Lipid nanoparticle compositions and processes of preparing the same

Abstract

Provided are compositions comprising empty LNPs and nucleic acids and processes for preparing the same. Further provided are processes for preparing LNP formulations from the compositions as well as the LNP formulations prepared thereof and uses of the LNP formulations.

Description

Lipid Nanoparticle Compositions and Processes of Preparing the sameFIELD

[0001] The present disclosure relates to the field of biopharmaceutical. In particular, provided are compositions comprising empty LNPs and nucleic acids and processes for preparing the same. Further provided are processes for preparing LNP formulations from the compositions as well as the LNP formulations prepared thereof and uses of the LNP formulations.BACKGROUND

[0002] Nucleic acids, in particular RNAs, have recently attracted much attention as novel agents with great therapeutic potential. However, the therapeutic applications of nucleic acids remain challenged due to their instability and low cell permeability.

[0003] Lipid nanoparticles (LNPs) are promising carriers for nucleic acid delivery, with several therapeutic RNA-loaded LNP (RNA-LNP) formulations on market and many in clinical trials. Although LNPs protect mRNA against enzymatic degradation and facilitate delivery of mRNA into cells, it is reported that interactions with and between LNP excipients introduce additional risks for mRNA degradation. On the other hand, a conventional process for RNA-LNP formulation preparation generally involves rapid combination of an aqueous phase containing RNA and an organic phase containing lipid mixture. A mixing apparatus is indispensable to achieve desirable particle physical properties and additional steps to remove the organic solvent are required for stability. Such requirements lead to high cost of pipeline maintenance to avoid cross-contamination among LNP formulations containing different payloads.

[0004] Recently, a “pre-formulation and post-encapsulation” or “Post-Hoc loading” (PHL) technique of preparing mRNA-LNP compositions has been developed (see for example, WO2021060440A1, WO2018089801A1 and WO2020160397A1) . This is achieved by preparing an empty LNP composition and mixing mRNA with the pre-formulation to form a “post-encapsulation” product. This technique is also compatible with “bedside” or “field-mix” application, where empty LNPs are processed in the absence of mRNA, stored, and mixed with mRNA cargo prior to use (see for example, WO2020160397A1) . However, there still exists a need to develop methods and compositions to facilitate cost-effective preparation and delivery, and long-term storage of LNP compositions, especially RNA-LNP compositions.BRIEF SUMMARY

[0005] It is generally believed in the art that an acidic pH is required for the system in order to encapsulating RNAs into LNPs, while a neutral pH would result in failure in encapsulation. For example, it is described in WO2021060440A1 and WO2023009421A1 that the pH of the system needs to be adjusted to be acidic for successful encapsulation. Thus, mixing an empty LNP composition having an acidic pH and an mRNA solution having an acidic pH to obtain an acidic system desirable for mRNA encapsulation is generally adopted in the art.

[0006] In general, the present disclosure provides LNP compositions (also referred to as “pre-encapsulation formulations” herein) comprising empty LNPs and nucleic acids and having a neutral pH (e.g., a pH of about 6.5 to about 8.6) which is unfavorable for encapsulation of the nucleic acids by the LNPs. For long-term storage, the pre-encapsulation formulations may be lyophilized in the presence of cryoprotectants. The present inventors unexpectedly find that by physically combining the empty LNPs and the nucleic acids, the pre-encapsulation formulations of the present disclosure exhibit superior thermostabilities for both the LNPs and the nucleic acids.

[0007] The present disclosure also provides a post-encapsulation process of preparing LNP formulations (also referred to as “post-encapsulation formulations” herein) from the pre-encapsulation formulations of the present disclosure. According to some embodiments, the post-encapsulation formulations may be obtained with a high encapsulation efficiency by simply adjusting the pH of the pre-encapsulation formulations to or reconstituting the lyophilized pre-encapsulation formulations at a pH suitable for encapsulation of the nucleic acids by the LNPs and incubating the mixture for about 10 minutes at room tempature (see FIG. 1) . Such pre-encapsulation formulations are suitable for the “bedside” preparation of mRNA-LNP compositions according to some preferable embodiments of the present disclosure, where lyophilized pre-encapsulation formulations are reconstituted with an acidic buffer to allow the encapsulation of the mRNAs by the LNPs to generate mRNA-LNP compositions ready for administration. This pre-formulation and post-encapsulation technique improves product stability and leads to better clinical flexibility.

[0008] In one aspect, provided is a liquid composition or a lyophilized composition thereof, wherein the liquid composition comprises an empty lipid nanoparticle (LNP) and a nucleic acid and has a pH of about 6.5 to about 8.6, wherein the empty LNP comprises a cationic lipid.

[0009] In some embodiments, the lipid composition has an encapsulation efficiency of the nucleic acid of less than 20%.

[0010] In some embodiments, the liquid composition has a pH of about 6.5 to about 8.5. In some embodiments, the liquid composition comprises a first buffer capable of maintaining a pH of about 6.5 to about 8.6. In some embodiments, the liquid composition comprises a first buffer capable of maintaining a pH of about 6.5 to about 8.5. In some preferable embodiments, the first buffer is selected from a Tris buffer, a phosphate buffer, a PIPES buffer, an ADA buffer, an ACES buffer, an acetate buffer, a citrate buffer, a DIPSO buffer, a BES buffer, an MOPSO buffer, an MOPS buffer, a HEPBS buffer, a HEPPSO buffer, a HEPES buffer, a TAPSO buffer, a TEA buffer, a TES buffer, a Tricine buffer and a combination thereof. In some embodiments, the first buffer has a buffer concentration of about 1 mM to about 100 mM.

[0011] In some embodiments, the liquid composition further comprises a cryoprotectant. In some preferable embodiments, the cryoprotectant comprises sucrose.

[0012] In some embodiments, the liquid composition or lyophilized composition of the present disclosure has a nitrogen to phosphate (N / P) ratio of about 1.1: 1 to about 30: 1.

[0013] In some embodiments, the cationic lipid comprises or is a compound according to Formula (01-I) , Formula (01-I-B) , Formula (01-I-B’) , Formula (01-I-B”) , Formula (01-I-C) , Formula (01-I-D) or Formula (01-I-E) , or a compound listed in Table 01; or a compound according to Formula (02-I) or Formula (02-II) , or a compound listed in Table 02; or a compound according to Formula (03-I) , or a compound listed in Table 03; or a compound according to Formula (04-I) or Formula (04-III) , or a compound listed in Table 04; or a compound according to Formula (05-I) .

[0014] In some embodiments, the empty LNP comprises: (i) the cationic lipid, (ii) a phospholipid, (iii) a steroid, and (iv) a polymer conjugated lipid. In some embodiments, the empty LNP comprises: i) between about 30 molar percent to about 55 molar percent of the cationic lipid; ii) between about 5 molar percent to about 40 molar percent of the phospholipid; iii) between about 20 molar percent to about 50 molar percent of the steroid; and iv) between about 1.0 molar percent to about 2.5 molar percent of the polymer conjugated lipid. In some embodiments, the empty LNP comprises: (i) Compound C1, Compound 03-15, Compound 04-92, Compound 04-86 or SM-102, (ii) 1, 2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC) , (iii) cholesterol, and (iv) DMG-PEG2000.

[0015] In some embodiments, the nucleic acid is an RNA; preferably, the RNA is selected from an mRNA (for example, a personalized mRNA cancer vaccine) , an sa RNA, an siRNA, an miRNA, a cirRNA, an shRNA and a lncRNA. In some preferable embodiments, the nucleic acid is an mRNA.

[0016] In another aspect, provided is a process of preparing the liquid composition of the present disclosure, the process comprising: (a) providing an LNP composition comprising the empty LNP; and (b) combining the LNP composition with the nucleic acid at a pH of about 6.5 to about 8.6, thereby forming the liquid composition.

[0017] In some embodiments, step (a) comprises: mixing (i) a lipid solution comprising the cationic lipid and optionally an organic solvent with (ii) an aqueous solution, thereby forming the LNP composition. In some embodiments, the LNP composition has a pH of about 6.5 to about 8.6. In some preferable embodiments, the LNP composition comprises a second buffer capable of maintaining a pH of about 6.5 to about 8.6. In some preferable embodiments, the second buffer is selected from a Tris buffer, a phosphate buffer, a PIPES buffer, an ADA buffer, an ACES buffer, an acetate buffer, a citrate buffer, a DIPSO buffer, a BES buffer, an MOPSO buffer, an MOPS buffer, a HEPBS buffer, a HEPPSO buffer, a HEPES buffer, a TAPSO buffer, a TEA buffer, a TES buffer, a Tricine buffer and a combination thereof.

[0018] In some embodiments, the process of preparing the liquid composition of the present disclosure does not comprise a step of pH adjusting.

[0019] In some embodiments, step (a) comprises: mixing (i) a lipid solution comprising the cationic lipid and optionally an organic solvent with (ii) an aqueous solution, thereby forming an LNP solution comprising the empty LNP; and adjusting the pH of the LNP solution to about 6.5 to about 8.6, thereby forming the the LNP composition. In some embodiments, the adjusting the pH of the LNP solution is performed by buffer exchanging. In some preferable embodiments, the buffer exchanging is performed by using a third buffer capable of maintaining a pH of about 6.5 to about 8.6. In some preferable embodiments, the third buffer is selected from a Tris buffer, a phosphate buffer, a PIPES buffer, an ADA buffer, an ACES buffer, an acetate buffer, a citrate buffer, a DIPSO buffer, a BES buffer, an MOPSO buffer, an MOPS buffer, a HEPBS buffer, a HEPPSO buffer, a HEPES buffer, a TAPSO buffer, a TEA buffer, a TES buffer, a Tricine buffer and a combination thereof.

[0020] In some embodiments, step (a) further comprises processing the LNP composition. In some preferable embodiments, the processing comprises at least one step selected from removing the organic solvent, filtering, buffer exchanging, diluting, dialyzing, concentrating, adding a cryoprotectant, and packing. In some preferable embodiments, the processing removes the organic solvent.

[0021] In some embodiments, the organic solvent is an alcohol. In some embodiments, the organic solvent is ethanol.

[0022] In a particular aspect, provided is a process of preparing a liquid composition comprising an empty lipid nanoparticle (LNP) and an mRNA ( “mRNA-eLNP composition” ) , wherein the empty LNP comprises a cationic lipid, the process comprising: in vitro transcribing a DNA template to produce the mRNA, digesting the DNA template to obtain a crude mRNA mixture, subjecting the crude mRNA mixture to chromatographic purification, subjecting the purified mRNA to filtration sterilization, thereby obtaining an mRNA solution comprising the mRNA, and combining the mRNA solution with an LNP solution comprising the empty LNP at a pH of about 6.5 to about 8.6, thereby forming the liquid composition.

[0023] In yet another aspect, provided is a process of preparing a lyophilized composition, comprising lyophilizing the liquid composition of the present disclosure in the presence of a cryoprotectant. In some embodiments, the cryoprotectant comprises or is sucrose.

[0024] In yet another aspect, provided is an apparatus for preparing a iquid composition comprising an empty lipid nanoparticle (LNP) and a nucleic acid, the apparatus comprising a formulation module 1 configured to combine a nucleic acid solution comprising the nucleic acid with an LNP solution comprising the empty LNP and optionally a cryoprotectant, at a pH of about 6.5 to about 8.6, thereby forming the liquid composition.

[0025] In some embodiments, the formulation module 1 comprises a first feeding unit 2 for providing the nucleic acid solution, a second feeding unit 3 for providing the LNP solution, and a first mixing channel 4 in fluid communication with the first feeding unit 2 and the second feeding unit 3, wherein the first feeding unit 2 and the second feeding unit 3 are configured to mix the nucleic acid solution and the LNP solution in the first mixing channel 4, thereby forming the liquid composition. In some embodiments, the first feeding unit 2 comprises a first reservoir 5 connected to a first feeding channel 6 via a first pumping device 15, the second feeding unit 3 comprises a second reservoir 7 connected to a second feeding channel 8 via a second pumping device 16, wherein the first feeding channel 6 and the second feeding channel 8 are in fluid communication with the first mixing channel 4.

[0026] In some embodiments, the formulation module 1 further comprises a third feeding unit 9, and a second mixing channel 10 in fluid communication with the third feeding unit 9 and the first mixing channel 4, wherein the third feeding unit 9 is configured to provide a storage buffer for the lipid composition. In some embodiments, the third feeding unit 9 comprises a third reservoir 11 connected to a third feeding channel 12 via a third pumping device 17, and the third feeding channel 12 is in fluid communication with the first mixing channel 4 and the second mixing channel 10.

[0027] In some embodiments, the apparatus further comprises a storage unit 13 for storing the liquid composition and a waste collection unit 14, wherein the storage unit 13 and the waste collection unit 14 are in fluid communication with the formulation module 1.

[0028] In another aspect, provided is a process of preparing a lipid nanoparticle (LNP) formulation comprising an LNP associated with a nucleic acid, the process comprising: adjusting the pH of the liquid composition of the present disclosure to a pH suitable for encapsulation of the nucleic acid by the LNP, thereby forming the LNP formulation; or reconstituting the lyophilized composition of the present disclosure at a pH suitable for encapsulation of the nucleic acid by the LNP, thereby forming the LNP formulation.

[0029] In some embodiments, the pH suitable for encapsulation of the nucleic acid by the LNP is about 4.25 to about 6.5, about 4.5 to about 6.0, about 4.8 to about 6.0, about 5.0 to about 6.0, or about 5.1 to about 5.9.

[0030] In some embodiments, the adjusting the pH of the liquid composition or the reconstituting the lyophilized composition is performed by using an acidic buffer. In some preferable embodiments, the acidic buffer is capable of maintaining a pH of about 2.0 to about 5.5. In some embodiments, the acidic buffer is selected from a citrate buffer, a maleic acid buffer, an acetate buffer, an MES (2-Morpholinoethanesulphonic acid) buffer, a phosphate buffer, a malic acid buffer, a tartaric acid buffer, a succinic acid buffer, and a combination thereof. In some embodiments, the acidic buffer has a buffer concentration of about 1 mM to about 20 mM.

[0031] In some embodiments, the encapsulation is carried out for a period of about 10 seconds to about 24 hours, preferably for a period of about 1 hour or less, about 50 minutes or less, about 40 minutes or less, about 30 minutes or less, about 20 minutes or less, or about 10 minutes or less.

[0032] In some embodiments, the process of preparing a lyophilized composition further comprises processing the LNP formulation. In some preferable embodiments, the processing comprises at least one step selected from filtering, buffer exchanging, diluting, dialyzing, concentrating, pH adjusting, adding a cryoprotectant, lyophilizing and packing.

[0033] In some embodiments of the process of preparing a lyophilized composition, the encapsulation efficiency of the nucleic acid is at least 80%.

[0034] Further provided is a lipid nanoparticle (LNP) formulation prepared by the process of preparing a lyophilized composition of the present disclosure.

[0035] In a particular aspect, provided is a process of preparing a lipid nanoparticle (LNP) formulation comprising an LNP associated with an mRNA ( “mRNA-LNP formulation” ) , the process comprising: in vitro transcribing a DNA template to produce the mRNA, digesting the DNA template to obtain a crude mRNA mixture, subjecting the crude mRNA mixture to chromatographic purification, subjecting the purified mRNA to filtration sterilization, thereby obtaining an mRNA solution comprising the mRNA, combining the mRNA solution with an LNP solution comprising an empty LNP at a pH of about 6.5 to about 8.6 to obtain a liquid composition comprising the empty LNP and the mRNA and having a pH of about 6.5 to about 8.6, and adjusting the pH of the liquid composition to a pH suitable for encapsulation of the mRNA by the LNP, thereby forming the LNP formulation.

[0036] In a further aspect, provided is an apparatus for preparing a lipid nanoparticle (LNP) formulation comprising an LNP associated with a nucleic acid, the apparatus comprising a formulation module 1 configured to provide a liquid composition comprising an empty LNP and a nucleic acid and adjust the pH of the liquid composition to a pH suitable for encapsulation of the nucleic acid by the LNP, thereby forming the LNP formulation, wherein the liquid composition has a pH of about 6.5 to about 8.6, and the empty LNP comprises a cationic lipid.

[0037] In some embodiments, the formulation module 1 comprises a first feeding unit 2 for providing a nucleic acid solution comprising the nucleic acid, a second feeding unit 3 for providing an LNP solution comprising the empty LNP, and a first mixing channel 4 in fluid communication with the first feeding unit 2 and the second feeding unit 3, wherein the first feeding unit 2 and the second feeding unit 3 are configured to mix the nucleic acid solution and the LNP solution in the first mixing channel 4, thereby forming the liquid composition.

[0038] In some embodiments, the first feeding unit 2 comprises a first reservoir 5 connected to a first feeding channel 6 via a first pumping device 15, the second feeding unit 3 comprises a second reservoir 7 connected to a second feeding channel 8 via a second pumping device 16, wherein the first feeding channel 6 and the second feeding channel 8 are in fluid communication with the first mixing channel 4.

[0039] In some embodiments, the formulation module 1 further comprises a third feeding unit 9, and a second mixing channel 10 in fluid communication with the third feeding unit 9 and the first mixing channel 4, wherein the third feeding unit 9 is configured to provide an acidic buffer to adjust the pH of the liquid composition to a pH suitable for encapsulation of the nucleic acid by the LNP in the second mixing channel 10, thereby forming the LNP formulation.

[0040] In some embodiments, the third feeding unit 9 comprises a third reservoir 11 connected to a third feeding channel 12 via a third pumping device 17, and the third feeding channel 12 is in fluid communication with the first mixing channel 4 and the second mixing channel 10.

[0041] In some embodiments, the apparatus further comprises a storage unit 13 for storing the LNP formulation and a waste collection unit 14, wherein the storage unit 13 and the waste collection unit 14 are in fluid communication with the formulation module 1.

[0042] In yet another aspect, provided is a kit comprising a first container comprising the liquid composition or lyophilized composition of the present disclosure, and optionally a second container comprising an acidic buffer.

[0043] In some embodiments, the acidic buffer is capable of maintaining a pH of about 2.0 to about 5.0. In some preferable embodiments, the acidic buffer is selected from a citrate buffer, a maleic acid buffer, an acetate buffer, an MES (2-Morpholinoethanesulphonic acid) buffer, a phosphate buffer, a malic acid buffer, a tartaric acid buffer, a succinic acid buffer, and a combination thereof. In some embodiments, the acidic buffer has a buffer concentration of about 1 mM to about 20 mM.

[0044] In some embodiments, the kit of the present disclosure further comprises instructions for combining the contents of the first container with the contents of the second container.

[0045] Further provided is a method of treating or preventing a disease in a subject in need thereof, the method comprising administering to the subject a therapeutically effective amount of the LNP formulation of the present disclosure, wherein the expression of the nucleic acid in the subject treats or prevents the disease.

[0046] In some embodiments, the nucleic acid encodes a polypeptide of interest, wherein the expression of the polypeptide of interest in the subject treats or prevents the disease.

[0047] Also provided is a method of introducing a nucleic acid to a cell or a subject in need thereof, comprising: (Ⅰa) adjusting the pH of the liquid composition of the present disclosure to a pH suitable for encapsulation of the nucleic acid by the LNP, thereby forming an LNP formulation comprising the LNP associated with the nucleic acid; or (Ⅰb) reconstituting the lyophilized composition of the present disclosure at a pH suitable for encapsulation of the nucleic acid by the LNP, thereby forming an LNP formulation comprising the LNP associated with the nucleic acid; and (Ⅱ) administering the LNP formulation to the cell or the subject.

[0048] In some embodiments, the pH suitable for encapsulation of the nucleic acid by the LNP is about 4.25 to about 6.5, about 4.5 to about 6.0, about 4.8 to about 6.0, or about 5.0 to about 6.0, or about 5.1 to about 5.9.

[0049] In some embodiments, the adjusting the pH of the liquid composition or the reconstituting the lyophilized composition is performed by using an acidic buffer. In some preferable embodiments, the acidic buffer is capable of maintaing a pH of about 2.0 to about 5.5. In some embodiments, the acidic buffer is selected from a citrate buffer, a maleic acid buffer, an acetate buffer, an MES (2-Morpholinoethanesulphonic acid) buffer, a phosphate buffer, a malic acid buffer, a tartaric acid buffer, a succinic acid buffer, and a combination thereof. In some embodiments, the acidic buffer has a buffer concentration of about 1 mM to about 20 mM.

[0050] In some embodiments, the encapsulation is carried out for a period of about 1 hour or less, about 50 minutes or less, about 40 minutes or less, about 30 minutes or less, about 20 minutes or less, or about 10 minutes or less.

[0051] In some embodiments, the method of the present disclosure does not comprise processing the LNP formulation prior to the administering.

[0052] In some embodiments, the nucleic acid encodes a polypeptide of interest.

[0053] Further areas of applicability of the present disclosure will become apparent from the detailed description provided hereinafter. It should be understood that the detailed description and specific examples, while indicating the preferred embodiment of the disclosure, are intended for purposes of illustration only and are not intended to limit the scope of the disclosure.BRIEF DESCRIPTION OF DRAWINGS

[0054] FIG. 1 shows a schematic diagram of the post-encapsulation process according to some embodiments.

[0055] FIG. 2 shows particle sizes (average diameter) and PDI measured for post-encapsulation formualtions preprared from reconstituting pre-encapsulation formulations lyophilized in Tris-HCl buffer.

[0056] FIG. 3 shows encapsulation efficiencies (EE%) measured for post-encapsulation formulations preprared from reconstituting pre-encapsulation formulations lyophilized in Tris-HCl buffer.

[0057] FIG. 4 shows particle sizes (average diameter) and PDI measured for post-encapsulation formulations preprared from reconstituting pre-encapsulation formulations lyophilized in phosphate buffer.

[0058] FIG. 5 shows encapsulation efficiencies (EE%) measured for post-encapsulation formulations preprared from reconstituting pre-encapsulation formulations lyophilized in phosphate buffer.

[0059] FIG. 6 shows RNA intergrities measured for a post-encapsulation formulation and a conventional LNP formulation prepared from reconstituting a lyophilized pre-encapsulation formulation and a conventional lyophilized LNP formulation, respectively, at days 0, 7, 14, 21 and 28 days of the stability challenge at 37℃.

[0060] FIG. 7 shows encapsulation efficiencies (EE%) and particle sizes (average diameter) measured for a post-encapsulation formulation at days 0, 7, 14, 21 and 28 days of the stability challenge at 37℃.

[0061] FIG. 8 shows human IL-12 p70 expressions from a conventional LNP formulation (F25) and a post-encapsulation formulation (F26) measured in HepG2 cells. F25 Pre lyo, the pre-lyophilization formulation of F25; F26 Pre lyo, the pre-lyophilization formulation of F26; F25 Post lyo, the reconstituted formualtion of F25; F26 Post lyo, the post-encapsulation of F26.

[0062] FIG. 9 shows luciferase expressions in mice injected with a conventional LNP formulation (F27) and a post-encapsulation formulation (F28) detected by using the IVIS in vivo imaging system.

[0063] FIG. 10 shows luciferase expressions (total flux) in mice injected with a conventional LNP formulation (F27) and a post-encapsulation formulation (F28) detected by using the IVIS in vivo imaging system.

[0064] FIG. 11 shows particle sizes (average diameter) measured for post-encapsulation formulations with varied N / P ratios.

[0065] FIG. 12 shows encapsulation efficiencies (EE%) measured for post-encapsulation formulations with varied N / P ratios.

[0066] FIG. 13 shows EPO expressions in mice injected with post-encapsulation formulations with varied N / P ratios.

[0067] FIG. 14 shows particle sizes (average diameter) measured for a post-encapsulation formulation and a reconstituted pre-formulation at day 0 and months 1 and 3 of the stability challenge at 37℃.

[0068] FIG. 15 shows encapsulation efficiencies (EE%) measured for a post-encapsulation formulation and a “bedside” formulation at day 0 and months 1 and 3 of the stability challenge at 25℃.

[0069] FIG. 16 shows encapsulation efficiency (EE%) and particle size (average diameter) measured for post-encapsulation formulations prepared from lyophilized pre-formations (Lyo eLNP) prepared at pH 7.5 and pH 5.3.

[0070] FIG. 17 shows particle counts measured for post-encapsulation formulations prepared from lyophilized pre-formations (Lyo eLNP) prepared at pH 7.5 and pH 5.3.

[0071] FIG. 18 shows protein expressions (RLU) of post-encapsulation formulations prepared from lyophilized pre-formations (Lyo eLNP) prepared at pH 7.5 and pH 5.3 measured in DC2.4 cells.

[0072] FIG. 19 shows a schematic diagram of an exemplary apparatus of the present disclosure according to some embodiments.DETAILED DESCRIPTIONDefinitions

[0073] Unless indicated otherwise, the scientific and technological terminologies used herein refer to meanings commonly understood by a person skilled in the art. Also, the terminologies and experimental procedures used herein relating to protein and nucleotide chemistry, molecular biology, cell and tissue cultivation, microbiology, immunology, all belong to terminologies and conventional methods generally used in the art. For example, the standard DNA recombination and molecular cloning technology used herein are well known to a person skilled in the art, and are described in details in the following references: Sambrook, J., Fritsch, Efland Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, 1989. In the meantime, in order to better understand the present invention, definitions and explanations for the relevant terminologies are provided below.

