Systems and methods of treating a spent culture medium for culturing cells

Abstract

A system of treating a spent culture medium for culturing cells, comprising: a first bioreactor, configured for culturing cells with a culture medium, such that a spent culture medium is produced; and a second bioreactor, comprising one or more waste-consuming or waste-adsorbing materials, wherein the first bioreactor is directly or indirectly in fluid communication with or integral with the second bioreactor, such that the spent culture medium from the first bioreactor is in contact with and treated by the one or more waste-consuming or waste-adsorbing materials, and wherein the one or more waste-consuming or waste-adsorbing materials are selected from a group consisting of plant, fungus, bacterium, yeast, and rock, and combination thereof. This would avoid or reduce the need to replace waste-accumulated medium with fresh medium (not containing any waste), reducing costs and leading to less resources being wasted.

Description

SYSTEMS AND METHODS OF TREATING A SPENT CULTURE MEDIUM FOR CULTURING CELLSBACKGROUND OF THE INVENTION

[0001] In many cell-culture processes, including both bacterial and animal / mammalian cells (such as cultivated-meat) , waste accumulation in culture medium is a challenging issue that negatively influences many cellular activities, such as decreased cell viabilities and doubling times.

[0002] Accordingly, there is an urgent need for new and alternative waste treatments for spent culture medium in cell-culture processes. In some embodiments, provided methods and systems minimize wastage and lower the costs.SUMMARY OF THE INVENTION

[0003] In some instances, provided is systems and methods for co-culturing

[0004] bacterial / mammalian / animal cells (where the cells can secrete both beneficial compounds and harmful waste products in the culture medium) with waste-consuming or waste-adsorbing plants / fungi / bacteria / yeast / rocks. Both the animal / mammalian / bacterial cells and the waste-consuming or waste-adsorbing plants / fungi / bacteria / yeast / rocks can consume products that are harmful to the other group, while retaining or secreting compounds that are beneficial to the other group as well. For example, duckweed can consume the ammonia and CO2 (which improve duckweed growth) secreted by muscle stem cells, while retaining (in the medium) the beneficial compounds such as growth factors secreted by the muscle stem cells. Duckweed can also produce O2, which is beneficial for the cells such as muscle stem cells. This would avoid or reduce the need to replace waste-accumulated medium with fresh medium (not containing any waste) , reducing costs and leading to less resources being wasted.

[0005] In some instances, the waste can include (but are not limited to) lactic acid, ammonia, carbon dioxide, urea, and / or uric acid.

[0006] In some instances, the rocks, plants, waste-consuming bacteria, waste-consuming yeast, or fungi can be used separately. In some instances, they can be used together.

[0007] The plants can include both aquatic and terrestrial plants. Methods of growing or culturing plants can include using whole plants, plant tissues, individual plant cells, plant organs, plant embryos, plant protoplasts, plant germs (e.g. seeds) , and / or other plant-derived materials. The growth or culture of plants can use a solid, liquid (e.g. suspension) , gaseous, and / or semi-solid systems with controlled and / or natural conditions.

[0008] Some examples of aquatic plants that can be used (but not limited to) are duckweed and seaweed. Some examples of terrestrial plants can be used (but not limited to) are Brassica oleracea.

[0009] The fungi that consume animal / mammalian / bacterial wastes while retaining or secreting beneficial compounds can include (but are not limited to) Asperigillus (which can remove ammonia) , and yeasts. The fungi growth or cultures can use whole fungi, fragmented mycelium, spores, protoplasts, tissue samples, biofilms, and other methods of fungal propagation or isolation.

[0010] The bacteria that consume animal / mammalian / bacterial wastes while retaining or secreting beneficial compounds can include (but are not limited to) nitrifying bacteria and propionibacterium species which produce propionic acid, acetic acid, carbon dioxide, from sugars and lactic acid.

[0011] In some embodiments, rocks are absorbent materials that can adsorb cellular wastes, such as zeolites absorbing ammonia, can be utilized. In some instances, ammonia or other wastes can be harvested from the rocks (such as zeolites) , such as through thermal desorption.

