Methods and systems for assessing risk posed by endocrine disrupting chemicals and epigenetic modifiers

Abstract

A system and method for assessing a risk posed by endocrine disrupting chemicals (EDCs) and epigenetic modifiers (EpMs) in a sample, the method comprising: i) exposing a biological model to the sample for a predetermined period; ii) extracting nucleic acids from the biological model following exposure; iii) sequencing the nucleic acids to determine a methylation pattern and a differential expression level for a plurality of target genes, wherein the plurality of target genes comprises functional gene clusters governing hormonal regulation, epigenetic regulation, reproduction, development, and growth; and iv) generating a quantitative risk score based on the determined methylation pattern and differential expression level, wherein the risk score indicates a potential for endocrine disruption and epigenetic modification induced by the sample.

Description

METHODS AND SYSTEMS FOR ASSESSING RISK POSED BY ENDOCRINE DISRUPTING CHEMICALS AND EPIGENETIC MODIFIERSTECHNICAL FIELD

[0001] The invention relates to methods and systems for assessing a health or environmental risk posed by harmful chemicals in a sample. Particularly, but not exclusively, the invention relates to methods and systems for assessing the risk posed by endocrine disrupting chemicals and epigenetic modifiers in a sample.BACKGROUND

[0002] Endocrine-disrupting chemicals (EDCs) can interfere with the normal function of the endocrine system even at extremely low concentrations (e.g., parts per trillion) , leading to a wide range of diseases. Over the past decade, emerging evidence has revealed that some chemicals may not only affect directly exposed individuals but can also induce epigenetic changes-through alterations in DNA methylation, histone modification, and microRNA expression. These changes may result in adverse effects such as reproductive and growth impairments or developmental deformities in subsequent generations, despite the offspring never being exposed to the chemicals during their life cycle. Such compounds, termed epigenetic-disrupting modifiers (EpMs) , pose a particularly serious concern. Notably, many widely used chemicals of diverse structures and functions (e.g., UV filters, plastic softeners, flame retardants, contraceptives) have been shown to exert both endocrine-and epigenetic-disrupting effects, thereby presenting a significant long-term threat to animal health, survival, and sustainability. Arguably, chemicals capable of modifying epigenetic processes are among the most dangerous, and their use and occurrence must be subject to strict surveillance and control.

[0003] Currently, chemical analysis is employed to identify and quantify individual compounds known to cause endocrine-and / or epigenetic-disrupting effects, and risk posed is then indirectly estimated based on their concentrations and limited knowledge of their biological impacts. This approach is far from satisfactory because: (a) existing knowledge of endocrine-and epigenetic-disrupting effects induced by specific chemicals remains incomplete, and (b) the structures and effects of potential EDCs and EpMs are highly diverse and variable. More importantly, chemical analysis can only provide concentration data for known compounds, and risk assessment relies heavily on certain assumptions. Furthermore, many unidentified chemicals co-exist in a single sample, and their interactions-whether synergistic, additive, or antagonistic-remain largely unknown and are rarely considered, despite the importance of these interactions are well established.

[0004] Therefore, there is a need for an improved and / or a direct measurement that can rapidly determine the risk posed by EDCs and EpMs in a sample.SUMMARY OF THE INVENTION

[0005] The invention provides a direct, rapid, and cost‐effective method and approach to detect and quantify endocrine‐and epigenetic-disrupting effects from all chemicals in a single sample. It enables simultaneous evaluation of both target and non‐target compounds, providing a comprehensive risk assessment without the need for individual chemical quantification.

[0006] In accordance with a first aspect of the present invention, there is provided a method for assessing a risk posed by EDCs and EpMs in a sample, the method comprising:

[0007] i) exposing a biological model to the sample for a predetermined period;

[0008] ii) extracting nucleic acids from the biological model following exposure;

[0009] iii) sequencing the nucleic acids to determine a methylation pattern and differential expression level for a plurality of target genes, wherein the plurality of target genes comprises functional gene clusters governing hormonal regulation, epigenetic regulation, reproduction, development, and growth; and

[0010] (iv) generating a quantitative risk score based on the determined methylation pattern and differential expression level wherein the risk score indicates a potential for endocrine disruption and epigenetic modification induced by the sample.

[0011] In accordance with the first aspect, the quantitative risk score is generated based on (a) a relative importance factor assigned to each of the target genes; (b) a level of change in expression level observed in each of the target genes; and (c) a level of change in methylation level observed in each of the target genes; and / or (d) a level of change in global methylation in the whole genome.

[0012] In accordance with the first aspect, the sequencing is performed using a nanopore sequencing device capable of detecting DNA modifications from raw electrical signal data.

