Production of barcode beads and related systems

Abstract

Provided is a method for preparing barcoded beads that includes generating a first plurality of droplets and a second plurality of droplets. Each droplet of the first plurality of droplets includes a respective DNA template and a primer that includes a moiety configured to react with a hydrogel. The second plurality of droplets does not include any DNA template. The DNA template may be amplified to form a plurality of double-stranded molecules with the moiety in the droplet. The method includes separating the second plurality of droplets from the first plurality of droplets. The method also includes injecting a crosslinking agent into the first plurality of droplets. The method also includes forming the hydrogel using the crosslinking agent and bonding the moieties of the plurality of double-stranded molecules to the hydrogel. The method includes demulsifying the first plurality of droplets to form the plurality of barcoded beads. Systems are also provided.

Description

PRODUCTION OF BARCODE BEADS AND RELATED SYSTEMSCROSS-REFERENCE TO RELATED APPLICATION

[0001] This Patent Cooperation Treaty (PCT) application is related to and claims priority to U.S. Provisional Patent Application Number 63 / 745,653, filed January 15, 2025, entitled “PRODUCTION OF BARCODE BEADS AND RELATED SYSTEMS, ” the entire disclosure of which is hereby incorporated by reference, for all purposes, as if fully set forth herein.BACKGROUND

[0002] Cellular heterogeneity in biological systems is prevalent even within isogenic populations due to genetic variations, phenotypic differences, and developmental discrepancies among cells. A plethora of evidence has shown cellular heterogeneity exists within isogenic or clonal populations. This heterogeneity can arise from genetic drift, differences in cell development or cell cycle status, and differences in cell age resulting from proliferation and passaging. The analysis of cell-to-cell heterogeneity is important in biomedical research. The workflow for single-cell analyses can be broadly summarized as follows: cell separation, barcoding, capture and enrichment of target molecules (such as mRNA or DNA) , sequencing, and subsequent data analysis. Recent significant advancements in the isolation of single cells1, 2, barcoding technologies3-5, and sequencing technologies6 have enabled in-depth profiling of DNA, RNA, and proteins at single-cell resolution7, 8. Single-cell barcoding is particularly important, as it is the primary criterion for distinguishing different cells after sequencing. If the molecules within specific cells or cell nuclei are not accurately and effectively barcoded, there is a high likelihood that rare cell types or low-expressed genes will be overlooked. Therefore, the process of adding barcodes to single cells must be precise, and the number of barcodes should be sufficient to accommodate a large quantity of single-cell analyses in each run.

[0003] The ability to uniquely identify and analyze genetic material has revolutionized numerous fields, including molecular biology, environmental science, forensic analysis, and personalized medicine. DNA barcoding is a technique that uses short, standardized regions of the genome to uniquely identify organisms or genetic material. This method has gained widespread adoption due to its efficiency, reproducibility, and applicability across diverse domains. DNA barcoding techniques typically involve the amplification of specific genomic regions using polymerase chain reaction (PCR) followed by sequencing and comparison against reference databases.

[0004] Despite its widespread use, current DNA barcoding methods face several challenges. One primary limitation is the scalability of these techniques for high-throughput applications, such as large-scale biodiversity studies and pathogen monitoring. The reliance on manual sample preparation, amplification, and sequencing workflows often introduces inefficiencies and increases the potential for contamination or human error.

[0005] Before 2015, dilution, manual cell picking, and fluorescence-activated cell sorting (FACS) were routinely used for isolating single cells, particularly rare cells found in clinical samples. In the earliest SMART-seq studies9, 10, single cells were manually picked and dispensed into PCR tubes individually for the subsequent processes. The sequencing library for single cells was constructed one at a time, thereby limiting the throughput and requiring excessive consumption of reagents. Subsequently, methods involving the addition of unique barcode primers to “tag” individual cells or nuclei were developed. With the unique barcodes, samples may be pooled together for processes such as target amplification and library construction, thereby improving the time-and cost-efficiency. For instance, CEL-seq11, 12 and MARS-seq13, 14 isolated single cells using FACS and dispensed into 96-well or 384-well plates, where the designed barcode oligo dT primers were introduced for reverse transcription, followed by sample pooling for the subsequent amplification and library preparation.

[0006] There is, therefore, a need for improved DNA barcoding techniques that are cost-effective, scalable, and capable of achieving high resolution in distinguishing genetic material. Such innovations could expand the applicability of DNA barcoding in areas such as ecological monitoring, food authentication, disease diagnostics, and synthetic biology. The embodiments described herein address these challenges and other challenges by introducing a barcoding methodology that enhances accuracy, efficiency, and scalability. BRIEF SUMMARY

[0007] Embodiments of the present invention are methods and systems to produce barcoded beads that all or nearly all contain DNA templates as barcodes, even though initially only about 10%of droplets may contain a DNA template. The methods allow for efficient production and use of substantially uniform barcoded beads.

[0008] In one aspect, methods include ddPCR, droplet sorting, and pico-injection, referred to as D3SPI. D3SPI includes sorting droplets with DNA templates (i.e., positive droplets) from those without DNA templates after amplification. The positive droplets may then be injected with a crosslinking agent. A hydrogel may be formed and the droplets with DNA templates may be bonded to the hydrogel as a result of using forward primers with moieties configured to bond to the hydrogel. Droplets may be demulsified, forming beads with the DNA templates as barcodes.

[0009] In another aspect, methods include ddPCR pico-injection bead sorting, referred to as DPIBS. With DPIBS, a reverse primer includes an affinity reagent, which is configured to bond to a target molecule. Positive and negative droplets are not sorted as in D3SPI. Instead, both positive and negative beads are formed. The beads are combined with target beads, which have a target molecule. Positive beads bond with the target beads. The target beads include a property that allows for separation of the bonded positive beads from the unbonded negative beads.

[0010] Systems related to the methods are also described. TERMS

[0011] “Affinity reagent” refers to a molecule or molecular complex designed to specifically bind a target molecule (or ligand) with high affinity and specificity. Affinity reagents may include antibodies, aptamers, peptides, small molecules (e.g., biotin) , engineered proteins, receptor molecules that bind specific ligands, ligands that bind specific receptor molecules, or synthetic polymers.

[0012] “Threshold” or “cutoff” refers to predetermined numbers used in an operation. For example, a cutoff diameter can refer to a diameter below which particles are excluded. As another example, a threshold value may be a value above or below which a particular classification applies. Either of these terms can be used in either of these contexts. A cutoff or threshold may be “areference value” or derived from a reference value that is representative of a particular classification or discriminates between two or more classifications. A cutoff may be predetermined with or without reference to the characteristics of the sample or the subject. A particular value for a cutoff, threshold, reference, etc. can be determined based on a desired accuracy (e.g., a sensitivity and specificity) .

[0013] “Fluidic communication” refers to the ability for a fluid (liquid or gas) to be conveyed between two components. Fluidic communication includes pathways, such as conduits, channels, tubes, or pipes, that facilitate fluid flow.

[0014] “D3SPI” refers to ddPCR, droplet sorting, and pico-injection.

[0015] “DPIBS” refers to ddPCR pico-injection bead sorting.

[0016] The term “about” or “approximately” can mean within an acceptable error range for the particular value as determined by one of ordinary skill in the art, which will depend in part on how the value is measured or determined, i.e., the limitations of the measurement system. For example, “about” can mean within 1 or more than 1 standard deviation, per the practice in the art. Alternatively, “about” can mean a range of up to 20%, up to 10%, up to 5%, or up to 1%of a given value. Alternatively, particularly with respect to biological systems or processes, the term “about” or “approximately” can mean within an order of magnitude, within 5-fold, and more preferably within 2-fold, of a value. Where particular values are described in the application and claims, unless otherwise stated the term “about” meaning within an acceptable error range for the particular value should be assumed. The term “about” can have the meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art. The term “about” can refer to ±10%. The term “about” can refer to ±5%.BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

[0017] To easily identify the discussion of any particular element or act, the most significant digit or digits in a reference number refer to the figure number in which that element is first introduced.

[0018] FIG. 1 illustrates an example process for D3SPI in accordance with one embodiment.

[0019] FIG. 2A illustrates a configuration for generating droplets in accordance with one embodiment.

[0020] FIG. 2B shows an image from a microscope in accordance with one embodiment.

[0021] FIG. 2C shows an image from a microscope in accordance with one embodiment.

[0022] FIG. 3 shows an example fluorescence-activated droplet sorting (FADS) system for separating positive droplets from negative droplets in accordance with one embodiment.

[0023] FIG. 4A shows an image of droplets in accordance with one embodiment.

[0024] FIG. 4B illustrates a sorting chip in accordance with one embodiment.

[0025] FIG. 4C illustrates a sorting trigger pulse after a fluorescence signal in accordance with one embodiment.

[0026] FIG. 4D shows a real-time image of droplet sorting in accordance with one embodiment.

[0027] FIG. 4E shows an image of sorted droplets in accordance with one embodiment.

[0028] FIG. 5A illustrates an injection chip in accordance with one embodiment.

[0029] FIG. 5B shows a bright-field image of the pico-injection process in accordance with one embodiment.

[0030] FIG. 5C shows the barcoded beads after demulsification and release of complementary strands under bright-field microscopy in accordance with one embodiment.

[0031] FIG. 5D shows the barcoded beads under fluorescence microscopy in accordance with one embodiment.

[0032] FIG. 6 illustrates an integrated microfluidic chip in accordance with one embodiment.

[0033] FIG. 7 illustrates a workflow for producing beads with sorting beads in accordance with one embodiment.

[0034] FIG. 8 is a photograph of the separation of positive magnetic streptavidin beads 802 in accordance with one embodiment.

[0035] FIG. 9 illustrates a process of adding functionalities to beads in accordance with one embodiment.

[0036] FIG. 10 illustrates a method 1000 for preparing a plurality of barcoded beads in accordance with one embodiment.

[0037] FIG. 11 illustrates an example system in accordance with one embodiment.

[0038] FIG. 12 illustrates a method 1200 for preparing a plurality of barcoded beads in accordance with one embodiment.

[0039] FIG. 13 illustrates an example system in accordance with one embodiment.

[0040] FIG. 14 illustrates an example computing system in accordance with one embodiment.DETAILED DESCRIPTION

[0041] Preparation of barcode beads has primarily been fabricated using the following methods: (1) synthesis by a DNA synthesizer on solid beads; (2) PCR-or ligation-based split-pool methods on solid or hydrogel beads; and (3) ddPCR-based barcode synthesis on hydrogel beads. While these methods are proven feasible, none of them is able to simultaneously satisfy the requests of high throughput, a large quantity of barcodes, and cost-and time-effectiveness. The PCR-or ligation-based barcode synthesis on beads yields high-quality barcodes, but time-and cost-intensive, given that each reaction round requires a substantial amount of buffer and enzyme, along with repeated washing after each cycle. Additionally, the total quantity of barcodes produced is limited. In contrast, ddPCR-based barcode synthesis is high-throughput and time-efficient, but it requires a significant amount of beads limited by the low positive rate embedded in the ddPCR reaction.

[0042] Embodiments of the present invention may carry high commercialization potential through the following: (1) Unique barcodes are introduced onto hydrogel beads through co-polymerization via high-throughput droplet microfluidics and ddPCR processes; (2) Fluorescence-activated or magnetic-bead sorting can be utilized to enrich droplets or hydrogel beads containing the amplified DNA products while effectively eliminating unwanted empty or negative droplets / hydrogel beads; (3) Droplet pico-injection is employed to add the crosslinking reagent to the sorted positive droplets for post-gelation of the barcode beads; and / or (4) The produced barcode beads are almost 100%positive, significantly reducing the reagent consumed for the negative droplets (at most 90%for previous methods) .

[0043] In summary, embodiments of the present invention provide a previously unattainable combined features for the production of barcode beads, including, but not limited to, time and cost efficiency, reduced reagent consumption and high throughput. The prepared barcode beads from ddPCR, droplet sorting, and pico-injection (i.e., D3SPI) or ddPCR, pico-injection, and bead sorting (i.e., DPIBS) can be used similarly with the protocols currently employed in commercially available or literature reported protocols available for exiting single-cell applications. Embodiments of the present invention include methods and systems for producing and using barcoded beads.

