Recombinant extracellular vesicles for bioactive protein delivery and uses thereof

Abstract

Provided are a catalase or its variant, a nucleic acid sequence encoding the catalase or its variant, a vector comprising the nucleic acid sequence, a delivery system comprising the catalase or its variant and / or the nucleic acid sequence or the vector, a pharmaceutical or a cosmetics composition comprising the catalase or its variant or the nucleic acid sequence or the vector or the delivery system, a use of the catalase or its variant or the nucleic acid sequence or the vector or the delivery system in the manufacturing of a pharmaceutical composition or a cosmetics composition for scavenging reactive oxygen species (ROS), mitigating oxidative stress, and / or ameliorating the visible signs and / or biomarkers of photoaging of the skin.

Description

Recombinant Extracellular Vesicles for Bioactive Protein Delivery and Uses Thereof

[0001] Cross-Reference to Related Applications

[0002] The application claims the priority to PCT Application No. PCT / CN2025 / 081856, filed on March 11, 2025. The content of the prior PCT applications is considered as a part of the present disclosure and are incorporated herein in its entirety.Technical Field

[0003] The present disclosure relates to field of biomedicine. In particular, the present disclosure relates to recombinant extracellular vesicles for bioactive protein delivery and uses thereof.Background

[0004] Skin aging and related cell senescence are caused by extrinsic factors (e.g., ultraviolet light exposure, smoking, pollution) and intrinsic factors (e.g., time, genetic factors, hormones) . UV radiation is the most potent extrinsic driver of age-related change in the skin, known as “photoaging” . Photoaging accounts for approximately 80%of facial aging. Photoaging of the skin is clinically manifest principally as actinic elastosis, wrinkles and dyspigmentation. UV radiation triggers the excessive creation of reactive oxygen species (ROS) in the epidermis and dermis layers of the skin, mitochondria is the main site of ROS production in cells. ROS exert negative effects on skin cells, including keratinocytes and fibroblasts, by inducing oxidative damage and promoting inflammatory responses. These effects lead to a reduction in cellular viability, accelerated collagen degradation, and upregulation of pro-inflammatory cytokines. Multiple characteristics of skin aging are associated with inflammation. During the polarization of M0 macrophages into pro-inflammatory M1 macrophages, the increase in ROS levels is often observed. Meanwhile, excessive ROS further promotes M1 polarization. Cytokines such as IL-6 and TNF-α are markers of M1 macrophages, and the upregulated levels can be found in the photoaging skin.

[0005] The use of small molecules therapeutically has been disappointing, which are ineffective to scavenging ROS inside cells. Antioxidant enzymes react thousands to millions of times more rapidly with those oxidants than small molecules do and provide the predominant antioxidant defense. As the most active antioxidant enzyme in both nature and the human body, catalase plays a crucial role in mitigating oxidative stress by efficiently scavenging ROS. Catalase's ability to decompose hydrogen peroxide into water and oxygen significantly reduces oxidative damage caused by UV radiation. This enzymatic activity not only protects keratinocytes and fibroblasts from ROS-induced cellular damage but also helps maintain skin integrity and elasticity. Catalase can serve as an effective strategy for ameliorating the visible signs of photoaging, such as wrinkles and dyspigmentation.

[0006] Extracellular vesicles (EVs) are lipid bilayer nanoparticles released from all cell types into extracellular space. EVs naturally transport essential cellular components (i.e., proteins or active enzyme, lipids, nucleic acids such as mRNA, micro-RNA) for intercellular communication. Therefore, EVs are promising in delivering an active ingredient, payload or therapeutic agent to or within a target cell. As natural secretomes from cells, EVs have numerous advantages as drug delivery system / vehicle compared to synthetic drug delivery vehicles (e.g. liposomes, lipid nanoparticles and virus vectors) . EVs are naturally derived from cells, making them inherently biocompatible and less likely to provoke an immune response compared to synthetic vehicles. This characteristic is crucial for reducing potential side effects in therapeutic applications; EVs possess intrinsic tissue-targeting abilities and an navigate through biological barriers; EVs exhibit great stability in biological fluids, which contributes to a prolonged circulation time in the extracellular matrix and bloodstream. EVs have been extensively validated in both scientific research and clinical applications with proven efficacy and safety in the field of medical aesthetics. Their potential therapeutic applications include anti-aging, anti-pigmentation, wound healing, hair regeneration, and others. However, active ingredient is very limited in natural stem cell derived EV.

[0007] Catalase has a short half-life due to rapid proteolytic degradation and immunogenicity when introduced into the body. Therefore, encapsulating catalase in EVs could enhance its stability and prolong its effective half-life, allowing it to better penetrate target tissues and cells, where it can scavenge reactive oxygen species effectively. Different methodologies have been developed for the loading of therapeutic agents into EVs including sonication, electroporation, and passive incubation. However, these conventional methods involve multiple manufacturing steps including catalase protein expression, EV production, and loading. They are plagued by drawbacks such as relatively low loading efficiency and high production costs.

[0008] There is unmet need to provide low-cost and efficient catalase and catalase delivery system to improve photoaging skin conditions.Summary of Invention

[0009] To solve the aforementioned technical problems, the present disclosure provides catalase and catalase delivery system by genetic engineering approaches, the producing cells are modified to achieve high-level expression of recombinant human catalase protein (rhCAT) and recombinant human extracellular vesicles (rhEV) , which streamlines the production and loading processes into a one-step approach, not only enhances loading efficiency but also significantly reduces overall production costs by minimizing the complexity of manufacturing workflows. Further, catalase is modified to target mitochondrial, which is more specific. The catalase and catalase delivery system in present disclosure presents a promising avenue for scavenging reactive oxygen species (ROS) , mitigating oxidative stress, and ameliorating the visible signs and / or biomarkers of photoaging of the skin.

[0010] In the first aspect, the present disclosure provides a catalase or its variant, which at least has one of the bioactivities of scavenging reactive oxygen species (ROS) , mitigating oxidative stress, and / or ameliorating the visible signs and / or biomarkers of photoaging of the skin.

[0011] In some embodiments, the catalase or its variant is a wild-type catalase or a modified catalase, wherein the modified catalase is selected from at least one of the following groups:

[0012] (i) a wild-type catalase having one or more amino acid mutations, inserts, deletions and / or additions,

[0013] (ii) a wild-type catalase modified with chemical groups, or

[0014] (iii) a fusion protein consisting of (a) a wild catalase or its variant, and (b) other functional protein or polypeptide with specific biological functions, preferably wherein the functional proteins or polypeptide having tissue targeting activities, further preferably, the functional proteins or polypeptide having mitochondrial targeting activities, most preferably, the fusion protein is obtained based on the catalase deleting C-terminal amino acid residues “K-A-N-L” and adding N-terminal mitochondrial targeting sequence.

[0015] In some embodiments, the catalase or its variant is selected from at least one of the following groups:

[0016] (i) the catalase having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, or having at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 99.5%sequence identity to SEQ ID NO: 1;

[0017] (ii) the mitochondria-targeting catalase having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2, or having at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 99.5%sequence identity to SEQ ID NO: 2.

[0018] In the second aspect, the present disclosure provides a nucleic acid sequence, which encoding the catalase or its variant according to the first aspect of the present disclosure.

[0019] In the third aspect, the present disclosure provides a vector which comprising the nucleic acid sequence according to the second aspect of the present disclosure.

[0020] In the fourth aspect, the present disclosure provides a delivery system, which comprising:

[0021] (i) the catalase or its variant according to the first aspect of the present disclosure and / or

[0022] (ii) the nucleic acid sequence according to the second aspect of the present disclosure or vector according to the third aspect of the present disclosure,

[0023] (iii) a carrier, wherein the carrier having the function of delivering the catalase or its variant into the specific tissues or cells.

[0024] In some embodiments, the carrier is selected from at least one of liposome, extracellular vesicle (EV) and virus-like particle (VLP) .

[0025] In some embodiments, the carrier is selected from at least one of universal extracellular vesicle or modified extracellular vesicle, preferably the extracellular vesicle is universal exosome or modified exosome.

[0026] In some embodiments, the extracellular vesicle is harvesting from the producer cell, preferably the extracellular vesicle is exosome, and the exosome can be modified to enhance production, exposure duration, tissue specific targeting or endosome escaping, more preferably the exosome comprising:

[0027] (i) peptide and / or protein containing a GPI-anchoring signal sequence,

[0028] (ii) peptide / antibody fragment modification, and / or

[0029] (iii) other protein modification.

[0030] In some embodiments, the producer cell overexpressing at least one of the proteins or protein fragments selected from CD46, CD52, CD55, CD58 and CD59.

[0031] In some embodiments, the producer cell is non-human mammalian cell line or human cell line.

[0032] In some embodiments, the producer cell is selected from HEK 293F cell line, HEK 293T cell line, stem cell line or any combination thereof.

[0033] In the fifth aspect, the present disclosure provides a pharmaceutical composition, comprising:

[0034] (i) the catalase or its variant according to the first aspect of the present disclosure, or

[0035] (ii) the nucleic acid sequence according to the second aspect of the present disclosure or the vector according to the third aspect of the present disclosure, or

[0036] (iii) the delivery system according to the fourth aspect of the present disclosure, and

[0037] (iv) a pharmaceutically acceptable excipient.