[0013] In accordance with the first aspect, the plurality of target genes comprises:

[0014] a) at least SHH, AR and CYP19A1 for the functional gene cluster governing reproduction;

[0015] b) at least SHH, AR, CYP19A1, THRA, THRB, and TSHR for the functional gene cluster governing development;

[0016] c) at least IGF1 and PPARG for the functional gene cluster governing growth;

[0017] d) at least NR3C1 for the functional gene cluster governing hormonal regulation; and

[0018] e) at least DMRT1 for the functional gene cluster governing epigenetic regulation.

[0019] In accordance with the first aspect, the plurality of target genes further comprises a) SOX9, ESR2, and STAR for the functional gene cluster governing reproduction; b) SOX9, ESR2, STAR, DIO2, DIO3 and TG for the functional gene cluster governing development; c) GH1, IGF2, PPARA and RXRA for the functional gene cluster governing growth; d) CRH and POMC for the functional gene cluster governing hormonal regulation. Furthermore, the plurality of target genes may further comprise a) BMP2, BMP4, NOTCH1, CYP17A1, DMRT1, FSHR, GNRHR, HSD17B3, LHCGR, and INSR for the functional gene cluster governing reproduction; b) BMP2, BMP4, COL1A1, NOTCH1, PAX6, PTCH1, RUNX2, SMAD4, SOX2, BDNF, CYP17A1, DMRT1, FSHR, GNRHR, HSD17B3, LHCGR, DIO1, PAX8, RXRA, SLC16A2, SLC5A5, TRH, TRHR and TSHB for the functional gene cluster governing development; c) AKT1, BMP2, BMP4, GHR, IGF1R, KRAS, MTOR, CEBPA, INSR, SREBF1 for the functional gene cluster governing growth; d) HSD11B2 and NR3C2 for the functional gene cluster governing hormonal regulation.

[0020] In accordance with the first aspect, the plurality of target genes further comprises SIRT1, SIRT6, CISD2, DMRT2 and DMRT3 for the functional gene cluster governing epigenetic regulation.

[0021] In accordance with the first aspect, the plurality of target genes comprises at least 50%of the genes listed in each of Table 1 to Table 5.

[0022] In accordance with the first aspect, the biological model comprises a human cell line encompassing steroidogenesis pathways. For example, the human cell line comprises H295R cells or SKOV3 ovarian cancer cells. In an alternative embodiment, the biological model comprises an in vivo vertebrate model exposed to the sample. For example, the vertebrate model is marine medaka fish or mice.

[0023] In accordance with the first aspect, the predetermined period of exposure is approximately or at least 48 hours.

[0024] In accordance with the first aspect, the quantitative risk score is generated between 1 to 3 days after exposing the biological model to the sample.

[0025] In accordance with the first aspect, the sample is an environmental sample, a chemical sample, a mixture of chemicals or a food sample.

[0026] In accordance with the first aspect, the step of sequencing utilizes a neural network-based base calling process to distinguish methylated cytosine from unmethylated cytosine.

[0027] In accordance with a second aspect of the present invention, there is provided a system for determining risk posed by a sample, comprising:

[0028] i) a sequencing device comprising an array of nanopores configured to sequence nucleic acids extracted from a biological model exposed to the sample; and

[0029] ii) a processor configured to:

[0030] receive sequencing data from the sequencing device;

[0031] analyze the sequencing data to identify changes in methylation and gene expression in a plurality of target genes, wherein the plurality of target genes comprises functional gene clusters governing hormonal regulation, epigenetic regulation, reproduction, development, and growth; and

[0032] generate a quantitative risk score indicating a potential for endocrine disruption and epigenetic modification induced by the sample.

[0033] In accordance with the second aspect, the sequencing device includes a sensor chip comprising an array of nanopores.

[0034] In accordance with the second aspect, the quantitative risk score is generated based on (a) a relative importance factor assigned to each of the target genes; (b) a level of change in expression level observed in each of the target genes; (c) a level of change in methylation pattern in each of the target gene and / or (d) a level of change in global methylation in the whole genome.

[0035] In accordance with the second aspect, the plurality of target genes comprises:

[0036] a) at least SHH, AR and CYP19A1 for the functional gene cluster governing reproduction;

[0037] b) at least SHH, AR, CYP19A1, THRA, THRB, and TSHR for the functional gene cluster governing development;

[0038] c) at least IGF1 and PPARG for the functional gene cluster governing growth;

[0039] d) at least NR3C1 for the functional gene cluster governing hormonal regulation; and

[0040] e) at least DMRT1 for the functional gene cluster governing epigenetic regulation.

