Novel cleavable peptide and use thereof

Abstract

Provided is a D-peptide linker comprising one or more D-amino acid residues and its use as a cathepsin B–cleavable linker in conjugates, including antibody–drug conjugates (ADCs). In certain embodiments, further relates to conjugates comprising the D-peptide linker and a therapeutic and / or diagnostic agent. The D-peptide linker may exhibit improved aqueous solubility and enhanced stability against plasma proteases, and may facilitate intracellular cleavage and payload release to enhance the biological activity of the conjugates. In some embodiments, the linker provides advantages in solubility and / or stability relative to selected hydrophobic peptide linkers.

Description

NOVEL CLEAVABLE PEPTIDE AND USE THEREOFField of the Invention

[0001] The present disclosure relates to a D-peptide comprising a D-amino acid residue and use thereof as a cleavable linker for ADC, therapeutic use or detection and diagnosis purposes. The present disclosure also relates to a conjugate comprising the D-peptide as a cleavable linker, such as ADC or other conjugates for medical use or detection and diagnosis purposes.Background of the Invention

[0002] Biomolecules in living organisms, such as DNA, RNA, and proteins, predominantly exist in a single enantiomeric form, a phenomenon known as homochirality (1, 2) . RNA and DNA are composed of D-nucleotides, while proteins are made of L-amino acids and the achiral glycine. It is well-established that interactions between natural biomolecules are based on homochiral recognitions, where L-proteins bind to other L-proteins or D-RNA / D-DNA. When the chirality of either binding partner is inversed, molecular binding is generally lost (FIG. 1A) . However, if the chirality of both binding partners is reversed, binding can still be retained (FIG. 1A) (3-5) . Proteases, as a crucial class of biomolecules, generally adhere to the well-established dogma of homochiral recognition (FIG. 1B) . Thus, it appears that heterochiral recognition-the ability of L-proteins to recognize D-proteins or D-polypeptides-does not exist in nature, as L-proteins have evolved specifically to interact with L-protein ligands (FIG. 1) .

[0003] Although homochiral recognition is the norm in biological systems, the presence of D-amino acids in specific contexts-such as in bacterial cell walls-hints at possible roles for heterochiral recognition, where L-proteins interact D-peptides. For instance, VanX and DD-transpeptidase can recognize D-Ala-D-Ala during the synthesis of bacteria cell wall peptidoglycan (6, 7) . Alkaline D-peptidase (Adp) (8) isolated from soil microorganisms was also reported to recognize D-amino acid in short mirror image peptides. However, these bacterial enzymes evolved to interact with the D-peptide substrates and generally exhibit chiral fidelity, as they fail to recognize the corresponding L-peptides. In eukaryotes, where D-amino acids are rarely utilized, such heterochiral recognition has yet to be observed.

[0004] While heterochiral recognition-interactions between L-proteins and D-proteins or D-polypeptides-is extremely rare in nature, it can be achieved artificially through molecular engineering. Techniques such as mirror-image phage display and de novo protein design have been used to develop D-peptides and D-proteins capable of binding to L-proteins (4, 9-12) . However, these artificially developed mirror-image biomolecules remain faithful to their designed targets; inversing the chirality of either binding partner will still disrupt the interaction. Interestingly, the Kay group reported that a natural bacterial chaperon system GroEL / ES, could fold both natural and mirror-image versions of the protein DapA (13) . However, the chaperone-mediated folding is based on nonspecific hydrophobic interactions and no chiral specificity is required. Thus, the phenomenon of ambidextrous recognition-where an L-protein would interact with both L-and D-enantiomers of another protein or peptide-does not appear to occur in nature when chiral-specific recognition is required. Although homochiral recognition is a well-established and widely accepted principle for natural biomolecules, we remain intrigued by the potential of biomolecules’ heterochiral recognition capability (FIG. 1B) .

[0005] To date, no proteases have been identified that can specifically recognize both L-and D-configurations of the same peptide substrates. Furthermore, no eukaryotic proteases have been shown to hydrolyze D-peptide substrates, suggesting that higher organisms lack the capability for heterochiral recognition, likely due to the rarity of D-peptides in these systems (FIG. 1B) .

[0006] Cathepsin B is implicated in various physiological and pathological processes (19, 20) . For instance, cathepsin B is overexpressed in many tumors, which has been utilized to design cleavable linkers for payload release in antibody-drug conjugates (ADCs) (19, 21) . Currently, the most commonly used enzyme-cleavable linkers are based on short peptides, such as -Gly-Gly-Phe-Gly- (-GGFG-) and -Val-Cit- (-VC-) , which are found in commercially available antibody-drug conjugates (ADCs) (22) . Most of the current peptide linkers used in ADCs are hydrophobic, and the use of hydrophobic peptide linkers in ADCs may lead to aggregation, DAR limitation, premature drug release and other problems, affecting the stability and efficacy of the drug.

[0007] In order to overcome these problems, there is an urgent need in the art to research and develop new linkers to improve the stability and therapeutic effect of ADCs.Summary of the Invention

[0008] In studying the heterochiral recognition potential of eukaryotic proteases for mirror-image D-peptide substrates, the inventors unexpectedly discovered that human cathepsin B can efficiently hydrolyze D-peptide substrates with high sequence specificity (FIG. 2A) . This discovery offers the first evidence that eukaryotic proteases possess the capability for heterochiral recognition of D-peptide substrates, in addition to their traditional homochiral recognition of L-peptide substrates. At the same time, the inventors surprisingly developed a group of D-peptides containing D-amino acids, which can be efficiently hydrolyzed by human cathepsin B. In other words, the inventors developed a new group of recognition sequences for human cathepsin B, which can be included in larger molecules such as peptides, proteins, ADCs, etc., and can be recognized and cleaved by human cathepsin B in appropriate environment to achieve the desired physiological activity. In addition, the D-peptide configuration ensures higher stability in plasma and prolonged blood circulation, which helps to improve the overall stability of ADC and can release drugs more effectively in the tumor microenvironment. This design helps to improve the efficacy of the drug and reduce systemic toxicity.

[0009] In a first aspect, the present disclosure provides a recognition sequence for human cathepsin B comprising an amino acid sequence of Formula (I) :

[0010] P5-P4-P3-P2-P1 / -P1’ (I)

[0011] wherein

[0012] P1 is selected from the group consisting of Gly; D-His, D-Ser, and a protected / modified form thereof; preferably, selected from Gly and a protected / modified form thereof;

[0013] P2 is a D-amino acid selected from the group consisting of D-Tyr, D-Trp, D-Phe, D-Pro, D-Val, D-His, D-Arg, D-Lys, D-Ser, D-Ala, D-Leu, D-Glu, and a protected / modified form thereof,

[0014] preferably, a D-amino acid selected from the group consisting of D-Tyr, D-Trp, D-Phe, D-His, D-Leu, D-Glu, and a protected / modified form thereof,

[0015] more preferably, a D-amino acid selected from the group consisting of D-Tyr, D-Phe, and a protected / modified form thereof;

[0016] P3 is a D-amino acid selected from the group consisting of D-Tyr, D-His, D-Trp, D-Phe, D-Ser, D-Lys, D-Arg, D-Gln, D-Leu, D-Pro, D-Glu, D-Ala, D-Val, D-Asp, D-Ile, D-Thr, D-Asn, and a protected / modified form thereof,

[0017] preferably, a D-amino acid selected from the group consisting of D-Tyr, D-His, D-Trp, D-Phe, D-Ser, D-Lys, D-Arg, D-Gln, D-Leu, D-Pro, D-Glu, D-Ala, D-Val, D-Asp, D-Thr, and a protected / modified form thereof,

[0018] more preferably, a D-amino acid selected from the group consisting of D-Tyr, D-His, D-Trp, D-Phe, D-Ala, D-Thr, and a protected / modified form thereof,

[0019] even more preferably, a D-amino acid selected from the group consisting of D-Tyr, D-His, and a protected / modified form thereof,

[0020] even more preferably, a D-amino acid selected from the group consisting of D-Tyr, and a protected / modified form thereof;

[0021] P4 is absent or a D-amino acid selected from the group consisting of D-His, D-Lys, D-Arg, D-Phe, D-Trp, D-Tyr, D-Leu, D-Pro, D-Gln, D-Ser, D-Glu, D-Ala, D-Val, D-Ile, D-Thr, D-Asn, D-Asp, and a protected / modified form thereof,

[0022] preferably, a D-amino acid selected from the group consisting of D-His, D-Lys, D-Arg, D-Phe, D-Trp, D-Tyr, D-Leu, D-Pro, D-Gln, D-Ser, D-Glu, and a protected / modified form thereof,

[0023] more preferably, a D-amino acid selected from the group consisting of D-His, D-Lys, D-Arg, D-Phe, D-Trp, D-Gln, D-Val, D-Thr, and a protected / modified form thereof, even more preferably, a D-amino acid selected from the group consisting of D-His, D-Lys, D-Arg, D-Phe, and a protected / modified form thereof,

[0024] even more preferably, a D-amino acid selected from the group consisting of D-Lys, and a protected / modified form thereof;

[0025] P5 is absent or a D-amino acid selected from the group consisting of D-Arg, D-Lys, D-His, D-Phe, D-Trp, D-Leu, D-Tyr, D-Pro, D-Gln, D-Ser, D-Glu, D-Ala, D-Val, D-Ile, D-Thr, D-Asn, D-Asp, and a protected / modified form thereof,

[0026] preferably, a D-amino acid selected from the group consisting of D-Arg, D-Lys, D-His, D-Phe, D-Trp, D-Leu, D-Tyr, D-Pro, D-Gln, D-Ser, D-Glu, and a protected / modified form thereof,

[0027] more preferably, a D-amino acid selected from the group consisting of D-Arg, D-Lys, D-His, D-Leu, D-Tyr, D-Gln, and a protected / modified form thereof,

[0028] even more preferably, a D-amino acid selected from the group consisting of D-Arg, and a protected / modified form thereof;

[0029] P1’ is absent or a D-amino acid selected from the group consisting of D-Trp, D-Phe, D-Tyr, D-Leu, D-Glu, D-Gln, D-His, D-Ser, D-Ala, D-Val, D-Ile, D-Thr, D-Asn, D-Asp, and a protected / modified form thereof,

[0030] preferably, is absent or a D-amino acid selected from the group consisting of D-Trp, D-Phe, D-Tyr, D-Leu, D-Glu, D-Gln, D-His, D-Ser, D-Ala, and a protected / modified form thereof;

[0031] more preferably, is absent or a D-amino acid selected from the group consisting of D-Trp, and a protected / modified form thereof;

[0032] “ / ” denotes to cleavage site where the recognition sequence is cleaved by human cathepsin B,

[0033] or a fragment thereof comprising the cleavage site “ / ” .

[0034] In some embodiments, the recognition sequence for human cathepsin B is a recognition sequence that is cleavable by human cathepsin B.

[0035] In some embodiments, the fragment comprises at least P2-P1 / -P1’ and is cleavable by human cathepsin B.

[0036] In some embodiments, the fragment thereof is contiguous peptide fragment comprising residues P3-P2-P1 / -P1’ of Formula (I) .

[0037] In a second aspect, the present disclosure provides a macromolecule comprising the recognition sequece for human cathepsin B comprising an amino acid sequence of Formula (I) of the present disclosure:

[0038] P5-P4-P3-P2-P1 / -P1’ (I)

[0039] wherein P1, P21, P31, P41, P5, P1’ , and “ / ” are provided as herein,

[0040] and the macromolecule includes but not limited to peptide, protein, ligand-therapeutic agent conjugate, antibody-drug conjugate, and the like.

[0041] In a third aspect, the present disclosure provides a peptide comprising an amino acid sequence of formula (II)

[0042] Pn…-P6-P5-P4-P3-P2-P1-P1’ -P2’ -…Pm’ (II)

[0043] wherein

[0044] n is an integer not greater than 8;

[0045] m is an integer not greater than 4;

[0046] P1 is selected from the group consisting of Gly; D-His, D-Ser, and a protected / modified form thereof; preferably, selected from Gly and a protected / modified form thereof;

[0047] P2 is a D-amino acid selected from the group consisting of D-Tyr, D-Trp, D-Phe, D-Pro, D-Val, D-His, D-Arg, D-Lys, D-Ser, D-Ala, D-Leu, D-Glu, and a protected / modified form thereof,

[0048] preferably, a D-amino acid selected from the group consisting of D-Tyr, D-Trp, D-Phe, D-His, D-Leu, D-Glu, and a protected / modified form thereof,

[0049] more preferably, a D-amino acid selected from the group consisting of D-Tyr, D-Phe, and a protected / modified form thereof;

[0050] P3 is a D-amino acid selected from the group consisting of D-Tyr, D-His, D-Trp, D-Phe, D-Ser, D-Lys, D-Arg, D-Gln, D-Leu, D-Pro, D-Glu, D-Ala, D-Val, D-Asp, D-Ile, D-Thr, D-Asn, and a protected / modified form thereof,

[0051] preferably, a D-amino acid selected from the group consisting of D-Tyr, D-His, D-Trp, D-Phe, D-Ser, D-Lys, D-Arg, D-Gln, D-Leu, D-Pro, D-Glu, D-Ala, D-Val, D-Asp, D-Thr, and a protected / modified form thereof,

[0052] more preferably, a D-amino acid selected from the group consisting of D-Tyr, D-His, D-Trp, D-Phe, D-Ala, D-Thr, and a protected / modified form thereof,

[0053] even more preferably, a D-amino acid selected from the group consisting of D-Tyr, D-His, and a protected / modified form thereof,

[0054] even more preferably, a D-amino acid selected from the group consisting of D-Tyr, and a protected / modified form thereof;

[0055] P4 is absent or a D-amino acid selected from the group consisting of D-His, D-Lys, D-Arg, D-Phe, D-Trp, D-Tyr, D-Leu, D-Pro, D-Gln, D-Ser, D-Glu, D-Ala, D-Val, D-Ile, D-Thr, D-Asn, D-Asp, and a protected / modified form thereof,

[0056] preferably, a D-amino acid selected from the group consisting of D-His, D-Lys, D-Arg, D-Phe, D-Trp, D-Tyr, D-Leu, D-Pro, D-Gln, D-Ser, D-Glu, and a protected / modified form thereof,

[0057] more preferably, a D-amino acid selected from the group consisting of D-His, D-Lys, D-Arg, D-Phe, D-Trp, D-Gln, D-Val, D-Thr, and a protected / modified form thereof, even more preferably, a D-amino acid selected from the group consisting of D-His, D-Lys, D-Arg, D-Phe, and a protected / modified form thereof,

[0058] even more preferably, a D-amino acid selected from the group consisting of D-Lys, and a protected / modified form thereof;

[0059] P5 is absent or a D-amino acid selected from the group consisting of D-Arg, D-Lys, D-His, D-Phe, D-Trp, D-Leu, D-Tyr, D-Pro, D-Gln, D-Ser, D-Glu, D-Ala, D-Val, D-Ile, D-Thr, D-Asn, D-Asp, and a protected / modified form thereof,

[0060] preferably, a D-amino acid selected from the group consisting of D-Arg, D-Lys, D-His, D-Phe, D-Trp, D-Leu, D-Tyr, D-Pro, D-Gln, D-Ser, D-Glu, and a protected / modified form thereof,

[0061] more preferably, a D-amino acid selected from the group consisting of D-Arg, D-Lys, D-His, D-Leu, D-Tyr, D-Gln, and a protected / modified form thereof,

[0062] even more preferably, a D-amino acid selected from the group consisting of D-Arg, and a protected / modified form thereof;

[0063] each of P6 to Pn is independently absent, a L-amino acid, or a D-amino acid;

[0064] P1’ is absent or a D-amino acid selected from the group consisting of D-Trp, D-Phe, D-Tyr, D-Leu, D-Glu, D-Gln, D-His, D-Ser, D-Ala, D-Val, D-Ile, D-Thr, D-Asn, D-Asp, and a protected / modified form thereof,

[0065] preferably, is absent or a D-amino acid selected from the group consisting of D-Trp, D-Phe, D-Tyr, D-Leu, D-Glu, D-Gln, D-His, D-Ser, D-Ala, and a protected / modified form thereof;

[0066] more preferably, is absent or a D-amino acid selected from the group consisting of D-Trp, and a protected / modified form thereof;

[0067] each of P2’ to Pm’ is independently absent, a L-amino acid, or a D-amino acid.

[0068] As used herein, the term “protected / modified form” refers to the protected form and / or modified form of amino acids. The protected form of amino acids comprises a form in which the amino group is protected using a group such as Boc or Fmoc, and a form in which the carboxyl group is protected by forming an ester such as methyl ester or ethyl ester. The modified form of amino acids includes, but is not limited to, methylation, phosphorylation, acetylation, glycosylation and hydroxylation of amino acids.

[0069] In a fourth aspect, the present disclosure provides use of the peptide of the present disclosure as a linker for ligand-therapeutic agent conjugate including ADC, therapeutic use, detection, and / or diagnosis.

[0070] In some embodiments, the linker moiety is cleavable by human cathepsin B.

[0071] The present disclosure provides a method of preparing a ligand-therapeutic agent conjugate, comprising covalently linking (i) a ligand component and (ii) a therapeutic agent through a linker moiety comprising the peptide of the present disclosure or the linker moiety of the present disclosure.

[0072] The present disclosure provides use of the peptide of the present disclosure, or the linker moiety of the present disclosure, as a cleavable linker moiety in a ligand-therapeutic agent conjugate.

[0073] The present disclosure provides an in vitro method for detecting cathepsin B activity in a sample, comprising contacting the sample with a substrate comprising the recognition sequence of the present disclosure or the peptide of the present disclosure, and detecting cleavage at the “ / ” site.

[0074] In a fifth aspect, the present disclosure provides a linker moiety comprising an amino acid sequence of formula (III)

[0075] -NHPn…-P6-P5-P4-P3-P2-P1-P1’ -P2’ -…Pm’ C=O- (III)

[0076] wherein

[0077] n is an integer not greater than 8;

[0078] m is an integer not greater than 4;

[0079] P1 is selected from the group consisting of Gly; D-His, D-Ser, and a protected / modified form thereof; preferably, selected from Gly and a protected / modified form thereof;

[0080] P2 is a D-amino acid selected from the group consisting of D-Tyr, D-Trp, D-Phe, D-Pro, D-Val, D-His, D-Arg, D-Lys, D-Ser, D-Ala, D-Leu, D-Glu, and a protected / modified form thereof,

[0081] preferably, a D-amino acid selected from the group consisting of D-Tyr, D-Trp, D-Phe, D-His, D-Leu, D-Glu, and a protected / modified form thereof,

[0082] more preferably, a D-amino acid selected from the group consisting of D-Tyr, D-Phe, and a protected / modified form thereof;

[0083] P3 is a D-amino acid selected from the group consisting of D-Tyr, D-His, D-Trp, D-Phe, D-Ser, D-Lys, D-Arg, D-Gln, D-Leu, D-Pro, D-Glu, D-Ala, D-Val, D-Asp, D-Ile, D-Thr, D-Asn, and a protected / modified form thereof,

[0084] preferably, a D-amino acid selected from the group consisting of D-Tyr, D-His, D-Trp, D-Phe, D-Ser, D-Lys, D-Arg, D-Gln, D-Leu, D-Pro, D-Glu, D-Ala, D-Val, D-Asp, D-Thr, and a protected / modified form thereof,

[0085] more preferably, a D-amino acid selected from the group consisting of D-Tyr, D-His, D-Trp, D-Phe, D-Ala, D-Thr, and a protected / modified form thereof,

[0086] even more preferably, a D-amino acid selected from the group consisting of D-Tyr, D-His, and a protected / modified form thereof,

[0087] even more preferably, a D-amino acid selected from the group consisting of D-Tyr, and a protected / modified form thereof;

[0088] P4 is absent or a D-amino acid selected from the group consisting of D-His, D-Lys, D-Arg, D-Phe, D-Trp, D-Tyr, D-Leu, D-Pro, D-Gln, D-Ser, D-Glu, D-Ala, D-Val, D-Ile, D-Thr, D-Asn, D-Asp, and a protected / modified form thereof,

[0089] preferably, a D-amino acid selected from the group consisting of D-His, D-Lys, D-Arg, D-Phe, D-Trp, D-Tyr, D-Leu, D-Pro, D-Gln, D-Ser, D-Glu, and a protected / modified form thereof,

[0090] more preferably, a D-amino acid selected from the group consisting of D-His, D-Lys, D-Arg, D-Phe, D-Trp, D-Gln, D-Val, D-Thr, and a protected / modified form thereof, even more preferably, a D-amino acid selected from the group consisting of D-His, D-Lys, D-Arg, D-Phe, and a protected / modified form thereof,

[0091] even more preferably, a D-amino acid selected from the group consisting of D-Lys, and a protected / modified form thereof;

[0092] P5 is absent or a D-amino acid selected from the group consisting of D-Arg, D-Lys, D-His, D-Phe, D-Trp, D-Leu, D-Tyr, D-Pro, D-Gln, D-Ser, D-Glu, D-Ala, D-Val, D-Ile, D-Thr, D-Asn, D-Asp, and a protected / modified form thereof,

[0093] preferably, a D-amino acid selected from the group consisting of D-Arg, D-Lys, D-His, D-Phe, D-Trp, D-Leu, D-Tyr, D-Pro, D-Gln, D-Ser, D-Glu, and a protected / modified form thereof,

[0094] more preferably, a D-amino acid selected from the group consisting of D-Arg, D-Lys, D-His, D-Leu, D-Tyr, D-Gln, and a protected / modified form thereof,

[0095] even more preferably, a D-amino acid selected from the group consisting of D-Arg, and a protected / modified form thereof;

[0096] each of P6 to Pn is independently absent, a L-amino acid, or a D-amino acid;

[0097] P1’ is absent or a D-amino acid selected from the group consisting of D-Trp, D-Phe, D-Tyr, D-Leu, D-Glu, D-Gln, D-His, D-Ser, D-Ala, D-Val, D-Ile, D-Thr, D-Asn, D-Asp, and a protected / modified form thereof,

[0098] preferably, is absent or a D-amino acid selected from the group consisting of D-Trp, D-Phe, D-Tyr, D-Leu, D-Glu, D-Gln, D-His, D-Ser, D-Ala, and a protected / modified form thereof;

[0099] more preferably, is absent or a D-amino acid selected from the group consisting of D-Trp, and a protected / modified form thereof;

[0100] each of P2’ to Pm’ is independently absent, a L-amino acid, or a D-amino acid, and

[0101] “NH” denotes to N-terminal side of the peptide residue; “C=O” denotes to C-terminal side of the peptide residue.

[0102] In some embodiment, the linker moiety comprises a first terminal functional group and a second terminal functional group as points of covalent attachment, the first terminal functional group comprises an amino / imino-containing group and the second terminal functional group comprises a carbonyl-containing group.

[0103] In some embodiments, the linker moiety is a linker moiety having an N-terminal imino group and a C-terminal carbonyl group for covalent coupling to, for example, a ligand and / or a therapeutic agent.

[0104] In a sixth aspect, the present disclosure provides a linker-therapeutic agent conjugate of Formula (IV) ,

[0105] LK-TA (IV)

[0106] or a pharmaceutically acceptable salt, solvate, stereoisomer, or isotopic variant thereof,

[0107] wherein,

[0108] LK denotes to a linker component comprising the peptide of the present disclosure or the linker moiety of the present disclosure, and

[0109] TA denotes to a therapeutic agent.

[0110] In some embodiments, the therapeutic agent is covalently linker to the linker component LK.

[0111] In some embodiments, the linker-therapeutic agent conjugate is selected from

[0112] In a seventh aspect, the present disclosure provides a ligand-therapeutic agent conjugate of Formula (V) ,

[0113] LG- (LK-TA) n (V)

[0114] or a pharmaceutically acceptable salt, solvate, stereoisomer, or isotopic variant thereof,

[0115] wherein,

[0116] LG denotes to a ligand component;

[0117] LK denotes to a linker component, having a structure ofZ-L-Q,

[0118] where

[0119] Z is absent or denotes to a stretcher moiety,

[0120] L denotes to a linker moiety comprising the peptide of the present disclosure or denotes to the linker moiety of the present disclosure, and

[0121] Q is absent or denotes to a spacer moiety;

[0122] TA denotes to a therapeutic agent; and

[0123] n is an integer or decimal selected from 1 to 8.

[0124] In some embodiments, the decimal is an average number of LK-TA moieties per LG ranging from 1 to 8.

[0125] In some embodiments, n is an integer from 1 to 8, or an average number of LK-TA moieties per LG ranging from 1 to 8.

[0126] In some embodiments, n is an average number in a range of 1 to 8

[0127] In a eighth aspect, the present disclosure provides a pharmaceutical composition comprising an effective amount of a ligand-therapeutic agent conjugate, for example, an ADC of the present disclosure, and a pharmaceutically acceptable carrier, diluent or excipient.

[0128] In a nineth aspect, the present disclosure provides a ligand-therapeutic agent conjugate, for example, an ADC of the present disclosure or a pharmaceutical composition comprising the ligand-therapeutic agent conjugate, for example, ADC of the present disclosure for use in the treatment of diseases, for example cancers, autoimmune disease, metabolic disease.

[0129] In some embodiments, the ligand-therapeutic agent conjugate is cleavable by human cathepsin B to release the therapeutic agent.

[0130] In an tenth aspect, the present disclosure provides a method for treating, preventing, ameliorating, and / diagnosing diseases, for example cancers, autoimmune disease, metabolic disease in a subject in need thereof, comprising administering to the subject an effective amount of a ligand-therapeutic agent conjugate, for example, an ADC of the present disclosure or a pharmaceutical composition comprising the ligand-therapeutic agent conjugate, for example, ADC of the present disclosure.

[0131] In some embodiments, diagnosing comprises detecting a diagnostically relevant signal associated with the administered conjugate.

[0132] In some embodiments, the ligand-therapeutic agent conjugate is cleavable by human cathepsin B to release the therapeutic agent.

[0133] In an eleventh aspect the the present disclosure provides use of a ligand-therapeutic agent conjugate, for example, an ADC of the present disclosure or a pharmaceutical composition comprising the ligand-therapeutic agent conjugate, for example, ADC of the present disclosure in the manufacture of a medicament for the treatment of diseases, for example cancers, autoimmune disease, metabolic disease.

[0134] In some embodiments, the ligand-therapeutic agent conjugate is cleavable by human cathepsin B to release the therapeutic agent.Brief Description of the Drawings

[0135] In order to describe more clearly the objects, technical solutions and beneficial effects of the present disclosure, the following accompanying drawings are provided. In the drawings, peptide-containing species shown in different chemical forms or derivatives of the same short peptide sequence are not independently numbered; instead, they uniformly refer to and share the corresponding SEQ ID NO (s) already assigned in the disclosure, as applicable.

[0136] FIG. 1 illustrates the homochiral and heterochiral recognition of biomolecules. (A) The homochiral recognition dogma of proteins. L-proteins bind with other L-protein binders (homochiral) , and wouldn’ t bind to the D-form of the same protein binder (heterochiral) . (B) Proteases in nature generally adhere to the homochiral recognition dogma. We wonder is natural proteases also retain heterochiral recognition capability in addition to the homochiral recognition property, hydrolyzing the L-peptide substrate as well as the D-peptide substrate with the same sequence?