[0038] In the sixth aspect, the present disclosure provides a cosmetics composition, comprising:

[0039] (i) the catalase or its variant according to the first aspect of the present disclosure, or

[0040] (ii) the nucleic acid sequence according to the second aspect of the present disclosure or the vector according to the third aspect of the present disclosure, or

[0041] (iii) the delivery system according to the fourth aspect of the present disclosure, and

[0042] (iv) an acceptable excipient.

[0043] In the seventh aspect, the present disclosure provides a manufacturing method of the delivery system according to the fourth aspect of the present disclosure, wherein the delivery system is formed by producer cell and secreted / released into the culture medium, which is then isolated and purified to obtain, the producer cell is transfected with the vector according to the third aspect of the present disclosure and produce the delivery system within the cell.

[0044] In some embodiments, the producer cell is selected from HEK 293F cell line, HEK 293T cell line, stem cell line or any combination thereof.

[0045] In the eighth aspect, the present disclosure provides a manufacturing method of the pharmaceutical composition according to the fifth aspect of the present disclosure, or the cosmetics composition according to the sixth aspect of the present disclosure, which use the catalase or its variant according to the first aspect of the present disclosure or the nucleic acid sequence according to the second aspect of the present disclosure or the vector according to the third aspect of the present disclosure or the delivery system according to the fourth aspect of the present disclosure.

[0046] In the ninth aspect, the present disclosure provides a method of using the pharmaceutical composition according to the fifth aspect of the present disclosure, or the cosmetics composition according to the sixth aspect of the present disclosure, which comprise administering an effective amount of the catalase or its variant according to the first aspect of the present disclosure or the nucleic acid sequence according to the second aspect of the present disclosure or the vector according to the third aspect of the present disclosure or the delivery system according to the fourth aspect of the present disclosure to a subject in need thereof.

[0047] In the tenth aspect, the present disclosure provides a use of the catalase or its variant according to the first aspect of the present disclosure or the nucleic acid sequence according to the second aspect of the present disclosure or the vector according to the third aspect of the present disclosure or the delivery system according to the fourth aspect of the present disclosure in the manufacturing of a pharmaceutical composition or a cosmetics composition for scavenging reactive oxygen species (ROS) , mitigating oxidative stress, and / or ameliorating the visible signs and / or biomarkers of photoaging of the skin.

[0048] In some embodiments, the pharmaceutical composition or cosmetic composition is for improving photoaging skin conditions.

[0049] In some embodiments, the improving photoaging skin condition comprising:

[0050] (i) promoting skin cells proliferation, preferably wherein the skin cells are human dermal fibroblasts and / or human keratinocyte cells;

[0051] (ii) reducing ROS level;

[0052] (iii) enhancing collagen regeneration;

[0053] (iv) reducing wrinkles, and / or

[0054] (v) improving inflammation condition of photoaged skin.

[0055] In some embodiments, the pharmaceutical composition or cosmetic composition is used for the treatment of photoaging of skin, natural aging of the skin, melasma, pigmentation and / or vitiligo.Brief Description of Drawings

[0056] The following is a brief description of the drawings, which are presented for the purposes of illustrating the exemplary embodiments disclosed herein and not for the purposes of limiting the same.

[0057] Figure 1 shows schematic of recombinant vector system. Figure 1A shows the PoI is wtCAT. Figure 1B shows the PoI is mitoCAT.

[0058] Figure 2 shows particle size distribution of EVs.

[0059] Figure 3 shows TEM of EVs.

[0060] Figure 4 shows Western Blot analysis for positive and negative markers of the purified EVs.

[0061] Figure 5 shows enzymatic activity of rhCAT (MCE) , rhCAT (Abcam) and 313EVCAT.

[0062] Figure 6 shows EV protect catalase from proteolytic degradation.

[0063] Figure 7 shows cytotoxity of naked EV, 313EVCAT and mitoEVCAT.

[0064] Figure 8 shows the ability of 313EVCAT for scavenging H2O2.

[0065] Figure 9 shows the ability of 313EVCAT and MSCEV for scavenging H2O2.

[0066] Figure 10 shows the ability of 313EVCAT for preventing UVB irradiation damage.

[0067] Figure 11 shows the ability of 313EVCAT for scavenging H2O2 in extracellular.

[0068] Figure 12 shows the relative mean fluorescence intensity of UVB irradiation cells pre-treatment with 313EVCAT, which represent intracellular H2O2 level.

[0069] Figure 13 shows the ELISA analysis, demonstrates that 313EVCAT can improve cell regeneration capability and reproduce collagen protein.

[0070] Figure 14 shows the qPCR analysis, demonstrates that 313EVCAT can improve cell regeneration capability and reproduce collagen protein.

[0071] Figure 15 shows the ability of 313EVCAT for reducing inflammatory cytokine IL-6.

[0072] Figure 16 shows the ability of 313EVCAT for reducing inflammatory cytokine TNF-α.

[0073] Figure 17 shows the expression levels of SOD1, SOD2 and catalase produce by producer cells in cells and exosomes. Figure 17A shows the expression levels of SOD1 produce by producer cells in cells and exosomes. Figure 17B shows the expression levels of SOD2 produce by producer cells in cells and exosomes. Figure 17C shows the expression levels of catalase produce by producer cells in cells and exosomes.

[0074] Figure 18 shows average catalase loaded and catalase activity of 313EVCAT and exogenously incorporating catalase (electroporation and freeze-thawing cycling) . Figure 18A shows average catalase loaded. Figure 18B shows catalase’s enzymatic activity.

[0075] Figure 19 shows the specific enzymatic activity of mitoCAT protein loaded in mitoEVCAT and wtCAT protein loaded in 313EVCAT. Figure 20 shows the ability of mitoEVCAT for scavenging H2O2.

[0076] Figure 21 shows the ability of mitoEVCAT for preventing UVB irradiation damage.

[0077] Figure 22 shows the relative mean fluorescence intensity of UVB irradiation cells pre-treatment with mitoEVCAT, which represent intracellular H2O2 level.

[0078] Figure 23 shows the red / green relative fluorescence ratio of UVB irradiation cells pre-treatment with mitoEVCAT, which reflects the health status of mitochondria within the cells.

[0079] Figure 24 shows the photos of the UV irradiation-rats treated by 313EVCAT, HA or RA.

[0080] Figure 25 shows the photos of the anti-wrinkle efficacy of 313EVCAT, HA or RA on UV irradiation-rats.

[0081] Figure 26 shows the wrinkle reduction rate of 313EVCAT, HA or RA on UV irradiation-rats.

[0082] Figure 27 shows the skin thickness of 313EVCAT, HA or RA treatment UV irradiation-rats.

[0083] Figure 28 shows Hematoxylin and eosin (H&E) staining and Masson's trichrome staining of 313EVCAT, HA or RA treatment UV irradiation-rats skin tissues.

[0084] Figure 29 shows collagen fiber area (%) of 313EVCAT, HA or RA treatment UV irradiation-rats skin tissues.

[0085] Figure 30 shows the expression of Collagen I mRNA of 313EVCAT, HA or RA treatment UV irradiation-rats.

[0086] Figure 31 shows dihydroethidium (DHE) staining fluorescence result of 313EVCAT, HA or RA treatment UV irradiation-rats.

[0087] Figure 32 shows the mean fluorescence intensity of dihydroethidium (DHE) staining in Figure 31.

[0088] Figure 33 shows immunofluorescence sections result about CD86 and CD206 of 313EVCAT, HA or RA treatment UV irradiation-rats.

[0089] Figure 34 shows the expression of IL-6 mRNA in 313EVCAT, HA or RA treatment UV irradiation-rats.

[0090] Figure 35 shows the expression of TNF-α mRNA in 313EVCAT, HA or RA treatment UV irradiation-rats.

[0091] Figure 36 shows the secreted of IL‐1β in 313EVCAT, HA or RA treatment UV irradiation-rats.

[0092] Figure 37 shows the secreted of IL‐6 in 313EVCAT, HA or RA treatment UV irradiation-rats.

[0093] Figure 38 shows the secreted of TNF-α in 313EVCAT, HA or RA treatment UV irradiation-rats.

[0094] *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001.Detailed Description

[0095] The present disclosure is explained in greater detail below. This description is not intended to be a detailed catalog of all the different ways in which the invention may be implemented or all the features that may be added to the instant invention. For example, features illustrated with respect to one embodiment may be incorporated into other embodiments, and features illustrated with respect to a particular embodiment may be deleted from that embodiment. In addition, numerous variations and additions to the various embodiments suggested herein will be apparent to those skilled in the art in light of the instant disclosure which do not depart from the instant invention. Hence, the following description is intended to illustrate some particular embodiments of the invention, and not to exhaustively specify all permutations, combinations and variations thereof.

[0096] Unless defined otherwise, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which the disclosure pertains. For those skilled in the art, it can vary according to the expected properties and effects sought through this disclosure, and each numerical parameter should be interpreted based on the number of significant digits and conventional rounding methods or in a way understood by those skilled in the art. Generally speaking, the nomenclature used in this article and the experimental procedures of organic chemistry, medicinal chemistry, and biology described in this article are well-known in the field and widely adopted in this field. Although any methods and materials similar or equivalent to those described herein may be used in the practice for testing of the present disclosure, the preferred materials and methods are described herein. In describing and claiming the present disclosure, the following terminology will be used.

