Engineering of novel oxidative aminases and use thereof

Abstract

Provided are an engineered aldehyde dehydrogenase for the preparation of amide compounds and use thereof. The said engineered aldehyde dehydrogenase uses aldehydes and amines as substrates and can efficiently catalyze the formation of amide bonds. Provided is an oxidative aminase, developed through the engineering of aldehyde dehydrogenase, which exhibits high catalytic activity and broad substrate recognition. This provides a new approach to the synthesis of amide bonds in medicinal chemistry, being greener and more environmentally friendly compared to traditional chemical coupling reagents, and holds potential for industrial-scale production.

Description

ENGINEERING OF NOVEL OXIDATIVE AMINASES AND USE THEREOFTechnical Field

[0001] The present application belongs to the field of biocatalysis technology, specifically relating to an engineered oxidative aminase for the preparation of amide compounds and use thereof.Background Art

[0002] Amide bond formation is a cornerstone of medicinal chemistry due to the widespread presence of the amide group in pharmaceutical compounds, including notable drugs like Apixaban, Rivaroxaban, Enzalutamide, Olaparib, Vadadustat, Regorafenib, Camlipixant, and Lazabemide. Remarkably, 117 of the top 200 small-molecule drugs by retail sales in 2023 contain at least one amide bond. Consequently, amide coupling reactions are among the most frequently employed transformations in parallel library synthesis during early drug discovery.

[0003] Traditional chemical methods for amide bond formation typically require activating the carboxylic acid precursor with stoichiometric coupling reagents. However, these processes generate significant amounts of hazardous waste, making them less environmentally friendly.

[0004] In contrast, catalytic methods for amide synthesis are emerging as greener, more sustainable alternatives. Among these, oxidative amidation of aldehydes or alcohols via hemiaminal intermediates offers significant advantages in terms of step efficiency and atom economy. Despite their promise, the reliance on expensive or toxic transition metal catalysts, such as ruthenium or copper complexes, remains a significant limitation for broader synthetic applications.

[0005] Compared with chemical methodologies, biocatalytic strategies to amide synthesis are quite limited, mainly including nitrile hydration or ester aminolysis catalyzed by lipases or N-acyltransferases, and amidation of acids catalyzed by ligases alone or coupled with N-acyltransferases. Among these, the third approach has recently garnered increasing research interest due to the easier accessibility of carboxylic acids. However, similar with the chemical amide coupling reactions, these enzymatic amidation processes indispensably consume stoichiometric ATP as the coupling reagent and thus are also featured with low atom economy. Consequently, novel biocatalytic strategies with better atom economy such as the oxidative amidation strategy are highly attractive but remain largely unexplored.

[0006] Aldehyde dehydrogenase (ALDH) is a NAD (P) +-dependent superfamily of enzymes that oxidize structurally diverse aliphatic and aromatic aldehydes into acids. Mechanistically, the aldehyde dehydrogenase-catalyzed transformation involves a reaction cascade composing of hemi-thioacetal formation, NAD (P) +-dependent thioester formation and hydrolysis. Previously, we have found that replacement of water with amines in the final hydrolysis step can empower ALDH with the ability to produce amides from aldehydes without the involvement of carboxylic acids and stoichiometric coupling reagents (e.g., ATP) . By substituting three conserved residues, the ALDH has been successfully repurposed to the oxidative aminase (OxiAms) . As a further development, here we provided an application of engineering of our previous developed OxiAms and their applications in the syntheses of pharmaceuticals.Summary

[0007] The purpose of the present application is to provide the engineering of OxiAms and use thereof in synthesizing amide bonds. Firstly, the present application provides a mutant of p-hydroxybenzaldehyde dehydrogenase (PHBDD) from Pseudomonas putida. These modified OxiAms may include an amino acid sequence with one or more residue differences compared to the sequence of PHBDD-R166M-E259L (M1, SEQ ID No: 5) at the following residue positions: P156, L163, T234, L415. Additionally, on the basis of these differences, the sequence may also include one or more insertions or deletions of amino acid residues. More specifically, in some embodiments, these modified oxidative aminases comprise polypeptides with amino acid sequences corresponding to SEQ ID No: 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27 and 29.

[0008] Specifically, the present application provides an oxidative aminase engineered from aldehyde dehydrogenase p-hydroxybenzaldehyde dehydrogenase (PHBDD) , which catalyzes a reaction between aldehydes and amines to produce amides, wherein the oxidative aminase includes an amino acid sequence that has at least 90%sequence identity to the reference sequence SEQ ID No: 5, and differs from SEQ ID No: 5 by at least one amino acid residue at positions P156, L163, T234, L415. Preferably, the amino acid sequence is selected from the group consisting of the sequences as represented by SEQ ID No: 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29.

[0009] The present application provides a class of PHBDD homologous proteins and their mutants. Specifically, the present application provides an oxidative aminase engineered from homologous proteins of aldehyde dehydrogenase p-hydroxybenzaldehyde dehydrogenase (PHBDD) , where the homologous proteins include an amino acid sequence having at least 50%sequence identity to the reference sequence SEQ ID No: 1 of the aldehyde dehydrogenase PHBDD, and at least one amino acid residue difference at positions L163, R166, T234, or E259, corresponding to those in SEQ ID No: 1 in terms of three-dimensional structure. Preferably, the amino acid sequence is selected from the group consisting of the sequences as represented by SEQ ID No: 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147 and 149.

[0010] The identity between two amino acid sequences or two nucleotide sequences can be determined using commonly used algorithms in the field, such as NCBI Blastp and Blastn software calculated with default parameters, or by using the Clustal W algorithm (Nucleic Acid Research, 22: 4673-4680, 1994) .

[0011] Preferably, the reaction is carried out at an aldehyde substrate concentration of 1 to 50 mM, an amine substrate concentration of 1 mM to 2.0 M, an NADP+ concentration of 2 to 100 mM, a pH of 9.0 to 11.0, and a temperature of 20℃ to 40℃ for 2 to 16 hours.

[0012] Furthermore, the application provides a polynucleotide, wherein the polynucleotide encodes the oxidative aminase mentioned above. In some embodiments, the polynucleotide may be part of an expression vector containing one or more control sequences for expressing a polypeptide of the oxidative aminases. In certain embodiments, the polynucleotide may include a sequence corresponding to the polynucleotide sequences as represented by SEQ ID No: 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148 and 150.

[0013] As known to a person skilled in the art, due to the degeneracy of nucleotide codons, polynucleotide sequences encoding the amino acid sequences of SEQ ID No: 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147 and 149 are not limited to SEQ ID No: 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148 and 150. The polynucleotide sequence of the oxidative aminases gene in the present application can also be any other polynucleotide sequence encoding the amino acid sequences as represented by SEQ ID No: 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147 and 149.

[0014] The application provides an expression vector comprising the polynucleotide mentioned above.

[0015] Preferably, the expression vector includes a plasmid, cosmid, bacteriophage, or viral vector.

[0016] The application provides a host cell comprising the expression vector mentioned above. Preferably, the host cell is Escherichia coli (E. coli) .

[0017] The application provides a method for preparing the oxidative aminase mentioned above, comprising the steps of culturing the host cell to obtain culture, and obtaining the oxidative aminase from the culture.

[0018] The application provides an oxidative aminase catalyst, wherein the catalyst is obtained from a host cell or culture containing the oxidative aminase, or a product processed from the oxidative aminase. Preferably, the product is an isolated product obtained by separating or purifying the oxidative aminase from an extract obtained from transformed cells.

[0019] The application provides a method for preparing a compound of structural formula (1) , the method comprises contacting an aldehyde substrate of structural formula (2) and an amine substrate of structural formula (3) with the oxidative aminase catalyst.

