BCMA binding moieties and uses thereof

Abstract

The present disclosure provides BCMA-binding moieties (e.g., single domain antibodies that bind to BCMA), and chimeric antigen receptors comprising the same. Further provided are engineered immune cells (e.g., T cells such as αβT cells, γδT cells) comprising the chimeric antigen receptors provided herein. In some embodiments, the engineered immune cells further comprise a Toll-like receptor (TLR) co-stimulatory molecule. Pharmaceutical compositions, kits and methods of treating a disease or disorder are also provided.

Description

BCMA BINDING MOIETIES AND USES THEREOF

[0001] CROSS REFERENCE TO RELATED APPLICATION

[0002] This application claims priority benefits of International Application No. PCT / CN2025 / 075192 filed January 26, 2025, entitled “BCMA BINDING MOIETIES AND USES THEREOF” , the contents of which is incorporated herein by reference in its entirety.

[0003] SEQUENCE STATEMENT

[0004] The content of the following submission on ASCII text file is incorporated herein by reference in its entirety: a computer readable form (CRF) of the Sequence Listing (file name: IEC260027PCT-seql. xml, date recorded: January 25, 2026, size: 60, 054 bytes) .1. FIELD

[0005] The present disclosure relates to BCMA-binding moieties (e.g., anti-BCMA single domain antibodies) , chimeric antigen receptors, engineered immune cells, and methods of use thereof. The present disclosure further relates to activation and expansion of cells for therapeutic uses, especially to chimeric antigen receptor-based T cells, such as γδ T cells, and NK cell immunotherapies.2. BACKGROUND

[0006] B-cell maturation antigen (BCMA or CD269) , also known as tumor necrosis factor receptor superfamily member 17 (TNFRSF17) , is a protein that in humans is encoded by the TNFRSF17 gene. It is expressed on differentiated plasma cells and plasmablasts under physiological conditions and is expressed on almost all multiple myeloma (MM) tumor cells. BCMA's ligands include APRIL (aproliferation-inducing ligand) and BAFF (B-cell activating factor) , which are involved in the maturation and differentiation of PCs and are essential for sustained humoral immunity. Therefore, BCMA is an important target in humoral immunity-mediated autoimmune diseases (e.g., SLE) and multiple myeloma.3. SUMMARY

[0007] In a first aspect, provided herein is a B-cell maturation antigen (BCMA) binding molecule, comprising a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of the CDR1, CDR2, and CDR3, respectively, as set forth in SEQ ID NO: 13-16.

[0008] In some embodiments, the CDR1, CDR2 and / or CDR3 are determined according to the AbM numbering scheme, the IMGT numbering scheme, the Kabat numbering scheme, the Chothia numbering scheme, the Contact numbering scheme, or any combination thereof. In some embodiments, the CDR1, CDR2 and / or CDR3 are determined according to the AbM numbering scheme.

[0009] In some embodiments, the BCMA binding molecule, comprising

[0010] (1) a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, and SEQ ID NO: 25, respectively; or

[0011] (2) a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, and SEQ ID NO: 28, respectively.

[0012] In some embodiments, the BCMA binding molecule further comprising framework regions (FRs) . In some embodiments, the framework regions are derived from a human immunoglobulin heavy chain variable region sequence.

[0013] In some embodiments, the BCMA binding molecule comprises the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 13-16, or an amino acid sequence having at least 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%sequence identity to the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 13-16.

[0014] In some embodiments, the BCMA binding molecule is an antibody or antigen binding fragment thereof. In some embodiments, the antibody or antigen binding fragment thereof is a murine, camelid, chimeric, human, or humanized antibody or fragment. In some embodiments, the antibody or antigen binding fragment thereof is monospecific, bispecific or multispecific. In some embodiments, the antibody or antigen binding fragment thereof is a Fab, a Fab′, a F (ab′) 2, a Fv, VHH, a single chain Fv (scFV) , a single domain antibody (sdAb) , a minibody, a diabody, an antibody mimetic or chemically linked F (ab′) 2. In some embodiments, the antibody comprises a Fc region, optionally the Fc region is the Fc of human IgG1, IgG2, IgG3 or IgG4.

[0015] In some embodiments, the BCMA binding molecule is a fusion protein. In some embodiments, the BCMA binding molecule is an immunoconjugate. In some embodiments, the immunoconjugate is an antibody-drug conjugate (ADC) further comprising a cytotoxic drug or a therapeutic radioisotope.

[0016] In some embodiments, provided herein is a nucleic acid comprising a nucleotide sequence encoding the binding molecule disclosed herein above.

[0017] In some embodiments, provided herein is a vector comprising the nucleic acid disclosed herein above.

[0018] In some embodiments, provided herein is a cell comprising the nucleic acid or the vector disclosed herein above.

[0019] In a second aspect, provided herein is a chimeric antigen receptor (CAR) comprising: (a) an extracellular antigen-binding domain comprising the binding molecule disclosed herein above; (b) a transmembrane domain; and (c) an intracellular signaling domain.

[0020] In some embodiments, the transmembrane domain is derived from a molecule selected from a group consisting of CD8α, CD4, CD28, CD137, CD80, CD86, CD152, and PD-1.

[0021] In some embodiments, the intracellular signaling domain comprises a primary intracellular signaling domain of an immune effector cell. In some embodiments, the primary intracellular signaling domain is derived from a molecule selected from a group consisting of CD3ζ, FcRγ, FcRβ, CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD5, CD22, CD79a, CD79b and CD66d.

[0022] In some embodiments, the intracellular signaling domain comprises a co-stimulatory signaling domain. In some embodiments, the co-stimulatory signaling domain is derived from a co-stimulatory molecule selected from the group consisting of CD27, CD28, CD137, OX40, CD30, CD40, CD3, LFA-1, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, ligands of CD83, and any combination thereof.

[0023] In some embodiments, the CAR further comprising a hinge. In some embodiments, the hinge domain is derived from a molecule selected from a group consisting of CD8α, CD28 and IgG4.

[0024] In some embodiments, the CAR comprising an amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 9-12.

[0025] In some embodiments, the CAR further comprising a signal peptide. In some embodiments, the signal peptide is derived from CD8α. In some embodiments, the signal peptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 37. In some embodiments, the CAR comprising an amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 1-4.

[0026] In some embodiments, provided herein is a nucleic acid comprising a nucleotide sequence encoding the CAR disclosed herein above.

[0027] In some embodiments, provided herein is a vector comprising the nucleic acid disclosed herein above.

[0028] In a third aspect, provided herein is an engineered immune cell, comprising the CAR disclosed herein above, the nucleic acid disclosed herein above, or the vector disclosed herein above.

[0029] In a fourth aspect, provided herein is an engineered immune cell comprising (i) the CAR disclosed herein above; and (ii) a Toll-like receptor (TLR) co-stimulatory molecule.

[0030] In some embodiments, the TLR co-stimulatory molecule comprises a) a first polypeptide comprising: i) a first target binding domain, ii) a first TLR transmembrane domain, and iii) a first TLR signaling domain; and

[0031] b) a second polypeptide comprising: i) a second target binding domain, ii) a second TLR transmembrane domain, and iii) a second TLR signaling domain;

[0032] wherein upon binding of the first target binding domain and second target binding domain to their corresponding target, the first TLR signaling domain and the second TLR signaling domain associate with each other to form a TLR signaling moiety capable of inducing TLR signaling.

[0033] In some embodiments, the first target binding domain and the second target binding domain bind to the same target molecule.

[0034] In some embodiments, the first TLR transmembrane domain and the first TLR signaling domain are derived from the same TLR molecule and / or the second TLR transmembrane domain and the second TLR signaling domain are derived from the same TLR molecule.

[0035] In some embodiments, the first TLR transmembrane domain and the second TLR transmembrane domain are the same and / or the first TLR signaling domain and the second TLR signaling domain are the same.

[0036] In some embodiments, the first TLR transmembrane domain and / or first TLR signaling domain are derived from TLR4.

[0037] In some embodiments, the second TLR transmembrane domain and / or second TLR signaling domain are derived from TLR4.

[0038] In some embodiments, the first TLR transmembrane domain, the first TLR signaling domain, the second TLR transmembrane domain and the second TLR signaling domain are derived from TLR4.

[0039] In some embodiments, the first target binding domain and / or second target binding domain is a scFv or sdAb. In some embodiments, the scFv or sdAb specifically binds to BCMA. In some embodiments, the sdAb comprising a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of the CDR1, CDR2, and CDR3, respectively, as set forth in SEQ ID NO: 13-16. In some embodiments, the sdAb comprising (1) a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, and SEQ ID NO: 25, respectively; or (2) a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, and SEQ ID NO: 28, respectively. In some embodiments, the sdAb comprises the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 13-16, or an amino acid sequence having at least 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%sequence identity to the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 13-16.

[0040] In some embodiments, the TLR co-stimulatory molecule comprises an amino acid sequence having at least about 95%sequence identity to an amino acid sequence of SEQ ID NOs: 33-36.

[0041] In some embodiments, the TLR co-stimulatory molecule further comprising a signal peptide. In some embodiments, the TLR co-stimulatory molecule comprises an amino acid sequence having at least about 95%sequence identity to an amino acid sequence of SEQ ID NOs: 29-32.

[0042] In some embodiments, the engineered immune cell comprises a first nucleic acid encoding the CAR, a second nucleic acid encoding the first polypeptide and a third nucleic acid encoding the second polypeptide.

[0043] In some embodiments, the first polypeptide and the second polypeptide are the same. In some embodiments, the engineered immune cell comprises a first nucleic acid encoding the CAR and a second nucleic acid encoding the first polypeptide and the second polypeptide.

[0044] In some embodiments, the first nucleic acid and the second nucleic acid are on the same vector. In some embodiments, the first nucleic acid encoding the CAR is linked to the second nucleic acid encoding the first polypeptide and the second polypeptide through a nucleic acid encoding a 2A self-cleaving peptide. In some embodiments, the 2A self-cleaving peptide is a T2A peptide or a P2A peptide.

[0045] In some embodiments, the nucleic acid encoding a polypeptide having at least about 95%sequence identity to an amino acid sequence of SEQ ID NOs: 5-8.

[0046] In some embodiments, the immune cell is a T cell (e.g., αβ T cell, γδ T cell) , NK cell, NKT, monocyte, dendritic cell, macrophage, B cell, peripheral blood mononuclear cell (PBMC) , hematopoietic stem cell, pluripotent stem cell, an embryonic stem cell, or any combination thereof.

[0047] In a fifth aspect, provided herein is a method for producing an engineered immune cell, comprising introducing the nucleic acid disclosed herein above or the vector disclosed herein above into an immune cell.

[0048] In a fifth aspect, provided herein is a pharmaceutical composition, comprising the binding molecule, the nucleic acid, the vector, the cell, the engineered immune cell disclosed herein above, and a pharmaceutically acceptable carrier and / or excipient.

[0049] In a sixth aspect, provided herein is a method for preventing and / or treating a disease or disorder in a subject, wherein the method comprises administering to a subject in need thereof the BCMA binding molecule, the engineered immune cell and / or the pharmaceutical composition disclosed herein above.

[0050] In some embodiments, the disease or disorder is an autoimmune disease, a tumor or cancer. In some embodiments, the autoimmune disease is systemic lupus erythematosus (SLE) . In some embodiments, the tumor or cancer is multiple myeloma (MM) .

[0051] 4. BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES

[0052] FIG. 1 shows the purity and CAR positive rate of WT-48 anti-BCMA CAR-αβT, H-48 anti-BCMA CAR-αβT, WT-22 anti-BCMA CAR-αβT and H-22 anti-BCMA CAR-αβT. CAR-αβT cells were expanded and transduced with WT-48 anti-BCMA CAR (SEQ ID NO. 1) , H-48 anti-BCMA CAR (SEQ ID NO. 3) , WT-22 anti-BCMA CAR (SEQ ID NO. 2) and H-22 anti-BCMA CAR (SEQ ID NO. 4) described in Example 3. Cell phenotypes were determined on day 5 post-transduction.

[0053] FIGs. 2A-2D show the long-term killing efficacy of WT-48 anti-BCMA CAR-αβT, H-48 anti-BCMA CAR-αβT, WT-22 anti-BCMA CAR-αβT and H-22 anti-BCMA CAR-αβT. CAR-αβT cells were expanded and transduced with WT-48 anti-BCMA CAR (SEQ ID NO. 1) , H-48 anti-BCMA CAR (SEQ ID NO. 3) , WT-22 anti-BCMA CAR (SEQ ID NO. 2) and H-22 anti-BCMA CAR (SEQ ID NO. 4) described in Example 3. In vitro anti-tumor cytotoxicity and cell proliferation were determined with long-term co-culture assay described in Example 4.

[0054] FIGs. 3A-3B show the evaluation of cytokine release of WT-48 anti-BCMA CAR-αβT, H-48 anti-BCMA CAR-αβT, WT-22 anti-BCMA CAR-αβT and H-22 anti-BCMA CAR-αβT. CAR-αβT cells were expanded and transduced with WT-48 anti-BCMA CAR (SEQ ID NO. 1) , H-48 anti-BCMA CAR (SEQ ID NO. 3) , WT-22 anti-BCMA CAR (SEQ ID NO. 2) and H-22 anti-BCMA CAR (SEQ ID NO. 4) described in Example 3. Cytokine release of IFN-γ were evaluated with HTRF assay described in Example 5.

[0055] FIG. 4 shows the purity and CAR positive rate of anti-BCMA Co-CAR-γδT, H48 anti-BCMA Co-CAR-γδT, H22 anti-BCMA Co-CAR-γδT and H48-22 anti-BCMA Co-CAR-γδT. CAR-γδT cells were expanded and transduced with anti-BCMA Co-CAR (SEQ ID NO. 5) , H48 anti-BCMA Co-CAR (SEQ ID NO. 6) , H22 anti-BCMA Co-CAR (SEQ ID NO. 7) and H48-22 anti-BCMA Co-CAR (SEQ ID NO. 8) described in Example 6. Cell phenotypes were determined on day 11 post-transduction.

[0056] FIGs. 5A-5C show the evaluation of cytokine release of anti-BCMA Co-CAR-γδT, H48 anti-BCMA Co-CAR-γδT, H22 anti-BCMA Co-CAR-γδT and H48-22 anti-BCMA Co-CAR-γδT. CAR-γδT cells were expanded and transduced with anti-BCMA Co-CAR (SEQ ID NO. 5) , H48 anti-BCMA Co-CAR (SEQ ID NO. 6) , H22 anti-BCMA Co-CAR (SEQ ID NO. 7) and H48-22 anti-BCMA Co-CAR (SEQ ID NO. 8) described in Example 6. Cytokine release of IFN-γ, GM-CSF and IL6 were evaluated with HTRF assay described in Example 7.

[0057] FIGs. 6A-B show the long-term killing efficacy of anti-BCMA Co-CAR-γδT, H48 anti-BCMA Co-CAR-γδT, H22 anti-BCMA Co-CAR-γδT and H48-22 anti-BCMA Co-CAR-γδT. CAR-γδT cells were expanded and transduced with anti-BCMA Co-CAR (SEQ ID NO. 5) , H48 anti-BCMA Co-CAR (SEQ ID NO. 6) , H22 anti-BCMA Co-CAR (SEQ ID NO. 7) and H48-22 anti-BCMA Co-CAR (SEQ ID NO. 8) described in Example 6. In vitro anti-tumor cytotoxicity and cell proliferation were determined with long-term co-culture assay described in Example 8.5. DETAILED DESCRIPTION

[0058] The present disclosure is based in part on the novel single domain antibodies (e.g., VHH domains) that bind to BCMA, chimeric antigen receptors or engineered cells comprising same, and improved properties thereof.

[0059] 5.1. Definitions

[0060] Techniques and procedures described or referenced herein include those that are generally well understood and / or commonly employed using conventional methodology by those skilled in the art, such as, for example, the widely utilized methodologies described in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3d ed. 2001) ; Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al. eds., 2003) ; Therapeutic Monoclonal Antibodies: From Bench to Clinic (An ed. 2009) ; Monoclonal Antibodies: Methods and Protocols (Albitar ed. 2010) ; and Antibody Engineering Vols 1 and 2 (Kontermann and Dübel eds., 2d ed. 2010) . Unless otherwise defined herein, technical and scientific terms used in the present description have the meanings that are commonly understood by those of ordinary skill in the art. For purposes of interpreting this specification, the following description of terms will apply and whenever appropriate, terms used in the singular will also include the plural and vice versa. In the event that any description of a term set forth conflicts with any document incorporated herein by reference, the description of the term set forth below shall control.

[0061] The term “antibody” , “immunoglobulin” or “Ig” is used interchangeably herein, and is used in the broadest sense and specifically covers, for example, monoclonal antibodies (including agonist, antagonist, neutralizing antibodies, full length or intact monoclonal antibodies) , antibody compositions with polyepitopic or monoepitopic specificity, polyclonal or monovalent antibodies, multivalent antibodies, multi-specific antibodies (e.g., bispecific antibodies so long as they exhibit the desired biological activity) , formed from at least two intact antibodies, single chain antibodies, and fragments thereof (e.g., domain antibodies) , as described below. An antibody can be human, humanized, chimeric and / or affinity matured, as well as an antibody from other species, for example, mouse, rabbit, llama, etc. The term “antibody” is intended to include a polypeptide product of B cells within the immunoglobulin class of polypeptides that is able to bind to a specific molecular antigen and is composed of two identical pairs of polypeptide chains, wherein each pair has one heavy chain (about 50-70 kDa) and one light chain (about 25 kDa) , each amino-terminal portion of each chain includes a variable region of about 100 to about 130 or more amino acids, and each carboxy-terminal portion of each chain includes a constant region. See, e.g., Antibody Engineering (Borrebaeck ed., 2d ed. 1995) ; and Kuby, Immunology (3d ed. 1997) . Antibodies also include, but are not limited to, synthetic antibodies, recombinantly produced antibodies, single domain antibodies including single domain antibodies from Camelidae species (e.g., llama or alpaca) or their humanized variants, intrabodies, anti-idiotypic (anti-Id) antibodies, and functional fragments (e.g., antigen-binding fragments) of any of the above, which refers to a portion of an antibody heavy or light chain polypeptide that retains some or all of the binding activity of the antibody from which the fragment was derived. Non-limiting examples of functional fragments (e.g., antigen-binding fragments) include single-chain Fvs (scFv) (e.g., including monospecific, bispecific, etc. ) , Fab fragments, F (ab’ ) fragments, F (ab) 2 fragments, F (ab’ ) 2 fragments, disulfide-linked Fvs (dsFv) , Fd fragments, Fv fragments, diabody, triabody, tetrabody, and minibody. In particular, antibodies provided herein include immunoglobulin molecules and immunologically active portions of immunoglobulin molecules, for example, antigen-binding domains or molecules that contain an antigen-binding site that binds to an antigen (e.g., one or more CDRs of an antibody) . Such antibody fragments can be found in, for example, Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual (1989) ; Mol. Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference (Myers ed., 1995) ; Huston et al., 1993, Cell Biophysics 22: 189-224; Plückthun and Skerra, 1989, Meth. Enzymol. 178: 497-515; and Day, Advanced Immunochemistry (2d ed. 1990) . The antibodies provided herein can be of any class ( (e.g., IgG, IgE, IgM, IgD, and IgA) or any subclass (e.g., IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl, and IgA2) of immunoglobulin molecule. Antibodies may be agonistic antibodies or antagonistic antibodies. Antibodies may be neither agonistic nor antagonistic.

[0062] An “antigen” is a structure to which an antibody can selectively bind. A target antigen may be a polypeptide, carbohydrate, nucleic acid, lipid, hapten, or other naturally occurring or synthetic compound. The target antigen may be a polypeptide. An antigen may be associated with a cell, for example, is present on or in a cell.

[0063] “Single-chain Fv” , also abbreviated as “sFv” or “scFv” , is antibody fragment that comprises the VH and VL antibody domains connected into a single polypeptide chain. For example, the sFv polypeptide further comprises a polypeptide linker between the VH and VL domains which enables the sFv to form the desired structure for antigen binding. For a review of the sFv, see Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994) .

[0064] The term “heavy chain-only antibody” or “HCAb” refers to a functional antibody, which comprises heavy chains, but lacks the light chains usually found in 4-chain antibodies. Camelid animals (such as camels, llamas, or alpacas) are known to produce HCAbs.

[0065] “Single domain antibody” or “sdAb" as used herein refers to a single monomeric variable antibody domain and which is capable of antigen binding (e.g., single domain antibodies that bind to BCMA) . Single domain antibodies include VHH domains as described herein. Examples of single domain antibodies include, but are not limited to, antibodies naturally devoid of light chains such as those from Camelidae species (e.g., llama) , single domain antibodies derived from conventional 4-chain antibodies, engineered antibodies and single domain scaffolds other than those derived from antibodies. Single domain antibodies may be derived from any species including, but not limited to mouse, human, camel, llama, goat, rabbit, and bovine. For example, a single domain antibody can be derived from antibodies raised in Camelidae species, for example in camel, llama, dromedary, alpaca and guanaco, as described herein. Other species besides Camelidae may produce heavy chain antibodies naturally devoid of light chain; VHHs derived from such other species are within the scope of the disclosure. The single domain antibody (e.g., VHH) provided herein may have a structure of FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4. Single domain antibodies may be recombinantly fused or chemically conjugated to another molecule (e.g., an agent) as described herein. Single domain antibodies may be part of a bigger binding molecule (e.g., a multi-specific antibody or a chimeric antigen receptor) .

[0066] The terms “binds" or “binding” refer to an interaction between molecules including, for example, to form a complex. Interactions can be, for example, non-covalent interactions including hydrogen bonds, ionic bonds, hydrophobic interactions, and / or van der Waals interactions. A complex can also include the binding of two or more molecules held together by covalent or non-covalent bonds, interactions, or forces. The strength of the total non-covalent interactions between a single antigen-binding site on an antibody and a single epitope of a target molecule, such as an antigen, is the affinity of the antibody or functional fragment for that epitope. The ratio of dissociation rate (koff) to association rate (kon) of a binding molecule (e.g., an antibody) to a monovalent antigen (koff / kon) is the dissociation constant KD, which is inversely related to affinity. The lower the KD value, the higher the affinity of the antibody. The value of KD varies for different complexes of antibody and antigen and depends on both kon and koff. The dissociation constant KD for an antibody provided herein can be determined using any method provided herein or any other method well known to those skilled in the art. The affinity at one binding site does not always reflect the true strength of the interaction between an antibody and an antigen. When complex antigens containing multiple, repeating antigenic determinants, such as a polyvalent antigen, come in contact with antibodies containing multiple binding sites, the interaction of antibody with antigen at one site will increase the probability of a reaction at a second site. The strength of such multiple interactions between a multivalent antibody and antigen is called the avidity.

[0067] In connection with the binding molecules described herein terms such as “bind to” “that specifically bind to” and analogous terms are also used interchangeably herein and refer to binding molecules of antigen binding domains that specifically bind to an antigen, such as a polypeptide. A binding molecule or antigen binding domain that binds to or specifically binds to an antigen can be identified, for example, by immunoassays,  or other techniques known to those of skill in the art. A binding molecule or antigen binding domain may bind to or specifically bind to an antigen when it binds to an antigen with higher affinity than to any cross-reactive antigen as determined using experimental techniques, such as radioimmunoassay (RIA) and enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) . Typically, a specific or selective reaction will be at least twice background signal or noise and may be more than 10 times background. See, e.g., Fundamental Immunology 332-36 (Paul ed., 2d ed. 1989) for a discussion regarding binding specificity. The extent of binding of a binding molecule or antigen binding domain to a “non-target” protein may be less than about 10%of the binding of the binding molecule or antigen binding domain to its particular target antigen, for example, as determined by fluorescence activated cell sorting (FACS) analysis or RIA. A binding molecule or antigen binding domain that binds to an antigen includes one that is capable of binding the antigen with sufficient affinity such that the binding molecule is useful, for example, as a therapeutic and / or diagnostic agent in targeting the antigen. A binding molecule or antigen binding domain that binds to an antigen may have a dissociation constant (KD) of less than or equal to 1 μM, 800 nM, 600 nM, 550 nM, 500 nM, 300 nM, 250 nM, 100 nM, 50 nM, 10 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM, 1 nM, 0.9 nM, 0.8 nM, 0.7 nM, 0.6 nM, 0.5 nM, 0.4 nM, 0.3 nM, 0.2 nM, or 0.1 nM. A binding molecule or antigen binding domain may bind to an epitope of an antigen that is conserved among the antigen from different species.

[0068] The term “variable region” , “variable domain” , “V region” , or “V domain” refers to a portion of the light or heavy chains of an antibody that is generally located at the amino-terminal of the light or heavy chain and has a length of about 120 to 130 amino acids in the heavy chain and about 100 to 110 amino acids in the light chain, and are used in the binding and specificity of each particular antibody for its particular antigen. The variable region of the heavy chain may be referred to as “VH” . The variable region of the light chain may be referred to as “VL” . The term “variable” refers to the fact that certain segments of the variable regions differ extensively in sequence among antibodies. The V region mediates antigen binding and defines specificity of a particular antibody for its particular antigen. However, the variability is not evenly distributed across the 110-amino acid span of the variable regions. Instead, the V regions consist of less variable (e.g., relatively invariant) stretches called framework regions (FRs) of about 15-30 amino acids separated by shorter regions of greater variability (e.g., extreme variability) called “hypervariable regions” that are each about 9-12 amino acids long. The variable regions of heavy and light chains each comprise four FRs, largely adopting a β sheet configuration, connected by three hypervariable regions, which form loops connecting, and in some cases form part of, the βsheet structure. The hypervariable regions in each chain are held together in close proximity by the FRs and, with the hypervariable regions from the other chain, contribute to the formation of the antigen-binding site of antibodies (see, e.g., Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (5th ed. 1991) ) . The constant regions are not involved directly in binding an antibody to an antigen, but exhibit various effector functions, such as participation of the antibody in antibody dependent cellular cytotoxicity (ADCC) and complement dependent cytotoxicity (CDC) . The variable regions differ extensively in sequence between different antibodies. The variable region may be a human variable region.

[0069] The term “heavy chain” when used in reference to an antibody refers to a polypeptide chain of about 50-70 kDa, wherein the amino-terminal portion includes a variable region of about 120 to 130 or more amino acids, and a carboxy-terminal portion includes a constant region. The constant region can be one of five distinct types, (e.g., isotypes) referred to as alpha (α) , delta (δ) , epsilon (ε) , gamma (γ) , and mu (μ) , based on the amino acid sequence of the heavy chain constant region. The distinct heavy chains differ in size: α, δ, and γ contain approximately 450 amino acids, while μ and ε contain approximately 550 amino acids. When combined with a light chain, these distinct types of heavy chains give rise to five well known classes (e.g., isotypes) of antibodies, IgA, IgD, IgE, IgG, and IgM, respectively, including four subclasses of IgG, namely IgGl, IgG2, IgG3, and IgG4.

[0070] The term “light chain” when used in reference to an antibody refers to a polypeptide chain of about 25 kDa, wherein the amino-terminal portion includes a variable region of about 100 to about 110 or more amino acids, and a carboxy-terminal portion includes a constant region. The approximate length of a light chain is 211 to 217 amino acids. There are two distinct types, referred to as kappa (κ) or lambda (λ) based on the amino acid sequence of the constant domains.

[0071] As used herein, the terms “hypervariable region” “HVR” “Complementarity Determining Region” and “CDR” are used interchangeably. A “CDR” refers to one of three hypervariable regions (H1, H2 or H3) within the non-framework region of the immunoglobulin (Ig or antibody) VH β-sheet framework, or one of three hypervariable regions (L1, L2 or L3) within the non-framework region of the antibody VL β-sheet framework. Accordingly, CDRs are variable region sequences interspersed within the framework region sequences.

[0072] CDR regions are well known to those skilled in the art and have been defined by well-known numbering schemes. For example, the Kabat Complementarity Determining Regions (CDRs) are based on sequence variability and are the most commonly used (see, e.g., Kabat et al., supra) . Chothia refers instead to the location of the structural loops (see, e.g., Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196: 901-17 (1987) ) . The end of the Chothia CDR-H1 loop when numbered using the Kabat numbering convention varies between H32 and H34 depending on the length of the loop (this is because the Kabat numbering scheme places the insertions at H35A and H35B; if neither 35A nor 35B is present, the loop ends at 32; if only 35A is present, the loop ends at 33; if both 35A and 35B are present, the loop ends at 34) . The AbM hypervariable regions represent a compromise between the Kabat CDRs and Chothia structural loops, and are used by Oxford Molecular’s AbM antibody modeling software (see, e.g., Antibody Engineering Vol. 2 (Kontermann and Dübel eds., 2d ed. 2010) ) . The “contact” hypervariable regions are based on an analysis of the available complex crystal structures. Another universal numbering scheme that has been developed and widely adopted is ImMunoGeneTics (IMGT) Information (Lafranc el al., Dev. Comp. Immunol. 27 (1) : 55-77 (2003) ) . IMGT is an integrated information scheme specializing in immunoglobulins (IG) , T-cell receptors (TCR) , and major histocompatibility complex (MHC) of human and other vertebrates. Herein, the CDRs are referred to in terms of both the amino acid sequence and the location within the light or heavy chain. As the “location” of the CDRs within the structure of the immunoglobulin variable domain is conserved between species and present in structures called loops, by using numbering schemes that align variable domain sequences according to structural features, CDR and framework residues are readily identified. This information can be used in grafting and replacement of CDR residues from immunoglobulins of one species into an acceptor framework from, typically, a human antibody. An additional numbering scheme (AHon) has been developed by Honegger and Plückthun, J. Mol Biol. 309: 657-70 (2001) . Correspondence between the numbering scheme, including, for example, the Kabat numbering and the IMGT unique numbering scheme, is well known to one skilled in the art (see, e.g., Kabat, supra, Chothia and Lesk, supra; Martin, supra; Lefranc et al., supra) . The residues from each of these hypervariable regions or CDRs are exemplified in Table A below.

[0073] Table A. Exemplary CDRs According to Various Numbering Schemes

[0074] The boundaries of a given CDR may vary depending on the scheme used for identification. Thus, unless otherwise specified, the terms “CDR” and “complementary determining region” of a given antibody or region thereof, such as a variable region, as well as individual CDRs (e.g., CDR-H1, CDR-H2) of the antibody or region thereof, should be understood to encompass the complementary determining region as defined by any of the known schemes described herein above. In some instances, the scheme for identification of a particular CDR or CDRs is specified, such as the CDR as defined by the IMGT, Kabat, AbM, Chothia, or Contact method. In some instances, one or more positions according to the Kabat numbering may not be occupied in the actual sequence, or the actual sequence may contain more amino acid residues than the number allowed for by the Kabat numbering. See, e.g., Deschacht etal., 2010. J Immunol 184: 5696-704 for an exemplary numbering for VHH domains according to Kabat. In other cases, the particular amino acid sequence of a CDR is given. It should be noted CDR regions may also be defined by a combination of various numbering schemes, e.g., a combination of Kabat and Chothia numbering systems, a combination of Kabat and AbM numbering systems, or a combination of Kabat and IMGT numbering systems. Therefore, the term such as “aCDR1 as set forth in a specific VH or VHH” includes any CDR1 as defined by the exemplary CDR numbering schemes described above, but is not limited thereby. Once a variable region (e.g., a VHH, VH or VL) is given, those skilled in the art would understand that CDRs within the region can be defined by different numbering systems or combinations thereof.