[0041] In accordance with the second aspect, the plurality of target genes further comprises a) SOX9, ESR2, and STAR for the functional gene cluster governing reproduction; b) SOX9, ESR2, STAR, DIO2, DIO3 and TG for the functional gene cluster governing development; c) GH1, IGF2, PPARA and RXRA for the functional gene cluster governing growth; d) CRH and POMC for the functional gene cluster governing hormonal regulation. Furthermore, the plurality of target genes may further comprise a) BMP2, BMP4, NOTCH1, CYP17A1, DMRT1, FSHR, GNRHR, HSD17B3, LHCGR, and INSR for the functional gene cluster governing reproduction; b) BMP2, BMP4, COL1A1, NOTCH1, PAX6, PTCH1, RUNX2, SMAD4, SOX2, BDNF, CYP17A1, DMRT1, FSHR, GNRHR, HSD17B3, LHCGR, DIO1, PAX8, RXRA, SLC16A2, SLC5A5, TRH, TRHR and TSHB for the functional gene cluster governing development; c) AKT1, BMP2, BMP4, GHR, IGF1R, KRAS, MTOR, CEBPA, INSR, SREBF1 for the functional gene cluster governing growth; d) HSD11B2 and NR3C2 for the functional gene cluster governing hormonal regulation.

[0042] In accordance with the second aspect, the plurality of target genes further comprises SIRT1, SIRT6, CISD2, DMRT2 and DMRT3 for the functional gene cluster governing epigenetic regulation.

[0043] In a particular embodiment, the plurality of target genes are those listed in Table 1 to Table 5.BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

[0044] Embodiments of the present invention will now be described, by way of example, with reference to the accompanying drawings in which:

[0045] Figure 1 is a schematic showing a DNA methylation analysis in the method according to an embodiment of the present invention, in which Medaka fish and cell lines are applied as an in vivo and an in vitro biological model to determine the risk or toxicity posed by a sample; and

[0046] Figure 2 is a schematic showing the use of nanopore sequencing technology in the method in accordance with an embodiment of the present invention.

[0047] DETAILED DESCRIPTION OF THE PREFERRED EMBODIMENTS

[0048] Unless otherwise defined, all technical terms used herein have the same meaning as commonly understood by one skilled in the art to which the invention belongs.

[0049] As used herein, “comprising” means including the following elements but not excluding others. “Consisting of” means that the material solely consists of, i.e. is formed by the respective element. As used herein, the forms “a” , “an” , and “the” , are intended to include the singular and plural forms unless the context clearly indicates otherwise.

[0050] Endocrine disrupting chemicals (EDCs) refer to any exogenous substance or mixture that interferes with the normal function of the endocrine system. Such chemicals may alter the synthesis, secretion, transport, binding, action, or elimination of natural hormones responsible for maintaining homeostasis, reproduction, growth, and development. EDCs include, but are not limited to, industrial chemicals, pesticides, plasticizers, flame retardants, pharmaceuticals, and personal care product ingredients. Specific examples of EDCs include, not limited to, bisphenol A, phthalates, polychlorinated biphenyls, dioxin, benzophenone-3, oxybenzone.

[0051] Epigenetic modifiers (EpMs) refers to any exogenous substance or mixture that induces heritable changes in gene expression without altering the underlying DNA sequence. Such chemicals may interfere with epigenetic regulatory mechanisms, including DNA methylation, histone modification, and microRNA expression, thereby leading to adverse biological outcomes.

[0052] The present invention therefore in one aspect provides a method for assessing a risk posed by EDCs and EpMs in a sample. The sample can be an environmental sample, a chemical, a chemical mixture, a food sample or a cosmetic sample.

[0053] As used herein, the term “environmental sample” refers to any material collected from the natural or built environment that may contain chemical, biological, or physical agents relevant to risk assessment. Such samples include, but are not limited to, water (surface, ground, or drinking) , soil, sediment, air particulates, wastewater, and biological specimens obtained from environmental monitoring (e.g., plants, fish, or other organisms) . The term “food sample” refers to any material intended for human or animal consumption that may contain chemical, biological, or physical agents relevant to risk assessment. Such samples include, but are not limited to, raw agricultural products, processed foods, beverages, dietary supplements, and feed materials. The term “cosmetic sample” refers to any material intended for application to the human body for cleansing, beautifying, promoting attractiveness, or altering appearance, which may contain chemical agents relevant to risk assessment. Such samples include, but are not limited to, skincare products, hair care products, makeup, sunscreens, and personal care formulations.

[0054] The method comprises:

[0055] i) exposing a biological model to the sample for a predetermined period, optionally the sample may be pre-treated before the exposure;

[0056] ii) extracting nucleic acids from the biological model following exposure;

[0057] iii) sequencing the nucleic acids to determine a methylation pattern and a differential expression level for a plurality of target genes, wherein the plurality of target genes comprises functional gene clusters governing hormonal regulation, epigenetic regulation, reproduction, development, and growth; and

[0058] (iv) generating a quantitative risk score based on the determined methylation pattern and differential expression level, wherein the risk score indicates a potential for endocrine disruption and epigenetic modification induced by the sample.