[0044] FIG. 1 shows an example process for D3SPI. At stage 104, D3SPI starts generating water-in-oil (W / O) droplets. A ddPCR solution 106 is flowed and then intercepted with an oil 108 stream. A droplet 110 is then formed, which may be a negative droplet 112, containing no DNA template, or a positive droplet 116, containing a DNA template 114. DNA template 114 may include a random sequence, which may later be used as an identifier or barcode. Positive droplet 116 may also include forward primer 118. Forward primer 118 may include a moiety 120, which may be acrydite. Positive droplet 116 may also include reverse primer 122. Positive droplet 116 may also include PCR buffer and polymerase. Negative droplet 112 may also include forward primer 118, reverse primer 122, PCR buffer, and polymerase. Droplets may be approximately 44 μm in diameter or any suitable diameter determined by the width of the channel.

[0045] At stage 124, thermal cycling is performed. Thermal cycling may include ddPCR, which may be performed by a ddPCR machine 126. After ddPCR, the droplets may have a typical positive rate of approximately 10% (e.g., 10%of all droplets are positive droplets, with the remaining being negative droplets) based on Poisson statistics. After ddPCR, the DNA template is amplified to form amplified droplet 128. Each amplified droplet 128 contains a unique acrydite-modified DNA barcode. The DNA in amplified droplet 128 is a double-stranded DNA molecule, including the acrydite-modified forward primer and the reverse primer.

[0046] At stage 130, droplet sorting is then employed to separate negative droplets from positive droplets. Sorting may be by fluorescence-activated droplet sorting. A laser may be directed at the droplets. Droplets with DNA products will fluoresce. The droplets that fluoresce will be detected by a detector (e.g., photodiode or photomultiplier tube [PMT] ) . A control system may trigger first electrode 132 to apply a dielectrophoretic (DEP) force after a given delay to allow for the positive droplet to flow down the channel. The force draws positive droplet 134 through one fork. The absence of the force results in negative droplet 136 flowing down a different fork.

[0047] At stage 138, positive droplets are injected with a crosslinking agent 140. The crosslinking agent may include acrylamide, bis-acrylamide, and / or ammonium persulfate (APS) in solution. Second electrode 142 may apply a force to inject crosslinking agent 140 into droplet 144, forming injected droplet 146. The electric voltage may rupture the surfactant layer of the droplet to let the reagent into the droplet. A volume of crosslinking agent 140 may be in the range of 10-12 L, hence the term “pico-injection. ” In some embodiments, stage 138 may occur before stage 130.

[0048] At stage 148, the droplets undergo gelation and demulsification. Following high-temperature incubation for the polymerization, acrydite-modified DNA barcodes are covalently incorporated into the polyacrylamide (PAA) gels as the crosslinking occurs. Incubation may after a period of 4 to 8 hours. Beads such as bead 102 are formed, where the bead includes double-stranded DNA.

[0049] At stage 150, the strand complementary to the target DNA is de-hybridizd and detached from beads. With the porous and aqueous hydrogel network, one or more washes with sodium hydroxide (NaOH) or enzyme digestion can remove the strand hybridized to the acrydite-modified DNA barcodes.

[0050] Flows within channels may be driven by pumps, including syringe pumps.

[0051] D3SPI improves the barcode production efficiency compared to a typical split-pool method. Furthermore, D3SPI enables high-throughput and cost-effective synthesis of barcode beads through the integration of aqueous ddPCR droplets with pre-crosslinking acrylamide solutions. By removing the negative droplets prior to bead-gelation, all produced beads carry a unique barcode sequence. The produced barcode beads may be 100%barcoded. D3SPI represents a method that offers the combined benefits of high throughput, time efficiency, and cost-effectiveness, which have not been previously reported. Generation of droplets

[0052] FIG. 2A shows a possible configuration for generating droplets in stage 104. The ddPCR droplets can be produced using a microfluidic flow-focusing droplet generator. The dispersed phase 202 may include DNA templates (e.g., 5'-TCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNSWNNNSWNNNTGGGCGGTAGGCGTG-3') , 5' acrydite-modified forward primers (e.g., 5'-acrydite-TTTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3') , reverse primers (e.g., 5'-CACGCCTACCGCCCA-3') , PCR buffer, and enzyme. N represents a random base in A / T / G / C (i.e., A or T or C or G) ; S represents a base in C / G (i.e., C or G) ; and W represents a base in A / T (i.e., A or T) . Continuous phase 204 may include Bio-Rad droplet generation oil. The size of the droplets can be controlled by the channel dimensions of the device and the flow rate ratio between the oil and aqueous phases. Droplets may contain both forward and reverse primers. The concentration of the DNA template may be based on a Poisson distribution, such that approximately 10%of the droplets contain only one copy of the DNA template.

[0053] FIG. 2A illustrates an exemplary chip design featuring a flow-focusing geometry. Continuous phase 204 may flow down channel 206. Dispersed phase 202 may flow down channel 208. The two phases may meet at mixing area 210. Droplets may be formed at then flow to outlet 212.

[0054] FIG. 2B shows an image from a microscope of the production of droplets within a chip. The image may show channel 206, channel 208, mixing area 210, and outlet 212. Dispersed phase 214 may flow to meet continuous phase 216 at mixing area 218. Droplet 220 may be formed. Droplets may collect in 222. As examples, when the flow rate of the continuous phase 204 (e.g., oil) was set to 15.8 μL / min and the flow rate of the dispersed phase 202 (e.g., PCR buffer) was 9.5 μL / min, the resulting droplets were uniform, with a diameter of 44 μm.

[0055] FIG. 2C shows an image from a microscope of produced droplets, such as 224. As shown in FIG. 2C, the generated droplets are uniform. The size of the droplets may be determined by the flow ratio between the oil and water phase. Droplets amplification and fluorescence labeling

[0056] After the generation of droplets, the droplets were added to a PCR tube. Mineral oil was added to the PCR tube to prevent evaporation during the subsequent amplification process. Thermal cycling was then conducted according to the PCR parameters: 95 ℃ for 3 minutes, followed by 40 cycles of 98 ℃ for 15 seconds, 65 ℃ for 20 seconds, and 72 ℃ for 20 seconds, with a final extension at 72 ℃ for 3 minutes. Other suitable temperatures and times may be used. The amplified droplets were stained with SYBR G, or other suitable stain that binds to DNA for later observation. Fluorescence-activated droplet sorting (FADS)

[0057] FIG. 3 shows an example fluorescence-activated droplet sorting (FADS) system for separating positive droplets from negative droplets after PCR and SYBR Green staining. The FADS system may be based upon a bright-field microscope for observing microfluidic operations. A transillumination light source 302 may be used to illuminate the sample, whose image may be collected by the objective 304 and projected to the camera 306 by the tube lens 308.

[0058] An epi-fluorescence setup may be employed for the detection of laser-induced fluorescence. A 488 nm laser 310 may be focused by the objective 304 to excite the fluorescence of SYBR Green. The laser-induced fluorescence may be then collected by the same objective 304. A photomultiplier tube (PMT) 312 and an analog-to-digital converter (ADC) 314 may be used to acquire the fluorescence signal in real-time for processing by a Zynq board 316, which includes a system on a chip that integrates a processing system and programmable logic. A sorting trigger may be generated by Zynq board 316 after a fluorescence signal with a time delay. Upon triggered, signal generator 318 generates a square wave that is then amplified to hundreds of volts by a voltage amplifier 320. The amplified AC voltage is connected to the on-chip electrodes (e.g., first electrode 132) to induce dielectrophoretic (DEP) force for droplet sorting. The Zynq board 316 may also connected to a PC 322 for visualizing data and viewing / setting various sorting parameters.

[0059] FIG. 4A shows an image of droplets after 40 cycles of thermal cycling. Droplets that contain amplified DNA, such as droplet 402, fluoresce green. About 10%of droplets fluoresce green.

[0060] FIG. 4B shows an example of a sorting chip 404. Sorting chip 404 may include inlet 406 and inlet 408. Inlet 408 may include oil used to separate reinjected fluorescently positive droplets from reservoir 410. The droplets may include amplified droplet 128 after stage 124. Inlet 406 may include oil used to direct non-fluorescent droplets to negative outlet 412 rather than positive outlet 414. The length of the positive outlet channels was designed with larger flow resistance, so that droplets, i.e. the negative droplets, would flow towards the negative outlet without an external trigger. Electrodes 416 provide a force to direct fluorescently positive droplets to positive outlet 414. Sorting chip 404 may perform sorting described with stage 130.

[0061] FIG. 4C illustrates a sorting trigger pulse after a fluorescence signal from a negative droplet 418 and a positive droplet 420. The top line illustrates the fluorescence intensity versus time. The negative droplet shows a slight increase in fluorescence intensity from the background signal after SYBR Green staining. This increase is well under a threshold level 422 of fluorescence intensity. Threshold level 422 may be set from previous data to achieve a desired sensitivity and / or specificity. Because the fluorescence intensity is under threshold level 422, the trigger voltage 424 remains at or near zero. On the other hand, positive droplet 116 results in a significant increase in fluorescence intensity, well above threshold level 422. The fluorescence intensity being above threshold level 422 leads to a pulse 426 (e.g., a square wave) . This pulse 426 may initiate electrodes 416 to provide the DEP force to direct the positive droplet to 414.

[0062] FIG. 4D shows a real-time image of droplet sorting, where the droplet encapsulating the amplified DNA products was deflected and flowed toward the positive outlet. Electrodes 428 apply a DEP force to move positive droplet 430 toward channel 432. Electrodes 428 do not apply a force when no fluorescence is detected. Hence, negative droplet 434 flows down a different channel, channel 436.

[0063] FIG. 4E shows an image of sorted droplets. As can be seen in image, 100%of sorted droplets exhibited green fluorescence, confirming the successful and accurate sorting. Droplets pico-injection

[0064] FIG. 5A shows an injection chip 500 for injecting a crosslinking agent into positive droplets. An acrylamide solution, or the gel solution, is prepared, with the specific concentrations of each component depending on the final volume of the beads. The acrylamide solution may be placed in acrylamide solution inlet 502. Oil may be provided in spacing oil inlet 504. Sorted and amplified droplets (e.g., from stage 130) may be in droplet reinjection inlet 506. The spacing oil and the droplets mix, increasing spacing between droplets. Acrylamide solution is injected into the droplets by using a DEP force generated by electrode 508. Injection chip 500 may perform the injection with stage 138.

[0065] Based on the droplet diameter increasing from 44 μm to 54 μm after pico-injection, a gel solution containing 13.04%acrylamide, 0.22%bis-acrylamide, and 0.86%ammonium persulfate (APS) was prepared to add to the droplet achieve a final concentration of 6%acrylamide and 0.1%bis-acrylamide in the beads. The concentration of acrylamide and bis-acrylamide can be tuned based on the particular application.

[0066] As examples, the flow rates were set at 5.8 μL / min for spacing oil, 1.9 μL / min for reinjected droplets, and 1.1 μL / min for the acrylamide solution. Flow rates may be set to retain a certain droplet size (e.g., 54 μm) . Both the spacing oil and the reinjected oil (the oil surrounding the reinjected droplets) were supplemented with 0.5% (vol / vol) tetramethylethylenediamine (TEMED) , which can trigger crosslinking of acrylamide monomers. TEMED may also be added after pico-injection process. After the pico-injection is complete, the bottom oil without TEMED can be removed and washed with oil supplemented with 0.5% (vol / vol) TEMED. Both methods of adding TEMED could result in gelation of the beads.

[0067] FIG. 5B shows a bright-field image of the pico-injection process illustrated in FIG. 5A. Droplets in droplet reinjection inlet 510 are mixed with spacing oil 512, which results in droplets, such as droplet 514 being spaced from adjacent droplets. Acrylamide solution 516 is directed into the droplets by a DEP force induced by electrode 518. After injection, the droplets are larger. The droplets are flowed through winding channel 520. The winding geometry of the channel promotes mixing. Flow rates may be optimized so that the acrylamide solution 516 is added only to droplets and not to the spacing oil.

