Biocatalysts and methods for synthesizing sacubitril intermediates

Abstract

Provided is an engineered transaminase polypeptide capable of asymmetrically preparing chiral amine compounds with extremely high stereoselectivity. In particular, the engineered transaminase can catalyze the production of sacubitril intermediates more efficiently. The polypeptide exhibits higher activity and stability, and has industrial application value for sacubitril manufacturing.

Description

Biocatalysts and Methods for Synthesizing Sacubitril IntermediatesTechnical Field

[0001] The present invention relates to the field of biotechnology, and in particular relates to the application of a transaminase in catalyzing the synthesis of sacubitril intermediates.

[0002] Background technology

[0003] Sacubitril / valsartan is a drug developed by Novartis Pharmaceuticals for the treatment of hypertension and heart failure. In February 2015, Novartis Pharmaceuticals'investigational drug sacubitril was granted priority review status by the U.S. FDA for the treatment of heart failure with reduced ejection fraction (HFrEF) . Data from its Phase III PARADIGM-HF study showed that compared with the ACE inhibitor enalapril, it can significantly reduce cardiovascular mortality and heart failure hospitalization rates and has a good application prospect.

[0004] (R) -3- ( [1, 1'-biphenyl] -4-yl) -2-aminopropan-1-ol is an important intermediate for the preparation of sacubitril. Compared with chemical methods for preparing this intermediate, enzyme-catalyzed reactions have advantages, and some research progress has been made. For example, it is mentioned in published patents such as CN111748590B, CN110183357B, CN116083497A and CN116606224A. However, the substrate load in the currently reported enzyme-catalyzed reaction processes is less than 100 g / L, and the amount of transaminase used is relatively high, resulting in such reaction processes being unsuitable for practical production applications. The present invention intends to develop a transaminase with higher activity, high stereoselectivity and high stability (heat resistance, solvent tolerance, storage stability, etc. ) to enable the enzymatic production of the above intermediate at industrial settings with more market competitiveness.

[0005] Content of the Invention

[0006] In order to obtain a biocatalyst capable of catalyzing the reaction shown in Figure 1, the inventors first screened a series of transaminases in their proprietary enzyme collection and identified a transaminase variant (SEQ ID No: 2) as the template for directed evolution. The transaminase variant SEQ ID No: 2 is an engineered transaminase with amino acid substitutions cross 16 sites over the wild-type transaminase from Pseudomonas fluorescens (NCBI ID: WP_032859640.1) : R32K; I69A; M73L; S183A; D189G; C190E; E191T; Q214D; A353Q; S363T; R388K; L389T; R390K; C438A; T443S; A446S. SEQ ID No: 2 is a transaminase variant developed through creative work that can catalyze the reaction shown in Figure 1. The engineered transaminase SEQ ID No: 2 can be produced by recombinant expression in Escherichia coli, with the host cell being E. coil BL21 (DE3) ; the expression vector used can be pACYC-Duet-1; the inducer used can be IPTG or lactose; and the enzyme formulations can be E. coli wet cells, cell lysate supernatant or enzyme powder.

[0007] The inventors further engineered SEQ ID No: 2 to develop a series of transaminase variants with further-improved catalytic performance. Among them, as tested by the inventors, when the substrate (Formula A1) loading is ≤100g / L, the loading of wet cells with recombinantly expressed transaminase variant SEQ ID No: 198 is ≤20g / L, and the enzyme-catalyzed reaction is carried out under specific conditions for ≤24h, the detected conversion is ≥99%, and the isolated yield is ≥85%; the purity of the prepared sacubitril intermediate product (Formula A2) is ≥99.4%, and the e. e. value is ≥99.6%.

[0008] The further-improved engineered transaminase polypeptides provided in this invention have better activity and / or stability compared with SEQ ID No: 2, and the engineered transaminases of this invention can asymmetrically prepare chiral amine compounds with extremely high stereoselectivity, especially more effectively catalyze the production of sacubitril intermediates. The engineered transaminases of this invention have important application value for the industrial production of sacubitril.

