Methods for producing mesenchymal stem cells from expanded potential stem cells

Abstract

Provided are the novel methods of differentiating mesenchymal stem cells (MSCs) from expanded potential stem cells (EPSCs), as well as the MSCs produced by said method. Also provided are compositions of MSCs differentiated from EPSCs and uses thereof.

Description

METHODS FOR PRODUCING MESENCHYMAL STEM CELLS FROM EXPANDED POTENTIAL STEM CELLSCROSS REFERENCE TO RELATED APPLICATIONS

[0001] This application claims priority to US Provisional Application No. 63 / 746,724, filed January 17, 2025, the content of which is hereby expressly incorporated by reference in its entirety.FIELD OF THE INVENTION

[0002] The present disclosure relates to novel methods of generating mesenchymal stem cells (MSCs) from expanded potential stem cells (EPSCs) , as well as uses thereof.BACKGROUND OF THE INVENTION

[0003] Mesenchymal stem cells (MSCs) show potential for use in overcoming a wide range of diseases. Apart from tissue-derived MSCs, researchers are increasingly interested in stem cell-derived MSCs due to better quality control of therapeutic cell products under good manufacturing practice (GMP) regulations and improved MSC properties compared to adult MSCs. For example, MSCs derived from induced pluripotent stem cells (iPSC-MSC) can significantly improve blood perfusion in a mouse model of hind-limb ischemia by promoting angiogenesis and immunomodulation.

[0004] Expanded potential stem cells (EPSCs) are shown to be more  compared to iPSCs. EPSCs display genetic stability and an ability to rapidly differentiate into both embryonic and extra-embryonic cell lineages, including trophoblastic cells. Although recent protocols support the differentiation of pluripotent stem cells (PSCs) , such as embryonic stem cells (ESCs) and iPSCs, into trophoblast-like cells expressing trophoblast markers, the authenticity of the derived trophoblasts remains questionable. Furthermore, to date there are no research studies on differentiating EPSCs to MSCs.

[0005] The disclosure of all publications, patents, patent publications and published patent applications referred to herein are hereby incorporated by reference in their entirety. BRIEF SUMMARY OF THE INVENTION

[0006] The present application in one aspect provides a method for generating a population of mesenchymal stem cells (MSCs) from Expanded Potential Stem Cells (EPSCs) , comprising subjecting the EPSCs to a first condition that differentiates the EPSCs into a population of trophoblast cells, wherein the first condition comprises an inhibitor of activin receptor-like kinase (ALK) receptor, and wherein the first condition does not comprise a BMP4 agonist.

[0007] The present application in a second aspect provides a method for generating a population of trophoblast cells from Expanded Potential Stem Cells (EPSCs) , comprising subjecting the EPSCs to a first condition that differentiates the EPSC into the population of trophoblast cells, wherein the first condition comprises an inhibitor of activin receptor-like kinase (ALK) receptor, and wherein the first condition does not comprise a BMP4 agonist.

[0008] In some embodiments, the inhibitor of ALK receptor is selected from the group consisting of SB-431542, A-83-01, and LY-2157299. In some embodiments, the inhibitor of ALK receptor is SB-431542. In some embodiments, the first condition comprises about 5μM to about 15μM SB-431542. In some embodiments, the first condition comprises about 10μM SB-431542.

[0009] In some embodiments according to any of the embodiments described above, the first condition further comprises a serum-free medium supplement (e.g., KnockOutTM SR) , non-essential amino acids (NEAA) , beta-mercaptoethanol, or penicillin-streptomycin-glutamine PSG) , or any combination thereof

[0010] In some embodiments according to any of the embodiments described above, the EPSCs are not in contact with a feeder cell population when subjected to the first condition.

[0011] In some embodiments according to any of the embodiments described above, the EPSCs are subjected to the first condition for less than three days. In some embodiments, the EPSCs are subjected to the first condition for about 2 days.

[0012] In some embodiments according to any of the embodiments described above, the EPSCs are subjected to the first condition at a temperature of about 37℃.

[0013] In some embodiments according to any of the embodiments described above, the EPSCs are subjected to the first condition in the presence of about 3%to about 6%CO2. In some embodiments, the EPSCs are subjected to the first condition in the presence of about 5%CO2.

[0014] In some embodiments according to any of the embodiments described above, the population of trophoblast cells expresses one or more trophoblast markers selected from the group consisting GATA3, GATA2, CDX2, KRT7, and TFAP2C. In some embodiments, the population of trophoblast cells expresses one or more trophoblast markers selected from the group consisting of GATA2, CDX2, and KRT7. In some embodiments, the population of trophoblast cells shows reduced expression of one or more pluripotency markers selected from the group consisting of OCT4, SOX2, and NANOG.

[0015] In some embodiments according to any of the embodiments described above, the method further comprises subjecting the population of trophoblast cells to a second condition that differentiates the population of trophoblast cells to a population of mesenchymal stem cells (MSCs) derived from EPSCs. In some embodiments, the second condition comprises Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) and Epidermal Growth Factor (EGF) . In some embodiments, the second condition comprises about 3 ng / mL to about 7 ng / mL bFGF. In some embodiments, the second condition comprises about 5 ng / mL bFGF. In some embodiments, the second condition comprises about 3 ng / mL to about 7 ng / mL EGF. In some embodiments, the second condition comprises about 5 ng / mL EGF.

[0016] In some embodiments according to any of the embodiments described above, the second condition further comprises fetal bovine serum (FBS) , non-essential amino acids, or beta-mercaptoethanol, or any combination thereof.

[0017] In some embodiments according to any of the embodiments described above, the population of trophoblast cells or cells derived therefrom are subjected to the second condition at a temperature of about 37℃.

[0018] In some embodiments according to any of the embodiments described above, the population of trophoblast cells or cells derived therefrom are subjected to the second condition in the presence of about 3%to about 6%CO2. In some embodiments, the population of trophoblast cells or the cells derived therefrom are subjected to the second condition in the presence of about 5%CO2.

[0019] In some embodiments according to any of the embodiments described above, the population of trophoblast cells or cells derived therefrom are subjected to the second condition for at least about 5 days. In some embodiments, at or after the at least about 5 days, the population of trophoblast cells or the cells derived therefrom are passaged. In some embodiments, the passaging comprises dissociating the population of trophoblast cells or the cells derived therefrom. In some embodiments, the dissociating comprises treating the population of trophoblast cells or the cells derived therefrom with trypsin. In some embodiments, the population of trophoblast cells or the cells derived therefrom are passaged at a ratio of about 1: 3 to about 1: 5.

[0020] In some embodiments according to any of the embodiments described above, the population of trophoblast cells or the cells derived therefrom are further subjected to the second condition for at least about 7 days. In some embodiments, around the at least about 7 days, the population of trophoblast cells or the cells derived therefrom are passaged.

[0021] In some embodiments according to any of the embodiments described above, the population of trophoblast cells or the cells derived therefrom are treated to one or more subsequent rounds of being subjected to the second condition for at least about 7 days and passaging, until the population of MSCs are differentiated.

[0022] In some embodiments according to any of the embodiments described above, the population of MSCs expresses one or more mesenchymal stem cell (MSC) markers selected from the group consisting of CD73, CD90, CD105, CD44, and CD29. In some embodiments, the population of MSCs is differentiated when greater than or equal to about 90%of cells derived from the population of trophoblast cells or cells derived therefrom express the one or more MSC markers.

[0023] In some embodiments according to any of the embodiments described above, the population of MSCs show no expression of one or more surface markers selected from the group consisting of CD45, CD34, CD11b, CD79a, and HLA-DR. In some embodiments, the population of MSCs shows reduced expression relative to the EPSCs or no expression of one or more pluripotency markers selected from the group consisting of OCT4, SOX2, and NANOG. In some embodiments, the population of MSCs shows reduced expression relative to the population of trophoblast cells or no expression of one or more trophoblast cell markers selected from the group consisting of GATA2, CDX2, and KRT7.

[0024] In some embodiments according to any of the embodiments described above, the population of MSCs shows increased expression of one or more genes selected from the group consisting of PVR, LINC02693, PID1, ULBP1, PDGFB, F3, INA, ULBP2, HSD11B1, HOXB2, HOXB4, KCNN2, XAF1, TRPM2, MAGEA3, NKX2.5, and TYRP1 at levels at least about 2-fold increased compared to a population of MSCs derived from induced pluripotent stem cells (iPSCs) . In some embodiments, the population of MSCs expresses PDGFB.

[0025] In some embodiments according to any of the embodiments described above, the population of MSCs shows reduced expression of one or more genes selected from the group consisting of LDOC1, TFAP2A, CPE, CLEC11A, SFRP2, BGN, CXCL12, HEPH, DLX1, BST1, CALHM2, PRRX1, NYNRIN, TMT1A, TMEM119, CD24, NLGN1, EBF2, EPB41L3, FES, and NFIB at levels at least about 2-fold increased compared to a population of MSCs derived from induced pluripotent stem cells (iPSCs) .

[0026] In some embodiments according to any of the embodiments described above, the population of MSCs are capable of differentiating into one or more of adipocytes, osteoblasts, and / or chondrocytes.

[0027] In some embodiments according to any of the embodiments described above, the population of MSCs are capable of promoting angiogenesis.

[0028] In some embodiments according to any of the embodiments described above, the population of MSCs are capable of recruiting one or more of macrophages, endothelial cells, and / or pericytes. In some embodiments, the macrophages are M2 macrophages. In some embodiments, the endothelial cells are CD31+ endothelial cells. In some embodiments, the pericytes are PDGFRbeta+NG2+ pericytes.

[0029] Also provided is a composition comprising a population of cells differentiated from a population of expanded potential stem cells (EPSCs) according to any of the methods described herein.

[0030] Also provided is a composition comprising a population of mesenchymal stem cells (MSCs) differentiated from a population of expanded potential stem cells (EPSCs) according to according to any of the methods described herein.

[0031] The present application in another aspect provides a composition comprising a population of mesenchymal stem cells (MSCs) differentiated from a population of expanded potential stem cells (EPSCs) , wherein the MSCs express one or more markers selected from the group consisting of CD73, CD90, CD105, CD44, and CD29.

[0032] In some embodiments according to any of the compositions described above, the population of MSCs have reduced expression or no expression of one or more markers selected from the group consisting of OCT4, SOX2, NANOG, GATA2, TFAP2A, TFAP2C, KRT7, TP63, ELF5, EPAS1, SP6, and ERVW-1.

[0033] In some embodiments according to any of the compositions described above, the population of MSCs: (i) expresses one or more genes selected from the group consisting of PVR, LINC02693, PID1, ULBP1, PDGFB, F3, INA, ULBP2, HSD11B1, HOXB2, HOXB4, KCNN2, XAF1, TRPM2, MAGEA3, NKX2.5, and TYRP1 at levels at least about 2-fold increased compared to a population of MSCs derived from induced pluripotent stem cells (iPSCs) ; and / or (ii) expresses one or more genes selected from the group consisting of LDOC1, TFAP2A, CPE, CLEC11A, SFRP2, BGN, CXCL12, HEPH, DLX1, BST1, CALHM2, PRRX1, NYNRIN, TMT1A, TMEM119, CD24, NLGN1, EBF2, EPB41L3, FES, and NFIB at levels at least about 2-fold decreased compared to a population of MSCs derived from induced pluripotent stem cells (iPSCs) .

[0034] In some embodiments according to any of the compositions described above, the population of MSCs is capable of differentiating into one or more of adipocytes, osteoblasts, and / or chondrocytes.

[0035] In some embodiments according to any of the compositions described above, the population of MSCs is capable of promoting angiogenesis.

[0036] In some embodiments according to any of the compositions described above, the population of MSCs is capable of recruiting one or more of macrophages, endothelial cells, and / or pericytes. In some embodiments, the macrophages are M2 macrophages. In some embodiments, the endothelial cells are CD31+ endothelial cells. In some embodiments, the pericytes are PDGFRbeta+NG2+ pericytes.

[0037] Also provided are pharmaceutical compositions comprising any of the compositions or populations of MSCs described herein.

[0038] Further provided are methods of treating a disease in an individual in need thereof, comprising administering to the individual a therapeutically effective amount of any of the compositions or pharmaceutical compositions described herein. In some embodiments, the method of treatment further comprises selecting the individual for treatment based on level of mesenchymal stem cells (MSCs) or pericytes.

[0039] In some embodiments according to any of the methods of treating a disease described above, the disease is selected from the group consisting of ischemia, a bone disorder or injury, a chondrocyte disorder or injury, a musculoskeletal disease, a neurodegenerative disease, an inflammatory disorder, an autoimmune disorder, kidney disease or injury, liver disease or injury, lung disease or injury, brain disease or injury, cardiac disease or injury, joint disease or injury, acute injury of a tissue, a vascular disease or disorder, and an infection. In some embodiments, the disease is selected from the group consisting of ischemia, ischemic stroke (IS) , microvascular ischemic disease (MVID) , perivascular kidney disease (PVKD) , chronic kidney disease (CKD) , peritubular capillary rarefaction (PTC) , small vessel disease (SVD) , peripheral artery disease (PAD) , hepatic ischemia (HI) , ischemic cholangiopathy (IC) , vascular dementia (VD) , Alzheimer’s disease (AD) , traumatic brain injury (TBI) , amyotrophic lateral sclerosis (ALS) , multiple sclerosis (MS) diabetes, diabetic retinopathy (DR) , diabetic nephropathy (DN) , glaucoma, Parkinson’s disease (PD) , sepsis, cardiovascular disease (CVD) , myocardial infarction (MI) , acute lung injury (ALI) , pulmonary arterial hypertension (PAH) , SARS-CoV-2 infection, ischemic bone necrosis, osteoporosis, osteopenia, osteoarthritis, juvenile idiopathic arthritis, gout, joint injury, synovial osteochondromatosis (SOC) , cartilage ischemia, epiphyseal avascular necrosis, and hyaline cartilage degeneration. In some embodiments, the disease is ischemia or perivascular kidney disease.

[0040] In some embodiments according to any of the methods of treating a disease described above, the composition or pharmaceutical composition is administered to the individual at least once. In some embodiments, the composition or pharmaceutical composition is administered to the individual at least twice. In some embodiments, the composition or pharmaceutical composition is administered to the individual at least twice, and wherein each administration is separated by at least about one week. In some embodiments, each administration is separated by at least about four weeks. In some embodiments, the composition or pharmaceutical composition is administered locally or systemically. In some embodiments, the route of administration of the composition or pharmaceutical composition is selected from the group consisting of intra-organ, intravascular, intraventricular, intravenous, intraarterial, intranasal, subcutaneous, intraperitoneal, intramedullary, intraarticular, intrasynovial, intracartilaginous, intrabiliary, intracardiac, intrapericardial, intraocular, intrapulmonary, intrapleural, intrabronchial, intracranial, intrathecal, or intramuscular administration.BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

[0041] FIGs. 1A-1F depict differentiation of EPSCs from iPSCs and compare the ability of each population to generate trophoblast stem cells (TSCs) . FIG. 1A includes representative micrographs showing the typical morphologies of iPSCs (IMR90-iPSC) and EPSCs (IMR90-EPSC) resulting from 2–4-week culture in human EPSC medium (hEPSCM) . FIG. 1B demonstrates the increased differentiation capacity of EPSCs to generate TSCs compared to iPSCs after culture in TSC medium. Representative micrographs show the typical morphological changes that take place during differentiation of TSCs. FIG. 1C shows representative immunofluorescence staining for trophoblast-related protein GATA2, TFAP2C, and KRT2 with DAPI counterstaining after 7-day culture in TSC medium. FIG. 1D shows quantification of RNA expression of TSC markers and syncytiotrophoblast (STB) markers after 7-day culture in TSC medium. For each gene, the bars from left to right are: IMR90-iPSC, IMR90-EPSC, and M1-EPSC. FIG. 1E shows quantification of pluripotent gene expression from day 0 to day 7 culture in TSC medium. For each day of each gene, the bars from left to right are: IMR90-iPSC, IMR90-EPSC, and M1-EPSC. FIG. 1F shows representative H&E staining images for 3-germ layers in teratomas formed from EPSCs (IMR90-EPSC) .

[0042] FIGs. 2A-2D depict the protocol for differentiation of MSCs from EPSCs. FIG. 2A shows a schematic for the culturing protocol for EPSC to MSC differentiation, as well as representative micrographs showing the typical cellular morphologies at days 1, 3, 7, 14, and 21 during the process. FIG. 2B depicts representative immunofluorescence staining showing all EPSC lines expressing CDX2, KRT7, TFAP2C and GATA3 after 2 days treatment with SB-431542. FIG. 2C shows upregulation of RNA for trophoblast markers Cdx2, Krt7, and Gata2 (arranged from left to right for each cell group) following this differentiation protocol. FIG. 2D shows downregulation of RNA for pluripotency markers Sox2, Nanog, and Oct4 (arranged from left to right for each cell group) following this differentiation protocol.

[0043] FIGs. 3A-3B show phenotypic and functional characterization of MSCs from EPSC cell lines M1 (M1-EPSC-MSCs) , C5 (C5-EPSC-MSC) , and IMR90 (IMR90-EPSC-MSC) . FIG. 3A shows flow cytometry results for MSC surface markers CD73, CD90, CD105, CD44 and CD29 as well as negative markers CD45, CD34, CD11b, CD79a and HLA-DR. FIG. 3B shows that all EPSC-MSC populations can undergo adipogenesis, osteogenesis and chondrogenesis. Oil red stain shows oil droplets in adipocytes, and cells are positive for fatty acid binding protein 4 (FABP4) . Alizarin Red staining identifies calcium containing osteocytes, and the cells express osteocalcin. Alcian blue staining and aggrecan positive signal in immunofluorescence staining identifies the presence of chondrocytes.

[0044] FIGs. 4A-4C show comparison of transcriptomes between EPSC-derived MSCs (e-MSCs) and iPSC-derived MSCs (i-MSCs) . FIG. 4A shows principal component analysis (PCA) and cluster diagram between e-MSC and i-MSC populations. FIG. 4B shows a heatmap of differential gene expression between e-MSC and i-MSC populations. FIG. 4C shows Gene Ontology (GO) enrichment analysis of e-MSC and i-MSC populations.

[0045] FIGs. 5A-5B show expression differences between e-MSC and i-MSC populations in angiogenic-related genes. FIG. 5A depicts a heatmap showing differentially expressed angiogogenic-related genes between e-MSC and i-MSC. FIG. 5B shows qPCR data on fold-change gene expression differences of angiogenesis-related genes Pdgfb, Pdgfc, and Vegfd between e-MSC and iMSC populations.

[0046] FIGs. 6A-6D show vascularizing effects of e-MSCs and i-MSCs in a hindlimb ischemia mouse model. FIG. 6A shows representative images of recovery of blood perfusion in ischemia group, e-MSC group and i-MSC group at 4 weeks following femoral artery ligation, with FIG. 6B showing quantification of recovery as measured by perfusion ratio (ratio of ischemic: non-ischemic hindlimb) . FIG. 6C shows representative immunofluorescence images and quantification of α-smooth muscle actin-positive (α-SMA+) blood vessels with DAPI counterstaining at weeks 1 and 4 following femoral artery ligation. FIG. 6D shows representative immunofluorescence images and quantification of von Willebrand Factor-positive (vWF+) blood vessels with DAPI counterstaining at weeks 1 and 4 following femoral artery ligation.