[0075] The term “constant region” or “constant domain” ' refers to a carboxy terminal portion of the light and heavy chain which is not directly involved in binding of the antibody to antigen but exhibits various effector function, such as interaction with the Fc receptor. The term refers to the portion of an immunoglobulin molecule having a more conserved amino acid sequence relative to the other portion of the immunoglobulin, such as the variable region, which contains the antigen binding site. The constant region may contain the CH1, CH2, and CH3 regions of the heavy chain and the CL region of the light chain.

[0076] The term “framework” or “FR” refers to those variable region residues flanking the CDRs. FR residues are present, for example, in chimeric, humanized, human, domain antibodies (e.g., single domain antibodies) , diabodies, linear antibodies, and bispecific antibodies. FR residues are those variable domain residues other than the hypervariable region residues or CDR residues.

[0077] The term “Fc region” herein is used to define a C-terminal region of an immunoglobulin heavy chain, including, for example, native sequence Fc regions, recombinant Fc regions, and variant Fc regions. Although the boundaries of the Fc region of an immunoglobulin heavy chain might vary, the human IgG heavy chain Fc region is often defined to stretch from an amino acid residue at position Cys226, or from Pro230, to the carboxyl-terminus thereof. The C-terminal lysine (residue 447 according to the EU numbering system) of the Fc region may be removed, for example, during production or purification of the antibody, or by recombinantly engineering the nucleic acid encoding a heavy chain of the antibody. Accordingly, a composition of intact antibodies may comprise antibody populations with all K447 residues removed, antibody populations with no K447 residues removed, and antibody populations having a mixture of antibodies with and without the K447 residue. A “functional Fc region” possesses an “effector function” of a native sequence Fc region. Exemplary “effector functions” include C1q binding; CDC; Fc receptor binding; ADCC; phagocytosis; downregulation of cell surface receptors (e.g., B cell receptor) , etc. Such effector functions generally require the Fc region to be combined with a binding region or binding domain (e.g., an antibody variable region or domain) and can be assessed using various assays known to those skilled in the art. A “variant Fc region” comprises an amino acid sequence which differs from that of a native sequence Fc region by virtue of at least one amino acid modification (e.g., substituting, addition, or deletion) . A variant Fc region may have at least one amino acid substitution compared to a native sequence Fc region or to the Fc region of a parent polypeptide, for example, from about one to about ten amino acid substitutions, or from about one to about five amino acid substitutions in a native sequence Fc region or in the Fc region of a parental polypeptide. The variant Fc region herein can possess at least about 80%homology with a native sequence Fc region and / or with an Fc region of a parental polypeptide, or at least about 90%homology therewith, for example, at least about 95%homology therewith.

[0078] “Percent (%) amino acid sequence identity” and “homology” with respect to a peptide, polypeptide or antibody sequence are defined as the percentage of amino acid residues in a candidate sequence that are identical with the amino acid residues in the specific peptide or polypeptide sequence, after aligning the sequences and introducing gaps, if necessary, to achieve the maximum percent sequence identity, and not considering any conservative substitutions as part of the sequence identity. Alignment for purposes of determining percent amino acid sequence identity can be achieved in various ways that are within the skill in the art, for instance, using publicly available computer software such as BLAST, BLAST-2, ALIGN or MEGALIGNTM (DNASTAR) software. Those skilled in the art can determine appropriate parameters for measuring alignment, including any algorithms needed to achieve maximal alignment over the full length of the sequences being compared.

[0079] The term “specificity” refers to selective recognition of an antigen binding protein (such as a CAR or an sdAb) for a particular epitope of an antigen. Natural antibodies, for example, are monospecific. The term “multi-specific” as used herein denotes that an antigen binding protein (such as a CAR or an sdAb) has two or more antigen-binding sites of which at least two bind different antigens (or epitopes) . “Bispecific” as used herein denotes that an antigen binding protein (such as a CAR or an sdAb) has two different antigen-binding specificities. The term “monospecific” as used herein denotes an antigen binding protein (such as a CAR or an sdAb) that has one or more binding sites each of which bind the same antigen (or epitope) .

[0080] The term "valent” as used herein denotes the presence of a specified number of binding sites in an antigen binding protein (such as a CAR or an sdAb) . A natural antibody for example or a full-length antibody has two binding sites and is bivalent. As such, the terms “trivalent” , “tetravalent” , “pentavalent” and “hexavalent” denote the presence of two binding site, three binding sites, four binding sites, five binding sites, and six binding sites, respectively, in an antigen binding protein (such as a CAR or an sdAb) .

[0081] “Chimeric antigen receptor” or “CAR” as used herein refers to genetically engineered receptors, which can be used to graft one or more antigen specificity onto immune effector cells, such as T cells, NK cells. Some CARs are also known as “artificial T-cell receptors” , “chimeric T cell receptors” or “chimeric immune receptors” . The CAR may comprise an extracellular antigen binding domain specific for one or more antigens (such as tumor antigens) , a transmembrane domain, and an intracellular signaling domain of a T cell and / or other receptors. “CAR-T cell” refers to a T cell that expresses a CAR. “CAR-NK cell” refers to a NK cell that expresses a CAR.

[0082] The terms “polypeptide” and “peptide” and “protein” are used interchangeably herein and refer to polymers of amino acids of any length. The polymer may be linear or branched, it may comprise modified amino acids, and it may be interrupted by non-amino acids. The terms also encompass an amino acid polymer that has been modified naturally or by intervention; for example, disulfide bond formation, glycosylation, lipidation, acetylation, phosphorylation, or any other manipulation or modification. Also included within the definition are, for example, polypeptides containing one or more analogs of an amino acid, including but not limited to, unnatural amino acids, as well as other modifications known in the art. It is understood that, because the polypeptides of this disclosure may be based upon antibodies or other members of the immunoglobulin superfamily, thus a “polypeptide” can occur as a single chain or as two or more associated chains.

[0083] “Polynucleotide” or “nucleic acid” as used interchangeably herein, refers to polymers of nucleotides of any length and includes DNA and RNA. The nucleotides can be deoxyribonucleotides, ribonucleotides, modified nucleotides or bases, and / or their analogs, or any substrate that can be incorporated into a polymer by DNA or RNA polymerase or by a synthetic reaction. A polynucleotide may comprise modified nucleotides, such as methylated nucleotides and their analogs. “Oligonucleotide” as used herein, refers to short, generally single-stranded, synthetic polynucleotides that are generally, but not necessarily, fewer than about 200 nucleotides in length. The terms “oligonucleotide” and “polynucleotide” are not mutually exclusive. The description above for polynucleotides is equally and fully applicable to oligonucleotides. A cell that produces a binding molecule of the present disclosure may include a parent hybridoma cell, as well as bacterial and eukaryotic host cells into which nucleic acids encoding the antibodies have been introduced. Unless specified otherwise, the left-hand end of any single-stranded polynucleotide sequence disclosed herein is the 5' end; the left-hand direction of double-stranded polynucleotide sequences is referred to as the 5' direction. The direction of 5' to 3' a ddition of nascent RNA transcripts is referred to as the transcription direction; sequence regions on the DNA strand having the same sequence as the RNA transcript that are 5' to the 5' end of the RNA transcript are referred to as “upstream sequences” ; sequence regions on the DNA strand having the same sequence as the RNA transcript that are 3' to the 3' end of the RNA transcript are referred to as “downstream sequences” .

[0084] A “nucleic acid” is, for example, an RNA, DNA, or a mixed nucleic acid, which is substantially separated from other genome DNA sequences as well as proteins or complexes such as ribosomes and polymerases, which naturally accompany a native sequence. An “isolated” nucleic acid molecule is one which is separated from other nucleic acid molecules which are present in the natural source of the nucleic acid molecule. Moreover, an “isolated” nucleic acid molecule, such as a cDNA molecule, can be substantially free of other cellular material, or culture medium when produced by recombinant techniques, or substantially free of chemical precursors or other chemicals when chemically synthesized. One or more nucleic acid molecules encoding a single domain antibody or an antibody as described herein may be isolated or purified. The term embraces nucleic acid sequences that have been removed from their naturally occurring environment, and includes recombinant or cloned DNA isolates and chemically synthesized analogues or analogues biologically synthesized by heterologous systems. A substantially pure molecule may include isolated forms of the molecule.

[0085] The term “vector” refers to a substance that is used to carry or include a nucleic acid sequence, including for example, a nucleic acid sequence encoding a binding molecule (e.g., an antibody) as described herein, in order to introduce a nucleic acid sequence into a host cell. Vectors applicable for use include, for example, expression vectors, plasmids, phage vectors, viral vectors, episomes, and artificial chromosomes, which can include selection sequences or markers operable for stable integration into a host cell’s chromosome. Additionally, the vectors can include one or more selectable marker genes and appropriate expression control sequences. Selectable marker genes that can be included, for example, provide resistance to antibiotics or toxins, complement auxotrophic deficiencies, or supply critical nutrients not in the culture media. Expression control sequences can include constitutive and inducible promoters, transcription enhancers, transcription terminators, and the like, which are well known in the art. When two or more nucleic acid molecules are to be co-expressed (e.g., both an antibody heavy and light chain or an antibody VH and VL) , both nucleic acid molecules can be inserted, for example, into a single expression vector or in separate expression vectors. For single vector expression, the encoding nucleic acids can be operationally linked to one common expression control sequence or linked to different expression control sequences, such as one inducible promoter and one constitutive promoter. The introduction of nucleic acid molecules into a host cell can be confirmed using methods well known in the art. Such methods include, for example, nucleic acid analysis such as Northern blots or polymerase chain reaction (PCR) amplification of mRNA, immunoblotting for expression of gene products, or other suitable analytical methods to test the expression of an introduced nucleic acid sequence or its corresponding gene product. It is understood by those skilled in the art that the nucleic acid molecules are expressed in a sufficient amount to produce a desired product and it is further understood that expression levels can be optimized to obtain sufficient expression using methods well known in the art.

[0086] The term “host cell” as used herein refers to a particular subject cell that may be transfected with a nucleic acid molecule and the progeny or potential progeny of such a cell. Progeny of such a cell may not be identical to the parent cell transfected with the nucleic acid molecule due to mutations or environmental influences that may occur in succeeding generations or integration of the nucleic acid molecule into the host cell genome.

[0087] As used herein, the term “autologous” is meant to refer to any material derived from the same individual to whom it is later to be re-introduced into the individual.

[0088] “Allogeneic” refers to a graft derived from a different individual of the same species.

[0089] The term “transfected” or “transformed” or “transduced” as used herein refers to a process by which exogenous nucleic acid is transferred or introduced into the host cell. A “transfected” or “transformed” or “transduced” cell is one which has been transfected, transformed or transduced with exogenous nucleic acid. The cell includes the primary subject cell and its progeny.

[0090] The term “pharmaceutically acceptable” as used herein means being approved by a regulatory agency of the Federal or a state government, or listed in United States Pharmacopeia, European Pharmacopeia, or other generally recognized Pharmacopeia for use in animals, and more particularly in humans.

[0091] A component may be “pharmaceutically acceptable” in the sense of being compatible with the other ingredients of a pharmaceutical formulation, and suitable for use in contact with the tissue or organ of humans and animals without excessive toxicity, irritation, allergic response, immunogenicity, or other problems or complications, commensurate with a reasonable benefit / risk ratio. See, e.g., Lippincott Williams & Wilkins: Philadelphia, PA, 2005; Handbook of Pharmaceutical Excipients, 6th ed. ; Rowe et al., Eds. ; The Pharmaceutical Press and the American Pharmaceutical Association: 2009; Handbook of Pharmaceutical Additives, 3rd ed. ; Ash and Ash Eds. ; Gower Publishing Company: 2007; Pharmaceutical Preformulation and Formulation, 2nd ed.; Gibson Ed. ; CRC Press LLC: Boca Raton, FL, 2009. Pharmaceutically acceptable excipients may be nontoxic to the cell or mammal being exposed thereto at the dosages and concentrations employed. A pharmaceutically acceptable excipient may be an aqueous pH buffered solution.

[0092] The term “effective amount” or “therapeutically effective amount” as used herein refers to the amount of a single domain antibody or a therapeutic molecule comprising an agent and the single domain antibody or pharmaceutical composition provided herein which is sufficient to result in the desired outcome.

[0093] The terms “subject” and “patient” may be used interchangeably. As used herein, a subject may be a mammal, such as a non-primate or a primate (e.g., human) . A subject may be a human. A subject may be a mammal, e.g., a human, diagnosed with a disease or disorder. A subject may be a mammal, e.g., a human, at risk of developing a disease or disorder.

[0094] “Administer” or “administration” refers to the act of injecting or otherwise physically delivering a substance as it exists outside the body into a patient, such as by mucosal, intradermal, intravenous, intramuscular delivery, and / or any other method of physical delivery described herein or known in the art.

[0095] As used herein, the terms “treat” “treatment” and “treating” refer to the reduction or amelioration of the progression, severity, and / or duration of a disease or condition resulting from the administration of one or more therapies. Treating may be determined by assessing whether there has been a decrease, alleviation and / or mitigation of one or more symptoms associated with the underlying disorder such that an improvement is observed with the patient, despite that the patient may still be afflicted with the underlying disorder. The term “treating” includes both managing and ameliorating the disease. The terms “manage” “managing” and “management” refer to the beneficial effects that a subject derives from a therapy which does not necessarily result in a cure of the disease.

[0096] The terms “prevent” “preventing” and “prevention” refer to reducing the likelihood of the onset (or recurrence) of a disease, disorder, condition, or associated symptom (s) (e.g., a autoimmune disease or a cancer) .

[0097] “BCMA associated disease or disorder” as used herein also refers to a disease or disorder that comprises a cell or tissue in which BCMA is expressed or overexpressed. BCMA associated disease or disorder may comprise a cell on which BCMA is abnormally expressed or over activated, e.g., with higher expression or activation of BCMA as compared with a normal or healthy cell. BCMA associated disease or disorder may comprise a cell in or on which BCMA is deficient.

[0098] “Derived from” as that term is used herein, indicates a relationship between a first and a second molecule. It generally refers to structural similarity between the first molecule and a second molecule and does not connotate or include a process or source limitation on a first molecule that is derived from a second molecule. For example, in the case of an intracellular signaling domain that is derived from a CD3zeta molecule, the intracellular signaling domain retains sufficient CD3zeta sequence / structure such that is has the required function, namely, the ability to generate a signal under the appropriate conditions. It does not connotate or include a limitation to a particular process of producing the intracellular signaling domain, for example, it does not mean that, to provide the intracellular signaling domain, one must start with a CD3zeta sequence and delete unwanted sequence, or impose mutations, to arrive at the intracellular signaling domain. A domain derived from a particular protein may have a sequence that is at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%identical to the relevant functional portion of the particular protein.

[0099] The terms “about” and “approximately” mean within 20%, within 15%, within 10%, within 9%, within 8%, within 7%, within 6%, within 5%, within 4%, within 3%, within 2%, within 1%, or less of a given value or range.

[0100] As used in the present disclosure and claims, the singular forms “a” , “an” and “the” include plural forms unless the context clearly dictates otherwise.

[0101] It is understood that wherever embodiments are described herein with the term “comprising” otherwise analogous embodiments described in terms of “consisting of” and / or “consisting essentially of” are also provided. It is also understood that wherever embodiments are described herein with the phrase “consisting essentially of” otherwise analogous embodiments described in terms of “consisting of” are also provided.

[0102] The term “between” as used in a phrase as such “between A and B” or “between A-B” refers to a range including both A and B.

[0103] The term “and / or” as used in a phrase such as “A and / or B” herein is intended to include both A and B; A or B; A (alone) ; and B (alone) . Likewise, the term "and / or" as used in a phrase such as "A, B, and / or C “is intended to encompass each of the following embodiments: A, B, and C; A, B, or C; A or C; A or B; B or C; A and C; A and B; B and C; A (alone) ; B (alone) ; and C (alone) .

[0104] 5.2 BCMA-binding moieties

[0105] 5.2.1 Single Domain Antibodies that Bind to BCMA

[0106] In one aspect, provided herein are BCMA-binding moieties, such as single domain antibodies (e.g., VHH domains) or antigen-binding fragments thereof, capable of binding to BCMA (B-cell maturation antigen) .

[0107] The BCMA-binding moieties provided herein can bind to human BCMA. In some embodiments, the BCMA-binding moieties provided herein may bind to cynomolgus BCMA. In some embodiments, the BCMA-binding moieties provided herein may exhibit cross-species binding activity to human and cynomolgus BCMA.

[0108] The BCMA-binding moiety provided herein may modulate one or more BCMA activities. The BCMA-binding moiety may be an anti-BCMA single domain antibody, the anti-BCMA single domain antibody provided herein may be an antagonist antibody or a agonists antibody.

[0109] The anti-BCMA single domain antibody provided herein may bind to BCMA (e.g., human BCMA) with a dissociation constant (KD) of < 1 μM, < 100 nM, < 10 nM, < 1 nM, < 0.1 nM, <0.01 nM, or < 0.001 nM (e.g., 10-7M or less, e.g., from 10-7 M to 10-13 M) . A variety of methods of measuring binding affinity are known in the art, any of which can be used for purposes of the present disclosure.

[0110] In some embodiments, the BCMA-binding moieties provided herein are anti-BCMA VHH domains. Exemplary anti-BCMA VHH domains provided herein are generated as described below in Section 6, and these anti-BCMA VHH domains are referred to as WT-48, WT-22, H-48 and H-22, as also shown in Table B below.

[0111] Thus, the BCMA-binding moiety provided herein may comprise one or more CDR sequences of any one of WT-48, WT-22, H-48 and H-22. CDR sequences can be determined according to well-known numbering systems, for example, a numbering system according to Table A. In some embodiments, the CDRs are determined according to IMGT numbering scheme. In some embodiments, the CDRs are determined according to Kabat numbering scheme. In some embodiments, the CDRs are determined according to AbM numbering scheme. In other embodiments, the CDRs are determined according to Chothia numbering scheme. In other embodiments, the CDRs are determined according to Contact numbering scheme. The CDRs may be determined according to a combination of any numbering scheme described above. In some embodiments, the BCMA-binding moiety is an anti-BCMA single domain antibody (sdAb) . In some embodiments, the anti-BCMA single domain antibody is camelid. In some embodiments, the anti-BCMA single domain antibody is humanized. In some embodiments, the anti-BCMA single domain antibody is chimeric. In some embodiments, the anti-BCMA single domain antibody comprises an acceptor human framework, e.g., a human immunoglobulin framework or a human consensus framework.

[0112] Table B. Exemplary anti-BCMA Single Domain Antibodies

[0113] The BCMA-binding moiety (e.g., anti-BCMA single domain antibody) provided herein may comprise: (i) a CDR1 comprising the amino acid sequence of the CDR1 as set forth in any one of SEQ ID NOs: 13-16; (ii) a CDR2 comprising the amino acid sequence of the CDR2 as set forth in any one of SEQ ID NOs: 13-16; and / or (iii) a CDR3 comprising the amino acid sequence of the CDR3 as set forth in any one of SEQ ID NOs: 13-16.

[0114] The BCMA-binding moiety provided herein may comprise one, two, or all three CDRs (CDR1, CDR2, and / or CDR3) of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13. The BCMA-binding moiety provided herein may comprise one, two, or all three CDRs (CDR1, CDR2, and / or CDR3) of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14. The BCMA-binding moiety provided herein may comprise one, two, or all three CDRs (CDR1, CDR2, and / or CDR3) of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15. The BCMA-binding moiety provided herein may comprise one, two, or all three CDRs (CDR1, CDR2, and / or CDR3) of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16.

[0115] In some embodiments, the BCMA-binding moiety provided herein comprise a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of the CDR1, CDR2, and CDR3, respectively, as set forth in SEQ ID NO: 13. In some embodiments, the BCMA-binding moiety provided herein comprise a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of the CDR1, CDR2, and CDR3, respectively, as set forth in SEQ ID NO: 14 In some embodiments, the BCMA-binding moiety provided herein comprise a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of the CDR1, CDR2, and CDR3, respectively, as set forth in SEQ ID NO: 15. In some embodiments, the BCMA-binding moiety provided herein comprise a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of the CDR1, CDR2, and CDR3, respectively, as set forth in SEQ ID NO: 16.

[0116] In some embodiments, the BCMA-binding moiety provided herein may comprise:

[0117] (i) a CDR1 comprising: (a) an amino acid sequence of SEQ ID NO: 17; (b) an amino acid sequence having at least 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or more sequence identity thereto; or (c) an amino sequence having a substitution, deletion and / or addition of one or several amino acids (e.g., a substitution, deletion and / or addition of 1, 2 or 3 amino acids) as compared thereto;

[0118] (ii) a CDR2 comprising: (a) an amino acid sequence of SEQ ID NO: 18; (b) an amino acid sequence having at least 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or more sequence identity thereto; or (c) an amino sequence having a substitution, deletion and / or addition of one or several amino acids (e.g., a substitution, deletion and / or addition of 1, 2 or 3 amino acids) as compared thereto; and / or,

[0119] (iii) a CDR3 comprising: (a) an amino acid sequence of SEQ ID NO: 19; (b) an amino acid sequence having at least 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or more sequence identity thereto; or (c) an amino sequence having a substitution, deletion and / or addition of one or several amino acids (e.g., a substitution, deletion and / or addition of 1, 2 or 3 amino acids) as compared thereto.

[0120] In some embodiments, the BCMA-binding moiety provided herein may comprise:

[0121] (i) a CDR1 comprising: (a) an amino acid sequence of SEQ ID NO: 20; (b) an amino acid sequence having at least 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or more sequence identity thereto; or (c) an amino sequence having a substitution, deletion and / or addition of one or several amino acids (e.g., a substitution, deletion and / or addition of 1, 2 or 3 amino acids) as compared thereto;

[0122] (ii) a CDR2 comprising: (a) an amino acid sequence of SEQ ID NO: 21; (b) an amino acid sequence having at least 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or more sequence identity thereto; or (c) an amino sequence having a substitution, deletion and / or addition of one or several amino acids (e.g., a substitution, deletion and / or addition of 1, 2 or 3 amino acids) as compared thereto; and / or,

[0123] (iii) a CDR3 comprising: (a) an amino acid sequence of SEQ ID NO: 22; (b) an amino acid sequence having at least 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or more sequence identity thereto; or (c) an amino sequence having a substitution, deletion and / or addition of one or several amino acids (e.g., a substitution, deletion and / or addition of 1, 2 or 3 amino acids) as compared thereto.

[0124] In some embodiments, the BCMA-binding moiety provided herein may comprise:

[0125] (i) a CDR1 comprising: (a) an amino acid sequence of SEQ ID NO: 23; (b) an amino acid sequence having at least 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or more sequence identity thereto; or (c) an amino sequence having a substitution, deletion and / or addition of one or several amino acids (e.g., a substitution, deletion and / or addition of 1, 2 or 3 amino acids) as compared thereto;

[0126] (ii) a CDR2 comprising: (a) an amino acid sequence of SEQ ID NO: 24; (b) an amino acid sequence having at least 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or more sequence identity thereto; or (c) an amino sequence having a substitution, deletion and / or addition of one or several amino acids (e.g., a substitution, deletion and / or addition of 1, 2 or 3 amino acids) as compared thereto; and / or,

[0127] (iii) a CDR3 comprising: (a) an amino acid sequence of SEQ ID NO: 25; (b) an amino acid sequence having at least 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or more sequence identity thereto; or (c) an amino sequence having a substitution, deletion and / or addition of one or several amino acids (e.g., a substitution, deletion and / or addition of 1, 2 or 3 amino acids) as compared thereto.

[0128] In some embodiments, the BCMA-binding moiety provided herein may comprise:

[0129] (i) a CDR1 comprising: (a) an amino acid sequence of SEQ ID NO: 26; (b) an amino acid sequence having at least 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or more sequence identity thereto; or (c) an amino sequence having a substitution, deletion and / or addition of one or several amino acids (e.g., a substitution, deletion and / or addition of 1, 2 or 3 amino acids) as compared thereto;

[0130] (ii) a CDR2 comprising: (a) an amino acid sequence of SEQ ID NO: 27; (b) an amino acid sequence having at least 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or more sequence identity thereto; or (c) an amino sequence having a substitution, deletion and / or addition of one or several amino acids (e.g., a substitution, deletion and / or addition of 1, 2 or 3 amino acids) as compared thereto; and / or,

[0131] (iii) a CDR3 comprising: (a) an amino acid sequence of SEQ ID NO: 28; (b) an amino acid sequence having at least 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or more sequence identity thereto; or (c) an amino sequence having a substitution, deletion and / or addition of one or several amino acids (e.g., a substitution, deletion and / or addition of 1, 2 or 3 amino acids) as compared thereto.

[0132] In some embodiments, the BCMA-binding moiety comprises a CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17, a CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18, and a CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19. In some embodiments, the BCMA-binding moiety comprises a CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:20, a CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21, and a CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22. In some embodiments, the BCMA-binding moiety comprises a CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 23, a CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 24, and a CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 25. In some embodiments, the BCMA-binding moiety comprises a CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26, a CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 27, and a CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 28.

[0133] The BCMA-binding moiety may further comprise one or more framework regions of WT-48, WT-22, H-48 and H-22. In some embodiments, the BCMA-binding moiety provided herein comprises one or more framework (s) derived from a VHH domain comprising the sequence of SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 or SEQ ID NO: 16. In some embodiments, the BCMA-binding moiety provided herein may comprise one or more FR regions selected from the group consisting of FR1, FR2, FR3, and FR4 each independently as set forth in any one of anti-BCMA VHH domains comprising the sequence of SEQ ID NOs: 13-16. In some embodiments, the BCMA-binding moiety provided herein may comprise one or more FR regions selected from the group consisting of FR1, FR2, FR3, and FR4 as set forth in SEQ ID NO: 13. The BCMA-binding moiety provided herein may comprise one or more FR regions selected from the group consisting of FR1, FR2, FR3, and FR4 as set forth in SEQ ID NO: 14. The BCMA-binding moiety provided herein may comprise one or more FR regions selected from the group consisting of FR1, FR2, FR3, and FR4 as set forth in SEQ ID NO: 15. The BCMA-binding moiety provided herein may comprise one or more FR regions selected from the group consisting of FR1, FR2, FR3, and FR4 as set forth in SEQ ID NO: 16.

[0134] In some embodiments, the BCMA-binding moiety provided herein comprises an anti-BCMA VHH domain comprising an amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 13-16; or an amino acid sequence having a substitution, deletion and / or addition of one or several amino acids (e.g., a substitution, deletion and / or addition of 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10 amino acids) as compared thereto; or an amino acid sequence having at least 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or more sequence identity thereto.

[0135] In some embodiments, the BCMA-binding moiety provided herein comprises an anti-BCMA VHH domain comprising an amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 13-16.

[0136] In another aspect, provided herein is a chimeric anti-BCMA antibody, that specifically binds to BCMA competitively with any one of the BCMA-binding moieties described herein. Competitive binding may be determined using an ELISA assay. For example, an antibody is provided that specifically binds to BCMA competitively with a BCMA-binding moiety comprising the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 13-16.

[0137] In another aspect, provided herein is a BCMA-binding protein comprising any one of the BCMA-binding moieties described above. The BCMA binding protein may be a monoclonal antibody, including a camelid, chimeric, humanized or human antibody. The anti-BCMA antibody may be an antibody fragment, e.g., a VHH fragment. The anti-BCMA antibody may be a full-length heavy-chain only antibody comprising an Fc region of any antibody class or isotype, such as IgGl or IgG4. The Fc region may have reduced or minimized effector function. The BCMA-binding protein may be a fusion protein comprising the BCMA-binding moiety provided herein. The BCMA-binding protein may be a multi-specific antibody comprising the BCMA-binding moiety provided herein. Other exemplary BCMA-binding molecules are described in more detail in the following sections.

[0138] The BCMA-binding protein may be a fusion protein comprising a BCMA-binding moiety provided herein, and an immunoglobulin Fc region or a fragment thereof.

[0139] In some embodiments, the fusion protein may further comprise a hinge region of an immunoglobulin.

[0140] In some embodiments, the Fc region and / or the hinge region each may be independently derived from an IgG (e.g., IgG1, IgG2, IgG3, or IgG4) , IgM or IgA.

[0141] In some embodiments, the fusion protein may comprise a peptide chain comprising from N-terminal to C-terminal a BCMA-binding moiety provided herein, the immunoglobulin hinge region, and the immunoglobulin Fc region or a fragment thereof.

[0142] In some embodiments, the fusion protein may be an HCAb.

[0143] In some embodiments, the fusion protein may comprise two peptide chains each comprising from N-terminal to C-terminal a BCMA-binding moiety provided herein, the immunoglobulin hinge region, and the immunoglobulin Fc region or a fragment thereof.

[0144] In some embodiments, the two peptide chains may have the same or different BCMA-binding moieties, the same or different immunoglobulin hinge regions, and / or, the same or different immunoglobulin Fc regions or fragments thereof.

[0145] The BCMA-binding protein may be a multi-specific antibody comprising a BCMA-binding moiety provided herein or the fusion protein described above.

[0146] The multi-specific antibody may comprise two or more BCMA-binding moieties as disclosed herein above. The multi-specific antibody may comprise a first BCMA-binding moiety disclosed herein above, and a second BCMA-binding moiety disclosed herein above. The first BCMA-binding moiety may be at the N-terminus of the second BCMA-binding moiety. The first BCMA-binding moiety may be at the C-terminus of the second BCMA-binding moiety. The first BCMA-binding moiety and / or the second BCMA-binding moiety each independently may comprise a CDR1, a CDR2, and a CDR3, each independently as set forth in any one of SEQ ID NOs: 13-16. The first BCMA-binding moiety and / or the second BCMA-binding moiety each independently may comprise an amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 13-16. The first BCMA-binding moiety and the second BCMA-binding moiety may be fused optionally via a peptide linker.

[0147] The BCMA-binding moiety provided herein may be an anti-BCMA single domain antibody as described above. The anti-BCMA single domain antibody may be camelid. The anti-BCMA single domain antibody may be humanized. The anti-BCMA single domain antibody may comprise an acceptor human framework, e.g., a human immunoglobulin framework or a human consensus framework.

[0148] 5.2.2 Humanized Single Domain Antibodies

[0149] The single domain antibodies described herein include humanized single domain antibodies. General strategies to humanize single domain antibodies from Camelidae species have been described (see, e. g, Vincke et al., J. Biol. Chem., 284 (5) : 3273-3284 (2009) ) and may be useful for producing humanized VHH domains as disclosed herein. The design of humanized single domain antibodies from Camelidae species may include the hallmark residues in the VHH, such as residues 11, 37, 44, 45 and 47 (residue numbering according to Kabat) (Muyldermans, Reviews Mol Biotech 74: 277-302 (2001) .

