Cell culture additive and uses thereof

Abstract

Provided is a cell culture additive or supplement that contains glycine, a selenite, and optionally histidine and lysine, as well as its use in batch or fed-batch culture of a mammalian cell for recombinant protein production.

Description

Cell culture additive and uses thereofCROSS REFERENCE TO RELATED APPLICATIONThis application claims priority from PCT international application PCT / CN2025 / 073990 filed January 22, 2025, which is incorporated herein by reference in its entirety.FIELD OF THE INVENTION

[0001] The present application generally relates to a cell culture additive or supplement that may comprise glycine, a selenite, and optionally histidine and lysine. The present application also relates to the use of the cell culture additive or supplement in culturing a mammalian cell that over-expresses a recombinant protein (e.g., an antibody) , for reducing the level of acidic species of the recombinant protein.BACKGROUND OF THE INVENTION

[0002] Among the biologic drugs under development and on the market, most are monoclonal antibodies (mAbs) . Antibodies are commonly produced in CHO cells, due to high production level, easy culture and scale-up, and correct antibody folding with desired post-translational modifications. The post-translational modifications may play important roles in antibodies’ characteristics. For example, sialic acid modification may prolong the circulatory half-life of antibodies by masking the terminal galactose that would otherwise be recognized by the hepatic asialoglycoprotein receptors (Sean Chia, et al., (2023) , Enhancing pharmacokinetic and pharmacodynamic properties of recombinant therapeutic proteins by manipulation of sialic acid content, Biomedicine &Pharmacotherapy, 163: 114757) .

[0003] These post-translational modifications, along with protein degradations, may cause antibody heterogeneity, including charge heterogeneity. When analyzed by ion-exchange chromatography (IEX) or isoelectric focusing (IEF) -based methods, the antibodies may be generally divided into three groups, the main peak or constituents, the acidic species or variants that elute earlier than the main peak from CEX or later than the main peak from AEX or alternatively with lower isoelectric point (pI) than the major constituents or species in IEF, and basic species or variants that elute later than the main peak from CEX or earlier than the main peak from AEX or alternatively with higher isoelectric point (pI) than the major constituents or species in IEF. The charge variants may result in different efficacy and pharmacokinetics outcomes. Particularly, acidic charge variants may negatively affect the therapeutic efficacy of antibodies (Chung S, et al., (2019) Modulating cell culture oxidative stress reduces protein glycation and acidic charge variant formation. MAbs. 11 (1) : 205-216) . Asparagine (Asn) deamidation, sialylation, and glycation are the major contributors to the formation of acidic variants, and cysteine-related modifications such as free cysteine, trisulfide bonds, cysteination, and glutathioneylation also cause the formation of acid variants. For example, the Asn deamidation in the CDR region may reduce the antibody binding ability of the antibodies, and the free cysteines in the antibodies may induce antibody aggregation leading to an increase in the immunogenicity, or alter antigen-binding activity (Beck A, et al., (2022) Risk-Based Control Strategies of Recombinant Monoclonal Antibody Charge Variants. Antibodies (Basel) . 11 (4) : 73) . Therefore, controlling acidic charge variants is critical for a bioprocess, especially an industrial bioprocess, of antibodies.

[0004] However, controlling charge heterogeneity remains a major challenge for manufacturing of biological therapeutics. The strategies may include control of raw material, manufacturing process, and the downstream processing. The cell culture is thought to be the most impactful stage on charge heterogeneity, due to the long duration, complicated media, and enzymes within or outside of the host cells (Beck A, et al., (2022) supra) . The cell culture operating parameters, including pH and temperature may be optimized to control or lower the acidic charge species levels. Studies have shown low cell culture temperature and low pH are effective in reduction of acidic charge variants. However, a low culture temperature may decrease the enzyme activity in host cells and affect the cell growth and metabolism and thus the antibody production level, while pH downshift may negatively affect cell metabolism and protein production. Alternatively, cell culture medium may be optimized for acidic charge variant reduction, including adjusting concentration of glucose, trace metals (e.g., iron, copper) or antioxidants. Higher sugar level was reported to correlate to higher acidic charge species level, and Fe2+ can induce the formation of reactive oxygen species (ROS) and thus caused the increase of acidic variants (Sissolak B, et al., (2019) Impact of mammalian cell culture conditions on monoclonal antibody charge heterogeneity: an accessory monitoring tool for process development. J Ind Microbiol Biotechnol. 46 (8) : 1167-1178; Gangwar, et al., (2022) Achieving charge variant profile of innovator molecule during development of monoclonal antibody based biosimilars –Use of media components. Biochemical Engineering Journal. 182: 1-7) . Cell culture media supplementation of bioflavonoids such as rutin and gallic acid as antioxidants reduced the percent of acidic variants (Hossler, et al., (2015) Cell Culture Media Supplementation of Bioflavonoids for the Targeted Reduction of Acidic Species Charge Variants on Recombinant Therapeutic Proteins. Biotechnology progress. 31 (4) : 1039-52) . The cells cultured in a medium containing 1 g / L or more arginine (Arg) , histidine (His) , lysine (Lys) or their combination produced antibodies with lower percentage of acidic variants (US 9, 683, 033B2) .

[0005] Citation or identification of any document in this application is not an admission that such document is available as prior art to the present invention.SUMMARY OF THE INVENTION

[0006] The inventors of the disclosure, have designed a cell culture additive or supplement, that simply contains glycine, a selenite, and optionally histidine and lysine. When added to CHO fed-batch culture in the early exponential growth phase (e.g., Day 3 of cultivation) , the cell culture additive or supplement surprisingly reduced the level of acidic species or variants in the antibodies as produced by the CHO cells, without affecting the main species level or even increasing the main species level to some extent, no matter what culture media were used in the cell culture. The cell culture additive or supplement containing histidine and lysine enhanced cell viability in the late culture stage.

[0007] Glycine is a common component in the cell culture medium, but there is little report on its role in reducing acidic variants of the protein as produced by the host cells. Further, the glycine in the cell culture medium was said to increase ammonium production and thus usually used in a low amount (Zizhuo Xing et al., (2011) Optimizing amino acid composition of CHO cell culture media for a fusion protein production. Process Biochemistry. 46: 1423-1429) . However, the introduction of additional glycine to the cell culture in the early exponential growth phase (e.g., Day 3 of the fed-batch culture) in the present application, did not adversely affect host cell growth and metabolism, and surprisingly reduced the acidic variants of the antibody as produced by the cultured cells.

[0008] Antioxidants such as bioflavonoids, when supplemented in the feed medium and added to the cells for several times during the culture, can reduce acidic charge variants of the protein as produced by the host cells (Hossler, et al., (2015) supra; Chung S, et al., (2019) ) . In the present application, a selenite, as an antioxidant, was introduced to the cell culture only once on Day 3 of the fed-batch culture, but not during the whole culture, successfully reduced the acidic variants of the antibody produced by the cultured cells.

[0009] Histidine and lysine, when added respectively in the cell culture at relatively high amounts, can reduce acidic variants of the antibody as produced by the cultured cells. However, the high histidine or lysine levels in the cell culture medium may cause tremendous cell viability decrease in the late culture stage (US 9,683,033B2) . In the present application, the addition of histidine and lysine alone showed mild effect on acidic variant reduction, but maintained the cell viability at a relatively high level in the late culture stage. When used together with glycine and the selenite, histidine and lysine further decreased the acidic variant level.

[0010] Therefore, in a first aspect, the disclosure provides a cell culture additive composition that may comprise or consist of glycine and a selenite.

[0011] The glycine may be glycine or a salt thereof, such as glycine hydrochloride. The glycine may be L-glycine.

[0012] The selenite may be sodium selenite, or potassium selenite. In certain embodiments, the selenite may be sodium selenite.

[0013] The cell culture additive composition may comprise or consist of the glycine and the selenite in a molar ratio of about 2.66: 2.89×10-3 -10.66: 2.89×10-4, such as about 3.33: 1.45×10-3 -6.66: 7.2×10-4, e.g., about 6.66: 1.45×10-3 -6.66: 7.2×10-4. In certain embodiments, the cell culture additive composition may comprise or consist of the glycine and the selenite in a molar ratio of about 6.66: 1.45×10-3.

[0014] The cell culture additive composition may comprise about 2.66×10-3 mol or more, or about 3.33×10-3 mol or more glycine, and about 10.66×10-3 mol or less, or about 6.66 ×10-3 mol or less glycine, when prepared for 1 L cell culture. The cell culture additive composition may comprise about 2.89×10-7 mol or more, or about 7.2×10-7 mol or more selenite, and about 2.89×10-6 mol or less, or about 1.45×10-6 mol or less selenite, when prepared for 1 L cell culture. The cell culture additive composition may comprise or consist of about 2.66×10-3 –10.66×10-3 mol glycine and about 2.89×10-7 -2.89×10-6 mol selenite, such as about 3.33×10-3-6.66×10-3 mol glycine and about 7.2×10-7-1.45×10-6 mol selenite, e.g., about 6.66×10-3 mol glycine and about 1.45×10-6 mol selenite, when prepared for 1 L cell culture.

[0015] The cell culture additive composition may comprise about 99.75-99.99 wt%glycine and about 0.01-0.25 wt%sodium selenite, such as about 99.88-99.98 wt%glycine and 0.02-0.12 wt% (weight%) sodium selenite, e.g., about 99.95 wt%glycine and 0.05 wt%sodium selenite.

[0016] The cell culture additive composition may comprise about 200 mg or more, or about 250 mg or more glycine, and about 800 mg or less, or about 500 mg or less glycine, when prepared for 1 L cell culture. The cell culture additive composition may comprise about 0.05 mg or more, about 0.125 mg or more, and about 0.5 mg or less, or about 0.25 mg or less sodium selenite, when prepared for 1 L cell culture. The cell culture additive composition may comprise or consist of about 200-800 mg glycine and about 0.05-0.5 mg sodium selenite, such as about 250-500 mg glycine and about 0.125-0.25 mg sodium selenite, e.g., about 500 mg glycine and about 0.25 mg sodium selenite, when prepared for 1 L cell culture.