[0074] Unless otherwise indicated, the term “at least” preceding a series of elements is to be understood to refer to every element in the series. Those skilled in the art will recognize or be able to ascertain using no more than routine experimentation, many equivalents to the specific embodiments of the present application. Such equivalents are intended to be encompassed by the present application.

[0075] As used herein, the expressions “comprising” , “including” , “containing” and “having” are open-ended, and do not exclude additional unrecited elements, steps, or ingredients. The expression “consisting of” excludes any element, step, or ingredient not designated. The expression “consisting essentially of” means that the scope is limited to the designated elements, steps or ingredients, plus elements, steps or ingredients that are optionally present that do not substantially affect the essential and novel characteristics of the claimed subject matter. It should be understood that the expression “comprising” encompasses the expressions “consisting essentially of” and “consisting of” .

[0076] It must be noted that as used herein and in the appended claims, the singular forms “a” , “an” and “the” include plural reference unless the context clearly dictates otherwise.

[0077] Unless otherwise stated, any numerical values, such as a concentration or a concentration range described herein, are to be understood as being modified in all instances by the term “about” . Thus, a numerical value without the preceding term “about” typically includes ± 10%of the recited value. For example, a concentration of 1 mg / mL includes 0.9 mg / mL to 1.1 mg / mL. Likewise, a concentration range of 1%to 10% (w / v) includes 0.9% (w / v) to 11% (w / v) . As used herein, the use of a numerical range expressly includes all possible subranges, all individual numerical values within that range, including integers within such ranges and fractions of the values unless the context clearly indicates otherwise.

[0078] As used herein, the term “about” means within an acceptable error range for the particular value as determined by a person of ordinary skill in the art, which will depend in part on how the value is measured or determined, i.e., the limitations of the measurement system. For example, “about” can mean within 1 or more than 1 standard deviation, per the practice in the art. Alternatively, “about” can mean a range of up to 0-20%, 0 to 10%, 0 to 5%, or up to 1%of a given value. When used with reference to a pH value, the term “about” typically refers to a tolerance of ± 0.2 pH units of the cited pH value. For example, the expression “a pH of about 6.5” includes a range of pH 6.3 to pH 6.7.

[0079] As used herein, the term "and / or" encompasses all combinations of items connected by the term, and each combination should be regarded as individually listed herein. For example, "A and / or B" covers "A" , "A and B" , and "B" . For example, "A, B, and / or C" covers "A" , "B" , "C" , "A and B" , "A and C" , "B and C" , and "A and B and C" .

[0080] The terms "polynucleotide" and "nucleic acid" are used interchangeably to refer to a polymer of RNA or DNA that is single-or double-stranded, optionally containing synthetic, non-natural or modified nucleotides. The nucleotides can be deoxyribonucleotides, ribonucleotides, modified nucleotides or bases, and / or their analogs, or any substrate that can be incorporated into a polymer by DNA or RNA polymerase or by a synthetic reaction. A polynucleotide may comprise modified nucleotides, such as methylated nucleotides and their analogs. As used herein and unless otherwise specified, “nucleic acid” also includes nucleic acid mimics such as locked nucleic acids (LNAs) , peptide nucleic acids (PNAs) , and morpholinos. “Oligonucleotide, ” as used herein, refers to short synthetic polynucleotides that are generally, but not necessarily, fewer than about 200 nucleotides in length. The terms “oligonucleotide” and “polynucleotide” are not mutually exclusive. The description above for polynucleotides is equally and fully applicable to oligonucleotides. Unless specified otherwise, the left-hand end of any single-stranded polynucleotide sequence disclosed herein is the 5’ end; the left-hand direction of double-stranded polynucleotide sequences is referred to as the 5’ direction.

[0081] As used herein, a nucleotide in a nucleotide sequence is referred to by the single letter designation of its nucleobase as follows: "A (a) " for adenine or deoxyadenine (for RNA or DNA, respectively) , "C (c) " for cytosine or deoxycytosine, "G (g) " for guanine or deoxyguanine, "U (u) " for uracil, "T (t) " for deoxythymine, "R" for purines (A or G) , "Y" for pyrimidines (C or T) , "I" for hypoxanthine, and "N" or "n" for any nucleotide. Although a nucleotide sequence may be represented as a DNA sequence (comprising T (s) ) , when referring to RNA, one skilled in the art can readily determine the corresponding RNA sequence (i.e., replacing T with U) , and vice versa.

[0082] The terms “polypeptide” and “protein” are used interchangeably herein to refer to a polymer of amino acid residues linked by covalent peptide bonds. That is, a description directed to a polypeptide applies equally to a description of a protein, and vice versa. The terms apply to naturally occurring amino acid polymers as well as amino acid polymers in which one or more amino acid residues is a non-naturally occurring amino acid (e.g., an amino acid analog) . As used herein, the terms encompass amino acid chains of any length, including full length proteins (e.g., antigens) .

[0083] The term “expression” as used herein, refers to the production of RNA from transcription or polypeptides from translation. The expression level of a polypeptide in a biological sampe can be examined using any method known in the art. Such methods include, but are not limited to, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) , western blot, flow cytometry, immunofluorescence imaging and immunohistochemistry using antibodies that specifically bind to the polypeptide to be examined.

[0084] As used herein and unless otherwise specified, the term “lipid” refers to a group of organic compounds that include, but are not limited to, esters of fatty acids and are generally characterized by being poorly soluble in water, but soluble in many nonpolar organic solvents. While lipids generally have poor solubility in water, there are certain categories of lipids (e.g., lipids modified by polar groups, e.g., DMG-PEG2000) that have limited aqueous solubility and can dissolve in water under certain conditions. Known types of lipids include biological molecules such as fatty acids, waxes, sterols, fat-soluble vitamins, monoglycerides, diglycerides, triglycerides, and phospholipids. Lipids can be divided into at least three classes: (1) “simple lipids, ” which include fats and oils as well as waxes; (2) “compound lipids, ” which include phospholipids and glycolipids (e.g., DMPE-PEG2000) ; and (3) “derived lipids” such as steroids. Further, as used herein, lipids also encompass lipidoid compounds. The term “lipidoid compound, ” also simply “lipidoid” , refers to a lipid-like compound (e.g. an amphiphilic compound with lipid-like physical properties) .

[0085] The term “lipid nanoparticle” or “LNP” refers to a particle having at least one dimension on the order of nanometers (nm) (e.g., 1 to 1,000 nm) , which contains one or more types of lipid molecules. The LNP provided herein can further contain at least one non-lipid payload molecule (e.g., one or more nucleic acid molecules) . In some embodiments, the LNP comprises a non-lipid payload molecule either partially or completely encapsulated inside a lipid shell. Particularly, in some embodiments, wherein the payload is a negatively charged molecule, and the lipid components of the LNP comprise at least one cationic lipid or ionizable cationic lipids. Without being bound by the theory, it is contemplated that the cationic lipids or ionizable cationic lipids can interact with the negatively charged payload molecules and facilitates incorporation and / or encapsulation of the payload into the LNP during LNP formation. Other lipids that can form part of an LNP as provided herein include but are not limited to neutral lipids and charged lipids, such as steroids, polymer conjugated lipids, and various zwitterionic lipids.

[0086] The term “cationic lipid” refers to a lipid that is either positively charged at any pH value or hydrogen ion activity of its environment, or capable of being positively charged in response to the pH value or hydrogen ion activity of its environment (e.g., the environment of its intended use) . Thus, the term “cationic” encompasses both “permanently cationic” and “cationisable. ” In certain embodiments, the positive charge in a cationic lipid results from the presence of a quaternary nitrogen atom. In certain embodiments, the cationic lipid comprises a zwitterionic lipid that assumes a positive charge in the environment of its intended use (e.g., at physiological pH) . In preferred embodiments, the cationic lipid is ionizable cationic lipid. The term “ionizable cationic lipid” refers to an ionizable lipid that is positively charged at acidic pH to condense RNAs into a composition, such as LNPs, but are neutral at physiological pH to minimize toxicity (Han X, Zhang H, Butowska K, Swingle KL, Alameh MG, Weissman D, Mitchell MJ. An ionizable lipid toolbox for RNA delivery. Nat Commun. 2021 Dec 13; 12 (1) : 7233. ) .

[0087] The term “polymer conjugated lipid” refers to a molecule comprising both a lipid portion and a polymer portion. An example of a polymer conjugated lipid is a pegylated lipid (PEG-lipid) , in which the polymer portion comprises a polyethylene glycol.

[0088] The term “neutral lipid” encompasses any lipid molecules existing in uncharged forms or neutral zwitterionic forms at a selected pH value or within a selected pH range. In some embodiments, the selected useful pH value or range corresponds to the pH condition in an environment of the intended uses of the lipids, such as the physiological pH. As non-limiting examples, neutral lipids that can be used in connection with the present disclosure include, but are not limited to, phosphotidylcholines such as 1, 2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC) , 1, 2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC) , 1, 2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC) , 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC) , 1, 2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) , phophatidylethanolamines such as 1, 2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) , 2- ( (2, 3-bis (oleoyloxy) propyl) dimethylammonio) ethyl hydrogen phosphate (DOCP) , sphingomyelins (SM) , ceramides. Neutral lipids as provided herein may be synthetic or derived (isolated or modified) from a natural source or compound.

[0089] The term “steroid” refers to a class of compounds with cyclopentane polyhydrophenanthrene as the parent nucleus, including sterols and their derivatives. Steroid compounds do not contain fatty acids and are non-saponifiable lipids. Steroids can be used as structural lipids in the lipid component of nanoparticle compositions herein. As a non-limiting example, steroids that may be used in connection with the present disclosure include but are not limited to cholesterol, fecosterol, sitosterol, ergosterol, campesterol, stigmasterol, and mixtures thereof.

[0090] The term “charged lipid” encompasses any lipid molecules that exist in either positively charged or negatively charged forms at a selected pH or within a selected pH range. In some embodiments, the selected pH value or range corresponds to the pH condition in an environment of the intended uses of the lipids, such as the physiological pH. As non-limiting examples, neutral lipids that can be used in connection with the present disclosure include, but are not limited to, phosphatidylserines, phosphatidic acids, phosphatidylglycerols, phosphatidylinositols, sterol hemisuccinates, dialkyl trimethylarnmonium-propanes, (e.g., DOTAP, DOTMA) , dialkyl dimethylaminopropanes, ethyl phosphocholines, dimethylaminoethane carbamoyl sterols (e.g., DC-Chol) , 1, 2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine sodium salt (DOPS-Na) , 1, 2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho- (1'-rac-glycerol) sodium salt (DOPG-Na) , and 1, 2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphate sodium salt (DOPA-Na) . Charged lipids as provided herein may be synthetic or derived (isolated or modified) from a natural source or compound.

[0091] As used herein, and unless otherwise specified, the term “pharmaceutically acceptable salt” includes both acid and base addition salts.

[0092] Examples of pharmaceutically acceptable acid addition salts include, but are not limited to, hydrochloric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, nitric acid, phosphoric acid and the like, and organic acids such as, but not limited to, acetic acid, 2, 2-dichloroacetic acid, adipic acid, alginic acid, ascorbic acid, aspartic acid, benzenesulfonic acid, benzoic acid, 4-acetamidobenzoic acid, camphoric acid, camphor-10-sulfonic acid, capric acid, caproic acid, caprylic acid, carbonic acid, cinnamic acid, citric acid, cyclamic acid, dodecylsulfuric acid, ethane-1, 2-disulfonic acid, ethanesulfonic acid, 2-hydroxyethanesulfonic acid, formic acid, fumaric acid, galactaric acid, gentisic acid, glucoheptonic acid, gluconic acid, glucuronic acid, glutamic acid, glutaric acid, 2-oxo-glutaric acid, glycerophosphoric acid, glycolic acid, hippuric acid, isobutyric acid, lactic acid, lactobionic acid, lauric acid, maleic acid, malic acid, malonic acid, mandelic acid, methanesulfonic acid, mucic acid, naphthalene-1, 5-disulfonic acid, naphthalene-2-sulfonic acid, 1-hydroxy-2-naphthoic acid, nicotinic acid, oleic acid, orotic acid, oxalic acid, palmitic acid, pamoic acid, propionic acid, pyroglutamic acid, pyruvic acid, salicylic acid, 4-aminosalicylic acid, sebacic acid, stearic acid, succinic acid, tartaric acid, thiocyanic acid, p-toluenesulfonic acid, trifluoroacetic acid, undecylenic acid, and the like.

[0093] Examples of pharmaceutically acceptable base addition salt include, but are not limited to, salts prepared from addition of an inorganic base or an organic base to a free acid compound. Salts derived from inorganic bases include, but are not limited to, the sodium, potassium, lithium, ammonium, calcium, magnesium, iron, zinc, copper, manganese, aluminum salts and the like. In one embodiment, the inorganic salts are the ammonium, sodium, potassium, calcium, and magnesium salts. Salts derived from organic bases include, but are not limited to, salts of primary, secondary, and tertiary amines, substituted amines including naturally occurring substituted amines, cyclic amines and basic ion exchange resins, such as ammonia, isopropylamine, trimethylamine, diethylamine, triethylamine, tripropylamine, diethanolamine, ethanolamine, deanol, 2-dimethylaminoethanol, 2-diethylaminoethanol, dicyclohexylamine, lysine, arginine, histidine, caffeine, procaine, hydrabamine, choline, betaine, benethamine, benzathine, ethylenediamine, glucosamine, methylglucamine, theobromine, triethanolamine, tromethamine, purines, piperazine, piperidine, N-ethylpiperidine, polyamine resins and the like. In one embodiment, the organic bases are isopropylamine, diethylamine, ethanolamine, trimethylamine, dicyclohexylamine, choline and caffeine.

[0094] A compound provided herein may contain one or more asymmetric centers and may thus give rise to enantiomers, diastereomers, and other stereoisomeric forms that may be defined, in terms of absolute stereochemistry, as (R) -or (S) -or, as (D) -or (L) -for amino acids. Unless otherwise specified, a compound provided herein is meant to include all such possible isomers, as well as their racemic and optically pure forms. Optically active (+) and (-) , (R) -and (S) -, or (D) -and (L) -isomers may be prepared using chiral synthons or chiral reagents, or resolved using conventional techniques, for example, chromatography and fractional crystallization. Conventional techniques for the preparation / isolation of individual enantiomers include chiral synthesis from a suitable optically pure precursor or resolution of the racemate (or the racemate of a salt or derivative) using, for example, chiral high pressure liquid chromatography (HPLC) . When the compounds described herein contain olefinic double bonds or other centers of geometric asymmetry, and unless specified otherwise, it is intended that the compounds include both E and Z geometric isomers. Likewise, all tautomeric forms are also intended to be included.

[0095] As used herein, and unless otherwise specified, the term “isomer” refers to different compounds that have the same molecular formula. “Stereoisomers” are isomers that differ only in the way the atoms are arranged in space. “Atropisomers” are stereoisomers from hindered rotation about single bonds. “Enantiomers” are a pair of stereoisomers that are non-superimposable mirror images of each other. A mixture of a pair of enantiomers in any proportion can be known as a “racemic” mixture. “Diastereoisomers” are stereoisomers that have at least two asymmetric atoms, but which are not mirror-images of each other.

[0096] “Stereoisomers” can also include E and Z isomers, or a mixture thereof, and cis and trans isomers or a mixture thereof. In certain embodiments, a compound described herein is isolated as either the E or Z isomer. In other embodiments, a compound described herein is a mixture of the E and Z isomers.

[0097] “Tautomers” refers to isomeric forms of a compound that are in equilibrium with each other. The concentrations of the isomeric forms will depend on the environment the compound is found in and may be different depending upon, for example, whether the compound is a solid or is in an organic or aqueous solution.

[0098] It should be noted that if there is a discrepancy between a depicted structure and a name for that structure, the depicted structure is to be accorded more weight.

[0099] As used herein, and unless otherwise specified, the term “pharmaceutically acceptable carrier, diluent or excipient” includes without limitation any adjuvant, carrier, excipient, glidant, sweetening agent, diluent, preservative, dye / colorant, flavor enhancer, surfactant, wetting agent, dispersing agent, suspending agent, stabilizer, isotonic agent, solvent, or emulsifier which has been approved by the United States Food and Drug Administration as being acceptable for use in humans or domestic animals.

[0100] The term “composition” is intended to encompass a product containing the specified ingredients (e.g., an mRNA molecule or a lipid nanoparticle provided herein) in, optionally, the specified amounts.

[0101] The term “processing” as used herein, includes one or more steps to purify, pH adjust, buffer exchange, and / or concentrate LNPs. Steps of processing an LNP solution may be selected by those skilled in the art as desired. For example, one or more steps of filtering, buffer exchanging, diluting, dialyzing, concentrating, pH adjusting, adding a cryoprotectant, lyophilizing and packing of an LNP solution may be selected. Unless otherwise stated, one or more steps of processing may be performed in any order.

[0102] Unless otherwise stated, one or more steps of the processes or methods of the present disclosure may be performed in any order.

[0103] The term “cryoprotectant” as used herein, refers to an excipient that protects unstable molecules during freezing. A cryoprotectant may be added to a liquid composition, for example, an LNP solution before lyophilizing the LNP solution. For example, a cryoprotectant may be added to the liquid composition of the present disclosure to give the lyophilized composition of the present disclosure. Suitable cryoprotectants known is the art are ingredients including but not limited to polyethylene glycol (PEG) , dextran, glycerol, glucose, trehalose, and sucrose.

[0104] The term “buffer” as used herein, refers to a solution containing a buffering agent or a mixture of buffering agents and, optionally, a divalent cation and a monovalent cation. The buffering capability can be conferred to a lyophilized composition by adding one or more buffering agents into the liquid composition before lyophilization.

[0105] Examples of buffers capable of maintaining a neutral pH, for example, a pH of about 6.5 to about 8.6 (e.g., a pH of about 7.0 to about 8.5) , may include but is not limited to: a Tris buffer (for example, Tris-HCl buffer) , a phosphate buffer, a PIPES buffer, an ADA buffer, an ACES buffer, an acetate buffer, a citrate buffer, a DIPSO buffer, a BES buffer, an MOPSO buffer, an MOPS buffer, a HEPBS buffer, a HEPPSO buffer, a HEPES buffer, a TAPSO buffer, a TEA buffer, a TES buffer and a Tricine buffer. According to some embodiments of the present disclosure, such a buffer may be comprised in the lipid solution and / or the aqueous solution for preparing the liquid composition, and / or in the exchanging buffer for adjusting the pH of the LNP solution.

[0106] The terms “reconstitution” , “reconstituting” , “rehydration” and “rehydrating” are used interchangeably to refer to an action of adding an aqueous solution to a lyophilized composition to obtain a liquid composition. The aqueous solution used for reconstitution may be water (e.g., sterile water) , an acidic buffer or a nucleic acid solution according to some embodiments of the present disclosure. The aqueous solution may comprise a buffering agent and / or a salt, or a cryoprotectant. According to some embodiments of the present disclosure, the aqueous solution for reconstitution may comprise a buffering agent to confer a buffering ability to the resulting liquid composition. Those skilled in the art will appreciate that the final concentration of a component (e.g., mRNA-LNP) after reconstitution may be higher, lower, or the same as its pre-lyophilization concentration, depending on the volume of solvent added. In some embodiments, reconstitution of a lyophilized composition may substantially restore the concentration of a component (e.g., mRNA-LNP) to that in the composition prior to lyophilization.

[0107] The terms “lyophilized, ” “lyophilzation” and the like as used herein refer to a process by which the material (e.g., nanoparticles) to be dried is first frozen and then the ice or frozen solvent is removed by sublimation in a vacuum environment. An excipient may be included in pre-lyophilized formulations to enhance stability of the lyophilized product upon storage.

[0108] The term “mRNA” as used herein refers to a message RNA molecule comprising one or more open reading frame (ORF) that can be translated by a cell or an organism provided with the mRNA to produce one or more peptide or protein product. The region containing the one or more ORFs is referred to as the coding region of the mRNA molecule. In certain embodiments, the mRNA molecule further comprises one or more untranslated regions (UTRs) .

[0109] As used herein, the term “encapsulation efficiency” when used with reference to a nucleic acid describes the amount of nucleic acid that is encapsulated or otherwise associated with an LNP in the LNP formulation (post-encapsualtion formulation) , relative to the initial amount provided. For efficient delivery, the encapsulation efficiency is desirably high (e.g., at least 80%, preferably at least 85%, more preferably at least 90%, for example, close to 100%) . The encapsulation efficiency can be measured, for example, by comparing the amount of nucleic acid in a solution of the LNP formulation in the presence or absence of an organic solvent or detergent. Fluorescence can be used to measure the amount of free nucleic acids (e.g., RNA) in a solution.

[0110] As used herein, “encapsulation” , “encapsulated” , “loaded” , and “associated” may refer to complete, substantial, or partial enclosure, confinement, or encasement. As used herein, “encapsulation” or “association” may refer to the process of confining or bounding of a payload (e.g., a nucleic acid molecule) by a lipid nanoparticle.Lipid nanoparticles (LNPs)

[0111] In certain aspects, the present disclosure provides an LNP. In some embodiments, the LNP comprises a cationic lipid as described herein. In some embodiments, the LNP comprises: i) a cationic lipid; ii) a phospholipid; iii) a steroid; and iv) a polymer conjugated lipid.

[0112] In some embodiments, the LNP is referred to an empty LNP. The term “empty” means that the LNP is substantially free of or not associated with or not loaded with a payload, such as a nucleic acid. As used herein, an “empty lipid nanoparticle (LNP) ” may refer to an LNP that consists substantially of only lipid components.

[0113] As used herein, “molar percent” refers to a component’s molar percentage relative to total mols of all lipid components in the LNP (i.e., total mols of cationic lipid (s) , the phospholipid, the steroid and the polymer conjugated lipid) .

[0114] In some embodiments, the LNP comprises between about 20 molar percent to about 65 molar percent of a cationic lipid. In some embodiments, the LNP comprises between about 30 molar percent to about 55 molar percent of a cationic lipid. In some embodiments, the LNP comprises greater than about 30 molar percent of a cationic lipid, such as greater than any of about 35 molar percent, 40 molar percent, 45 molar percent, 50 molar percent, 55 molar percent, or greater, of a cationic lipid. In some embodiments, the LNP comprises less than about 55 molar percent of a cationic lipid, such as less than any of about 50 molar percent, 45 molar percent, 40 molar percent, 35 molar percent, 30 molar percent, or less, of a cationic lipid.

[0115] In some embodiments, the LNP comprises between about 5 molar percent to about 40 molar percent of a phospholipid. In some embodiments, the LNP comprises greater than about 5 molar percent of a phospholipid, such as greater than any of about 10 molar percent, 15 molar percent, 20 molar percent, 25 molar percent, 30 molar percent, 35 molar percent, 40 molar percent, or greater, of a phospholipid. In some embodiments, the LNP comprises less than about 40 molar percent of a phospholipid, such as less than any of about 35 molar percent, 30 molar percent, 25 molar percent, 20 molar percent, 15 molar percent, 10 molar percent, 5 molar percent, or less, of a phospholipid.

[0116] In some embodiments, the LNP comprises between about 20 molar percent to about 50 molar percent of a steroid. In some embodiments, the LNP comprises greater than about 20 molar percent of a steroid, such as greater than any of about 25 molar percent, 30 molar percent, 35 molar percent, 40 molar percent, 45 molar percent, 50 molar percent, or greater, of a steroid. In some embodiments, the LNP comprises less than about 50 molar percent of a steroid, such as less than any of about 45 molar percent, 40 molar percent, 35 molar percent, 30 molar percent, 25 molar percent, 20 molar percent, or less, of a steroid.

[0117] In some embodiments, the LNP comprises a cationic lipid, a phospholipid, a steroid, and a polymer conjugated lipid, such as any of the cationic lipids, phospholipids, steroids, and polymer conjugated lipids described herein. In some embodiments, the LNP comprises i) between about 30 molar percent to about 55 molar percent of a cationic lipid, ii) between about 5 molar percent to about 40 molar percent of a phospholipid. In some embodiments, the LNP comprises: i) between about 30 molar percent to about 55 molar percent of a cationic lipid; ii) between about 5 molar percent to about 40 molar percent of a phospholipid; iii) between about 20 molar percent to about 50 molar percent of a steroid; and iv) between about 1.0 molar percent to about 2.5 molar percent of a polymer conjugated lipid. i. Cationic Lipid

[0118] In some embodiments, the LNP comprises a cationic lipid, also referred to herein as an “ionizable lipid. ”

[0119] The cationic lipid can be any of a number of lipid species which carry a net positive charge at a selected pH, such as physiological pH. Exemplary cationic lipids are described herein below. The pKa value of an ionizable lipid defines the pH at which its functional ionizable groups are 50%in ionized and 50%in a de-ionized form. In one embodiment, the cationic lipid has a pKa greater than 6.25. In one embodiment, the cationic lipid has a pKa greater than 6.5. In one embodiment, the cationic lipid has a pKa greater than 6.1, greater than 6.2, greater than 6.3, greater than 6.35, greater than 6.4, greater than 6.45, greater than 6.55, greater than 6.6, greater than 6.65, or greater than 6.7.