[0150] Humanized antibodies, such as the humanized single domain antibodies disclosed herein can also be produced using a variety of techniques known in the art, including but not limited to, CDR-grafting (European Patent No. EP 239, 400; International publication No. WO 91 / 09967; and U.S. Patent Nos. 5, 225, 539, 5, 530, 101, and 5, 585, 089) , veneering or resurfacing (European Patent Nos. EP 592, 106 and EP 519, 596; Padlan, Molecular Immunology 28 (4 / 5) : 489-498 (1991) ; Studnicka et al., Protein Engineering 7 (6) : 805-814 (1994) ; and Roguska et al., PNAS 91: 969-973 (1994) ) , chain shuffling (U.S. Patent No 5, 565, 332) , and techniques disclosed in, e.g., U.S. Pat. No, 6,407, 213, U.S. Pat. No, 5, 766, 886, WO 9317105, Tan et al., J. Immunol. 169: 1119 25 (2002) , Caldas et al., Protein Eng. 13 (5) : 353-60 (2000) , Morea et al., Methods 20 (3) : 267 79 (2000) , Bacae et al., J. Biol. Chem. 272 (16) : 10678-84 (1997) , Roguska et al. Protein Eng. 9 (10) : 895 904 (1996) , Couto et al., Cancer Res. 55 (23 Supp) : 5973s-5977s (1995) , Couto etal., Cancer Res. 55 (8) : 1717-22 (1995) , Sandhu JS, Gene 150 (2) : 409-10 (1994) , and Pedersen et al., J. Mol. Biol. 235 (3) : 959-73 (1994) . See also U.S. Patent Pub. No. US 2005 / 0042664 Al (Feb. 24, 2005) , each of which is incorporated by reference herein in its entirety.

[0151] The single domain antibodies provided herein may be humanized single domain antibodies that bind to BCMA, including human BCMA. For example, humanized single chain antibodies of the present disclosure may comprise one or more CDRs each independently as set forth in any one of SEQ ID NOs: 13-16. Various methods for humanizing non-human antibodies are known in the art. For example, a humanized antibody can have one or more amino acid residues introduced into it from a source that is non-human. These non-human amino acid residues are often referred to as “import” residues, which are typically taken from an “import” variable domain. Humanization may be performed, for example, following the method of Jones et al., Nature 321: 522-25 (1986) ; Riechmann et al., Nature 332: 323-27 (1988) ; and Verhoeyen et al., Science 239: 1534-36 (1988) ) , by substituting hypervariable region sequences for the corresponding sequences of a human antibody. Humanization of the single domain antibody provided herein may be performed as described in Section 6 below.

[0152] The humanized antibodies may be constructed by CDR grafting, in which the amino acid sequences of the CDRs of the parent non-human antibody are grafted onto a human antibody framework. For example, Padlan et al. determined that only about one third of the residues in the CDRs actually contact the antigen, and termed these the “specificity determining residues” or SDRs (Padlan et al., FASEB J 9: 133-39 (1995) ) , In the technique of SDR grafting, only the SDR residues are grafted onto the human antibody framework (see, e.g., Kashmiri et al., Methods 36: 25-34 (2005) ) .

[0153] The choice of human variable domains to be used in making the humanized antibodies can be important to reduce antigenicity. For example, according to the so-called “best-fit” method, the sequence of the variable domain of a non-human antibody is screened against the entire library of known human variable-domain sequences. The human sequence that is closest to that of the non-human antibody may be selected as the human framework for the humanized antibody (Sims et al., J. Immunol. 151: 2296-308 (1993) ; and Chothia et al., J. Mol. Biol. 196: 901-17 (1987) ) . Another method uses a particular framework derived from the consensus sequence of all human antibodies of a particular subgroup of light or heavy chains. The same framework may be used for several different humanized antibodies (Carter et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 4285-89 (1992) ; and Presta etaL, J. Immunol. 151: 2623-32 (1993) ) , The framework may be derived from the consensus sequences of the most abundant human subclasses, VL6 subgroup I (VL6I) and VH subgroup III (VHIII) . In another method, human germline genes are used as the source of the framework regions.

[0154] In an alternative paradigm based on comparison of CDRs, called superhumanization, FR homology is irrelevant. The method consists of comparison of the non-human sequence with the functional human germline gene repertoire. Those genes encoding the same or closely related canonical structures to the murine sequences are then selected. Next, within the genes sharing the canonical structures with the non-human antibody, those with highest homology within the CDRs are chosen as FR donors. Finally, the non-human CDRs are grafted onto these FRs (see, e.g., Tan etal., J. Immunol. 169: 1119-25 (2002) ) .

[0155] It is further generally desirable that antibodies be humanized with retention of their affinity for the antigen and other favorable biological properties. To achieve this goal, according to one method, humanized antibodies are prepared by a process of analysis of the parental sequences and various conceptual humanized products using three-dimensional models of the parental and humanized sequences. Three-dimensional immunoglobulin models are commonly available and are familiar to those skilled in the art. Computer programs are available which illustrate and display probable three-dimensional conformational structures of selected candidate immunoglobulin sequences. These include, for example, WAM (Whitelegg and Rees, Protein Eng. 13: 819-24 (2002) ) , Modeller (Sali and Blundell, J. Mol. Biol. 234: 779-815 (1993) ) , and Swiss PDB Viewer (Guex and Peitsch, Electrophoresis 18: 2714-23 (1997) ) . Inspection of these displays permits analysis of the likely role of the residues in the functioning of the candidate immunoglobulin sequence, e.g., the analysis of residues that influence the ability of the candidate immunoglobulin to bind its antigen. In this way, FR residues can be selected and combined from the recipient and import sequences so that the desired antibody characteristic, such as increased affinity for the target antigen (s) , is achieved. In general, the hypervariable region residues are directly and most substantially involved in influencing antigen binding.

[0156] Another method for antibody humanization is based on a metric of antibody humanness termed Human String Content (HSC) . This method compares the mouse sequence with the repertoire of human germline genes, and the differences are scored as HSC. The target sequence is then humanized by maximizing its HSC rather than using a global identity measure to generate multiple diverse humanized variants (Lazar et al., Mol. Immunol. 44: 1986-98 (2007) ) .

[0157] In addition to the methods described above, empirical methods may be used to generate and select humanized antibodies. These methods include those that are based upon the generation of large libraries of humanized variants and selection of the best clones using enrichment technologies or high throughput screening techniques. Antibody variants may be isolated from phage, ribosome, and yeast display libraries as well as by bacterial colony screening (see, e.g., Hoogenboom, Nat. Biotechnol. 23: 1105-16 (2005) ; Dufner et al., Trends Biotechnol. 24: 523-29 (2006) ; Feldhaus et al., Nat. Biotechnol. 21: 163-70 (2003) ; and Schlapschy et al., Protein Eng. Des. Sel. 17: 847-60 (2004) ) .

[0158] In the FR library approach, a collection of residue variants is introduced at specific positions in the FR followed by screening of the library to select the FR that best supports the grafted CDR. The residues to be substituted may include some or all of the “Vernier” residues identified as potentially contributing to CDR structure (see, e.g., Foote and Winter, J Mol. Biol. 224: 487-99 (1992) ) , or from the more limited set of target residues identified by Baca et al. J. Biol. Chem. 272: 10678-84 (1997) .

[0159] In FR shuffling, whole FRs are combined with the non-human CDRs instead of creating combinatorial libraries of selected residue variants (see, e.g., Dall’A cqua et al., Methods 36: 4360 (2005) ) . A one-step FR shuffling process may be used. Such a process has been shown to be efficient, as the resulting antibodies exhibited improved biochemical and physicochemical properties including enhanced expression, increased affinity, and thermal stability (see, e.g., Damschroder et al., Mol. Immunol. 44: 3049-60 (2007) ) .

[0160] The “humaneering” method is based on experimental identification of essential minimum specificity determinants (MSDs) and is based on sequential replacement of non-human fragments into libraries of human FRs and assessment of binding. This methodology typically results in epitope retention and identification of antibodies from multiple subclasses with distinct human V-segment CDRs.

[0161] The “human engineering” method involves altering a non-human antibody or antibody fragment by making specific changes to the amino acid sequence of the antibody so as to produce a modified antibody with reduced immunogenicity in a human that nonetheless retains the desirable binding properties of the original non-human antibodies. Generally, the technique involves classifying amino acid residues of a non-human antibody as “low risk” “moderate risk” or “high risk” residues. The classification is performed using a global risk / reward calculation that evaluates the predicted benefits of making particular substitution (eg, for immunogenicity in humans) against the risk that the substitution will affect the resulting antibody's folding. The particular human amino acid residue to be substituted at a given position (e.g., low or moderate risk) of a non-human antibody sequence can be selected by aligning an amino acid sequence from the non-human antibody's variable regions with the corresponding region of a specific or consensus human antibody sequence. The amino acid residues at low or moderate risk positions in the non-human sequence can be substituted for the corresponding residues in the human antibody sequence according to the alignment. Techniques for making human engineered proteins are described in greater detail in Studnicka et al., Protein Engineering 7: 805-14 (1994) ; U.S. Pat. Nos, 5, 766, 886; 5, 770, 196; 5, 821, 123; and 5, 869, 619; and PCT Publication WO 93 / 11794.

[0162] A composite human antibody can be generated using, for example, Composite Human AntibodyTM technology (Antitope Ltd., Cambridge, United Kingdom) . To generate composite human antibodies, variable region sequences are designed from fragments of multiple human antibody variable region sequences in a manner that avoids T cell epitopes, thereby minimizing the immunogenicity of the resulting antibody.

[0163] A deimmunized antibody is an antibody in which T-cell epitopes have been removed. Methods for making deimmunized antibodies have been described. See, e.g., Jones et al., Methods Mol Biol. 525: 405-23 (2009) , xiv, and De Groot et al., Cell. Immunol. 244: 148-153 (2006) ) . Deimmunized antibodies comprise T-cell epitope-depleted variable regions and human constant regions. Briefly, variable regions of an antibody are cloned and T-cell epitopes are subsequently identified by testing overlapping peptides derived from the variable regions of the antibody in a T cell proliferation assay. T cell epitopes are identified via in silico methods to identify peptide binding to human MHC class II. Mutations are introduced in the variable regions to abrogate binding to human MHC class II. Mutated variable regions are then utilized to generate the deimmunized antibody.

[0164] 5.2.3 Single Domain Antibody Variants

[0165] Amino acid sequence modification (s) of the single domain antibodies that bind to BCMA described herein may be contemplated. For example, it may be desirable to optimize the binding affinity and / or other biological properties of the antibody, including but not limited to specificity, thermostability, expression level, effector functions, glycosylation, reduced immunogenicity, or solubility. Thus, in addition to the single domain antibodies that bind to BCMA described herein, it is contemplated that variants of the single domain antibodies that bind to BCMA described herein can be prepared. For example, single domain antibody variants can be prepared by introducing appropriate nucleotide changes into the encoding DNA, and / or by synthesis of the desired antibody or polypeptide. Those skilled in the art who appreciate that amino acid changes may alter post-translational processes of the single domain antibody.

[0166] Substitutions, Deletions, or Insertions

[0167] Variations may be a substitution, deletion, or insertion of one or more codons encoding the single domain antibody or polypeptide that results in a change in the amino acid sequence as compared with the original antibody or polypeptide. Sites of interest for substitutional mutagenesis include the CDRs and FRs.

[0168] Amino acid substitutions can be the result of replacing one amino acid with another amino acid having similar structural and / or chemical properties, such as the replacement of a leucine with a serine, e.g., conservative amino acid replacements. Standard techniques known to those of skill in the art can be used to introduce mutations in the nucleotide sequence encoding a molecule provided herein, including, for example, site-directed mutagenesis and PCR-mediated mutagenesis which results in amino acid substitutions. Insertions or deletions may optionally be in the range of about 1 to 5 amino acids. The substitution, deletion, or insertion may include fewer than 25 amino acid substitutions, fewer than 20 amino acid substitutions, fewer than 15 amino acid substitutions, fewer than 10 amino acid substitutions, fewer than 5 amino acid substitutions, fewer than 4 amino acid substitutions, fewer than 3 amino acid substitutions, or fewer than 2 amino acid substitutions relative to the original molecule. The substitution may be a conservative amino acid substitution made at one or more predicted non-essential amino acid residues. The variation allowed may be determined by systematically making insertions, deletions, or substitutions of amino acids in the sequence and testing the resulting variants for activity exhibited by the parental antibodies.

[0169] Amino acid sequence insertions include amino-and / or carboxyl-terminal fusions ranging in length from one residue to polypeptides containing multiple residues, as well as intrasequence insertions of single or multiple amino acid residues. Examples of terminal insertions include an antibody with an N-terminal methionyl residue.

[0170] Single domain antibodies generated by conservative amino acid substitutions are included in the present disclosure. In a conservative amino acid substitution, an amino acid residue is replaced with an amino acid residue having a side chain with a similar charge. As described above, families of amino acid residues having side chains with similar charges have been defined in the art. These families include amino acids with basic side chains (e.g., lysine, arginine, histidine) , acidic side chains (e.g., aspartic acid, glutamic acid) , uncharged polar side chains (e.g., glycine, asparagine, glutamine, serine, threonine, tyrosine, cysteine) , nonpolar side chains (e.g., alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, methionine, tryptophan) , beta-branched side chains (e.g., threonine, valine, isoleucine) and aromatic side chains (e.g., tyrosine, phenylalanine, tryptophan, histidine) . Optionally, mutations can be introduced randomly along all or part of the coding sequence, such as by saturation mutagenesis, and the resultant mutants can be screened for biological activity to identify mutants that retain activity. Following mutagenesis, the encoded protein can be expressed and the activity of the protein can be determined. Conservative (e.g., within an amino acid group with similar properties and / or side chains) substitutions may be made, so as to maintain or not significantly change the properties. Exemplary substitutions are shown in Table C below.

[0171] Table C. Amino Acid Substitutions

[0172] Amino acids may be grouped according to similarities in the properties of their side chains (see, e.g., Lehninger, Biochemistry 73-75 (2d ed. 1975) ) : (1) non-polar: Ala (A) , Val (V) , Leu (L) , Ile (I) , Pro (P) , Phe (F) , Trp (W) , Met (M) ; (2) uncharged polar: Gly (G) , Ser (S) , Thr (T) , Cys (C) , Tyr (Y) , Asn (N) , Gln (Q) ; (3) acidic: Asp (D) , Glu (E) ; and (4) basic: Lys (K) , Arg (R) , His (H) . Optionally, naturally occurring residues may be divided into groups based on common side-chain properties: (1) hydrophobic: Norleucine, Met, Ala, Val, Leu, Ile; (2) neutral hydrophilic: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; (3) acidic: Asp, Glu; (4) basic: His, Lys, Arg; (5) residues that influence chain orientation: Gly, Pro; and (6) aromatic: Trp, Tyr, Phe. For example, any cysteine residue not involved in maintaining the proper conformation of the single domain antibody also may be substituted, for example, with another amino acid, such as alanine or serine, to improve the oxidative stability of the molecule and to prevent aberrant crosslinking. Non-conservative substitutions will entail exchanging a member of one of these classes for another class.

[0173] One type of substitutional variant involves substituting one or more hypervariable region residues of a parental antibody (eg, a humanized or human antibody) . Generally, the resulting variant (s) selected for further study will have modifications (e.g., improvements) in certain biological properties (e.g., increased affinity, reduced immunogenicity) relative to the parental antibody and / or will have substantially retained certain biological properties of the parental antibody. An exemplary substitutional variant is an affinity matured antibody, which may be conveniently generated, e.g., using phage display-based affinity maturation techniques such as those described herein. Briefly, one or more CDR residues are mutated and the variant antibodies displayed on phage and screened for a particular biological activity (e.g. binding affinity) .

[0174] Alterations (e.g., substitutions) may be made in CDRs, e.g., to improve antibody affinity. Such alterations may be made in CDR “hotspots” i.e., residues encoded by codons that undergo mutation at high frequency during the somatic maturation process (see, e.g., Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207: 179-196 (2008) ) , and / or SDRs (a-CDRs) , with the resulting variant antibody or fragment thereof being tested for binding affinity. Affinity maturation by constructing and reselecting from secondary libraries has been described, e.g., in Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178: 1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001) . For affinity maturation, diversity may be introduced into the variable genes chosen for maturation by any of a variety of methods (e.g., error-prone PCR, chain shuffling, or oligonucleotide-directed mutagenesis) . A secondary library is then created. The library is then screened to identify any antibody variants with the desired affinity. Another method to introduce diversity involves CDR-directed approaches, in which several CDR residues (e.g., 4-6 residues at a time) are randomized. CDR residues involved in antigen binding may be specifically identified, e.g., using alanine scanning mutagenesis or modeling. More detailed description regarding affinity maturation is provided in the section below.

[0175] Substitutions, insertions, or deletions may occur within one or more CDRs so long as such alterations do not substantially reduce the ability of the antibody to bind antigen. For example, conservative alterations (e.g., conservative substitutions as provided herein) that do not substantially reduce binding affinity may be made in CDRs. Each CDR of the variant VHH sequences provided herein may either be unaltered, or may contain no more than one, two or three amino acid substitutions.

[0176] A useful method for identification of residues or regions of an antibody that may be targeted for mutagenesis is called “alanine scanning mutagenesis” as described by Cunningham and Wells, Science, 244: 1081-1085 (1989) . In this method, a residue or group of target residues (e.g., charged residues such as Arg, Asp, His, Lys, and Glu) are identified and replaced by a neutral or negatively charged amino acid (e.g., alanine or polyalanine) to determine whether the interaction of the antibody with antigen is affected. Further substitutions may be introduced at the amino acid locations demonstrating functional sensitivity to the initial substitutions. Alternatively, or additionally, a crystal structure of an antigen-antibody complex to identify contact points between the antibody and antigen. Such contact residues and neighboring residues may be targeted or eliminated as candidates for substitution. Variants may be screened to determine whether they contain the desired properties.

[0177] Amino acid sequence insertions include amino-and / or carboxyl-terminal fusions ranging in length from one residue to polypeptides containing a hundred or more residues, as well as intrasequence insertions of single or multiple amino acid residues. Examples of terminal insertions include an antibody with an N-terminal methionyl residue. Other insertional variants of the antibody molecule include the fusion to the N-or C-terminus of the antibody to an enzyme (e.g., for ADEPT) or a polypeptide which increases the serum half-life of the antibody.

[0178] The variations can be made using methods known in the art such as oligonucleotide-mediated (site-directed) mutagenesis, alanine scanning, and PCR mutagenesis. Site-directed mutagenesis (see, e.g., Carter, Biochem J. 237: 1-7 (1986) ; and Zoller et al., Nucl. Acids Res. 10: 6487-500 (1982) ) , cassette mutagenesis (see, eg, Wells et al., Gene 34: 315-23 (1985) ) , or other known techniques can be performed on the cloned DNA to produce the single domain antibody variant DNA.

[0179] 5.2.4 In vitro Affinity Maturation

[0180] Antibody variants having an improved property such as affinity, stability, or expression level as compared to a parental antibody may be prepared by in vitro affinity maturation. Like the natural prototype, in vitro affinity maturation is based on the principles of mutation and selection. Libraries of antibodies are displayed on the surface of an organism (eg, phage, bacteria, yeast, or mammalian cell) or in association (e.g., covalently or non-covalently) with their encoding mRNA or DNA. Affinity selection of the displayed antibodies allows isolation of organisms or complexes carrying the genetic information encoding the antibodies. Two or three rounds of mutation and selection using display methods such as phage display usually results in antibody fragments with affinities in the low nanomolar range. Affinity matured antibodies can have nanomolar or even picomolar affinities for the target antigen.

[0181] Phage display is a widespread method for display and selection of antibodies. The antibodies are displayed on the surface of Fd or M13 bacteriophages as fusions to the bacteriophage coat protein. Selection involves exposure to antigen to allow phage-displayed antibodies to bind their targets, a process referred to as “panning” . Phage bound to antigen are recovered and used to infect bacteria to produce phage for further rounds of selection. For review, see, for example, Hoogenboom, Methods. Mol. Biol. 178: 1-37 (2002) ; and Bradbury and Marks, J. Immunol. Methods 290: 29-49 (2004) .

[0182] In a yeast display system (see, e.g., Boder et al., Nat. Biotech. 15: 553-57 (1997) ; and Chao et al., Nat. Protocols 1: 755-68 (2006) ) , the antibody may be fused to the adhesion subunit of the yeast agglutinin protein Aga2p, which attaches to the yeast cell wall through disulfide bonds to Aga1p. Display of a protein via Aga2p projects the protein away from the cell surface, minimizing potential interactions with other molecules on the yeast cell wall. Magnetic separation and flow cytometry are used to screen the library to select for antibodies with improved affinity or stability. Binding to a soluble antigen of interest is determined by labeling of yeast with biotinylated antigen and a secondary reagent such as streptavidin conjugated to a fluorophore. Variations in surface expression of the antibody can be measured through immunofluorescence labeling of either the hemagglutinin or c-Myc epitope tag flanking the single chain antibody (e.g., scFv) . Expression has been shown to correlate with the stability of the displayed protein, and thus antibodies can be selected for improved stability as well as affinity (see, e.g., Shusta et al., J. Mol. Biol. 292: 949-56 (1999) ) . An additional advantage of yeast display is that displayed proteins are folded in the endoplasmic reticulum of the eukaryotic yeast cells, taking advantage of endoplasmic reticulum chaperones and quality-control machinery. Once maturation is complete, antibody affinity can be conveniently “titrated” while displayed on the surface of the yeast, eliminating the need for expression and purification of each clone. A theoretical limitation of yeast surface display is the potentially smaller functional library size than that of other display methods; however, a recent approach uses the yeast cells' mating system to create combinatorial diversity estimated to be 1014 in size (see, e.g., U.S. Pat. Publication 2003 / 0186374; and Blaise et al., Gene 342: 211-18 (2004) ) .

[0183] In ribosome display, antibody-ribosome-mRNA (ARM) complexes are generated for selection in a cell-free system. The DNA library coding for a particular library of antibodies is genetically fused to a spacer sequence lacking a stop codon. This spacer sequence, when translated, is still attached to the peptidyl tRNA and occupies the ribosomal tunnel, and thus allows the protein of interest to protrude out of the ribosome and fold. The resulting complex of mRNA, ribosome, and protein can bind to surface-bound ligand, allowing simultaneous isolation of the antibody and its encoding mRNA through affinity capture with the ligand. The ribosome-bound mRNA is then reverse transcribed back into cDNA, which can then undergo mutagenesis and be used in the next round of selection (see, e.g., Fukuda et al., Nucleic Acids Res. 34: e127 (2006) ) . In mRNA display, a covalent bond between antibody and mRNA is established using puromycin as an adaptor molecule (Wilson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 3750-55 (2001) ) .

[0184] As these methods are performed entirely in vitro, they provide two main advantages over other selection technologies. First, the diversity of the library is not limited by the transformation efficiency of bacterial cells, but only by the number of ribosomes and different mRNA molecules present in the test tube. Second, random mutations can be introduced easily after each selection round, for example, by non-proofreading polymerases, as no library must be transformed after any diversification step.

[0185] Mammalian display systems may be used.

[0186] Diversity may also be introduced into the CDRs of the antibody libraries in a targeted manner or via random introduction. The former approach includes sequentially targeting all the CDRs of an antibody via a high or low level of mutagenesis or targeting isolated hot spots of somatic hypermutations (see, e.g., Ho et al., J. Biol. Chem. 280: 607-17 (2005) ) or residues suspected of affecting affinity on experimental basis or structural reasons. Diversity may also be introduced by replacement of regions that are naturally diverse via DNA shuffling or similar techniques (see, e.g., Lu et al., J. Biol. Chem. 278: 43496-507 (2003) , U.S. Pat. Nos. 5, 565, 332 and 6, 989, 250) . Alternative techniques target hypervariable loops extending into framework-region residues (see, e.g., Bond et al., J. Mol. Biol. 348: 699-709 (2005) ) employ loop deletions and insertions in CDRs or use hybridization-based diversification (see, e.g., U.S. Pat. Publication No. 2004 / 0005709) . Additional methods of generating diversity in CDRs are disclosed, for example, in U.S. Pat. No. 7,985, 840. Further methods that can be used to generate antibody libraries and / or antibody affinity maturation are disclosed, e.g., in U.S. Patent Nos. 8, 685, 897 and 8, 603, 930, and U.S. Publ. Nos. 2014 / 0170705, 2014 / 0094392, 2012 / 0028301, 2011 / 0183855, and 2009 / 0075378, each of which are incorporated herein by reference.

[0187] Screening of the libraries can be accomplished by various techniques known in the art. For example, single domain antibodies can be immobilized onto solid supports, columns, pins, or cellulose / poly (vinylidene fluoride) membranes / other filters, expressed on host cells affixed to adsorption plates or used in cell sorting, or conjugated to biotin for capture with streptavidin-coated beads or used in any other method for panning display libraries.

[0188] For review of in vitro affinity maturation methods, see, e.g., Hoogenboom, Nature Biotechnology 23: 1105-16 (2005) ; Quiroz and Sinclair, Revista Ingeneria Biomedia 4: 39-51 (2010) , and references therein.

[0189] 5.2.5 Modifications of Single Domain Antibodies

[0190] Covalent modifications of single domain antibodies are included within the scope of the present disclosure. Covalent modifications include reacting targeted amino acid residues of a single domain antibody with an organic derivatizing agent that is capable of reacting with selected side chains or the N-or C-terminal residues of the single domain antibody. Other modifications include deamidation of glutaminyl and asparaginyl residues to the corresponding glutamyl and aspartyl residues, respectively, hydroxylation of proline and lysine, phosphorylation of hydroxyl groups of seryl or threonyl residues, methylation of the a-amino groups of lysine, arginine, and histidine side chains (see, e.g., Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties 79-86 (1983) ) , acetylation of the N-terminal amine, and amidation of any C-terminal carboxyl group.

[0191] Other types of covalent modification of the single domain antibody included within the scope of this present disclosure include altering the native glycosylation pattern of the antibody or polypeptide as described above (see, e.g., Beck et al., Curr. Pharm. Biotechnol. 9: 482-501 (2008) ; and Walsh, Drug Discov. Today 15: 773-80 (2010) ) , and linking the antibody to one of a variety of nonproteinaceous polymers, e.g., polyethylene glycol (PEG) , polypropylene glycol, or polyoxyalkylenes, in the manner set forth, for example, in U.S. Pat. Nos. 4, 640, 835; 4, 496, 689; 4,301, 144; 4, 670, 417; 4, 791, 192; or 4, 179, 337. The single domain antibody that binds to BCMA of the disclosure may also be recombinantly fused or conjugated to one or more immunoglobulin constant regions or portions thereof (e.g., Fc) to extend half-life and / or to impart known Fc-mediated effector functions.

[0192] The single chain antibody that binds to BCMA of the present disclosure may also be modified to form chimeric molecules comprising the single chain antibody that binds to BCMA fused to another, heterologous polypeptide or amino acid sequence, for example, an epitope tag (see, e.g., Terpe, Appl. Microbiol. Biotechnol. 60: 523-33 (2003) ) or the Fc region of an IgG molecule (see, e.g., Aruffo, Antibody Fusion Proteins 221-42 (Chamow and Ashkenazi eds., 1999) ) . The single chain antibody that binds to BCMA may also be used to generate BCMA binding chimeric antigen receptor (CAR) , as described in more detail below.

[0193] Also provided herein are fusion proteins comprising the single chain antibody that binds to BCMA of the disclosure and a heterologous polypeptide. The heterologous polypeptide to which the antibody is recombinantly fused or chemically conjugated may be useful for targeting the antibody to cells having cell surface expressed BCMA.

[0194] Also provided herein are panels of antibodies that bind to a BCMA antigen. The panels of antibodies may have different association rates, different dissociation rates, different affinities for a BCMA antigen, and / or different specificities for a BCMA antigen. The panels comprise or consist of about 10 to about 1000 antibodies or more. Panels of antibodies can be used, for example, in 96-well or 384-well plates, for assays such as ELISAs.

[0195] 5.2.6 Preparation of Single Domain Antibodies

[0196] Methods of preparing single domain antibodies have been described. See, e.g., Els Pardon et al, Nature Protocol, 9 (3) : 674 (2014) . Single domain antibodies (such as VHHs) may be obtained using methods known in the art such as by immunizing a Camelid species (such as camel or llama) and obtaining hybridomas therefrom, or by cloning a library of single domain antibodies using molecular biology techniques known in the art and subsequent selection by ELISA with individual clones of unselected libraries or by using phage display.

[0197] Single domain antibodies provided herein may be produced by culturing cells transformed or transfected with a vector containing a single domain antibody-encoding nucleic acid. Polynucleotide sequences encoding polypeptide components of the antibody of the present disclosure can be obtained using standard recombinant techniques. Desired polynucleotide sequences may be isolated and sequenced from antibody producing cells such as hybridomas cells or B cells. Optionally, polynucleotides can be synthesized using nucleotide synthesizer or PCR techniques. Once obtained, sequences encoding the polypeptides are inserted into a recombinant vector capable of replicating and expressing heterologous polynucleotides in host cells. Many vectors that are available and known in the art can be used for the purpose of the present disclosure. Selection of an appropriate vector will depend mainly on the size of the nucleic acids to be inserted into the vector and the particular host cell to be transformed with the vector. Host cells suitable for expressing antibodies of the present disclosure include prokaryotes such as Archaebacteria and Eubacteria, including Gram-negative or Gram-positive organisms, eukaryotic microbes such as filamentous fungi or yeast, invertebrate cells such as insect or plant cells, and vertebrate cells such as mammalian host cell lines. Host cells are transformed with the above-described expression vectors and cultured in conventional nutrient media modified as appropriate for inducing promoters, selecting transformants, or amplifying the genes encoding the desired sequences. Antibodies produced by the host cells are purified using standard protein purification methods as known in the art.

[0198] Methods for antibody production including vector construction, expression, and purification are further described in Plückthun et al. Antibody Engineering: Producing antibodies in Escherichia coli: From PCR to fermentation 203-52 (McCafferty et al. eds., 1996) ; Kwong and Rader, E. coli Expression and Purification of Fab Antibody Fragments, in Current Protocols in Protein Science (2009) ; Tachibana and Takekoshi, Production of Antibody Fab Fragments in Escherichia coli, in Antibody Expression and Production (Al-Rubeai ed., 2011) ; and Therapeutic Monoclonal Antibodies: From Bench to Clinic (An ed., 2009) .

[0199] It is, of course, contemplated those alternative methods, which are well known in the art, may be employed to prepare anti-BCMA single domain antibodies. For instance, the appropriate amino acid sequence, or portions thereof, may be produced by direct peptide synthesis using solid-phase techniques (see, e.g., Stewart et aL, Solid-Phase Peptide Synthesis (1969) ; and Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85: 2149-54 (1963) ) , In vitro protein synthesis may be performed using manual techniques or by automation. Various portions of the anti-BCMA antibody may be chemically synthesized separately and combined using chemical or enzymatic methods to produce the desired anti-BCMA antibody. Optionally, antibodies may be purified from cells or bodily fluids, such as milk, of a transgenic animal engineered to express the antibody, as disclosed, for example, in U.S. Pat Nos, 5, 545, 807 and 5, 827, 690.