[0137] FIG. 2. Overview of the workflow for D-peptide substrates screening towards hCATB. (A) Schematic diagram of workflow. Substrate positions are designated according to canonical protease substrate nomenclature. (B) The design of the combinatorial D-pentapeptide library. x denotes different combinations of mixed amino acids, lowercase letters represent D-amino acids.

[0138] FIG. 3. Human Cathepsin B recognizes and hydrolyzes D-peptide substrates with high specificity and efficiency. (A, B) Initial screening D-peptide substrates of hCATB using different libraries. j denotes different combinations of mixed amino acids, lowercase letters represent D-amino acids. (C) D-peptide-GGyGG- (SEQ ID NO: 46) was the initially identified hCATB substrate, achieving 20%cleavage after 12 hours of incubation at 37℃. The red dotted line represents the scissile bond. The black arrow in the HPLC trace indicates the intact peptide, and the colored arrows indicate the cleaved fragments. (D) Site saturation mutagenesis screening of D-amino acids at P5-P3 and P1’ to identify optimal D-peptide substrate (n=2 independent replicates) . (E) Peptide-rkyyGw- (SEQ ID NO: 105) is the optimal D-peptide substrate for hCATB, achieving 80%cleavage within 1 hour. (F-H) The X-ray crystal structure of hCATB in complex with Ac-rkyyG-Cl was refined at 1.5 resolution. (F) The Fo-Fc omit map of D-substrate is displayed as a gray mesh at a contour level of 1.0σ. (G) Hydrogen bonding interactions between hCATB and D-substrate (green) , with involved residues shown as gray sticks. (H) A surface model of the hCATB structure is shown with the D-substrate (green, PDB 9K08) covalently attached to the catalytic Cys29.

[0139] FIG. 4. The proteolytic activity of hCATB on the corresponding L-peptide substrate -RKYYGW- (SEQ ID NO: 106) . Cleaved fragments are labeled as numbers 1-5.

[0140] FIG. 5. (A) The structure of Ac-rkyyG-Cl, as a covalent inhibitor to target the catalytic Cys29 of human Cathepsin B. (B) The activation of CATB-S115A in MES buffer at room temperature was confirmed by SDS-PAGE. (C) The deconvolutional LC-MS of active CATB-S115A reveals different peaks corresponding to various cleavages of the C-propeptide

[0031] . (D) The deconvolutional LC-MS also demonstrates that Ac-rkyyG-Cl covalently binds to CATB-S115A.

[0141] FIG. 6. A surface model of the hCATB structure is shown with the L-substrate (magenta, PDB 1CSB) covalently attached to the catalytic Cys29.

[0142] FIG. 7. The characterizations of-rkyyG-spacer-. (A) The structure of PAB and the replaced spacer. (B) -rkyyG-spacer-can also be recognized by hCATB, achieving quantitative cleavage within 0.5 hours. (C) The kinetics of hCATB with-VC-spacer-and (D) -GGFG-spacer- were separately determined using a fluorescence-quenched pair (n=2 independent replicates) .

[0143] FIG. 8. The D-peptide substrate of hCATB can be utilized to construct ADCs. (A) The kinetics of hCATB cleavage of peptide-rkyyG-spacer- (n=2 independent replicates) . (B) Structure of antibody-MMAE conjugate constructed using the D-peptide linker. (C) Cytotoxicity of anti-HER2 ADCs in tumor cells. ADC-rkyyG-MMAE: SK-BR-3 (IC50=0.04 ±0.01 nM) , JIMT-1 (IC50=0.03±0.002 nM) and MCF-7 (IC50=229 nM) . ADC-VC-MMAE: SK-BR-3 (IC50=0.07±0.01 nM) , JIMT-1 (IC50=1.9±0.21 nM) and MCF-7 (IC50=610 nM) . (D) In vitro stability of anti-HER2 ADCs in plasma from different species. (E) In vivo mouse pharmacokinetics of different ADCs, where ADCs were administered via tail vein injection at a dose of 1 mg / kg. C-E, data are presented as mean±SD. Each experiment was repeated at least twice.

[0144] FIG. 9. Cytotoxicity of anti-HER2 ADC with negative D-linker (-rkyya-) in tumor cells. ADC-rkyya-MMAE: SK-BR-3 (IC50=607±125 nM) , JIMT-1 (IC50=43±3 nM) .

[0145] FIG. 10. The specificity of D-peptide substrates-rkyyG-spacer-, control-VC-spacer-, and control-GGFG-spacer-against lysosomal cathepsin proteases is presented. The HPLC results are detailed in Table 14.

[0146] FIG. 11. The HPLC and MS results of Ac-rkyyG-Cl.

[0147] FIG. 12. (A) The HPLC and MS results of DBCO-PEG3-rkyyG-PAB-MMAE. (B) The HPLC and MS results of DBCO-PEG3-VC-PAB-MMAE.

[0148] FIG. 13. (A) The SDS-PAGE results of purified pro-CATB. (B) The SDS-PAGE results of purified pro-CATB mutants. (C) The activation of CATB in MES buffer at 37℃was confirmed by SDS-PAGE. (D) SDS-PAGE analysis of active CATB mutants indicates that CATB-S115A is successfully deglycosylated. (E) Enzymatic activity assays of CATB mutants demonstrate that CATB-S115A retains activity comparable to that of wild-type CATB, whereas the dead mutant C29A exhibits a loss of activity.

[0149] FIG. 14. (A) The SDS-PAGE results of purified anti-HER2 antibody. (B) The SEC results of purified anti-HER2 antibody.Detailed Description of the Invention

[0150] Reference will now be made in detail to certain embodiments, examples of which are illustrated in the accompanying detailed description. While enumerated embodiments will be described, it will be understood that they are not intended to limit the invention to those embodiments. On the contrary, the invention is intended to cover all alternatives, modifications, and equivalents, which may be included within the scope of the present disclosure as defined by the claims. One skilled in the art will recognize many methods and materials similar or equivalent to those described herein, which could be used in the practice of the present disclosure. The present disclosure is in no way limited to the methods and materials described. In the event that one or more of the incorporated literatures and similar materials differs from or contradicts this application, including but not limited to defined terms, term usage, described techniques, or the like, this application controls.

[0151] It is appreciated that certain features of the present disclosure, which are, for clarity, described in the context of separate embodiments, can also be provided in combination in a single embodiment. Conversely, various features of the present disclosure, which are, for brevity, described in the context of a single embodiment, can also be provided separately or in any suitable sub-combination.

[0152] Unless otherwise indicated, the present disclosure will be implemented using the conventional techniques of molecular biology (including recombinant techniques) , microbiology, cell biology, biochemistry, and immunology in the art.

[0153] To maintain consistency among the specification, the drawings, and the sequence listing, it is noted that, throughout the disclosure, certain peptide sequences, particularly short peptide substrates, linker peptides, or peptide motifs, may be employed or illustrated in different chemical forms or derivatives in the course of experimental studies. Such derivatives may include, by way of example and without limitation, N-terminal or C-terminal modifications, acetylation, amidation, incorporation of terminally activated or reactive functional groups for conjugation or covalent ligand preparation, or other chemical modifications that do not change the identity, composition, or order of the core amino acid sequence.

[0154] Unless expressly stated otherwise, these chemically modified forms or derivatives shall not be construed as new or separate sequence entities, but rather as different chemical forms or modifications of the same underlying amino acid sequence. Accordingly, no separate SEQ ID NOs are assigned to such chemical derivatives. Any reference in the specification or drawings to such modified peptide forms (including, for example, differently modified short peptide sequences) uniformly corresponds to the relevant SEQ ID NO (s) already assigned in this application, where applicable.

[0155] Definition

[0156] Unless otherwise defined, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which the present disclosure belongs.

[0157] The articles “a” , “an” , and “the” are used herein to refer to one or to more than one (i. e. to at least one) of the grammatical object of the article. By way of example, “an element” means one element or more than one element.

[0158] The use of alternatives (e.g., "or" ) should be understood to mean one, two, or any combination thereof of the alternatives.

[0159] As used herein, the term "and / or" is to be understood as referring to one or both alternatives.

[0160] As used herein, the term “about” means approximately, in the region of, roughly, or around. When the term “about” is used in conjunction with a numerical range, it modifies that range by extending the boundaries above and below the numerical values set forth. In general, the term “about” is used herein to modify a numerical value above and below the given value by a variance of20%, typically 10%, more typically 5%, and even more typically 1%. Sometimes, such a range can lie within the experimental error, type of standard methods used for the measurement and / or determination of a given value or range.

[0161] Unless otherwise specified, any concentration range, percentage range, ratio range, or integer range shall be understood to include any integer value within said range and, where appropriate, fractions thereof (such as tenths and hundredths of an integer) . When immediately preceded by a numeric or numeric value, the term "approximately" refers to plus or minus 10 percent of the numeric or numeric range.

[0162] Throughout the specification, unless the context otherwise requires, the term "comprise / comprises / comprising" should be understood to mean the inclusion of a specified step, or element, or group of steps or elements, but does not exclude any other step, or element, or group of steps or elements. In particular embodiments, the terms "includes" , "has" , "contains" and"comprises" are used synonymously.

[0163] Definitions of specific functional groups and chemical terms are described in more detail below. For purpose of this disclosure, the chemical elements are identified in accordance with the Periodic Table of the Elements, CAS version, Handbook of Chemistry and Physics, 75th Edition, inside cover, and specific functional groups are generally defined as described therein. Additionally, general principles of organic chemistry, as well as specific functional moieties and reactivity, are described in Organic Chemistry, Thomas Sorrell, University Science Books, Sausalito, 1999; Smith and March, March’s Advanced Organic Chemistry, 5th Edition, John Wiley&Sons, Inc., New York, 2001; Larock, Comprehensive Organic Transformations, VCH Publishers, Inc., New York, 1989; Carruthers, Some Modem Methods of Organic Synthesis, 3rd Edition, Cambridge University Press, Cambridge, 1987.

[0164] As used herein, the terms "protein" or "peptide" refer to a polymeric form of amino acids. Proteins are understood to comprise more amino acids than peptides and a "protein" typically comprises at least about 60 amino acids while peptides typically comprise from 2 to about 60 amino acids. The amino acids in a protein or peptide may exist in either the D or L configuration or a combination of the two configurations and may be chemically or biochemically modified. Modification of the amino acids may take place at the side chains or at the peptide bond linking the amino acids. The peptide bonds (-CONH-) may be modified to change the properties of the peptide bond. The peptide may also be chemically modified by the addition of covalently bound chemical groups such as biotin, thiol, cysteine, amide, carboxyl, linear or branched alkyl, primary or secondary amines, lipids, phospholipids, fatty acids cholesterol etc. These chemical groups may be added to the peptide at the N-terminal and / or C-terminal end or within the peptide. A peptide may also be modified by the addition of one or more additional bonds within the peptide between the N-and C-terminals, such as a disulphide bond. The amine group at the N-terminal may also be chemically modified, for example by the additional of a cap by acetylation.

[0165] As used herein, the terms "amino acid" refers to a molecule that comprises amine (-NH) and carboxyl (-COOH) functional groups and a side chain. Amino acids may be encoded by triplet codons of nucleic acids (canonical amino acids) or by variant codons (non-canonical amino acids) . Amino acids may be characterized asα-amino acids orβ-amino acids. In α-amino acids, the amine and carboxylic groups are attached to the first carbon. Inβ-amino acids, the amine and carboxyl groups are attached to adjacent carbons. Amino acids may also be characterized as D-amino acids (where the stereogenic carbon alpha to the amino group has the D-configuration) or L-amino acids (where the stereogenic carbon alpha to the amino group has the L-configuration) . Amino acids may also be classified based on their properties of their side chains. For example, amino acids may be classified as acidic, basic, polar, hydrophobic or aromatic and an amino acid may fall into one or more categories. Aromatic amino acids include phenylalanine (Phe) , tryptophan (Trp) , tyrosine (Tyr) , and histidine (His) . Hydrophobic amino acids include glycine (Gly) , alanine (Ala) , valine (Val) , leucine (Leu) , isoleucine (lie) , proline (Pro) , phenylalanine (Phe) , methionine (Met) , and tryptophan (Trp) . Polar amino acids include serine (Ser) , threonine (Thr) , cysteine (Cys) , asparagine (Asn) , glutamine (Gin) , and tyrosine (Tyr) . Basic amino acids include arginine (Arg) , lysine (Lys) , and histidine (His) and acidic amino acids include aspartic acid or aspartate (Asp) and glutamic acid or glutamate (Glu) .

[0166] Amino acids as used herein may be naturally occurring, non-naturally occurring or synthetic. Amino acids as used herein may also be modified by substituting one or more groups on the side chains.

[0167] Table 1: Specific Examples of Amino acids

[0168] As used herein, the terms "D-amino acid" refers to an amino acid where the stereogenic carbon alpha to the amino group has the D-configuration, specifically, refer to anα-amino acid where the stereogenic carbon alpha to the amino group has the D-configuration. In some embodiments, D-amino acids D-amino acids include, but are not limited to, the D-configurations of the amino acids listed in Table 1.

[0169] As used herein, the term "modified" , "protected / modified form" , "modification" or grammatical variants thereof in the context of a modified amino acid refers to an amino acid wherein one or more groups on the side chain is substituted. The one or more groups may be substituted with alkyl, alkenyl, alkynyl, thioalkyl, cycloalkyl, cycloalkenyl, heterocycloalkyl, halo, carboxyl, haloalkyl, haloalkynyl, hydroxyl, alkoxy, thioalkoxy, alkenyloxy, haloalkoxy, haloalkenyloxy, nitro, amino, nitroalkyl, nitroalkenyl, nitroalkynyl, nitroheterocyclyl, alkylamino, dialkylamino, alkenylamine, alkynylamino, acyl, alkenoyl, alkynoyl, acylamino, diacylamino, acyloxy, alkylsulfonyloxy, heterocycloxy, heterocycloamino, haloheterocycloalkyl, alkylsulfenyl, alkylcarbonyloxy, alkylthio, acylthio, phosphorus-containing groups such as phosphono and phosphinyl, aryl, heteroaryl, alkylaryl, alkylheteroaryl, cyano, cyanate, isocyanate, -C (O) NH (alkyl) , and-C (O) N (alkyl) 2.

[0170] As used herein, the term "antibody" refers to any form of immunoglobulin molecule that exhibits the desired biological or binding activity. Accordingly, it is used in the broadest sense and specifically covers, but is not limited to, monoclonal antibodies (including full-length monoclonal antibodies) , polyclonal antibodies, multispecific antibodies (e.g., bispecific antibodies) , humanized, fully human antibodies, chimeric antibodies and camelidized single domain antibodies.

[0171] As used herein, the term "antibody" includes not only an intact polyclonal or monoclonal antibody, but also, unless otherwise specified, any antigen-binding portion thereof that competes with the intact antibody for specific binding, a fusion protein comprising an antigen-binding portion, and any other modified conformation of an immunoglobulin molecule comprising an antigen recognition site. Antigen-binding portions include, for example, Fab, Fab', F (ab') 2, Fd, Fv, structural domain antibodies (dAb, e. g. shark and camel antibodies) , fragments containing complementary determining regions (CDR) , single-chain variable fragment antibodies (scFv) , maximal antibodies, microbodies, intracellular antibodies, double antibodies, triple antibodies, quadruple antibodies, v-NAR and double scFv, and immune peptides containing at least a portion of an immunoglobulin (sufficient to confer peptide-specific antigen binding) . Antibodies include any class of antibody, such as IgG, IgA or IgM(or subclasses thereof) , and the antibody need not be of any particular class.

[0172] As used herein, the term "subject" means an animal, such as a mammal, including but not limited to a human, rodent, ape, feline, canine, equine, bovine, porcine, sheep, goat, mammalian laboratory animal, mammalian farm animal, mammalian sport animal, and mammalian pet. Subjects may be male or female and may be of any age, including infants, juveniles, young adults, adults, and elderly subjects. In some embodiments, a subject is an individual in need of treatment for a disease or condition. In some embodiments, the subject receiving the treatment may be a patient who has a condition associated with the treatment or is at risk of developing the condition. In particular embodiments, the subject is a human, such as a human patient. The term is often used interchangeably with"patient" , "test subject" , "treatment subject" , and the like.

[0173] As used herein, the term "pharmaceutically acceptable" indicates that the substance or composition must be chemically and / or toxicologically compatible with the other ingredients comprising the formulation and / or the mammal treated therewith. A "pharmaceutically acceptable carrier" includes any and all physiologically compatible solvents, dispersion media, coatings, antibacterial and antifungal agents, isotonic agents, absorption delay agents, etc. Examples of pharmaceutically acceptable carriers include one or more of water, saline, phosphate buffered saline, dextrose, glycerol, ethanol, etc., and combinations thereof.

[0174] As used herein, the wavy line,  denotes a point of attachment of a component / moiety / part to another component / moiety / part.

[0175] RECOGNITION SEQUENCE

[0176] In a first aspect, the present disclosure provides a recognition sequence for human cathepsin B comprising an amino acid sequence of Formula (I) :

[0177] P5-P4-P3-P2-P1 / -P1’ (I)

[0178] wherein

[0179] P1 is selected from the group consisting of Gly; D-His, D-Ser, and a protected / modified form thereof;

[0180] P2 is a D-amino acid selected from the group consisting of D-Tyr, D-Trp, D-Phe, D-Pro, D-Val, D-His, D-Arg, D-Lys, D-Ser, D-Ala, D-Leu, D-Glu, and a protected / modified form thereof;

[0181] P3 is a D-amino acid selected from the group consisting of D-Tyr, D-His, D-Trp, D-Phe, D-Ser, D-Lys, D-Arg, D-Gln, D-Leu, D-Pro, D-Glu, D-Ala, D-Val, D-Asp, D-Ile, D-Thr, D-Asn, and a protected / modified form thereof;

[0182] P4 is absent or a D-amino acid selected from the group consisting of D-His, D-Lys, D-Arg, D-Phe, D-Trp, D-Tyr, D-Leu, D-Pro, D-Gln, D-Ser, D-Glu, D-Ala, D-Val, D-Ile, D-Thr, D-Asn, D-Asp, and a protected / modified form thereof,

[0183] P5 is absent or a D-amino acid selected from the group consisting of D-Arg, D-Lys, D-His, D-Phe, D-Trp, D-Leu, D-Tyr, D-Pro, D-Gln, D-Ser, D-Glu, D-Ala, D-Val, D-Ile, D-Thr, D-Asn, D-Asp, and a protected / modified form thereof,

[0184] P1’ is absent or a D-amino acid selected from the group consisting of D-Trp, D-Phe, D-Tyr, D-Leu, D-Glu, D-Gln, D-His, D-Ser, D-Ala, D-Val, D-Ile, D-Thr, D-Asn, D-Asp, and a protected / modified form thereof;

[0185] “ / ” denotes to cleavage site where the recognition sequence is cleaved by human cathepsin B,

[0186] or a fragment thereof comprising the cleavage site “ / ” .

[0187] In some embodiments, the recognition sequence for human cathepsin B is a recognition sequence that is cleavable by human cathepsin B.

[0188] In some embodiments, the fragment comprises at least P2-P1 / -P1’ and is cleavable by human cathepsin B.

[0189] In some embodiments, the fragment thereof is contiguous peptide fragment comprising residues P3-P2-P1 / -P1’ of Formula (I) .

[0190] In some embodiment, preferably, P1 is selected from Gly and a protected / modified form thereof.

[0191] In some embodiments, preferably, P2 is a D-amino acid selected from the group consisting of D-Tyr, D-Trp, D-Phe, D-His, D-Leu, D-Glu, and a protected / modified form thereof. More preferably, P2 is a D-amino acid selected from the group consisting of D-Tyr, D-Phe, and a protected / modified form thereof.

[0192] In some embodiments, preferably, P3 is a D-amino acid selected from the group consisting of D-Tyr, D-His, D-Trp, D-Phe, D-Ser, D-Lys, D-Arg, D-Gln, D-Leu, D-Pro, D-Glu, D-Ala, D-Val, D-Asp, D-Thr, and a protected / modified form thereof. More preferably, P3 is a D-amino acid selected from the group consisting of D-Tyr, D-His, D-Trp, D-Phe, D-Ala, D-Thr, and a protected / modified form thereof. Even more preferably, P3 is a D-amino acid selected from the group consisting of D-Tyr, D-His, D-Ala, and a protected / modified form thereof. Even more preferably, P3 is a D-amino acid selected from the group consisting of D-Tyr, and a protected / modified form thereof.

[0193] In some embodiments, preferably, P4 is absent, or a D-amino acid selected from the group consisting of D-His, D-Lys, D-Arg, D-Phe, D-Trp, D-Tyr, D-Leu, D-Pro, D-Gln, D-Ser, D-Glu, and a protected / modified form thereof. More preferably, P4 is a D-amino acid selected from the group consisting of D-His, D-Lys, D-Arg, D-Phe, D-Trp, D-Gln, D-Val, D-Thr, and a protected / modified form thereof. Even more preferably, P4 is a D-amino acid selected from the group consisting of D-His, D-Lys, D-Arg, D-Phe, and a protected / modified form thereof. Even more preferably, P4 is a D-amino acid selected from the group consisting of D-Lys, and a protected / modified form thereof;

[0194] In some embodiments, preferably, P5 is absent, or a D-amino acid selected from the group consisting of D-Arg, D-Lys, D-His, D-Phe, D-Trp, D-Leu, D-Tyr, D-Pro, D-Gln, D-Ser, D-Glu, and a protected / modified form thereof. More preferably, P5 is a D-amino acid selected from the group consisting of D-Arg, D-Lys, D-His, D-Leu, D-Tyr, D-Gln, and a protected / modified form thereof. Even more preferably, P5 is a D-amino acid selected from the group consisting of D-Arg, and a protected / modified form thereof;

[0195] In some embodiments, preferably, P1’ is absent or a D-amino acid selected from the group consisting of D-Trp, D-Phe, D-Tyr, D-Leu, D-Glu, D-Gln, D-His, D-Ser, D-Ala, and a protected / modified form thereof. More preferably, P1’ is absent or a D-amino acid selected from the group consisting of D-Trp, and a protected / modified form thereof;

[0196] In some embodiments, P1 is selected from the group consisting of Gly; D-His, D-Ser, and a protected / modified form thereof; P2 is a D-amino acid selected from the group consisting of D-Tyr, D-Trp, D-Phe, D-His, D-Leu, D-Glu, and a protected / modified form thereof; P3 is a D-amino acid selected from the group consisting of D-Tyr, D-His, D-Trp, D-Phe, D-Ala, D-Thr, and a protected / modified form thereof; P4 is a D-amino acid selected from the group consisting of D-His, D-Lys, D-Arg, D-Phe, D-Trp, D-Gln, D-Val, D-Thr, and a protected / modified form thereof; P5 is a D-amino acid selected from the group consisting of D-Arg, D-Lys, D-His, D-Leu, D-Tyr, D-Gln, and a protected / modified form thereof; and / or P1’ is absent or a D-amino acid selected from the group consisting of D-Trp, and a protected / modified form thereof.

[0197] In some embodiments, the recognition sequence for human cathepsin B comprises an amino acid sequence selected from the group consisting of

[0198] D-Arg-D-Lys-D-Tyr-D-Tyr-Gly (SEQ ID NO: 1)

[0199] D-Lys-D-Lys-D-Tyr-D-Tyr-Gly (SEQ ID NO: 2)

[0200] D-Lys-D-Arg-D-Tyr-D-Tyr-Gly (SEQ ID NO: 3)

[0201] D-Lys-D-His-D-Tyr-D-Tyr-Gly (SEQ ID NO: 4)

[0202] D-Arg-D-His-D-Tyr-D-Tyr-Gly (SEQ ID NO: 5)

[0203] D-Arg-D-Arg-D-Tyr-D-Tyr-Gly (SEQ ID NO: 6)

[0204] D-Arg-D-Phe-D-Tyr-D-Tyr-Gly (SEQ ID NO: 7)

[0205] D-His-D-Arg-D-Tyr-D-Tyr-Gly (SEQ ID NO: 8)

[0206] D-Arg-D-Arg-D-Ala-D-Tyr-Gly (SEQ ID NO: 9)

[0207] D-His-D-Arg-D-Ala-D-Tyr-Gly (SEQ ID NO: 10)

[0208] D-Arg-D-Phe-D-Ala-D-Tyr-Gly (SEQ ID NO: 11)

[0209] D-Arg-D-Arg-D-His-D-Tyr-Gly (SEQ ID NO: 12)

[0210] D-Arg-D-Lys-D-His-D-Tyr-Gly (SEQ ID NO: 13)

[0211] D-Arg-D-His-D-Ala-D-Tyr-Gly (SEQ ID NO: 14)

[0212] D-Lys-D-Arg-D-Ala-D-Tyr-Gly (SEQ ID NO: 15)

[0213] D-Arg-D-Lys-D-Ala-D-Tyr-Gly (SEQ ID NO: 16)

[0214] D-Arg-D-His-D-His-D-Tyr-Gly (SEQ ID NO: 17)

[0215] D-Arg-D-Phe-D-His-D-Tyr-Gly (SEQ ID NO: 18)

[0216] D-Arg-D-Lys-D-Phe-D-Trp-Gly (SEQ ID NO: 19)

[0217] D-Arg-D-Lys-D-Phe-D-Tyr-Gly (SEQ ID NO: 20)

[0218] D-Arg-D-Lys-D-Phe-D-Leu-Gly (SEQ ID NO: 21)

[0219] D-Arg-D-Lys-D-Tyr-D-Phe-Gly (SEQ ID NO: 22)

[0220] D-Leu-D-Lys-D-Phe-D-Phe-Gly (SEQ ID NO: 23)

[0221] D-Arg-D-Trp-D-Phe-D-Phe-Gly (SEQ ID NO: 24)

[0222] D-Arg-D-Lys-D-Phe-D-Phe-Gly (SEQ ID NO: 25)

[0223] D-Tyr-D-Lys-D-Phe-D-Phe-Gly (SEQ ID NO: 26)

[0224] D-Arg-D-Arg-D-Phe-D-Phe-Gly (SEQ ID NO: 27)

[0225] D-Arg-D-Thr-D-Phe-D-Phe-Gly (SEQ ID NO: 28)

[0226] D-Arg-D-His-D-Phe-D-Phe-Gly (SEQ ID NO: 29)

[0227] D-Lys-D-Lys-D-Phe-D-Phe-Gly (SEQ ID NO: 30)

[0228] D-Arg-D-Lys-D-Phe-D-Glu-Gly (SEQ ID NO: 31)

[0229] D-Arg-D-Lys-D-Phe-D-His-Gly (SEQ ID NO: 32)

[0230] D-Arg-D-Lys-D-Thr-D-Phe-Gly (SEQ ID NO: 33)

[0231] D-Arg-D-Lys-D-Trp-D-Phe-Gly (SEQ ID NO: 34)

[0232] D-Arg-D-Gln-D-Phe-D-Phe-Gly (SEQ ID NO: 35)

[0233] D-Arg-D-Val-D-Phe-D-Phe-Gly (SEQ ID NO: 36)

[0234] D-Gln-D-Lys-D-Phe-D-Phe-Gly (SEQ ID NO: 37)

[0235] D-His-D-Lys-D-Phe-D-Phe-Gly (SEQ ID NO: 38)

[0236] D-Tyr-D-Lys-D-Tyr-D-Tyr-Gly (SEQ ID NO: 39)

[0237] D-Arg-D-Trp-D-Tyr-D-Tyr-Gly (SEQ ID NO: 40)

[0238] D-Tyr-D-Lys-D-Phe-D-Tyr-Gly (SEQ ID NO: 41)

[0239] D-Arg-D-Trp-D-Phe-D-Tyr-Gly (SEQ ID NO: 42)

[0240] D-Arg-D-Lys-D-Tyr-D-Tyr-D-His (SEQ ID NO: 43)

[0241] D-Arg-D-Lys-D-Tyr-D-Tyr-D-Ser (SEQ ID NO: 44) .