[0120] Cationic lipids that may be comprised in the LNPs provided herein are known in the art. For example, the cationic lipid may include, but is not limited to, the cationic lipids described in WO2012040184, WO2011153120, WO2011149733, WO2011090965, WO2011043913, WO2011022460, WO2012061259, WO2012054365, WO2012044638, WO2010080724, WO201021865 and WO2008103276, U.S. Pat. Nos. 7,893,302, 7,404,969 and 8,283,333 and U.S. Patent Publication No. US20100036115 and US20120202871; each of which is herein incorporated by reference in their entirety. In some embodiments, the cationic lipid is selected from the non-limiting group consisting of 3- (didodecylamino) -N1, N1, 4-tridodecyl-1-piperazineethanamine (KL10) , 14, 25-ditridecyl-15, 18, 21, 24-tetraaza-octatriacontane (KL25) , 1, 2-dilinoleyloxy-N, N-dimethylaminopropane (DLin-DMA) , 2, 2-dilinoleyl-4-dimethylaminomethyl- [1, 3] -dioxolane (DLin-K-DMA) , heptatriaconta-6, 9, 28, 31-tetraen-19-yl 4- (dimethylamino) butanoate (DLin-MC3-DMA) , 2, 2-dilinoleyl-4- (2-dimethylaminoethyl) - [1, 3] -dioxolane (DLin-KC2-DMA) , 1, 2-dioleyloxy-N, N-dimethylaminopropane (DODMA) , 2- ( {8- [ (3β) -cholest-5-en-3-yloxy] octyl} oxy) -N, N-dimethyl-3- [ (9Z, 12Z) -octadeca-9, 12-dien-1-yloxy] propan-1-amine (Octyl-CLinDMA) , (2R) -2- ( {8- [ (3β) -cholest-5-en-3-yloxy] octyl} oxy) -N, N-dimethyl-3- [ (9Z, 12Z) -octadeca-9, 12-dien-1-yloxy] pro pan-1-amine (Octyl-CLinDMA (2R) ) , and (2S) -2- ( {8- [ (3β) -cholest-5-en-3-yloxy] octyl} oxy) -N, N-di methyl-3- [ (9Z, 12Z) -octadeca-9, 12-dien-1-yloxy] prop an-1-amine (Octyl-CLinDMA (2S) ) , or a pharmaceutically acceptable salt or stereoisomer thereof. In addition to these, the cationic lipid may also be a lipid including a cyclic amine.

[0121] In some embodiments, the cationic lipid comprises or is a compound according to Formula (01-I) , Formula (01-I-B) , Formula (01-I-B’) , Formula (01-I-B”) , Formula (01-I-C) , Formula (01-I-D) or Formula (01-I-E) , or a compound listed in Table 01; or a compound according to Formula (02-I) or Formula (02-II) , or a compound listed in Table 02; or a compound according to Formula (03-I) , or a compound listed in Table 03; or a compound according to Formula (04-I) or Formula (04-III) , or a compound listed in Table 04; or a compound according to Formula (05-I) .

[0122] In some embodiments, the cationic lipid is a cationic lipid described in International Patent Publication No. WO 2021 / 204175, the entirety of which is incorporated herein by reference.

[0123] In some embodiments, the cationic lipid is a compound of Formula (01-I) : or a pharmaceutically acceptable salt, prodrug or stereoisomer thereof, wherein: G1 and G2 are each independently a bond, C2-C12 alkylene, or C2-C12 alkenylene, wherein one or more -CH2-in the alkylene or alkenylene is optionally replaced by -O-; L1 is –OC (=O) R1, -C (=O) OR1, -OC (=O) OR1, -C (=O) R1, -OR1, -S (O) xR1, -S-SR1, -C (=O) SR1, -SC (=O) R1, -NRaC (=O) R1, -C (=O) NRbRc, -NRaC (=O) NRbRc, -OC (=O) NRbRc, -NRaC (=O) OR1, -SC (=S) R1, -C (=S) SR1, -C (=S) R1, -CH (OH) R1, -P (=O) (ORb) (ORc) , - (C6-C10 arylene) -R1, - (6-to 10-membered heteroarylene) -R1, or R1; L2 is –OC (=O) R2, -C (=O) OR2, -OC (=O) OR2, -C (=O) R2, -OR2, -S (O) xR2, -S-SR2, -C (=O) SR2, -SC (=O) R2, -NRdC (=O) R2, -C (=O) NReRf, -NRdC (=O) NReRf, -OC (=O) NReRf, -NRdC (=O) OR2, -SC (=S) R2, -C (=S) SR2, -C (=S) R2, -CH (OH) R2, -P (=O) (ORe) (ORf) , - (C6-C10 arylene) -R2, - (6-to 10-membered heteroarylene) -R2, or R2; R1 and R2 are each independently C6-C32 alkyl or C6-C32 alkenyl; Ra, Rb, Rd, and Re are each independently H, C1-C24 alkyl, or C2-C24 alkenyl; Rc and Rf are each independently C1-C32 alkyl or C2-C32 alkenyl; G3 is C2-C24 alkylene, C2-C24 alkenylene, C3-C8 cycloalkylene, or C3-C8 cycloalkenylene; R3 is -N (R4) R5; R4 is C3-C8 cycloalkyl, C3-C8 cycloalkenyl, 4-to 8-membered heterocyclyl, or C6-C10 aryl; or R4, G3 or part of G3, together with the nitrogen to which they are attached form a cyclic moiety; R5 is C1-C12 alkyl or C3-C8 cycloalkyl; or R4, R5, together with the nitrogen to which they are attached form a cyclic moiety; x is 0, 1, or 2; and wherein each alkyl, alkenyl, cycloalkyl, cycloalkenyl, heterocyclyl, aryl, alkylene, alkenylene, cycloalkylene, cycloalkenylene, arylene, heteroarylene, and cyclic moiety is independently optionally substituted.

[0124] In some embodiments, the cationic lipid is a compound of Formula (01-I-B) , (01-I-B’) , (01-I-B”) , (01-I-C) , (01-I-D) , or (01-I-E) : or a pharmaceutically acceptable salt, prodrug, or stereoisomer thereof.

[0125] In some embodiments, G1 and G2 are each independently C3-C7 alkylene. In some embodiments, G1 and G2 are each independently C5 alkylene. In some embodiments, G3 is C2-C4 alkylene. In some embodiments, G3 is C2 alkylene. In some embodiments, G3 is C4 alkylene.

[0126] In some embodiments, R3 has one of the following structures:

[0127] In some embodiments, R1, R2, Rc, and Rf are each independently branched C6-C32 alkyl or branched C6-C32 alkenyl. In some embodiments, R1, R2, Rc, and Rf are each independently branched C6-C24 alkyl or branched C6-C24 alkenyl. In some embodiments, R1, R2, Rc, and Rf are each independently -R7-CH (R8) (R9) , wherein R7 is C0-C5 alkylene, and R8 and R9 are independently C2-C10 alkyl. In some embodiments, R1, R2, Rc, and Rf are each independently -R7-CH (R8) (R9) , wherein R7 is C0-C1 alkylene, and R8 and R9 are independently C4-C8 alkyl.

[0128] In some embodiments, the cationic lipid is a compound in Table 01, or a pharmaceutically acceptable salt, prodrug, or stereoisomer thereof.

[0129] Table 01.

[0130] In some embodiments, the cationic lipid is a cationic lipid described in International Patent Application No. PCT / CN2022 / 072694, the entirety of which is incorporated herein by reference. In some embodiments, the cationic lipid is a compound of Formula (02-I) : or a pharmaceutically acceptable salt, prodrug, or stereoisomer thereof, wherein: G1 and G2 are each independently C2-C12 alkylene or C2-C12 alkenylene, wherein one or more -CH2-in G1 and G2 is optionally replaced by -O-, -C (=O) O-, or -OC (=O) -; each L1 is independently –OC (=O) R1, -C (=O) OR1, -OC (=O) OR1, -C (=O) R1, -OR1, -S (O) xR1, -S-SR1, -C (=O) SR1, -SC (=O) R1, -NRaC (=O) R1, -C (=O) NRbRc, -NRaC (=O) NRbRc, -OC (=O) NRbRc, -NRaC (=O) OR1, -SC (=S) R1, -C (=S) SR1, -C (=S) R1, -CH (OH) R1, -P (=O) (ORb) (ORc) , -NRaP (=O) (ORb) (ORc) ; each L2 is independently –OC (=O) R2, -C (=O) OR2, -OC (=O) OR2, -C (=O) R2, -OR2, -S (O) xR2, -S-SR2, -C (=O) SR2, -SC (=O) R2, -NRdC (=O) R2, -C (=O) NReRf, -NRdC (=O) NReRf, -OC (=O) NReRf, -NRdC (=O) OR2, -SC (=S) R2, -C (=S) SR2, -C (=S) R2, -CH (OH) R2, -P (=O) (ORe) (ORf) , -NRdP (=O) (ORe) (ORf) ; R1 and R2 are each independently C6-C24 alkyl or C6-C24 alkenyl; Ra, Rb, Rd, and Re are each independently H, C1-C24 alkyl, or C2-C24 alkenyl; Rc and Rf are each independently C1-C24 alkyl or C2-C24 alkenyl; G3 is C2-C12 alkylene or C2-C12 alkenylene, wherein part or all of alkylene or alkenylene is optionally replaced by a C3-C8 cycloalkylene or C3-C8 cycloalkenylene; R3 is -N (R4) R5, -OR6, or -SR6; R4 is C1-C12 alkyl, C2-C12 alkenyl, C3-C8 cycloalkyl, C3-C8 cycloalkenyl, C6-C10 aryl, or 4-to 8-membered heterocycloalkyl; R5 is H, C1-C12 alkyl, C3-C8 cycloalkyl, C3-C8 cycloalkenyl, C6-C10 aryl, or 4-to 8-membered heterocycloalkyl; R6 is hydrogen, C1-C12 alkyl, C3-C8 cycloalkyl, C3-C8 cycloalkenyl, or C6-C10 aryl; x is 0, 1, or 2; and wherein each alkyl, alkenyl, cycloalkyl, cycloalkenyl, heterocycloalkyl, aryl, alkylene, alkenylene, cycloalkylene, and cycloalkenylene is independently optionally substituted.

[0131] In some embodiments, the cationic lipid is a compound of Formula (02-II) : or a pharmaceutically acceptable salt, prodrug, or stereoisomer thereof, wherein: G1 and G2 are each independently C2-C12 alkylene or C2-C12 alkenylene, wherein one or more -CH2-in G1 and G2 is optionally replaced by -O-, -C (=O) O-, or -OC (=O) -; each L1 is independently –OC (=O) R1, -C (=O) OR1, -OC (=O) OR1, -C (=O) R1, -OR1, -S (O) xR1, -S-SR1, -C (=O) SR1, -SC (=O) R1, -NRaC (=O) R1, -C (=O) NRbRc, -NRaC (=O) NRbRc, -OC (=O) NRbRc, -NRaC (=O) OR1, -SC (=S) R1, -C (=S) SR1, -C (=S) R1, -CH (OH) R1, -P (=O) (ORb) (ORc) , -NRaP (=O) (ORb) (ORc) ; each L2 is independently –OC (=O) R2, -C (=O) OR2, -OC (=O) OR2, -C (=O) R2, -OR2, -S (O) xR2, -S-SR2, -C (=O) SR2, -SC (=O) R2, -NRdC (=O) R2, -C (=O) NReRf, -NRdC (=O) NReRf, -OC (=O) NReRf, -NRdC (=O) OR2, -SC (=S) R2, -C (=S) SR2, -C (=S) R2, -CH (OH) R2, -P (=O) (ORe) (ORf) , -NRdP (=O) (ORe) (ORf) ; R1 and R2 are each independently C6-C24 alkyl or C6-C24 alkenyl; Ra, Rb, Rd, and Re are each independently H, C1-C24 alkyl, or C2-C24 alkenyl; Rc and Rf are each independently C1-C24 alkyl or C2-C24 alkenyl; G3 is C2-C12 alkylene or C2-C12 alkenylene, wherein part or all of alkylene or alkenylene is optionally replaced by a C3-C8 cycloalkylene or C3-C8 cycloalkenylene; R3 is -N (R4) R5, -OR6, or -SR6; R4 is C1-C12 alkyl, C2-C12 alkenyl, C3-C8 cycloalkyl, C3-C8 cycloalkenyl, C6-C10 aryl, or 4-to 8-membered heterocycloalkyl; R5 is H, C1-C12 alkyl, C3-C8 cycloalkyl, C3-C8 cycloalkenyl, C6-C10 aryl, or 4-to 8-membered heterocycloalkyl; R6 is hydrogen, C1-C12 alkyl, C3-C8 cycloalkyl, C3-C8 cycloalkenyl, or C6-C10 aryl; x is 0, 1, or 2; and wherein each alkyl, alkenyl, cycloalkyl, cycloalkenyl, heterocycloalkyl, aryl, alkylene, alkenylene, cycloalkylene, and cycloalkenylene is independently optionally substituted.

[0132] In some embodiments, the compound is a compound in Table 02, or a pharmaceutically acceptable salt, prodrug, or stereoisomer thereof.

[0133] Table 02.

[0134] In some embodiments, the cationic lipid described herein is a cationic lipid described in International Patent Publication No. WO 2022 / 152109, the entirety of which is incorporated herein by reference.

[0135] In some embodiments, the cationic lipid is a compound of Formula (03-I) : or a pharmaceutically acceptable salt, prodrug, or stereoisomer thereof, wherein: G1 and G2 are each independently a bond, C2-C12 alkylene, or C2-C12 alkenylene, wherein one or more -CH2-in G1 and G2 is optionally replaced by -O-; each L1 is independently –OC (=O) R1, -C (=O) OR1, -OC (=O) OR1, -C (=O) R1, -OR1, -S (O) xR1, -S-SR1, -C (=O) SR1, -SC (=O) R1, -NRaC (=O) R1, -C (=O) NRbRc, -NRaC (=O) NRbRc, -OC (=O) NRbRc, -NRaC (=O) OR1, -SC (=S) R1, -C (=S) SR1, -C (=S) R1, -CH (OH) R1, -P (=O) (ORb) (ORc) , -NRaP (=O) (ORb) (ORc) , - (C6-C10 arylene) -R1, - (6-to 10-membered heteroarylene) -R1, - (4-to 8-membered heterocyclylene) -R1, or R1; each L2 is independently –OC (=O) R2, -C (=O) OR2, -OC (=O) OR2, -C (=O) R2, -OR2, -S (O) xR2, -S-SR2, -C (=O) SR2, -SC (=O) R2, -NRdC (=O) R2, -C (=O) NReRf, -NRdC (=O) NReRf, -OC (=O) NReRf, -NRdC (=O) OR2, -SC (=S) R2, -C (=S) SR2, -C (=S) R2, -CH (OH) R2, -P (=O) (ORe) (ORf) , -NRdP (=O) (ORe) (ORf) , - (C6-C10 arylene) -R2, - (6-to 10-membered heteroarylene) -R2, - (4-to 8-membered heterocyclylene) -R2, or R2; R1 and R2 are each independently C6-C24 alkyl or C6-C24 alkenyl; Ra, Rb, Rd, and Re are each independently H, C1-C24 alkyl, or C2-C24 alkenyl; Rc and Rf are each independently C1-C24 alkyl or C2-C24 alkenyl; G3 is C2-C12 alkylene or C2-C12 alkenylene, wherein part or all of alkylene or alkenylene is optionally replaced by C3-C8 cycloalkylene, C3-C8 cycloalkenylene, C3-C8 cycloalkynylene, 4-to 8-membered heterocyclylene, C6-C10 arylene, or 5-to 10-membered heteroarylene; R3 is hydrogen, C1-C12 alkyl, C2-C12 alkenyl, C2-C12 alkynyl, C3-C8 cycloalkyl, C3-C8 cycloalkenyl, C3-C8 cycloalkynyl, 4-to 8-membered heterocyclyl, C6-C10 aryl, or 5-to 10-membered heteroaryl; or R3 and G1, or part of G1, together with the nitrogen to which they are attached form a cyclic moiety; or R3 and G3 or part of G3, together with the nitrogen to which they are attached form a cyclic moiety; R4 is C1-C12 alkyl or C3-C8 cycloalkyl; x is 0, 1, or 2; n is 1 or 2; m is 1 or 2; and wherein each alkyl, alkenyl, alkynyl, cycloalkyl, cycloalkenyl, cycloalkynyl, heterocyclyl, aryl, heteroaryl, alkylene, alkenylene, cycloalkylene, cycloalkenylene, cycloalkynylene, heterocyclylene, arylene, heteroarylene, and cyclic moiety is independently optionally substituted.

[0136] In some embodiments, the cationic lipid is a compound in Table 03, or a pharmaceutically acceptable salt, prodrug, or stereoisomer thereof.

[0137] Table 03

[0138] In some embodiments, the cationic lipid is a cationic lipid described in International Patent Application No. PCT / CN2022 / 094227, the entirety of which is incorporated herein by reference.

[0139] In some embodiments, the cationic lipid is a compound of Formula (04-I) : or a pharmaceutically acceptable salt, prodrug, or stereoisomer thereof, wherein: G1 and G2 are each independently a bond, C2-C12 alkylene, or C2-C12 alkenylene; L1 is –OC (=O) R1, -C (=O) OR1, -OC (=O) OR1, -C (=O) R1, -OR1, -S (O) xR1, -S-SR1, -C (=O) SR1, -SC (=O) R1, -NRaC (=O) R1, -C (=O) NRbRc, -NRaC (=O) NRbRc, -OC (=O) NRbRc, -NRaC (=O) OR1, -SC (=S) R1, -C (=S) SR1, -C (=S) R1, -CH (OH) R1, -P (=O) (ORb) (ORc) , - (C6-C10 arylene) -R1, - (6-to 10-membered heteroarylene) -R1, or R1; L2 is –OC (=O) R2, -C (=O) OR2, -OC (=O) OR2, -C (=O) R2, -OR2, -S (O) xR2, -S-SR2, -C (=O) SR2, -SC (=O) R2, -NRdC (=O) R2, -C (=O) NReRf, -NRdC (=O) NReRf, -OC (=O) NReRf, -NRdC (=O) OR2, -SC (=S) R2, -C (=S) SR2, -C (=S) R2, -CH (OH) R2, -P (=O) (ORe) (ORf) , - (C6-C10 arylene) -R2, - (6-to 10-membered heteroarylene) -R2, or R2; R1 and R2 are each independently C5-C32 alkyl or C5-C32 alkenyl; Ra, Rb, Rd, and Re are each independently H, C1-C24 alkyl, or C2-C24 alkenyl; Rc and Rf are each independently C1-C32 alkyl or C2-C32 alkenyl; R0 is C1-C12 alkyl, C2-C12 alkenyl, C3-C8 cycloalkyl, C3-C8 cycloalkenyl, C6-C10 aryl, or 4-to 8-membered heterocycloalkyl; G3 is C2-C12 alkylene or C2-C12 alkenylene; R4 is C1-C12 alkyl, C2-C12 alkenyl, C3-C8 cycloalkyl, C3-C8 cycloalkenyl, C6-C10 aryl, or 4-to 8-membered heterocycloalkyl; R5 is C1-C12 alkyl, C3-C8 cycloalkyl, C3-C8 cycloalkenyl, C6-C10 aryl, or 4-to 8-membered heterocycloalkyl; x is 0, 1, or 2; s is 0 or 1; and wherein each alkyl, alkenyl, cycloalkyl, cycloalkenyl, heterocycloalkyl, aryl, alkylene, alkenylene, arylene, and heteroarylene, is independently optionally substituted.

[0140] In some embodiments, the cationic lipid is a compound of Formula (04-III) : or a pharmaceutically acceptable salt, prodrug, or stereoisomer thereof, wherein: R1 and R2 are each independently C5-C32 alkyl or C5-C32 alkenyl; R0 is C1-C12 alkyl, C2-C12 alkenyl, C3-C8 cycloalkyl, C3-C8 cycloalkenyl, C6-C10 aryl, or 4-to 8-membered heterocycloalkyl; G3 is C2-C12 alkylene or C2-C12 alkenylene; G4 is C2-C12 alkylene or C2-C12 alkenylene; R3 is -N (R4) R5 or -OR6; R4 is C1-C12 alkyl, C2-C12 alkenyl, C3-C8 cycloalkyl, C3-C8 cycloalkenyl, C6-C10 aryl, or 4-to 8-membered heterocycloalkyl; R5 is C1-C12 alkyl, C3-C8 cycloalkyl, C3-C8 cycloalkenyl, C6-C10 aryl, or 4-to 8-membered heterocycloalkyl; or R4 and R5, together with the nitrogen to which they are attached form a cyclic moiety; R6 is hydrogen, C1-C12 alkyl, C3-C8 cycloalkyl, C3-C8 cycloalkenyl, or C6-C10 aryl; and wherein each alkyl, alkenyl, cycloalkyl, cycloalkenyl, heterocycloalkyl, aryl, alkylene, alkenylene, and cyclic moiety is independently optionally substituted.

[0141] In some embodiments, the cationic lipid is a compound in Table 04, or a pharmaceutically acceptable salt, prodrug, or stereoisomer thereof.

[0142] Table 04.

[0143] In some embodiments, the cationic lipid may be synthesized by methods known in the art and / or as described in International Publication Nos. WO2012040184, WO2011153120, WO2011149733, WO2011090965, WO2011043913, WO2011022460, WO2012061259, WO2012054365, WO2012044638, WO2010080724 and WO201021865; each of which is herein incorporated by reference in their entirety.

[0144] In one embodiment, the cationic lipid contained in the particles or compositions provided herein is a cationic lipid described in U.S. Patent Nos. US10442756B2, US9868691B2, and US9868692B2, the entire teachings of which are incorporated herein by reference.

[0145] In one embodiment, the cationic lipid is a compound Formula (05-I) : or a salt or isomer thereof, wherein l is selected from 1, 2, 3, 4, and 5; m is selected from 5, 6, 7, 8, and 9; M1 is a bond or M’ ; R4 is unsubstituted C1-3 alkyl, or - (CH2) nQ, in which Q is OH, -NHC (S) N (R) 2, -NHC (O) N (R) 2, -N (R) C (O) R, -N (R) S (O) 2R, -N (R) R8, -NHC (=NR9) N (R) 2, -NHC (=CHR9) N (R) 2, -OC (O) N (R) 2, -N (R) C (O) OR, -N (OR) C (O) R, -N (OR) S (O) 2R, -N (OR) C (O) OR, -N (OR) C (O) N (R) 2, -N (OR) C (S) N (R) 2, -N (OR) C (=NR9) N (R) 2, -N (OR) C (=CHR9) N (R) 2, or heteroaryl, and each n is selected from 1, 2, 3, 4, or 5; M and M’ are independently selected from -C (O) O-, -OC (O) -, -C (O) N (R’) -, -P (O) (OR’) O-, -S-S-, an aryl group, and a heteroaryl group; and R2 and R3 are both C1-14 alkyl, or C2-14 alkenyl, R8 is selected from the group consisting of C3-6 carbocycle and heterocycle; R9 is selected from the group consisting of H, CN, NO2, C1-6 alkyl, -OR, -S (O) 2R, -S (O) 2N (R) 2, C2-6 alkenyl, C3-6 carbocycle and heterocycle; each R is independently selected from the group consisting of C1-3 alkyl, C2-3 alkenyl, and H; and R’ is a linear alkyl.

[0146] In one embodiment, the cationic lipid is SM-102 or Lipid 5:

[0147] It should be understood in the present description, combinations of substituents and / or variables of the depicted formulae are permissible only if such contributions result in stable compounds. Other ionizable lipids

[0148] As described herein, in some embodiments, an LNP provided herein comprises one or more charged or ionizable lipids in addition to a lipid of Series 01, 02, 03, or 04, e.g., a lipid according to any one of Formulae (01-I) , (02-I) , (02-II) , (03-I) , (04-I) and (04-III) (and sub-formulas thereof, see e.g., WO2023098842) .