[0200] Specifically, the single domain antibodies, or other BCMA binders provided herein, can be generated by immunizing llamas, performing single B-cell sorting, undertaking V-gene extraction, cloning the BCMA binders, such as VHH-Fc fusions, and then performing small scale expression and purification. Additional screening of the single domain antibodies and other molecules that bind to BCMA can be performed, including one or more of selecting for ELISA-positive, BLI-positive, and KD less than 100 nM. These selection criteria can be combined as described in Section 6 below. Additionally, individual VHH binders (and other molecules that bind to BCMA) can be assayed for their ability to bind to cells expressing BCMA. Such assay can be performed using FACS analysis with cells expressing BCMA, and measuring the mean fluorescence intensity (MFI) of fluorescently-labeled VHH molecules. Various aspects mentioned above are described in more details below.

[0201] 5.2.7 Binding Molecules Comprising the Single Domain Antibodies

[0202] In another aspect, provided herein is a binding molecule comprising a single domain antibody (e.g., a VHH domain against BCMA) provided herein. In addition to chimeric antigen receptors (CARs) provided herein as described in Section 5.3 below, a single domain antibody against BCMA provided herein is part of other binding molecules. Exemplary binding molecules of the present disclosure are described herein.

[0203] Fusion Protein

[0204] The BCMA-binding moiety (e.g., anti-BCMA single domain antibody) provided herein, can be recombinantly fused or chemically conjugated to another agent, for example, protein-based entities. The BCMA-binding moiety (e.g., anti-BCMA single domain antibody) may be chemically-conjugated to the agent, or otherwise non-covalently conjugated to the agent. The agent can be a peptide or antibody (or a fragment thereof) .

[0205] Thus, provided herein may be anti-BCMA single domain antibodies (e.g., VHH domains) or antigen-binding fragments thereof that are recombinantly fused or chemically conjugated (covalently or non-covalently conjugated) to a heterologous protein or polypeptide (or fragment thereof, for example, to a polypeptide of about 10, about 20, about 30, about 40, about 50, about 60, about 70, about 80, about 90, about 100, about 150, about 200, about 250, about 300, about 350, about 400, about 450 or about 500 amino acids, or over 500 amino acids) to generate fusion proteins, as well as uses thereof. In particular, provided herein are fusion proteins comprising an antigen-binding fragment of the single domain antibody provided herein (e.g., CDR1, CDR2, and / or CDR3) and a heterologous protein, polypeptide, or peptide.

[0206] Moreover, antibodies provided herein can be fused to marker or “tag” sequences, such as a peptide, to facilitate purification. The marker or tag amino acid sequence may be a hexa-histidine peptide, hemagglutinin ( “HA” ) tag, and “FLAG” tag.

[0207] Methods for fusing or conjugating moieties (including polypeptides) to antibodies are known (see, e.g., Arnon et al., Monoclonal Antibodies for Immunotargeting of Drugs in Cancer Therapy, in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy 243-56 (Reisfeld et al. eds., 1985) ; Hellstrom et al., Antibodies for Drug Delivery, in Controlled Drug Delivery 623-53 (Robinson et al. eds., 2d ed.1987) ; Thorpe, Antibody Carriers of Cytotoxic Agents in Cancer Therapy: A Review, in Monoclonal Antibodies: Biological and Clinical Applications 475-506 (Pinchera et al. eds., 1985) ; Analysis, Results, and Future Prospective of the Therapeutic Use of Radiolabeled Antibody in Cancer Therapy, in Monoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapy 303-16 (Baldwin et al. eds., 1985) ; Thorpe et al., Immunol. Rev. 62: 119-58 (1982) ; U.S. Pat. Nos. 5, 336, 603; 5,622, 929; 5, 359, 046; 5, 349, 053; 5, 447, 851; 5, 723, 125; 5, 783, 181; 5, 908, 626; 5, 844, 095; and 5,112, 946; EP 307, 434; EP 367, 166; EP 394, 827; PCT publications WO 91 / 06570, WO 96 / 04388, WO 96 / 22024, WO 97 / 34631, and WO 99 / 04813; Ashkenazi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:10535-39 (1991) ; Traunecker et al., Nature, 331: 84-86 (1988) ; Zheng et al., J. Immunol. 154: 5590-600 (1995) ; and Vil et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 11337-41 (1992) ) .

[0208] Fusion proteins may be generated, for example, through the techniques of gene-shuffling, motif-shuffling, exon-shuffling, and / or codon-shuffling (collectively referred to as “DNA shuffling” ) . DNA shuffling may be employed to alter the activities of the single domain antibodies or antigen-binding fragments thereof as provided herein, including, for example, antibodies with higher affinities and lower dissociation rates (see, e.g., U.S. Pat. Nos. 5, 605, 793; 5, 811, 238; 5,830, 721; 5, 834, 252; and 5, 837, 458; Patten et al., Curr. Opinion Biotechnol. 8: 724-33 (1997) ; Harayama, Trends Biotechnol. 16 (2) : 76-82 (1998) ; Hansson et al., J. Mol. Biol. 287: 265-76 (1999) ; and Lorenzo and Blasco, Biotechniques 24 (2) : 308-13 (1998) ) . Antibodies, or the encoded antibodies, may be altered by being subjected to random mutagenesis by error-prone PCR, random nucleotide insertion, or other methods prior to recombination. A polynucleotide encoding an antibody provided herein may be recombined with one or more components, motifs, sections, parts, domains, fragments, etc. of one or more heterologous molecules.

[0209] The BCMA-binding moiety, e.g., anti-BCMA single domain antibody (e.g., VHH domain) provided herein, may be conjugated to a second antibody to form an antibody heteroconjugate.

[0210] The BCMA-binding moiety (e.g., anti-BCMA single domain antibody) may be recombinantly fused to the agent. Recombinant fusion may be accomplished by placing a linker (e.g., a polypeptide) between the single domain antibody and the agent. The linker may be a flexible linker.

[0211] The BCMA-binding moiety (e.g., anti-BCMA single domain antibody) may be recombinantly conjugated to a therapeutic molecule, with a hinge region linking the single domain antibody to the therapeutic molecule.

[0212] Also provided herein are methods for making the various fusion proteins provided herein. The various methods described in Section 5.2.6 above may also be utilized to make the fusion proteins provided herein.

[0213] The fusion protein provided herein may be recombinantly expressed. Recombinant expression of a fusion protein provided herein may require construction of an expression vector containing a polynucleotide that encodes the protein or a fragment thereof. Once a polynucleotide encoding a protein provided herein or a fragment thereof has been obtained, the vector for the production of the molecule may be produced by recombinant DNA technology using techniques well-known in the art. Thus, methods for preparing a protein by expressing a polynucleotide containing an encoding nucleotide sequence are described herein. Methods which are well known to those skilled in the art can be used to construct expression vectors containing coding sequences and appropriate transcriptional and translational control signals. These methods include, for example, in vitro recombinant DNA techniques, synthetic techniques, and in vivo genetic recombination. Also provided are replicable vectors comprising a nucleotide sequence encoding a fusion protein provided herein, or a fragment thereof, or a CDR, operably linked to a promoter.

[0214] The expression vector can be transferred to a host cell by conventional techniques and the transfected cells are then cultured by conventional techniques to produce a fusion protein provided herein. Thus, also provided herein are host cells containing a polynucleotide encoding a fusion protein provided herein or fragments thereof operably linked to a heterologous promoter.

[0215] A variety of host-expression vector systems may be utilized to express the fusion protein provided herein. Such host-expression systems represent vehicles by which the coding sequences of interest may be produced and subsequently purified, but also represent cells which may, when transformed or transfected with the appropriate nucleotide coding sequences, express a fusion protein provided herein in situ. These include but are not limited to microorganisms such as bacteria (e.g., E. coli and B. subtilis) transformed with recombinant bacteriophage DNA, plasmid DNA or cosmid DNA expression vectors containing coding sequences; yeast (e.g., Saccharomyces Pichia) transformed with recombinant yeast expression vectors containing coding sequences; insect cell systems infected with recombinant virus expression vectors (e.g., baculovirus) containing coding sequences; plant cell systems infected with recombinant virus expression vectors (e.g., cauliflower mosaic virus, CaMV, tobacco mosaic virus, TMV) or transformed with recombinant plasmid expression vectors (e.g., Ti plasmid) containing coding sequences; or mammalian cell systems (e.g., COS, CHO, BHK, 293, NS0, and 3T3 cells) harboring recombinant expression constructs containing promoters derived from the genome of mammalian cells (e.g., metallothionein promoter) or from mammalian viruses (e.g., the adenovirus late promoter; the vaccinia virus 7.5K promoter) . Bacterial cells such as Escherichia coli, or, eukaryotic cells, especially for the expression of whole recombinant antibody molecule, can be used for the expression of a recombinant fusion protein. For example, mammalian cells such as Chinese hamster ovary cells (CHO) , in conjunction with a vector such as the major intermediate early gene promoter element from human cytomegalovirus is an effective expression system for antibodies or variants thereof. The expression of nucleotide sequences encoding the fusion proteins provided herein may be regulated by a constitutive promoter, inducible promoter or tissue specific promoter.

[0216] In bacterial systems, a number of expression vectors may be advantageously selected depending upon the use intended for the fusion protein being expressed. For example, when a large quantity of such a fusion protein is to be produced, for the generation of pharmaceutical compositions of a fusion protein, vectors which direct the expression of high levels of fusion protein products that are readily purified may be desirable. Such vectors include, but are not limited to, the E. coli expression vector pUR278 (Ruther et al., EMBO 12: 1791 (1983) ) , in which the coding sequence may be ligated individually into the vector in frame with the lac Z coding region so that a fusion protein is produced; pIN vectors (Inouye &Inouye, Nucleic Acids Res. 13: 3101-3109 (1985) ; Van Heeke &Schuster, J. Biol. Chem. 24: 5503-5509 (1989) ) ; and the like. pGEX vectors may also be used to express foreign polypeptides as fusion proteins with glutathione 5-transferase (GST) . In general, such fusion proteins are soluble and can easily be purified from lysed cells by adsorption and binding to matrix glutathione agarose beads followed by elution in the presence of free glutathione. The pGEX vectors are designed to include thrombin or factor Xa protease cleavage sites so that the cloned target gene product can be released from the GST moiety.

[0217] In mammalian host cells, a number of viral-based expression systems may be utilized. In cases where an adenovirus is used as an expression vector, the coding sequence of interest may be ligated to an adenovirus transcription / translation control complex, e.g., the late promoter and tripartite leader sequence. This chimeric gene may then be inserted in the adenovirus genome by in vitro or in vivo recombination. Insertion in a non-essential region of the viral genome (e.g., region El or E3) will result in a recombinant virus that is viable and capable of expressing the fusion protein in infected hosts (e.g., see Logan &Shenk, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8 1: 355-359 (1984) ) . Specific initiation signals may also be required for efficient translation of inserted coding sequences. These signals include the ATG initiation codon and adjacent sequences. Furthermore, the initiation codon must be in phase with the reading frame of the desired coding sequence to ensure translation of the entire insert. These exogenous translational control signals and initiation codons can be of a variety of origins, both natural and synthetic. The efficiency of expression may be enhanced by the inclusion of appropriate transcription enhancer elements, transcription terminators, etc. (see, e.g., Bittner et al., Methods in Enzymol. 153: 51-544 (1987) ) .

[0218] In addition, a host cell strain may be chosen which modulates the expression of the inserted sequences, or modifies and processes the gene product in the specific fashion desired. Such modifications (e.g., glycosylation) and processing (e.g., cleavage) of protein products may be important for the function of the protein. Different host cells have characteristic and specific mechanisms for the post-translational processing and modification of proteins and gene products. Appropriate cell lines or host systems can be chosen to ensure the correct modification and processing of the foreign protein expressed. To this end, eukaryotic host cells which possess the cellular machinery for proper processing of the primary transcript, glycosylation, and phosphorylation of the gene product may be used. Such mammalian host cells include but are not limited to CHO, VERY, BHK, Hela, COS, MDCK, 293, 3T3, W138, BT483, Hs578T, HTB2, BT2O and T47D, NS0 (amurine myeloma cell line that does not endogenously produce any immunoglobulin chains) , CRL7O3O and HsS78Bst cells.

[0219] For long-term, high-yield production of recombinant proteins, stable expression can be utilized. For example, cell lines which stably express the fusion proteins may be engineered. Rather than using expression vectors which contain viral origins of replication, host cells can be transformed with DNA controlled by appropriate expression control elements (e.g., promoter, enhancer, sequences, transcription terminators, polyadenylation sites, etc. ) , and a selectable marker. Following the introduction of the foreign DNA, engineered cells may be allowed to grow for 1-2 days in an enriched media, and then are switched to a selective media. The selectable marker in the recombinant plasmid confers resistance to the selection and allows cells to stably integrate the plasmid into their chromosomes and grow to form foci which in turn can be cloned and expanded into cell lines. This method may advantageously be used to engineer cell lines which express the fusion protein. Such engineered cell lines may be particularly useful in screening and evaluation of compositions that interact directly or indirectly with the binding molecule.

[0220] A number of selection systems may be used, including but not limited to, the herpes simplex virus thymidine kinase (Wigler et al., Cell 11: 223 (1977) ) , hypoxanthineguanine phosphoribosyltransferase (Szybalska &Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48: 202 (1992) ) , and adenine phosphoribosyltransferase (Lowy et al., Cell 22: 8-17 (1980) ) genes can be employed in tk-, hgprt-or aprt-cells, respectively. Also, antimetabolite resistance can be used as the basis of selection for the following genes: dhfr, which confers resistance to methotrexate (Wigler et al., Natl. Acad. Sci. USA 77: 357 (1980) ; O’ Hare et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 1527 (1981) ) ; gpt, which confers resistance to mycophenolic acid (Mulligan &Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072 (1981) ) ; neo, which confers resistance to the aminoglycoside G-418 (Wu and Wu, Biotherapy 3: 87-95 (1991) ; Tolstoshev, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32: 573-596 (1993) ; Mulligan, Science 260: 926-932 (1993) ; and Morgan and Anderson, Ann. Rev. Biochem. 62: 191-217 (1993) ; May, TIB TECH 11 (5) : l55-2 15 (1993) ) ; and hygro, which confers resistance to hygromycin (Santerre et al., Gene 30: 147 (1984) ) . Methods commonly known in the art of recombinant DNA technology may be routinely applied to select the desired recombinant clone, and such methods are described, for example, in Ausubel et al. (eds. ) , Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley &Sons, NY (1993) ; Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990) ; and in Chapters 12 and 13, Dracopoli et al. (eds. ) , Current Protocols in Human Genetics, John Wiley &Sons, NY (1994) ; Colberre-Garapin et al., J. Mol. Biol. 150: 1 (1981) , which are incorporated by reference herein in their entireties.

[0221] The expression level of a fusion protein can be increased by vector amplification (for a review, see Bebbington and Hentschel, the use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, Vol. 3 (Academic Press, New York, 1987) ) . When a marker in the vector system expressing a fusion protein is amplifiable, increase in the level of inhibitor present in culture of host cell will increase the number of copies of the marker gene. Since the amplified region is associated with the fusion protein gene, production of the fusion protein will also increase (Crouse et al., Mol. Cell. Biol. 3: 257 (1983) ) .

[0222] The host cell may be co-transfected with multiple expression vectors provided herein. The vectors may contain identical selectable markers which enable equal expression of respective encoding polypeptides. Optionally, a single vector may be used which encodes, and is capable of expressing multiple polypeptides. The coding sequences may comprise cDNA or genomic DNA.

[0223] Once a fusion protein provided herein has been produced by recombinant expression, it may be purified by any method known in the art for purification of a polypeptide (e.g., an immunoglobulin molecule) , for example, by chromatography (e.g., ion exchange, affinity, particularly by affinity for the specific antigen after Protein A, sizing column chromatography, and Kappa select affinity chromatography) , centrifugation, differential solubility, or by any other standard technique for the purification of proteins. Further, the fusion protein molecules provided herein can be fused to heterologous polypeptide sequences described herein or otherwise known in the art to facilitate purification.

[0224] Immunoconjugates

[0225] The present disclosure also provides immunoconjugates comprising any of the antibodies (such as anti-BCMA single domain antibodies) described herein conjugated to one or more agents with or without a linker, such as chemotherapeutic agents or drugs, growth inhibitory agents, toxins (e.g., protein toxins, enzymatically active toxins of bacterial, fungal, plant, or animal origin, or fragments thereof) , or radioactive isotopes.

[0226] An immunoconjugate may be an antibody-drug conjugate (ADC) in which an antibody is conjugated to one or more drugs, including but not limited to a maytansinoid (see U.S. Patent Nos. 5,208, 020, 5, 416, 064 and European Patent EP 0 425 235 B1) ; an auristatin such as monomethyl auristatin drug moieties DE and DF (MMAE and MMAF) (see U.S. Patent Nos. 5, 635, 483 and 5,780, 588, and 7, 498, 298) ; a dolastatin; a calicheamicin or derivative thereof (see U.S. Patent Nos. 5,712, 374, 5, 714, 586, 5, 739, 116, 5, 767, 285, 5, 770, 701, 5, 770, 710, 5, 773, 001, and 5, 877, 296; Hinman et al., Cancer Res. 53: 3336-3342 (1993) ; and Lode et al., Cancer Res. 58: 2925-2928 (1998) ) ; an anthracycline such as daunomycin or doxorubicin (see Kratz et al., Current Med. Chem. 13:477-523 (2006) ; Jeffrey et al., Bioorganic &Med. Chem. Letters 16: 358-362 (2006) ; Torgov et al., Bioconj. Chem. 16: 717-721 (2005) ; Nagy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 829-834 (2000) ; Dubowchik et al., Bioorg. &Med. Chem. Letters 12: 1529-1532 (2002) ; King et al., J. Med. Chem. 45: 4336-4343 (2002) ; and U.S. Patent No. 6, 630, 579) ; methotrexate; vindesine; a taxane such as docetaxel, paclitaxel, larotaxel, tesetaxel, and ortataxel; a trichothecene; and CC1065.

[0227] An immunoconjugate may comprise an antibody as described herein conjugated to an enzymatically active toxin or fragment thereof, including but not limited to diphtheria A chain, nonbinding active fragments of diphtheria toxin, exotoxin A chain (from Pseudomonas aeruginosa) , ricin A chain, abrin A chain, modeccin A chain, alpha-sarcin, Aleurites fordii proteins, dianthin proteins, Phytolaca americana proteins (PAPI, PAPII, and PAP-S) , momordica charantia inhibitor, curcin, crotin, sapaonaria officinalis inhibitor, gelonin, mitogellin, restrictocin, phenomycin, enomycin, and the tricothecenes.

[0228] An immunoconjugate may comprise an antibody as described herein conjugated to a radioactive atom to form a radioconjugate. A variety of radioactive isotopes are available for the production of radioconjugates. Examples include At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 and radioactive isotopes of Lu. When the radioconjugate is used for detection, it may comprise a radioactive atom for scintigraphic studies, for example tc99m or I123, or a spin label for nuclear magnetic resonance (NMR) imaging (also known as magnetic resonance imaging, mri) , such as iodine-123 again, iodine-131, indium-111, fluorine-19, carbon-13, nitrogen-15, oxygen-17, gadolinium, manganese or iron.

[0229] Conjugates of an antibody and cytotoxic agent may be made using a variety of bifunctional protein coupling agents such as N-succinimidyl-3- (2-pyridyldithio) propionate (SPDP) , succinimidyl-4- (N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate (SMCC) , iminothiolane (IT) , bifunctional derivatives of imidoesters (such as dimethyl adipimidate HCl) , active esters (such as disuccinimidyl suberate) , aldehydes (such as glutaraldehyde) , bis-azido compounds (such as bis (p-azidobenzoyl) hexanediamine) , bis-diazonium derivatives (such as bis- (p-diazoniumbenzoyl) -ethylenediamine) , diisocyanates (such as toluene 2, 6-diisocyanate) , and bis-active fluorine compounds (such as 1, 5-difluoro-2, 4-dinitrobenzene) . For example, a ricin immunotoxin can be prepared as described in Vitetta et al., Science 238: 1098 (1987) . Carbon-14-labeled 1-isothiocyanatobenzyl-3-methyldiethylene triaminepentaacetic acid (MX-DTPA) is an exemplary chelating agent for conjugation of radionucleotide to the antibody. See WO94 / 11026.

[0230] The linker may be a “cleavable linker” facilitating release of the conjugated agent in the cell, but non-cleavable linkers are also contemplated herein. Linkers for use in the conjugates of the present disclosure include, without limitation, acid labile linkers (e.g., hydrazone linkers) , disulfide-containing linkers, peptidase-sensitive linkers (e.g., peptide linkers comprising amino acids, for example, valine and / or citrulline such as citrulline-valine or phenylalanine-lysine) , photolabile linkers, dimethyl linkers, thioether linkers, or hydrophilic linkers designed to evade multidrug transporter-mediated resistance.

[0231] The immunuoconjugates herein contemplate, but are not limited to such conjugates prepared with cross-linker reagents including, but not limited to, BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC, and sulfo-SMPB, and SVSB (succinimidyl- (4-vinylsulfone) benzoate) which are commercially available (e.g., from Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., U.S.A) .

[0232] Antibodies provided herein may be conjugated or recombinantly fused, e.g., to a diagnostic molecule. Such diagnosis and detection can be accomplished, for example, by coupling the antibody to detectable substances including, but not limited to, various enzymes, such as, but not limited to, horseradish peroxidase, alkaline phosphatase, beta-galactosidase, or acetylcholinesterase; prosthetic groups, such as, but not limited to, streptavidin / biotin or avidin / biotin; fluorescent materials, such as, but not limited to, umbelliferone, fluorescein, fluorescein isothiocynate, rhodamine, dichlorotriazinylamine fluorescein, dansyl chloride, or phycoerythrin; luminescent materials, such as, but not limited to, luminol; bioluminescent materials, such as, but not limited to, luciferase, luciferin, or aequorin; chemiluminescent material, such as, 225Acγ-emitting, Auger-emitting, β-emitting, an alpha-emitting or positron-emitting radioactive isotope.

[0233] 5.3 Chimeric antigen receptors

[0234] In another aspect, provided herein is a chimeric antigen receptor (CAR) comprising an extracellular antigen binding domain comprising one or more BCMA-binding moieties (e.g., single domain antibodies (e.g., VHH) that bind to BCMA) provided herein. Exemplary CARs comprising the present VHH domains (i.e., VHH-based CARs) are illustrated in Section 6 below.

[0235] In some embodiments, the chimeric antigen receptor (CAR) provided herein comprises a polypeptide comprising: (a) an extracellular antigen binding domain comprising the BCMA-binding moiety (e.g., the single domain antibody (sdAb) specifically binding to BCMA) as provided herein, and optionally one or more additional binding domain (s) ; (b) a transmembrane domain; and (c) an intracellular signaling domain. Each component and additional regions are described in more detail below.

[0236] 5.3.1. Extracellular Antigen Binding Domain

[0237] The extracellular antigen binding domain of the CARs described herein comprises one or more (such as any one of 1, 2, 3, 4, 5, 6 or more) BCMA-binding moieties, such as anti-BCMA single domain antibodies (e.g., anti-BCMA VHH domain) . The BCMA-binding moieties can be fused to each other directly via peptide bonds, or via peptide linkers.

[0238] Single domain antibodies

[0239] The CARs of the present disclosure comprise an extracellular antigen binding domain comprising one or more antigen-binding moieties, such as single domain antibodies. The sdAbs may be of the same or different origins, and of the same or different sizes. Exemplary sdAbs include, but are not limited to, heavy chain variable domains from heavy-chain only antibodies (eg, VHH or VNAR) , binding molecules naturally devoid of light chains, single domains (such as VH) derived from conventional 4-chain antibodies, humanized heavy-chain only antibodies, human single domain antibodies produced by transgenic mice or rats expressing human heavy chain segments, and engineered domains and single domain scaffolds other than those derived from antibodies. Any sdAbs known in the art or developed by the present disclosure, including the single domain antibodies or antigen-binding fragments thereof described above in the present disclosure, may be used to construct the CARs described herein. The sdAbs may be derived from any species including, but not limited to mouse, rat, human, camel, llama, lamprey, fish, shark, goat, rabbit, and bovine. Single domain antibodies contemplated herein also include naturally occurring single domain antibody molecules from species other than Camelidae and sharks.

[0240] The sdAb may be derived from a naturally occurring single domain antigen binding molecule known as heavy chain antibody devoid of light chains (also referred herein as “heavy chain only antibodies” ) . Such single domain molecules are disclosed in WO 94 / 04678 and Hamers-Casterman, C.et al., Nature 363: 446-448 (1993) , for example. For clarity reasons, the variable domain derived from a heavy chain molecule naturally devoid of light chain is known herein as a VHH to distinguish it from the conventional VH of four chain immunoglobulins. Such a VHH molecule can be derived from antibodies raised in Camelidae species, for example, camel, llama, vicuna, dromedary, alpaca and guanaco. Other species besides Camelidae may produce heavy chain molecules naturally devoid of light chain, and such VHHs are within the scope of the present disclosure. In addition, humanized versions of VHHs as well as other modifications and variants are also contemplated and within the scope of the present disclosure.

[0241] VHH molecules from Camelids are about 10 times smaller than IgG molecules. They are single polypeptides and can be very stable, resisting extreme pH and temperature conditions. Moreover, they can be resistant to the action of proteases which is not the case for conventional 4-chain antibodies. Furthermore, in vitro expression of VHHs produces high yield, properly folded functional VHHs. In addition, antibodies generated in Camelids can recognize epitopes other than those recognized by antibodies generated in vitro through the use of antibody libraries or via immunization of mammals other than Camelids (see, for example, WO9749805) . Since VHHs are known to bind into “unusual” epitopes such as cavities or grooves, the affinity of CARs comprising such VHHs may be more suitable for therapeutic treatment than conventional multispecific polypeptides.

[0242] The sdAb may be derived from a variable region of the immunoglobulin found in cartilaginous fish. For example, the sdAb can be derived from the immunoglobulin isotype known as Novel Antigen Receptor (NAR) found in the serum of shark. Methods of producing single domain molecules derived from a variable region of NAR ( “lgNARs” ) are described in WO 03 / 014161 and Streltsov, Protein ScL 14: 2901-2909 (2005) .

[0243] The sdAb is recombinant, CDR-grafted, humanized, camelized, de-immunized and / or in vitro generated (e.g., selected by phage display) . The amino acid sequence of the framework regions may be altered by “camelization” of specific amino acid residues in the framework regions. Camelization refers to the replacing or substitution of one or more amino acid residues in the amino acid sequence of a (naturally occurring) VH domain from a conventional 4-chain antibody by one or more of the amino acid residues that occur at the corresponding position (s) in a VHH domain of a heavy chain antibody. This can be performed in a manner known in the field, which will be clear to the skilled person. Such “camelizing” substitutions may be inserted at amino acid positions that form and / or are present at the VH-VL interface, and / or at the so-called Camelidae hallmark residues, as defined herein (see for example WO 94 / 04678, Davies and Riechmann FEBS Letters 339: 285-290 (1994) ; Davies and Riechmann, Protein Engineering 9 (6) : 531-537 (1996) ; Riechmann, J. Mol. Biol. 259: 957-969 (1996) ; and Riechmann and Muyldermans, J. Immunol. Meth. 231: 25-38 (1999) ) .

[0244] The sdAb may be a human single domain antibody produced by transgenic mice or rats expressing human heavy chain segments. See, e.g., US20090307787. U.S. Pat. No, 8, 754, 287, US20150289489, US20100122358, and W02004049794. The sdAb may be affinity matured.

[0245] Naturally occurring VHH domains against a particular antigen or target, can be obtained from (naive or immune) libraries of Camelid VHH sequences. Such methods may or may not involve screening such a library using said antigen or target, or at least one part, fragment, antigenic determinant or epitope thereof using one or more screening techniques known in the field. Such libraries and techniques are for example described in WO 99 / 37681, WO 01 / 90190, WO 03 / 025020 and WO 03 / 035694. Optionally, improved synthetic or semi-synthetic libraries derived from (naive or immune) VHH libraries may be used, such as VHH libraries obtained from (naive or immune) VHH libraries by techniques such as random mutagenesis and / or CDR shuffling, as for example described in WO 00 / 43507.

[0246] The single domain antibodies may be generated from conventional four-chain antibodies. See, for example, EP 0368684; Ward et al., Nature, 341 (6242) : 544-6 (1989) ; Holt et al., Trends Biotechnol., 21 (11) : 484-490 (2003) ; WO 06 / 030220; and WO 06 / 003388.

[0247] The extracellular antigen-binding domain provided herein may comprise at least one antigen binding domain, and the at least one antigen binding domain comprises a BCMA-binding moieties as provided herein, such as a single domain antibody that binds to BCMA as provided herein, e.g., the BCMA-binding moieties described in Section 5.2 above.

[0248] In some embodiments, a CAR provided herein comprises a polypeptide comprising: (a) an extracellular antigen binding domain comprising a BCMA-binding moiety described in Section 5.2 above; (b) a transmembrane domain; and (c) an intracellular signaling domain. In some embodiments, the extracellular antigen binding domain comprises one BCMA-binding moiety as provided therein. In some embodiments, the extracellular antigen binding domain comprises two or more BCMA-binding moieties as provided therein.

[0249] In some embodiments, the CAR provided herein may comprise a polypeptide comprising: (a) an extracellular antigen binding domain comprising a BCMA-binding moiety; (b) a transmembrane domain; and (c) an intracellular signaling domain; wherein the BCMA-binding moiety comprises a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of the CDR1, CDR2, and CDR3, respectively, each independently as set forth in any one of SEQ ID NOs: 13-16.

[0250] In some embodiments, the CAR provided herein may comprise a polypeptide comprising: (a) an extracellular antigen binding domain comprising a BCMA-binding moiety; (b) a transmembrane domain; and (c) an intracellular signaling domain; wherein the BCMA-binding moiety comprises (1) a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of the CDR1, CDR2, and CDR3, respectively, as set forth in SEQ ID NO: 13; (2) a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of the CDR1, CDR2, and CDR3, respectively, as set forth in SEQ ID NO: 14; (3) a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of the CDR1, CDR2, and CDR3, respectively, as set forth in SEQ ID NO: 15; or (4) a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of the CDR1, CDR2, and CDR3, respectively, as set forth in SEQ ID NO: 16.

[0251] In some embodiments, the CAR provided herein may comprise a polypeptide comprising: (a) an extracellular antigen binding domain comprising a BCMA-binding moiety; (b) a transmembrane domain; and (c) an intracellular signaling domain, wherein the BCMA-binding moiety comprises (1) a CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17; a CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18, and a CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19; (2) a CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20; a CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21, and a CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22; (3) a CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 23, a CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 24; and a CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 25; or (4) a CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26; a CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 27, and a CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 28.

[0252] In some embodiments, the CAR provided herein may comprise a polypeptide comprising: (a) an extracellular antigen binding domain comprising a BCMA-binding moiety; (b) a transmembrane domain; and (c) an intracellular signaling domain, wherein the BCMA-binding moiety comprises an amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 13-16; or an amino acid sequence having a substitution, deletion and / or addition of one or several amino acids (e.g., a substitution, deletion and / or addition of 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10 amino acids) as compared thereto; or an amino acid sequence having at least 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or more sequence identity thereto.

[0253] A CAR provided herein may comprise a polypeptide comprising: (a) an extracellular antigen binding domain comprising two or more BCMA-binding moieties, which are each independently described in Section 5.2 above; (b) a transmembrane domain; and (c) an intracellular signaling domain. In some embodiments, the extracellular antigen binding domain comprises a first BCMA-binding moiety and a second BCMA-binding moiety.