[0020] R1 is an optionally substituted aryl (alkenyl) or heteroaryl (alkenyl) group;

[0021] R2 is an optionally hydrogen, or alkynyl, or alkenyl, or alkyl optionally including one or more heteroatoms which are O, S or N, and optionally substituted by one or more of halo, OR, SR, NR2, RCO, COOR, CONR2, OOCR, wherein R is H or alkyl, or by CN or C=O, or by an aliphatic or aromatic membered ring optionally containing heteroatoms;

[0022] R3 is an optionally hydrogen, or alkynyl, or alkenyl, or alkyl optionally including one or more heteroatoms, S or N, and optionally substituted by one or more of halo, OR, SR, NR2, RCO, COOR, CONR2, OOCR, wherein R is H or alkyl, or by CN or C=O, or by an aliphatic or aromatic membered ring optionally containing heteroatoms.

[0023] Preferably, the heteroatom is O.

[0024] Preferably, the compound of structural formula (1) is:

[0025] Preferably, the aldehyde substrate of structural formula (2) is:

[0026] Preferably, the amine substrate of structural formula (3) is

[0027] Preferably, the compound of structural formula (1) is:

[0028] Preferably, the amine substrate of structural formula (3) is:

[0029] Preferably, the aldehyde substrate of structural formula (2) is

[0030] Preferably, the method comprises a de novo route for the enzymatic catalytic synthesis of the oral chronic kidney disease anemia drug vadadustat (brand name: Vafseo) .

[0031] Preferably, the method comprises a de novo route for the enzymatic catalytic synthesis of the Nav1.7 / 1.8 blocker ABBV-318.

[0032] The application provides primers for amplifying the aforementioned DNA fragments, with the primers shown as SEQ ID No. 151-206.

[0033] Secondly, the present application also provides a bio-material containing a gene encoding the claimed oxidative aminases, and the bio-material is an expression kit, a plasmid, a vector, a microorganism, an insect cell, an animal cell or a plant cell.

[0034] Preferably, when using microorganisms as hosts, any commercially available plasmid can be used as a vector, as long as it can be stably maintained within the bacterial cells. When Escherichia coli is used as the host, it is preferable to use the pET28a or pQlinkHx plasmids.

[0035] During the specific implementation process, the obtained gene (DNA fragment) can be linked downstream of a specific promoter sequence to induce expression of the target protein in E. coli. For example, pET28a has an inducible T7 promoter, and by adding isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) to the culture medium during mid-cultivation, E. coli can be induced to express PHBDD protein or its mutants. The cultivation of transformants is carried out using conventional methods. For example, when using bacteria such as Bacillus or E coli, the culture medium can be broth, LB medium (1%tryptone, 0.5%yeast extract, 0.5%sodium chloride) , or 2×YT medium (1.6%tryptone, 0.8%yeast extract, 0.5%sodium chloride) . After inoculating the strain into the medium, it can be cultured at 37℃ with stirring for 4-8 hours, as needed. Subsequently, 0.1-1 mM IPTG is added, and the culture is continued with stirring at 18℃ or 37℃ for 12-20 hours, as needed. The resulting culture is then centrifuged, and the microbial cells are collected.

[0036] Further, the microbial cells can be disrupted using known methods such as mechanical disruption (using a rotary stirrer, French press, homogenizer, mortar, etc. ) , freeze-thaw, autolysis, drying (freeze-drying, air-drying, etc. ) , enzymatic treatment (using lysozyme, etc. ) , ultrasonic treatment, or chemical treatment (acid or alkaline treatment, etc. ) . The resulting cell debris, denatured cell wall or cell membrane, or other processed cell materials can be used as a crude enzyme solution for the synthesis of amide compounds.

[0037] Additionally, depending on the situation, the active component with amide-forming activity can be purified from the cell material using conventional enzyme purification methods (salting out, isoelectric precipitation, organic solvent precipitation, dialysis, various chromatography methods, etc. ) to prepare partially purified or purified enzymes for use. The enzyme added to the reaction system, as long as it has the required activity, can be in any form, including microbial cells (including transformants) , cell preparations, or enzymes derived from these preparations. Preferably, for preparative-scale synthesis, the wet cells containing the enzyme, obtained by centrifugation, are used directly.

[0038] Thirdly, the present application provides the application of any of the aforementioned mutants, nucleic acids, or biological materials in the synthesis of amide compounds using aryl (alkenyl) or heteroaryl (alkenyl) aldehydes and aliphatic amines as substrates. For preparative-scale synthesis of amide compounds, the preferred initial concentration of the aldehyde is 5-50 mM, more preferably 20-50 mM. The preferred initial equivalent of NADP sodium salt is 1-2 equivalents, more preferably 1.5 equivalents. The preferred initial equivalent of amine is 2-100 equivalents, more preferably 2, 5, 10, 15, 20, or 40 equivalents. The preferred amounts of wet cells used is 0.5-2 g, more preferably 1, 1.5, or 2 g. The preferred reaction conditions are a pH of 7-11, more preferably 10-11. The preferred cosolvents are methanol and dimethyl sulfoxide, with methanol being more preferred. The preferred temperature is 35℃-40℃, more preferably 37℃. The reaction is preferably carried out in a shaker for 0.5-16 hours. The enzymes used are preferably PHBDD-ML-T234G (SEQ ID No: 9) , PHBDD-ML-L163G (SEQ ID No: 7) , PHBDD-ML-L163G-T234G (SEQ ID No: 15) , PHBDD-ML-P156G-T234G (SEQ ID No: 19) with PHBDD-ML-T234G (SEQ ID No: 9) being most preferred.

[0039] The specific implementation steps are as follows: Suspend wet E. coli overexpressing PHBDD-ML-T234G (SEQ ID No: 9) (1.0 g) in CAPS buffer (5.0 mL, 0.2 M, pH 11) . Sequentially add NADP sodium salt (115 mg, 0.15 mmol, 1.5 eq. ) , amine (2, 5, 10, 15, 20, 40 eq.) , and 0.10 mmol aldehyde (1.0 eq., dissolved in 0.5 mL methanol) to the suspension. After incubating the reaction mixture at 37℃ and 220 rpm for 4 hours, add saturated NaCl (aq) (5 mL) and ethyl acetate (20 mL) , and shake thoroughly to lyse the cells. Then, centrifuge the mixture at 3,000 × g for 15 minutes, and extract the aqueous layer with ethyl acetate (2 × 20 mL) . Combine the organic layers, wash with saturated NaCl (10 mL) , dry over anhydrous Na2SO4, and concentrate under reduced pressure to obtain the crude product. The crude product is further purified by column chromatography using a petroleum ether / ethyl acetate system to obtain the desired amide product.

[0040] The application provides a new chemo-enzymatic route to prepare Vadadustat. Vadadustat, a drug molecule for treating renal anemia, was reported to be synthesized in five steps starting from trisubstituted pyridine with an overall yield of 49%. The key amide bond in this molecule is synthesized from carboxylic acid and glycine methyl ester under the action of the coupling agent CDI. In our de novo designed chemo-enzymatic route, the key intermediate was synthesized from the disubstituted pyridine via a Suzuki coupling reaction followed by a formylation reaction, and then transformed into amide in glycine buffer using the PHBDD-ML-T234G variant as the catalyst. The crude amide product can be directly used in the next step without purification, enabling the four-step synthesis of Vadadustat with an overall yield of 59%. Compared to the reported route, the new route only needs three isolation steps and avoids the regioselectivity issue in the original Suzuki coupling reaction and the use of stoichiometric coupling agents, thus providing a more efficient and economical way to manufacture Vadadustat.

[0041] The application provides a new chemo-enzymatic route to prepare ABBV-318. For the Nav1.7 / 1.8 channel inhibitor ABBV-318, the reported synthesis route starts from hydroxyquinoline and proceeds through five steps. With the new biocatalyst in hand, a new chemo-enzymatic route starting from methylquinoline was successfully developed to synthesize ABBV-318 within three steps. This route also replaces the usage of stoichiometric condensing agent HATU with the key oxidative amidation, and avoids the usage of highly corrosive or heavy metal reagents in the original route. Notably, the commonly used PHBDD-ML-T234G variant could not effectively catalyze the amidation in the final enzymatic step, primarily producing carboxylic acid instead. However, after activity screening, the PHBDD-ML-L163G-T234G variant was identified as the best biocatalyst for the oxidative amidation of the aldehyde substrate, yielding ABBV-318 in a high yield of 90%.Brief Description of the Drawings

[0042] Fig. 1 shows activity of PHBDD variants using different amines.

