A chemoenzymatic route for synthesizing 2, 5-furandicarboxylic acid

Abstract

Provided is a method for synthesizing 2, 5-furandicarboxylic acid (FDCA) using low-cost and readily available C6 aldonic acids as the starting materials. Firstly, two precursors for synthesis of 2, 5-furandicarboxylic acid, namely C6 aldaric acid and 4-deoxy-5-dehydro-aldaric acid, are obtained through enzyme-catalyzed reactions. Subsequently, 4-deoxy-5-dehydro-aldaric acid undergoes dehydration under acidic conditions to afford 2, 5-furandicarboxylic acid (FDCA).

Description

A Chemoenzymatic Route for Synthesizing 2, 5-Furandicarboxylic AcidTechnical Field

[0001] The present invention relates to the chemoenzymatic synthesis of 2, 5-furandicarboxylic acid (FDCA) , and in particular to the application of engineered galactose oxidase, uronate dehydrogenase, and glucarate dehydratase in the synthesis of 2, 5-furandicarboxylic acid.

[0002] Background technology

[0003] 2, 5-furandicarboxylic acid (FDCA) is a monomer with unique properties for constructing polymers such as resins. It is regarded as a green alternative to terephthalic acid (the main compound currently used in polymer and resin manufacturing) . Over the past two decades, although significant progress has been made in FDCA synthesis technologies, its industrial-scale production still faces numerous challenges, resulting in high costs and hindering large-scale application.

[0004] The current mainstream route for FDCA production involves the dehydration of fructose to produce 5-hydroxymethylfurfural (HMF) , followed by the catalytic oxidation of HMF to form FDCA. However, this route has issues such as poor HMF stability, inadequate selectivity and stability of catalysts, and the need for neutralization steps. These problems lead to low overall yield, high impurity content, and complex purification processes.

[0005] In addition to the FDCA synthesis route using HMF (and its derivatives) derived from fructose, FDCA can also be prepared via the dehydration and cyclization of C6 aldaric acids (e.g., galactaric acid, glucaric acid, mannaroic acid) .

[0006] Glucaric acid exhibits excellent stability and can be dehydrated to form FDCA under acid-catalyzed conditions (J. Kim et al., Biomass and Bioenergy, 181 (2024) , 107049) . However, there are still problems with the solvent choice, acid catalysts and process conditions utilized in the current reaction process, resulting in equipment corrosion and environmental issues. Furthermore, 4-deoxy-5-dehydroglucaric acid (DDG) -formed by the dehydration of glucaric acid-is one of the precursors for FDCA synthesis. Compared with glucaric acid, DDG offers advantages for FDCA synthesis, including a shorter reaction pathway and fewer impurities.

[0007] Currently, the preparation of glucaric acid also faces many challenges. The main methods for glucaric acid synthesis are microbial fermentation and chemical oxidation. Chemical oxidation typically requires harsh reaction conditions such as the reaction of strong oxidants like nitric acid under high temperature and high pressure. The chemical oxidation method exhibits low reaction selectivity, yields a considerable amount of by-products, and the separation and purification of the compounds also constitute a major challenge. For microbial fermentation method, due to the acidity of glucaric acid, the fermentation product, the pH of the fermentation system decreases during the fermentation process, limiting the yield of glucaric acid.

[0008] Content of the Invention

[0009] The present invention aims to obtain two precursors for FDCA synthesis-C6 aldaric acids and 4-deoxy-5-dehydro-aldaric acid -via enzyme-catalyzed reactions using low-cost and readily available C6 aldonic acids as starting materials. The synthesis route of C6 aldaric acids is shown in Figure 1: C6 aldonic acids are converted to C6 uronic acids in the first enzymatic step, and then C6 uronic acids are converted to C6 aldaric acids in the second enzymatic step

[0010] The C6 aldonic acid raw materials can be gluconic acid, galactonic acid, mannonic acid, allonic acid, iduronic acid, etc.

[0011] In particular, the present invention uses gluconic acid as the starting material to synthesize glucaric acid, with the specific process involving two steps (Reaction A and Reaction B) as shown in Figure 2.