[0254] In some embodiments, the CAR provided herein may comprise a polypeptide comprising: (a) an extracellular antigen binding domain comprising from N-terminal to C-terminal a first BCMA-binding moiety described in Section 5.2 above, and a second BCMA-binding moiety described in Section 5.2 above; (b) a transmembrane domain; and (c) an intracellular signaling domain. In some embodiments, the CAR provided herein may comprise a polypeptide comprising: (a) an extracellular antigen binding domain comprising from C-terminal to N-terminal a first BCMA-binding moiety described in Section 5.2 above, and a second BCMA-binding moiety described in Section 5.2 above; (b) a transmembrane domain; and (c) an intracellular signaling domain. In some embodiments, the first BCMA-binding moiety and the second BCMA-binding moiety are fused optionally via a peptide bond, or optionally via a peptide linker.

[0255] In some embodiments, the first BCMA-binding moiety and the second BCMA-binding moiety each independently may include the VHH domains in Table B and those having one, two or all three CDRs each independently as set forth in any of those VHH domains in Table B. In some embodiments of the CAR, the first BCMA-binding moiety and / or the second BCMA-binding moiety each independently may comprise a CDR1, a CDR2, and a CDR3, each independently as set forth in any one of SEQ ID NOs: 13-16.

[0256] In some embodiments of the CAR, the first BCMA-binding moiety and / or the second BCMA-binding moiety each independently may comprise a CDR1, a CDR2, and a CDR3, each independently as set forth in any one of SEQ ID NOs: 13-16.

[0257] In some embodiments, the extracellular antigen binding domain may further comprise one or more additional antigen binding domain (s) .

[0258] The additional antigen (s) targeted by the CARs of the present disclosure may be cell surface molecules, e.g., a cell surface marker on target cells associated with a special disease state. The antigen may be a tumor antigen. Tumors express a number of proteins that can serve as a target antigen for an immune response, particularly T cell mediated immune responses. The antigens targeted by the CAR may be antigens on a single diseased cell or antigens that are expressed on different cells that each contribute to the disease. The antigens targeted by the CAR may be directly or indirectly involved in the diseases.

[0259] Tumor antigens are proteins that are produced by tumor cells that can elicit an immune response, particularly T-cell mediated immune responses. The selection of the additional targeted antigen of the present disclosure will depend on the particular type of cancer to be treated. Exemplary tumor antigens include, but not limited to, a glioma-associated antigen, carcinoembryonic antigen (CEA) , β-human chorionic gonadotropin, alphafetoprotein (AFP) , GPRC5D, lectin-reactive AFP, thyroglobulin, RAGE-1, MN-CAIX, human telomerase reverse transcriptase, RUI, RU2 (AS) , intestinal carboxyl esterase, mut hsp70-2, M-CSF, prostase, prostate-specific antigen (PSA) , PAP, NY-ESO-1, LAGE-la, p53, prostein, PSMA, HER2 / neu, survivin and telomerase, prostate-carcinoma tumor antigen-1 (PCTA-1) , MAGE, ELF2M, neutrophil elastase, ephrinB2, CD22, insulin growth factor (IGF) -I, IGF-II, IGF-I receptor and mesothelin.

[0260] The tumor antigen may comprise one or more antigenic cancer epitopes associated with a malignant tumor. Malignant tumors express a number of proteins that can serve as target antigens for an immune attack. These molecules include, but are not limited to, tissue-specific antigens such as MART-1, tyrosinase and gp100 in melanoma and prostatic acid phosphatase (PAP) and prostate-specific antigen (PSA) in prostate cancer. Other target molecules belong to the group of transformation-related molecules such as the oncogene HER2 / Neu / ErbB-2. Yet another group of target antigens are onco-fetal antigens such as carcinoembryonic antigen (CEA) . In B-cell lymphoma the tumor-specific idiotype immunoglobulin constitutes a truly tumor-specific immunoglobulin antigen that is unique to the individual tumor. In addition to CD19, GPRC5D, B-cell differentiation antigens such as CD20 and CD37 are other candidates for target antigens in B-cell lymphoma.

[0261] The tumor antigen may be a tumor-specific antigen (TSA) or a tumor-associated antigen (TAA) , A TSA is unique to tumor cells and does not occur on other cells in the body. A TAA associated antigen is not unique to a tumor cell, and instead is also expressed on a normal cell under conditions that fail to induce a state of immunologic tolerance to the antigen. The expression of the antigen on the tumor may occur under conditions that enable the immune system to respond to the antigen. TAAs may be antigens that are expressed on normal cells during fetal development, when the immune system is immature, and unable to respond or they may be antigens that are normally present at extremely low levels on normal cells, but which are expressed at much higher levels on tumor cells.

[0262] Non-limiting examples of TSA or TAA antigens include: differentiation antigens such as MART-1 / Melan A (MART-I) , gp 100 (Pmel 17) , tyrosinase, TRP-1, TRP-2 and tumor-specific multilineage antigens such as MAGE-1, MAGE-3, BAGE, GAGE-1, GAGE-2, pl5; overexpressed embryonic antigens such as CEA; overexpressed oncogenes and mutated tumor-suppressor genes such as p53, Ras, HER2 / neu; unique tumor antigens resulting from chromosomal translocations; such as BCR-ABL, E2A-PRL, H4-RET, IGH-IGK, MYL-RAR; and viral antigens, such as the Epstein Barr virus antigens EBVA and the human papillomavirus (HPV) antigens E6 and E7.

[0263] In some more specific embodiments, the one or more additional antigen (s) is selected from a group consisting of CD19, CD20, CD22, CD33, CD38, CS1, ROR1, GPC3, CD123, IL-13R, CD138, c-Met, EGFRvIII, GD-2, NY-ESO-1, MAGE A3, glycolipid F77, GPRC5D and combinations thereof.

[0264] In addition to the one or more antigen binding domain (s) provided herein, the CAR provided herein may further comprise one or more of the following: a linker (e.g., a peptide linker) , a transmembrane domain, a hinge domain, a signal peptide, an intracellular signaling domain, a co-stimulatory signaling domain, each of which is described in more detail below.

[0265] 5.3.2. Transmembrane Domain

[0266] The CARs of the present disclosure comprise a transmembrane domain that can be directly or indirectly fused to the extracellular antigen binding domain. The transmembrane domain may be derived either from a natural or from a synthetic source. As used herein, a “transmembrane domain” refers to any protein structure that is thermodynamically stable in a cell membrane, for example a eukaryotic cell membrane. Transmembrane domains compatible for use in the CARs described herein may be obtained from a naturally occurring protein. Optionally, it can be a synthetic, non-naturally occurring protein segment, e.g., a hydrophobic protein segment that is thermodynamically stable in a cell membrane.

[0267] The transmembrane domain of the CAR may comprise a transmembrane domain chosen from the transmembrane domain of an alpha, beta or zeta chain of a T-cell receptor, CD28, CD3 epsilon, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154, KIRDS2, OX40, CD2, CD27, LFA-1 (CDl la, CD18) , ICOS (CD278) , 4-1BB (CD137) , GITR, CD40, BAFFR, HVEM (LIGHTR) , SLAMF7, NKp80 (KLRFl) , CD160, Claudin-6, IL-2R beta, IL-2R gamma, IL-7R a, ITGA1, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CDl ld, ITGAE, CD103, ITGAL, CDl la, LFA-1, ITGAM, CDl lb, ITGAX, CDl lc, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, TNFR2, DNAM1 (CD226) , SLAMF4 (CD244, 2B4) , CD84, CD96 (Tactile) , CEACAM1, CRT AM, Ly9 (CD229) , CD160 (BY55) , PSGL1, CDIOO (SEMA4D) , SLAMF6 (NTB-A, Lyl08) , SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3) , BLAME (SLAMF8) , SELPLG (CD162) , LTBR, PAG / Cbp, NKp44, NKp30, NKp46, NKG2D, and / or NKG2C. In some embodiments, the transmembrane domain is derived from a molecule selected from the group consisting of CD8α, CD4, CD28, CD137, CD80, CD86, CD152 and PD1. In some specific embodiments, the transmembrane domain is derived from CD8α. In some embodiments, the transmembrane domain is a transmembrane domain of CD8α comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 39, or an amino acid sequence having at least 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or more sequence identity thereto. In some specific embodiments, the transmembrane domain is derived from CD28. In some embodiments, the transmembrane domain is a transmembrane domain of CD28 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 44, or an amino acid sequence having at least 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or more sequence identity thereto.

[0268] 5.3.3. Intracellular Signaling Domain

[0269] The CARs of the present disclosure comprise an intracellular signaling domain. The intracellular signaling domain is responsible for activation of at least one of the normal effector functions of the immune effector cell expressing the CARs. Exemplary intracellular signaling sequences include those derived from CD3ζ, FcR gamma (FCER1G) , FcR beta (Fc Epsilon Rib) , CD3 gamma, CD3 delta, CD3 epsilon, CD5, CD22, CD79a, CD79b, and CD66d. In some embodiments, the primary intracellular signaling domain is derived from CD3ζ. The primary intracellular signaling domain of CD3ζ may comprise the amino acid sequence of SEQ ID NO: 41, or an amino acid sequence having at least 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or more sequence identity thereto.

[0270] 5.3.4. Co-stimulatory Signaling Domain

[0271] The intracellular signaling domain may comprise a single co-stimulatory signaling domain. The intracellular signaling domain may comprise two or more (such as about any of 2, 3, 4, or more) co-stimulatory signaling domains. The intracellular signaling domain may comprise two or more of the same co-stimulatory signaling domains. The intracellular signaling domain may comprise two or more co-stimulatory signaling domains from different co-stimulatory proteins, such as any two or more co-stimulatory proteins described herein. The intracellular signaling domain comprises a primary intracellular signaling domain (such as cytoplasmic signaling domain of CD3ζ) and one or more co-stimulatory signaling domains. The one or more co-stimulatory signaling domains and the primary intracellular signaling domain (such as cytoplasmic signaling domain of CD3ζ) may be fused to each other via optional peptide linkers. The primary intracellular signaling domain, and the one or more co-stimulatory signaling domains may be arranged in any suitable order. The one or more co-stimulatory signaling domains may be located between the transmembrane domain and the primary intracellular signaling domain (such as cytoplasmic signaling domain of CD3ζ) . Multiple co-stimulatory signaling domains may provide additive or synergistic stimulatory effects.

[0272] The one or more co-stimulatory signaling domains may be selected from the group consisting of CD27, CD28, CD137 (4-1BB) , OX40, CD30, CD40, CD3, lymphocyte function-associated antigen-1 (LFA-1) , CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, ligands that specially bind to CD83, and combinations thereof.

[0273] The intracellular signaling domain in the CAR of the present disclosure may comprise a co-stimulatory signaling domain derived from 4-1BB (i.e., CD137) . The intracellular signaling domain may comprise a cytoplasmic signaling domain of CD3ζ and a co-stimulatory signaling domain of 4-1BB. The intracellular signaling domain may comprise a co-stimulatory signaling domain of 4-1BB comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 40, or an amino acid sequence having at least 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or more sequence identity thereto. The intracellular signaling domain in the CAR of the present disclosure may comprise a co-stimulatory signaling domain derived from CD28. The intracellular signaling domain may comprise a cytoplasmic signaling domain of CD3ζ and a co-stimulatory signaling domain of CD28. The intracellular signaling domain may comprise a co-stimulatory signaling domain of CD28 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 42, or an amino acid sequence having at least 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or more sequence identity thereto.

[0274] The co-stimulatory signaling domains may comprise up to 10 amino acid residue variations (e.g., 1, 2, 3, 4, 5, or 8) as compared to a wild-type counterpart. Such co-stimulatory signaling domains comprising one or more amino acid variations may be referred to as variants. Mutation of amino acid residues of the co-stimulatory signaling domain may result in an increase in signaling transduction and enhanced stimulation of immune responses relative to co-stimulatory signaling domains that do not comprise the mutation. Mutation of amino acid residues of the co-stimulatory signaling domain may result in a decrease in signaling transduction and reduced stimulation of immune responses relative to co-stimulatory signaling domains that do not comprise the mutation.

[0275] 5.3.5. Hinge Domain

[0276] The CARs of the present disclosure may comprise a hinge domain that is located between the extracellular antigen binding domain and the transmembrane domain. A hinge domain is an amino acid segment that is generally found between two domains of a protein and may allow for flexibility of the protein and movement of one or both of the domains relative to one another. Any amino acid sequence that provides such flexibility and movement of the extracellular antigen binding domain relative to the transmembrane domain of the effector molecule can be used.

[0277] In some embodiments, the hinge domain is derived from a molecule selected from a group consisting of CD8α, CD28 and IgG4. In some embodiments, the hinge domain is derived from CD8α. The hinge domain may be a portion of the hinge domain of CD8α, e.g., a fragment containing at least 15 (e.g., 20, 25, 30, 35, or 40) consecutive amino acids of the hinge domain of CD8α. In some embodiments, the hinge domain of CD8α comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 38, or an amino acid sequence having at least 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or more sequence identity thereto. In some embodiments, the hinge domain is derived from CD28. The hinge domain may be a portion of the hinge domain of CD28, e.g., a fragment containing at least 15 (e.g., 20, 25, 30, 35, or 40) consecutive amino acids of the hinge domain of CD28. In some embodiments, the hinge domain of CD28 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 43, or an amino acid sequence having at least 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or more sequence identity thereto.

[0278] 5.3.6. Signal Peptide

[0279] The CARs of the present disclosure may comprise a signal peptide (also known as a signal sequence) at the N-terminus of the polypeptide. The signal peptide may be derived from a molecule selected from the group consisting of CD8α, GM-CSF receptor α, and IgG1 heavy chain. In some embodiments, the signal peptide is derived from CD8α. In some embodiments, the signal peptide of CD8α comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 37, or an amino acid sequence having at least 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or more sequence identity thereto.

[0280] 5.3.7. Exemplary CARs

[0281] In some embodiments, the CAR provided herein may comprise or consist of an amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 9-12; or an amino acid sequence having at least 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or more sequence identity thereto. In some embodiments, the CAR provided herein further comprises a single peptide, and may comprise or consist of an amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 1-4; or an amino acid sequence having at least 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or more sequence identity thereto.

[0282] In some embodiments, provided herein is a nucleic acid encoding any of the BCMA CARs provided herein. In some embodiments, the BCMA CAR is expressed by introducing a nucleic acid encoding it into a cell in vivo (e.g., in vivo cell therapy) or in vitro (e.g., autologous cell therapy and allogeneic cell therapy) . In some embodiments, the cell is an immune cell. More detailed description regarding nucleic acid sequences and vectors are provided below.

[0283] 5.4. Toll-like receptor (TLR) co-stimulatory molecules (e.g., TLR polypeptides)

[0284] In another aspect, provided herein is a Toll-like receptor (TLR) co-stimulatory molecule comprising a first polypeptide and a second polypeptide, wherein the first polypeptide and the second polypeptide each encode a TLR polypeptide comprising a TLR signaling domain. In some embodiments, upon binding of the TLR polypeptides to their correspond target, the TLR signaling domains of the first and second polypeptide associate with each other to form a TLR signaling moiety, wherein the TLR signaling moiety induces TLR signaling, resulting in strong anti-tumor effects. The first polypeptide and the second polypeptide may be identical or different.

[0285] In some embodiments, the first TLR polypeptide comprises: i) a first target binding domain (e.g., an antibody moiety or fragment thereof) , ii) a first TLR transmembrane domain, and iii) a first TLR signaling domain; and the second TLR polypeptide comprises: i) a second target binding domain (e.g., an antibody moiety or fragment thereof) , ii) a second TLR transmembrane domain, and iii) a second TLR signaling domain. Upon binding of the first target binding domain and second target binding domain to their corresponding targets, the first TLR signaling domain and the second TLR signaling domain associate with each other to form a TLR signaling moiety capable of inducing TLR signaling. In some embodiments, the TLR co-stimulatory molecule may further comprise a TLR hinge that is located between the first target binding domain (e.g., an antibody moiety or fragment thereof) and the first TLR transmembrane domain. In some embodiments, the TLR co-stimulatory molecule may further comprise a TLR hinge that is located between the second target binding domain (e.g., an antibody moiety or fragment thereof and the second TLR transmembrane domain.

[0286] In some embodiments, the TLR polypeptides induce an increased tumor cell killing efficacy by the engineering immune cell compared to engineering immune cells not comprising said TLR polypeptides. In some embodiments, the TLR polypeptides induce increased tumor cell killing efficacy, such as increased by at least about any one of 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 12 fold, 14 fold, 16 fold, 20 fold, 25 fold, 30 fold, 40 fold or more, compared to an engineering immune cell not comprising said TLR polypeptides. In some embodiments, the TLR polypeptides confer long lasting efficacy for the engineering immune cell, e.g., such as increased by at least about any one of 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 2 fold, 5 fold, 10 fold, 20 fold, 50 fold, 100 fold, 200 fold, 500 fold, 1000 fold or more, compared to a engineering immune cell not comprising said TLR polypeptides. In some embodiments, the engineering immune cell has reduced toxicity in vivo when administered to an individual compared to an engineering immune cell that does comprise a TLR polypeptide. In some embodiments, the engineering immune cell decrease exhaustion in vivo when administered to an individual compared to an engineering immune cell that compared to an engineering immune cell that does comprise a TLR polypeptide. In some embodiments, the TLR polypeptide is a co-stimulatory molecule.

[0287] In some embodiments, the Toll-like receptor (TLR) co-stimulatory molecule comprising a) a first polypeptide comprising: i) a first target binding domain, ii) a first TLR transmembrane domain, and iii) a first TLR signaling domain; and b) a second polypeptide comprising: i) a second target binding domain, ii) a second TLR transmembrane domain, and iii) a second TLR signaling domain, wherein upon binding of the first target binding domain and second target binding domain to their corresponding target, the first TLR signaling domain and the second TLR signaling domain associate with each other to form a TLR signaling moiety capable of inducing TLR signaling. In some embodiments, the first TLR transmembrane domain and the first TLR signaling domain are derived from the same TLR molecule. In some embodiments, the first TLR transmembrane domain and the first TLR signaling domain are derived from different TLR molecules. In some embodiments, the second TLR transmembrane domain and the second TLR signaling domain are derived from the same TLR molecule. In some embodiments, the second TLR transmembrane domain and the second TLR signaling domain are derived from different TLR molecules. In some embodiments, the first TLR transmembrane domain and the second TLR transmembrane domain are the same. In some embodiments, the first TLR transmembrane domain and the second TLR transmembrane domain are different. In some embodiments, the first TLR signaling domain and the second TLR signaling domain are different. In some embodiments, the first TLR signaling domain and the second TLR signaling domain are the same. In some embodiments, the TLR molecule (s) is selected from the group consisting of TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, and TLR9, such as TLR1, TLR2, TLR4 or TLR6.

[0288] In some embodiments, the Toll-like receptor (TLR) co-stimulatory molecule comprising: a) a first polypeptide comprising: i) a first target binding domain, ii) a first TLR transmembrane domain, and iii) a first TLR signaling domain; and b) a second polypeptide comprising: i) a second target binding domain, ii) a second TLR transmembrane domain, and iii) a second TLR signaling domain, wherein upon binding of the first target binding domain and second target binding domain to their corresponding target, the first TLR signaling domain and the second TLR signaling domain associate with each other to form a TLR signaling moiety capable of inducing TLR signaling, and wherein the first TLR transmembrane domain, the first TLR signaling domain, the second TLR transmembrane domain, and the second TLR signaling domain are derived from TLR4.

[0289] In some embodiments, the Toll-like receptor (TLR) co-stimulatory molecule comprising a) a first polypeptide comprising: i) a first target binding domain, ii) a first TLR transmembrane domain, and iii) a first TLR signaling domain; and b) a second polypeptide comprising: i) a second target binding domain, ii) a second TLR transmembrane domain, and iii) a second TLR signaling domain, wherein upon binding of the first target binding domain and second target binding domain to their corresponding target, the first TLR signaling domain and the second TLR signaling domain associate with each other to form a TLR signaling moiety capable of inducing TLR signaling; wherein the first TLR transmembrane domain and the first TLR signaling domain are derived from TLR2, and wherein the second TLR transmembrane domain and the second TLR signaling domain are derived from TLR1, or wherein the first TLR transmembrane domain and the first TLR signaling domain are derived from TLR1, and wherein the second TLR transmembrane domain and the second TLR signaling domain are derived from TLR2.

[0290] In some embodiments, the Toll-like receptor (TLR) co-stimulatory molecule comprising a) a first polypeptide comprising: i) a first target binding domain, ii) a first TLR transmembrane domain, and iii) a first TLR signaling domain; and b) a second polypeptide comprising: i) a second target binding domain, ii) a second TLR transmembrane domain, and iii) a second TLR signaling domain, wherein upon binding of the first target binding domain and second target binding domain to their corresponding target, the first TLR signaling domain and the second TLR signaling domain associate with each other to form a TLR signaling moiety capable of inducing TLR signaling; wherein the first TLR transmembrane domain and the first TLR signaling domain are derived from TLR6, and wherein the second TLR transmembrane domain and the second TLR signaling domain are derived from TLR2, or wherein the first TLR transmembrane domain and the first TLR signaling domain are derived from TLR2, and wherein the second TLR transmembrane domain and the second TLR signaling domain are derived from TLR6.

[0291] In some embodiments, the Toll-like receptor (TLR) co-stimulatory molecule comprising a) a first polypeptide comprising: i) a first target binding domain, ii) a first TLR transmembrane domain, and iii) a first TLR signaling domain; and b) a second polypeptide comprising: i) a second target binding domain, ii) a second TLR transmembrane domain, and iii) a second TLR signaling domain, wherein upon binding of the first target binding domain and second target binding domain to their corresponding target, the first TLR signaling domain and the second TLR signaling domain associate with each other to form a TLR signaling moiety capable of inducing TLR signaling; and wherein the first target binding domain and / or the second target binding domain is an antibody moiety or antigen-binding fragment thereof. In some embodiments, the first target binding domain and the second target binding domain are antibody moieties or antigen-binding fragment thereof. In some embodiments, the first target binding domain and / or second target binding domain is a scFv or sdAb. In some embodiments, the first target binding domain and / or second target binding domain specifically binds to CD33, CLL1, CD123, CD19, CD20, CD22, BCMA, GPRC5D, NKG2D, or GPC3. In some embodiments, the first target binding domain and the second target binding domain are the same. In some embodiments, the first target binding domain and the second target binding domain are different. In some embodiments, the first target binding domain and second target binding domain specifically binds to BCMA. In some embodiments, the first target binding domain and the second target binding domain are each an sdAb that specifically binds to BCMA.

[0292] In some embodiments, the Toll-like receptor (TLR) co-stimulatory molecule comprising a) a first polypeptide comprising: i) a first target binding domain, ii) a first TLR transmembrane domain, and iii) a first TLR signaling domain; and b) a second polypeptide comprising: i) a second target binding domain, ii) a second TLR transmembrane domain, and iii) a second TLR signaling domain, wherein the first target binding domain and the second binding domain bind to the same target molecule, wherein the first polypeptide comprises from the N-terminus to the C-terminus: a signal peptide, an anti-BCMA sdAb, a TLR4 hinge, a TLR4 transmembrane domain, and a TLR4 signaling domain (e.g., the cytoplasmic portion of TLR4) , and the second polypeptide comprises from the N-terminus to the C-terminus: a signal peptide, an anti-BCMA sdAb, a TLR4 hinge, a TLR4 transmembrane domain, and a TLR4 signaling domain (e.g., the cytoplasmic portion of TLR4) , and wherein upon binding of the first target binding domain and second target binding domain to their corresponding target, the first TLR4 signaling domain and the second TLR4 signaling domain associate with each other to form a TLR signaling moiety capable of inducing TLR signaling.

[0293] In some embodiments, the Toll-like receptor (TLR) co-stimulatory molecule comprising a) a first polypeptide comprising: i) a first target binding domain, ii) a first TLR transmembrane domain, and iii) a first TLR signaling domain; and b) a second polypeptide comprising: i) a second target binding domain, ii) a second TLR transmembrane domain, and iii) a second TLR signaling domain, wherein the first target binding domain and the second target binding domain each binds to a different non-overlapping target site on a single target molecule, wherein the first polypeptide comprises from the N-terminus to the C-terminus: a signal peptide, an anti-BCMA sdAb, a TLR4 hinge, a TLR4 transmembrane domain, and a TLR4 signaling domain (e.g., the cytoplasmic portion of TLR4) , and the second polypeptide comprises from the N-terminus to the C-terminus: a signal peptide, an anti-BCMA sdAb, a TLR4 hinge, a TLR4 transmembrane domain, and a TLR4 signaling domain (e.g., the cytoplasmic portion of TLR4) , and wherein upon binding of the first target binding domain and second target binding domain to their corresponding target, the first TLR4 signaling domain and the second TLR4 signaling domain associate with each other to form a TLR signaling moiety capable of inducing TLR signaling.

[0294] 5.5. Engineered Immune Cells

[0295] In another aspect, provided herein are immune cells comprising any one of the CARs as described herein. The immune cells may be immune effector cells.

[0296] Thus, an engineered immune cell (such as T cell or NK cell) provided herein may comprise a CAR which comprises a polypeptide comprising: (a) an extracellular antigen binding domain comprising one or more BCMA-binding moieties; (b) a transmembrane domain; and (c) an intracellular signaling domain, wherein one or more BCMA-binding moieties are each independently the BCMA-binding moieties as described in Section 5.2 above, including, e.g., the VHH domains in Table B and those having one, two or all three CDRs each independently as set forth in any of those VHH domains in Table B. The BCMA-binding moiety may be an anti-BCMA sdAb. The anti-BCMA sdAb may be camelid, chimeric, human, or humanized. The transmembrane domain may be selected from the group consisting of CD8α, CD4, CD28, CD137, CD80, CD86, CD152 and PD-1. The intracellular signaling domain may comprise a primary intracellular signaling domain of an immune cell (such as T cell or NK cell) . The primary intracellular signaling domain may be derived from CD3ζ. The intracellular signaling domain may comprise a co-stimulatory signaling domain. The co-stimulatory signaling domain may be derived from a co-stimulatory molecule selected from the group consisting of CD27, CD28, CD137, 0X40, CD30, CD40, CD3, LFA-1, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, ligands of CD83 and combinations thereof. The CAR may further comprise a hinge domain (such as a CD8α hinge domain) located between the C-terminus of the extracellular antigen binding domain and the N-terminus of the transmembrane domain. The CAR may further comprise a signal peptide (such as a CD8α signal peptide) located at the N-terminus of the polypeptide. The polypeptide may comprise from the N-terminus to the C-terminus: a CD8α signal peptide, the extracellular antigen binding domain, a CD8α hinge domain, a CD8α transmembrane domain, a co-stimulatory signaling domain derived from 4-1BB, and a primary intracellular signaling domain derived from CD3ζ.

[0297] An engineered immune cell (such as T cell or NK cell) provided herein may comprise a CAR which comprises a polypeptide comprising: (a) an extracellular antigen binding domain comprising a BCMA-binding moiety; (b) a transmembrane domain; and (c) an intracellular signaling domain; wherein the BCMA-binding moiety comprises a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of the CDR1, CDR2, and CDR3, respectively, each independently as set forth in any one of SEQ ID NOs: 13-16.

[0298] An engineered immune cell (such as T cell or NK cell) provided herein may comprise a CAR which comprises a polypeptide comprising: (a) an extracellular antigen binding domain comprising a BCMA-binding moiety; (b) a transmembrane domain; and (c) an intracellular signaling domain, wherein the BCMA-binding moiety comprises: (1) a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of the CDR1, CDR2, and CDR3, respectively, as set forth in SEQ ID NO: 13; (2) a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of the CDR1, CDR2, and CDR3, respectively, as set forth in SEQ ID NO: 14; (3) a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of the CDR1, CDR2, and CDR3, respectively, as set forth in SEQ ID NO: 15; or (4) a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of the CDR1, CDR2, and CDR3, respectively, as set forth in SEQ ID NO: 16.

[0299] An engineered immune cell (such as T cell or NK cell) provided herein may comprise a CAR which comprises a polypeptide comprising: (a) an extracellular antigen binding domain comprising a BCMA-binding moiety; (b) a transmembrane domain; and (c) an intracellular signaling domain, wherein the BCMA-binding moiety comprises (1) a CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17; a CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:18, and a CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19; (2) a CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20; a CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21, and a CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22;(3) a CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 23, a CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 24; and a CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 25; or (4) a CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26; a CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 27, and a CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 28.

[0300] An engineered immune cell (such as T cell or NK cell) provided herein may comprise a CAR which comprises a polypeptide comprising: (a) an extracellular antigen binding domain comprising a BCMA-binding moiety; (b) a transmembrane domain; and (c) an intracellular signaling domain, wherein the BCMA-binding moiety comprises or consist of an amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 13-16; or an amino acid sequence having a substitution, deletion and / or addition of one or several amino acids (e.g., a substitution, deletion and / or addition of 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10 amino acids) as compared thereto; or an amino acid sequence having at least 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or more sequence identity thereto.

[0301] In some embodiments, the engineered immune cell (such as T cell or NK cell) provided herein may comprise, from the N-terminus to the C-terminus: a signal peptide, an anti-BCMA sdAb, a CD8α hinge domain, a CD8α transmembrane (TM) domain, the cytoplasmic portion of the 4-1BB (CD137) co-stimulatory signaling domain, and a CD3ζ primary intracellular signaling domain.

[0302] In some embodiments, the engineered immune cell (such as T cell or NK cell) provided herein may comprise a CAR comprising an amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 9-12; or an amino acid sequence having at least 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or more sequence identity thereto. In some embodiments, the engineered immune cell (such as T cell or NK cell) provided herein may comprise a CAR which further comprises a single peptide, and may comprise an amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 1-4; or an amino acid sequence having at least 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or more sequence identity thereto.

[0303] An engineered immune cell (such as T cell or NK cell) provided herein may comprise a CAR which comprises a polypeptide comprising: (a) an extracellular antigen binding domain comprising two or more BCMA-binding moieties, which are each independently the BCMA-binding moiety as described in Section 5.2 above; (b) a transmembrane domain; and (c) an intracellular signaling domain. In some embodiments, the extracellular antigen binding domain comprises a first BCMA-binding moiety and a second BCMA-binding moiety.

[0304] In some embodiments, the engineered immune cell (such as T cell or NK cell) provided herein may comprise a CAR which comprises: (a) an extracellular antigen binding domain comprising from N-terminal to C-terminal a first BCMA-binding moiety as described in Section 5.2 above, and a second BCMA-binding moiety as described in Section 5.2 above; (b) a transmembrane domain; and (c) an intracellular signaling domain. In some embodiments, the engineered immune cell (such as T cell or NK cell) provided herein may comprise a CAR which comprises: (a) an extracellular antigen binding domain comprising from C-terminal to N-terminal a first BCMA-binding moiety as described in Section 5.2 above, and a second BCMA-binding moiety as described in Section 5.2 above; (b) a transmembrane domain; and (c) an intracellular signaling domain. In some embodiments, the first BCMA-binding moiety and the second BCMA-binding moiety are fused optionally via a peptide bond, or optionally via a peptide linker.

