Engineering of aldehyde dehydrogenases into oxidative aminases and use thereof

Abstract

Provided are an engineered aldehyde dehydrogenase for the preparation of amide compounds and use thereof. The said engineered aldehyde dehydrogenase uses aldehydes and amines as substrates and can efficiently catalyze the formation of amide bonds. Provided is an oxidative aminase, developed through the engineering of aldehyde dehydrogenase, which exhibits high catalytic activity and broad substrate recognition. This provides a new approach to the synthesis of amide bonds in medicinal chemistry, being greener and more environmentally friendly compared to traditional chemical coupling reagents, and holds potential for industrial-scale production.

Description

ENGINEERING OF ALDEHYDE DEHYDROGENASES INTO OXIDATIVE AMINASES AND USE THEREOFTechnical Field

[0001] The present application belongs to the field of biocatalysis technology, specifically relating to an engineered aldehyde dehydrogenase for the preparation of amide compounds and use thereof.Background Art

[0002] Amide bond formation is unquestionably considered as one of the most important chemical transformations in medical chemistry due to the ubiquitous existence of amide moiety in pharmaceutical agents such as Apixaban, Rivaroxaban, Enzalutamide, Olaparib, Vadadustat, Regorafenib, Camlipixant and Lazabemide. In fact, 117 of the top 200 small molecule drugs by retail sales in 2023 contains at least one amide bond. Therefore, amide coupling reactions are the most frequently used in parallel library synthesis for discovering lead compounds in the early stages of drug development. However, the chemical amide coupling methods need first to activate the acid using stoichiometric coupling reagents such as DIC (N, N’-diisopropylcarbodiimide) , HATU [2- (7-azabenzotriazol-1-yl) -N, N, N', N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate] , CDI (1, 1’-carbonyldiimidazole) , and thus inevitably generate hazardous chemical waste. Compared with these traditional stoichiometric amidation, catalytic amidations are considered greener and more sustainable approaches to synthesize amides. Among them, the oxidative amidation of aldehyde or alcohol via hemiaminal formation shows an apparent advantage in step and atom economy and thus serves as a promising strategy to tackle the synthetic challenges in amide synthesis. However, the use of expensive or toxic transition metal catalysts such as ruthenium complex or copper catalysts hinders the synthetic applications of these methods.

[0003] Compared with chemical methodologies, biocatalytic strategies to amide synthesis are quite limited, mainly including nitrile hydration or ester aminolysis catalyzed by lipases or N-acyltransferases, and amidation of acids catalyzed by ligases alone or coupled with N-acyltransferases. Among these, the third approach has recently garnered increasing research interest due to the easier accessibility of carboxylic acids. However, similar with the chemical amide coupling reactions, these enzymatic amidation processes indispensably consume stoichiometric ATP as the coupling reagent and thus are also featured with low atom economy. Consequently, novel biocatalytic strategies with better atom economy such as the oxidative amidation strategy are highly attractive but remain largely unexplored.

[0004] Aldehyde dehydrogenase (ALDH) is a NAD (P) +-dependent superfamily of enzymes that oxidize structurally diverse aliphatic and aromatic aldehydes into acids. Mechanistically, the aldehyde dehydrogenase-catalyzed transformation involves a reaction cascade composing of hemi-thioacetal formation, NAD (P) +-dependent thioester formation and hydrolysis. Considering the high reactivity of the thioester intermediate formed in the active site of aldehyde dehydrogenases, we propose that replacement of water with amines in the final hydrolysis step (Figure 1) can empower ALDH with the ability to produce amides from aldehydes without the involvement of carboxylic acids and stoichiometric coupling reagents (e.g., ATP) . Here, we provided an application of the rationale-based protein engineering of aldehyde dehydrogenases into oxidative aminases and their applications in the synthesis of pharmaceuticals.Summary

[0005] The purpose of the present application is to provide the engineering of aldehyde dehydrogenase to oxidative aminase and use thereof in synthesizing amide bonds. Firstly, the present application provides a mutant of p-hydroxybenzaldehyde dehydrogenase (PHBDD) from Pseudomonas putida. These modified oxidative aminases may include an amino acid sequence with one or more residue differences compared to the sequence of SEQ ID No: 1 at the following residue positions: R166 and E259. Additionally, on the basis of these differences, the sequence may also include one or more insertions or deletions of amino acid residues. More specifically, in some embodiments, these modified oxidative aminases comprise polypeptides with amino acid sequences corresponding to SEQ ID No: 3, 5.

[0006] Specifically, the present application provides an oxidative aminase engineered from aldehyde dehydrogenase p-hydroxybenzaldehyde dehydrogenase (PHBDD) , which catalyzes a reaction between aldehydes and amines to produce amides, wherein the oxidative aminase includes amino acid sequences that differs from SEQ ID No: 1 by at least one amino acid residue at positions R166, E259. Preferably, the amino acid sequences are listed in SEQ ID Nos: 3 and 5.

[0007] Preferably, the reaction is carried out at an aldehyde substrate concentration of 1 to 50 mM, an amine substrate concentration of 10 mM to 2.0 M, an NADP+ concentration of 2 to 100 mM, a pH of 9.0 to 11.0, and a temperature of 20℃ to 40℃ for 2 to 16 hours.