[0012] Reaction A is an enzymatic reaction in which gluconic acid is converted to L-guluronic acid by oxidases in the presence of oxygen. Oxidases capable of catalyzing Reaction A are diverse, such as L-lactate oxidase (EC 1.1.3.2) , Glucose oxidase (EC 1.1.3.4) , Hexose oxidase (EC 1.1.3.5) , L-gulonolactone oxidase (EC 1.1.3.8) , Galactose oxidase (EC 1.1.3.9) , Pyranose oxidase (EC 1.1.3.10) , L-sorbose oxidase (EC 1.1.3.11) , Alcohol oxidase (EC 1.1.3.13) , N-acylhexosamine oxidase (EC 1.1.3.29) , Polyvinyl alcohol oxidase (EC 1.1.3.30) , D-arabinose-1, 4-lactone oxidase (EC 1.1.3.37) , D-mannitol oxidase (EC 1.1.3.40) , Alditol oxidase (EC 1.1.3.41) , 5-hydroxymethylfurfural oxidase (EC 1.1.3.47) , 3-deoxy-α-D-manno-octulosonic acid (octulosonate) -8-oxidase (EC 1.1.3.48) . More specifically, the oxidase catalyzing Reaction A is a galactose oxidase variant. This variant has been engineered to exhibit oxidase activity for oxidizing the 6-position hydroxyl group of gluconic acid, thereby producing L-guluronic acid (the precursor for glucaric acid) . The active site of galactose oxidase consists of two histidine residues, one tyrosine residue, one cross-linked cysteine-tyrosine unit, and a single coordinated copper ion. Thus, copper ions are required for the reaction to exhibit catalytic activity; during the reaction, some copper ions at the enzyme's active center exist in a semi-reduced state, resulting in the loss of enzyme’s oxidative activity. In this application, horseradish peroxidase (HRP, EC 1.11.1.7) , acting as an activator of galactose oxidase, oxidizes the semi-reduced form of copper ions via 1e- oxidation to restore its catalytic activity. The hydrogen peroxide (H2O2) generated during the reaction is decomposed by catalase (EC 1.11.1.6) to avoid its harmful effect on the enzymes.

[0013] Reaction B is also an oxidation reaction, where L-guluronic acid is oxidized to D-glucaric acid. Catalysts for Reaction B can be either metal catalysts (e.g., Au, Pt, Pd, Ru, Rh, Ir) or enzymes. Enzymes capable of catalyzing Reaction B include Alcohol dehydrogenase (EC 1.1.1.1, EC 1.1.1.2) , Ketoreductase, Uronate dehydrogenase (UDH, EC 1.1.1.203) , and others. More specifically, the enzyme catalyzing Reaction B is uronate dehydrogenase (UDH) . UDH requires the cofactor NAD+ or NADP+ to complete the oxidation of substrates, producing NADH or NADPH, respectively. In the presence of oxygen, NADH or NADPH is oxidized back to NAD+ or NADP+ by NAD (P) H oxidases (NOx, EC 1.6.3.1, EC 1.6.3.4) , enabling cofactor recycling.

[0014] For Reaction A shown in Figure 2, catalase (product code: 02071-5ML-F) and horseradish peroxidase (product code: P8125-50KU) available from Sigma-Aldrich can be used.

[0015] After obtaining C6 aldaric acids via the reaction in Figure 1, it can be directly dehydrated and cyclized to form FDCA under heated, acidic conditions (Figure 3) . However, C6 aldaric acids tend to form 1, 5-aldaric acid lactone during the reaction, thus easily generating the impurity 4-hydroxy-6-carboxy-2-pyranone (HOPC) as shown in Figure 4, which affects the yield of the product FDCA.

[0016] To reduce by-products and improve reaction efficiency, the present invention utilizes the reaction shown in Figure 5 to further catalyze the conversion of C6 aldaric acids into 4-deoxy-5-dehydro-aldaric acids via a dehydratase, and this intermediate is used for the synthesis of FDCA. Using 4-deoxy-5-dehydro-aldaric acids to produce FDCA is more efficient, eliminating the formation of the impurity HOPC.

[0017] The C6 aldaric acids mentioned in the above route can be D / L-glucaric acid, D / L-galactaric acid, D / L-mannaroic acid, D / L-iduronic acid, D / L-allonic acid, D / L-altraric acid, (2S, 3R, 4R, 5S) -2, 3, 4, 5-tetrahydroxyhexanedioic acid, etc.