[0012] The cells (animal or mammalian or bacterial) and waste-consuming / waste-adsorbing plants / fungi / bacteria / yeast / rocks can be incorporated in various ways. A container (which can be in the form of a bioreactor) with animal / mammalian / bacterial cells can be connected to another container with waste-consuming / waste-adsorbing plants / fungi / bacteria / yeast / rocks. In this system, both containers will contain culture medium, and a circular perfusion can be established where the medium from the animal / mammalian / bacterial cells can be flowed into (e.g. via a tube) the waste-consuming / waste-adsorbing plants / fungi / bacteria / yeast / rocks container, and vice versa (e.g. via another tube) (refer to Fig 5) . In some embodiments, provided system may also contain or operatively connect with other parts such as impellers, air filters, sensors, etc, and combination thereof.

[0013] Rather than connecting the animal / mammalian / bacterial cell container and the waste-consuming / waste-adsorbing plants / fungi / bacteria / yeast / rocks containers together, the two containers can be separated and the medium can be transferred from one container to the other one or multiple times, periodically or continuously (refer to Fig 6)

[0014] In some embodiments, both the animal / mammalian / bacterial cells and waste-consuming / waste-adsorbing plants / fungi / bacteria / yeast / rocks can be cultured in the same container (refer to Fig 7) .

[0015] In some instances, the nutrients can be supplemented intermittently or continuously to the culture medium as there may be consumption of nutrients by either the

[0016] animal / mammalian / bacterial cells or waste-consuming / waste-adsorbing plants / fungi / bacteria / yeast / rocks. For example, both muscle stem cells and duckweeds may consume glucose.

[0017] In some embodiments, during bacterial or animal or mammalian (such as, but not limited to, cultivated-meat) cell-culture processes, waste is often produced in these processes. These wastes include (but are not limited to) ammonia, lactic acid, and carbon dioxide, and often have a negative impact on cell health. To solve this issue, we propose a bacterial / animal / mammalian cell-culture system which incorporates materials such as naturally occurring materials that can remove the waste being produced via absorption, adsorption, and / or consumption. These naturally occurring could include plants (both aquatic and terrestrial) , rocks, fungi (both terrestrial and aquatic) , and microorganisms such as nitrifying bacteria. The plants and fungi may consume and utilize the ammonia from the culture media, which can help with their own growth. The rocks can adsorb ammonium ions from the culture media, which can then be subsequently be harvested for other purposes.

[0018] In some embodiments, provided is a method of bacteria / animal / mammalian cell-culture media treatment via the exposure to plants / fungi / bacteria / yeast / rocks.

[0019] In some embodiments, one or more of the plants / fungi / bacteria / yeast / rocks used for the purposes of treating cell-culture media is naturally occurring.

[0020] In some embodiments, one or more of the plants / fungi / bacteria / yeast / rocks used for the purposes of treating cell-culture media are used together instead of separately.

[0021] In some embodiments, one or more of the plants / fungi / bacteria / yeast / rocks used for the purposes of treating cell-culture media are used separately.

[0022] In some embodiments, the plant is used in whole, or in part.

[0023] In some embodiments, the plant is aquatic and are duckweeds, seaweed, and / or lotus.

[0024] In some embodiments, the plant is a terrestrial plant and are lettuce and / or aloe vera.

[0025] In some embodiments, the fungus is used whole, or in part.

[0026] In some embodiments, the animal or mammalian cells are cells relevant to Cultivated-Meat applications

[0027] In some embodiments, the animal or mammalian cells are derived from fibroblasts, vascular cells, pericytes, endothelial cells, myoblast cells, satellite cells, skeletal muscle cells, muscle cells, smooth muscle cells, fat cells, adipose-derived stem cells, induced pluripotent stem cells (iPSCs) , skin cells, tendon, liver, brain, bone, heart, kidney, stem cells, and combination thereof.

[0028] In some embodiments, the animal or mammalian cells are cells that can differentiate into or derived from fibroblasts, vascular cells, pericytes, endothelial cells, myoblast cells, satellite cells, skeletal muscle cells, muscle cells, smooth muscle cells, fat cells, adipose-derived stem cells, induced pluripotent stem cells (iPSCs) , skin cells, tendon, liver, brain, bone, heart, kidney, stem cells, and combination thereof.

[0029] In some embodiments, provided methods and systems improve bacterial / animal / mammalian cell growth / health. In some embodiments, provided methods and systems does not involve genetic engineering which would lead to consumer acceptance issues and longer / stricter regulatory requirements / timeframes. In some embodiments, provided methods and systems are easy to operate and environmentally friendly.