[0047] FIGs. 7A-7D show secretome profiles of differentially expressed proteins and pathway enrichment in muscle protein extract from mice treated with either e-MSC or i-MSC following femoral artery ligation assay, or ischemic controls. FIG. 7A shows a heatmap of all 96 secretome proteins profiled at week 1 and week 4 following femoral artery ligation assay. FIG. 7B shows a heatmap of proteins that are significantly different in expression between all groups. FIG. 7C shows NPX levels of angiogenesis or inflammatory-related proteins at week 1 and week 4 following femoral artery ligation assay. FIG. 7D shows a volcano plot of differential proteins in week 1 (e-MSC group vs. i-MSC group) .

[0048] FIGs. 8A-8B show infiltration of M2 macrophages in mice treated with either e-MSC or i-MSC following femoral artery ligation assay, or ischemic controls. The total number of macrophages (FIG. 8A) the number of M2 macrophages (FIG. 8B) in all groups are shown at week 1 and week 4 following femoral artery ligation assay, including representative immunofluorescence images and quantification.

[0049] FIGs. 9A-9B show recruitment of pericytes and maturation of vasculature in MSC-treatment groups or ischemic controls following femoral artery ligation assay. FIG. 9A shows representative immunofluorescence images and quantification of PDGFRβ+ / NG2+ pericyte recruitment in all groups at week 4 following femoral artery ligation assay. FIG. 9B shows representative immunofluorescence images and quantification of PDGFRβ+ / CD31+ blood vessels at week 4 following femoral artery ligation assay.DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

[0050] The present application provides novel methods of generating a population of mesenchymal stem cells (MSCs) from Expanded Potential Stem Cells (EPSCs) . The conditions and agents (e.g., inhibitor of activin receptor-like kinase (ALK) receptor) of the methods are specifically designed such that the resulting MSCs show unique genetic profile and functional properties relative to MSCs generated from induced pluripotent stem cells (iPSCs) .

[0051] Further, it was demonstrated that the population of MSCs derived from EPSCs exhibited the ability to differentiate into any of adipocytes, osteoblasts, and chondrocytes, as well as the ability to promote angiogenesis. Surprisingly, the population of MSCs derived from EPSCs exhibited significantly increased recruitment of macrophages, endothelial cells, and / or pericytes compared to a population of MSCs derived from iPSCs.

[0052] Thus, in one aspect, provided herein is a method for generating a population of MSCs from EPSCs, comprising: subjecting the EPSCs to a first condition that differentiates the EPSC into a population of trophoblast cells, wherein the first condition comprises an inhibitor of activin receptor-like kinase (ALK) receptor, and wherein the first condition does not comprise a BMP4 agonist, as well as compositions (e.g., pharmaceutical compositions) comprising the MSCs that are generated as disclosed herein.

[0053] In another aspect, provided herein is a composition of mesenchymal stem cells differentiated from a population of expanded potential stem cells (EPSCs) according to any of the methods of generating disclosed herein.

[0054] In another aspect, provided herein is a method of treating a disease in an individual, promoting wound repair in an individual, promoting tissue regeneration in an individual, or promoting angiogenesis in an individual comprising administering to the individual an effective amount of the pharmaceutical composition disclosed herein. I. Definitions

[0055] Techniques and procedures described or referenced herein include those that are generally well understood and / or commonly employed using conventional methodology by those skilled in the art, such as, for example, the widely utilized methodologies described in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4d ed. 2012) and Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al. eds., 2012) . Unless otherwise defined herein, technical and scientific terms used in the present description have the meanings that are commonly understood by those of ordinary skill in the art. For purposes of interpreting this specification, the following description of terms will apply and whenever appropriate, terms used in the singular will also include the plural and vice versa. In the event that any description of a term set forth conflicts with any document incorporated herein by reference, the description of the term set forth below shall control.

[0056] As used herein, the term “autologous” is meant to refer to any material derived from the same individual to whom it is later to be re-introduced into the individual.

[0057] As used herein, the term “allogeneic” refers to a graft derived from a different individual of the same species.

[0058] As used herein, the term “pharmaceutically acceptable” means being approved by a regulatory agency of the Federal or a state government, or listed in United States Pharmacopeia, European Pharmacopeia, or other generally recognized Pharmacopeia for use in animals, and more particularly in humans.

[0059] As used herein, the term “effective amount” or “therapeutically effective amount” refers to the amount of an antibody or a therapeutic molecule comprising an agent and the antibody or pharmaceutical composition provided herein which is sufficient to result in the desired outcome.

[0060] As used herein, the terms “subject, ” “individual, ” and “patient” may be used interchangeably. As used herein, in certain embodiments, a subject or an individual is a mammal, such as a non-primate or a primate (e.g., human) . In specific embodiments, the individual is a human. In one embodiment, the individual is a mammal, e.g., a human, diagnosed with a disease or disorder, or at risk of developing a disease or disorder.

[0061] As used herein, the terms “treat, ” “treatment” and “treating” refer to the reduction or amelioration of the progression, severity, and / or duration of a disease or condition resulting from the administration of one or more therapies. Treating may be determined by assessing whether there has been a decrease, alleviation and / or mitigation of one or more symptoms associated with the underlying disorder such that an improvement is observed with the patient, despite that the patient may still be afflicted with the underlying disorder. The term “treating” includes both managing and ameliorating the disease. The terms “manage, ” “managing, ” and “management” refer to the beneficial effects that a subject derives from a therapy which does not necessarily result in a cure of the disease.

[0062] As used herein, the terms “prevent, ” “preventing, ” and “prevention” refer to reducing the likelihood of the onset (or recurrence) of a disease, disorder, condition, or associated symptom (s) .

[0063] As used herein, the terms “about” and “approximately” mean within 20%, within 15%, within 10%, within 9%, within 8%, within 7%, within 6%, within 5%, within 4%, within 3%, within 2%, within 1%, or less of a given value or range.

[0064] As used in the present disclosure and claims, the singular forms “a” , “an” and “the” include plural forms unless the context clearly dictates otherwise.

[0065] It is understood that wherever embodiments are described herein with the term “comprising” otherwise analogous embodiments described in terms of “consisting of” and / or “consisting essentially of” are also provided. It is also understood that wherever embodiments are described herein with the phrase “consisting essentially of” otherwise analogous embodiments described in terms of “consisting of” are also provided.

[0066] As used herein, the term “between” as used in a phrase as such “between A and B” or “between A-B” refers to a range including both A and B.

[0067] As used herein, the term “and / or” as used in a phrase such as “Aand / or B” herein is intended to include both A and B; A or B; A (alone) ; and B (alone) . Likewise, the term “and / or” as used in a phrase such as “A, B, and / or C” is intended to encompass each of the following embodiments: A, B, and C; A, B, or C; A or C; A or B; B or C; A and C; A and B; B and C; A (alone) ; B (alone) ; and C (alone) . II. Methods of Generating a Population of Cells

[0068] The present application in one aspect provides a method for generating a population of mesenchymal stem cells (MSCs) from Expanded Potential Stem Cells (EPSCs) , comprising subjecting the EPSCs to a first condition that differentiates the EPSC into a population of trophoblast cells, wherein the first condition comprises an inhibitor of activin receptor-like kinase (ALK) receptor, wherein the first condition does not comprise a BMP4 agonist. In some embodiments, the inhibitor of ALK receptor is selected from the group consisting of SB-431542, A-83-01, and LY-2157299. In some embodiments, wherein the inhibitor of ALK receptor is SB-431542. In some embodiments, the first condition comprises about 5 μM to about 15 μM (e.g., about 10 μM) SB-431542. In some embodiments, the first condition further comprises a serum-free medium supplement. Without being bound by theory, the serum-free medium supplement can be used to replace a serum supplementation in cell culture, thereby allowing for a culture formulation with defined components that supports cell growth and proliferation. In some embodiments, the serum-free medium supplement is KnockOutTM Serum Replacement (KnockOutTM SR; e.g., ThermoFisher Scientific Cat. #10828028) . In some embodiments, the first condition further comprises one or more components selected from the group consisting of non-essential amino acids (NEAA) , beta-mercaptoethanol, and penicillin-streptomycin-glutamine (PSG) , or any combination thereof.

[0069] The present application in another aspect provides a method for generating a population of trophoblast cells from Expanded Potential Stem Cells (EPSCs) , comprising subjecting the EPSCs to a first condition that differentiates the EPSC into a population of trophoblast cells, wherein the first condition comprises an inhibitor of activin receptor-like kinase (ALK) receptor, wherein the first condition does not comprise a BMP4 agonist. In some embodiments, the inhibitor of ALK receptor is selected from the group consisting of SB-431542, A-83-01, and LY-2157299. In some embodiments, wherein the inhibitor of ALK receptor is SB-431542. In some embodiments, the first condition comprises about 5 μM to about 15 μM (e.g., about 10 μM) SB-431542. In some embodiments, the first condition further comprises a serum-free medium supplement. In some embodiments, the serum-free medium supplement is KnockOutTM Serum Replacement (KnockOutTM SR; e.g., ThermoFisher Scientific Cat. #10828028) . In some embodiments, the first condition further comprises one or more components selected from the group consisting of non-essential amino acids (NEAA) , beta-mercaptoethanol, and penicillin-streptomycin-glutamine (PSG) , or any combination thereof.

[0070] In some embodiments, the EPSCs are not in contact with a feeder cell population when subjected to the first condition. In some embodiments, the EPSCs are subjected to the first condition for less than three days (e.g., for about 2 days) . In some embodiments, the EPSCs are subjected to the first condition at a temperature of about 37℃. In some embodiments, the EPSCs are subjected to the first condition in the presence of about 3%to about 6%CO2 (e.g., about 5%CO2) . In some embodiments, the EPSCs are subjected to the first condition in the presence of about 18%to about 22%O2 (e.g., about 20%O2) .

[0071] In some embodiments, the EPSCs subjected to the first condition first differentiate into a population of trophoblast cells, wherein the population of trophoblast cells expresses one or more trophoblast markers selected from the group consisting of GATA3, GATA2, CDX2, KRT7, and TFAP2C (e.g., one or more trophoblast markers selected from the group consisting of GATA2, CDX2, and KRT7) . In some embodiments, the population of trophoblast cells shows reduced expression of one or more pluripotency markers selected from the group consisting of OCT4, SOX2, and NANOG. In some embodiments, the trophoblast cells then are subjected to a second condition to differentiate into a population of mesenchymal stem cells (MSCs) derived from the EPSCs. In some embodiments, the second condition comprises Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) and Epidermal Growth Factor (EGF) . In some embodiments, the second condition comprises about 3 ng / mL to about 7 ng / mL bFGF (e.g., about 5 ng / mL bFGF) . In some embodiments, the second condition comprises about 3 ng / mL to about 7 ng / mL EGF (e.g., about 5 ng / mL EGF) . In some embodiments, the second condition further comprises fetal bovine serum (FBS) , non-essential amino acids, beta-mercaptoethanol, or any combination thereof.

[0072] In some embodiments, the population of trophoblast cells or cells derived therefrom are subjected to the second condition at a temperature of about 37℃. In some embodiments, the population of trophoblast cells or cells derived therefrom are subjected to the second condition in the presence of about 3%to about 6%CO2 (e.g., about 5%CO2) . In some embodiments, the population of trophoblast cells or cells derived therefrom are subjected to the second condition in the presence of about 18%to about 22%O2 (e.g., about 20%O2) . In some embodiments, the population of trophoblast cells or cells derived therefrom are subjected to the second condition for at least about 5 days (e.g., at least about any of 5 days, 6 days, 7 days, 8 days, 9 days, 10 days, 11 days, 12 days, 13 days, 14 days, 15 days, 1 week, 2 weeks, 3 weeks, 4 weeks, or more) . In some embodiments, at or after the at least about 5 days, the population of trophoblast cells or the cells derived therefrom are passaged (e.g., at a ratio of about 1: 3 to about 1: 5) . In some embodiments, the passaging comprises dissociating the population of trophoblast cells or the cells derived therefrom (e.g., using trypsin) .

[0073] In some embodiments, after the first passaging, the population of trophoblast cells or the cells derived therefrom are further subjected to the second condition for at least about 7 days (e.g., at least about any of 7 days, 8 days, 9 days, 10 days, 11 days, 12 days, 13 days, 14 days, 15 days, 1 week, 2 weeks, 3 weeks, 4 weeks, or more) . In some embodiments, at or after the at least about 7 days, the population of trophoblast cells or the cells derived therefrom are passaged a second time (e.g., at a ratio of about 1: 3 to about 1: 5) . In some embodiments, the second passaging comprises dissociating the population of trophoblast cells or the cells derived therefrom (e.g., using trypsin) . In some embodiments, after the second passaging, the population of trophoblast cells or the cells derived therefrom are treated to one or more subsequent rounds of being subjected to the second condition for at least about 7 days and passaging, until the population of MSCs are differentiated.

[0074] In some embodiments, the population of MSCs are differentiated when the population of MSCs expresses one or more mesenchymal stem cell (MSC) markers selected from the group consisting of CD73, CD90, CD105, CD44, and CD29, and when the population of MSCs shows no expression of one or more surface markers selected from the group consisting of CD45, CD34, CD11b, CD79a, and HLA-DR. In some embodiments, the population of MSCs is differentiated when at least about 90% (such as about any of 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or more) of cells derived from the population of trophoblast cells or cells derived therefrom express the one or more MSC markers. In some embodiments, the population of MSCs shows reduced or no expression of one or more pluripotency markers selected from the group consisting of OCT4, SOX2, and NANOG relative to the EPSCs. In some embodiments, the population of MSCs shows reduced or no expression of one or more trophoblast cell markers selected from the group consisting of GATA2, CDX2, and KRT7 relative to the population of trophoblast cells.

[0075] In some embodiments, the population of MSCs derived from EPSCs show a different gene profile compared to a population of MSCs derived from induced pluripotent stem cells (iPSCs) . For example, in some embodiments, the population of MSCs shows at least about 2-fold increased expression of one or more genes selected from the group consisting of PVR, LINC02693, PID1, ULBP1, PDGFB, F3, INA, ULBP2, HSD11B1, HOXB2, HOXB4, KCNN2, XAF1, TRPM2, MAGEA3, NKX2.5, and TYRP1 compared to a population of MSCs derived from induced pluripotent stem cells (iPSCs) . In some embodiments, the population of MSCs shows at least about 2-fold reduced expression of one or more genes selected from the group consisting of LDOC1, TFAP2A, CPE, CLEC11A, SFRP2, BGN, CXCL12, HEPH, DLX1, BST1, CALHM2, PRRX1, NYNRIN, TMT1A, TMEM119, CD24, NLGN1, EBF2, EPB41L3, FES, and NFIB compared to a population of MSCs derived from induced pluripotent stem cells (iPSCs) . In some embodiments, the population of MSCs expresses PDGFB.

[0076] In some embodiments, the population of MSCs displays multipotency in vitro. Without being bound by theory, multipotency in vitro can be displayed through one or more in vitro differentiation methods, for example those described in Example 2 and FIG. 3B. In some embodiments, the population of MSCs displays multipotency in vivo. Without being bound by theory, multipotency in vivo can be determined, for example, by lineage tracing of transplanted MSCs and analysis of differentiation into one or more MSC-derived tissue types, e.g. bone, cartilage, and / or adipose tissue. In some embodiments, the population of MSCs differentiates into one or more of adipocytes, osteoblasts, and / or chondrocytes.

[0077] In some embodiments, the population of MSCs promotes angiogenesis. In some embodiments, the population of MSCs recruits one or more of macrophages (e.g., M2 macrophages) , endothelial cells (e.g., CD31+ endothelial cells) , and / or pericytes (e.g., PDGFRbeta+NG2+ pericytes) . A. Source of EPSCs and cell preparation

[0078] Expanded potential stem cells or extended pluripotent stem cells (EPSCs) are generated from early-cleavage embryos and display some features of totipotent embryos. EPSCs are molecularly similar across species and have broader developmental potential to generate embryonic and extraembryonic cell lineages. EPSCs possess robust self-renewal capacity in long-term culture, allow efficient genome editing, and generate both embryonic and extraembryonic cell lineages in vitro and in chimeras in terms of mouse and porcine EPSCs. Mouse EPSCs were reported to self-assemble into blastocyst-like structures. Recently, a more stable cell line, which is named expanded potential stem cells or extended pluripotent stem cells (EPSCs) , with enriched molecular signatures of blastomeres and expanded developmental potential to form both embryonic and extraembryonic (ExEm) lineages was established from 4-cell stage or 8-cell stage embryos (see, e.g., Gao et al., 2019, Nat. Cell Biol. 21: 687-699) . These EPSCs can produce all three types of blastocyst stem cells -embryo, placenta, and yolk sac.

[0079] EPSCs for use in differentiation and expansion can be obtained from several sources, including being isolated from 4-cell stage or 8-cell stage embryos, or being derived from embryonic stem cells or induced pluripotent stem cells. The high resemblance of EPSC-derived trophoblasts to tissue-derived trophoblasts highlights the advantages of EPSC-trophoblast applications, whereas the authenticity of trophoblasts derived from pluripotent stem cells (PSCs) , such as embryonic stem cells (ESCs) and iPSCs, remains questionable.

[0080] In some embodiments, EPSCs for use in the methods described herein are generated from pluripotent stem cells. In some embodiments, the pluripotent stem cells are selected from the group consisting of embryonic stem cells (ESCs) , induced pluripotent stem cells (iPSCs) , and epiblast stem cells (EpiSCs) . In some embodiments, pluripotent stem cells are cultured in EPSC medium to differentiate EPSCs. EPSC medium and differentiation protocols are described, e.g., in US 17 / 435,943 and US 11,913,018, all of which are herein incorporated by reference in their entireties. In some embodiments, the cells are then passaged and expanded for 2 to 4 weeks, until the cultured cells exhibit EPSC-like morphology, which is closely packed and dome-shaped (see, e.g., FIG. 1A) .

[0081] In some embodiments, a pluripotent stem cell population is cultured on SNL feeder cells to differentiate EPSCs. The SNL feeder cell line is an immortalized subclone of the STO line manipulated to stably express the neomycin resistance and leukaemia inhibitory factor (LIF) genes (see, e.g., McMahon and Bradley, 1990) . The STO cell line itself was derived from mouse SIM embryonic fibroblasts, and is resistant to 6-thioguanine and ouabain, sensitive to HAT selection (hypoxanthine, aminoprotein and thymidine) and negative for HPRT (hypoxanthine guanine phosphoribosyl transferase) . As SNL feeder cells are immortalized, they are easier to maintain than MEFs for the preparation of feeder layers. See, e.g., Pan et al. (2010) J Genet Genomics 37 (4) : 241–248.