[0059] As used herein, the term biological model refers to any living organism, or biological preparation employed for the study, assessment, or quantification of chemical, biological, or physiological effects. Biological models include, but are not limited to, in vitro cell lines, in vivo animal models such as mice, and aquatic organisms such as medaka fish. These models provide representative platforms for evaluating endocrine‐and epigenetic-disrupting effects, as well as associated risks to health, development, and survival. In embodiments, the biological model comprises a human cell line encompassing steroidogenesis pathways. In embodiments, the human cell line can be SKOV3 ovarian cancer cells or H295R cells. In another embodiment, the biological model comprises an in vivo vertebrate model, and preferably is selected from medaka fish and mice.

[0060] In step i) , the biological model is exposed or incubated with the sample for a predetermined period and the predetermined period can be approximately 12 hours, approximately 24 hours, approximately 36 hours, approximately 48 hours, approximately 60 hours, or approximately 72 hours. In some embodiments, the predetermined period is approximately 48 hours. Preferably, the predetermined period is less than 72 hours. It is advantageous because the total time from exposing the biological model to generating the risk score can be reduced to between 1 and 3 days.

[0061] In some instances, the sample may be pre-treated for better exposure. For example, the sample may be filtered to remove large particles before the exposure. In particular, the supernatant of the sample may be used. In another example, the sample may be subjected to extraction or purification first before the exposure.

[0062] In step ii) , the nucleic acids are extracted from the biological model following the exposure. The “nucleic acids” as used herein refers to any polymer of nucleotide monomers, including both deoxyribonucleic acid (DNA) and ribonucleic acid (RNA) , whether single‐stranded or double‐stranded, linear or circular, natural or synthetic. The method herein may use the established nucleic acid extraction methods to obtain DNA and / or RNA suitable for the subsequent sequencing. The extraction methods include, but are not limited to, chemical extraction techniques such as phenol–chloroform and guanidinium thiocyanate–phenol (TRIzol) , solid‐phase extraction using silica column matrices, and magnetic bead‐based extraction systems. The choice of method may be adapted according to sample type. In some instances, the method extracts DNAs from the biological sample for sequencing.

[0063] In step iii) , the extracted nucleic acids are subjected to sequencing to determine a methylation pattern and a differential expression level for a plurality of target genes. Preferably, the sequencing is performed using a nanopore sequencing device capable of detecting DNA modifications from raw electrical signal data. The use of third-generation long-read sequencing technology enables direct detection of methylation patterns, and thereby allow a rapid data acquisition without complex setup.

[0064] The instant method considers the methylation pattern and the expression levels of the target gene to derive a suitable score for reflecting the risk of suffering from endocrine disruption and epigenetic modification induced by the sample. “Methylation pattern” refers to the specific arrangement and distribution of methyl groups covalently attached to cytosine residues within nucleic acids, particularly DNA. Methylation patterns encompass both gene‐specific methylation (localized changes at promoter or regulatory regions) and global methylation (overall genomic methylation status) . These patterns serve as epigenetic markers that regulate gene expression, chromatin structure, and cellular function, and may be altered in response to chemical exposures, environmental factors, or disease states. The term “differential expression level” refers to the measurable change in the abundance of transcripts or gene products of a specific gene when comparing two or more biological conditions, treatments, or sample groups. As used herein, the term encompasses both up‐regulation and down‐regulation relative to a reference or control.

[0065] The target genes of the present invention comprise, but not limited to, functional gene clusters governing hormonal regulation, epigenetic regulation, reproduction, development, and growth. Preferably, the plurality of target genes comprises:

[0066] a) at least SHH, AR and CYP19A1 for the functional gene cluster governing reproduction;

[0067] b) at least SHH, AR, CYP19A1, THRA, THRB, and TSHR for the functional gene cluster governing development;

[0068] c) at least IGF1 and PPARG for the functional gene cluster governing growth;

[0069] d) at least NR3C1 for the functional gene cluster governing hormonal regulation; and e) at least DMRT1 for the functional gene cluster governing epigenetic regulation.

[0070] In some instances, the plurality of target genes further comprises a) SOX9, ESR2, and STAR for the functional gene cluster governing reproduction; b) SOX9, ESR2, STAR, DIO2, DIO3 and TG for the functional gene cluster governing development; c) GH1, IGF2, PPARA and RXRA for the functional gene cluster governing growth; d) CRH and POMC for the functional gene cluster governing hormonal regulation. Preferably, the plurality of target gene further comprises a) BMP2, BMP4, NOTCH1, CYP17A1, DMRT1, FSHR, GNRHR, HSD17B3, LHCGR, and INSR for the functional gene cluster governing reproduction; b) BMP2, BMP4, COL1A1, NOTCH1, PAX6, PTCH1, RUNX2, SMAD4, SOX2, BDNF, CYP17A1, DMRT1, FSHR, GNRHR, HSD17B3, LHCGR, DIO1, PAX8, RXRA, SLC16A2, SLC5A5, TRH, TRHR and TSHB for the functional gene cluster governing development; c) AKT1, BMP2, BMP4, GHR, IGF1R, KRAS, MTOR, CEBPA, INSR, SREBF1 for the functional gene cluster governing growth; d) HSD11B2 and NR3C2 for the functional gene cluster governing hormonal regulation.