[0305] In some embodiments of the engineered immune cell, wherein the first BCMA-binding moiety and / or the second BCMA-binding moiety in the CAR each independently include the VHH domains in Table B and those having one, two or all three CDRs each independently as set forth in any of those VHH domains in Table B. In some embodiments of the engineered immune cell, wherein the first BCMA-binding moiety and / or the second BCMA-binding moiety in the CAR each independently comprise a CDR1, a CDR2, and a CDR3, each independently as set forth in any one of SEQ ID NOs: 13-16.

[0306] In some embodiments of the engineered immune cell, wherein the extracellular antigen binding domain of the CAR may further comprise one or more additional antigen binding domain (s) . The one or more additional antigen binding domain (s) may bind to one or more antigen (s) selected from a group consisting of CD 19, CD20, CD22, CD33, CD38, CS1, ROR1, GPC3, CD123, IL-13R, CD138, c-Met, EGFRvIII, GD-2, NY-ESO-1, MAGE A3, glycolipid F77, GPRC5D and combinations thereof.

[0307] In another aspect, provided herein are immune cells comprising a Toll-like receptor (TLR) co-stimulatory molecule as described herein. The immune cells may be immune effector cells.

[0308] Thus, an engineered immune cell (such as T cell or NK cell) provided herein may comprise a Toll-like receptor (TLR) co-stimulatory molecule which comprising a first polypeptide and a second polypeptide, wherein the first polypeptide and the second polypeptide each encode a TLR polypeptide comprising a TLR signaling domain. In some embodiments, upon binding of the TLR polypeptides to their correspond target, the TLR signaling domains of the first and second polypeptide associate with each other to form a TLR signaling moiety, wherein the TLR signaling moiety induces TLR signaling, resulting in strong anti-tumor effects. The first polypeptide and the second polypeptide may be identical or different.

[0309] In some embodiments, the engineered immune cell (such as T cell or NK cell) provided herein may comprise a Toll-like receptor (TLR) co-stimulatory molecule which comprising a first TLR polypeptide comprises: i) a first target binding domain (e.g., an antibody moiety or fragment thereof) , ii) a first TLR transmembrane domain, and iii) a first TLR signaling domain; and a second TLR polypeptide comprises: i) a second target binding domain (e.g., an antibody moiety or fragment thereof) , ii) a second TLR transmembrane domain, and iii) a second TLR signaling domain. Upon binding of the first target binding domain and second target binding domain to their corresponding targets, the first TLR signaling domain and the second TLR signaling domain associate with each other to form a TLR signaling moiety capable of inducing TLR signaling. In some embodiment, the TLR co-stimulatory molecule may further comprise a TLR hinge that is located between the first target binding domain (e.g., an antibody moiety or fragment thereof) and the first TLR transmembrane domain. In some embodiment, the TLR co-stimulatory molecule may further comprise a TLR hinge that is located between the second target binding domain (e.g., an antibody moiety or fragment thereof and the second TLR transmembrane domain.

[0310] In some embodiments, the engineered immune cell (such as T cell or NK cell) provided herein may comprise a Toll-like receptor (TLR) co-stimulatory molecule which comprising a) a first polypeptide comprising: i) a first target binding domain, ii) a first TLR transmembrane domain, and iii) a first TLR signaling domain; and b) a second polypeptide comprising: i) a second target binding domain, ii) a second TLR transmembrane domain, and iii) a second TLR signaling domain, wherein upon binding of the first target binding domain and second target binding domain to their corresponding target, the first TLR signaling domain and the second TLR signaling domain associate with each other to form a TLR signaling moiety capable of inducing TLR signaling. In some embodiments, the first TLR transmembrane domain and the first TLR signaling domain are derived from the same TLR molecule. In some embodiments, the first TLR transmembrane domain and the first TLR signaling domain are derived from different TLR molecules. In some embodiments, the second TLR transmembrane domain and the second TLR signaling domain are derived from the same TLR molecule. In some embodiments, the second TLR transmembrane domain and the second TLR signaling domain are derived from different TLR molecules. In some embodiments, the first TLR transmembrane domain and the second TLR transmembrane domain are the same. In some embodiments, the first TLR transmembrane domain and the second TLR transmembrane domain are different. In some embodiments, the first TLR signaling domain and the second TLR signaling domain are different. In some embodiments, the first TLR signaling domain and the second TLR signaling domain are the same. In some embodiments, the TLR molecule (s) is selected from the group consisting of TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, and TLR9, such as TLR1, TLR2, TLR4 or TLR6.

[0311] In some embodiments, the engineered immune cell (such as T cell or NK cell) provided herein may comprise a Toll-like receptor (TLR) co-stimulatory molecule which comprising: a) a first polypeptide comprising: i) a first target binding domain, ii) a first TLR transmembrane domain, and iii) a first TLR signaling domain; and b) a second polypeptide comprising: i) a second target binding domain, ii) a second TLR transmembrane domain, and iii) a second TLR signaling domain, wherein upon binding of the first target binding domain and second target binding domain to their corresponding target, the first TLR signaling domain and the second TLR signaling domain associate with each other to form a TLR signaling moiety capable of inducing TLR signaling, and wherein the first TLR transmembrane domain, the first TLR signaling domain, the second TLR transmembrane domain, and the second TLR signaling domain are derived from TLR4.

[0312] In some embodiments, the engineered immune cell (such as T cell or NK cell) provided herein may comprise a Toll-like receptor (TLR) co-stimulatory molecule which comprising a) a first polypeptide comprising: i) a first target binding domain, ii) a first TLR transmembrane domain, and iii) a first TLR signaling domain; and b) a second polypeptide comprising: i) a second target binding domain, ii) a second TLR transmembrane domain, and iii) a second TLR signaling domain, wherein upon binding of the first target binding domain and second target binding domain to their corresponding target, the first TLR signaling domain and the second TLR signaling domain associate with each other to form a TLR signaling moiety capable of inducing TLR signaling; wherein the first TLR transmembrane domain and the first TLR signaling domain are derived from TLR2, and wherein the second TLR transmembrane domain and the second TLR signaling domain are derived from TLR1, or wherein the first TLR transmembrane domain and the first TLR signaling domain are derived from TLR1, and wherein the second TLR transmembrane domain and the second TLR signaling domain are derived from TLR2.

[0313] In some embodiments, the engineered immune cell (such as T cell or NK cell) provided herein may comprise a Toll-like receptor (TLR) co-stimulatory molecule which comprising a) a first polypeptide comprising: i) a first target binding domain, ii) a first TLR transmembrane domain, and iii) a first TLR signaling domain; and b) a second polypeptide comprising: i) a second target binding domain, ii) a second TLR transmembrane domain, and iii) a second TLR signaling domain, wherein upon binding of the first target binding domain and second target binding domain to their corresponding target, the first TLR signaling domain and the second TLR signaling domain associate with each other to form a TLR signaling moiety capable of inducing TLR signaling; wherein the first TLR transmembrane domain and the first TLR signaling domain are derived from TLR6, and wherein the second TLR transmembrane domain and the second TLR signaling domain are derived from TLR2, or wherein the first TLR transmembrane domain and the first TLR signaling domain are derived from TLR2, and wherein the second TLR transmembrane domain and the second TLR signaling domain are derived from TLR6.

[0314] In some embodiments, the engineered immune cell (such as T cell or NK cell) provided herein may comprise a Toll-like receptor (TLR) co-stimulatory molecule which comprising a) a first polypeptide comprising: i) a first target binding domain, ii) a first TLR transmembrane domain, and iii) a first TLR signaling domain; and b) a second polypeptide comprising: i) a second target binding domain, ii) a second TLR transmembrane domain, and iii) a second TLR signaling domain, wherein upon binding of the first target binding domain and second target binding domain to their corresponding target, the first TLR signaling domain and the second TLR signaling domain associate with each other to form a TLR signaling moiety capable of inducing TLR signaling; and wherein the first target binding domain and / or the second target binding domain is an antibody moiety or antigen-binding fragment thereof. In some embodiments, the first target binding domain and the second target binding domain are antibody moieties or antigen-binding fragment thereof. In some embodiments, the first target binding domain and / or second target binding domain is a scFv or sdAb. In some embodiments, the first target binding domain and / or second target binding domain specifically binds to CD33, CLL1, CD123, CD19, CD20, CD22, BCMA, GPRC5D, NKG2D, or GPC3. In some embodiments, the first target binding domain and the second target binding domain are the same. In some embodiments, the first target binding domain and the second target binding domain are different. In some embodiments, the first target binding domain and the second target binding domain specifically binds to BCMA. In some embodiments, the first target binding domain and the second target binding domain are each a sdAb that specifically binds to BCMA.

[0315] In some embodiments, the engineered immune cell (such as T cell or NK cell) provided herein may comprise a Toll-like receptor (TLR) co-stimulatory molecule which comprising a) a first polypeptide comprising: i) a first target binding domain, ii) a first TLR transmembrane domain, and iii) a first TLR signaling domain; and b) a second polypeptide comprising: i) a second target binding domain, ii) a second TLR transmembrane domain, and iii) a second TLR signaling domain, wherein the first target binding domain and the second binding domain bind to the same target molecule, wherein the first polypeptide comprises from the N-terminus to the C-terminus: a signal peptide, an anti-BCMA sdAb, a TLR4 hinge, a TLR4 transmembrane domain, and a TLR4 signaling domain (e.g., the cytoplasmic portion of TLR4) , and the second polypeptide comprises from the N-terminus to the C-terminus: a signal peptide, an anti-BCMA sdAb, a TLR4 hinge, a TLR4 transmembrane domain, and a TLR4 signaling domain (e.g., the cytoplasmic portion of TLR4) , and wherein upon binding of the first target binding domain and second target binding domain to their corresponding target, the first TLR4 signaling domain and the second TLR4 signaling domain associate with each other to form a TLR signaling moiety capable of inducing TLR signaling.

[0316] In some embodiments, the engineered immune cell (such as T cell or NK cell) provided herein may comprise the Toll-like receptor (TLR) co-stimulatory molecules which comprising a) a first polypeptide comprising: i) a first target binding domain, ii) a first TLR transmembrane domain, and iii) a first TLR signaling domain; and b) a second polypeptide comprising: i) a second target binding domain, ii) a second TLR transmembrane domain, and iii) a second TLR signaling domain, wherein the first target binding domain and the second target binding domain each binds to a different non-overlapping target site on a single target molecule, wherein the first polypeptide comprises from the N-terminus to the C-terminus: a signal peptide, an anti-BCMA sdAb, a TLR4 hinge, a TLR4 transmembrane domain, and a TLR4 signaling domain (e.g., the cytoplasmic portion of TLR4) , and the second polypeptide comprises from the N-terminus to the C-terminus: a signal peptide, an anti-BCMA sdAb, a TLR4 hinge, a TLR4 transmembrane domain, and a TLR4 signaling domain (e.g., the cytoplasmic portion of TLR4) , and wherein upon binding of the first target binding domain and second target binding domain to their corresponding target, the first TLR4 signaling domain and the second TLR4 signaling domain associate with each other to form a TLR signaling moiety capable of inducing TLR signaling.

[0317] Also provided are engineered immune cells (such as T cell or NK cell) comprising (or expressing) a CAR as described in Section 5.3, and a Toll-like receptor (TLR) co-stimulatory molecule as described in Section 5.4. In some embodiments, the CAR and the Toll-like receptor (TLR) co-stimulatory molecule described herein may be expressed in combination.

[0318] In some embodiments, the engineered immune cell (such as T cell or NK cell) may comprise:

[0319] (i) a CAR as described in Section 5.3, or a nucleotide sequence encoding the CAR; and

[0320] (ii) a Toll-like receptor (TLR) co-stimulatory molecule as described in Section 5.4, or a nucleotide sequence encoding the TLR polypeptides.

[0321] In some embodiments, the engineered immune cell may comprise:

[0322] (i) a chimeric antigen receptor (CAR) comprising: (a) an extracellular antigen binding domain comprising the BCMA-binding moiety (e.g., the single domain antibody (sdAb) specifically binding to BCMA) as provided herein, and optionally one or more additional binding domain (s) ; (b) a transmembrane domain; and (c) an intracellular signaling domain; and

[0323] (ii) a Toll-like receptor (TLR) co-stimulatory molecule comprising (a) a first TLR polypeptide comprises: i) a first target binding domain (e.g., an antibody moiety or fragment thereof) , ii) a first TLR transmembrane domain, and iii) a first TLR signaling domain; and (b) a second TLR polypeptide comprises: i) a second target binding domain (e.g., an antibody moiety or fragment thereof) , ii) a second TLR transmembrane domain, and iii) a second TLR signaling domain. Upon binding of the first target binding domain and second target binding domain to their corresponding targets, the first TLR signaling domain and the second TLR signaling domain associate with each other to form a TLR signaling moiety capable of inducing TLR signaling.

[0324] In some embodiments, the engineered immune cell may comprise:

[0325] (i) a chimeric antigen receptor (CAR) comprising: (a) an extracellular antigen binding domain comprising a BCMA-binding moiety; (b) a transmembrane domain; and (c) an intracellular signaling domain, wherein the BCMA-binding moiety comprises (1) a CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17; a CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:18, and a CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19; and

[0326] (ii) a Toll-like receptor (TLR) co-stimulatory molecule comprising (a) a first TLR polypeptide comprises: i) a first target binding domain (e.g., an antibody moiety or fragment thereof) , ii) a first TLR transmembrane domain, and iii) a first TLR signaling domain; and (b) a second TLR polypeptide comprises: i) a second target binding domain (e.g., an antibody moiety or fragment thereof) , ii) a second TLR transmembrane domain, and iii) a second TLR signaling domain. Upon binding of the first target binding domain and second target binding domain to their corresponding targets, the first TLR signaling domain and the second TLR signaling domain associate with each other to form a TLR signaling moiety capable of inducing TLR signaling, wherein the first TLR transmembrane domain, the first TLR signaling domain, the second TLR transmembrane domain, and the second TLR signaling domain are derived from TLR4; wherein the first target binding domain and the second target binding domain comprises (1) a CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20; a CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21, and a CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22.

[0327] In some embodiments, the engineered immune cell may comprise:

[0328] (i) a chimeric antigen receptor (CAR) comprising: (a) an extracellular antigen binding domain comprising a BCMA-binding moiety; (b) a transmembrane domain; and (c) an intracellular signaling domain, wherein the BCMA-binding moiety comprises (1) a CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 23; a CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:24, and a CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 25; and

[0329] (ii) a Toll-like receptor (TLR) co-stimulatory molecule comprising (a) a first TLR polypeptide comprises: i) a first target binding domain (e.g., an antibody moiety or fragment thereof) , ii) a first TLR transmembrane domain, and iii) a first TLR signaling domain; and (b) a second TLR polypeptide comprises: i) a second target binding domain (e.g., an antibody moiety or fragment thereof) , ii) a second TLR transmembrane domain, and iii) a second TLR signaling domain. Upon binding of the first target binding domain and second target binding domain to their corresponding targets, the first TLR signaling domain and the second TLR signaling domain associate with each other to form a TLR signaling moiety capable of inducing TLR signaling, wherein the first TLR transmembrane domain, the first TLR signaling domain, the second TLR transmembrane domain, and the second TLR signaling domain are derived from TLR4; wherein the first target binding domain and the second target binding domain comprises (1) a CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20; a CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21, and a CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22.

[0330] In some embodiments, the engineered immune cell may comprise:

[0331] (i) a chimeric antigen receptor (CAR) comprising: (a) an extracellular antigen binding domain comprising a BCMA-binding moiety; (b) a transmembrane domain; and (c) an intracellular signaling domain, wherein the BCMA-binding moiety comprises (1) a CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17; a CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:18, and a CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19; and

[0332] (ii) a Toll-like receptor (TLR) co-stimulatory molecule comprising (a) a first TLR polypeptide comprises: i) a first target binding domain (e.g., an antibody moiety or fragment thereof) , ii) a first TLR transmembrane domain, and iii) a first TLR signaling domain; and (b) a second TLR polypeptide comprises: i) a second target binding domain (e.g., an antibody moiety or fragment thereof) , ii) a second TLR transmembrane domain, and iii) a second TLR signaling domain. Upon binding of the first target binding domain and second target binding domain to their corresponding targets, the first TLR signaling domain and the second TLR signaling domain associate with each other to form a TLR signaling moiety capable of inducing TLR signaling, wherein the first TLR transmembrane domain, the first TLR signaling domain, the second TLR transmembrane domain, and the second TLR signaling domain are derived from TLR4; wherein the first target binding domain and the second target binding domain comprises (1) a CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26; a CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 27, and a CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 28.

[0333] In some embodiments, the engineered immune cell may comprise:

[0334] (i) a chimeric antigen receptor (CAR) comprising: (a) an extracellular antigen binding domain comprising a BCMA-binding moiety; (b) a transmembrane domain; and (c) an intracellular signaling domain, wherein the BCMA-binding moiety comprises (1) a CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 23; a CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:24, and a CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 25; and

[0335] (ii) a Toll-like receptor (TLR) co-stimulatory molecule comprising (a) a first TLR polypeptide comprises: i) a first target binding domain (e.g., an antibody moiety or fragment thereof) , ii) a first TLR transmembrane domain, and iii) a first TLR signaling domain; and (b) a second TLR polypeptide comprises: i) a second target binding domain (e.g., an antibody moiety or fragment thereof) , ii) a second TLR transmembrane domain, and iii) a second TLR signaling domain. Upon binding of the first target binding domain and second target binding domain to their corresponding targets, the first TLR signaling domain and the second TLR signaling domain associate with each other to form a TLR signaling moiety capable of inducing TLR signaling, wherein the first TLR transmembrane domain, the first TLR signaling domain, the second TLR transmembrane domain, and the second TLR signaling domain are derived from TLR4; wherein the first target binding domain and the second target binding domain comprises (1) a CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26; a CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 27, and a CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 28.

[0336] In some embodiments, the engineered immune cell may comprise:

[0337] (i) a chimeric antigen receptor (CAR) comprising: (a) an extracellular antigen binding domain comprising a BCMA-binding moiety; (b) a transmembrane domain; and (c) an intracellular signaling domain, wherein the BCMA-binding moiety comprises an amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 13-16, and

[0338] (ii) a Toll-like receptor (TLR) co-stimulatory molecule comprising (a) a first TLR polypeptide comprises: i) a first target binding domain (e.g., an antibody moiety or fragment thereof) , ii) a first TLR transmembrane domain, and iii) a first TLR signaling domain; and (b) a second TLR polypeptide comprises: i) a second target binding domain (e.g., an antibody moiety or fragment thereof) , ii) a second TLR transmembrane domain, and iii) a second TLR signaling domain. Upon binding of the first target binding domain and second target binding domain to their corresponding targets, the first TLR signaling domain and the second TLR signaling domain associate with each other to form a TLR signaling moiety capable of inducing TLR signaling, wherein the first TLR transmembrane domain, the first TLR signaling domain, the second TLR transmembrane domain, and the second TLR signaling domain are derived from TLR4; wherein the first target binding domain and the second target binding domain comprises an amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 13-16.

[0339] In some embodiments, the engineered immune cell may comprise:

[0340] (i) a chimeric antigen receptor (CAR) comprising: (a) an extracellular antigen binding domain comprising a BCMA-binding moiety; (b) a transmembrane domain; and (c) an intracellular signaling domain, wherein the BCMA-binding moiety comprises an amino acid sequence of SEQ ID NOs: 15, and

[0341] (ii) a Toll-like receptor (TLR) co-stimulatory molecule comprising (a) a first TLR polypeptide comprises: i) a first target binding domain (e.g., an antibody moiety or fragment thereof) , ii) a first TLR transmembrane domain, and iii) a first TLR signaling domain; and (b) a second TLR polypeptide comprises: i) a second target binding domain (e.g., an antibody moiety or fragment thereof) , ii) a second TLR transmembrane domain, and iii) a second TLR signaling domain. Upon binding of the first target binding domain and second target binding domain to their corresponding targets, the first TLR signaling domain and the second TLR signaling domain associate with each other to form a TLR signaling moiety capable of inducing TLR signaling, wherein the first TLR transmembrane domain, the first TLR signaling domain, the second TLR transmembrane domain, and the second TLR signaling domain are derived from TLR4; wherein the first target binding domain and the second target binding domain comprises an amino acid sequence of SEQ ID NOs: 16.

[0342] In some embodiments, the engineered immune cell may comprise:

[0343] (i) a chimeric antigen receptor (CAR) comprising: (a) an extracellular antigen binding domain comprising a BCMA-binding moiety; (b) a transmembrane domain; and (c) an intracellular signaling domain, wherein the BCMA-binding moiety comprises an amino acid sequence of SEQ ID NOs: 13, and

[0344] (ii) a Toll-like receptor (TLR) co-stimulatory molecule comprising (a) a first TLR polypeptide comprises: i) a first target binding domain (e.g., an antibody moiety or fragment thereof) , ii) a first TLR transmembrane domain, and iii) a first TLR signaling domain; and (b) a second TLR polypeptide comprises: i) a second target binding domain (e.g., an antibody moiety or fragment thereof) , ii) a second TLR transmembrane domain, and iii) a second TLR signaling domain. Upon binding of the first target binding domain and second target binding domain to their corresponding targets, the first TLR signaling domain and the second TLR signaling domain associate with each other to form a TLR signaling moiety capable of inducing TLR signaling, wherein the first TLR transmembrane domain, the first TLR signaling domain, the second TLR transmembrane domain, and the second TLR signaling domain are derived from TLR4; wherein the first target binding domain and the second target binding domain comprises an amino acid sequence of SEQ ID NOs: 16.

[0345] In some embodiments, the engineered immune cell may comprise:

[0346] (i) a chimeric antigen receptor (CAR) comprising: (a) an extracellular antigen binding domain comprising a BCMA-binding moiety; (b) a transmembrane domain; and (c) an intracellular signaling domain, wherein the BCMA-binding moiety comprises an amino acid sequence of SEQ ID NOs: 15, and

[0347] (ii) a Toll-like receptor (TLR) co-stimulatory molecule comprising (a) a first TLR polypeptide comprises: i) a first target binding domain (e.g., an antibody moiety or fragment thereof) , ii) a first TLR transmembrane domain, and iii) a first TLR signaling domain; and (b) a second TLR polypeptide comprises: i) a second target binding domain (e.g., an antibody moiety or fragment thereof) , ii) a second TLR transmembrane domain, and iii) a second TLR signaling domain. Upon binding of the first target binding domain and second target binding domain to their corresponding targets, the first TLR signaling domain and the second TLR signaling domain associate with each other to form a TLR signaling moiety capable of inducing TLR signaling, wherein the first TLR transmembrane domain, the first TLR signaling domain, the second TLR transmembrane domain, and the second TLR signaling domain are derived from TLR4; wherein the first target binding domain and the second target binding domain comprises an amino acid sequence of SEQ ID NOs: 14.

[0348] In some embodiments, the engineered immune cell may comprise:

[0349] (i) a chimeric antigen receptor (CAR) comprising: (a) an extracellular antigen binding domain comprising a BCMA-binding moiety; (b) a transmembrane domain; and (c) an intracellular signaling domain, wherein the BCMA-binding moiety comprises an amino acid sequence of SEQ ID NOs: 13, and

[0350] (ii) a Toll-like receptor (TLR) co-stimulatory molecule comprising (a) a first TLR polypeptide comprises: i) a first target binding domain (e.g., an antibody moiety or fragment thereof) , ii) a first TLR transmembrane domain, and iii) a first TLR signaling domain; and (b) a second TLR polypeptide comprises: i) a second target binding domain (e.g., an antibody moiety or fragment thereof) , ii) a second TLR transmembrane domain, and iii) a second TLR signaling domain. Upon binding of the first target binding domain and second target binding domain to their corresponding targets, the first TLR signaling domain and the second TLR signaling domain associate with each other to form a TLR signaling moiety capable of inducing TLR signaling, wherein the first TLR transmembrane domain, the first TLR signaling domain, the second TLR transmembrane domain, and the second TLR signaling domain are derived from TLR4; wherein the first target binding domain and the second target binding domain comprises an amino acid sequence of SEQ ID NOs: 14.

[0351] In some embodiments, the engineered immune cell may comprise:

[0352] (i) a chimeric antigen receptor (CAR) comprising: (a) an extracellular antigen binding domain comprising a BCMA-binding moiety; (b) a transmembrane domain; and (c) an intracellular signaling domain, wherein the CAR comprises an amino acid sequence of SEQ ID NOs: 1, and

[0353] (ii) a Toll-like receptor (TLR) co-stimulatory molecule comprising (a) a first TLR polypeptide comprises: i) a first target binding domain (e.g., an antibody moiety or fragment thereof) , ii) a first TLR transmembrane domain, and iii) a first TLR signaling domain; and (b) a second TLR polypeptide comprises: i) a second target binding domain (e.g., an antibody moiety or fragment thereof) , ii) a second TLR transmembrane domain, and iii) a second TLR signaling domain. Upon binding of the first target binding domain and second target binding domain to their corresponding targets, the first TLR signaling domain and the second TLR signaling domain associate with each other to form a TLR signaling moiety capable of inducing TLR signaling, wherein the TLR co-stimulatory molecule comprises an amino acid sequence of SEQ ID NOs: 30. In some embodiments, the engineered immune cell may comprise:

[0354] (i) a chimeric antigen receptor (CAR) comprising: (a) an extracellular antigen binding domain comprising a BCMA-binding moiety; (b) a transmembrane domain; and (c) an intracellular signaling domain, wherein the CAR comprises an amino acid sequence of SEQ ID NOs: 3, and

[0355] (ii) a Toll-like receptor (TLR) co-stimulatory molecule comprising (a) a first TLR polypeptide comprises: i) a first target binding domain (e.g., an antibody moiety or fragment thereof) , ii) a first TLR transmembrane domain, and iii) a first TLR signaling domain; and (b) a second TLR polypeptide comprises: i) a second target binding domain (e.g., an antibody moiety or fragment thereof) , ii) a second TLR transmembrane domain, and iii) a second TLR signaling domain. Upon binding of the first target binding domain and second target binding domain to their corresponding targets, the first TLR signaling domain and the second TLR signaling domain associate with each other to form a TLR signaling moiety capable of inducing TLR signaling, wherein the TLR co-stimulatory molecule comprises an amino acid sequence of SEQ ID NOs: 30. In some embodiments, the engineered immune cell may comprise:

[0356] (i) a chimeric antigen receptor (CAR) comprising: (a) an extracellular antigen binding domain comprising a BCMA-binding moiety; (b) a transmembrane domain; and (c) an intracellular signaling domain, wherein the CAR comprises an amino acid sequence of SEQ ID NOs: 1, and

[0357] (ii) a Toll-like receptor (TLR) co-stimulatory molecule comprising (a) a first TLR polypeptide comprises: i) a first target binding domain (e.g., an antibody moiety or fragment thereof) , ii) a first TLR transmembrane domain, and iii) a first TLR signaling domain; and (b) a second TLR polypeptide comprises: i) a second target binding domain (e.g., an antibody moiety or fragment thereof) , ii) a second TLR transmembrane domain, and iii) a second TLR signaling domain. Upon binding of the first target binding domain and second target binding domain to their corresponding targets, the first TLR signaling domain and the second TLR signaling domain associate with each other to form a TLR signaling moiety capable of inducing TLR signaling, wherein the TLR co-stimulatory molecule comprises an amino acid sequence of SEQ ID NOs: 32. In some embodiments, the engineered immune cell may comprise:

[0358] (i) a chimeric antigen receptor (CAR) comprising: (a) an extracellular antigen binding domain comprising a BCMA-binding moiety; (b) a transmembrane domain; and (c) an intracellular signaling domain, wherein the CAR comprises an amino acid sequence of SEQ ID NOs: 3, and

[0359] (ii) a Toll-like receptor (TLR) co-stimulatory molecule comprising (a) a first TLR polypeptide comprises: i) a first target binding domain (e.g., an antibody moiety or fragment thereof) , ii) a first TLR transmembrane domain, and iii) a first TLR signaling domain; and (b) a second TLR polypeptide comprises: i) a second target binding domain (e.g., an antibody moiety or fragment thereof) , ii) a second TLR transmembrane domain, and iii) a second TLR signaling domain. Upon binding of the first target binding domain and second target binding domain to their corresponding targets, the first TLR signaling domain and the second TLR signaling domain associate with each other to form a TLR signaling moiety capable of inducing TLR signaling, wherein the TLR co-stimulatory molecule comprises an amino acid sequence of SEQ ID NOs: 32.

[0360] In some embodiments, the CAR and the Toll-like receptor (TLR) co-stimulatory molecule may be encoded on the same or different nucleic acid molecules, or the same or different vectors.

[0361] In some embodiments, the engineered immune cell (such as T cell or NK cell) may comprise: (i) a first nucleic acid encoding the CAR; and (ii) a second nucleic acid encoding the first TLR polypeptide; and (iii) a third nucleic acid encoding the second TLR polypeptide.

[0362] In some embodiments, the first polypeptide and the second polypeptide are the same and the engineered immune cell (such as T cell or NK cell) may comprise: (1) a first nucleic acid encoding the CAR and (ii) a second nucleic acid encoding the first polypeptide and the second polypeptide.

[0363] In some embodiments of the TLR co-stimulatory molecule may be fused to the N-terminal and / or C-terminal of the CAR, optionally via a cleavage linker, such as a P2A or T2A linker.

[0364] In some embodiments, the engineered immune cell may comprise a CAR fusion construct, wherein the CAR fusion construct comprises an anti-BCMA CAR and anti-BCMA TLR polypeptides. In some embodiments, the CAR fusion construct comprises an amino acid sequence having at least about 85% (e.g., at least about any one of 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or higher) sequence identity to SEQ ID NO: 5-8. In some embodiments, the CAR fusion construct comprises SEQ ID NO: 5-8.

[0365] The engineered immune cell may be a T cell (e.g., αβT cell, γδT cell) , an NK cell, NKT, monocyte, dendritic cell, macrophage, B cell, a peripheral blood mononuclear cell (PBMC) , a hematopoietic stem cell, a pluripotent stem cell, or an embryonic stem cell. The engineered immune cell may be autologous. The engineered immune cell may be allogenic.

[0366] Also provided are engineered immune cells comprising (or expressing) two or more different CARs. Any two or more of the CARs described herein may be expressed in combination. The CARs may target different antigens, thereby providing synergistic or additive effects. The two or more CARs may be encoded on the same vector or different vectors.

[0367] 5.6. Nucleic Acids (Polynucleotides)

[0368] The present disclosure provides nucleic acids comprising a nucleotide sequence encoding the BCMA-binding moieties (e.g., sdAbs or antigen-binding fragments thereof that bind to BCMA) described in Section 5.2, engineered receptor (e.g., CAR) described in Section 5.3, Toll-like receptor (TLR) co-stimulatory molecule described in Section 5.4 herein.

[0369] The present disclosure also provides a nucleic acid may comprise: (i) a nucleic acid sequence encoding the CAR described in Section 5.3; and (ii) a nucleic acid sequence encoding the Toll-like receptor (TLR) co-stimulatory molecule (TLR polypeptides) described in Section 5.4.