[0082] In some embodiments, EPSCs for use in the methods described herein are selected from either C5-EPSC or M1-EPSC cell line (see, e.g., Chen, Y., et al. (2024) , Dev Cell 59 (12) : 1506-1522. e11) B. Differentiation to and expansion of MSCs derived from EPSCs

[0083] In some embodiments, EPSCs are seeded at a cell density of at least about any of 1×104 to 1×106, for example about any of 1×104, 2×104, 3×104, 4×104, 5×104, 6×104, 7×104, 8×104, 9×104, 1×105, 2×105, 3×105, 4×105, 5×105, 6×105, 7×105, 8×105, 9×105, or 1×106 cells / well in a 6-well plate. In some embodiments, EPSCs are seeded at a cell density of about 2×104, 3×104, 4×104, or 5×104, such as 3×104. In some embodiments, the plate is coated with Matrigel. In some embodiments, the EPSCs are seeded under feeder-free conditions. In some embodiments, the EPSC cells are cultured in DMEM / F12 base medium. In some embodiments, the base medium is further supplemented, e.g., with 20%KnockOutTM SR, non-essential amino acids (NEAA) , beta-mercaptoethanol, and / or penicillin-streptomycin-glutamine PSG) .

[0084] In some embodiments, the EPSCs are pre-conditioned with 20%KnockOutTM SR in DMEM / F12 media for one day. In some embodiments, the pre-conditioning media further comprises the ROCK inhibitor, Y-27632.

[0085] In some embodiments, after EPSC attachment to the 6-well plate, EPSCs are differentiated into early trophoblast cells by being subjected to a first condition comprising a TGFβ inhibitor. In some embodiments, the TGFβ inhibitor is selected from the group consisting of SB-431542, Dorsomorphin, A-83-01, LY-2157299, LDN193189, DMH-1, Galunisertib, RepSox, LY2109761, SB-525334, Vactosertib, SB-505124, GW788388, SD-208, R-268712, LDN193719, ITD-1, LY-3200882, PF-06952229, CJJ300, IN-1130, AZ12799734, ALK5-IN-8, Metelimumab, A 77-01, IMM-H007, Vicatertide, BIBF0775, BIO-013077-01, HYL001, ALK5-IN-28, ALK5-IN-32, (+) -ITD-1, LY550410. In some embodiments, the TGFβ inhibitor is selected from the group consisting of SB-431542, A-83-01, and LY-2157299. In some embodiments, the TGFβ inhibitor is SB-431542.

[0086] In some embodiments, the trophoblast cells derived from the EPSCs express one or more trophoblast markers selected from the group consisting of CDX2, KRT7, TFAP2C, and GATA3. In some embodiments, the trophoblast markers are expressed after about 2 or 3 days of the EPSCs being subjected to the first condition. In some embodiments, the trophoblast markers are assessed by immunofluorescent staining and qPCR.

[0087] In some embodiments, the trophoblast cells derived from EPSCs are then subjected to a second condition comprising the growth factors bFGF and EGF. In some embodiments, the differentiating cells are passaged upon reaching at least about 80% (e.g., about any of 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, or more) confluency. For example, the cells can be passaged by trypsinization to dissociate the cells adherent to the 6-well plate, and then can be seeded onto 0.1%gelatin-coated plates for further MSC enrichment. After about 3 to about 5 passages, the cells become elongated and spindle-shaped, thereby resembling the known morphology of mesenchymal stem cells (MSCs) .

[0088] In some embodiments, the cells appear homogeneous within about three weeks in culture (e.g., about any of 2, 3, 4, 5, or 6 weeks in culture) . In some embodiments, the cells are harvested for cell surface marker analysis by flow cytometry upon reaching homogeneity. The cell passage is designated as “P1” when at least about 90%of the cells express the MSC markers CD105, CD90, CD73, CD44 and CD29, and do not express CD45, CD34, CD11b, CD79a, and HLA-DR, as well as when the cells display downregulated RNA expression of pluripotency genes (e.g., any of NANOG, OCT4, and SOX2) . In some embodiments, MSCs derived from EPSCs are capable of being differentiated into adipocytes, osteocytes, and / or chondrocytes in vitro.

[0089] Conditions appropriate for EPSC culture include an appropriate media (e.g., DMEM / F12) that may contain factors necessary for proliferation, differentiation, and viability, including serum (e.g., fetal bovine or human serum) , non-essential amino acids (NEAA) , beta-mercaptoethanol, etc. and any other additives for the growth of cells known to the skilled artisan. Other additives for the growth of cells include, but are not limited to, surfactant, plasmanate, and reducing agents such as N-acetylcysteine and 2-mercaptoethanol. Media can include RPMI 1640, AIM-V, DMEM, F12, MEM, α-MEM, F-12, X-Vivo 15, and X-Vivo 20, optimizer, with added amino acids, sodium pyruvate, and vitamins, either serum-free or supplemented with an appropriate amount of serum (or plasma) or a defined set of hormones, and / or an amount of cytokine (s) sufficient for the growth and expansion of EPSCs into trophoblast cells and / or MSCs. Antibiotics, e.g., penicillin and streptomycin, are included only in experimental cultures, not in cultures of cells that are to be infused into an individual. The target cells are maintained under conditions necessary to support growth, for example, an appropriate temperature (e.g., 37℃) and atmosphere (e.g., air plus 5%CO2) . MSCs that have been exposed to various conditions or derived from different types of stem cells (e.g., EPSC, iPSC, ESC) may exhibit different characteristics. Accordingly, depending on the purpose of treatment, infusing an individual with an MSC population that resembles the native MSC population within the tissue targeted by said treatment may be advantageous.

[0090] In some embodiments, the methods include assessing expression of one or more markers (e.g., marker presented on the cell surface) of the differentiated cells. In one embodiment, the methods include assessing surface expression of CD105, CD73, CD90, CD45, CD34, CD14, CD11b, CD79α, CD19, HLA-DR, CCL5, PDGFA, PDGFB, PDGFC, OCT4, SOX2, NANOG, GATA2, CDX2, and KRT7, for example, by affinity-based detection methods such as by flow cytometry and / or qPCR. In some embodiments, the methods further include assessing the expression of one or more of PVR, LINC02693, PID1, ULBP1, PDGFB, F3, INA, ULBP2, HSD11B1, HOXB2, HOXB4, KCNN2, XAF1, TRPM2, MAGEA3, NKX2.5, TYRP1, LDOC1, TFAP2A, CPE, CLEC11A, SFRP2, BGN, CXCL12, HEPH, DLX1, BST1, CALHM2, PRRX1, NYNRIN, TMT1A, TMEM119, CD24, NLGN1, EBF2, EPB41L3, FES, and NFIB, for example by qPCR. C. Isolation and enrichment of MSCs

[0091] In some embodiments, the method described herein further comprise isolating or enriching the mesenchymal stem cells (MSCs) in vitro following differentiation from EPSCs. In some embodiments, the MSCs are substantially or entirely homogeneous (e.g., at least about 90%of cells displaying MSC characteristics) . In some embodiments, the culture time of the MSCs can be optimized to generate a population of MSCs that has 95%or greater cells displaying MSC characteristics (e.g., positive for CD105, CD73, and CD90, and negative for CD45, CD34, CD14 or CD11b, CD79α or CD19, and HLA-DR surface molecules) .

[0092] In some embodiments, the isolation or enrichment methods may include the separation of different cell types based on the absence or presence in the cell of one or more specific molecules, such as surface markers, e.g., surface proteins, intracellular markers, or nucleic acid. In some embodiments, MSCs are selected and isolated based on the presence of CD105, CD73, and CD90, and the absence of CD45, CD34, CD14 or CD11b, CD79α or CD19, and HLA-DR surface molecules.

[0093] In some embodiments, any known method for separation based on such markers may be used. In some embodiments, the separation is affinity-or immunoaffinity-based separation. For example, the isolation in some aspects includes separation of cells and cell populations based on the cells’ expression or expression level of one or more markers, typically cell surface markers, for example, by incubation with an antibody or binding partner that specifically binds to such markers, followed generally by washing steps and separation of cells having bound the antibody or binding partner, from those cells having not bound to the antibody or binding partner.

[0094] Such separation steps can be based on positive selection, in which the cells having bound the reagents are retained for further use, and / or negative selection, in which the cells having not bound to the antibody or binding partner are retained. In some examples, both fractions are retained for further use. In some aspects, negative selection can be particularly useful where no antibody is available that specifically identifies a cell type in a heterogeneous population, such that separation is best carried out based on markers expressed by cells other than the desired population.

[0095] The separation need not result in 100%enrichment or removal of a particular cell population or cells expressing a particular marker. For example, positive selection of or enrichment for cells of a particular type, such as those expressing a marker, refers to increasing the number or percentage of such cells, but need not result in a complete absence of cells not expressing the marker. Likewise, negative selection, removal, or depletion of cells of a particular type, such as those expressing a marker, refers to decreasing the number or percentage of such cells, but need not result in a complete removal of all such cells.

[0096] In some examples, multiple rounds of separation steps are carried out, where the positively or negatively selected fraction from one step is subjected to another separation step, such as a subsequent positive or negative selection. In some examples, a single separation step can deplete cells expressing multiple markers simultaneously, such as by incubating cells with a plurality of antibodies or binding partners, each specific for a marker targeted for negative selection. Likewise, multiple cell types can simultaneously be positively selected by incubating cells with a plurality of antibodies or binding partners expressed on the various cell types.

[0097] For example, in some aspects, specific subpopulations of MSCs, such as cells positive or expressing high levels of one or more markers, e.g., IL-7+, CD73+, ENG+, THY1+, CD200+, CD39+, CD317+, CD274+, and / or MX1+ MSCs, are isolated by positive or negative selection techniques.

[0098] In some embodiments, isolation is carried out by enrichment for a particular cell population by positive selection, or depletion of a particular cell population, by negative selection. In some embodiments, positive or negative selection is accomplished by incubating cells with one or more antibodies or other binding agent that specifically bind to one or more surface markers expressed or expressed (marker+) at a relatively higher level (markerhigh) on the positively or negatively selected cells, respectively.

[0099] In some aspects, the sample or composition of cells to be separated is incubated with small, magnetizable or magnetically responsive material, such as magnetically responsive particles or microparticles, such as paramagnetic beads (e.g., such as Dynabeads or MACS beads) . The magnetically responsive material, e.g., particle, generally is directly or indirectly attached to a binding partner, e.g., an antibody, that specifically binds to a molecule, e.g., surface marker, present on the cell, cells, or population of cells that it is desired to separate, e.g., that it is desired to negatively or positively select.

[0100] In some embodiments, the magnetic particle or bead comprises a magnetically responsive material bound to a specific binding member, such as an antibody or other binding partner. There are many well-known magnetically responsive materials used in magnetic separation methods. Suitable magnetic particles include those described in Molday, U.S. Pat. No. 4,452,773, and in European Patent Specification EP 452342 B, which are hereby incorporated by reference. Colloidal sized particles, such as those described in Owen U.S. Pat. No. 4,795,698, and Liberti et al., U.S. Pat. No. 5,200,084 are other examples.

[0101] The incubation generally is carried out under conditions whereby the antibodies or binding partners, or molecules, such as secondary antibodies or other reagents, which specifically bind to such antibodies or binding partners, which are attached to the magnetic particle or bead, specifically bind to cell surface molecules if present on cells within the sample.

[0102] In some embodiments, the sample is placed in a magnetic field, and those cells having magnetically responsive or magnetizable particles attached thereto will be attracted to the magnet and separated from the unlabeled cells. For positive selection, cells that are attracted to the magnet are retained; for negative selection, cells that are not attracted (unlabeled cells) are retained. In some aspects, a combination of positive and negative selection is performed during the same selection step, where the positive and negative fractions are retained and further processed or subject to further separation steps.

[0103] In certain embodiments, the magnetically responsive particles are coated in primary antibodies or other binding partners, secondary antibodies, lectins, enzymes, or streptavidin. In certain embodiments, the magnetic particles are attached to cells via a coating of primary antibodies specific for one or more markers. In certain embodiments, the cells, rather than the beads, are labeled with a primary antibody or binding partner, and then cell-type specific secondary antibody-or other binding partner (e.g., streptavidin) -coated magnetic particles, are added. In certain embodiments, streptavidin-coated magnetic particles are used in conjunction with biotinylated primary or secondary antibodies.

[0104] In some embodiments, the magnetically responsive particles are left attached to the cells that are to be subsequently incubated, cultured and / or engineered; in some aspects, the particles are left attached to the cells for administration to a patient. In some embodiments, the magnetizable or magnetically responsive particles are removed from the cells. Methods for removing magnetizable particles from cells are known and include, e.g., the use of competing non-labeled antibodies, magnetizable particles or antibodies conjugated to cleavable linkers, etc. In some embodiments, the magnetizable particles are biodegradable.

[0105] In some embodiments, the affinity-based selection is via magnetic-activated cell sorting (MACS) (Miltenyi Biotec, Auburn, Calif. ) . Magnetic Activated Cell Sorting (MACS) systems are capable of high-purity selection of cells having magnetized particles attached thereto. In certain embodiments, MACS operates in a mode wherein the non-target and target species are sequentially eluted after the application of the external magnetic field. That is, the cells attached to magnetized particles are held in place while the unattached species are eluted. Then, after this first elution step is completed, the species that were trapped in the magnetic field and were prevented from being eluted are freed in some manner such that they can be eluted and recovered. In certain embodiments, the non-target cells are labelled and depleted from the heterogeneous population of cells.

[0106] In certain embodiments, the isolation or separation is carried out using a system, device, or apparatus that carries out one or more of the isolation, cell preparation, separation, processing, incubation, culture, and / or formulation steps of the methods. In some aspects, the system is used to carry out each of these steps in a closed or sterile environment, for example, to minimize error, user handling and / or contamination. In one example, the system is a system as described in International Patent Application, Publication Number WO2009 / 072003, or US 20110003380 A1.

[0107] In some embodiments, the system or apparatus carries out one or more, e.g., all, of the isolation, processing, engineering, and formulation steps in an integrated or self-contained system, and / or in an automated or programmable fashion. In some aspects, the system or apparatus includes a computer and / or computer program in communication with the system or apparatus, which allows a user to program, control, assess the outcome of, and / or adjust various aspects of the processing, isolation, engineering, and formulation steps.

[0108] In some embodiments, an MSC population described herein is enriched and collected in vitro using the methods of generating MSCs described herein. In some embodiments, the MSC population described herein is collected and enriched via flow cytometry, in which cells stained for multiple cell surface markers are carried in a fluidic stream. In some embodiments, the MSC population described herein is collected and enriched (or depleted) via preparative scale (FACS) -sorting. In certain embodiments, the MSC population described herein is collected and enriched (or depleted) by use of microelectromechanical systems (MEMS) chips in combination with a FACS-based detection system (see, e.g., WO 2010 / 033140, Cho et al. (2010) Lab Chip 10, 1567-1573; and Godin et al. (2008) J Biophoton. 1 (5) : 355-376. In both cases, cells can be labeled with multiple markers, allowing for the isolation of well-defined MSC subsets at high purity.

[0109] In some embodiments, the antibodies or binding partners are labeled with one or more detectable marker, to facilitate separation for positive and / or negative selection. For example, separation may be based on binding to fluorescently labeled antibodies. In some examples, separation of cells based on binding of antibodies or other binding partners specific for one or more cell surface markers are carried in a fluidic stream, such as by fluorescence-activated cell sorting (FACS) , including preparative scale (FACS) and / or microelectromechanical systems (MEMS) chips, e.g., in combination with a flow-cytometric detection system. Such methods allow for positive and negative selection based on multiple markers simultaneously.

[0110] Also see “Examples” section for method details. III. Mesenchymal Stem Cell Composition (s)

[0111] Also provided herein are compositions comprising a mesenchymal stem cell (MSC) derived from expanded potential stem cells (EPSCs) or populations thereof.

[0112] In some embodiments, there is provided a composition comprising a population of cells (e.g., trophoblast cells or MSCs) differentiated from a population of expanded potential stem cells (EPSCs) according to any of the methods described in Section II: “Methods of Generating a Population of Cells” above.

[0113] In some embodiments, there is provided a composition comprising a population of mesenchymal stem cells (MSCs) differentiated from a population of expanded potential stem cells (EPSCs) according to any of the methods described in Section II: “Methods of Generating a Population of Cells” above.

[0114] In some embodiments, there is provided a composition comprising a population of mesenchymal stem cells (MSCs) differentiated from a population of expanded potential stem cells (EPSCs) , wherein the MSCs express one or more markers selected from the group consisting of CD73, CD90, CD105, CD44, and CD29. A. Mesenchymal Stem Cells

[0115] The terms MSC and MSCs have become the preferred acronym to describe a cell / cell population of multipotential stem / progenitor cells commonly referred to as mesenchymal stem cells, multipotential stromal cells, mesenchymal stromal cells, or mesenchymal progenitor cells. MSCs can differentiate to important lineages under defined conditions in vitro and after implantation in vivo. MSCs have broad anti-inflammatory and immune-modulatory properties. See, e.g., Pittenger et al. (2019) Regen. Med. 4: 22. MSCs from different sources behave differently and exhibit distinct secretome profiles and immunomodulatory properties.

[0116] Mesenchymal stem cells (MSCs) possess multi-lineage differentiation and self-renewal potentials. Mesenchymal stem cells (MSCs) possess the potential of specific-lineage differentiation toward osteoblasts, adipocytes, or chondrocytes, as well as the capacity of plastic adherence when cultured in vitro. According to the International Society for Cellular Therapy (ISCT) -published minimal guidelines to define human MSC identity, these cells are positive for CD105, CD73, and CD90, and negative for CD45, CD34, CD14 or CD11b, CD79αor CD19, and HLA-DR surface molecules. See, e.g., Han et al. (2022) Sig Transduct Target Ther. 7: 92.

[0117] MSCs can be isolated from organs such as bone marrow, dental pulp, thymus, muscle, pancreas, and lung. Studies have shown that MSCs isolated and cultured from different tissues / organs are more closely related to each other than other mesodermal lineages, and that their phenotypic signature is similar to that of perivascular cells. Furthermore, it is known that the phenotype and biological features of MSCs can be altered dynamically by culture conditions, leading to distinct capacities of differentiation and proliferation during their expansion in vitro. See, e.g., Han et al. (2022) . Since the function of MSCs can be largely influenced by certain aspects of their differentiation, MSCs may be a more heterogeneous category of stem cell wherein specific subsets of MSCs may possess differential functions and, by extension, potentially divergent clinical applications. For example, one such element that may influence MSC heterogeneity can include the progenitor cell type from which said MSC population is derived.

[0118] MSCs can be characterize by a broad set of molecular markers shared amongst more heterogeneous subtypes. In some embodiments, the MSC or population of MSCs expresses one or more mesenchymal stem cell (MSC) markers selected from the group consisting of CD73, CD90, CD105, CD44, and CD29. Without being bound by theory, the MSC markers are commonly expressed surface markers generally found on MSCs, including MSCs derived from iPSCs or EPSCs. In some embodiments, the MSC or population of MSCs shows no expression of one or more surface markers selected from the group consisting of CD45, CD34, CD11b, CD79a, and HLA-DR.