[0149] Without being bound by the theory, it is contemplated that certain charged or zwitterionic lipid components of a nanoparticle composition resembles the lipid component in the cell membrane, thereby can improve cellular uptake of the nanoparticle. Exemplary charged or ionizable lipids that can form part of the present nanoparticle composition include but are not limited to 3- (didodecylamino) -N1, N1, 4-tridodecyl-1-piperazineethanamine (KL10) , N1- [2- (didodecylamino) ethyl] -N1, N4, N4-tridodecyl-1, 4-piperazinediethanamine (KL22) , 14, 25-ditridecyl-15, 18, 21, 24-tetraaza-octatriacontane (KL25) , 1, 2-dilinoleyloxy-N, N-dimethylaminopropane (DLinDMA) , 2, 2-dilinoleyl-4-dimethylaminomethyl- [1, 3] -dioxolane (DLin-K-DMA) , heptatriaconta-6, 9, 28, 31-tetraen-19-yl 4- (dimethylamino) butanoate (DLin-MC3-DMA) , 2, 2-dilinoleyl-4- (2-dimethylaminoethyl) - [1, 3] -dioxolane (DLin-KC2-DMA) , 1, 2-dioleyloxy-N, N-dimethylaminopropane (DODMA) , 2- ( {8- [ (3β) -cholest-5-en-3-yloxy] octyl} oxy) -N, N-dimethyl-3 [ (9Z, 12Z) -octadeca-9, 12-dien-1-yloxy] propan-1-amine (Octyl-CLinDMA) , (2R) -2- ( {8- [ (3β) -cholest-5-en-3-yloxy] octyl} oxy) -N, N-dimethyl-3- [ (9Z, 12Z) --octadeca-9, 12-dien-1-yloxy] propan-1-amine (Octyl-CLinDMA (2R) ) , (2S) -2- ( {8- [ (3β) -cholest-5-en-3-yloxy] octyl} oxy) -N, N-dimethyl-3- [ (9Z-, 12Z) -octadeca-9, 12-dien-1-yloxy] propan-1-amine (Octyl-CLinDMA (2S) ) , (12Z, 15Z) -N, N-dimethyl-2-nonylhenicosa 12, 15-den-1-amine, N, N-dimethyl-1- { (1S, 2R) -2-octylcyclopropyl} heptadecan-8-amine. Additional exemplary charged or ionizable lipids that can form part of the present nanoparticle composition include the lipids (e.g., lipid 5) described in Sabnis S, Kumarasinghe ES, Salerno T, Mihai C, Ketova T, Senn JJ, Lynn A, Bulychev A, McFadyen I, Chan J, Almarsson Stanton MG, Benenato KE. A Novel Amino Lipid Series for mRNA Delivery: Improved Endosomal Escape and Sustained Pharmacology and Safety in Non-human Primates. Mol Ther. 2018 Jun 6; 26 (6) : 1509-1519., the entirety of which is incorporated herein by reference.

[0150] In some embodiments, suitable cationic lipids include N- [1- (2, 3-dioleyloxy) propyl] -N, N, N-trimethylammonium chloride (DOTMA) ; N- [1- (2, 3-dioleoyloxy) propyl] -N, N, N-trimethylammonium chloride (DOTAP) ; 1, 2-dioleoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine (DOEPC) ; 1, 2-dilauroyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine (DLEPC) ; 1, 2-dimyristoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine (DMEPC) ; 1, 2-dimyristoleoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine (14: 1) ; N1- [2- ( (1S) -1- [ (3-aminopropyl) amino] -4- [di (3-amino-propyl) amino] butylcarboxamido) ethyl] -3, 4-di [oleyloxy] -benzamide (MVL5) ; dioctadecylamido-glycylspermine (DOGS) ; 3b- [N- (N', N'-dimethylaminoethyl) carbamoyl] cholesterol (DC-Chol) ; dioctadecyldimethylammonium bromide (DDAB) ; SAINT-2, N-methyl-4- (dioleyl) methylpyridinium; 1, 2-dimyristyloxypropyl-3-dimethylhydroxyethylammonium bromide (DMRIE) ; 1, 2-dioleoyl-3-dimethyl-hydroxyethyl ammonium bromide (DORIE) ; 1, 2-dioleoyloxypropyl-3-dimethylhydroxyethyl ammonium chloride (DORI) ; di-alkylated amino acid (DILA2) (e.g., C18: 1-norArg-C16) ; dioleyldimethylammonium chloride (DODAC) ; 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine (POEPC) ; 1, 2-dimyristoleoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine (MOEPC) ; (R) -5- (dimethylamino) pentane-1, 2-diyl dioleate hydrochloride (DODAPen-Cl) ; (R) -5-guanidinopentane-1, 2-diyl dioleate hydrochloride (DOPen-G) ; and (R) -N, N, N-trimethyl-4, 5-bis (oleoyloxy) pentan-1-aminium chloride (DOTAPen) . Also suitable are cationic lipids with headgroups that are charged at physiological pH, such as primary amines (e.g., DODAG N', N'-dioctadecyl-N-4, 8-diaza-10-aminodecanoylglycine amide) and guanidinium head groups (e.g., bis-guanidinium-spermidine-cholesterol (BGSC) , bis-guanidiniumtren-cholesterol (BGTC) , PONA, and (R) -5-guanidinopentane-1, 2-diyl dioleate hydrochloride (DOPen-G) ) . Yet another suitable cationic lipid is (R) -5- (dimethylamino) pentane-1, 2-diyl dioleate hydrochloride (DODAPen-Cl) . In certain embodiments, the cationic lipid is a particular enantiomer or the racemic form, and includes the various salt forms of a cationic lipid as above (e.g., chloride or sulfate) . For example, in some embodiments, the cationic lipid is N- [1- (2, 3-dioleoyloxy) propyl] -N, N, N-trimethylammonium chloride (DOTAP-Cl) or N- [1- (2, 3-dioleoyloxy) propyl] -N, N, N-trimethylammonium sulfate (DOTAP-Sulfate) . In some embodiments, the cationic lipid is an ionizable cationic lipid such as, e.g., dioctadecyldimethylammonium bromide (DDAB) ; 1, 2-dilinoleyloxy-3-dimethylaminopropane (DLinDMA) ; 2, 2-dilinoleyl-4- (2dimethylaminoethyl) - [1, 3] -dioxolane (DLin-KC2-DMA) ; heptatriaconta-6, 9, 28, 31-tetraen-19-yl 4- (dimethylamino) butanoate (DLin-MC3-DMA) ; 1, 2-dioleoyloxy-3-dimethylaminopropane (DODAP) ; 1, 2-dioleyloxy-3-dimethylaminopropane (DODMA) ; and morpholinocholesterol (Mo-CHOL) . In certain embodiments, a lipid nanoparticle includes a combination or two or more cationic lipids (e.g., two or more cationic lipids as above) .

[0151] Additionally, in some embodiments, the charged or ionizable lipid that can form part of the present nanoparticle composition is a lipid including a cyclic amine group. Additional cationic lipids that are suitable for the formulations and methods disclosed herein include those described in WO2015199952, WO2016176330, and WO2015011633, the entire contents of each of which are hereby incorporated by reference in their entireties. Additionally, in some embodiments, the charged or ionizable lipid that can form part of the present nanoparticle composition is a lipid including a cyclic amine group. Additional cationic lipids that are suitable for the formulations and methods disclosed herein include those described in WO2015199952, WO2016176330, and WO2015011633, the entire contents of each of which are hereby incorporated by reference in their entireties. ii. Phospholipid

[0152] In some embodiments, the LNP comprises a phospholipid. Exemplary phospholipids are described in US20180000953A1, the contents of which is incorporated by reference in its entirety. In some embodiments, the phospholipid may include one or more (poly) unsaturated lipids. In some embodiments, a phospholipid of the LNP includes a phospholipid moiety and one or more fatty acid moieties, one or more of which may be unsaturated. In some embodiments, the phospholipid moiety may be selected from the non-limiting group consisting of phosphatidyl choline, phosphatidyl ethanolamine, phosphatidyl glycerol, phosphatidyl serine, phosphatidic acid, 2-lysophosphatidyl choline, and a sphingomyelin. In some embodiments, the fatty acid moiety may be selected from the non-limiting group consisting of lauric acid, myristic acid, myristoleic acid, palmitic acid, palmitoleic acid, stearic acid, oleic acid, linoleic acid, alpha-linolenic acid, erucic acid, arachidic acid, arachidonic acid, phytanoic acid, eicosapentaenoic acid, behenic acid, docosapentaenoic acid, and docosahexaenoic acid. In some embodiments, the phospholipid is selected from the group consisting of 1, 2-dilinoleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DLPC) , 1, 2-dimyristoyl-sn-glycero-phosphocholine (DMPC) , 1, 2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) , 1, 2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC) , 1, 2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC) , 1, 2-diundecanoyl-sn-glycero-phosphocholine (DUPC) , 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC) , 1, 2-di-O-octadecenyl-sn-glycero-3-phosphocholine (18: 0 Diether PC) , 1-oleoyl-2-cholesterylhemisuccinoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (OChemsPC) , 1-hexadecyl-sn-glycero-3-phosphocholine (C16 Lyso PC) , 1, 2-dilinolenoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, 1, 2-diarachidonoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, 1, 2-didocosahexaenoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, 1, 2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) , 1, 2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (ME 16.0 PE) , 1, 2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, 1, 2-dilinoleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, 1, 2-dilinolenoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, 1, 2-diarachidonoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, 1, 2-didocosahexaenoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, 1, 2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-rac- (1-glycerol) sodium salt (DOPG) , and sphingomyelin, or a pharmaceutically acceptable salt thereof. Non-natural species including natural species with modifications and substitutions including branching, oxidation, cyclization, and alkynes are also contemplated. iii. Steroid

[0153] In some embodiments, the LNP comprises a steroid. In some embodiments, the steroid comprises a sterol. In some embodiments, the sterol is a structural lipid. In some embodiments, the sterol is cholesterol, fecosterol, sitosterol, campesterol, stigmasterol, brassicasterol, ergosterol, tomatidine, tomatine, ursolic acid, or alpha-tocopherol, or a pharmaceutically acceptable salt thereof. In some embodiments, the sterol is cholesterol. iv. Polymer conjugated lipid

[0154] In some embodiments, the LNP comprises one or more polymer conjugated lipids, such as PEGylated lipids (PEG lipids) . Without being bound by the theory, it is contemplated that a polymer conjugated lipid component in a nanoparticle composition can improve of colloidal stability and / or reduce protein absorption of the nanoparticles. Exemplary cationic lipids that can be used in connection with the present disclosure include but are not limited to PEG-modified phosphatidylethanolamines, PEG-modified phosphatidic acids, PEG-modified ceramides, PEG-modified dialkylamines, PEG-modified diacylglycerols, PEG-modified dialkylglycerols, and mixtures thereof. For example, a PEG lipid may be PEG-c-DOMG, PEG-DMG (for example DMG-PEG2000) , PEG-DLPE, PEG-DMPE, PEG-DPPC, PEG-DSPE, Ceramide-PEG2000, or Chol-PEG2000.

[0155] In some embodiments, the polymer conjugated lipid is a pegylated lipid. For example, some embodiments include a pegylated diacylglycerol (PEG-DAG) such as 1- (monomethoxy-polyethyleneglycol) -2, 3-dimyristoylglycerol (PEG-DMG) , a pegylated phosphatidylethanoloamine (PEG-PE) , a PEG succinate diacylglycerol (PEG-S-DAG) such as 4-O- (2’, 3’-di (tetradecanoyloxy) propyl-1-O- (ω-methoxy (polyethoxy) ethyl) butanedioate (PEG-S-DMG) , a pegylated ceramide (PEG-cer) , or a PEG dialkoxypropylcarbamate such as ω-methoxy (polyethoxy) ethyl-N- (2, 3-di (tetradecanoxy) propyl) carbamate or 2, 3-di (tetradecanoxy) propyl-N- (ω-methoxy (polyethoxy) ethyl) carbamate.

[0156] In some embodiments, the polymer conjugated lipid is present in a concentration ranging from 0.5 to 5 molar percent. In some embodiments, the polymer conjugated lipid is present in a concentration ranging from 1.0 to 2.5 molar percent. In one embodiment, the polymer conjugated lipid is present in a concentration of about 1.7 molar percent. In one embodiment, the polymer conjugated lipid is present in a concentration of about 1.5 molar percent.

[0157] In some embodiments, the molar ratio of cationic lipid to the polymer conjugated lipid ranges from about 35: 1 to about 25: 1. In one embodiment, the molar ratio of cationic lipid to polymer conjugated lipid ranges from about 100: 1 to about 20: 1.

[0158] In some embodiments, the molar ratio of cationic lipid to the polymer conjugated lipid ranges from about 35: 1 to about 25: 1. In one embodiment, the molar ratio of cationic lipid to polymer conjugated lipid ranges from about 100: 1 to about 20: 1.

[0159] In some embodiments, the pegylated lipid has the following Formula: or a pharmaceutically acceptable salt, tautomer or stereoisomer thereof, wherein: R12 and R13 are each independently a straight or branched, saturated or unsaturated alkyl chain containing from 10 to 30 carbon atoms, wherein the alkyl chain is optionally interrupted by one or more ester bonds; and w has a mean value ranging from 30 to 60.

[0160] In some embodiments, R12 and R13 are each independently straight, saturated alkyl chains containing from 12 to 16 carbon atoms. In other embodiments, the average w ranges from 42 to 55, for example, the average w is 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54 or 55. In some specific embodiments, the average w is about 49.

[0161] In some embodiments, the pegylated lipid has the following Formula: wherein the average w is about 49. Additional components

[0162] In some embodiments, the LNP may comprise one or more additional components. For example, the LNP may comprise one or more small hydrophobic molecules, such as a vitamin (e.g., vitamin A or vitamin E) , permeability enhancer molecules, carbohydrates (e.g., similar sugars or polysaccharides) , polymers, therapeutic agents, surface altering agents, or other components. In some embodiments, a polymer may be included in and / or used to encapsulate or partially encapsulate the LNP. A polymer may be biodegradable and / or biocompatible.

[0163] Therapeutic agents may include, but are not limited to, cytotoxic, chemotherapeutic, and other therapeutic agents. Cytotoxic agents may include, for example, taxol, cytochalasin B, gramicidin D, ethidium bromide, emetine, mitomycin, etoposide, teniposide, vincristine, vinblastine, colchicine, doxorubicin, daunorubicin, dihydroxyanthracinedione, mitoxantrone, mithramycin, actinomycin D, 1-dehydrotestosterone, glucocorticoids, procaine, tetracaine, lidocaine, propranolol, puromycin, maytansinoids, rachelmycin, and analogs thereof. Radioactive ions may also be used as therapeutic agents and may include, for example, radioactive iodine, strontium, phosphorous, palladium, cesium, iridium, cobalt, yttrium, samarium, and praseodymium. Other therapeutic agents may include, for example, antimetabolites (e.g., methotrexate, 6-mercaptopurine, 6-thioguanine, cytarabine, and 5-fluorouracil, and decarbazine) , alkylating agents (e.g., mechlorethamine, thiotepa, chlorambucil, rachelmycin, melphalan, carmustine, lomustine, cyclophosphamide, busulfan, dibromomannitol, streptozotocin, mitomycin C, and cis-dichlorodiamine platinum (II) (DDP) , and cisplatin) , anthracyclines (e.g., daunorubicin and doxorubicin) , antibiotics (e.g., dactinomycin, bleomycin, mithramycin, and anthramycin) , and anti-mitotic agents (e.g., vincristine, vinblastine, taxol, and maytansinoids) .

[0164] In some embodiments, the LNP comprises: i) a cationic lipid, which comprises or is a compound according to Formula (01-I) , Formula (01-I-B) , Formula (01-I-B’) , Formula (01-I-B”) , Formula (01-I-C) , Formula (01-I-D) or Formula (01-I-E) , or a compound listed in Table 01; or a compound according to Formula (02-I) or Formula (02-II) , or a compound listed in Table 02; or a compound according to Formula (03-I) , or a compound listed in Table 03; or a compound according to Formula (04-I) or Formula (04-III) , or a compound listed in Table 04; or a compound according to Formula (05-I) ; ii) a phospholipid; iii) a steroid; and iv) a polymer conjugated lipid. In some embodiments, the LNP comprises: i) Compound C1, Compound 03-15, Compound 04-92, Compound 04-86 or SM-102; ii) 1, 2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC) ; iii) cholesterol; and iv) DMG-PEG (for example DMG-PEG2000) .

[0165] Nanoparticle compositions may be characterized by a variety of methods. For example, microscopy (e.g., transmission electron microscopy or scanning electron microscopy) may be used to examine the morphology and size distribution of a nanoparticle composition. Dynamic light scattering or potentiometry (e.g., potentiometric titrations) may be used to measure zeta potentials. Dynamic light scattering may also be utilized to determine particle sizes. Instruments such as the Zetasizer Nano ZS (Malvem Instruments Ltd, Malvem, Worcestershire, UK) may also be used to measure multiple characteristics of a nanoparticle composition, such as particle size, polydispersity index, and zeta potential.

[0166] In various embodiments, the mean size of an LNP can be between 10s of nm and 100s of nm in diameter. For example, the LNP may have an average diameter in the range of from about 40 nm to about 150 nm, such as about 40 nm, 45 nm, 50 nm, 55 nm, 60 nm, 65 nm, 70 nm, 75 nm, 80 nm, 85 nm, 90 nm, 95 nm, 100 nm, 105 nm, 110 nm, 115 nm, 120 nm, 125 nm, 130 nm, 135 nm, 140 nm, 145 nm, or 150 nm. In some embodiments, the LNP has an average diameter in the range of from about 50 nm to about 100 nm, from about 50 nm to about 90 nm, from about 50 nm to about 80 nm, from about 50 nm to about 70 nm, from about 50 nm to about 60 nm, from about 60 nm to about 100 nm, from about 60 nm to about 90 nm, from about 60 nm to about 80 nm, from about 60 nm to about 70 nm, from about 70 nm to about 100 nm, from about 70 nm to about 90 nm, from about 70 nm to about 80 nm, from about 80 nm to about 100 nm, from about 80 nm to about 90 nm, or from about 90 nm to about 100 nm. In certain embodiments, the LNP has an average diameter in the range of from about 50 nm to about 100 nm.

[0167] A nanoparticle composition can be relatively homogenous. A polydispersity index (PDI) can be used to indicate the homogeneity of a nanoparticle composition, e.g., the particle size distribution of the nanoparticle compositions. A small (e.g., less than 0.3) polydispersity index generally indicates a narrow particle size distribution. A nanoparticle composition can have a polydispersity index from about 0 to about 0.25, such as 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.10, 0.11, 0.12, 0.13, 0.14, 0.15, 0.16, 0.17, 0.18, 0.19, 0.20, 0.21, 0.22, 0.23, 0.24, or 0.25. In some embodiments, the polydispersity index of a nanoparticle composition can be from about 0.10 to about 0.20.

[0168] The “zeta potential” of an LNP composition can be used to indicate the electrokinetic potential of the composition. For example, the zeta potential can describe the surface charge of an LNP composition. LNP compositions with relatively low charges, positive or negative, are generally desirable, as more highly charged species can interact undesirably with cells, tissues, and other elements in the body. In some embodiments, the zeta potential of a nanoparticle composition can be from about -10 mV to about +20 mV, from about -10 mV to about +15 mV, from about -10 mV to about +10 mV, from about -10 mV to about +5 mV, from about -10 mV to about 0 mV, from about -10 mV to about -5 mV, from about -5 mV to about +20 mV, from about -5 mV to about +15 mV, from about -5 mV to about +10 mV, from about -5 mV to about +5 mV, from about -5 mV to about 0 mV, from about 0 mV to about +20 mV, from about 0 mV to about +15 mV, from about 0 mV to about +10 mV, from about 0 mV to about +5 mV, from about +5 mV to about +20 mV, from about +5 mV to about +15 mV, or from about +5 mV to about +10 mV.Nucleic acids

[0169] According to some embodiments, the compositions of the present disclosure may be used for deliverying a nucleic acid into a host cell. According to some embodiments, a nucleic acid (e.g., mRNA) delivered by the LNP compositions of the present disclosure may have an increased expression in a host cell.

[0170] The nucleic acid suitable for use in the present invention may be a deoxyribonucleic acid (DNA) or a ribonucleic acid (RNA) , or a DNA / RNA hybrid. The nucleic acid may be single-stranded or double-stranted. The nucleic acid may be a naturally occurring or modified nucleic acid.

[0171] In some embodiments, the nucleic acid is a ribonucleic acid (RNA) . The type of the RNA that can be used is not limited, and can be selected as according to the purpose of use. For example, the RNA may be selected from self-amplyfing RNA (saRNA) , small interfering RNA (siRNA) , microRNA (miRNA) , small hairpin RNA (shRNA) , long non-coding RNA (lncRNA) , antisense RNA, messenger RNA (mRNA) , single-stranded RNA, Dicer-substrate RNA (dsRNA) , double-stranded RNA, circular RNA (cirRNA) , RNA replicon, transfer RNA (tRNA) , ribosomal RNA and the like. In some embodiments, the RNA is selected from an mRNA (for example, a personalized mRNA cancer vaccine) , an saRNA, an siRNA, an miRNA, a cirRNA, an shRNA and a lncRNA. In some embodiments, the nucleic acid is an mRNA.

[0172] In some particular embodiments, the nucleic acid encodes a polypeptide of interest (POI) . The POI encoded by the nucleic acid may be selected according to the purpose of use. In some embodiments, the POI has an activity of disease prophylaxis or treatment.

[0173] The nucleic acid used in the processes of the present disclosure may be provided as a nucleic acid solution or a lyophilized nucleic acid composition.Compositions comprising empty LNPs and nucleic acids

[0174] In one aspect, provided is a liquid composition or a lyophilized composition thereof, wherein the liquid composition comprises an empty lipid nanoparticle (LNP) and a nucleic acid and has a pH of about 6.5 to about 8.6, wherein the empty LNP comprises a cationic lipid.

[0175] The composition comprising an empty LNP and a nucleic acid provided herein may be referred to as a “pre-encapsulation formulation” . The pre-encapsulation formulation of the present disclosure may be a liquid composition or a lyophilized composition prepared from the liquid composition by the process of lyophilization. The lipid nanoparticles in the pre-encapsulation formulation of the present disclosure are not efficiently “loaded” (or electrostatically complexed) with a nucleic acid. In some embodiments, the encapsulation efficiency of the nucleic acid in the pre-encapsulation formulation (e.g., the liquid composition) of the present disclosure is less than 20%, for example, less than than less than 19%, less than 18%, less than 17%, less than 16%, preferably less than 15%, less than 14%, less than 13%, less than 12%, or less than 11%, more preferably less than 10%, less than 9%, less than 8%, less than 7%or less than 6%, and most preferably less than 5%, less than 4%, less than 3%, less than 2%, less than 1%, or less than 0. As described herein, the pH of pre-encapsulation formulation (e.g., the liquid composition) of the present disclosure may be adjusted to a pH suitable for encapsulation of the nucleic acid by the LNP to prepare a post-encapsulation formulation having a nucleic acid encapsulation efficiency of at least 80%.

[0176] The liquid composition may be a buffered composition comprising any suitable buffer, provided that the empty LNP is stable. Preferably, the liquid composition is a buffered composition which comprises a buffer capable of maintaining a neutral pH, for example a pH of about 6.5 to about 8.6.

[0177] In some embodiments, the liquid composition comprises a first buffer. In some embodiments, the first buffer is capable of maintaining a pH of about 6.5 to about 8.6. In some embodiments, the first buffer is capable of maintaining a pH of about 6.5 to about 8.5. In some embodiments, the first buffer is selected from a Tris buffer (for example, Tris-HCl buffer) , a phosphate buffer, a PIPES buffer, an ADA buffer, an ACES buffer, an acetate buffer, a citrate buffer, a DIPSO buffer, a BES buffer, an MOPSO buffer, an MOPS buffer, a HEPBS buffer, a HEPPSO buffer, a HEPES buffer, a TAPSO buffer, a TEA buffer, a TES buffer, a Tricine buffer and a combination thereof. In a particular embodiment, the first buffer comprises a Tris-HCl buffer.

[0178] In some embodiments, the liquid composition (or the first buffer) has a pH of about 6.5 to about 8.6, for example, about 6.5 to about 8.5. For example, the liquid composition (or the first buffer) may have a pH of about 6.5, about 6.6, about 6.7, about 6.8, about 6.9, about 7.0, about 7.1, about 7.2, about 7.3, about 7.4, about 7.5, about 7.6, about 7.7, about 7.8, about 7.9, about 8.0, about 8.1, about 8.2, about 8.3, about 8.4, about 8.5 or about 8.6, or a range constituted by any two of the stated values. In some embodiments, the liquid composition (or the first buffer) has a pH of about 6.5 to about 8.5, about 6.5 to about 8.25, about 6.5 to about 8.0, about 6.5 to about 7.75, about 6.5 to about 7.5, about 6.5 to about 7.25, about 6.5 to about 7.0, about 6.5 to about 7.25, about 6.5 to about 7.0, or about 6.5 to about 6.75. In some embodiments, the liquid composition (or the first buffer) has a pH of about 6.75 to about 8.6, about 6.75 to about 8.5, about 6.75 to about 8.25, about 6.75 to about 8.0, about 6.75 to about 7.75, about 6.75 to about 7.5, about 6.75 to about 7.25, or about 6.75 to about 7.0. In some embodiments, the liquid composition (or the first buffer) has a pH of about 7.0 to about 8.6, about 7.0 to about 8.5, about 7.0 to about 8.25, about 7.0 to about 8.0, about 7.0 to about 7.75, about 7.0 to about 7.5, or about 7.0 to about 7.25. In some embodiments, the liquid composition (or the first buffer) has a pH of about 7.25 to about 8.6, about 7.25 to about 8.5, about 7.25 to about 8.25, about 7.25 to about 8.0, about 7.25 to about 7.75, or about 7.25 to about 7.5. In some embodiments, the liquid composition (or the first buffer) has a pH of about 7.5 to about 8.6, about 7.5 to about 8.5, about 7.5 to about 8.25, about 7.5 to about 8.0, or about 7.5 to about 7.75. In some embodiments, the liquid composition (or the first buffer) has a pH of about 7.75 to about 8.6, about 7.75 to about 8.5, about 7.75 to about 8.25, or about 7.75 to about 8.0. In some embodiments, the liquid composition (or the first buffer) has a pH of about 8.0 to about 8.6, about 8.0 to about 8.5, about 8.0 to about 8.25, or about 8.25 to about 8.5. In a particular embodiment, the liquid composition (or the first buffer) has a pH of about 7.5. In some embodiments, the liquid composition (or the first buffer) comprises a Tris-HCl buffer and has a pH of about 7.5. In some other embodiments, the liquid composition (or the first buffer) comprises a phosphate (for example, K2HPO4 / KH2PO4) buffer and has a pH of about 7.5.

