E3 ubiquitin ligases binders and applications thereof in protacs

Abstract

Disclosed herein are compounds of E3 ubiquitin ligase binders. In an aspect is provided a proteolysis targeting chimera (PROTAC) comprising 1) a protein of interest binder (POIB), 2) an E3 ubiquitin ligase binder (ELB), and 3) a chemical linker connecting the POIB and the ELB. Also provided are pharmaceutical compositions comprising the E3 ubiquitin ligase binders or PROTAC, and applications of the E3 ubiquitin ligase binders or PROTAC for decreasing thermal stability of the proteins of interest and for degrading the proteins of interest.

Description

E3 UBIQUITIN LIGASES BINDERS AND APPLICATIONS THEREOF IN PROTACSTechnical Field

[0001] This disclosure relates to novel E3 ubiquitin ligase binders, PROTACs based on the E3 ubiquitin ligases binders, pharmaceutical compositions comprising them, and their applications for decreasing thermal stability of proteins of interest and for degrading the proteins of interest.Background Art

[0002] Recently proteolysis targeting chimeras (PROTACs) strategy has attracted great attentions because of its promise in the discovery of an entirely new therapeutic modality for the treatment of human diseases. The remarkable work by Crews group and Bradner group showing that PROTAC molecules induce protein of interest (POI) degradation by the ubiquitin–proteasome system. A PROTAC molecule is a hetero bifunction small molecule that generates covalent linking of a POI binding ligand and an E3 ubiquitin ligase recruiting ligand with an optimal linker. Once the POI–PROTAC–E3 ubiquitin ligase complex is formed, E2 ubiquitin-conjugating enzymes transfer ubiquitin (Ub) to POI. After that, POI ubiquitination happens and the recognition of polyubiquitylation signal by the proteasome facilitates the degradation of POI.

[0003] Compared with traditional occupancy-based inhibitors, PROTACs regulate protein function by degrading target proteins instead of inhibiting them. Strikingly, the degradation induced by PROTACs is a catalytic process, which allows PROTACs action at very low does for efficacy. Based on these properties, PROTACs show lower dose, less side effects, more sensitivity to drug-resistant targets, better selectivity compared to classic inhibitors, and greater chance to modulate ‘undruggable’ targets. Many PROTACs that showed in vivo efficacy have been reported, and they could degrade various oncogenes, including ALK, AR, ER, BCL-ABL, and BKT. Among them, ARV-766 and ARV-471 targeting AR and ER have been advanced to Phase III / II clinical trial. ARV-766 is an oral AR-targeting PROTAC with high potency against both wild-type and mutants for the treatment of prostate cancer, and ARV-471 is an oral estrogen receptor (ER) PROTAC degrader for breast cancer. The initiated clinical trials of PROTAC drugs targeting AR and ER will be highly informative regarding the potential clinical feasibility of this novel strategy.

[0004] The concept of PROTAC was raised by Crews in early 2001 but developed rapidly in recent years with the discovery of E3 ubiquitin ligase ligands. It is worth noting that the great majority of PROTACs recruit the specific E3 ubiquitin ligases CRBN or VHL to degrade proteins. There are more than 600 E3 ubiquitin ligases encoded by human genome, and only very few E3 ubiquitin ligases (CRBN, VHL, cIAPs, and MDM2) have been exploited in PROTACs with most E3 ubiquitin ligases remain untapped for PROTAC in part due to the lack of ligands. However, some tissues and cells don’t express these two widely studied E3 ubiquitin ligases (CRBN and VHL) , thus limiting the applications of PROTACs. What’s worse, CRBN mutations or deletions were observed in some cancers, which would greatly affect the efficacy of PROTACs hijacking E3 ubiquitin ligase CRBN.

[0005] There exists an ongoing need for discovery of PROTACs employing novel ligands for other E3 ubiquitin ligases, showing great targeted protein degradation ability. The present disclosure is intended to address this need.Summary of the invention

[0006] The present disclosure provides a compound that serves as an E3 ubiquitin ligase binder (ELB) , wherein the E3 ubiquitin ligase is human RNF113A or human RNF114. Provided is an E3 ubiquitin ligase binder of formula (I) :

[0007] wherein:

[0008] x is an integer selected from 0, 1, 2, 3, and 4,

[0009] R is independently selected from the group consisting of -H, -NO2, -CN, -F, -Cl, -Br, -I, -N3, -ORa, -SRa, -N (Ra) 2, -NHRa, -C (O) Ra, -C (O) ORa, -C (O) NHRa, -C (O) N (Ra) 2, -OC (O) Ra, -OC (O) NHRa, -OC (O) N (Ra) 2, -NHC (O) Ra, -NHC (O) NHRa, -NHC (O) N (Ra) 2, substituted or unsubstituted alkyl, substituted or unsubstituted heteroalkyl, substituted or unsubstituted aryl, substituted or unsubstituted heteroaryl, substituted or unsubstituted cycloalkyl, and substituted or unsubstituted heterocycloalkyl, wherein Ra is selected from the group consisting of hydrogen, substituted or unsubstituted alkyl, substituted or unsubstituted heteroalkyl, substituted or unsubstituted aryl, substituted or unsubstituted heteroaryl, substituted or unsubstituted cycloalkyl, and substituted or unsubstituted heterocycloalkyl;

[0010] R1 and R2 are independently selected from the group consisting of - (CH2) bRb, -C (O) CH2Rb, -C (O) CH=CHRb, -C (O) CH=C (Rb) 2, and -C (O) CCRb, wherein b is an integer selected from 0-10; Rb is selected from the group consisting of -H, -NO2, -CN, -F, -Cl, -Br, -I, -N3, -ORc, -SRc, -N (Rc) 2, -NHRc, -C (O) Rc, -C (O) ORc, -C (O) NHRc, -C (O) N (Rc) 2, -OC (O) Rc, -OC (O) NHRc, -OC (O) N (Rc) 2, -NHC (O) Rc, -NHC (O) NHRc, -NHC (O) N (Rc) 2, substituted or unsubstituted alkyl, substituted or unsubstituted heteroalkyl, substituted or unsubstituted aryl, substituted or unsubstituted heteroaryl, substituted or unsubstituted cycloalkyl, and substituted or unsubstituted heterocycloalkyl, wherein the substituted alkyl is preferably -CY3, -CHY2, or -CH2Y, Y being selected from the group consisting of -F, -Cl, -Br, and -I; Rc is selected from the group consisting of hydrogen, substituted or unsubstituted alkyl, substituted or unsubstituted heteroalkyl, substituted or unsubstituted aryl, substituted or unsubstituted heteroaryl, substituted or unsubstituted cycloalkyl, and substituted or unsubstituted heterocycloalkyl;

[0011] a is an integer selected from 0-10;

[0012] R3 is selected from the group consisting of -H, -ORd, -SRd, -N (Rd) 2, -NHRd, -OC (O) Rd, -OC (O) NHRd, -OC (O) N (Rd) 2, -NHC (O) Rd, -NHC (O) NHRd, -NHC (O) N (Rd) 2, substituted or unsubstituted alkyl, substituted or unsubstituted heteroalkyl, substituted or unsubstituted aryl, substituted or unsubstituted heteroaryl, substituted or unsubstituted cycloalkyl, and substituted or unsubstituted heterocycloalkyl, wherein Rd is selected from the group consisting of hydrogen, substituted or unsubstituted alkyl, substituted or unsubstituted heteroalkyl, substituted or unsubstituted aryl, substituted or unsubstituted heteroaryl, substituted or unsubstituted cycloalkyl, and substituted or unsubstituted heterocycloalkyl.

[0013] In a preferable embodiment, x is 0.

[0014] In a preferable embodiment, R is alkyl, haloalkyl or hydrogen.

[0015] In a preferable embodiment, R is C1-6 alkyl, C1-6 haloalkyl or hydrogen. More preferably, R is C1-4 alkyl, C1-4 haloalkyl or hydrogen.

[0016] In a preferable embodiment, a is 1.

[0017] In a preferable embodiment, R1 and R2 are independently selected from the group consisting of haloalkyl, alkyl, cyanoalkyl, and alkenyl

[0018] In a preferable embodiment, R1 and R2 are independently selected from the group consisting of C1-6 haloalkyl, C1-6 alkyl, C1-6 cyanoalkyl, and C1-6 alkenylcarbonyl. More preferably, R1 and R2 are independently selected from the group consisting of C1-4 haloalkyl, C1-4 alkyl, C1-4 cyanoalkyl, and C1-4 alkenylcarbonyl.

[0019] In a preferable embodiment, R1 and R2 are independently selected from the group consisting of -CH2CH2Cl, -CH2CH2CH3, -CH2CH2F, -CH2CH2CF3, -CH2CH2CN, -CH2CH2CH2Cl, and -C (O) CH=CH2.

[0020] In a preferable embodiment, when one of R1 and R2 is alkyl, the other is not alkyl.

[0021] In a preferable embodiment, R3 is selected from the group consisting of -OH, alkoxy, alkylamino, (alkynyl) alkylamino, and alkynl (diazo) alkylamino.

[0022] In a preferable embodiment, R3 is selected from the group consisting of -OH, C1-6 alkoxy, C1-6 alkylamino, C1-6 (alkynyl) alkylamino, and ethynyl (diazo) C2-6alkylamino. More preferably, R3 is selected from the group consisting of -OH, C1-4 alkoxy, C1-4 alkylamino, (C1-4 alkynyl) methyleneamino, and

[0023] In a preferable embodiment, R3 is selected from -OH, -OEt, -NHPrn,

[0024] In a preferable embodiment, chlorambucil is excluded from the E3 ubiquitin ligase binder of formula (I) .