[0097] Unless clearly indicated otherwise, the term “comprise” , “include” , “contain” , and their variations such as “comprising” , “comprises” as used herein should be understood to imply the inclusion of a stated element or step or a group of elements or steps, but not the exclusion of any other element or step or a group of elements or steps.

[0098] Unless clearly contraindicated in the context herein or indicated otherwise, the expression of “A and / or B” includes three situations: (1) A, (2) B, and (3) A and B; the expression of “A, B and / or C” includes seven situations: (1) A, (2) B, (3) C, (4) A and B, (5) A and C, (6) B and C, and (7) A, B and C. The meaning of similar expressions can be inferred in this manner.

[0099] As used herein, the term “reactive oxygen species (ROS) ” refers to the general term for peroxides that are related to oxygen metabolism, oxygen-containing free radicals, and easily form free radicals in living organisms. It plays an important role in cell signaling and homeostasis. However, during periods of environmental stress (such as UV or heat exposure) , ROS levels can sharply increase. This may cause serious damage to cellular structure, known as oxidative stress. One of the main sources of ROS in the body is the substrate end of the respiratory chain in the inner membrane of mitochondria.

[0100] As used herein, the term “wild-type” refers to the highest frequency phenotype observed in the wild population.

[0101] As used herein, the term “fusion protein” refers to a recombinant protein of two or more polypeptides. Fusion protein can be produced, for example, by a nucleic acid sequence encoding one polypeptide is joined to the nucleic acid encoding another polypeptide or a protein domain.

[0102] As used herein, the term “mitochondria-targeting” refers to a substance can be delivered to mitochondria specifically. The substance is selected from at least one of small molecule, polymer, nucleic acid, polypeptide, protein and enzyme.

[0103] As used herein, the term “vector” is a nucleic acid molecule, preferably self-replicating, which transfers and / or replicates an inserted nucleic acid molecule, such as a transgene or exogenous nucleic acid into and / or between host cells. It includes a plasmid or viral chromosome into whose genome a fragment of recombinant DNA is inserted and used to introduce recombinant DNA, or a transgene, into a polypeptide of the present disclosure.

[0104] As used herein, the term “extracellular vesicle (EV) ” shall be understood with the meaning commonly known in the art and refers to vesicles containing membrane-coated cytoplasmic portions that are released from cells in the microenvironment, including exosomes, microvesicles, and apoptotic bodies.

[0105] As used herein, the term “virus-like particle (VLP) ” refers to a large particle assembled from one or several structural proteins of viruses, without viral nucleic acid, cannot replicate autonomously, and has a similar overall structure to viral particles.

[0106] As used herein, the term “exosome” refers to small membrane vesicle (40-160nm) containing complex RNA, DNA, lipids, metabolites and proteins.

[0107] As used herein, the term “GPI” refers to glycosyl-phosphatidyl-inositol, the GPI group is added post-translationally at the C-terminus of the polypeptide. The GPI is a lipid moiety comprising a phosphoethanolamine linker, glycan core, and phospholipid tail. In some cases, the GPI group is covalently attached to a polypeptide as a post-translational modification marker to allow in lipid raft partitioning, signal transduction, cellular communication, or apical membrane targeting.

[0108] As used herein, "acceptable excipient" refers to those compounds, materials, compositions, and / or dosage forms which are, within the scope of sound medical judgment, suitable for use in contact with the tissues, organs, and / or bodily fluids of human beings and animals without excessive toxicity, irritation, allergic response, or other problems or complications commensurate with a reasonable benefit / risk ratio.

[0109] As used herein, a "pharmaceutically acceptable excipient" refers to, and includes, any and all solvents, dispersion media, coatings, antibacterial and antifungal agents, isotonic and absorption delaying agents, and the like that are physiologically compatible.

[0110] As used herein, the term “administration” refers to the administration of a composition to a subject or system to achieve delivery of a catalase that is, or is included in, the composition.

[0111] As used herein, the term "effective amount" is defined as an amount sufficient to achieve or at least partially achieve the desired effect. Amounts effective for this use will depend upon the severity of the disorder being treated and the general state of the patient’s own immune system.

[0112] As used herein, the term “Woodchuck Hepatitis virus (WHP) posttranscriptional regulatory element (WPRE) ” is a DNA sequence that, when transcribed creates a tertiary structure enhancing expression. Commonly used in molecular biology to increase expression of genes delivered by viral vectors. WPRE is a tripartite regulatory element with gamma, alpha, and beta components.

[0113] As used herein, the term “phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) ” is an irreversible non-specific inhibitor of serine proteases, papain and acetylcholinesterase.

[0114] As used herein, the term “peroxy orange-1 (PO-1) ” refers to a H2O2 specific fluorescent probe.

[0115] As used herein, the term “wtCAT” refers to a wild-type catalase (NCBI Reference Sequence: NP_001743.1) having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO. 1 and having the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO. 5.

[0116] As used herein, the term “mitoCAT” refers to a modified catalase which targeting to mitochondrial having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO. 2 and having the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO. 6.

[0117] As used herein, the term “313EVCAT” refers to an EV enriched with wtCAT, produced by HEK293 cells transfected with wtCAT sequence, alternate name is evCAT.

[0118] As used herein, the term “rhCAT” refers to a commercial recombinant catalase which expressed by E. coli, rhCAT (Abcam) having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO. 3, rhCAT (MCE) having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO. 4.

[0119] As used herein, the term “mitoEVCAT” refers to an EV enriched with mitoCAT, produced by HEK293 cells transfected with mitoCAT sequence.

[0120] As used herein, the term “mesenchymal stem cell (MSC) ” is a type of pluripotent stem cell that share all the commonalities of stem cells, namely self-renewal and multipotent differentiation ability.

[0121] As used herein, the term “MSCEV” refers to an EV derived from MSC.

[0122] Catalase or its variant

[0123] In the first aspect, the present disclosure provides a catalase or its variant, which at least has one of the bioactivities of scavenging reactive oxygen species (ROS) , mitigating oxidative stress, and / or ameliorating the visible signs and / or biomarkers of photoaging of the skin.

[0124] In some embodiments, the catalase or its variant is a wild-type catalase or a modified catalase, wherein the modified catalase is a wild-type catalase having one or more amino acid mutations, inserts, deletions and / or additions.

[0125] In some embodiments, the catalase or its variant is a wild-type catalase or a modified catalase, wherein the modified catalase is a wild-type catalase modified with chemical groups.

[0126] In some embodiments, the catalase or its variant is a wild-type catalase or a modified catalase, wherein the modified catalase is a fusion protein consisting of (a) a wild catalase or its variant, and (b) other functional protein or polypeptide with specific biological functions.

[0127] In some embodiments, wherein the functional proteins or polypeptide having tissue targeting activities.

[0128] In some embodiments, wherein the functional proteins or polypeptide having mitochondrial targeting activities.

[0129] In some embodiments, wherein the fusion protein is obtained based on the catalase deleting C-terminal amino acid residues “K-A-N-L” and adding N-terminal mitochondrial targeting sequence.

[0130] In some embodiments, the catalase or its variant is the catalase having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, or having at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 99.5%sequence identity to SEQ ID NO: 1.

[0131] In some embodiments, the catalase or its variant is the mitochondria-targeting catalase having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2, or having at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 99.5%sequence identity to SEQ ID NO: 2.

[0132] Nucleic acid sequence or vector

[0133] In the second aspect, the present disclosure provides a nucleic acid sequence, which encoding the catalase or its variant according to the first aspect of the present disclosure.

[0134] In the third aspect, the present disclosure provides a vector which comprising the nucleic acid sequence according to the second aspect of the present disclosure.

[0135] Delivery system

[0136] In the fourth aspect, the present disclosure provides a delivery system, which comprising:

[0137] (i) the catalase or its variant according to the first aspect of the present disclosure and / or

[0138] (ii) the nucleic acid sequence according to the second aspect of the present disclosure or vector according to the third aspect of the present disclosure,

[0139] (iii) a carrier, wherein the carrier having the function of delivering the catalase or its variant into the specific tissues or cells.

[0140] In some embodiments, the carrier is extracellular vesicle (EV) .

[0141] In some embodiments, the carrier is liposome.

[0142] In some embodiments, the carrier is virus-like particle (VLP) .

[0143] In some embodiments, the carrier is universal extracellular vesicle or modified extracellular vesicle.

[0144] In some embodiments, the extracellular vesicle is universal exosome or modified exosome.

[0145] In some embodiments, the extracellular vesicle is harvesting from the producer cell.

[0146] In some embodiments, the exosome is harvesting from the producer cell, and the exosome can be modified to enhance production, exposure duration, tissue specific targeting or endosome escaping.

[0147] In some embodiments, the exosome comprising:

[0148] (i) peptide and / or protein containing a GPI-anchoring signal sequence,

[0149] (ii) peptide / antibody fragment modification, and / or

[0150] (iii) other protein modification.

[0151] In some embodiments, the delivery system is isolated from the condition medium by ultra-centrifugation, or Tangential Flow Filtration (TFF) .

[0152] In some embodiments, the delivery system particle size and distribution are analyzed by nano flow cytometry (nFCM) or nanoparticle tracking analysis (NTA) instrument.