[0179] In some embodiments, the liquid composition (or the first buffer) has a buffer concentration of about 1 mM to about 100 mM, about 1 mM to about 90 mM, about 1 mM to about 80 mM, about 1 mM to about 70 mM, about 1 mM to about 60 mM, about 1 mM to about 50 mM, about 5 mM to about 50 mM, about 10 to about 40 mM, about 10 to about 30 mM, about 5 to about 25 mM, for example, 5 mM, 10 mM, 15 mM, 20 mM or 25 mM. In some embodiments, the liquid composition (or the first buffer) comprises about 5 mM to about 25 mM Tris-HCl and has a pH of about 7.5. In some other embodiments, the liquid composition (or the first buffer) comprises about 2 mM to about 10 mM potassium phosphate (K2HPO4 / KH2PO4) buffer and has a pH of about 7.5.

[0180] In some embodiments, the liquid composition or the lyophilized composition further comprises a cryoprotectant as described herein. In some embodiments, the cryoprotectant comprises at least one selected from polyethylene glycol (PEG) , dextran, glycerol, glucose, trehalose, sucrose and a combination thereof. In a particular embodiment, the cryoprotectant comprises sucrose.

[0181] In some embodiments, the liquid composition comprises 2%to 20%w / v sucrose. In some embodiments, the liquid composition comprises 5%to 20%w / v sucrose. In some embodiments, the liquid composition comprises 5%to 15%w / v sucrose. In preferable embodiments, the liquid composition comprises 5%to 10%w / v sucrose.

[0182] In some embodiments, the empty LNP comprises: (i) the cationic lipid as described herein, (ii) a phospholipid, (iii) a steroid, and (iv) a polymer conjugated lipid. In some embodiments, the cationic lipid comprises or is a compound according to Formula (01-I) , Formula (01-I-B) , Formula (01-I-B’) , Formula (01-I-B”) , Formula (01-I-C) , Formula (01-I-D) or Formula (01-I-E) , or a compound listed in Table 01; or a compound according to Formula (02-I) or Formula (02-II) , or a compound listed in Table 02; or a compound according to Formula (03-I) , or a compound listed in Table 03; or a compound according to Formula (04-I) or Formula (04-III) , or a compound listed in Table 04; or a compound according to Formula (05-I) . In some embodiments, the cationic lipid is Compound C1, Compound 03-15, Compound 04-92, Compound 04-86 or SM-102. In some embodiment, the phospholipid is 1, 2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC) . In some embodiment, the steroid is cholesterol. In some embodiment, the polymer conjugated lipid is DMG-PEG2000. In some embodiments, the LNP comprises: i) Compound C1, Compound 03-15, Compound 04-92, Compound 04-86 or SM-102; ii) 1, 2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC) ; iii) cholesterol; and iv) DMG-PEG2000.

[0183] The nucleic acid may present in the liquid composition in various concentrations. In some embodiments, the concentration of the the nucleic acid in the liquid composition is about 0.01 to about 1 mg / mL.

[0184] In some embodiments, the liquid composition or lyophilized composition of the present disclosure has a nitrogen to phosphate ratio (i.e., N / P ratio, where N represents the moles of cationic lipid and P represents the moles of phosphate present as part of the nucleic acid backbone) of about 1.1: 1 to about 30: 1. For example, the N / P ratio may be about 1.5: 1 to about 25: 1, about 3: 1 to about 22: 1, about 5: 1 to about 20: 1, or about 2: 1 to about 12: 1. Exemplary N / P ratios include but not limited to about 1.5: 1, about 1.8: 1, about 2: 1, about 2.5: 1, about 2.8: 1, about 3: 1, about 3.5: 1, about 3.8: 1, about 4: 1, about 4.5: 1, about 4.8: 1, about 5: 1, about 6: 1, about 10: 1, about 12: 1 and about 22: 1. In some embodiments, the N / P ratio is about 1.5: 1 to about 10: 1, about 1.5: 1 to about 8: 1, about 1.5: 1 to about 6: 1, about 1.5: 1 to about 4: 1, about 2: 1 to about 10: 1, about 2: 1 to about 8: 1, about 2: 1 to about 6: 1, or about 2: 1 to about 4: 1.Processes of preparing compositions comprising empty LNPs and nucleic acids

[0185] In another aspect, provided is a process of preparing the liquid composition of the present disclosure, the process comprising: (a) providing an LNP composition comprising the empty LNP; and (b) combining the LNP composition with the nucleic acid at a pH of about 6.5 to about 8.6, thereby forming the liquid composition.

[0186] In some embodiments, step (a) comprises: mixing (i) a lipid solution comprising the cationic lipid and optionally an organic solvent with (ii) an aqueous solution, thereby forming the LNP composition.

[0187] In some embodiments, the LNP composition has a pH of about 6.5 to about 8.6. In some embodiments, the LNP composition has a pH of about 6.5 to about 8.5. For example, the LNP composition may have a pH of about 6.5, about 6.6, about 6.7, about 6.8, about 6.9, about 7.0, about 7.1, about 7.2, about 7.3, about 7.4, about 7.5, about 7.6, about 7.7, about 7.8, about 7.9, about 8.0, about 8.1, about 8.2, about 8.3, about 8.4, about 8.5 or about 8.6, or a range constituted by any two of the stated values. In some embodiments, the LNP composition comprises a second buffer capable of maintaining a pH of about 6.5 to about 8.5. In some preferable embodiments, the second buffer is selected from a Tris buffer, a phosphate buffer, a PIPES buffer, an ADA buffer, an ACES buffer, an acetate buffer, a citrate buffer, a DIPSO buffer, a BES buffer, an MOPSO buffer, an MOPS buffer, a HEPBS buffer, a HEPPSO buffer, a HEPES buffer, a TAPSO buffer, a TEA buffer, a TES buffer, a Tricine buffer and a combination thereof. In some embodiments, the second buffer is substantially the same as the first buffer.

[0188] Step (b) may be carried out at a neutral pH which is unfavorable for encapsulation of the nucleic acid by the empty LNP. For example, the combining may be carreid out at a pH of about 6.5, about 6.6, about 6.7, about 6.8, about 6.9, about 7.0, about 7.1, about 7.2, about 7.3, about 7.4, about 7.5, about 7.6, about 7.7, about 7.8, about 7.9, about 8.0, about 8.1, about 8.2, about 8.3, about 8.4, about 8.5 or about 8.6, or a range constituted by any two of the stated values. In some embodiments, the combining is carried out at a pH of about 6.5 to about 8.6. In some embodiments, the combining is carried out at a pH of about 6.5 to about 8.5, about 6.5 to about 8.25, about 6.5 to about 8.0, about 6.5 to about 7.75, about 6.5 to about 7.5, about 6.5 to about 7.25, about 6.5 to about 7.0, about 6.5 to about 7.25, about 6.5 to about 7.0, or about 6.5 to about 6.75. In some embodiments, the combining is carried out at a pH of about 6.75 to about 8.6, about 6.75 to about 8.5, about 6.75 to about 8.25, about 6.75 to about 8.0, about 6.75 to about 7.75, about 6.75 to about 7.5, about 6.75 to about 7.25, or about 6.75 to about 7.0. In some embodiments, the combining is carried out at a pH of about 7.0 to about 8.6, about 7.0 to about 8.5, about 7.0 to about 8.25, about 7.0 to about 8.0, about 7.0 to about 7.75, about 7.0 to about 7.5, or about 7.0 to about 7.25. In some embodiments, the combining is carried out at a pH of about 7.25 to about 8.6, about 7.25 to about 8.5, about 7.25 to about 8.25, about 7.25 to about 8.0, about 7.25 to about 7.75, or about 7.25 to about 7.5. In some embodiments, the combining is carried out at a pH of about 7.5 to about 8.6, about 7.5 to about 8.5, about 7.5 to about 8.25, about 7.5 to about 8.0, or about 7.5 to about 7.75. In some embodiments, the combining is carried out at a pH of about 7.75 to about 8.6, about 7.75 to about 8.5, about 7.75 to about 8.25, or about 7.75 to about 8.0. In some embodiments, the combining is carried out at a pH of about 8.0 to about 8.6, about 8.0 to about 8.5, about 8.0 to about 8.25, or about 8.25 to about 8.5. In a particular embodiment, the combining is carried out at a pH of about 7.5.

[0189] In some embodiments, the process of preparing the liquid composition of the present disclosure does not comprise a step of pH adjusting. This may be achieved by providing a buffering agent in the lipid solution and / or the aqueous solution and / or a nucleic acid solution comprising the nucleic acid, such that the resulting liquid composition has a pH of about 6.5 to about 8.6. For example, both the LNP composition and the nucleic acid solution has a pH of about 6.5 to about 8.6. Preferably, both the LNP composition and the nucleic acid solution has a pH of about 7.0 to about 8.6.

[0190] In some embodiments, the process comprises a step of pH adjusting.

[0191] In some embodiments, step (a) comprises: mixing (i) a lipid solution comprising the cationic lipid and optionally an organic solvent with (ii) an aqueous solution, thereby forming an LNP solution comprising the empty LNP; and adjusting the pH of the LNP solution to about 6.5 to about 8.5, thereby forming the the LNP composition.

[0192] Varies kinds of methods of pH adjusting known in the art may be used. For example, the pH of the LNP solution may be adjusted with a buffer capable of maintaining a neutral pH by methods of buffer exchanging (for example, dialysis and ultrafiltration) and / or dilution.

[0193] In some embodiments, the adjusting the pH of the LNP solution is performed by buffer exchanging. In some embodiments, the adjusting the pH of the LNP solution is performed concurrently with adding a cryoprotectant to the LNP solution and / or removing an organic solvent from the LNP solution. In some embodiments, the buffer exchanging adjusts the pH of the LNP solution to about 6.5 to about 8.6. In some embodiments, the buffer exchanging adjusts the pH of the LNP solution to about 6.5 to about 8.5. In some embodiments, the buffer exchanging adds a cryoprotectant into the LNP solution. In some embodiments, the buffer exchanging removes an organic solvent from the LNP solution. The buffer exchanging may be performed by any method known in the art, for example, dialyzing, tangential flow filtration (TFF) or desalting (for example, by using a PD-10 desalting column) . The buffer exchanging may be performed by using a buffer capable of maintaining a neutral pH, for example, a buffer selected from a Tris buffer (for example, Tris-HCl buffer) , a phosphate buffer, a PIPES buffer, an ADA buffer, an ACES buffer, an acetate buffer, a citrate buffer, a DIPSO buffer, a BES buffer, an MOPSO buffer, an MOPS buffer, a HEPBS buffer, a HEPPSO buffer, a HEPES buffer, a TAPSO buffer, a TEA buffer, a TES buffer, a Tricine buffer and a combination thereof.

[0194] In some embodiments, the buffer exchanging is performed by using a third buffer capable of maintaining a pH of about 6.5 to about 8.6. In some embodiments, the buffer exchanging is performed by using a third buffer capable of maintaining a pH of about 6.5 to about 8.5. For example, the buffer exchanging may be performed by using a third buffer capable of maintaining a pH of about about 6.5, about 6.6, about 6.7, about 6.8, about 6.9, about 7.0, about 7.1, about 7.2, about 7.3, about 7.4, about 7.5, about 7.6, about 7.7, about 7.8, about 7.9, about 8.0, about 8.1, about 8.2, about 8.3, about 8.4, about 8.5 or about 8.6, or a range constituted by any two of the stated values. In some embodiments, the adjusting the pH of the LNP solution is performed with a third buffer having a pH of about 6.5 to about 8.6, for example, a pH of about 6.5 to about 8.5, which is selected from a Tris buffer (for example, Tris-HCl buffer) , a phosphate buffer, a PIPES buffer, an ADA buffer, an ACES buffer, an acetate buffer, a citrate buffer, a DIPSO buffer, a BES buffer, an MOPSO buffer, an MOPS buffer, a HEPBS buffer, a HEPPSO buffer, a HEPES buffer, a TAPSO buffer, a TEA buffer, a TES buffer, a Tricine buffer and a combination thereof. In a particular embodiment, the adjusting the pH of the LNP solution is performed by dialyzing the LNP solution using a Tris-HCl buffer having a pH of about 6.5 to about 8.6, for example, a pH of about 6.5 to about 8.5, preferably a pH of about 7.5. In a particular embodiment, the adjusting the pH of the LNP solution is performed by dialyzing the LNP solution using a Tris-HCl buffer having a pH of about 6.5 to about 8.6, for example, a pH of about 6.5 to about 8.5, preferably a pH of about 7.5. In another particle embodiment, the adjusting the pH of the LNP solution is performed by dialyzing the LNP solution using a phosphate buffer having a pH of about 6.5 to about 8.6, for example, a pH of about 6.5 to about 8.5, preferably a pH of 7.5. In some embodiments, the third buffer is the same as the first buffer. In some embodiments, the third buffer comprises a cryoprotectant, for example sucrose.

[0195] In some embodiments, step (a) further comprises processing the LNP composition. In some embodiments, the processing comprises at least one step selected from filtering, buffer exchanging, diluting, dialyzing, concentrating, adding a cryoprotectant, and packing. In some embodiments, the processing removes an organic solvent. In some embodiments, the LNP composition is substantially free of an organic solvent.

[0196] In some embodiments, the lipid solution further comprises an organic solvent. In some embodiments, the organic solvent is an alcohol, for example ethanol. In some embodiments, the processing comprises removing the organic solvent. The organic solvent may be removed anytime after formation of the empty LNP using any method known in the art. In some embodiments, the removing the organic solvent is performed by buffer exchanging, for example, by dialysis. In some embodiments, the removing the organic solvent is performed before the pH adjusting. In some embodiments, the removing the organic solvent is performed after the pH adjusting. In some embodiments, the removing the organic solvent is performed at the same time as the pH adjusting.

[0197] In some embodiments, the nucleic acid is an mRNA. Accordingly, in a particular aspect, provided is a process of preparing a liquid composition comprising an empty lipid nanoparticle (LNP) and an mRNA ( “mRNA-eLNP composition” ) , wherein the empty LNP comprises a cationic lipid, the process comprising: in vitro transcribing a DNA template to produce the mRNA, digesting the DNA template to obtain a crude mRNA mixture, subjecting the crude mRNA mixture to chromatographic purification, subjecting the purified mRNA to filtration sterilization, thereby obtaining an mRNA solution comprising the mRNA, and combining the mRNA solution with an LNP solution comprising the empty LNP at a pH of about 6.5 to about 8.6, thereby forming the liquid composition.

[0198] In some embodiments, the process of preparing the mRNA-eLNP composition of the present disclosure further comprises exchanging the buffer and / or adjusting the concentration of the purified mRNA before the filtration sterilization. In some embodiments, the exchanging the buffer and adjusting the concentration is performed by ultrafiltration and diafiltration (UF / DF) . In some embodiments, the chromatographic purification comprises affinity chromatography. In some embodiments, the mRNA is a personalized mRNA cancer vaccine. In some embodiments, the combining is performed in the formulation module (1) as described for the apparatus for preparing the liquid composition of the present disclosure. Lipid solution

[0199] In some embodiments, the processes of the present disclosure provide a lipid solution. In some embodiments, the lipid solution comprises a cationic lipid.

[0200] In some embodiments, the lipid solution comprises a phospholipid.

[0201] In some embodiments, the lipid solution comprises a steroid.

[0202] In some embodiments, the lipid solution comprises a polymer conjugated lipid.

[0203] In some particular embodiments, the lipid solution comprises a cationic lipid, a phospholipid, a steroid and a polymer conjugated lipid.

[0204] In some embodiments, the lipid solution comprises a total lipid concentration of about 1 mM to about 20 mM, for example, about 2 mM to about 15 mM, about 3 mM to about 12 mM, or about 5 mM to about 10 mM.

[0205] The lipid solution may further comprises a buffering agent and / or a salt.

[0206] In some embodiments, the lipid solution comprises a buffer capable of maintaining a pH of about 6.5 to about 8.6, for example, a pH of about 6.5 to about 8.5. In some embodiments, the buffer is selected from a Tris buffer, a phosphate buffer, a PIPES buffer, an ADA buffer, an ACES buffer, a citrate buffer, a DIPSO buffer, a BES buffer, an MOPSO buffer, an MOPS buffer, a HEPBS buffer, a HEPPSO buffer, a HEPES buffer, a TAPSO buffer, a TES buffer, a Tricine buffer and a combination thereof.

[0207] In some embodiments, the lipid solution further comprieses an organic sovlent. In some embodiments, the organic solvent is an alchol. In a particlar embodiment, the organic solvent is ethanol. Aqueous solution

[0208] The aqueous solution may be any aqueous solution suitable for mixing with the lipid solution to form the empty LNPs. In some embodiments, the aqueous solution is water. In some embodiments, the aqueous solution may further comprise a buffering agent and / or a salt.

[0209] The aqueous solution may have a pH in a suitable range, for example, a pH of about 3.0 to about 9.0, provided that stable empty LNPs are formed. In some embodiments, the aqueous solution comprises a buffer capable of maintaining a pH of about 6.5 to about 8.6, for example, about 6.5 to about 8.5. In some embodiments, the buffer is selected from a Tris buffer, a phosphate buffer, a PIPES buffer, an ADA buffer, an ACES buffer, a citrate buffer, a DIPSO buffer, a BES buffer, an MOPSO buffer, an MOPS buffer, a HEPBS buffer, a HEPPSO buffer, a HEPES buffer, a TAPSO buffer, a TES buffer, a Tricine buffer and a combination thereof.

[0210] In some embodiments, the aqueous solution comprises 1-20 mM citrate buffer and has a pH of about 3.0 to about 6.5. In some embodiments, the aqueous solution comprises 1-20 mM Tris-HCl buffer and has a pH of about 7.0 to about 8.5. Lyophilized compositions comprising empty LNPs and nucleic acids

[0211] In yet another aspect, provided is a process of preparing a lyophilized composition, comprising lyophilizing the liquid composition of the present disclosure in the presence of a cryoprotectant. The cryoprotectant may be added into an exchanging buffer, for example, in the second buffer as described above.

[0212] In some embodiments, the cryoprotectant comprises at least one selected from polyethylene glycol (PEG) , dextran, glycerol, glucose, trehalose, sucrose and a combination thereof. In some embodiments, the cryoprotectant comprises sucrose. In some embodiments, the liquid composition comprises 2%to 20%w / v sucrose. In some embodiments, the liquid composition comprises 5%to 20%w / v sucrose. In some embodiments, the liquid composition comprises 5%to 15%w / v sucrose. In preferable embodiments, the liquid composition comprises 5%to 10%w / v sucrose.

[0213] In some embodiments, the lyophilization is carried out in a suitable glass receptacle (e.g., a type I glass vial) . In some embodiment, the step of lyophilizing comprises freezing the liquid composition at a temperature of about -40℃ to about -60℃, thereby forming a frozon composition; and drying the frozen composition to form the lyophilized composition. In some embodiments, the drying step is performed at a vacuum ranging from about 20 mTorr to about 100 mTorr. In some embodiments, the drying step comprises a first cycle of drying at a low temperature of about -25℃ to -35℃, and a second cycle of drying at a higher temperature at about 5℃ to 25℃.Apparatuses for preparing compositions comprising empty LNPs and nucleic acids

[0214] In yet another aspect, provided is an apparatus for preparing a iquid composition comprising an empty lipid nanoparticle (LNP) and a nucleic acid, the apparatus comprising a formulation module 1 configured to combine a nucleic acid solution comprising the nucleic acid with an LNP solution comprising the empty LNP and optionally a cryoprotectant, at a pH of about 6.5 to about 8.6, thereby forming the liquid composition.

[0215] In the following, exemplary embodiments of the apparatus are described by referring to Figure 19.

[0216] In some embodiments, the formulation module 1 comprises a first feeding unit 2 for providing the nucleic acid solution, a second feeding unit 3 for providing the LNP solution, and a first mixing channel 4 in fluid communication with the first feeding unit 2 and the second feeding unit 3, wherein the first feeding unit 2 and the second feeding unit 3 are configured to mix the nucleic acid solution and the LNP solution in the first mixing channel 4, thereby forming the liquid composition.

[0217] In some embodiments, the first feeding unit 2 comprises a first reservoir 5 connected to a first feeding channel 6 via a first pumping device 15, the second feeding unit 3 comprises a second reservoir 7 connected to a second feeding channel 8 via a second pumping device 16, wherein the first feeding channel 6 and the second feeding channel 8 are in fluid communication with the first mixing channel 4.

[0218] In some embodiments, the formulation module 1 further comprises a third feeding unit 9, and a second mixing channel 10 in fluid communication with the third feeding unit 9 and the first mixing channel 4, wherein the third feeding unit 9 is configured to provide a storage buffer for the lipid composition.

[0219] In some embodiments, the third feeding unit 9 comprises a third reservoir 11 connected to a third feeding channel 12 via a third pumping device 17, and the third feeding channel 12 is in fluid communication with the first mixing channel 4 and the second mixing channel 10.

[0220] In some embodiments, the apparatus further comprises a storage unit 13 for storing the liquid composition and a waste collection unit 14, wherein the storage unit 13 and the waste collection unit 14 are in fluid communication with the formulation module 1.

[0221] In some embodiments, each of the units is configured for single use.

[0222] In some embodiments, the nucleic acid is an mRNA, optionally a personalized mRNA cancer vaccine.Processes of preparing LNP formulations

[0223] In a further aspect, provided is a process of preparing a lipid nanoparticle (LNP) formulation, the process comprising: adjusting the pH of the liquid composition of the present disclosure to a pH suitable for encapsulation of the nucleic acid by the LNP, thereby forming the LNP formulation; or reconstituting the lyophilized composition of the present disclosure at a pH suitable for encapsulation of the nucleic acid by the LNP, thereby forming the LNP formulation.

[0224] The LNP formulation provided herein may be referred to as a “post-encapsulation formulation” . In some embodiments, the encapsulation efficiency of the nucleic acid in the post-encapsulation formulation preprared by the process of the present disclosure is at least 80%, preferably at least 85%, more preferably at least 90%, most preferably at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%or at least 100%. In some embodiments, the LNP formulation is a pharmaceutical composition.

[0225] The encapsulation may be carried at a pH suitable for encapsulating the nucleic acid. In some embodiments, the pH suitable for encapsulation of the nucleic acid by the LNP is about 4.25 to about 6.5, for example, about 4.5, about 4.6, about 4.7, about 4.8, about 4.9, about 5.0, about 5.1, about 5.2, about 5.3, about 5.4, about 5.5, about 5.6, about 5.7, about 5.8, about 5.9, about 6.0, about 6.1, about 6.2, about 6.3, about 6.4 or about 6.5, or a range constituted by any two of the stated values. In some embodiments, the pH suitable for encapsulation of the nucleic acid by the LNP is about 4.25 to about 6.5, about 4.25 to about 6.25, about 4.25 to about 6.0, about 4.25 to about 5.75, about 4.25 to about 5.5, about 4.25 to about 5.25, about 4.25 to about 5.0, about 4.25 to about 4.75, or about 4.25 to about 4.5. In some embodiments, the pH suitable for encapsulation is about 4.5 to about 6.25, about 4.5 to about 6.0, about 4.5 to about 5.75, about 4.5 to about 5.5, about 4.5 to about 5.25, about 4.5 to about 5.0, or about 4.5 to about 4.75. In some embodiments, the pH suitable for encapsulation is about 4.75 to about 6.5, about 4.75 to about 6.25, about 4.75 to about 6.0, about 4.75 to about 5.75, about 4.75 to about 5.5, about 4.75 to about 5.25, or about 4.75 to about 5.0. In some embodiments, the pH suitable for encapsulation is about 5.0 to about 6.5, about 5.0 to about 6.25, about 5.0 to about 6.0, about 5.0 to about 5.75, about 5.0 to about 5.5, or about 5.0 to about 5.25. In some embodiments, the pH suitable for encapsulation is about 5.25 to about 6.5, about 5.25 to about 6.25, about 5.25 to about 6.0, about 5.25 to about 5.75, or about 5.3 to about 5.8, or about 5.25 to about 5.5, or about 5.3 to about 5.5. In some embodiments, the pH suitable for encapsulation is about 5.5 to about 6.5, about 5.5 to about 6.25, about 5.5 to about 6.0, or about 5.5 to about 5.75. In some embodiments, the pH suitable for encapsulation is about 5.75 to about 6.5, about 6.0 to about 6.5, or about 6.25 to about 6.5. In some embodiments, the pH suitable for encapsulation is about 6.0 to about 6.5, or about 6.25 to about 6.5. In some embodiments, the pH suitable for encapsulation is about 4.25 to about 6.5, about 4.5 to about 6.0, or about 4.8 to about 6.0. In some embodiments, the pH suitable for encapsulation is about 5.0 to about 6.0. In some embodiments, the pH suitable for encapsulation is about 5.1 to about 5.9. In some preferable embodiments, the pH suitable for encapsulation is about 5.2, about 5.3, about 5.4, about 5.5, about 5.6, about 5.7, or about 5.8. In a particular embodiment, the pH suitable for encapsulation is about 5.9.