[0068] Following pico-injection, the droplets can be incubated for 4-8 hours at 55 ℃ for crosslinking. Barcode beads may be formed after demulsification by adding 30% (vol / vol) perfluorooctanol (PFO) to break the oil interface. These steps may be similar to those described with stage 148.

[0069] Repetitive washing with NaOH is conducted to remove the second strands of DNA, resulting in final beads composed of single-stranded DNA. The washing may be as described with stage 150.

[0070] FIG. 5C shows the barcoded beads after demulsifiation and release of complementary strands under bright-field microscopy. The beads show high uniformity.

[0071] FIG. 5D shows the barcoded beads under fluorescence microscopy. The beads show high uniformity and the presence of the DNA template.

[0072] The concentration of acrylamide and bis-acrylamide monomers in the final hydrogel beads can be adjusted by varying the initial concentration of monomers and the flow rate of each component during pico-injection. Additionally, droplet sorting can also be conducted after pico-injection. We have validated that sorting was as effective either before or after gelation.

[0073] FIG. 6 shows an integrated microfluidic chip 600. Integrated microfluidic chip 600 includes pico-injection and sorting on the same chip. For example, integrated microfluidic chip 600 may include the functions of both sorting chip 404 and injection chip 500. Integrated microfluidic chip 600 is configured such that the injection occurs before the sorting. Sorting may be performed first, but then the positive droplets would not have uniform spacing after sorting, which may make pico-injection more challenging.

[0074] The left side of integrated microfluidic chip 600 includes components for injection of acrylamide from acrylamide solution inlet 602. Acrylamide solution inlet 602 may be similar to acrylamide solution inlet 502.

[0075] Droplets after ddPCR may be in reservoir 604, which may be similar to droplet reinjection inlet 506 or reservoir 410. Inlet 606 may include oil used to separate reinjected droplets from reservoir 604. Inlet 606 may be similar to inlet 408 or spacing oil inlet 504.

[0076] Injection electrodes 608 may apply an electric voltage to inject acrylamide solution into the droplets. Injection electrodes 608 may be similar to electrode 508.

[0077] Spacing oil from spacing oil inlet 610 and inlet 612 may be used to further space out droplets (both positive and negative) . Spacing oil inlet 610 may be similar to inlet 408 and / or inlet 406.

[0078] Sorting electrodes 614 provide a force to direct fluorescently positive droplets to positive outlet 616. Negative droplets flow to negative outlet 618. Sorting electrodes 614 may be similar to electrodes 416. Positive outlet 616 may be similar to positive outlet 414. Negative outlet 618 may be similar to negative outlet 412. ddPCR, pico-injection, and bead sorting (DPIBS)

[0079] A workflow that does not sort droplets may be performed by co-encapsulating acrydite-modified forward primers and biotin-modified reverse primers in the step of ddPCR droplet generation. FIG. 7 shows a workflow for producing beads without sorting droplets but instead sorting beads. This workflow, termed ddPCR, pico-injection, and bead sorting (DPIBS) , uses less equipment than D3SPI.

[0080] At stage 702, droplets are generated. Stage 702 is similar to stage 104. However, the droplets include different reverse primers 122. The reverse primer 122 includes biotin 704. Biotin 704 is used later to bond to streptavidin beads 706 later in the workflow.

[0081] At stage 708, DNA templates in positive droplets are amplified. Stage 708 is similar to stage 124. However, the double-stranded DNA 710 produced includes not only acrydite at one end but also biotin at the other end, as a result of biotin 704 on the reverse primer 712.

[0082] At stage 714, acrylamide is injected into droplets. Stage 714 is similar to stage 138. Negative droplets are also injected with acrylamide solution because the workflow in FIG. 7 avoids a droplet-sorting step such as stage 130.

[0083] At stage 716, the droplets undergo gelation and demulsification. Stage 716 is similar to stage 148.

[0084] At stage 718, the beads with DNA templates (i.e., positive beads) are separated from the beads without DNA templates (i.e., negative beads) . Magnetic streptavidin beads 706 are introduced to all beads in a vessel. Streptavidin binds with the biotin in the positive beads. A magnetic field is applied, which attracts the streptavidin bound to positive beads. The positive beads are then separated and sorted from the negative beads.

[0085] At stage 720, the complementary strand is removed. Stage 720 can be performed in a similar manner as stage 150.

[0086] FIG. 8 is a photograph of the separation of positive magnetic streptavidin beads 802 in a magnetic separation rack. Negative beads 804 have been separated from magnetic streptavidin beads 802 and are at the bottom of the vial.

[0087] For D3SPI and DPIBS, beads of multiple functionalities may be synthesized. FIG. 9 illustrates a process of adding functionalities to beads. By introducing molecules that may be copolymerized with hydrogel, e.g. acrylamide monomers, functional ends may be grafted onto the hydrogel network, through pico-injection.

[0088] When performing pico-injection, the acrylamide solution 902 may include designed oligos or small molecule ligands. The barcoded bead 904, after gelation, may then include small molecule ligands, such as methacrylate-PEG-benzylguanine (BG) and / or methacrylate-PEG-chloroalkane (CA) . These small molecule ligands may copolymerize with the acrylamide. Barcoded bead 904 may also include other primers, which can be used to target DNA or RNA, similar to the processes in FIG. 1 and FIG. 7. Although barcoded bead 904 show both BG and CA for illustrative purposes, the barcoded bead 904 may include only one of these ligands. Barcoded bead 904 may be functionalized to form functionalized bead 906. CA can bond with Halo-tag proteins. BG may bond with SNAP-tag proteins. The proteins can then bind with proteins or cells. The functionalized beads may then be used to label cells or individual proteins for proteomics. Functionalized bead 906 is illustrated showing several different tags, but functionalized bead 906 may include a subset of the bound proteins (including only one type of the bound protein) . For example, functionalized bead 906 may include only a plurality of Spytag-SpyCatcher functionalities.

[0089] As described herein, acrydite-modified oligos can be grafted onto the polyacrylamide (PAA) beads. Additional acrydite-modified oligos with designed sequences can be incorporated. For pooled screens with single-cell transcriptome readouts, such as CROP-seq19, Perturb-seq26, and CRISP-seq27, this set of additional oligos can be designed to capture the vector DNA / sgRNA molecules presented in each cell, while mRNA molecules can be captured by barcode oligo dT via 3’ poly-A. For single cell immune profiling of T cells or B cells, additional oligos can be designed to target the V (D) J region, facilitating capturing and sequencing of the V (D) J sequences. Other than incorporating additional designed oligos or small molecule ligands (such as methacrylate-PEG-benzylguanine [BG] and methacrylate-PEG-chloroalkane [CA] ) can be added to copolymerize with acrylamide and bis-acrylamide monomers. BG ligand acts as a suicide substrate for SNAP-tag28 (e.g., BG ligand can covalently bind to SNAP-tag) , and CA ligand acts as a suicide substrate for Halo-tag29. Consequently, hydrogel beads can covalently capture various types of SNAP- / Halo-tag fusion proteins via these attached ligands and capture target proteins, such as SnpC, SpyC, SnpCatcher, and Spytag proteins.

[0090] For instance, concanavalin A protein fused with a SNAP- / Halo-tag can be conjugated to the beads. Because concanavalin A can bind to glycoproteins on the cell surface, concanavalin A enables the hydrogel beads to capture cells. Additionally, antibodies fused with SNAP- / Halo-tag that bind to specific cell surface proteins can assist the hydrogel beads in capturing and enriching specific cell types. This cell-capturing capability of hydrogel barcode beads can be advantageous in microfluidics-free single-cell genomics such as Seq-Well18, Microwell-seq21, RevGel-seq30, and PIP-seq31 (particle-templated instant partition sequencing) . For example, the barcode beads and cells can be mixed to enable barcode bead-cell coupling.

[0091] The quantity of barcode beads may significantly exceed the number of cells, resulting in the majority of barcode beads binding to no more than one cell. The barcode bead-cell mixture can then be loaded into microwells used in Seq-Well and Microwell-seq. In the original Seq-Well and Microwell-seq, barcode beads and cells are loaded into microwells separately in two steps (e.g., load the cells, wash, then load the beads) . Therefore, the cell-capturing capability of hydrogel barcode beads may simplify the microwell loading procedures. For RevGel-seq, this cell-capturing capability may enable bead-cell association without the need to label cells with a bifunctional chemical linker, which is used to tether individual cells to barcode beads in the original method. For PIP-seq, the cell-capturing capability of hydrogel barcode beads may increase the cell capturing rate during the droplet generation step via particle-templated emulsion. Attaching all cells to the hydrogel barcode beads may prevent the generation of droplets containing only cells without any barcode beads.

[0092] D3SPI and DPIBS are workflows that may generate barcode beads, and in general multi-functional beads, in a facile, high-throughput, and cost-effective format. Example Droplet Sorting Method

[0093] FIG. 10 shows a method for preparing a plurality of barcoded beads. FIG. 10 may be used to carry out the workflow described in FIG. 1 and any other workflow described with D3SPI.

[0094] In block 1002, method 1000 generates a first plurality of droplets and a second plurality of droplets. Each droplet of the first plurality of droplets may include a respective DNA template characterized by a respective sequence. Each droplet may contain a primer including a moiety configured to react with a hydrogel. Each droplet may include a polymerase. Each droplet of the second plurality of droplets may not include any DNA template.

[0095] The moiety may include acrydite. The crosslinking agent may include acrylamide, bis-acrylamide, or APS. The hydrogel may include polyacrylamide. The primer with the moiety may be a forward primer. Each droplet may include a reverse primer.

[0096] Each droplet in the first plurality of droplets may include a single DNA template. The single DNA template may be unique to the droplet. The DNA template may be used later as the barcode to identify a cell.

[0097] The first plurality of droplets may be in a range from 8%to 10%or 10%to 12%of all droplets on a microfluidic chip or in a particular location on the chip (e.g., outlet 212) . The second plurality of droplets may be the remainder of the droplets.

[0098] Generating the first plurality of droplets and the second plurality of droplets may include mixing oil with a ddPCR solution (e.g., stage 104) . Each droplet of the first plurality of droplets may be characterized by a diameter in a range from 30 to 40 μm, 40 to 45 μm, 45 to 50 μm, or 50 to 60 μm.

[0099] In block 1004, method 1000, in each droplet of the first plurality of droplets, amplifies the respective DNA template using the primer to form a plurality of double-stranded molecules in the droplet (e.g., stage 124) . The double-stranded molecule may include a respective first strand having the respective DNA template. The double-stranded molecule may include a respective complementary strand. The double-stranded molecule may include the moiety. Amplifying the respective DNA template may include thermal cycling and / or using a ddPCR machine.

[0100] In block 1006, method 1000 separates the second plurality of droplets from the first plurality of droplets (e.g., stage 130) . Separating may include using fluorescence-activated droplet sorting (FADS) . Separation may use FADS system 300. Separation may include inducing a force (e.g., DEP force) by electrodes following a trigger generated by a threshold fluorescence level. The force may send the first plurality of droplets down a path different from the second plurality of droplets.

[0101] In block 1008, method 1000 injects a crosslinking agent into each droplet of the first plurality of droplets (e.g., stage 138) . In some embodiments, injection may occur before separating the second plurality of droplets from the first plurality of droplets. Hence, injecting the crosslinking agent may also be performed on the second plurality of droplets. Injecting the crosslinking agent may involve using electrodes to induce a force to insert the crosslinking agent into the droplet. The size of the droplet may increase after injection. The increase in diameter may be from 5%to 10%, 10%to 20%, 20%to 30%, or greater than 30%.

[0102] In block 1010, method 1000 forms the hydrogel using the crosslinking agent (e.g., stage 148) . Forming the hydrogen may involve incubation for a period of 2 to 4 hours, 4 to 6 hours, 6 to 10 hours, 10 to 12 hours, or greater than 12 hours. The incubation temperature may be from 40 to 50 ℃, 50 to 55 ℃, 55 to 60 ℃, or 60 to 70 ℃.