[0025] In a preferable embodiment, the E3 ubiquitin ligases is any one of HECT (homologous to E6AP C terminus) family or RING-finger family, and preferably is RNF114 or RNF113A.

[0026] In a preferable embodiment, the E3 ubiquitin ligases binder is selected from the structures shown in table 1 below.

[0027] TABLE 1

[0028] In an aspect, provided is use of the compound of formula (I) or a stereoisomer or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an E3 ubiquitin ligase binder (ELB) ,

[0029] wherein R, R1, R2, R3, x and a are as defined as above.

[0030] In an aspect, provided is a proteolysis targeting chimera (PROTAC) of formula (Ⅱ) , or a stereoisomer or a pharmaceutically acceptable salt thereof, wherein the PROTAC comprising 1) a protein of interest binder (POIB) , 2) an E3 ubiquitin ligase binder (ELB) , and 3) a chemical linker L connecting the POIB and the ELB,

[0031] wherein:

[0032] R, R1, R2, x, and a are as defined in the formula (I) .

[0033] In a preferable embodiment, L is selected from the group consisting of a bond, -NH (CH2) nCH2-, -NH (CH2) nO-, -NH (CH2) nNH-, -NH (CH2) nC (O) -, -NH (CH2CH2O) nCH2CH2-, -NH (CH2CH2O) nCH2CH2O-, -NH (CH2CH2O) nCH2CH2NH-, -NH (CH2CH2O) nCH2CH2C (O) -, -NH (CH2) nNH (CH2) m CH2-, -NH (CH2) nNH (CH2) mO-, NH (CH2) nNH (CH2) mNH-, -NH (CH2) nNH (CH2) mC (O) , -NH (CH2CH2O) nNH (CH2) mCH2CH2-, -NH (CH2CH2O) nNH (CH2) mCH2CH2O-, -NH (CH2CH2O) nNH (CH2) mCH2CH2NH-, -NH (CH2CH2O) nNH (CH2) mCH2CH2C (O) -, -NH (CH2) nNHC (O) (CH2) mCH2-, -NH (CH2) nNHC (O) (CH2) mO-, -NH (CH2) nNHC (O) (CH2) mNH-, NH (CH2) nC (O) -, NH (CH2CH2O) nNHC (O) (CH2) mCH2-, -NH (CH2CH2O) nNHC (O) (CH2) mO-, -NH (CH2CH2O) nNHC (O) (CH2) m2NH-, -NH (CH2CH2O) nNHC (O) (CH2) mC (O) -, and RL1RL2, wherein RL1 and RL2 are each independently selected from the group consisting of substituted or unsubstituted alkyl, substituted or unsubstituted heteroalkyl, substituted or unsubstituted aryl, substituted or unsubstituted heteroaryl, substituted or unsubstituted cycloalkyl, and substituted or unsubstituted heterocycloalkyl,

[0034] In a preferable embodiment, the POIB is selected from disease related protein binders, and the disease related protein binders include: AKT1, AKT3, ALK, AR, AR-V7, AURKA, BCL2, BCL-xL, BCR-ABL, BRAF, BRD2, BRD4, BRD9, BTK, CDK2, CDK4, CDK6, CDK9, CSK, CYP1B1, DAPK1, EGFR, EML4-ALK, EPHA1, ER, ERK1, ERK5, FGFR2, FLT1, FLT3, GPX4, GSK3A, GSPT1, HDAC1, HDAC6, IDO1, IRAK1, IRAK4, ITK, JAK1, JAK3, KRAS, LDHA, LRRK2, MAP3K1, MAP4K1, MAPK8, MARK2, MEK1, MYC, NEK1, NEK3, NSD2, p38alpha, PARP1, PI3Kalpha, PI3Kbeta, PIM1, PLK1, PYK2, RIPK1, RPS6KA1, SGK3, SHP2, SIK2, SIRT2, SMARCA2, SMARCA4, SOS1, STAT3, STAT6, STING, STK10, Tau, TESK2, TRKA, TRKC, ULK1, and VEGFR-2.

[0035] In a preferable embodiment, x is 0.

[0036] In a preferable embodiment, R is alkyl, haloalkyl or hydrogen.

[0037] In a preferable embodiment, R is C1-6 alkyl, C1-6 haloalkyl or hydrogen. More preferably, R is C1-4 alkyl, C1-4 haloalkyl or hydrogen.

[0038] In a preferable embodiment, R is halomethyl or hydrogen.

[0039] In a preferable embodiment, a is 1.

[0040] In a preferable embodiment, R1 and R2 are independently selected from the group consisting of haloalkyl, alkyl, cyanoalkyl, and alkenylcarbonyl.

[0041] In a preferable embodiment, R1 and R2 are independently selected from the group consisting of C1-6 haloalkyl, C1-6 alkyl, C1-6 cyanoalkyl, and C1-6 alkenylcarbonyl. More preferably, R1 and R2 are independently selected from the group consisting of C1-4 haloalkyl, C1-4 alkyl, C1-4 cyanoalkyl, and C1-4 alkenylcarbonyl.

[0042] In a preferable embodiment, R1 and R2 are independently haloalkyl or alkyl. Preferably, haloalkyl is C1-6 haloalkyl, more preferably, C1-4 haloalkyl. Preferably, alkyl is C1-6 alkyl, more preferably, C1-4 alkyl. Preferably, the halogen in the haloalkyl is chlorine or fluorine.

[0043] In a preferable embodiment, R1 and R2 are independently -CH2CH2Cl or -CH2CH2CH3. In a preferable embodiment, L is selected from the following structures:

[0044] In a preferable embodiment, the POIB is selected from the following structures:

[0045] In a preferable embodiment, the E3 ubiquitin ligase is any one of HECT (homologous to E6AP C terminus) family or RING-finger family, and preferably is RNF114 or RNF113A.

[0046] In a preferable embodiment, the PROTAC is selected from the structures shown in table 2 below.

[0047] TABLE 2

[0048] In some embodiments, the structure of such PROTACs can be depicted as:

[0049] ELB-L-POIB (Ⅱ)

[0050] wherein ELB is a E3 ubiquitin ligase binder, POIB is a protein of interest binder (or a binder of the protein of interest) , e.g., a BRD4 binder (BB) , and L is a linker moiety which links the ELB and POIB.

[0051] In another aspect, there are provided compositions which function to recruit E3 ubiquitin ligase for targeted protein ubiquitination and degradation.

[0052] In another aspect, there are provided a pharmaceutical composition comprising the E3 ubiquitin ligase binder of formula (I) , or a stereoisomer or a pharmaceutically acceptable salt thereof, or PROTAC of formula (Ⅱ) , or a stereoisomer or a pharmaceutically acceptable salt thereof, and a pharmaceutically acceptable excipient.

[0053] In another aspect, provided is a method for degrading thermal stability of protein of interest, comprising administering the E3 ubiquitin ligase binder of formula (I) , or a stereoisomer or a pharmaceutically acceptable salt thereof as described herein, or PROTAC of formula (Ⅱ) , or a stereoisomer or a pharmaceutically acceptable salt thereof as described herein, or the pharmaceutical composition as described herein.

[0054] In some embodiments, the E3 ubiquitin ligase is RNF113A or RNF114.

[0055] In another aspect, provided is a method for degrading the cellular protein level, comprising administering the E3 ubiquitin ligase binder of formula (I) , or a stereoisomer or a pharmaceutically acceptable salt thereof as described herein, or PROTAC of formula (Ⅱ) , or a stereoisomer or a pharmaceutically acceptable salt thereof as described herein, or the pharmaceutical composition as described herein.

[0056] In some embodiments, provided is a compound (E3 ubiquitin ligase binder) as described herein, or a stereoisomer, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, for use in degrading proteins of interest.

[0057] In some embodiments, the compounds (E3 ubiquitin ligase binder) as described herein may be used to effectuate the degradation of proteins of interest.

[0058] In some embodiments, the cellular protein is disease related protein, preferably BRD4, BTK, AR, or CDK6, and more preferably, BRD4 or BTK.

[0059] In some embodiments, the method for degrading the cellular protein level comprises a PROTAC process to degrade cellular protein through ubiquitin proteosome system, preferably the method comprises the steps as follows:

[0060] 1) allowing the PROTAC to induce interaction between E3 ubiquitin ligase and cellular protein to generate E3 ubiquitin ligase -PROTAC-cellular protein ternary complex;

[0061] 2) attaching a ubiquitin tag to the cellular protein;

[0062] 3) a proteosome recognizing the ubiquitinated cellular protein and forming a ubiquitinated cellular protein-proteosome complex; and

[0063] 4) carrying out proteolysis of the cellular protein by the proteosome.

[0064] In another aspect, the description provides methods for evaluating the effects of the degradation of proteins of interest in a biological system using compounds according to the present disclosure.Brief Description of the Drawings

[0065] [Corrected under Rule 26, 11.04.2025]Figures 1A-1F. Discovery of chlorambucil as the binder of E3 ubiquitin ligase RNF113A. A) Chemical structures of chlorambucil and its derivatives I-1 and I-3. B) WB-CETSA analysis showed that chlorambucil decreased the thermal stability of RNF113A at different heating temperatures in HEK293T cell lysates. C) WB-CETSA analysis showed chlorambucil decreased the thermal stability of RNF113A in a dose-dependent manner in HEK293T cell lysates. D) WB-CETSA analysis showed that chlorambucil could decrease the thermal stability of RNF113A in a dose-dependent manner. E) WB-CETSA analysis showed that chlorambucil derivatives I-1 could decreased the thermal stability of RNF113A at different heating temperatures in HEK293T cell lysates as chlorambucil did. F) WB-CETSA analysis showed that chlorambucil derivatives I-3 couldn’ t affect the thermal stability of RNF113A at different heating temperatures in HEK293T cell lysates. The symbol “+” in the figures 1B, 1C, 1E and 1F means corresponding substances are added in the experiments, and the symbol “-” in these figures means corresponding substances are not added in the experiments.