[0226] In some embodiments, the adjusting the pH of the liquid composition or the reconstituting the lyophilized composition is performed by using an acidic buffer.

[0227] The term “acidic buffer” as used herein refers to a buffer having a pH of less than 7.0. An acidic buffer may contain any buffering agent or mixture of buffering agents that can neutralize alkaline compounds. Those skilled in the art will appreciate that the pH, type of buffering agent, buffer concentration and volume of the acid buffer may vary. Those skilled in the art can easily determine these factors for the acidic buffer based on the pH, buffering agent, buffer concentration and volume of the liquid composition. In some embodiments, the acidic buffer used for reconstituting the lyophilized composition substantially restores the LNP concentration to that of the liquid composition.

[0228] The acidic buffer may have a pH of less than 7.0, for example, a pH of about 1.0 to below 6.5, in particular about 2.0 to below 6.0. In preferable embodiments, the acidic buffer has a pH of about 2.0 to about 6.0, about 2.1, about 2.2, about 2.3, about 2.4, about 2.5, about 2.6, about 2.7, about 2.8, about 2.9, about 3.0, about 3.1, about 3.2, about 3.3, about 3.4, about 3.5, about 3.6, about 3.7, about 3.8, about 3.9, about 4.0, about 4.1, about 4.2, about 4.3, about 4.4, about 4.5, about 4.6, about 4.7, about 4.8, about 4.9, about 5.0, about 5.1, about 5.2, about 5.3, about 5.4, about 5.5, about 5.6, about 5.7, about 5.8, about 5.9, or about 6.0. In some embodiments, the acidic buffer has a pH of about 2.0 to about 5.5. In some embodiments, the acidic buffer is capable of maintaining a pH of about 2.0 to about 5.5. In some embodiments, the acidic buffer is capable of maintaining a pH of about 2.5 to about 5.5, about 3.0 to about 5.5, about 3.0 to about 5.0, about 3.0 to about 4.5, or about 3.0 to about 4.0.

[0229] In some embodiments, the acidic buffer is selected from a citrate buffer, a maleic acid buffer, an acetate buffer, an MES (2-Morpholinoethanesulphonic acid) buffer, a phosphate buffer, a malic acid buffer, a tartaric acid buffer, a succinic acid buffer, and a combination thereof.

[0230] In some embodiments, the acidic buffer has a buffer concentration of about 1 mM to about 20 mM, for example, about 1 mM to about 15 mM, about 2 mM to about 10 mM, or about 3 mM to about 10 mM, for example, 4 mM, 5 mM, 6 mM, 7 mM, 8 mM, 9 mM or 10 mM. In some embodiments, the acidic buffer comprises 1-10 mM (e.g., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 mM) citrate buffer and has a pH of about 3.0 to about 4.0.

[0231] In some embodiments, the process of reconstituting of the lyophilized composition of the present disclosure does not comprise a step of pH adjusting. This may be achieved by, for example, controlling the buffering abilities of the lyophilized composition and the acidic buffer, such that the reconstitution results in the encapsulation of the nucleic acid by the LNP, for example, the reconstitution results in the formation of an LNP formulation having a pH of about 4.25 to about 6.5, for example, about 4.5, about 4.6, about 4.7, about 4.8, about 4.9, about 5.0, about 5.1, about 5.2, about 5.3, about 5.4, about 5.5, about 5.6, about 5.7, about 5.8, about 5.9, about 6.0, about 6.1, about 6.2, about 6.3, about 6.4 or about 6.5, or a range constituted by any two of the stated values. The LNP formulation prepared by reconstituting the lypophilized composition of the present disclosure may be directly administered to a subject in need thereof, for example, through injection, such as intramuscular injection.

[0232] In some embodiments, the LNP formulation has a pH of about 4.25 to about 6.5, about 4.25 to about 6.25, about 4.25 to about 6.0, about 4.25 to about 5.75, about 4.25 to about 5.5, about 4.25 to about 5.25, about 4.25 to about 5.0, about 4.25 to about 4.75, or about 4.25 to about 4.5. In some embodiments, the LNP formulation has a pH of about 4.5 to about 6.25, about 4.5 to about 6.0, about 4.5 to about 5.75, about 4.5 to about 5.5, about 4.5 to about 5.25, about 4.5 to about 5.0, or about 4.5 to about 4.75. In some embodiments, the LNP formulation has a pH of about 4.75 to about 6.5, about 4.75 to about 6.25, about 4.75 to about 6.0, about 4.75 to about 5.75, about 4.75 to about 5.5, about 4.75 to about 5.25, or about 4.75 to about 5.0. In some embodiments, the LNP formulation has a pH of about 5.0 to about 6.5, about 5.0 to about 6.25, about 5.0 to about 6.0, about 5.0 to about 5.75, about 5.0 to about 5.5, or about 5.0 to about 5.25. In some embodiments, the LNP formulation has a pH of about 5.25 to about 6.5, about 5.25 to about 6.25, about 5.25 to about 6.0, about 5.25 to about 5.75, or about 5.3 to about 5.8, or about 5.25 to about 5.5, or about 5.3 to about 5.5. In some embodiments, the LNP formulation has a pH of about 5.5 to about 6.5, about 5.5 to about 6.25, about 5.5 to about 6.0, or about 5.5 to about 5.75. In some embodiments, the LNP formulation has a pH of about 5.75 to about 6.5, about 6.0 to about 6.5, or about 6.25 to about 6.5. In some embodiments, the LNP formulation has a pH of about 6.0 to about 6.5, or about 6.25 to about 6.5. In some embodiments, the LNP formulation has a pH of about 4.25 to about 6.5, about 4.5 to about 6.0, or about 4.8 to about 6.0. In some embodiments, the LNP formulation has a pH of about 5.0 to about 6.0. In some embodiments, the LNP formulation has a pH of about 5.1 to about 5.9. In some preferable embodiments, the LNP formulation has a pH of about 5.2, about 5.3, about 5.4, about 5.5, about 5.6, about 5.7, or about 5.8. In a particular embodiment, the LNP formulation has a pH of about 5.9.

[0233] In some embodiments, the encapsulation is carried out for a period of about 10 seconds to about 24 hours, for example, about 1 minute to about 24 hours, about 5 minutes to about 24 hours, about 10 minutes to about 18 hours, about 20 minutes to about 12 hours, about 30 minutes to about 6 hours, about 1 hour to about 4 hours or about 5 minutes to about 1 hour, or about 10 minutes to about 30 minutes. In some preferable embodiments, the encapsulation is carried out for a period of about 1 hour or less, about 50 minutes or less, about 40 minutes or less, about 30 minutes or less, about 20 minutes or less, or about 10 minutes or less, for example, about 10 minutes, about 9 minutes, about 8 minutes, about 7 minutes, about 6 minutes, about 5 minutes, about 4 minutes, about 3 minutes, about 2 minutes, about 1 minute, about 50 seconds, about 40 seconds, about 30 seconds, about 20 seconds, about 10 seconds, about 5 seconds, about 4 seconds, about 3 seconds, about 2 seconds, or about 1 second, or a range constituted by any two of the stated values. In some preferable embodiments, the encapsulation is carried out for a period of about 1 minute to about 1 hour, about 1 minute to about 50 minutes, about 1 minute to about 40 minutes, about 1 minute to about 30 minutes, about 1 minute to about 20 minutes, about 1 minute to about 15 minutes, about 1 minute to about 10 minutes, or about 1 minute to about 5 minutes. In some preferable embodiments, the encapsulation is carried out for a period ofa bout 2 minutes to about 1 hour, about 2 minutes to about 50 minutes, about 2 minutes to about 40 minutes, about 2 minutes to about 30 minutes, about 2 minutes to about 20 minutes, about 2 minutes to about 15 minutes, about 2 minutes to about 10 minutes, or about 2 minutes to about 5 minutes. In some preferable embodiments, the encapsulation is carried out for a period ofa bout 3 minutes to about 1 hour, about 3 minutes to about 50 minutes, about 3 minutes to about 40 minutes, about 3 minutes to about 30 minutes, about 3 minutes to about 20 minutes, about 3 minutes to about 15 minutes, about 3 minutes to about 10 minutes, or about 3 minutes to about 5 minutes. In some preferable embodiments, the encapsulation is carried out for a period ofa bout 4 minutes to about 1 hour, about 4 minutes to about 50 minutes, about 4 minutes to about 40 minutes, about 4 minutes to about 30 minutes, about 4 minutes to about 20 minutes, about 4 minutes to about 15 minutes, about 4 minutes to about 10 minutes, or about 4 minutes to about 5 minutes.

[0234] In some preferable embodiments, the encapsulation is carried out at about pH 5.0 to about 6.0. In such embodiments, the encapsulation may be carried out for a period of about 30 minutes or less, about 20 minutes or less, or about 10 minutes or less. In a particular embodiment, the encapsulation is carried out at a pH of about 5.0 to about 6.0 for a perid of about 10 min or less.

[0235] In some embodiments, the process further comprises processing the LNP formulation. In some embodiments, the processing comprises at least one step selected from filtering, buffer exchanging, diluting, dialyzing, concentrating, pH adjusting, adding a cryoprotectant, lyophilizing and packing.

[0236] In some embodiments, the processing removes an organic solvent from the LNP formulation.

[0237] It would appreciated by those skilled in the art although an acidic pH is required for encapsulation of the nucleic acid by the LNP, once the encapsulation occurs, further adjusting the pH to a neutral range would not dissociate the nucleic acid from the LNP. Accordingly, in some embodiments, the processing comprises ajusting the pH of the LNP formulation. In some embodiments, the processing comprises adjusting the pH of the LNP formulation to a neutral pH, e.g., a pH of about 6.5 to about 8.5, about 7.0 to about 8.0, about 7.2 to about 7.8, or about 7.4 to about 7.6. Thus, the LNP formulation preprared by the process of the present disclosure may have any pH suitable for administration (e.g., injection, such as intramuscular injection) to a subject. For example, the LNP formulation may have a pH of about 4.25 to about 8.5, about 4.5 to about 8.0, or about 5.0 to about 7.6.

[0238] In some embodiments, the process of the present disclosure provides a high encapsulation efficiency of the nucleic acid. The encapsulation efficiency of a nucleic acid can be at least 50%, for example 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%. In some embodiments, the encapsulation efficiency can be at least 80%. In some embodiments, the encapsulation efficiency is at least 80%. In certain embodiments, the encapsulation efficiency is at least 85%. In some preferable embodiments, the encapsulation efficiency is at least 90%.

[0239] In a particular aspect, provided is a process of preparing a lipid nanoparticle (LNP) formulation comprising an LNP associated with an mRNA ( “mRNA-LNP formulation” ) , the process comprising: in vitro transcribing a DNA template to produce the mRNA, digesting the DNA template to obtain a crude mRNA mixture, subjecting the crude mRNA mixture to chromatographic purification, subjecting the purified mRNA to filtration sterilization, thereby obtaining an mRNA solution comprising the mRNA, combining the mRNA solution with an LNP solution comprising an empty LNP at a pH of about 6.5 to about 8.6 to obtain a liquid composition comprising the empty LNP and the mRNA and having a pH of about 6.5 to about 8.6, and adjusting the pH of the liquid composition to a pH suitable for encapsulation of the mRNA by the LNP, thereby forming the LNP formulation.

[0240] In some embodiments, the process of preparing the mRNA-LNP formulation of the present disclosure further comprises exchanging the buffer and / or adjusting the concentration of the purified mRNA before the filtration sterilization. In some embodiments, the exchanging the buffer and adjusting the concentration is performed by ultrafiltration and diafiltration (UF / DF) . In some embodiments, the chromatographic purification comprises affinity chromatography. In some embodiments, the mRNA is a personalized mRNA cancer vaccine. In some embodiments, the combining and the pH adjusting are performed in the formulation module (1) as described for the apparatus for preparing the LNP formulation of the present disclosure.

[0241] In another aspect, provided is a lipid nanoparticle (LNP) formulation prepared by the process of the present disclosure.Apparatuses for preparing LNP formulations

[0242] In a further aspect, provided is an apparatus for preparing a lipid nanoparticle (LNP) formulation comprising an LNP associated with a nucleic acid, the apparatus comprising a formulation module 1 configured to provide a liquid composition comprising an empty LNP and a nucleic acid and adjust the pH of the liquid composition to a pH suitable for encapsulation of the nucleic acid by the LNP, thereby forming the LNP formulation, wherein the liquid composition has a pH of about 6.5 to about 8.6, and the empty LNP comprises a cationic lipid.

[0243] In the following, exemplary embodiments of the apparatus are described by referring to Figure 19.

[0244] In some embodiments, the formulation module 1 comprises a first feeding unit 2 for providing a nucleic acid solution comprising the nucleic acid, a second feeding unit 3 for providing an LNP solution comprising the empty LNP, and a first mixing channel 4 in fluid communication with the first feeding unit 2 and the second feeding unit 3, wherein the first feeding unit 2 and the second feeding unit 3 are configured to mix the nucleic acid solution and the LNP solution in the first mixing channel 4, thereby forming the liquid composition.

[0245] In some embodiments, the first feeding unit 2 comprises a first reservoir 5 connected to a first feeding channel 6 via a first pumping device 15, the second feeding unit 3 comprises a second reservoir 7 connected to a second feeding channel 8 via a second pumping device 16, wherein the first feeding channel 6 and the second feeding channel 8 are in fluid communication with the first mixing channel 4.

[0246] In some embodiments, the formulation module 1 further comprises a third feeding unit 9, and a second mixing channel 10 in fluid communication with the third feeding unit 9 and the first mixing channel 4, wherein the third feeding unit 9 is configured to provide an acidic buffer to adjust the pH of the liquid composition to a pH suitable for encapsulation of the nucleic acid by the LNP in the second mixing channel 10, thereby forming the LNP formulation.

[0247] In some embodiments, the third feeding unit 9 comprises a third reservoir 11 connected to a third feeding channel 12 via a third pumping device 17, and the third feeding channel 12 is in fluid communication with the first mixing channel 4 and the second mixing channel 10.

[0248] In some embodiments, the apparatus further comprises a storage unit 13 for storing the LNP formulation and a waste collection unit 14, wherein the storage unit 13 and the waste collection unit 14 are in fluid communication with the formulation module 1.

[0249] In some embodiments, wherein each of the units is configured for single use.

[0250] In some embodiments, the nucleic acid is an mRNA, optionally a personalized mRNA cancer vaccine.Kits

[0251] In another aspect, provided is a kit comprising the liquid composition or the lyophilized composition of the present disclosure. In some embodiments, the kit comprises a first container comprising the liquid composition or lyophilized composition of the present disclosure, and optionally a second container comprising an acidic buffer.

[0252] In some embodiments, the first container comprises the liquid LNP composition of the present disclosure. In some embodiments, the first container comprises the lyophilized LNP composition of the present disclosure.

[0253] In some embodiments, the acidic buffer has a pH of about 2.0 to about 5.5. In some embodiments, the acidic buffer is capable of maintaining a pH of about 2.0 to about 5.5. In some embodiments, the acidic buffer is capable of maintaining a pH of about 2.5 to about 5.5, about 3.0 to about 5.5, about 3.0 to about 5.0, about 3.0 to about 4.5, about 3.0 to about 4.0.

[0254] In some embodiments, the acidic buffer is selected from a citrate buffer, a maleic acid buffer, an acetate buffer, an MES (2-Morpholinoethanesulphonic acid) buffer, a phosphate buffer, a malic acid buffer, a tartaric acid buffer, a succinic acid buffer, and a combination thereof.

[0255] In some embodiments, the acidic buffer has a buffer concentration of about 1 mM to about 20 mM, for example, about 1 mM to about 15 mM, about 2 mM to about 10 mM, or about 3 mM to about 10 mM, for example, 4 mM, 5 mM, 6 mM, 7 mM, 8 mM, 9 mM or 10 mM. In some embodiments, the acidic buffer comprises 1-10 mM (e.g., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 mM) citrate buffer and has a pH of about 3.0 to about 4.0.

[0256] In some embodiments, the first container comprises the lyophilized composition of the present disclosure, and the second container comprises the acidic buffer described herein.

[0257] In some embodiments, the kit further comprises instructions for combining the contents of the first container with the contents of the second container.Methods of use

[0258] The present disclosure further provides the liquid composition, the lyophilized composition, the LNP formulation and the processes for preparing the same for medical use and / or non-medical use.

[0259] In a further apsect, provided is a method of treating or preventing a disease in a subject in need thereof, the method comprising administering to the subject a therapeutically effective amount of the LNP formulation of the present disclosure. In some embodiments, the expression of the nucleic acid in the subject treats or prevents the disease. In some embodiments, the nucleic acid encodes a polypeptide of interest, wherein the expression of the polypeptide of interest in the subject treats or prevents the disease.

[0260] Further provided is use of the liquid composition, the lyophilized composition or the LNP formulation of the present disclosure in the manufacture of a medicament for treating or preventing a disease in a subject in need thereof.

[0261] In yet another aspect, provided is a method of introducing a nucleic acid to a cell or a subject in need thereof, comprising (Ⅰa) adjusting the pH of the liquid composition of the present disclosure to a pH suitable for encapsulation of the nucleic acid by the LNP, thereby forming an LNP formulation comprising the LNP associated with the nucleic acid; or (Ⅰb) reconstituting the lyophilized composition of the present disclosure at a pH suitable for encapsulation of the nucleic acid by the LNP, thereby forming an LNP formulation comprising the LNP associated with the nucleic acid; and (Ⅱ) administering the LNP formulation to the cell or the subject.

[0262] The encapsulation may be carried at a pH suitable for encapsulating the nucleic acid. In some embodiments, the pH suitable for encapsulation of the nucleic acid by the LNP is about 4.25 to about 6.5, for example, about 4.5, about 4.6, about 4.7, about 4.8, about 4.9, about 5.0, about 5.1, about 5.2, about 5.3, about 5.4, about 5.5, about 5.6, about 5.7, about 5.8, about 5.9, about 6.0, about 6.1, about 6.2, about 6.3, about 6.4 or about 6.5, or a range constituted by any two of the stated values. In some embodiments, the pH suitable for encapsulation of the nucleic acid by the LNP is about 4.25 to about 6.5, about 4.25 to about 6.25, about 4.25 to about 6.0, about 4.25 to about 5.75, about 4.25 to about 5.5, about 4.25 to about 5.25, about 4.25 to about 5.0, about 4.25 to about 4.75, or about 4.25 to about 4.5. In some embodiments, the pH suitable for encapsulation is about 4.5 to about 6.25, about 4.5 to about 6.0, about 4.5 to about 5.75, about 4.5 to about 5.5, about 4.5 to about 5.25, about 4.5 to about 5.0, or about 4.5 to about 4.75. In some embodiments, the pH suitable for encapsulation is about 4.75 to about 6.5, about 4.75 to about 6.25, about 4.75 to about 6.0, about 4.75 to about 5.75, about 4.75 to about 5.5, about 4.75 to about 5.25, or about 4.75 to about 5.0. In some embodiments, the pH suitable for encapsulation is about 5.0 to about 6.5, about 5.0 to about 6.25, about 5.0 to about 6.0, about 5.0 to about 5.75, about 5.0 to about 5.5, or about 5.0 to about 5.25. In some embodiments, the pH suitable for encapsulation is about 5.25 to about 6.5, about 5.25 to about 6.25, about 5.25 to about 6.0, about 5.25 to about 5.75, or about 5.3 to about 5.8, or about 5.25 to about 5.5, or about 5.3 to about 5.5. In some embodiments, the pH suitable for encapsulation is about 5.5 to about 6.5, about 5.5 to about 6.25, about 5.5 to about 6.0, or about 5.5 to about 5.75. In some embodiments, the pH suitable for encapsulation is about 5.75 to about 6.5, about 6.0 to about 6.5, or about 6.25 to about 6.5. In some embodiments, the pH suitable for encapsulation is about 6.0 to about 6.5, or about 6.25 to about 6.5. In some embodiments, the pH suitable for encapsulation is about 4.25 to about 6.5, about 4.5 to about 6.0, or about 4.8 to about 6.0. In some embodiments, the pH suitable for encapsulation is about 5.0 to about 6.0. In some embodiments, the pH suitable for encapsulation is about 5.1 to about 5.9. In some preferable embodiments, the pH suitable for encapsulation is about 5.2, about 5.3, about 5.4, about 5.5, about 5.6, about 5.7, or about 5.8. In a particular embodiment, the pH suitable for encapsulation is about 5.9.

[0263] In some embodiments, the adjusting the pH of the liquid composition or the reconstituting the lyophilized composition is performed by using an acidic buffer. In some embodiments, the acidic buffer has a pH of about 2.0 to about 5.5. In some embodiments, the acidic buffer is capable of maintaining a pH of about 2.0 to about 5.5. In some embodiments, the acidic buffer is capable of maintaining a pH of about 2.5 to about 5.5, about 3.0 to about 5.5, about 3.0 to about 5.0, about 3.0 to about 4.5, or about 3.0 to about 4.0.

[0264] In some embodiments, the acidic buffer is selected from a citrate buffer, a maleic acid buffer, an acetate buffer, an MES (2-Morpholinoethanesulphonic acid) buffer, a phosphate buffer and a combination thereof.

[0265] In some embodiments, the acidic buffer has a buffer concentration of about 1 mM to about 20 mM, for example, about 1 mM to about 15 mM, about 2 mM to about 10 mM, or about 3 mM to about 10 mM, for example, 4 mM, 5 mM, 6 mM, 7 mM, 8 mM, 9 mM or 10 mM. In some embodiments, the acidic buffer comprises 1-10 mM (e.g., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 mM) citrate buffer and has a pH of about 3.0 to about 4.0.

[0266] In some embodiments, the process of reconstituting of the lyophilized composition of the present disclosure does not comprise a step of pH adjusting. This may be achieved by, for example, controlling the buffering abilities of the lyophilized composition and the acidic buffer, such that the reconstitution results in the encapsulation of the nucleic acid by the LNP, for example, the reconstitution results in the formation of an LNP formulation having a pH of about 4.25 to about 6.5, for example, about 4.5, about 4.6, about 4.7, about 4.8, about 4.9, about 5.0, about 5.1, about 5.2, about 5.3, about 5.4, about 5.5, about 5.6, about 5.7, about 5.8, about 5.9, about 6.0, about 6.1, about 6.2, about 6.3, about 6.4 or about 6.5, or a range constituted by any two of the stated values.

[0267] In some embodiments, the LNP formulation has a pH of about 4.25 to about 6.5, about 4.25 to about 6.25, about 4.25 to about 6.0, about 4.25 to about 5.75, about 4.25 to about 5.5, about 4.25 to about 5.25, about 4.25 to about 5.0, about 4.25 to about 4.75, or about 4.25 to about 4.5. In some embodiments, the LNP formulation has a pH of about 4.5 to about 6.25, about 4.5 to about 6.0, about 4.5 to about 5.75, about 4.5 to about 5.5, about 4.5 to about 5.25, about 4.5 to about 5.0, or about 4.5 to about 4.75. In some embodiments, the LNP formulation has a pH of about 4.75 to about 6.5, about 4.75 to about 6.25, about 4.75 to about 6.0, about 4.75 to about 5.75, about 4.75 to about 5.5, about 4.75 to about 5.25, or about 4.75 to about 5.0. In some embodiments, the LNP formulation has a pH of about 5.0 to about 6.5, about 5.0 to about 6.25, about 5.0 to about 6.0, about 5.0 to about 5.75, about 5.0 to about 5.5, or about 5.0 to about 5.25. In some embodiments, the LNP formulation has a pH of about 5.25 to about 6.5, about 5.25 to about 6.25, about 5.25 to about 6.0, about 5.25 to about 5.75, or about 5.3 to about 5.8, or about 5.25 to about 5.5, or about 5.3 to about 5.5. In some embodiments, the LNP formulation has a pH of about 5.5 to about 6.5, about 5.5 to about 6.25, about 5.5 to about 6.0, or about 5.5 to about 5.75. In some embodiments, the LNP formulation has a pH of about 5.75 to about 6.5, about 6.0 to about 6.5, or about 6.25 to about 6.5. In some embodiments, the LNP formulation has a pH of about 6.0 to about 6.5, or about 6.25 to about 6.5. In some embodiments, the LNP formulation has a pH of about 4.25 to about 6.5, about 4.5 to about 6.0, or about 4.8 to about 6.0. In some embodiments, the LNP formulation has a pH of about 5.0 to about 6.0. In some embodiments, the LNP formulation has a pH of about 5.1 to about 5.9. In some preferable embodiments, the LNP formulation has a pH of about 5.2, about 5.3, about 5.4, about 5.5, about 5.6, about 5.7 or about 5.8. In a particular embodiment, the LNP formulation has a pH of about 5.9.