[0008] Furthermore, the application provides a polynucleotide, wherein the polynucleotide encodes the oxidative aminase. In some embodiments, the polynucleotide may be part of an expression vector containing one or more control sequences for expressing a polypeptide of the oxidative aminases. In certain embodiments, the polynucleotide may include a sequence corresponding to the polynucleotide sequences as represented by SEQ ID No: 4, 6.

[0009] As known to a person skilled in the art, due to the degeneracy of nucleotide codons, polynucleotide sequences encoding the amino acid sequences of SEQ ID No: 3, 5 are not limited to SEQ ID No: 4, 6. The polynucleotide sequence of the oxidative aminases gene in the present application can also be any other polynucleotide sequence encoding the amino acid sequences as represented by SEQ ID No: 3, 5.

[0010] The application provides an expression vector comprising the polynucleotide mentioned above.

[0011] Preferably, the expression vector includes a plasmid, cosmid, bacteriophage, or viral vector.

[0012] The application provides a host cell comprising the expression vector. Preferably, the host cell is Escherichia coli (E. coli) .

[0013] The application provides a method for preparing the oxidative aminase, comprising the steps of culturing the host cell to obtain culture, and obtaining the oxidative aminase from the culture.

[0014] The application provides an oxidative aminase catalyst, wherein the catalyst is obtained from a host cell or culture containing the oxidative aminase, or a product processed from the oxidative aminase. Preferably, the product is and isolated product obtained by separating or purifying the oxidative aminase from an extract obtained from transformed cells.

[0015] The application provides a method for preparing a compound of structural formula (1) , the method comprises contacting an aldehyde substrate of structural formula (2) and an amine substrate of structural formula (3) with the oxidative aminase catalyst,

[0016] R1 is an optionally substituted aryl group, wherein the substitution groups are H, methyl, methoxyl, phenyl, halogens, nitrile, hydroxyl, formyl at para position, or halogens at ortho position; or a naphthalene group, or an azaindole group;

[0017] R2 is a hydrogen atom;

[0018] R3 is an optionally hydrogen, or alkyl containing 1 or 2 carbons, which optionally includes one heteroatom, preferably, the heteroatom is O.

[0019] Preferably, wherein the compound of structural formula (1) is:

[0020] Preferably, the aldehyde substrate of structural formula (2) is:

[0021] Preferably, the amine substrate of structural formula (3) is

[0022] Preferably, the compound of structural formula (1) is:

[0023] Preferably, the amine substrate of structur2l formula (3) is:

[0024] Preferably, the aldehyde substrate of structural formula (2) is

[0025] Secondly, the present application also provides a bio-material containing a gene encoding the claimed oxidative aminases, and the bio-material is an expression kit, a plasmid, a vector, a microorganism, an insect cell, an animal cell or a plant cell.

[0026] Preferably, when using microorganisms as hosts, any commercially available plasmid can be used as a vector, as long as it can be stably maintained within the bacterial cells. When Escherichia coli is used as the host, it is preferable to use the pET28a or pQlinkHx plasmids.

[0027] During the specific implementation process, the obtained gene (DNA fragment) can be linked downstream of a specific promoter sequence to induce expression of the target protein in E. coli. For example, pET28a has an inducible T7 promoter, and by adding isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) to the culture medium during mid-cultivation, E. coli can be induced to express PHBDD protein or its mutants. The cultivation of transformants is carried out using conventional methods. For example, when using bacteria such as Bacillus or E coli, the culture medium can be broth, LB medium (1%tryptone, 0.5%yeast extract, 0.5%sodium chloride) , or 2×YT medium (1.6%tryptone, 0.8%yeast extract, 0.5%sodium chloride) . After inoculating the strain into the medium, it can be cultured at 37℃ with stirring for 4-8 hours, as needed. Subsequently, 0.1-1 mM IPTG is added, and the culture is continued with stirring at 18℃ or 37℃ for 12-20 hours, as needed. The resulting culture is then centrifuged, and the microbial cells are collected.

[0028] Further, the microbial cells can be disrupted using known methods such as mechanical disruption (using a rotary stirrer, French press, homogenizer, mortar, etc. ) , freeze-thaw, autolysis, drying (freeze-drying, air-drying, etc. ) , enzymatic treatment (using lysozyme, etc. ) , ultrasonic treatment, or chemical treatment (acid or alkaline treatment, etc. ) . The resulting cell debris, denatured cell wall or cell membrane, or other processed cell materials can be used as a crude enzyme solution for the synthesis of amide compounds.

[0029] Additionally, depending on the situation, the active component with amide-forming activity can be purified from the cell material using conventional enzyme purification methods (salting out, isoelectric precipitation, organic solvent precipitation, dialysis, various chromatography methods, etc. ) to prepare partially purified or purified enzymes for use. The enzyme added to the reaction system, as long as it has the required activity, can be in any form, including microbial cells (including transformants) , cell preparations, or enzymes derived from these preparations. Preferably, for preparative-scale synthesis, the wet cells containing the enzyme, obtained by centrifugation, are used directly.