[0071] In some instances, the plurality of target genes further comprises SIRT1, SIRT6, CISD2, DMRT2 and DMRT3 for the functional gene cluster governing epigenetic regulation.

[0072] In particular, the plurality of target genes may comprise any combinations of genes listed in Table 1 to Table 5. In some instances, the plurality of target genes comprises at least 50%, at least 75%at least 85%, at least 90%, at least 95%of the genes listed in each of the Table 1 to Table 5. In some instances, the plurality of target genes are those listed in Table 1 to Table 5. The following tables also include the respective weighting factor for each target gene, for generation of the risk score.

[0073] Table 1 List of 41 target genes related to reproduction and their corresponding weighting factor.

[0074] Table 2 List of 260 target genes related to development and their corresponding weighting factor.

[0075] Table 3 List of 117 target genes related to growth and their corresponding weighting factor.

[0076] Table 4 List of 26 target genes related to endocrine disruption and their corresponding weighting factor.

[0077] Table 5 List of 6 targeted genes related to epigenetic and their corresponding weighting factor.

[0078] Preferably, the risk score is generated based on (a) a relative importance factor assigned to each of the target genes; (b) a level of change in expression level observed in each of the target genes; (c) a level of change in methylation pattern in each of the target genes, and (d) a level of change in global methylation.

[0079] In some instances, the step of sequencing iii) may further utilize a neural network-based base calling process to distinguish methylated cytosine from unmethylated cytosine.

[0080] The present invention in another aspect provides a system for determining risk posed by the sample. The sample is as described above. The system comprises:

[0081] i) a sequencing device, such as a sensor chip comprising an array of nanopores, configured to sequence nucleic acids extracted from a biological model exposed to the sample; and

[0082] ii) a processor configured to:

[0083] receive sequencing data from the sequencing device;

[0084] analyze the sequencing data to identify changes in methylation and gene expression in a plurality of target genes, wherein the plurality of target genes is as described above; and

[0085] generate a risk score indicating a potential for endocrine disruption and epigenetic modification induced by the sample.

[0086] The processor may be provided as a general purpose processor, a digital signal processor (DSP) , an application specific integrated circuit (ASIC) , a field programmable gate array (FPGA) or other programmable logic component, discrete gate or transistor logic, discrete hardware components, or any combination thereof designed to perform the functions described herein. A general purpose processor may be a microprocessor, but in the alternative, the processor may be any conventional processor, controller, microcontroller, circuit, and / or state machine. A processor may also be implemented as a combination of computing components, e.g., a combination of a DSP and a microprocessor, a number of microprocessors, one or more microprocessors in conjunction with a DSP core, or any other such configuration. In some instances, the risk score is generated based on (a) a relative importance factor assigned to each of the target genes; (b) a level of change in expression level observed in each of the target genes; (c) a level of change in methylation in each of the target genes, and / or (d) a level of change in global methylation.

[0087] An example of the practical application include an embodiment where the disclosed method is applied to the assessment of drinking water safety. A water treatment facility traditionally relies on gas chromatography–mass spectrometry (GC‐MS) to detect a predefined list of regulated pesticides and industrial chemicals. However, such chemical‐specific assays are limited to known compounds and fail to account for novel or unregulated contaminants, and also interactions between different chemicals. Using the disclosed invention, a technician may apply the water sample to a biological model comprising Medaka fish for a 48‐hour incubation. For example, with reference to Figures 1 and 2, the Medaka fish is exposed to the water sample for 48 hours, and fish ovarian tissues are collected. Afterwards, nucleic acids are extracted from the treated fish ovarian tissues and loaded onto a nanopore‐based sequencing device. The nano-pore based sequencing device is as illustrated in Figure 2. As the DNA passes through the nanopores, the system simultaneously reads sequence information and detects expression of specific genes and methylation marks. Software filters the data against a defined gene panel associated with the five functional gene clusters as described above. The system then calculate an overall risk score based on the relative importance of individual genes, their gene specific methylation patterns, differential expression levels of the target genes and global methylation.

[0088] It would be important to appreciate that the system of the invention identifies the specific and overall biological consequences of chemical exposure without prior knowledge of the specific compounds present. Unlike traditional GC‐MS, which requires chemical identification and quantification, the disclosed method directly measures functional genomic and epigenetic responses. As a result, the facility halts water distribution pending investigation, thereby preventing a public health crisis. The entire process can be completed within three days, at significantly lower cost than conventional toxicology studies, highlighting the rapid, reliable, and cost‐effective nature of the invention.