[0009] The engineered transaminase polypeptides provided in this invention may include amino acid sequences with one or more residue differences compared with the sequence of SEQ ID No: 2 at the residue positions corresponding to: X22, X23, X25, X26, X49, X50, X77, X80, X81, X85, X151, X152, X162, X164, X165, X166, X169, X207, X310, X315, X332, X341, X346, X394, X395, X396, X401, X406, X409, X414, X415, X418, X419, X420, X424. The improved engineered transaminase polypeptides include amino acid sequences with at least one of the following characteristics: V22RC, A23V, E25S, Q26MD, G49A, I50VM, A77S, Q80NST, T81ML, I85V, V151CL, S162PQRLMA, Y164FIMTV, Q165K, F166VLARWMHK, G169R, Q207HV, E310S, V315Y, S332T, Q341R, G346T, D394LS, P395TMEFIKLMN, A396DV, S401EH, R406HMV, L409EHMST, V414LM, R415PQSTGHIACGQS, G418M, T419SVMAGP, K420VNT, S424AC; or on top of these differences, they may contain insertions or deletions of 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 or more amino acid residues.

[0010] More specifically, in some embodiments, the engineered transaminase polypeptides improved on the basis of SEQ ID NO: 2 include polypeptides composed of amino acid sequences corresponding to SEQ ID No: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204.

[0011] In some embodiments, the engineered transaminase polypeptides include amino acid sequences with at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or more sequence identity compared with the reference sequences of SEQ ID No: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204.

[0012] The identity between two amino acid sequences or two nucleotide sequences can be obtained by algorithms commonly used in the art. It can be calculated using NCBI Blastp and Blastn software according to default parameters, or using the Clustal W algorithm (Nucleic Acid Research, 22 (22) : 4673-4680, 1994) . For example, using the Clustal W algorithm, the amino acid sequence identity between SEQ ID No: 2 and WP_032859640.1 is 96.4%, the amino acid sequence identity between SEQ ID No: 2 and SEQ ID No: 10 is 98.4%, and the amino acid sequence identity between SEQ ID No: 2 and SEQ ID No: 204 is 97.5%.

[0013] In another aspect, this invention provides polynucleotide sequences encoding the engineered transaminase polypeptides. In some embodiments, the polynucleotide may be part of an expression vector having one or more control sequences for expressing the engineered transaminase polypeptide. In some embodiments, the polynucleotide may include polynucleotide sequences corresponding to the sequences shown in SEQ ID No: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 199, 201, 203.

[0014] As is known to those skilled in the art, due to the degeneracy of nucleotide codons, the polynucleotide sequences encoding the amino acid sequences of SEQ ID No: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204 are not limited to SEQ ID No: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 199, 201, 203. The nucleic acid sequences of the engineered transaminase polypeptides in this invention can also be any other nucleic acid sequences that encode the amino acid sequences shown in SEQ ID No: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204.

[0015] In another aspect, the present disclosure provides polynucleotides encoding the engineered transaminases, as well as expression vectors and host cells capable of expressing the engineered transaminases. In some embodiments, the host cell may be a bacterial host cell, such as Escherichia coli. The host cell can be used to express and isolate the engineered transaminases described herein, or alternatively, directly used in reactions to convert substrates into products.

[0016] In some embodiments, the engineered transaminase, in the form of intact cells, crude extracts, isolated polypeptides, or purified polypeptides, can be used alone or in an immobilized form (e.g., immobilized on a resin) .

[0017] The present disclosure also provides a method for converting a ketone substrate represented by Structural Formula (II) into a chiral amine compound represented by Structural Formula (I) using the engineered transaminase polypeptides disclosed herein:

[0018] The amine product of Structural Formula (I) has the indicated stereochemical configuration at the chiral center marked with *; the amine product of Structural Formula (I) is in an enantiomeric excess relative to the opposite enantiomer, where:

[0019] -R1 is an optionally substituted or unsubstituted aryl or heteroaryl group, or an optionally substituted or unsubstituted C1-C8 alkyl, cycloalkyl, or heterocycloalkyl group;

[0020] -R2 is an optionally substituted or unsubstituted C1-C6 alkyl group, carboxyl group, -CO2R’  / -COR’ , -C (O) NR’ , -SO2NH2 / -SONH2, -CN, or -CF3;

[0021] wherein each R’ is independently selected from a halogen, C1-C8 alkyl, C2-C12 alkenyl, C2-C12 alkynyl, cycloalkyl, aryl, or heterocycloalkyl group. The method includes contacting the ketone substrate of Structural Formula (II) and an amino donor with the transaminase polypeptide under reaction conditions suitable for converting the ketone substrate to the amine product. The transaminase polypeptide is the engineered transaminase polypeptide described herein and is capable of converting the ketone substrate of Structural Formula (II) to the amine product of Structural Formula (I) with a higher conversion rate compared to SEQ ID No: 2.

[0022] In some embodiments, the amine product of Structural Formula (I) is produced with an enantiomeric excess of at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or higher.