[0153] In some embodiments, the producer cell overexpressing at least one of the proteins or protein fragments selected from CD46, CD52, CD55, CD58 and CD59. In some embodiments, the producer cell overexpressing CD46. In some embodiments, the producer cell overexpressing CD59. In some embodiments, the producer cell overexpressing CD55.

[0154] In some embodiments, the producer cell is non-human mammalian cell line or human cell line. In some embodiments, the producer cell is HEK 293F cell line. In some embodiments, the producer cell is HEK 293T cell line. In some embodiments, the producer cell is stem cell line. In some embodiments, the producer cell is any combination of HEK 293F cell line, HEK 293T cell line, stem cell line.

[0155] In some embodiments, transfection method of the producer cell with expression vector system comprising liposome transfection, viral infection, lentiviral transfection, calcium phosphate, microporation and electroporation.

[0156] Composition

[0157] In the fifth aspect, the present disclosure provides a pharmaceutical composition, comprising:

[0158] (i) the catalase or its variant according to the first aspect of the present disclosure, or

[0159] (ii) the nucleic acid sequence according to the second aspect of the present disclosure or the vector according to the third aspect of the present disclosure, or

[0160] (iii) the delivery system according to the fourth aspect of the present disclosure, and

[0161] (iv) a pharmaceutically acceptable excipient.

[0162] In some embodiments, the pharmaceutical composition comprising the catalase or its variant and a pharmaceutically acceptable excipient.

[0163] In some embodiments, the pharmaceutical composition comprising the nucleic acid sequence or the vector and a pharmaceutically acceptable excipient.

[0164] In some embodiments, the pharmaceutical composition comprising the delivery system and a pharmaceutically acceptable excipient.

[0165] In the sixth aspect, the present disclosure provides a cosmetics composition, comprising:

[0166] (i) the catalase or its variant according to the first aspect of the present disclosure, or

[0167] (ii) the nucleic acid sequence according to the second aspect of the present disclosure or the vector according to the third aspect of the present disclosure, or

[0168] (iii) the delivery system according to the fourth aspect of the present disclosure, and

[0169] (iv) an acceptable excipient.

[0170] In some embodiments, the cosmetics composition comprising the catalase or its variant and an acceptable excipient. In some embodiments, the cosmetics composition comprising the nucleic acid sequence or the vector and an acceptable excipient. In some embodiments, the cosmetics composition comprising the delivery system and an acceptable excipient.

[0171] Manufacturing method and using method

[0172] In the seventh aspect, the present disclosure provides a manufacturing method of the delivery system according to the fourth aspect of the present disclosure, wherein the delivery system is formed by producer cell and secreted / released into the culture medium, which is then isolated and purified to obtain, the producer cell is transfected with the vector according to the third aspect of the present disclosure and produce the delivery system within the cell. In some embodiments, the delivery system is obtained from the producer cell directly. The manufacturing method of the delivery system in the present disclosure named “AesoBoost technology” .

[0173] In some embodiments, the producer cell is a HEK 293T cell, HEK 293F cell, or any HEK 293 derivative cell, or any combination thereof. In some embodiments, the producer cell is a mammalian cell. In some embodiments, the producer cell is a genetically engineered stable cell line. In some embodiments, the producer cell is a stable cell line obtained through monoclonal screening.

[0174] In the eighth aspect, the present disclosure provides a manufacturing method of the pharmaceutical composition according to the fifth aspect of the present disclosure, or the cosmetics composition according to the sixth aspect of the present disclosure, which use the catalase or its variant according to the first aspect of the present disclosure or the nucleic acid sequence according to the second aspect of the present disclosure or the vector according to the third aspect of the present disclosure or the delivery system according to the fourth aspect of the present disclosure.

[0175] In the ninth aspect, the present disclosure provides a method of using the pharmaceutical composition according to the fifth aspect of the present disclosure, or the cosmetics composition according to the sixth aspect of the present disclosure, which comprise administering an effective amount of the catalase or its variant according to the first aspect of the present disclosure or the nucleic acid sequence according to the second aspect of the present disclosure or the vector according to the third aspect of the present disclosure or the delivery system according to the fourth aspect of the present disclosure to a subject in need thereof.

[0176] In the tenth aspect, the present disclosure provides a use of the catalase or its variant according to the first aspect of the present disclosure or the nucleic acid sequence according to the second aspect of the present disclosure or the vector according to the third aspect of the present disclosure or the delivery system according to the fourth aspect of the present disclosure in the manufacturing of a pharmaceutical composition or a cosmetics composition for scavenging reactive oxygen species (ROS) , mitigating oxidative stress, and / or ameliorating the visible signs and / or biomarkers of photoaging of the skin.

[0177] In some embodiments, the pharmaceutical composition or cosmetic composition is for protecting mitochondrial structural stability and functional performance.

[0178] In some embodiments, the pharmaceutical composition or cosmetic composition is for improving photoaging skin conditions. In some embodiments, the improving photoaging skin condition comprising promoting skin cells proliferation. In some embodiments, wherein the skin cells are human dermal fibroblasts and / or human keratinocyte cells. In some embodiments, the improving photoaging skin condition comprising reducing ROS level. In some embodiments, the improving photoaging skin condition comprising enhancing collagen regeneration. In some embodiments, the improving photoaging skin condition comprising reducing wrinkles. In some embodiments, the improving photoaging skin condition comprising improving inflammation condition of photoaged skin. In some embodiments, the improving inflammation condition of photoaged skin comprising the reductions of IL-6 and / or TNF-α.

[0179] In some embodiments, the pharmaceutical composition or cosmetic composition is used for the treatment of photoaging of skin, natural aging of the skin, melasma, pigmentation and / or vitiligo.

[0180] The formation of melasma is related to various factors, including genetic predisposition, ultraviolet radiation, endocrine changes, and the side effects of certain drugs.

[0181] Skin pigmentation refers to the abnormal accumulation of melanin in the skin, forming punctate or patchy lesions that are different from normal skin color. Common causes include post inflammatory pigmentation, friction induced melanosis, cirrhosis, and other diseases.

[0182] Vitiligo is a disease caused by the destruction of melanocytes in the skin, leading to a lack of melanin and the formation of local white patches. Oxidative stress is considered an important factor in the pathogenesis of vitiligo, which may lead to damage and dysfunction of melanocytes.

[0183] In some embodiments, for the therapeutic method, the delivery system, the pharmaceutical composition or cosmetic composition in present disclosure may be administered through topical, subcutaneous, intravenous, intra-arterial, intranasal, or ocular administration.

[0184] In some embodiments, for the skin-related diseases or disorders, the administration methods may be subcutaneous, intradermal, microneedling or topical treatments.

[0185] In some embodiments, the delivery system, the pharmaceutical composition or cosmetic composition in present disclosure can be utilized independently or in conjunction with other clinically validated medical cosmetology treatments, including drugs, medical devices, and active ingredients. Notable examples include dermal fillers composed of hyaluronic acid, collagen, botulinum toxin, biostimulators (e.g. PLLA, PCL) , as well as technologies like Thermage, Ultherapy, radio-frequency microneedling, and lasers, creating a synergistic effect.

[0186] In some embodiments, the delivery system, the pharmaceutical composition or cosmetic composition in present disclosure may help alleviate inflammatory symptoms, such as redness and swelling induced by certain treatments, while also enhancing wound healing throughout the treatment process.

[0187] EXAMPLES

[0188] The following examples, both actual and prophetic, are provided in conjunction with the accompanying drawings for the purpose of illustrating specific embodiments or features of the present invention and are not intended to limit its scope.

[0189] The skilled in the art should recognize that various alterations and modifications can be made to the embodiments described herein without departing from the spirit and scope of the present disclosure. Description of well-known functions, structures and the like in the art are omitted from the following description for conciseness.

[0190] The experimental methods in the following embodiments, if not otherwise specified, are conventional methods, performed in accordance with the techniques or conditions described in the literature in the field or in accordance with the product protocols. The materials, reagents, and the like used in the following embodiments are commercially available, if not otherwise specified.

[0191] Example 1. Genetically engineering a producer cell to overexpress catalase

[0192] 1.1 Establishment of stable producer cell line

[0193] The producer cell is Expi293FTM cell (Thermo Fisher, A14527) transfected with a recombinant vector system. The vector (Addgene plasmid #17448) is used to construct the recombinant vector system. The recombinant vector system comprises a nucleic acid sequence encoding protein of interest (PoI) , more specifically, PoI is wild-type catalase (wtCAT, Figure 1A) having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO. 1 and having the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO. 5, or mitochondria-targeted catalase (mitoCAT, Figure 1B) having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO. 2 and having the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO. 6. The recombinant vector system is configured 5’ →3’as per the following: a constitutive cytomegalo-virus promoter, the nucleic acid sequence of wtCAT or mitoCAT, and the Woodchuck Hepatitis virus (WHP) posttranscriptional regulatory element (WPRE) which is used to enhance the expression level of the target gene. The recombinant vector system also contains puromycin and penicillin resistance genes for selection purposes. The construction of the recombinant vector is conducted using a combination of polymerase chain reaction amplification for individual fragment and subsequently seamless joining by enzyme. The exogenous construct can lead to overexpression of the wtCAT or mitoCAT and increased concentration of wtCAT or mitoCAT in the producer cell.