[0089] Therefore, the disclosed method and system provide a direct estimate of the total endocrine-disrupting effects and epigenetic changes induced by all chemicals in a single sample. The underlying principle is to determine concomitantly: (a) the overall endocrine disrupting effects and epigenetic changes induced by all chemicals in the sample, and (b) the number and relative importance of relevant genes affected. The generated risk score enables estimation and comparison of both endocrine‐and epigenetic-disrupting effects induced by all chemicals present in a sample. This invention provides a rapid, direct, and reliable method for assessing and comparing such biological consequences without the need for laborious chemical analysis. Importantly, the method delivers an integrated assessment of specific and overall adverse outcomes without requiring identification or quantification of individual compounds, nor attribution of toxicity to any single chemical within the mixture.EXAMPLES

[0090] EXAMPLE 1: In vitro biological model test

[0091] SKOV3 Ovarian cell lines are seeded onto a 12-well plate at a density of 1 x 105 cells per well. The cells are then incubated with a solvent dimethyl sulfoxide (DMSO) for 48 hours to form a negative control group, and with benzophenone-3 (BP-3) at a concentration of 10 ng / mL for 48 hours to form a positive treatment group. After 48 hours, the cells are then collected and lysed for RNA and DNA extraction. The extracted RNA and DNA pellet is washed to remove any residual salts or other impurities, and resuspended in a suitable buffer for subsequent sequencing.

[0092] Nanopore sequencing technology is then applied to directly measure the expression levels of target genes in each group, as well as provide a methylation pattern.

[0093] The target genes belong to five functional gene clusters governing hormonal regulation, epigenetic regulation, reproduction, development, and growth. Each target gene is assigned a weighting factor to reflect its relative importance in calculating the overall risk score. The differences in gene expression levels and DNA methylation changes between the negative group and the positive group are then multiplied by the corresponding weighting factor, producing a weighed risk contribution. The sequencing further provides a global methylation reflecting the overall amount of 5mC content present across the entire genome. By combining all the weighed risk scores and the global methylation, a risk score is generated to reflect the toxicity or the total biological adverse effect induced by BP-3.

[0094] Tables 6 to 10 show the differential DNA methylation and gene expression of different target genes, and the calculation of the corresponding weighed risk.

[0095] Table 6 The weighted risk derived from the differential DNA methylation and gene expression of the target gene related to reproduction in the in vitro model.

[0096] Table 7 The weighted risk derived from the differential DNA methylation and gene expression of the target gene related to development in the in vitro model.

[0097] Table 8 The weighted risk derived from the differential DNA methylation and gene expression of the target gene related to growth in the in vitro model.

[0098] Table 9 The weighted risk derived from the differential DNA methylation and gene expression of the target gene related to endocrine disruption in the in vitro model.

[0099] Table 10 The weighted risk derived from the differential DNA methylation and gene expression of the target gene related to epigenetic in the in vitro model.

[0100] By combining all the weighted risks, the overall risk score is calculated as 3950. Since BP3 is recognized as a well-known EDC and EpM, this score provides a reference value for a sample presenting an unacceptable level of risk. In particular, for a sample exposed to an in vitro biological model, the sample having a risk score equals to or above 3752 would be classified as posing a “VERY HIGH” risk to environment or human health. Similarly, if the sample has a risk score equals to or above 2962, the sample would be classified as posing a “HIGH” risk to environment or human health. In particular, the risk scores for different risk levels are shown in Table 11.

[0101] Table 11 Risk Scores for assessing a combined risk posed by EDCs and EpMs in a sample by using an in vitro biological model.

[0102] EXAMPLE 2: In vivo biological model test

[0103] Medaka fish are separated into two groups, i.e. a negative control and a positive treatment group. The fish in the negative group are treated with DMSO (0.004%) for 48 hours, while the fish in the positive group are exposed to BP-3 at a concentration of 50 ug / L for the same duration. After 48 hours, fish ovarian tissues are collected and subject to cell lysis and RNA / DNA extraction. The extracted RNA / DNA pellet is washed to remove any residual salts or other impurities, and resuspended in a suitable buffer for subsequent sequencing.

[0104] Nanopore sequencing technology is then applied to directly measure the expression levels and DNA methylation of target genes in each group, as well as provide a global methylation pattern.

[0105] Similar to Example 1, the target genes belong to five functional gene clusters governing hormonal regulation, epigenetic regulation, reproduction, development, and growth. Each target gene is assigned a weighting factor to reflect its relative importance in the gene cluster to calculate the overall risk score. The differences in gene expression levels and DNA methylation changes between the negative group and the positive group are then multiplied by the corresponding weighting factor, producing a weighed risk contribution. The sequencing further provides a global methylation reflecting the overall amount of 5mC content present across the entire genome. By combining all the weighed risk scores and the global methylation, a risk score is generated to reflect the toxicity or the total biological adverse effect induced by BP-3.

[0106] Tables 12 to 16 show the differential DNA methylation of different target genes, and the calculation of the corresponding weighed risk.

[0107] Table 12 The weighted risk derived from the differential DNA methylation and gene expression of the target gene related to reproduction in the in vivo model.

[0108] Table 13 The weighted risk derived from the differential DNA methylation and gene expression of the target gene related to development in the in vivo model.