[0043] Fig. 2 shows the conversion and amide ratio of PHBDD variants using different amines.

[0044] Fig. 3 shows the protein electrophoresis image of representative PHBDD homologs.

[0045] Fig. 4 shows PHBDD homologs variants can also be evolved into OxiAm by inducing mutations L163G and T234G.

[0046] Fig. 5 shows isolated yields of amide formation reactions of PHBDD mutants with different aldehyde substrates from Example 3 of the present application.

[0047] Fig. 6 shows isolated yields of amide formation reactions of PHBDD mutants with different amine substrates from Example 4 of the present application.

[0048] Fig. 7 shows conversion rates of amide formation reactions of PHBDD mutants with other amine and aldehyde substrates.

[0049] Specific Modes for Carrying Out the Embodiments

[0050] The following embodiments give a detailed and specific description of the present application, but it should be understood that the present application is not limited to the following examples. Unless otherwise specified, the reagents and raw materials used in the following embodiments are commercially available. The strains, vectors, culture media and reagents used in the following embodiments are mainly as follows:

[0051] The modulation of DNA in the examples, the use of restriction enzyme digestion, and the transformation methods with E. coli are all performed according to the procedures outlined in "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition" (Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989) . All chemicals and reagents were purchased from commercial suppliers (Sigma-Aldrich, J&K, Alfa Aesar Chemicals, TCI, etc. ) and used without further purification unless otherwise stated. Analytical thin-layer chromatography was performed using 0.25 mm silica gel 60-F plates, using 254 / 365 nm UV light as the visualizing agent. Flash column chromatography was performed using 200-300 mesh silica gel. Yields refer to chromatographically and spectroscopically pure materials unless otherwise stated. NMR spectra were recorded on a Bruker 400 MHz NMR spectrometer (AVANCE III) or a Bruker 500 MHz NMR spectrometer (AVANCE III) at ambient temperature with acetone-d6, DMSO-d6, methanol-d4 or D2O as the solvent unless otherwise stated. Chemical shifts are reported in parts per million (ppm) , relative to acetone-d6 (1H, δ 2.05; 13C, δ 29.84) , DMSO-d6 (1H, δ 2.50; 13C, δ 39.52) , methanol-d4 (1H, δ 3.31; 13C, δ 49.03) or D2O (1H, δ 4.80) . Data for 1H NMR are reported as follows: chemical shift, multiplicity, coupling constant, integration. High-resolution mass spectrometry (HRMS) was recorded on a Q-TOF (AB SCIEX X500R with ESI source, and Agilent 7250 with EI source) , which combines quadrupole precursor ion selection and a high-resolution accurate-mass (HR / AM) Time of Flight (TOF) mass analyzer to deliver mass accuracy. Ultraperformance liquid chromatography (UPLC)  / mass spectrometry (MS) analysis was performed on an ACQUITY UPLC H-class system (Waters) coupled with an SQ Detector 2 equipped with an electrospray ionization source. All the UPLC / MS analysis was conducted on an ACQUITY UPLC BEN C18 column (length, 50 mm; inner diameter, 2.1 mm; particle size, 1.7 μm; Waters) at a flow rate of 0.3 mL / min at 40℃. The gradient elution consists of 0.1%formic acid-H2O (A) and MeCN (B) . The gradient programs were 5-20%B, 0-2 min, 20-45%B, 2-3 min, 45-100%B, 3-7 min.

[0052] Example 1: Activity testing of PHBDD and its Mutants

[0053] 1. Expression and purification of PHBDD and its mutants

[0054] The E. coli MC1061 strain containing pQlinkHx-PHBDD and the PHBDD mutants prepared was inoculated into liquid LB medium. Subsequently, 20 mL of this culture was transferred to 1 L of LB medium containing 100 μg / mL ampicillin. The culture was grown at 37℃ with shaking at 220 rpm until the OD of the culture reached 0.8-1.0. After cooling to 18℃ for 1 hour, IPTG was added to a final concentration of 0.5 mM to induce expression for 18-20 hours.

[0055] After cultivation, the cells were collected by centrifugation (5000 × g, 20 minutes) and resuspended in 25 mL lysis buffer (20 mM NaH2PO4-Na2HPO4, 0.2 mM NaCl, pH 8.0) . The cells were then disrupted using ultrasonic treatment (500 W, 30%power, 5 seconds on, 5 seconds off, for a total of 20 minutes) . The cell debris was removed by centrifugation (15,000 rpm, 1 hour) , and the supernatant was filtered through a 0.22 μm membrane to obtain the crude enzyme solution.

[0056] The crude enzyme solution was applied to a gravity nickel column that had been equilibrated with 5 column volumes of lysis buffer. The crude enzyme solution was slowly added to the column to allow it to pass through gradually. Proteins were washed with wash buffer (20 mM Tris-HCl, 0.2 mM NaCl, 40 mM imidazole, pH 8.0) , and the target protein was eluted with elution buffer (20 mM Tris-HCl, 0.2 mM NaCl, 300 mM imidazole, pH 8.0) . The expression level of PHBDD and its mutants in E. coli reached up to 120 mg / L. The eluted target protein was concentrated to a volume of 1-2 mL using a 30 kDa ultrafiltration membrane.

[0057] The concentrated protein sample was further purified using a Superdex S200 molecular sieve column equilibrated with buffer (20 mM Tris-HCl, 0.2 mM NaCl, pH 8.0) using an Akta system. After collecting the target protein fractions, the protein was concentrated to 15 mg / mL using a 30 kDa ultrafiltration membrane.

[0058] 2. Activity screening of PHBDD mutants

[0059] Four different amines 12-15 and aldehyde 9 were used for determination of engineered PHBDD variants to exhibit the success of protein engineering. Reaction condition: 1 mM substrate 9, 2 mM NADP+, 200 mM amine and 2 mg / mL proteins were incubated in 80 μL CAPS buffer (0.1 M, pH = 10) at 37℃ for 12 hours. The conversion was defined as consumption of substrate 9. The ratio of amide and acid was calculated with molar mass of products generated in the reactions using standard curves. All the data are presented as mean values from three independent measurements.

[0060] Compared with the parent M1 (45%conversion, 16 / 11 = 0.16: 1) , previous best mutant M1-L163G showed a remarkable increase in conversion rate (92%) and amide selectivity (16 / 11 = 11: 1) , while also acquiring new oxidative amidation activity with amines 14 and 15 to produce 18 and 19 respectively (Figures 1, 2) . The M1-T234G variant outperformed M1-L163G, achieving full conversion (100%) and significantly improved selectivity (16 / 11 = 43: 1) for substrate 13, raising the HPLC yield of 16 from 6%to 98%. Meanwhile, M1-T234G demonstrated superior performance with bulkier amines 14 and 15 compared to M1-L163G, yielding higher amounts of the corresponding amides. To assess whether these mutations could synergistically enhance enzymatic activity, we combined them to create the M1-L163G-T234G (M1-2G) variant. Despite significantly improved product ratios for amines 12-15, the M1-2G variant exhibited reduced enzymatic activity with substrates 13 and 14 compared to M1-T234G. Therefore, M1-T234G was selected as the representative OxiAm for subsequent synthetic applications.

[0061] Example 2: Activity screening of PHBDD homologous proteins and their variants

[0062] The reactions were performed in 100 uL CAPS buffer (0.1 M, pH = 10.0) containing 2 mM 9, 4 mM NADP+, 200 mM EtNH2 and 1 mg / mL proteins at 37℃ for 12 hours. The reactions were quenched by adding 200 uL MeOH and analyzed using UPLC-MS. The residues’ numbers used in this figure were corresponding to PHBDD. M1: R166M-E259L; 2G: L163G-T234G. Remarkably, all these ALDHs were successfully transformed into OxiAms when tested with model substrates 9 and 14 (Figure 4) . Therefore, our findings provide a new perspective for developing more OxiAms from ALDHs to further expand their applications in amide synthesis, considering the abundance of ALDH enzymes in nature.