[0030] ILLUSTRATION OF THE DRAWINGS

[0031] Fig 1. Color change of media upon treatment with duckweed. Tube 1: 4 pieces of Wolfia globosa (W. globosa) . Tube 2: 8 pieces of W. globosa. Tube 3: Salvinia cucullata (S. cucullata) . Tube 4: No duckweed treatments.

[0032] Fig 2. MTT results (490nm–630nm) . Fresh DF12 / F (10%) refers to the positive control of fresh proliferation medium, non-treated spent media refers to spent media that were not treated with duckweeds, 4 duckweeds, and 8 duckweeds refer to duckweeds of the W. globosa species, and different duckweeds refer to the duckweed of the S. cucullata species.

[0033] Fig 3. MTT results (490nm–630nm) . Fresh DF12 / F (10%) refers to the positive control of fresh proliferation medium, non-treated spent media refers to spent media that were not treated with duckweeds, 4, 8, and 16 duckweeds refer to duckweeds of the W. globosa species.

[0034] Fig 4. MTT results (490nm–630nm) . Fresh DF12 / F (10%) refers to the positive control of fresh proliferation medium, non-treated spent media refers to spent media that were not treated with duckweeds, 4, 8, and 16 duckweeds refer to duckweeds of the W. globosa species.

[0035] Fig 5. Animal / mammalian / bacterial cells and plant / fungi / waste-consuming bacteria / waste-consuming yeast / waste-adsorbing rocks are in separate containers or bioreactors, but connected (e.g. via tubes) for circular perfusion of culture media) (i.e., in direct fluid communication between two containers or bioreactors) .

[0036] Fig 6. Animal / mammalian / bacterial cells are kept in a separate container or bioreactor from plants / fungi / waste-consuming bacteria / waste-consuming yeast / waste-adsorbing rocks, but culture medium are routinely transferred between the two containers or bioreactors) (i.e., in indirect fluid communication between two containers or bioreactors) .

[0037] Fig 7. Animal / mammalian / bacterial cells and plants / fungi / waste-consuming bacteria / waste-consuming yeast / waste-adsorbing rocks are kept in the same container or bioreactor (i.e., two containers or bioreactors are integral as one) .

[0038] SPECIFIC IMPLEMENTATION METHOD

[0039] EXAMPLE 1

[0040] Materials

[0041] - Wolffia globosa (purchased from greenflow. hk)

[0042] - Salvinia cucullata (purchased from greenflow. hk)

[0043] - T75 flask (Labselect, 13212a)

[0044] - DMEM: F12 (Biosharp, BL305A)

[0045] - Gelatin (Sigma, G1890)

[0046] - Porcine immortalized muscle satellite cells (Cellverse, iCell-0017a, icellbioscience. com)

[0047] - Fetal Bovine Serum (Biochannel, BC-SE-FBS07-100mL)

[0048] - 0.25%Trypsin / EDTA (Biosharp, BL512B)

[0049] - DPBS (Biosharp, BL310A)

[0050] - Trypan Blue (Invitrogen, T10282)

[0051] - Automatic cell counter (Thermofisher, Countess II FL)

[0052] - Primocin (Invivogen, ant-pm-05)

[0053] Method:

[0054] Day 0:

[0055] 1. Duckweed maintenance

[0056] a. Place the duckweed in a container with tap water, and expose it to sunlight

[0057] Day 1:

[0058] 2. Upon purchasing satellite cells, the cells from a vial were thawed at 37℃ within 2mins and recovered with proliferation media (DMEM: F12 supplemented with 10%(v / v) Fetal Bovine Serum (FBS) +100ug / mL primocin) .

[0059] 3. Cells were centrifuged at 0.2 rcf for 5mins and the supernatant was discarded and then resuspended with 1mL proliferation media.

[0060] 4. These were transferred into a 0.1%gelatin-coated T75 flask with 8-10mL of proliferation media.

[0061] 5. Cells are incubated at 37℃, 5%CO2 (all further instances of37℃ incubation would also include 5%CO2) .

[0062] 6. Cells were routinely passaged upon 70-80%confluency.

[0063] a. During the passage, proliferation media is removed from the T75 flask and washed twice with DPBS

[0064] b. 4mL of0.25%Trypsin / EDTA is then added, and incubated at 37℃ for 5min. Occasional tapping at the sides and bottom of the flask was introduced.

[0065] c. After cells have detached from the surface of the T75 flask, 4mL of TNS solution is introduced and mixed evenly.