[0194] Transfection method of the producer cells with expression vector system is lentiviral transfection, via Three-Plasmid Lentiviral Packaging System (Y. Mao, et. al., Lentiviral Vectors Mediate Long-Term and High Efficiency Transgene Expression in HEK 293T cells [J] , International Journal of Medical Sciences, 2015, 12 (5) : 407-415. DOI: 10.7150 / ijms. 11270) . The transfection may result in a transient or stable transformation of the producer cells. Screen and select a stable cell line that can stably express EVs and wtCAT or mitoCAT from the transfected cell lines. The producer cell makes wtCAT or mitoCAT encapsulated in recombinant EVs. Monoclonal screening techniques are applied to stable cell lines to isolate monoclonal cell lines with enhanced stability and increased yield of EVs and wtCAT or mitoCAT.

[0195] 1.2 Production of EVs loaded with wtCAT or mitoCAT

[0196] 1.2.1 Cell culture

[0197] Expi293FTM Cells (Thermo Fisher, A14527) were cultured in DMEM medium (Thermo Fisher) containing 10%fetal bovine serum (Thermo Fisher) at 37 ℃ in humidified conditions equilibrated with 5%CO2. The cells were seeded at 4×105 cells / mL in serum-free medium containing 5%serum on a shaker at 120 rpm. The cells were incubated to reach maximum cell density of >85%cell viability. The cells were passaged through sequential splitting in culture medium with decreasing concentration of serum from 5%to 0%of serum in the medium.

[0198] 1.2.2 Isolation and purification of EVs

[0199] The EVs were isolated from the condition medium by Tangential Flow Filtration (TFF) . For TFF (Repligen, KMPi and KrosFlo KR2i) method, the cells of the disclosure comprising the EVs were filtered through a filter with suitable mesh or pore size with the range below 750 kDa.

[0200] The isolated and concentrated solution of EVs was subjected to purification. The common purification method of EVs is Size-Exclusion Chromatography (SEC, Cytiva, AKTA Pure 25 M1) .

[0201] Clean the hollow fiber filter (Repligen) using ultrapure water until the pH at the reflux end is neutral. Rinse the filter with PBS, followed by concentration diafiltration of the EVs solution, concentrating the sample to approximately 1 / 100 to 1 / 25 of its original volume.

[0202] Perform a second TFF on the concentrated solution, further concentrating it to approximately 1 / 20 to 1 / 5 for SEC purification.

[0203] Prepare the chromatography column (Cytiva, HiScale 16 / 40) by washing it sequentially with water and PBS until the conductivity and UV curves stabilize. Load the sample into the loading cup, initiate the run, and position centrifuge tubes in the collector to gather purified EVs. Filter and sterilize the purified sample, aliquot it. Collect samples for exosome safety assessments (sterility, mycoplasma, and bacterial endotoxin testing) and characterization analysis.

[0204] Example 2. Characterization and verification of EVs and wtCAT or mitoCAT loading

[0205] 2.1 Characterization of EVs

[0206] The EVs particle size and distribution were analyzed by nano flow cytometry (nFCM) instrument. The uniformity and size of the EVs were measured by transmission electron microscopy (TEM) .

[0207] The particle concentration of the purified EVs, as measured by Apogee Micro-GxP Nano Flow Cytometer, is 7.95×1011 particles / mL. Following treatment with 0.1%Triton, the particle concentration is 8.63×1010 particles / mL. The analysis indicates that the EV percentage in the sample is 89.15%. The particle size distribution is illustrated in the Figure 2.

[0208] The purified EVs sample was further diluted to 0.1 μg / μL. An equal volume of 4%paraformaldehyde to the sample was added and incubated for 2 hours. 3μL of the mixture was added into the TEM grid, which was washed by 1X PBS and fixed with 1%glutaraldehyde. After PBS and ddH2O wash, the grid was stained on ice. EVs were examined in a JEOL 1200EX transmission electron microscope at 100 kV. The Figure 3 shows that the EV sample appear in a typical cup shape.

[0209] The Figure 4 shows the result of Western Blot analysis for positive markers of the purified EVs. ALIX, TSG101 and CD9 are positive markers that should be present in EVs and CYC1 is negative marker that should not be present in EVs.

[0210] Therefore, when considering the results shown in the above (nFCM, TEM and WB) , it can be seen that the particles in the sample satisfying the characteristics of extracellular vesicles and exosomes.

[0211] 2.2 Measurement of wtCAT or mitoCAT loading

[0212] The successful loading of the wtCAT or mitoCAT into EVs, loading efficiency, and whether the loaded wtCAT or mitoCAT retains its enzymatic activity were evaluated using ELISA and enzyme activity assays.

[0213] Detected by human catalase ELISA kit (Abcam, ab277396) and microplate reader (BioTek) , for EVs at concentrations of particles / mL and particles / mL, the loading amounts of the wtCAT or mitoCAT were 204.7 copies / EV and 87.0 copies / EV respectively (Table 1) .

[0214] Table 1 The loading amounts of the wtCAT or mitoCAT in EV

[0215] Enzymatic activity of wtCAT encapsulated in EVs was measured by Amplex Red Catalase Assay Kit (Thermo Fisher, A22180) . 313EVCAT is EV loading wtCAT, alternate name is evCAT. For the concentration of 1×107 particles / mL 313EVCAT, enzymatic activity was over 800,000 U / mg. According to the average loading of wtCAT in each EV measured by ELISA, can calculate the concentration of wtCAT. Recombinant catalase (rhCAT, Abcam, ab286037) (2ng / mL) and recombinant catalase (rhCAT, MCE, HY-P7744) (2ng / mL) were also measured by Amplex Red Catalase Assay Kit (Thermo Fisher, A22180) . Compared to recombinant catalase (rhCAT, Abcam, ab286037) , the enzymatic activity of catalase encapsulated in 313EVCAT was nearly 7.7 times higher (Figure 5) , the enzymatic activity of recombinant catalase (rhCAT, MCE, HY-P7744) is 683.6 mU / ng, the enzymatic activity of recombinant catalase (rhCAT, Abcam, ab286037) is 106.3 mU / ng, the enzymatic activity of wtCAT loaded in 313EVCAT is 817.6 mU / ng.

[0216] According to the results of loading capacity and enzymatic activity of 313EVCAT and mitoEVCAT, calculated specific enzymatic activity. The specific enzymatic activity of mitoCAT protein loaded in mitoEVCAT is about twice that of wtCAT protein loaded in 313EVCAT, as shown in Figure 19. The modified mitoCAT protein has stronger specific enzymatic activity.

[0217] 2.3 EV protection from proteolytic degradation

[0218] Catalase has a short half-life due to rapid proteolytic degradation in the extracellular space. EVs could protect PoIs from protease and enhance its stability and prolong its effective half-life.

[0219] In this study, rhCAT (Abcam) and 313EVCAT were separately treated with 5μL 50μg / mL Proteinase K (Pro K, a serine protease, Thermo Fisher) at 50 ℃ for 90 minutes. Cool down to 4 ℃ and added phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) . After lysing the membranes of 313EVCAT solution, centrifuge them and extract the supernatant. Enzymatic activity (Ample Red Hydrogen Peroxide Assay Kit, Thermo Fisher, A22180) was measured to evaluate the ability of EVs to protect catalase from protease degradation.

[0220] The results showed that, compared to the untreated control group (PBS) respectively, the enzymatic activity of rhCAT (Abcam) dropped significantly to 33.03%. In contrast, 313EVCAT retained 83.05%of its activity, preserving the majority of enzymatic functionality (Figure 6) .

[0221] Example 3. In vitro evaluation on photoaging and inflammation model

[0222] 3.1 Measurement of cytotoxity

[0223] In order to evaluate the cytotoxicity of the EVs, human skin fibroblast HFF-1 cells (ATCC, SCRC-1041TM) were treated with 1×109 particles / mL (measured by nFCM) naked EVs without protein of interest, 1×109 and 1×1010 particles / mL of the purified 313EVCAT and mitoEVCAT, then the cell viability was examined.

[0224] HFF-1 cells were cultured in DMEM with 10%fetal bovine serum at 37 ℃ in humidified conditions equilibrated with 5%CO2. After 24 hours, the medium was removed, and the cells were treated with various concentrations of the EVs prepared. Then, the viability of the cells was evaluated when the cells were cultured for 24 and 48 hours. The cell viability was measured using CCK-8 reagent (Beyotime, C0039) .

[0225] The cells in control group were cultured in the same medium without the EVs. It was confirmed that the naked EVs, 313EVCAT and mitoEVCAT of the present invention showed no cytotoxicity in the concentration range used in the test (Figure 7) .

[0226] 3.2 Evaluation of effect of ameliorating oxidative stress cell proliferation

[0227] Hydrogen peroxide and hydroxyl radical are major reactive oxygen species that cause oxidative stress and damage inside and outside cells. Thus, 313EVCAT’s and mitoEVCAT’s effect of ameliorating hydrogen peroxide induced oxidative stress was evaluated.

[0228] HFF-1 cells were cultured in DMEM with 10%fetal bovine serum at 37 ℃ in humidified conditions equilibrated with 5%CO2. The cells were incubated with 1×1010 particles / mL of the purified 313EVCAT or mitoEVCAT for 24 hours. After incubation, the EVs were removed and the cells were treated by 150μM hydrogen peroxide for 6 hours. When H2O2 treatment finished, the cells were replaced with EV-free medium and cultured for 24 and 48 hours. The cell viability was measured using CCK-8 reagent (Beyotime, C0039) . The results demonstrate that pre-treating with 1×1010 particles / mL of 313EVCAT or mitoEVCAT for 24 hours effectively protects HFF-1 cells from hydrogen peroxide induced oxidative damage, highlighting the efficacy of 313EVCAT (Figure 8) or mitoEVCAT (Figure 20) in oxidative stress models. “NC” refers to negative control.