[0017] In a second aspect, the disclosure provides a cell culture additive composition that may comprise or consist of histidine and lysine.

[0018] The histidine may be histidine or a salt thereof, e.g., histidine hydrochloride. The histidine may be L-histidine. In certain embodiments, the histidine may be L-histidine hydrochloride monohydrate.

[0019] The lysine may be lysine or a salt thereof, e.g., lysine hydrochloride. The lysine may be L-lysine. In certain embodiments, the lysine may be L-lysine monohydrochloride.

[0020] The cell culture additive composition may comprise or consist of the histidine and the lysine in a molar ratio of about 1.19: 6.57-7.16: 2.19, such as about 2.39: 4.38-4.77: 2.19, e.g., about 4.77: 4.38-4.77: 2.19. In certain embodiments, the cell culture additive composition may comprise or consist of the histidine and the lysine in a molar ratio of about 4.77: 4.38.

[0021] The cell culture additive composition may comprise about 1.19×10-3 mol or more, or about 2.39×10-3 mol or more, and about 7.16×10-3 mol or less, or about 4.77×10-3 mol or less histidine, when prepared for 1 L cell culture. The cell culture additive composition may comprise about 2.19×10-3 mol or more, or about 4.38×10-3 mol or more and about 6.57×10-3 mol or less, or about 4.38×10-3 mol or less lysine, when prepared for 1 L cell culture. The cell culture additive composition may comprise or consist of about 1.19×10-3 –7.16×10-3 mol histidine and about 2.19×10-3 –6.57×10-3 mol lysine, such as about 2.39×10-3-4.77×10-3 mol histidine and about 2.19×10-3-4.38×10-3 mol lysine, e.g., about 4.77×10-3 mol histidine and about 4.38×10-3 mol lysine, when prepared for 1 L cell culture.

[0022] The cell culture additive composition may comprise about 17.24-78.95 wt%L-histidine hydrochloride monohydrate and about 21.05-82.76 wt%L-lysine monohydrochloride, such as about 38.46-71.43 wt%L-histidine hydrochloride monohydrate and about 28.57-61.54 wt%L-lysine monohydrochloride, e.g., about 55.56 wt%L-histidine hydrochloride monohydrate and 44.44 wt%L-lysine monohydrochloride.

[0023] The cell culture additive composition may comprise about 250 mg or more, or 500 mg or more, and about 1500 mg or less, or about 1000 mg or less L-histidine hydrochloride, when prepared for 1 L cell culture. The cell culture additive composition may comprise about 400 mg or more, or 800 mg or more, and 1200 mg or less, or 800 mg or less L-lysine monohydrochloride, when prepared for 1 L cell culture. The cell culture additive composition may comprise or consist of about 250-1500 mg L-histidine hydrochloride and about 400-1200 mg L-lysine monohydrochloride, such as about 500-1000 mg L-histidine hydrochloride monohydrate and about 400-800 mg L-lysine monohydrochloride, e.g., about 1000 mg L-histidine hydrochloride monohydrate and about 800 mg L-lysine monohydrochloride, when prepared for 1 L cell culture.

[0024] In a third aspect, the disclosure may provide a cell culture additive composition that may comprise or consist of glycine, a selenite, histidine and lysine.

[0025] The cell culture additive composition may comprise or consist of the glycine, the selenite, the histidine and the lysine in a molar ratio of about (2.66-10.66) : (2.89×10-4 –2.89×10-3) : (1.19-7.16) : (2.19-6.57) , such as about (3.33-6.66) : (7.2×10-4-1.45×10-3) : (2.39–4.77) : (2.19–4.38) , e.g., about 3.33: 7.2×10-4: 2.39: 2.19 -6.66: 1.45×10-3: 4.77: 4.38, e.g., about 3.33: 1.45×10-3: 2.39: 4.38 -6.66: 1.45×10-3: 4.77: 4.38.

[0026] The cell culture additive composition may comprise or consist of the glycine, the selenite, the histidine and the lysine in a molar ratio of about 6.66: 1.45×10-3: 4.77: 4.38, about 3.33: 7.2×10-4: 2.39: 2.19, about 6.66: 1.45×10-3: 2.39: 4.38, about 6.66: 7.2×10-4: 4.77: 2.19, about 3.33: 1.45×10-3: 4.77: 4.38, or about 3.33: 7.2×10-4: 4.77: 2.19.

[0027] The cell culture additive composition may comprise about 2.66×10-3 mol or more, or about 3.33×10-3 mol or more glycine, and about 10.66×10-3 mol or less, or about 6.66 ×10-3 mol or less glycine, when prepared for 1 L cell culture. The cell culture additive composition may comprise about 2.89×10-7 mol or more, or about 7.2×10-7 mol or more selenite, and about 2.89×10-6 mol or less, or about 1.45×10-6 mol or less selenite, when prepared for 1 L cell culture. The cell culture additive composition may comprise about 1.19×10-3 mol or more, or about 2.39×10-3 mol or more, and about 7.16×10-3 mol or less, or about 4.77×10-3 mol or less histidine, when prepared for 1 L cell culture. The cell culture additive composition may comprise about 2.19×10-3 mol or more, or about 4.38×10-3 mol or more, and about 6.57×10-3 mol or less, or about 4.38×10-3 mol or less lysine, when prepared for 1 L cell culture. The cell culture additive composition may comprise or consist of about 2.66×10-3 –10.66×10-3 mol glycine, about 2.89×10-7 -2.89×10-6 mol selenite, about 1.19×10-3 –7.16×10-3 mol histidine and about 2.19×10-3 –6.57×10-3 mol lysine, when prepared for 1 L cell culture. The cell culture additive composition may comprise of consist of about 3.33×10-3 mol glycine, about 1.45×10-6 mol selenite, about 4.77×10-3 mol histidine, and about 4.38×10-3 mol lysine; about 6.66×10-3 mol glycine, about 1.45×10-6 mol selenite, about 2.39×10-3 mol histidine, and about 4.38×10-3 mol lysine; about 6.66×10-3 mol glycine, about 1.45×10-6 mol selenite, about 4.77×10-3 mol histidine, and about 4.38×10-3 mol lysine; about 6.66×10-3 mol glycine, about 7.2×10-7 mol selenite, about 4.77×10-3 mol histidine, and about 2.19×10-3 mol lysine; about 3.33×10-3 mol glycine, about 1.45×10-6 mol selenite, about 4.77×10-3 mol histidine, and about 4.38×10-3 mol lysine; or about 3.33×10-3 mol glycine, about 7.2×10-7 mol selenite, about 4.77×10-3 mol histidine, and about 2.19×10-3 mol lysine, when prepared for 1 L cell culture.

[0028] The glycine may be glycine or a salt thereof, such as glycine hydrochloride. The glycine may be L-glycine.

[0029] The selenite may be sodium selenite, or potassium selenite. In certain embodiments, the selenite may be sodium selenite.

[0030] The histidine may be histidine or a salt thereof, e.g., histidine hydrochloride. The histidine may be L-histidine. In certain embodiments, the histidine may be L-histidine hydrochloride monohydrate.

[0031] The lysine may be lysine or a salt thereof, e.g., lysine hydrochloride. The lysine may be L-lysine. In certain embodiments, the lysine may be L-lysine monohydrochloride.

[0032] The cell culture additive composition may comprise or consist of about 6.90-55.17 wt%glycine, about 0.001-0.059 wt%sodium selenite, about 11.11-71.43 wt%L-Histidine hydrochloride monohydrate, and about 14.81-72.73 wt%L-Lysine monohydrochloride, such as about 12.19-35.71 wt%glycine, about 0.005-0.022 wt%sodium selenite, about 27.77-60.60 wt%L-Histidine hydrochloride monohydrate, and about 21.05-51.61 wt%L-Lysine monohydrochloride. The cell culture additive composition, in certain embodiments, may comprise or consist of about 21.74 wt%glycine, about 0.011 wt%sodium selenite, about 43.47 wt%L-Histidine hydrochloride monohydrate, and about 34.78 wt%L-Lysine monohydrochloride; about 27.77 wt%glycine, about 0.014 wt%sodium selenite, about 27.77 wt%L-Histidine hydrochloride monohydrate, and about 44.44 wt%L-Lysine monohydrochloride; about 26.31 wt%glycine, about 0.007 wt%sodium selenite, about 52.63 wt%L-Histidine hydrochloride monohydrate, and about 21.05 wt%L-Lysine monohydrochloride; about 12.19 wt%glycine, about 0.012 wt%sodium selenite, about 48.77 wt%L-Histidine hydrochloride monohydrate, and about 39.02 wt%L-Lysine monohydrochloride; or about 15.15 wt%glycine, about 0.008 wt%sodium selenite, about 60.60 wt%L-Histidine hydrochloride monohydrate, and about 24.24 wt%L-Lysine monohydrochloride.

[0033] The cell culture additive composition may comprise about 200 mg or more, or about 250 mg or more glycine, and about 800 mg or less, or about 500 mg or less glycine, when prepared for 1 L cell culture. The cell culture additive composition may comprise about 0.05 mg or more, about 0.125 mg or more, and about 0.5 mg or less, or about 0.25 mg or less sodium selenite, when prepared for 1 L cell culture. The cell culture additive composition may comprise about 250 mg or more, or 500 mg or more, and about 1500 mg or less, or about 1000 mg or less L-histidine hydrochloride, when prepared for 1 L cell culture. The cell culture additive composition may comprise about 400 mg or more, or 800 mg or more, and 1200 mg or less, or 800 mg or less L-lysine monohydrochloride, when prepared for 1 L cell culture. The cell culture additive composition may comprise about 200-800 mg glycine, about 0.05-0.5 mg sodium selenite, about 250-1500 mg L-histidine hydrochloride, and about 400-1200 mg L-lysine monohydrochloride, when prepared for 1 L cell culture. The cell culture additive composition may comprise or consist of about 500 mg glycine, about 0.25 mg sodium selenite, about 1000 mg L-Histidine hydrochloride monohydrate, and about 800 mg L-Lysine monohydrochloride; about 250 mg glycine, about 0.125 mg sodium selenite, about 500 mg L-Histidine hydrochloride monohydrate, and about 400 mg L-Lysine monohydrochloride; about 500 mg glycine, about 0.25 mg sodium selenite, about 500 mg L-Histidine hydrochloride monohydrate, and about 800 mg L-Lysine monohydrochloride; about 500 mg glycine, about 0.125 mg sodium selenite, about 1000 mg L-Histidine hydrochloride monohydrate, and about 400 mg L-Lysine monohydrochloride; about 250 mg glycine, about 0.25 mg sodium selenite, about 1000 mg L-Histidine hydrochloride monohydrate, and about 800 mg L-Lysine monohydrochloride; about 250 mg glycine, about 0.125 mg sodium selenite, about 1000 mg L-Histidine hydrochloride monohydrate, and about 400 mg L-Lysine monohydrochloride, when prepared for 1 L cell culture.