[0066] d. The mixture is transferred to a 15mL centrifuge tube, and subjected to centrifugation at 200g for 5min.

[0067] e. The supernatant is discarded, and the pellet is resuspended in proliferation media for subsequent cultures in a 0.1%gelatin-coated T75 flask, or cryopreservation medium (10% (v / v) DMSO+90% (v / v) DMEM: F12) for storage in liquid nitrogen.

[0068] f. Cells in T75 flasks are incubated at 37℃, 5%CO2.

[0069] g. The above steps are repeated as necessary.

[0070] 7. Prepare spent media (refers to media that has been left in cell cultures for a period of time)

[0071] a. Spent media is collected from a T75 flask (24-72h after being inoculated)

[0072] 8. 2 mL of spent media are equally aliquoted into four 50mL tubes with vented caps (e.g. with 0.45um filters) , with of spent media per tube.

[0073] 9. Weigh 75 pieces of duckweeds in wet to determine the average weight per piece (was determined to be 0.00383g / piece) . Various duckweed types and amounts are added into each tube and left at room temperature (next to a window for sunlight) :

[0074] i. Tube 1-4 pieces (0.00383g / piece*4 pieces=0.0153g) of duckweed (Wolfia globosa) . For clarity’s sake, each piece generally has a stem, and multiple (e.g., 1, 2 or 3) leaves.

[0075] 1. Approximately 0.5mL / duckweed, 130.7mL / g of duckweed, or 0.00765g / mL (Wolfia globosa)

[0076] ii. Tube 2-8 pieces (0.0038g / piece*8 pieces=0.0306g) of duckweed (W. globosa)

[0077] 1. Approximately 0.25mL / duckweed, 65.4mL / g, or 0.0153g / mL (Wolfia globosa)

[0078] iii. Tube 3-1 piece of duckweed (Salvinia cucullata)

[0079] iv. Tube 4-No duckweeds added

[0080] 10. Cells were detached from the T75 flask, following steps 4a-d, with an added step of cell counting between steps 4c and 4d. The cell counting step is as follows (For this experiment, cells that have gone through 9 passages were used) :

[0081] a. 20uL of cell suspension was mixed with 20uL of trypan blue solution

[0082] b. 15uL of the mixture is then added to each side of a hemocytometer

[0083] c. Cells are counted under an automatic cell counter

[0084] 11. After centrifugation, the supernatant is removed and the cell pellet is resuspended in DMEM: F12+100ug / mL primocin up to a cell density of5e4cells / mL

[0085] 12. 100uL of cell suspension is seeded into 15 wells of a 96-well plate, following the following arrangement:

[0086] Day 2:

[0087] 13. 17h after step 7, filter the media from the tubes of step 7 with 0.45um filters

[0088] 14. Aspirate and remove the media from the wells of step 10, and replace it with media from the tubes of step 7 that were filtered in step 11 according to the following arrangement (8uL of a 5mg / mL primocin solution was also added to each well) :

[0089] 15. Incubate for 48h at 37℃, 5%CO2.

[0090] Day 4:

[0091] 16. Assess via MTT:

[0092] a. Prepare an MTT-medium mixture by adding 1mL of MTT to 10mL of DMEM: F12

[0093] b. Add 110ul of MTT-medium mixture to each well

[0094] c. Incubate at 37℃ for 4 hours

[0095] d. Remove the supernatant and add 100μL of DMSO to each well

[0096] e. Incubate at 37℃ for 10 minutes, then read the absorbance (with orbital shaking for 20 seconds) at 490 nm, 540 nm, 570 nm, and 630 nm)

[0097] Results

[0098] Weighed 75 pieces of duckweeds (W. globose) (each has about 2 leaves) , and it weighed approximately 0.287g. Therefore, the average weight of duckweed is around 3.83mg per piece (each has about 2 leaves) .

[0099] Prior to filtering the duckweed-treated media, the physical appearance of the media was observed (Fig. 1) . Without any duckweed treatment, the media was orange in color. Upon treatment with duckweeds, the media turned purplish-pink. The W. globosa groups had a less transparent appearance compared to the S. cucullata group. A potential reason for this may be due to the S. cucullata being much larger in size and weight, consuming much more of the nutrients in the medium.