[0023] In some embodiments of the method, the amine product of Structural Formula (I) is:

[0024] wherein R3 is an optionally substituted or unsubstituted C1-C4 alkyl group, -H, halogen (e.g., -F, -Cl, -Br, -I) , aryl, eteroaryl, -NO2, -NO, -SO2R’  / -SOR’ , -SR’ , -NR’ R’ , -OR’ , -CO2R’  / -COR’ , -C (O) NR’ , -CNR’ , -SO2NH2 / -SONH2, -CN, CF3; each R’ is independently selected from -H, C1-C4 alkyl, cycloalkyl, aryl, or heterocycloalkyl group; R2 is as defined above; and the ketone substrate of Structural Formula (II) is:

[0025] In some embodiments, R3 is at the para position of the phenyl ring. In some embodiments, R3 is at the meta position of the phenyl ring. In some embodiments, R3 is at the ortho position of the phenyl ring. In some embodiments, R3 is at both the para and meta positions of the phenyl ring. In some embodiments, R3 is at both the para and ortho positions of the phenyl ring. In some embodiments, R3 is at both the meta and ortho positions of the phenyl ring.

[0026] In some embodiments of the method, the amine product of Structural Formula (I) is:

[0027] wherein R4 is R3 as defined above; R3 and R2 are as defined above; and the ketone substrate of Structural Formula (II) is:

[0028] In some embodiments, R3 is at the meta position of the phenyl ring. In some embodiments, R3 is at the ortho position of the phenyl ring.

[0029] In some embodiments of the method, the chiral amine product of Structural Formula (I) is:

[0030] and the ketone substrate of Structural Formula (II) is:

[0031] In some embodiments of the method, the chiral amine product of Structural Formula (I) is:

[0032] and the ketone substrate of Structural Formula (II) is:

[0033] In some embodiments of the method, the chiral amine product of Structural Formula (I) is:

[0034] and the ketone substrate of Structural Formula (II) is:

[0035] In some embodiments, the engineered transaminase polypeptides can be used in a method for preparing enantiomerically enriched A2 compound, an intermediate of Sacubitril:

[0036] In these embodiments, the method includes a step of contacting the compound of Structural Formula A1 with the engineered transaminase polypeptides disclosed herein in a suitable organic solvent and in the presence of an amino donor, under reaction conditions suitable for converting the compound of Formula A1 into the compound of Formula A2:

[0037] Any of the methods disclosed herein for preparing Compound of Formula (I) or Compound of Formula A2 using the engineered polypeptides can be carried out under a series of suitable reaction conditions, including but not limited to ranges of amino donor, pH, temperature, buffer, solvent system, substrate loading, polypeptide loading, cofactor loading, pressure, and reaction time. For example, in some embodiments, the preparation of Compound of Formula (I) or Compound of Formula A2 can be carried out under suitable reaction conditions including: (a) a substrate loading of about 1 g / L to 100 g / L for Substrate Compound (II) or A1; (b) an engineered polypeptide loading of about 0.1 g / L to 100 g / L; (c) an amino donor loading of about 10 g / L to 300 g / L (the amino donor includes but is not limited to isopropylamine (IPM) , phenethylamine, and alanine) ; (d) a PLP cofactor loading of about 0.1 g / L to 5 g / L; (e) an organic solvent content of about 0% (v / v) to 50% (v / v) (the organic solvent includes but is not limited to methanol, ethanol, propanol, toluene, isopropyl acetate, dimethyl sulfoxide (DMSO) , methyl tert-butyl ether (MTBE) , dichloromethane (DCM) , or dimethylformamide (DMF) ) ; (f) a pH of about 7.0 to 11.0; and (g) a temperature of about 10℃ to 60℃.

[0038] Examples of the improved transaminases are provided in Table 1 below, which illustrates the engineered transaminase polypeptides developed in this invention. Each row provides the nucleotide sequence number, amino acid sequence number, and residue differences (compared with SEQ ID No: 2) of a specific engineered transaminase polypeptide. The catalytic performance of each exemplified engineered transaminase polypeptide (comprehensive performance of the enzyme in the reaction, including but not limited to activity, thermal stability, stability in the reaction system, stereoselectivity for the product, etc. ) is indicated by "+" .