[0268] In some embodiments, the encapsulation is carried out for a period of about 10 seconds to about 24 hours, for example, about 1 minute to about 24 hours, about 5 minutes to about 24 hours, about 10 minutes to about 18 hours, about 20 minutes to about 12 hours, about 30 minutes to about 6 hours, about 1 hour to about 4 hours or about 5 minutes to about 1 hour, or about 10 minutes to about 30 minutes. In some preferable embodiments, the encapsulation is carried out for a period of about 1 hour or less, about 50 minutes or less, about 40 minutes or less, about 30 minutes or less, about 20 minutes or less, or about 10 minutes or less, for example, about 10 minutes, about 9 minutes, about 8 minutes, about 7 minutes, about 6 minutes, about 5 minutes, about 4 minutes, about 3 minutes, about 2 minutes, about 1 minute, about 50 seconds, about 40 seconds, about 30 seconds, about 20 seconds, about 10 seconds, about 5 seconds, about 4 seconds, about 3 seconds, about 2 seconds, or about 1 second, or a range constituted by any two of the stated values. In some preferable embodiments, the encapsulation is carried out for a period of about 1 minute to about 1 hour, about 1 minute to about 50 minutes, about 1 minute to about 40 minutes, about 1 minute to about 30 minutes, about 1 minute to about 20 minutes, about 1 minute to about 15 minutes, about 1 minute to about 10 minutes, or about 1 minute to about 5 minutes. In some preferable embodiments, the encapsulation is carried out for a period ofa bout 2 minutes to about 1 hour, about 2 minutes to about 50 minutes, about 2 minutes to about 40 minutes, about 2 minutes to about 30 minutes, about 2 minutes to about 20 minutes, about 2 minutes to about 15 minutes, about 2 minutes to about 10 minutes, or about 2 minutes to about 5 minutes. In some preferable embodiments, the encapsulation is carried out for a period ofa bout 3 minutes to about 1 hour, about 3 minutes to about 50 minutes, about 3 minutes to about 40 minutes, about 3 minutes to about 30 minutes, about 3 minutes to about 20 minutes, about 3 minutes to about 15 minutes, about 3 minutes to about 10 minutes, or about 3 minutes to about 5 minutes. In some preferable embodiments, the encapsulation is carried out for a period ofa bout 4 minutes to about 1 hour, about 4 minutes to about 50 minutes, about 4 minutes to about 40 minutes, about 4 minutes to about 30 minutes, about 4 minutes to about 20 minutes, about 4 minutes to about 15 minutes, about 4 minutes to about 10 minutes, or about 4 minutes to about 5 minutes. In some preferable embodiments, the encapsulation is carried out at about pH 5.0 to about 6.0. In such embodiments, the encapsulation may be carried out for a period of about 30 minutes or less, about 20 minutes or less, or about 10 minutes or less. In a particular embodiment, the encapsulation is carried out at a pH of about 5.0 to about 6.0 for a perid of about 10 min or less.

[0269] In some preferable embodiments, the method does not comprise processing the LNP formulation prior to the administering.

[0270] The nucleic acid may be a nucleic acid as described herein. The type of the nucleic acid may be selected according to the purpose of use. In some embodiments, the nucleic acid is a ribonucleic acid (RNA) . In some embodiments, the RNA is selected from an mRNA (for example, a personalized mRNA cancer vaccine) , an saRNA, an siRNA, an miRNA, a cirRNA, an shRNA and a lncRNA. In some embodiments, the nucleic acid is an mRNA. In some embodiments, the nucleic acid is an siRNA. In some embodiments, the nucleic acid encodes a polypeptide of interest. In some embodiments, the expression of the polypeptide of interest in the subject treats or prevents a disease in the subject.Benificial effects

[0271] The compositions, the LNP formulations, the processes and the methods of the present disclosure may facilitate delivery of a payload, such as a nucleic acid, in at least one of the following aspects: cost-effective preparation and storage of nucleic acid compositions, a high encapsulation efficiency of nucleic acid, flexible and simple administration, and increased biological efficacy of nucleic acid.EXAMPLES

[0272] The present disclosure is further described below with reference to specific examples. It is to be understood that the examples are not intended to limit the scope of the disclosure. The specific experimental methods which were not mentioned in the following examples were carried out according to conventional experimental method. Unless otherwise specified, instruments described could be obtained commercially, and reagents and materials could be obtained commercially or prepared according to methods known in the art. Example 1. Preparation of empty LNPs and nucleic acids

[0273] Empty LNPs were prepared by mixing a lipid solution (organic phase) with an aqueous solution (aqueous phase) . Briefly, the lipid solution was prepared by solubilizing a specified amount of the lipid components in ethanol at the following molar ratio: cationic lipid (e.g., Compound C1, Compound 03-15, Compound 04-92, Compound 04-86 or SM-102) : phospholipid (e.g., DSPC) : steroid (e.g., Cholesterol) : polymer conjugated lipid (e.g., DMG-PEG2000) = 30–55 : 5–40 : 20–50 : 1.0–2.5 (e.g., 50 : 10 : 38.5 : 1.5) . The empty LNPs were prepared at a total lipid concentration of 3–12 mM, by mixing the ethanolic lipid solution with the aqueous solution (H2O or a buffer, for example, Tris-HCl buffer or citrate buffer) at a volume ratio of 1: 3 using a microfluidic apparatus, total flow rate ranging from 9 to 30 mL / min. Ethanol was removed through dialysis against an aqueous buffer having a neutral pH. As a comparison, empty LNPs dialyzed in acidic aqueous buffer (10 mM Na2HPO4 / NaH2PO4, pH 5.3, 10%sucrose) were also prepared. The empty LNP compositions are also referred to as “pre-formulations” .

[0274] Messenger RNA (mRNA) solutions were prepared by dissolving mRNA to a final concentration of 0.01–1 mg / mL in citrate buffer (CB) , pH 3.0-7.0 or sterile water only. For the preparation of lyophilized mRNA, cryoprotectants were added to the nucleic acid solutions. Example 2. Preparation of pre-encapsulation formulations

[0275] Empty LNPs in neutral buffers and nucleic acids as prepared in Example 1 were mixed to form liquid pre-encapsulation formulations.

[0276] To prepare lyophilized pre-encapsulation formulations, liquid pre-encapsulation formulations were added with cryoprotectants (e.g., sucrose) (e.g., 5%to 20%w / v) before lyophilization. Lyophilization process was performed in a glass chamber of a Pilot Freeze Dryer (Christ Epsilon 2-10D LSCplus Lyophilizer) . Samples were frozen at -40 to -60℃ for 3 h, followed by a primary drying cycle at -25 to -35℃ / 20 to 100 mTorr for 48 to 80 h. During the secondary drying cycle, samples were warmed to 5-25℃ / 20 to 100 mTorr and held for 12 to 24 h. Vials were capped with stopper at vacuum, and additionally capped with aluminum cap and transferred to 2-8℃ for long-term storage. Example 3. Preparation of conventional LNP formulations

[0277] Preparation of mRNA-LNP formulations using the conventional process (conventional LNP formulations) was described in, for example, WO2023098842A1. Briefly, the specified amount of the lipid components was solubilized in ethanol at a molar ratio of Compound C1: DSPC: Cholesterol: DMG-PEG2000 = 30–55 : 5–40 : 20–50 : 1.0–2.5 (e.g., 50 : 10 : 38.5 : 1.5) with a total lipid concentration of 3–12 mM. MRNA was diluted in 10 to 50 mM citrate buffer, pH = 3-5. The mRNA-LNP formulation was prepared at a total lipid to mRNA weight ratio of approximately 10: 1 to 30: 1 by mixing the ethanolic lipid solution with the aqueous mRNA solution at a volume ratio of 1: 3 using a microfluidic apparatus, total flow rate ranging from 9 to 30 mL / min. Ethanol was thereby removed and replaced by 1×PBS via dialysis. After dialysis, the mRNA-LNP solution was buffer exchanged to cryoprotectant buffers (e.g., 14 mM Tris-HCl, 10%sucrose, pH 7.5) and filtered through a 0.2 μm sterile filter. The mRNA-LNP formulation was loaded into type I glass vials and lyophilized using similar lyophilization cycles as described in Example 2. Example 4. Characterization of LNP compositions

[0278] Lipid nanoparticle sizes were determined by dynamic light scattering using a Malvern Zetasizer Nano ZS (Malvern UK) using a 173o backscatter detection mode. To measure the size and PDI of lipid nanoparticles, LNP formulations were diluted 20-fold in PBS and transferred 1 mL in measurement cuvette.

[0279] The encapsulation efficiency (EE%) was determined using a Quant-it RiboGreen RNA quantification assay kit (Thermo Fisher Scientific, UK) according to the manufacturer’s instructions. Briefly, two equal aliquots of mRNA-LNP compositions were diluted to 0.5 μg / mL in Tris-EDTA (10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1 mM EDTA) and Tris-EDTA containing 0.1%Triton X-100 for determination of the free RNA amount and the total RNA amount, respectively. Then the RiboGreen reagent was diluted 200-fold with Tris-EDTA buffer and mixed with the diluted post-encapsulation formulation at a ratio of 1: 1 (v / v) , and the resulting mixture was measured for fluorescence intensity at room temperature in a Molecular Devices Spectramax iD3 spectrometer using excitation and emission wavelengths of 488 nm and 525 nm.EE%was calculated using the following formula: EE%= (Total RNA fluorescence intensity -Free RNA fluorescence intensity)  / Total RNA fluorescence intensity×100%. Example 5. Characterization of LNPs before and after lyophilization

[0280] To illustrate the pre-formulation and post-encapsulation process, a pre-encapsulation formulation (F1) comprising empty LNPs (Compound C1: DSPC: Cholesterol: DMG-PEG2000 =30–55 : 5–40 : 20–50 : 1.0–2.5 (e.g., 50 : 10 : 38.5 : 1.5) ) and hIL-12 mRNA (hIL-12-encoding mRNA, SEQ ID NO: 3; at a final concentration of 40 μg / mL, i.e., maintaining N / P ratio = 5.44) was prepared and lyophilized in 20 mM Tris-HCl, 5%sucrose, pH 7.5 using similar procedures described in Examples 1 and 2. Lyophilized F1 was reconstituted with deionized water (diH2O) or 4 mM citrate buffer of pH 4.0. The resulting solutions were incubated for 10 min at room temperature. The formulations before lyophilization and after lyophilization (and reconstitution) were characterized for particle size, PDI and EE%. The results are shown in Table 1.

[0281] As can be seen from Table 1, before lyophilization, the pH of F1 was around 7.5 and the EE%was no more than 0%, indicating no encapsulation occurs at this stage. Reconstitution of lyophilized F1 with diH2O lead to an EE%lower than 0%, indicating no cargo encapsulation occurs. However, reconstitution of lyophilized F1 with 4 mM citrate buffer, pH 4.0 lead to a pH of about 5.9, an EE%of about 96%and a significant increase in particle size. The changes in EE%, particle size and pH indicate the occurrence of cargo encapsulation.

[0282] Table 1. Example 6. Preparation of post-encapsulation formulations from pre-encapsulaiton formulations lyophilized in Tris buffer

[0283] Pre-encapsulation formulations lyophilized in Tris buffer were prepared using similar procedures as described in Examples 1 and 2 and the compositions were listed in Table 2. The pre-encapsulation formulations were prepared with variable nitrogen to phosphate ratios (N / P ratios) by adding different amounts of mRNA.

[0284] Lyophilized pre-encapsulation formulations were reconstituted with 4 mM Citrate Buffer, pH 4.0. The resulting solutions (post-reconstitution pH 5.0-6.0) were incubated for 10 min at room temperature. The post-encapsulation formulations were characterized for particle size, PDI and EE%. The results are shown in Figures 2 and 3. The results suggest that pre-encapsulation formulations prepared with varied aqueous buffers, lyophilization buffers and N / P ratios can be used to prepare post-encapsulation formulations, without significantly affecting the particle size, PDI and EE%.

[0285] Table 2. Example 7. Preparation of post-encapsulation formulations from pre-encapsulaiton formulations lyophilized in phosphate buffer

[0286] Pre-encapsulation formulations with different N / P ratios were prepared using similar procedures as described in Examples 1 and 2 by increasing the amount of mRNA and lyophilized in phosphate buffer. The compositions were listed in Table 3.

[0287] Lyophilized pre-encapsulation formulations were reconstituted with 2 mM Citrate Buffer, pH 4.0. The resulting solutions (post-reconstitution pH 5.0-6.0) were incubated for 10 min at room temperature. The post-encapsulation formulations were characterized for particle size, PDI and EE%. The results are shown in Figures 4 and 5. As shown in Figure 4, the post-encapsulation formulations. The results suggest that pre-encapsulation formulations prepared using varied aqueous buffers, lyophilization buffers and N / P ratios can be used to prepare post-encapsulation formulations, without significantly affecting the particle size, PDI and EE%.

[0288] Table 3. Example 8. Thermostability comparison of lyophilized pre-encapsulation formulations and conventional lyophilized formulations

[0289] A lyophilized pre-encapsulation formulation comprising empty LNPs (Compound C1: DSPC: Cholesterol: DMG-PEG2000 =30–55 : 5–40 : 20–50 : 1.0–2.5 (e.g., 50 : 10 : 38.5 : 1.5) ) and Rabies mRNA (Rabies virus G protein-encoding mRNA, SEQ ID NO: 1; at a final concentration of 40 μg / mL, i.e., maintaining N / P ratio = 5.44) lyophilized in 20 mM Tris, 10%sucrose, pH 7.5 was prepared using similar procedures as described in Examples 1 and 2.

[0290] As a comparison, a conventional lyophilized formulation comprising Rabies mRNA encapsulated in LNPs (LNPs, Compound C1: DSPC: Cholesterol: DMG-PEG2000 =30–55 : 5–40 : 20–50 : 1.0–2.5 (e.g., 50 : 10 : 38.5 : 1.5) ; Rabies mRNA, 40 μg / mL, i.e., maintaining N / P ratio = 5.44) lyophilized in 14 mM Tris, 10%sucrose, pH 7.5 was prepared using similar procedures as decribed in Example 3.

[0291] The lyophilized formulations were subjected to stability challenge by incubating at 37℃for 28 days. At Days 7, 14, 21 and 28 of the stability challenge, the lyophilized pre-encapsulation formulation and the conventional lyophilized formulation were reconstituted with 4 mM Citrate buffer, pH 4.0 and sterile water for injection (WFI) , respectively. The resulting solutions (pH 5.0–6.0) were incubated for 10 min at room temperature.

[0292] The reconstituted formulations (i.e., the post-encapsulation formulation and the conventional LNP formulation) were subjected to mRNA extraction (Qiagen RNeasy Mini Kit, Cat. No. 74106) and mRNA integrities were measured with a fragment analyzer (Agilent fragment analyzer 5200) . The results are shown in Figure 6. As shown in Figure 6, after 28 days storage at 37℃, the mRNA in the post-encapsulation formulation showed substantially no degradation. In constrast, the mRNA in the conventional LNP formulation significantly degraded over time. At Day 28, the mRNA in the conventional LNP formulation degraded by about 45%.

[0293] The post-encapsulation formulations reconstituted at Days 7, 14, 21 and 28 of the stability challenge were characterized for particle size and EE%. The results are shown in Figure 7. As shown in Figure 7, no significant change was observed in particle size, and the EE%dropped slightly over time. The results suggest that the lyophilized pre-encapsulation formulations have superior thermostability and may significantly reduce the transportation and storage cost of mRNA products. Example 9. In vitro expression of mRNA from post-encapsulation formulations

[0294] A lyophilized pre-encapsulation formulation (F26) comprising empty LNPs (Compound C1: DSPC: Cholesterol: DMG-PEG2000 =30–55 : 5–40 : 20–50 : 1.0–2.5 (e.g., 50 : 10 : 38.5 : 1.5) ) and hIL-12 mRNA (at a final concentration of 40 μg / mL, i.e., maintaining N / P ratio = 5.44) lyophilized in 20 mM Tris, 10%sucrose, pH 7.5 was prepared using similar procedures as described in Examples 1 and 2.

[0295] As a comparison, a conventional lyophilized formulation (F25) comprising hIL-12 mRNA encapsulated in LNPs (LNPs, Compound C1: DSPC: Cholesterol: DMG-PEG2000=30–55 : 5–40 : 20–50 : 1.0–2.5 (e.g., 50 : 10 : 38.5 : 1.5) ; hIL-12 mRNA, 40 μg / mL, i.e., maintaining N / P ratio = 5.44) lyophilized in 14 mM Tris, 10%sucrose, pH 7.5 was prepared using similar procedures as decribed in Example 3.

[0296] Formulations F26 and F25 were reconstituted with 4 mM Citrate buffer, pH 4.0 and sterile WFI, respectively. The resulting solutions were incubated for 10 min at room temperature. The reconstituted formulations were characterized for particle size, PDI and EE%. Buffers for lyophilization and reconstitution of the LNP formulations, and the results of LNP characterizations were listed in Table 4.

[0297] To investigate the in vitro expression, the reconstituted F25 and F26 formulations and their pre-lyophilization formulations were in vitro transfected into HepG2 cells (ATCC, HB-8065) . Briefly, HepG2 cells were seeded in a 6-well plate one day before transfection. The formulations were mixed with human serum AB (Gemini Biproducts, Cat. No. 100-512) for a couple of minutes and transfected into the cells for 72 h. The expressions of hIL-12 were analyzed using an ELISA kit (R&D systems, Cat. No. DY1270) .

[0298] The results are shown in Figure 8. As shown in Figure 8, the reconstituted F26 (post-encapsulation) formulation yielded significantly higher protein expression compared to the conventional lyophilized formulation F25. No significant change was observed for the conventional LNP formulation before lyophilization and after lyophilization. Since no mRNA encapsulation occurred before lyophilization for pre-encapsulation formulation F26, no hIL-12 expression was observed as expected.

[0299] Table 4. Example 10. In vivo expression of mRNA from post-encapsulation formulations

[0300] A lyophilized pre-encapsulation formulation (F28) comprising empty LNPs (Compound C1: DSPC: Cholesterol: DMG-PEG2000 =30–55 : 5–40 : 20–50: 1.0–2.5 (e.g., 50 : 10 : 38.5 : 1.5) ) and luciferase saRNA (self-amplifying mRNA encoding luciferase, SEQ ID NO: 2; at a final concentration of 40 μg / mL, i.e., N / P ratio = 5.44) lyophilized in 20 mM Tris, 10%sucrose, pH 7.5 was prepared as described in Examples 1 and 2.

[0301] As a comparison, a conventional lyophilized formulation (F27) comprising lucifierase saRNA encapsulated in LNPs (LNPs, Compound C1: DSPC: Cholesterol: DMG-PEG2000 =30–55 : 5–40 : 20–50 : 1.0–2.5 (e.g., 50 : 10 : 38.5 : 1.5) ; luciferase saRNA, 40 μg / mL, i.e., maintaining N / P ratio = 5.44) lyophilized in 14 mM Tris, 10%sucrose, pH 7.5 was prepared using similar procedures as decribed in Example 3.

[0302] Formulations F28 and F27 were reconstituted with 4 mM Citrate buffer, pH 4.0 and sterile WFI, respectively. The resulting solutions were incubated for 10 min at room temperature. The reconstituted formulations were characterized for particle size, PDI and EE%. Buffers for lyophilization and reconstitution of the LNP formulations, and the results of LNP characterizations were listed in Table 5.

[0303] The reconstituted F27 and F28 formulations were intramuscularly injected into Balb / c mice (Vital River) at a dose of 1.5 μg / mouse. D-luciferin (Perkin Elmer, Cat. No. 122799) was injected intraperitoneally at 6 hours post-administration. Luminescence was quantified by IVIS (Bio-Rad) system. Data were shown in Figures 9 and 10. Overall, the “post-encapsulation” formulation F28 yielded a significantly higher protein expression (4.5-fold increase in luminescence) , compared to the conventional LNP formulation F27.

[0304] Table 5. Example 11. Preparation and characterization of post-encapsulation formulations with varied N / P ratios

[0305] To investigate the universality of the post-encapsulation process, lyophilized pre-encapsulation formulations comprising empty LNPs (Compound C1: DSPC: Cholesterol: DMG-PEG2000 =30–55 : 5–40 : 20–50 : 1.0–2.5 (e.g., 50 : 10 : 38.5 : 1.5) and EPO mRNA (EPO-encoding mRNA, SEQ ID NO: 4) with three different N / P ratios (the nitrogen from ionizable lipids and phosphate from nucleic acids; final concentration of EPO mRNA 40 or 80 or 120 μg / mL, i.e., N / P ratio = 5.44 or 2.72 or 1.81, respectively) lyophilized in 20 mM Tris, 10%sucrose, pH 7.5 were prepared using similar procedures as described in Examples 1 and 2 by maintaining the amount of empty LNPs and increasing the amount of the mRNA. The lyophilized pre-encapsulation formulations were reconstituted with 4 mM citrate buffer, pH 4.0. The resulting solutions (post-reconstitution pH 5.0-6.0) were incubated for 10 min at room temperature. The post-encapsulation formulations were characterized for particle size and EE%. The results were shown in Figures 11 and 12. Overall, the particle size increases as the N / P ratio decreases, suggesting that more mRNA were loaded into LNPs. For all the N / P ratios tested, the EE%reached >95%within 10-min incubation.

[0306] The post-encapsulation formulations were intravenously injected into ICR mice (Vital River) at a dose of 0.5 mpk. Sera were collected for EPO expression measurement at 6 hours post-administration. EPO levels were quantified using an ELISA kit (ACRODiagnostics Inc. Cat. No. CEA-C027) .

[0307] The results are shown in Figure 13. As shown in Figure 13, the post-encapsulation formulations with different N / P ratios yielded high expression of EPO in vivo, and no significant difference was observed between different N / P ratios. The pre-encapsulation formulations of the present disclosure allow preparation of post-encapsulation formulations with a low N / P ratio, which may reduce the amount of lipids and lipid-related toxicity. Example 12. Preparation and characterization of post-encapsulation formulations with various ionizable lipids

[0308] To investigate the universality of the post-encapsulation process, different ionizable lipids were used to prepare lyophilized pre-encapsulation formulations using similar procedures as described in Examples 1 and 2. Briefly, empty LNP compositions were prepared with Ionizable Lipid: DSPC: Cholesterol: DMG-PEG2000 =30–55: 5–40: 20–50: 1.0–2.5 (e.g., 50: 10: 38.5: 1.5) ; luciferase saRNA were added into the empty LNP compositions at a final concentration of 40 μg / mL (maintaining N / P ratio = 5.44) ; and the pre-encapsulation formulations were lyophilized in 20 mM Tris, 10%sucrose, pH 7.5. The lyophilized pre-encapsulation formulations were reconstituted with 4 mM citrate buffer, pH 4.0. The resulting solutions (post-reconstitution pH 5.0-6.0) were incubated for 10 min at room temperature. The post-encapsulation formulations were characterized for particle size, PDI and EE%. Compositions of the formulations and the results of LNP characterizations were listed in Table 6. All in all, desirable particle size, PDI and EE%could be achieved with different ionizable lipids, indicating the universality of “post-encapsulation” formulation technique.

[0309] Table 6. Example 13. Preparation and characterization of post-encapsulation formulations with different pH

[0310] Pre-encapsulation formulations lyophilized in Tris buffer with pH 6.5–8.6 were prepared and the compositions were listed in Table 7. The pre-encapsulation formulations were prepared with empty LNPs (Compound C1 / DSPC / cholesterol / DMG-PEG) and luciferase mRNA at fixed nitrogen to phosphate ratios of 5.44.

[0311] Lyophilized pre-encapsulation formulations were reconstituted with 5–15 mM citrate buffers. The resulting solutions were incubated for 10 min at room temperature. The post-encapsulation formulations were characterized for particle size, PDI and EE%. The results are shown in Table 7. The results suggest that pre-encapsulation formulations prepared with varied pH ranging from 6.5 to 8.6 could be used to prepare post-encapsulation formulations, without significantly affecting the particle size, PDI and EE%. For formulations F33-F37, the nucleic acid encapsulation efficiencies in the pre-encapsulation formulations are below 0%, indicating no mRNA were encapsulated.

[0312] Table 7. Example 14. Preparation and characterization of post-encapsulation formulations with different reconstitution buffers

[0313] Pre-encapsulation formulations lyophilized in Tris buffer with pH 7.5 were prepared and the compositions were listed in Table 8. The pre-encapsulation formulations were prepared with empty LNPs (Compound C1 / DSPC / cholesterol / DMG-PEG) and luciferase mRNA at fixed nitrogen to phosphate ratios of 5.44.

[0314] Lyophilized pre-encapsulation formulations were reconstituted with different acidic buffers. The resulting solutions were incubated for 10 min at room temperature. The post-encapsulation formulations were characterized for particle size, PDI and EE%. The results are shown in Table 8. The results suggest that post-encapsulation formulations could be prepared with different buffers, without significantly affecting the particle size, PDI and EE%.