[0229] As shown in Figure 8, compared to NC, the 24h cell viability of pre-treating with 313EVCAT is 0.9685, while the control is 0.5678; the 48h cell viability of pre-treating with 313EVCAT is 0.9725, while the control is 0.6536.

[0230] As shown in Figure 20, compared to NC, the 24h cell viability of pre-treating with mitoEVCAT is 0.3614, while the control is 0.0350; the 48h cell viability of pre-treating with mitoEVCAT is 0.4229, while the control is 0.0279.

[0231] Currently mesenchymal stem cell (MSC) -derived exosomes have been widely used for both research and commercial purposes. MSC-derived exosomes have antioxidant capacity, including but not limited to superoxide dismutase (SOD) 1-3, glutathione peroxidase (GPX) and catalase. MSC-derived exosomes can relieve cellular oxidative stress damage (Y. Yan, et al., HucMSC exosome-derived GPX1 is required for the recovery of hepatic oxidant injury [J] , Mol. Ther., 2017, 25: 465-479) and exert local anti-inflammatory effects (U. Pivorait, et al., Exosomes from human dental pulp stem cells suppress carrageenan-induced acute inflammation in mice [J] , Inflammation, 2015, 38 (5) : 1933-1941) . MSC-derived exosomes stimulated cardiomyocyte H9C2 cell proliferation, inhibited apoptosis induced by H2O2, inhibited cardiac fibrosis and inflammation (L. Shao, et al., MiRNA-sequence indicates that mesenchymal stem cells and exosomes have similar mechanism to enhance cardiac repair [J / OL] , Biomed. Res. Int., 2017, 2017: 4150705) .

[0232] The cells were treated by different concentration of hydrogen peroxide for 6 hours. The experimental results demonstrated that 313EVCAT presents superior effect on ameliorating oxidative stress versus MSC-derived exosomes (MSCEV) (Echo Biotech) (Figure 9, Table 2) . Table 2 The cell viability of pre-treating 313EVCAT or MSCEV

[0233] 3.3 Evaluation of effect of ameliorating UVB irradiated cell proliferation, ROS scavenging, maintenance of mitochondrial structure and collagen production

[0234] HFF-1 cells were cultured in DMEM with 10%fetal bovine serum at 37 ℃ in humidified conditions equilibrated with 5%CO2. The cells were incubated with 1×1010 particles / mL of the purified 313EVCAT or mitoEVCAT for 24 hours. Then EVs were removed from the medium and the cells were irradiated by 150 mJ / cm2 UVB. The cells were replaced with EV-free medium and cultured for 24 and 48 hours. The cell viability was measured using CCK-8 reagent (Beyotime, C0039) .

[0235] The results present that 313EVCAT (Figure 10) or mitoEVCAT (Figure 21) can ameliorate cell viability and prevent from UVB irradiation damage.

[0236] As shown in Figure 10, compared to NC, the 24h cell viability of pre-treating with 313EVCAT is 0.6121, while the control is 0.5106; the 48h cell viability of pre-treating with 313EVCAT is 0.8938, while the control is 0.6218.

[0237] As shown in Figure 21, compared to NC, the 24h cell viability of pre-treating with mitoEVCAT is 0.6860, while the control is 0.4718; the 48h cell viability of pre-treating with mitoEVCAT is 0.5212, while the control is 0.3359.

[0238] UV irradiation primarily causes cellular damage by generating reactive oxygen species. Hydrogen peroxide could be able to transport both intracellularly and extracellularly through diffusion. 313EVCAT’s effect of ROS scavenging extracellularly and intracellularly was evaluated.

[0239] The cells were incubated with 1×1010 particles / mL of the purified 313EVCAT for 24 hours. Then EVs were removed from the medium and the cells were irradiated by 300 mJ / cm2 UVB. Measure extracellular hydrogen peroxide level by the Ample Red Hydrogen Peroxide Assay Kit (Thermo Fisher, A22188) (Figure 11) , shows nearly half of H2O2 have been scavenged compared to control. The cells were incubated with 1×1010 particles / mL of the purified 313EVCAT or mitoEVCAT for 24 hours. Then EVs were removed from the medium and the cells were irradiated by 150 mJ / cm2 UVB. Measure intracellular hydrogen peroxide level by peroxy orange-1 (PO-1) reagent (Macklin Biochemical, P991796) 4h or 24h after irradiation. The results present that 313EVCAT (Figure 12) or mitoEVCAT (Figure 22) could consistently and stably reduced UVB-induced excess extracellular and intracellular hydrogen peroxide.

[0240] As shown in Figure 12, compared to NC, 4h after irradiation, the relative mean fluorescence intensity of pre-treating with 313EVCAT is 0.9985, while the control is 1.2281, 24h after irradiation, the relative mean fluorescence intensity of pre-treating with 313EVCAT is 1.0121, while the control is 1.2376, means control has more hydrogen peroxide.

[0241] As shown in Figure 22, compared to NC, 24h after irradiation, the relative mean fluorescence intensity of pre-treating with mitoEVCAT is 1.0610, while the control is 1.2357, means control has more hydrogen peroxide.

[0242] Under ultraviolet radiation, high-intensity energy tends to act directly on mitochondria, damaging their structure and thereby accelerating human aging. One hallmark of mitochondrial damage is the collapse of mitochondrial membrane potential. Healthy mitochondria typically exhibit a higher membrane potential, whereas damaged mitochondria generally show a lower membrane potential. When using the JC-1 reagent for detection, a high membrane potential is usually indicated by red fluorescence, while a low membrane potential is indicated by green fluorescence. The ratio of red to green fluorescence can accurately reflect the health status of mitochondria within the cells.

[0243] The cells were incubated with 1×1010 particles / mL of the purified mitoEVCAT for 24 hours. Then EVs were removed from the medium and the cells were irradiated by 300 mJ / cm2 UVB. Measure mitochondrial membrane potential by JC-1 reagent (Beyotime, C2003S) . The results present that mitoEVCAT (Figure 23) could effectively resist the damage of high-intensity UVB to cellular mitochondria, protect mitochondrial structural stability and functional performance.

[0244] As shown in Figure 23, compared to NC, the relative fluorescence (red / green ratio) of pre-treating with mitoEVCAT is 5.5312, while the control is 3.4748, means the mitochondrial structures in the group of pre-treatment are more intact. The cells were incubated with 1×1010 particles / mL of the purified 313EVCAT for 24 hours. Then EVs were removed from the medium and the cells were irradiated by 300 mJ / cm2 UVB. With additional 24h or 48h cultivation, supernatant was collected for ELISA test, and the cells were harvested for qPCR analysis. The ELISA (MultiSciences, EK1C01) (Figure 13) and qPCR (Roche, LC480) (Figure 14) analysis demonstrate that 313EVCAT can improve cell regeneration capability and reproduce collagen protein.

[0245] As shown in Figure 13, compared to NC, the 24h pro-col 1a1 concentration of pre-treating with 313EVCAT is 0.4129, while the control is 0.2563; the 48h pro-col 1a1 concentration of pre-treating with 313EVCAT is 0.5099, while the control is 0.2833.

[0246] As shown in Figure 14, compared to NC, the 24h relative Col 1a1 mRNA expression of pre-treating with 313EVCAT is 0.7716, while the control is 0.5799; the 48h relative Col 1a1 mRNA expression of pre-treating with 313EVCAT is 0.6833, while the control is 0.4673.

[0247] 3.4 Evaluation of effect of decreasing inflammatory cytokine

[0248] Mouse macrophage Raw264.7 cells (Procell, CL-0190) were cultured in DMEM with 10%fetal bovine serum. The cells were seeded into a 12-well plate at a density of 6×104 cells / well. The cells were treated with 1×109 particles / mL (measured by nFCM) and 1×1010 particles / mL of the purified 313EVCAT, and cultured at 37 ℃ in humidified conditions equilibrated with 5%CO2 for 24 hours. Then the EVs were removed through rinsing with PBS.

[0249] Raw264.7 cells were treated with a combination of 100 ng / mL lipopolysaccharide (LPS) and 20 ng / mL interferon-gamma (IFN-γ) for 24 hours. Then the culture medium was collected, and inflammatory cytokine IL-6 was measured by ELISA reagent (MultiSciences, EK206) , inflammatory cytokine TNF-α was measured by ELISA reagent (MultiSciences, EK282) .

[0250] The results showed a significant increase in the secretion of cytokines IL-6 (Figure 15) and TNF-α (Figure 16) in the control group, with 6.7-fold (IL-6) and 13.7-fold (TNF-α) higher than the negative control (NC) group. However, incubation with 313EVCAT effectively reduced the secretion of inflammatory cytokines. Compared to control group, the M1 313EVCAT group exhibited reductions in IL-6 and TNF-α secretion to approximately 16%and 13%, respectively.