[0242] As used herein, the term "recognition sequence" generally refers to a specific amino acid sequence that can be recognized and bound by other proteins (such as antibodies, enzymes, receptors, etc. ) . In the present disclosure, "recognition sequence" refers to a specific amino acid sequence that a protease, such as human cathepsin B, recognizes and binds to on its substrate protein or peptide chain. The recognition sequence determines the substrate specificity of the protease, that is, which proteins or peptides the protease will preferentially or specifically cut. The recognition sequence includes the cleavage site (cutting site) and the amino acid residues around the cleavage site. In addition to the cleavage site itself, the surrounding amino acid residues are also crucial to the recognition and cleavage efficiency of the protease. These residues interact with the active pocket of the protease and affect the binding and cleavage of the substrate.

[0243] As used herein, the term "cleavage site / cutting site" refers to a peptide comprise at least a D-amino acid residue. Cleavage site / Cutting site refers to the specific location where an enzyme (especially a protease or restriction endonuclease) cuts on its substrate molecule, usually represented by an arrow (↓) or a slash ( / ) . Proteases are enzymes that catalyze the hydrolysis of peptide bonds in proteins, and in the present disclosure, specifically human cathepsin B. Their cleavage site refers to a specific amino acid sequence on a protein or peptide chain that is cut by a protease. More specifically, it refers to the location in a peptide chain where a peptide bond is broken, usually between two amino acid residues. P site and P' site: To more accurately describe the amino acid residues around the cleavage site, the nomenclature of P site and P' site are used in the field of biochemistry. The amino acid residues before the cleavage site are called P sites, which are P1, P2, P3, and so on, with P1 being the amino acid next to the cleavage site. The amino acid residues after the cleavage site are called P' sites, which are P1', P2', P3', and so on, with P1' also being the amino acid next to the cleavage site. For example, if a sequence is P3-P2-P1 / P1'-P2'-P3', then cleavage occurs between P1 and P1'.

[0244] When referring to a "recognition sequence" in the present disclosure, it should be understood that the "recognition sequence" can be a complete amino acid chain of a short peptide, or or a segment of an amino acid chain included in a polypeptide, protein and / or other macromolecule containing amino acid chain, for example, a ligand-therapeutic agent conjugate, an antibody-drug conjugate, and the like.

[0245] In the case of referred to a complete amino acid chain of a short peptide, the amino terminus of the amino acid sequence of Formula (I) : P5-P4-P3-P2-P1 / -P1’ is-NH2 or a protected form thereof, and the carboxyl terminus is-COOH or a protected form thereof.

[0246] In the case of referred to a segment of an amino acid chain included in a polypeptide, protein and / or other macromolecule containing amino acid chain, the amino and / or carboxyl termini of the amino acid sequence of Formula (I) : P5-P4-P3-P2-P1 / -P1’ are chemical bonds, especially peptide bonds, which covalently link it to other parts of the polypeptide, protein and / or other macromolecule containing amino acid chain. Alternatively, the amino acid sequence of the recognition sequence can also be expressed as Formula (Ia) or Formula (Ib) :

[0247] -P5-P4-P3-P2-P1 / -P1’ - (Ia) ,

[0248] -NHP5-P4-P3-P2-P1 / -P1’ C=O- (Ib)

[0249] wherein, “-NH” indicates an imino group at the amino terminus of the amino acid sequence that can be covalently linked to other groups. “C=O-” "C=O-" indicates a carbonyl group at the carboxyl terminus of an amino acid sequence that can be covalently linked to other groups.

[0250] It should be understood that the amino acid sequences of the recognition sequences of the present disclosure listed above can also be expressed in a manner similar to Formula (Ia) and (Ib) in various contexts, and different expressions do not change the chemical structure and properties represented by them.

[0251] MACROMOLECULE COMPRISING RECOGNITION SEQUENCE

[0252] The recognition sequences of the present disclosure can be specifically recognized and cleaved by human cathepsin B, and they can be included in larger molecules such as peptides, proteins, ligand-therapeutic agent conjugates such as ADC, etc., so that these macromolecules can be recognized and cleaved by human cathepsin B under appropriate conditions, thereby achieving the desired physiological activity. The D-peptide configuration of the recognition sequences of the present disclosure ensures that these macromolecules are not easily destroyed by many proteases in plasma, so they have higher stability in plasma and longer blood circulation time, which helps to improve the overall stability of these macromolecules, such as ADC drugs, so that they can release drugs more effectively in the tumor microenvironment, which is beneficial to improving drug efficacy and reducing systemic toxicity.

[0253] In a second aspect, the present disclosure provides a macromolecule comprising the recognition sequece for human cathepsin B comprising an amino acid sequence of Formula (I) of the present disclosure:

[0254] P5-P4-P3-P2-P1 / -P1’ (I)

[0255] wherein P1, P21, P31, P41, P5, P1’ , and “ / ” are provided as herein.

[0256] The macromolecule includes but not limited to peptide, protein, ligand-therapeutic agent conjugate, antibody-drug conjugate, and the like.

[0257] As used herein, the term "macromolecule" refers to a complex compound with a molecular weight of more than several hundred, which is composed of a large number of atoms closely connected by chemical bonds such as covalent bonds, for example, a relatively large molecular weight biologically active molecule formed by many repeated structural units connected by covalent bonds or other chemical bonds. In some embodiments, the macromolecule includes peptides, proteins, ligand-therapeutic agent conjugates, such as antibody-drug conjugates, etc. Peptides are chain molecules formed by amino acids connected by peptide bonds. They can act as signal molecules to transmit information between cells or have the function of regulating physiological processes. Proteins, as an important class of macromolecules, are one of the main components of organisms and are involved in almost all life activities, such as catalyzing chemical reactions (enzymes) , transporting substances (hemoglobin) , providing structural support (collagen) , participating in immune responses (antibodies) , etc. Ligand-therapeutic agent conjugates, such as antibody-drug conjugates, are macromolecules formed by connecting a ligand with a targeting effect (such as an antibody) with a drug with therapeutic activity through a specific linker. It combines the targeting of the ligand with the therapeutic effect of the therapeutic agent, and can act more accurately on diseased cells or tissues, improve the therapeutic effect and reduce side effects on normal tissues. In addition, macromolecules can also include substances with large molecular weights such as nucleic acids and polysaccharides that are well known to those skilled in the art.

[0258] PEPTIDES and LINKER

[0259] As used herein, the term "D-peptide" refers to a peptide comprise at least a D-amino acid residue.

[0260] In a third aspect, the present disclosure provides a peptide comprising an amino acid sequence of Formula (II)

[0261] Pn…-P6-P5-P4-P3-P2-P1-P1’ -P2’ -…Pm’ (II)

[0262] wherein

[0263] n is an integer not greater than 8;

[0264] m is an integer not greater than 4;

[0265] P1 is selected from the group consisting of Gly; D-His, D-Ser, and a protected / modified form thereof;

[0266] P2 is a D-amino acid selected from the group consisting of D-Tyr, D-Trp, D-Phe, D-Pro, D-Val, D-His, D-Arg, D-Lys, D-Ser, D-Ala, D-Leu, D-Glu, and a protected / modified form thereof,

[0267] P3 is a D-amino acid selected from the group consisting of D-Tyr, D-His, D-Trp, D-Phe, D-Ser, D-Lys, D-Arg, D-Gln, D-Leu, D-Pro, D-Glu, D-Ala, D-Val, D-Asp, D-Ile, D-Thr, D-Asn, and a protected / modified form thereof,

[0268] P4 is absent or a D-amino acid selected from the group consisting of D-His, D-Lys, D-Arg, D-Phe, D-Trp, D-Tyr, D-Leu, D-Pro, D-Gln, D-Ser, D-Glu, D-Ala, D-Val, D-Ile, D-Thr, D-Asn, D-Asp, and a protected / modified form thereof,

[0269] P5 is absent or a D-amino acid selected from the group consisting of D-Arg, D-Lys, D-His, D-Phe, D-Trp, D-Leu, D-Tyr, D-Pro, D-Gln, D-Ser, D-Glu, D-Ala, D-Val, D-Ile, D-Thr, D-Asn, D-Asp, and a protected / modified form thereof,

[0270] each of P6 to Pn is independently absent, a L-amino acid, or a D-amino acid;

[0271] P1’ is absent or a D-amino acid selected from the group consisting of D-Trp, D-Phe, D-Tyr, D-Leu, D-Glu, D-Gln, D-His, D-Ser, D-Ala, D-Val, D-Ile, D-Thr, D-Asn, D-Asp, and a protected / modified form thereof,

[0272] each of P2’ to Pm’ is independently absent, a L-amino acid, or a D-amino acid.

[0273] In some embodiments, each of P6 to Pn is independently absent or a D-amino acid selected from the group consisting of D-Ala, D-Arg, D-Asn, D-Asp, D-Cys, D-Gln, D-Glu, D-Gly, D-His, D-Ile, D-Leu, D-Lys, D-Met, D-Phe, D-Pro, D-Ser, D-Thr, D-Trp, D-Tyr, D-Val, D-Cit, D-Orn, and a protected / modified form thereof;

[0274] In some embodiments, P6 is absent or a D-amino acid selected from the group consisting of D-Trp, D-Arg, D-Met, D-Glu, D-Lys, D-Asp, D-Leu, D-Pro, D-Ser, D-Gly, D-Tyr, D-Phe, D-His, D-Gln, D-Asn, D-Thr, D-Val, D-Ala, D-Cit, and a protected / modified form thereof.

[0275] In some embodiments, each of P2’ to Pm’ is independently absent or a D-amino acid selected from the group consisting of D-Ala, D-Arg, D-Asn, D-Asp, D-Cys, D-Gln, D-Glu, D-Gly, D-His, D-Ile, D-Leu, D-Lys, D-Met, D-Phe, D-Pro, D-Ser, D-Thr, D-Trp, D-Tyr, D-Val, D-Cit, D-Orn, and a protected / modified form thereof;

[0276] In some embodiments, the protected / modified form of a D-amino acid refers to the protected form and / or modified form of the D-amino acid. The protected form of a D-amino acid comprises a form in which the amino group is protected using a group such as Boc or Fmoc, and a form in which the carboxyl group is protected by forming an ester such as methyl ester or ethyl ester. The modified form of a D-amino acid includes, but is not limited to, methylation, phosphorylation, acetylation, glycosylation and hydroxylation of the D-amino acid.

[0277] The present disclosure provides a peptide comprising an amino acid sequence of Formula (IIa)

[0278] P6-P5-P4-P3-P2-P1-P1’ (IIa)

[0279] wherein

[0280] P1 is selected from the group consisting of Gly; D-His, D-Ser, and a protected / modified form thereof;

[0281] P2 is a D-amino acid selected from the group consisting of D-Tyr, D-Trp, D-Phe, D-Pro, D-Val, D-His, D-Arg, D-Lys, D-Ser, D-Ala, D-Leu, D-Glu, and a protected / modified form thereof,

[0282] P3 is a D-amino acid selected from the group consisting of D-Tyr, D-His, D-Trp, D-Phe, D-Ser, D-Lys, D-Arg, D-Gln, D-Leu, D-Pro, D-Glu, D-Ala, D-Val, D-Asp, D-Ile, D-Thr, D-Asn, and a protected / modified form thereof,

[0283] P4 is absent or a D-amino acid selected from the group consisting of D-His, D-Lys, D-Arg, D-Phe, D-Trp, D-Tyr, D-Leu, D-Pro, D-Gln, D-Ser, D-Glu, D-Ala, D-Val, D-Ile, D-Thr, D-Asn, D-Asp, and a protected / modified form thereof,

[0284] P5 is absent or a D-amino acid selected from the group consisting of D-Arg, D-Lys, D-His, D-Phe, D-Trp, D-Leu, D-Tyr, D-Pro, D-Gln, D-Ser, D-Glu, D-Ala, D-Val, D-Ile, D-Thr, D-Asn, D-Asp, and a protected / modified form thereof,

[0285] P6 is absent or a D-amino acid selected from the group consisting of D-Trp, D-Arg, D-Met, D-Glu, D-Lys, D-Asp, D-Leu, D-Pro, D-Ser, D-Gly, D-Tyr, D-Phe, D-His, D-Gln, D-Asn, D-Thr, D-Val, D-Ala, D-Cit, and a protected / modified form thereof, and

[0286] P1’ is absent or a D-amino acid selected from the group consisting of D-Trp, D-Phe, D-Tyr, D-Leu, D-Glu, D-Gln, D-His, D-Ser, D-Ala, D-Val, D-Ile, D-Thr, D-Asn, D-Asp, and a protected / modified form thereof,

[0287] The present disclosure also provides use of the peptide of Formula (II) or Formula (IIa) in preparation of a ligand-therapeutic agent conjugate, for example, an antibody-drug conjugate (ADC) as described herein.

[0288] The present disclosure also provides the peptide of Formula (II) or Formula (IIa) for use in preparation of a ligand-therapeutic agent conjugate, for example, an antibody-drug conjugate (ADC) as described herein.

[0289] The description below can be applied to both or either of the peptide comprising an amino acid sequence of Formula (II) and (IIa) .

[0290] In some embodiment, preferably, P1 is selected from Gly and a protected / modified form thereof.

[0291] In some embodiments, preferably, P2 is a D-amino acid selected from the group consisting of D-Tyr, D-Trp, D-Phe, D-His, D-Leu, D-Glu, and a protected / modified form thereof. More preferably, P2 is a D-amino acid selected from the group consisting of D-Tyr, D-Phe, and a protected / modified form thereof.

[0292] In some embodiments, preferably, P3 is a D-amino acid selected from the group consisting of D-Tyr, D-His, D-Trp, D-Phe, D-Ser, D-Lys, D-Arg, D-Gln, D-Leu, D-Pro, D-Glu, D-Ala, D-Val, D-Asp, D-Thr, and a protected / modified form thereof. More preferably, P3 is a D-amino acid selected from the group consisting of D-Tyr, D-His, D-Trp, D-Phe, D-Ala, D-Thr, and a protected / modified form thereof. Even more preferably, P3 is a D-amino acid selected from the group consisting of D-Tyr, D-His, D-Ala, and a protected / modified form thereof. Even more preferably, P3 is a D-amino acid selected from the group consisting of D-Tyr, and a protected / modified form thereof.

[0293] In some embodiments, preferably, P4 is absent, or a D-amino acid selected from the group consisting of D-His, D-Lys, D-Arg, D-Phe, D-Trp, D-Tyr, D-Leu, D-Pro, D-Gln, D-Ser, D-Glu, and a protected / modified form thereof. More preferably, P4 is a D-amino acid selected from the group consisting of D-His, D-Lys, D-Arg, D-Phe, D-Trp, D-Gln, D-Val, D-Thr, and a protected / modified form thereof. Even more preferably, P4 is a D-amino acid selected from the group consisting of D-His, D-Lys, D-Arg, D-Phe, and a protected / modified form thereof. Even more preferably, P4 is a D-amino acid selected from the group consisting of D-Lys, and a protected / modified form thereof;

[0294] In some embodiments, preferably, P5 is absent, or a D-amino acid selected from the group consisting of D-Arg, D-Lys, D-His, D-Phe, D-Trp, D-Leu, D-Tyr, D-Pro, D-Gln, D-Ser, D-Glu, and a protected / modified form thereof. More preferably, P5 is a D-amino acid selected from the group consisting of D-Arg, D-Lys, D-His, D-Leu, D-Tyr, D-Gln, and a protected / modified form thereof. Even more preferably, P5 is a D-amino acid selected from the group consisting of D-Arg, and a protected / modified form thereof;

[0295] In some embodiments, preferably, P6 is absent;

[0296] In some embodiments, preferably, P1’ is absent or a D-amino acid selected from the group consisting of D-Trp, D-Phe, D-Tyr, D-Leu, D-Glu, D-Gln, D-His, D-Ser, D-Ala, and a protected / modified form thereof. More preferably, P1’ is absent or a D-amino acid selected from the group consisting of D-Trp, and a protected / modified form thereof;

[0297] In some embodiments, P1 is selected from the group consisting of Gly; D-His, D-Ser, and a protected / modified form thereof; P2 is a D-amino acid selected from the group consisting of D-Tyr, D-Trp, D-Phe, D-His, D-Leu, D-Glu, and a protected / modified form thereof; P3 is a D-amino acid selected from the group consisting of D-Tyr, D-His, D-Trp, D-Phe, D-Ala, D-Thr, and a protected / modified form thereof; P4 is a D-amino acid selected from the group consisting of D-His, D-Lys, D-Arg, D-Phe, D-Trp, D-Gln, D-Val, D-Thr, and a protected / modified form thereof; P5 is a D-amino acid selected from the group consisting of D-Arg, D-Lys, D-His, D-Leu, D-Tyr, D-Gln, and a protected / modified form thereof; P6 is absent; and / or P1’ is absent or a D-amino acid selected from the group consisting of D-Trp, and a protected / modified form thereof.

[0298] In some embodiments, the peptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of

[0299] D-Arg-D-Lys-D-Tyr-D-Tyr-Gly (SEQ ID NO: 1)

[0300] D-Lys-D-Lys-D-Tyr-D-Tyr-Gly (SEQ ID NO: 2)

[0301] D-Lys-D-Arg-D-Tyr-D-Tyr-Gly (SEQ ID NO: 3)

[0302] D-Lys-D-His-D-Tyr-D-Tyr-Gly (SEQ ID NO: 4)

[0303] D-Arg-D-His-D-Tyr-D-Tyr-Gly (SEQ ID NO: 5)

[0304] D-Arg-D-Arg-D-Tyr-D-Tyr-Gly (SEQ ID NO: 6)

[0305] D-Arg-D-Phe-D-Tyr-D-Tyr-Gly (SEQ ID NO: 7)

[0306] D-His-D-Arg-D-Tyr-D-Tyr-Gly (SEQ ID NO: 8)

[0307] D-Arg-D-Arg-D-Ala-D-Tyr-Gly (SEQ ID NO: 9)

[0308] D-His-D-Arg-D-Ala-D-Tyr-Gly (SEQ ID NO: 10)

[0309] D-Arg-D-Phe-D-Ala-D-Tyr-Gly (SEQ ID NO: 11)

[0310] D-Arg-D-Arg-D-His-D-Tyr-Gly (SEQ ID NO: 12)

[0311] D-Arg-D-Lys-D-His-D-Tyr-Gly (SEQ ID NO: 13)

[0312] D-Arg-D-His-D-Ala-D-Tyr-Gly (SEQ ID NO: 14)

[0313] D-Lys-D-Arg-D-Ala-D-Tyr-Gly (SEQ ID NO: 15)

[0314] D-Arg-D-Lys-D-Ala-D-Tyr-Gly (SEQ ID NO: 16)

[0315] D-Arg-D-His-D-His-D-Tyr-Gly (SEQ ID NO: 17)

[0316] D-Arg-D-Phe-D-His-D-Tyr-Gly (SEQ ID NO: 18)

[0317] D-Arg-D-Lys-D-Phe-D-Trp-Gly (SEQ ID NO: 19)

[0318] D-Arg-D-Lys-D-Phe-D-Tyr-Gly (SEQ ID NO: 20)

[0319] D-Arg-D-Lys-D-Phe-D-Leu-Gly (SEQ ID NO: 21)

[0320] D-Arg-D-Lys-D-Tyr-D-Phe-Gly (SEQ ID NO: 22)

[0321] D-Leu-D-Lys-D-Phe-D-Phe-Gly (SEQ ID NO: 23)

[0322] D-Arg-D-Trp-D-Phe-D-Phe-Gly (SEQ ID NO: 24)

[0323] D-Arg-D-Lys-D-Phe-D-Phe-Gly (SEQ ID NO: 25)

[0324] D-Tyr-D-Lys-D-Phe-D-Phe-Gly (SEQ ID NO: 26)

[0325] D-Arg-D-Arg-D-Phe-D-Phe-Gly (SEQ ID NO: 27)

[0326] D-Arg-D-Thr-D-Phe-D-Phe-Gly (SEQ ID NO: 28)

[0327] D-Arg-D-His-D-Phe-D-Phe-Gly (SEQ ID NO: 29)

[0328] D-Lys-D-Lys-D-Phe-D-Phe-Gly (SEQ ID NO: 30)

[0329] D-Arg-D-Lys-D-Phe-D-Glu-Gly (SEQ ID NO: 31)

[0330] D-Arg-D-Lys-D-Phe-D-His-Gly (SEQ ID NO: 32)

[0331] D-Arg-D-Lys-D-Thr-D-Phe-Gly (SEQ ID NO: 33)

[0332] D-Arg-D-Lys-D-Trp-D-Phe-Gly (SEQ ID NO: 34)

[0333] D-Arg-D-Gln-D-Phe-D-Phe-Gly (SEQ ID NO: 35)

[0334] D-Arg-D-Val-D-Phe-D-Phe-Gly (SEQ ID NO: 36)

[0335] D-Gln-D-Lys-D-Phe-D-Phe-Gly (SEQ ID NO: 37)

[0336] D-His-D-Lys-D-Phe-D-Phe-Gly (SEQ ID NO: 38)

[0337] D-Tyr-D-Lys-D-Tyr-D-Tyr-Gly (SEQ ID NO: 39)

[0338] D-Arg-D-Trp-D-Tyr-D-Tyr-Gly (SEQ ID NO: 40)

[0339] D-Tyr-D-Lys-D-Phe-D-Tyr-Gly (SEQ ID NO: 41)

[0340] D-Arg-D-Trp-D-Phe-D-Tyr-Gly (SEQ ID NO: 42)

[0341] D-Arg-D-Lys-D-Tyr-D-Tyr-D-His (SEQ ID NO: 43)

[0342] D-Arg-D-Lys-D-Tyr-D-Tyr-D-Ser (SEQ ID NO: 44) .

[0343] In a fourth aspect, the present disclosure provides use of the peptide of the present disclosure as a linker moiety for ligand-therapeutic agent conjugate, for example, ADC, therapeutic use or detection and diagnosis.

[0344] The present disclosure provides the peptide of the present disclosure for use as a linker moiety for ligand-therapeutic agent conjugate, for example, ADC, therapeutic use or detection and diagnosis.

[0345] In some embodiments, the linker moiety is cleavable by human cathepsin B.

[0346] The present disclosure provides a method of preparing a ligand-therapeutic agent conjugate, comprising covalently linking (i) a ligand component and (ii) a therapeutic agent through a linker moiety comprising the peptide of the present disclosure or the linker moiety of the present disclosure.

[0347] The present disclosure provides use of the peptide of the present disclosure, or the linker moiety of the present disclosure, as a cleavable linker moiety in a ligand-therapeutic agent conjugate.

[0348] The present disclosure provides an in vitro method for detecting cathepsin B activity in a sample, comprising contacting the sample with a substrate comprising the recognition sequence of the present disclosure or the peptide of the present disclosure, and detecting cleavage at the “ / ” site.

[0349] In a fifth aspect, the present disclosure provides a linker moiety comprising an amino acid sequence of Formula (III)

[0350] -NHPn…-P6-P5-P4-P3-P2-P1-P1’ -P2’ -…Pm’ C=O- (III)

[0351] wherein, P1, P2, P3, P4, P5, P6, Pn, P1’ , P2’ , Pm’ , n and m are as defined herein; “-NH” indicates an imino group at the amino terminus of the amino acid sequence that can be covalently linked to other groups. “C=O-” indicates a carbonyl group at the carboxyl terminus of an amino acid sequence that can be covalently linked to other groups.

[0352] In some embodiment, the linker moiety comprises a first terminal functional group and a second terminal functional group as points of covalent attachment, the first terminal functional group comprises an amino / imino-containing group and the second terminal functional group comprises a carbonyl-containing group.

[0353] In some embodiments, the linker moiety is a linker moiety having an N-terminal imino group and a C-terminal carbonyl group for covalent coupling to, for example, a ligand and / or a therapeutic agent.

[0354] The present disclosure provides a linker moiety comprising an amino acid sequence of formula (IIIa)

[0355] -NHP6-P5-P4-P3-P2-P1-P1’ C=O- (IIIa)

[0356] wherein, P1’ , P1, P2, P3, P4, P5, and P6 are as defined herein; “-NH” indicates an imino group at the amino terminus of the amino acid sequence that can be covalently linked to other groups. “C=O-” indicates a carbonyl group at the carboxyl terminus of an amino acid sequence that can be covalently linked to other groups.