[0370] In some embodiment, the nucleic acid may comprise: (i) a nucleic acid sequence encoding the CAR described in Section 5.3; and (ii) a nucleic acid sequence encoding the Toll-like receptor (TLR) co-stimulatory molecule (TLR polypeptides) described in Section 5.4, wherein the TLR co-stimulatory molecule comprises a) a first polypeptide comprising: i) a first target binding domain, ii) a first TLR transmembrane domain, and iii) a first TLR signaling domain; and b) a second polypeptide comprising: i) a second target binding domain, ii) a second TLR transmembrane domain, and iii) a second TLR signaling domain; wherein upon binding of the first target binding domain and second target binding domain to their corresponding target, the first TLR signaling domain and the second TLR signaling domain associate with each other to form a TLR signaling moiety capable of inducing TLR signaling.

[0371] In some embodiments, the nucleic acids may comprise:

[0372] (i) a first nucleic acid encoding a chimeric antigen receptor (CAR) comprising: (a) an extracellular antigen binding domain comprising the BCMA-binding moiety (e.g., the single domain antibody (sdAb) specifically binding to BCMA) as provided herein, and optionally one or more additional binding domain (s) ; (b) a transmembrane domain; and (c) an intracellular signaling domain; and

[0373] (ii) a second nucleic acid encoding a first TLR polypeptide comprises: i) a first target binding domain (e.g., an antibody moiety or fragment thereof) , ii) a first TLR transmembrane domain, and iii) a first TLR signaling domain; and

[0374] (ii) a third nucleic acid encoding a second TLR polypeptide comprises: i) a second target binding domain (e.g., an antibody moiety or fragment thereof) , ii) a second TLR transmembrane domain, and iii) a second TLR signaling domain. Upon binding of the first target binding domain and second target binding domain to their corresponding targets, the first TLR signaling domain and the second TLR signaling domain associate with each other to form a TLR signaling moiety capable of inducing TLR signaling.

[0375] In some embodiments, the first polypeptide and the second polypeptide are the same. In some embodiments, the nucleic acid comprises (i) a first nucleic acid encoding the CAR and (ii) a second nucleic acid encoding the first polypeptide and the second polypeptide. In some embodiments, the first nucleic acid and the second nucleic acid are on the same vector. In some embodiments, the first nucleic acid encoding the CAR is linked to the second nucleic acid encoding the first polypeptide and the second polypeptide through a nucleic acid encoding a 2A self-cleaving peptide. In some embodiments, the 2A self-cleaving peptide is a T2A peptide or a P2A peptide.

[0376] The present disclosure also provides nucleic acids comprising anti-BCMA CAR and a TLR co-stimulatory molecule targeting BCMA, wherein the nucleic acids encoding a polypeptide comprises, from the N-terminus to the C-terminus: a signal peptide, an anti-BCMA sdAb, a CD8αhinge domain, a CD8α transmembrane (TM) domain, the cytoplasmic portion of the 4-1BB (CD137) co-stimulatory signaling domain, and a CD3ζ primary intracellular signaling domain, a P2A cleavage site, a signal peptide, an anti-BCMA sdAb, a TLR4 transmembrane (TM) region, and the cytoplasmic portion of TLR4 (e.g., TLR4 primary intracellular signaling domain) . In some embodiments, the nucleic acid encoding a peptide having a comprises an amino acid sequence having at least about 85% (e.g., at least about any one of 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or higher) sequence identity to SEQ ID NO: 5-8. In some embodiments, the nucleic acid encoding a polypeptide having a comprises SEQ ID NO: 5-8.

[0377] The polynucleotides of the disclosure can be in the form of RNA or in the form of DNA. DNA includes cDNA, genomic DNA, and synthetic DNA; and can be double-stranded or single-stranded, and if single stranded can be the coding strand or non-coding (anti-sense) strand. The polynucleotide may be in the form of cDNA. The polynucleotide may be a synthetic polynucleotide.

[0378] The present disclosure further relates to variants of the polynucleotides described herein, wherein the variant encodes, for example, fragments, analogs, and / or derivatives of the antibody, CAR, Toll-like receptor (TLR) co-stimulatory molecules or the CAR fusion construct that binds BCMA of the disclosure. The present disclosure may provide a polynucleotide comprising a polynucleotide having a nucleotide sequence at least about 75%identical, at least about 80%identical, at least about 85%identical, at least about 90%identical, at least about 95%identical, or, at least about 96%, 97%, 98%or 99%identical to a polynucleotide encoding the antibody, CAR, Toll-like receptor (TLR) co-stimulatory molecules or the CAR fusion construct that binds BCMA of the disclosure.

[0379] A polynucleotide of the present disclosure may comprise a first polynucleotide sequence encoding the CAR and a second polynucleotide sequence encoding the Toll-like receptor (TLR) co-stimulatory molecules. The first and second polynucleotide sequence can be separated by a self-cleaving peptide. The self-cleaving peptide may be selected from the group consisting of T2A, P2A and F2A. A self-cleaving peptide for use in the present disclosure allows for multiple proteins to be encoded by the same nucleic acid sequence (e.g., a multicistronic or bicistronic sequence) , which are translated as a polyprotein that is dissociated into separate protein components. The polynucleotide may comprise from 5’ to 3’ the first polynucleotide sequence, the self-cleaving peptide, and the second polynucleotide sequence. The first polynucleotide sequence may encode an engineered receptor (e.g., CAR) described herein and the second polynucleotide sequence may encode a Toll-like receptor (TLR) co-stimulatory molecule described herein.

[0380] 5.7. Vector

[0381] Also provided are vectors comprising the nucleic acid molecules described herein. In some embodiments, there is provided a vector comprising any one of the nucleic acids encoding the CAR and / or the Toll-like receptor (TLR) co-stimulatory molecules described herein. In some embodiments, there is provided a vector comprising a first nucleic acid sequence encoding any one of the CAR described herein and a second nucleic acid sequence encoding any one of the Toll-like receptor (TLR) co-stimulatory molecules described herein. In some embodiments, the first nucleic acid sequence encoding the CAR is fused to the second nucleic acid sequence encoding the Toll-like receptor (TLR) co-stimulatory molecules via a self-cleavable linker, such as P2A, T2A, E2A, or F2A peptide. In some embodiments, there is provided a composition comprising a first vector comprising a first nucleic acid sequence encoding any one of the CAR described herein, and a second vector comprising a second nucleic acid sequence encoding any one of the Toll-like receptor (TLR) co-stimulatory molecules described herein. In some embodiments, there is provided a vector comprising a first nucleic acid sequence encoding a CAR (e.g., a BCMA CAR) and a second nucleic acid sequence encoding a Toll-like receptor (TLR) co-stimulatory molecule, wherein the first nucleic acid sequence is fused to the second nucleic acid sequence via a self-cleavable linker, such as P2A. In some embodiments, the vector comprises a nucleic acid sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5-8.

[0382] The vector is suitable for replication and integration in eukaryotic cells, such as mammalian cells. The vector may be a viral vector. Examples of viral vectors include, but are not limited to, adenoviral vectors, adeno-associated virus vectors, lentiviral vector, retroviral vectors, vaccinia vector, herpes simplex viral vector, and derivatives thereof. Viral vector technology is well known in the art and is described, for example, in Sambrook et al. (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York) , and in other virology and molecular biology manuals. The nucleic acid molecules can be incorporated into a recombinant expression vector. The present disclosure provides recombinant expression vectors comprising any of the nucleic acids of the disclosure. As used herein, the term “recombinant expression vector” means a genetically-modified oligonucleotide or polynucleotide construct that permits the expression of an mRNA, protein, polypeptide, or peptide by a host cell, when the construct comprises a nucleotide sequence encoding the mRNA, protein, polypeptide, or peptide, and the vector is contacted with the cell under conditions sufficient to have the mRNA, protein, polypeptide, or peptide expressed within the cell. The vectors described herein are not naturally occurring as a whole; however, parts of the vectors can be naturally occurring. The described recombinant expression vectors can comprise any type of nucleotides, including, but not limited to DNA and RNA, which can be single-stranded or double-stranded, synthesized or obtained in part from natural sources, and which can contain natural, non-natural or altered nucleotides. The recombinant expression vectors can comprise naturally occurring or non-naturally occurring internucleotide linkages, or both types of linkages. The non-naturally occurring or altered nucleotides or internucleotide linkages do not hinder the transcription or replication of the vector.

[0383] The recombinant expression vector of the disclosure can be any suitable recombinant expression vector, and can be used to transform or transfect any suitable host. Suitable vectors include those designed for propagation and expansion or for expression or both, such as plasmids and viruses. The vector can be selected from the group consisting of the pUC series (Fermentas Life Sciences, Glen Burnie, Md. ) , the pBluescript series (Stratagene, LaJolla, Calif. ) , the pET series (Novagen, Madison, Wis. ) , the pGEX series (Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden) , and the pEX series (Clontech, Palo Alto, Calif. ) . Bacteriophage vectors, such as λGT10, λGT11, λEMBL4, and λNM1149, λZapII (Stratagene) can be used. Examples of plant expression vectors include pBI01, pBI01.2, pBI121, pBI101.3, and pBIN19 (Clontech) . Examples of animal expression vectors include pEUK-Cl, pMAM, and pMAMneo (Clontech) . The recombinant expression vector may be a viral vector, e.g., a retroviral vector, e.g., a gamma retroviral vector.

[0384] The recombinant expression vectors can be prepared using standard recombinant DNA techniques described in, for example, Sambrook et al., supra, and Ausubel et al., supra. Constructs of expression vectors, which are circular or linear, can be prepared to contain a replication system functional in a prokaryotic or eukaryotic host cell. Replication systems can be derived, e.g., from ColE1, SV40, 2μ plasmid, λ, bovine papilloma virus, and the like.

[0385] The recombinant expression vector may comprise regulatory sequences, such as transcription and translation initiation and termination codons, which are specific to the type of host (e.g., bacterium, plant, fungus, or animal) into which the vector is to be introduced, as appropriate, and taking into consideration whether the vector is DNA-or RNA-based.

[0386] The recombinant expression vector can include one or more marker genes, which allow for selection of transformed or transfected hosts. Marker genes include biocide resistance, e.g., resistance to antibiotics, heavy metals, etc., complementation in an auxotrophic host to provide prototrophy, and the like. Suitable marker genes for the described expression vectors include, for instance, neomycin / G418 resistance genes, histidinol x resistance genes, histidinol resistance genes, tetracycline resistance genes, and ampicillin resistance genes.

[0387] The recombinant expression vector can comprise a native or normative promoter operably linked to the nucleotide sequence of the disclosure. The selection of promoters, e.g., strong, weak, tissue-specific, inducible and developmental-specific, is within the ordinary skill of the artisan. Similarly, the combining of a nucleotide sequence with a promoter is also within the skill of the artisan. The promoter can be a non-viral promoter or a viral promoter, e.g., a cytomegalovirus (CMV) promoter, an RSV promoter, an SV40 promoter, or a promoter found in the long-terminal repeat of the murine stem cell virus.

[0388] The recombinant expression vectors can be designed for either transient expression, for stable expression, or for both. Also, the recombinant expression vectors can be made for constitutive expression or for inducible expression.

[0389] A polynucleotide may be isolated. A polynucleotide may be substantially pure.

[0390] Also provided are host cells comprising the nucleic acid molecules described herein. The host cell may be any cell that contains a heterologous nucleic acid. The heterologous nucleic acid can be a vector (e.g., an expression vector) . For example, a host cell can be a cell from any organism that is selected, modified, transformed, grown, used or manipulated in any way, for the production of a substance by the cell, for example the expression by the cell of a gene, a DNA or RNA sequence, a protein or an enzyme. An appropriate host may be determined. For example, the host cell may be selected based on the vector backbone and the desired result. By way of example, a plasmid or cosmid can be introduced into a prokaryote host cell for replication of several types of vectors. Bacterial cells such as, but not limited to DH5α, JM109, and KCB,  Competent Cells, and SOLOPACK Gold Cells, can be used as host cells for vector replication and / or expression. Additionally, bacterial cells such as E. coli LE392 could be used as host cells for phage viruses. Eukaryotic cells that can be used as host cells include, but are not limited to yeast (e.g., YPH499, YPH500 and YPH501) , insects and mammals. Examples of mammalian eukaryotic host cells for replication and / or expression of a vector include, but are not limited to, HeLa, NIH3T3, Jurkat, 293, COS, Saos, PC12, SP2 / 0 (American Type Culture Collection (ATCC) , Manassas, VA, CRL-1581) , NS0 (European Collection of Cell Cultures (ECACC) , Salisbury, Wiltshire, UK, ECACC No. 85110503) , FO (ATCC CRL-1646) and Ag653 (ATCC CRL-1580) murine cell lines. An exemplary human myeloma cell line is U266 (ATCC CRL-TIB-196) . Other useful cell lines include those derived from Chinese Hamster Ovary (CHO) cells such as CHO-K1SV (Lonza Biologics, Walkersville, MD) , CHO-K1 (ATCC CRL-61) or DG44.

[0391] Introduction of polynucleotides into host cells

[0392] The polynucleotides (e.g., vectors) described herein can be introduced as one or more polynucleotides or constructs, optionally comprising a marker that will allow for selection of host cells that contain the construct (s) . The genes and regulatory regions can be isolated, as appropriate, ligated, cloned in an appropriate cloning host, analyzed by restriction or sequencing. Particularly, using PCR, individual fragments including all or portions of a functional unit can be isolated, where one or more mutations can be introduced using "primer repair" , ligation, in vitro mutagensis, etc. as appropriate. The polynucleotides obtained and demonstrated to have the appropriate sequences can then be introduced into the host cell by any convenient means. The polynucleotides can be integrated and packaged into non-replicating, defective viral genomes like lentivirus, Adenovirus, Adeno-associated virus (AAV) , or Herpes simplex virus (HSV) or others, including retroviral vectors, for infection or transduction into cells. The polynucleotides can include viral sequences for transfection, if desired. Alternatively, the polynucleotides can be introduced by fusion, electroporation, biolistics, transfection, lipofection, or the like. The host cells can be grown and expanded in culture before introduction of the construct (s) , followed by the appropriate treatment for introduction of the construct (s) and integration of the construct (s) . The cells are then expanded and screened by virtue of a marker present in the construct. Various markers that can be used successfully include hprt, neomycin resistance, thymidine kinase, hygromycin resistance, etc.

[0393] The engineered receptor (e.g., CAR) , Toll-like receptor (TLR) co-stimulatory molecules or the CAR fusion construct can be introduced into the modified cells as an RNA for transient expression. RNA can be delivered to the immune cells of the disclosure by various means including microinjection, electroporation, and lipid-mediated transfection, for example. Introduction of constructs into the cell's genome can occur via transposons. An example of a synthetic transposon for use is the Sleeping Beauty transposon that comprises an expression cassette including the appropriate gene of active fragment thereof. The construct can be integrated at a particular locus in the genome of the host cell. An endogenous gene can be replaced with the gene encoded for by the construct using homologous recombination.

[0394] A construct encoding an engineered receptor (e.g., a CAR) , Toll-like receptor (TLR) co-stimulatory molecules or the CAR fusion construct can be introduced into the host cell using a lentiviral delivery system. A construct encoding an engineered receptor (e.g., a CAR) , Toll-like receptor (TLR) co-stimulatory molecules or the CAR fusion construct can be introduced into the host cell using a retroviral delivery system.

[0395] The host cells can be human cells. The host cells can be human T cells. The human T cells can be purified from commercialized PBMCs. The host cells is selected from the group consisting of a cytotoxic T cell, a helper T cell, a natural killer (NK) cell, an NK-cell, an iNK-T cell, an NK-T like cell, an αβT cell and a γδT cell.

[0396] 5.8. Pharmaceutical Compositions

[0397] In one aspect, the present disclosure further provides pharmaceutical compositions comprising an antigen-binding moiety (e.g., a sdAb) , a binding molecule or therapeutic molecule comprising an antibody, or an engineered immune cell of the present disclosure. A pharmaceutical composition may comprise a therapeutically effective amount of the antigen-binding moiety (e.g., a BCMA-binding moiety such as an anti-BCMA sdAb provided herein) , the binding molecule or therapeutic molecule comprising the antigen-binding moiety (e.g., a sdAb) , or the engineered immune cell of the present disclosure and a pharmaceutically acceptable excipient.

[0398] A pharmaceutical composition provided herein may comprise a BCMA-binding moiety (e.g., an anti-BCMA sdAb) , the cell, the CAR, the Toll-like receptor (TLR) co-stimulatory molecules, the CAR fusion construct, the nucleic acid, the vector, or the engineered immune cell provided herein, and a pharmaceutically acceptable excipient.

[0399] A pharmaceutical composition provided herein may comprise a therapeutically effective amount of the BCMA-binding moiety provided herein (e.g., an anti-BCMA sdAb provided herein) and a pharmaceutically acceptable excipient. BCMA-binding moieties, such as antibodies, may be agonistic or antagonistic.

[0400] A pharmaceutical composition provided herein may comprise a therapeutically effective amount of the therapeutic molecule (such as a fusion protein, immunoconjugate, and a multispecific binding molecule) comprising the BCMA-binding moiety (e.g., an anti-BCMA sdAb) provided herein and a pharmaceutically acceptable excipient.

[0401] A pharmaceutical composition provided herein may comprise a therapeutically effective amount of CAR comprising the BCMA-binding moiety (e.g., an anti-BCMA sdAb) provided herein and a pharmaceutically acceptable excipient. The CAR can be a BCMA targeting CAR provided herein.

[0402] A pharmaceutical composition provided herein may comprise a therapeutically effective amount of Toll-like receptor (TLR) co-stimulatory molecules comprising the BCMA-binding moiety (e.g., an anti-BCMA sdAb) provided herein and a pharmaceutically acceptable excipient. The Toll-like receptor (TLR) co-stimulatory molecules can be a BCMA targeting TLR polypeptides provided herein.

[0403] A pharmaceutical composition provided herein may comprise a therapeutically effective amount of CAR fusion construct comprising the anti-BCMA CAR and anti-BCMA TLR co-stimulatory molecules provided herein and a pharmaceutically acceptable excipient.

[0404] A pharmaceutical composition provided herein may comprise a therapeutically effective amount of engineered immune cells provided herein and a pharmaceutically acceptable excipient. The engineered immune cells can comprise a BCMA targeting CAR provided herein. The engineered immune cells can comprise a Toll-like receptor (TLR) co-stimulatory molecule. The engineered immune cells can comprise a CAR fusion construct which comprises an anti-BCMA CAR and an anti-BCMA TLR co-stimulatory molecules.

[0405] The engineered immune cell may be an engineered immune effector cell.

[0406] A pharmaceutical composition provided herein may comprise a therapeutically effective amount of a nucleic acid provided herein, e.g., in a vector, and a pharmaceutically acceptable excipient, e.g., suitable for gene therapy.

[0407] 5.9. Methods and Uses

[0408] In another aspect, provided herein are methods for using and uses of the BCMA binding molecules provided herein, including the BCMA-binding moieties e.g., anti-BCMA sdAbs, chimeric antigen receptors (CARs) that bind to BCMA, Toll-like receptor (TLR) co-stimulatory molecule that binds to BCMA, CAR fusion construct, and / or engineered cells expressing the chimeric receptors, Toll-like receptor (TLR) co-stimulatory molecule that bind to BCMA or CAR fusion construct.

[0409] Such methods and uses include therapeutic methods and uses, for example, involving administration of the molecules, cells, or compositions containing the same, to a subject having a disease, condition, or disorder associated with BCMA. The molecule, cell, and / or composition may be administered in an effective amount to effect treatment of the disease or disorder. Uses include uses of the molecules and cells in such methods and treatments, and in the preparation of a medicament in order to carry out such therapeutic methods. The methods may be carried out by administering the molecules or cells, or compositions comprising the same, to the subject having or suspected of having the disease or condition. The methods thereby may treat the disease or disorder in the subject.

[0410] The treatment provided herein may cause complete or partial amelioration or reduction of a disease or disorder, or a symptom, adverse effect or outcome, or phenotype associated therewith. Desirable effects of treatment include, but are not limited to, preventing occurrence or recurrence of disease, alleviation of symptoms, diminishment of any direct or indirect pathological consequences of the disease, preventing metastasis, decreasing the rate of disease progression, amelioration or palliation of the disease state, and remission or improved prognosis. The terms include, but do not imply, complete curing of a disease or complete elimination of any symptom or effect (s) on all symptoms or outcomes.

[0411] As used herein, the treatment provided herein may delay development of a disease or disorder, e.g., defer, hinder, slow, retard, stabilize, suppress and / or postpone development of the disease (such as cancer) . This delay can be of varying lengths of time, depending on the history of the disease and / or individual being treated. As is evident to one skilled in the art, a sufficient or significant delay can, in effect, encompass prevention, in that the individual does not develop the disease or disorder. For example, a late-stage cancer, such as development of metastasis, may be delayed. The method or the use provided herein may prevent a disease or disorder.

[0412] The disease or disorder may be a BCMA associated disease or disorder.

[0413] The disease or disorder may be an autoimmune disease (e.g., a humoral immunity-mediated autoimmune disease) associated with BCMA. The autoimmune disease associated with BCMA may be systemic lupus erythematosus (SLE) , multiple sclerosis, N-methyl-d-aspartate receptor (NMDAR) encephalitis, myasthenia gravis, rheumatoid arthritis, myelin oligodendrocyte glycoprotein spectrum disorder (MOGSD) , neuromyelitis optica spectrum disorder (NMOSD) , and any combination thereof.

[0414] The disease or disorder associated with BCMA may be a BCMA positive cancer, i.e., a cancer that expresses or overexpresses BCMA. A BCMA positive cancer may be cute leukemias (e.g., acute myeloid leukemia (AML) , B-cell acute lymphoid leukemia (BALL) , T-cell acute lymphoid leukemia (TALL) , acute lymphoid leukemia (ALL) ) , chronic leukemias (e.g., chronic myelogenous leukemia (CML) , chronic lymphocytic leukemia (CLL) ) , multiple myeloma (MM, e.g., refractory or relapsed multiple myeloma) , myelodysplastic syndrome (MDS) , myeloproliferative neoplasms (MPNs) , chronic myeloid leukemia (CML) , blastic plasmacytoid dendritic cell neoplasm (BPDCN) , and any combination thereof.

[0415] The methods may include adoptive cell therapy, whereby genetically engineered cells expressing the provided BCMA targeting CARs or the anti-BCMA CAR fusion protein are administered to a subject. Such administration can promote activation of the cells (e.g., T cell activation) in a BCMA targeted manner, such that the cells of the disease or disorder are targeted for destruction. The genetically engineered cells expressing the provided BCMA targeted CARs may further express one or more additional antigen binding domain (s) . The genetically engineered cells may further express a chimeric receptor.

[0416] The methods may include administration of the cells or a composition containing the cells to a subject, tissue, or cell, such as one having, at risk for, or suspected of having the disease or disorder. The cells, cell populations and compositions may be administered to a subject having the particular disease or disorder to be treated, e.g., via adoptive cell therapy, such as adoptive T cell therapy. The cells, cell populations or compositions may be administered to the subject, such as a subject having or at risk for the disease or disorder. The methods thereby may treat, e.g., ameliorate one or more symptom of the disease or disorder, such as by lessening tumor burden in a BCMA-expressing cancer.

[0417] Methods for administration of cells for adoptive cell therapy are known, as described, e.g., in US Patent Application Publication No. 2003 / 0170238; U.S. Pat. No. 4, 690, 915; Rosenberg, Nat Rev Clin Oncol. 8 (10) : 577-85 (2011) ; Themeli et al., Nat Biotechnol. 31 (10) : 928-933 (2013) ; Tsukahara et al., Biochem Biophys Res Commun 438 (1) : 84-9 (2013) ; and Davila et al., PloS ONE 8(4) : e61338 (2013) . These methods may be used in connection with the methods and compositions provided herein.

[0418] The cell therapy (e.g., adoptive T cell therapy) may be carried out by autologous transfer, in which the cells are isolated and / or otherwise prepared from the subject who is to receive the cell therapy, or from a sample derived from such a subject. Thus, in some aspects, the cells are derived from a subject in need of a treatment and the cells, following isolation and processing are administered to the same subject. The cell therapy (e.g., adoptive T cell therapy) may be carried out by allogeneic transfer, in which the cells are isolated and / or otherwise prepared from a subject other than a subject who is to receive or who ultimately receives the cell therapy, e.g., a first subject. The cells then are then administered to a different subject, e.g., a second subject, of the same species. The first and second subjects may be genetically identical. The first and second subjects may be genetically similar. The second subject may express the same HLA class or supertype as the first subject. The cell therapy (e.g., adoptive T cell therapy) may be carried out by allogeneic transfer.

[0419] The subject, to whom the cells, cell populations, or compositions are administered, may be a primate, such as a human. The subject can be male or female and can be any suitable age, including infant, juvenile, adolescent, adult, and geriatric subjects. In some examples, the subject is a validated animal model for disease, adoptive cell therapy, and / or for assessing toxic outcomes.

[0420] The BCMA binding molecules, such as antibodies and chimeric antigen receptors that bind to BCMA and cells expressing the same, can be administered by any suitable means, for example, by injection, e.g., intravenous or subcutaneous injections, intraocular injection, periocular injection, subretinal injection, intravitreal injection, trans-septal injection, subscleral injection, intrachoroidal injection, intracameral injection, subconjectval injection, subconjuntival injection, sub-Tenon's injection, retrobulbar injection, peribulbar injection, or posterior juxtascleral delivery. They may be administered by parenteral, intrapulmonary, and intranasal, and, if desired for local treatment, intralesional administration. Parenteral infusions include intramuscular, intravenous, intraarterial, intraperitoneal, or subcutaneous administration.

[0421] The amount of a prophylactic or therapeutic agent provided herein that will be effective in the prevention and / or treatment of a disease or condition can be determined by standard clinical techniques. Effective doses may be extrapolated from dose-response curves derived from in vitro or animal model test systems. For the prevention or treatment of disease, the appropriate dosage of the binding molecule or cell may depend on the type of disease or disorder to be treated, the type of binding molecule, the severity and course of the disease or disorder, whether the therapeutic agent is administered for preventive or therapeutic purposes, previous therapy, the patient's clinical history and response to the agent, and the discretion of the attending physician. The compositions, molecules and cells may be suitably administered to the patient at one time or over a series of treatments.

[0422] For example, depending on the type and severity of the disease, dosages of antibodies may include about 10 μg / kg to 100 mg / kg or more. Multiple doses may be administered intermittently. An initial higher loading dose, followed by one or more lower doses may be administered. Wherein the pharmaceutical composition may comprise any one of the antibodies described herein, the pharmaceutical composition is administered at a dosage of about 10 ng / kg up to about 100 mg / kg of body weight of the individual or more per day, for example, at about 1 mg / kg / day to 10 mg / kg / day, depending upon the route of administration. Guidance as to particular dosages and methods of delivery is provided in the literature (see, e.g., U.S. Pat. Nos. 4, 657, 760; 5, 206, 344; and 5, 225, 212) .

[0423] In the context of genetically engineered cells containing the binding molecules, a subject may be administered the range of about one million to about 100 billion cells and / or that amount of cells per kilogram of body weight. Wherein the pharmaceutical composition may comprise any one of the engineered immune cells described herein, the pharmaceutical composition is administered at a dosage of at least about any of 104, 105, 106, 107, 108, or 109 cells / kg of body weight of the individual. Dosages may vary depending on attributes particular to the disease or disorder and / or patient and / or other treatments.

[0424] The pharmaceutical composition may be administered for a single time. The pharmaceutical composition may be administered for multiple times (such as any of 2, 3, 4, 5, 6, or more times) . The pharmaceutical composition may be administered once or multiple times during a dosing cycle. A dosing cycle can be, e.g., 1, 2, 3, 4, 5 or more week (s) , or 1, 2, 3, 4, 5, or more month (s) . The optimal dosage and treatment regime for a particular patient can be determined by one skilled in the art of medicine by monitoring the patient for signs of disease and adjusting the treatment accordingly. Once the cells are administered to a mammal (e.g., a human) , the biological activity of the engineered cell populations and / or antibodies may be measured by any of a number of known methods. Parameters to assess include specific binding of an engineered or natural T cell or other immune cell to antigen, in vivo, e.g., by imaging, or ex vivo, e.g., by ELISA or flow cytometry. The ability of the engineered cells to destroy target cells can be measured using any suitable method known in the art, such as cytotoxicity assays described in, for example, Kochenderfer et al., J. Immunotherapy, 32 (7) : 689-702 (2009) , and Herman et al. J. Immunological Methods, 285 (1) : 25-40 (2004) . The biological activity of the cells also can be measured by assaying expression and / or secretion of certain cytokines, such as CD107a, IFNγ, IL-2, and TNF. In some aspects, the biological activity is measured by assessing clinical outcome, such as reduction in tumor burden or load.

[0425] In another aspect, provided herein is a method for treating a disease or disorder in a subject comprising administering to the subject a binding molecule comprising a BCMA-binding moiety, such as an anti-BCMA sdAb, as described in Section 5.2 above (e.g., VHHs that bind BCMA or antigen-binding fragments thereof) , including, e.g., those comprising an amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 13-16; or an amino acid sequence having a substitution, deletion and / or addition of one or several amino acids (e.g., a substitution, deletion and / or addition of 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10 amino acids) as compared thereto; or an amino acid sequence having at least 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or more sequence identity thereto. The disease or disorder may be a BCMA associated disease or disorder. The disease or disorder may be an autoimmune disease (e.g., a humoral immunity-mediated autoimmune disease) associated with BCMA. The autoimmune disease associated with BCMA may be systemic lupus erythematosus (SLE) , multiple sclerosis, N-methyl-d-aspartate receptor (NMDAR) encephalitis, myasthenia gravis, rheumatoid arthritis, myelin oligodendrocyte glycoprotein spectrum disorder (MOGSD) , neuromyelitis optica spectrum disorder (NMOSD) , and any combination thereof. The disease or disorder associated with BCMA may be a BCMA positive cancer, i.e., a cancer that expresses or overexpresses BCMA. A BCMA positive cancer may be cute leukemias (e.g., acute myeloid leukemia (AML) , B-cell acute lymphoid leukemia (BALL) , T-cell acute lymphoid leukemia (TALL) , acute lymphoid leukemia (ALL) ) , chronic leukemias (e.g., chronic myelogenous leukemia (CML) , chronic lymphocytic leukemia (CLL) ) , multiple myeloma (MM, e.g., refractory or relapsed multiple myeloma) , myelodysplastic syndrome (MDS) , myeloproliferative neoplasms (MPNs) , chronic myeloid leukemia (CML) , blastic plasmacytoid dendritic cell neoplasm (BPDCN) , and any combination thereof.