[0039] Table 1 Description of Drawings

[0040] Figure 1: Transaminase-catalyzed synthesis of sacubitril intermediate

[0041] Figure 2: SDS-PAGE image of transaminase (Lane 1: Supernatant of homogenized enzyme solution -soluble protein; Lane 2: Precipitate of homogenized enzyme solution -insoluble protein)

[0042] Figure 3: HPLC chromatogram for substrate and product detection

[0043] Figure 4: HPLC chromatogram for product chiral isomers detectionExamples

[0044] The following examples further illustrate the present invention, and clearly and completely describe the technical solutions of the present invention. However, the present invention is not limited thereto; the described examples are only a part of the examples of the present invention, rather than all the examples. Based on the examples in the present invention, all other examples obtained by those of ordinary skill in the art without creative work shall fall within the protection scope of the present invention. In addition, the experimental methods involved in the following examples that do not specify specific conditions are generally carried out in accordance with conventional conditions in the field of biotechnology and chemistry or conditions recommended by manufacturers. The reagents and equipment involved that are not specifically noted are all commercially available.

[0045] Example 1: Gene Cloning and Construction of Expression Vector

[0046] The nucleic acid corresponding to the amino acid sequence of the transaminase variant was synthesized by common techniques in the field and cloned into the expression vector pACYC-Duet-1. The recombinant expression plasmid was transformed into competent cells of E . coil BL21 (DE3) . The transformation conditions were as follows: heat shock at 42℃ for 90 seconds, followed by ice bath for 5 minutes. Then, it was added to LB medium and incubated in a 37℃ shaking incubator for 1 hour for recovery. Finally, the recovered transformation was spread on LB plates containing chloramphenicol which was incubated upside down at 37℃ overnight to obtain recombinant transformants.

[0047] Example 2: Shake-Flask Expression of Transaminase

[0048] Recombinant E. coli BL21 (DE3) containing the transaminase expression plasmid was inoculated into 50 mL of LB medium (with 30 μg / mL chloramphenicol) in a 250 mL Erlenmeyer flask, which was then cultured in a shaking incubator at 30℃ overnight. When the OD600 of the overnight culture reached 2, it was subcultured at the inoculum of 5% (v / v) into a 1000 mL Erlenmeyer flask containing 250 mL of TB medium. Isopropyl-β-D-thiogalactoside (IPTG) was added to a final concentration of 1 mM to induce the expression of transaminase, and the flask was placed in a shaking incubator at 30℃. After 20 hours, the culture was centrifuged at 8000 rpm for 10 minutes; the supernatant was discarded, and the cells were harvested to obtain wet cells. The wet cells were directly used for the enzymatic reaction or could be stored frozen at -20℃ until use.

[0049] Example 3: 1L Fermentation and Post-Treatment of Transaminase

[0050] A single colony of E. coli BL21 (DE3) containing a plasmid bearing the target engineered transaminase polynucleotide was inoculated into a 50 mL of LB broth containing 30 μg / mL chloramphenicol (5.0 g / L Yeast Extract, 10 g / L Tryptone, 10 g / L NaCl) . In was incubated at 250 rpm in a shaking incubator at 30℃ for 21 hours. When the OD600 of the culture reached 3.5-5.0, the culture was taken out of the shaker and was used to inoculate a 1.0 L fermenter containing 0.6 L base medium which had been sterilized in an autoclave at 121℃ for 30 minutes beforehand. Temperature of fermenter was maintained at 37℃. The medium in fermenter was agitated at 200-1000 rpm and air was supplied to the fermentation vessel at 0.4-0.8 L / min to maintain a dissolved oxygen level no less than 80%. The culture was maintained at pH 7.0 by addition of 25-28% (v / v) ammonium hydroxide. Cell growth was maintained by feeding a solution containing 500 g / L of food-grade glucose monohydrate, 12 g / L ammonium chloride, and 5 g / L magnesium sulfate heptahydrate. After 8 hours, when the OD600 of the culture reached 25±5, the temperature of fermenter was decreased and maintained at 30℃. Then, isopropyl-β-D-thiogalactoside (IPTG) was added to a final concentration of 1 mM to induce the expression of transaminase. Fermentation process then continued for additional 16-22 hours. After the fermentation process was complete, cells were harvested using a Thermo Multifuge X3R centrifuge at 8000 rpm for 10 minutes at 4℃. Harvested cells were used directly for the enzymatic reaction or stored frozen at -20℃.

[0051] Compared with the starting template SEQ ID No: 2, the engineered transaminase SEQ ID No: 198 had retained enzyme activity for additional >1 month in storage; the improved enzyme stability is beneficial to the operation in industrial setting. The SDS-PAGE image of the expressed transaminase is shown in Figure 2.