[0119] MSC subtypes and / or MSC subpopulations may comprise particular molecular markers indicative of more specialized function and / or differentiation capacity. In some embodiments, the MSC or population of MSCs expresses the gene PDGFB. Without being bound by theory, expression of PDGFB indicates a population of EPSC-derived MSCs. For example, EPSC-derived MSCs expressing the gene PDGFB demonstrate an increased capacity to recruit PDGFRβ+ cells (e.g. pericytes) in a mouse hindlimb ischemia model relative to iPSC-derived MSCs as shown in Example 4 and FIGs. 9A-9B.

[0120] In some embodiments, the MSC or population of MSCs (or composition thereof) is capable of differentiating into one or more of adipocytes, osteoblasts, and / or chondrocytes. In some embodiments, the MSC or population of MSCs (or composition thereof) is capable of promoting angiogenesis.

[0121] In some embodiments, the MSC or population of MSCs (or composition thereof) is capable of recruiting one or more of macrophages, endothelial cells, and / or pericytes. Recruitment of one or more of macrophages, endothelial cells, and / or pericytes can be assessed in the context of experimentally-induced vascularization (e.g., angiogenesis and / or arteriogenesis) in vivo, for example in an ischemic mouse model induced through femoral artery ligation as described in Example 4. In some embodiments, the macrophages are M2 macrophages. In some embodiments, the endothelial cells are CD31+ endothelial cells. In some embodiments, the pericytes are PDGFRbeta+NG2+ pericytes.

[0122] In some embodiments, the MSC or population of MSCs is made from expanded potential stem cells (EPSCs) . In some embodiments, the MSC or population of MSCs is CD73+ / CD90+ / CD105+ / CD44+ / CD29+. In some embodiments, the MSC or population of MSCs produce CCL5, PDGFA, PDGFB, and / or PDGFC. In some embodiments, the MSC or population of MSCs recruits one or more of macrophages, endothelial cells, and / or pericytes. In some embodiments, the macrophages are M2 macrophages. In some embodiments, the endothelial cells are CD31+ endothelial cells. In some embodiments, the pericytes are PDGFRbeta+NG2+ pericytes.

[0123] In some embodiments, at least about 90% (such as about any of 91%, 92%, 93%, 94%, 96%, 96%, 97%, 98%, 99%, or more) of the MSCs in a population of MSCs made from EPSCs express one or more MSC markers selected from the group consisting of CD73, CD90, CD105, CD44, and CD29. In some embodiments, the MSC or population of MSCs made from EPSCs have no expression of one or more surface markers selected from the group consisting of CD45, CD34, CD11b, CD79a, and HLA-DR. In some embodiments, the MSC or population of MSCs made from EPSCs have reduced expression or no expression of one or more markers selected from the group consisting of OCT4, SOX2, NANOG, GATA2, TFAP2A, TFAP2C, KRT7, TP63, ELF5, EPAS1, SP6, and ERVW-1. In some embodiments, the MSC or population of MSCs made from EPSCs has reduced expression or no expression of one or more pluripotency markers selected from the group consisting of OCT4, SOX2, and NANOG relative to a population of EPSCs. In some embodiments, the MSC or population of MSCs made from EPSCs has reduced expression or no expression of one or more trophoblast cell markers selected from the group consisting of GATA2, CDX2, and KRT7 relative to a population of trophoblast cells.

[0124] In some embodiments, the MSC or population of MSCs made from EPSCs (or composition thereof) expresses one or more genes selected from the group consisting of PVR, LINC02693, PID1, ULBP1, PDGFB, F3, INA, ULBP2, HSD11B1, HOXB2, HOXB4, KCNN2, XAF1, TRPM2, MAGEA3, NKX2.5, and TYRP1 at levels at least about 2-fold increased compared to an MSC or population of MSCs made from induced pluripotent stem cells (iPSCs) . In some embodiments, the MSC or population of MSCs made from EPSCs (or composition thereof) expresses one or more genes selected from the group consisting of LDOC1, TFAP2A, CPE, CLEC11A, SFRP2, BGN, CXCL12, HEPH, DLX1, BST1, CALHM2, PRRX1, NYNRIN, TMT1A, TMEM119, CD24, NLGN1, EBF2, EPB41L3, FES, and NFIB at levels at least about 2-fold decreased compared to an MSC or population of MSCs made from induced pluripotent stem cells (iPSCs) .

[0125] In some embodiments, the population of MSCs comprises a homogeneous MSC cell population. In other embodiments, the population of MSCs comprises a heterogeneous MSC cell population. The heterogeneity of MSCs is reflected in different levels, such as the molecular levels (transcriptomics, proteomics, secretomics, and epigenomics) , and the function levels (tri-lineage differentiation potentials, immunomodulatory capabilities, and regenerative activities) . The heterogeneity of MSCs could be induced by various factors including the donor conditions (age, gender, health condition, genetic background, and so on) , tissue origin, and the strategies to isolate and expand the MSCs (digestion enzyme, matrix protein, cell culture medium, passage number, and so on) . See, e.g., Chen et al. (2024) J Regen Med. 22: 459.

[0126] Expanded potential stem cells (EPSCs) for making the mesenchymal stem cells (MSCs) described herein can be from any sources, such as derived from related or unrelated humans, or non-human animals. In some embodiments, the composition comprising any of the mesenchymal stem cells described herein is allogeneic (e.g., derived from a healthy individual) . In some embodiments, the composition comprising any of the mesenchymal stem cells described herein is autologous.

[0127] In some embodiments, the MSC or population of MSCs (or composition thereof) further comprises a heterologous nucleic acid encoding one or more genes (such as one or more therapeutically relevant genes, e.g., therapeutically relevant transgenes, for example a cytokine or chemokine) . B. Introduction of Nucleic Acids into MSCs derived from EPSCs

[0128] Any of the mesenchymal stem cells (MSCs) or populations thereof described herein, or the expanded potential stem cells (EPSCs) or trophoblasts from which the MSCs are differentiated can be further engineered to express one or more heterologous nucleic acids encoding one or more genes (such as one or more therapeutically relevant genes, e.g., therapeutically relevant transgenes) or vectors encoding thereof.

[0129] Methods of introducing vectors (e.g., viral vectors) or isolated nucleic acids into a mammalian cell are known in the art. The vectors described herein can be transferred into an MSC, EPSC, or trophoblast by physical, chemical, or biological methods.

[0130] Physical methods for introducing a vector (e.g., viral vector) into an MSC, EPSC, or trophoblast include calcium phosphate precipitation, lipofection, particle bombardment, microinjection, electroporation, and the like. Methods for producing cells comprising vectors and / or exogenous nucleic acids are well-known in the art. See, for example, Sambrook et al. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York. In some embodiments, the vector (e.g., viral vector) is introduced into the cell by electroporation.

[0131] Biological methods for introducing a vector (e.g., viral vector) into an MSC, EPSC, or trophoblast include the use of DNA and RNA vectors. Viral vectors have become the most widely used method for inserting genes into mammalian, e.g., human cells.

[0132] Chemical means for introducing a vector (e.g., viral vector) into an MSC, EPSC, or trophoblast include colloidal dispersion systems, such as macromolecule complexes, nanocapsules, microspheres, beads, and lipid-based systems including oil-in-water emulsions, micelles, mixed micelles, and liposomes. An exemplary colloidal system for use as a delivery vehicle in vitro is a liposome (e.g., an artificial membrane vesicle) .

[0133] In some embodiments, the transduced / transfected MSC, EPSC, or trophoblast is propagated ex vivo after introduction of the vector or isolated nucleic acid. In some embodiments, the transduced / transfected MSC, EPSC, or trophoblast is cultured to propagate for at least about any of 1 day, 2 days, 3 days, 4 days, 5 days, 6 days, 7 days, 10 days, 12 days, or 14 days. In some embodiments, the transduced / transfected MSC, EPSC, or trophoblast is further evaluated or screened to select desired engineered mammalian cell, e.g., engineered MSCs described herein.

[0134] Reporter genes may be used for identifying potentially transfected / transduced cells and for evaluating the functionality of regulatory sequences. In general, a reporter gene is a gene that is not present in or expressed by the recipient organism or tissue and that encodes a polypeptide whose expression is manifested by some easily detectable property, e.g., enzymatic activity. Expression of the reporter gene is assayed at a suitable time after the DNA / RNA has been introduced into the recipient cells. Suitable reporter genes may include genes encoding luciferase, beta-galactosidase, chloramphenicol acetyl transferase, secreted alkaline phosphatase, or the green fluorescent protein (GFP) gene (e.g., Ui-Tei et al. FEBS Letters 479: 79-82 (2000) ) . Suitable expression systems are well known and may be prepared using known techniques or obtained commercially.

[0135] In some embodiments, a heterologous nucleic acid is present on a vector. In some embodiments, the vector is suitable for replication and integration in eukaryotic cells, such as mammalian cells. In some embodiments, the vector is a viral vector. Examples of viral vectors include, but are not limited to, adenoviral vectors, adeno-associated virus vectors, lentiviral vector, retroviral vectors, herpes simplex viral vector, and derivatives thereof. Viral vector technology is well known in the art and is described, for example, in Sambrook et al. (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York) , and in other virology and molecular biology manuals.

[0136] A number of viral based systems have been developed for gene transfer into mammalian cells. For example, retroviruses provide a convenient platform for gene delivery systems. A heterologous nucleic acid can be inserted into a vector and packaged in retroviral particles using techniques known in the art. The recombinant virus can then be isolated and delivered to the engineered mammalian cell in vitro or ex vivo. A number of retroviral systems are known in the art. In some embodiments, adenovirus vectors are used. A number of adenovirus vectors are known in the art. In some embodiments, lentivirus vectors are used. In some embodiments, self-inactivating lentiviral vectors are used. The lentiviral vectors can be used to transduce a mammalian cell (such as primary MSCs) using methods known in the art. Vectors derived from retroviruses such as lentivirus are suitable tools to achieve long-term gene transfer, because they allow long-term, stable integration of a transgene and its propagation in progeny cells. Lentiviral vectors also have low immunogenicity, and can transduce non-proliferating cells. In some embodiments, the vector encoding the heterologous nucleic acid is a lentiviral vector.

[0137] In some embodiments, the vector is a non-viral vector. In some embodiments, the vector is a transposon, such as a Sleeping Beauty (SB) transposon system, or a PiggyBac transposon system. In some embodiments, the vector is a polymer-based non-viral vector, including for example, poly (lactic-co-glycolic acid) (PLGA) and poly lactic acid (PLA) , poly (ethylene imine) (PEI) , and dendrimers. In some embodiments, the vector is a cationic-lipid based non-viral vector, such as cationic liposome, lipid nanoemulsion, and solid lipid nanoparticle (SLN) . In some embodiments, the vector is a peptide-based gene non-viral vector, such as poly-L-lysine. Any of the known non-viral vectors suitable for genome editing can be used for introducing the nucleic acid encoding the chimeric construct to the engineered immune cell (e.g., T cell) . See, for example, Yin H. et al. Nature Rev. Genetics (2014) 15: 521-555; Aronovich EL et al. “The Sleeping Beauty transposon system: a non-viral vector for gene therapy. ” Hum. Mol. Genet. (2011) R1: R14-20; and Zhao S. et al. “PiggyBac transposon vectors: the tools of the human gene editing. ” Transl. Lung Cancer Res. (2016) 5 (1) : 120-125, which are incorporated herein by reference. In some embodiments, any one or more of the nucleic acids encoding the chimeric construct disclosure herein is introduced to the engineered MSC, EPSC, or trophoblast (e.g., MSC) by a physical method, including, but not limited to electroporation, sonoporation, photoporation, magnetofection, hydroporation.

[0138] In some embodiments, the vector (e.g., viral vector such as lentiviral vector) comprises any one of the nucleic acids encoding the chimeric constructs described herein. The nucleic acid can be cloned into the vector using any known molecular cloning methods in the art, including, for example, using restriction endonuclease sites and one or more selectable markers.

[0139] In some embodiments, the nucleic acid encoding the chimeric construct is operably linked to a promoter. Varieties of promoters have been explored for gene expression in mammalian cells, and any of the promoters known in the art may be used in the present disclosure. Promoters may be roughly categorized as constitutive promoters or regulated promoters, such as inducible promoters.

[0140] In some embodiments, the heterologous nucleic acid is operably linked to a constitutive promoter. Constitutive promoters allow heterologous genes (also referred to as transgenes) to be expressed constitutively in the host cells. Exemplary promoters contemplated herein include, but are not limited to, cytomegalovirus immediate-early promoter (CMV) , human elongation factors-1alpha (hEF1α) , ubiquitin C promoter (UbiC) , phosphoglycerokinase promoter (PGK) , simian virus 40 early promoter (SV40) , chicken β-Actin promoter coupled with CMV early enhancer (CAGG) , a Rous Sarcoma Virus (RSV) promoter, a polyoma enhancer / herpes simplex thymidine kinase (MC1) promoter, a beta actin (β-ACT) promoter, a “myeloproliferative sarcoma virus enhancer, negative control region deleted, d1587rev primer-binding site substituted (MND) ” promoter.

[0141] In some embodiments, the heterologous nucleic acid is operably linked to an inducible promoter. Inducible promoters belong to the category of regulated promoters. The inducible promoter can be induced by one or more conditions, such as a physical condition, microenvironment of the mesenchymal stem cell (MSC) , or the physiological state of the MSC, an inducer (i.e., an inducing agent) , or a combination thereof. In some embodiments, the inducing condition does not induce the expression of endogenous genes in the engineered mammalian cell, and / or in the subject that receives the pharmaceutical composition. In some embodiments, the inducing condition is selected from the group consisting of: inducer, irradiation (such as ionizing radiation, light) , temperature (such as heat) , redox state, tumor environment, and the activation state of the engineered mammalian cell. In some embodiments, the inducible promoter can be an NFAT promoter, a  promoter, or an NFκB promoter.

[0142] In some embodiments, the inducing condition does not induce the expression of endogenous genes in the engineered MSC, and / or in the individual that receives the pharmaceutical composition.

[0143] In some embodiments, the vector also contains a selectable marker gene or a reporter gene to select cells expressing the chimeric constructs described herein from the population of host cells transfected through vectors (e.g., lentiviral vectors) . Both selectable markers and reporter genes may be flanked by appropriate regulatory sequences to enable expression in the host cells. For example, the vector may contain transcription and translation terminators, initiation sequences, and promoters useful for regulation of the expression of the nucleic acid sequences. C. Pharmaceutical Compositions

[0144] Also provided are pharmaceutical compositions comprising any of the mesenchymal stem cells (MSCs) or compositions thereof described herein, and optionally a pharmaceutically acceptable excipient. Any excipient suitable for the storage and administration of MSCs can be used herein. The excipient may not affect the viability, engraftment, expansion, and / or bioactivity of the MSCs.

[0145] “Excipient” means a pharmaceutically acceptable material, composition, or vehicle, such as a liquid or solid filler, diluent, solvent, or encapsulating material. Excipients include, for example, encapsulating materials or additives such as absorption accelerators, antioxidants, binders, buffers, carriers, coating agents, coloring agents, diluents, disintegrating agents, emulsifiers, extenders, fillers, flavoring agents, humectants, lubricants, perfumes, preservatives, propellants, releasing agents, wetting agents and mixtures thereof. The term “excipient” can also refer to a diluent, adjuvant (e.g., Freunds’ adjuvant (complete or incomplete) or vehicle.

[0146] Excipients may be pharmaceutically acceptable excipients. Examples of pharmaceutically acceptable excipients include buffers, such as phosphate, citrate, and other organic acids; antioxidants, including ascorbic acid; low molecular weight (e.g., fewer than about 10 amino acid residues) polypeptide; proteins, such as serum albumin, gelatin, or immunoglobulins; hydrophilic polymers, such as polyvinylpyrrolidone; amino acids, such as glycine, glutamine, asparagine, arginine, or lysine; monosaccharides, disaccharides, and other carbohydrates, including glucose, mannose, or dextrins; chelating agents, such as EDTA; sugar alcohols, such as mannitol or sorbitol; salt-forming counterions, such as sodium; and / or nonionic surfactants, such as TWEENTM, polyethylene glycol (PEG) , and PLURONICSTM. Other examples of pharmaceutically acceptable excipients are described in Remington and Gennaro, Remington’s Pharmaceutical Sciences (18th ed. 1990) .

[0147] In one embodiment, each component is “pharmaceutically acceptable” in the sense of being compatible with the other ingredients of a pharmaceutical formulation, and suitable for use in contact with the tissue or organ of humans and animals without excessive toxicity, irritation, allergic response, immunogenicity, or other problems or complications, commensurate with a reasonable benefit / risk ratio. See, e.g., Lippincott Williams &Wilkins: Philadelphia, PA, 2005; Handbook of Pharmaceutical Excipients, 6th ed.; Rowe et al., Eds.; The Pharmaceutical Press and the American Pharmaceutical Association: 2009; Handbook of Pharmaceutical Additives, 3rd ed.; Ash and Ash Eds.; Gower Publishing Company: 2007; Pharmaceutical Preformulation and Formulation, 2nd ed.; Gibson Ed.; CRC Press LLC: Boca Raton, FL, 2009. In some embodiments, pharmaceutically acceptable excipients are nontoxic to the cell or mammal being exposed thereto at the dosages and concentrations employed. In some embodiments, a pharmaceutically acceptable excipient is an aqueous pH buffered solution.

[0148] Excipients may be sterile liquids, such as water and oils, including those of petroleum, animal, vegetable, or synthetic origin, such as peanut oil, soybean oil, mineral oil, sesame oil, and the like. Water is an exemplary excipient when a composition (e.g., a pharmaceutical composition) is administered intravenously. Saline solutions and aqueous dextrose and glycerol solutions can also be employed as liquid excipients, particularly for injectable solutions. An excipient can also include starch, glucose, lactose, sucrose, gelatin, malt, rice, flour, chalk, silica gel, sodium stearate, glycerol monostearate, talc, sodium chloride, dried skim milk, glycerol, propylene, glycol, water, ethanol, and the like. The composition, if desired, can also contain minor amounts of wetting or emulsifying agents, or pH buffering agents. Compositions can take the form of solutions, suspensions, and the like.

[0149] Compositions, including pharmaceutical compositions, may contain a population of mesenchymal stem cells (e.g., any of the MSCs described herein) , for example, in isolated form, together with a suitable number of excipients.

[0150] In some embodiments, there is provided a pharmaceutical composition comprising: i) a population of mesenchymal stem cells (MSCs) that were differentiated from expanded potential stem cells (EPSCs) , and ii) optionally a pharmaceutically acceptable excipient.

[0151] The choice of excipient may be determined in part by the particular cell and / or by the method of administration. Accordingly, there are a variety of suitable formulations.