[0357] Alternatively, the amino acid sequence of the linker moiety can also be simplified expressed as Formula (IIIb)

[0358] -P6-P5-P4-P3-P2-P1-P1’ - (IIIb)

[0359] In some embodiments, the linker moiety comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of

[0360] -D-Arg-D-Lys-D-Tyr-D-Tyr-Gly- (SEQ ID NO: 1)

[0361] -D-Lys-D-Lys-D-Tyr-D-Tyr-Gly- (SEQ ID NO: 2)

[0362] -D-Lys-D-Arg-D-Tyr-D-Tyr-Gly- (SEQ ID NO: 3)

[0363] -D-Lys-D-His-D-Tyr-D-Tyr-Gly- (SEQ ID NO: 4)

[0364] -D-Arg-D-His-D-Tyr-D-Tyr-Gly- (SEQ ID NO: 5)

[0365] -D-Arg-D-Arg-D-Tyr-D-Tyr-Gly- (SEQ ID NO: 6)

[0366] -D-Arg-D-Phe-D-Tyr-D-Tyr-Gly- (SEQ ID NO: 7)

[0367] -D-His-D-Arg-D-Tyr-D-Tyr-Gly- (SEQ ID NO: 8)

[0368] -D-Arg-D-Arg-D-Ala-D-Tyr-Gly- (SEQ ID NO: 9)

[0369] -D-His-D-Arg-D-Ala-D-Tyr-Gly- (SEQ ID NO: 10)

[0370] -D-Arg-D-Phe-D-Ala-D-Tyr-Gly- (SEQ ID NO: 11)

[0371] -D-Arg-D-Arg-D-His-D-Tyr-Gly- (SEQ ID NO: 12)

[0372] -D-Arg-D-Lys-D-His-D-Tyr-Gly- (SEQ ID NO: 13)

[0373] -D-Arg-D-His-D-Ala-D-Tyr-Gly- (SEQ ID NO: 14)

[0374] -D-Lys-D-Arg-D-Ala-D-Tyr-Gly- (SEQ ID NO: 15)

[0375] -D-Arg-D-Lys-D-Ala-D-Tyr-Gly- (SEQ ID NO: 16)

[0376] -D-Arg-D-His-D-His-D-Tyr-Gly- (SEQ ID NO: 17)

[0377] -D-Arg-D-Phe-D-His-D-Tyr-Gly- (SEQ ID NO: 18)

[0378] -D-Arg-D-Lys-D-Phe-D-Trp-Gly- (SEQ ID NO: 19)

[0379] -D-Arg-D-Lys-D-Phe-D-Tyr-Gly- (SEQ ID NO: 20)

[0380] -D-Arg-D-Lys-D-Phe-D-Leu-Gly- (SEQ ID NO: 21)

[0381] -D-Arg-D-Lys-D-Tyr-D-Phe-Gly- (SEQ ID NO: 22)

[0382] -D-Leu-D-Lys-D-Phe-D-Phe-Gly- (SEQ ID NO: 23)

[0383] -D-Arg-D-Trp-D-Phe-D-Phe-Gly- (SEQ ID NO: 24)

[0384] -D-Arg-D-Lys-D-Phe-D-Phe-Gly- (SEQ ID NO: 25)

[0385] -D-Tyr-D-Lys-D-Phe-D-Phe-Gly- (SEQ ID NO: 26)

[0386] -D-Arg-D-Arg-D-Phe-D-Phe-Gly- (SEQ ID NO: 27)

[0387] -D-Arg-D-Thr-D-Phe-D-Phe-Gly- (SEQ ID NO: 28)

[0388] -D-Arg-D-His-D-Phe-D-Phe-Gly- (SEQ ID NO: 29)

[0389] -D-Lys-D-Lys-D-Phe-D-Phe-Gly- (SEQ ID NO: 30)

[0390] -D-Arg-D-Lys-D-Phe-D-Glu-Gly- (SEQ ID NO: 31)

[0391] -D-Arg-D-Lys-D-Phe-D-His-Gly- (SEQ ID NO: 32)

[0392] -D-Arg-D-Lys-D-Thr-D-Phe-Gly- (SEQ ID NO: 33)

[0393] -D-Arg-D-Lys-D-Trp-D-Phe-Gly- (SEQ ID NO: 34)

[0394] -D-Arg-D-Gln-D-Phe-D-Phe-Gly- (SEQ ID NO: 35)

[0395] -D-Arg-D-Val-D-Phe-D-Phe-Gly- (SEQ ID NO: 36)

[0396] -D-Gln-D-Lys-D-Phe-D-Phe-Gly- (SEQ ID NO: 37)

[0397] -D-His-D-Lys-D-Phe-D-Phe-Gly- (SEQ ID NO: 38)

[0398] -D-Tyr-D-Lys-D-Tyr-D-Tyr-Gly- (SEQ ID NO: 39)

[0399] -D-Arg-D-Trp-D-Tyr-D-Tyr-Gly- (SEQ ID NO: 40)

[0400] -D-Tyr-D-Lys-D-Phe-D-Tyr-Gly- (SEQ ID NO: 41)

[0401] -D-Arg-D-Trp-D-Phe-D-Tyr-Gly- (SEQ ID NO: 42)

[0402] -D-Arg-D-Lys-D-Tyr-D-Tyr-D-His- (SEQ ID NO: 43)

[0403] -D-Arg-D-Lys-D-Tyr-D-Tyr-D-Ser- (SEQ ID NO: 44) .

[0404] LINKER-THERAPEUTIC AGENT CONJUGATES

[0405] As used herein, the term “linker-therapeutic agent compound” refers to a compound formed by attaching a linker component to a therapeutic agent.

[0406] In a sixth aspect, the present disclosure provide a linker-therapeutic agent conjugate of Formula (IV) :

[0407] LK-TA (IV)

[0408] or a pharmaceutically acceptable salt, solvate, stereoisomer, or isotopic variant thereof,

[0409] wherein,

[0410] LK denotes to a linker component comprising the peptide of the present disclosure or the linker moiety of the present disclosure, as defined herein,

[0411] TA denotes to a therapeutic agent, as defined herein.

[0412] In some embodiments, LK denotes to a linker component, having a structure ofZ-L-Q, as defined herein.

[0413] In some embodiments, the therapeutic agent is covalently linker to the linker component LK.

[0414] In some embodiments, the ligand-therapeutic agent conjugate of the present disclosure is selected from

[0415] LIGAND-THERAPEUTIC AGENT CONJUGATES

[0416] As used herein, the term "ligand-therapeutic agent conjugate" refers to a compound obtained by connecting a ligand and a therapeutic agent together using a linker, for example a linker comprising the peptide of Formula (II) or Formula (IIa) . In the present disclosure, "ligand-therapeutic agent conjugate" is preferably antibody-drug conjugate (ADC) , which refers to a conjugate obtained by attaching an antibody (for example, a monoclonal antibody) or an antibody fragment to a therapeutic agent (for example, a cytotoxic drug) via a linker.

[0417] In a seventh aspect, the present disclosure is directed to a ligand-therapeutic agent conjugate of Formula (V) :

[0418] LG- (LK-TA) n (V)

[0419] or a pharmaceutically acceptable salt, solvate, stereoisomer, or isotopic variant thereof,

[0420] wherein,

[0421] LG denotes to a ligand component;

[0422] LK denotes to a linker component, having a structure ofZ-L-Q,

[0423] where

[0424] Z is absent or denotes to a stretcher moiety,

[0425] L denotes to a linker moiety comprising the peptide of the present disclosure or denotes to the linker moiety of the present disclosure, and

[0426] Q is absent or denotes to a spacer moiety;

[0427] TA denotes to a therapeutic agent; and

[0428] n is an integer or decimal selected from 1 to 8.

[0429] In some embodiments, the decimal is an average number of LK-TA moieties per LG ranging from 1 to 8.

[0430] In some embodiments, n is an integer from 1 to 8, or an average number of LK-TA moieties per LG ranging from 1 to 8.

[0431] In some embodiments, n is an average number in a range of 1 to 8

[0432] As used herein, the term “ligand” refers to a macromolecular compound that recognizes and binds an antigen or receptor associated with a target cell. The term “ligand component” refers to a radical derived the ligand, which constitutes one component of the ligand-therapeutic agent conjugate and is linked to other components of the ligand-therapeutic agent conjugate, such as a linker component, by covalent bonding. Herein, the terms "ligand" and "ligand component" can be used interchangeably in some cases, and those skilled in the art are fully capable of distinguishing and judging whether the term refers to a complete molecule or a radical derived therefrom.

[0433] The role of the ligand / ligand component is to present the therapeutic agent (for example, acytotoxic drug) to a population of target cells bound to the ligand. The ligand includes, but is not limited to, protein-like hormones, lectins, growth factors, antibodies or other molecules capable of binding to cells. In some embodiments, the ligand / ligand component may form a linking bond with the linker component via a heteroatom on the ligand. Preferably, the ligand / ligand component is an antibody or antigen-binding fragment thereof, and the antibody is selected from a chimeric antibody, a humanized antibody, a fully human antibody or a mouse-derived antibody; preferably a monoclonal antibody.

[0434] In some embodiments, the ligand / ligand component is coupled to the linker component via a mercapto group (-SH) , amine group (-NH2) , or azide group (-N3) .

[0435] In some embodiments, the antibody or antigen-binding fragment thereof is coupled to the linker component via a mercapto group (-SH) , amine group (-NH2) , or azide group (-N3) on the side chain of an amino acid residue.

[0436] As used herein, the term “antibody” refers to any antigen-binding molecule that contains at least one (e.g., one, two, three, four, five, or six) complementary determining region (CDR) (e.g., any of the three CDRs from an immunoglobulin light chain or any of the three CDRs from an immunoglobulin heavy chain) and is capable of specifically binding to an epitope. Non-limiting examples of antibodies include: monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, multi-specific antibodies (e.g., bi-specific antibodies) , single-chain antibodies, chimeric antibodies, human antibodies, and humanized antibodies. In some embodiments, an antibody can contain an Fc region of a human antibody. The term antibody also includes derivatives, e.g., bi-specific antibodies, single-chain antibodies, diabodies, linear antibodies, and multi-specific antibodies formed from antibody fragments.

[0437] As used herein, the term “antigen-binding fragment” refers to a portion of a full-length antibody, wherein the portion of the antibody is capable of specifically binding to an antigen. In some embodiments, the antigen-binding fragment contains at least one variable domain (e.g., a variable domain of a heavy chain or a variable domain of light chain) . Non-limiting examples of antibody fragments include, e.g., Fab, Fab’ , F (ab’ ) 2, and Fv fragments.

[0438] As used herein, the term “human antibody” refers to an antibody that is encoded by an endogenous nucleic acid (e.g., rearranged human immunoglobulin heavy or light chain locus) derived from a human. In some embodiments, a human antibody is collected from a human or produced in a human cell culture (e.g., human hybridoma cells) . In some embodiments, ahuman antibody is produced in a non-human cell (e.g., a mouse or hamster cell line) . In some embodiments, a human antibody is produced in a bacterial or yeast cell. In some embodiments, a human antibody is produced in a transgenic non-human animal (e.g., a bovine) containing an unrearranged or rearranged human immunoglobulin locus (e.g., heavy or light chain human immunoglobulin locus) .

[0439] As used herein, the term “chimeric antibody” refers to an antibody that contains a sequence present in at least two different species (e.g., antibodies from two different mammalian species such as a human and a mouse antibody) . A non-limiting example of a chimeric antibody is an antibody containing the variable domain sequences (e.g., all or part of a light chain and / or heavy chain variable domain sequence) of a non-human (e.g., mouse) antibody and the constant domains of a human antibody. Additional examples of chimeric antibodies are described herein and are known in the art.

[0440] As used herein, the term “humanized antibody” refers to a non-human antibody which contains minimal sequence derived from a non-human (e.g., mouse) immunoglobulin and contains sequences derived from a human immunoglobulin. In non-limiting examples, humanized antibodies are human antibodies (recipient antibody) in which hypervariable (e.g., CDR) region residues of the recipient antibody are replaced by hypervariable (e.g., CDR) region residues from a non-human antibody (e.g., a donor antibody) , e.g., a mouse, rat, or rabbit antibody, having the desired specificity, affinity, and capacity. In some embodiments, the Fv framework residues of the human immunoglobulin are replaced by corresponding non-human (e.g., mouse) immunoglobulin residues. In some embodiments, humanized antibodies may contain residues which are not found in the recipient antibody or in the donor antibody. These modifications can be made to further refine antibody performance. In some embodiments, the humanized antibody contains substantially all of at least one, and typically two, variable domains, in which all or substantially all of the hypervariable loops (CDRs) correspond to those of a non-human (e.g., mouse) immunoglobulin and all or substantially all of the framework regions are those of a human immunoglobulin. The humanized antibody can also contain at least a portion of an immunoglobulin constant region (Fc) , typically, that of a human immunoglobulin. Humanized antibodies can be produced using molecular biology methods known in the art. Non-limiting examples of methods for generating humanized antibodies are described herein.

[0441] As used herein, the term “single-chain antibody” refers to a single polypeptide that contains at least two immunoglobulin variable domains (e.g., a variable domain of a mammalian immunoglobulin heavy chain or light chain) that is capable of specifically binding to an antigen. Non-limiting examples of single-chain antibodies are described herein.

[0442] Preferably, the antibody described in the present disclosure refers to an immunoglobulin, which is a tetrapeptide chain structure consisting of two identical heavy chains and two identical light chains linked by interchain disulphide bonds. Immunoglobulins differ in the composition and order of amino acids in the constant region of the heavy chain, and therefore in their antigenicity. Accordingly, immunoglobulins can be divided into five classes, or isotypes of immunoglobulins, namely IgM, IgD, IgG, IgA and IgE, whose corresponding heavy chains areμ, δ, γ, α, andεchains respectively. For example, IgG can be divided into IgG1, IgG2, IgG3 and IgG4. Light chains can be divided intoκorλchains depending on their constant regions. Each of the five classes of Ig can have either aκchain or aλchain.

[0443] Preferably, the antibodies described in the present disclosure are specific antibodies against cell surface antigens on target cells, non-limiting embodiments being the following antibodies: anti-HER2 (ErbB2) antibody, anti-EGFR antibody, anti-B7-H3 antibody, anti-c-Met antibody, anti-HER3 (ErbB3) antibody, anti-HER4 (ErbB4) antibody, anti-CD20 antibody, anti-CD22 antibody, anti-CD30 antibody, anti-CD33 antibody, anti-CD44 antibody, anti-CD56 antibody, anti-CD70 antibody, anti CD73 antibody, anti-CD105 antibody, anti-CEA antibody, anti-A33 antibody, anti-Cripto antibody, anti-EphA2 antibody, anti-G250 antibody, anti-MUCl antibody, anti-Lewis Y antibody, anti-VEGFR antibody, anti-GPNMB antibody, anti-Integrin antibody, anti-PSMA antibody, anti-Tenascin-C antibody, anti SLC44A4 antibody, anti CTLA4 antibody, OX40 antibbody or one or more of anti-Mesothelin antibodies; preferably trastuzumab, pertuzumab, nimotuzumab, Enoblituzumab, Emibetuzumab, Inotuzumab, Pinatuzumab, Brentuximab, Gemtuzumab, Bivatuzumab, Lorvotuzumab, cBR96 and Glematumamab.

[0444] In some embodiments, the antibody is an antibody capable of binding to HER2, HER3, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD37, CD45, CD56, CD66e, CD70, CD74, CD79b, CD137, CD138, CD147, CD223, EpCAM, Mucin 1, STEAP1, GPNMB, FGF2, FOLR1, EGFR, EGFRvIII, Tissue factor, c-MET, FGFR, Nectin 4, AGS-16, Guanylyl cyclase C, Mesothelin, SLC44A4, PSMA, EphA2, AGS-5, GPC-3, c-KIT, ROR1, PD-L1, CD27L, 5T4, Mucin 16, NaPi2b, STEAP, SLITRK6, ETBR, BCMA, Trop-2, CEACAM5, SC-16, SLC39A6, Delta-like protein3, or Claudin 18.2 tumor-associated antigen.

[0445] As used herein, the term “linker component” refers to a chemical group that act like a bridge to connect the ligand component and the therapeutic component in ligand-therapeutic agent conjugate, for example an antibody and a cytotoxic payload ( “drug” ) in the case of ADC. The linker component should be stable in the bloodstream to prevent premature release of the t therapeutic component before it reaches the target cells. This is crucial for minimizing damage to healthy tissues.

[0446] In some embodiments, the linker component has a structure ofZ-L-Q, wherein Z is absent or denotes to a stretcher moiety, L denotes to a linker moiety comprising the peptide of the present disclosure, and Q is absent or denotes to a spacer moiety.

[0447] In some embodiments, Z is absent, the linker moiety L is directly connected to the ligand component.

[0448] In some embodiments, Z denotes to a stretcher moiety.

[0449] As used herein, the “stretcher moiety” (which can be referred to as “stretcher” for short herein) refers to a specific part of the linker component that directly attaches to the ligand component, for example, antibody in the case of ADC. It functions as a “hitch” that connects the rest of the linker component (and ultimately the therapeutic agent component) to the ligand component. The stretcher is not a separate entity but rather a functional moiety within the overall linker component. It's the chemical group or portion of the linker component that forms a covalent bond with the ligand component. Useful functional groups that can be present on a ligand, either naturally or via chemical manipulation include, but are not limited to, sulfhydryl (-SH) , amino, hydroxyl, carboxy, azide, the anomeric hydroxyl group of a carbohydrate, and carboxyl. The stretcher typically targets specific functional groups on the ligand component, for example, specifical amino acid residues on the antibody, such as: lysine residues (which are abundant on antibody surfaces and are often targeted using amine-reactive chemistries) , cysteine residues (which are often targeted after partial reduction of disulfide bonds in the antibody) , modified lysine and / or cysteine residues with azide. The stretcher can comprise a variety of chemical groups, but some common examples include but not limited to maleimide, which reacts specifically with thiol groups (sulfhydryl groups) on cysteine residues, N-hydroxysuccinimide (NHS) esters, which react with amine groups on lysine residues, and DBCO, which reacts septically with azide groups introduced on lysine or cysteines residues.

[0450] In the present disclosure, there is no specific limitation on the type and structure of the stretcher that is linked to the ligand (including the antibody) . Those chemical structures that can be utilized as stretchers and are widely known to those skilled in the art can all be employed in the ligand-ligand-therapeutic agent conjugates disclosed herein.

[0451] In some embodiments, the stretcher moiety Z has a structure of:

[0452] wherein Z’ is a function group capable of being coupled to the ligand;

[0453] A1 is absent or is selected from the group consisting of C1-8 alkylidene, C2-8 alkenylidene, C3-8 cycloalkylidene, C3-8 cycloalkenylidene, 3-to 10-membered heterocyclylene, -O-C1-8 alkylidene, arylene, C1-8 alkylidene-arylene, arylene-C1-8 alkylidene, C1-8 alkylidene-C3-8 cycloalkylidene, C3-8 cycloalkylidene-C1-8 alkylidene, C1-8 alkylidene-3-to 10-membered heterocyclylene, 3-to 10-membered heterocyclylene-C1-8 alkylidene, - (CH2CH2O) r-, and -(CH2CH2O) r-C1-8 alkylidene-, C1-8 alkylidene- (CH2CH2O) r, C1-8 alkylidene- (CH2CH2O) r-C1-8 alkylidene, r is an integer ranging from 1 to 8, where the aforesaid groups are optionally substituted with 1 to 4 substituents independently selected from the group consisting of halogen, -CN, RA1, -ORA1, -SRA1, and-N (RA1) 2, where each RA1 is independently selected from the group consisting of C1-6 alkyl, C1-6 haloalkyl, C3-6 cycloalkyl, 3-to 10-membered heterocyclyl, C6-10 aryl, and 5-to 10-membered heteroaryl; and

[0454] A2 is absent or is selected from an amino acid residue, dipeptide, tripeptide, tetrapeptide, pentapeptide, hexapeptide, and modified form thereof,

[0455] denotes to the site covalently attached to the ligand component LG or the linker moiety L.

[0456] In some preferred embodiments, the function group Z’ is selected from the group consisting of

[0457] “*” denotes to the site covalently attached to A; and

[0458] denotes to the site covalently attached to the ligand component LG.

[0459] In some preferred embodiments, the group A1 is selected from the group consisting of methylene, ethylene, propylene, butylene, pentylene, hexylene, C1-8 alkylidene- (CH2CH2O) r-C1-8 alkylidene, r is an integer ranging from 1 to 8.

[0460] In some preferred embodiments, the stretcher moiety Z is selected from the group consisting of

[0461] denotes to the site covalently attached to the ligand component LG or the linker moiety L.

[0462] As used herein, the term “linker moiety” refers to an essential part constituting a linker component. The linker component may not include a stretcher moiety and a spacer moiety, but must include a linker moiety. In the absence of a stretcher moiety and / or a spacer moiety, the linker moiety can be directly covalently linked to a ligand component and / or a therapeutic agent.

[0463] In the present disclosure, the linker moiety is a cleavable linker moiety, which means that the linker moiety can be cleaved in a physiological environment by enzymes such as cathepsins, especially Cathepsin B, phosphatases and pyrophosphatases, β-glucuronidases and β-galactosidases, sulfonyl esterases, etc., or is cleaved under acidic conditions.

[0464] In some embodiments, the linker moiety comprises the peptide of the present disclosure as defined herein. One or more groups selected from amino acid residues, amino acid residue analogs can be linked to either side of the peptides of the present disclosure, as long as they do not prevent the cleavable linking moiety from being cleaved in a physiological environment.

[0465] In some embodiments, the linker moiety consists of the peptide of the present disclosure as defined herein.

[0466] In some embodiment, the linker moiety comprises or consists of the peptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of

[0467] D-Arg-D-Lys-D-Tyr-D-Tyr-Gly (SEQ ID NO: 1)

[0468] D-Lys-D-Lys-D-Tyr-D-Tyr-Gly (SEQ ID NO: 2)

[0469] D-Lys-D-Arg-D-Tyr-D-Tyr-Gly (SEQ ID NO: 3)

[0470] D-Lys-D-His-D-Tyr-D-Tyr-Gly (SEQ ID NO: 4)

[0471] D-Arg-D-His-D-Tyr-D-Tyr-Gly (SEQ ID NO: 5)

[0472] D-Arg-D-Arg-D-Tyr-D-Tyr-Gly (SEQ ID NO: 6)

[0473] D-Arg-D-Phe-D-Tyr-D-Tyr-Gly (SEQ ID NO: 7)

[0474] D-His-D-Arg-D-Tyr-D-Tyr-Gly (SEQ ID NO: 8)

[0475] D-Arg-D-Arg-D-Ala-D-Tyr-Gly (SEQ ID NO: 9)

[0476] D-His-D-Arg-D-Ala-D-Tyr-Gly (SEQ ID NO: 10)

[0477] D-Arg-D-Phe-D-Ala-D-Tyr-Gly (SEQ ID NO: 11)

[0478] D-Arg-D-Arg-D-His-D-Tyr-Gly (SEQ ID NO: 12)

[0479] D-Arg-D-Lys-D-His-D-Tyr-Gly (SEQ ID NO: 13)

[0480] D-Arg-D-His-D-Ala-D-Tyr-Gly (SEQ ID NO: 14)

[0481] D-Lys-D-Arg-D-Ala-D-Tyr-Gly (SEQ ID NO: 15)

[0482] D-Arg-D-Lys-D-Ala-D-Tyr-Gly (SEQ ID NO: 16)

[0483] D-Arg-D-His-D-His-D-Tyr-Gly (SEQ ID NO: 17)

[0484] D-Arg-D-Phe-D-His-D-Tyr-Gly (SEQ ID NO: 18)

[0485] D-Arg-D-Lys-D-Phe-D-Trp-Gly (SEQ ID NO: 19)

[0486] D-Arg-D-Lys-D-Phe-D-Tyr-Gly (SEQ ID NO: 20)

[0487] D-Arg-D-Lys-D-Phe-D-Leu-Gly (SEQ ID NO: 21)

[0488] D-Arg-D-Lys-D-Tyr-D-Phe-Gly (SEQ ID NO: 22)

[0489] D-Leu-D-Lys-D-Phe-D-Phe-Gly (SEQ ID NO: 23)

[0490] D-Arg-D-Trp-D-Phe-D-Phe-Gly (SEQ ID NO: 24)

[0491] D-Arg-D-Lys-D-Phe-D-Phe-Gly (SEQ ID NO: 25)

[0492] D-Tyr-D-Lys-D-Phe-D-Phe-Gly (SEQ ID NO: 26)

[0493] D-Arg-D-Arg-D-Phe-D-Phe-Gly (SEQ ID NO: 27)

[0494] D-Arg-D-Thr-D-Phe-D-Phe-Gly (SEQ ID NO: 28)

[0495] D-Arg-D-His-D-Phe-D-Phe-Gly (SEQ ID NO: 29)

[0496] D-Lys-D-Lys-D-Phe-D-Phe-Gly (SEQ ID NO: 30)

[0497] D-Arg-D-Lys-D-Phe-D-Glu-Gly (SEQ ID NO: 31)

[0498] D-Arg-D-Lys-D-Phe-D-His-Gly (SEQ ID NO: 32)

[0499] D-Arg-D-Lys-D-Thr-D-Phe-Gly (SEQ ID NO: 33)

[0500] D-Arg-D-Lys-D-Trp-D-Phe-Gly (SEQ ID NO: 34)

[0501] D-Arg-D-Gln-D-Phe-D-Phe-Gly (SEQ ID NO: 35)

[0502] D-Arg-D-Val-D-Phe-D-Phe-Gly (SEQ ID NO: 36)

[0503] D-Gln-D-Lys-D-Phe-D-Phe-Gly (SEQ ID NO: 37)

[0504] D-His-D-Lys-D-Phe-D-Phe-Gly (SEQ ID NO: 38)

[0505] D-Tyr-D-Lys-D-Tyr-D-Tyr-Gly (SEQ ID NO: 39)

[0506] D-Arg-D-Trp-D-Tyr-D-Tyr-Gly (SEQ ID NO: 40)

[0507] D-Tyr-D-Lys-D-Phe-D-Tyr-Gly (SEQ ID NO: 41)

[0508] D-Arg-D-Trp-D-Phe-D-Tyr-Gly (SEQ ID NO: 42)

[0509] D-Arg-D-Lys-D-Tyr-D-Tyr-D-His (SEQ ID NO: 43)

[0510] D-Arg-D-Lys-D-Tyr-D-Tyr-D-Ser (SEQ ID NO: 44) .

[0511] In some embodiments, Q is absent, the linker moiety L is directly connected to the therapeutic agent component. In some embodiments, the linker moiety L is coupled to the therapeutic agent component via a bond selected from the group consisting of carbonyl, amide, and ester bond, preferably an amide bond.

[0512] In some embodiments, Q denotes to a spacer moiety.

[0513] As used herein, the “spacer moiety” (which can be referred to as “spacer” for short herein) refers to a specific part of the linker component that directly attaches to the therapeutic agent component, for example, cytotoxic drug in the case of ADC. It provides physical separation between these two bulky molecules, the ligand component and the therapeutic agent component. The spacer is not a separate entity but rather a functional moiety within the overall linker component. It's the chemical group or portion of the linker component that forms a covalent bond with the therapeutic agent component. The spacer reduces steric hindrance, and prevents the large ligand component, for example, an antibody from interfering with activity of the therapeutic agent component, for example, a cytotoxic drug. If the linker is cleavable, the spacer can provide the necessary environment for efficient cleavage and payload release.

[0514] In the present disclosure, there is no specific limitation on the type and structure of the spacer that is linked to the therapeutic agent (including the cytotoxic drug) . Those chemical structures that can be utilized as spacers and are widely known to those skilled in the art can all be employed in the ligand-therapeutic agent conjugates disclosed herein.

[0515] In some embodiments, the spacer moiety Q is coupled to the therapeutic agent component via a bond selected from the group consisting of carbonyl, amide, and ester bond, preferably an amide bond.

[0516] In some embodiments, the spacer moiety is a self-immolative spacer. Within a cleavable linker, the self-immolative spacer is the part that undergoes a rapid, spontaneous fragmentation after the initial cleavage event. This fragmentation leads to the complete release of the payload, i.e. the therapeutic agent, for example, a cytotoxic drug in the case of ADC. In some embodiments, the self-immolative spacer includes but is not limited to p-aminobenzyl alcohol (PABA) derivatives, comprising p-aminobenzyl carbamates, p-aminobenzyl ethers; aminomethoxy derivatives; 1, 2-diol derivatives; disulfide-based self-immolative spacers; cyclization-induced self-immolative linkers; and grob fragmentation-based self-immolative linkers.

[0517] In some embodiments, the spacer Q is selected from the group consisting of PAB, 3- (4-aminophenyl) propionic acid.

[0518] As used herein, the term “therapeutic agent” , refers to a biologically active molecule that is designed to kill the targeted cells, typically cancer cells. It's the "warhead" of the ADC, delivering the cytotoxic effect.

[0519] In some embodiments, the therapeutic agent is a cytotoxic or cytostatic agent (e.g., monomethyl auristatin E, monomethyl auristatin F, cytochalasin B, gramicidin D, ethidium bromide, emetine, mitomycin, etoposide, tenoposide, vincristine, vinblastine, colchicin, doxorubicin, daunorubicin, dihydroxy anthracin, maytansinoids such as DM-1 and DM-4, dione, mitoxantrone, mithramycin, actinomycin D, 1-dehydrotestosterone, glucocorticoids, procaine, tetracaine, lidocaine, propranolol, puromycin, epirubicin, and cyclophosphamide and analogs) . Useful classes of cytotoxic, cytostatic, or immunomodulatory agents include, for example, antitubulin agents, DNA minor groove binders, DNA replication inhibitors, and alkylating agents.