[0103] In block 1012, method 1000, in each droplet of the first plurality of droplets, bonds the respective moiety of the respective plurality of double-stranded molecules to the hydrogel (e.g., stage 148) .

[0104] In block 1014, method 1000 removes the respective complementary strand in each double-stranded molecule of the respective plurality of double-stranded molecules (e.g., stage 150) . Removing the complementary strand may include washing with sodium hydroxide.

[0105] In block 1016, method 1000 demulsifies the first plurality of droplets to form the plurality of barcoded beads. Each bead may be barcoded with the respective DNA template. Forming the hydrogen may include using perfluorooctanol.

[0106] Method 1000 may further include functionalizing the surface of the bead with an affinity reagent (e.g., FIG. 9) . Functionalizing the surface may include injecting a ligand into each droplet of the first plurality of droplets. The ligand may be BG or CA. Functionalizing the surface may include injecting an oligo into the droplet. The injection may be with injecting the crosslinking agent in block 1008. Functionalizing the surface may include binding the affinity reagent to the ligand or to the oligo. The affinity reagent may be a protein. The affinity reagent comprises a SNAP-tag protein, a Halo-tag protein, a SnpC protein, a SpyC protein, a SnpCatcher protein, a Spytag protein, a SpyCatcher protein, an antibody, an antigen, or a concanavalin A protein. Functionalizing the surface may be similar to process 900.

[0107] Method 1000 may further include labeling a cell or nucleus with a first bead of the plurality of barcoded beads. Example Droplet Sorting System

[0108] FIG. 11 shows an example droplet sorting system 1100 that may be used with method 1000. The droplet sorting system may include aspects of FIG. 1, FIG. 2A, FIG. 2B, FIG. 3, FIG. 4B, FIG. 4D, FIG. 5A, FIG. 5B, or any suitable system described herein.

[0109] System 1100 may include a first microfluidic chip 1102. First microfluidic chip 1102 may include a droplet reservoir 1104 configured to contain a first plurality of droplets and a second plurality of droplets. Each droplet of the first plurality of droplets may include a respective DNA template. Each droplet of the second plurality of droplets may exclude a DNA template. The droplets may be any droplets described herein. The first microfluidic chip 1102 may be similar to sorting chip 404.

[0110] First microfluidic chip 1102 may also include a first outlet 1106 configured to receive the first plurality of droplets. First microfluidic chip 1102 may also include a second outlet 1108 configured to receive the second plurality of droplets. First microfluidic chip 1102 may also include a first channel 1110 in fluidic communication with the droplet reservoir 1104, the first outlet 1106, and the second outlet 1108. The first microfluidic chip 1102 may include an oil reservoir 1112. The oil reservoir 1112 may be in fluidic communication with first channel 1110.

[0111] First microfluidic chip 1102 may also include a first electrode 1114 configured to apply a first force into the first channel 1110. The applied first force directs a droplet into the first outlet 1106. First microfluidic chip 1102 may include a plurality of first electrodes. In some embodiments, system 1100 may include a control system 1116 configured to trigger the plurality of first electrodes to apply a plurality of first forces upon detector 1118 detecting the fluorescence signal. The control system 1116 may be configured to trigger the first electrode 1114 after a delay upon detection. The control system 1116 may include a computing system.

[0112] The system may also include an optical emission source 1120 configured to illuminate a droplet in the first channel 1110. Optical emission source 1120 may be a laser (e.g., laser 310) . The system may include a detector 1118 configured to detect a fluorescence signal from a droplet in the first channel 1110. A portion of or all of optical emission source 1120 and detector 1118 may or may not be part of the first microfluidic chip 1102. Detector 1118 may be PMT 312 or a photodiode or any suitable detector. System 1100 may include any of the components in FADS system 300.

[0113] System 1100 may also include a control system 1116 configured to trigger the first electrode 1114 to apply the first force upon the detector 1118 detecting the fluorescence signal.

[0114] The system may also include a second microfluidic chip 1122. The second microfluidic chip 1122 may include a droplet inlet 1124, a crosslinking agent reservoir 1126 configured to contain a crosslinking agent, a third outlet 1128, and an injection channel 1130 in fluidic communication with the crosslinking agent reservoir 1126. Second microfluidic chip 1122 may further include a second channel 1132 in fluidic communication with the droplet inlet 1124, the injection channel 1130, and the third outlet 1128, and a second electrode 1134 configured to apply a second force to inject the crosslinking agent into a droplet in the second channel 1132. Second microfluidic chip 1122 may be similar to injection chip 500.

[0115] Second microfluidic chip 1122 may include a plurality of second electrodes. The plurality of second electrodes may include the second electrode. The plurality of second electrodes may be configured to apply a plurality of second forces to inject the crosslinking agent into the droplet in the second channel 1132.

[0116] Second microfluidic chip 1122 may include oil reservoir 1112. Oil reservoir 1112 may be in fluidic communication with second channel 1132 through oil channel 1136.

[0117] The second channel may have a portion between the injection channel 1130 and third outlet 1128. The portion may have a plurality of turns.

[0118] In some embodiments, the second microfluidic chip is the same chip as the first microfluidic chip. For example, in FIG. 11, first microfluidic chip 1102 and second microfluidic chip 1122 may be connected by the chip substrate. The first outlet 1106 may be the same as droplet inlet 1124.

[0119] System 1100 may include a robotic handling system 1138 to transfer contents of the first outlet 1106 to droplet inlet 1124. Robotic handling system 1138 may transfer contents (e.g., through pipetting) from a supply container to first microfluidic chip 1102 or second microfluidic chip 1122.

[0120] System 1100 may also include a third microfluidic chip, which may be the chip depicted in FIG. 2A. The third microfluidic chip may include an oil reservoir (e.g., reservoir with continuous phase 204) . The third microfluidic chip may include a buffer reservoir (e.g., reservoir with dispersed phase 202) . The chip may include a mixing zone (e.g., mixing area 210) in fluidic communication with the oil reservoir and the buffer reservoir. The mixing zone may be configured to mix an oil output of the oil reservoir and a buffer output of the buffer reservoir. The third microfluidic chip may include a fourth outlet (e.g., outlet 212) in fluidic communication with the mixing zone. The fourth outlet may be configured to receive a mixture of the oil output and the buffer output. In some embodiments, third microfluidic chip may be the same as first microfluidic chip 1102 and / or second microfluidic chip 1122.

[0121] System 1100 may include a PCR system 1140, which may be a ddPCR system. A robotic handling system 1138 may be configured to transfer contents from the fourth outlet to the PCR system 1140 and to transfer contents from the PCR system 1140 to the droplet reservoir 1104.

[0122] System 1100 may further include the first plurality of droplets and the second plurality of droplets disposed in the droplet reservoir 1104. System 1100 may include the crosslinking agent disposed in the crosslinking agent reservoir. System 1100 may include the first plurality of droplets in the first outlet 1106 and the second plurality of droplets in the second outlet 1108. System 1100 may include droplets injected with acrylamide solution in third outlet 1128.

[0123] System 1100 may also include an incubator configured to demulsify droplets into beads. Example Bead Sorting Method

[0124] FIG. 12 shows a method 1200 for preparing a plurality of barcoded beads. FIG. 12 may be used to carry out the workflow described in FIG. 7 and any other workflow described with DPIBS.

[0125] In block 1202, method 1200 generates a first plurality of droplets and a second plurality of droplets (e.g., stage 702) . Each droplet of the first plurality of droplets may include a respective DNA template characterized by a respective sequence. Each droplet may include a first primer with a moiety configured to react with a hydrogel. Each droplet may include a second primer comprising an affinity reagent configured to bond with a target molecule. The first primer may be a forward primer. The second primer may be a reverse primer. Each droplet may include a polymerase. Each droplet of the second plurality of droplets may exclude a DNA template. Generating the first plurality of droplets and the second plurality of droplets comprises mixing oil with a ddPCR solution.

[0126] The moiety may include acrydite. The crosslinking agent may include acrylamide. The hydrogel may include polyacrylamide.

[0127] The first plurality of droplets may include a single DNA template. The single DNA template may be unique to the droplet. The DNA template may be used later as barcode to identify a cell. The droplets may have any diameter described herein.

[0128] The affinity reagent may include biotin. The target molecule may include streptavidin. Other affinity reagent and target molecule systems may include avidin-biotin, NeutrAvidin-biotin, nanobody-based systems, aptamer-ligand systems, complementary DNA strands, peptide-based binding systems (e.g., HaloTag System, SNAP-Tag and CLIP-Tag, SpyTag-SpyCatcher) , small molecule-based systems (e.g., digoxigenin-anti-digoxigenin, fluorescein-anti-fluorescein) protein-based systems (e.g., Fc-protein A / G system, calcium-binding proteins) , or synthetic ligand-protein systems (e.g., Designed Ankyrin Repeat Proteins [DARPins] , receptor-ligand pairs) .

[0129] In block 1204, method 1200, in each droplet of the first plurality of droplets, amplifies the respective DNA template using the first primer and the second primer to form a plurality of double-stranded molecules in the droplet (e.g., stage 708) . Amplifying may include the steps described with block 1004. The double-stranded molecule may include a first strand having the respective DNA template. The double-stranded molecule may include a respective complementary strand. The double-stranded molecule may also include the moiety at a first end of the double-stranded molecule. In addition, the double-stranded molecule may include the affinity reagent at a second end of the double-stranded molecule.

[0130] In block 1206, method 1200 injects a crosslinking agent into each droplet of the first plurality of droplets and each droplet of the second plurality of droplets (e.g., stage 714) . Injecting the crosslinking agent may be performed similar to block 1008.

[0131] In block 1208, method 1200 forms the hydrogel using the crosslinking agent (e.g., stage 716) . Forming the hydrogel may be similar to block 1010.

[0132] In block 1210, method 1200 demulsifies the first plurality of droplets to form a first plurality of beads (e.g., stage 716) . Block 1210 may be performed similar to block 1016.

[0133] In block 1212, method 1200 demulsifies the second plurality of droplets to form a second plurality of beads (e.g., stage 716) . Block 1212 may be performed similar to block 1016.

[0134] In block 1214, method 1200 bonds the first plurality of beads to a plurality of target beads (e.g., stage 718) . Each target bead may be coupled to a respective target molecule. Bonding may include bonding the respective affinity reagent to the respective target molecule.

[0135] In block 1216, method 1200 separates the first plurality of beads from the second plurality of beads using the plurality of target beads (e.g., stage 718) .

[0136] The plurality of target beads may be magnetic. Separating the beads may include using a magnet or electromagnetic force to attract the first plurality of beads.

[0137] In some embodiments, the plurality of target beads may include target beads having a threshold diameter. Separating the beads may include filtering the beads to retain the first plurality of beads.

[0138] In some embodiments, the plurality of target beads may include target beads having a threshold weight. Separating the beads may use centrifugation, where the heavier first plurality of beads are separated from the lighter second plurality of beads.

[0139] In block 1218, method 1200 removes the respective complementary strand from a respective plurality of double-stranded molecules in each bead of the first plurality of beads (e.g., stage 720) . Block 1218 may be similar to block 1014.

[0140] Method 1200 may further include functionalizing the surface of the bead with a second affinity reagent (e.g., FIG. 9) . Functionalizing the surface may include injecting a ligand into each droplet of the first plurality of droplets. The ligand may be BG or CA. Functionalizing the surface may include injecting an oligo into the droplet. The injection may be with injecting the crosslinking agent in block 1206. Functionalizing the surface may include binding the second affinity reagent to the ligand or to the oligo. The second affinity reagent may be a protein. The second affinity reagent comprises a SNAP-tag protein, a Halo-tag protein, a SnpC protein, a SpyC protein, a SnpCatcher protein, a Spytag protein, a SpyCatcher protein, an antibody, an antigen, or a concanavalin A protein. Functionalizing the surface may be similar to process 900.