[0034] The cell culture additive composition of the disclosure may be used in batch culture or fed-batch culture of a mammalian cell. For example, the cell culture additive composition of the disclosure may be added to the cell on e.g., Day 3 of the cell culture. The cell culture additive of the disclosure, when added to a mammalian cell engineered to express, e.g., over-express, a recombinant protein, especially a recombinant antibody, may reduce the level of acidic variants in the proteins as produced by the mammalian cell, and in some cases may even increase the level of the main species.

[0035] Therefore, in a fourth aspect, the disclosure provides the use of the cell culture additive composition of the disclosure, in culturing a mammalian cell that expresses (e.g., over-expresses) a recombinant protein, for e.g., reducing the level of the acidic variants of the protein, improving the cell viability in the late culture stage, or increasing the main species of the protein. Particularly, the disclosure provides the use of the cell culture additive composition of the disclosure in reducing the level of the acidic variants of a recombinant protein produced by a mammalian cell.

[0036] The recombinant protein may be a recombinant antibody.

[0037] The mammalian cell may be a Chinese ovary (CHO) cell, e.g., a CHO-K1 cell. The mammalian cell may have been adapted for suspension culture. The mammalian cell may be a CHO cell, e.g., a CHO-K1 cell, for suspension culture.

[0038] The mammalian cell may be a recombinant cell that over-expresses a recombinant protein. The mammalian cell may comprise a nucleic acid molecule for over-expressing the recombinant protein, integrated into its genome, or in an expression vector. The expression vector may be a DNA molecule (e.g., a plasmid vector) , a RNA molecule (e.g., a circular RNA molecule) , or a DNA-RNA molecule. The mammalian cell may be introduced by e.g., transfection, with the nucleic acid molecule for over-expressing the recombinant protein in e.g., a vector. The vector may be a DNA molecule, e.g., a plasmid vector such as an adeno-associated virus (AAV) vector. The recombinant protein may be an antibody.

[0039] The cell culture additive or supplement composition of the disclosure may be added to a batch culture or a fed-batch culture, of the mammalian cell in the early exponential phase (e.g., Day 3 of the fed-batch culture) .

[0040] Particularly, the disclosure provides a method for culturing a mammalian cell, which may comprise culturing the mammalian cell in a cell culture medium in a fed-batch culture or a batch culture, and adding to the cell culture medium in the early exponential phase (e.g., 1st, 2nd or 3rd day, such as 3rd day of the fed-batch culture or the batch culture) the cell culture additive composition of the disclosure.

[0041] The step of adding to the cell culture medium the cell culture additive composition of the disclosure may comprise adding glycine and a selenite at final concentrations of about 2.66×10-3 -10.66×10-3 mol / L and about 2.89×10-7 -2.89×10-6 mol / L, respectively. The step of adding to the cell culture medium the cell culture additive composition of the disclosure may comprise adding the glycine at the final concentration of about 2.66×10-3 mol / L or more, about 3.33×10-3 mol / L or more, and about 10.66×10-3 mol / L or less, or about 6.66×10-3 mol / L or less. The step of adding to the cell culture medium the cell culture additive composition of the disclosure may comprise adding the selenite at the final concentration of about 2.89×10-7 mol / L or more, or about 7.2×10-7 mol / L or more, and about 2.89×10-6 mol / L or less, or about 1.45×10-6 mol / L or less. The step of adding to the cell culture medium the cell culture additive composition of the disclosure may comprise adding glycine and a selenite at final concentrations of about 3.33×10-3 -6.66×10-3 mol / L and about 7.2×10-7 -1.45×10-6 mol / L, respectively. In certain embodiments, the step of adding to the cell culture medium the cell culture additive composition of the disclosure may comprise adding glycine and the selenite at final concentrations of about 6.66×10-3 mol / L and about 1.45×10-6 mol / L, respectively.

[0042] The step of adding to the cell culture medium the cell culture additive composition of the disclosure may comprise adding histidine and lysine at final concentrations of about 1.19×10-3 –7.16×10-3 mol / L and about 2.19×10-3 –6.57×10-3 mol / L, respectively. The step of adding to the cell culture medium the cell culture additive composition of the disclosure may comprise adding histidine at the final concentration of about 1.19×10-3 mol / L or more, about 2.39×10-3 mol / L or more, and about 7.16×10-3 mol / L or less, or about 4.77×10-3 mol / L or less. The step of adding to the cell culture medium the cell culture additive composition of the disclosure may comprise adding lysine at the final concentration of about 2.19×10-3 mol / L or more, about 4.38×10-3 mol / L or more, and about 6.57×10-3 mol / L or less, or about 4.38×10-3 mol / L or less. The step of adding to the cell culture medium the cell culture additive composition of the disclosure may comprise adding histidine and lysine at final concentrations of about 2.39×10-3 -4.77×10-3 mol / L and about 2.19×10-3 -4.38×10-3 mol / L, respectively. In certain embodiments, the step of adding to the cell culture medium the cell culture additive composition of the disclosure may comprise adding histidine and lysine at final concentrations of about 4.77×10-3 mol / L and about 4.38×10-3 mol / L, respectively.

[0043] The step of adding to the cell culture medium the cell culture additive composition of the disclosure may comprise adding glycine, a selenite, histidine and lysine at final concentrations of about 2.66×10-3 –10.66×10-3 mol / L, about 2.89×10-7 –2.89×10-6 mol / L, about 1.19×10-3 –7.16×10-3 mol / L and about 2.19×10-3 –6.57×10-3 mol / L, respectively. The step of adding to the cell culture medium the cell culture additive composition of the disclosure may comprise adding glycine, a selenite, histidine and lysine at final concentrations of 3.33×10-3 -6.66×10-3 mol / L, 7.2×10-7 -1.45×10-6 mol / L, 2.39×10-3 -4.77×10-3 mol / L and 2.19×10-3 -4.38×10-3 mol / L, respectively. The step of adding to the cell culture medium the cell culture additive composition of the disclosure may comprise adding the glycine at the final concentration of about 2.66×10-3 mol / L or more, about 3.33×10-3 mol / L or more, and about 10.66×10-3 mol / L or less, or about 6.66×10-3 mol / L or less. The step of adding to the cell culture medium the cell culture additive composition of the disclosure may comprise adding the selenite at the final concentration of about 2.89×10-7 mol / L or more, or about 7.2×10-7 mol / L or more, and about 2.89×10-6 mol / L or less, or about 1.45×10-6 mol / L or less. The step of adding to the cell culture medium the cell culture additive composition of the disclosure may comprise adding histidine at the final concentration of about 1.19×10-3 mol / L or more, about 2.39×10-3 mol / L or more, and about 7.16×10-3 mol / L or less, or about 4.77×10-3 mol / L or less. The step of adding to the cell culture medium the cell culture additive composition of the disclosure may comprise adding lysine at the final concentration of about 2.19×10-3 mol / L or more, about 4.38×10-3 mol / L or more, and about 6.57×10-3 mol / L or less, or about 4.38×10-3 mol / L or less. In certain embodiments, the step of adding to the cell culture medium the cell culture additive composition of the disclosure may comprise adding glycine, the selenite, histidine and lysine at final concentrations of about 6.66×10-3 mol / L, about 1.45×10-6 mol / L, about 4.77×10-3 mol / L and about 4.38×10-3 mol / L, respectively; about 3.33×10-3 mol / L, about 7.2×10-7 mol / L, about 2.39×10-3 mol / L and about 2.19×10-3 mol / L, respectively; about 6.66×10-3 mol / L, about 1.45×10-6 mol / L, about 2.39×10-3 mol / L and about 4.38×10-3 mol / L, respectively; about 6.66×10-3 mol / L, about 7.2×10-7 mol / L, about 4.77×10-3 mol / L and about 2.19×10-3 mol / L, respectively; about 3.33×10-3 mol / L, about 1.45×10-6 mol / L, about 4.77×10-3 mol / L and about 4.38×10-3 mol / L, respectively; or about 3.33×10-3 mol / L, about 7.2×10-7 mol / L, about 4.77×10-3 mol / L and about 2.19×10-3 mol / L, respectively.

[0044] The glycine may be glycine or a salt thereof, such as glycine hydrochloride. The glycine may be L-glycine.

[0045] The selenite may be sodium selenite, or potassium selenite. In certain embodiments, the selenite may be sodium selenite.

[0046] The histidine may be histidine or a salt thereof, e.g., histidine hydrochloride. The histidine may be L-histidine. In certain embodiments, the histidine may be L-histidine hydrochloride monohydrate.

[0047] The lysine may be lysine or a salt thereof, e.g., lysine hydrochloride. The lysine may be L-lysine. In certain embodiments, the lysine may be L-lysine monohydrochloride.

[0048] The step of adding to the cell culture medium the cell culture additive composition of the disclosure may comprise adding about 200-800 mg / L glycine and about 0.05-0.5 mg / L sodium selenite. The step of adding to the cell culture medium the cell culture additive composition of the disclosure may comprise adding about 250-500 mg / L glycine and about 0.125-0.25 mg / L sodium selenite. The step of adding to the cell culture medium the cell culture additive composition of the disclosure may comprise adding about 200 mg / L or more, about 250 mg / L or more, and about 800 mg / L or less, or about 500 mg / L or less glycine. The step of adding to the cell culture medium the cell culture additive composition of the disclosure may comprise adding about 0.05 mg / L or more, about 0.125 mg / L or more, and about 0.5 mg / L or less, or about 0.25 mg / L or less sodium selenite. In certain embodiments, the step of adding to the cell culture medium the cell culture additive composition of the disclosure may comprise adding about 500 mg / L glycine and about 0.25 mg / L sodium selenite.