[0152] Suitable pharmaceutically acceptable excipient for mesenchymal stem cells (MSCs) may comprise buffers such as neutral buffered saline, phosphate buffered saline and the like; carbohydrates such as glucose, mannose, sucrose or dextrans, mannitol; proteins; polypeptides or amino acids such as glycine; antioxidants; chelating agents such as EDTA or glutathione; adjuvants (e.g., aluminum hydroxide) ; and preservatives. The pharmaceutically acceptable excipient may contain autologous serum, such as human serum. In some embodiments, the pharmaceutically acceptable excipient is non-toxic, biocompatible, non-immunogenic, biodegradable, and can avoid recognition by the host’s defense mechanism. The excipient may also contain adjuvants such as preserving stabilizing, wetting, emulsifying agents and the like. The pharmaceutically acceptable excipient may enhance the stability of the MSCs. The final form may be sterile and may also be able to pass readily through an injection device such as a hollow needle. The proper viscosity may be achieved and maintained by the proper choice of excipients.

[0153] In some embodiments, the pharmaceutical composition is formulated to have a pH in the range of about 4.5 to about 9.0, including for example pH ranges of about any one of 5.0 to about 8.0, about 6.5 to about 7.5, or about 7.0 to about 7.4. The pharmaceutical composition can also be made to be isotonic with blood by the addition of a suitable tonicity modifier, such as glycerol.

[0154] Typically, acceptable carriers, excipients, or stabilizers are nontoxic to recipients at the dosages and concentrations employed, and include buffers, antioxidants including ascorbic acid, methionine, Vitamin E, sodium metabisulfite; preservatives, isotonicifiers, stabilizers, metal complexes (e.g., Zn-protein complexes) ; chelating agents such as EDTA and / or non-ionic surfactants.

[0155] Buffers may be used to control the pH in a range which optimizes the therapeutic effectiveness, especially if stability is pH dependent. Suitable buffering agents for use with the present disclosure include both organic and inorganic acids and salts thereof. For example, citrate, phosphate, succinate, tartrate, fumarate, gluconate, oxalate, lactate, acetate. Additionally, buffers may comprise histidine and trimethylamine salts such as Tris.

[0156] Preservatives may be added to slow microbial growth. Suitable preservatives for use with the present disclosure include octadecyldimethylbenzyl ammonium chloride; hexamethonium chloride; benzalkonium halides (e.g., chloride, bromide, iodide) , benzethonium chloride; thimerosal, phenol, butyl or benzyl alcohol; alkyl parabens such as methyl or propyl paraben; catechol; resorcinol; cyclohexanol, 3-pentanol, and m-cresol.

[0157] Tonicity agents, sometimes known as “stabilizers” can be present to adjust or maintain the tonicity of liquid in a composition. Exemplary tonicity agents include polyhydric sugar alcohols, trihydric or higher sugar alcohols, such as glycerin, erythritol, arabitol, xylitol, sorbitol and mannitol.

[0158] Additional exemplary excipients include: (1) bulking agents, (2) solubility enhancers, (3) stabilizers and (4) agents preventing denaturation or adherence to the container wall. Such excipients include: polyhydric sugar alcohols (enumerated above) ; amino acids such as alanine, glycine, glutamine, asparagine, histidine, arginine, lysine, ornithine, leucine, 2-phenylalanine, glutamic acid, threonine, etc.; organic sugars or sugar alcohols such as sucrose, lactose, lactitol, trehalose, stachyose, mannose, sorbose, xylose, ribose, ribitol, myoinisitose, myoinisitol, galactose, galactitol, glycerol, cyclitols (e.g., inositol) , polyethylene glycol; sulfur containing reducing agents, such as urea, glutathione, thioctic acid, sodium thioglycolate, thioglycerol, α-monothioglycerol and sodium thiosulfate; low molecular weight proteins such as human serum albumin, bovine serum albumin, gelatin or other immunoglobulins; hydrophilic polymers such as polyvinylpyrrolidone; monosaccharides (e.g., xylose, mannose, fructose, glucose; disaccharides (e.g., lactose, maltose, sucrose) ; trisaccharides such as raffinose; and polysaccharides such as dextrin or dextran.

[0159] In order for the pharmaceutical compositions to be used for in vivo administration, they are sterile. The pharmaceutical compositions herein generally can be placed into a container having a sterile access port, for example, an intravenous solution bag or vial having a stopper pierceable by a hypodermic injection needle.

[0160] In some embodiments, the pharmaceutical composition is suitable for administration to a human. In some embodiments, the pharmaceutical composition is suitable for administration to a human by parenteral administration. Formulations suitable for parenteral administration include aqueous and non-aqueous, isotonic sterile injection solutions, which can contain antioxidants, buffers, bacteriostats, and solutes that render the formulation compatible with the blood of the intended recipient, and aqueous sterile suspensions that can include suspending agents, solubilizers, thickening agents, stabilizing agents, and / or preservatives. In some embodiments, the pharmaceutical composition is contained in a single-use vial, such as a single-use sealed vial. In some embodiments, the pharmaceutical composition is contained in a multi-use vial. In some embodiments, the pharmaceutical composition is contained in bulk in a container. In some embodiments, the pharmaceutical composition is cryopreserved.

[0161] In some embodiments, the pharmaceutical composition is formulated for local or systemic administration, e.g., via any one of intra-organ, intravascular, intraventricular, intravenous, intraarterial, intranasal, subcutaneous, intraperitoneal, intramedullary, intraarticular, intrasynovial, intracartilaginous, intrabiliary, intracardiac, intrapericardial, intraocular, intrapulmonary, intrapleural, intrabronchial, intracranial, intrathecal, or intramuscular administration. In some embodiments, the pharmaceutical composition is formulated for intravenous or subcutaneous administration. In some embodiments, the pharmaceutical composition is formulated for local administration to an organ or tissue site.

[0162] In some embodiments, the pharmaceutical composition must meet certain standards for administration to an individual. For example, the United States Food and Drug Administration has issued regulatory guidelines setting standards for cell-based immunotherapeutic products, including 21 CFR 610 and 21 CFR 610.13. Methods are known in the art to assess the appearance, identity, purity, safety, and / or potency of pharmaceutical compositions. In some embodiments, the pharmaceutical composition is substantially free of extraneous protein capable of producing allergenic effects, such as proteins of an animal source used in cell culture other than the mesenchymal stem cells. In some embodiments, “substantially free” is less than about any of 10%, 5%, 1%, 0.1%, 0.01%, 0.001%, 1 ppm or less of total volume or weight of the pharmaceutical composition. In some embodiments, the pharmaceutical composition is prepared in a GMP-level workshop. In some embodiments, the pharmaceutical composition comprises less than about 5 EU / kg body weight / hr of endotoxin for parenteral administration. In some embodiments, at least about 70%of the mesenchymal stem cells in the pharmaceutical composition are alive for intravenous administration. In some embodiments, the pharmaceutical composition has a “no growth” result when assessed using a 14-day direct inoculation test method as described in the United States Pharmacopoeia (USP) . In some embodiments, prior to administration of the pharmaceutical composition, a sample including both the mesenchymal stem cells and the pharmaceutically acceptable excipient should be taken for sterility testing approximately about 48-72 hours prior to the final harvest (or coincident with the last re-feeding of the culture) . In some embodiments, the pharmaceutical composition is free of mycoplasma contamination. In some embodiments, the pharmaceutical composition is free of detectable microbial agents. In some embodiments, the pharmaceutical composition is free of communicable disease agents, such as HIV type I, HIV type II, HBV, HCV, Human T-lymphotropic virus, type I; and Human T-lymphotropic virus, type II. In some embodiments, the pharmaceutical composition is free of viral (e.g., lentivirus) components during manufacture. IV. Method of Treatment

[0163] The present application further provides methods of treating a disease (e.g., ischemia or perivascular kidney disease) in an individual (e.g., human) in need thereof, comprising administering to the individual a therapeutically effective amount of any of the compositions (e.g., pharmaceutical compositions) described herein. In some embodiments, the disease is selected from the group consisting of ischemia, a bone disorder or injury, a chondrocyte disorder or injury, a musculoskeletal disease, a neurodegenerative disease, an inflammatory disorder, an autoimmune disorder, kidney disease or injury, liver disease or injury, lung disease or injury, brain disease or injury, cardiac disease or injury, joint disease or injury, acute injury of a tissue, a vascular disease or disorder, and an infection. In some embodiments, the disease is ischemia or perivascular kidney disease. In some embodiments, the method further comprises selecting the individual for treatment based on the level of mesenchymal stem cells (MSCs) and / or pericytes at the site (s) of the disease or symptoms of said disease. In some embodiments, the composition or pharmaceutical composition is administered to the individual at least once. In some embodiments, the composition or pharmaceutical composition is administered to the individual at least twice. In some embodiments, the composition or pharmaceutical composition is administered to the individual at least twice, and wherein each administration is separated by at least about one week (e.g., by at least about four weeks) . In some embodiments, the individual is human.

[0164] In some embodiments, the method of treatment is an allogeneic treatment comprising administering to the individual a composition or pharmaceutical composition comprising any of the mesenchymal stem cells described herein, wherein the mesenchymal stem cells are derived from another individual (e.g., a healthy individual) . In some embodiments, the method of treatment is an autologous treatment comprising administering to the individual a composition of pharmaceutical composition comprising any of the mesenchymal stem cells described herein, wherein the mesenchymal stem cells are derived from the individual (i.e. the same individual) .

[0165] Also provided herein is a method of promoting wound repair in an individual (e.g., human) in need thereof, comprising administering to the individual a therapeutically effective amount of any of the compositions (e.g., pharmaceutical compositions) described herein. In some embodiments, the individual has or is at risk of developing a disease selected from the group consisting of ischemia, a bone disorder or injury, a chondrocyte disorder or injury, a musculoskeletal disease, a neurodegenerative disease, an inflammatory disorder, an autoimmune disorder, kidney disease or injury, liver disease or injury, lung disease or injury, brain disease or injury, cardiac disease or injury, joint disease or injury, acute injury of a tissue, a vascular disease or disorder, and an infection. In some embodiments, the wound to be repaired is a symptom and / or side effect of the disease or a side effect of standard treatments of said disease. In some embodiments, the method further comprises selecting the individual for treatment based on the level of mesenchymal stem cells (MSCs) and / or pericytes at the site (s) of the wound to be repaired. In some embodiments, the composition or pharmaceutical composition is administered to the individual at least once. In some embodiments, the composition or pharmaceutical composition is administered to the individual at least twice. In some embodiments, the composition or pharmaceutical composition is administered to the individual at least twice, and wherein each administration is separated by at least about one week (e.g., by at least about four weeks) . In some embodiments, the individual is human.

[0166] In some embodiments, there is provided a method of promoting tissue regeneration in an individual (e.g., human) in need thereof, comprising administering to the individual a therapeutically effective amount of any of the compositions (e.g., pharmaceutical compositions) described herein. In some embodiments, the individual has or is at risk of developing a disease characterized by tissue loss or tissue damage, such as a disease selected from the group consisting of ischemia, a bone disorder or injury, a chondrocyte disorder or injury, a musculoskeletal disease, a neurodegenerative disease, an inflammatory disorder, an autoimmune disorder, kidney disease or injury, liver disease or injury, lung disease or injury, brain disease or injury, cardiac disease or injury, joint disease or injury, acute injury of a tissue, a vascular disease or disorder, and an infection. In some embodiments, the method further comprises selecting the individual for treatment based on the level of mesenchymal stem cells (MSCs) and / or pericytes at the site (s) of the damaged or diseased tissue. In some embodiments, the composition or pharmaceutical composition is administered to the individual at least once. In some embodiments, the composition or pharmaceutical composition is administered to the individual at least twice. In some embodiments, the composition or pharmaceutical composition is administered to the individual at least twice, and wherein each administration is separated by at least about one week (e.g., by at least about four weeks) . In some embodiments, the individual is human.

[0167] In some embodiments, there is provided a method of promoting angiogenesis in an individual (e.g., human) in need thereof, comprising administering to the individual a therapeutically effective amount of any of the compositions (e.g., pharmaceutical compositions) described herein. In some embodiments, the individual has or is at risk of developing a disease characterized by a loss of blood flow and / or healthy blood vessels, such as a disease selected from the group consisting of ischemia, a bone disorder or injury, a chondrocyte disorder or injury, a musculoskeletal disease, a neurodegenerative disease, an inflammatory disorder, an autoimmune disorder, kidney disease or injury, liver disease or injury, lung disease or injury, brain disease or injury, cardiac disease or injury, joint disease or injury, acute injury of a tissue, a vascular disease or disorder, and an infection. In some embodiments, the disease is ischemia or perivascular kidney disease. In some embodiments, the method further comprises selecting the individual for treatment based on the level of mesenchymal stem cells (MSCs) and / or pericytes at the site (s) of the disease or symptoms of said disease. In some embodiments, the composition or pharmaceutical composition is administered to the individual at least once. In some embodiments, the composition or pharmaceutical composition is administered to the individual at least twice. In some embodiments, the composition or pharmaceutical composition is administered to the individual at least twice, and wherein each administration is separated by at least about one week (e.g., by at least about four weeks) . In some embodiments, the individual is human.

[0168] In some embodiments, the individual to whom the compositions are administered is a primate, such as a human, monkey, gorilla, chimpanzee, etc. In some embodiments, the individual is a human. The individual can be male or female and can be any suitable age, including infant, juvenile, adolescent, adult, and geriatric individuals. In some embodiments, the individual is a mammal, including but not limited to, mice, rats, hamsters, guinea pigs, rabbits, chinchillas, cats, dogs, horses, donkeys, cows, goats, sheep, deer, monkeys, apes, etc. In some embodiments, the individual is a livestock. In some embodiments, the individual is a companion animal. In some examples, the individual is a validated animal model for assessing disease, adoptive cell therapy, and / or toxic outcomes.

[0169] The methods are applicable to diseases of all stages, including early-stage diseases and advanced stage diseases. The methods described herein may be used as a first therapy, second therapy, third therapy, or combination therapy with other types of therapies known in the art for treating the disease.

[0170] In some embodiments, the disease is selected from the group consisting of ischemia, ischemic stroke (IS) , microvascular ischemic disease (MVID) , perivascular kidney disease (PVKD) , chronic kidney disease (CKD) , peritubular capillary rarefaction (PTC) , small vessel disease (SVD) , peripheral artery disease (PAD) , hepatic ischemia (HI) , ischemic cholangiopathy (IC) , vascular dementia (VD) , Alzheimer’s disease (AD) , traumatic brain injury (TBI) , amyotrophic lateral sclerosis (ALS) , multiple sclerosis (MS) diabetes, diabetic retinopathy (DR) , diabetic nephropathy (DN) , glaucoma, Parkinson’s disease (PD) , sepsis, cardiovascular disease (CVD) , myocardial infarction (MI) , acute lung injury (ALI) , pulmonary arterial hypertension (PAH) , SARS-CoV-2 infection, ischemic bone necrosis, osteoporosis, osteopenia, osteoarthritis, juvenile idiopathic arthritis, gout, joint injury, synovial osteochondromatosis (SOC) , cartilage ischemia, epiphyseal avascular necrosis, and hyaline cartilage degeneration. In some embodiments, the disease is ischemia or perivascular kidney disease.

[0171] Any suitable methods for the administration of any of the compositions (e.g., pharmaceutical composition) described herein can be used herein. The route of administration is in accordance with any known and accepted methods, such as by single or multiple infusion (s) over a long period of time in a suitable manner, e.g., injection or infusion by via intra-organ, intravascular, intraventricular, intravenous, intraarterial, intranasal, subcutaneous, intraperitoneal, intramedullary, intraarticular, intrasynovial, intracartilaginous, intrabiliary, intracardiac, intrapericardial, intraocular, intrapulmonary, intrapleural, intrabronchial, intracranial, intrathecal and intramuscular administration. In some embodiments, the composition (e.g., pharmaceutical composition) is administered locally or systemically. In some embodiments, the composition (e.g., pharmaceutical composition) is administered intravenously, such as by infusion.

[0172] In some embodiments, the pharmaceutical composition provided herein contains the MSCs described herein in amounts effective to treat or prevent the disease or disorder, such as a therapeutically effective or prophylactically effective amount. Therapeutic or prophylactic efficacy in some embodiments is monitored by periodic assessment of treated individuals. For repeated administrations over several days or longer, depending on the condition, the treatment is repeated until a desired suppression of disease symptoms occurs. However, other dosage regimens may be useful and can be determined.

[0173] Dosages and desired concentration of MSCs in the pharmaceutical composition of the present disclosure may vary depending on the particular use envisioned. The determination of the appropriate dosage or route of administration is well within the skill of an ordinary artisan. Animal experiments provide reliable guidance for the determination of effective doses for human therapy. Interspecies scaling of effective doses can be performed following the principles laid down by Mordenti, J. and Chappell, W. “The Use of Interspecies Scaling in Toxicokinetics, ” In Toxicokinetics and New Drug Development, Yacobi et al., Eds, Pergamon Press, New York 1989, pp. 42-46. It is within the scope of the present application that different formulations will be effective for different treatments and different disorders, and that administration intended to treat a specific organ or tissue may necessitate delivery in a manner different from that to another organ or tissue.

[0174] In some embodiments, an individual may be administered the range of about ten thousand to about 100 billion cells and / or that amount of cells per kilogram of body weight. In some embodiments, the composition (or pharmaceutical composition thereof) is administered at a dosage of at least about any of 104, 105, 106, 107, 108, or 109 cells / kg of body weight of the individual. Dosages may vary depending on attributes particular to the disease or disorder and / or patient and / or other treatments. The method may occur without or with the administration of one or more cytokines and / or chemokines, for example cytokines and / or chemokines that may promote MSC survival and / or engraftment in the individual to whom the composition (e.g., pharmaceutical composition) has been administered.

[0175] In some embodiments, the composition (e.g., pharmaceutical composition thereof) is administered at least once. In some embodiments, the composition (e.g., pharmaceutical composition thereof) is administered multiple times (such as any of 2, 3, 4, 5, 6, or more times) . In some embodiments, the composition (e.g., pharmaceutical composition thereof) is administered once or multiple times during a dosing cycle. A dosing cycle can be, e.g., 1, 2, 3, 4, 5 or more week (s) , or 1, 2, 3, 4, 5, or more month (s) . The optimal dosage and treatment regime for a particular patient can be determined by one skilled in the art of medicine by monitoring the patient for signs of disease and adjusting the treatment accordingly.

[0176] In certain embodiments, once the composition (e.g., pharmaceutical composition thereof) is administered to a mammal (e.g., a human) , the biological activity of the MSCs of the composition is measured by any of a number of known methods. MSCs have been shown to exert therapeutic effects largely through their paracrine actions. Growth factors, cytokines, chemokines, extracellular matrix components, and metabolic products have been found to be functional molecules of MSCs within various therapeutic paradigms. These secretory factors contribute to immune modulation, tissue remodeling, and cellular homeostasis during regeneration. In certain embodiments, the biological activity of the MSCs of the composition can be measured by assaying expression and / or secretion of certain growth factors, cytokines, chemokines, extracellular matrix components, and / or metabolic products, such as secretion of platelet-derived growth factor (PDGFB) , CXC motif chemokine 12 (CXCL12, also known as SDF-1) , C-C motif ligand 2 (CCL2, also known as MCP-1) , vascular endothelial growth factor (VEGF) , basic fibroblast growth factor (bFGF) , keratinocyte growth factor (KGF) , insulin-like growth factors (IGF-1 and IGF-2) , and hepatocyte growth factor (HGF) , etc. In some aspects, the biological activity is measured by assessing clinical outcome, such as reduction in symptom severity of the disease (e.g., ischemia or perivascular kidney disease) . EXEMPLARY EMBODIMENTS

[0177] Embodiment 1. A method for generating a population of mesenchymal stem cells (MSCs) from Expanded Potential Stem Cells (EPSCs) , comprising: subjecting the EPSCs to a first condition that differentiates the EPSC into a population of trophoblast cells, wherein the first condition comprises an inhibitor of activin receptor-like kinase (ALK) receptor, wherein the first condition does not comprise a BMP4 agonist.