[0251] Comparison 1: EVs loaded with SOD1 or SOD2

[0252] Besides catalase, there are other important enzymes in the reactive oxygen species (ROS) scavenging pathway, such as SOD1 and SOD2. Established a recombinant vector, PoI is SOD1 (the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO. 7 and the nucleic acid sequence is shown in SEQ ID NO. 9) or SOD2 (the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO. 8 and the nucleic acid sequence is shown in SEQ ID NO. 10) , and adopted the lentiviral transfection method obtained producer cells containing recombinant vector; cultured producer cells, then isolated and purificated of EVs (refer to Example 1) , test the expressing SOD1 or SOD2, and test the efficacy of loading SOD1 or SOD2 into EVs. The expressing of catalase and the efficacy of loading catalase into EVs in Example 1 were also tested. Naked cell refer to the cell (Expi293FTM cell) does not contain recombinant vector, naked EV is the exosome secreted by naked cell.

[0253] Western Blot was used to detect POIs in intracellular and EVs. After using Triton-100 to break the cell and EV membranes, total protein was collected and detected by BCA method. Each sample was subjected to electrophoresis with the same protein content and detected by corresponding antibody, followed by analysis using grayscale values.

[0254] The results showed in Table 3, Figure 17A and Figure 17B, although the expression levels of SOD1 or SOD2 in cells increased significantly, these two enzymes were hardly packaged into exosomes. In Figure 17C, the expression levels of catalase in cells increased significantly as well as in exosomes. Thus, this indicates that loading catalase using the delivery system in the present disclosure is highly efficient and advantageous, and using the same method to load different proteins such as SOD1 and SOD2 may result in significant differences in outcomes due to different proteins exhibit variations in their expression levels, modifications, and localizations within cells.

[0255] Table 3 The protein expression of SOD1, SOD2, and CAT

[0256] Comparison 2: Exogenously loading catalase

[0257] Exogenous loading generally entails incorporating target proteins into naked extracellular vesicles (naked EV) using physical, chemical, or biological methods. In the present application, employed two methods: electroporation and freeze-thawing cycling (refer to US20220409535A1) , to test the efficacy of exogenously incorporating catalase (rhCAT, MCE, HY-P7744) into naked EV.

[0258] Average catalase loaded and catalase activity of 313EVCAT (produced by the delivery system in the present disclosure) and exogenously incorporating catalase (electroporation and freeze-thawing cycling) were measured refer to Example 2.2.

[0259] As shown in Figure 18A and Figure 18B, results demonstrated that 313EVCAT produced by the delivery system in the present disclosure was far superior to electroporation and freeze-thawing, both in catalase loading capacity and enzymatic activity. The average catalase loaded of 313EVCAT is 171.0723  / particle, while electroporation method is 1.3788  / particle, freeze-thawing cycling method is 1.6048  / particle. The enzymatic activity of 313EVCAT is 430.7895 mU / 1E7 particles, while electroporation method is 89.7872 mU / 1E7 particles, freeze-thawing cycling method is 121.3596 mU / 1E7 particles.

[0260] This indicates that the endogenous incorporation of catalase offers highly significant advantages, and the manufacturing method of the delivery system in the present disclosure named “AesoBoost technology” is suitable for large-scale and efficient production of highly active EVs loading with catalase.

[0261] It will be readily apparent to those skilled in the art that other suitable modifications and adaptations of the present disclosure described herein are obvious and may be made using suitable equivalents without departing from the scope of the disclosure or the embodiments disclosed herein.

[0262] Example 4. In vivo evaluation on photoaging model

[0263] 4.1 Animal models of photoaging

[0264] The female SD rats (6 weeks old, with an average weight of approximately 150 g) were purchased from Liaoning Changsheng Biotechnology Co. The rats were acclimated for one week in the SPF-grade animal facility at the College of Life Sciences, Jilin University, under controlled conditions of 25℃, with free access to water and food to adapt to the environment. The dorsal hair of SD rats was removed. All rats except the control group (n=4) were exposed to UV irradiation to simulate photoaged skin conditions. The total doses of UVA and UVB were set at 14.07 J / cm2 and 11.66 J / cm2 respectively, with the UV lamp positioned 30 cm away. Rats received UV irradiation once daily for 7 weeks. EV-treated groups (313EVCAT and naked EV) and hyaluronic acid (HA) -treated group were delivered via intradermal injection, and 0.5%retinoic acid (RA) was topically applied to the dorsal skin (RA-treated group) . During the experimental period, photographs were taken and the condition of the dorsal skin of each rat was documented regularly. At the end of the experiment, the rats were euthanized by cervical dislocation. Blood samples were collected from the orbital sinus of each rat, and the dorsal skin was excised and collected for subsequent analysis.

[0265] 4.2 Evaluation of effect of attenuating UV-induced dermal wrinkles

[0266] The photographs of the dorsal skin of the rats were imported into the image analysis software (Image Pro Plus) , and wrinkle detection was performed using the software. The collected wrinkle data were subjected to statistical analysis to assess the construction of the photoaging model and the effects of treatment on wrinkle quantity.

[0267] Following successful model establishment, treatments were administered on days 1, 5, 8, 15, 22, and 28. Rats were photographed and weighed at each time point (Figure 24) . At the end of the study, dorsal skin samples were collected for histological analysis and skin replica casting. Beginning on day 22, the high-dose (1×1010 particles / mL) 313EVCAT group exhibited a significantly greater reduction in wrinkle formation compared to the naked EV and hyaluronic acid (HA) groups, with further improvement noted by day 28. These findings indicate that intradermal administration of 313EVCAT effectively improves skin condition and reduces photoaging-induced wrinkle (Figure 26, Table 4) . Skin replicas obtained on day 28 confirmed the superior anti-wrinkle efficacy of 313EVCATs relative to the UV, naked EVs, HA, and retinoic acid (RA) control groups (Figure 25) . Remarkably, high-dose (1×1010 particles / mL) 313EVCAT-treatment over 28 days markedly reduced dermal thickening, with therapeutic outcomes surpassing those of the RA group (Figure 27, Table 5) , underscoring the potent anti-photoaging effect of 313EVCATs.

[0268] Table 4 Wrinkle reduction rate (%of Day 0)

[0269] Table 5 Skin thickness (mm)

[0270] 4.3 Evaluation of effects of 313EVCAT on pathological features and collagen content

[0271] To evaluate the histopathological impact of 313EVCAT-treatment on photoaged skin, H&E staining was performed on dorsal skin samples from SD rats. The SD rats were euthanized by cervical dislocation, and the dorsal skin tissues were excised using surgical scissors. Excess fat tissues were removed, and the skin samples were placed in centrifuge tubes containing 4%paraformaldehyde solution for fixation for 24 h. The fixed skin tissues were then removed from the tubes and embedded to prepare paraffin sections. Hematoxylin and eosin (H&E) staining was performed, and the stained sections were examined under an optical microscope to observe the structure of each skin layer, as well as the presence of collagen and inflammatory cell infiltration within the skin. Paraffin sections were prepared and stained with Masson's trichrome staining. The morphology and distribution of collagen fibers, as well as the collagen content, were examined under an optical microscope. The collagen content in the tissues was quantitatively assessed using ImageJ software.

[0272] In the UV-irradiated control group, marked epidermal erosion, necrosis, and extensive inflammatory cell infiltration were observed, consistent with characteristic features of photoaging and photodamage. In contrast, 313EVCAT (1×1010 particles / mL) -treatment significantly attenuated these pathological changes, reducing epidermal injury and inflammation while restoring dermal collagen fiber structure and density (Figure 28) . To assess collagen deposition, skin samples collected on day 28 post-treatment were subjected to Masson’s trichrome staining, followed by quantitatively analysis for collagen content. Compared to HA and RA treatments, 313EVCATs administration led to a pronounced increase in collagen synthesis and remodeling, reflecting its superior capacity to promote tissue repair and matrix regeneration (Figure 28) . Immunohistochemical analysis was performed to assess the collagen content in skin sections. The 313EVCAT-treatment group exhibited significantly improved regeneration of Col 1a1 compared to the untreated group, with skin and collagen structure showing better therapeutic effects than those observed with hyaluronic acid (HA) and retinoic acid (RA) treatments (Figure 29, Table 6) . Moreover, RT-qPCR analysis (Bio-Rad T100) revealed a 4.38-fold increase in Col 1a1 mRNA expression in the high-dose (1×1010 particles / mL) 313EVCAT-treated group compared to controls, confirming enhanced collagen synthesis (Figure 30, Table 6) .

[0273] Table 6 Collagen fiber area (%) and the expression of Collagen I mRNA

[0274] Tissue sections were immersed in the dihydroethidium (DHE) working solution, ensuring that the dye uniformly covered the sections. The sections were then incubated in the dark for a period of time to allow DHE to penetrate the cells and be oxidized by ROS. After incubation, the sections were washed with PBS or another appropriate buffer to remove unbound DHE dye.

[0275] In ROS detection, the sections were observed under a fluorescence microscope with appropriate excitation and emission wavelengths set to detect the fluorescence signal generated by oxidized DHE. The intensity and distribution of the fluorescence signal within the cells were observed and recorded, with the fluorescence intensity being proportional to the level of ROS. The fluorescence signal was quantitatively analyzed using ImageJ software to assess the intracellular ROS levels. The antioxidant properties of 313EVCATs were investigated by dihydroethidium (DHE) staining to quantify ROS levels in skin tissues (Figure 31) . Fluorescence imaging and quantitative analysis revealed a significant reduction in ROS accumulation in the 313EVCAT-treated groups, with the high-dose group (313EVCAT (1×1010 particles / mL) ) demonstrating more potent ROS scavenging activity than the low-dose group (313EVCAT (1×109 particles / mL) ) , indicating a dose-dependent antioxidant effect (Figure 32, Table 7) .