[0063] Example 3: Substrate scope expansion of aldehydes and preparative-scale reactions

[0064] As shown in Figure 5, preparative-scale reactions were conducted using various aldehyde substrates and ethylamine. The wet E. coli overexpressing PHBDD mutants was used in amounts of 1.0-1.5 g, with 0.1 mmol of aldehyde, 0.15 mmol of NADP sodium salt, and 1.0-2.0 mmol of ethylamine. The buffer solution was 0.2 M CAPS (pH = 11) , and the reaction took place at 37℃, shaking at 220 rpm for 2-6 hours. The target products were purified via column chromatography, and the yields were reported as isolated yields.

[0065] 1. Synthesis of N-ethyl-4-methylbenzamide

[0066] E. coli cells overexpressing PHBDD-ML-T234G (1.0 g) were suspended in CAPS buffer (0.2 M, pH 11, 5.0 mL) . NADP sodium salt (115 mg, 0.15 mmol, 1.5 eq. ) , EtNH2 (70 mg, 65%wt in H2O, 1.0 mmol, 10 eq. ) , and aldehyde (0.10 mmol, 1.0 eq., dissolved in 0.5 mL MeOH) were sequentially added to the suspension. The reaction mixture was incubated at 37℃ and 220 rpm for 6 hours. Saturated NaCl (5 mL) and EtOAc (20 mL) were added to the reaction mixture, which was then thoroughly shaken to lyse the cells. The mixture was then centrifuged at 3000 × g for 15 minutes, and the aqueous layer was further extracted with EtOAc (2 × 20 mL) . The combined organic layers were washed with saturated NaCl (10 mL) , dried over anhydrous Na2SO4 and concentrated under reduced pressure to afford the crude product, which was further purified by flash column chromatography using petroleum ether / EtOAc system to yield the pure product as white solid with a yield of 73% (11.9 mg) .

[0067] 1H NMR (400 MHz, Acetone-d6) δ 7.81 –7.74 (m, 2H) , 7.64 (brs, 1H) , 7.24 (d, J = 8.0 Hz, 2H) , 3.40 (qd, J = 7.2, 5.6 Hz, 2H) , 2.36 (s, 3H) , 1.17 (t, J = 7.2 Hz, 3H) .

[0068] 13C NMR (101 MHz, Acetone-d6) δ 166.93, 141.88, 133.44, 129.64, 127.94, 35.10, 21.29, 15.26.

[0069] HRMS (ESI) m / z: [M + H] + calculated for C10H13NO: 164.1070, found: 164.1069.

[0070] TLC Rf = 0.4 (petroleum ether / EtOAc 2: 1) .

[0071] 2. Synthesis of 4-acetyl-N-ethylbenzamide

[0072] E. coli cells overexpressing PHBDD-ML-T234G (1.0 g) were suspended in CAPS buffer (0.2 M, pH 11, 5.0 mL) . NADP sodium salt (115 mg, 0.15 mmol, 1.5 eq. ) , EtNH2 (140 mg, 65%wt in H2O, 2.0 mmol, 20 eq. ) , and aldehyde (0.10 mmol, 1.0 eq., dissolved in 0.5 mL MeOH) were sequentially added to the suspension. The reaction mixture was incubated at 37℃and 220 rpm for 6 hours. Saturated NaCl (5 mL) and EtOAc (20 mL) were added to the reaction mixture, which was then thoroughly shaken to lyse the cells. The mixture was then centrifuged at 3000 × g for 15 minutes, and the aqueous layer was further extracted with EtOAc (2 × 20 mL) . The combined organic layers were washed with saturated NaCl (10 mL) , dried over anhydrous Na2SO4 and concentrated under reduced pressure to afford the crude product, which was further purified by flash column chromatography using petroleum ether / EtOAc system to yield the pure product as white solid with a yield of 86% (16.4 mg) . 1H NMR (400 MHz, Acetone-d6) δ 8.07 –8.01 (m, 2H) , 8.01 –7.95 (m, 2H) , 7.90 (brs, 1H) , 3.43 (qd, J = 7.2, 5.6 Hz, 2H) , 2.61 (s, 3H) , 1.20 (t, J = 7.2 Hz, 3H) .

[0073] 13C NMR (101 MHz, Acetone-d6) δ 197.65, 166.28, 139.88, 139.87, 128.99, 128.19, 35.33, 26.89, 15.10.

[0074] HRMS (ESI) m / z: [M + H] + calculated for C11H13NO2: 192.1019, found: 192.1015.

[0075] TLC Rf = 0.12 (petroleum ether / EtOAc 2: 1) .

[0076] 3. Synthesis of 4-acetyl-N-ethylbenzamide

[0077] E. coli cells overexpressing PHBDD-ML-T234G (1.5 g) were suspended in CAPS buffer (0.2 M, pH 11, 5.0 mL) . NADP sodium salt (115 mg, 0.15 mmol, 1.5 eq. ) , EtNH2 (70 mg, 65%wt in H2O, 2.0 mmol, 10 eq. ) , and aldehyde (0.10 mmol, 1.0 eq., dissolved in 0.5 mL MeOH) were sequentially added to the suspension. The reaction mixture was incubated at 37℃ and 220 rpm for 6 hours. Saturated NaCl (5 mL) and EtOAc (20 mL) were added to the reaction mixture, which was then thoroughly shaken to lyse the cells. The mixture was then centrifuged at 3000 × g for 15 minutes, and the aqueous layer was further extracted with EtOAc (2 × 20 mL) . The combined organic layers were washed with saturated NaCl (10 mL) , dried over anhydrous Na2SO4 and concentrated under reduced pressure to afford the crude product, which was further purified by flash column chromatography using petroleum ether / EtOAc system to yield the pure product as white solid with a yield of 50% (9.6 mg) .

[0078] 1H NMR (400 MHz, Acetone-d6) δ 10.34 (s, 1H) , 8.07 –7.66 (m, 4H) , 3.43 (qd, J = 7.3, 5.6 Hz, 2H) , 2.69 (s, 3H) , 1.20 (t, J = 7.2 Hz, 3H) .

[0079] 13C NMR (101 MHz, Acetone-d6) δ 193.00, 166.24, 141.22, 140.25, 136.76, 132.22, 131.31, 125.78, 35.33, 19.45, 15.09.

[0080] HRMS (ESI) m / z: [M + H] + calculated for C11H13NO2: 192.1019, found: 192.1017.

[0081] TLC Rf = 0.2 (petroleum ether / EtOAc 2: 1) .

[0082] 4. Synthesis of N-ethyl- [1, 1'-biphenyl] -4-carboxamide

[0083] E. coli cells overexpressing PHBDD-ML-L163G-T234G (1.0 g) were suspended in CAPS buffer (0.2 M, pH 11, 5.0 mL) . NADP sodium salt (115 mg, 0.15 mmol, 1.5 eq. ) , EtNH2 (70 mg, 65%wt in H2O, 1.0 mmol, 10 eq. ) , and aldehyde (0.10 mmol, 1.0 eq., dissolved in 0.5 mL MeOH) were sequentially added to the suspension. The reaction mixture was incubated at 37℃ and 220 rpm for 6 hours. Saturated NaCl (5 mL) and EtOAc (20 mL) were added to the reaction mixture, which was then thoroughly shaken to lyse the cells. The mixture was then centrifuged at 3000 × g for 15 minutes, and the aqueous layer was further extracted with EtOAc (2 × 20 mL) . The combined organic layers were washed with saturated NaCl (10 mL) , dried over anhydrous Na2SO4 and concentrated under reduced pressure to afford the crude product, which was further purified by flash column chromatography using petroleum ether / EtOAc system to yield the pure product as white solid with a yield of 50% (11.3 mg) . 1H NMR (400 MHz, Acetone-d6) δ 8.02 –7.94 (m, 2H) , 7.78 (brs, 1H) , 7.75 –7.66 (m, 4H) , 7.53 –7.44 (m, 2H) , 7.44 –7.35 (m, 1H) , 3.44 (qd, J = 7.2, 5.6 Hz, 2H) , 1.21 (t, J = 7.2 Hz, 3H) .