[0178] Embodiment 2. A method for generating a population of trophoblast cells from Expanded Potential Stem Cells (EPSCs) , comprising: subjecting the EPSCs to a first condition that differentiates the EPSC into the population of trophoblast cells, wherein the first condition comprises an inhibitor of activin receptor-like kinase (ALK) receptor, wherein the first condition does not comprise a BMP4 agonist.

[0179] Embodiment 3. The method of Embodiment 1 or Embodiment 2, wherein the inhibitor of ALK receptor is selected from the group consisting of SB-431542, A-83-01, and LY-2157299.

[0180] Embodiment 4. The method of any one of Embodiments 1-3, wherein the inhibitor of ALK receptor is SB-431542.

[0181] Embodiment 5. The method of Embodiment 3 or Embodiment 4, wherein the first condition comprises about 5μM to about 15μM SB-431542.

[0182] Embodiment 6. The method of Embodiment 5, wherein the first condition comprises about 10μM SB-431542.

[0183] Embodiment 7. The method of any one of Embodiments 1-6, wherein the first condition further comprises a serum-free medium supplement, non-essential amino acids (NEAA) , beta-mercaptoethanol, or penicillin-streptomycin-glutamine (PSG) , or any combination thereof.

[0184] Embodiment 8. The method of any one of Embodiments 1-7, wherein the EPSCs are not in contact with a feeder cell population when subjected to the first condition.

[0185] Embodiment 9. The method of any one of Embodiments 1-8, wherein the EPSCs are subjected to the first condition for less than three days.

[0186] Embodiment 10. The method of any one of Embodiments 1-9, wherein the EPSCs are subjected to the first condition for about 2 days.

[0187] Embodiment 11. The method of any one of Embodiments 1-10, wherein the EPSCs are subjected to the first condition at a temperature of about 37℃.

[0188] Embodiment 12. The method of any one of Embodiments 1-11, wherein the EPSCs are subjected to the first condition in the presence of about 3%to about 6%CO2.

[0189] Embodiment 13. The method of any one of Embodiments 1-12, wherein the EPSCs are subjected to the first condition in the presence of about 5%CO2.

[0190] Embodiment 14. The method of any one of Embodiments 1-13, wherein the population of trophoblast cells expresses one or more trophoblast markers selected from the group consisting of GATA3, GATA2, CDX2, KRT7, and TFAP2C.

[0191] Embodiment 15. The method of any one of Embodiments 1-14, wherein the population of trophoblast cells expresses one or more trophoblast markers selected from the group consisting of GATA2, CDX2, and KRT7.

[0192] Embodiment 16. The method of any one of Embodiments 1-15, wherein the population of trophoblast cells shows reduced expression of one or more pluripotency markers selected from the group consisting of OCT4, SOX2, and NANOG.

[0193] Embodiment 17. The method of any one of Embodiments 1-16, further comprising subjecting the population of trophoblast cells to a second condition that differentiates the population of trophoblast cells to a population of mesenchymal stem cells (MSCs) derived from EPSCs.

[0194] Embodiment 18. The method of Embodiment 17, wherein the second condition comprises Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) and Epidermal Growth Factor (EGF) .

[0195] Embodiment 19. The method of Embodiment 18, wherein the second condition comprises about 3 ng / mL to about 7 ng / mL bFGF.

[0196] Embodiment 20. The method of Embodiment 19, wherein the second condition comprises about 5 ng / mL bFGF.

[0197] Embodiment 21. The method of any one of Embodiments 18-20, wherein the second condition comprises about 3 ng / mL to about 7 ng / mL EGF.

[0198] Embodiment 22. The method of Embodiment 21, wherein the second condition comprises about 5 ng / mL EGF.

[0199] Embodiment 23. The method of any one of Embodiments 17-22, wherein the second condition further comprises fetal bovine serum (FBS) , non-essential amino acids, or beta-mercaptoethanol, or any combination thereof.

[0200] Embodiment 24. The method of any one of Embodiments 17-23, wherein the population of trophoblast cells or cells derived therefrom are subjected to the second condition at a temperature of about 37℃.

[0201] Embodiment 25. The method of any one of Embodiments 17-24, wherein the population of trophoblast cells or cells derived therefrom are subjected to the second condition in the presence of about 3%to about 6%CO2.

[0202] Embodiment 26. The method of Embodiment 25, wherein the population of trophoblast cells or the cells derived therefrom are subjected to the second condition in the presence of about 5%CO2.

[0203] Embodiment 27. The method of any one of Embodiments 17-26, wherein the population of trophoblast cells or cells derived therefrom are subjected to the second condition for at least about 5 days.

[0204] Embodiment 28. The method of Embodiment 27, wherein at or after the at least about 5 days, the population of trophoblast cells or the cells derived therefrom are passaged.

[0205] Embodiment 29. The method of Embodiment 28, wherein the passaging comprises dissociating the population of trophoblast cells or the cells derived therefrom.

[0206] Embodiment 30. The method of Embodiment 29, wherein the dissociating comprises treating the population of trophoblast cells or the cells derived therefrom with trypsin.

[0207] Embodiment 31. The method of any one of Embodiments 28-30, wherein the population of trophoblast cells or the cells derived therefrom are passaged at a ratio of about 1:3 to about 1: 5.

[0208] Embodiment 32. The method of any one of Embodiments 28-31, wherein the population of trophoblast cells or the cells derived therefrom are further subjected to the second condition for at least about 7 days.

[0209] Embodiment 33. The method of Embodiment 32, wherein around the at least about 7 days, the population of trophoblast cells or the cells derived therefrom are passaged.

[0210] Embodiment 34. The method of Embodiment 33, wherein the population of trophoblast cells or the cells derived therefrom are treated to one or more subsequent rounds of being subjected to the second condition for at least about 7 days and passaging, until the population of MSCs is differentiated.

[0211] Embodiment 35. The method of any one of Embodiments 1 and 27-34, wherein the population of MSCs expresses one or more mesenchymal stem cell (MSC) markers selected from the group consisting of CD73, CD90, CD105, CD44, and CD29.

[0212] Embodiment 36. The method of Embodiment 35, wherein the population of MSCs is differentiated when greater than or equal to about 90%of cells derived from the population of trophoblast cells or cells derived therefrom express the one or more MSC markers.

[0213] Embodiment 37. The method of Embodiment 35 or Embodiment 36, wherein the population of MSCs shows no expression of one or more surface markers selected from the group consisting of CD45, CD34, CD11b, CD79a, and HLA-DR.

[0214] Embodiment 38. The method of any one of Embodiments 1 and 27-37, wherein the population of MSCs shows reduced expression relative to the EPSCs or no expression of one or more pluripotency markers selected from the group consisting of OCT4, SOX2, and NANOG.

[0215] Embodiment 39. The method of any one of Embodiments 1 and 27-38, wherein the population of MSCs shows reduced expression relative to the population of trophoblast cells or no expression of one or more trophoblast cell markers selected from the group consisting of GATA2, CDX2, and KRT7.

[0216] Embodiment 40. The method of any one of Embodiments 1 and 27-39, wherein the population of MSCs shows increased expression of one or more genes selected from the group consisting of PVR, LINC02693, PID1, ULBP1, PDGFB, F3, INA, ULBP2, HSD11B1, HOXB2, HOXB4, KCNN2, XAF1, TRPM2, MAGEA3, NKX2.5, and TYRP1 at levels at least about 2-fold increased compared to a population of MSCs derived from induced pluripotent stem cells (iPSCs) .

[0217] Embodiment 41. The method of any one of Embodiments 1 and 27-40, wherein the population of MSCs expresses PDGFB.

[0218] Embodiment 42. The method of any one of Embodiments 1 and 27-41, wherein the population of MSCs shows reduced expression of one or more genes selected from the group consisting of LDOC1, TFAP2A, CPE, CLEC11A, SFRP2, BGN, CXCL12, HEPH, DLX1, BST1, CALHM2, PRRX1, NYNRIN, TMT1A, TMEM119, CD24, NLGN1, EBF2, EPB41L3, FES, and NFIB at levels at least about 2-fold increased compared to a population of MSCs derived from induced pluripotent stem cells (iPSCs) .

[0219] Embodiment 43. The method of any one of Embodiments 1 and 27-42, wherein the population of MSCs is capable of differentiating into one or more of adipocytes, osteoblasts, and / or chondrocytes.

[0220] Embodiment 44. The method of any one of Embodiments 1 and 27-43, wherein the population of MSCs is capable of promoting angiogenesis.

[0221] Embodiment 45. The method of any one of Embodiments 1 and 27-44, wherein the population of MSCs is capable of recruiting one or more of macrophages, endothelial cells, and / or pericytes.

[0222] Embodiment 46. The method of Embodiment 45, wherein the macrophages are M2 macrophages.

[0223] Embodiment 47. The method of Embodiment 45, wherein the endothelial cells are CD31+ endothelial cells.

[0224] Embodiment 48. The method of Embodiment 45, wherein the pericytes are PDGFRbeta+NG2+ pericytes.

[0225] Embodiment 49. A composition comprising a population of cells differentiated from a population of expanded potential stem cells (EPSCs) according to the method of any one of Embodiments 1-48.

[0226] Embodiment 50. A composition comprising a population of mesenchymal stem cells (MSCs) differentiated from a population of expanded potential stem cells (EPSCs) according to the method of any one of Embodiments 1 and 27-48.

[0227] Embodiment 51. A composition comprising a population of mesenchymal stem cells (MSCs) differentiated from a population of expanded potential stem cells (EPSCs) , wherein the MSCs express one or more markers selected from the group consisting of CD73, CD90, CD105, CD44, and CD29.

[0228] Embodiment 52. The composition of Embodiment 50 or Embodiment 51, wherein the population of MSCs has reduced expression or no expression of one or more markers selected from the group consisting of OCT4, SOX2, NANOG, GATA2, TFAP2A, TFAP2C, KRT7, TP63, ELF5, EPAS1, SP6, and ERVW-1.

[0229] Embodiment 53. The composition of any one of Embodiments 50-52, wherein the population of MSCs: i. expresses one or more genes selected from the group consisting of PVR, LINC02693, PID1, ULBP1, PDGFB, F3, INA, ULBP2, HSD11B1, HOXB2, HOXB4, KCNN2, XAF1, TRPM2, MAGEA3, NKX2.5, and TYRP1 at levels at least about 2-fold increased compared to a population of MSCs derived from induced pluripotent stem cells (iPSCs) ; and / or ii. expresses one or more genes selected from the group consisting of LDOC1, TFAP2A, CPE, CLEC11A, SFRP2, BGN, CXCL12, HEPH, DLX1, BST1, CALHM2, PRRX1, NYNRIN, TMT1A, TMEM119, CD24, NLGN1, EBF2, EPB41L3, FES, and NFIB at levels at least about 2-fold decreased compared to a population of MSCs derived from induced pluripotent stem cells (iPSCs) .

[0230] Embodiment 54. The composition of any one of Embodiments 50-53, wherein the population of MSCs is capable of differentiating into one or more of adipocytes, osteoblasts, and / or chondrocytes.

[0231] Embodiment 55. The composition of any one of Embodiments 50-54, wherein the population of MSCs is capable of promoting angiogenesis.

[0232] Embodiment 56. The composition of any one of Embodiments 50-55, wherein the population of MSCs is capable of recruiting one or more of macrophages, endothelial cells, and / or pericytes.

[0233] Embodiment 57. The composition of Embodiment 56, wherein the macrophages are M2 macrophages.

[0234] Embodiment 58. The method of Embodiment 56, wherein the endothelial cells are CD31+ endothelial cells.

[0235] Embodiment 59. The method of Embodiment 56, wherein the pericytes are PDGFRbeta+NG2+ pericytes.

[0236] Embodiment 60. A pharmaceutical composition comprising the composition of any one of Embodiments 49-59, and optionally a pharmaceutical carrier.

[0237] Embodiment 61. A method of treating a disease in an individual in need thereof, comprising administering a therapeutically effective amount of the composition of any one of Embodiments 49-59 or the pharmaceutical composition of Embodiment 60 to the individual.

[0238] Embodiment 62. The method of Embodiment 61, further comprising selecting the individual for treatment based on level of mesenchymal stem cells (MSCs) or pericytes.

[0239] Embodiment 63. The method of Embodiment 61 or Embodiment 62, wherein the disease is selected from the group consisting of ischemia, a bone disorder or injury, a chondrocyte disorder or injury, a musculoskeletal disease, a neurodegenerative disease, an inflammatory disorder, an autoimmune disorder, kidney disease or injury, liver disease or injury, lung disease or injury, brain disease or injury, cardiac disease or injury, joint disease or injury, acute injury of a tissue, a vascular disease or disorder, and an infection.

[0240] Embodiment 64. The method of any one of Embodiments 61-63, wherein the disease is selected from the group consisting of ischemia, ischemic stroke (IS) , microvascular ischemic disease (MVID) , perivascular kidney disease (PVKD) , chronic kidney disease (CKD) , peritubular capillary rarefaction (PTC) , small vessel disease (SVD) , peripheral artery disease (PAD) , hepatic ischemia (HI) , ischemic cholangiopathy (IC) , vascular dementia (VD) , Alzheimer’s disease (AD) , traumatic brain injury (TBI) , amyotrophic lateral sclerosis (ALS) , multiple sclerosis (MS) diabetes, diabetic retinopathy (DR) , diabetic nephropathy (DN) , glaucoma, Parkinson’s disease (PD) , sepsis, cardiovascular disease (CVD) , myocardial infarction (MI) , acute lung injury (ALI) , pulmonary arterial hypertension (PAH) , SARS-CoV-2 infection, ischemic bone necrosis, osteoporosis, osteopenia, osteoarthritis, juvenile idiopathic arthritis, gout, joint injury, synovial osteochondromatosis (SOC) , cartilage ischemia, epiphyseal avascular necrosis, and hyaline cartilage degeneration.

[0241] Embodiment 65. The method of any one of Embodiments 61-64, wherein the disease is ischemia or perivascular kidney disease.

[0242] Embodiment 66. The method of any one of Embodiments 61-65, wherein the composition or pharmaceutical composition is administered to the individual at least once.

[0243] Embodiment 67. The method of Embodiment 66, wherein the composition or pharmaceutical composition is administered to the individual at least twice.

[0244] Embodiment 68. The method of Embodiment 67, wherein the composition or pharmaceutical composition is administered to the individual at least twice, and wherein each administration is separated by at least about one week.

[0245] Embodiment 69. The method of Embodiment 68, wherein each administration is separated by at least about four weeks.

[0246] Embodiment 70. The method of any one of Embodiments 61-69, wherein the composition or pharmaceutical composition is administered locally or systemically.

[0247] Embodiment 71. The method of any one of Embodiments 61-69, wherein the route of administration of the composition or pharmaceutical composition is selected from the group consisting of intra-organ, intravascular, intraventricular, intravenous, intraarterial, intranasal, subcutaneous, intraperitoneal, intramedullary, intraarticular, intrasynovial, intracartilaginous, intrabiliary, intracardiac, intrapericardial, intraocular, intrapulmonary, intrapleural, intrabronchial, intracranial, intrathecal, or intramuscular administration. EXAMPLES

[0248] The following examples are put forth so as to provide those of ordinary skill in the art with a complete disclosure and description of how to make and use the present disclosure, and are not intended to limit the scope of what the inventors regard as their disclosure nor are they intended to represent that the experiments below are all or the only experiments performed. Efforts have been made to ensure accuracy with respect to numbers used (e.g., amounts, temperature, etc. ) but some experimental errors and deviations should be accounted for. The examples below are intended to be purely exemplary of the application and should therefore not be considered to limit the application in any way.

[0249] The present disclosure has been described in terms of particular embodiments found or proposed by the present inventor to comprise preferred modes for the practice of the disclosure. It will be appreciated by those of skill in the art that, in light of the present disclosure, numerous modifications and changes can be made in the particular embodiments exemplified without departing from the intended scope of the disclosure. For example, due to codon redundancy, changes can be made in the underlying DNA sequence without affecting the protein sequence. Moreover, due to biological functional equivalency considerations, changes can be made in protein structure without affecting the biological action in kind or amount. All such modifications are intended to be included within the scope of the appended claims. Example 1: Generation of Expanded Potential Stem Cells (EPSCs) from Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs)

[0250] This example describes the generation of Expanded Potential Stem Cells (EPSCs) from Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) and demonstrates the expanded potential of EPSCs by comparing the ability of both populations to differentiate trophoblastic cell populations including trophoblast stem cells (TSCs) and / or syncytiotrophoblasts (STB) .

[0251] To convert iPSC into EPSC, iPSCs (from the IMR90-iPSC cell line; herein “IMR90-EPSCs” ) were seeded on SNL feeders and cultured in EPSC medium. SNL feeders are clonally derived from a mouse fibroblast STO cell line transformed with neomycin resistance and murine LIF genes. EPSC medium comprises DMEM / F12 NeurobasalTM Medium (ThermoFisher Scientific Cat. #21103049) , 1x Penicillin-Streptomycin-Glutamine (PSG) , 1x Non-Essential Amino Acids (NEAA) , 1x B-27TM Supplement (ThermoFisher Scientific, Cat. #17504044) , 0.5x N-2 Supplement (ThermoFisher Scientific, Cat. #17502048) , 1x Insulin-Transferrin-Selenium-X supplement (ITS-X Supplement; ThermoFisher Scientific, Cat. #51500056) , 1 mM Sodium Pyruvate, 0.045%BSA, 1x Defined lipids, 1x Trace element B, 1x Trace element C, 3.3μg / ml Reduced glutathione, 64μg / ml Vitamin C, 55μM 2-Mercaptoethanol, 2.5 μM Endo-IWR-1, 1 μM CHIR99021, 2.5 μM XAV939, and 0.1 μM A-419259 trihydrochloride.

[0252] Cells were cultured and expanded for 2 to 4 weeks, including passages every 3-5 days. Beginning at 2 weeks of differentiation, cultured cells began to exhibit EPSC-like phenotypes, including close cell-packing and dome-shaped morphology as shown in FIG. 1A.