[0049] The step of adding to the cell culture medium the cell culture additive composition of the disclosure may comprise adding about 250-1500 mg / L L-histidine hydrochloride monohydrate and about 400-1200 mg / L L-lysine monohydrochloride. The step of adding to the cell culture medium the cell culture additive composition of the disclosure may comprise adding about 500-1000 mg / L L-histidine hydrochloride monohydrate and about 400-800 mg / L L-lysine monohydrochloride. The step of adding to the cell culture medium the cell culture additive composition of the disclosure may comprise adding about 250 mg / L or more, about 500 mg / L or more, and 1500 mg / L or less, or about 1000 mg / L or less L-histidine hydrochloride monohydrate. The step of adding to the cell culture medium the cell culture additive composition of the disclosure may comprise adding about 400 mg / L or more, or about 800 mg / L or more, and about 1200 mg / L or less, or about 800 mg / L or less L-lysine monohydrochloride. In certain embodiments, the step of adding to the cell culture medium the cell culture additive composition of the disclosure may comprise adding about 1000 mg / L L-histidine hydrochloride monohydrate and about 800 mg / L L-lysine monohydrochloride.

[0050] The step of adding to the cell culture medium the cell culture additive composition of the disclosure may comprise adding about 200-800 mg / L glycine, about 0.05-0.5 mg / L sodium selenite, about 250-1500 mg / L L-histidine hydrochloride monohydrate and about 400-1200 mg / L L-lysine monohydrochloride. The step of adding to the cell culture medium the cell culture additive composition of the disclosure may comprise adding about 250-500 mg / L glycine, about 0.125-0.25 mg / L sodium selenite, about 500-1000 mg / L L-histidine hydrochloride monohydrate and about 400-800 mg / L L-lysine monohydrochloride. The step of adding to the cell culture medium the cell culture additive composition of the disclosure may comprise adding about 200 mg / L or more, about 250 mg / L or more, and about 800 mg / L or less, or about 500 mg / L or less glycine. The step of adding to the cell culture medium the cell culture additive composition of the disclosure may comprise adding about 0.05 mg / L or more, about 0.125 mg / L or more, and about 0.5 mg / L or less, or about 0.25 mg / L or less sodium selenite. The step of adding to the cell culture medium the cell culture additive composition of the disclosure may comprise adding about 250 mg / L or more, about 500 mg / L or more, and 1500 mg / L or less, or about 1000 mg / L or less L-histidine hydrochloride monohydrate. The step of adding to the cell culture medium the cell culture additive composition of the disclosure may comprise adding about 400 mg / L or more, or about 800 mg / L or more, and about 1200 mg / L or less, or about 800 mg / L or less L-lysine monohydrochloride. In certain embodiments, the step of adding to the cell culture medium the cell culture additive composition of the disclosure may comprise adding about 500 mg / L glycine, about 0.25 mg / L sodium selenite, about 1000 mg / L L-Histidine hydrochloride monohydrate, and about 800 mg / L L-Lysine monohydrochloride; about 250 mg / L glycine, about 0.125 mg / L sodium selenite, about 500 mg / L L-Histidine hydrochloride monohydrate, and about 400 mg / L L-Lysine monohydrochloride; about 500 mg / L glycine, about 0.25 mg / L sodium selenite, about 500 mg / L L-Histidine hydrochloride monohydrate, and about 800 mg / L L-Lysine monohydrochloride; about 500 mg / L glycine, about 0.125 mg / L sodium selenite, about 1000 mg / L L-Histidine hydrochloride monohydrate, and about 400 mg / L L-Lysine monohydrochloride; about 250 mg / L glycine, about 0.25 mg / L sodium selenite, about 1000 mg / L L-Histidine hydrochloride monohydrate, and about 800 mg / L L-Lysine monohydrochloride; about 250 mg / L glycine, about 0.125 mg / L sodium selenite, about 1000 mg / L L-Histidine hydrochloride monohydrate, and about 400 mg / L L-Lysine monohydrochloride.

[0051] The method may further comprise maintaining the glucose concentration at about 7 g / L during the batch culture or the fed-batch culture. In certain embodiment, the method may comprise supplementing glucose every day, from e.g., Day 3 of the batch culture or the fed-batch culture, to bring glucose concentration to about 7 g / L.

[0052] The method may comprise inoculating the mammalian cell at a suitable seeding density. In certain embodiments, the method may comprise inoculating the mammalian cell at a cell density of 0.4 to 0.6×106 cells / mL.

[0053] The method may comprise culturing the mammalian cell under a suitable condition. In certain embodiments, the method may comprise culturing the mammalian cell at a shaking speed of 280 rpm under 5%CO2 and 80%humidity.

[0054] The method may comprise culturing the mammalian cell for 11 days or more. In certain embodiments, the method may comprise culturing the mammalian cell for 11 days.

[0055] The method may comprise culturing the mammalian cell in chemically defined medium, e.g., chemically defined basal and feed media. In certain embodiment, the method may comprise culturing the mammalian cell in UproCHOTM M01 basal medium and UproCHOTM F01A and UproCHOTM F01B feed medium. In certain embodiment, the method may comprise culturing the mammalian cell in Altair CHO medium basal medium and Altair Feed and CDFS36 feed media. The method may comprise seeding the mammalian cells into basal medium at the beginning of the culture. The method may comprise adding the feed medium every other day, beginning on 3rd day of the fed-batch culture.

[0056] The recombinant protein may be a recombinant antibody.

[0057] The mammalian cell may be a Chinese ovary (CHO) cell, e.g., a CHO-K1 cell. The mammalian cell may have been adapted for suspension culture. The mammalian cell may be a CHO cell, e.g., a CHO-K1 cell, for suspension culture.

[0058] The mammalian cell may be a recombinant cell that over-expresses a recombinant protein. The mammalian cell may comprise a nucleic acid molecule for over-expressing the recombinant protein, integrated into its genome, or in an expression vector. The expression vector may be a DNA molecule (e.g., a plasmid vector) , a RNA molecule (e.g., a circular RNA molecule) , or a DNA-RNA molecule. The mammalian cell may be introduced by e.g., transfection, with the nucleic acid molecule for over-expressing the recombinant protein in e.g., a vector. The vector may be a DNA molecule, e.g., a plasmid vector such as an adeno-associated virus (AAV) vector. The recombinant protein may be an antibody.

[0059] In certain embodiments, the method may reduce acidic variants of the recombinant protein, e.g., the recombinant antibody, as produced by the mammalian cell.

[0060] In certain embodiments, the method may reduce acidic variants of the recombinant protein with slight increase of basic species of the recombinant protein.

[0061] In certain embodiments, the method may increase main species of the recombinant protein, e.g., the recombinant antibody, as produced by the mammalian cell.

[0062] In certain embodiments, the method may increase the level or titer of the recombinant protein, e.g., the recombinant antibody, as produced by the mammalian cell.

[0063] In certain embodiments, the method may improve cell viability in the late culture stage.

[0064] The disclosure also provide a method for reducing acidic variants of a recombinant protein produced by a recombinant mammalian cell, wherein the recombinant mammalian cell expresses (e.g., over-expresses) the recombinant protein, the method comprising performing the method of the disclosure for culturing a mammalian cell. Particularly, the method may comprise culturing the recombinant mammalian cell in a cell culture medium in a batch culture or a fed-batch culture, and adding the cell culture additive composition of the disclosure to the cell culture medium in the early exponential phase (e.g., 1st, 2nd or 3rd day, such as 3rd day of the batch culture or the fed-batch culture) .

[0065] The recombinant protein may be a recombinant antibody.

[0066] The recombinant mammalian cell may be a Chinese ovary (CHO) cell, e.g., a CHO-K1 cell, that over-expresses a recombinant protein. The recombinant mammalian cell may have been adapted for suspension culture. The recombinant mammalian cell may be a CHO cell, e.g., a CHO-K1 cell, for suspension culture. The recombinant mammalian cell may comprise a nucleic acid molecule for over-expressing the recombinant protein, integrated into its genome, or in an expression vector.

[0067] The step of adding to the cell culture medium the cell culture additive composition of the disclosure may comprise adding glycine and a selenite at final concentrations of about 2.66×10-3 -10.66×10-3 mol / L and about 2.89×10-7 -2.89×10-6 mol / L, respectively. The step of adding to the cell culture medium the cell culture additive composition of the disclosure may comprise adding the glycine at the final concentration of about 2.66×10-3 mol / L or more, about 3.33×10-3 mol / L or more, and about 10.66×10-3 mol / L or less, or about 6.66×10-3 mol / L or less. The step of adding to the cell culture medium the cell culture additive composition of the disclosure may comprise adding the selenite at the final concentration of about 2.89×10-7 mol / L or more, or about 7.2×10-7 mol / L or more, and about 2.89×10-6 mol / L or less, or about 1.45×10-6 mol / L or less. The step of adding to the cell culture medium the cell culture additive composition of the disclosure may comprise adding glycine and a selenite at final concentrations of about 3.33×10-3 -6.66×10-3 mol / L and about 7.2×10-7 -1.45×10-6 mol / L, respectively. In certain embodiments, the step of adding to the cell culture medium the cell culture additive composition of the disclosure may comprise adding glycine and the selenite at final concentrations of about 6.66×10-3 mol / L and about 1.45×10-6 mol / L, respectively.