[0141] Method 1200 may further include labeling a cell or nucleus with a first bead of the plurality of barcoded beads. Example Bead Sorting System

[0142] FIG. 13 shows an example droplet sorting system 1300 that may be used with method 1200. The droplet sorting system 1300 may include aspects of FIG. 2A, FIG. 7, FIG. 8, or any suitable system described herein.

[0143] System 1300 may include a microfluidic chip 1302. Microfluidic chip 1302 may include a droplet reservoir configured to contain a first plurality of droplets and a second plurality of droplets. Each droplet of the first plurality of droplets may include a respective DNA template, a first primer having a moiety configured to react with a hydrogel, a second primer having an affinity reagent configured to bond with a target molecule, and a polymerase. Each droplet of the second plurality of droplets may exclude a DNA template. The droplets, first primer, second primer, affinity reagent, and target molecule may be any described herein.

[0144] Microfluidic chip 1302 may also include a crosslinking agent reservoir 1304 configured to contain a crosslinking agent. Microfluidic chip 1302 may a channel 1306 in fluidic communication with the droplet reservoir 1308 and the crosslinking agent reservoir 1304. Microfluidic chip 1302 may include an electrode 1310 configured to apply a force to inject a crosslinking agent from the crosslinking agent reservoir 1304 through injection channel 1312 into a droplet in the channel 1306.

[0145] Microfluidic chip 1302 may include a plurality of electrodes. The plurality of electrodes may be configured to apply a plurality of forces to inject the crosslinking agent from crosslinking agent reservoir 1304 into the droplet in channel 1306.

[0146] Microfluidic chip 1302 may include oil reservoir 1314, which may be in fluidic communication with channel 1306 through oil channel 1316.

[0147] System 1300 may include a PCR system 1318 for amplifying DNA templates. PCR system 1318 may be any PCR system described herein.

[0148] System 1300 may include an incubator 1320 configured to demulsify the first plurality of droplets to form a first plurality of beads and to demulsify the second plurality of droplets to form a second plurality of beads.

[0149] System 1300 may include a bonding module 1322 configured to bond the first plurality of beads to a plurality of target beads. The target beads may be any target beads described herein. Each target bead may be coupled to a respective target molecule. Bonding may include bonding the respective affinity reagent to the respective target molecule. The bonding module 1322 may include a mixer, stirrer, and / or heater to facilitate bonding.

[0150] System 1300 may include a separation module 1324 configured to separate the first plurality of beads from the second plurality of beads using the plurality of target beads. Separation module 1324 may be a magnetic separation system (e.g., FIG. 8) , a filtering system, or a centrifuge.

[0151] System 1300 may further include a robotic handling system 1326 configured to transfer contents exiting channel 1306 (e.g., in outlet 1328) to incubator 1320. Robotic handling system 1326 may be similar to robotic handling system 1138. Robotic handling system 1326 may transfer contents from incubator 1320 to bonding module 1322. Robotic handling system 1326 may transfer contents from bonding module 1322 to separation module 1324.

[0152] System 1300 may include a control system 1330, which may include a computing system. Control system 1330 may issue commands to any one of or combination of robotic handling system 1326, PCR system 1318, incubator 1320, bonding module 1322, and separation module 1324.

[0153] System 1300 may further include the first plurality of droplets and the second plurality of droplets disposed in droplet reservoir 1332. System 1300 may include the crosslinking agent disposed in the crosslinking agent reservoir 1304. System 1300 may include the first plurality of droplets in the first outlet 1106 and the second plurality of droplets in the channel 1306. System 1100 may include droplets injected with acrylamide solution in outlet 1328. Computing System

[0154] Any of the computer systems mentioned herein may utilize any suitable number of subsystems. Examples of such subsystems are shown in FIG. 14 in computer system 1400. In some embodiments, a computer system includes a single computer apparatus, where the subsystems can be the components of the computer apparatus. In other embodiments, a computer system can include multiple computer apparatuses, each being a subsystem, with internal components. A computer system can include desktop and laptop computers, tablets, mobile phones, other mobile devices, and cloud-based systems.

[0155] The subsystems shown in FIG. 14 are interconnected via a system bus 1402. Additional subsystems such as a printer 1404, keyboard 1406, storage device (s) 1408, monitor 1410 (e.g., a display screen, such as an LED) , which is coupled to display adapter 1412, and others are shown. Peripherals and input / output (I / O) devices, which couple to I / O controller 1414, can be connected to the computer system by any number of means known in the art such as input / output (I / O) 1416 (e.g., USB, Lightning, ThunderboltTM) . For example, i / o port 1416 or external interface 1418 (e.g. Ethernet, Wi-Fi, etc. ) can be used to connect computer system 1400 to a wide area network such as the Internet, a mouse input device, or a scanner. The interconnection via system bus 1402 allows the central processor 1420 to communicate with each subsystem and to control the execution of a plurality of instructions from system memory 1422 or the storage device (s) 1408 (e.g., a fixed disk, such as a hard drive, or optical disk) , as well as the exchange of information between subsystems. The system memory 1422 and / or the storage device (s) 1408 may embody a computer readable medium. Another subsystem is a data collection device 85, such as a camera, microphone, accelerometer, and the like. Any of the data mentioned herein can be output from one component to another component and can be output to the user.

[0156] A computer system can include a plurality of the same components or subsystems, e.g., connected together by external interface 1418, by an internal interface, or via removable storage devices that can be connected and removed from one component to another component. In some embodiments, computer systems, subsystem, or apparatuses can communicate over a network. In such instances, one computer can be considered a client and another computer a server, where each can be part of a same computer system. A client and a server can each include multiple systems, subsystems, or components.

[0157] Aspects of embodiments can be implemented in the form of control logic using hardware circuitry (e.g. an application specific integrated circuit or field programmable gate array) and / or using computer software with a generally programmable processor in a modular or integrated manner. As used herein, a processor can include a single-core processor, multi-core processor on a same integrated chip, or multiple processing units on a single circuit board or networked, as well as dedicated hardware. Based on the disclosure and teachings provided herein, a person of ordinary skill in the art will know and appreciate other ways and / or methods to implement embodiments of the present invention using hardware and a combination of hardware and software.

[0158] Any of the software components or functions described in this application may be implemented as software code to be executed by a processor using any suitable computer language such as, for example, Java, C, C++, C#, Objective-C, Swift, or scripting language such as Perl or Python using, for example, conventional or object-oriented techniques. The software code may be stored as a series of instructions or commands on a computer readable medium for storage and / or transmission. A suitable non-transitory computer readable medium can include random access memory (RAM) , a read only memory (ROM) , a magnetic medium such as a hard-drive or a floppy disk, or an optical medium such as a compact disk (CD) or DVD (digital versatile disk) or Blu-ray disk, flash memory, and the like. The computer readable medium may be any combination of such storage or transmission devices.

[0159] Such programs may also be encoded and transmitted using carrier signals adapted for transmission via wired, optical, and / or wireless networks conforming to a variety of protocols, including the Internet. As such, a computer readable medium may be created using a data signal encoded with such programs. Computer readable media encoded with the program code may be packaged with a compatible device or provided separately from other devices (e.g., via Internet download) . Any such computer readable medium may reside on or within a single computer product (e.g. a hard drive, a CD, or an entire computer system) , and may be present on or within different computer products within a system or network. A computer system may include a monitor, printer, or other suitable display for providing any of the results mentioned herein to a user.

[0160] Any of the methods described herein may be totally or partially performed with a computer system including one or more processors, which can be configured to perform the steps. Thus, embodiments can be directed to computer systems configured to perform the steps of any of the methods described herein, potentially with different components performing a respective step or a respective group of steps. Although presented as numbered steps, steps of methods herein can be performed at a same time or at different times or in a different order. Additionally, portions of these steps may be used with portions of other steps from other methods. Also, all or portions of a step may be optional. Additionally, any of the steps of any of the methods can be performed with modules, units, circuits, or other means of a system for performing these steps.

[0161] Any of the methods described herein may be totally or partially performed with a computer system including one or more processors, which can be configured to perform the steps. Thus, embodiments can be directed to computer systems configured to perform the steps of any of the methods described herein, potentially with different components performing a respective step or a respective group of steps. Although presented as numbered steps, steps of methods herein can be performed at a same time or at different times or in a different order that is logically possible. Additionally, portions of these steps may be used with portions of other steps from other methods. Also, all or portions of a step may be optional. Additionally, any of the steps of any of the methods can be performed with modules, units, circuits, or other means of a system for performing these steps.

[0162] As will be apparent to those of skill in the art upon reading this disclosure, each of the individual embodiments described and illustrated herein has discrete components and features which may be readily separated from or combined with the features of any of the other several embodiments without departing from the scope or spirit of the present disclosure.

[0163] The above description of example embodiments of the present disclosure has been presented for the purposes of illustration and description and are set forth so as to provide those of ordinary skill in the art with a complete disclosure and description of how to make and use embodiments of the present disclosure. It is not intended to be exhaustive or to limit the disclosure to the precise form described nor are they intended to represent that the experiments are all or the only experiments performed. Although the disclosure has been described in some detail by way of illustration and example for purposes of clarity of understanding, it is readily apparent to those of ordinary skill in the art in light of the teachings of this disclosure that certain changes and modifications may be made thereto without departing from the spirit or scope of the appended claims.

[0164] Accordingly, the preceding merely illustrates the principles of the invention. It will be appreciated that those skilled in the art will be able to devise various arrangements which, although not explicitly described or shown herein, embody the principles of the invention and are included within its spirit and scope. Furthermore, all examples and conditional language recited herein are principally intended to aid the reader in understanding the principles of the disclosure being without limitation to such specifically recited examples and conditions. Moreover, all statements herein reciting principles, aspects, and embodiments of the invention as well as specific examples thereof, are intended to encompass both structural and functional equivalents thereof. Additionally, it is intended that such equivalents include both currently known equivalents and equivalents developed in the future, i.e., any elements developed that perform the same function, regardless of structure. The scope of the present invention, therefore, is not intended to be limited to the exemplary embodiments shown and described herein. Rather, the scope and spirit of present invention is embodied by the appended claims.

[0165] A recitation of “a” , “an” or “the” is intended to mean “one or more” unless specifically indicated to the contrary. The use of “or” is intended to mean an “inclusive or, ” and not an “exclusive or” unless specifically indicated to the contrary. Reference to a “first” component does not necessarily require that a second component be provided. Moreover, reference to a “first” or a “second” component does not limit the referenced component to a particular location unless expressly stated. The term “based on” is intended to mean “based at least in part on. ”

[0166] The claims may be drafted to exclude any element which may be optional. As such, this statement is intended to serve as antecedent basis for use of such exclusive terminology as “solely” , “only” , and the like in connection with the recitation of claim elements, or the use of a “negative” limitation.

[0167] Where a range of values is provided, it is understood that each intervening value, to the tenth of the unit of the lower limit unless the context clearly dictates otherwise, between the upper and lower limits of that range is also specifically disclosed. Each smaller range between any stated value or intervening value in a stated range and any other stated or intervening value in that stated range is encompassed within embodiments of the present disclosure. The upper and lower limits of these smaller ranges may independently be included or excluded in the range, and each range where either, neither, or both limits are included in the smaller ranges is also encompassed within the present disclosure, subject to any specifically excluded limit in the stated range. Where the stated range includes one or both of the limits, ranges excluding either or both of those included limits are also included in the present disclosure.

[0168] All patents, patent applications, publications, and descriptions mentioned herein are hereby incorporated by reference in their entirety for all purposes as if each individual publication or patent were specifically and individually indicated to be incorporated by reference and are incorporated herein by reference to disclose and describe the methods and / or materials in connection with which the publications are cited. None is admitted to be prior art.

[0169] Embodiments may include the following.