[0100] The MTT readings are shown in Fig 2. The highest group was the positive control with proliferation media (denoted as “Fresh DF12 / F (10%) ” ) , followed by the 8 W. globosa group (denoted as “8 duckweeds” ) , non-treated group, 4 duckweed group (denoted as “4 duckweeds” ) , and the S. cucullata group (denoted as “different duckweeds” ) . This showed that some duckweed is beneficial for promoting cell growth, but too much may diminish the amount of nutrients in the medium and lead to lower cell growth.

[0101] This experiment demonstrates that the amount of duckweed does have an influence on medium composition due to media color changes and corresponding changes in cell growths. The type of duckweed may also affect waste removal and cell growth, however, due to the large size of the S. cucullata, the reduced cell growth effect might likely be due to nutrient depletion (due to overconsumption from the large S. cucullata) and / or larger plant toxin secretion (compared to the W. globosa group with much less weight) , rather than due to the type of duckweed.

[0102] Note: Freshly bought duckweeds from the store were used, which were previously left in fish-containing aquariums to grow (the fishes secrete waste too, which provides a source of ammonia / nitrogen) .

[0103] EXAMPLE 2

[0104] Materials

[0105] - Wolffia globosa (purchased from greenflow. hk)

[0106] - T75 flask (Labselect, 13212a)

[0107] - DMEM: F12 (Biosharp, BL305A)

[0108] - Gelatin (Sigma, G1890)

[0109] - Porcine immortalized muscle satellite cells (Cellverse, iCell-0017a, icellbioscience. com)

[0110] - Fetal Bovine Serum (Biochannel, BC-SE-FBS07-100mL)

[0111] - 0.25%Trypsin / EDTA (Biosharp, BL512B)

[0112] - DPBS (Biosharp, BL310A)

[0113] - Trypan Blue (Invitrogen, T10282)

[0114] - Automatic cell counter (Thermofisher, Countess II FL)

[0115] - Primocin (Invivogen, ant-pm-05)

[0116] Method:

[0117] Day 0:

[0118] 1. Duckweed maintenance

[0119] f. Place the duckweed in a container with tap water, and expose it to sunlight

[0120] Day 1:

[0121] 2. Upon purchasing satellite cells, the cells from a vial were thawed at 37℃ within 2mins and recovered with proliferation media (DMEM: F12 supplemented with 10%(v / v) Fetal Bovine Serum (FBS) +100ug / mL primocin) .

[0122] 3. Cells were centrifuged at 0.2 rcf for 5mins and the supernatant was discarded and then resuspended with 1mL proliferation media.

[0123] 4. Cells are incubated at 37℃, 5%CO2.

[0124] 5. Cells were routinely passaged upon 70-80%confluency.

[0125] a. During the passage, proliferation media is removed from the T75 flask and washed twice with DPBS

[0126] b. 4mL of 0.25%Trypsin / EDTA is then added, and incubated at 37℃ for 5min. Occasional tapping at the sides and bottom of the flask was introduced.

[0127] c. After cells have detached from the surface of the T75 flask, 4mL of TNS solution is introduced and mixed evenly.

[0128] d. The mixture is transferred to a 15mL centrifuge tube, and subjected to centrifugation at 200g for 5min.

[0129] e. The supernatant is discarded, and the pellet is resuspended in proliferation media for subsequent cultures in a 0.1%gelatin-coated T75 flask, or cryopreservation medium (10% (v / v) DMSO+90% (v / v) DMEM: F12) for storage in liquid nitrogen.

[0130] f. Cells in T75 flasks are incubated at 37℃, 5%CO2.

[0131] g. The above steps are repeated as necessary.

[0132] 6. Prepare spent media (refers to media that has been left in or exposed to cell cultures for a certain period of time)

[0133] b. Spent media is collected from a T75 flask (24-72h after being inoculated)

[0134] 7. 2 ml of spent media are equally aliquoted into four wells of a 12-well plate

[0135] 8. Various duckweed types and amounts are added into each tube and left at room temperature (next to a window for sunlight) :

[0136] i. Well 1-4 pieces (0.00383g / piece*4 pieces=0.0153g) of duckweed (W. globosa)

[0137] 1. Approximately 0.5mL / duckweed, 130.7mL / g, or 0.00765g / mL (W. globosa)

[0138] ii. Tube 2-8 pieces (0.00383g / piece*8 pieces=0.0306g) of duckweed (W. globosa)