[0018] Dehydratases applicable for the reaction in Figure 5 include Glucarate dehydratase (EC 4.2.1.40) , Citrate dehydratase (EC 4.2.1.4) , Arabinate dehydratase (EC 4.2.1.5) , Galactonate dehydratase (EC 4.2.1.6) , Trehalonate dehydratase (EC 4.2.1.7) , Mannonate dehydratase (EC 4.2.1.8) , Dihydroxy acid dehydratase (EC 4.2.1.9) , 3-dehydroquinate dehydratase (EC 4.2.1.10) , Phosphogluconate dehydratase (EC 4.2.1.12) , L-arabinate dehydratase (EC 4.2.1.25) , Propanediol dehydratase (EC 4.2.1.28) , Glycerol dehydratase (EC 4.2.1.30) , L-tartrate dehydratase (EC 4.2.1.32) , Isopropylmalate dehydratase (EC 4.2.1.33.3) , (S) -2-methylmalate dehydratase (EC 4.2.1.34) , (R) -2-methylmalate dehydratase (EC 4.2.1.35) , Galactogluconate dehydratase (EC 4.2.1.39) , Aldarate dehydratase (EC 4.2.1.42) , 2-dehydro-3-deoxy-L-arabinate dehydratase (EC 4.2.1.43) , Inosine-2 dehydratase (EC 4.2.1.44) , CDP-glucose 4, 6-dehydratase (EC 4.2.1.45) , TDP-glucose 4, 6-dehydratase (EC 4.2.1.46) , GDP-mannose 4, 6-dehydratase (EC 4.2.1.47) , D-succinate dehydratase (EC 4.2.1.67) , L-succinate dehydratase (EC 4.2.1.68) , UDP-glucose 4, 6-dehydratase (EC 4.2.1.76) , 2-methylcitrate dehydratase (EC 4.2.1.79) , D-tartrate dehydratase (EC 4.2.1.81) , Xylonate dehydratase (EC 4.2.1.82) , L-rhamnonate dehydratase (EC 4.2.1.90) , 2-methylisocitrate dehydratase (EC 4.2.1.99) , 1, 5-anhydro-D-fructose dehydratase (EC 4.2.1.111) , 2-methylcitrate dehydratase (EC 4.2.1.117) , Linalool dehydratase (EC 4.2.1.127) , D-lactate dehydratase (EC 4.2.1.130) , Gluconate / galactonate dehydratase (EC 4.2.1.140) , 2-dehydro-3-deoxy-D-arabinate dehydratase (EC 4.2.1.141) , L-galactonate dehydratase (EC 4.2.1.146) , L-talarate dehydratase (EC 4.2.1.156) , D-galactonate dehydratase (EC 4.2.1.158) , 6-deoxy-6-sulfo-D-gluconate dehydratase (EC 4.2.1.162) , etc.

[0019] More specifically, the present application uses glucaric acid to synthesize FDCA, which can be achieved at heated acidic conditions. The specific route is shown in Figure 6 (Reaction C) , and the inorganic acid employed in this process is selected from one or a combination of sulfuric acid, hydrofluoric acid, hydrochloric acid, hydrobromic acid, hydroiodic acid, etc.

[0020] In addition to using acids to catalyze the direct dehydration of glucaric acid for FDCA production, FDCA can also be synthesized via 4-deoxy-5-dehydroglucaric acid (DDG) , the partial dehydration product of glucaric acid by glucarate dehydratase (GlucD, EC 4.2.1.40) (Reaction D shown in Figure 7) . GlucD is a magnesium ion-dependent enzyme; besides magnesium ion, divalent metal ions such as manganese ion can also serve as cofactors for GlucD to participate in the enzymatic catalysis process. The magnesium ion concentration in the enzymatic dehydration reaction is 0.05-5 mM; the reaction temperature is 25-60℃, preferably 45℃; and the pH range is 7-10. Synthesizing FDCA using DDG results in a shorter and more efficient reaction route, eliminating the formation of impurity HOPC.