[0052] Example 4: Transaminase-catalyzed Reaction and Detection

[0053] 4.1 Preparation of "IPM + PLP" Premix

[0054] Weigh 52.5 g of IPM and 0.11 g of PLP into a 250 mL glass bottle, then add 50 mL of pure water into the bottle and stir thoroughly until complete dissolution. Adjust the pH of the solution to 8.5 with hydrochloric acid (cool to 35℃ in an ice-water bath) , and finally top up the solution to 200 mL with pure water.

[0055] 4.2 Preparation of "Substrate + DMSO" Premix

[0056] Weigh 10 g of substrate (compound of Formula A1, B1, or C1) into a 100 mL glass bottle, then add 50 mL of DMSO into the bottle and stir thoroughly until the substrate is completely dissolved.

[0057] 4.3 Operation of Transaminase-Catalyzed Reaction

[0058] 4.3.1 Condition 1

[0059] A magnetic stirring reactor was set at 35℃ and a 400 rpm. Into a 25 mL glass bottle, 0.025 g of wet cells with expressed transaminase, 4.5 mL of "IPM + PLP" premix and 0.5 mL of "Substrate + DMSO" premix were charged. A stirring bar was added into the bottle and the bottle cap was screwed tightly. The glass bottle was put onto the magnetic stirring reactor to start the reaction.

[0060] 4.3.2 Condition 2 (Higher Substrate loading and Solvent content)

[0061] A magnetic stirring reactor was set at 35℃ and a 400 rpm. Into a 25 mL glass bottle, 0.25 g of wet cells with expressed transaminase, 2.5 mL of "IPM + PLP" premix and 2.5 mL of "Substrate + DMSO" premix were charged. A stirring bar was added into the bottle and the bottle cap was screwed tightly. The glass bottle was put onto the magnetic stirring reactor to start the reaction.

[0062] 4.3.3 Condition 3 (Higher Reaction Temperature)

[0063] A magnetic stirring reactor was set at 50℃ and a 400 rpm. Into a 25 mL glass bottle, 0.25 g of wet cells with expressed transaminase, 4.5 mL of "IPM + PLP" premix and 0.5 mL of "Substrate + DMSO" premix were charged. A stirring bar was added into the bottle and the bottle cap was screwed tightly. The glass bottle was put onto the magnetic stirring reactor to start the reaction.

[0064] 4.4 Detection of Enzyme Activity

[0065] After 24 hours of the transaminase-catalyzed reaction, 20 mL of acetonitrile was added to each glass bottle to quench the reaction. The quenched reaction was stirred for 30 minutes at 800 rpm. Samples were taken into 2 mL centrifuge tubes, diluted more than 10-fold with 75%acetonitrile, and centrifuged. The supernatant was collected for HPLC analysis.

[0066] Examples of the conversion rates and e. e. value of products obtained from HPLC analysis are shown in Table 4.1 to 4.3.

[0067] Table 4.1 (Reaction Condition 1)

[0068] Table 4.2 (Reaction Condition 2)

[0069] Table 4.3 (Reaction Condition 3)

[0070] Example 5: Enzymatic Reaction Process and Workup Process for Preparing Sacubitril Intermediate

[0071] Example 5.1

[0072] Into a 2 L three-necked round-bottom flask, 14.9 g of triethanolamine (TEOA) , 640 g of pure water, and 118 g of isopropylamine (IPM) were added sequentially. Stirring of the reaction flask was started, and 0.5 g of pyridoxal 5'-phosphate (PLP) was added. After stirring for 3 minutes, approximately 169 mL of concentrated hydrochloric acid was slowly added with careful temperature control. After the hydrochloric acid was completely added, reaction temperature was maintained at 40℃, and reaction pH was adjusted to 9.0. Finally, 20 g of wet cells with expressed transaminase variant (SEQ ID No: 198) and 100 g of substrate (Formula A1) were added into the reaction flask to start the reaction. After 24 hours, reaction sampling and HPLC showed a conversion rate of 99.0%.

[0073] Hydrochloric acid was added to the reaction till the pH reached 1～2. Then 1 L methanol was added, the temperature was raised to 60℃ with stirring for 1 hour. The mixture was filtered, and the filter cake was rinsed with 200 mL of methanol. The filtrate was concentrated, and a 40%sodium hydroxide aqueous solution was added under stirring. After stirring for 1 hour, it was filtered. The filter cake was rinsed twice with 300 mL of pure water, and dried to obtain 88 g of an off-white powder. Quantitative nuclear magnetic resonance (NMR) detection showed a purity of 99.4%, HPLC analysis showed a e. e. value of 99.6%, and the yield was 88%.