[0253] Next, the potential of EPSCs to differentiate into trophoblast cell populations was tested in comparison to iPSCs. It has previously been reported that EPSCs can be differentiated into trophoblastic cells without the addition of BMP-4 to cultures, whereas iPSCs do not possess this capacity. See, for example, Wei et al., Efficient derivation of human trophoblast stem cells from primed pluripotent stem cells. Sci Adv, 2021.7 (33) , the contents of which are herein incorporated by reference in its entirety. As such, both IMR90-EPSCs and IMR90-iPSCs were stimulated to differentiate into trophoblast stem cells (TSC) or trophoblast-lineage cells in the absence of BMP-4 supplementation using TSC induction medium comprising DMEM / F12 basal medium with 0.2%fetal bovine serum (FBS) , 1%Penicillin-Streptomycin-Glutamine (PSG) , 1%Insulin-Transferrin-Selenium-X supplement (ITS-X Supplement; ThermoFisher Scientific, Cat. #51500056) , 0.3%Bovine Albumin Fraction V, 50 μg / mL L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate, 50μg / mL Human EGF Recombinant Protein, 10μM Valproic Acid, 2 μM CHIR99021, 5 μM Y27632, 0.5μM A83-01, 55 μM 2-Mercaptoethanol, and 1 μM SB-431542 (Cat. #04-0010-05, Stemolecule) .

[0254] As shown in FIG. 1B, after 7 days of culture, IMR90-EPSCs differentiated into cells with TSC-like morphology, whereas IMR90-iPSC-derived cells either died or failed to form TSC-like morphology (e.g., cobblestone-shaped colonies) within the same culture period. IMR90-EPSC-derived cells also demonstrated increased expression of trophoblast-related protein markers KRT7, TFAP2C, and GATA2 which was decreased or entirely absent in IMR90-iPSC-derived cells (FIG. 1C) .

[0255] Next, changes in RNA expression patterns in cells derived from TSC-differentiated IMR90-iPSCs and IMR90-EPSCs were tested and compared to an established EPSC cell line (M1-EPSC) from Chen, Y., et al., SP6 controls human cytotrophoblast fate decisions and trophoblast stem cell establishment by targeting MSX2 regulatory elements. Dev Cell, 2024. 59 (12) : p. 1506-1522. e11, the contents of which are herein incorporated by reference in its entirety. As shown in FIG. 1D, both IMR90-EPSC-derived cells and M1-EPSC-derived cells exhibited a marked increase in the RNA expression levels of TSC-related genes (Gata2, Tfap2A, Tfap2C, Krt7, Tp63, Elf5, Epas1, Sp6) and syncytiotrophoblast (STB) -related genes (Cga, Cgb3, and Sdc1 and Ervw-1) compared to cells derived from IMR90-iPSC after 7 days of TSC differentiation. All cell populations exhibited a significant decrease in RNA levels of pluripotent genes Nanog, Sox2, and Oct4 (FIG. 1E) .

[0256] Finally, the in vivo differentiation capacity of IMR90-EPSCs was examined using a teratoma formation assay in NOD / SCID mice. Here, EPSC colonies were digested into single cells with TrypLE. 5 x 10^6 cells and suspended with a mixture of 50 μL of pre-cooled saline and 50 μl of Matrigel. Mixtures were then injected subcutaneously into the flank of 6-8 weeks NOD / SCID mice, generally resulting in the formation of teratomas at 4-8 weeks post-injection. Mice were sacrificed before the teratoma size exceeded 1500 mm3. Teratomas were then isolated and fixed in 4%PFA, embedded in paraffin, sectioned and histologically characterized by H&E staining for detecting the presence of representative tissues of all three germ layers. As shown in FIG. 1F, EPSC-derived teratomas comprised all three germ layers.

[0257] These results demonstrate that iPSC-derived EPSCs not only possessed pluripotency normally associated with pluripotent stem cell populations such as iPSCs, but also expanded potential to form trophoblast cell populations not normally demonstrated by iPSC populations. Example 2: Differentiation of Mesenchymal Stem Cells (MSCs) derived from iPSCs (i-MSCs) and from EPSCs (e-MSCs)

[0258] This example describes the development of a protocol for differentiation of mesenchymal stem cells (MSC) from EPSCs. A general schematic for this differentiation protocol is shown at the top of FIG. 2A.

[0259] EPSC cell lines, including IMR90-EPSCs and established cell lines C5-EPSC and M1-EPSC, were used to test MSC differentiation. In brief, the EPSCs were first differentiated into a trophoblast transition stage then further differentiated into MSCs, namely C5-MSC (derived from C5-EPSCs) , M1-MSC (derived from M1-EPSCs) , and e-MSC (derived from IMR90-EPSCs) . EPSCs were initially seeded at a cell density of 3x104 cells / well in a 6-well plate on a Matrigel-coated surface under feeder-free conditions and pre-conditioned with 20%KnockOutTM Serum Replacement (KSR) in DMEM / F12 in the presence of the ROCK inhibitor Y-27632 and cultured overnight at 37℃ and 5%CO2 to permit cell attachment. The next day following cell attachment, EPSCs were cultured for 2 days at 37℃ and 5%CO2 in trophoblast induction medium described in Example 1 to differentiate early trophoblast cells. After trophoblast induction, all EPSC lines showed expression of trophoblast markers CDX2, KRT7, TFAP2C, and GATA3, as confirmed by immunofluorescent staining, and increased RNA expression of trophoblast-related genes Cdx2, Krt7 and Gata2 confirmed using qPCR (as shown in FIGs. 2B and 2C, respectively) . FIG. 2D also shows that all populations lose RNA expression of pluripotency markers Sox2, Oct4, and Nanog during this differentiation process.

[0260] Early trophoblast-like cells were then directed to differentiate toward a mesenchymal fate. Beginning at day 3, these cells were cultured at 37℃ and 5%CO2 in MSC induction medium comprising DMEM / F12 with 10%fetal bovine serum (FBS) , 5 ng / mL bFGF, 5 ng / mL EGF, MEM non-essential amino acids (NEAA) , and 55 μM 2-mercaptoethanol. Cultures were maintained for about 7 days until reaching about 80%confluency, at which point cells were detached using 1 ml of 0.05%Trypsin-EDTA for 3 minutes at 37℃, then seeded onto 0.1%gelatin-coated plates for further MSC enrichment. After 3-5 passages, the cells exhibited elongated and spindle-shaped, resembling the morphology of mesenchymal stem cells as shown in FIG. 2A. Cells were further maintained in culture for about three weeks with media changes approximately every two days. Upon reaching 100%confluency (typically every 4-5 days in culture) , cells were passaged by detaching using 1 ml of 0.05%Trypsin-EDTA for 3 minutes at 37℃, resuspended in fresh MSC medium, then seeded on a new 0.1%gelatin-coated plate for continued MSC differentiation. After about three weeks, MSC cultures were analyzed once cells became homogenous in appearance.

[0261] C5-MSCs, M1-MSCs, and e-MSCs were then tested for MSC phenotypes and differentiation potential. After three weeks of MSC differentiation, cells were harvested from morphologically homogenous cultures and analyzed by flow cytometry while being passaged to maintain the cultures. Flow cytometric analysis of cells from the first passage (P1) showed over 90%of the cells expressing MSC markers CD105, CD90, CD73, CD44 and CD29 (FIG. 3A) . These cells also lacked negative markers of non-MSC lineages, including CD45, CD34, CD11b, CD79a, and HLA-DR (FIG. 3A) , which was mirrored by downregulated RNA expression of pluripotent genes (Nanog, Oct4, and Sox2) (FIG. 2C) .

[0262] Cells were maintained and passaged in above MSC media conditions. At passage 3 (P3) , cells were functionally characterized for MSC potency through tri-lineage differentiation to adipocytes, osteocytes, and chondrocytes in vitro. Briefly, MSCs were subjected to adipogenesis, osteogenesis and chondrogenesis using MSC functional identification kit (SC006, R&D Systems) according to the manufacturers’ user manual. As shown in FIG. 3B, all three EPSC-MSC populations were capable of undergoing adipogenesis, osteogenesis and chondrogenesis. Oil red stain shows oil droplets in adipocytes, and cells are positive for fatty acid binding protein 4 (FABP4) . Alizarin Red staining identifies calcium containing osteocytes, and the cells express osteocalcin. Alcian blue staining and aggrecan positive signal in immunofluorescence staining identifies the presence of chondrocytes.

[0263] Next, expression of angiogenesis-related genes selected from the PANTHER (Protein Analysis Through Evolutionary Relationships) pathway database were compared between e-MSC and iPSC-derived MSC (herein “i-MSC” ) populations. Among a total of 141 angiogenesis-related genes analyzed from the PANTHER database, 21 genes were upregulated, and 16 genes were downregulated in e-MSCs compared to i-MSCs. In particular, genes encoding PDGF-related proteins (Pdgfb and Pdgfc) are upregulated in e-MSC, while Vegfd is upregulated in i-MSC (FIG. 5A) . Gene expression changes for the Pdgfb, Pdgfc, and Vegfd genes during differentiation of e-MSCs and i-MSCs, including during the intermediate trophoblast stages, was further analyzed using qPCR.

[0264] qPCR was performed as follows: to generate cDNA from RNA, reverse transcription was performed using reverse transcription kit (TaKaRa, RR037A) according to the manufacturers’ manual. cDNA generated from reverse transcription was incorporated into a qPCR mixture using TB Green Premix Ex Taq II (TaKaRa, RR820A) according to the manufacturers’ manual. qPCR program was run as follows: Stage1: Initial denaturation at 95℃ for 30s, Stage2: PCR at 95℃ for 5s, followed by 60℃ for 34s. Stage 2 repeats for 40 cycles. Stage3: 95℃ for 15s, then 60℃ for 1min, and 95℃ for 15s. Following qPCR, the program progressed to a melt curve stage comprising: 95℃ for 15s, 60℃ for 1 min, and 95℃for 1s. Gene expression was normalized to GAPDH using the ΔΔCt method.

[0265] As shown in FIG. 5B, intermediate EPSC-trophoblasts expressed significantly higher levels of both Pdgfb and Pdgfc, leading to the maintenance of gene expression after complete MSC differentiation to e-MSCs. In particular, Pdgfb and Pdgfc gene expression in EPSC-derived trophoblasts was higher than the original iPSC population from which EPSCs were originally differentiated, with 2381-fold increase above iPSCs for Pdgfb and 9.9-fold increase above iPSCs for Pdgfc. In iPSC-derived trophoblasts, there was an increase of 72-fold for Pdgfb and 5.5-fold for Pdgfc compared to iPSCs. In derived MSCs, the expression in e-MSC is 56-fold for Pdgfb and 2.8-fold for Pdgfc higher than that of i-MSC.

[0266] For the expression of Vegfd, differences between the two populations only appeared at the MSC stage, with no statistical differences between the two groups throughout intermediate trophoblast stages (FIG. 5B) . Bulk RNAseq analysis had found that the expression of Vegfd in i-MSC fluctuates more within the biological repeats (FIG. 5A) , but i-MSC Vegfd expression is higher than that of e-MSC on average. Specifically, i-MSCs exhibited an increase in Vegfd expression of 1.8-fold compared to that of e-MSC (FIG. 5B) .

[0267] These results show that EPSCs derived from iPSCs (IMR90-iPSCs) are capable of being differentiated to MSCs with similar phenotypic and functional capacity to those of established EPSC-MSC cell lines (C5-EPSC-MSCs and M1-EPSC-MSCs) . Example 3. e-MSC molecular profiles reveal increased interaction with the innate immune system and differential angiogenic gene expression relative to i-MSCs.

[0268] This example describes molecular comparisons between MSCs derived from EPSCs (e-EPSCs) and MSCs derived from iPSCs (i-MSCs) to elucidate how the expanded potential of EPSCs affects the properties of MSCs derived therefrom.

[0269] First, the transcriptomes of e-MSCs and i-MSCs were compared. RNA was isolated from each cell samples by trypsinizing, washing with PBS, pelleting, and storing the sample at -80℃ for later use. RNA extraction kit (TaKaRa, 9767) were used according to the manufacturer’s manual. In brief, cell pellet was lysed by provided lysis buffer, then DNA were removed from the mixture by passing through provided DNA column. RNA was then purified and collected by passing through the provided RNA column after several rounds of washing using provided washing buffer.

[0270] A total of 4 biological replicates were collected and stored at -80℃ until processing. RNA with a minimum RNA Integrity Number (RIN) of 4 was considered of sufficient quality for transcriptomic analysis. For library preparation, messenger RNA (mRNA) was isolated from total RNA using magnetic beads comprising poly-T oligos. Following fragmentation, first-strand cDNA was synthesized with random hexamer primers, which was then followed by the synthesis of second-strand cDNA. The library preparation was completed through steps including end repair, A-tailing, adapter ligation, size selection, amplification, and purification.

[0271] Library quality was assessed using Qubit and real-time PCR for quantification, along with a Bioanalyzer for size distribution analysis. Quantified libraries were then pooled and sequenced on Illumina platforms, based on the effective library concentration and desired data volume. Resulting data were processed as follows: quality control of the raw sequencing data was carried out using fastp, ensuring that over 95%of reads achieve a Q30 score. Subsequently, the reads were aligned to the GRCh38. p14 genome using the Spliced Transcripts Alignment to a Reference (STAR) aligner. After alignment, read quantification was performed with featureCounts.

[0272] After data preprocessing, genes with a count equal to zero across all samples were filtered out followed by normalization using the Trimmed Mean of M-values (TMM) method to ensure that the expression levels are comparable across samples. Differential analysis on the normalized data was performed using DESeq2. The criteria for extracting differentially expressed genes were p. adj (adjusted p-value) < 0.05 and the absolute value of LFC (log2 fold change) > 1. Specifically, genes with p. adj < 0.05 and LFC > 1 were classified as upregulated, while those with p. adj < 0.05 and LFC < -1 were classified as downregulated.

[0273] Based on this analysis, a principal component analysis (PCA) and cluster diagram depicting differential gene expression was prepared as shown in FIG. 4A. PCA showed that e-MSC and i-MSC are significantly different at the transcriptome level (FIG. 4A) . While it is normal to have variations between individual differentiation repeats within the group, the two MSC populations were distinct in the PCA plot, with 81%variance in PC1 highlighting their dissimilarities.

[0274] Next, differential expression of individual genes was compared between e-MSCs and i-MSCs. Differential gene expression was determined bioinformatically as described above and expressed in a heatmap arranged by sorting p. adj from smallest to largest, with smaller p.adj values indicating higher significance. For genes with the same p. adj, those with a larger absolute value of LFC were ranked higher. The heatmap clustering was performed using the "ward. D" method.

[0275] The resulting heatmap of differential gene expression is shown in FIG. 4B. Among the top 50 differentially expressed genes (DEGs) resulting from this analysis, there were 13 upregulated genes (F3, Il32, Linc02693, Ostm1, Ulbp1, Pid1, Adora2b, Ina, Hsd11b1, Pdgfb, Ulbp2, Pvr, and Il15ra) and 37 downregulated genes (including Prrx1, Nr2f1, Dlx2, Dppa4, Sfrp2, Tceal7, Auts2, Tfap2a, Bgn, and Igfbp2) (FIG. 4B) . Of note, e-MSCs highly expressed Pdgfb. Next, Gene Ontology (GO) analysis was performed on DEGs in reference to the GO Knowledgebase (http:  / / geneontology. org) using a p-value cutoff of 0.05, adjusted using the false discovery rate (FDR) method. As shown in FIG. 4C, the enriched pathways in e-MSC show more interaction with the innate immune system, including leukocyte migration and leukocyte cell-cell adhesion, while i-MSC pathways are more enriched for nervous system development.

[0276] These results show that differentiation of MSCs from EPSCs affects molecular profile of the resulting population relative to MSCs derived from iPSCs. This may suggest unique functionality and therapeutic relevance of the e-MSCs. Example 4: e-MSCs promote increased M2 macrophage infiltration and maturation of vasculature relative to i-MSCs in ischemia models.

[0277] This example describes a comparison of EPSC-derived MSCs (e-MSCs) and iPSC-derived MSCs (i-MSCs) in promoting angiogenesis and immune infiltration in mouse models of ischemia. Hindlimb ischemia mouse model by ligation of the femoral artery and effects of e-MSC and i-MSC on vascularization.

[0278] First, mice were subjected to the hindlimb ischemia model by ligation of the left femoral artery following the protocol Limbourg et al., 2009, the content of which is herein incorporated by reference in its entirety. In brief, each ICR mouse (male, aged 8-10 weeks) underwent anesthesia through an intraperitoneal injection of 100 mg / kg of ketamine and 10 mg / kg of xylazine and placed on a temperature-regulated heating pad. Hair around the surgical area was removed using a depilatory cream. Subsequently, a 5 mm incision was made along the femoral vessel to expose the femoral artery, vein, and nerve. Next, the femoral artery was carefully dissected and ligated while not causing injury to the adjacent vein and nerve. Immediately following the induction of hind-limb ischemia, the mice were randomly assigned to receive direct intramyocardial injections of 100μL saline (ischmia group) or DiR-labeled e-MSC or i-MSC resuspended in 1: 1 plain medium and Matrigel, at a dosage of 3x106 cells / mouse at three distinct sites adjacent to the ligation area. 5 mice from each group were sacrificed in week 1 for analysis, while the remaining mice were sacrificed in week 4 (ischemia group; n=7, e-MSC group; n=10; i-MSC group; n=10) .

[0279] To evaluate changes in blood perfusion over time, serial laser Doppler imaging and analysis was performed to measure blood perfusion weekly following femoral artery ligation up to week 4. As shown in FIG. 6A and quantified in FIG. 6B, immediately following femoral artery ligation (Day 0) , a significant decrease in blood flow in the ischemic limb relative to the non-ischemic limb was observed in all groups: ischemia group (0.039 ± 0.013%) , e-MSC group (0.045 ± 0.009%) , and i-MSC group (0.08 ± 0.015%) . There were no significant differences among the three groups (p > 0.05) , indicating successful induction of hindlimb ischemia (FIGs. 6A-6B) .

[0280] As shown in FIG. 6A and quantified in FIG. 6B, for the 4 weeks following femoral artery ligation, blood perfusion was tracked weekly to determine differences in recovery between the different groups. At week 1, the i-MSC group showed a higher perfusion rate (0.265 ± 0.033%) compared to both the ischemia group (0.109 ± 0.018%, p<0.01) and the e-MSC group (0.152 ± 0.03%, p<0.05) , while no significant improvement was found in the e-MSC group. By week 2, there were no statistically significant differences between all three groups. However, from week 3 onwards, the e-MSC group began to show significantly improved blood flow compared to the ischemia group, and by week 4 post-femoral artery ligation exhibited superior effects compared to both the ischemia and i-MSC groups. By week 4, perfusion ratios in the ischemia, e-MSC, and i-MSC groups were 0.243 ± 0.02%, 0.682 ±0.049%, and 0.449 ± 0.042%, respectively. Both treatment groups showed statistical significance compared to the ischemia group (p < 0.001 for the e-MSC group and p < 0.01 for the i-MSC group) , while the e-MSC group showed increased improvement compared to the i-MSC group (p < 0.01) at 4 weeks post-treatment.