[0068] The step of adding to the cell culture medium the cell culture additive composition of the disclosure may comprise adding histidine and lysine at final concentrations of about 1.19×10-3 –7.16×10-3 mol / L and about 2.19×10-3 –6.57×10-3 mol / L, respectively. The step of adding to the cell culture medium the cell culture additive composition of the disclosure may comprise adding histidine at the final concentration of about 1.19×10-3 mol / L or more, about 2.39×10-3 mol / L or more, and about 7.16×10-3 mol / L or less, or about 4.77×10-3 mol / L or less. The step of adding to the cell culture medium the cell culture additive composition of the disclosure may comprise adding lysine at the final concentration of about 2.19×10-3 mol / L or more, about 4.38×10-3 mol / L or more, and about 6.57×10-3 mol / L or less, or about 4.38×10-3 mol / L or less. The step of adding to the cell culture medium the cell culture additive composition of the disclosure may comprise adding histidine and lysine at final concentrations of about 2.39×10-3 -4.77×10-3 mol / L and about 2.19×10-3 -4.38×10-3 mol / L, respectively. In certain embodiments, the step of adding to the cell culture medium the cell culture additive composition of the disclosure may comprise adding histidine and lysine at final concentrations of about 4.77×10-3 mol / L and about 4.38×10-3 mol / L, respectively.

[0069] The step of adding to the cell culture medium the cell culture additive composition of the disclosure may comprise adding glycine, a selenite, histidine and lysine at final concentrations of about 2.66×10-3 –10.66×10-3 mol / L, about 2.89×10-7 –2.89×10-6 mol / L, about 1.19×10-3 –7.16×10-3 mol / L and about 2.19×10-3 –6.57×10-3 mol / L, respectively. The step of adding to the cell culture medium the cell culture additive composition of the disclosure may comprise adding glycine, a selenite, histidine and lysine at final concentrations of 3.33×10-3 -6.66×10-3 mol / L, 7.2×10-7 -1.45×10-6 mol / L, 2.39×10-3 -4.77×10-3 mol / L and 2.19×10-3 -4.38×10-3 mol / L, respectively. The step of adding to the cell culture medium the cell culture additive composition of the disclosure may comprise adding the glycine at the final concentration of about 2.66×10-3 mol / L or more, about 3.33×10-3 mol / L or more, and about 10.66×10-3 mol / L or less, or about 6.66×10-3 mol / L or less. The step of adding to the cell culture medium the cell culture additive composition of the disclosure may comprise adding the selenite at the final concentration of about 2.89×10-7 mol / L or more, or about 7.2×10-7 mol / L or more, and about 2.89×10-6 mol / L or less, or about 1.45×10-6 mol / L or less. The step of adding to the cell culture medium the cell culture additive composition of the disclosure may comprise adding histidine at the final concentration of about 1.19×10-3 mol / L or more, about 2.39×10-3 mol / L or more, and about 7.16×10-3 mol / L or less, or about 4.77×10-3 mol / L or less. The step of adding to the cell culture medium the cell culture additive composition of the disclosure may comprise adding lysine at the final concentration of about 2.19×10-3 mol / L or more, about 4.38×10-3 mol / L or more, and about 6.57×10-3 mol / L or less, or about 4.38×10-3 mol / L or less. In certain embodiments, the step of adding to the cell culture medium the cell culture additive composition of the disclosure may comprise adding glycine, the selenite, histidine and lysine at final concentrations of about 6.66×10-3 mol / L, about 1.45×10-6 mol / L, about 4.77×10-3 mol / L and about 4.38×10-3 mol / L, respectively; about 3.33×10-3 mol / L, about 7.2×10-7 mol / L, about 2.39×10-3 mol / L and about 2.19×10-3 mol / L, respectively; about 6.66×10-3 mol / L, about 1.45×10-6 mol / L, about 2.39×10-3 mol / L and about 4.38×10-3 mol / L, respectively; about 6.66×10-3 mol / L, about 7.2×10-7 mol / L, about 4.77×10-3 mol / L and about 2.19×10-3 mol / L, respectively; about 3.33×10-3 mol / L, about 1.45×10-6 mol / L, about 4.77×10-3 mol / L and about 4.38×10-3 mol / L, respectively; or about 3.33×10-3 mol / L, about 7.2×10-7 mol / L, about 4.77×10-3 mol / L and about 2.19×10-3 mol / L, respectively.

[0070] Other features and advantages of the instant disclosure will be apparent from the following detailed description and examples, which should not be construed as limiting. The contents of all references, Genbank entries, patents and published patent applications cited throughout this application are expressly incorporated herein by reference. DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

[0071] The following detailed description, given by way of example, but not intended to limit the invention solely to the specific embodiments described, may best be understood in conjunction with the accompanying drawings.

[0072] FIG. 1 shows the viable cell density of CHO cells added with different cell culture additive compositions on Day 3 of fed-batch culture.

[0073] FIG. 2 shows the cell viability of CHO cells added with different cell culture additive compositions on Day 3 of fed-batch culture.

[0074] FIG. 3 shows the viable cell density of CHO cells added with different cell culture additive compositions on Day 3 of fed-batch culture.

[0075] FIG. 4 shows the cell viability of CHO cells added with different cell culture additive compositions on Day 3 of fed-batch culture.

[0076] FIG. 5 shows the viable cell density of CHO cells added with a cell culture additive composition on Day 3 of fed-batch culture using different culture media.

[0077] FIG. 6 shows the cell viability of CHO cells added with a cell culture additive composition on Day 3 of fed-batch culture using different culture media.

[0078] FIG. 7 shows the viable cell density of CHO cells added with a cell culture additive composition on Day 3 of fed-batch culture for producing a different antibody.

[0079] FIG. 8 shows the cell viability of CHO cells added with a cell culture additive composition on Day 3 of fed-batch culture for producing a different antibody.DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

[0080] Unless defined otherwise, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which this invention belongs. Although any methods and materials similar or equivalent to those described herein can be used in the practice or testing of the invention, it will be understood that modifications and variations are encompassed within the spirit and scope of the instant disclosure.

[0081] As used herein, the singular forms “a” , “an” and “the” are intended to include the plural forms as well, unless the context clearly indicates otherwise.

[0082] The term “about” or “approximately” means within an acceptable error range for the particular value as determined by one of ordinary skill in the art, which will depend in part on how the value is measured or determined, i.e., the limitations of the measurement system. For example, “about” can mean within one or more than one standard deviation, per the practice in the art. Alternatively, “about” can mean a range of up to 20%, up to 15%, up to 10%, up to 5%, or up to 1%of a given value.

[0083] The term “comprising” , “comprise” , “containing” , or “contain” is inclusive and does not exclude additional, unrecited elements or features, as long as they do not render the invention unworkable. The term “consist” or “consisting” excludes any element, step, or ingredient not specifically mentioned after said wording. Furthermore, to the extent that the terms “including” , “includes” , “having” , “has” , “with” , or variants thereof are used in either the detailed description and / or the claims, such terms are intended to be inclusive in a manner similar to the term “comprising” .

[0084] A cell culture “additive” or “supplement” refers to a substance or a group of substances that is / are added to the cell culture medium in e.g., small quantities, to support and / or promote the host cell growth and / or protein production, to improve protein heterogeneity (e.g., charge heterogeneity) , to extend or strengthen an attribute of the culture or cells as a whole, or to make up for a deficiency. The cell culture additive or supplement of the disclosure is mainly used to reduce acidic charge species in the proteins as produced by host cells, to increase main species in the proteins as produced by host cells, and to improve cell viability in the late cell culture stage (from Day 9 of cell culture) .

[0085] A “batch” culture is a kind of cell culture where all the medium components are placed in the reactor at the start of cultivation except for atmospheric gases, acid or base for pH control, antifoaming agents, and optionally the carbon source (e.g., glucose) .

[0086] A “fed-batch” culture is a modified batch culture that adds compounds needed for cell growth, cell proliferation and / or recombinant protein production periodically. In a fed-batch process, a basal medium supports initial growth and production, and a feed medium prevents depletion of nutrients and sustains the production phase.

[0087] The “expression” of a gene or a protein refers to the process by which genetic information stored in a gene is utilized to produce a functional gene product, such as a RNA or protein molecule, while the “over-expression” of a gene or a protein refers to an unnatural or abnormal increase in the production or expression of a gene in an organism, e.g., a recombinant host cell, resulting in increased RNA or protein levels. “Expression” of a gene or a protein refers to

[0088] The term “host cell” refers to a living cell invaded by or capable of being invaded by a foreign nucleic acid-carrying vector, e.g., a plasmid vector.

[0089] A “recombinant” cell is a cell that receives DNA from an outside source and incorporates it into its own. The process of creating recombinant cells involves combining genetic material from two different sources to alter their characteristics.

[0090] The term “transfecting” or “transfection” refers to a technique or process that introduces a foreign nucleic acid (DNA or RNA) into a cell using non-viral methods. The foreign nucleic acid as introduced into the cell may integrate into the cell genome, or exist as an independent molecule but interferes with the cell’s function.

[0091] An “antibody” , also known as an immunoglobulin, is a glycoprotein produced by e.g., plasma cells, or in vitro recombinantly produced, that recognizes and specifically binds a target, through at least one antigen-binding site. An antibody can be any of the five major classes of immunoglobulins: IgA, IgD, IgE, IgG, and IgM, or subclasses (isotypes) thereof (e.g., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 and IgA2) , based on the identity of their heavy-chain constant domains referred to as alpha, delta, epsilon, gamma, and mu, respectively. The different classes of immunoglobulins have different and well-known subunit structures and three-dimensional configurations. A full-length IgG antibody may comprise two heavy (H) chains and two light (L) chains inter-connected by disulfide bonds. Each heavy chain may be comprised of a heavy chain variable region (abbreviated herein as VH) and a heavy chain constant region (CH) . The heavy chain constant region may be comprised of three domains, CH1, CH2 and CH3. Each light chain may be comprised of a light chain variable region (abbreviated herein as VL) and a light chain constant region (CL) . The light chain constant region may be comprised of one domain. The heavy chain constant regions of the antibodies may mediate the binding of the immunoglobulin to host tissues or factors, including various cells of the immune system (e.g., effector cells) and the first component (C1q) of the classical complement system, while the light chain constant region may function to stabilize the antibody structure.