[0066] Figures 2A-2F. BRD4 protein degradation by RNF113A-based PROTAC I-12. A) Chemical structures of BRD4-PRTOAC I-12 and its corresponding negative control I-22. B) Western-blot showed that I-12 could induce BRD4 degradation in a dose-dependent manner in HEK293T cells. C) Western-blot showed that I-12 could induce BRD4 degradation in a time dependent manner in HEK293T cells. D) BRD4 degradation by I-12 could be inhibited by proteasome inhibitor MG132 and NEDD8 inhibitor MLN4924 in HEK293T cells. E) Negative control I-22 without RNF113A binding moiety lost the BRD4 degradation ability in HEK293T cells. F) BRD4 degradation induced by I-12 could be rescued in RNF113A knockdown HEK293T cells. The symbol “+” in the figures 2D and 2F means corresponding substances are added in the experiments, and the symbol “-” in these figures means corresponding substances are not added in the experiments.

[0067] Figures 3A-3C. BTK protein degradation by RNF113A-based PROTAC I-27. A) Chemical structures of BTK-PRTOAC I-27. B) Western-blot showed that I-27 could induce BTK degradation in a dose-dependent manner in Jeko-1 cells. C) Western-blot showed that I-27 could induce BTK degradation in a time dependent manner in Jeko-1 cells.DETAILED DESCRIPTION

[0068] Terms

[0069] In the present invention, unless otherwise specified, the terms used have the general meanings known to those skilled in the art.

[0070] Ubiquitin is a class of small molecule proteins of which the primary function is to tag proteins for degradation so that they can be recognized and degraded by a proteasome. E3 ubiquitin ligases are key enzymes in the ubiquitination process and are responsible for recognizing specific target proteins and transferring the ubiquitin from the E2 ligases to the target proteins. The specificity of the E3 ubiquitin ligases determines which proteins are subjected to ubiquitination. E3 ubiquitin ligase binders (ELB) , also known as E3 ubiquitin ligase ligands, are a class of small molecule compounds or biomolecules that bind specifically to E3 ubiquitin ligases.

[0071] Proteolysis Targeting Chimeras (PROTACs) refers to a technology for degradation of POI, which selectively degrade POI by utilizing the intracellular Ubiquitin-Proteasome System (UPS) . The core of this technology is the formation of a chimera by linking a ligand that specifically binds the POI (i.e. protein of interest binder, POIB) to a ligand that recruits the E3 ubiquitin ligases (i.e. ELB) . When the chimera binds to the target protein, the E3 ubiquitin ligases are recruited to the vicinity of the POI, thereby promoting ubiquitination-modification of the POI and eventual degradation by the proteasome.

[0072] Western Blot Cellular Thermal Shift Assay (WB-CETSA) is a technique that combines the Cellular Thermal Shift Assay (CETSA) and the Western Blot assay to study drug interactions with target proteins in cells. CETSA is based on the change in the thermal stability of proteins upon binding of a drug. When a drug binds to a target protein, the thermal stability of the protein changes, making it more difficult or easier to denature and precipitate at high temperature. WB-CETSA detects changes in the thermal stability of specific target proteins by Western Blot to validate drug-target protein interactions.

[0073] The term “alkyl” used herein refers to a branched or straight chain saturated aliphatic hydrocarbon group. In one embodiment, the alkyl contains from 1 to about 12 (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12) carbon atoms, more generally from l to about 6 carbon atoms or from l to about 4 carbon atoms. In one embodiment, the alkyl contains from 1 to about 8 carbon atoms. In certain embodiments, the alkyl is C1-C2, C1-C3, or C1-C6. The specified ranges as used herein indicate an alkyl group having each member of the range described as an independent species. For example, the term C1-C6 alkyl as used herein indicates a straight or branched alkyl group having from 1, 2, 3, 4, 5, or 6 carbon atoms and is intended to mean that each of these is described as an independent species. Examples of alkyl include, but are not limited to, methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, isobutyl, sec-butyl, t-butyl, n-pentyl, isopentyl, tert-pentyl, neopentyl, n-hexyl, 2-methylpentyl, 3-methylpentyl, 2, 2-dimethylbutyl and 2, 3-dimethylbutyl. In one embodiment, the alkyl group is optionally substituted as described herein.

[0074] The term used herein, “alkenyl” refers to a branched or straight chain aliphatic hydrocarbon group having one or more carbon-carbon double bonds that may occur at a stable point along the chain. Nonlimiting examples are C2-C6 alkenyl (such as C2, C3, C4, C5, C6) and C2-C4 alkenyl. The specified ranges as used herein indicate an alkenyl group having each member of the range described as an independent species, as described herein for the alkyl moiety. Examples of alkenyl include, but are not limited to, ethenyl, propenyl, butadienyl (including 1, 2-butadienyl and 1, 3-butadienyl) . In one embodiment, the alkenyl group is optionally substituted as described herein.

[0075] The term “heteroalkyl” used herein refers to a group in which a heteroatom (e.g. O, N and S) is introduced into the alkyl structure, and heteroalkyl may have a straight or branched chain structure, typically comprising from 1 to 20 carbon atoms. The heteroalkyl may be, but not limited to, CH3OCH2-, CH3OCH2CH2-, CH3OCH2CH2CH2-, CH3OCH2CH2CH2CH2-, CH3CH2OCH2-, CH3CH2OCH2CH2-, CH3CH2OCH2CH2CH2-, CH3CH2OCH2CH2CH2CH2-, CH3CH2CH2OCH2CH2-, CH3CH2CH2CH2OCH2-, CH3CH2CH2CH2OCH2CH2-, N (CH3) 2CH2CH2-, and CH3CH2SCH2CH2-, CH3NHCH2CH2-.

[0076] The term “cycloalkyl” used herein includes, but not limited to, cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl, and the like.

[0077] The term “heterocycloalkyl” used herein refers to a group formed by introducing one or more heteroatoms (e.g., oxygen, nitrogen, sulfur, etc. ) into the structure of a cycloalkyl, and these heteroatoms take the place of some of the carbon atoms and form the core structure of the heterocyclic ring. The heterocycloalkyl may be, but not limited to, tetrahydrofuranyl, pyrrolidinyl, thiazolidinyl, oxazolidinyl, imidazolidinyl, piperidinyl, morpholinyl, piperazinyl, thiomorpholinyl, and pyranyl.

[0078] The term “aryl” used herein refers to a group formed by removing a hydrogen atom from an aromatic hydrocarbon molecule. The aryl may be, but not limited to, phenyl, tolyl, aminophenyl, hydroxyphenyl, naphthyl, anthryl, and phenanthryl.

[0079] The term “heteroaryl” used herein refers to an aryl group that contains one or more heteroatoms (e.g., nitrogen, oxygen, sulfur, etc. ) in its aromatic ring structure. The heteroaryl may be, but not limited to, pyrrolyl, furyl, thienyl, imidazolyl, oxazolyl, thiazolyl, pyridyl, pyrimidinyl, indolyl, pyrrolopyridyl, benzofuranyl, benzothienyl and quinolinyl.

[0080] In some embodiments, the substituents in the substituted groups (such as substituted alkyl, substituted heteroalkyl, and substituted aryl) , include but not limited to alkyl, halogen (such as, F, Cl, Br, I) , hydroxyl, alkoxy, amino, aminoalkyl, alkylamino, alkynylalkyl, and diazo.

[0081] The ELB of formula (I) and the PROTAC) of formula (Ⅱ) can form acid addition salts thereof. It will be appreciated that for use in medicine the salts of the compounds of formula (I) or (II) should be pharmaceutically acceptable. Suitable pharmaceutically acceptable salts will be apparent to those skilled in the art. Examples of the acid for forming the pharmaceutically acceptable salts include, but not limited to, inorganic acids, such as hydrochloric, hydrobromic, sulfuric, nitric or phosphoric acid; and organic acids, such as, succinic, maleic, formic, acetic, trifluoroacetic, propionic, fumaric, citric, tartaric, benzoic, p-toluenesulfonic, methanesulfonic or naphthalenesulfonic acid. Certain of the compounds of formula (I) or (II) may form acid addition salts with one or more equivalents of the acid. The present disclosure includes within its scope all possible stoichiometric and non-stoichiometric forms.

[0082] In some embodiments, the POIB is a disease related protein binder, and the disease includes but not limited to, psoriasis; cancer, such as, colorectal cancer, cervical cancer, breast cancer, gastric cancer, esophageal cancer, small cell lung cancer, and hepatocellular carcinoma; autoimmune diseases, such as systemic lupus erythematosus (SLE) and Crohn's disease; male infertility; cataracts; and x-linked hairy sulfur dystrophy syndrome.

[0083] RNF114 (RING finger protein 114) is an E3 ubiquitin ligase associated with the onset and progression of several diseases including: psoriasis, cancer (e.g., colorectal cancer, cervical cancer, breast cancer, gastric cancer) , autoimmune diseases (e.g., systemic lupus erythematosus (SLE) and Crohn's disease) , male infertility, and cataracts. RNF114 may also be associated with neurodegenerative and inflammatory diseases.