[0021] DDG can be directly cyclized and dehydrated to form FDCA via chemical methods under heated acidic conditions (Reaction E shown in Figure 8) , and the inorganic acid employed in this process is selected from one or a combination of sulfuric acid, hydrofluoric acid, hydrochloric acid, hydrobromic acid, hydroiodic acid, etc.Description of Drawings

[0022] Figure 1: Enzymatic preparation of C6 aldaric acid from C6 aldonic acid via C6 uronic acid

[0023] Figure 2: Enzymatic synthesis of L-guluronic acid (Reaction A) and D-glucaric acid (Reaction B) .

[0024] Figure 3: Direct dehydration and cyclization of C6 aldaric acid to synthesize FDCA under heated, acidic conditions.

[0025] Figure 4: Chemical structure of 4-hydroxy-6-carboxy-2-pyranone.

[0026] Figure 5: Enzymatic preparation of 4-deoxy-5-dehydro-aldaric acid and the synthesis of FDCA from 4-deoxy-5-dehydro-aldaric acid.

[0027] Figure 6: Dehydration of glucaric acid to form FDCA under acidic conditions (Reaction C) .

[0028] Figure 7: Partial dehydration of glucaric acid to form 4-deoxy-5-dehydroglucaric acid catalyzed by dehydratase (Reaction D) .

[0029] Figure 8: Dehydration of 4-deoxy-5-dehydroglucaric acid to form FDCA under acidic conditions (Reaction E)Examples

[0030] The following examples further illustrate the present invention and clearly and completely describe its technical solutions. However, the present invention is not limited thereto; the described examples are only a part of the examples of the present invention, not all of them. Based on the examples of the present invention, all other examples obtained by those of ordinary skill in the art without creative work shall fall within the protection scope of the present invention. In addition, the experimental methods involved in the following examples that do not specify specific conditions are generally carried out in accordance with conventional conditions in the fields of biotechnology and chemistry or conditions recommended by manufacturers. The reagents and equipment involved that are not specifically noted are all commercially available.

[0031] Example 1

[0032] All reaction samples were detected using the following LC-MS method:

[0033] Example 2

[0034] Into a 500 mL reaction vessel, 12.5 g sodium gluconate, 0.5 g enzyme powder of galactose oxidase variant SEQ ID No: 1, 0.1 mL enzyme solution of catalase (02071 from Sigma-Aldrich) , 25 mL stock solution of 5 mM copper sulfate, 50 mM Tris-HCl (pH = 8) , and 25 mL stock solution of 1 g / L horseradish peroxidase (P8125 from Sigma-Aldrich) were added. Stirring was started, and the final reaction volume was adjusted to 250 mL. The reaction was carried out at room temperature for 24 hours. Reaction sampling and LC-MS analysis showed that the reaction yield of L-guluronic acid was 93.1%.

[0035] Example 3

[0036] The reaction solution obtained in Example 2 was heated at 60℃ for 2 hours and filtered under reduced pressure to collect the filtrate. The filtrate was rotary-evaporated at 50℃ until it reached 25%of the original volume. The remaining rotary-evaporated solution was stored at 4℃ overnight, then filtered under reduced pressure. The filter cake was rinsed twice with ice water, and finally 8 g of solid sodium L-guluronate was obtained.

[0037] Example 4

[0038] Into a 100 mL reaction vessel, 2.5 g solid sodium L-guluronate that was prepared in Example 3, 0.5 g wet cells with recombinantly-expressed UDH variant SEQ ID No: 2, 0.5 g wet cells with recombinantly-expressed NOx variant SEQ ID No: 3, 50 mM Tris-HCl (pH = 9) , and 5 mL stock solution of 1 g / L NAD+ were added. The final reaction volume was 50 mL. During the reaction, 5 M sodium hydroxide was used to maintain the pH of reaction at pH9 in real time. The reaction was carried out at 30℃ for 24 hours. Reaction sampling and LC-MS analysis showed that 94%of sodium L-guluronate was converted to glucaric acid.