[0092] The term “antibody” herein also includes the “antigen-binding portion” of an antibody, which refers to one or more fragments of an antibody that retain the ability to specifically bind to an antigen. It has been shown that the antigen-binding function of an antibody can be performed by fragments of a full-length antibody. Examples of binding fragments encompassed within the term “antigen-binding portion” of an antibody include (i) a Fab fragment, a monovalent fragment consisting of the VL, VH, CL and CH1 domains; (ii) a F (ab') 2 fragment, a bivalent fragment which may comprise two Fab fragments linked by a disulfide bridge at the hinge region; (iii) a Fd fragment consisting of the VH and CH1 domains; (iv) a Fv fragment consisting of the VL and VH domains of a single arm of an antibody, and (v) a dAb fragment (Ward et al., (1989) Nature 341: 544-546) , which consists of a VHH domain.

[0093] The term “monoclonal antibody” or “mAb” as used herein refers to an antibody obtained from a population of substantially homogeneous antibodies, i.e., the individual antibodies comprising the population are identical except for possible naturally occurring mutations and / or post-translation modifications (e.g., isomerizations, amidations) that may be present in minor amounts.

[0094] The term “vector” refers to a substance that is used to carry or include a nucleic acid sequence, including for example, in order to introduce a nucleic acid sequence into a host cell and optionally express a nucleic acid sequence in the host cell. Vectors applicable for use include, for example, expression vectors, plasmids, phage vectors, viral vectors, episomes and artificial chromosomes, which can include selection sequences or markers operable for replication in a host cell or for stable integration into a host cell’s chromosome. Additionally, the vectors can include one or more selectable marker genes and appropriate expression control sequences. Selectable marker genes that can be included, for example, to provide resistance to antibiotics or toxins, complement auxotrophic deficiencies, or supply critical nutrients not in the culture media. Expression control sequences can include constitutive and inducible promoters, transcription enhancers, transcription terminators, and the like which are well known in the art. The term “promoter” as used herein, generally refers to the regulatory DNA region which controls transcription or expression of a gene and which may be located adjacent to or overlapping a nucleotide or region of nucleotides at which RNA transcription is initiated. A promoter may contain specific DNA sequences which bind protein factors, often referred to as transcription factors, which facilitate binding of RNA polymerase to the DNA leading to gene transcription. When two or more nucleic acid molecules are to be co-expressed, both nucleic acid molecules can be inserted, for example, into a single expression vector or in separate expression vectors. For single vector expression, the encoding nucleic acids can be operationally linked to one common expression control sequence or linked to different expression control sequences, such as one inducible promoter and one constitutive promoter. The introduction of nucleic acid molecules into a host cell can be confirmed using methods well known in the art. It is understood by those skilled in the art that the nucleic acid molecules are expressed in a sufficient amount to produce a desired product, and it is further understood that expression levels can be optimized to obtain sufficient expression using methods well known in the art. Particularly, an “expression vector” is associated with actual expression of a coding DNA fragment into an mRNA and a protein in the target cell or organism, and usually contains all the regulatory sequences, such as promoter, ribosomal binding site, transcription initiation site, translation initiation site, which are essential for getting maximum expression. The expression vector in the disclosure may be a DNA vector or an RNA vector, e.g., an mRNA or a circular RNA.

[0095] The term “integrated into” or “integrating into” the genome of a cell means the insertion or addition of a DNA sequence into a cell genome at a proper site to produce a functional protein or functional proteins.

[0096] The term “acidic variant” , “acidic charge variant” , “acidic species” or “acidic charge species” refers to the variants of proteins that elute earlier than the main peak during CEX (charge exchange) or later than the main peak during AEX (size exclusion) analysis, or alternatively with lower isoelectric point (pI) than the major constituents or species in isoelectric focusing (IEF) -based analysis. While the term “basic variant” , “basic charge variant” , “basic species” or “basic charge species” refers to the variants of proteins that elute later than the main peak during CEX (charge exchange) or earlier than the main peak during AEX (size exclusion) analysis, or alternatively with higher isoelectric point (pI) than the major constituents or species in isoelectric focusing (IEF) -based analysis. The term “main peak” , “main peak product” or “main species” herein refers to major constituents or species of proteins.

[0097] The term “isoelectric point” or “pI” is the pH of an aqueous solution of a peptide or protein at which the molecules on average have no net charge, i.e., the positively charged groups are exactly balanced by the negatively charged groups.

[0098] Among the biologic drugs under development and on the market, most are monoclonal antibodies (mAbs) . The mAb production is often done in mammalian cells such as CHO cells in a batch culture or a fed-batch culture. A fed-batch culture is a semi-batch operation in which the nutrients necessary for cell growth and target product production, including the carbon source, nitrogen source, amino acids, and some kinds of inducers, are fed either intermittently or continuously during the course of an otherwise batch operation. The over-supply or under-supply of the carbon source or any other compounds during the cell culture may adversely affect the cell growth and product production. For example, during the penicillin fermentation, the over-supply of a carbon source resulted in more mycelial growth and low penicillin formation, while under-supply caused slower mycelial growth and eventually slower penicillin formation (Henry C. Lim, Hwa Sung Shin, (2013) Fed-Batch Cultures: Principles and Applications of Semi-Batch Bioreactors, Cambridge University Press, ISBN: 9780521513364) .

[0099] One reason to choose CHO cells as the host cells for mAb production is that, mAbs can correctly folded with desired post-translational modifications. The post-translational modifications may play important roles in antibodies’ functions. For example, sialic acid modification can prolong the half-life of mAbs, and fucosylation can improve the mAb’s ability to induce ADCC. These post-translational modifications, along with protein degradations, may also cause antibody heterogeneity, including charge heterogeneity. Incomplete cleavage of C-terminal lysine (Lys) is a major contributor to basic species, but has no effect on the structure, stability, or potency of mAbs. Isomerization of Asp in mAb CDRs has also been reported to promote formation of basic species, which caused decrease in antigen binding. Asparagine (Asn) deamidation, sialylation, and glycation are major contributors to the formation of acidic variants. Cysteine-related modifications such as free cysteine, trisulfide bonds, cysteination, and glutathioneylation also cause the formation of acid variants. Asn deamidation in the CDR region may reduce the binding ability of the antibody. Sialic acid may lead to a decrease in ADCC activity. Free cysteine may lead to the formation of aggregations, which leads to an increase in the immunogenicity.

[0100] In view of the above, as compared to the basic species, acidic charge variants may have more negative effects on antibodies’ therapeutic efficacy and safety, and should be controlled or reduced to some extent.

[0101] The strategies to control the acidic species of mAbs include control of raw material, manufacturing process, and the downstream processing, and the cell culture is thought to be the most impactful stage on charge heterogeneity, due to the long duration, complicated media, and enzymes within or outside of the host cells (Beck A, et al., (2022) supra) .

[0102] The cell culture operating parameters, including pH and temperature may be optimized to control or lower the acidic charge species levels.

[0103] Alternatively, cell culture medium may be optimized for acidic charge variant reduction, including adjusting concentration of glucose, trace metals (e.g., iron, copper) or antioxidants. Studies have shown bioflavonoids such as rutin and gallic acid as antioxidants, when added to the cell culture for several times during the culture, reduced the percent of acidic variants (Hossler, et al., (2015) supra) . Studies also showed that, the cells cultured in a medium containing 1 g / L or higher arginine (Arg) , histidine (His) , lysine (Lys) or their combination produced antibodies with lower percentage of acidic variants (US 9, 683, 033B2) .

[0104] Most cells in animals are exposed to low O2 concentrations, in the range of 1-10 mm Hg, while the in vitro cell culture is commonly performed under 95%air / 5%CO2, generating more reactive oxygen species (ROS) and imposing an oxidative stress on the cells which may produce proteins with post-translational modifications that generate acidic charge species. The cell culture media are frequently deficient in the antioxidants that are normally obtained in the animal diet and delivered to cells by bloodstream. Neither vitamin E nor vitamin C is added to the cell culture medium as being insoluble or unstable. The inventors of the disclosure introduced a selenite, as an antioxidant, to the cell culture only once on Day 3 of the batch culture, but not during the whole culture, successfully reduced the acidic variants of the antibody produced by the cultured cells, which was unexpected.

[0105] Arginine, histidine, and lysine were used in US 9, 683, 033B2 in rather high concentrations, which caused tremendous cell viability decrease in the late culture stage. As mentioned above, the over-supply of the carbon source or any other compounds during the cell culture may adversely affect the cell growth and product production. Arginine, histidine and lysine are essential amino acids, their minimum concentrations in cell culture medium for mammalian cells are 0.084 g / L, 0.015 g / L and 0.000 g / L, and their maximum concentrations in such cell culture medium are 1.331 g / L, 0.152 g / L and 2.000 g / L (Salazar A, et al., (2016) . Amino acids in the cultivation of mammalian cells. Amino Acids. 48 (5) : 1161-71) . The inventors of the disclosure found that histidine and lysine at much lower levels than those in US 9, 683, 033B2 have mild effect on acidic variant reduction, but can maintain cell viability at a relatively high level in the late culture stage. Further, the acidic variant reduction effect of histidine and lysine may be added to that of glycine and the selenite, resulting in improved acidic species reduction.

[0106] Glycine is commonly used in the cell culture medium, but there is little report on its role in reducing acidic variants of the protein as produced by the host cells. As a non-essential amino acid, glycine in the cell culture medium was said to increase ammonium production and thus usually used in a low amount (Zizhuo Xing et al., (2011) supra) . The inventors of the disclosure introduced additional glycine to the cell culture in the early exponential growth phase (e.g., Day 3 of the batch culture) , which did not adversely affect host cell growth and metabolism, and surprisingly reduced the acidic variants of the antibody as produced by the cultured cells.

[0107] Therefore, the disclosure provides a cell culture additive or supplement composition, which may comprise i) glycine and a selenite, ii) histidine and lysine, and iii) glycine, a selenite, histidine and lysine.

[0108] The cell culture additive composition may comprise or consist of the glycine and the selenite in a molar ratio of 3.33: 1.45×10-3 -6.66: 7.2×10-4, e.g., 6.66: 1.45×10-3 -6.66: 7.2×10-4. The cell culture additive composition may comprise or consist of 3.33×10-3-6.66×10-3 mol glycine and 7.2×10-7-1.45×10-6 mol selenite, e.g., 6.66×10-3 mol glycine and 1.45×10-6 mol selenite, when prepared for 1 L cell culture.