[0084] RNF113A (RING finger protein 113A) is an E3 ubiquitin ligase associated with the onset and progression of several diseases including: cervical cancer, esophageal cancer, hepatocellular carcinoma, x-linked hairy sulfur dystrophy syndrome, and small cell lung cancer. RNF113A may also be involved in the regulation of proliferation, differentiation, and survival of neural stem cells and affect neurodevelopmental defects.

[0085] Examples

[0086] Synthetic Examples S1-S37

[0087] Compounds disclosed herein can be synthesized according to preparing methods described herein from the commercially available materials. The following examples and preparation procedure described below should not be considered as limiting the scope of the present disclosure.

[0088] The structures of the compounds in the present disclosure were confirmed by 1H NMR. The reaction process can be detected by TLC or HPLC. All the compounds or intermediates in the synthetic steps were purified by column chromatography unless otherwise specified. The elution systems in the purification stage were petroleum ether / ethyl acetate or dichloromethane / methanol unless otherwise specified.

[0089] Example S1: Synthesis of 4- (4- (bis (2-chloroethyl) amino) phenyl) -N-propylbutanamide (Compound I-1)

[0090] Step 1: Synthesis of 4- (4- (bis (2-chloroethyl) amino) phenyl) -N-propylbutan amide (Compound I-1) . To a solution of chlorambucil (91 mg, 0.3 mmol) in DCM (5 mL) was added propylamine (32 μL, 0.39 mmol) , HOBt (53 mg, 0.39 mmol) , EDCI (92 mg, 0.48 mmol) , and DIPEA (157 μL, 0.9 mmol) under argon atmosphere. The reaction mixture was stirred at room temperature for 24 h. After that, the reaction was quenched with Sat. NaCl solution (5 mL) and extracted with DCM (15 mL × 2) . The combined organic layers were dried over Na2SO4, the solution was concentrated in vacuo and purified by flash chromatography (silica gel, 20%～30%EtOAc in petrol ether) to afford the desired product I-1 (101 mg, 98%) .

[0091] 1H NMR (600 MHz CDCl3) : δ 7.07 (d, J = 8.4 Hz, 2H) , 6.62 (d, J = 9.0 Hz, 2H) , 5.37 (s, 1H) , 3.70 (t, J = 7.2 Hz, 4H) , 3.62 (t, J = 7.2 Hz, 4H) , 3.21 (q, J = 7.2 Hz, 2H) , 2.56 (t, J = 7.2 Hz, 2H) , 2.16 (t, J = 7.2 Hz, 2H) , 1.92 (qui, J = 7.2 Hz, 2H) , 1.51 (m, 2H) , 0.92 (t, J = 7.2 Hz, 3H) .

[0092] Example S2: Synthesis of ethyl 4- (4- (bis (2-chloroethyl) amino) phenyl) butanoate (Compound I-2)

[0093] Step 1: Synthesis of ethyl 4- (4- (bis (2-chloroethyl) amino) phenyl) butanoate (Compound I-2) . To a solution of chlorambucil (91 mg, 0.3 mmol) in DCM (2.5 mL) was added EtOH (ethanol, 21 μL, 0.36 mmol) , DCC (75 mg, 0.36 mmol) , and DMAP (3.7 mg, 0.03 mmol) under argon atmosphere. The reaction mixture was stirred at room temperature for 24 h. After that, removing the solid through filtration, and washing the solid with DCM (15 mL) . The filtrate was washed with Sat. NaCl solution (5 mL) . The organic layer was collected and dried over Na2SO4, the solution was concentrated in vacuo and purified by flash chromatography (silica gel, 5%EtOAc in petrol ether) to afford the desired product I-2 (100 mg, Quant. ) . 1H NMR (600 MHz CDCl3) : δ 7.07 (d, J = 8.4 Hz, 2H) , 6.62 (d, J = 8.4 Hz, 2H) , 4.12 (q, J = 7.2 Hz, 2H) , 3.70 (t, J = 7.2 Hz, 4H) , 3.62 (t, J = 7.2 Hz, 4H) , 2.56 (t, J = 7.8 Hz, 2H) , 2.31 (t, J = 7.2 Hz, 2H) , 1.92 (qui, J = 7.2 Hz, 2H) , 1.25 (t, J = 7.2 Hz, 3H) .

[0094] Example S3: Synthesis of 4- (4- (dipropylamino) phenyl) butanoic acid (Compound I-3)

[0095] Step 1: Synthesis of methyl 4- (4- (dipropylamino) phenyl) butanoate (Compound 4) . To a solution of Compound 2 (193 mg, 1 mmol) in anhydrous DMF (5 mL) was added 1-bromopropane 3 (308 mg, 2.5 mmol) , and K2CO3 (414 mg, 3 mmol) under argon atmosphere. The reaction mixture was stirred at 120 ℃ for 12 h. After that, the reaction was quenched with Sat. NaCl solution (10 mL) and extracted with EtOAc (20 mL × 2) . The combined organic layers were dried over Na2SO4, the solution was concentrated in vacuo and purified by flash chromatography (silica gel, 5%EtOAc in petrol ether) to afford the desired product 4 (192 mg, 70%) .

[0096] 1H NMR (400 MHz CDCl3) : δ 7.00 (d, J = 8.8 Hz, 2H) , 6.58 (d, J = 8.4 Hz, 2H) , 3.66 (s, 3H) , 3.20 (t, J = 7.6 Hz, 4H) , 2.53 (t, J = 7.6 Hz, 2H) , 2.33 (t, J = 7.6 Hz, 2H) , 1.91 (qui, J =7.6 Hz, 2H) , 1.59 (m, 4H) , 0.92 (t, J = 7.6 Hz, 6H) .

[0097] Step 2: Synthesis of 4- (4- (dipropylamino) phenyl) butanoic acid (Compound I-3) . To a solution of Compound 4 (83 mg, 0.3 mmol) in MeOH / H2O (4 mL / 1 mL) was added LiOH (72 mg, 3 mmol) under argon atmosphere. The reaction mixture was stirred room temperature for 24 h. After that, the reaction was quenched with Sat. NH4Cl solution (10 mL) and extracted with EtOAc (20 mL × 2) . The combined organic layers were dried over Na2SO4, the solution was concentrated in vacuo and purified by flash chromatography (silica gel, 15%～25%EtOAc in petrol ether) to afford the desired product I-3 (78 mg, Quant. ) .

[0098] 1H NMR (400 MHz CDCl3) : δ 7.01 (d, J = 8.4 Hz, 2H) , 6.58 (d, J = 8.4 Hz, 2H) , 3.20 (t, J = 7.6 Hz, 4H) , 2.56 (t, J = 7.6 Hz, 2H) , 2.37 (t, J = 7.6 Hz, 2H) , 1.92 (qui, J = 7.6 Hz, 2H) , 1.59 (m, 4H) , 0.92 (t, J = 7.6 Hz, 6H) .

[0099] Example S4: Synthesis of 4- (4- (bis (2-fluoroethyl) amino) phenyl) butanoic acid (Compound I-4)

[0100] Step 1: Synthesis of methyl 4- (4- (bis (2-fluoroethyl) amino) phenyl) butanoate (Compound 6) . To a solution of Compound 2 (97 mg, 0.5 mmol) in anhydrous DMF (2.5 mL) was added 1-fluoro-2-iodoethane 5 (261 mg, 1.5 mmol) , and K2CO3 (242 mg, 1.75 mmol) under argon atmosphere. The reaction mixture was stirred at 120 ℃ for 12 h. After that, the reaction was quenched with Sat. NaCl solution (10 mL) and extracted with EtOAc (20 mL × 2) . The combined organic layers were dried over Na2SO4, the solution was concentrated in vacuo and purified by flash chromatography (silica gel, 5～10%EtOAc in petrol ether) to afford the desired product 6 (40 mg, 28%) .

[0101] 1H NMR (600 MHz CDCl3) : δ 7.05 (d, J = 8.4 Hz, 2H) , 6.64 (d, J = 8.4 Hz, 2H) , 4.62 (t, J = 5.4 Hz, 2H) , 4.55 (t, J = 5.4 Hz, 2H) , 3.72 (t, J = 5.4 Hz, 2H) , 3.68 (t, J = 5.4 Hz, 2H) , 3.66 (s, 3H) , 2.55 (t, J = 7.8 Hz, 2H) , 2.32 (t, J = 7.8 Hz, 2H) , 1.91 (qui, J = 7.8 Hz, 2H) .

[0102] Step 2: Synthesis of 4- (4- (bis (2-fluoroethyl) amino) phenyl) butanoic acid (Compound I-4) . To a solution of Compound 6 (35 mg, 0.12 mmol) in MeOH / H2O (2 mL / 0.5 mL) was added LiOH (30 mg, 1.2 mmol) under argon atmosphere. The reaction mixture was stirred room temperature for 24 h. After that, the reaction was quenched with Sat. NH4Cl solution (10 mL) and extracted with EtOAc (20 mL × 2) . The combined organic layers were dried over Na2SO4, the solution was concentrated in vacuo and purified by flash chromatography (silica gel, 15%～35%EtOAc in petrol ether) to afford the desired product I-4 (15 mg, 46%) .

[0103] 1H NMR (400 MHz CDCl3) : δ 7.06 (d, J = 7.8 Hz, 2H) , 6.64 (d, J = 8.4 Hz, 2H) , 4.63 (t, J = 5.4 Hz, 2H) , 4.55 (t, J = 5.4 Hz, 2H) , 3.73 (t, J = 5.4 Hz, 2H) , 3.69 (t, J = 5.4 Hz, 2H) , 2.58 (t, J = 7.8 Hz, 2H) , 2.37 (t, J = 7.8 Hz, 2H) , 1.93 (qui, J = 7.8 Hz, 2H) .