[0039] Example 5

[0040] Into a 30 mL reaction vial, 1 g D-glucaric acid monopotassium salt, 0.005 g wet cells with recombinantly-expressed GlucD variant SEQ ID No: 4, 0.5 mL stock solution of 20 mM magnesium chloride, and 50 mM Tris-HCl (pH = 8) were added. The pH was adjusted to 8 with 5 M potassium hydroxide, and stirring was started. The final reaction volume was 5 mL. The reaction was carried out at 30℃ for 5 hours. Reaction sampling and LC-MS analysis showed that the conversion rate of D-glucaric acid monopotassium salt to DDG was >99%.

[0041] Example 6

[0042] Each of six 30 mL reaction vials was charged with 1 g D-glucaric acid monopotassium salt, 0.0025 g wet cells with recombinantly-expressed GlucD variant SEQ ID No: 4, 0.5 mL stock solution of 20 mM magnesium chloride, and 50 mM Tris-HCl (pH = 8) . The pH was adjusted to 8 with 5 M potassium hydroxide, and stirring was started. The final reaction volume for each vial was 5 mL. The reactions were carried out at 30℃, 35℃, 40℃, 45℃, 50℃, and 60℃ for 4 hours, respectively. Reaction samples were taken and analyzed by LC-MS, and the conversion rates of D-glucaric acid monopotassium salt to DDG are shown in the table below:

[0043] Example 7

[0044] Each of three 30 mL reaction vials was charged with 1 g D-glucaric acid monopotassium salt, 0.0025 g wet cells with recombinantly-expressed GlucD variant SEQ ID No: 4, 50 mM Tris-HCl (pH = 8) , and 0.5 mL stock solution of magnesium chloride (with concentrations of 0.5 mM, 20 mM, and 50 mM in the three different vials, respectively) . The pH was adjusted to 8 with 5 M potassium hydroxide, and stirring was started. The final reaction volume for each vial was 5 mL. All reactions were carried out at 40℃ for 4 hours. Reaction samples were taken and analyzed by LC-MS, and the conversion rates of D-glucaric acid monopotassium salt to DDG are shown in the table below:

[0045] Example 8

[0046] Each of four 30 mL reaction vials was charged with 1 g D-glucaric acid monopotassium salt, 0.0025 g wet cells with recombinantly-expressed GlucD variant SEQ ID No: 4, 0.5 mL stock solution of 20 mM magnesium chloride, and 50 mM Tris-HCl buffer (pH=8) . The pH of each reaction mixture was adjusted to 7, 8, 9, and 10 with 5 M potassium hydroxide, respectively. The final reaction volume was 5 mL, and each reaction was carried out at 40℃ for 4 hours. Reaction samples were taken and analyzed by LC-MS, and the conversion rates of D-glucarate monopotassium salt to DDG are shown in the table below.

[0047] Example 9

[0048] Into a 500 mL reaction vessel, 12.5 g sodium gluconate, 0.5 g enzyme powder of galactose oxidase variant SEQ ID No: 1, 2.5 g wet cells with recombinantly-expressed UDH variant SEQ ID No: 2, 2.5 g wet cells with recombinantly-expressed NOx variant SEQ ID No: 3, 0.125 g wet cells expressing with recombinantly-expressed GlucD variant SEQ ID No: 4, 0.1 mL enzyme solution of catalase (02071 from Sigma-Aldrich) , 25 mL stock solution of 5 mM copper sulfate, 50 mM Tris-HCl (pH = 9) , 25 mL stock solution of 1 g / L horseradish peroxidase (P8125 from Sigma-Aldrich) , and 25 mL stock solution of 20 mM magnesium chloride were added. Stirring was started, and the final reaction volume was adjusted to 250 mL. During the reaction, 5 M sodium hydroxide was used to maintain the pH of reaction at pH8.5 in real time. The reaction was carried out at room temperature for 24 hours. Reaction sampling and LC-MS analysis showed that the conversion rate of sodium gluconate to DDG was 99.2%.

[0049] Example 10

[0050] The reaction solution from Example 9 was heated at 60℃ for 2 hours to denature and precipitate proteins. The heated reaction solution was filtered. After filtration, the filtrate was freeze-dried and 9.5 g of solid was obtained. 0.2 g, 0.5 g, and 1 g of the solid were respectively mixed with n-butanol and concentrated sulfuric acid, and the concentration of sulfuric acid was controlled at 5 M. The reactions were carried out at 60℃, 80℃, and 120℃ for 5 hours, respectively. The conversion rates of DDG to FDCA are shown in the table below:

[0051] It should be understood that after reading the above content of the present invention, those skilled in the art can make various modifications or adaptations to the present invention, and these equivalent forms also fall within the scope defined by the appended claims of the present application.