[0109] The cell culture additive composition may comprise or consist of the histidine and the lysine in a molar ratio of 2.39: 4.38-4.77: 2.19, e.g., 4.77: 4.38-4.77: 2.19. The cell culture additive composition may comprise or consist of 2.39×10-3-4.77×10-3 mol histidine and 2.19×10-3-4.38×10-3 mol lysine, e.g., 4.77×10-3 mol histidine and 4.38×10-3 mol lysine, when prepared for 1 L cell culture.

[0110] The cell culture additive composition may comprise or consist of the glycine, the selenite, the histidine and the lysine in a molar ratio of (3.33 -6.66) : (7.2×10-4 -1.45×10-3) : (2.39 -4.77) : (2.19 -4.38) . The cell culture additive composition may comprise or consist of 3.33×10-3 mol glycine, 1.45×10-6 mol selenite, 4.77×10-3 mol histidine, and 4.38×10-3 mol lysine; 6.66×10-3 mol glycine, 1.45×10-6 mol selenite, 2.39×10-3 mol histidine, and 4.38×10-3 mol lysine; 6.66×10-3 mol glycine, 1.45×10-6 mol selenite, 4.77×10-3 mol histidine, and 4.38×10-3 mol lysine; 6.66×10-3 mol glycine, 7.2×10-7 mol selenite, 4.77×10-3 mol histidine, and 2.19×10-3 mol lysine; 3.33×10-3 mol glycine, 1.45×10-6 mol selenite, 4.77×10-3 mol histidine, and 4.38×10-3 mol lysine; or 3.33×10-3 mol glycine, 7.2×10-7 mol selenite, 4.77×10-3 mol histidine, and 2.19×10-3 mol lysine, when prepared for 1 L cell culture.

[0111] Those skilled in the art can readily determine the amounts of additive components for cell culture of 2 L, 2.5 L, 3 L or other sizes.

[0112] The cell culture additive composition of the disclosure may be used in batch culture or a fed-batch culture of a mammalian cell. For example, the cell culture additive composition of the disclosure may be added to the cell on e.g., Day 3 of the cell culture. The cell culture additive of the disclosure, when added to a mammalian cell engineered to express, e.g., over-express, a recombinant protein, especially a recombinant antibody, may reduce the level of acidic variants in the proteins as produced by the mammalian cell, and in some cases may even increase the level of the main species.

[0113] In another respect, the disclosure provides a method for culturing a mammalian cell, which may comprise culturing the mammalian cell in a cell culture medium in a batch culture or a fed-batch culture, and adding to the cell in the early exponential phase (e.g., Day 3 of the batch culture) the cell culture additive composition of the disclosure.

[0114] The method may improve cell viability in the late cell culture stage (from e.g., Day 8, Day 9, Day 10 or Day 11) .

[0115] This method may be used to produce a recombinant protein, e.g., an antibody, especially a monoclonal antibody, resulting in reduced acidic species level, and optionally increased main species.

[0116] The step of adding to the cell culture medium the cell culture additive composition of the disclosure may comprise adding i) glycine and a selenite at final concentrations of 3.33×10-3 -6.66×10-3 mol / L and 7.2×10-7 -1.45×10-6 mol / L, respectively; ii) histidine and lysine at final concentrations of 2.39×10-3 -4.77×10-3 mol / L and 2.19×10-3 -4.38×10-3 mol / L, respectively; or iii) glycine, a selenite, histidine and lysine at final concentrations of 3.33×10-3 -6.66×10-3 mol / L, 7.2×10-7 -1.45×10-6 mol / L, 2.39×10-3 -4.77×10-3 mol / L and 2.19×10-3 -4.38×10-3 mol / L, respectively.

[0117] The method may further comprise supplementing glucose every day, from e.g., Day 3 of the fed-batch culture or batch culture, to bring glucose concentration to a suitable level, e.g., about 7 g / L. The method may comprise inoculating the mammalian cell at a suitable seeding density, e.g., 0.4 to 0.6×106 cells / mL. The method may comprise culturing the mammalian cell under a suitable condition.

[0118] The method may comprise culturing the mammalian cell for 11 days or more. The data showed that the viable cell density or cell viability was still quite high on Day 11, meaning the cell culture may last for more than 11 days, if required.

[0119] The additive or supplement of the disclosure may be used in cell culture using any suitable cell culture media. In the Examples of the disclosure, two sets of basal and feed media were used in the tests. It turned out that the addition of the additive or supplement at the early culture phase, e.g., Day 3 of the cell culture, resulted in enhanced cell viability in the late culture stages and reduced acidic species, no matter what cell culture media were used. In certain embodiments, the method may comprise culturing the mammalian cell in chemically defined basal and feed media.

[0120] The mammalian cell may be a Chinese ovary (CHO) cell, e.g., a CHO-K1 cell. The mammalian cell may have been adapted for suspension culture. The mammalian cell may be a CHO cell, e.g., a CHO-K1 cell, for suspension culture.

[0121] The mammalian cell may be a recombinant cell that over-expresses a recombinant protein. The mammalian cell may comprise a nucleic acid molecule for over-expressing the recombinant protein, integrated into its genome, or in an expression vector. The recombinant protein may be an antibody. The nucleic acid molecule for expressing the desired protein, e.g., an antibody, may be in a vector and introduced into the cell with the vector. The nucleic acid molecule may express the protein in the vector. Alternatively, the nucleic acid molecule may be integrated or incorporated into the genome of the host cell to obtain stable cell lines. The skilled in the art know the technique for integrating foreign DNAs into the genome of a host cell. For example, a vector carrying a foreign DNA may incorporate the foreign DNA into the host cell genome by random integration, where the DNA inserts into random locations within the genome. Alternatively, the integration can occur through homologous recombination, where the foreign DNA is precisely inserted at a specific site guided by homologous sequences. Another method involves the use of transposon elements, e.g., the transposase and transposon-derived ITRs, which facilitate the movement and integration of the DNA into various genomic locations. In the Examples below, the mammalian cell used for over-expressing the antibody was constructed by introducing the antibody-encoding sequences in a vector (e.g., a plasmid) into the cell by transfection, and integrating the sequences into the cell’s genome by random integration.

[0122] The present invention will be further illustrated in the following Examples which are given for illustration purposes only and are not intended to limit the invention in any way. EXAMPLESExample 1. Addition of cell culture additive compositions in fed-batch culture of CHO cells for reducing antibody acidic variants

[0123] CHO-K1 cells, obtained by adapting CHO-K1 cells (ECACC, Cat. No.: 85051005) to suspension culture, were transfected, by electroporation, with a plasmid vector (pGenHT 1.0-UP, GenScript Probio) containing a DNA fragment encoding a full-length human IgG antibody (hereinafter referred to as mAb1) , and screened for monoclonal stable cell lines capable of producing the antibody.

[0124] One of the monoclonal stable cell lines as obtained were seeded into a 50 mL spin tube in 10 mL UproCHOTM M01 basal medium (hereinafter referred to as M01, ProBio) at a cell density of 0.5 (±0.1) ×106 cells / mL, and cultured in a shaking incubator at the shaking speed of 280 rpm under 5%CO2 and 80%humidity.

[0125] On the 3rd day of the cell culturing, the cells were added with three different additive compositions with the components and their final concentrations specified in Table 1. No cell culture additive was added to the cells of the control group.

[0126] Beginning on Day 3, 4% (v / v) feed medium UproCHOTM F01A (hereinafter referred to as F01A, ProBio) and 0.4% (v / v) UproCHOTM F01B (herein after referred to as F01B, ProBio) were supplemented every other day according to the initial culture volume. The residual glucose concentration in the cell culture was measured every day, and a 400 g / kg glucose stock solution was added to the cell culture as needed to maintain the glucose concentration at about 7 g / L.

[0127] The cell growth status, including the viable cell density (VCD) and cell viability (VIA) , was monitored regularly throughout the cell culture. The antibody level / titer and charge variant profile were measured by Octet and icIEF, respectively. Table 1. Final concentration of each additive component in cell culture medium

[0128] As shown in FIG. 1, the addition of different additive compositions in cell culture had no negative effect on viable cell density as compared to the control group.

[0129] As shown in FIG. 2, there was little difference in terms of the cell viability among all groups in the early cell culture stage. The cells of Group 3, 4 and 5 added with histidine (His) and lysine (Lys) maintained high cell viability at the late stage of the culture, while the cells of Group 1 and 2 without His or Lys addition showed lower viability, as the cells from the control group did.

[0130] The antibody levels or titers of these groups were summarized in Table 2. It can be seen that the antibody levels or titers of Group 1 to 5 were all comparable to, or a bit higher than that of the control group. Table 2. mAb1 level or titer on Day 11

[0131] The charge variants profile on Day 11 were shown in Table 3. The addition of the selenite (Se) and glycine (Gly) only evidently reduced the acidic species percent and increased the main species percent, with a slight increase of the basic species percent. While the addition of His and Lys only also reduced the percent of acidic variants, but with a significant increase of the basic species percent. The antibodies produced in Group 5 with addition of all four additive components had the lowest acidic species percent, and a relatively high main species percent. Table 3. Charge variant profile of mAb1 on Day11

[0132] In summary, either the combination of Se and Gly, or the combination of His and Lys, can reduce the acidic species percent, and the combination of Se, Gly, His and Lys resulted in lowest acidic species percent. The addition of Se and Gly increased the main species percent to some extent.Example 2. Addition of glycine, selenite, histidine and lysine at different concentrations for reducing antibody acidic variants

[0133] More cell culture additive compositions containing Se, Gly, His and Lys at different concentrations were tested for their capability to reduce antibody acidic variants.

[0134] Briefly, following the protocol of Example 1, the same stable CHO-K1 cells for expressing mAb1 were subjected to an 11-day fed-batch culture using the same M01 / F01A / F01B medium, with addition of cell culture additive compositions on the 3rd day at final component concentrations set forth in Table 4.

[0135] The VCD, VIA, mAb1 level / titer and charge variant profile were measured and shown in FIG. 3, FIG. 4, Table 5 and Table 6, respectively. Table 4. Final concentration of each additive component in cell culture medium

[0136] As shown in FIG. 3, there was no viable cell density difference among groups.