[0170] Embodiment 1. A method for preparing a plurality of barcoded beads, the method comprising: generating a first plurality of droplets and a second plurality of droplets, wherein: each droplet of the first plurality of droplets comprises: a respective DNA template characterized by a respective sequence, a primer comprising a moiety configured to react with a hydrogel, and a polymerase, and each droplet of the second plurality of droplets does not comprise any DNA template; in each droplet of the first plurality of droplets, amplifying the respective DNA template using the primer to form a plurality of double-stranded molecules in the droplet, wherein the double-stranded molecule comprises: a respective first strand having the respective DNA template, a respective complementary strand, and the moiety; separating the second plurality of droplets from the first plurality of droplets; injecting a crosslinking agent into each droplet of the first plurality of droplets; forming the hydrogel using the crosslinking agent; and in each droplet of the first plurality of droplets: bonding the respective moiety of the respective plurality of double-stranded molecules to the hydrogel; removing the respective complementary strand in each double-stranded molecule of the respective plurality of double-stranded molecules; and demulsifying the first plurality of droplets to form the plurality of barcoded beads, wherein each bead is barcoded with the respective DNA template.

[0171] Embodiment 2. The method of embodiment 1, wherein generating the first plurality of droplets and the second plurality of droplets comprises mixing oil with a ddPCR solution.

[0172] Embodiment 3. The method of embodiment 1, wherein: the moiety comprises acrydite, the crosslinking agent comprises acrylamide, and the hydrogel comprises polyacrylamide.

[0173] Embodiment 4. The method of embodiment 1, wherein the primer in each droplet is a forward primer, and wherein each droplet of the first plurality of droplets comprises a reverse primer.

[0174] Embodiment 5. The method of embodiment 1, wherein each droplet in the first plurality of droplets comprises a single DNA template, and the single DNA template is unique to the droplet.

[0175] Embodiment 6. The method of embodiment 1, wherein each droplet of the first plurality of droplets is characterized by a diameter in a range from 40 μm to 50 μm.

[0176] Embodiment 7. The method of embodiment 1, wherein amplifying the respective DNA template comprises thermal cycling.

[0177] Embodiment 8. The method of embodiment 1, wherein separating the second plurality of droplets comprises fluorescence-activated droplet sorting.

[0178] Embodiment 9. The method of embodiment 1, wherein the first plurality of droplets is in a range from 8%to 12%of all droplets on a microfluidic chip.

[0179] Embodiment 10. The method of embodiment 1, further comprising labeling a cell or nucleus with a first bead of the plurality of barcoded beads.

[0180] Embodiment 11. The method of embodiment 1, further comprising: for each bead of the plurality of beads, functionalizing a surface of the bead with an affinity reagent.

[0181] Embodiment 12. The method of embodiment 11, wherein functionalizing the surface of the bead comprises: injecting a ligand into each droplet of the first plurality of droplets; and binding the affinity reagent to the ligand.

[0182] Embodiment 13. The method of embodiment 11, wherein the affinity reagent is a protein.

[0183] Embodiment 14. The method of embodiment 11, wherein the affinity reagent comprises a SNAP-tag protein, a Halo-tag protein, a SnpC protein, a SpyC protein, a SnpCatcher protein, a Spytag protein, a SpyCatcher protein, an antibody, an antigen, or a concanavalin A protein.

[0184] Embodiment 15. The method of embodiment 1, wherein injecting the crosslinking agent occurs before separating the second plurality of droplets from the first plurality of droplets.

[0185] Embodiment 16. A system comprising: a first microfluidic chip, wherein the first microfluidic chip comprises: a droplet reservoir configured to contain a first plurality of droplets and a second plurality of droplets, wherein: each droplet of the first plurality of droplets comprises a respective DNA template, and each droplet of the second plurality of droplets does not comprise a DNA template; a first outlet configured to receive the first plurality of droplets; a second outlet configured to receive the second plurality of droplets; a first channel in fluidic communication with the droplet reservoir, the first outlet, and the second outlet; a first electrode configured to apply a first force into the first channel, wherein the applied first force directs a droplet into the first outlet; an optical emission source configured to illuminate a droplet in the first channel; a detector configured to detect a fluorescence signal from a droplet in the first channel; a control system configured to: trigger the first electrode to apply the first force upon the detector detecting the fluorescence signal; and a second microfluidic chip, wherein the second microfluidic chip comprises: a droplet inlet; a crosslinking agent reservoir configured to contain a crosslinking agent; a third outlet; an injection channel in fluidic communication with the crosslinking agent reservoir; a second channel in fluidic communication with the droplet inlet, the injection channel, and the third outlet; and a second electrode configured to apply a second force to inject the crosslinking agent into a droplet in the second channel.

[0186] Embodiment 17. The system of embodiment 16, wherein the first microfluidic chip is the second microfluidic chip.

[0187] Embodiment 18. The system of embodiment 17, wherein: the droplet inlet is the droplet reservoir, and the third outlet is the first channel.

[0188] Embodiment 19. The system of embodiment 16, wherein the droplet inlet is the first outlet.

[0189] Embodiment 20. The system of embodiment 16, wherein: the first microfluidic chip further comprises an oil reservoir, and the oil reservoir is in fluidic communication with the first channel.

[0190] Embodiment 21. The system of embodiment 16, wherein: the first microfluidic chip comprises a plurality of first electrodes, the plurality of first electrodes comprises the first electrode, and the control system is configured to trigger the plurality of first electrodes to apply a plurality of first forces upon the detector detecting the fluorescence signal.

[0191] Embodiment 22. The system of embodiment 16, wherein the control system is configured to trigger the first electrode after a delay upon detecting the fluorescence signal.

[0192] Embodiment 23. The system of embodiment 16, wherein the optical emission source is a laser.

[0193] Embodiment 24. The system of embodiment 16, wherein: the second microfluidic chip further comprises an oil reservoir, and the oil reservoir is in fluidic communication with the second channel.

[0194] Embodiment 25. The system of embodiment 16, wherein: the second microfluidic chip comprises a plurality of second electrodes, the plurality of second electrodes comprises the second electrode, and the plurality of second electrodes is configured to apply a plurality of second forces to inject the crosslinking agent into the droplet in the second channel.

[0195] Embodiment 26. The system of embodiment 16, wherein: the second channel comprises a first portion between the injection channel and the third outlet, and the first portion of the second channel comprises a plurality of turns.

[0196] Embodiment 27. The system of embodiment 16, further comprising a robotic handling system to transfer contents of the first outlet to the droplet inlet.

[0197] Embodiment 28. The system of embodiment 16, further comprising a third microfluidic chip comprising: an oil reservoir; a buffer reservoir; a mixing zone in fluidic communication with the oil reservoir and the buffer reservoir, wherein the mixing zone is configured to mix an oil output of the oil reservoir and a buffer output of the buffer reservoir; and a fourth outlet in fluidic communication with the mixing zone, wherein the fourth outlet is configured to receive a mixture of the oil output and the buffer output.

[0198] Embodiment 29. The system of embodiment 28, further comprising a ddPCR system.

[0199] Embodiment 30. The system of embodiment 29, further comprising: a robotic handling system configured to transfer contents from the fourth outlet to the ddPCR system and to transfer contents from the ddPCR system to the droplet reservoir.

[0200] Embodiment 31. The system of embodiment 16, further comprising: the first plurality of droplets and the second plurality of droplets disposed in the droplet reservoir; and the crosslinking agent disposed in the crosslinking agent reservoir.

[0201] Embodiment 32. A method for preparing a plurality of barcoded beads, the method comprising: generating a first plurality of droplets and a second plurality of droplets, wherein: each droplet of the first plurality of droplets comprises: a respective DNA template characterized by a respective sequence, a first primer comprising a moiety configured to react with a hydrogel, wherein the first primer is a forward primer, a second primer comprising an affinity reagent configured to bond with a target molecule, wherein the second primer is a reverse primer, and a polymerase; each droplet of the second plurality of droplets does not comprise a DNA template; in each droplet of the first plurality of droplets, amplifying the respective DNA template using the first primer and the second primer to form a plurality of double-stranded molecules in the droplet, wherein the double-stranded molecule comprises: a first strand having the respective DNA template, a respective complementary strand, the moiety at a first end of the double-stranded molecule, and the affinity reagent at a second end of the double-stranded molecule; injecting a crosslinking agent into each droplet of the first plurality of droplets and each droplet of the second plurality of droplets; forming the hydrogel using the crosslinking agent; demulsifying the first plurality of droplets to form a first plurality of beads; demulsifying the second plurality of droplets to form a second plurality of beads; bonding the first plurality of beads to a plurality of target beads, each target bead coupled to a respective target molecule, wherein bonding comprises bonding the respective affinity reagent to the respective target molecule; separating the first plurality of beads from the second plurality of beads using the plurality of target beads; and removing the respective complementary strand from a respective plurality of double-stranded molecules in each bead of the first plurality of beads.

[0202] Embodiment 33. The method of embodiment 32, wherein the affinity reagent comprises biotin, and the target molecule comprises streptavidin.

[0203] Embodiment 34. The method of embodiment 32, wherein: the plurality of target beads is magnetic, and separating the first plurality of beads from the second plurality of beads comprises using a magnet to attract the first plurality of beads.

[0204] Embodiment 35. The method of embodiment 32, wherein: the plurality of target beads comprises target beads having a threshold diameter, and separating the first plurality of beads from the second plurality of beads comprises filtering to retain the first plurality of beads.

[0205] Embodiment 36. The method of embodiment 32, wherein: the moiety comprises acrydite, the crosslinking agent comprises acrylamide, and the hydrogel comprises polyacrylamide.

[0206] Embodiment 37. The method of embodiment 32, wherein generating the first plurality of droplets and the second plurality of droplets comprises mixing oil with a ddPCR solution.

[0207] Embodiment 38. The method of embodiment 32, wherein each droplet of the first plurality of droplets comprises a single DNA template, and the single DNA template is unique to the droplet.

[0208] Embodiment 39. The method of embodiment 32, wherein each droplet of the first plurality of droplets is characterized by a diameter in a range from 40 μm to 50 μm.

[0209] Embodiment 40. The method of embodiment 32, wherein amplifying the respective DNA template comprises thermal cycling.

[0210] Embodiment 41. The method of embodiment 32, wherein the first plurality of droplets is in a range from 8%to 12%of all droplets on a microfluidic chip.

[0211] Embodiment 42. The method of embodiment 32, further comprising labeling a cell or nucleus with a first bead of the plurality of barcoded beads.

[0212] Embodiment 43. The method of embodiment 32, wherein: the affinity reagent is a first affinity reagent; and for each bead of the first plurality of beads, the method further comprises functionalizing a surface of the bead with a second affinity reagent.

[0213] Embodiment 44. The method of embodiment 43, wherein functionalizing the surface of the bead comprises: injecting a ligand into each droplet of the first plurality of droplets; and binding the second affinity reagent to the ligand.

[0214] Embodiment 45. A system comprising: a microfluidic chip, wherein the microfluidic chip comprises: a droplet reservoir configured to contain a first plurality of droplets and a second plurality of droplets, wherein: each droplet of the first plurality of droplets comprises: a respective DNA template, a first primer comprising a moiety configured to react with a hydrogel, a second primer comprising an affinity reagent configured to bond with a target molecule, and a polymerase, and each droplet of the second plurality of droplets does not comprise a DNA template; a crosslinking agent reservoir configured to contain a crosslinking agent; a channel in fluidic communication with the droplet reservoir and the crosslinking agent reservoir; and an electrode configured to apply a force to inject a crosslinking agent from the crosslinking agent reservoir into a droplet in the channel; an incubator configured to demulsify the first plurality of droplets to form a first plurality of beads and to demulsify the second plurality of droplets to form a second plurality of beads; a bonding module configured to bond the first plurality of beads to a plurality of target beads, each target bead coupled to a respective target molecule, wherein bonding comprises bonding the respective affinity reagent to the respective target molecule; and a separation module configured to separate the first plurality of beads from the second plurality of beads using the plurality of target beads.

[0215] Embodiment 46. The system of embodiment 45, wherein: the plurality of target beads comprises magnetic streptavidin beads, and the separation module comprises a magnetic separation system.