[0426] In another aspect, provided herein is a method for treating a disease or disorder in a subject comprising administering to the subject an engineered immune cell expressing a CAR provided herein, for example, a CAR comprising a BCMA-binding moiety, such as a sdAb that binds to BCMA, as described in Section 5.2 above, including, e.g., those comprising an amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 13-16; or an amino acid sequence having a substitution, deletion and / or addition of one or several amino acids (e.g., a substitution, deletion and / or addition of 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10 amino acids) as compared thereto; or an amino acid sequence having at least 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or more sequence identity thereto. The engineered immune cell administered to a subject may comprise a CAR comprising an amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 1-4, and 9-12; or an amino acid sequence having at least 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or more sequence identity thereto. The engineered immune cell administered to a subject may comprise a Toll-like receptor (TLR) co-stimulatory molecule comprising an amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 29-36; or an amino acid sequence having at least 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or more sequence identity thereto. The engineered immune cell administered to a subject may comprise a CAR fusion protein comprising an amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 5-8; or an amino acid sequence having at least 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or more sequence identity thereto. The disease or disorder may be a BCMA associated disease or disorder. The disease or disorder may be an autoimmune disease (e.g., a humoral immunity-mediated autoimmune disease) associated with BCMA. The autoimmune disease associated with BCMA may be systemic lupus erythematosus (SLE) , multiple sclerosis, N-methyl-d-aspartate receptor (NMDAR) encephalitis, myasthenia gravis, rheumatoid arthritis, myelin oligodendrocyte glycoprotein spectrum disorder (MOGSD) , neuromyelitis optica spectrum disorder (NMOSD) , and any combination thereof. The disease or disorder associated with BCMA may be a BCMA positive cancer, i.e., a cancer that expresses or overexpresses BCMA. A BCMA positive cancer may be cute leukemias (e.g., acute myeloid leukemia (AML) , B-cell acute lymphoid leukemia (BALL) , T-cell acute lymphoid leukemia (TALL) , acute lymphoid leukemia (ALL) ) , chronic leukemias (e.g., chronic myelogenous leukemia (CML) , chronic lymphocytic leukemia (CLL) ) , multiple myeloma (MM, e.g., refractory or relapsed multiple myeloma) , myelodysplastic syndrome (MDS) , myeloproliferative neoplasms (MPNs) , chronic myeloid leukemia (CML) , blastic plasmacytoid dendritic cell neoplasm (BPDCN) , and any combination thereof.

[0427] 6. EXAMPLES

[0428] Example 1. Humanization of the camelid anti-BCMA sdAbs

[0429] Humanization of WT-48 (SEQ ID NO: 15) and WT-22 sdAbs (SEQ ID NO: 16) was performed using the CDR grafting method (Winter G, Harris WJ 1993) . The camelid sdAb sequences were BLASTed against NCBI human germline V gene database to identify human VH germline sequences (i.e. human acceptor) with the highest identity to the camel antibodies. In the CDR grafting approach, CDRs of the human acceptors were replaced by those of the camel antibodies, which makes the straight-graft sequences. However, straight-graft antibodies often lose binding activity. To restore activity, framework residues critical for antibody functionality were replaced with the corresponding camel residues (i.e. back mutation) . Using this method, humanized variants H-48 (SEQ ID NO: 13) and H-22 (SEQ ID NO: 14) of the selected camel antibodies were designed.

[0430] The camel and humanized sdAb sequences were fused with human IgG1 hinge and Fc regions. The DNA encoding these HCAbs were synthesized and inserted into the pcDNA3.4 vector. HCAb expression plasmids were used to transfect Free-style 293 cells. Crude HCAb proteins secreted into the medium were subjected to affinity measurement using surface plasmon resonance (SPR) on a BIAcore T200 instrument (GE Healthcare) , as follows: The antibodies were captured onto the sensorchip pre-coated with goat-anti-human pAb (Jackson ImmunoResearch, 109-005-098) via interaction between polyclonal antibody and human Fc region. Increasing concentrations of human BCMA (ranging from 0.625 nM to 40 nM; ACRO Biosystems, BCA-H522y) were injected over the sensorchip surface and allowed to bind the captured antibody for 100 s followed by injection of running buffer to enable dissociation of the complex for 300s. After each cycle, the surface was regenerated with 50 mM HCl. The Langmuir model, describing a simple 1: 1 interaction where one ligand molecule interacts with one analyte, was applied to fit the experimental data and determine the kinetic values for the on-rate (ka) and off-rate (kd) . These values were used to calculate the equilibrium dissociation constant (KD) . According to the results summarized in Table 1, these two humanized antibodies retained their binding capability to human BCMA, with improved humanness predicted after humanization.

[0431] Table 1. Humanness and affinity of humanized sdAbs

[0432] Example 2: Plasmid construction and virus production

[0433] Constructs encoding chimeric antigen receptor (CAR) srespectively with non-humanized 48 (WT-48) , non-humanized 22 (WT-22) , humanized 48 (H-48) or humanized 22 (H-22) antigen-binding domains were designed in the format as shown in Table 2.

[0434] Table 2. Examples of anti-BCMA CAR constructs

[0435] Lentiviral vector pLVX-Puro (Clontech#632164) was modified by replacing the original promoter with human elongation factor 1α promoter (hEF1α) and by removing the puromycin resistance gene with EcoRI and BamHI to provide PLVX-EF1A. Each construct (SEQ ID NO. 1-4) was cloned into PLVX-EF1A, which was then subject to the lentivirus packaging procedure as described below.

[0436] To generate viral particles comprising nucleic acids of the target constructs above, lentivirus packaging plasmid mixture including pMDLg / pRRE (Addgene#11251) , pRSV-Rev (Addgene#11253) , and pMD2. G (Addgene#11259) were pre-mixed with a PLVX-EF1A vector (including a target construct) at a pre-optimized ratio with polyetherimide (PEI) , mixed properly, and incubated at room temperature for 5 minutes. The transfection mix was added dropwise to 293-T cells and mixed gently. Transfected 293-T cells were incubated overnight at 37℃ and 5%CO2. Twenty-four hours post-transfection, supernatants were collected and centrifuged at 4℃, 500 g for 10 minutes to remove any cellular debris. Centrifuged supernatants were filtered through a 0.45 μm PES filter to concentrate the viral supernatants post ultracentrifugation. After centrifugation, the supernatants were carefully discarded, and the virus pellets were rinsed with pre-chilled DPBS. The concentration of virus was measured. The virus was aliquoted and stored at -80℃. Viral titers were determined by functional transduction of a standard T cell line.

[0437] Constructs encoding chimeric antigen receptor (CAR) srespectively with non-humanized 48 CAR chain antigen-binding domains along with non-humanized 22 co-chain antigen-binding domains, humanized 48 CAR chain antigen-binding domains along with non-humanized 22 co-chain antigen-binding domains, non-humanized 48 CAR chain antigen-binding domains along with humanized 22 co-chain antigen-binding domains, or humanized 48 CAR chain antigen-binding domains along with humanized 22 co-chain antigen-binding domains were designed in the format as shown in Table 3.

[0438] Table 3. Examples of anti-BCMA Co-CAR constructs

[0439] To generate retroviral particles comprising nucleic acids of the target constructs above, RVV packaging plasmid mixture including a plasmid expressing MoMLV gag-pol and a plasmid expressing envelope protein was pre-mixed with a transfer plasmid (including a target construct) at a pre-optimized ratio with polyetherimide (PEI) , mixed properly, and incubated at room temperature for 10-15 minutes. The transfection mix was added dropwise to 293-T cells and mixed gently. Transfected 293-T cells were incubated 4-6 hours at 35℃ and 5%CO2, then discarded the cultured media and added fresh complete media. Forty-eight hours post-transfection, supernatants were collected and centrifuged at 4℃, 3000 rpm for 10 minutes to remove any cellular debris. Centrifuged supernatants were filtered through a 0.45 μm PES filter to concentrate the viral supernatants post ultracentrifugation. After centrifugation, the supernatants were carefully discarded, and the virus pellets were rinsed with pre-chilled DPBS. The concentration of virus was measured. The virus was aliquoted and stored at -80℃. Viral titers were determined by functional transduction of a standard T cell line.

[0440] Viruses encoding said designs (i.e., corresponding to SEQ ID NOs: 1-8) were selected for transduction of αβT or γδT cells following the quality evaluation.

[0441] Example 3. Preparation of CAR-αβT cells

[0442] αβT cells were isolated from Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) by Pan T Cell Isolation Kit (Miltenyi 130-096-535) and activated by T Cell Activation / Expansion Kit (Miltenyi 130-091-441) in cell culture medium 1 (AIM-V+5%FBS) . Approximately 48 h after activation, cells were transduced with lentiviral vectors encoding the constructs described in Table 1 respectively in cell culture medium 2 (AIM-V+5%FBS+300IU / ml IL-2) . On one day post-transduction, transduced αβT cells were harvested and resuspended in fresh cell culture medium 2 at the density of 0.2-0.3M / ml. Then, culture media 2 was added to maintain cell density at 0.5-0.7M / ml every other day. On five days post-transduction, αβT cells were harvested for quality assessment. The cell number was detected by Cellometer K2 (Nexcelom) . The Purity of αβT cells and transduction efficiency were detected by Flow Cytometry (BD) using Brilliant Violet 785TM conjugated anti-human CD3 Antibody (Biolegend, 344842) and Rabbit anti-camel sdAb pAb Alexa Fluor 488 (GenScript, C9042GH240) .

[0443] The purity (as determined by the percentage of CD3 positive cells) of both CAR-αβT was above 97%, and the transduction efficiency of WT-48 anti-BCMA CAR-αβT, H-48 anti-BCMA CAR-αβT, WT-22 anti-BCMA CAR-αβT and H-22 anti-BCMA CAR-αβT was 26.2%, 28.8%, 10.5%and 52.2%respectively (FIG. 1) . The results indicated that CAR constructions with humanized 48 antigen-binding domains or humanized 22 antigen-binding domains can be expressed normally by αβT cells, which is comparable to those with non-humanized antigen-binding domains. Both CAR-αβT cells were qualified for the following research.

[0444] Example 4. Long-term killing efficacy of CAR-αβT cells with humanized antigen-binding domains

[0445] To evaluate anti-tumor ability of CAR-αβT cells with humanized antigen-binding domains, long-term co-culture assays were performed to mimic the dynamic killing process in vivo. H-48 anti-BCMA CAR-αβT cells or H-22 anti-BCMA CAR-αβT cells (2×105 / well) , respectively, were co-cultured with MM. 1S target cells (4×105 well) at an E: T ratio of 1: 2 in 24-well plates. As a control, WT-48 anti-BCMA CAR-αβT cells or WT-22 anti-BCMA CAR-αβT cells were co-cultured with MM. 1S target cells respectively in the same experimental setting. Part of the cells were harvested and stained for CD3 after 2 or 3 days of co-culture. CAR-αβT cells were identified by CD3 and CAR signal. For serial co-culture assays, the remaining αβT cells were then re-challenged with fresh MM. 1S target cells (4×105 well) at the same E: T ratio. The αβT cell proliferation rate at each time point was calculated by dividing the number of αβT cells at the time point by the initial number of αβT cells.

[0446] The killing efficacy of CAR-αβT cells in the repeated tumor stimulation assay is shown in FIGs. 2A-2B. H-48 anti-BCMA CAR-αβT and WT-48 anti-BCMA CAR-αβT both became exhausted after 6 rounds of tumor stimulation (FIG. 2A) , meanwhile, WT-22 anti-BCMA CAR-αβT became exhausted after 6 rounds while H-22 anti-BCMA CAR-αβT killed tumor cells continuously (FIG. 2B) . These results indicated that tumor cytotoxicity of CAR-αβTs were comparable or better after humanizing WT-48 binders or WT-22 binders to H-48 binders or H-22 binders.

[0447] In terms of proliferation after targets stimulation, H-48 anti-BCMA CAR-αβT or H-22 anti-BCMA CAR-αβT showed very slight decrease in CAR-T cell expansion compared with WT-48 anti-BCMA CAR-αβT or WT-22 anti-BCMA CAR-αβT (FIGs. 2C-2D) . It indicated that binder humanization can affect CAR-αβT proliferation slightly, but not significantly, after tumor recognition.

[0448] Example 5. Preliminary evaluation of cytokine release of anti-BCMA CAR-αβT cells in long-term killing assays

[0449] The production of IFN-γ was detected to evaluate the safety of anti-BCMA CAR-αβT cells after tumor stimulation. Supernatants from the first three rounds of long-term killing assays were collected to assess CAR-induced cytokine release, and Homogeneous Time Resolved Fluorescence (HTRF) assays for IFN-γ (Cisbio) was performed according to the manufacturer’s manual.

[0450] As shown in FIGs. 3A-3B, the IFN-γ release of H-48 anti-BCMA CAR-αβT and H-22 anti-BCMA CAR-αβT cells was comparable to WT-48 anti-BCMA CAR-αβT and WT-22 anti-BCMA CAR-αβT, respectively. It indicated that CAR-αβT didn’ t show a risk rise after binder humanization when stimulated by targeting tumors only.

[0451] Example 6. Preparation of CAR-γδT cells

[0452] Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were seeded into G-Rex 24 well plates and stimulated by zoledronic acid (5μΜ) in Optimizer media (Gibco A10221-01) supplemented with 10%Human Platelet Lysate on day 0. On day 2, cells were transduced with retroviral vectors encoding the constructs described in Table 2. On one day post-transduction, 7 ml fresh cell culture media was added into each well. Then, culture media was half-replaced on day 7, day 9 and day 11.On day 13, γδT cells were harvested for quality assessment. The cell number was detected by Cellometer K2 (Nexcelom) . The Purity of γδT cells and transduction efficiency were detected by Flow Cytometry (BD) using APC conjugated anti-Human Vδ9 Antibody (Biolegend, 331310) , Brilliant Violet 421TM conjugated anti-human CD3 Antibody (Biolegend, 317344) and Rabbit anti-camel sdAb pAb Alexa Fluor 488 (GenScript, C9042GH240) .

[0453] The purity (as determined by the percentage of Vδ9 positive and CD3 positive cells) of both CAR-γδT was above 95%, and the transduction efficiency of anti-BCMA Co-CAR-γδT, H48 anti-BCMA Co-CAR-γδT, H22 anti-BCMA Co-CAR-γδT and H48-22 anti-BCMA Co-CAR-γδT was 34.9%, 41.0%, 50.5%and 22.7%respectively (FIG. 4) . The results indicated that CAR constructions with humanized 48 antigen-binding domains or humanized 22 antigen-binding domains can be expressed normally by γδT cells, which is comparable to those with non-humanized antigen-binding domains. All CAR-γδT cells were qualified for the following research. Example 7. Comparison of cytokine release safety between CAR-γδT cells with humanized or non-humanized antigen-binding domains in MLR assays

[0454] To preclinically evaluate the cytokine release safety of CAR-γδT with humanized antigen-binding domains (H48 anti-BCMA Co-CAR-γδT, H22 anti-BCMA Co-CAR-γδT and H48-22 anti-BCMA Co-CAR-γδT) when encountered with PBMC and tumor cells, and to compare it with that of CAR-γδT with non-humanized antigen-binding domains (Anti-BCMA Co-CAR-γδT) , the production of pro-inflammatory cytokines such as IFN-γ, GM-CSF and IL-6 were detected in Mixed Lymphocyte Reaction (MLR) assays. MLR assays were performed to mimic interaction system of the host cell and tumor cells with CAR-γδT cells in vivo. PBMC and tumor cells were co-cultured with anti-BCMA Co-CAR-γδT, H48 anti-BCMA Co-CAR-γδT, H22 anti-BCMA Co-CAR-γδT or H48-22 anti-BCMA Co-CAR-γδT, respectively, at a ratio of 1: 1: 1. Next, collecting supernatants from the MLR assays after 6h, 24h, 48h and 120h co-culture followed by CAR-induced cytokine release detection. Homogeneous Time Resolved Fluorescence (HTRF) assays for IFN-γ, GM-SCF and IL-6 (Cisbio) were performed according to the manufacturer’s manual.

[0455] As shown in FIG. 5A and FIG. 5B, it was obvious that H48 anti-BCMA Co-CAR-γδT, H22 anti-BCMA Co-CAR-γδT and H48-22 anti-BCMA Co-CAR-γδT cells secreted lower amount of IFN-γ or GM-CSF compared with anti-BCMA Co-CAR-γδT cells, and these trends are most significant at the 48h or 120h respectively. Meanwhile, IL-6, mostly secreted by host immune cells after co-cultured with allogeneic CAR-T cells, decreased in the co-culture groups of H48 anti-BCMA Co-CAR-γδT, H22 anti-BCMA Co-CAR-γδT and H48-22 anti-BCMA Co-CAR-γδT cells compared to that of anti-BCMA Co-CAR-γδT cells (FIG. 5C) . The above results indicated that binder humanization has the potential to reduce cytokine release risk of CAR-T cell infusion, which was achieved by reducing cytokines released by CAR-Ts themselves or by host immune cells.

[0456] Example 8. Evaluation of anti-tumor ability of CAR-γδT cells with humanized antigen-binding domains

[0457] Long-term co-culture assays were performed to figure out effects of binder humanization on CAR-γδT anti-tumor cytotoxicity and proliferation. H48 anti-BCMA Co-CAR-γδT, H22 anti-BCMA Co-CAR-γδT or H48-22 anti-BCMA Co-CAR-γδT cells (2×105 / well) , respectively, were co-cultured with NCI-H929 target cells (2×105 / well) at an E: T ratio of 1: 1 in 24-well plates. Meanwhile, anti-BCMA Co-CAR-γδT cells were co-cultured with tumor cells at the same E: T ratio as a control group. After 2 or 3 days of co-culture, part of the cells was harvested for cell counting and flow cytometry detection, in which cells were labeled with CD3, γ9 and CAR signal. For serial co-culture assays, the remaining γδT cells were then re-challenged with fresh NCI-H929 target cells (2×105 / well) at the same E: T ratio. The number of CAR-γδT cells was calculated based on the CD3, γ9 and CAR positive signals and total cell numbers. And the CAR-γδT cell proliferation rate at each time point was calculated by dividing the number of CAR-γδT cells at the time point by the initial number of CAR-γδT cells.

[0458] Tumor killing efficacy and expansion of CAR-γδT cells are shown in FIGs. 6A-6B. H22 anti-BCMA Co-CAR-γδT and H48-22 anti-BCMA Co-CAR-γδT both showed one round longer tumor rechallenge rounds than anti-BCMA Co-CAR-γδT, indicating significantly better anti-tumor efficacy. H48 anti-BCMA Co-CAR-γδT became exhausted at the same round to anti-BCMA Co-CAR-γδT, which means that it has the comparable anti-tumor efficacy to anti-BCMA Co-CAR-γδT. In terms of CAR-γδT cells expansion, H48-22 anti-BCMA Co-CAR-γδT cells have stronger proliferation level while H22 anti-BCMA Co-CAR-γδT and H48 anti-BCMA Co-CAR-γδT showed slightly weaker proliferation level than anti-BCMA Co-CAR-γδT.

[0459] To summary, taking both efficacy and proliferation into consideration, humanization of antigen-recognition domains has no side effect on anti-malignancy efficacy. Moreover, applying humanized binders to both CAR chain and co-chain (designed as H48-22 anti-BCMA Co-CAR-γδT) can further improve CAR-T cell anti-tumor ability in terms of efficacy and expansion.

[0460] SEQUENCE LISTING

[0461] SEQ ID NO: 1 (WT-48 anti-BCMA CAR with a signal peptide)

[0462] SEQ ID NO: 2 (WT-22 anti-BCMA CAR with a signal peptide)

[0463] SEQ ID NO: 3 (H-48 anti-BCMA CAR with a signal peptide)

[0464] SEQ ID NO: 4 (H-22 anti-BCMA CAR with a signal peptide)

[0465] SEQ ID NO: 5 (anti-BCMA Co-CAR with a signal peptide)

[0466] SEQ ID NO: 6 (H48 anti-BCMA Co-CAR with a signal peptide)

[0467] SEQ ID NO: 7 (H22 anti-BCMA Co-CAR with a signal peptide)

[0468] SEQ ID NO: 8 (H48-22 anti-BCMA Co-CAR with a signal peptide)

[0469] SEQ ID NO: 9 (WT-48 anti-BCMA CAR without a signal peptide)

[0470] SEQ ID NO: 10 (WT-22 anti-BCMA CAR without a signal peptide)

[0471] SEQ ID NO: 11 (H-48 anti-BCMA CAR without a signal peptide)

[0472] SEQ ID NO: 12 (H-22 anti-BCMA CAR without a signal peptide)

[0473] SEQ ID NO: 13 (H-48 sdAb)

[0474] SEQ ID NO: 14 (H-22 sdAb)

[0475] SEQ ID NO: 15 (WT-48 sdAb)

[0476] SEQ ID NO: 16 (WT-22 sdAb)

[0477] Table B

[0478] SEQ ID NO: 29 (WT-48 sdAb-TLR4 hinge TLR4 TM-TLR4 IC with a signal peptide)

[0479] SEQ ID NO: 30 (WT-22 sdAb-TLR4 hinge TLR4 TM-TLR4 IC with a signal peptide)

[0480] SEQ ID NO: 31 (H-48 sdAb-TLR4 hinge TLR4 TM-TLR4 IC with a signal peptide)

[0481] SEQ ID NO: 32 (H-22 sdAb-TLR4 hinge TLR4 TM-TLR4 IC with a signal peptide)

[0482] SEQ ID NO: 33 (WT-48 sdAb-TLR4 hinge TLR4 TM-TLR4 IC without a signal peptide)

[0483] SEQ ID NO: 34 (WT-22 sdAb-TLR4 hinge TLR4 TM-TLR4 IC without a signal peptide)

[0484] SEQ ID NO: 35 (H-48 sdAb-TLR4 hinge TLR4 TM-TLR4 IC without a signal peptide)

[0485] SEQ ID NO: 36 (H-22 sdAb-TLR4 hinge TLR4 TM-TLR4 IC without a signal peptide)

[0486] SEQ ID NO: 37 (CD8α signal peptide)

[0487] SEQ ID NO: 38 (CD8α hinge domain)

[0488] SEQ ID NO: 39 (CD8α transmembrane domain)

[0489] SEQ ID NO: 40 (4-1BB co-stimulatory signaling domain)

[0490] SEQ ID NO: 41 (CD3ζ cytoplasmic domain)

[0491] SEQ ID NO: 42 (CD28 co-stimulatory signaling domain)

[0492] SEQ ID NO: 43 (CD28 hinge domain)

[0493] SEQ ID NO: 44 (CD28 transmembrane domain)

[0494] SEQ ID NO: 45 (TLR4 hinge)

[0495] SEQ ID NO: 46 (TLR4 transmembrane domain)

[0496] SEQ ID NO: 47 (TLR4 cytoplasmic domain)

Claims

1.A B-cell maturation antigen (BCMA) binding molecule, comprising a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of the CDR1, CDR2, and CDR3, respectively, as set forth in SEQ ID NO: 13-16.2.The BCMA binding molecule of claim 1, wherein the CDR1, CDR2 and / or CDR3 are determined according to the AbM numbering scheme, the IMGT numbering scheme, the Kabat numbering scheme, the Chothia numbering scheme, the Contact numbering scheme, or any combination thereof.3.The BCMA binding molecule of claim 1, wherein the CDR1, CDR2 and / or CDR3 are determined according to the AbM numbering scheme.4.A BCMA binding molecule, comprising(1) a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, and SEQ ID NO: 25, respectively; or(2) a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, and SEQ ID NO: 28, respectively.5.The BCMA binding molecule of any one of claims 1-4, wherein the binding molecule further comprising framework regions (FRs) .6.The BCMA binding molecule of claim 5, wherein the framework regions are derived from a human immunoglobulin heavy chain variable region sequence.7.The BCMA binding molecule of any one of claims 1-6, wherein the binding molecule comprises the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 13-16, or an amino acid sequence having at least 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%sequence identity to the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 13-16.8.The BCMA binding molecule of any one of claims 1-7, wherein the binding molecule is an antibody or antigen binding fragment thereof.9.The BCMA binding molecule of claim 8, wherein the antibody or antigen binding fragment thereof is a murine, camelid, chimeric, human, or humanized antibody or fragment.10.The BCMA binding molecule of claim 8, wherein the antibody or antigen binding fragment thereof is monospecific, bispecific or multispecific.11.The BCMA binding molecule of claim 8, wherein the antibody or antigen binding fragment thereof is a Fab, a Fab′, a F (ab′) 2, a Fv, VHH, a single chain Fv (scFV) , a single domain antibody (sdAb) , a minibody, a diabody, an antibody mimetic or chemically linked F (ab′) 2.12.The BCMA binding molecule of claim 8, wherein the antibody comprises a Fc region, optionally the Fc region is the Fc of human IgG1, IgG2, IgG3 or IgG4.13.The BCMA binding molecule of any one of claims 1-12, wherein the binding molecule is a fusion protein.14.A nucleic acid comprising a nucleotide sequence encoding the binding molecule of any one of claims 1-13.15.A vector comprising the nucleic acid of claim 14.16.A cell comprising the nucleic acid of claim 14 or the vector of claim 15.17.The BCMA binding molecule of any one of claims 1-12, wherein the binding molecule is an immunoconjugate.18.The BCMA binding molecule of claim 17, wherein the immunoconjugate is an antibody-drug conjugate (ADC) further comprising a cytotoxic drug or a therapeutic radioisotope.19.A chimeric antigen receptor (CAR) comprising:(a) an extracellular antigen-binding domain comprising the binding molecule of any one of claims 1-11;(b) a transmembrane domain; and(c) an intracellular signaling domain.20.The CAR of claim 19, wherein the transmembrane domain is derived from a molecule selected from a group consisting of CD8α, CD4, CD28, CD137, CD80, CD86, CD152, and PD-1.21.The CAR of claim 19 or 20, wherein the intracellular signaling domain comprises a primary intracellular signaling domain of an immune effector cell.22.The CAR of claim 21, wherein the primary intracellular signaling domain is derived from a molecule selected from a group consisting of CD3ζ, FcRγ, FcRβ, CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD5, CD22, CD79a, CD79b and CD66d.23.The CAR of any one of claims 19-22, wherein the intracellular signaling domain comprises a co-stimulatory signaling domain.24.The CAR of claim 23, wherein the co-stimulatory signaling domain is derived from a co-stimulatory molecule selected from the group consisting of CD27, CD28, CD137, OX40, CD30, CD40, CD3, LFA-1, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, ligands of CD83, and any combination thereof.25.The CAR of any one of claims 19-24, wherein the CAR further comprising a hinge.26.The CAR of claim 25, wherein the hinge domain is derived from a molecule selected from a group consisting of CD8α, CD28 and IgG4.27.The CAR of any one of claims 19-26, wherein the CAR comprising an amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 9-12.28.The CAR of any one of claims 19-27, wherein the CAR further comprising a signal peptide.29.The CAR of claim 28, wherein the signal peptide is derived from CD8α, optionally wherein the signal peptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 37.30.A nucleic acid comprising a nucleotide sequence encoding the CAR of any one of claims 19-29.31.A vector comprising the nucleic acid of claim 30.32.An engineered immune cell, comprising the CAR of any one of claims 19-29, the nucleic acid of claim 30, or the vector of claim 31.33.An engineered immune cell comprising(i) the CAR of any one of claims 19-29; and(ii) a Toll-like receptor (TLR) co-stimulatory molecule.34.The engineered immune cell of claim 33, wherein the TLR co-stimulatory molecule comprises a) a first polypeptide comprising: i) a first target binding domain, ii) a first TLR transmembrane domain, and iii) a first TLR signaling domain; andb) a second polypeptide comprising: i) a second target binding domain, ii) a second TLR transmembrane domain, and iii) a second TLR signaling domain;wherein upon binding of the first target binding domain and second target binding domain to their corresponding target, the first TLR signaling domain and the second TLR signaling domain associate with each other to form a TLR signaling moiety capable of inducing TLR signaling.35.The engineered immune cell of claim 34, wherein the first target binding domain and the second target binding domain bind to the same target molecule.36.The engineered immune cell of claim 34 or 35, wherein the first TLR transmembrane domain and the first TLR signaling domain are derived from the same TLR molecule and / or the second TLR transmembrane domain and the second TLR signaling domain are derived from the same TLR molecule.37.The engineered immune cell of any one of claims 34-36, wherein the first TLR transmembrane domain and the second TLR transmembrane domain are the same and / or the first TLR signaling domain and the second TLR signaling domain are the same.38.The engineered immune cell of claim 37, wherein the first TLR transmembrane domain and / or first TLR signaling domain are derived from TLR4.39.The engineered immune cell of any one of claims 34-38, wherein the first target binding domain and / or second target binding domain is a scFv or sdAb.40.The engineered immune cell of claim 39, wherein the scFv or sdAb specifically binds to BCMA.41.The engineered immune cell of claim 40, wherein the sdAb comprising a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of the CDR1, CDR2, and CDR3, respectively, as set forth in SEQ ID NO: 13-16.42.The engineered immune cell of claim 41, wherein the sdAb comprising(1) a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, and SEQ ID NO: 25, respectively; or(2) a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, and SEQ ID NO: 28, respectively.43.The engineered immune cell of claim 41 or 42, wherein the sdAb comprises the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 13-16, or an amino acid sequence having at least 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%sequence identity to the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 13-16.44.The engineered immune cell of any one of claims 33-43, wherein the TLR co-stimulatory molecule comprises an amino acid sequence having at least about 95%sequence identity to an amino acid sequence of SEQ ID NOs: 33-36.45.The engineered immune cell of any one of claims 33-44, wherein the TLR co-stimulatory molecule further comprising a signal peptide.46.The engineered immune cell of any one of claims 34-45, wherein the engineered immune cell comprises a first nucleic acid encoding the CAR, a second nucleic acid encoding the first polypeptide and a third nucleic acid encoding the second polypeptide.47.The engineered immune cell of any one of claims 34-45, wherein the first polypeptide and the second polypeptide are the same, and wherein the engineered immune cell comprises a first nucleic acid encoding the CAR and a second nucleic acid encoding the first polypeptide and the second polypeptide.48.The engineered immune cell of claim 47, wherein the first nucleic acid and the second nucleic acid are on the same vector.49.The engineered immune cell of claim 47 or 48, wherein the first nucleic acid encoding the CAR is linked to the second nucleic acid encoding the first polypeptide and the second polypeptide through a nucleic acid encoding a 2A self-cleaving peptide.50.The engineered immune cell of claim 49, wherein the 2A self-cleaving peptide is a T2A peptide or a P2A peptide.51.The engineered immune cell of any of claims 47-50, the nucleic acid encoding a polypeptide having at least about 95%sequence identity to an amino acid sequence of SEQ ID NOs: 5-8.52.The engineered immune cell of any one of claims 32-51, wherein the immune cell is a T cell (e.g., αβ T cell, γδ T cell) , NK cell, NKT, monocyte, dendritic cell, macrophage, B cell, peripheral blood mononuclear cell (PBMC) , hematopoietic stem cell, pluripotent stem cell, an embryonic stem cell, or any combination thereof.53.A pharmaceutical composition, comprising the binding molecule of any one of claims 1-13, 17-18, or the nucleic acid of claim 14 or 30, or the vector of claim 15 or 31, or the cell of claim 16 or the engineered immune cell of any one of claims 32-52, and a pharmaceutically acceptable carrier and / or excipient.54.A method for preventing and / or treating a disease or disorder in a subject, wherein the method comprises administering to a subject in need thereof the BCMA binding molecule of any one of claims 1-13, 17-18, the cell of claim 16, the engineered immune cell of any one of claims 32-52, and / or the pharmaceutical composition of claim 53.55.The method of claim 54, wherein the disease or disorder is an autoimmune disease, a tumor or cancer.56.The method of claim 55, wherein the autoimmune disease is systemic lupus erythematosus (SLE) .57.The method according to any one of claims 55, wherein the tumor or cancer is multiple myeloma (MM) .

Images