[0104] Example S5: Synthesis of 4- (4- (bis (3, 3, 3-trifluoropropyl) amino) phenyl) butanoic acid (Compound I-5)

[0105] Step 1: Synthesis of methyl 4- (4- (bis (3, 3, 3-trifluoropropyl) amino) phenyl) butanoate (Compound 8) . To a solution of Compound 2 (97 mg, 0.5 mmol) in anhydrous MeOH (5 mL) was added AcOH (0.5 mL) and 3, 3, 3-trifluoropropanal 7 (281 mg, 2.5 mmol) under argon atmosphere. After stirring at room temperature for 10 min, NaCNBH3 (157 mg, 2.5 mmol) was added. The reaction mixture was stirred at 60 ℃ for 24 h. After that, the reaction was quenched with Sat. NaCl solution (10 mL) and extracted with EtOAc (20 mL × 2) . The combined organic layers were dried over Na2SO4, the solution was concentrated in vacuo and purified by flash chromatography (silica gel, 5%EtOAc in petrol ether) to afford the desired product 8 (79 mg, 41%) .

[0106] 1H NMR (400 MHz CDCl3) : δ 7.09 (d, J = 8.8 Hz, 2H) , 6.63 (d, J = 8.8 Hz, 2H) , 3.67 (s, 3H) , 3.55 (t, J = 7.6 Hz, 4H) , 2.57 (t, J = 7.6 Hz, 2H) , 2.36 (m, 6H) , 1.92 (qui, J = 7.6 Hz, 2H) .

[0107] Step 2: Synthesis of 4- (4- (bis (3, 3, 3-trifluoropropyl) amino) phenyl) butanoic acid (Compound I-5) . To a solution of Compound 8 (60 mg, 0.156 mmol) in MeOH / H2O (2.5 mL / 0.5 mL) was added LiOH (38 mg, 1.56 mmol) under argon atmosphere. The reaction mixture was stirred room temperature for 24 h. After that, the reaction was quenched with Sat. NH4Cl solution (10 mL) and extracted with EtOAc (20 mL × 2) . The combined organic layers were dried over Na2SO4, the solution was concentrated in vacuo and purified by flash chromatography (silica gel, 3%methanol in methylene chloride) to afford the desired product I-5 (52 mg, 90%) .

[0108] 1H NMR (600 MHz CDCl3) : δ 7.10 (d, J = 8.4 Hz, 2H) , 6.63 (d, J = 8.4 Hz, 2H) , 3.55 (t, J = 7.8 Hz, 4H) , 2.60 (t, J = 7.8 Hz, 2H) , 2.37 (m, 6H) , 1.93 (qui, J = 7.8 Hz, 2H) .

[0109] Example S6: Synthesis of 4- (4- (bis (2-cyanoethyl) amino) phenyl) butanoic acid (Compound I-6)

[0110] Step 1: Synthesis of methyl 4- (4- (bis (2-cyanoethyl) amino) phenyl) butanoate (Compound 10) . To a solution of Compound 2 (97 mg, 0.5 mmol) in anhydrous DMF (2.5 mL) was added 3-bromopropanenitrile 9 (201 mg, 1.5 mmol) and K2CO3 (207 mg, 1.5 mmol) under argon atmosphere. The reaction mixture was stirred at 120 ℃ for 24 h. After that, the reaction was quenched with Sat. NaCl solution (10 mL) and extracted with EtOAc (20 mL × 2) . The combined organic layers were dried over Na2SO4, the solution was concentrated in vacuo and purified by flash chromatography (silica gel, 5～10%EtOAc in petrol ether) to afford the desired product 10 (63 mg, 42%) .

[0111] 1H NMR (400 MHz CDCl3) : δ 7.11 (d, J = 8.4 Hz, 2H) , 6.66 (d, J = 8.8 Hz, 2H) , 3.73 (t, J = 6.8 Hz, 4H) , 3.67 (s, 3H) , 2.60 (m, 6H) , 2.32 (t, J = 7.6 Hz, 2H) , 1.91 (qui, J = 7.6 Hz, 2H) .

[0112] Step 2: Synthesis of 4- (4- (bis (2-cyanoethyl) amino) phenyl) butanoic acid (Compound I-6) . To a solution of Compound 10 (63 mg, 0.2 mmol) in MeOH / H2O (3 mL / 0.75 mL) was added LiOH (48 mg, 2 mmol) under argon atmosphere. The reaction mixture was stirred room temperature for 24 h. After that, the reaction was quenched with Sat. NH4Cl solution (10 mL) and extracted with EtOAc (20 mL × 2) . The combined organic layers were dried over Na2SO4, the solution was concentrated in vacuo and purified by flash chromatography (silica gel, 3%methanol in methylene chloride) to afford the desired product I-6 (52 mg, 86%) .

[0113] 1H NMR (400 MHz CDCl3) : δ 7.12 (d, J = 8.4 Hz, 2H) , 6.67 (d, J = 8.4 Hz, 2H) , 3.73 (t, J = 6.8 Hz, 4H) , 2.60 (t, J = 6.8 Hz, 6H) , 2.37 (t, J = 7.6 Hz, 2H) , 1.93 (qui, J = 7.6 Hz, 2H) .

[0114] Example S7: Synthesis of 4- (4- (bis (3-chloropropyl) amino) phenyl) butanoic acid (Compound I-7)

[0115] Step 1: Synthesis of methyl methyl 4- (4- (bis (3-chloropropyl) amino) phenyl) butanoate (Compound 12) . To a solution of Compound 2 (97 mg, 0.5 mmol) in anhydrous DMF (2.5 mL) was added 1-chloro-3-iodopropane 11 (306 mg, 1.5 mmol) and K2CO3 (207 mg, 1.5 mmol) under argon atmosphere. The reaction mixture was stirred at 120 ℃ for 24 h. After that, the reaction was quenched with Sat. NaCl solution (10 mL) and extracted with EtOAc (20 mL ×2) . The combined organic layers were dried over Na2SO4, the solution was concentrated in vacuo and purified by flash chromatography (silica gel, 5～10%EtOAc in petrol ether) to afford the desired product 12 (43 mg, 25%) .

[0116] 1H NMR (400 MHz CDCl3) : δ 7.04 (d, J = 8.4 Hz, 2H) , 6.67 (d, J = 8.4 Hz, 2H) , 3.66 (s, 3H) , 3.60 (t, J = 6.4 Hz, 3H) , 3.47 (t, J = 6.8 Hz, 3H) , 3.40 (t, J = 6.8 Hz, 1H) , 3.21 (t, J = 6.8 Hz, 1H) , 2.54 (t, J = 7.6 Hz, 2H) , 2.33 (t, J = 7.6 Hz, 2H) , 2.05 (m, 4H) , 1.91 (qui, J = 7.6 Hz, 2H) .

[0117] Step 2: Synthesis of 4- (4- (bis (3-chloropropyl) amino) phenyl) butanoic acid (Compound I-7) . To a solution of Compound 12 (43 mg, 0.124 mmol) in MeOH / H2O (2 mL / 0.5 mL) was added LiOH (30 mg, 1.24 mmol) under argon atmosphere. The reaction mixture was stirred room temperature for 24 h. After that, the reaction was quenched with Sat. NH4Cl solution (10 mL) and extracted with EtOAc (20 mL × 2) . The combined organic layers were dried over Na2SO4, the solution was concentrated in vacuo and purified by flash chromatography (silica gel, 3%methanol in methylene chloride) to afford the desired product I-7 (34 mg, 82%) . 1H NMR (400 MHz CDCl3) : δ 7.05 (d, J = 8.0 Hz, 2H) , 6.68 (d, J = 8.8 Hz, 2H) , 3.60 (t, J = 6.0 Hz, 3H) , 3.47 (t, J = 6.8 Hz, 3H) , 3.40 (t, J = 6.8 Hz, 1H) , 3.21 (t, J = 6.8 Hz, 1H) , 2.57 (t, J = 7.6 Hz, 2H) , 2.37 (t, J = 7.6 Hz, 2H) , 2.05 (m, 4H) , 1.92 (qui, J = 7.6 Hz, 2H) .

[0118] Example S8: Synthesis of 4- (4- ( (2-chloroethyl) (propyl) amino) phenyl) butanoic acid (Compound I-8)

[0119] Step 1: Synthesis of methyl 4- (4- (propylamino) phenyl) butanoate (Compound 13) . To a solution of Compound 2 (97 mg, 0.5 mmol) in anhydrous DMF (2.5 mL) was added 1-bromopropane 3 (123 mg, 1 mmol) , and K2CO3 (138 mg, 1 mmol) under argon atmosphere. The reaction mixture was stirred at 50 ℃ for 24 h. After that, the reaction was quenched with Sat. NaCl solution (10 mL) and extracted with EtOAc (20 mL × 2) . The combined organic layers were dried over Na2SO4, the solution was concentrated in vacuo and purified by flash chromatography (silica gel, 5～10%EtOAc in petrol ether) to afford the desired product 13 (73 mg, 62%) .

[0120] 1H NMR (400 MHz CDCl3) : δ 6.98 (d, J = 8.0 Hz, 2H) , 6.55 (d, J = 8.0 Hz, 2H) , 3.66 (s, 3H) , 3.06 (t, J = 7.2 Hz, 2H) , 2.53 (t, J = 7.6 Hz, 2H) , 2.32 (t, J = 7.6 Hz, 2H) , 1.90 (qui, J = 7.6 Hz, 2H) , 1.63 (m, 2H) , 0.99 (t, J = 7.6 Hz, 3H) .