[0074] Example 5.2

[0075] Into a 2 L three-necked round-bottom flask, 14.9 g of triethanolamine (TEOA) , 390 g of pure water, 250 mL of methanol, and 118 g of isopropylamine (IPM) were added sequentially. Stirring of the reaction flask was started, and 0.5 g of pyridoxal 5'-phosphate (PLP) was added. After stirring for 3 minutes, approximately 165 mL of concentrated hydrochloric acid was slowly added with careful temperature control. After the hydrochloric acid was completely added, reaction temperature was maintained at 40℃, and reaction pH was adjusted to 9.0. Finally, 20 g of wet cells with expressed transaminase variant (SEQ ID No: 198) and 100 g of substrate (Formula A1) were added into the reaction flask to start the reaction. After 24 hours, reaction sampling and HPLC showed a conversion rate of 99.3%.

[0076] Hydrochloric acid was added to the reaction till the pH reached 1～2. Then 0.5 L methanol was added, the temperature was raised to 60℃ with stirring for 1 hour. The mixture was filtered, and the filter cake was rinsed with 200 mL of methanol. The filtrate was concentrated, and a 40%sodium hydroxide aqueous solution was added under stirring. After stirring for 1 hour, it was filtered. The filter cake was rinsed twice with 300 mL of pure water, and dried to obtain 86 g of an off-white powder. Quantitative nuclear magnetic resonance (NMR) detection showed a purity of 99.5%, HPLC analysis showed a e. e. value of 99.6%, and the yield was 86%.

[0077] Example 5.3

[0078] Into a 2 L three-necked round-bottom flask, 640 g of pure water, 200 mL of dimethyl sulfoxide (DMSO) , and 59 g of isopropylamine (IPM) were added sequentially. Stirring of the reaction flask was started, and 0.1 g of pyridoxal 5'-phosphate (PLP) was added. After stirring for 3 minutes, approximately 80 mL of concentrated hydrochloric acid was slowly added with careful temperature control. After the hydrochloric acid was completely added, reaction temperature was maintained at 38℃, and reaction pH was adjusted to 8.5. Finally, 10 g of wet cells with expressed transaminase variant (SEQ ID No: 198) and 50 g of substrate (Formula A1) were added into the reaction flask to start the reaction. After 18 hours, reaction sampling and HPLC showed a conversion rate of 99.9%.

[0079] Hydrochloric acid was added to the reaction till the pH reached 1～2. Then 1 L methanol was added, the temperature was raised to 60℃ with stirring for 1 hour. The mixture was filtered, and the filter cake was rinsed with 200 mL of methanol. The filtrate was concentrated, and a 40%sodium hydroxide aqueous solution was added under stirring. After stirring for 1 hour, it was filtered. The filter cake was rinsed twice with 300 mL of pure water, and dried to obtain 47 g of an off-white powder with a yield of 93%.

[0080] Example 5.4

[0081] Into a 2 L three-necked round-bottom flask, 640 g of pure water and 118 g of isopropylamine (IPM) were added sequentially. Stirring of the reaction flask was started, and 0.2 g of pyridoxal 5'-phosphate (PLP) was added. After stirring for 3 minutes, approximately 162 mL of concentrated hydrochloric acid was slowly added with careful temperature control. After the hydrochloric acid was completely added, reaction temperature was maintained at 45℃, and reaction pH was adjusted to 9.5. Finally, 15 g of wet cells with expressed transaminase variant (SEQ ID No: 198) and 70 g of substrate (Formula A1) were added into the reaction flask to start the reaction. After 20 hours, reaction sampling and HPLC showed a conversion rate of 99.7%.

[0082] Hydrochloric acid was added to the reaction till the pH reached 1～2. Then 1 L methanol was added, the temperature was raised to 60℃ with stirring for 1 hour. The mixture was filtered, and the filter cake was rinsed with 200 mL of methanol. The filtrate was concentrated, and a 40%sodium hydroxide aqueous solution was added under stirring. After stirring for 1 hour, it was filtered. The filter cake was rinsed twice with 300 mL of pure water, and dried to obtain 63 g of an off-white powder with a yield of 90%.