[0520] In some embodiments, the therapeutic agent can include, but not limited to, cytotoxic reagents, such as chemo-therapeutic agents, immunotherapeutic agents and the like, antiviral agents or antimicrobial agents. In some embodiments, the therapeutic agent to be conjugated can be selected from, but not limited to, MMAE (monomethyl auristatin E) , MMAD (monomethyl auristatin D) , or MMAF (monomethyl auristatin F) .

[0521] In some embodiments, the therapeutic agent is an auristatin, such as auristatin E (also known in the art as a derivative of dolastatin-10) or a derivative thereof. The auristatin can be, for example, an ester formed between auristatin E and a keto acid. For example, auristatin E can be reacted with paraacetyl benzoic acid or benzoylvaleric acid to produce AEB and AEVB, respectively. Other typical auristatins include AFP, MMAF, and MMAE. The synthesis and structure of exemplary auristatins are described in U. S. Patent Application Publication No. 2003-0083263; International Patent Publication No. WO 04 / 010957, International Patent Publication No. WO 02 / 088172, and U.S. Pat. Nos. 7,498,298, 6,884,869, 6,323,315; 6,239,104; 6,034,065; 5,780,588; 5,665,860; 5,663,149; 5,635,483; 5,599,902; 5,554,725; 5,530,097; 5,521,284; 5,504,191; 5,410,024; 5,138,036; 5,076,973; 4,986,988; 4,978,744; 4,879,278; 4,816,444; and 4,486,414, each of which is incorporated by reference herein in its entirety and for all purposes.

[0522] Auristatins have been shown to interfere with microtubule dynamics and nuclear and cellular division and have anticancer activity. Auristatins bind tubulin and can exert a cytotoxic or cytostatic effect on cancer cell. There are a number of different assays, known in the art, which can be used for determining whether an auristatin or resultant antibody-drug conjugate exerts a cytostatic or cytotoxic effect on a desired cell.

[0523] In some embodiments, the therapeutic agent is a chemotherapeutic agent. Examples of chemotherapeutic agents include alkylating agents such as thiotepa and cyclosphosphamide (CYTOXANTM) ; alkyl sulfonates such as busulfan, improsulfan and piposulfan; aziridines such as benzodopa, carboquone, meturedopa, and uredopa; ethylenimines and methylamelamines including altretamine, triethylenemelamine, triethylenephosphoramide, triethylenethiophosphaoramide and trimethylolomelamine; nitrogen mustards such as chlorambucil, chlornaphazine, cholophosphamide, estramustine, ifosfamide, mechlorethamine, mechlorethamine oxide hydrochloride, melphalan, novembichin, phenesterine, prednimustine, trofosfamide, uracil mustard; nitrosureas such as carmustine, chlorozotocin, fotemustine, lomustine, nimustine, ranimustine; antibiotics such as aclacinomysins, actinomycin, authramycin, azaserine, bleomycins, cactinomycin, calicheamicin, carabicin, carminomycin, carzinophilin, chromomycins, dactinomycin, daunorubicin, detorubicin, 6-diazo-5-oxo-L-norleucine, doxorubicin, epirubicin, esorubicin, idarubicin, marcellomycin, mitomycins, mycophenolic acid, nogalamycin, olivomycins, peplomycin, potfiromycin, puromycin, quelamycin, rodorubicin, streptonigrin, streptozocin, tubercidin, ubenimex, zinostatin, zorubicin; anti-metabolites such as methotrexate and 5-fluorouracil (5-FU) ; folic acid analogues such as denopterin, methotrexate, pteropterin, trimetrexate; purine analogs such as fludarabine, 6-mercaptopurine, thiamiprine, thioguanine; pyrimidine analogs such as ancitabine, azacitidine, 6-azauridine, carmofur, cytarabine, dideoxyuridine, doxifluridine, enocitabine, floxuridine, 5-FU; androgens such as calusterone, dromostanolone propionate, epitiostanol, mepitiostane, testolactone; anti-adrenals such as aminoglutethimide, mitotane, trilostane; folic acid replenisher such as frolinic acid; aceglatone; aldophosphamide glycoside; aminolevulinic acid; amsacrine; bestrabucil; bisantrene; edatraxate; defofamine; demecolcine; diaziquone; elfornithine; elliptinium acetate; etoglucid; gallium nitrate; hydroxyurea; lentinan; lonidamine; mitoguazone; mitoxantrone; mopidamol; nitracrine; pentostatin; phenamet; pirarubicin; podophyllinic acid; 2-ethylhydrazide; procarbazine; PSK7; razoxane; sizofiran; spirogermanium; tenuazonic acid; triaziquone; 2’ , 2’ , 2’ -trichlorotriethylamine; urethan; vindesine; dacarbazine; mannomustine; mitobronitol; mitolactol; pipobroman; gacytosine; arabinoside ( “Ara-C” ) ; cyclophosphamide; taxanes, e. g. paclitaxel (TAXOL Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N. J. ) and doxetaxel (TAXOTERE Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France) ; chlorambucil; gemcitabine; 6-thioguanine; platinum analogs such as cisplatin and carboplatin; vinblastine; platinum; etoposide (VP-16) ; ifosfamide; mitomycin C; mitoxantrone; vincristine; vinorelbine; navelbine; novantrone; teniposide; daunomycin; aminopterin; xeloda; ibandronate; CPT-11; topoisomerase inhibitor RFS 2000; difluoromethylornithine (DMFO) ; retinoic acid; esperamicins; capecitabine; and pharmaceutically acceptable salts, acids or derivatives of any of the above. Also included in this definition are anti-hormonal agents that act to regulate or inhibit hormone action on tumors such as anti-estrogens including for example tamoxifen, raloxifene, aromatase inhibiting 4 (5) -imidazoles, 4-hydroxytamoxifen, trioxifene, keoxifene, LY117018, onapristone, and toremifene (Fareston) ; and anti-androgens such as flutamide, nilutamide, bicalutamide, leuprolide, and goserelin; and pharmaceutically acceptable salts, acids or derivatives of any of the above. A detailed description of the chemotherapeutic agents can be found in, e.g., US20180193477A1, which is incorporated by reference in its entirety.

[0524] In some embodiments, n denotes to the average amount of therapeutic agent (for example, a cytotoxic drug) loaded on each ligand (for example, an antibody) in a molecule of Formula (V) . It is also expressed as a ratio of the amount of drug to the amount of antibody, i.e., drug-to-antibody ratio (abbreviated as DAR) in the case of ADC. In some embodiments, n exemplarily may be a number of 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8. The average amount of drug per ADC molecule after the coupling reaction can be identified by conventional methods such as UV / visible spectroscopy, mass spectrometry, ELISA tests and HPLC characterization.

[0525] USAGE AND ADMINISTRATION

[0526] The antibody-drug conjugates of the present disclosure-or a pharmaceutically acceptable salt, solvate, stereoisomer, or isotopic variant thereof, including mixtures thereof in all ratios-can be used as medicaments. They are found to exhibit pharmacological activity of inhibiting tumors.

[0527] Accordingly, the antibody-drug conjugates of the present disclosure being anti-tumor agents are useful in particular in the treatment of cancer, in particular tumors including solid tumor, brain cancer, lung cancer, melanoma, prostate cancer, esophageal squamous cell carcinoma, leukemia, lymphoma, ovarian cancer, colorectal cancer, head and neck cancer, bladder cancer, renal cancer pancreatic cancer, liver cancer, bladder cancer, stomach cancer or breast cancer. Without wishing to commit to any specific theory or explanation, it may be assumed that the antibody-drug conjugates might be able to achieve this by direct effects on the cancer cells and / or indirectly by modulating the response of the immune system against the tumor.

[0528] The antibody-drug conjugates of the present disclosure may be administered in an amount effective to treat the diseases or conditions as described herein. The antibody-drug conjugates of the present disclosure can be administered as compound per se, or alternatively, as a pharmaceutically acceptable salt. For administration and dosing purposes, the antibody-drug conjugates of the present disclosure per se or pharmaceutically acceptable salt, solvate, stereoisomer, or isotopic variant thereof will simply be referred to as the antibody-drug conjugates of the present disclosure.

[0529] The antibody-drug conjugates of the present disclosure are administered by any suitable route in the form of a pharmaceutical composition adapted to such a route, and in a dose effective for the treatment intended. The antibody-drug conjugates of the present disclosure may be administered orally, rectally, vaginally, parenterally, or topically.

[0530] As used herein, the terms “administration” and “administer” refer to absorbing, ingesting, injecting, inhaling, implanting, or otherwise introducing the antibody-drug conjugate of the present disclosure, or a pharmaceutical composition thereof. The terms “treatment” and “treat” refer to reversing, alleviating, delaying the onset of, or inhibiting the progress of a “pathological condition” (e.g., a disease, disorder, or condition, or one or more signs or symptoms thereof) described herein. In certain embodiments, treatment may be administered after one or more signs or symptoms of a disease or condition have developed or have been observed. In other embodiments, treatment may be administered in the absence of signs or symptoms of the disease or condition. For example, treatment may be administered to a susceptible individual prior to the onset of symptoms (e.g., in light of a history of symptoms and / or in light of genetic or other susceptibility factors) . Treatment may also be continued after symptoms have resolved, for example, to delay or prevent recurrence. As used herein, the terms “disease” , “disorder” , “condition” , and “pathological condition” are used interchangeably.

[0531] Dosage levels for administration can be determined by those skilled in the art by routine experimentation. The dosage regimen for the antibody-drug conjugates of the present disclosure and / or compositions comprising said compounds is based on a variety of factors, including the type, age, weight, sex, and medical condition of the patient; the severity of the condition; the route of administration; and the activity of the particular compound employed. Thus, the dosage regimen may vary widely. For example, dosage levels for the antibody-drug conjugates of the present disclosure may be from about 0.001 to about 100 mg / kg (i.e., mg per kilogram of body weight) per day. In certain embodiments, the total daily dose of an antibody-drug conjugate of the present disclosure, administered in single or divided doses, may be from about 0.001 to about 10 mg / kg. It is not uncommon that the administration of the antibody-drug conjugates of the present disclosure may be repeated a plurality of times in a day.

[0532] In some embodiments, the antibody-drug conjugate of the present disclosure may be administered in combination with one or more of additional therapeutic agents. In certain embodiments, non-limiting examples of the additional therapeutic agents may include an anti-tumor agent. The additional therapeutic agent (s) can be administered before, after, or at the same time that the antibody-drug conjugate of the present disclosure is administered.

[0533] As used herein, the term “anti-tumor agent” refers to any agent which is administered to a subject suffered from a cancer for the purposes of treating the cancer. Conventional surgery or radiotherapy or medicinal therapy may be used in combination with the antibody-drug conjugate of the present disclosure for cancer treatment.

[0534] PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS

[0535] In some aspect, the present disclosure is directed to a pharmaceutical composition comprising the antibody-drug conjugate of Formula (V) or a pharmaceutically acceptable salt, solvate, stereoisomer, or isotopic variant thereof as provided herein, and at least one pharmaceutically acceptable diluent, carrier or excipient.

[0536] As used herein, the term “pharmaceutically acceptable diluent, carrier or excipient” refers to a diluent, carrier or excipient which is useful for preparing a pharmaceutical composition that is generally safe, non-toxic, and neither biologically nor otherwise undesirable, and includes diluent, carrier or excipient that is acceptable for veterinary use as well as human pharmaceutical use. A pharmaceutically acceptable diluent, carrier or excipient as used herein includes both one and more than one such diluent, carrier or excipient. The particular diluent, carrier or excipient used will depend upon the means and purpose for which the antibody-drug conjugates of the present disclosure is being applied. Suitable diluents, carriers and excipients are well known to those skilled in the art and are described in detail in, e.g., Ansel, Howard C, et al., Ansel’s Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems. Philadelphia: Lippincott, Williams&Wilkins, 2004; Gennaro, Alfonso R., et al., Remington: The Science and Practice of Pharmacy. Philadelphia: Lippincott, Williams&Wilkins, 2000; and Rowe, Raymond C. Handbook of Pharmaceutical Excipients. Chicago, Pharmaceutical Press, 2005. One or more of buffers, stabilizing agents, surfactants, wetting agents, lubricating agents, emulsifiers, suspending agents, preservatives, antioxidants, opaquing agents, glidants, processing aids, colorants, sweeteners, perfuming agents, flavoring agents, and other known additives may also be included to provide an elegant presentation of the drug (i.e., the compound or pharmaceutical composition as provided herein) or aid in the manufacturing of the pharmaceutical product (i.e., medicament) .

[0537] The compositions of the present disclosure may be formulated in a variety of forms. These include, for example, liquid, semi-solid, and solid dosage forms, such as liquid solutions (e.g., injectable and infusible solutions) , dispersions, or suspensions, tablets, pills, powders, liposomes, suppositories, etc. The form depends on the intended mode of administration and therapeutic application.

[0538] Pharmaceutical compositions of the present disclosure may be prepared by any of the well-known techniques of pharmacy, such as effective formulation and administration procedures. The above considerations in regard to effective formulations and administration procedures are well known in the art, and are described in standard textbooks. Formulation of pharmaceutical products is discussed in, e.g., Hoover, John E., Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania, 1975; Liberman, et al., Eds., Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Decker, New York, N.Y., 1980; and Kibbe, et al., Eds., Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3rd Edition, American Pharmaceutical Association, Washington, 1999.

[0539] In certain embodiments, the pharmaceutical compositions comprise the antibody-drug conjugate of Formula (V) or a pharmaceutically acceptable salt, solvate, stereoisomer, or isotopic variant thereof as provided herein, in combination with one or more of additional therapeutic agents such as an anti-tumor agent, and at least one pharmaceutically acceptable diluent, carrier or excipient.

[0540] In a further aspect, the present disclosure relates to a kit for treating a cancer, which comprises an antibody-drug conjugate of Formula (V) or a pharmaceutically acceptable salt, solvate, stereoisomer, or isotopic variant thereof as provided herein, or a pharmaceutical composition comprising the antibody-drug conjugate of Formula (V) or a pharmaceutically acceptable salt, solvate, stereoisomer, or isotopic variant thereof as provided herein, a container, and optionally a package insert or label indicating treatment. In certain embodiments, the kit may further contain one or more of additional therapeutic agents such as an anti-tumor agent.

[0541] METHODS OF TREATMENT

[0542] In a further aspect, the present disclosure is directed to a method of treating a cancer in a subject in need thereof, which comprises administering to the subject a therapeutically effective amount of the antibody-drug conjugate of Formula (V) or a pharmaceutically acceptable salt, solvate, stereoisomer, or isotopic variant thereof as provided herein.

[0543] As used herein, the term “subject in need thereof” is a subject having a cancer, or a subject having an increased risk of developing a cancer relative to the population at large. In certain embodiments, the subject is a warm-blooded animal. In certain embodiments, the warm-blooded animal is a mammal. In certain embodiments, the warm-blooded animal is a human.

[0544] The method of treating a cancer as described herein may be used as a monotherapy. As used herein, the term “monotherapy” refers to the administration of a single active or therapeutic compound to a subject in need thereof. In certain embodiments, monotherapy will involve administration of a therapeutically effective amount of one of the antibody-drug conjugates of the present disclosure or a pharmaceutically acceptable salt, solvate, stereoisomer, or isotopic variant thereof, to a subject in need of such treatment.

[0545] Depending upon the particular disease or condition to be treated, the method of treating a cancer described herein may involve, in addition to administration of the antibody-drug conjugate of Formula (V) , combination therapy of one or more additional therapeutic agent (s) , for example, an anti-tumor agent. As used herein, the term “combination therapy” refers to the administration of a combination of multiple active therapeutic agents. In certain embodiments, the antibody-drug conjugate of the present disclosure or a pharmaceutically acceptable salt, solvate, stereoisomer, or isotopic variant thereof may be administered simultaneously, separately or sequentially to treatment with the one or more additional therapeutic agent (s) . For example, the additional therapeutic agent (s) may be administered separately from the antibody-drug conjugate of the present disclosure, as part of a multiple dosage regimen. Alternatively, the additional therapeutic agent (s) may be part of a single dosage form, mixed with the antibody-drug conjugate of the present disclosure in a single composition.

[0546] In a further aspect, the present disclosure is directed to use of the antibody-drug conjugate of Formula (V) or a pharmaceutically acceptable salt, solvate, stereoisomer, or isotopic variant thereof as provided herein in the manufacture of a medicament for treating a cancer in a subject in need thereof.

[0547] All publications and patents mentioned herein are hereby incorporated by reference in their entirety as if each individual publication or patent were specifically and separately indicated as not incorporated by reference. In the event of conflict, this application (including any definitions herein) shall control. However, any references, articles, publications, patents, patent publications and patent applications cited herein are not and shall not be deemed to be admissions or suggestions of any kind which constitute valid prior art or form part of the common knowledge of any country in the world.

[0548] The present disclosure is further described in the following examples, which are not limiting the scope of the present disclosure as described in the claims.

[0549] Examples

[0550] Unless otherwise specified, all experiments were conducted using standard protocols well known in the art.

[0551] Example 1. Peptide synthesis

[0552] All screened peptides were synthesized on a 0.01 mmol scale using an automated parallel peptide synthesizer (SyroⅡ, Biotage) at room temperature unless otherwise stated. Fmoc-Rink amide resin was used, so the peptides were amide terminus after cleaving from the resin. Each amino acid was double coupled and the cycle included 12 minutes of coupling with 200μL Fmoc-protected amino acid (0.5 M in DMF) , 200μL HCTU (0.475 M in DMF) and 100μL N, N-diisopropylethylamine (2 M in NMP) , 3 minutes wash with DMF three times, deprotection with 20% (v / v) PIP in DMF once and 3 minutes wash with DMF four times. After completion of the process, acetylation was modified to the N-terminus using acetic anhydride: DIEA: DMF =1: 1: 8 at room temperature for 30 minutes followed by DMF washing four times. The resins were then washed thoroughly with DCM and dried under a vacuum. The peptides were then cleaved off from the resins, and side chains were deprotected using a cocktail with 2.5% (v / v) water and 2.5% (v / v) triisoproprylsilan in neat trifluoroacetic acid (TFA) for 2 hours at room temperature. The resulting peptide solution was filtered, precipitated, and washed with cold diethyl ether two times. After evaporation, the peptide solid was dissolved in 50%solvent A / B (v / v) and lyophilized. The molecular weight and purity of peptides were confirmed by LC-MS. LC-MS analysis was performed using an Agilent 1260-6230 single TOF LC / MS. The column used was Agilent ZORBAX 3.5μm 300SB-C18 and Agilent ZORBAX 5μm 300SB-CN.

[0553] Example 2. D-peptide Substrate Screening of Human Cathepsin B (EC 3.4.22.1)

[0554] Proteases typically recognize peptide substrates within a stretch of4–6 amino acids, with one or two key amino acids serving as the critical recognition residues (14-16) . To explore whether different proteases could cleave D-peptides, we constructed a combinatorial D-pentapeptide library consisting of D-amino acids and the achiral glycine, systematically varying a single amino acid or the combination of two amino acids (Library) at different positions (FIG. 2B) . A short D-peptide was added to both the N-terminal and the C-terminal of the D-peptide libraries to facilitate result analysis while ensuring that any observed proteolytic activity was due to the recognition of D-peptide substrates. We incubated human cathepsins B (hCATB) with our D-peptide libraries under its optimal proteolytic conditions, envisioning that the protease would have a higher probability of recognizing D-peptides. LC-MS was then used to identify potential proteolyzed D-peptide fragments (FIG. 2A) . The preliminary screening results revealed that hCATB exhibited promising activity on peptides in the-GGJGG- (SEQ ID NO: 45) library, such as-GGyG / G- (SEQ ID NO: 46) , -GGfG / G- (SEQ ID NO: 47) , and -GGwG / G- (SEQ ID NO: 48) (FIG. 3A and Table 3-4) . hCATB also cleaved peptides in the -GJJGG- (SEQ ID NO: 49) library, including-GyyG / G- (SEQ ID NO: 50) , -GyfG / G-(SEQ ID NO: 51) , and-GfwG / G- (SEQ ID NO: 52) (FIG. 3B and Table 3-4) . These results indicate a preference for D-Tyr, D-Phe, and D-Trp at the P2 position, with Gly at the P1 position.

[0555] a. Standard enzymatic reaction conditions

[0556] To a solution of peptide (0.4μL of a 4 mM stock solution in 10%DMSO / H2O, resulting in a final concentration of 0.04 mM) in 25 mM MES buffer (pH 5.5, containing 1 mM EDTA and 5 mM DTT, 39.2μL) , human Cathepsin B (SinoBiological, 10483-H08H, 0.4μL of a 2 μM stock solution in PBS, resulting in a final concentration of 20 nM, approximately 1μmol: 0.046 U) was added subsequently. The mixture was vortexed and then incubated at 37℃. At defined time points, the mixture was boiled at 95℃for 10 minutes to quench the reaction. The crude reaction mixture was then centrifuged and analyzed by LC-MS to determine the reaction yield.

[0557] b. Initial screening of mixed peptides

[0558] D-Amino acids existed in combinatorial substrate libraries: k, s, d, G, m, l, w, n, h, cit (citrulline) , e, a, t, y, q, r, v, p, i, f. These D-amino acids were mixed proportionally as L-amino acids to ensure equal distribution of the synthesized peptides

[0029]

[0030] .

[0559] Table 2. The amino acid ratio in the mixture

[0560] The combinatorial pentapeptide substrate library with a Gly at the C-terminal of screened D-peptide was synthesized. The library included 12 D-amino acids (x) , and the amino acids were categorized into three groups based on their properties. One mixed peptide had one variable site for four (48 sequences) or two variable sites for six (864 sequences) were screened. Details are as follows (Table 3) : x1=h+a+p+y x2=r+s+d+f x3=k+e+v+w x=x1+x2+x3

[0561] Accordingly, B1–B12 in Table 3 define the library design and composition and do not represent single, fully defined amino-acid sequences. For clarity and consistency, SEQ ID NOs are assigned only to fully defined sequences with explicit residue order (e.g., hit sequences identified in subsequent tables) , and the specification uniformly cites such SEQ ID NOs.

[0562] Table 3. Sequences included in-wsaGGxGG-and-wsaGxxGG-

[0563] Note: B1–B12 in Table 3 describe mixed / degenerate libraries with variable positions (x / x1 / x2 / x3) and therefore are not assigned SEQ ID NOs. SEQ ID NOs are assigned only to fully defined sequences listed in subsequent tables.

[0564] "-wsa-" and “-as-” were appended to both termini of the target screening sequences to ensure column retention before and after cleavage. This procedure was consistently applied. All samples were incubated at 37℃for 36 hours.

[0565] Table 4. Sequences recognized by hCATB based on Table 3

[0566] " / " donates the cleavage site of hCATB. Only sequences with more than 1%cleavage products of B1-B12 are shown here. The D-amino acid highlighted in red was recognized as P2 or P3 and Gly was P1.

[0567] The combinatorial substrate libraries showed consistent results that CATB preferred Gly at P1 and hydrophobic D-amino acids at P2.

[0568] We synthesized individual D-peptides and evaluated their susceptibility to hCATB (Table 5) and confirmed the peptide-GGyG / G- (SEQ ID NO: 46) as a basic sequence for further screening, achieving 20%hCATB cleavage after 12 hours at 37℃ (FIG. 3C) . To identify the optimal substrate sequence for maximum hCATB cleavage efficiency, we systematically assessed D-amino acid preferences at the P3, P4, P5, and P1’ positions (FIG. 3D and Table 6-8) . Our findings indicate that most D-amino acids were tolerated at these positions, with P3, P4, and P5 showing a general preference for aromatic and positively charged residues, while P1’ exhibited a strong preference for aromatic amino acids. We then combined the preferred amino acids and identified that both-rryyG / G- (SEQ ID NO: 103) and-rkyyG / G- (SEQ ID NO: 104) achieved 90%hCATB cleavage after 6 hours (Table 9) , while-rkyyG / w-(SEQ ID NO: 105) reached 80%cleavage within 1 hour (FIG. 3E and Table 8) , demonstrating superior recognition by hCATB. Additionally, we confirmed that hCATB degrades the corresponding L-peptide substrate-RKYYGW- (SEQ ID NO: 106) within 5 minutes (FIG. 4) , showing that, like papain, hCATB exhibits heterochiral recognition capability alongside its traditional homochiral recognition property.

[0569] Table 5: The single peptides were synthesized to confirm the specificity and preferences.

[0570] c. Positional scanning of the promising sequence

[0571] Table 6. Positional scan with a single mutation at P3 of Ac-AEEA-wsaGP3yGG-AEEA based on peptide Ac-AEEA2-GGyG / G-AEEA

[0572] " / " donates the cleavage site of hCATB. P3 had low selectivity with D-amino acids, but D-His and D-Tyr had relatively high cleavage efficiency.

[0573] Table 7: Positional scan with a single mutation at P4, P5 of Ac-AEEA-wsaP5P4yyG-AEEA based on peptide Ac-AEEA2-GGyyG / G-AEEA

[0574] " / " donates the cleavage site of hCATB. P4 and P5 also had little selectivity with D-amino acids, but D-His, D-Lys, D-Arg, D-Phe at P4, and D-Arg at P5 greatly increased cleavage efficiency.

[0575] Table 8. Positional scan with a single mutation at P1’ of Ac-AEEA2-rkyyGP1’ -AEEA based on peptide Ac-AEEA-rkyyG / -AEEA

[0576] " / " donates the cleavage site of hCATB. P1’ preferred hydrophobic D-amino acids, especially D-Trp, D-Phe, D-Tyr.

[0577] Table 9. Combination of promising amino acids at P3 and P4

[0578] Example 3. Co-crystallization and Structure Determination

[0579] To better understand hCATB's recognition of its D-peptide substrate, we synthesized Ac-rkyyG-Cl (FIG. 5A) as a hCATB covalent inhibitor to target the catalytic Cys29 of human Cathepsin B. A deglycosylated mutant, hCATB-S115A, was utilized to facilitate the monitoring of the covalent reaction and the crystallization of the complex (17, 18) . After the covalent reaction between Ac-rkyyG-Cl and hCATB (FIG. 5C and FIG. 5D) , we successfully obtained a single crystal and solved the complex structure (PDB: 9K08) . The X-ray diffraction yielded high-quality data with an average resolution of 1.5  (Table 10) , and the D-peptide fitted well within the electron density map, as indicated by the gray mesh at a contour level of 1.0σ (FIG 3F) . The electron density map clearly showed that the D-peptide substrate was covalently attached to the catalytic Cys29 of hCATB (FIG. 3G) . The D-peptide was well-recognized by hCATB, forming six hydrogen bonds between the substrate and protease: P1-Gly with Gln23 and Cys29, P2-D-Tyr with Gly74 and Glu245, and P5-D-Arg with Ser175 and Gly198 (FIG. 3G-H) . The side chain of P2-D-Tyr was well-positioned in the active pocket and formed a hydrogen bond with Glu245, while the P3-D-Tyr side chain extended outward with unresolved density. The P4-D-Lys and P5-D-Arg residues pointed toward negatively charged regions of the protein (FIG. 3H) , suggesting electrostatic complementarity as the likely reason for the enhanced enzymatic activity at these positions. Overall, the crystal structure demonstrated that the-rkyyG-sequence stably resides in the catalytic pocket of hCATB, confirming its ability to specifically recognize D-peptide substrates.