[0216] Embodiment 47. The system of embodiment 45, wherein: each target bead of the plurality of target beads is characterized by a threshold diameter, and the separation module comprises a filter to retain particles having diameters greater than or equal to the threshold diameter.

[0217] Embodiment 48. The system of embodiment 45, wherein: the affinity reagent comprises biotin, the target molecule comprises streptavidin, and the bonding module comprises a mixer to mix the first plurality of beads with the plurality of target beads.

[0218] Embodiment 49. The system of embodiment 45, wherein: the microfluidic chip comprises a plurality of electrodes, the plurality of electrodes comprises the electrode, and the plurality of electrodes is configured to apply a plurality of forces to inject the crosslinking agent from the crosslinking agent reservoir into the droplet in the channel.

[0219] Embodiment 50. The system of embodiment 45, further comprising a robotic handling system configured to transfer contents exiting the channel to the incubator.

[0220] Embodiment 51. The system of embodiment 45, further comprising a robotic handling system to transfer contents from the incubator to the bonding module.

[0221] Embodiment 52. The system of embodiment 45, further comprising a robotic handling system to transfer contents from the bonding module to the separation module.

[0222] Embodiment 53. The system of embodiment 45, further comprising: the first plurality of droplets and the second plurality of droplets in the droplet reservoir, and the crosslinking agent in the crosslinking agent reservoir.

[0223] Embodiment 54. The system of embodiment 45, further comprising: the first plurality of beads in the bonding module, and the plurality of target beads in the bonding module. REFERENCES 1. Gross, A.; Schoendube, J.; Zimmermann, S.; Steeb, M.; Zengerle, R.; Koltay, P., Technologies for Single-Cell Isolation. Int J Mol Sci 2015, 16 (8) , 16897-16919. 2. Pensold, D.; Zimmer-Bensch, G., Methods for Single-Cell Isolation and Preparation. Adv Exp Med Biol 2020, 1255, 7-27. 3. Kebschull, J. M.; Zador, A. M., Cellular barcoding: lineage tracing, screening and beyond. Nat Methods 2018, 15 (11) , 871-879. 4. Vallot, C., RNA barcoding: the catalyst for the single-cell revolution. Nat Rev Genet 2023, 24 (8) , 491-491. 5. O'Huallachain, M.; Bava, F.A.; Shen, M.; Dallett, C.; Paladugu, S.; Samusik, N.;Yu, S.; Hussein, R.; Hillman, G.R.; Higgins, S.; Lou, M.; Trejo, A.; Qin, L.; Tai, Y.C.; Kinoshita, S. M.; Jager, A.; Lashkari, D.; Goltsev, Y.; Ozturk, S.; Nolan, G.P., Ultra-high throughput single-cell analysis of proteins and RNAs by split-pool synthesis. Commun Biol 2020, 3 (1) . 6. Metzker, M. L., APPLICATIONS OF NEXT-GENERATION SEQUENCING Sequencing technologies -the next generation. Nat Rev Genet 2010, 11 (1) , 31-46. 7. Hu, T. S.; Chitnis, N.; Monos, D.; Dinh, A., Next-generation sequencing technologies: An overview. Hum Immunol 2021, 82 (11) , 801-811. 8. Bleidorn, C., Third generation sequencing: technology and its potential impact on evolutionary biodiversity research. Syst Biodivers 2016, 14 (1) , 1-8. 9.  D.; Luo, S.J.; Wang, Y.C.; Li, R.; Deng, Q. L.; Faridani, O. R.; Daniels, G. A.; Khrebtukova, I.; Loring, J.F.; Laurent, L.C.; Schroth, G.P.; Sandberg, R., Full-length mRNA-Seq from single-cell levels of RNA and individual circulating tumor cells. Nat Biotechnol 2012, 30 (8) , 777-782. 10. Picelli, S.; Faridani, O. R.;  K.; Winberg, G.; Sagasser, S.; Sandberg, R., Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2. Nat Protoc 2014, 9 (1) , 171-181. 11. Hashimshony, T.; Wagner, F.; Sher, N.; Yanai, I., CEL-Seq: Single-Cell RNA-Seq by Multiplexed Linear Amplification. Cell Rep 2012, 2 (3) , 666-673. 12. Hashimshony, T.; Senderovich, N.; Avital, G.; Klochendler, A.; de Leeuw, Y.; Anavy, L.; Gennert, D.; Li, S. Q.; Livak, K.J.; Rozenblatt-Rosen, O.; Dor, Y.; Regev, A.; Yanai, I., CEL-Seq2: sensitive highly-multiplexed single-cell RNA-Seq. Genome Biol 2016, 17. 13. Jaitin, D. A.; Kenigsberg, E.; Keren-Shaul, H.; Elefant, N.; Paul, F.; Zaretsky, I.; Mildner, A.; Cohen, N.; Jung, S.; Tanay, A.; Amit, I., Massively Parallel Single-Cell RNA-Seq for Marker-Free Decomposition of Tissues into Cell Types. Science 2014, 343 (6172) , 776-779. 14. Keren-Shaul, H.; Kenigsberg, E.; Jaitin, D. A.; David, E.; Paul, F.; Tanay, A.; Amit, I., MARS-seq2.0: an experimental and analytical pipeline for indexed sorting combined with single-cell RNA sequencing. Nat Protoc 2019, 14 (6) , 1841-1862. 15. Lan, F.; Demaree, B.; Ahmed, N.; Abate, A. R., Single-cell genome sequencing at ultra-high-throughput with microfluidic droplet barcoding. Nat Biotechnol 2017, 35 (7) , 640-+. 16. Lan, F.; Haliburton, J. R.; Yuan, A.; Abate, A. R., Droplet barcoding for massively parallel single-molecule deep sequencing. Nat Commun 2016, 7. 17. Macosko, E. Z.; Basu, A.; Satija, R.; Nemesh, J.; Shekhar, K.; Goldman, M.;Tirosh, I.; Bialas, A. R.; Kamitaki, N.; Martersteck, E. M.; Trombetta, J. J.; Weitz, D. A.; Sanes, J. R.; Shalek, A. K.; Regev, A.; McCarroll, S. A., Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets. Cell 2015, 161 (5) , 1202-1214. 18. Gierahn, T. M.; Wadsworth, M. H.; Hughes, T. K.; Bryson, B. D.; Butler, A.;Satija, R.; Fortune, S.; Love, J. C.; Shalek, A. K., Seq-Well: portable, low-cost RNA sequencing of single cells at high throughput. Nat Methods 2017, 14 (4) , 395-+. 19. Datlinger, P.; Rendeiro, A. F.; Schmidl, C.; Krausgruber, T.; Traxler, P.; Klughammer, J.; Schuster, L. C.; Kuchler, A.; Alpar, D.; Bock, C., Pooled CRISPR screening with single-cell transcriptome readout. Nat Methods 2017, 14 (3) , 297-+. 20. Rajbhandari, P.; Arneson, D.; Hart, S. K.; Ahn, I. S.; Diamante, G.; Santos, L. C.; Zaghari, N.; Feng, A. C.; Thomas, B.J.; Vergnes, L.; Lee, S. D.; Rajbhandari, A. K.; Reue, K.; Smale, S. T.; Yang, X.; Tontonoz, P., Single cell analysis reveals immune cell-adipocyte crosstalk regulating the transcription of thermogenic adipocytes. Elife 2019, 8. 21. Han, X. P.; Wang, R. Y.; Zhou, Y.C.; Fei, L.J.; Sun, H. Y.; Lai, S. J.; Saadatpour, A.; Zhou, Z. M.; Chen, H. D.; Ye, F.; Huang, D. S.; Xu, Y.; Huang, W.T.; Jiang, M. M.; Jiang, X. Y.; Mao, J.; Chen, Y.; Lu, C. Y.; Xie, J.; Fang, Q.; Wang, Y. B.; Yue, R.; Li, T. F.; Huang, H.; Orkin, S. H.; Yuan, G. C.; Chen, M.; Guo, G. J., Mapping the Mouse Cell Atlas by Microwell-Seq. Cell 2018, 172 (5) , 1091-+. 22. Klein, A. M.; Mazutis, L.; Akartuna, I.; Tallapragada, N.; Veres, A.; Li, V.;Peshkin, L.; Weitz, D. A.; Kirschner, M. W., Droplet Barcoding for Single-Cell Transcriptomics Applied to Embryonic Stem Cells. Cell 2015, 161 (5) , 1187-1201. 23. Zilionis, R.; Nainys, J.; Veres, A.; Savova, V.; Zemmour, D.; Klein, A. M.; Mazutis, L., Single-cell barcoding and sequencing using droplet microfluidics. Nat Protoc 2017, 12 (1) . 24. Delley, C. L.; Abate, A. R., Modular barcode beads for microfluidic single cell genomics. Sci Rep-Uk 2021, 11 (1) . 25.  E.; Redin, D.; Lundin, S.; Berglund, E.; Andersson, A. F.; Ahmadian, A., Phasing of single DNA molecules by massively parallel barcoding. Nat Commun 2015, 6. 26. Dixit, A.; Pamas, O.; Li, B. Y.; Chen, J.; Fulco, C. P.; Jerby-Amon, L.; Marjanovic, N. D.; Dionne, D.; Burks, T.; Raychowdhury, R.; Adamson, B.;Norman, T. M.; Lander, E. S.; Weissman, J. S.; Friedman, N.; Regev, A., Perturb-Seq: Dissecting Molecular Circuits with Scalable Single-Cell RNA Profiling of Pooled Genetic Screens. Cell 2016, 167 (7) , 1853-+. 27. Jaitin, D. A.; Weiner, A.; Yofe, I.; Lara-Astiaso, D.; Keren-Shaul, H.; David, E.; Salame, T. M.; Tanay, A.; van Oudenaarden, A.; Amit, I., Dissecting Immune Circuits by Linking CRISPR-Pooled Screens with Single-Cell RNA-Seq. Cell 2016, 167 (7), 1883-+. 28. Keppler, A.; Gendreizig, S.; Gronemeyer, T.; Pick, H.; Vogel, H.; Johnsson, K., A general method for the covalent labeling of fusion proteins with small molecules. Nat Biotechnol 2003, 21 (1) , 86-89. 29. Los, G. V.; Encell, L. P.; McDougall, M. G.; Hartzell, D. D.; Karassina, N.; Zimprich, C.; Wood, M. G.; Learish, R.; Ohana, R. F.; Urh, M., HaloTag: a novel protein labeling technology for cell imaging and protein analysis. ACS chemical biology 2008, 3 (6) , 373-382. 30. Komatsu, J.; Cico, A.; Poncin, R.; Le Bohec, M.; Morf, J.; Lipin, S.; Graindorge, A.; Eckert, H.; Saffarian, A.; Cathaly, L.; Guérin, F.; Majello, S.; Ulveling, D.;Vayaboury, A.; Fernandez, N.; Dimitrova, D.; Bussell, X.; Fourne, Y.; Chaumat, P.; André, B.; Baldivia, E.; Godet, U.; Guinin, M.; Moretto, V.; Ismail, J.; Caille, O.;Roblot, N.; Beaupère, C.; Liboz, A.; Guillemain, G.; Blondeau, B.; Walrafen, P.; Edelstein, S., RevGel-seq: instrument-free single-cell RNA sequencing using a reversible hydrogel for cell-specific barcoding. Sci Rep-Uk 2023, 13 (1) . 31. Clark, I. C.; Fontanez, K. M.; Meltzer, R. H.; Xue, Y.; Hayford, C.; May-Zhang, A.; D'A mato, C.; Osman, A.; Zhang, J.Q.; Hettige, P.; Ishibashi, J.S. A.; Delley, C. L.; Weisgerber, D. W.; Replogle, J. M.; Jost, M.; Phong, K.T.; Kennedy, V. E.; Peretz, C. A. C.; Kim, E. A.; Song, S. Y.; Karlon, W.; Weissman, J. S.; Smith, C.C.;Gartner, Z.J.; Abate, A.R., Microfluidics-free single-cell genomics with templated emulsification.Nat Biotechnol 2023, 41 (11), 1557-+.