[0030] Thirdly, the present application provides the application of any of the aforementioned mutants, nucleic acids, or biological materials in the synthesis of amide compounds using aldehydes and amines as substrates. For preparative-scale synthesis of amide compounds, the preferred initial concentration of the aldehyde is 5-50 mM, more preferably 20-50 mM. The preferred initial equivalent of NADP sodium salt is 1-2 equivalents, more preferably 1.5 equivalents. The preferred initial equivalent of amine is 100-1000 equivalents, more preferably 100 equivalents. The preferred amounts of wet cells used is 0.5-2 g, more preferably 1, 1.5, or 2 g. The preferred reaction conditions are a pH of 7-11, more preferably 10-11. The preferred cosolvents are methanol and dimethyl sulfoxide, with methanol being more preferred. The preferred temperature is 35℃-40℃, more preferably 37℃. The reaction is preferably carried out in a shaker for 0.5-16 hours. The enzyme used is preferably PHBDD-ML (SEQ ID No: 5) .

[0031] The specific implementation steps are as follows: Suspend wet E. coli overexpressing PHBDD-ML (SEQ ID No: 5) (1.0 g) in CAPS buffer (5.0 mL, 0.2 M, pH 11) . Sequentially add NADP sodium salt (115 mg, 0.15 mmol, 1.5 eq. ) , amine (100, 200, 500, 1000 eq. ) , and 0.10 mmol aldehyde (1.0 eq., dissolved in 0.5 mL methanol) to the suspension. After incubating the reaction mixture at 37℃ and 220 rpm for 4 hours, add saturated NaCl (aq) (5 mL) and ethyl acetate (20 mL) , and shake thoroughly to lyse the cells. Then, centrifuge the mixture at 3,000 × g for 15 minutes, and extract the aqueous layer with ethyl acetate (2 × 20 mL) . Combine the organic layers, wash with saturated NaCl (10 mL) , dry over anhydrous Na2SO4, and concentrate under reduced pressure to obtain the crude product. The crude product is further purified by column chromatography using a petroleum ether / ethyl acetate system to obtain the desired amide product.Brief Description of the Drawings

[0032] Figure 1 shows the traditional chemical and enzymatic strategies for amide bond formation and our proposed new-to-nature oxidative amidation strategy using aldehyde dehydrogenase (ALDH) .

[0033] Figure 2 shows the protein electrophoresis image of PHBDD from Example 1 of the present application.

[0034] Figure 3 shows amide-forming reactivity of PHBDD using ammonia from Example 1 of the present application.

[0035] Figure 4 shows enzymatic reaction screening results of PHBDD and its first-generation mutants from Example 2 of the present application.

[0036] Figure 5 shows enzymatic reaction screening results of PHBDD and its second-generation mutants from Example 2 of the present application.

[0037] Figure 6 shows relative activity of PHBDD-ML at different pH levels from Example 3 of the present application.

[0038] Figure 7 shows relative activity of PHBDD-ML at different temperatures from Example 3 of the present application.

[0039] Figure 8 shows conversion rates of different aldehyde and amine substrates with PHBDD-ML.

[0040] Specific Modes for Carrying Out the Embodiments

[0041] The following embodiments give a detailed and specific description of the present application, but it should be understood that the present application is not limited to the following examples. Unless otherwise specified, the reagents and raw materials used in the following embodiments are commercially available. The strains, vectors, culture media and reagents used in the following embodiments are mainly as follows:

[0042] The modulation of DNA in the examples, the use of restriction enzyme digestion, and the transformation methods with E. coli are all performed according to the procedures outlined in "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition" (Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989) . All chemicals and reagents were purchased from commercial suppliers (Sigma-Aldrich, J&K, Alfa Aesar Chemicals, TCI, etc. ) and used without further purification unless otherwise stated. Analytical thin-layer chromatography was performed using 0.25 mm silica gel 60-F plates, using 254 / 365 nm UV light as the visualizing agent. Flash column chromatography was performed using 200-300 mesh silica gel. Yields refer to chromatographically and spectroscopically pure materials unless otherwise stated. NMR spectra were recorded on a Bruker 400 MHz NMR spectrometer (AVANCE III) or a Bruker 500 MHz NMR spectrometer (AVANCE III) at ambient temperature with acetone-d6, DMSO-d6, methanol-d4 or D2O as the solvent unless otherwise stated. Chemical shifts are reported in parts per million (ppm) , relative to acetone-d6 (1H, δ 2.05; 13C, δ 29.84) , DMSO-d6 (1H, δ 2.50; 13C, δ 39.52) , methanol-d4 (1H, δ 3.31; 13C, δ 49.03) or D2O (1H, δ 4.80) . Data for 1H NMR are reported as follows: chemical shift, multiplicity, coupling constant, integration. High-resolution mass spectrometry (HRMS) was recorded on a Q-TOF (AB SCIEX X500R with ESI source, and Agilent 7250 with EI source) , which combines quadrupole precursor ion selection and a high-resolution accurate-mass (HR / AM) Time of Flight (TOF) mass analyzer to deliver mass accuracy. Ultraperformance liquid chromatography (UPLC)  / mass spectrometry (MS) analysis was performed on an ACQUITY UPLC H-class system (Waters) coupled with an SQ Detector 2 equipped with an electrospray ionization source. All the UPLC / MS analysis was conducted on an ACQUITY UPLC BEN C18 column (length, 50 mm; inner diameter, 2.1 mm; particle size, 1.7 μm; Waters) at a flow rate of 0.3 mL / min at 40℃. The gradient elution consists of 0.1%formic acid-H2O (A) and MeCN (B) . The gradient programs were 5-20%B, 0-2 min, 20-45%B, 2-3 min, 45-100%B, 3-7 min.