[0580] a.Preparation of (Ac-) rkyyG-CATB complex

[0581] ProCATB-S115A was activated in activation buffer (100-time dilution. 25 mM MES, pH 5.5, 1 mM EDTA, 2 mM DTT) for 90 mins at room temperature [31, 32] . Amicon Ultra filter with 10 K cut-off was used to remove DTT and propeptide. The (Ac) -rkyyG-CATB complex was covalently formed by incubation of a 5-fold molar excess of Ac-rkyyG-Cl (4 mM in DMSO) with 1.5 mg of active CATB-S115A in binding buffer (25 mM MES, pH 5.5) for 30 min at room temperature. The complex was buffer exchanged more than four times into binding buffer using an Amicon Ultra filter (10 K) and finally concentrated to 10 mg / mL.

[0582] b. X-ray crystallography

[0583] The crystallization conditions were screened in 96-well hanging-drop trays from Hampton Research and the temperature was 18℃. Crystals were grown using the hanging-drop vapor diffusion method by mixing protein solution and well buffer in ratios of 1: 1, 1: 2, or 2: 1. The complex was successfully crystallized in conditions D9 (0.1 M bicine, pH 8.5, 20%w / v PEG 10K. 0.2μL complex: 0.1μL well-buffer) from the Hampton PEG-Rx HT kit and F10 (0.1 M MES monohydrate pH 6.5, 12%w / v PEG 20K. 0.1μL complex: 0.2μL well-buffer) from the Hampton Crystal Screen HT kit. For sample preparation, crystals were mounted on loops and submerged in cryoprotectant (reservoir solution plus 20% (v / v) glycerol) . Diffraction data were collected using a single crystal X-ray diffractometer (Rigaku, XtaLAB Synergy Customer) at 100K. The structure from condition D9 was determined by data reduction and molecular replacement with Phaser in CCP4i2, using PDB 1CSB (FIG 6)

[0033] with the ligand removed as the model. The structures were refined iteratively in Phenix. Diffraction data and refinement statistics for (Ac) -rkyyG-hCATB (PDB: 9K08) are presented in Table 10.

[0584] Table 10. X-ray structure statistics of (Ac) -rkyyG-hCATB complex

[0585] In Example 3, the D-peptide substrates used are-rkyyG-and its derivatives (e.g., the N-terminally acetylated and reactive ligand Ac-rkyyG-Cl) . These species represent different forms / derivatives of the same core substrate sequence and are employed for structural studies and / or covalent ligand preparation, without introducing any new sequence entities. Accordingly, to maintain one-to-one correspondence and traceability of the sequence listing, no new SEQ ID NOs are assigned for the sequences referenced in Example 3; instead, -rkyyG- (and its derivatives) should uniformly refer to the corresponding SEQ ID NO already assigned elsewhere in this application, where applicable.

[0586] Example 4. ADCs Preparation and Cytotoxicity Assay

[0587] Cathepsin B is implicated in various physiological and pathological processes (19, 20) . For instance, cathepsin B is overexpressed in many tumors, which has been utilized to design cleavable linkers for payload release in antibody-drug conjugates (ADCs) (19, 21) . Currently, the most commonly used enzyme-cleavable linkers are based on short peptides, such as -Gly-Gly-Phe-Gly- (-GGFG-) (SEQ ID NO: 178) and-Val-Cit- (-VC-) , which are found in commercially available antibody-drug conjugates (ADCs) (22) . The ability of -rkyyG- (SEQ ID NO: 1) to be efficiently cleaved by cathepsin B suggests its potential for designing new ADCs. Moreover, most current peptide linkers used in ADCs are hydrophobic, which can contribute to instability. In contrast, -rkyyG- (SEQ ID NO: 1) contains two positively charged residues, significantly enhancing the hydrophilicity of the linker. Additionally, the D-peptide configuration ensures greater stability in plasma, contributing to the overall stability of the designed ADCs.

[0588] To design an optimal cathepsin B-cleavable linker for ADC applications, we attached a spacer-3- (4-aminophenyl) propionic acid-to the C-terminus of the D-peptide substrates. This spacer was chosen to mimic the self-immolative PAB (ρ-aminobenzyl) commonly used in ADCs, allowing us to evaluate the compatibility of the D-peptide with the spacer (FIG. 7A and Table 11) . The results demonstrated that the presence of the spacer significantly enhanced cleavage efficiency, with the sequence-rkyyG / - (SEQ ID NO: 1) remaining optimal, giving 100%cleavage within 30 minutes (FIG. 7B) .

[0589] Table 11. Sequences included in the test

[0590] Additionally, the combinatorial peptide substrate library based on the sequence -rkffG / spacer-was synthesized. The library included 19 D-amino acids (z) , and the amino acids were categorized into two groups based on their properties. One mixed peptide had one variable site for five (95 sequences) were screened. Details are as follows (Table 12)

[0591] Accordingly, B13–B22 in Table 12 define the library design and composition using mixed / degenerate positions and do not represent single, fully defined amino-acid sequence entities. To maintain one-to-one correspondence, determinacy and traceability of the sequence listing, no new SEQ ID NOs are assigned to the combinatorial library sequences (B13–B22) . SEQ ID NOs are assigned only to fully defined sequences with explicit residue order identified in subsequent tables, and such SEQ ID NOs are cited consistently throughout the specification.

[0592] Table 12. Sequences included in the test z1=w, r, h, e, k, n, l, t, p, G z2=y, f, m, q, d, i, v, s, a z=z1+z2

[0593] Note: B13–B22 in Table 12 describe mixed / degenerate libraries with variable positions (Z / Z1 / Z2) and therefore are not assigned SEQ ID NOs. SEQ ID NOs are assigned only to fully defined sequences listed in subsequent tables.

[0594] Degenerate / mixed libraries are described in the specification for screening purposes and are not included as individual entries in the sequence listing.

[0595] The preference pattern of the new library screening (Table 12) is similar to the aforementioned pattern. Specifically, we synthesized individual D-peptides with observed D-amino acids and evaluated their susceptibility to hCATB (Table 13) and confirmed that the peptide-rkyyG / spacer-is also a superior candidate.

[0596] Table 13. Sequences included in the test

[0597] We measured the enzymatic kinetic parameters of hCATB on the-rkyyG / spacer-substrate and found a kcat of 0.5±0.1 s-1 and a Km of 46±14μM, resulting in a kcat / Km of 10,830±450 s-1M-1 (FIG. 8A) . In comparison, the kinetic parameters of hCATB on the commercial ADC linkers-VC-and-GGFG-yielded kcat / Km values of 15,900±3720 s-1M-1 and 10,310± 1480 s-1M-1, respectively (FIG. 7C and 7D) . Thus, the D-peptide linker demonstrates enzymatic efficiency comparable to these widely used L-peptides, highlighting its potential for ADC applications.

[0598] Next, we attached-rkyyG-PAB-MMAE to the anti-HER2 antibody trastuzumab using our recently developed CAST conjugation method to prepare a homogeneous ADC (FIG. 8B) (24) . Additionally, we created a positive control ADC using the commonly used -VC-PAB-MMAE, along with a negative control ADC featuring-rkyya-PAB-MMAE (-rkyya- (SEQ ID NO: 223) is not cleavable by cathepsin B) , following the same procedure. Cytotoxicity assays confirmed that the ADC constructed with our D-peptide linker could effectively kill HER2-positive SK-BR-3 cells (HER2+++, IC50=0.04±0.01 nM) and JIMT-1 cells (HER2+++, IC50=0.03±0.02 nM) while exhibiting minimal toxicity to HER2-negative MCF-7 cells (FIG. 8C) . The positive control ADC (with-VC-PAB-MMAE) showed expected cell-killing activity towards HER2-positive cells (FIG. 8C) while the negative control ADC (with-rkyya-PAB-MMAE) showed no or minimal cytotoxicity to different cells (FIG. 9) . Additionally, all ADCs showed no cytotoxicity to CHO-K1 cells, indicating the prepared ADC activities are target-dependent.

[0599] a. Preparation of ADC

[0600] Consistent with the published conjugation method

[0030] , a boronic acid reagent with azide was synthesized and specifically modified the CASTi tag tethered to the C-terminus of the antibody heavy chain. DBCO-PEG3-rkyyG-MMAE, DBCO-PEG3-rkyya-MMAE, and DBCO-PEG3-Val-Cit-MMAE (10 mM stock solution in DMSO, 10 equivalents) were added to initiate the click reaction with azide in PBS buffer (pH 7.4) . The mixture was incubated at 37℃for 2 hours or longer, and the reaction progress was monitored using LC-MS. Upon completion of the reaction, excess peptides were removed by dialysis in PBS. The ADCs were then concentrated, filtered, and quantified using a BCA kit (Beyotime, P0010) .

[0601] b. Cell culture

[0602] For anti-HER2 ADCs, SK-BR-3 (ATCC HTB-30) , JIMT-1 (Procell, CL-0770) , and MCF-7 (ATCC HTB-2) were prepared for cell assay. The culture media and conditions adhered to ATCC guidelines. CHO-K1 cells were cultured in Ham's F-12K basal medium, while the other two cell lines, obtained from collaborators (Oricell) , were maintained in RPMI-1640 basal medium supplemented with 10%fetal bovine serum (FBS) , 100 mg / mL streptomycin, and 100 U / mL penicillin. All cells were cultured at 37℃in a 5%CO2 environment.

[0603] c. Cytotoxicity assay

[0604] Cells were seeded in a 96-well plate (Corning, 3599) at a density of 5×103 / well (2500 / well for CHO) . Cells were allowed to culture for 24 hours and then treated with serial dilutions of ADCs, DBCO-MMAE, and Tz-CASTi for 96 hours, three replicate wells for each sample. The viability of cells was measured using Cell Counting Kit-8 (CCK8) (Lablead, CK001) following the manufacturer’s protocol and was normalized to the viability of cells without any treatment. The data were plotted and analyzed using Graphad Prism 9.5.0, employing a nonlinear fit analysis with an inhibitor versus normalized response-variable slope model.

[0605] For clarity, SEQ ID NOs refer to the peptide sequences (e.g., -rkyyG-and-rkyya-) only. Conjugates such as -rkyyG-PAB-MMAE, -VC-PAB-MMAE and -rkyya-PAB-MMAE include non-peptidic linker / payload moieties (PAB / MMAE) and therefore are not assigned new SEQ ID NOs; the peptide portion of each conjugate corresponds to the previously assigned SEQ ID NO.

[0606] Example 5. Plasma Stability Determination

[0607] We further assessed the stability of the D-peptide linker ADC (trastuzumab-rkyyG-MMAE) in human, Sprague-Dawley rat, and mouse plasma, comparing it to an ADC constructed with the commonly used-VC-linker. We measured the residue ADC concentrations using sandwich ELISA (anti-MMAE monoclonal antibody for ADC detection) . The results showed that trastuzumab-rkyyG-MMAE remained stable across all three plasma types, retaining more than 70%, 80%, and 65%of intact ADC after 14 days of incubation. In comparison, trastuzumab-VC-MMAE exhibited reasonable stability in human and Sprague-Dawley rat plasma, with over 50%and 65%of the intact ADC remaining after 14 days, but showed pronounced instability in mouse plasma, where less than 20%of the ADC remained after only 10 minutes-likely due to rapid cleavage by mouse carboxylesterase 1C (mCES1C) , which specifically targets the-VC-linker (FIG. 8D and Table 14) (23, 24) . In vivo stability tests in mice further confirmed that trastuzumab-rkyyG-MMAE exhibited significantly better stability than trastuzumab-VC-MMAE (FIG. 8E and Table 15) .

[0608] a. in vitro human, rat, and mouse plasma stability

[0609] ICR / CD-1 mouse plasma (IPHASE, 0191E1.11) , Sprague-Dawley rat plasma (IPHASE, 0191D1.11) and human plasma (IPHASE, A01911.11) were purchased from IPHASE and was frozen and thawed no more than five times.

[0610] For peptide stability, 2μL peptides (10 mM stock in DMSO) were individually incubated with 198μL plasma at 37℃respectively. 10μL samples were taken at set time points and acetonitrile (75%final concentration) was added to precipitate plasma proteins. The precipitates were removed by centrifugation at 12000×g for 5min and the supernatant was diluted 200 times with A1 and analyzed by Agilent 1260-6230 TOF LC / MS. Calculated the amount of peptide remaining and compared.

[0611] For ADCs stability, 1.2μL ADCs (100μg / mL stock in PBS) were individually incubated with 118.8μL plasma at 37℃respectively. 15μL samples were taken at set time points and stored at-80℃for sandwich ELISA.

[0612] b. in vivo mouse pharmacokinetics

[0613] Male BALB / c mice (8 weeks old) were purchased from Shanghai Jihui Laboratory Animal Care Co., Ltd. and bred at the Laboratory Animal Resources Center of Westlake University were prepared. The mice were acclimated to the animal facility for 1 week following quarantine and were housed under specific pathogen-free conditions. All animal maintenance and experimental procedures adhered to the guidelines of the Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ofWestlake University (Hangzhou, China) .

[0614] Mice were randomly divided into control and experimental groups (n>3 per group) . ADCs were administered intravenously at a dose of 1 mg / kg (100μL) . Blood samples were collected by tail bleeding either before or at specified time points post-injection. The collected blood samples, in heparin-coated tubes, were centrifuged at 1500 g for 10 minutes to isolate plasma. A protease inhibitor cocktail (Abcam, ab271306) and 5 mM EDTA were immediately added to the plasma, which was then stored at-80℃for subsequent sandwich ELISA analysis. The half-life and area under the curve (AUC) were determined using PKsolver.

[0615] c. Sandwich ELISA

[0616] A high-binding 96-well ELISA plate (Biofil, 190731-080) was coated with in-house-prepared HER2 protein (100 ng per well) diluted in ELISA coating buffer (pH 9.6 0.05 M NaHCO3) overnight at 4℃. Following washing with TBS-T (pH 7.4, 0.05%Tween 20) , each well was blocked with 5%nonfat dried milk (Beyotime, P0216) in TBST for 2 hours at RT.Then, washed again and loaded diluted proteins or blood plasma samples to each well and incubated at 4℃overnight. For Trastuzumab detection, 100μL of Rabbit Anti-Human IgG H&L(HRP) (ab6759) (1: 5000) was added to each well at room temperature for two hours. For MMAE payload detection, 100μL of Monoclonal Anti-MMAE Antibody, Mouse IgG (Acro, MME-M5252) (1: 5000) was added to each well at room temperature for two hours. Followed by adding 100μL HRP-labeled Goat Anti-Mouse IgG (H+L) (Beyotime, A0216) (1: 5000) as a secondary detection antibody. Between all the steps, the plate was washed by filling the wells with 200μl of TBS-T four times. Finally, 100μl of TMB (Solarbio Life Sciences) was added to each well and incubated for 10-15 minutes, followed by the addition of an equal volume of2 M HCl to stop the reaction. The optical density was read at 450 nm with a microplate reader (Varioskan LUX) . The data were analyzed using GraphPad Prism V9.5.0, standard curves were plotted using PBS diluted protein samples. all data were analyzed by Graphpad Prism 9.5.0.

[0617] Table 14. In vitro stability of anti-HER2 ADCs in plasma from different species

[0618] Table 15. Summary of primary PK parameters for anti-HER2 ADCs in mouse plasma

[0619] Example 6. Specificity of-rkyyG-spacer-Substrate against Cathepsin Families

[0620] The cathepsin family includes a variety of proteases, and cathepsins B, L1, and S have all been implicated in the release of ADC payloads (25) . We wanted to determine whether the D-peptide linker was specifically recognized by cathepsin B or if it could also be cleaved by other cathepsin family proteins, such as hCATA, hCATC, hCATD, hCATL1, hCATS, and hCATV (L2) . Our results showed that the-rkyyG / spacer-linker exhibited high selectivity for hCATB, achieving 100%cleavage after 30 minutes (FIG. 7b) , while none of the other cathepsins could cleave the D-peptide substrate-even when using 10 times the amount of protease and extending the incubation time to 12 hours (FIG. 10 and Table 16) . In contrast, most cathepsin proteins efficiently cleaved the-VC / spacer-linker (FIG. 10) . The high specificity of-rkyyG / spacer-for hCATB suggests potential safety advantages in ADC applications by minimizing unintended premature payload release.

[0621] Cathepsin B / L1 / K / S has been reported to be involved in ADC drug release, so the CATB homologous family of cysteine proteases, CATA, CATC, CATD, CATL1, CATS, and CATV (L2) , were selected to monitor the specificity of the substrate reaction. All protease reaction conditions were the optimal, using ten or more times the recommended amount of protease, substrate concentrations consistent with those for CATB, and reaction times extended to 12 hours or longer. The details are as follows:

[0622] Optimal reaction conditions of Cathepsin A (Sinobiological, 10482-H08H, no specific activity) :

[0623] The activation buffer is 25 mM MES, 5 mM DTT, pH 6.0. The assay buffer is 25 mM MES, pH 5.5, 1 mM EDTA, and 5 mM DTT. Diluted rhCathepsin A to 200μg / mL in activation buffer. Added rhCathepsin L and activation buffer to rhCathepsin A for final concentrations of 20μg / mL rhCathepsin L and 100μg / mL rhCathepsin A. Incubated the compounds at room temperature for 1 hour. Diluted activated rhCathepsin A to 7.5μg / mL in assay buffer for 50μL and substrate to 40μM for 0.5μL. Then the protease and substrate were incubated at 37℃for 12 h or longer. A portion of the mixture was taken for LC-MS monitoring.

[0624] Optimal reaction conditions of Cathepsin C (Sinobiological, 10484-H08H, >200 pmols / min / ug) :

[0625] The activation buffer is 25 mM MES, 5 mM DTT, pH 6.0. The assay buffer is 25 mM MES, 50 mM NaCl, pH 6.0, 1 mM EDTA, and 5 mM DTT. Diluted rhCathepsin C to 200 μg / mL in activation buffer. Added rhCathepsin L and activation buffer to rhCathepsin C for final concentrations of 20μg / mL rhCathepsin L and 100μg / mL rhCathepsin C. Incubated the compounds at room temperature for 1 hour. Diluted activated rhCathepsin C to 7.5μg / mL in assay buffer for 50μL and substrate to 40μM for 0.5μL. Then the protease and substrate were incubated at 37℃for 12 h or longer. A portion of the mixture was taken for LC-MS monitoring.

[0626] Optimal reaction conditions of Cathepsin D (Sinobiological, 10487-H08H, no specific activity) :

[0627] The assay buffer is 100 mM NaOAc, 200 mM NaCl, pH 3.5, 1 mM EDTA, and 5 mM DTT. Diluted rhCathepsin D to 15μg / mL in assay buffer for 50μL and incubated at room temperature for 15 mins. Diluted Substrate to 40μM in assay buffer for 0.5μL and mixed with the protease, incubating at 37℃for 12 h or longer. A portion of the mixture was taken for LC-MS monitoring.

[0628] Optimal reaction conditions of Cathepsin L1 (Sinobiological, 10486-H08H, no specific activity) :

[0629] The assay buffer was 50 mM NaOAc, 100 mM NaCl, pH 3.5, 1 mM EDTA, and 5 mM DTT. Diluted rhCathepsin L1 to 40μg / mL in assay buffer and incubated diluted rhCathepsin L on ice for 15 minutes. Diluted incubated 40μg / mL rhCathepsin L to 3.75μg / mL in assay buffer for 50μL and substrate to 40μM in assay buffer for 0.5μL. Then the protease and substrate were incubated at 37℃for 12 h or longer. A portion of the mixture was taken for LC-MS monitoring.

[0630] Optimal reaction conditions of Cathepsin S (Sinobiological, 10487-H08H, >300 pmols / min / ug) :

[0631] The assay buffer is 50 mM NaOAc, 250 mM NaCl, pH 4.5, 1 mM EDTA, and 5 mM DTT. Diluted rhCathepsin S to 15μg / mL in assay buffer for 50μL and incubated at room temperature for 2 hours. Diluted Substrate to 40μM in assay buffer for 0.5μL and mixed with the protease, incubating at 37℃for 12 h or longer. A portion of the mixture was taken for LC-MS monitoring.

[0632] Optimal reaction conditions of Cathepsin V (Sinobiological, 10093-H08H, >1000 pmols / min / ug) :

[0633] The assay buffer is 25 mM NaOAc, 100 mM NaCl, pH 5.5, 1 mM EDTA, and 5 mM DTT. Diluted rhCathepsin V to 3.75μg / mL in assay buffer for 50μL and substrate to 40μM in assay buffer for 0.5μL. Then the protease and substrate were incubated at 37℃for 12 h or longer. Aportion of the mixture was taken for LC-MS monitoring.

[0634] Table 16: Cleavage efficiency of substrates by lysosomal cathepsin proteases

[0635] Together, these data suggest that the D-peptide linker identified for cathepsin B is suitable for a range of ADC constructions, offering superior hydrophilicity, enhanced stability and better selectivity compared to current linkers, highlighting its potential for future applications in ADC.

[0636] The inherent properties of the D-peptides of the present disclosure make them highly water soluble and resistant to plasma proteases, providing distinct advantages over commercially available hydrophobic ADC peptide linkers. The D-peptide substrate is extremely selective for hCATB over other closely related human cathepsins, providing a better opportunity for precise, cell-specific payload release, thereby potentially minimizing premature payload release and reducing toxicity.

[0637] Example 7. Synthesis Procedures

[0638] a. Synthesis of Ac-rkyyG-Cl for co-crystallization

[0639] We used standard Fmoc solid phase peptide synthesis methods on 2-chlorotrityl chloride resin (0.5 mmol / g, 500 mg) to synthesize the Ac-r (Pbf) k (Boc) y (tBu) y (tBu) -OH. We got 700 mg crude peptide. Ac-r (Pbf) k (Boc) y (tBu) y (tBu) -OH (350 mg, 0.308 mmol) , 1-Amino-3-chloropropan-2-one (32 mg, 0.308 mmol) , HATU (117 mg, 0.308 mmol) and pyridine (73 mg, 0.308 mmol) were dissolved in DMF (5 mL) . Stirred at room temperature for 2 h. When the reaction was complete, the mixture was diluted with deionized water and extracted with EtOAc (3×) . The combined organic layers were washed with brine, dried with MgSO4, and concentrated in vacuo. The crude was purified by flash column chromatography (5%CH2Cl2 in MeOH) to make the product (60 mg, 16%) a white solid. Then, it was dissolved in 3 mL DCM, and 3 mL TFA was added to the reaction. The reaction lasted for 20 minutes at room temperature. The resulting crude product was purified by HPLC with an Agilent C18 column and lyophilized to the product Ac-rkyyG-Cl as a white powder (20 mg, 54%) . HRMS calculated for C35H50ClN9O8 [M+H] +760.3549 Da, observed at 760.3505 Da. (FIG. 11)

[0640] b. Synthesis of ACC-linker-K (DNP) for kinetics assay

[0035]

[0641] All peptides were synthesized on a 0.01 mmol scale using an automated parallel peptide synthesizer (SyroⅡ, Biotage) . All reactions were carried out at room temperature unless otherwise stated. Each amino acid synthesis cycle includes 12 minutes coupling with 200μL Fmoc-protected amino acid (0.53 M in DMF) , 200μL HCTU (0.5 M in DMF) and 100μL N, N-diisopropylethylamine (2 M in NMP) twice, 3 minutes wash with DMF three times, deprotection with 20% (v / v) 4-methyl piperidine in DMF once and 3 minutes wash with DMF three times. After completion of the stepwise SPPS, the resins were washed thoroughly with DCM and dried under a vacuum. The peptides were then cleaved off the resins, and side chains were deprotected by treatment with 2% (v / v) water, 2% (v / v) triisoproprylsilane, and 1% (m / v) DTT in neat trifluoroacetic acid (TFA) for 2 hours at room temperature. The resulting peptide solution was precipitated and washed with cold diethyl ether three times. The obtained solid was dissolved in 50%H2O: 50%acetonitrile containing 0.1%TFA and lyophilized. The resulting crude product was purified by HPLC with an Agilent C18 column and lyophilized to the product.

[0642] According to the peptide synthesis method described above, four peptides were synthesized for the FRET experiments.

[0643] c. Synthesis of DBCO-linker-MMAE for ADC conjugation

[0644] Fmoc-Gly-OH (892 mg, 3 mmol) and TSTU (1084 mg, 3.6 mmol) were dissolved in DMF (10 mL) . N, N-Diisopropylethylamine (775 mg, 6 mmol) was added to the mixture and stirred at room temperature for 3h. Add 4-aminobenzyl alcohol (369 mg, 3 mmol) to the reaction and react for another 2 h. When the reaction was complete, the mixture was diluted with deionized water and extracted with EtOAc (3×) . The combined organic layers were washed with brine, dried with MgSO4, and concentrated in vacuo. The crude was purified by flash column chromatography (5%CH2Cl2 in MeOH) to afford the product Fmoc-G-PAB-OH (400 mg, 33%) as a white solid. HRMS calculated for C24H22N2O4 [M+H] +403.1658 Da, observed 403.1700 Da.

[0645] Fmoc-G-PAB-OH (80 mg, 0.2 mmol) and Bis (4-nitrophenyl) carbonate (308 mg, 10 mmol) were dissolved in DCM (3 mL) . 4-Dimethylaminopyridine (50 mg, 4 mmol) was added to the mixture and stirred at room temperature for 2 h. The reaction was filtered to get the product Fmoc-G-PAB-PNP (90 mg, 80%) . HRMS calculated for C31H25N3O8 [M+H] +568.1720 Da, observed 568.1691 Da.

[0646] Fmoc-G-PAB-PNP (57 mg, 0.1 mmol) , MMAE (110 mg, 0.15 mmol) , and HOAt (30 mg, 0.2 mmol) were dissolved in DCM (5 mL) . N, N-Diisopropylethylamine (0.5 mL, 0.5 mmol) was added to the mixture and stirred at room temperature for 30 min. Add piperidine (1mL) to the reaction, and react for 5 min. Concentrate the reaction in a vacuum; the resulting crude product was purified by HPLC with Agilent C18 column and lyophilized to the product G-PAB-MMAE as a white powder (65 mg, 70%) . HRMS calculated for C49H77N7O10 [M+H] +924.5810 Da, observed 924.5841 Da.

[0647] We used standard Fmoc solid phase peptide synthesis methods on 2-chlorotrityl chloride resin (0.5 mmol / g, 500 mg) to synthesize the DBCO-PEG3-rk (Boc) yy-OH. There is no side chain protection in the D-Arg-OH and D-Tyr-OH we used. Couplings were performed using a 5-fold molar excess of each amino acid, a5-fold molar excess of DIC, and a 5-fold molar excess of Oxyma. Final peptide deprotection and cleavage: 1%TFA in DCM for 1 h. TEA is added to neutralize the solution before concentration. The crude was purified by HPLC with an Agilent C18 column and lyophilized to get a white powder (50 mg, 17%) . HRMS calculated for C62H80N10O15 [M+H] +1205.5882 Da, observed 1205.5760 Da.