[0083] Example 5.5

[0084] Into a 2 L three-necked round-bottom flask, 14.9 g of triethanolamine (TEOA) , 640 g of pure water, and 118 g of isopropylamine (IPM) were added sequentially. Stirring of the reaction flask was started, and 1.0 g of pyridoxal 5'-phosphate (PLP) was added. After stirring for 3 minutes, approximately 170 mL of concentrated hydrochloric acid was slowly added with careful temperature control. After the hydrochloric acid was completely added, reaction temperature was maintained at 35℃, and reaction pH was adjusted to 8.5. Finally, 20 g of wet cells with expressed transaminase variant (SEQ ID No: 198) and 80 g of substrate (Formula D1) were added into the reaction flask to start the reaction. After 24 hours, reaction sampling and HPLC showed a conversion rate of 99.1%.

[0085] Hydrochloric acid was added to the reaction till the pH reached 1～2. Then 1 L methanol was added, the temperature was raised to 60℃ with stirring for 1 hour. The mixture was filtered, and the filter cake was rinsed with 200 mL of methanol. The filtrate was concentrated, and a 40%sodium hydroxide aqueous solution was added under stirring. After stirring for 1 hour, it was filtered. The filter cake was rinsed twice with 300 mL of pure water, and dried to obtain 60 g of an off-white powder with a yield of 75%.

[0086] Example 6: HPLC Analysis Method

[0087] 6.1 Concentration Detection Method

[0088] -Column: Ultimate XB-C8 (150 × 4.6 mm, 5 μm)

[0089] -Mobile phase: 0.1%phosphoric acid : acetonitrile = 60～45 : 40～55

[0090] -Flow rate: 2 mL / min

[0091] -Column temperature: 30℃

[0092] -Detection wavelength: 254 nm

[0093] -Retention time: 3.5 min for substrate A1, 1.1 min for product A2

[0094] The HPLC chromatogram of the substrate and product is shown in Figure 3.

[0095] 6.2 Chirality Detection Method

[0096] -Column: CHIRALPAK-ZWIX (+) (250 × 4 mm, 3 μm)

[0097] -Mobile phase: 60%methanol + 40%acetonitrile + 50 mM formic acid + 25 mM diethylamine

[0098] -Flow rate: 0.4 mL / min

[0099] -Column temperature: 25℃

[0100] -Detection wavelength: 254 nm

[0101] -Retention time: 33.5 min for the target A2 isomer, 31.8 min for the other isomer

[0102] The HPLC chromatogram is shown in Figure 4.

[0103] Comparative Example 1

[0104] According to the conditions described in Example 4 and the optimal enzyme sequence 3 of CN111748590B, 30 g of substrate A1 was added to 100 mL of toluene and 300 mL of enzyme solution, and the reaction was carried out until end point. The reaction system was heated to 100℃ to denature the protein. After filtration, the filter cake was slurried twice with ethyl acetate, and the aqueous phase was extracted once with ethyl acetate. The combined organic phases were concentrated under reduced pressure, and 18 g of product was obtained by column chromatography. The conversion rate of A1 in this reaction was measured as 90%, and the actual product yield was 60%. When the workup process described in Example 5 of the present invention was applied, 22 g of product could be obtained with an actual yield of 73%.

[0105] It should be understood that after reading the above content of this invention, those skilled in the art can make various modifications or adjustments to this invention, and these equivalent forms also fall within the scope defined by the appended claims of this invention.