[0281] Next, changes in neovascularization in the ischemia, i-MSC, and e-MSC groups were assessed by immunohistochemical staining of alpha-smooth muscle antigen (α-SMA) and von Willebrand factor (vWF) at weeks 1 and 4, as shown in FIGs. 6C-6D. Without being bound by theory, quantification of α-SMA-positive vessels (mainly arteries) represents arteriogenesis, while small vWF-positive vessels (mainly capillaries) represent angiogenesis. The average number of vessels was counted from 10 random areas in each sample. At week 1, a marked increase in vWF-positive capillaries was found in the i-MSC group (8.425 ± 0.58 / mm2) , compared to both the ischemia group (4.656 ± 0.21 / mm2, p<0.001) and the e-MSC group (4.9 ± 0.39 / mm2, p<0.01) (FIG. 6D) . Nevertheless, there was no statistically significant increase in α-SMA-positive vessels in all three groups (FIG. 6C) .

[0282] By week 4, more α-SMA-positive vessels were found in the e-MSC group (15.635 ±1.02 / mm2) compared to both the ischemia group (8.8 ± 0.56 / mm2, p<0.001) and the i-MSC group (12.74 ± 0.57 / mm2, p<0.05) (FIG. 6C) . The e-MSC group also presented more vWF-positive vessels in week 4 (22.937 ± 1.39 / mm2) compared with the ischemia group (10.197 ± 1.11 / mm2, p<0.001) , and the i-MSC group (17.787 ± 1.36 / mm2, p<0.05) (FIG. 6D) .

[0283] In sum, these results suggest that e-MSCs promoted delayed yet more fully matured angiogenesis and arteriogenesis than i-MSC counterparts in the femoral artery ligation assay. Secretome analysis following femoral artery ligation.

[0284] Next, differences microenvironment composition induced by e-MSCs and i-MSCs was assessed during the femoral ligation assay. To assess the differences in microenvironments between groups, as well as the changes over time, protein lysate was extracted from muscle tissues at week 1 and week 4 (n=4 at each time point in all groups) during the femoral ligation assay for Olink proteomic analysis using the Olink Statistical Analysis application (https:  / / olinkproteomics. shinyapps. io / OlinkStatisticalAnalysis / ) .

[0285] Among the 92 proteins tested in the Olink assays, significant changes were observed in 7 proteins (VEGF-D, PDGF-B, CCL5, IL-6, IL-17a, MAP2K6, and QDPR) within the three groups in week 1, of which VEGF-D, PDGF-B, CCL5, IL-6, and IL-17a are directly related to inflammation and angiogenesis (FIG. 7A) . However, at week 4 no significant differences in protein expression was found between all three groups (FIG. 7A) . FIG. 7B summarizes all proteins with differential expression between all three groups at week 1.

[0286] VEGF-D, a potent angiogenesis factor, was markedly increased in the i-MSC group in week 1 (NPX=1.763±0.196) compared to both the ischemia group (NPX=1.121±0.092, p<0.001) and the e-MSC group (NPX=1.344±0.150, p<0.01) . However, no differences were observed in week 4. Another angiogenic protein, PDGF-B, was increased in the e-MSC (NPX=8.315±0.7) compared to both the ischemia group (NPX=4.693±1.438, p<0.001) and i-MSC group (NPX=5.702±1.513, p<0.01) . No differences in PDGF-B expression were observed among the groups were found in week 4, however (FIG. 7C) .

[0287] A significant decrease was observed in both e-MSC and i-MSC treatment groups compared to the ischemia control group for the inflammatory cytokines IL-17a (p < 0.001, FIG. 7C) and IL-6 (p < 0.01 for e-MSC and p < 0.001 for i-MSC versus the ischemia group) . An increase in CCL5, a monocyte chemoattractant, was also observed in the e-MSC group in week 1 (NPX=2.074 ± 0.472) compared to the ischemia group (NPX=0.93 ± 0.252, p < 0.01) and the i-MSC group (NPX=0.861 ± 0.484, p < 0.01, FIG. 7C) , implying an increased potential for monocyte recruitment in the e-MSC group. FIG. 7D shows a volcano plot of differentially expressed proteins between e-MSC and i-MSC groups at week 1 following femoral artery ligation. Macrophage infiltration following femoral artery ligation.

[0288] Considering that e-MSC treatment increased expression of the CCL5 chemoattractant, the effect of e-MSCs and i-MSCs on macrophage infiltration was next measured. Without being bound by theory, chemoattractants such as CCL5 are capable of inducing chemotaxis in macrophages in response to instances of tissue damage in vivo, as described for example, in Vogel et al., J. of Neuroinflammation, 2014, and Keophiphath et al., Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology, 2009, all of which are herein incorporated by reference in their entireties. Macrophage infiltration was evaluated by calculating the total number of macrophages in the ligated muscles using immunohistochemical staining with an anti-mouse F4 / 80 antibody (FIG. 8A) . By calculating the average number of cells with F4 / 80 signals per mm2, it was found that the total number of macrophages increased in both the e-MSC group (25.080±1.671 / mm2, p<0.001) and the i-MSC group (17.340±1.209 / mm2, p<0.01) compared to the ischemia group (9.380±0.641 / mm2) at week 1 following ligation, with the e-MSC group exhibiting increased macrophage infiltration compared to i-MSC group at week 1 (p<0.01; FIG. 8A) . By week 4, the e-MSC group (8.550±0.812 / mm2) and the i-MSC group (7.690±0.655 / mm2) still showed increased infiltration of F4 / 80+ macrophages compared to the ischemia group (3.629±0.412 / mm2) , with p<0.001 for e-MSC group and p<0.01 for i-MSC group (FIG. 8A) .

[0289] The polarization of macrophages was further examined by immunofluorescence staining with CD80 and CD206 (markers for M1 and M2 macrophages, respectively) . As shown in FIG. 8B, a marked increase in the total number of CD206-positive cells (M2 macrophages) was observed in both the e-MSC (19.140±1.814 / mm2) and i-MSC groups (9.460±0.455 / mm2) compared to the ischemia group (5.220±0.334 / mm2) at week 1 following ligation , with p<0.001 for e-MSC group and p<0.05 for i-MSC group. Notably, there were significantly more M2 macrophages in the e-MSC group compared to the i-MSC group (p<0.001) (FIG. 8B) . Differences between the two MSC treatment groups were not found in week 4, but e-MSC group displayed a significant increase in M2 macrophages compared to the ischemia group (p<0.05) (FIG. 8B) . The ratio of M1 / M2 macrophage phenotypes in e-MSC group was the lowest at week 1 (0.19±0.02) compared to the ischemia group (0.38±0.06 p<0.001) and the i-MSC group (0.26±0.04 p<0.05, Fig 9b) , indicating a higher potential for promoting M2 polarization in macrophages in the ligated limb in the e-MSC group (FIG. 8B) . By week 4, no CD80-positive M1 macrophages were found in any group (FIG. 8B) .

[0290] These results demonstrate an increase in acute promotion of macrophage infiltration by treatment with e-MSCs when compared to i-MSCs, suggesting that the unique molecular profile, and particularly secretome, of e-MSCs may offer unique therapeutic advantages in some instances of ischemia. Pericyte recruitment following femoral artery ligation.

[0291] Given increased expression of PDGF-B in e-MSC molecular profiles, it was next tested whether e-MSC treatment promoted recruitment of PDGFRβ+ cells (e.g. pericytes) . At week 1 following femoral artery ligation, muscle tissue was stained for PDGFRβ and NG2, two markers of pericytes. As shown in FIG. 9A, free pericytes were present the muscle tissue of the e-MSC treatment group only (8.62±3.39 / mm2) , but not in the ischemia or i-MSC groups, indicating active pericyte recruitment at week 1 in the e-MSC group.

[0292] To further confirm whether the e-MSC group can better promote blood vessel maturation and stabilization, the average number of CD31+ blood vessels surrounded by PDGFRβ+ supporting cells per mm2 were counted and compared using immunohistochemical staining with anti-mouse PDGFRβ and anti-mouse CD31 antibodies. As shown in FIG. 9B, there was a limited number of PDGFRβ+ / CD31+ vessels in the ischemia group at week 4, averaging 1.6±0.400 / mm2. Compared to the ischemia control group, there was an increased number of PDGFRβ+ cells incorporated into blood vessels in both the e-MSC and i-MSC groups, with counts of 8.258±0.659 / mm2 (p<0.001) and 4.837±0.580 / mm2 (p<0.01) , respectively. The e-MSC group also exhibited increased number of PDGFRβ+ cells incorporated into blood vessels relative to the i-MSC group (p<0.01, FIG. 9B) .

[0293] Taken together, the e-MSC group can better promote blood vessel stability and maturation at 4 weeks post-ischemia compared to i-MSCs through the active recruitment of pericytes to the ischemic area.

[0294] Overall, the evidence provided herein demonstrate that e-MSCs have a delayed but superior effect in promoting angiogenesis in hindlimb ischemia mouse models compared to that of i-MSCs and may prove useful in therapeutic interventions for treatment of ischemia.

Claims

A method for generating a population of mesenchymal stem cells (MSCs) from Expanded Potential Stem Cells (EPSCs) , comprising:subjecting the EPSCs to a first condition that differentiates the EPSC into a population of trophoblast cells,wherein the first condition comprises an inhibitor of activin receptor-like kinase (ALK) receptor, andwherein the first condition does not comprise a BMP4 agonist.A method for generating a population of trophoblast cells from Expanded Potential Stem Cells (EPSCs) , comprising:subjecting the EPSCs to a first condition that differentiates the EPSC into the population of trophoblast cells,wherein the first condition comprises an inhibitor of activin receptor-like kinase (ALK) receptor, andwherein the first condition does not comprise a BMP4 agonist.The method of claim 1 or claim 2, wherein the inhibitor of ALK receptor is selected from the group consisting of SB-431542, A-83-01, and LY-2157299.The method of any one of claims 1-3, wherein the inhibitor of ALK receptor is SB-431542.The method of claim 3 or claim 4, wherein the first condition comprises about 5μM to about 15μM SB-431542.The method of any one of claims 1-5, wherein the first condition further comprises a serum-free medium supplement, non-essential amino acids (NEAA) , beta-mercaptoethanol, or penicillin-streptomycin-glutamine (PSG) , or any combination thereof.The method of any one of claims 1-6, wherein the EPSCs are not in contact with a feeder cell population when subjected to the first condition.The method of any one of claims 1-7, wherein the EPSCs are subjected to the first condition for less than three days.The method of any one of claims 1-8, wherein the EPSCs are subjected to the first condition at a temperature of about 37℃.The method of any one of claims 1-9, wherein the population of trophoblast cells expresses one or more trophoblast markers selected from the group consisting of GATA3, GATA2, CDX2, KRT7, and TFAP2C.The method of any one of claims 1-10, wherein the population of trophoblast cells shows reduced expression of one or more pluripotency markers selected from the group consisting of OCT4, SOX2, and NANOG.The method of any one of claims 1-11, further comprising subjecting the population of trophoblast cells to a second condition that differentiates the population of trophoblast cells to a population of mesenchymal stem cells (MSCs) derived from EPSCs.The method of claim 12, wherein the second condition comprises Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) and Epidermal Growth Factor (EGF) .The method of claim 13, wherein the second condition comprises about 3 ng / mL to about 7 ng / mL bFGF.The method of claim 13 or 14, wherein the second condition comprises about 3 ng / mL to about 7 ng / mL EGF.The method of any one of claims 12-15, wherein the second condition further comprises fetal bovine serum (FBS) , non-essential amino acids, or beta-mercaptoethanol, or any combination thereof.The method of any one of claims 12-16, wherein the population of trophoblast cells or cells derived therefrom are subjected to the second condition at a temperature of about 37℃.The method of any one of claims 12-17, wherein the population of trophoblast cells or cells derived therefrom are subjected to the second condition in the presence of about 3%to about 6%CO2.The method of any one of claims 12-18, wherein the population of trophoblast cells or cells derived therefrom are subjected to the second condition for at least about 5 days.The method of claim 19, wherein at or after the at least about 5 days, the population of trophoblast cells or the cells derived therefrom are passaged.The method of claim 20, wherein the population of trophoblast cells or the cells derived therefrom are passaged at a ratio of about 1: 3 to about 1: 5.The method of claim 20 or 21, wherein the population of trophoblast cells or the cells derived therefrom are further subjected to the second condition for at least about 7 days.The method of claim 22, wherein around the at least about 7 days, the population of trophoblast cells or the cells derived therefrom are passaged.The method of claim 23, wherein the population of trophoblast cells or the cells derived therefrom are treated to one or more subsequent rounds of being subjected to the second condition for at least about 7 days and passaging, until the population of MSCs is differentiated.The method of any one of claims 1 and 19-24, wherein the population of MSCs:(a) expresses one or more mesenchymal stem cell (MSC) markers selected from the group consisting of CD73, CD90, CD105, CD44, and CD29;(b) shows no expression of one or more surface markers selected from the group consisting of CD45, CD34, CD11b, CD79a, and HLA-DR;(c) shows reduced expression relative to the EPSCs or no expression of one or more pluripotency markers selected from the group consisting of OCT4, SOX2, and NANOG;(d) shows reduced expression relative to the population of trophoblast cells or no expression of one or more trophoblast cell markers selected from the group consisting of GATA2, CDX2, and KRT7;(e) shows increased expression of one or more genes selected from the group consisting of PVR, LINC02693, PID1, ULBP1, PDGFB, F3, INA, ULBP2, HSD11B1, HOXB2, HOXB4, KCNN2, XAF1, TRPM2, MAGEA3, NKX2.5, and TYRP1 at levels at least about 2-fold increased compared to a population of MSCs derived from induced pluripotent stem cells (iPSCs) ;(f) expresses PDGFB;(g) shows reduced expression of one or more genes selected from the group consisting of LDOC1, TFAP2A, CPE, CLEC11A, SFRP2, BGN, CXCL12, HEPH, DLX1, BST1, CALHM2, PRRX1, NYNRIN, TMT1A, TMEM119, CD24, NLGN1, EBF2, EPB41L3, FES, and NFIB at levels at least about 2-fold increased compared to a population of MSCs derived from induced pluripotent stem cells (iPSCs) ;(h) is capable of differentiating into one or more of adipocytes, osteoblasts, and / or chondrocytes. ;(i) is capable of promoting angiogenesis; and / or(j) is capable of recruiting one or more of macrophages, endothelial cells, and / or pericytes.The method of claim 25, wherein:(a) the population of MSCs is capable of recruiting macrophages, and wherein the macrophages are M2 macrophages;(b) the population of MSCs is capable of recruiting endothelial cells, and wherein the endothelial cells are CD31+ endothelial cells; and / or(c) the population of MSCs is capable of recruiting pericytes, and wherein the pericytes are PDGFRbeta+NG2+ pericytes.A composition comprising a population of cells differentiated from a population of expanded potential stem cells (EPSCs) according to the method of any one of claims 1-26.A composition comprising a population of mesenchymal stem cells (MSCs) differentiated from a population of expanded potential stem cells (EPSCs) according to the method of any one of claims 1 and 19-26.A composition comprising a population of mesenchymal stem cells (MSCs) differentiated from a population of expanded potential stem cells (EPSCs) , wherein the MSCs express one or more markers selected from the group consisting of CD73, CD90, CD105, CD44, and CD29.The composition of claim 28 or 29, wherein the population of MSCs:(a) has reduced expression or no expression of one or more markers selected from the group consisting of OCT4, SOX2, NANOG, GATA2, TFAP2A, TFAP2C, KRT7, TP63, ELF5, EPAS1, SP6, and ERVW-1;(b) expresses one or more genes selected from the group consisting of PVR, LINC02693, PID1, ULBP1, PDGFB, F3, INA, ULBP2, HSD11B1, HOXB2, HOXB4, KCNN2, XAF1, TRPM2, MAGEA3, NKX2.5, and TYRP1 at levels at least about 2-fold increased compared to a population of MSCs derived from induced pluripotent stem cells (iPSCs) ; and / or(c) expresses one or more genes selected from the group consisting of LDOC1, TFAP2A, CPE, CLEC11A, SFRP2, BGN, CXCL12, HEPH, DLX1, BST1, CALHM2, PRRX1, NYNRIN, TMT1A, TMEM119, CD24, NLGN1, EBF2, EPB41L3, FES, and NFIB at levels at least about 2-fold decreased compared to a population of MSCs derived from induced pluripotent stem cells (iPSCs) ;(d) is capable of differentiating into one or more of adipocytes, osteoblasts, and / or chondrocytes;(e) is capable of promoting angiogenesis; and / or(f) is capable of recruiting one or more of macrophages, endothelial cells, and / or pericytes.The composition of claim 30, wherein:(a) the population of MSCs is capable of recruiting macrophages, and wherein the macrophages are M2 macrophages;(b) the population of MSCs is capable of recruiting endothelial cells, and wherein the endothelial cells are CD31+ endothelial cells; and / or(c) the population of MSCs is capable of recruiting pericytes, and wherein the pericytes are PDGFRbeta+NG2+ pericytes.A pharmaceutical composition comprising the composition of any one of claims 27-31, and optionally a pharmaceutical carrier.A method of treating a disease in an individual in need thereof, comprising administering a therapeutically effective amount of the composition of any one of claims 27-31 or the pharmaceutical composition of claim 32 to the individual.The method of claim 33, further comprising selecting the individual for treatment based on level of mesenchymal stem cells (MSCs) or pericytes.The method of claim 33 or 34, wherein the disease is selected from the group consisting of ischemia, a bone disorder or injury, a chondrocyte disorder or injury, a musculoskeletal disease, a neurodegenerative disease, an inflammatory disorder, an autoimmune disorder, kidney disease or injury, liver disease or injury, lung disease or injury, brain disease or injury, cardiac disease or injury, joint disease or injury, acute injury of a tissue, a vascular disease or disorder, and an infection.The method of any one of claims 33-35, wherein the disease is selected from the group consisting of ischemia, ischemic stroke (IS) , microvascular ischemic disease (MVID) , perivascular kidney disease (PVKD) , chronic kidney disease (CKD) , peritubular capillary rarefaction (PTC) , small vessel disease (SVD) , peripheral artery disease (PAD) , hepatic ischemia (HI) , ischemic cholangiopathy (IC) , vascular dementia (VD) , Alzheimer’s disease (AD) , traumatic brain injury (TBI) , amyotrophic lateral sclerosis (ALS) , multiple sclerosis (MS) diabetes, diabetic retinopathy (DR) , diabetic nephropathy (DN) , glaucoma, Parkinson’s disease (PD) , sepsis, cardiovascular disease (CVD) , myocardial infarction (MI) , acute lung injury (ALI) , pulmonary arterial hypertension (PAH) , SARS-CoV-2 infection, ischemic bone necrosis, osteoporosis, osteopenia, osteoarthritis, juvenile idiopathic arthritis, gout, joint injury, synovial osteochondromatosis (SOC) , cartilage ischemia, epiphyseal avascular necrosis, and hyaline cartilage degeneration.The method of any one of claims 33-36, wherein the disease is ischemia or perivascular kidney disease.The method of claim 37, wherein the composition or pharmaceutical composition is administered to the individual at least twice, and wherein each administration is separated by at least about one week.The method of any one of claims 33-38, wherein the composition or pharmaceutical composition is administered locally or systemically.

Images