[0084] 13C NMR (101 MHz, Acetone-d6) δ 166.72, 144.26, 140.93, 135.01, 129.83, 128.74, 128.57, 127.86, 127.55, 35.22, 15.24.

[0085] HRMS (ESI) m / z: [M + H] + calculated for C15H15NO: 226.1227, found: 226.1223.

[0086] TLC Rf = (petroleum ether / EtOAc 2: 1) .

[0087] Example 4: Substrate scope expansion of amines and preparative-scale reactions

[0088] As shown in Figure 6, preparative-scale reactions were conducted using various amine substrates and 5-chloropicolinaldehyde. The wet E. coli overexpressing PHBDD mutants was used in amounts of 1.0 g, with 0.1 mmol of 5-chloropicolinaldehyde, 0.15 mmol of NADP sodium salt, and 0.2-1.5 mmol of amines. The buffer solution was 0.2 M CAPS (pH = 11) , and the reaction took place at 37℃, shaking at 220 rpm for 2-6 hours. The target products were purified via column chromatography, and the yields were reported as isolated yields.

[0089] 1. Synthesis of 5-chloro-N-ethylpicolinamide

[0090] E. coli cells overexpressing PHBDD-ML-L163G-T234G (1.0 g) were suspended in CAPS buffer (0.2 M, pH 11, 5.0 mL) . NADP sodium salt (115 mg, 0.15 mmol, 1.5 eq. ) , EtNH2 (14 mg, 65%wt in H2O, 0.2 mmol, 2 eq. ) , and 5-chloropicolinaldehyde (0.10 mmol, 1.0 eq., dissolved in 0.5 mL MeOH) were sequentially added to the suspension. The reaction mixture was incubated at 37℃ and 220 rpm for 6 hours. Saturated NaCl (5 mL) and EtOAc (20 mL) were added to the reaction mixture, which was then thoroughly shaken to lyse the cells. The mixture was then centrifuged at 3,000 × g for 15 minutes, and the aqueous layer was further extracted with EtOAc (2 × 20 mL) . The combined organic layers were washed with saturated NaCl (10 mL) , dried over anhydrous Na2SO4 and concentrated under reduced pressure to afford the crude product, which was further purified by flash column chromatography using petroleum ether / EtOAc system to yield the pure product as white solid with a yield of 72%(13.3 mg) .

[0091] 1H NMR (400 MHz, Acetone-d6) δ 8.57 (d, J = 2.0 Hz, 1H) , 8.32 (brs, 1H) , 8.14 –8.10 (m, 1H) , 8.03 (dd, J = 8.4, 2.4 Hz, 1H) , 3.46 (qd, J = 7.2, 6.1 Hz, 2H) , 1.21 (t, J = 7.2 Hz, 3H) . 13C NMR (101 MHz, Acetone-d6) δ 163.55, 149.96, 147.85, 138.09, 135.08, 124.02, 34.79, 15.24.

[0092] HRMS (ESI) m / z: [M + H] + calculated for C8H9ClN2O: 185.0476, found: 185.0477.

[0093] TLC Rf = 0.6 (petroleum ether / EtOAc 2: 1) .

[0094] 2. Synthesis of 5-chloropicolinamide

[0095] E. coli cells overexpressing PHBDD-ML-L163G (1.0 g) were suspended in CAPS buffer (0.2 M, pH 11, 5.0 mL) . NADP sodium salt (115 mg, 0.15 mmol, 1.5 eq. ) , ammonia (28%wt in H2O, 0.5 mmol, 5 eq. ) , and 5-chloropicolinaldehyde (0.10 mmol, 1.0 eq., dissolved in 0.5 mL MeOH) were sequentially added to the suspension. The reaction mixture was incubated at 37℃ and 220 rpm for 6 hours. Saturated NaCl (5 mL) and EtOAc (20 mL) were added to the reaction mixture, which was then thoroughly shaken to lyse the cells. The mixture was then centrifuged at 3000 × g for 15 minutes, and the aqueous layer was further extracted with EtOAc (2 × 20 mL) . The combined organic layers were washed with saturated NaCl (10 mL) , dried over anhydrous Na2SO4 and concentrated under reduced pressure to afford the crude product, which was further purified by flash column chromatography using petroleum ether / EtOAc system to yield the pure product as white solid with a yield of 78% (12.2 mg) . 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.67 (d, J = 2.3 Hz, 1H) , 8.13 (brs, 1H) , 8.10 (dd, J =8.4, 2.4 Hz, 1H) , 8.04 (d, J = 8.4 Hz, 1H) , 7.73 (brs, 1H) .

[0096] 13C NMR (101 MHz, DMSO-d6) δ 165.13, 148.87, 147.06, 137.41, 133.86, 123.46.

[0097] HRMS (ESI) m / z: [M + H] + calculated for C6H5ClN2O: 157.0163, found: 157.0166.

[0098] TLC Rf = 0.25 (petroleum ether / EtOAc 2: 1) .

[0099] 3. Synthesis of 5-chloro-N- (2-hydroxyethyl) picolinamide

[0100] E. coli cells overexpressing PHBDD-ML-P156G-T234G (1.0 g) were suspended in CAPS buffer (0.2 M, pH 11, 5.0 mL) . NADP sodium salt (115 mg, 0.15 mmol, 1.5 eq. ) , ethanolamine (0.5 mmol, 5 eq. ) , and 5-chloropicolinaldehyde (0.10 mmol, 1.0 eq., dissolved in 0.5 mL MeOH) were sequentially added to the suspension. The reaction mixture was incubated at 37℃ and 220 rpm for 6 hours. Saturated NaCl (5 mL) and EtOAc (20 mL) were added to the reaction mixture, which was then thoroughly shaken to lyse the cells. The mixture was then centrifuged at 3000 × g for 15 minutes, and the aqueous layer was further extracted with EtOAc (2 × 20 mL) . The combined organic layers were washed with saturated NaCl (10 mL) , dried over anhydrous Na2SO4 and concentrated under reduced pressure to afford the crude product, which was further purified by flash column chromatography using petroleum ether / EtOAc system to yield the pure product as white solid with a yield of 60% (12.4 mg) .

[0101] 1H NMR (400 MHz, Acetone-d6) δ 8.63 –8.57 (m, 1H) , 8.41 (brs, 1H) , 8.14 –8.10 (m, 1H) , 8.05 (dd, J = 8.4, 2.4 Hz, 1H) , 4.04 (t, J = 5.4 Hz, 1H) , 3.73 (q, J = 5.5 Hz, 2H) , 3.55 (q, J = 5.7 Hz, 2H) .

[0102] 13C NMR (101 MHz, Acetone-d6) δ 164.03, 149.72, 147.95, 138.17, 135.23, 124.07, 61.64, 61.51, 42.84, 42.81.

[0103] HRMS (ESI) m / z: [M + H] + calculated for C8H9ClN2O2: 201.0426, found: 201.0421.

[0104] TLC Rf = 0.12 (petroleum ether / EtOAc 2: 1) .

[0105] 4. Synthesis of 5-chloro-N- (2-morpholinoethyl) picolinamide

[0106] E. coli cells overexpressing PHBDD-ML-T234G (1.0 g) were suspended in CAPS buffer (0.2 M, pH 11, 5.0 mL) . NADP sodium salt (115 mg, 0.15 mmol, 1.5 eq. ) , 2-morpholinoethan-1-amine (1.0 mmol, 10 eq. ) , and 5-chloropicolinaldehyde (0.10 mmol, 1.0 eq., dissolved in 0.5 mL MeOH) were sequentially added to the suspension. The reaction mixture was incubated at 37℃ and 220 rpm for 6 hours. Saturated NaCl (5 mL) and EtOAc (20 mL) were added to the reaction mixture, which was then thoroughly shaken to lyse the cells. The mixture was then centrifuged at 3000 × g for 15 minutes, and the aqueous layer was further extracted with EtOAc (2 × 20 mL) . The combined organic layers were washed with saturated NaCl (10 mL) , dried over anhydrous Na2SO4 and concentrated under reduced pressure to afford the crude product, which was further purified by flash column chromatography using petroleum ether / EtOAc system to yield the pure product as white solid with a yield of 74% (20.0 mg) .