[0137] FIG. 4 showed that the viability of Group 1-5 were comparable to that of the control group in the early stage of cell culture, but a bit higher than the control group at the late culture stage.

[0138] As shown in Table 5, the antibody levels or titers of Group 1 to 5 were all comparable to, or a bit higher than, that of the control group . Table 5. mAb1 level or titer on Day 11

[0139] Table 6 showed the charge variant profile of mAb1 on Day 11. Compared to the control group, the antibodies as produced by cells of Group 1-5 had lower acidic species percent and higher main species percent.

[0140] In summary, the additive compositions with Se, Gly, His and Lys at different concentrations in M01 / F01A / F01B medium system were able to reduce the antibody acidic species percent, with no impact on cell growth. Table 6. Charge variant profile of mAb1 on Day 11 Example 3. Addition of glycine, selenite, histidine and lysine in cell culture using Altair CHO medium

[0141] The cell culture additive composition of the disclosure was further tested for the capability to reduce antibody acidic variants when other culture media were used.

[0142] Following the protocol of Example 1, the same stable CHO-K1 cells for expressing mAb1 were seeded into a 50 mL spin tube in 10 mL Altair CHO medium (OPM, C670226) at a cell density of 0.5 (±0.1) ×106 cells / mL, and cultured in a shaking incubator at the shaking speed of 280 rpm under 5%CO2 and 80%humidity. Beginning on Day 3, 4% (v / v) Altair Feed (OPM, C679332) and 0.4% (v / v) CDFS36 (OPM, C672069) were supplemented every other day according to the initial culture volume. On the 3rd day of the cell culture, the cells were added with a cell culture additive composition at the component concentrations set forth in Table 7.

[0143] The VCD, VIA, mAb1 level or titer, and charge variant profile were measured on Day 11. Table 7. Final concentration of each additive component in cell culture medium

[0144] As shown in FIG. 5, the viable cell density of Group 1 was lower than that of the control group from about Day 6. However, the viability of Group 1 was higher at the late stage of the cell culture than that of the control group, as shown in FIG. 6.

[0145] Table 8 showed the antibody level or titer on Day 11. The mAb1 level or titer of Group 1 was comparable to, or slightly lower than, that of the control group. Table 8. mAb1 level or titer on Day 11

[0146] The charge variant profiles were summarized in Table 9. Compared to the control group, the acidic species percent of Group 1 was decreased by about 14%.

[0147] In summary, the cell culture additive composition significantly reduced the acidic species percent, even different culture media were used in cell culture. Table 9. Charge heterogeneity of mAb1 on Day 11 Example 4. Effect of cell culture additive composition on production of another antibody

[0148] The cell culture additive composition of the disclosure was further tested for its effect on acidic variant reduction in production of another full-length human IgG antibody (hereafter referred to as mAb2) .

[0149] Briefly, following the protocol of Example 1, another stable CHO-K1 cell line expressing mAb2 was established and subjected to an 11-day fed-batch culture in the same M01 / F01A / F01B medium, with addition of a cell culture additive composition on the 3rd day at the final component concentrations set forth in Table 10.

[0150] The VCD, VIA, mAb2 level / titer and charge variant profile were measured on Day 11 and shown in FIG. 7, FIG. 8, Table 11 and Table 12. Table 10. Final concentration of each additive component in cell culture medium

[0151] As shown in FIG. 7, the additive composition reduced the peak viable cell density in Group 1, as compared to the control group.

[0152] FIG. 8 showed that there was little difference in viability between Group 1 and the control group at the early stage of cell culture, but the cells of Group 1 maintained higher cell viability at the late stage of the culture than the control group.

[0153] As shown in Table 11, the mAb2 level or titer of Group 1 was comparable to, or slightly lower than, that of the control group. Table 11. mAb2 level or titer on Day 11

[0154] Table 12 showed the charge variant profile of mAb2. Compared to the control group, the acidic species percent of Group 1 was lowered by 21.1%. Table 12. Charge heterogeneity of mAb2 on Day 11

[0155] In summary, the addition of the cell culture additive composition slightly lowered mAb2 titer, but prevented the cell viability drop at the late stage of cell culture and significantly reduced the acidic species percent of mAb2. ***

[0156] Having thus described in detail preferred embodiments of the present invention, it is to be understood that the invention is not to be limited to particular details set forth in the above description as many apparent variations thereof are possible without departing from the spirit or scope of the present invention.

Claims

1.A cell culture additive composition, comprising glycine and a selenite.2.The cell culture additive composition of claim 1, comprising the glycine and the selenite in a molar ratio of about 2.66: 2.89×10-3-10.66: 2.89×10-4, preferably about 3.33: 1.45×10-3–6.66: 7.2×10-4, preferably about 6.66: 1.45×10-3-6.66: 7.2×10-4.3.The cell culture additive composition of claim 2, comprising the glycine and the selenite in a molar ratio of about 6.66: 1.45×10-3.4.The cell culture additive composition of claim 3, wherein the selenite is sodium selenite.5.The cell culture additive composition of claim 1, further comprising histidine and lysine.6.The cell culture additive composition of claim 5, comprising the glycine, the selenite, the histidine and the lysine in a molar ratio of about (2.66-10.66) : (2.89×10-4–2.89×10-3) : (1.19-7.16) : (2.19-6.57) , preferably about (3.33-6.66) : (7.2×10-4-1.45×10-3) : (2.39–4.77) : (2.19–4.38) , preferably about 3.33: 7.2×10-4: 2.39: 2.19-6.66: 1.45×10-3: 4.77: 4.38.7.The cell culture additive composition of claim 6, comprising the glycine, the selenite, the histidine and the lysine in a molar ratio of about 6.66: 1.45×10-3: 4.77: 4.38, 3.33: 7.2×10-4: 2.39: 2.19, about 6.66: 1.45×10-3: 2.39: 4.38, about 6.66: 7.2×10-4: 4.77: 2.19, about 3.33: 1.45×10-3: 4.77: 4.38, or about 3.33: 7.2×10-4: 4.77: 2.19.8.The cell culture additive composition of claim 7, wherein the histidine is L-Histidine hydrochloride monohydrate, and the lysine is L-Lysine monohydrochloride9.A method for culturing a mammalian cell, wherein the mammalian cell comprises a nucleic acid fragment for expressing a recombinant protein integrated into its genome or in an expression vector, the method comprising culturing the mammalian cell in a cell culture medium in a batch culture or a fed-batch culture, and adding to the cell culture medium glycine and a selenite at final concentrations of about 2.66×10-3–10.66×10-3mol / L and about 2.89×10-7–2.89×10-6mol / L, respectively, preferably about 3.33×10-3-6.66×10-3mol / L and about 7.2×10-7-1.45×10-6mol / L, respectively, on 1st, 2nd or 3rd day of the batch culture or the fed-batch culture.10.The method of claim 9, comprising adding to the cell culture medium the glycine and the selenite on the 3rd day of the batch culture or the fed-batch culture.11.The method of claim 10, comprising adding to the cell culture medium on 3rd day of the batch culture or the fed-batch culture the glycine and the selenite at final concentrations of about 6.66×10-3 mol / L and about 1.45×10-6 mol / L, respectively.12.The method of claim 11, wherein the selenite is sodium selenite.13.The method of claim 12, comprising adding to the cell culture medium on 3rd day of the batch culture or the fed-batch culture the glycine and the selenite at final concentrations of about 500 mg / L and about 0.25 mg / L, respectively.14.The method of claim 10, further comprising adding to the cell culture medium on 3rd day of the batch culture or the fed-batch culture histidine and lysine at final concentrations of about 1.19×10-3-7.16×10-3 mol / L and about 2.19×10-3-6.57×10-3 mol / L, respectively, preferably about 2.39×10-3-4.77×10-3 mol / L and about 2.19×10-3-4.38×10-3 mol / L, respectively.15.The method of claim 14, comprising adding to the cell culture medium on 3rd day of the batch culture or the fed-batch culture the glycine, the selenite, the histidine and the lysine at final concentrations of about 6.66×10-3 mol / L, about 1.45×10-6 mol / L, about 4.77×10-3 mol / L and about 4.38×10-3 mol / L, respectively; about 3.33×10-3 mol / L, about 7.2×10-7 mol / L, about 2.39×10-3 mol / L and about 2.19×10-3 mol / L, respectively; about 6.66×10-3 mol / L, about 1.45×10-6 mol / L, about 2.39×10-3 mol / L and about 4.38×10-3 mol / L, respectively; about 6.66×10-3 mol / L, about 7.2×10-7 mol / L, about 4.77×10-3 mol / L and about 2.19×10-3 mol / L, respectively; about 3.33×10-3 mol / L, about 1.45×10-6 mol / L, about 4.77×10-3 mol / L and about 4.38×10-3 mol / L, respectively; or about 3.33×10-3 mol / L, about 7.2×10-7 mol / L, about 4.77×10-3 mol / L and about 2.19×10-3 mol / L, respectively.16.The method of claim 15, wherein the histidine is L-Histidine hydrochloride monohydrate, and the lysine is L-Lysine monohydrochloride.17.The method of claim 16, comprising adding to the cell culture medium on 3rd day of the batch culture or the fed-batch culture the glycine, the selenite, the histidine and the lysine at final concentrations of about 500 mg / L, about 0.25 mg / L, about 1000 mg / L and about 800 mg / L, respectively; about 250 mg / L, about 0.125 mg / L, about 500 mg / L and about 400 mg / L, respectively; about 500 mg / L, about 0.25 mg / L, about 500 mg / L and about 800 mg / L, respectively; about 500 mg / L, about 0.125 mg / L, about 1000 mg / L and about 400 mg / L, respectively; about 250 mg / L, about 0.25 mg / L, about 1000 mg / L and about 800 mg / L, respectively; or about 250 mg / L, about 0.125 mg / L, about 1000 mg / L and about 400 mg / L, respectively.18.The method of claim 9, wherein the recombinant protein is a recombinant antibody.19.The method of claim 9, wherein the method reduces acidic variants of the recombinant protein, preferably an antibody.20.The method of claim 9, wherein the mammalian cell is a CHO cell, preferably a CHO-K1 cell.

Images