Claims

1.An engineered transaminase polypeptide capable of catalyzing the conversion of a ketone substrate to a sacubitril intermediate, wherein the polypeptide comprises an amino acid sequence having at least 97%sequence identity to the reference sequence SEQ ID NO: 2 and containing at least one residue difference N34D compared to SEQ ID NO: 2.2.The engineered transaminase polypeptide of claim 1, wherein the reaction conditions include a ketone substrate loading of 1-100 g / L, an engineered polypeptide loading of 0.1-100 g / L, an amino donor loading of 10-300 g / L, a PLP cofactor concentration of 0.1-5 g / L, an organic solvent content of 0-50% (v / v) , a pH of 7.0-11.0, and a temperature of 10-60℃.3.An engineered polypeptide, wherein the polypeptide is:a) a polypeptide consisting of an amino acid sequence corresponding to SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204;b) a polypeptide with transaminase activity, wherein the amino acid sequence of the polypeptide has the following characteristics:i. at least 95%sequence identity to the amino acid sequence described in a) ;ii. at least one residue difference N34D compared to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.4.A polynucleotide encoding a polypeptide of any one of claim 3.5.The polynucleotide of claim 4, wherein the polynucleotide sequence corresponds to SEQ ID No: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 199, 201, 203.6.An expression vector comprising a polynucleotide of any one of claims 4-5.7.A host cell an expression vector of claim 6.8.A method for preparing a transaminase polypeptide, which comprises the steps of: culturing the host cell according to claim 7, and obtaining the transaminase polypeptide from the culture.9.A transaminase catalyst, which comprises the culture obtained according to claim 8, cells or culture medium containing the transaminase polypeptide obtained from the culture, or products processed therefrom; wherein the products refer to extracts obtained from cells, isolated products obtained by isolation or purification of the transaminase in the extracts, or immobilized products obtained by immobilizing cells, their extracts, or isolated products of the extracts.10.A process for preparing a compound of structural formula (I) : The amine product of Structural Formula (I) has the indicated stereochemical configuration at the chiral center marked with *; the amine product of Structural Formula (I) is in an enantiomeric excess relative to the opposite enantiomer, wherein R1 is an optionally substituted or unsubstituted aryl or heteroaryl group, or an optionally substituted or unsubstituted C1-C8 alkyl, cycloalkyl, or heterocycloalkyl group; R2 is an optionally substituted or unsubstituted C1-C6 alkyl group, carboxyl group, -CO2R’ / -COR’, -C (O) NR’, -SO2NH2 / -SONH2, -CN, -CF3; each R’is independently selected from a halogen, C1-C8 alkyl, C2-C12 alkenyl, C2-C12 alkynyl, cycloalkyl, aryl, or heterocycloalkyl group, the process comprises the step of contacting an amino donor and a ketone substrate of structural formula (II) :with the engineered polypeptide of claims 1-3 under reaction conditions suitable for converting the ketone substrate to the amine product.11.The process of claim 10, wherein the chiral amine products of structural formula (I) are: wherein R2 is an optionally substituted or unsubstituted C1-C6 alkyl group, carboxyl group, -CO2R’ / -COR’, -C (O) NR’, -SO2NH2 / -SONH2, -CN, -CF3; each R’is independently selected from a halogen, C1-C8 alkyl, C2-C12 alkenyl, C2-C12 alkynyl, cycloalkyl, aryl, or heterocycloalkyl group;R3 or R4 is an optionally substituted or unsubstituted C1-C4 alkyl group, -H, halogen (e.g., -F, -Cl, -Br, -I) , aryl, heteroaryl, -NO2, -NO, -SO2R’ / -SOR’, -SR’, -NR’R’, -OR’, -CO2R’ / -COR’, -C (O) NR’, -CNR’, -SO2NH2 / -SO NH2, -CN, CF3; each R’is independently selected from -H, C1-C4 alkyl, cycloalkyl, aryl, or heterocycloalkyl group; and the substrates of structural formula (II) are:12.The process of claim 10, wherein the chiral amine products of structural formula (I) are: 13.The process of claim 11, wherein R3 is at the para position of the phenyl ring, or R3 is at the meta position of the phenyl ring, or R3 is at the ortho position of the phenyl ring; or R3 is at both the para and meta positions of the phenyl ring, or R3 is at both the para and ortho positions of the phenyl ring, or R3 is at both the meta and ortho positions of the phenyl ring.14.A process for preparing the sacubitril intermediate of structural formula A2: wherein the process comprises the step of contacting the ketone substrate of structural formula A1with the engineered transaminase polypeptide of any one of claims 1-3 in the presence of an amino donor and appropriate reaction solvent under reaction conditions suitable for converting the compound of formula A1 to the compound of formula A2.15.The process of any one of claims 10-14, wherein the reaction conditions include a pH of 7.0-11.0 and a temperature of 10-60℃.16.The process of any one of claims 10-15, wherein the amino donor includes isopropylamine (IPM) , phenethylamine, and alanine.17.The process of any one of claims 10-16, wherein the reaction solvent includes water, methanol, ethanol, propanol, toluene, isopropyl acetate, dimethyl sulfoxide (DMSO) , methyl tert-butyl ether (MTBE) , dichloromethane (DCM) , or dimethylformamide (DMF) .18.A workup process for preparing a sacubitril intermediate, the process comprises: first adding hydrochloric acid to adjust the pH to 1～2, then adding methanol, heating to 60℃ and stirring for 1 hour, followed by filtration; rinsing the filter cake with methanol, concentrating the filtrate; adding a 40%aqueous sodium hydroxide solution during stirring, stirring for 1 hour, then filtering; rinsing the filter cake with pure water at least twice, and drying to obtain an off-white powder, i.e., the chiral amine product.

Images