[0139] 1. Approximately 0.25mL / duckweed, 65.4mL / g, or 0.0153g / mL (W. globosa)

[0140] iii. Tube 3-16 pieces (0.00383g / piece*16 pieces=0.0613g) of duckweed (W. globosa)

[0141] 1. Approximately 0.125mL / duckweed, 32.6mL / g, or 0.0307g / mL (W. globosa)

[0142] iv. Tube 4-No duckweeds added

[0143] 9. Cells were detached from the T75 flask, following steps 4a-d, with an added step of cell counting between steps 4c and 4d. The cell counting steps are as follows (For this experiment, cells that have gone through 11 passages were used) :

[0144] a. 20uL of cell suspension was mixed with 20uL of trypan blue solution

[0145] b. 15uL of the mixture is then added to each side of a hemocytometer

[0146] c. Cells are counted under an automatic cell counter

[0147] 10. After centrifugation, the supernatant is removed and the cell pellet is resuspended in DMEM: F12+100ug / mL primocin up to a cell density of5e4cells / mL

[0148] 11. 100uL of cell suspension is seeded into 15 wells of a 96-well plate, following the following arrangement:

[0149] Day 3:

[0150] 12. 41h after step 7, filter the media from the tubes of step 7 with 0.45um filters

[0151] 13. Aspirate and remove the media from the wells of step 10, and replace it with media from the wells of step 7 that were filtered in step 11 according to the following arrangement (8uL of a 5mg / mL primocin solution was also added to each well) :

[0152] 14. Incubate for 72h at 37℃, 5%CO2.

[0153] Day 6:

[0154] 15. Assess via MTT:

[0155] a. Prepare an MTT-medium mixture by adding 1mL of MTT to 10mL of DMEM: F12

[0156] b. Add 110ul of MTT-medium mixture to each well

[0157] c. Incubate at 37℃ for 4 hours

[0158] d. Remove the supernatant and add 100μL of DMSO to each well

[0159] e. Incubate at 37℃ for 10 minutes, then read the absorbance (with orbital shaking for 20 seconds) at 490 nm, 540 nm, 570 nm, and 630 nm)

[0160] Results

[0161] Compared to Example 1, this experiment only utilized the W. globosa species (since the size is not overly large for the cell amount that is being used) , the duckweed treatment time is extended to 48h, and the exposure of cells to the duckweed treated medium is prolonged to 72h.

[0162] As seen in the MTT results (Fig 3) , there is an overall downward trend starting from 4 duckweeds onwards. Unlike Example 1 where the best performing group is 8 W. globosa, 4 W. globosa was the best performer this time. This might be due to the prolonged treatment of the media to duckweeds, which may increase the accumulation of plant toxins secreted by duckweeds, and lead to overconsumption of nutrients from the duckweeds. The same duckweeds were used compared to Example 1, but Example 2 was performed 1-2 weeks after Example 1. Since the duckweed stocks were maintained in ammonia-free tap water (lacks nitrogen) , their growth and health may have been compromised as well. Some of the duckweed also turned white in color, which might be due to the sunlight exposure (might be able to recover if they have nitrogen, but since ammonia-free tap water is used, it might just be sun bleached without any chance of recovery) . A potential theory is that the health of the duckweed may affect the secretion of plant toxins as well, which subsequently reduces the health of the cells. Regardless, 4 duckweeds still showed a greater influence on cell proliferation compared to the non-treated (with duckweed) spent media.

[0163] It may be worthwhile to repeat this experiment with healthier duckweeds (maintained in nitrogen-containing water) , replenish some of the consumed nutrients in the duckweed-treated media, and further control the exposure times of the duckweed to the spent media and the cell culture times of the cells to the duckweed-treated media. The number of duckweeds can also be tuned, as the peak cell growth may be a duckweed amount that is between 0-8 duckweeds (peak cell growth that occurred here is 4 duckweeds, so the actual peak may be somewhere close to 4 duckweeds) .

[0164] EXAMPLE 3

[0165] Materials

[0166] The same materials were used as Example 2. The same duckweed-treated medium was used (steps 1-7 and 11) .