[0315] Table 8. Example 15. Preparation and characterization of liquid post-encapsulation formulations.

[0316] Different dosage forms were developed for post-encpasulation formulations. In addition to lyophilized LNPs, liquid formulations were prepared for more convenience in clinical use. Empty LNPs were prepared with Ionizable Lipid: DSPC: Cholesterol: DMG-PEG2000 in 23.33 mM Tris, 13.33%sucrose, 0.1083%PS20, pH 7.5.500 μg / mL mRNA-based personalized cancer vaccine (PCV) were added into the empty LNPs (maintaining N / P ratio = 5.44) to obtain liquid pre-encpasulation formulations in 15.56 mM Tris / Tris-HCl, 8.89%sucrose, 0.072%polysorbate 20 (PS20) , pH 7.5. Afterwards, 60 mM CB, pH 4.0 were added to the liquid pre-encapsulation formulations and the resulting solutions were incubated for 10 min at room temperature. The post-encapsulation formulations were characterized for particle size, PDI and EE%. Compositions of the formulations and the results of LNP characterizations were listed in Table 9. All in all, desirable particle size, PDI and EE%could be achieved with different ionizable lipids, indicating the universality of “post-encapsulation” formulation technique.

[0317] Table 9. Example 16. Preparation and characterization of liquid post-encapsulation formulations with different pH

[0318] Empty LNPs were prepared with Compound C1: DSPC: Cholesterol: DMG-PEG2000 in 23.33 mM Tris / Tris-HCl, 13.33%sucrose, 0.1083%PS20, pH 7.5.25 μg / mL luciferase mRNA (SEQ ID NO: 5) were added into the empty LNPs (maintaining N / P ratio = 5.44) to obtain liquid pre-encpasulation formulations in 15.56 mM Tris / Tris-HCl, 8.89%sucrose, 0.0022%polysorbate 20, pH 7.5. Afterwards, citrate buffers of varing concentrations (pH 4.0) were added to the liquid pre-encapsulation formulations to achieve different post-reconstitution (post-recon. ) pH and the resulting solutions were incubated for 10 min at room temperature. The post-encapsulation formulations were characterized for particle size, PDI and EE%. Compositions of the formulations and the results of LNP characterizations were listed in Table 10. All in all, desirable particle size, PDI and EE%could be achieved with post-reconstitution pH ranging from 5.3 to 6.5, indicating the universality of the “post-encapsulation” formulation technique.

[0319] Table 10. Example 17. Thermostability comparison of lyophilized pre-encapsulation formulations and lyophilized empty LNP formulations

[0320] Lyophilized pre-encapsulation formulations comprising empty LNPs and Rabies mRNA or luciferase mRNA were prepared as described in Examples 1 and 2. Briefly, empty LNPs were prepared with Compound C1: DSPC: Cholesterol: DMG-PEG2000, and 40 μg / mL Rabies mRNA or luciferase mRNA were added into the empty LNPs (maintaining N / P ratio =5.44) to achieve a liquid pre-encpasulation formulations in 20 mM Tris, 10%sucrose, pH 7.5.

[0321] As a comparison, liquid or lyophilized pre-formulations (i.e., empty LNPs without nucleic acids) were prepared using similar procedures described in Examples 1 and 2. Briefly, empty LNPs were prepared with Compound C1: DSPC: Cholesterol: DMG-PEG2000. Liquid pre-formulations were dialyzed in 1×PBS, pH 7.5, while lyophilized pre-formulations were lyophilized in 10 mM Tris-HCl, 5%sucrose, pH 7.5. In this scenario, mRNA for preparing “bedside” formulations together with the pre-formulations was dissolved in 2 mM or 10 mM citrate buffer, 5%sucrose, pH 4.0 and lyophilized for long-term storage.

[0322] The lyophilized pre-encapsulation formulations, the liquid pre-formulations, and the lyophilized mRNA were subjected to stability challenge by incubating at 37℃ for 28 days. At days 0, 7, 14, 21 and 28 of the stability challenge, the lyophilized pre-encapsulation formulations were reconstituted with 4 mM Citrate buffer, pH 4.0. To prepare the “bedside” formulation, the lyophilized mRNA was firstly reconstituted with WFI, and then the mRNA solution was mixed with the liquid pre-formulation. The resulting solutions were incubated for 10 min at room temperature. The formulations were characterized for particle size. The results are shown in Figure 14. As shown in Figure 14, for the “bedside” formulation (liquid pre-formulation + lyophilized mRNA) , particle sizes increased 24 nm after 28 days storage at 37℃. In contrast, no significant particle change was observed with the post-encapsulation formulations.

[0323] To compare the stability of the LNPs in the lyophilized pre-encapsulation formulations and that in the lyophilized pre-formulations, the lyophilized pre-encapsulaiton formualtions comprising luciferase mRNA (40 μg / mL) , the lyophilized pre-formulations, and the lyophilized mRNA were stored at 25℃ for three months. At day 0, 1 and 3 months of the stability test, the lyophilized pre-encapsulation formulations were reconstituted with 4 mM Citrate buffer, pH 4.0. To preprare the “bedside” formulations, the lyophilized mRNA was firstly reconstituted with WFI, and then the lyophilized pre-formulations were reconstituted with the mRNA solution. The resulting solutions were incubated for 10 min at room temperature. The reconstituted formulations were characterized for encapsulation efficiency. The results are shown in Figure 15. As shown in Figure 15, for the “bedside” formulations, the EE%at higher N / P ratio (N / P = 5.44) decreased from 91.7%to 85.2%after 3-month storage at 25℃, and the drop in EE%at lower N / P ratio (N / P = 2.72) was more significant (about 22.6%drop) . However, the post-encapsulation formulations maintained good EE% (95-96%) over 3 months storage at both high and low N / P ratios.

[0324] The results suggest that the LNPs in the lyophilized pre-encapsulation formulations are more stable than those in the liquid or lyophilized pre-formulations.

[0325] Similar observations were made when comparing pre-encapsulation formulations F29 to F32, or F33 to F37 with their corresponding pre-formulations. The pre-formulations have the same pH and LNP compositions as their corresponding pre-encapsulation formulations. Example 18. Characterization of post-encapsulation formulations prepared from pre-formulations with different pH

[0326] Post-encapsulation formulations F50 and F51 were prepared by reconstituting lyophilized pre-formulations prepared at neutral (pre-formulation “lyo eLNP, 7.5” , wherein the empty LNPs were lypholized in 10 mM Tris-HCl, 5%sucrose, pH 7.5) and acidic pH (pre-formulation “lyo eLNP, 5.3” , wherein the empty LNPs were lypholized in 10 mM Na2HPO4 / NaH2PO4, 10%sucrose, pH 5.3) with RNA solutions containing luciferase mRNA (Table 11) and characterized for their particle sizes, encapsulation efficiencies and in vitro expression.

[0327] Table 11

[0328] The results are shown in Figures 16-18. Overall, the particle sizes and encapsulation efficiencies of the two post-encapsulation formulations are comparable (Figure 16) . In both cases, post-encapsulation efficiency reached 95%. Unexpectedly, compared with post-encapsulation formulation F50, post-encapsulation formulation 51 yielded significantly more subvisible particulates (Figure 17) , which might lead to concerns in clinical use.

[0329] For in vitro expression study, post-encapsulation formulations F50 and F51 (each containing 130–1000 ng formulated mRNA) were transfected into DC2.4 cells for 24 h. D-luciferin was added to the wells before luminescence measurement. The post-encapsulation formulations yielded significant protein expression levels in DC2.4 cells. Surprisingly, post-encapsulation formulation F50 led to a 5-to 10-fold increase in luminescence compared with post-encapsulation formulation 51 (Figure 18) . The results suggest that post-encapsulation formulations prepared from pre-formulations having a neutral pH achieves high expression without the need for pH adjustment.

[0330] Similar observations were made when comparing pre-encapsulation formulations F29 to F32, or F41 to F43, or F33 to F37 with their corresponding pre-formulations. The pre-formulations have the same LNP compositions as their corresponding pre-encapsulation formulations and an acidic pH.

[0331] While the disclosure has been described with respect to specific examples including presently preferred modes of carrying out the disclosure, those skilled in the art will appreciate that there are numerous variations and permutations of the above described systems and techniques. It is to be understood that other embodiments may be utilized and structural and functional modifications may be made without departing from the scope of the present disclosure. Thus, the scope of the disclosure should be construed broadly as set forth in the appended claims.Sequence Listing

Claims

A liquid composition or a lyophilized composition thereof, wherein the liquid composition comprises an empty lipid nanoparticle (LNP) and a nucleic acid and has a pH of about 6.5 to about 8.6, wherein the empty LNP comprises a cationic lipid.The liquid composition or lyophilized composition of claim 1, wherein the encapsulation efficiency of the nucleic acid in the liquid composition is less than 20%.The liquid composition or lyophilized composition of claim 1 or 2, wherein the liquid composition comprises a first buffer capable of maintaining a pH of about 6.5 to about 8.6;preferably, the first buffer is selected from a Tris buffer, a phosphate buffer, a PIPES buffer, an ADA buffer, an ACES buffer, an acetate buffer, a citrate buffer, a DIPSO buffer, a BES buffer, an MOPSO buffer, an MOPS buffer, a HEPBS buffer, a HEPPSO buffer, a HEPES buffer, a TAPSO buffer, a TEA buffer, a TES buffer, a Tricine buffer and a combination thereof; and / orthe first buffer has a buffer concentration of about 1 mM to about 100 mM.The liquid composition or lyophilized composition of any one of claims 1-3, wherein the liquid composition further comprises a cryoprotectant; preferably, the cryoprotectant comprises sucrose.The liquid composition or lyophilized composition of any one of claims 1-4, which has a nitrogen to phosphate (N / P) ratio of about 1.1: 1 to about 30: 1.The liquid composition or lyophilized composition of any one of claims 1-5, wherein the cationic lipid comprises or is a compound according to Formula (01-I) , Formula (01-I-B) , Formula (01-I-B’ ) , Formula (01-I-B” ) , Formula (01-I-C) , Formula (01-I-D) or Formula (01-I-E) , or a compound listed in Table 01; or a compound according to Formula (02-I) or Formula (02-II) , or a compound listed in Table 02; or a compound according to Formula (03-I) , or a compound listed in Table 03; or a compound according to Formula (04-I) or Formula (04-III) , or a compound listed in Table 04; or a compound according to Formula (05-I) .The liquid composition or lyophilized composition of any one of claims 1-6, wherein the empty LNP comprises: (i) the cationic lipid, (ii) a phospholipid, (iii) a steroid, and (iv) a polymer conjugated lipid.The liquid composition or lyophilized composition of claim 7, wherein the empty LNP comprises: i) between about 30 molar percent to about 55 molar percent of the cationic lipid; ii) between about 5 molar percent to about 40 molar percent of the phospholipid; iii) between about 20 molar percent to about 50 molar percent of the steroid; and iv) between about 1.0 molar percent to about 2.5 molar percent of the polymer conjugated lipid.The liquid composition or lyophilized composition of claim 7 or 8, wherein the empty LNP comprises: (i) Compound C1, Compound 03-15, Compound 04-92, Compound 04-86 or SM-102, (ii) 1, 2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC) , (iii) cholesterol, and (iv) DMG-PEG2000.The liquid composition or lyophilized composition of any one of claims 1-9, wherein the nucleic acid is an RNA; preferably, the RNA is selected from an mRNA (for example, a personalized mRNA cancer vaccine) , an sa RNA, an siRNA, an miRNA, a cirRNA, an shRNA and a lncRNA; more preferably, the nucleic acid is an mRNA.A process of preparing the liquid composition of any one of claims 1-10, the process comprising:(a) providing an LNP composition comprising the empty LNP; and(b) combining the LNP composition with the nucleic acid at a pH of about 6.5 to about 8.6, thereby forming the liquid composition.The process of claim 11, wherein step (a) comprises:mixing (i) a lipid solution comprising the cationic lipid and optionally an organic solvent with (ii) an aqueous solution, thereby forming the LNP composition.The process of claim 11 or 12, wherein the LNP composition has a pH of about 6.5 to about 8.5;preferably, the LNP composition comprises a second buffer capable of maintaining a pH of about 6.5 to about 8.5;more preferably, the second buffer is selected from a Tris buffer, a phosphate buffer, a PIPES buffer, an ADA buffer, an ACES buffer, an acetate buffer, a citrate buffer, a DIPSO buffer, a BES buffer, an MOPSO buffer, an MOPS buffer, a HEPBS buffer, a HEPPSO buffer, a HEPES buffer, a TAPSO buffer, a TEA buffer, a TES buffer, a Tricine buffer and a combination thereof.The process of any one of claims 11-13, which does not comprise a step of pH adjusting.The process of any one of claims 11-13, wherein step (a) comprises:mixing (i) a lipid solution comprising the cationic lipid and optionally an organic solvent with (ii) an aqueous solution, thereby forming an LNP solution comprising the empty LNP; andadjusting the pH of the LNP solution to about 6.5 to about 8.5, thereby forming the the LNP composition.The process of claim 15, wherein the adjusting the pH of the LNP solution is performed by buffer exchanging;preferably, the buffer exchanging is performed by using a third buffer capable of maintaining a pH of about 6.5 to about 8.5;more preferably, the third buffer is selected from a Tris buffer, a phosphate buffer, a PIPES buffer, an ADA buffer, an ACES buffer, an acetate buffer, a citrate buffer, a DIPSO buffer, a BES buffer, an MOPSO buffer, an MOPS buffer, a HEPBS buffer, a HEPPSO buffer, a HEPES buffer, a TAPSO buffer, a TEA buffer, a TES buffer, a Tricine buffer and a combination thereof.The process of any one of claims 11-16, wherein step (a) further comprises processing the LNP composition;preferably, the processing comprises at least one step selected from removing the organic solvent, filtering, buffer exchanging, diluting, dialyzing, concentrating, adding a cryoprotectant, and packing; more preferably, the processing removes the organic solvent.The process of any one of claims 11-17, wherein the organic solvent is an alcohol, for example ethanol.A process of preparing a lyophilized composition, comprising lyophilizing the liquid composition of any one of claims 1-10 in the presence of a cryoprotectant, for example, sucrose.A process of preparing a lipid nanoparticle (LNP) formulation comprising an LNP associated with a nucleic acid, the process comprising:adjusting the pH of the liquid composition of any one of claims 1-10 to a pH suitable for encapsulation of the nucleic acid by the LNP, thereby forming the LNP formulation; orreconstituting the lyophilized composition of any one of claims 1-10 at a pH suitable for encapsulation of the nucleic acid by the LNP, thereby forming the LNP formulation.The process of claim 20, wherein the pH suitable for encapsulation of the nucleic acid by the LNP is about 4.25 to about 6.5, about 4.5 to about 6.0, about 4.8 to about 6.0, about 5.0 to about 6.0, or about 5.1 to about 5.9.The process of claim 20 or 21, wherein the adjusting the pH of the liquid composition or the reconstituting the lyophilized composition is performed by using an acidic buffer;preferably, the acidic buffer is capable of maintaining a pH of about 2.0 to about 5.5; and / orthe acidic buffer is selected from a citrate buffer, a maleic acid buffer, an acetate buffer, an MES (2-Morpholinoethanesulphonic acid) buffer, a phosphate buffer, a malic acid buffer, a tartaric acid buffer, a succinic acid buffer, and a combination thereof; and / orthe acidic buffer has a buffer concentration of about 1 mM to about 20 mM.The process of any one of claims 20-22, wherein the encapsulation is carried out for a period of about 10 seconds to about 24 hours, preferably for a period of about 1 hour or less, about 50 minutes or less, about 40 minutes or less, about 30 minutes or less, about 20 minutes or less, or about 10 minutes or less.The process of any one of claims 20-23, further comprising processing the LNP formulation; preferably, wherein the processing comprises at least one step selected from filtering, buffer exchanging, diluting, dialyzing, concentrating, pH adjusting, adding a cryoprotectant, lyophilizing and packing.The process of any one of claims 20-24, wherein the encapsulation efficiency of the nucleic acid is at least 80%.A lipid nanoparticle (LNP) formulation prepared by the process of any of claims 20-25.A kit comprising a first container comprising the liquid composition or lyophilized composition of any one of claims 1-10, and optionally a second container comprising an acidic buffer.The kit of claim 27, wherein the acidic buffer is capable of maintaining a pH of about 2.0 to about 5.0;preferably, the acidic buffer is selected from a citrate buffer, a maleic acid buffer, an acetate buffer, an MES (2-Morpholinoethanesulphonic acid) buffer, a phosphate buffer, a malic acid buffer, a tartaric acid buffer, a succinic acid buffer, and a combination thereof; and / orthe acidic buffer has a buffer concentration of about 1 mM to about 20 mM.The kit of claim 27 or 28 further comprising instructions for combining the contents of the first container with the contents of the second container.A method of treating or preventing a disease in a subject in need thereof, the method comprising administering to the subject a therapeutically effective amount of the LNP formulation of claim 26, wherein the expression of the nucleic acid in the subject treats or prevents the disease.The method of claim 30, wherein the nucleic acid encodes a polypeptide of interest, wherein the expression of the polypeptide of interest in the subject treats or prevents the disease.A method of introducing a nucleic acid to a cell or a subject in need thereof, comprising(Ⅰa) adjusting the pH of the liquid composition of any one of claims 1-10 to a pH suitable for encapsulation of the nucleic acid by the LNP, thereby forming an LNP formulation comprising the LNP associated with the nucleic acid; or(Ⅰb) reconstituting the lyophilized composition of any one of claims 1-10 at a pH suitable for encapsulation of the nucleic acid by the LNP, thereby forming an LNP formulation comprising the LNP associated with the nucleic acid; and(Ⅱ) administering the LNP formulation to the cell or the subject.The method of claim 32, wherein the pH suitable for encapsulation of the nucleic acid by the LNP is about 4.25 to about 6.5, about 4.5 to about 6.0, about 4.8 to about 6.0, or about 5.0 to about 6.0, or about 5.1 to about 5.9.The method of claim 32 or 33, wherein the adjusting the pH of the liquid composition or the reconstituting the lyophilized composition is performed by using an acidic buffer;preferably, the acidic buffer is capable of maintaing a pH of about 2.0 to about 5.5; and / orthe acidic buffer is selected from a citrate buffer, a maleic acid buffer, an acetate buffer, an MES (2-Morpholinoethanesulphonic acid) buffer, a phosphate buffer, a malic acid buffer, a tartaric acid buffer, a succinic acid buffer, and a combination thereof; and / orthe acidic buffer has a buffer concentration of about 1 mM to about 20 mM.The method of any one of claims 32-34, wherein the encapsulation is carried out for a period of about 1 hour or less, about 50 minutes or less, about 40 minutes or less, about 30 minutes or less, about 20 minutes or less, or about 10 minutes or less.The method of any one of claims 32-35, which does not comprise processing the LNP formulation prior to the administering.The method of any one of claims 32-36, wherein the nucleic acid encodes a polypeptide of interest.An apparatus for preparing a liquid composition comprising an empty lipid nanoparticle (LNP) and a nucleic acid, the apparatus comprisinga formulation module (1) configured to combine a nucleic acid solution comprising the nucleic acid with an LNP solution comprising the empty LNP and optionally a cryoprotectant, at a pH of about 6.5 to about 8.6, thereby forming the liquid composition.The apparatus of claim 38, wherein the formulation module (1) comprisesa first feeding unit (2) for providing the nucleic acid solution,a second feeding unit (3) for providing the LNP solution, anda first mixing channel (4) in fluid communication with the first feeding unit (2) and the second feeding unit (3) ,wherein the first feeding unit (2) and the second feeding unit (3) are configured to mix the nucleic acid solution and the LNP solution in the first mixing channel (4) , thereby forming the liquid composition.The apparatus of claim 39, whereinthe first feeding unit (2) comprises a first reservoir (5) connected to a first feeding channel (6) via a first pumping device (15) ,the second feeding unit (3) comprises a second reservoir (7) connected to a second feeding channel (8) via a second pumping device (16) ,wherein the first feeding channel (6) and the second feeding channel (8) are in fluid communication with the first mixing channel (4) .The apparatus of claim 40, wherein the formulation module (1) further comprises a third feeding unit (9) , anda second mixing channel (10) in fluid communication with the third feeding unit (9) and the first mixing channel (4) ,wherein the third feeding unit (9) is configured to provide a storage buffer for the lipid composition.The apparatus of claim 41, wherein the third feeding unit (9) comprises a third reservoir (11) connected to a third feeding channel (12) via a third pumping device (17) , and the third feeding channel (12) is in fluid communication with the first mixing channel (4) and the second mixing channel (10) .The apparatus of any one of claims 38-42, further comprising a storage unit (13) for storing the liquid composition and a waste collection unit (14) , wherein the storage unit (13) and the waste collection unit (14) are in fluid communication with the formulation module (1) .An apparatus for preparing a lipid nanoparticle (LNP) formulation comprising an LNP associated with a nucleic acid, the apparatus comprising a formulation module (1) configured to provide a liquid composition comprising an empty LNP and a nucleic acid and adjust the pH of the liquid composition to a pH suitable for encapsulation of the nucleic acid by the LNP, thereby forming the LNP formulation,wherein the liquid composition has a pH of about 6.5 to about 8.6, and the empty LNP comprises a cationic lipid.The apparatus of claim 44, wherein the formulation module (1) comprisesa first feeding unit (2) for providing a nucleic acid solution comprising the nucleic acid,a second feeding unit (3) for providing an LNP solution comprising the empty LNP, anda first mixing channel (4) in fluid communication with the first feeding unit (2) and the second feeding unit (3) ,wherein the first feeding unit (2) and the second feeding unit (3) are configured to mix the nucleic acid solution and the LNP solution in the first mixing channel (4) , thereby forming the liquid composition.The apparatus of claim 45, whereinthe first feeding unit (2) comprises a first reservoir (5) connected to a first feeding channel (6) via a first pumping device (15) ,the second feeding unit (3) comprises a second reservoir (7) connected to a second feeding channel (8) via a second pumping device (16) ,wherein the first feeding channel (6) and the second feeding channel (8) are in fluid communication with the first mixing channel (4) .The apparatus of claim 46, wherein the formulation module (1) further comprisesa third feeding unit (9) , anda second mixing channel (10) in fluid communication with the third feeding unit (9) and the first mixing channel (4) ,wherein the third feeding unit (9) is configured to provide an acidic buffer to adjust the pH of the liquid composition to a pH suitable for encapsulation of the nucleic acid by the LNP in the second mixing channel (10) , thereby forming the LNP formulation.The apparature of claim 47, wherein the third feeding unit (9) comprises a third reservoir (11) connected to a third feeding channel (12) via a third pumping device (17) , and the third feeding channel (12) is in fluid communication with the first mixing channel (4) and the second mixing channel (10) .The apparatus of any one of claims 44-48, further comprising a storage unit (13) for storing the LNP formulation and a waste collection unit (14) , wherein the storage unit (13) and the waste collection unit (14) are in fluid communication with the formulation module (1) .The apparatus of any one of claims 39-43 and 45-49, wherein each of the units is configured for single use.The apparatus of any one of claims 38-50, wherein the nucleic acid is an mRNA, optionally a personalized mRNA cancer vaccine.A process of preparing a liquid composition comprising an empty lipid nanoparticle (LNP) and an mRNA, wherein the empty LNP comprises a cationic lipid, the process comprising:in vitro transcribing a DNA template to produce the mRNA,digesting the DNA template to obtain a crude mRNA mixture,subjecting the crude mRNA mixture to chromatographic purification,subjecting the purified mRNA to filtration sterilization, thereby obtaining an mRNA solution comprising the mRNA, andcombining the mRNA solution with an LNP solution comprising the empty LNP at a pH of about 6.5 to about 8.6, thereby forming the liquid composition.A process of preparing a lipid nanoparticle (LNP) formulation comprising an LNP associated with an mRNA, the process comprising:in vitro transcribing a DNA template to produce the mRNA,digesting the DNA template to obtain a crude mRNA mixture,subjecting the crude mRNA mixture to chromatographic purification,subjecting the purified mRNA to filtration sterilization, thereby obtaining an mRNA solution comprising the mRNA,combining the mRNA solution with an LNP solution comprising an empty LNP at a pH of about 6.5 to about 8.6 to obtain a liquid composition comprising the empty LNP and the mRNA and having a pH of about 6.5 to about 8.6, andadjusting the pH of the liquid composition to a pH suitable for encapsulation of the mRNA by the LNP, thereby forming the LNP formulation.The process of claim 52 or 53, further comprising exchanging the buffer and / or adjusting the concentration of the purified mRNA before the filtration sterilization; preferably, the exchanging the buffer and adjusting the concentration is performed by ultrafiltration and diafiltration (UF / DF) .The process of any one of claims 52-54, wherein the chromatographic purification comprises affinity chromatography.The process of any one of claims 52-55, wherein the mRNA is a personalized mRNA cancer vaccine.The process of any one of claims 52 and 54-56, wherein the combining is performed in the formulation module (1) as defined in any one of claims 39-42 and 50.The process of any one of claims 53-56, wherein the combining and the pH adjusting are performed in the formulation module (1) as defined in any one of claims 45-48 and 50.

Images