14: T cells) .

[0134] Example 5: Validation of intratumoral expression of CAR-T cells and NK cells carrying different intratumoral stress elements (6×PGK-HRE, 6×HSE, and 8×NR4A) in CLDN18.2 CXCL9-AsPC-1 tumor-bearing mice

[0135] 1) Inoculation of CLDN18.2 CXCL9-AsPC-1 subcutaneous transplanted tumor: The expression level of CLDN18.2 in AsPC-1 cells (cell bank of Chinese Academy of Sciences, SCSP-5080) expressing human Claudin 18.2 and human CXCL9 coding sequences was 99.9%. CLDN18.2 CXCL9-AsPC-1 in a logarithmic growth phase with good growth condition was collected and adjusted to the density of 6×107 cells / mL using DPBS, and 50 μL (3×106 cells / mouse) of cell suspension was injected subcutaneously on the right back of 8-week-old female NPSG mice. The date of inoculation with the tumor cells was marked as D0.

[0136] 2) Experimental groups: On D6 of tumor inoculation, the NPSG mice were randomly divided into 5 groups (6×PGK-HRE-MinP, 6×HSE-MinP, 8×NR4A-MinP, LTR, and blank control) , with 5 mice per group.

[0137] 3) Immune cells carrying different stress element promoters were prepared by the method described in Example 3. T cells were additionally transduced with a retrovirus containing sequences encoding anti-CLDN18.2 CAR (referring to CN118580356A, with the nucleotide sequence as set forth in SEQ ID NO: 34) to generate CAR-T cells carrying stress element promoters. NK cells had strong killing effects on CLDN18.2 CXCL9-AsPC-1 (FIG. 15) , and thus were not transduced additionally with CAR structures. The prepared NK cells and CAR-T cells were detected by flow cytometry (FIG. 16) .

[0138] 4) Adoptive transfer of NK cells and T cells: On D7, a mixed solution of the NK cells and the T cells (1.0×107 cells each) was infused through the tail vein. After 4 h, a D-Luciferin substrate was intraperitoneally injected, the mice were observed using a small animal live imager, followed by injection of the substrate and detection every 3 days. The in vivo imaging experiment demonstrated that the 6×PGK-HRE-MinP promoter had high intratumoral inducibility and low extratumoral leakiness (FIG. 17) .

[0139] 5) The mice in each group were euthanized, and spleens and tumors were collected. The spleens were placed on a 70 μm cell strainer, homogenized into a 50 mL collection tube, washed and resuspended with a DMEM culture medium, centrifuged at 4℃ and 350×g for 5 min, and resuspended in 200 μL of PBS to obtain spleen single-cell suspensions. The pre-prepared 100×stock solution for digestion (containing collagenase I (100 mg / mL) and DNAse I (20 mg / mL) ) was diluted 100-fold with a DMEM high-glucose medium supplemented with 5%FBS, and preheated at 37℃. The tumors of the mice were cut into pieces with scissors and transferred to a 15 mL centrifuge tube, and 10 mL of a tissue digestion solution was added for digestion at 37℃ for 1 h. The tumor tissue suspension was pipetted to a 70 μm cell strainer using a Pasteur pipette for filtering. Simultaneously the tissue pieces remaining on the strainer were ground using the back of a 1 mL syringe. The tissue pieces on the strainer were rinsed with a DMEM high glucose base culture medium. The obtained tumor suspension was centrifuged at 4℃ and 350×g for 5 min, the supernatant was discarded, and the cells were washed with 5 mL of PBS, centrifuged at 350×g for 5 min, and resuspended in 500 μL of PBS to obtain a tumor single-cell suspension. The cell suspensions were stained with DRAQ5 (viability dye) , hCD45 (APC) , hCD3 (BV421) , and hCD56 (PE) antibodies to detect the GFP MFI values of the T cells and the NK cells in the tumors and the spleens, respectively. The results showed that the PGK-HRE-MinP promoter had lower activity in the spleens and higher activity in the tumors (FIG. 18 to FIG. 19) .