[0043] Example 1: Obtaining PHBDD mutants

[0044] 1. Construction of plasmid pQlinkHx-PHBDD

[0045] The gene of wild-type PHBDD was inserted into vector pQlinkHx. The linear pQlinkHx vector was obtained via PCR using the primers pQlinkHx-F and pQlinkHx-R, and with empty pQlinkHx vector as the template. The gene of wild-type PHBDD was amplified by PCR with TransStart FastPfu DNA polymerase (Transgene Biotech) using primers pQlinkHx-PHBDD-F / R and the synthesized PHBDD gene (as represented by SEQ ID No: 2) as the template. The specific steps are as follows:

[0046] Reaction system:

[0047] Procedure of PCR

[0048] The primers sequences were shown in the following:

[0049] pQlinkHx-F:

[0050] pQlinkHx-R:

[0051] pQlinkHx-PHBDD-F:

[0052] pQlinkHx-PHBDD-R:

[0053] The linear vector and gene fragment of PHBDD were extracted from gels using gel extraction kit. After that, the resulting gene fragment was inserted into the linear vector using ClonExpress II One Step Cloning Kit (Vazyme Biotech) following standard protocols.

[0054] Standard reaction system:

[0055] The resulting reaction mixture was transformed into E. coli MC1061 and incubated overnight at 37℃. The clones grown in the plate were picked for DNA sequencing and the correct clones were cultured and stored at -80℃.

[0056] 2. Construction of PHBDD variants

[0057] The DNA fragments containing site mutations were amplified via PCR using TransStart FastPfu DNA polymerase (Transgene Biotech) with plasmid pQlinkHx-PHBDD as the template, primers pQlinkHx-Down-R and corresponding forward primer as primers following the protocols:

[0058] Reaction system:

[0059] Procedure of PCR

[0060] The fragments were extracted and followed by MEGAWHOP PCR to construct plasmids containing PHBDD variants. The protocol for MEGAWHOP PCR as following procedure:

[0061] Reaction system:

[0062] Procedure of PCR

[0063] The resulting reaction mixtures were then digested using Dpn I at 37℃ for 4 hours. After that, the digestion products were transformed into E. coli MC1061 and incubated overnight at 37℃. The clones grown in the plate were picked for DNA sequencing and the correct clones were cultured and stored at -80℃ for further use.

[0064] Example 2: Expression, purification, and activity testing of PHBDD and its Mutants

[0065] 1. Expression and purification of PHBDD and its mutants

[0066] The E. coli MC1061 strain containing pQlinkHx-PHBDD and the PHBDD mutants prepared in Example 1 was inoculated into liquid LB medium. Subsequently, 20 mL of this culture was transferred to 1 L of LB medium containing 100 μg / mL ampicillin. The culture was grown at 37℃ with shaking at 220 rpm until the OD of the culture reached 0.8-1.0. After cooling to 18℃ for 1 hour, IPTG was added to a final concentration of 0.5 mM to induce expression for 18-20 hours.

[0067] After cultivation, the cells were collected by centrifugation (5000 × g, 20 minutes) and resuspended in 25 mL lysis buffer (20 mM NaH2PO4-Na2HPO4, 0.2 mM NaCl, pH 8.0) . The cells were then disrupted using ultrasonic treatment (500 W, 30%power, 5 seconds on, 5 seconds off, for a total of 20 minutes) . The cell debris was removed by centrifugation (15,000 rpm, 1 hour) , and the supernatant was filtered through a 0.22 μm membrane to obtain the crude enzyme solution.

[0068] The crude enzyme solution was applied to a gravity nickel column that had been equilibrated with 5 column volumes of lysis buffer. The crude enzyme solution was slowly added to the column to allow it to pass through gradually. Proteins were washed with wash buffer (20 mM Tris-HCl, 0.2 mM NaCl, 40 mM imidazole, pH 8.0) , and the target protein was eluted with elution buffer (20 mM Tris-HCl, 0.2 mM NaCl, 300 mM imidazole, pH 8.0) . The expression level of PHBDD and its mutants in E. coli reached up to 120 mg / L. The eluted target protein was concentrated to a volume of 1-2 mL using a 30 kDa ultrafiltration membrane.

[0069] The concentrated protein sample was further purified using a Superdex S200 molecular sieve column equilibrated with buffer (20 mM Tris-HCl, 0.2 mM NaCl, pH 8.0) using an Akta system. After collecting the target protein fractions, the protein was concentrated to 15 mg / mL using a 30 kDa ultrafiltration membrane. A 10 μL aliquot of the purified protein was mixed with 3 μL of 5× protein loading buffer, heated at 100℃ for 5 minutes, and analyzed by 10%SDS-PAGE. The gel was stained with Coomassie Brilliant Blue. The protein band appeared to be approximately 45 kDa, as shown in Figure 2.