Claims

1.A chemoenzymatic route for synthesizing 2, 5-furandicarboxylic acid (FDCA) , which comprises the following enzymatic reactions and chemical reaction: (i) C6 aldonic acid, the starting material, is converted to C6 uronic acid through enzyme-catalyzed oxidation; (ii) C6 uronic acid is further converted to C6 aldaric acid via enzyme-catalyzed oxidation; (iii) C6 aldaric acid undergoes enzyme-catalyzed dehydration to yield 4-deoxy-5-dehydro-aldaric acid; (iv) 4-Deoxy-5-dehydro-aldaric acid is dehydrated under acidic conditions to obtain 2, 5-furandicarboxylic acid. 2.The method according to claim 1, wherein the starting materials for reaction (i) include gluconic acid, galactonic acid, mannonic acid, allonic acid, and iduronic acid; the enzymes used include L-lactate oxidase (EC 1.1.3.2) , Glucose oxidase (EC 1.1.3.4) , Hexose oxidase (EC 1.1.3.5) , L-gulonolactone oxidase (EC 1.1.3.8) , Galactose oxidase (EC 1.1.3.9) , Pyranose oxidase (EC 1.1.3.10) , L-sorbose oxidase (EC 1.1.3.11) , Alcohol oxidase (EC 1.1.3.13) , N-acylhexosamine oxidase (EC 1.1.3.29) , Polyvinyl alcohol oxidase (EC 1.1.3.30) , D-arabinose-1, 4-lactone oxidase (EC 1.1.3.37) , D-mannitol oxidase (EC 1.1.3.40) , Alditol oxidase (EC 1.1.3.41) , 5-hydroxymethylfurfural oxidase (EC 1.1.3.47) , and 3-deoxy-α-D-manno-octulosonic acid (octulosonate) -8-oxidase (EC 1.1.3.48) ; hydrogen peroxide generated in reaction (i) is decomposed using catalase (EC 1.11.1.6) .3.The method according to claim 1, wherein the enzymes used for reaction (ii) include alcohol dehydrogenase (EC 1.1.1.1, EC 1.1.3.2) , ketoreductase, and uronate dehydrogenase (EC 1.1.1.203) ; cofactor NAD+ or NADP+ is added simultaneously in this enzymatic reaction, and NAD (P) H oxidase (NOx, EC 1.6.3.1, EC 1.6.3.4) is used to achieve cyclic regeneration of the cofactor; the C6 aldaric acid obtained from reaction (ii) includes D / L-glucaric acid, D / L-galactaric acid, D / L-mannaric acid, D / L-idaric acid, D / L-allaric acid, D / L-altraric acid, and (2S, 3R, 4R, 5S) -2, 3, 4, 5-tetrahydroxyhexanedioic acid.4.The method according to claim 1, wherein the enzymes used for reaction (iii) include glucarate dehydratase (EC 4.2.1.40) , citrate dehydratase (EC 4.2.1.4) , arabinonate dehydratase (EC 4.2.1.5) , galactonate dehydratase (EC 4.2.1.6) , treonate dehydratase (EC 4.2.1.7) , mannonate dehydratase (EC 4.2.1.8) , dihydroxyacid (Dihydroxy acid) dehydratase (EC 4.2.1.9) , 3-dehydroquinate dehydratase (EC 4.2.1.10) , phosphogluconate dehydratase (EC 4.2.1.12) , L-arabinonate dehydratase (EC 4.2.1.25) , propanediol dehydratase (EC 4.2.1.28) , glycerol dehydratase (EC 4.2.1.30) , L-tartrate dehydratase (EC 4.2.1.32) , isopropylmalate dehydratase (EC 4.2.1.33.3) , (S) -2-methylmalate dehydratase (EC 4.2.1.34) , (R) -2-methylmalate dehydratase (EC 4.2.1.35) , galactogluconate dehydratase (EC 4.2.1.39) , aldarate dehydratase (EC 4.2.1.42) , 2-dehydro-3-deoxy-L-arabinonate dehydratase (EC 4.2.1.43) , inosine-2 dehydratase (EC 4.2.1.44) , CDP-glucose 4, 6-dehydratase (EC 4.2.1.45) , TDP-glucose 4,6-dehydratase (EC 4.2.1.46) , GDP-mannose 4, 6-dehydratase (EC 4.2.1.47) , D-succinate dehydratase (EC 4.2.1.67) , L-succinate dehydratase (EC 4.2.1.68) , UDP-glucose 4, 6-dehydratase (EC 4.2.1.76) , 2-methylcitrate dehydratase (EC 4.2.1.79) , D-tartrate dehydratase (EC 