Claims

1.A method for preparing a plurality of barcoded beads, the method comprising:generating a first plurality of droplets and a second plurality of droplets, wherein:each droplet of the first plurality of droplets comprises:a respective DNA template characterized by a respective sequence,a primer comprising a moiety configured to react with a hydrogel, anda polymerase, andeach droplet of the second plurality of droplets does not comprise any DNA template;in each droplet of the first plurality of droplets, amplifying the respective DNA template using the primer to form a plurality of double-stranded molecules in the droplet, wherein the double-stranded molecule comprises:a respective first strand having the respective DNA template,a respective complementary strand, andthe moiety;separating the second plurality of droplets from the first plurality of droplets;injecting a crosslinking agent into each droplet of the first plurality of droplets;forming the hydrogel using the crosslinking agent; andin each droplet of the first plurality of droplets:bonding the respective moiety of the respective plurality of double-stranded molecules to the hydrogel;removing the respective complementary strand in each double-stranded molecule of the respective plurality of double-stranded molecules; anddemulsifying the first plurality of droplets to form the plurality of barcoded beads, wherein each bead is barcoded with the respective DNA template.2.The method of claim 1, wherein generating the first plurality of droplets and the second plurality of droplets comprises mixing oil with a ddPCR solution.3.The method of claim 1, wherein:the moiety comprises acrydite,the crosslinking agent comprises acrylamide, andthe hydrogel comprises polyacrylamide.4.The method of claim 1, wherein the primer in each droplet is a forward primer, and wherein each droplet of the first plurality of droplets comprises a reverse primer.5.The method of claim 1, wherein each droplet in the first plurality of droplets comprises a single DNA template, and the single DNA template is unique to the droplet.6.The method of claim 1, wherein each droplet of the first plurality of droplets is characterized by a diameter in a range from 40 μm to 50 μm.7.The method of claim 1, wherein amplifying the respective DNA template comprises thermal cycling.8.The method of claim 1, wherein separating the second plurality of droplets comprises fluorescence-activated droplet sorting.9.The method of claim 1, wherein the first plurality of droplets is in a range from 8%to 12%of all droplets on a microfluidic chip.10.The method of claim 1, further comprising labeling a cell or nucleus with a first bead of the plurality of barcoded beads.11.The method of claim 1, further comprising:for each bead of the plurality of beads, functionalizing a surface of the bead with an affinity reagent.12.The method of claim 11, wherein functionalizing the surface of the bead comprises:injecting a ligand into each droplet of the first plurality of droplets; andbinding the affinity reagent to the ligand.13.The method of claim 11, wherein the affinity reagent is a protein.14.The method of claim 11, wherein the affinity reagent comprises a SNAP-tag protein, a Halo-tag protein, a SnpC protein, a SpyC protein, a SnpCatcher protein, a Spytag protein, a SpyCatcher protein, an antibody, an antigen, or a concanavalin A protein.15.The method of claim 1, wherein injecting the crosslinking agent occurs before separating the second plurality of droplets from the first plurality of droplets.16.A system comprising:a first microfluidic chip, wherein the first microfluidic chip comprises:a droplet reservoir configured to contain a first plurality of droplets and a second plurality of droplets, wherein:each droplet of the first plurality of droplets comprises a respective DNA template, andeach droplet of the second plurality of droplets does not comprise a DNA template;a first outlet configured to receive the first plurality of droplets;a second outlet configured to receive the second plurality of droplets;a first channel in fluidic communication with the droplet reservoir, the first outlet, and the second outlet;a first electrode configured to apply a first force into the first channel, wherein the applied first force directs a droplet into the first outlet;an optical emission source configured to illuminate a droplet in the first channel;a detector configured to detect a fluorescence signal from a droplet in the first channel;a control system configured to:trigger the first electrode to apply the first force upon the detector detecting the fluorescence signal; anda second microfluidic chip, wherein the second microfluidic chip comprises:a droplet inlet;a crosslinking agent reservoir configured to contain a crosslinking agent;a third outlet;an injection channel in fluidic communication with the crosslinking agent reservoir;a second channel in fluidic communication with the droplet inlet, the injection channel, and the third outlet; anda second electrode configured to apply a second force to inject the crosslinking agent into a droplet in the second channel.17.The system of claim 16, wherein the first microfluidic chip is the second microfluidic chip.18.The system of claim 17, wherein:the droplet inlet is the droplet reservoir, andthe third outlet is the first channel.19.The system of claim 16, wherein the droplet inlet is the first outlet.20.The system of claim 16, wherein:the first microfluidic chip further comprises an oil reservoir, andthe oil reservoir is in fluidic communication with the first channel.21.The system of claim 16, wherein:the first microfluidic chip comprises a plurality of first electrodes,the plurality of first electrodes comprises the first electrode, andthe control system is configured to trigger the plurality of first electrodes to apply a plurality of first forces upon the detector detecting the fluorescence signal.22.The system of claim 16, wherein the control system is configured to trigger the first electrode after a delay upon detecting the fluorescence signal.23.The system of claim 16, wherein the optical emission source is a laser.24.The system of claim 16, wherein:the second microfluidic chip further comprises an oil reservoir, andthe oil reservoir is in fluidic communication with the second channel.25.The system of claim 16, wherein:the second microfluidic chip comprises a plurality of second electrodes,the plurality of second electrodes comprises the second electrode, andthe plurality of second electrodes is configured to apply a plurality of second forces to inject the crosslinking agent into the droplet in the second channel.26.The system of claim 16, wherein:the second channel comprises a first portion between the injection channel and the third outlet, andthe first portion of the second channel comprises a plurality of turns.27.The system of claim 16, further comprising a robotic handling system to transfer contents of the first outlet to the droplet inlet.28.The system of claim 16, further comprising a third microfluidic chip comprising:an oil reservoir;a buffer reservoir;a mixing zone in fluidic communication with the oil reservoir and the buffer reservoir, wherein the mixing zone is configured to mix an oil output of the oil reservoir and a buffer output of the buffer reservoir; anda fourth outlet in fluidic communication with the mixing zone, wherein the fourth outlet is configured to receive a mixture of the oil output and the buffer output.29.The system of claim 28, further comprising a ddPCR system.30.The system of claim 29, further comprising:a robotic handling system configured to transfer contents from the fourth outlet to the ddPCR system and to transfer contents from the ddPCR system to the droplet reservoir.31.The system of claim 16, further comprising:the first plurality of droplets and the second plurality of droplets disposed in the droplet reservoir; andthe crosslinking agent disposed in the crosslinking agent reservoir.32.A method for preparing a plurality of barcoded beads, the method comprising:generating a first plurality of droplets and a second plurality of droplets, wherein:each droplet of the first plurality of droplets comprises:a respective DNA template characterized by a respective sequence,a first primer comprising a moiety configured to react with a hydrogel, wherein the first primer is a forward primer,a second primer comprising an affinity reagent configured to bond with a target molecule, wherein the second primer is a reverse primer, anda polymerase;each droplet of the second plurality of droplets does not comprise a DNA template;in each droplet of the first plurality of droplets, amplifying the respective DNA template using the first primer and the second primer to form a plurality of double-stranded molecules in the droplet, wherein the double-stranded molecule comprises:a first strand having the respective DNA template,a respective complementary strand,the moiety at a first end of the double-stranded molecule, andthe affinity reagent at a second end of the double-stranded molecule;injecting a crosslinking agent into each droplet of the first plurality of droplets and each droplet of the second plurality of droplets;forming the hydrogel using the crosslinking agent;demulsifying the first plurality of droplets to form a first plurality of beads;demulsifying the second plurality of droplets to form a second plurality of beads;bonding the first plurality of beads to a plurality of target beads, each target bead coupled to a respective target molecule, wherein bonding comprises bonding the respective affinity reagent to the respective target molecule;separating the first plurality of beads from the second plurality of beads using the plurality of target beads; andremoving the respective complementary strand from a respective plurality of double-stranded molecules in each bead of the first plurality of beads.33.The method of claim 32, wherein the affinity reagent comprises biotin, and the target molecule comprises streptavidin.34.The method of claim 32, wherein:the plurality of target beads is magnetic, andseparating the first plurality of beads from the second plurality of beads comprises using a magnet to attract the first plurality of beads.35.The method of claim 32, wherein:the plurality of target beads comprises target beads having a threshold diameter, andseparating the first plurality of beads from the second plurality of beads comprises filtering to retain the first plurality of beads.36.The method of claim 32, wherein:the moiety comprises acrydite,the crosslinking agent comprises acrylamide, andthe hydrogel comprises polyacrylamide.37.The method of claim 32, wherein generating the first plurality of droplets and the second plurality of droplets comprises mixing oil with a ddPCR solution.38.The method of claim 32, wherein each droplet of the first plurality of droplets comprises a single DNA template, and the single DNA template is unique to the droplet.39.The method of claim 32, wherein each droplet of the first plurality of droplets is characterized by a diameter in a range from 40 μm to 50 μm.40.The method of claim 32, wherein amplifying the respective DNA template comprises thermal cycling.41.The method of claim 32, wherein the first plurality of droplets is in a range from 8%to 12%of all droplets on a microfluidic chip.42.The method of claim 32, further comprising labeling a cell or nucleus with a first bead of the plurality of barcoded beads.43.The method of claim 32, wherein:the affinity reagent is a first affinity reagent; andfor each bead of the first plurality of beads, the method further comprises functionalizing a surface of the bead with a second affinity reagent.44.The method of claim 43, wherein functionalizing the surface of the bead comprises:injecting a ligand into each droplet of the first plurality of droplets; andbinding the second affinity reagent to the ligand.45.A system comprising:a microfluidic chip, wherein the microfluidic chip comprises:a droplet reservoir configured to contain a first plurality of droplets and a second plurality of droplets, wherein:each droplet of the first plurality of droplets comprises:a respective DNA template,a first primer comprising a moiety configured to react with a hydrogel,a second primer comprising an affinity reagent configured to bond with a target molecule, anda polymerase, andeach droplet of the second plurality of droplets does not comprise a DNA template;a crosslinking agent reservoir configured to contain a crosslinking agent;a channel in fluidic communication with the droplet reservoir and the crosslinking agent reservoir; andan electrode configured to apply a force to inject a crosslinking agent from the crosslinking agent reservoir into a droplet in the channel;an incubator configured to demulsify the first plurality of droplets to form a first plurality of beads and to demulsify the second plurality of droplets to form a second plurality of beads;a bonding module configured to bond the first plurality of beads to a plurality of target beads, each target bead coupled to a respective target molecule, wherein bonding comprises bonding the respective affinity reagent to the respective target molecule; anda separation module configured to separate the first plurality of beads from the second plurality of beads using the plurality of target beads.46.The system of claim 45, wherein:the plurality of target beads comprises magnetic streptavidin beads, andthe separation module comprises a magnetic separation system.47.The system of claim 45, wherein:each target bead of the plurality of target beads is characterized by a threshold diameter, andthe separation module comprises a filter to retain particles having diameters greater than or equal to the threshold diameter.48.The system of claim 45, wherein:the affinity reagent comprises biotin,the target molecule comprises streptavidin, andthe bonding module comprises a mixer to mix the first plurality of beads with the plurality of target beads.49.The system of claim 45, wherein:the microfluidic chip comprises a plurality of electrodes,the plurality of electrodes comprises the electrode, andthe plurality of electrodes is configured to apply a plurality of forces to inject the crosslinking agent from the crosslinking agent reservoir into the droplet in the channel.50.The system of claim 45, further comprising a robotic handling system configured to transfer contents exiting the channel to the incubator.51.The system of claim 45, further comprising a robotic handling system to transfer contents from the incubator to the bonding module.52.The system of claim 45, further comprising a robotic handling system to transfer contents from the bonding module to the separation module.53.The system of claim 45, further comprising:the first plurality of droplets and the second plurality of droplets in the droplet reservoir, andthe crosslinking agent in the crosslinking agent reservoir.54.The system of claim 45, further comprising:the first plurality of beads in the bonding module, andthe plurality of target beads in the bonding module.

Images