[0121] Step 2: Synthesis of methyl 4- (4- ( (2-chloroethyl) (propyl) amino) phenyl) butanoate (Compound 15) . To a solution of Compound 13 (73 mg, 0.31 mmol) in anhydrous MeOH (4 mL) was added AcOH (acetic acid, 0.5 mL) and 2-chloroacetaldehyde 14 (98 mg, 1.24 mmol) under argon atmosphere. After stirring at room temperature for 10 min, NaCNBH3 (78 mg, 1.24 mmol) was added. The reaction mixture was stirred at room temperature for 24 h. After that, the reaction was quenched with Sat. NaCl solution (10 mL) and extracted with EtOAc (20 mL × 2) . The combined organic layers were dried over Na2SO4, the solution was concentrated in vacuo and purified by flash chromatography (silica gel, 5～10%EtOAc in petrol ether) to afford the desired product 15 (73 mg, 79%) .

[0122] 1H NMR (400 MHz CDCl3) : δ 7.03 (d, J = 8.4 Hz, 2H) , 6.61 (d, J = 8.0 Hz, 2H) , 3.67 (s, 3H) , 3.60 (m, 4H) , 3.26 (t, J = 7.6 Hz, 2H) , 2.54 (t, J = 7.6 Hz, 2H) , 2.33 (t, J = 7.6 Hz, 2H) , 1.91 (qui, J = 7.6 Hz, 2H) , 1.61 (m, 2H) , 0.93 (t, J = 7.2 Hz, 3H) .

[0123] Step 3: Synthesis of 4- (4- ( (2-chloroethyl) (propyl) amino) phenyl) butanoic acid (Compound I-8) . To a solution of Compound 15 (33 mg, 0.11 mmol) in MeOH / H2O (2 mL / 0.5 mL) was added LiOH (27 mg, 1.1 mmol) under argon atmosphere. The reaction mixture was stirred room temperature for 24 h. After that, the reaction was quenched with Sat. NH4Cl solution (10 mL) and extracted with EtOAc (20 mL × 2) . The combined organic layers were dried over Na2SO4, the solution was concentrated in vacuo and purified by flash chromatography (silica gel, 3～5%methanol in methylene chloride) to afford the desired product I-8 (19 mg, 59%) .

[0124] 1H NMR (600 MHz CDCl3) : δ 7.04 (d, J = 9.0 Hz, 2H) , 6.61 (d, J = 8.4 Hz, 2H) , 3.60 (m, 4H) , 3.26 (t, J = 7.8 Hz, 2H) , 2.57 (t, J = 7.8 Hz, 2H) , 2.37 (t, J = 7.8 Hz, 2H) , 1.92 (qui, J = 7.8 Hz, 2H) , 1.61 (m, 2H) , 0.93 (t, J = 7.8 Hz, 3H) .

[0125] Example S9: Synthesis of 4- (4- (N- (2-chloroethyl) acrylamido) phenyl) butanoic acid (Compound I-9)

[0126] Step 1: Synthesis of methyl 4- (4- ( (2-chloroethyl) amino) phenyl) butanoate (Compound 16) . To a solution of Compound 2 (97 mg, 0.5 mmol) in anhydrous MeOH (5 mL) was added 2-chloroacetaldehyde 14 (78.5 mg, 1 mmol) under argon atmosphere. After stirring at room temperature for 10 min, NaCNBH3 (95 mg, 1.5 mmol) was added. The reaction mixture was stirred at room temperature for 24 h. After that, the reaction was quenched with Sat. NaCl solution (10 mL) and extracted with EtOAc (20 mL × 2) . The combined organic layers were dried over Na2SO4, the solution was concentrated in vacuo and purified by flash chromatography (silica gel, 5～10%EtOAc in petrol ether) to afford the desired product 16 (31 mg, 24%) .

[0127] 1H NMR (400 MHz CDCl3) : δ 7.01 (d, J = 8.0 Hz, 2H) , 6.59 (d, J = 8.0 Hz, 2H) , 3.71 (t, J = 6.0 Hz, 2H) , 3.66 (s, 3H) , 3.48 (t, J = 6.0 Hz, 2H) , 2.55 (t, J = 7.6 Hz, 2H) , 2.32 (t, J = 7.6 Hz, 2H) , 1.90 (qui, J = 7.6 Hz, 2H) .

[0128] Step 2: Synthesis of methyl 4- (4- (N- (2-chloroethyl) acrylamido) phenyl) butanoate (Compound 18) . To a solution of Compound 16 (19 mg, 0.074 mmol) in anhydrous DCM (1 mL) was added acryloyl chloride 17 (8 μL, 0.096 mmol) and TEA (triethylamine, 31 μL, 0.222 mmol) under argon atmosphere. The reaction mixture was stirred at room temperature for 12 h. After that, the reaction was quenched with Sat. NaCl solution (10 mL) and extracted with DCM (20 mL × 2) . The combined organic layers were dried over Na2SO4, the solution was concentrated in vacuo and purified by flash chromatography (silica gel, 15～25%EtOAc in petrol ether) to afford the desired product 18 (13 mg, 56%) .

[0129] 1H NMR (600 MHz CDCl3) : δ 7.23 (d, J = 7.8 Hz, 2H) , 7.12 (d, J = 8.4 Hz, 2H) , 6.37 (dd, J = 16.8, 1.8 Hz, 1H) , 6.00 (dd, J = 10.2, 6.6 Hz, 1H) , 5.54 (d, J = 10.8 Hz, 1H) , 4.07 (t, J = 6.6 Hz, 2H) , 3.68 (s, 3H) , 3.67 (t, J = 6.6 Hz, 2H) , 2.69 (t, J = 7.8 Hz, 2H) , 2.36 (t, J = 7.8 Hz, 2H) , 1.98 (qui, J = 7.8 Hz, 2H) .

[0130] Step 3: Synthesis of 4- (4- (N- (2-chloroethyl) acrylamido) phenyl) butanoic acid (Compound I-9) . To a solution of Compound 18 (15 mg, 0.05 mmol) in THF / H2O (2 mL / 0.5 mL) was added LiOH (12 mg, 0.5 mmol) under argon atmosphere. The reaction mixture was stirred room temperature for 24 h. After that, the reaction was quenched with Sat. NH4Cl solution (10 mL) and extracted with EtOAc (20 mL × 2) . The combined organic layers were dried over Na2SO4, the solution was concentrated in vacuo and purified by flash chromatography (silica gel, 3～5%methanol in methylene chloride) to afford the desired product I-9 (5.4 mg, 37%) .

[0131] 1H NMR (400 MHz CDCl3) : δ 7.24 (d, J = 8.0 Hz, 2H) , 7.13 (d, J = 8.0 Hz, 2H) , 6.38 (d, J = 17.2 Hz, 1H) , 6.00 (dd, J = 10.4, 6.4 Hz, 1H) , 5.54 (d, J = 10.0 Hz, 1H) , 4.07 (t, J = 6.8 Hz, 2H) , 3.68 (t, J = 6.8 Hz, 2H) , 2.72 (t, J = 7.6 Hz, 2H) , 2.42 (t, J = 7.6 Hz, 2H) , 2.00 (qui, J = 7.6 Hz, 2H) .

[0132] Example S10: Synthesis of 4- (4- (bis (2-chloroethyl) amino) phenyl) -N- (prop-2-yn-1-yl) butanamide (Compound I-10)

[0133] Step 1: Synthesis of 4- (4- (bis (2-chloroethyl) amino) phenyl) -N- (prop-2-yn-1-yl)butanamide (Compound I-10) . To a solution of chlorambucil (91 mg, 0.3 mmol) in DCM (5 mL) was added propargylamine (22 mg, 0.39 mmol) , HOBt (53 mg, 0.39 mmol) , EDCI (92 mg, 0.48 mmol) , and DIPEA (157 μL, 0.9 mmol) under argon atmosphere. The reaction mixture was stirred at room temperature for 24 h. After that, the reaction was quenched with Sat. NaCl solution (5 mL) and extracted with DCM (15 mL × 2) . The combined organic layers were dried over Na2SO4, the solution was concentrated in vacuo and purified by flash chromatography (silica gel, 20%～30%EtOAc in petrol ether) to afford the desired product I-10 (96 mg, 94%) .

[0134] 1H NMR (600 MHz CDCl3) : δ 7.07 (d, J = 8.4 Hz, 2H) , 6.62 (d, J = 9.0 Hz, 2H) , 5.60 (s, 1H) , 4.04 (dd, J = 2.4, 3.0 Hz, 2H) , 3.70 (t, J = 7.2 Hz, 4H) , 3.62 (t, J = 7.2 Hz, 4H) , 2.56 (t, J = 7.8 Hz, 2H) , 2.23 (t, J = 2.4 Hz, 1H) , 2.19 (t, J = 7.8 Hz, 2H) , 1.93 (qui, J = 7.8 Hz, 2H) .