[0167] Methods

[0168] Day 1:

[0169] 1. Cells were detached from the T75 flask, following steps 4a-d of Example 2, with an added step of cell counting in between steps 4c and 4d. The cell counting steps are as follows (For this experiment, cells that have gone through 11 passages were used) :

[0170] a. 20uL of cell suspension was mixed with 20uL of trypan blue solution

[0171] b. 15uL of the mixture is then added to each side of a hemocytometer

[0172] c. Cells are counted under an automatic cell counter

[0173] 2. After centrifugation, the supernatant is removed and the cell pellet is resuspended in DMEM: F12+100ug / mL primocin up to a cell density of5e5cells / mL

[0174] 3. 10uL of cell suspension is seeded into 15 wells of a 96-well plate. Filtered duckweed-treated media from steps 7 and 11 of Example 2 were used, following the following arrangement:

[0175] 4. Approximately 18-24h after cells were seeded into the plates, MTT was performed according to the same procedure in Example 2 (step 14) .

[0176] Results

[0177] This experiment looks at cell adhesion rather than proliferation due to the duckweed-treated mediums. This is why the treated media was added immediately after cells were seeded to the wells.

[0178] Overall, the trend for MTT (Fig 4) looks similar to the trend of Experiment 2, where the best-performing duckweed group is 4 duckweeds, followed by a downward trend thereafter. The 16 duckweeds, non-treated medium, and fresh proliferation medium had similar levels of cell adhesion but were all lower in absorbance compared to the 4 duckweed and 8 duckweed groups.

[0179] These results demonstrated that duckweeds were able to increase the culture medium’s ability to improve cell adhesion. Similar to Example 2, the same factors will be further investigated.

Claims

1.A system of treating a spent culture medium for culturing cells, comprising:a first bioreactor, configured for culturing cells with a culture medium, such that a spent culture medium is produced; anda second bioreactor, comprising one or more waste-consuming or waste-adsorbing materials,wherein the first bioreactor is directly or indirectly in fluid communication with or integral with the second bioreactor, such that the spent culture medium from the first bioreactor is in contact with and treated by the one or more waste-consuming or waste-adsorbing materials, andwherein the one or more waste-consuming or waste-adsorbing materials are selected from a group consisting of plant, fungus, bacterium, yeast, and rock, and combination thereof.2.The system of claim 1, wherein the cells are animal cells or mammalian cells or bacterial cells, optionally wherein the animal or mammalian cells are derived from or differentiated into fibroblasts, vascular cells, pericytes, endothelial cells, myoblast cells, satellite cells, skeletal muscle cells, muscle cells, smooth muscle cells, fat cells, adipose-derived stem cells, induced pluripotent stem cells (iPSCs) , skin cells, tendon, liver, brain, bone, heart, kidney, stem cells, or combination thereof.3.The system of claim 1, wherein the plant is selected from the group consisting of duckweed, seaweed, lettuce, aloe vera, and combination thereof;wherein the fungus is selected from the group consisting of Asperigillus, and yeasts, and combination thereof;wherein the bacterium is selected from the group consisting of Propionibacterium, nitrifying bacteria, and combination thereof; andwherein the rock is zeolite.4.The system of any one of the preceding claims, whereinthe one or more waste-consuming or waste-adsorbing materials is aplant, wherein the plant is duckweed, wherein the duckweed is Wolffia Globosa;wherein the cells are satellite cells;wherein the culture medium comprises DMEM: F12 and optionally FBS;wherein the Wolffia Globosa is present at about 7.65-15.3 mg per mL of the spent culture medium; andwherein the spent culture medium is treated with the Wolffia Globosa for 24 hours.5.The system of any one of the preceding claims, whereinthe one or more waste-consuming or waste-adsorbing materials is aplant, wherein the plant is duckweed, wherein the duckweed is Wolffia Globosa;wherein the cells are satellite cells;wherein the culture medium comprises DMEM: F12 and optionally FBS;wherein the Wolffia Globosa is present at about 7.65-30.7 mg per mL of the spent culture medium; andwherein the spent culture medium is treated with the Wolffia Globosa for 48 hours.6.A method of treating spent culture medium, comprising the steps of:providing a system of any one of claim 1-5; andcontacting and treating spent culture medium from the first bioreactor with one or more waste-consuming or waste-adsorbing materials in the second bioreactor;wherein the one or more waste-consuming or waste-adsorbing materials are selected from a group consisting of plant, fungi, bacteria, yeast, and absorbent and combination thereof.7.The method of claim 6, wherein the spent culture medium is treated with the Wolffia Globosa for 24-48 hours, wherein the spent culture medium is incubated with the Wolffia Globosa at room temperature.

Images