[0648] DBCO-PEG3-rk (Boc) yy-OH (40 mg, 0.033 mmol) , G-PAB-MMAE (30 mg, 0.032 mmol) , DIC (4.2 mg, 0.033 mmol) , Oxyma (4.7 mg, 0.033 mmol) were dissolved in DMF (5 mL) . Stirred at room temperature for 2 h. The resulting crude product was purified by HPLC with Agilent C18 column and lyophilized to the product DBCO-PEG3-rkyyG-PAB-MMAE as a white powder (15 mg, 21%) . The product was dissolved in 1 mL DCM, and 0.25 mL TFA was added to the reaction and stirred at room temperature for 30 minutes. The resulting crude product was purified by HPLC with Agilent C18 column and lyophilized to the product DBCO-PEG3-rkyyG-PAB-MMAE as a white powder (2.7 mg, 18%) . HRMS calculated for C106H147N17O22 [M+H] +2011.0984 Da, observed 2011.0697 Da (FIG. 12A) .

[0649] Fmoc-Val-Cit-PAB-PNP (77 mg, 0.1 mmol) , MMAE (72 mg, 0.1 mmol) , and HOAt (30 mg, 0.2 mmol) were dissolved in DCM (5 mL) . N, N-Diisopropylethylamine (0.5 mL, 0.5 mmol) was added to the mixture and stirred at room temperature for 30 min. Add piperidine (1mL) to the reaction, and react for 5 min. Concentrate the reaction in a vacuum; the resulting crude product was purified by HPLC with Agilent C18 column and lyophilized to the product Val-Cit-PAB-MMAE as a white powder (55 mg, 49%) . HRMS calculated for C58H94N10O12 [M+H] +1123.7131, observed 1123.7028.

[0650] We used standard Fmoc solid phase peptide synthesis methods on 2-chlorotrityl chloride resin (0.5 mmol / g, 500 mg) to synthesize the DBCO-PEG3-OH. Couplings were performed using a 5-fold molar excess of each amino acid, a 5-fold molar excess of DIC, and a 5-fold molar excess of Oxyma. Final peptide deprotection and cleavage: 1%TFA in DCM for 1 h. TEA is added to neutralize the solution before concentration. The crude was directly used for the next reaction without purification.

[0651] DBCO-PEG3-OH (25 mg, 0.05 mmol) , Val-Cit-PAB-MMAE (56 mg, 0.05 mmol) , HATU (19 mg, 0.05 mmol) , DIEA (20 mg, 0.15 mmol) were dissolved in DCM (5 mL) . Stirred at room temperature for 1 h. The resulting crude product was purified by HPLC with Agilent C18 column and lyophilized to the product DBCO-PEG3-Val-Cit-PAB-MMAE as a white powder (5 mg, 6%) . HRMS calculated for C85H122N12O18 [M+H] +1599.9078, observed 1599.9008 (FIG. 12b) .

[0652] Example 8. Preparation of Proteins

[0653] a. Expression and purification of human pro-Cathepsin B

[0654] Construction of plasmids for recombinant proteins

[0655] The gene of human pro-Cathepsin B (Arg18-Ile339) (NP_001899.1) was synthesized by Genewiz, Suzhou, China. It was cloned into the vector pcDNA3.4 with IL10 secretory signal peptide and 8 His-tag at the N-terminal. The amino acid sequences are shown below. KOD OneTM PCR Master Mix-Blue (ThermoFisher Scientific) was used to PCR amplify the DNA. All the gene fragments were assembled by the Gibson assembly kit (Cat. C115-01, Vazyme) . The cloned plasmids were transformed into Escherichia coli DH5αfor amplification. The amplified plasmids were extracted using a GoldHi EndoFree Plasmid Maxi Kit (Cat. CW2104M, CWBio) .

[0656] Based on wild-type human pro-Cathepsin B,

[0036] the dead mutant (C29A) was constructed to confirm the enzymatic active site of Cathepsin B. The S115A mutation was introduced to eliminate the primary N-glycosylation, thereby enabling the determination of the molecular weight using LC-MS.

[0657] Protein expression and purification

[0658] Expi293F cells (Invitrogen) were cultured in SMM 293-TII medium (Sino Biological, Lot. RZ14NO1601) at 37℃under 6%CO2 in a CRYSTAL shaker (140 rpm) . The cells were transiently transfected with plasmids and polyethyleneimine (PEI) (Polysciences, Cat. 24765-1) when the cell density reached approximately 1.5×106 / mL. A total of 1.5 mg of plasmid was premixed with 3.9 mg of PEI (1: 2.6) in 50 mL of fresh medium for 20 minutes before being added to a 1 L cell culture. The transfected cells were cultured for 84-96 hours before harvesting.

[0659] For purification of pro-CATB, cell supernatants were harvested by centrifugation at 1200×g for 5 minutes. Then, the supernatants were loaded onto Ni-NTA beads (Genscript, Cat. NO. L00666-100) and washed with washing buffer (10-30 mM imidazole, 1×PBS, pH 7.4) . The proteins were then eluted with elution buffer (100 mM imidazole, 1×PBS, pH 7.4) . After SDS–PAGE and Coomassie blue staining, the eluents with the highest purity were concentrated to a certain volume for dialysis into PBS buffer, pH 7.4. Concentrated and stored at -80℃ (FIG. 13A and 13B) .

[0660] Sequence of secretory pro-CATB

[0661] IL10_8His_N-propeptide_light chain_inter_heavy chain_C-propeptide (SEQ ID NO: 224)

[0662] C29A mutant (SEQ ID NO: 225)

[0663] S115A mutant (SEQ ID NO: 226)

[0664] C29A-S115A mutant (SEQ ID NO: 227)

[0665] b. Activation of human Cathepsin B

[0666] The activation buffer is 25 mM MES, pH 5.5, 1 mM EDTA, and 2 mM DTT. Concentratedproteins were fully activated diluting them at least 50-fold in the activation buffer, followed by incubation at 37℃for 30 minutes (FIG. 13C and 13D) or at room temperature for 90 min (FIG. 5B) . Activation efficiency was confirmed using SDS-PAGE and LC-MS. The enzymatic activity of proteases was assessed using the candidate D-linker (-rkyyG-spacer-) at both high and low [E]  /  [S] ratios, with cleavage efficiency compared in batch assays.

[0667] Mature CATB (SEQ ID NO: 228)

[0668] Mature CATB-S115A (SEQ ID NO: 229)

[0669] c.Expression and purification ofantibodies

[0670] The pVITRO1-Tz-CASTi plasmid was prepared previously

[0030] and the CASTi tag was inserted at the C-terminus ofthe trastuzumab (Tz) heavy chain. The sequences are listedbelow.

[0671] The expression of the antibody was the same as the pro-CATB mentioned above. For Tz-CASTi plasmid, a total of 1.5 mg ofthe plasmid was premixed with 3.9 mg of PEI (1: 2.6) in 50 mL of fresh medium.

[0672] The supernatant ofthe medium was harvested by centrifugation at 1200×g for 5 minutes. The supernatants were loaded on Protein A beads (GenScript, Cat. L00210-50) twice and washed with PBS buffer for 10-column volume. Antibodies were then eluted with 0.1 M glycine (pH 3.0) , and neutralized in 0.2 M NaHCO3 (pH 8.2) immediately. The elution was concentrated and subjected to size-exclusion chromatography (Superdex 200 Increase 10 / 300 GL, GE Healthcare) in NMM buffer (50 mM, 0.2 M NaCl, pH 7.4) . The purified proteins were harvested and analyzedby LC-MS, and stored at-80℃ (FIG. 14A and 14B) .

[0673] Tz-CASTi-Light Chain (SEQ ID NO: 230)

[0674] Tz-CASTi-Heavy Chain (SEQ ID NO: 231)

[0675] Example 9. Kinetic Assay of Proteases and Substrates

[0676] a. Kinetics detection of cathepsin B with fluorogenic substrates

[0677] The assay buffer of Cathepsin B was 25 mM MES buffer (pH 5.5, 1 mM EDTA, 5 mM DTT, 39.2μL) . For ACC-AEEA-rkyyG-spacer-K (DNP) substrates, 400μM in 4%DMSO / H2O was prepared and the initial concentration was two-fold gradient dilution. Diluted Cathepsin B to 200 nM (about 7.4μg / mL, laboratory-prepared) in the assay buffer and incubated at room temperature for 15 minutes. Then 50μL of the dilute Cathepsin B was loaded in a black well plate and the reaction was started by adding 50μL ofthe substrate, including a substrate with assay buffer as blank. For ACC-AEEA-Val-Cit-spacer-K (DNP) substrates, 400μM in 10%DMSO / H2O was prepared, and the concentration of Cathepsin B was 100 nM. For ACC-AEEA-Val-Cit-spacer-K (DNP) substrates, 400μM in 10%DMSO / H2O was prepared, and the concentration of Cathepsin B was 150 nM. All kinetic measurements were performed using a Thermo Varioskan LUX Microplate reader at 37℃. For the substrates with the donor-acceptor pair, ACC / DNP, the excitation wavelength was 355 nm, and the emission wavelength was 460 nm. The kinetic mode was set to 60s / cycle, 70 cycles. The initial velocity of the enzyme was calculated using the highest slope recorded for 10 consecutive fluorescent readings within the initial 10 min. RFU values were converted to s–1 using ACC-K (DNP) standard curves.

[0678] b. Kinetic parameters analysis

[0679] The kcat and Km values were obtained from a curve fitting the concentration of substrates and initial velocity using GraphPad Prism software to the equation v0= (Vmax [S] )  /  (Km+ [S] ) , where v0 is the initial velocity ofthe enzyme with its corresponding [S] substrate concentration and Vmax is the maximum enzyme velocity at saturated [S] . Vmax=kcat [E] T, where [E] T is the total cathepsin B concentration used in the assay. Km is the x-axis value [S] , where y=Vmax / 2. All data were plotted, calculated, and analyzed using GraphPad Prism (version 9.5.0) .

[0680] Example 10. The N-terminal extension ofpentapeptide

[0681] The N-terminus (Pn-P5) of-rkyyG / -could be extended with most D-amino acids (n≥5) . Here, based on the sequence-rkyyG / spacer-, we evaluated the extendability of P6, with the results presented in Table 17. It was determined that the N-terminus of the pentapeptide can indeed be extended. Similarly, sites longer than P5 have already surpassed the active pocket binding region of cathepsin B, and are not essential for the specific recognition and cleavage by the protease. We propose that Pn-P5 can be any amino acid, including D-amino acids and their protected / modified forms.

[0682] The combinatorial peptide-x-rkyyG- (B23) was used for screening, and x denoted D-Trp, D-Arg, D-Met, D-Glu, D-Lys, D-Asp, D-Leu, D-Pro, D-Ser, D-Gly, D-Tyr, D-Phe, D-His, D-Gln, D-Asn, D-Thr, D-Val, D-Ala, D-Cit. The sequences and results are shown in Table 17.

[0683] Table 17. Sequences included in the test

[0684] Example 11. Validation based on sequence-ffG-

[0685] Table 18 shows that the reaction rate of-rkffG / spacer-is slower than that of -rkyyG / spacer-. Here, we selected-ffG-as the base sequence to verify the reliability of the aforementioned claim through random combination sequences.

[0686] The combinatorial peptide-x-ffG- (B24) was used for screening, and x denoted D-Trp, D-Arg, D-Met, D-Glu, D-Lys, D-Asp, D-Leu, D-Pro, D-Ser, D-Gly, D-Tyr, D-Phe, D-His, D-Gln, D-Asn, D-Thr, D-Val, D-Ala, D-Cit, D-Ile.

[0687] Table 18. Sequences included in the test

[0688] WSP-and-PR had the same usage as AEEA2-and-AEEA, and no effect on the recognition and cleavage of D-form sequences at key intermediate positions by proteases.

[0689] As shown in Table 19, the N-terminus of-ffG-can also be further extended, and the enzymatic cleavage rates did not show significant decreases. The conclusion is consistent with Example 10. Here, our longest sequence is P7-…-P1.

[0690] Table 19. Sequences included in the test

[0691] Example 12. The preference of P1 based on sequence-rkyyG-

[0692] We chose the optimal peptide-rkyyG / spacer-to synthesize a combinatorial peptide library-rkyy-x-spacer- (B25) , and x denoted D-Trp, D-Arg, D-Met, D-Glu, D-Lys, D-Asp, D-Leu, D-Pro, D-Ser, D-Gly, D-Tyr, D-Phe, D-His, D-Gln, D-Asn, D-Thr, D-Val, D-Ala, D-Cit, D-Ile.

[0693] The result shows that in addition to being Gly, P1 can also be D-His and D-Ser, with the reaction rates of D-amino acids being significantly slower than those of Gly (Table 20) .

[0694] Table 20. Sequences included in the test

[0695] References

[0696] 1. J.S. Siegel, Homochiral imperative of molecular evolution. Chirality 10, 24-27 (1998) .

[0697] 2. D.G. Blackmond, The origin of biological homochirality. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2, a002147 (2010) .

[0698] 3. R.C. deL. Milton, S.C.F. Milton, S.B.H. Kent, Total chemical synthesis of a D-enzyme: the enantiomers of HIV-1 protease show demonstrations of reciprocal chiral substrate specificity [corrected] . Science 256, 1445-1448 (1992) .

[0699] 4. K. Mandal, M. Uppalapati, D. Ault-Riché, J. Kenney, J. Lowitz, S.S. Sidhu, S.B.H. Kent, Chemical synthesis and X-ray structure of a heterochiral D-protein antagonist plus vascular endothelial growth factor protein complex by racemic crystallography. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 14779-14784 (2012) .

[0700] 5. K. Harrison, A.S. Mackay, L. Kambanis, J.W.C. Maxwell, R.J. Payne, Synthesis and applications of mirror-image proteins. Nat. Rev. Chem. 7, 383-404 (2023) .

[0701] 6. Z. Wu, C.T. Walsh, Phosphinate analogs of D-, D-dipeptides: slow-binding inhibition and proteolysis protection of VanX, a D-, D-dipeptidase required for vancomycin resistance in Enterococcus faecium. Proc. Natl. Acad. Sci. 92, 11603-11607 (1995) .

[0702] 7. J. Grandchamps, M. Nguyen-Disteche, C. Damblon, J.M. Frere, J.M. Ghuysen, Streptomyces K15 active-site serine DD-transpeptidase: specificity profile for peptide, thiol ester and ester carbonyl donors and pathways of the transfer reactions. Biochem J. 307 (Pt 2) , 335-339 (1995) .

[0703] 8. Y. Asano, H. Ito, T. Dairi, Y. Kato, An alkaline D-stereospecific endopeptidase with beta-lactamase activity from Bacillus cereus. J. Biol. Chem. 271, 30256-30262 (1996) .

[0704] 9. L.M.M. Ton N.M. Schumacher, Daniel L. Minor Jr., Michael A. Milhollen, Michael W. Burgess, Peter S. Kim, Identification of D-Peptide Ligands Through Mirror-Image Phage is play. Science 271, 1854-1857 (1996) .

[0705] 10. Y. -K. Qi, J. -S. Zheng, L. Liu, Mirror-image protein and peptide drug discovery through mirror-image phage display. Chem. (2024) .

[0706] 11. M. Uppalapat, D.J. Lee, K. Mandal, H. Li, L.P. Miranda, J. Lowitz, J. Kenney, J.J. Adams, D. Ault-Riché, S.B.H. Kent, and S. Sachdev, A Potent d-Protein Antagonist of VEGF-A is Nonimmunogenic, Metabolically Stable, and Longer-Circulating in Vivo. ACS Chem Biol. 11, 1058-1065 (2016) .

[0707] 12. K. Sun, S. Li, B. Zheng, Y. Zhu, T. Wang, M. Liang, Y. Yao, K. Zhang, J. Zhang, H. Li, D. Han, J. Zheng, B. Coventry, L. Cao, D. Baker, L. Liu, P. Lu, Accurate de novo design of heterochiral protein-protein interactions. Cell Res. (2024) .

[0708] 13. M.T. Weinstock, M.T. Jacobsen, M.S. Kay, Synthesis and folding of a mirror-image enzyme reveals ambidextrous chaperone activity. Proc. Natl. Acad. Sci. 111, 11679-11684 (2014) .

[0709] 14. R.A. Houghten, C. Pinilla, S.E. Blondelle, J.R. Appel, C.T. Dooley, J.H. Cuervo, Generation and use of synthetic peptide combinatorial libraries for basic research and drug discovery. Nature 354, 84–86 (1991) .

[0710] 15. B.J. Backes, J.L. Harris, F. Leonetti, C.S. Craik, J.A. Ellman, Synthesis of positional-scanning libraries of fluorogenic peptide substrates to define the extended substrate specificity of plasmin and thrombin. Nat. Biotechnol. 18, 187-193 (2000) .

[0711] 16. I. Schechter, A. BergerB, On the size of the active site in proteases. I. Papain. Biochem. Biophys. Res. Commun. 27, 157-162 (1967) .

[0712] 17. I. Redzynia, A. Ljunggren, M. Abrahamso, J.S. Mort, J.C. Krupa, M. Jaskolski, G. Bujacz, Displacement of the occluding loop by the parasite protein, chagasin, results in efficient inhibition of human cathepsin B. J. Biol. Chem. 283, 22815-22825 (2008) .

[0713] 18. R. Kuhelj, M. Dolinar, J. Pungercar, V. Turk, The preparation of catalytically active human cathepsin B from its precursor expressed in Escherichia coli in the form of inclusion bodies. Eur. J. Biochem. 229, 533-539 (1995) .

[0714] 19. V.S. Egorova, E.P. Kolesova, M. Lopus, N. Yan, A. Parodi, A.A. Zamyatnin Jr, Smart Delivery Systems Responsive to Cathepsin B Activity for Cancer Treatment. Pharmaceutics 15, (2023) .

[0715] 20. T. Yadati, T. Houben, A. Bitorina, R. Shiri-Sverdlov, The Ins and Outs of Cathepsins: Physiological Function and Role in Disease Management. Cells 9, (2020) .

[0716] 21. B. We, J. Gunzner-Toste, H. Yao, T. Wang, J. Wang, Z. Xu, J. Chen, J. Wai, J. Nonomiya, S.P. Tsai, J. dela Cruz-Chuh, K.R. Kozak, Y. Liu, Discovery of Peptidomimetic Antibody-Drug Conjugate Linkers with Enhanced Protease Specificity. J. Med. Chem. 61, 989-1000 (2018) .

[0717] 22. S. Balamkundu, C.F. Liu, Lysosomal-Cleavable Peptide Linkers in Antibody-Drug Conjugates. Biomedicines 11, (2023) .

[0718] 23. M. Dorywalska, R. Dushin, L. Moine, S.E. Farias, D. Zhou, T. Navaratnam, V. Lui, A. Hasa-Moreno, M.G. Casas, T. T Tran, K. Delaria, S.H. Liu, D. Foletti, C.J. O'Donnell, J. Pons, D.L. Shelton, A. Rajpal, P. Strop, Molecular Basis of Valine-Citrulline-PABC Linker Instability in Site-Specific ADCs and Its Mitigation by Linker Design. Mol. Cancer Ther. 15, 958-970 (2016) .

[0719] 24. R. Ubink, E.H.C. Dirksen, M. Rouwette, E.S.J. M. Bakker, J. Krijger, T. Bos, P.M. van der Graaf, H.J.W.M. Beijnen, J.H. Beijnen, Unraveling the Interaction between Carboxylesterase 1c and the Antibody-Drug Conjugate SYD985: Improved Translational PK / PD by Using Ces1c Knockout Mice. Mol. Cancer Ther. 17, 2389-2398 (2018) .

[0720] 25. N.G. Caculitan, N.G., J. dela Cruz Chuh, Y. Ma, D. Zhang, K.R. Kozak, Y. Liu, T.H. Pillow, J. Sadowsky, Cathepsin B Is Dispensable for Cellular Processing of Cathepsin B-Cleavable Antibody-Drug Conjugates. Cancer Res. 77, 7027-7037 (2017) .

[0721] 26. M. Poreba, K. Groborz, M. Vizovisek, M. Maruggi, D. Turk, B. Turk, G. Salvesen, J.W.L. Chin, Fluorescent probes towards selective cathepsin B detection and visualization in cancer cells and patient samples. Chem. Sci. 10, 8461-8477 (2019) .

[0722] 27. R.J.S. Miller, S.M. Miller, S. Ng, R.N. Zuckermann, J.M. Kerr, W.H. Moos, Comparison of the proteolytic susceptibilities of homologous L-amino acid, D-amino acid, and N-substituted glycine peptide and peptoid oligomers. Drug Dev. Res. 35, 20-32 (1995) .

[0723] 28. D. Turk, M. Podobnik, T. Popovic, N. Katunuma, W. Bode, R. Huber, V. Turk, Crystal structure of cathepsin B inhibited with CA030 at 2.0-A resolution: A basis for the design of specific epoxysuccinyl inhibitors. Biochemistry 34, 4791-4797 (1995) .

[0724] 29. Dooley, C.T. and R.A. Houghten, Synthesis and Screening of Positional Scanning Combinatorial Libraries, in Combinatorial Peptide Library Protocols, S. Cabilly, Editor. 1998, Humana Press: Totowa, NJ. p. 13-24.

[0725] 30. Guo, M., et al., Copper assisted sequence-specific chemical protein conjugation at a single backbone amide. Nat. Commun., 2023. 14 (1) : p. 8063.

[0726] 31. Mach, L., et al., Activation of procathepsin B in human hepatoma cells: the conversion into the mature enzyme relies on the action of cathepsin B itself. Biochem J., 1993. 293 Pt 2 (Pt 2) : p. 437-42.

[0727] 32. Mach, L., et al., Proteolytic processing and glycosylation of cathepsin B. The Biochemical Journal, 1992. 282 (Pt 2) : p. 577-82.

[0728] 33. D. Turk, et al., Crystal structure of cathepsin B inhibited with CA030 at 2.0-A resolution: A basis for the design of specific epoxysuccinyl inhibitors. Biochemistry, 1995. 34: p. 4791-4797.

[0729] 34. Gavriel, A.G., et al., Recent advances in self-immolative linkers and their applications in polymeric reporting systems. Polymer Chemistry, 2022. 13 (22) : p. 3188-3269.

[0730] 35. Poreba, M., et al., Highly sensitive and adaptable fluorescence-quenched pair discloses the substrate specificity profiles in diverse protease families. Sci. Rep., 2017. 7: p. 43135.

[0731] 36. Redzynia, I., et al., Displacement of the occluding loop by the parasite protein, chagasin, results in efficient inhibition of human cathepsin B.J. Biol. Chem., 2008. 283 (33) : p. 22815-25.