[0140] The results of Example 4 and Example 5 show that compared to the polynucleotide constructs comprising other regulatory elements (e.g., 6×VEGF-HRE, 6×HSP-HRE, 6×ERSE, 6×UPRE, 6×HSE, and 8×NR4A) , or compared to the polynucleotide constructs comprising other promoters (e.g., mini-SV40, mini-IL2, mini-TK, mini-CMV, and mini-ADE) , the polynucleotide construct comprising 6×PGK-HRE-MinP has very low activity in the normoxic environment but significant induction activity on the transcription of the downstream genes in the hypoxic environment. Therefore, engineered immune cells (e.g., iNKT cells, T cells, and NK cells) prepared from the 6×PGK-HRE-MinP construct exhibited high expression of therapeutic transgenes in hypoxic environments such as solid tumors, while maintaining low activity in normoxic environments such as extratumoral tissues (e.g., spleen) . This differential regulation enables effective tumor-specific targeting and provides a safety switch function.

[0141] Example 6: In vitro testing of response effects of hypoxia-responsive elements, from different human genes in immune cells (T cells and iNKT cells)

[0142] In light of the results from Example 4, which showed that the hypoxia-responsive promoter using MinP as the minimal promoter exhibited significantly lower background signal compared to other minimal promoters, we hypothesize that the most critical element in the hypoxia-responsive promoter is the minimal promoter. When hypoxia-responsive elements from other genes are combined with MinP, they may also perform effectively.

[0143] Following the method described in Example 1, we synthesized hypoxia-responsive promoters containing different hypoxia-responsive elements, with sequences as shown in Table 4. These were then cloned into the region between the restriction sites XholI and EcoRI of a sin LTR retroviral vector, pRFFu-mini. Referring to the method outlined in Example 2, we used the plasmids constructed in Example 1 to package different retroviruses. Subsequently, we followed the method in Example 3 to prepare immune cells (T cells and iNKT cells) containing different hypoxia-responsive promoters. Table 4 Sequences of polynucleotide constructs using different hypoxia-responsive elements in vector

[0144] Using the approach from Example 4, we assessed the biological activity of the different hypoxia-responsive promoters in immune cells (T cells and iNKT cells) . The results are shown in FIG. 20 (T cells) and FIG. 21 (iNKT cells) . It was found that the 6×PGK-HRE-MinP promoter still exhibited the best performance, demonstrating low activity in normoxic environments but significant induction activity on the transcription of downstream genes. However, when hypoxia-responsive elements were derived from other human genes (hPGK, hEnolase, hAldolase, hVEGF, and hEPO) , the promoters still maintained low background and high hypoxia-induced signal activity. This indicates that the various hypoxia-responsive promoters provided by the present invention can be applied in scenarios requiring different levels of induction.

[0145] It should be noted that the above are only preferred examples of the present application and are not intended to limit the present application. For those skilled in the art, the present application may have various changes and variations. Although specific embodiments have been described, there may be or are currently unforeseeable alternatives, modifications, variations, improvements, and substantial equivalents to the above embodiments for the applicant or other skilled in the art. Therefore, the submitted claims and potentially amended claims are intended to cover all such alternatives, modifications, variations, improvements, and substantial equivalents. It is important that with the evolution of technology, many of the elements described herein can be replaced by equivalent elements that appear after the present application.