[0276] Table 7 Fluorescence imaging quantitative analysis

[0277] 4.4 Evaluation of effect of 313EVCAT on anti-inflammatory

[0278] To investigate the anti-inflammatory effects of 313EVCATs, immunofluorescence was used to examine the levels of CD206 (Anti-CD206 is purchased from PROTEINTECH, 18704-1-AP) and CD86 (Anti-CD86 is purchased from Thermo Fisher, RAB02398) in skin sections. In the 313EVCAT-treated group, the immunofluorescence sections showed a substantial expression of green fluorescence for CD206, while the expression of CD86 was significantly reduced compared to the untreated group. The green fluorescence of CD206 in the 313EVCAT-treated group was significantly increased compared to other treatment groups, while CD86 showed the opposite trend. This indicates that 313EVCAT-treatment has the effect of transforming pro-inflammatory M1 macrophages into anti-inflammatory M2 macrophages. The results indicated that the low-dose (1×109 particles / mL) 313EVCAT-treated group also exhibited significant therapeutic effects. 313EVCAT-treated group demonstrated superior therapeutic effects in reversing macrophage phenotypes compared to the commonly used drugs HA and RA (Figure 33) .

[0279] In addition, to investigate the therapeutic efficacy of 313EVCATs in vivo, their impact on anti-inflammatory responses was systematically analyzed in a UV-induced photoaging rat model. RT‐qPCR analysis (Bio-Rad T100) demonstrated that 313EVCAT-treatment significantly downregulated mRNA expression of proinflammatory cytokines IL‐6 (Figure 34) , and TNF‐α (Figure 35) compared to the control group. Notably, even low-dose (1×109 particles / mL) 313EVCAT-treatment led to substantial reductions in inflammatory gene expression. In the high-dose (1×1010 particles / mL) group, IL-6 mRNA levels were comparable to those in the NC group, suggesting effective suppression of UV-induced inflammation. Consistent with the mRNA findings, ELISA results showed a significant dose-dependent reduction in IL‐1β (Figure 36) , IL‐6 (Figure 37) , and TNF‐α (Figure 38) protein levels in serum of 313EVCAT-treated rats. IL-1β was measured by ELISA reagent (Elabscience, E-EL-R0012) , IL-6 was measured by ELISA reagent (Elabscience, E-EL-R0015) , TNF-α was measured by ELISA reagent (Elabscience, E-EL-R2856) .

[0280] Table 8 Evaluation of effect of 313EVCAT on anti-inflammatory

[0281] These results and Table 8 indicate that 313EVCATs exert robust anti-inflammatory effects, attenuating the elevated cytokine levels associated with UV-induced photoaging.

[0282] All of the articles and methods disclosed and claimed herein can be made and executed without undue experimentation in light of the present disclosure. While the articles and methods of this disclosure have been described in terms of preferred embodiments, it will be apparent to those of skill in the art that variations may be applied to the articles and methods without departing from the spirit and scope of the disclosure. All such variations and equivalents apparent to those skilled in the art, whether now existing or later developed, are deemed to be within the spirit and scope of the disclosure as defined by the appended claims. All patents, patent applications, and publications mentioned in the specification are indicative of the levels of those of ordinary skill in the art to which the disclosure pertains. All patents, patent applications, and publications are herein incorporated by reference in their entirety for all purposes and to the same extent as if each individual publication was specifically and individually indicated to be incorporated by reference in its entirety for any and all purposes. The disclosure illustratively described herein suitably may be practiced in the absence of any element (s) not specifically disclosed herein. Thus, it should be understood that although the present disclosure has been specifically disclosed by preferred embodiments and optional features, modification and variation of the concepts herein disclosed may be resorted to by those skilled in the art, and that such modifications and variations are considered to be within the scope of this invention as defined by the appended claims.

Claims

A catalase or its variant, which at least has one of the bioactivities of scavenging reactive oxygen species (ROS) , mitigating oxidative stress, and / or ameliorating the visible signs and / or biomarkers of photoaging of the skin.The catalase or its variant according to claim 1, which is a wild-type catalase or a modified catalase, wherein the modified catalase is selected from at least one of the following groups:(i) a wild-type catalase having one or more amino acid mutations, inserts, deletions and / or additions,(ii) a wild-type catalase modified with chemical groups, or(iii) a fusion protein consisting of (a) a wild catalase or its variant, and (b) other functional protein or polypeptide with specific biological functions, preferably wherein said functional proteins or polypeptide having tissue targeting activities, further preferably, said functional proteins or polypeptide having mitochondrial targeting activities, most preferably, said fusion protein is obtained based on the catalase deleting C-terminal amino acid residues “K-A-N-L” and adding N-terminal mitochondrial targeting sequence.The catalase or its variant according to claim 1 or 2, which is selected from at least one of the following groups:(i) the catalase having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, or having at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 99.5%sequence identity to SEQ ID NO: 1;(ii) the mitochondria-targeting catalase having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:2, or having at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 99.5%sequence identity to SEQ ID NO: 2.A nucleic acid sequence, which encoding the catalase or its variant according to claim 1 or 2.A vector which comprising the nucleic acid sequence according to claim 4.A delivery system, which comprising:(i) the catalase or its variant according to any one of claims 1-3 and / or(ii) the nucleic acid sequence according to claim 4 or vector according to claim 5,(iii) a carrier, wherein said carrier having the function of delivering the catalase or its variant into the specific tissues or cells.The delivery system according to claim 6, wherein the carrier is selected from at least one of liposome, extracellular vesicle (EV) and virus-like particle (VLP) .The delivery system according to claim 6, wherein the carrier is selected from at least one of universal extracellular vesicle or modified extracellular vesicle, preferably the extracellular vesicle is universal exosome or modified exosome.The delivery system according to claim 8, wherein the extracellular vesicle is harvesting from the producer cell, preferably the extracellular vesicle is exosome, and said exosome can be modified to enhance production, exposure duration, tissue specific targeting or endosome escaping, more preferably the exosome comprising:(i) peptide and / or protein containing a GPI-anchoring signal sequence,(ii) peptide / antibody fragment modification, and / or(iii) other protein modification.The delivery system according to claim 9, wherein the producer cell overexpressing at least one of the proteins or protein fragments selected from CD46, CD52, CD55, CD58 and CD59.The delivery system according to claim 9, wherein the producer cell is non-human mammalian cell line or human cell line.The delivery system according to claim 9, wherein the producer cell is selected from HEK 293F cell line, HEK 293T cell line, stem cell line or any combination thereof.A pharmaceutical composition, comprising:(i) the catalase or its variant according to any one of claims 1-3, or(ii) the nucleic acid sequence according to claim 4 or the vector according to claim 5, or(iii) the delivery system according to any one of claims 6-12, and(iv) a pharmaceutically acceptable excipient.A cosmetics composition, comprising:(i) the catalase or its variant according to any one of claims 1-3, or(ii) the nucleic acid sequence according to claim 4 or the vector according to claim 5, or(iii) the delivery system according to any one of claims 6-12, and(iv) an acceptable excipient.A manufacturing method of the delivery system according to any one of claims 6-12, wherein said delivery system is formed by producer cell and secreted / released into the culture medium, which is then isolated and purified to obtain, said producer cell is transfected with the vector according to claim 5 and produce said delivery system within the cell.The manufacturing method according to claim 15, wherein said producer cell is selected from HEK 293F cell line, HEK 293T cell line, stem cell line or any combination thereof.A manufacturing method of the pharmaceutical composition according to claim 13, or the cosmetics composition according to claim 14, which use the catalase or its variant according to any one of claims 1-3 or the nucleic acid sequence according to claim 4 or the vector according to claim 5 or the delivery system according to any one of claims 6-12.A method of using the pharmaceutical composition according to claim 13, or the cosmetics composition according to claim 14, which comprise administering an effective amount of the catalase or its variant according to any one of claims 1-3 or the nucleic acid sequence according to claim 4 or the vector according to claim 5 or the delivery system according to any one of claims 6-12 to a subject in need thereof.A use of the catalase or its variant according to any one of claims 1-3 or the nucleic acid sequence according to claim 4 or the vector according to claim 5 or the delivery system according to any one of claims 6-12 in the manufacturing of a pharmaceutical composition or a cosmetics composition for scavenging reactive oxygen species (ROS) , mitigating oxidative stress, and / or ameliorating the visible signs and / or biomarkers of photoaging of the skin.The use according to claim 19, the pharmaceutical composition or cosmetic composition is for improving photoaging skin conditions.The use according to claim 20, wherein the improving photoaging skin condition comprising:(i) promoting skin cells proliferation, preferably wherein the skin cells are human dermal fibroblasts and / or human keratinocyte cells;(ii) reducing ROS level;(iii) enhancing collagen regeneration;(iv) reducing wrinkles, and / or(v) improving inflammation condition of photoaged skin.The use according to claim 19, wherein the pharmaceutical composition or cosmetic composition is used for the treatment of photoaging of skin, natural aging of the skin, melasma, pigmentation and / or vitiligo.

Images