[0070] 2. Activity tests of wild type PHBDD

[0071] Add 1 μL of a DMSO solution of p-methylbenzaldehyde (final concentration 1 mM) and 2 μL of NADP+ (final concentration 2 mM) to 100 μL of reaction buffer (1 M NH3 / NH4Cl, pH = 5, 7, or 10) . Then add 7 μL of PHBDD protein (final concentration 1 mg / mL) . After reacting at 37℃ for 12 hours, quench the reaction by adding 200 μL of methanol. After centrifugation at 15,000 rpm for 10 minutes, analyze the sample using UPLC-MS.

[0072] The UPLC-MS analysis results, as shown in Figure 3, indicate that the wild-type aldehyde dehydrogenase PHBDD not only produced p-methylbenzoic acid under the conditions of 1 M NH3 / NH4Cl, pH = 10, but also detected the formation of p-toluamide. This result suggests the potential feasibility of modifying PHBDD into an oxidative aminase.

[0073] 3. Activity screening of PHBDD mutants

[0074] Inoculate 3 mL of liquid LB medium (containing 100 μg / mL ampicillin) with glycerol stocks of PHBDD and its mutants, and incubate at 37℃ with 220 rpm for about 10 hours. Then transfer the entire 3 mL overnight culture to 15 mL of liquid LB medium (containing 100 μg / mL ampicillin and 0.5 mM IPTG) , and incubate overnight at 37℃ with 220 rpm. Next, centrifuge at 4℃ and 4,000 rpm for 10 minutes, collect the cells, and discard the supernatant. Resuspend the cells in 1 mL of Buffer 1 (1.0 M NH4Cl-NH3, pH = 10.0) or Buffer 2 (1.0 M EtNH2 / EtNH3Cl, pH = 10.0) . Transfer 200 μL of the suspension to a 2 mL EP tube. Add 4 μL of 0.1 M NADP+ (final concentration 2 mM) and 2 μL of a 0.1 M DMSO solution of p-methylbenzaldehyde (final concentration 1 mM) to the tube. Incubate the reaction mixture at 37℃ with 220 rpm for approximately 12 hours. After the reaction, add 400 μL of anhydrous methanol to quench the reaction and filter through a 0.22 μm membrane before submitting the sample for UPLC-MS analysis.

[0075] The UPLC-MS analysis results, shown in Figure 4, indicate that among the first-generation mutants from the saturation mutagenesis library based on wild-type PHBDD, the E259N mutant exhibited the highest activity for the reaction with ammonia to produce p-toluamide. As shown in Figure 5, in the second-generation mutant screening of E259-R166, the R166M-E259L mutant showed the best activity for the reaction with ethylamine to produce N-ethyl-4-methylbenzamide.

[0076] Example 3: Optimal pH and temperature testing for PHBDD-R166M-E259L (PHBDD-ML)

[0077] 1. Optimal pH

[0078] To examine the effect of different pH buffer solutions on the catalysis of the amide formation reaction by PHBDD-ML, use p-methoxybenzaldehyde and ethylamine as substrates. The pH range tested includes: 7.0-9.0 (100 mM Tris-HCl buffer) , 10.0-11.0 (100 mM CAPS buffer) , and 11.5-12.0 (sodium hydrogen phosphate-sodium hydroxide buffer) . In each buffer solution, containing 2 mM p-methoxybenzaldehyde, 400 mM ethylamine, and 1 mg / mL PHBDD-ML-L163G, the reaction volume is 100 μL and the reaction time is 1 hour at 30℃. After the reaction, add 200 μL of methanol to stop the reaction, vortex to mix, and centrifuge at 20,000 g for 30 minutes. Collect the supernatant and analyze using UPLC. Perform three parallel reactions for each condition. The relative activity of the enzyme is calculated based on the peak area of the product, and the optimal pH for PHBDD-ML is determined, as shown in Figure 6. Figure 6 indicates that the optimal pH is 11.0.

[0079] 2. Optimal temperature

[0080] To assess the effect of different reaction temperatures (20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, and 65℃) on the catalysis of the amide formation reaction by PHBDD-ML, use p-methoxybenzaldehyde and ethylamine as substrates. The reaction system (100 mM CAPS, pH = 10.0) contains 2 mM p-methoxybenzaldehyde, 400 mM ethylamine, and 1 mg / mL PHBDD-ML with a reaction volume of 100 μL and a reaction time of 2 hours. After the reaction, add 200 μL of methanol to stop the reaction, vortex to mix, and centrifuge at 20,000 g for 15 minutes. Collect the supernatant and analyze using UPLC-MS. Perform three parallel reactions for each condition. The relative activity of the enzyme is calculated based on the peak area of the product, and the optimal reaction temperature for PHBDD-ML is determined, as shown in Figure 7. Figure 7 indicates that the optimal reaction temperature is between 35-40℃.

[0081] Example 4: Substrate scope expansion and preparative-scale reactions

[0082] As shown in Figure 8, the conversion rate of different aldehydes and amines at 0.1 μmol scale were determined by UPLC-MS. Several representative examples were chosen for preparative-scale reactions, in which the wet E. coli overexpressing PHBDD-ML was used in amounts of 1.0-1.5 g, with 0.1 mmol of aldehyde, 0.15 mmol of NADP sodium salt, and 10-20 mmol of amines. The buffer solution was 0.2 M CAPS (pH = 11) , and the reaction took place at 37℃, shaking at 220 rpm for 2-6 hours. The target products were purified via column chromatography, and the yields were reported as isolated yields.