[0107] 1H NMR (400 MHz, Acetone-d6) δ 8.60 (dd, J = 2.4, 0.8 Hz, 1H) , 8.37 (brs, 1H) , 8.12 (dd, J = 8.4, 0.8 Hz, 1H) , 8.04 (dd, J = 8.4, 2.4 Hz, 1H) , 3.64 –3.60 (m, 4H) , 3.55 (q, J = 6.2 Hz, 2H) , 2.57 (t, J = 6.4 Hz, 2H) , 2.51 –2.42 (m, 4H) .

[0108] 13C NMR (101 MHz, Acetone-d6) δ 163.65, 149.79, 147.97, 138.12, 135.16, 124.04, 67.48, 58.25, 54.41, 36.78.

[0109] HRMS (ESI) m / z: [M + H] + calculated for C12H16ClN3O2: 270.1004, found: 270.0997.

[0110] TLC Rf = 0.2 (petroleum ether / EtOAc 2: 1) .

[0111] 5. Synthesis of (5-chloropicolinoyl) glycine

[0112] E. coli cells overexpressing PHBDD-ML-T234G (1.0 g) were suspended in CAPS buffer (0.2 M, pH 11, 5.0 mL) . NADP sodium salt (115 mg, 0.15 mmol, 1.5 eq. ) , glycine (1.5 mmol, 15 eq. ) , and 5-chloropicolinaldehyde (0.10 mmol, 1.0 eq., dissolved in 0.5 mL MeOH) were sequentially added to the suspension. The reaction mixture was incubated at 37℃ and 220 rpm for 6 hours. Saturated NaCl (5 mL) , 1.0 M HCl (1 mL) and EtOAc (20 mL) were added to the reaction mixture, which was then thoroughly shaken to lyse the cells. The mixture was then centrifuged at 3000 × g for 15 minutes, and the aqueous layer was further extracted with EtOAc (2 × 20 mL) . The combined organic layers were washed with saturated NaCl (10 mL) , dried over anhydrous Na2SO4 and concentrated under reduced pressure to afford the crude product, which was further purified by flash column chromatography using dichloromethane / methanol system to yield the pure product as white solid with a yield of 90%(19.3 mg) .

[0113] 1H NMR (400 MHz, Acetone-d6) δ 8.63 (d, J = 1.9 Hz, 1H) , 8.14 (d, J = 8.4 Hz, 1H) , 8.07 (dd, J = 8.4, 2.4 Hz, 1H) , 4.21 (s, 2H) .

[0114] 13C NMR (101 MHz, Acetone-d6) δ 171.12, 164.13, 164.08, 149.17, 148.15, 138.24, 135.53, 124.19, 41.45.

[0115] HRMS (ESI) m / z: [M + H] + calculated for C8H7ClN2O3: 215.0218, found: 215.0215.

[0116] TLC Rf = 0.4 (CH2Cl2 / MeOH 10: 1) .

[0117] Please find all the NMR data of isolated substrates in Table 1, and the substrate scope with low conversions in Figure 7.

[0118] Table 1: the full NMR data of all isolated products in the substrate scope expansion.

[0119] Example 5: The chemo-enzymatic synthesis of Vadadustat

[0120] 1. Synthesis of 3- (3-chlorophenyl) -5-methoxypyridine (VAD-2)

[0121] To a solution of 3-bromo-5-methoxypyridine (944 mg, 5.0 mmol, 1.0 eq) in DMF (10 mL) were added (3-chlorophenyl) boronic acid (860 mg, 5.5 mmol, 1.1 eq) , K2CO3 (2.07 g, 15 mmol, 3.0 eq) , H2O (2 mL) , and [1, 1’ -bis (diphenylphosphino) ferrocene] dichloropalladium (II) [PdCl2 (dppf) , 110 mg, 0.015 mmol, 0.03 eq. ] under argon atmosphere. The reaction mixture was stirred at 55℃ until complete conversion of the starting material. The reaction mixture was then diluted in EtOAc (200 mL) , washed with 5%NaCl (3 × 40 mL) and saturated NaCl (40 mL) , dried over anhydrous Na2SO4, and concentrated under reduced pressure to afford the crude product, which was further purified by flash column chromatography using a petroleum ether / acetone system to obtain the pure product as a white solid with a yield of 95% (1.04 g) .

[0122] 1H NMR (400 MHz, Acetone-d6) δ 8.47 (d, J = 1.9 Hz, 1H) , 8.31 (d, J = 2.8 Hz, 1H) , 7.74 (t, J = 2.0 Hz, 1H) , 7.66 (dt, J = 7.8, 1.4 Hz, 1H) , 7.60 (dd, J = 2.8, 1.9 Hz, 1H) , 7.51 (t, J = 7.8 Hz, 1H) , 7.44 (ddd, J = 8.0, 2.1, 1.2 Hz, 1H) , 3.97 (s, 3H) .

[0123] 13C NMR (101 MHz, Acetone-d6) δ 156.89, 140.94, 140.73, 138.23, 136.39, 135.35, 131.51, 128.88, 127.96, 126.60, 118.97, 56.09.

[0124] HRMS (ESI) m / z: [M + H] + calculated for C12H10ClNO: 220.0524, found: 220.0518.

[0125] TLC Rf = 0.3 (petroleum ether / EtOAc 2: 1) .

[0126] 2. Synthesis of 5- (3-chlorophenyl) -3-methoxypicolinaldehyde (VAD-3)

[0127] To an oven-dried flask was added 3- (3-chlorophenyl) -5-methoxypyridine (220 mg, 1.0 mmol, 1.0 eq. ) and anhydrous THF (0.7 mL) . To the reaction mixture was dropwise added 2, 2, 6, 6-tetramethylpiperidyl magnesium chloride lithium chloride complex (TMPMgCl·LiCl, 3.0 mL, 1.0 M in THF, 3.0 eq. ) at 0℃ under argon atmosphere. The reaction mixture was stirred at 0℃ for 10 minutes and warmed to room temperature for 3 hours, then cooled to 0℃. Anhydrous DMF (0.39 mL, 5.0 mmol, 5.0 eq. ) was then added to the reaction mixture, and stirred for 10 minutes at 0℃, then at room temperature for 1 hour. Saturated NH4Cl (3 mL) was added to quench the reaction, and the reaction mixture was diluted in EtOAc (50 mL) , washed with saturated NaCl (20 mL) , and concentrated under reduced pressure to afford the crude product, which was further purified by flash column chromatography using a petroleum ether / acetone system to obtain the pure product as a white solid with a yield of 70% (173 mg) . The starting material was recovered with a yield of 25% (55 mg) , the yield based on recovered starting material (brsm) was 93%.

[0128] 1H NMR (400 MHz, Acetone-d6) δ 10.26 (s, 1H) , 8.66 (d, J = 1.7 Hz, 1H) , . 97 (d, J =1.8 Hz, 1H) , 7.88 (t, J = 1.9 Hz, 1H) , 7.80 (dt, J = 7.5, 1.6 Hz, 1H) , 7.62 –7.49 (m, 2H) , 4.10 (s, 3H) .

[0129] 13C NMR (101 MHz, Acetone-d6) δ 190.30, 158.60, 141.31, 140.86, 140.83, 139.66, 135.54, 131.72, 129.86, 128.41, 127.06, 119.84, 56.52.

[0130] HRMS (ESI) m / z: [M + H] + calculated for C13H10ClNO2: 248.0473, found: 248.0465.

[0131] TLC Rf = 0.25 (petroleum ether / EtOAc 2: 1) .