4.2.1.81) , xylonate dehydratase (EC 4.2.1.82) , L-rhamnonate dehydratase (EC 4.2.1.90) , 2-methylisocitrate dehydratase (EC 4.2.1.99) , 1, 5-anhydro-D-fructose dehydratase (EC 4.2.1.111) , 2-methylcitrate dehydratase (EC 4.2.1.117) , linalool dehydratase (EC 4.2.1.127) , D-lactate dehydratase (EC 4.2.1.130) , gluconate / galactonate dehydratase (EC 4.2.1.140) , 2-dehydro-3-deoxy-D-arabinonate dehydratase (EC 4.2.1.141) , L-galactonate dehydratase (EC 4.2.1.146) , L-talarate dehydratase (EC 4.2.1.156) , D-galactonate dehydratase (EC 4.2.1.158) , and 6-deoxy-6-sulfo-D-gluconate dehydratase (EC 4.2.1.162) .5.The method according to claim 1, wherein in reaction (iv) , 4-deoxy-5-dehydro-aldaric acid is cyclized and dehydrated to generate 2, 5-furandicarboxylic acid under heated and in the presence of inorganic acid; the inorganic acid is selected from one or a combination of sulfuric acid, hydrofluoric acid, hydrochloric acid, hydrobromic acid, hydroiodic acid.6.A chemoenzymatic route for synthesizing 2, 5-furandicarboxylic acid, which comprises the following three or four enzymatic reactions and chemical reaction: (a) gluconic acid, the starting material, is converted to L-guluronic acid via enzymatic catalytic oxidation; (b) L-guluronic acid is further converted to D-glucaric acid via enzymatic catalytic oxidation or metal-catalyzed oxidation; (c) D-glucaric acid is dehydrated to generate 2, 5-furandicarboxylic acid under heated conditions in the presence of inorganic acid; alternatively, (a) gluconic acid, the starting material, is converted to L-guluronic acid via enzymatic catalytic oxidation; (b) L-guluronic acid is further converted to D-glucaric acid via enzymatic catalytic oxidation or metal-catalyzed oxidation; (d) D-glucaric acid is dehydrated to obtain 4-deoxy-5-dehydroglucaric acid catalyzed by dehydratase; (e) 4-deoxy-5-dehydroglucaric acid is dehydrated to obtain 2, 5-furandicarboxylic acid under acidic conditions. 7.The method according to claim 6, whereas in reaction (a) , an oxidase is used with horseradish peroxidase as an activator of the oxidase, and hydrogen peroxide generated in the reaction is decomposed by catalase.8.The method according to claim 7, wherein the oxidase used in reaction (a) comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID No: 1.9.The method according to claim 6, wherein the enzyme used in reaction (b) comprises uronate dehydrogenase; cofactor NAD+ or NADP+ is added simultaneously, and NAD (P) H oxidase is used to achieve cyclic regeneration of the cofactor.10.The method according to claim 9, wherein the uronate dehydrogenase used in reaction (b) comprises the sequence shown in SEQ ID No: 2, and the NAD (P) H oxidase used in reaction (b) comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID No: 3.11.The method according to claim 6, wherein the dehydratase used in reaction (d) comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID No: 4.12.The method according to claim 6, wherein in reaction (e) , 4-deoxy-5-dehydroglucaric acid is dehydrated to generate 2, 5-furandicarboxylic acid under heated conditions in the presence of inorganic acid; the inorganic acid is selected from one or a combination of sulfuric acid, hydrofluoric acid, hydrochloric acid, hydrobromic acid, hydroiodic acid.

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