[0083] 1. Synthesis of N-ethyl-4-methylbenzamide

[0084] E. coli cells overexpressing PHBDD-ML (1.0 g) were suspended in CAPS buffer (0.2 M, pH 11, 5.0 mL) . NADP sodium salt (115 mg, 0.15 mmol, 1.5 eq. ) , EtNH2 (700 mg, 65%wt in H2O, 10.0 mmol, 100 eq. ) , and aldehyde (0.10 mmol, 1.0 eq., dissolved in 0.5 mL MeOH) were sequentially added to the suspension. The reaction mixture was incubated at 37℃ and 220 rpm for 6 hours. Saturated NaCl (5 mL) and EtOAc (20 mL) were added to the reaction mixture, which was then thoroughly shaken to lyse the cells. The mixture was then centrifuged at 3000 × g for 15 minutes, and the aqueous layer was further extracted with EtOAc (2 × 20 mL) . The combined organic layers were washed with saturated NaCl (10 mL) , dried over anhydrous Na2SO4 and concentrated under reduced pressure to afford the crude product, which was further purified by flash column chromatography using petroleum ether / EtOAc system to yield the pure product as white solid with a yield of 50% (8.2 mg) .

[0085] 1H NMR (400 MHz, Acetone-d6) δ 7.81 –7.74 (m, 2H) , 7.64 (brs, 1H) , 7.24 (d, J = 8.0 Hz, 2H) , 3.40 (qd, J = 7.2, 5.6 Hz, 2H) , 2.36 (s, 3H) , 1.17 (t, J = 7.2 Hz, 3H) .

[0086] 13C NMR (101 MHz, Acetone-d6) δ 166.93, 141.88, 133.44, 129.64, 127.94, 35.10, 21.29, 15.26.

[0087] HRMS (ESI) m / z: [M + H] + calculated for C10H13NO: 164.1070, found: 164.1069.

[0088] TLC Rf = 0.4 (petroleum ether / EtOAc 2: 1) .

[0089] 2. Synthesis of N-ethyl-4-formyl-3-methylbenzamide

[0090] E. coli cells overexpressing PHBDD-ML (1.5 g) were suspended in CAPS buffer (0.2 M, pH 11, 5.0 mL) . NADP sodium salt (115 mg, 0.15 mmol, 1.5 eq. ) , EtNH2 (700 mg, 65%wt in H2O, 10.0 mmol, 100 eq. ) , and aldehyde (0.10 mmol, 1.0 eq., dissolved in 0.5 mL MeOH) were sequentially added to the suspension. The reaction mixture was incubated at 37℃ and 220 rpm for 6 hours. Saturated NaCl (5 mL) and EtOAc (20 mL) were added to the reaction mixture, which was then thoroughly shaken to lyse the cells. The mixture was then centrifuged at 3000 × g for 15 minutes, and the aqueous layer was further extracted with EtOAc (2 × 20 mL) . The combined organic layers were washed with saturated NaCl (10 mL) , dried over anhydrous Na2SO4 and concentrated under reduced pressure to afford the crude product, which was further purified by flash column chromatography using petroleum ether / EtOAc system to yield the pure product as white solid with a yield of 45% (8.6 mg) .

[0091] 1H NMR (400 MHz, Acetone-d6) δ 10.34 (s, 1H) , 8.07 –7.66 (m, 4H) , 3.43 (qd, J = 7.3, 5.6 Hz, 2H) , 2.69 (s, 3H) , 1.20 (t, J = 7.2 Hz, 3H) .

[0092] 13C NMR (101 MHz, Acetone-d6) δ 193.00, 166.24, 141.22, 140.25, 136.76, 132.22, 131.31, 125.78, 35.33, 19.45, 15.09.

[0093] HRMS (ESI) m / z: [M + H] + calculated for C11H13NO2: 192.1019, found: 192.1017.

[0094] TLC Rf = 0.2 (petroleum ether / EtOAc 2: 1) .

[0095] 3. Synthesis of N-ethyl- [1, 1'-biphenyl] -4-carboxamide

[0096] E. coli cells overexpressing PHBDD-ML (1.0 g) were suspended in CAPS buffer (0.2 M, pH 11, 5.0 mL) . NADP sodium salt (115 mg, 0.15 mmol, 1.5 eq. ) , EtNH2 (700 mg, 65%wt in H2O, 10 mmol, 100 eq. ) , and aldehyde (0.10 mmol, 1.0 eq., dissolved in 0.5 mL MeOH) were sequentially added to the suspension. The mixture was incubated at 37℃ and 220 rpm for 6 hours. Saturated NaCl (5 mL) and EtOAc (20 mL) were added to the reaction mixture, which was then thoroughly shaken to lyse the cells. The mixture was then centrifuged at 3000 × g for 15 minutes, and the aqueous layer was further extracted with EtOAc (2 × 20 mL) . The combined organic layers were washed with saturated NaCl (10 mL) , dried over anhydrous Na2SO4 and concentrated under reduced pressure to afford the crude product, which was further purified by flash column chromatography using petroleum ether / EtOAc system to yield the pure product as white solid with a yield of 47% (10.6 mg) .