Claims

1.A polynucleotide construct comprising a regulatory sequence operably linked to a promoter, wherein the regulatory sequence comprises at least one hypoxia-responsive element (HRE) , and the promoter comprises the nucleotide sequence as set forth in SEQ ID NO: 10.2.The polynucleotide construct according to claim 1, wherein the HRE is selected from the group consisting of phosphoglycerate kinase hypoxia-responsive element (PGK-HRE) , enolase hypoxia-responsive element (Enolase-HRE) , aldolase hypoxia-responsive element (Aldolase-HRE) , vascular endothelial growth factor hypoxia-responsive element (VEGF-HRE) , and erythropoietin hypoxia-responsive element (EPO-HRE) .3.The polynucleotide construct according to claim 2, wherein(a) the PGK-HRE comprises the nucleotide sequence as set forth in SEQ ID NO: 37 or 1,(b) the Enolase-HRE comprises the nucleotide sequence as set forth in SEQ ID NO: 38,(c) the Aldolase-HRE comprises the nucleotide sequence as set forth in SEQ ID NO: 39,(d) the VEGF-HRE comprises the nucleotide sequence as set forth in SEQ ID NO: 40, or(e) the EPO-HRE comprises the nucleotide sequence as set forth in SEQ ID NO: 41.4.The polynucleotide construct according to any one of the preceding claims, wherein the regulatory sequence comprises at least six HREs, optionally adjacent HREs are linked via a first spacer sequence, and each first spacer sequence comprises at least 6 nucleotides.5.The polynucleotide construct according to claim 4, wherein each first spacer sequence independently comprises the nucleotide sequence TCTAGT or GCTAGC.6.The polynucleotide construct according to claim 5, wherein the regulatory sequence comprises the nucleotide sequence as set forth in any one of SEQ ID NOs: 2 and 42-46.7.The polynucleotide construct according to any one of the preceding claims, wherein the regulatory sequence is located upstream of the promoter.8.The polynucleotide construct according to any one of the preceding claims, wherein the regulatory sequence is operably linked to the promoter via a second spacer sequence, and the second spacer sequence comprises at least 12 nucleotides.9.The polynucleotide construct according to claim 8, wherein the second spacer sequence comprises the nucleotide sequence as set forth in SEQ ID NO: 30.10.The polynucleotide construct according to any one of the preceding claims, wherein the polynucleotide construct comprises the nucleotide sequence as set forth in any one of SEQ ID NOs: 20 and 47-51.11.The polynucleotide construct according to any one of the preceding claims, further comprising a nucleotide sequence encoding a chimeric antigen receptor (CAR) .12.A recombinant vector comprising the polynucleotide construct according to any one of the preceding claims.13.The recombinant vector according to claim 12, wherein the vector is an expression vector, optionally the expression vector comprises a plasmid vector, a retroviral vector, a lentiviral vector, an adenoviral vector, an adeno-associated viral vector, a transposon vector, a CRISPR / Cas gene editing delivery vector, or an RNA vector.14.A host cell comprising the polynucleotide construct according to any one of claims 1 to 11, or the recombinant vector according to claim 12 or 13, optionally the host cell is a microorganism cell, a yeast cell, or a mammalian cell, optionally the host cell is a tumor cell.15.A modified immune cell comprising the polynucleotide construct according to any one of claims 1 to 11 or the recombinant vector according to claim 12 or 13, optionally the immune cell is a human immune cell.16.The modified immune cell according to claim 15, wherein the immune cell is selected from T cells (including CD8+ T cells, CD4+ T cells (e.g., Th1, Th2, Th17, and Foxp3+cells) , memory T cells (such as T memory stem cells, central, and effector memory cells) , terminally differentiated effector T cells, γδ T cells, and regulatory T cells (Tregs) ) , natural killer (NK) cells, NKT cells (e.g., iNKT cells) , tumor infiltrating lymphocytes (TILs) , cytotoxic T lymphocytes (CTLs) , and dendritic cells (DCs) ; optionally the immune cells is a T cell, a NK cell or an iNKT cell.17.A pharmaceutical composition comprising the polynucleotide construct according to any one of claims 1 to 11, the recombinant vector according to claim 12 or 13, the host cell according to claim 14, or the modified immune cell according to claim 15 or 16, and one or more pharmaceutically acceptable carriers.18.A kit comprising the polynucleotide construct according to any one of claims 1 to 11, the recombinant vector according to claim 12 or 13, the host cell according to claim 14, the modified immune cell according to claim 15 or 16, or the pharmaceutical composition according to claim 17.19.A method for detecting, preventing, alleviating, or treating a disease, comprising administering the polynucleotide construct according to any one of claims 1 to 11, the recombinant vector according to claim 12 or 13, the host cell according to claim 14, the modified immune cell according to claim 15 or 16, the pharmaceutical composition according to claim 17, or the kit according to claim 18 to a subject in need thereof.20.The method according to claim 19, wherein the disease comprises tumors or cancers.

Images