Claims

1.A recognition sequence for human cathepsin B comprising an amino acid sequence of Formula (I) :P5-P4-P3-P2-P1 / -P1’ (I)whereinP1 is selected from the group consisting of Gly; D-His, D-Ser, and a protected / modified form thereof; preferably, selected from Gly and a protected / modified form thereof;P2 is a D-amino acid selected from the group consisting of D-Tyr, D-Trp, D-Phe, D-Pro, D-Val, D-His, D-Arg, D-Lys, D-Ser, D-Ala, D-Leu, D-Glu, and a protected / modified form thereof,preferably, a D-amino acid selected from the group consisting of D-Tyr, D-Trp, D-Phe, D-His, D-Leu, D-Glu, and a protected / modified form thereof;P3 is a D-amino acid selected from the group consisting of D-Tyr, D-His, D-Trp, D-Phe, D-Ser, D-Lys, D-Arg, D-Gln, D-Leu, D-Pro, D-Glu, D-Ala, D-Val, D-Asp, D-Ile, D-Thr, D-Asn, and a protected / modified form thereof,preferably, a D-amino acid selected from the group consisting of D-Tyr, D-His, D-Trp, D-Phe, D-Ser, D-Lys, D-Arg, D-Gln, D-Leu, D-Pro, D-Glu, D-Ala, D-Val, D-Asp, D-Thr, and a protected / modified form thereof,P4 is absent or a D-amino acid selected from the group consisting of D-His, D-Lys, D-Arg, D-Phe, D-Trp, D-Tyr, D-Leu, D-Pro, D-Gln, D-Ser, D-Glu, D-Ala, D-Val, D-Ile, D-Thr, D-Asn, D-Asp, and a protected / modified form thereof,preferably, a D-amino acid selected from the group consisting of D-His, D-Lys, D-Arg, D-Phe, D-Trp, D-Tyr, D-Leu, D-Pro, D-Gln, D-Ser, D-Glu, and a protected / modified form thereof;P5 is absent or a D-amino acid selected from the group consisting of D-Arg, D-Lys, D-His, D-Phe, D-Trp, D-Leu, D-Tyr, D-Pro, D-Gln, D-Ser, D-Glu, D-Ala, D-Val, D-Ile, D-Thr, D-Asn, D-Asp, and a protected / modified form thereof,preferably, a D-amino acid selected from the group consisting of D-Arg, D-Lys, D-His, D-Phe, D-Trp, D-Leu, D-Tyr, D-Pro, D-Gln, D-Ser, D-Glu, and a protected / modified form thereof;P1’ is absent or a D-amino acid selected from the group consisting of D-Trp, D-Phe, D-Tyr, D-Leu, D-Glu, D-Gln, D-His, D-Ser, D-Ala, D-Val, D-Ile, D-Thr, D-Asn, D-Asp, and a protected / modified form thereof,preferably, is absent or a D-amino acid selected from the group consisting of D-Trp, D-Phe, D-Tyr, D-Leu, D-Glu, D-Gln, D-His, D-Ser, D-Ala, and a protected / modified form thereof;“ / ” denotes to cleavage site where the recognition sequence is cleaved by human cathepsin B,or a fragment thereof comprising the cleavage site “ / ” .2.The recognition sequence according to claim 1, wherein P1 is selected from the group consisting of Gly; D-His, D-Ser, and a protected / modified form thereof.3.The recognition sequence according to claim 1 or 2, wherein P2 is a D-amino acid selected from the group consisting of D-Tyr, D-Trp, D-Phe, D-His, D-Leu, D-Glu, and a protected / modified form thereof.4.The recognition sequence according to any one of claims 1 to 3, wherein P3 is a D-amino acid selected from the group consisting of D-Tyr, D-His, D-Trp, D-Phe, D-Ala, D-Thr, and a protected / modified form thereof.5.The recognition sequence according to any one of claims 1 to 4, wherein P4 is a D-amino acid selected from the group consisting of D-His, D-Lys, D-Arg, D-Phe, D-Trp, D-Gln, D-Val, D-Thr, and a protected / modified form thereof.6.The recognition sequence according to any one of claims 1 to 5, wherein P5 is a D-amino acid selected from the group consisting of D-Arg, D-Lys, D-His, D-Leu, D-Tyr, D-Gln, and a protected / modified form thereof.7.The recognition sequence according to any one of claims 1 to 6, wherein P1’ is absent or a D-amino acid selected from the group consisting of D-Trp, and a protected / modified form thereof.8.The recognition sequence according to any one of claims 1 to 7, wherein the recognition sequence comprises an amino acid sequence selected from the group consisting of D-Arg-D-Lys-D-Tyr-D-Tyr-Gly D-Lys-D-Lys-D-Tyr-D-Tyr-Gly D-Lys-D-Arg-D-Tyr-D-Tyr-Gly D-Lys-D-His-D-Tyr-D-Tyr-Gly D-Arg-D-His-D-Tyr-D-Tyr-Gly D-Arg-D-Arg-D-Tyr-D-Tyr-Gly D-Arg-D-Phe-D-Tyr-D-Tyr-Gly D-His-D-Arg-D-Tyr-D-Tyr-Gly D-Arg-D-Arg-D-Ala-D-Tyr-Gly D-His-D-Arg-D-Ala-D-Tyr-Gly D-Arg-D-Phe-D-Ala-D-Tyr-Gly D-Arg-D-Arg-D-His-D-Tyr-Gly D-Arg-D-Lys-D-His-D-Tyr-Gly D-Arg-D-His-D-Ala-D-Tyr-Gly D-Lys-D-Arg-D-Ala-D-Tyr-Gly D-Arg-D-Lys-D-Ala-D-Tyr-Gly D-Arg-D-His-D-His-D-Tyr-Gly D-Arg-D-Phe-D-His-D-Tyr-Gly D-Arg-D-Lys-D-Phe-D-Trp-Gly D-Arg-D-Lys-D-Phe-D-Tyr-Gly D-Arg-D-Lys-D-Phe-D-Leu-Gly D-Arg-D-Lys-D-Tyr-D-Phe-Gly D-Leu-D-Lys-D-Phe-D-Phe-Gly D-Arg-D-Trp-D-Phe-D-Phe-Gly D-Arg-D-Lys-D-Phe-D-Phe-Gly D-Tyr-D-Lys-D-Phe-D-Phe-Gly D-Arg-D-Arg-D-Phe-D-Phe-Gly D-Arg-D-Thr-D-Phe-D-Phe-Gly D-Arg-D-His-D-Phe-D-Phe-Gly D-Lys-D-Lys-D-Phe-D-Phe-Gly D-Arg-D-Lys-D-Phe-D-Glu-Gly D-Arg-D-Lys-D-Phe-D-His-Gly D-Arg-D-Lys-D-Thr-D-Phe-Gly D-Arg-D-Lys-D-Trp-D-Phe-Gly D-Arg-D-Gln-D-Phe-D-Phe-Gly D-Arg-D-Val-D-Phe-D-Phe-Gly D-Gln-D-Lys-D-Phe-D-Phe-Gly D-His-D-Lys-D-Phe-D-Phe-Gly D-Tyr-D-Lys-D-Tyr-D-Tyr-Gly D-Arg-D-Trp-D-Tyr-D-Tyr-Gly D-Tyr-D-Lys-D-Phe-D-Tyr-Gly D-Arg-D-Trp-D-Phe-D-Tyr-Gly D-Arg-D-Lys-D-Tyr-D-Tyr-D-His D-Arg-D-Lys-D-Tyr-D-Tyr-D-Ser.9.A macromolecule comprising the recognition sequece according to any one of claims 1 to 7.10.The macromolecule according to claim 9, which is selected from the group consisting of protein, a macromolecule containing amino acid chain, for example, ligand-therapeutic agent conjugate, antibody-drug conjugate, and the like.11.A peptide comprising an amino acid sequence of formula (II) Pn…-P6-P5-P4-P3-P2-P1-P1’-P2’-…Pm’ (II)whereinn is an integer not greater than 8;m is an integer not greater than 4;P1 is selected from the group consisting of Gly; D-His, D-Ser, and a protected / modified form thereof; preferably, selected from Gly and a protected / modified form thereof;P2 is a D-amino acid selected from the group consisting of D-Tyr, D-Trp, D-Phe, D-Pro, D-Val, D-His, D-Arg, D-Lys, D-Ser, D-Ala, D-Leu, D-Glu, and a protected / modified form thereof,preferably, a D-amino acid selected from the group consisting of D-Tyr, D-Trp, D-Phe, D-His, D-Leu, D-Glu, and a protected / modified form thereof;P3 is a D-amino acid selected from the group consisting of D-Tyr, D-His, D-Trp, D-Phe, D-Ser, D-Lys, D-Arg, D-Gln, D-Leu, D-Pro, D-Glu, D-Ala, D-Val, D-Asp, D-Ile, D-Thr, D-Asn, and a protected / modified form thereof,preferably, a D-amino acid selected from the group consisting of D-Tyr, D-His, D-Trp, D-Phe, D-Ser, D-Lys, D-Arg, D-Gln, D-Leu, D-Pro, D-Glu, D-Ala, D-Val, D-Asp, D-Thr, and a protected / modified form thereof;P4 is absent or a D-amino acid selected from the group consisting of D-His, D-Lys, D-Arg, D-Phe, D-Trp, D-Tyr, D-Leu, D-Pro, D-Gln, D-Ser, D-Glu, D-Ala, D-Val, D-Ile, D-Thr, D-Asn, D-Asp, and a protected / modified form thereof,preferably, a D-amino acid selected from the group consisting of D-His, D-Lys, D-Arg, D-Phe, D-Trp, D-Tyr, D-Leu, D-Pro, D-Gln, D-Ser, D-Glu, and a protected / modified form thereof;P5 is absent or a D-amino acid selected from the group consisting of D-Arg, D-Lys, D-His, D-Phe, D-Trp, D-Leu, D-Tyr, D-Pro, D-Gln, D-Ser, D-Glu, D-Ala, D-Val, D-Ile, D-Thr, D-Asn, D-Asp, and a protected / modified form thereof,preferably, a D-amino acid selected from the group consisting of D-Arg, D-Lys, D-His, D-Phe, D-Trp, D-Leu, D-Tyr, D-Pro, D-Gln, D-Ser, D-Glu, and a protected / modified form thereof;each of P6 to Pn is independently absent, a L-amino acid, or a D-amino acid;P1’ is absent or a D-amino acid selected from the group consisting of D-Trp, D-Phe, D-Tyr, D-Leu, D-Glu, D-Gln, D-His, D-Ser, D-Ala, D-Val, D-Ile, D-Thr, D-Asn, D-Asp, and a protected / modified form thereof,preferably, is absent or a D-amino acid selected from the group consisting of D-Trp, D-Phe, D-Tyr, D-Leu, D-Glu, D-Gln, D-His, D-Ser, D-Ala, and a protected / modified form thereof;each of P2’ to Pm’ is independently absent, a L-amino acid, or a D-amino acid.12.The peptide according to claim 11, wherein P1 is selected from the group consisting of Gly; D-His, D-Ser, and a protected / modified form thereof.13.The peptide according to claim 11 or 12, wherein P2 is a D-amino acid selected from the group consisting of D-Tyr, D-Trp, D-Phe, D-His, D-Leu, D-Glu, and a protected / modified form thereof.14.The peptide according to any one of claims 11 to 13, wherein P3 is a D-amino acid selected from the group consisting of D-Tyr, D-His, D-Trp, D-Phe, D-Ala, D-Thr, and a protected / modified form thereof.15.The peptide according to any one of claims 11 to 14, wherein P4 is a D-amino acid selected from the group consisting of D-His, D-Lys, D-Arg, D-Phe, D-Trp, D-Gln, D-Val, D-Thr, and a protected / modified form thereof.16.The peptide according to any one of claims 11 to 15, wherein P5 is a D-amino acid selected from the group consisting of D-Arg, D-Lys, D-His, D-Leu, D-Tyr, D-Gln, and a protected / modified form thereof.17.The peptide according to any one of claims 11 to 16, wherein P6 is absent or a D-amino acid selected from the group consisting of D-Trp, D-Arg, D-Met, D-Glu, D-Lys, D-Asp, D-Leu, D-Pro, D-Ser, D-Gly, D-Tyr, D-Phe, D-His, D-Gln, D-Asn, D-Thr, D-Val, D-Ala, D-Cit, and a protected / modified form thereof.18.The peptide according to any one of claims 11 to 17, wherein P1’ is absent or a D-amino acid selected from the group consisting of D-Trp, and a protected / modified form thereof.19.The peptide according to any one of claims 11 to 18, wherein the peptide comprises an amino acid sequence of Formula (IIa) P6-P5-P4-P3-P2-P1-P1’ (IIa) .20.The peptide according to any one of claims 11 to 19, wherein the peptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of D-Arg-D-Lys-D-Tyr-D-Tyr-Gly D-Lys-D-Lys-D-Tyr-D-Tyr-Gly D-Lys-D-Arg-D-Tyr-D-Tyr-Gly D-Lys-D-His-D-Tyr-D-Tyr-Gly D-Arg-D-His-D-Tyr-D-Tyr-Gly D-Arg-D-Arg-D-Tyr-D-Tyr-Gly D-Arg-D-Phe-D-Tyr-D-Tyr-Gly D-His-D-Arg-D-Tyr-D-Tyr-Gly D-Arg-D-Arg-D-Ala-D-Tyr-Gly D-His-D-Arg-D-Ala-D-Tyr-Gly D-Arg-D-Phe-D-Ala-D-Tyr-Gly D-Arg-D-Arg-D-His-D-Tyr-Gly D-Arg-D-Lys-D-His-D-Tyr-Gly D-Arg-D-His-D-Ala-D-Tyr-Gly D-Lys-D-Arg-D-Ala-D-Tyr-Gly D-Arg-D-Lys-D-Ala-D-Tyr-Gly D-Arg-D-His-D-His-D-Tyr-Gly D-Arg-D-Phe-D-His-D-Tyr-Gly D-Arg-D-Lys-D-Phe-D-Trp-Gly D-Arg-D-Lys-D-Phe-D-Tyr-Gly D-Arg-D-Lys-D-Phe-D-Leu-Gly D-Arg-D-Lys-D-Tyr-D-Phe-Gly D-Leu-D-Lys-D-Phe-D-Phe-Gly D-Arg-D-Trp-D-Phe-D-Phe-Gly D-Arg-D-Lys-D-Phe-D-Phe-Gly D-Tyr-D-Lys-D-Phe-D-Phe-Gly D-Arg-D-Arg-D-Phe-D-Phe-Gly D-Arg-D-Thr-D-Phe-D-Phe-Gly D-Arg-D-His-D-Phe-D-Phe-Gly D-Lys-D-Lys-D-Phe-D-Phe-Gly D-Arg-D-Lys-D-Phe-D-Glu-Gly D-Arg-D-Lys-D-Phe-D-His-Gly D-Arg-D-Lys-D-Thr-D-Phe-Gly D-Arg-D-Lys-D-Trp-D-Phe-Gly D-Arg-D-Gln-D-Phe-D-Phe-Gly D-Arg-D-Val-D-Phe-D-Phe-Gly D-Gln-D-Lys-D-Phe-D-Phe-Gly D-His-D-Lys-D-Phe-D-Phe-Gly D-Tyr-D-Lys-D-Tyr-D-Tyr-Gly D-Arg-D-Trp-D-Tyr-D-Tyr-Gly D-Tyr-D-Lys-D-Phe-D-Tyr-Gly D-Arg-D-Trp-D-Phe-D-Tyr-Gly D-Arg-D-Lys-D-Tyr-D-Tyr-D-His D-Arg-D-Lys-D-Tyr-D-Tyr-D-Ser.21.Use of the peptide according to any one of claims 11 to 20 as a linker moiety for ligand-therapeutic agent conjugate, therapeutic use or detection and diagnosis.22.A linker moiety comprising an amino acid sequence of Formula (III) -NHPn…-P6-P5-P4-P3-P2-P1-P1’-P2’-…Pm’ C=O- (III)whereinn is an integer not greater than 8;m is an integer not greater than 4;P1 is selected from the group consisting of Gly; D-His, D-Ser, and a protected / modified form thereof; preferably, selected from Gly and a protected / modified form thereof;P2 is a D-amino acid selected from the group consisting of D-Tyr, D-Trp, D-Phe, D-Pro, D-Val, D-His, D-Arg, D-Lys, D-Ser, D-Ala, D-Leu, D-Glu, and a protected / modified form thereof,preferably, a D-amino acid selected from the group consisting of D-Tyr, D-Trp, D-Phe, D-His, D-Leu, D-Glu, and a protected / modified form thereof;P3 is a D-amino acid selected from the group consisting of D-Tyr, D-His, D-Trp, D-Phe, D-Ser, D-Lys, D-Arg, D-Gln, D-Leu, D-Pro, D-Glu, D-Ala, D-Val, D-Asp, D-Ile, D-Thr, D-Asn, and a protected / modified form thereof,preferably, a D-amino acid selected from the group consisting of D-Tyr, D-His, D-Trp, D-Phe, D-Ser, D-Lys, D-Arg, D-Gln, D-Leu, D-Pro, D-Glu, D-Ala, D-Val, D-Asp, D-Thr, and a protected / modified form thereof;P4 is absent or a D-amino acid selected from the group consisting of D-His, D-Lys, D-Arg, D-Phe, D-Trp, D-Tyr, D-Leu, D-Pro, D-Gln, D-Ser, D-Glu, D-Ala, D-Val, D-Ile, D-Thr, D-Asn, D-Asp, and a protected / modified form thereof,preferably, a D-amino acid selected from the group consisting of D-His, D-Lys, D-Arg, D-Phe, D-Trp, D-Tyr, D-Leu, D-Pro, D-Gln, D-Ser, D-Glu, and a protected / modified form thereof;P5 is absent or a D-amino acid selected from the group consisting of D-Arg, D-Lys, D-His, D-Phe, D-Trp, D-Leu, D-Tyr, D-Pro, D-Gln, D-Ser, D-Glu, D-Ala, D-Val, D-Ile, D-Thr, D-Asn, D-Asp, and a protected / modified form thereof,preferably, a D-amino acid selected from the group consisting of D-Arg, D-Lys, D-His, D-Phe, D-Trp, D-Leu, D-Tyr, D-Pro, D-Gln, D-Ser, D-Glu, and a protected / modified form thereof, andeach of P6 to Pn is independently absent, a L-amino acid, or a D-amino acid;P1’ is absent or a D-amino acid selected from the group consisting of D-Trp, D-Phe, D-Tyr, D-Leu, D-Glu, D-Gln, D-His, D-Ser, D-Ala, D-Val, D-Ile, D-Thr, D-Asn, D-Asp, and a protected / modified form thereof,preferably, a D-amino acid selected from the group consisting of D-Trp, D-Phe, D-Tyr, D-Leu, D-Glu, D-Gln, D-His, D-Ser, D-Ala, and a protected / modified form thereof;each of P2’ to Pm’ is independently absent, a L-amino acid, or a D-amino acid;“NH” denotes to N-terminal side of the peptide residue; “C=O” denotes to C-terminal side of the peptide residue.23.The linker moiety according to claim 22, wherein P1 is selected from the group consisting of Gly; D-His, D-Ser, and a protected / modified form thereof.24.The linker moiety according to claim 22 or 23, wherein P2 is a D-amino acid selected from the group consisting of D-Tyr, D-Trp, D-Phe, D-His, D-Leu, D-Glu, and a protected / modified form thereof.25.The linker moiety according to any one of claims 22 to 24, wherein P3 is a D-amino acid selected from the group consisting of D-Tyr, D-His, D-Trp, D-Phe, D-Ala, D-Thr, and a protected / modified form thereof.26.The linker moiety according to any one of claims 22 to 25, wherein P4 is a D-amino acid selected from the group consisting of D-His, D-Lys, D-Arg, D-Phe, D-Trp, D-Gln, D-Val, D-Thr, and a protected / modified form thereof.27.The linker moiety according to any one of claims 22 to 26, wherein P5 is a D-amino acid selected from the group consisting of D-Arg, D-Lys, D-His, D-Leu, D-Tyr, D-Gln, and a protected / modified form thereof.28.The linker moiety according to any one of claims 22 to 27, wherein P6 is absent or a D-amino acid selected from the group consisting of D-Trp, D-Arg, D-Met, D-Glu, D-Lys, D-Asp, D-Leu, D-Pro, D-Ser, D-Gly, D-Tyr, D-Phe, D-His, D-Gln, D-Asn, D-Thr, D-Val, D-Ala, D-Cit, and a protected / modified form thereof.29.The linker moiety according to any one of claims 22 to 28, wherein P1’ is absent or a D-amino acid selected from the group consisting of D-Trp, and a protected / modified form thereof.30.The linker moiety according to any one of claims 22 to 29, wherein the peptide comprises an amino acid sequence of Formula (IIIa) -NHP6-P5-P4-P3-P2-P1-P1’C=O- (IIIa) .31.The linker moiety according to any one of claims 22 to 30, wherein the linker moiety comprises an amino acid sequence selected from the group consisting of -D-Arg-D-Lys-D-Tyr-D-Tyr-Gly- -D-Lys-D-Lys-D-Tyr-D-Tyr-Gly- -D-Lys-D-Arg-D-Tyr-D-Tyr-Gly- -D-Lys-D-His-D-Tyr-D-Tyr-Gly- -D-Arg-D-His-D-Tyr-D-Tyr-Gly- -D-Arg-D-Arg-D-Tyr-D-Tyr-Gly- -D-Arg-D-Phe-D-Tyr-D-Tyr-Gly- -D-His-D-Arg-D-Tyr-D-Tyr-Gly- -D-Arg-D-Arg-D-Ala-D-Tyr-Gly- -D-His-D-Arg-D-Ala-D-Tyr-Gly- -D-Arg-D-Phe-D-Ala-D-Tyr-Gly- -D-Arg-D-Arg-D-His-D-Tyr-Gly- -D-Arg-D-Lys-D-His-D-Tyr-Gly- -D-Arg-D-His-D-Ala-D-Tyr-Gly- -D-Lys-D-Arg-D-Ala-D-Tyr-Gly- -D-Arg-D-Lys-D-Ala-D-Tyr-Gly- -D-Arg-D-His-D-His-D-Tyr-Gly- -D-Arg-D-Phe-D-His-D-Tyr-Gly- -D-Arg-D-Lys-D-Phe-D-Trp-Gly- -D-Arg-D-Lys-D-Phe-D-Tyr-Gly- -D-Arg-D-Lys-D-Phe-D-Leu-Gly- -D-Arg-D-Lys-D-Tyr-D-Phe-Gly- -D-Leu-D-Lys-D-Phe-D-Phe-Gly- -D-Arg-D-Trp-D-Phe-D-Phe-Gly- -D-Arg-D-Lys-D-Phe-D-Phe-Gly- -D-Tyr-D-Lys-D-Phe-D-Phe-Gly- -D-Arg-D-Arg-D-Phe-D-Phe-Gly- -D-Arg-D-Thr-D-Phe-D-Phe-Gly- -D-Arg-D-His-D-Phe-D-Phe-Gly- -D-Lys-D-Lys-D-Phe-D-Phe-Gly- -D-Arg-D-Lys-D-Phe-D-Glu-Gly- -D-Arg-D-Lys-D-Phe-D-His-Gly- -D-Arg-D-Lys-D-Thr-D-Phe-Gly- -D-Arg-D-Lys-D-Trp-D-Phe-Gly- -D-Arg-D-Gln-D-Phe-D-Phe-Gly- -D-Arg-D-Val-D-Phe-D-Phe-Gly- -D-Gln-D-Lys-D-Phe-D-Phe-Gly- -D-His-D-Lys-D-Phe-D-Phe-Gly- -D-Tyr-D-Lys-D-Tyr-D-Tyr-Gly- -D-Arg-D-Trp-D-Tyr-D-Tyr-Gly- -D-Tyr-D-Lys-D-Phe-D-Tyr-Gly- -D-Arg-D-Trp-D-Phe-D-Tyr-Gly- -D-Arg-D-Lys-D-Tyr-D-Tyr-D-His- -D-Arg-D-Lys-D-Tyr-D-Tyr-D-Ser-.32.A linker-therapeutic agent conjugate of Formula (IV) , LK-TA (IV)wherein,LK denotes to a linker component comprising the peptide according to any one of claims 11-20, or the linker moiety according to any one of claims 22 to 31, andTA denotes to a therapeutic agent.33.The linker-therapeutic agent conjugate according to claim 32, wherein the linker-therapeutic agent conjugate is selected from 34.A ligand-therapeutic agent conjugate of Formula (V) ,LG- (LK-TA) n (V)or a pharmaceutically acceptable salt, solvate, stereoisomer, or isotopic variant thereof,wherein,LG denotes to a ligand component;LK denotes to a linker component, having a structure of Z-L-Q,whereZ is absent or denotes to a stretcher moiety,L denotes to a linker moiety comprising the peptide according to any one of claims 11 to 20, or denotes to the linker moiety according to any one of claims 22 to 31, andQ is absent or denotes to a spacer moiety;TA denotes to a therapeutic agent; andn is an integer or decimal selected from 1 to 8.35.The ligand-therapeutic agent conjugate according to claim 34, wherein the stretcher moiety Z has a structure of: wherein Z’ is a function group capable of being coupled to the ligand;A1 is absent or is selected from the group consisting of C1-8 alkylidene, C2-8 alkenylidene, C3-8 cycloalkylidene, C3-8 cycloalkenylidene, 3-to 10-membered heterocyclylene, -O-C1-8 alkylidene, arylene, C1-8 alkylidene-arylene, arylene-C1-8 alkylidene, C1-8 alkylidene-C3-8 cycloalkylidene, C3-8 cycloalkylidene-C1-8 alkylidene, C1-8 alkylidene-3-to 10-membered heterocyclylene, 3-to 10-membered heterocyclylene-C1-8 alkylidene, - (CH2CH2O) r-, and - (CH2CH2O) r-C1-8 alkylidene-, C1-8 alkylidene- (CH2CH2O) r, C1-8 alkylidene- (CH2CH2O) r-C1-8 alkylidene, r is an integer ranging from 1 to 8, where the aforesaid groups are optionally substituted with 1 to 4 substituents independently selected from the group consisting of halogen, -CN, RA1, -ORA1, -SRA1, and-N (RA1) 2, where each RA1 is independently selected from the group consisting of C1-6 alkyl, C1-6 haloalkyl, C3-6 cycloalkyl, 3-to 10-membered heterocyclyl, C6-10 aryl, and 5-to 10-membered heteroaryl; andA2 is absent or is selected from an amino acid residue, dipeptide, tripeptide, tetrapeptide, pentapeptide, hexapeptide, and modified form thereof,denotes to the site covalently attached to the ligand component LG or the linker moiety L.36.The ligand-therapeutic agent conjugate according to claim 34 or 35, wherein the function group Z’ is selected from the group consisting of “*” denotes to the site covalently attached to A; anddenotes to the site covalently attached to the ligand component LG.37.The ligand-therapeutic agent conjugate according to any one of claims 34 to 36, wherein the group A1 is selected from the group consisting of methylene, ethylene, propylene, butylene, pentylene, hexylene, C1-8 alkylidene- (CH2CH2O) r-C1-8 alkylidene, r is an integer ranging from 1 to 8.38.The ligand-therapeutic agent conjugate according to any one of claims 34 to 37, wherein the stretcher moiety Z is selected from the group consisting of denotes to the site covalently attached to the ligand component LG or the linker moiety L.39.The ligand-therapeutic agent conjugate according to any one of claims 34 to 38, wherein the linker moiety comprises or consists of the peptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of D-Arg-D-Lys-D-Tyr-D-Tyr-Gly D-Lys-D-Lys-D-Tyr-D-Tyr-Gly D-Lys-D-Arg-D-Tyr-D-Tyr-Gly D-Lys-D-His-D-Tyr-D-Tyr-Gly D-Arg-D-His-D-Tyr-D-Tyr-Gly D-Arg-D-Arg-D-Tyr-D-Tyr-Gly D-Arg-D-Phe-D-Tyr-D-Tyr-Gly D-His-D-Arg-D-Tyr-D-Tyr-Gly D-Arg-D-Arg-D-Ala-D-Tyr-Gly D-His-D-Arg-D-Ala-D-Tyr-Gly D-Arg-D-Phe-D-Ala-D-Tyr-Gly D-Arg-D-Arg-D-His-D-Tyr-Gly D-Arg-D-Lys-D-His-D-Tyr-Gly D-Arg-D-His-D-Ala-D-Tyr-Gly D-Lys-D-Arg-D-Ala-D-Tyr-Gly D-Arg-D-Lys-D-Ala-D-Tyr-Gly D-Arg-D-His-D-His-D-Tyr-Gly D-Arg-D-Phe-D-His-D-Tyr-Gly D-Arg-D-Lys-D-Phe-D-Trp-Gly D-Arg-D-Lys-D-Phe-D-Tyr-Gly D-Arg-D-Lys-D-Phe-D-Leu-Gly D-Arg-D-Lys-D-Tyr-D-Phe-Gly D-Leu-D-Lys-D-Phe-D-Phe-Gly D-Arg-D-Trp-D-Phe-D-Phe-Gly D-Arg-D-Lys-D-Phe-D-Phe-Gly D-Tyr-D-Lys-D-Phe-D-Phe-Gly D-Arg-D-Arg-D-Phe-D-Phe-Gly D-Arg-D-Thr-D-Phe-D-Phe-Gly D-Arg-D-His-D-Phe-D-Phe-Gly D-Lys-D-Lys-D-Phe-D-Phe-Gly D-Arg-D-Lys-D-Phe-D-Glu-Gly D-Arg-D-Lys-D-Phe-D-His-Gly D-Arg-D-Lys-D-Thr-D-Phe-Gly D-Arg-D-Lys-D-Trp-D-Phe-Gly D-Arg-D-Gln-D-Phe-D-Phe-Gly D-Arg-D-Val-D-Phe-D-Phe-Gly D-Gln-D-Lys-D-Phe-D-Phe-Gly D-His-D-Lys-D-Phe-D-Phe-Gly D-Tyr-D-Lys-D-Tyr-D-Tyr-Gly D-Arg-D-Trp-D-Tyr-D-Tyr-Gly D-Tyr-D-Lys-D-Phe-D-Tyr-Gly D-Arg-D-Trp-D-Phe-D-Tyr-Gly D-Arg-D-Lys-D-Tyr-D-Tyr-D-His D-Arg-D-Lys-D-Tyr-D-Tyr-D-Ser.40.The ligand-therapeutic agent conjugate according to any one of claims 34 to 39, wherein the spacer moiety is a self-immolative spacer selected from the group consisting of p-aminobenzyl alcohol (PABA) derivatives, comprising p-aminobenzyl carbamates, p-aminobenzyl ethers; aminomethoxy derivatives; 1, 2-diol derivatives; disulfide-based self-immolative spacers; cyclization-induced self-immolative linkers; and grob fragmentation-based self-immolative linkers.41.The ligand-therapeutic agent conjugate according to any one of claims 34 to 40, wherein the therapeutic agent is a cytotoxic or cytostatic agent.42.The ligand-therapeutic agent conjugate according to any one of claims 34 to 41, wherein the ligand-therapeutic agent is an antibody-drug conjugate.43.A pharmaceutical composition comprising an effective amount of a ligand-therapeutic agent conjugate according to any one of claims 34 to 42, and a pharmaceutically acceptable carrier, diluent or excipient.44.The ligand-therapeutic agent conjugate according to any one of claims 34 to 42 or the pharmaceutical composition according to claim 43 for use in the treatment of diseases, for example cancers, autoimmune disease, metabolic disease.45.A method for treating, preventing, ameliorating, and / or diagnosing diseases, for example cancers, autoimmune disease, metabolic disease in a subject in need thereof, comprising administering to the subject an effective amount of the ligand-therapeutic agent conjugate according to any one of claims 34 to 42 or the pharmaceutical composition according to claim 43.46.Use of the ligand-therapeutic agent conjugate according to any one of claims 34 to 42 or the pharmaceutical composition according to claim 43 in the manufacture of a medicament for the treatment of diseases,for example cancers,autoimmune disease, metabolic disease.

Images