[0097] 1H NMR (400 MHz, Acetone-d6) δ 8.02 –7.94 (m, 2H) , 7.78 (brs, 1H) , 7.75 –7.66 (m, 4H) , 7.53 –7.44 (m, 2H) , 7.44 –7.35 (m, 1H) , 3.44 (qd, J = 7.2, 5.6 Hz, 2H) , 1.21 (t, J = 7.2 Hz, 3H) .

[0098] 13C NMR (101 MHz, Acetone-d6) δ 166.72, 144.26, 140.93, 135.01, 129.83, 128.74, 128.57, 127.86, 127.55, 35.22, 15.24.

[0099] HRMS (ESI) m / z: [M + H] + calculated for C15H15NO: 226.1227, found: 226.1223.

[0100] TLC Rf = (petroleum ether / EtOAc 2: 1) .

[0101] 4. Synthesis of 5-chloro-N-ethylpicolinamide

[0102] E. coli cells overexpressing PHBDD-ML (1.0 g) were suspended in CAPS buffer (0.2 M, pH 11, 5.0 mL) . NADP sodium salt (115 mg, 0.15 mmol, 1.5 eq. ) , EtNH2 (700 mg, 65%wt in H2O, 10 mmol, 100 eq. ) , and 5-chloropicolinaldehyde (0.10 mmol, 1.0 eq., dissolved in 0.5 mL MeOH) were sequentially added to the suspension. The reaction mixture was incubated at 37℃ and 220 rpm for 6 hours. Saturated NaCl (5 mL) and EtOAc (20 mL) were added to the reaction mixture, which was then thoroughly shaken to lyse the cells. The mixture was then centrifuged at 3,000 × g for 15 minutes, and the aqueous layer was further extracted with EtOAc (2 × 20 mL) . The combined organic layers were washed with saturated NaCl (10 mL) , dried over anhydrous Na2SO4 and concentrated under reduced pressure to afford the crude product, which was further purified by flash column chromatography using petroleum ether / EtOAc system to yield the pure product as white solid with a yield of 30% (5.5 mg) .

[0103] 1H NMR (400 MHz, Acetone-d6) δ 8.57 (d, J = 2.0 Hz, 1H) , 8.32 (brs, 1H) , 8.14 –8.10 (m, 1H) , 8.03 (dd, J = 8.4, 2.4 Hz, 1H) , 3.46 (qd, J = 7.2, 6.1 Hz, 2H) , 1.21 (t, J = 7.2 Hz, 3H) .

[0104] 13C NMR (101 MHz, Acetone-d6) δ 163.55, 149.96, 147.85, 138.09, 135.08, 124.02, 34.79, 15.24.

[0105] HRMS (ESI) m / z: [M + H] + calculated for C8H9ClN2O: 185.0476, found: 185.0477.

[0106] TLC Rf = 0.6 (petroleum ether / EtOAc 2: 1) .

[0107] 5. Synthesis of 5-chloropicolinamide

[0108] E. coli cells overexpressing PHBDD-ML (1.0 g) were suspended in CAPS buffer (0.2 M, pH 11, 5.0 mL) . NADP sodium salt (115 mg, 0.15 mmol, 1.5 eq. ) , ammonia (28%wt in H2O, 10 mmol, 100 eq. ) , and 5-chloropicolinaldehyde (0.10 mmol, 1.0 eq., dissolved in 0.5 mL MeOH) were sequentially added to the suspension. The mixture was incubated at 37 ℃ and 220 rpm for 6 hours. Saturated NaCl (5 mL) and EtOAc (20 mL) were added to the reaction mixture, which was then thoroughly shaken to lyse the cells. The mixture was then centrifuged at 3000 × g for 15 minutes, and the aqueous layer was further extracted with EtOAc (2 × 20 mL) . The combined organic layers were washed with saturated NaCl (10 mL) , dried over anhydrous Na2SO4 and concentrated under reduced pressure to afford the crude product, which was further purified by flash column chromatography using petroleum ether / EtOAc system to yield the pure product as white solid with a yield of 78% (12.2 mg) .

[0109] 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.67 (d, J = 2.3 Hz, 1H) , 8.13 (brs, 1H) , 8.10 (dd, J =8.4, 2.4 Hz, 1H) , 8.04 (d, J = 8.4 Hz, 1H) , 7.73 (brs, 1H) .

[0110] 13C NMR (101 MHz, DMSO-d6) δ 165.13, 148.87, 147.06, 137.41, 133.86, 123.46.

[0111] HRMS (ESI) m / z: [M + H] + calculated for C6H5ClN2O: 157.0163, found: 157.0166.

[0112] TLC Rf = 0.25 (petroleum ether / EtOAc 2: 1) .