[0132] 3. Synthesis of (5- (3-chlorophenyl) -3-methoxypicolinoyl) glycine (VAD-4)

[0133] E. coli cells overexpressing with PHBDD-ML-T234G (2.0 g) were suspended in glycine buffer (2.0 M, pH 11, 10 mL) . NADP sodium salt (288 mg, 0.38 mmol, 1.5 eq. ) and 5- (3-chlorophenyl) -3-methoxypicolinaldehyde (62 mg, 0.25 mmol, 1.0 eq., dissolved in 1.0 mL MeOH) were sequentially added to the suspension. The reaction mixture was incubated at 37℃and 220 rpm for 6 hours. Saturated NaCl (5 mL) was added to the reaction mixture, and the pH was adjusted to 1 by 6 M HCl. EtOAc (20 mL) was added to the reaction mixture, which was then thoroughly shaken to lyse the cells. The mixture was then centrifuged at 3000 × g for 15 minutes, and the aqueous layer was further extracted with EtOAc (2 × 20 mL) . The combined organic layers were dried over anhydrous Na2SO4 and concentrated under reduced pressure to afford the crude product, which was used for the next step directly without purification. The NMR sample was purified by prep-HPLC using 0.1%HCl-H2O / acetonitrile system to obtain the pure product as a white solid.

[0134] 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.70 (t, J = 5.9 Hz, 1H) , 8.55 (d, J = 1.8 Hz, 1H) , 8.01 –7.91 (m, 2H) , 7.83 (dt, J = 7.0, 1.9 Hz, 1H) , 7.62 –7.49 (m, 2H) , 3.98 (s, 3H) , 3.95 (d, J =5.9 Hz, 2H) .

[0135] 13C NMR (101 MHz, DMSO-d6) δ 171.03, 163.78, 154.66, 139.01, 138.14, 137.57, 134.00, 130.94, 128.74, 127.19, 126.16, 119.86, 56.29, 40.99.

[0136] HRMS (ESI) m / z: [M + H] + calculated for C15H13ClN2O4: 321.0637, found: 321.0634.

[0137] TLC Rf = 0.5 (CH2Cl2 / MeOH 10: 1, 0.1%HOAc) .

[0138] 4. Synthesis of (5- (3-chlorophenyl) -3-hydroxypicolinoyl) glycine (Vadadustat)

[0139] Crude sample obtained from previous step was dissolved in HBr (33%in AcOH, 2 mL) . The reaction mixture was heated to 85℃ under argon atmosphere for 24 hours. After complete conversion of the starting material, the reaction mixture was cooled to room temperature, diluted with saturated NaCl (20 mL) , and then extracted with CH2Cl2 (3 × 20 mL) . The combined organic layers were dried over anhydrous Na2SO4, and concentrated under reduced pressure to afford the crude product, which was further purified by CH2Cl2 / MeOH system to obtain the pure product as a white solid with a two-step yield of 67% (51.4 mg) .

[0140] 1H NMR (400 MHz, Acetone-d6) δ 12.25 (s, 1H) , 8.88 (t, J = 6.1 Hz, 1H) , 8.44 (d, J =1.5 Hz, 1H) , 7.79 (d, J = 1.7 Hz, 1H) , 7.74 –7.67 (m, 1H) , 7.62 (t, J = 1.6 Hz, 1H) , 7.57 –7.47 (m, 2H) , 4.27 (d, J = 6.0 Hz, 2H) .

[0141] 13C NMR (101 MHz, Acetone-d6) δ 170.69, 169.98, 158.67, 141.20, 139.48, 139.23, 135.49, 131.68, 131.38, 129.67, 128.09, 126.78, 124.35, 41.13.

[0142] HRMS (ESI) m / z: [M + H] + calculated for C14H11ClN2O4: 307.0480, found: 307.0476.

[0143] TLC Rf = 0.6 (CH2Cl2 / MeOH 10: 1, 0.1%HOAc) .

[0144] Example 6: The enzymatic synthesis of ABBV-318

[0145] 1. Synthesis of 2-methyl-6- ( (5- (trifluoromethyl) pyridin-2-yl) oxy) quinoline (NAV-2)

[0146] To a solution of 2-methylquinolin-6-ol (160 mg, 1.0 mmol, 1.0 eq. ) in DMF (1 mL) was added 2-fluoro-5- (trifluoromethyl) pyridine (215 mg, 1.3 mmol, 1.3 eq. ) and Cs2CO3 (490 mg, 1.5 mmol, 1.5 eq. ) under argon atmosphere. The reaction was stirred at 80℃ until complete conversion of the starting material. The reaction mixture was filtered, concentrated under reduced pressure to afford the crude product, which was further purified by flash column chromatography using a petroleum ether / EtOAc system to obtain the pure product as a white solid with a yield of 87% (266 mg) .

[0147] 1H NMR (400 MHz, Acetone-d6) δ 8.48 (dt, J = 2.7, 1.0 Hz, 1H) , 8.22 –8.15 (m, 2H) , 8.01 (d, J = 9.1 Hz, 1H) , 7.70 (d, J = 2.7 Hz, 1H) , 7.57 (dd, J = 9.1, 2.7 Hz, 1H) , 7.42 (d, J =8.4 Hz, 1H) , 7.29 (dt, J = 8.7, 0.8 Hz, 1H) , 2.69 (s, 3H) .

[0148] 13C NMR (101 MHz, Acetone-d6) δ 166.87, 159.48, 151.49, 146.65, 146.11 (q, J = 4.4 Hz) , 138.15 (q, J = 3.4 Hz) , 136.47, 131.12, 127.97, 125.63, 124.96 (q, J = 271.7 Hz) 123.33, 122.19 (q, J = 32.9 Hz) , 118.75, 112.78, 25.18.

[0149] 19F NMR (471 MHz, Acetone-d6) δ -62.13.

[0150] HRMS (ESI) m / z: [M + H] + calculated for C16H11F3N2O: 305.0896, found: 305.0895.

[0151] TLC Rf = (petroleum ether / EtOAc 2: 1) .

[0152] 2. Synthesis of 6- ( (5- (trifluoromethyl) pyridin-2-yl) oxy) quinoline-2-carbaldehyde (NAV-3)

[0153] To a solution of 2-methyl-6- ( (5- (trifluoromethyl) pyridin-2-yl) oxy) quinoline (305 mg, 1.0 mmol, 1.0 eq. ) in 1, 4-dioxane (1 mL) was added SeO2 (222 mg, 2.0 mmol, 2.0 eq. ) under argon atmosphere. The reaction mixture was stirred at 80℃ until complete conversion of the starting material. The reaction mixture was filtered, concentrated under reduced pressure to afford the crude product, which was further purified by flash column chromatography using a petroleum ether / EtOAc system to obtain the pure product as a white solid with a yield of 85%(270 mg)

[0154] 1H NMR (400 MHz, Acetone-d6) δ 10.16 (d, J = 0.9 Hz, 1H) , 8.59 –8.48 (m, 2H) , 8.32 (d, J = 9.1 Hz, 1H) , 8.25 (dd, J = 8.7, 2.6 Hz, 1H) , 8.03 (d, J = 8.5 Hz, 1H) , 7.91 (d, J = 2.6 Hz, 1H) , 7.80 (dd, J = 9.2, 2.7 Hz, 1H) , 7.38 (dt, J = 8.7, 0.8 Hz, 1H) .

[0155] 13C NMR (101 MHz, Acetone-d6) δ 194.07, 166.41, 154.42, 153.47, 146.56, 146.16 (q, J = 4.5 Hz) , 138.43 (q, J = 3.0 Hz) , 138.09, 132.85, 131.89, 127.26, 124.92 (q, J = 271.7 Hz) , 122.72 (q, J = 32.9 Hz) , 118.87, 118.27, 113.23.

[0156] 19F NMR (471 MHz, Acetone-d6) δ -62.20.

[0157] HRMS (ESI) m / z: [M + H] + calculated for C16H19F3N2O2: 319.0689, found: 319.0681.

[0158] TLC Rf = (petroleum ether / EtOAc 2: 1) .