[0109] Table 14 The weighted risk derived from the differential DNA methylation and gene expression of the target gene related to growth in the in vivo model.

[0110] Table 15 The weighted risk derived from the differential DNA methylation and gene expression of the target gene related to endocrine disruption in the in vivo model.

[0111] Table 16 The weighted risk derived from the differential DNA methylation and gene expression of the target gene related to epigenetic in the in vivo model.

[0112] The global methylation obtained from the sequencing is 1.39.

[0113] By combining all the weighted risks with the global methylation data, the overall risk score is calculated as 525. Since BP3 is recognized as a well-known EDC and EpM, this score provides a reference value for a sample presenting an unacceptable level of risk. In particular, for a sample exposed to an in vivo biological model, the sample having a risk score equals to or above 499 would be classified as posing a “VERY HIGH” risk to both environment and human health. Similarly, if the sample has a risk score equals to or above 394, the sample would be classified as posing a “HIGH” risk to environment and human health. In particular, the risk scores for different risk levels are shown in Table 17.

[0114] Table 17 Risk Scores for assessing a combined risk posed by EDCs and EpMs in a sample by using an in vivo biological model.

[0115] Based on the above, both specific and overall risks are derived quantitatively. The overall risk score is generated by considering: (a) the relative importance of each gene, (b) the magnitude of change, (c) the extent of gene‐specific DNA methylation changes, and (d) the level of global methylation changes.

[0116] The disclosed method provides a direct, rapid, reliable, informative, and cost‐effective quantitative approach for assessing and identifying risks posed by EDCs and EpMs in a sample. It can be applied to determine the toxicity of environmental, food, cosmetic samples and emerging new chemicals for use. It is because endocrine‐disrupting effects and epigenetic changes are closely linked to critical fitness traits such as reproduction, growth, and development, this method enables evaluation of risks that may significantly impact species survival and sustainability.

[0117] Also, the invention provides a direct and rapid tool for quantifying both specific and overall endocrine‐disrupting effects and epigenetic changes induced by all chemicals within a single test sample. This effective tool enables direct risk assessment of both target and non‐target EDCs and EpMs, eliminating the need for tedious individual chemical quantification, which otherwise yields only indirect evaluations. It is believed that the present invention will meet the imminent and growing demands of the drug industry, food industry, product industry, medical diagnostic as well as regulatory requirements.

[0118] It will be appreciated by persons skilled in the art that numerous variations and / or modifications may be made to the invention as shown in the specific embodiments without departing from the spirit or scope of the invention as broadly described. The present embodiments are, therefore, to be considered in all respects as illustrative and not restrictive.

[0119] Any reference to prior art contained herein is not to be taken as an admission that the information is common general knowledge, unless otherwise indicated.