[0113] 6. Synthesis of 5-chloro-N- (2-hydroxyethyl) picolinamide

[0114] E. coli cells overexpressing PHBDD-ML (1.0 g) were suspended in CAPS buffer (0.2 M, pH 11, 5.0 mL) . NADP sodium salt (115 mg, 0.15 mmol, 1.5 eq. ) , ethanolamine (10 mmol, 100 eq. ) , and 5-chloropicolinaldehyde (0.10 mmol, 1.0 eq., dissolved in 0.5 mL MeOH) were sequentially added to the suspension. The reaction mixture was incubated at 37℃ and 220 rpm for 6 hours. Saturated NaCl (5 mL) and EtOAc (20 mL) were added to the reaction mixture, which was then thoroughly shaken to lyse the cells. The mixture was then centrifuged at 3000 × g for 15 minutes, and the aqueous layer was further extracted with EtOAc (2 × 20 mL) . The combined organic layers were washed with saturated NaCl (10 mL) , dried over anhydrous Na2SO4 and concentrated under reduced pressure to afford the crude product, which was further purified by flash column chromatography using petroleum ether / EtOAc system to yield the pure product as white solid with a yield of 20% (4.1 mg) .

[0115] 1H NMR (400 MHz, Acetone-d6) δ 8.63 –8.57 (m, 1H) , 8.41 (brs, 1H) , 8.14 –8.10 (m, 1H) , 8.05 (dd, J = 8.4, 2.4 Hz, 1H) , 4.04 (t, J = 5.4 Hz, 1H) , 3.73 (q, J = 5.5 Hz, 2H) , 3.55 (q, J = 5.7 Hz, 2H) .

[0116] 13C NMR (101 MHz, Acetone-d6) δ 164.03, 149.72, 147.95, 138.17, 135.23, 124.07, 61.64, 61.51, 42.84, 42.81.

[0117] HRMS (ESI) m / z: [M + H] + calculated for C8H9ClN2O2: 201.0426, found: 201.0421.

[0118] TLC Rf = 0.12 (petroleum ether / EtOAc 2: 1) .Industrial applicability

[0119] This application belongs to the field of biocatalysis, specifically relating to an engineered aldehyde dehydrogenase for the preparation of amide compounds and use thereof. The engineered aldehyde dehydrogenase provided by this application uses aldehydes and amines as substrates and can efficiently catalyze the formation of amide bonds. The application offers an oxidative aminase, developed through the engineering of aldehyde dehydrogenase, which exhibits high catalytic activity and broad substrate recognition. This provides a new approach to the synthesis of amide bonds in medicinal chemistry, being greener and more environmentally friendly compared to traditional chemical coupling reagents, and holds potential for industrial-scale production. The engineered aldehyde dehydrogenase for the preparation of amide compounds of the present application has good economic value and application prospects.

Claims

1.An oxidative aminase engineered from aldehyde dehydrogenase p-hydroxybenzaldehyde dehydrogenase (PHBDD) , which catalyzes a reaction between aldehydes and amines to produce amides, wherein the oxidative aminase includes amino acid sequences that differs from SEQ ID No: 1 by at least one amino acid residue at positions R166, E259; preferably, the amino acid sequences are listed in SEQ ID Nos: 3 and 5.2.The oxidative aminase according to claim 1, wherein the reaction is carried out at an aldehyde substrate concentration of 1 to 50 mM, an amine substrate concentration of 10 mM to 2.0 M, an NADP+ concentration of 2 to 100 mM, a pH of 9.0 to 11.0, and a temperature of 20℃ to 40℃ for 2 to 16 hours.3.A polynucleotide, wherein the polynucleotide encodes the oxidative aminase according to claim 1.4.The polynucleotide according to claim 4, wherein the polynucleotide has the sequences of SEQ ID Nos: 4 and 6.5.An expression vector comprising the polynucleotide according to any one of claims 3 to 4.6.The expression vector according to claim 5, wherein the expression vector includes a plasmid, cosmid, bacteriophage, or viral vector.7.A host cell comprising the expression vector according to any one of claims 5 to 6, wherein the host cell is preferably Escherichia coli (E. coli) .8.A method for preparing the oxidative aminase according to any one of claims 1 to 2, comprising the steps of culturing the host cell according to claim 7 to obtain culture, and obtaining the oxidative aminase from the culture.9.An oxidative aminase catalyst, wherein the catalyst is obtained from a host cell or culture containing the oxidative aminase prepared by the method of claim 8, or a product processed from the oxidative aminase prepared by the method of claim 8; wherein the product is and isolated product obtained by separating or purifying the oxidative aminase from an extract obtained from transformed cells.10.A method for preparing a compound of structural formula (1) , the method comprises contacting an aldehyde substrate of structural formula (2) and an amine substrate of structural formula (3) with the oxidative aminase catalyst according to claim 9, R1 is an optionally substituted aryl group, wherein the substitution groups are H, methyl, methoxyl, phenyl, halogens, nitrile, hydroxyl, formyl at para position, or halogens at ortho position; or a naphthalene group, or an azaindole group;R2 is a hydrogen atom;R3 is an optionally hydrogen, or alkyl containing 1 or 2 carbons, which optionally includes one heteroatom, preferably, the heteroatom is O.11.The method according to claim 10, wherein the compound of structural formula (1) is: the aldehyde substrate of structural formula (2) is:andthe amine substrate of structural formula (3) is12.The method according to claim 10, wherein the compound of structural formula (1) is: the amine substrate of structur2l formula (3) is:andthe aldehyde substrate of structural formula (2) is

Images