[0159] 3. Synthesis of (R) - (3-fluoropyrrolidin-1-yl) (6- ( (5- (trifluoromethyl) pyridin-2-yl) oxy) quinolin-2-yl) methanone (ABBV-318)

[0160] E. coli cells overexpressing PHBDD-ML-L163G-T234G (2.0 g) was suspended in CAPS buffer (0.2 M, pH 11, 10 mL) . NADP sodium salt (230 mg, 0.13 mmol, 1.5 eq. ) , (R) -3-fluoropyrrolidine hydrochloride (504 mg, 4.0 mmol, 20 eq. ) , NaOH (160 mg, 4.0 mmol, 20 eq., dissolved in 1 mL water) and 6- ( (5- (trifluoromethyl) -pyridin-2-yl) oxy) quinoline-2-carbaldehyde (63.6 mg, 0.2 mmol, 1.0 eq. ) was sequentially added to the suspension. The reaction mixture was incubated at 37℃ and 220 rpm for 6 hours. Saturated NaCl (5 mL) and EtOAc (20 mL) was added to the mixture, which was then thoroughly shaken to lyse the cells. The mixture was then centrifuged at 3,000 × g for 15 minutes, and the aqueous layer was further extracted with EtOAc (2 × 20 mL) . The combined organic layers were washed with saturated NaCl (10 mL) , dried over anhydrous Na2SO4 and concentrated under reduced pressure to afford the crude product, which was further purified by flash column chromatography using a petroleum ether / EtOAc system to obtain the pure product as a white solid with a yield of 90% (72.9 mg) .

[0161] 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 8.58 (d, J = 2.5 Hz, 1H) , 8.47 (d, J = 8.6 Hz, 1H) , 8.28 (dd, J = 8.7, 2.6 Hz, 1H) , 8.15 (dd, J = 9.1, 6.0 Hz, 1H) , 7.95 –7.83 (m, 2H) , 7.71 (dd, J = 9.0, 2.7 Hz, 1H) , 7.38 (d, J = 8.7 Hz, 1H) , 5.40 (ddt, J = 54.0, 14.7, 3.5 Hz, 1H) , 4.17 –4.04 (m, 1H) , 4.04 –3.92 (m, 1H) , 3.92 –3.84 (m, 1H) , 3.84 –3.59 (m, 1H) , 2.28 –2.04 (m, 2H) .

[0162] 13C NMR (126 MHz, DMSO-d6) δ 165.53 (d, J = 25.2 Hz) , 165.29, 153.12, 152.96, 151.81, 151.78, 145.29 (q, J = 4.4 Hz) , 143.61, 143.54, 137.81 (q, J = 3.2 Hz) , 136.82, 136.77, 131.08, 131.06, 128.70, 128.67, 125.90, 123.81 (q, J = 272.2 Hz) , 121.05, 120.98, 120.85 (q, J = 32.8 Hz) , 93.70 (d, J = 173.2 Hz) , 91.65 (d, J = 172.1 Hz) , 55.08 (d, J = 22.1 Hz) , 53.23 (d, J = 22.3 Hz) , 46.30, 44.49, 32.54 (d, J = 20.8 Hz) , 29.93 (d, J = 21.0 Hz) .

[0163] 19F NMR (471 MHz, DMSO-d6) δ -60.18, -176.51, -176.70.

[0164] HRMS (ESI) m / z: [M + H] + calculated for C20H15F4N3O2: 406.1173, found: 406.1167.

[0165] TLC Rf = 0.1 (petroleum ether / EtOAc 2: 1) .

[0166] Although the present application has been described in detail with general description and specific embodiments, it is obvious to a person skilled in the art that some modifications or improvements can be made on the basis of the present application. Therefore, these modifications or improvements made without deviating from the spirit of the present application belong to the scope of protection claimed in the present application.Industrial applicability

[0167] This application provides an engineered oxidative aminase (OxiAm) for the preparation of amide compounds and use thereof. The engineered OxiAm provided by this application displayed better reactivity of using aldehydes and amines as substrates to catalyze the formation of amide bonds than the previous generation. The application also offers a general strategy to reprogram the aldehyde dehydrogenase to OxiAm which exhibits high catalytic activity and broad substrate recognition in engineered homologous proteins. The engineered OxiAms were applied in formal synthesis or total synthesis of seven drugs and bioactive molecules, providing greener and more environmentally friendly methods towards those molecules.

Claims

1.An oxidative aminase engineered from aldehyde dehydrogenase p-hydroxybenzaldehyde dehydrogenase (PHBDD) , which catalyzes a reaction between aldehydes and amines to produce amides, wherein the oxidative aminase includes an amino acid sequence that has at least 90%sequence identity to the reference sequence SEQ ID No: 5, and differs from SEQ ID No: 5 by at least one amino acid residue at positions P156, L163, T234, L415; preferably, the amino acid sequence is selected from the group consisting of the sequences as represented by SEQ ID No: 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29.2.An oxidative aminase engineered from homologous proteins of aldehyde dehydrogenase p-hydroxybenzaldehyde dehydrogenase (PHBDD) , where the homologous proteins include an amino acid sequence having at least 50%sequence identity to the reference sequence SEQ ID No: 1 of the aldehyde dehydrogenase PHBDD, and at least one amino acid residue difference at positions L163, R166, T234, or E259, corresponding to those in SEQ ID No: 1 in terms of three-dimensional structure; preferably, the amino acid sequence is selected from the group consisting of the sequences as represented by SEQ ID No: 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147 and 149.3.The oxidative aminase according to any one of claims 1 to 2, wherein the reaction is carried out at an aldehyde substrate concentration of 1 to 50 mM, an amine substrate concentration of 1 mM to 2.0 M, an NADP+ concentration of 2 to 100 mM, a pH of 9.0 to 11.0, and a temperature of 20℃ to 40℃ for 2 to 16 hours.4.A polynucleotide, wherein the polynucleotide encodes the oxidative aminase according to any one of claims 1 to 2.5.The polynucleotide according to claim 4, wherein the polynucleotide has the sequences of any one or more of SEQ ID Nos: 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148 and 150.6.An expression vector comprising the polynucleotide according to any one of claims 4 to 5.7.The expression vector according to claim 6, wherein the expression vector includes a plasmid, cosmid, bacteriophage, or viral vector.8.A host cell comprising the expression vector according to any one of claims 6 to 7, wherein the host cell is preferably Escherichia coli (E. coli) .9.A method for preparing the oxidative aminase according to any one of claims 1 to 3, comprising the steps of culturing the host cell according to claim 8 to obtain culture, and obtaining the oxidative aminase from the culture.10.An oxidative aminase catalyst, wherein the catalyst is obtained from a host cell or culture containing the oxidative aminase prepared by the method of claim 9, or a product processed from the oxidative aminase prepared by the method of claim 9; wherein the product is an isolated product obtained by separating or purifying the oxidative aminase from an extract obtained from transformed cells.11.A method for preparing a compound of structural formula (1) , the method comprises contacting an aldehyde substrate of structural formula (2) and an amine substrate of structural formula (3) with the oxidative aminase catalyst according to claim 10. R1 is an optionally substituted aryl (alkenyl) or heteroaryl (alkenyl) group;R2 is an optionally hydrogen, or alkynyl, or alkenyl, or alkyl optionally including one or more heteroatoms which are O, S or N, and optionally substituted by one or more of halo, OR, SR, NR2, RCO, COOR, CONR2, OOCR, wherein R is H or alkyl, or by CN or C=O, or by an aliphatic or aromatic membered ring optionally containing heteroatoms;R3 is an optionally hydrogen, or alkynyl, or alkenyl, or alkyl optionally including one or more heteroatoms, S or N, and optionally substituted by one or more of halo, OR, SR, NR2, RCO, COOR, CONR2, OOCR, wherein R is H or alkyl, or by CN or C=O, or by an aliphatic or aromatic membered ring optionally containing heteroatoms, preferably, the heteroatom is O.12.The method according to claim 11, wherein the compound of structural formula (1) is: andthe aldehyde substrate of structural formula (2) is:andthe amine substrate of structural formula (3) is13.The method according to claim 11, wherein the compound of structural formula (1) is: andthe amine substrate of structural formula (3) is:andthe aldehyde substrate of structural formula (2) is14.The method according to claim 11, wherein the method comprises a de novo route for the enzymatic catalytic synthesis of the oral chronic kidney disease anemia drug vadadustat (brand name: Vafseo) . 15.The method according to claim 11, wherein the method comprises a de novo route for the enzymatic catalytic synthesis of the Nav1.7 / 1.8 blocker ABBV-318.

Images