Claims

1.A method for assessing a risk posed by endocrine disrupting chemicals (EDCs) and epigenetic modifiers (EpMs) in a sample, the method comprising:i) exposing a biological model to the sample for a predetermined period;ii) extracting nucleic acids from the biological model following exposure;iii) sequencing the nucleic acids to determine a methylation pattern and a differential expression level for a plurality of target genes, wherein the plurality of target genes comprises functional gene clusters governing hormonal regulation, epigenetic regulation, reproduction, development, and growth; andiv) generating a quantitative risk score based on the determined methylation pattern and differential expression level, wherein the risk score indicates a potential for endocrine disruption and epigenetic modification induced by the sample.2.The method of claim 1, wherein the sequencing is performed using a nanopore sequencing device capable of detecting DNA modifications from raw electrical signal data.3.The method of claim 1, wherein the quantitative risk score is generated based on (a) a relative importance factor assigned to each of the target genes; (b) a level of change in expression level observed in each of the target genes; c) a level of change in methylation level observed in each of the target genes; and / or (d) a level of change in global methylation.4.The method of claim 1, wherein the plurality of target genes comprises:a) at least SHH, AR and CYP19A1 for the functional gene cluster governing reproduction;b) at least SHH, AR, CYP19A1, THRA, THRB, and TSHR for the functional gene cluster governing development;c) at least IGF1 and PPARG for the functional gene cluster governing growth;d) at least NR3C1 for the functional gene cluster governing hormonal regulation; ande) at least DMRT1 for the functional gene cluster governing epigenetic regulation.5.The method of claim 4, wherein the plurality of target genes further comprises a) SOX9, ESR2, and STAR for the functional gene cluster governing reproduction; b) SOX9, ESR2, STAR, DIO2, DIO3 and TG for the functional gene cluster governing development; c) GH1, IGF2, PPARA and RXRA for the functional gene cluster governing growth; d) CRH and POMC for the functional gene cluster governing hormonal regulation.6.The method of claim 5, wherein the plurality of target genes further comprises a) BMP2, BMP4, NOTCH1, CYP17A1, DMRT1, FSHR, GNRHR, HSD17B3, LHCGR, and INSR for the functional gene cluster governing reproduction; b) BMP2, BMP4, COL1A1, NOTCH1, PAX6, PTCH1, RUNX2, SMAD4, SOX2, BDNF, CYP17A1, DMRT1, FSHR, GNRHR, HSD17B3, LHCGR, DIO1, PAX8, RXRA, SLC16A2, SLC5A5, TRH, TRHR and TSHB for the functional gene cluster governing development; c) AKT1, BMP2, BMP4, GHR, IGF1R, KRAS, MTOR, CEBPA, INSR, SREBF1 for the functional gene cluster governing growth; d) HSD11B2 and NR3C2 for the functional gene cluster governing hormonal regulation.7.The method of claim 4, wherein the plurality of target genes further comprises SIRT1, SIRT6, CISD2, DMRT2 and DMRT3 for the functional gene cluster governing epigenetic regulation.8.The method of claim 4, wherein the plurality of target genes comprises at least 50%of the genes listed in each of Table 1 to Table 5.9.The method of claim 1, wherein the biological model comprises a human cell line encompassing steroidogenesis pathways.10.The method of claim 9, wherein the human cell line comprises SKOV3 ovarian cancer cells or H295R cells.11.The method of claim 1, wherein the biological model comprises an in vivo vertebrate model exposed to the sample.12.The method of claim 11, wherein the vertebrate model is marine medaka fish or mice.13.The method of claim 1, wherein the predetermined period of exposure is approximately or at least 48 hours.14.The method of claim 1, wherein the quantitative risk score is generated between 1 to 3 days after exposing the biological model to the sample.15.The method of claim 1, wherein the sample is an environmental sample, a chemical, a chemical mixture or a food sample.16.The method of claim 1, wherein the step of sequencing utilizes a neural network-based base calling process to distinguish methylated cytosine from unmethylated cytosine.17.A system for determining risk posed by a sample, comprising:i) a sequencing device configured to sequence nucleic acids extracted from a biological model exposed to the sample; andii) a processor configured to:receive sequencing data from the sequencing device;analyze the sequencing data to identify changes in methylation and gene expression in a plurality of target genes, wherein the plurality of target genes comprises functional gene clusters governing hormonal regulation, epigenetic regulation, reproduction, development, and growth; andgenerate a quantitative risk score indicating a potential for endocrine disruption and epigenetic modification induced by the sample.18.The system of claim 17, wherein the quantitative risk score is generated based on (a) a relative importance factor assigned to each of the target genes; (b) a level of change in expression level observed in each of the target genes; (c) a level of change in methylation pattern in each of the target gene; and / or (d) a level of change in global methylation.19.The system of claim 17, wherein the plurality of target genes comprises:a) at least SHH, AR and CYP19A1 for the functional gene cluster governing reproduction;b) at least SHH, AR, CYP19A1, THRA, THRB, and TSHR for the functional gene cluster governing development;c) at least IGF1 and PPARG for the functional gene cluster governing growth;d) at least NR3C1 for the functional gene cluster governing hormonal regulation; ande) at least DMRT1 for the functional gene cluster governing epigenetic regulation.20.The system of claim 19, wherein the plurality of target genes further comprises a) SOX9, ESR2, and STAR for the functional gene cluster governing reproduction; b) SOX9, ESR2, STAR, DIO2, DIO3 and TG for the functional gene cluster governing development; c) GH1, IGF2, PPARA and RXRA for the functional gene cluster governing growth; d) CRH and POMC for the functional gene cluster governing hormonal regulation.21.The system of claim 20, wherein the plurality of target genes further comprises a) BMP2, BMP4, NOTCH1, CYP17A1, DMRT1, FSHR, GNRHR, HSD17B3, LHCGR, and INSR for the functional gene cluster governing reproduction; b) BMP2, BMP4, COL1A1, NOTCH1, PAX6, PTCH1, RUNX2, SMAD4, SOX2, BDNF, CYP17A1, DMRT1, FSHR, GNRHR, HSD17B3, LHCGR, DIO1, PAX8, RXRA, SLC16A2, SLC5A5, TRH, TRHR and TSHB for the functional gene cluster governing development; c) AKT1, BMP2, BMP4, GHR, IGF1R, KRAS, MTOR, CEBPA, INSR, SREBF1 for the functional gene cluster governing growth; d) HSD11B2 and NR3C2 for the functional gene cluster governing hormonal regulation.22.The system of claim 19, wherein the plurality of target genes further comprises SIRT1, SIRT6, CISD2, DMRT2 and DMRT3 for the functional gene cluster governing epigenetic regulation.23.The system of claim 17, wherein the plurality of target genes are those listed in Table 1 to Table 5.24.The system of claim 17, wherein the sample is an environmental sample, a chemical, a chemical mixture or a food sample.25.The system of claim 17, wherein the sequencing device includes a sensor chip comprising an array of nanopores.

Images