[0135] Example S11: Synthesis of 4- (4- (bis (2-chloroethyl) amino) phenyl) -N- (2- (3- (but-3-yn-1-yl) -3H-diazirin-3-yl) ethyl) butanamide (Compound I-11)

[0136] Step 1: Synthesis of 4- (4- (bis (2-chloroethyl) amino) phenyl) -N- (2- (3- (but-3-yn-1-yl) -3H-diazirin-3-yl) ethyl) butanamide (Compound I-11) . To a solution of chlorambucil (46 mg, 0.152 mmol) in DCM (3 mL) was added 2- (3- (but-3-yn-1-yl) -3H-diazirin-3-yl) ethan-1-amine 20 (25 mg, 0.182 mmol) , HOBt (27 mg, 0.198 mmol) , EDCI (47 mg, 0.243 mmol) , and DIPEA (80 μL, 0.456 mmol) under argon atmosphere. The reaction mixture was stirred at room temperature for 24 h. After that, the reaction was quenched with Sat. NaCl solution (5 mL) and extracted with DCM (15 mL × 2) . The combined organic layers were dried over Na2SO4, the solution was concentrated in vacuo and purified by flash chromatography (silica gel, 20%～40%EtOAc in petrol ether) to afford the desired product I-11 (59 mg, 92%) .

[0137] 1H NMR (400 MHz CDCl3) : δ 7.07 (d, J = 8.8 Hz, 2H) , 6.63 (d, J = 8.8 Hz, 2H) , 5.51 (brs, 1H) , 3.70 (m, 4H) , 3.62 (m, 4H) , 3.09 (q, J = 6.4 Hz, 2H) , 2.56 (t, J = 7.6 Hz, 2H) , 2.17 (t, J = 7.6 Hz, 2H) , 2.00 (m, 3H) , 1.92 (qui, J = 7.6 Hz, 2H) , 1.69 (t, J = 6.8 Hz, 2H) , 1.64 (t, J = 7.2 Hz, 2H) .

[0138] Example S12: Synthesis of (S) -4- (4- (bis (2-chloroethyl) amino) phenyl) -N- (2- (2- (2- (4- (4-chlorophenyl) -2, 3, 9-trimethyl-6H-thieno [3, 2-f] [1, 2, 4] triazolo [4, 3-a] [1, 4] diazepin-6-yl) acetamido) ethoxy) ethyl) butanamide (Compound I-12)

[0139] Step 1: Synthesis of tert-butyl (2- (2- (4- (4- (bis (2-chloroethyl) amino) phenyl) butanamido) ethoxy) ethyl) carbamate (Compound 22) . To a solution of chlorambucil (91 mg, 0.3 mmol) in DCM (5 mL) was added tert-butyl (2- (2-aminoethoxy) ethyl) carbamate 21 (80 mg, 0.39 mmol) , HOBt (53 mg, 0.39 mmol) , EDCI (92 mg, 0.48 mmol) , and DIPEA (157 μL, 0.9 mmol) under argon atmosphere. The reaction mixture was stirred at room temperature for 24 h. After that, the reaction was quenched with Sat. NaCl solution (5 mL) and extracted with DCM (15 mL × 2) . The combined organic layers were dried over Na2SO4, the solution was concentrated in vacuo and purified by flash chromatography (silica gel, 40%～60%EtOAc in petrol ether) to afford the desired product 22 (143 mg, 97%) .

[0140] 1H NMR (600 MHz CDCl3) : δ 7.07 (d, J = 8.4 Hz, 2H) , 6.62 (d, J = 8.4 Hz, 2H) , 3.70 (t, J = 7.2 Hz, 4H) , 3.62 (t, J = 7.2 Hz, 4H) , 3.52 (m, 4H) , 3.44 (m, 2H) , 3.31 (m, 2H) , 2.56 (t, J = 7.2 Hz, 2H) , 2.20 (t, J = 7.2 Hz, 2H) , 1.92 (qui, J = 7.2 Hz, 2H) , 1.45 (s, 9H) .

[0141] Step 2: Synthesis of (S) -4- (4- (bis (2-chloroethyl) amino) phenyl) -N- (2- (2- (2- (4- (4-chlorophenyl) -2, 3, 9-trimethyl-6H-thieno [3, 2-f] [1, 2, 4] triazolo [4, 3-a] [1, 4] diazepin-6-yl) acet amido) ethoxy) ethyl) butanamide (Compound I-12) . To a solution of Compound 22 (76 mg, 0.155 mmol) in DCM (2 mL) was added TFA (0.5 mL) under argon atmosphere. The reaction mixture was stirred at room temperature for 2 h. After that, the solutions were removed in vacuo. The residues were dissolved in i-PrOH / CHCl3 = 1: 3 (20 mL) and washed with Sat. NaHCO3 (10 mL) . The organic layer was collected and dried over Na2SO4, and the solvent was removed in vacuo to afford the desired product without further purification. The above residue was dissolved in DCM (2.5 mL) , (+) -JQ-1 carboxylic acid (40 mg, 0.1 mmol) , HATU (57 mg, 0.15 mmol) , and DIPEA (136 μL, 0.8 mmol) were added to the solution under argon atmosphere. The reaction mixture was stirred at room temperature for 2 h. After that, the reaction was quenched with Sat. NaCl solution (5 mL) and extracted with DCM (15 mL × 2) . The combined organic layers were dried over Na2SO4, the solution was concentrated in vacuo and purified by flash chromatography (silica gel, 2～5%methanol in methylene chloride) to afford the desired product I-12 (73 mg, 95%) .

[0142] 1H NMR (600 MHz CDCl3) : δ 7.43 (d, J = 8.4 Hz, 2H) , 7.34 (d, J = 8.4 Hz, 2H) , 7.22 (t, J = 5.4 Hz, 1H) , 7.13 (t, J = 5.4 Hz, 1H) , 7.03 (d, J = 8.4 Hz, 2H) , 6.57 (d, J = 8.4 Hz, 2H) , 4.55 (q, J = 4.8 Hz, 1H) , 3.72 (t, J = 7.2 Hz, 4H) , 3.65 (t, J = 7.2 Hz, 4H) , 3.54 (m, 4H) , 3.45 (m, 2H) , 3.30 (m, 2H) , 2.65 (s, 3H) , 2.52 (t, J = 7.2 Hz, 2H) , 2.41 (s, 3H) , 2.26 (t, J = 7.2 Hz, 2H) , 1.92 (qui, J = 7.2 Hz, 2H) , 1.68 (s, 3H) .

[0143] Example S13: Synthesis of (S) -4- (4- (bis (2-chloroethyl) amino) phenyl) -N- (2- (2- (2- (2- (4- (4-chlorophenyl) -2, 3, 9-trimethyl-6H-thieno [3, 2-f] [1, 2, 4] triazolo [4, 3-a] [1, 4] diazepin-6-yl) acetamido) ethoxy) ethoxy) ethyl) butanamide (Compound I-13)

[0144] Step 1: Synthesis of tert-butyl (2- (2- (2- (4- (4- (bis (2-chloroethyl) amino) phenyl) butanamido) ethoxy) ethoxy) ethyl) carbamate (Compound 24) . To a solution of chlorambucil (91 mg, 0.3 mmol) in DCM (5 mL) was added tert-butyl (2- (2- (2-aminoethoxy) ethoxy) ethyl) carbamate 23 (97 mg, 0.39 mmol) , HOBt (53 mg, 0.39 mmol) , EDCI (92 mg, 0.48 mmol) , and DIPEA (157 μL, 0.9 mmol) under argon atmosphere. The reaction mixture was stirred at room temperature for 24 h. After that, the reaction was quenched with Sat. NaCl solution (5 mL) and extracted with DCM (15 mL × 2) . The combined organic layers were dried over Na2SO4, the solution was concentrated in vacuo and purified by flash chromatography (silica gel, 3%methanol in methylene chloride) to afford the desired product 24 (181 mg, Quant. ) .

[0145] 1H NMR (600 MHz CDCl3) : δ 7.08 (d, J = 6.0 Hz, 2H) , 6.66 (d, J = 6.0 Hz, 2H) , 3.70 (m, 4H) , 3.62 (m, 8H) , 3.55 (m, 4H) , 3.47 (m, 2H) , 3.31 (m, 2H) , 2.56 (t, J = 5.4 Hz, 2H) , 2.19 (t, J = 5.4 Hz, 2H) , 1.92 (qui, J = 5.4 Hz, 2H) , 1.45 (s, 9H) .

[0146] Step 2: Synthesis of (S) -4- (4- (bis (2-chloroethyl) amino) phenyl) -N- (2- (2- (2- (2- (4- (4-chlorophenyl) -2, 3, 9-trimethyl-6H-thieno [3, 2-f] [1, 2, 4] triazolo [4, 3-a] [1, 4] diazepin-6-yl) acetamido) ethoxy) ethoxy) ethyl) butanamide (Compound I-13) . To a solution of Compound 24 (60.3 mg, 0.111 mmol) in DCM (2 mL) was added TFA (0.5 mL) under argon atmosphere. The reaction mixture was stirred at room temperature for 2 h. After that, the solutions were removed in vacuo. The residues were dissolved in i-PrOH / CHCl3 = 1: 3 (20 mL) and washed with Sat. NaHCO3 (10 mL) . The organic layer was collected and dried over Na2SO4, and the solvent was removed in vacuo to afford the desired product without further purification. The above residue was dissolved in DCM (4 mL) , (+) -JQ-1 carboxylic acid (32.7 mg, 0.082 mmol) , HOBt (14.4 mg, 0.106 mmol) , EDCI (25 mg, 0.132 mmol) , and DIPEA (43 μL, 0.246 mmol) were added to the solution under argon atmosphere. The reaction mixture was stirred at room temperature for 12 h. After that, the reaction was quenched with Sat. NaCl solution (5 mL) and extracted with DCM (15 mL × 2) . The combined organic layers were dried over Na2SO4, the solution was concentrated in vacuo and purified by flash chromatography (silica gel, 3～10%methanol in methylene chloride) to afford the desired product I-13 (59 mg, 88%) .

[0147] 1H NMR (600 MHz CDCl3) : δ 7.42 (d, J = 6.0 Hz, 2H) , 7.33 (d, J = 7.2 Hz, 2H) , 7.04 (t, J = 6.6 Hz, 2H) , 7.00 (brs, 1H) , 6.60 (d, J = 6.6 Hz, 2H) , 6.54 (brs, 1H) , 4.66 (m, 1H) , 3.70-3.46 (m, 22H) , 2.67 (s, 3H) , 2.50 (t, J = 5.4 Hz, 2H) , 2.41 (s, 3H) , 2.19 (t, J = 5.4 Hz, 2H) , 1.88 (qui, J = 5.4 Hz, 2H) , 1.68 (s, 3H) .

[0148] Example S14: Synthesis of (S) -4- (4- (bis (2-chloroethyl) amino) phenyl) -N- (1- (4- (4-chlorophenyl) -2, 3, 9-trimethyl-6H-thieno [3, 2-f] [1, 2, 4] triazolo [4, 3-a] [1, 4] diazepin-6-yl) -2-oxo-6, 9, 12-trioxa-3-azatetradecan-14-yl) butanamide (Compound I-14)

[0149] Step 1: Synthesis of tert-butyl (16- (4- (bis (2-chloroethyl) amino) phenyl) -13-oxo-3, 6, 9-trioxa-12-azahexadecyl) carbamate (Compound 26) . To a solution of chlorambucil (61 mg, 0.2 mmol) in DCM (3.5 mL) was added tert-butyl (2- (2- (2- (2-aminoethoxy) ethoxy) ethoxy) ethyl) carbamate 25 (76 mg, 0.26 mmol) , HOBt (35 mg, 0.26 mmol) , EDCI (61 mg, 0.32 mmol) , and DIPEA (105 μL, 0.6 mmol) under argon atmosphere. The reaction mixture was stirred at room temperature for 24 h. After that, the reaction was quenched with Sat. NaCl solution (5 mL) and extracted with DCM (15 mL × 2) . The combined organic layers were dried over Na2SO4, the solution was concentrated in vacuo and purified by flash chromatography (silica gel, 3～5%methanol in methylene chloride) to afford the desired product 26 (103 mg, 89%) .

[0150] 1H NMR (400 MHz CDCl3) : δ 7.07 (d, J = 8.4 Hz, 2H) , 6.63 (d, J = 8.4 Hz, 2H) , 6.03 (brs, 1H) , 5.04 (brs, 1H) , 3.70 (m, 4H) , 3.62 (m, 12H) , 3.54 (m, 4H) , 3.45 (m, 2H) , 3.31 (m, 2H) , 2.55 (t, J = 7.6 Hz, 2H) , 2.18 (t, J = 7.2 Hz, 2H) , 1.91 (qui, J = 3.6 Hz, 2H) , 1.44 (s, 9H) .

[0151] Step 2: Synthesis of (S) -4- (4- (bis (2-chloroethyl) amino) phenyl) -N- (1- (4- (4-chloro phenyl) -2, 3, 9-trimethyl-6H-thieno [3, 2-f] [1, 2, 4] triazolo [4, 3-a] [1, 4] diazepin-6-yl) -2-oxo-6, 9, 12-trioxa-3-azatetradecan-14-yl) butanamide (Compound I-14) . To a solution of Compound 6 (78.4 mg, 0.135 mmol) in DCM (2 mL) was added TFA (0.5 mL) under argon atmosphere. The reaction mixture was stirred at room temperature for 2 h. After that, the solutions were removed in vacuo. The residues were dissolved in i-PrOH / CHCl3 = 1: 3 (20 mL) and washed with Sat. NaHCO3 (10 mL) . The organic layer was collected and dried over Na2SO4, and the solvent was removed in vacuo to afford the desired product without further purification. The above residue was dissolved in DCM (4 mL) , (+) -JQ-1 carboxylic acid (36.7 mg, 0.092 mmol) , HOBt (16.1 mg, 0.119 mmol) , EDCI (28.2 mg, 0.147 mmol) , and DIPEA (48 μL, 0.276 mmol) were added to the solution under argon atmosphere. The reaction mixture was stirred at room temperature for 12 h. After that, the reaction was quenched with Sat. NaCl solution (5 mL) and extracted with DCM (15 mL × 2) . The combined organic layers were dried over Na2SO4, the solution was concentrated in vacuo and purified by flash chromatography (silica gel, 3～10%methanol in methylene chloride) to afford the desired product I-14 (67 mg, 85%) .

[0152] 1H NMR (400 MHz CDCl3) : δ 7.41 (d, J = 8.4 Hz, 2H) , 7.32 (d, J = 8.4 Hz, 2H) , 7.04 (t, J = 8.8 Hz, 2H) , 7.00 (brs, 1H) , 6.60 (d, J = 8.8 Hz, 2H) , 6.56 (brs, 1H) , 4.68 (t, J = 7.2 Hz, 1H) , 3.70-3.37 (m, 26H) , 2.66 (s, 3H) , 2.51 (t, J = 7.6 Hz, 2H) , 2.40 (s, 3H) , 2.17 (t, J = 7.6 Hz, 2H) , 1.88 (qui, J = 7.6 Hz, 2H) , 1.67 (s, 3H) .

[0153] Example S15: Synthesis of (S) -4- (4- (bis (2-chloroethyl) amino) phenyl) -N- (3- (2- (4- (4-chlorophenyl) -2, 3, 9-trimethyl-6H-thieno [3, 2-f] [1, 2, 4] triazolo [4, 3-a] [1, 4] diazepin-6-yl) acetamido) propyl) butanamide (Compound I-15)

[0154] Step 1: Synthesis of tert-butyl (3- (4- (4- (bis (2-chloroethyl) amino) phenyl) butanamido) propyl) carbamate (Compound 28) . To a solution of chlorambucil (91 mg, 0.3 mmol) in DCM (5 mL) was added tert-butyl (3-aminopropyl) carbamate 27 (68 mg, 0.39 mmol) , HOBt (53 mg, 0.39 mmol) , EDCI (92 mg, 0.39 mmol) , and DIPEA (157 μL, 0.9 mmol) under argon atmosphere. The reaction mixture was stirred at room temperature for 24 h. After that, the reaction was quenched with Sat. NaCl solution (5 mL) and extracted with DCM (15 mL × 2) . The combined organic layers were dried over Na2SO4, the solution was concentrated in vacuo and purified by flash chromatography (silica gel, 25～55%EtOAc in petrol ether) to afford the desired product 28 (148 mg, Quant. ) .

[0155] 1H NMR (400 MHz CDCl3) : δ 7.04 (d, J = 8.4 Hz, 2H) , 6.56 (d, J = 8.4 Hz, 2H) , 3.69 (m, 4H) , 3.61 (m, 4H) , 3.32 (m, 4H) , 2.54 (t, J = 7.6 Hz, 2H) , 2.19 (t, J = 7.6 Hz, 2H) , 1.91 (qui, J = 7.6 Hz, 2H) , 1.66 (m, 2H) , 1.44 (s, 9H) .

[0156] Step 2: Synthesis of (S) -4- (4- (bis (2-chloroethyl) amino) phenyl) -N- (3- (2- (4- (4-chlorophenyl) -2, 3, 9-trimethyl-6H-thieno [3, 2-f] [1, 2, 4] triazolo [4, 3-a] [1, 4] diazepin-6-yl) acet amido) propyl) butanamide (Compound I-15) . To a solution of Compound 28 (60 mg, 0.12 mmol) in DCM (2 mL) was added TFA (0.5 mL) under argon atmosphere. The reaction mixture was stirred at room temperature for 2 h. After that, the solutions were removed in vacuo. The residues were dissolved in i-PrOH / CHCl3 = 1: 3 (20 mL) and washed with Sat. NaHCO3 (10 mL) . The organic layer was collected and dried over Na2SO4, and the solvent was removed in vacuo to afford the desired product without further purification. The above residue was dissolved in DCM (4 mL) , (+) -JQ-1 carboxylic acid (40 mg, 0.1 mmol) , HOBt (18 mg, 0.13 mmol) , EDCI (31 mg, 0.16 mmol) , and DIPEA (53 μL, 0.3 mmol) were added to the solution under argon atmosphere. The reaction mixture was stirred at room temperature for 12 h. After that, the reaction was quenched with Sat. NaCl solution (5 mL) and extracted with DCM (15 mL × 2) . The combined organic layers were dried over Na2SO4, the solution was concentrated in vacuo and purified by flash chromatography (silica gel, 3～5%methanol in methylene chloride) to afford the desired product I-15 (70 mg, 91%) .

[0157] 1H NMR (400 MHz CDCl3) : δ 7.39 (d, J = 8.4 Hz, 2H) , 7.32 (d, J = 8.4 Hz, 2H) , 7.12 (t, J = 6.4 Hz, 1H) , 7.05 (t, J = 8.4 Hz, 2H) , 6.58 (d, J = 8.4 Hz, 2H) , 6.57 (brs, 1H) , 4.62 (t, J =6.8 Hz, 1H) , 3.68 (m, 4H) , 3.60 (m, 4H) , 3.54 (m, 1H) , 3.33 (m, 4H) , 3.19 (m, 1H) , 2.66 (s, 3H) , 2.53 (t, J = 7.6 Hz, 2H) , 2.40 (s, 3H) , 2.19 (t, J = 7.6 Hz, 2H) , 1.92 (qui, J = 7.6 Hz, 2H) , 1.67 (s, 3H) , 1.65 (m, 2H) .

[0158] Example S16: Synthesis of (S) -4- (4- (bis (2-chloroethyl) amino) phenyl) -N- (5- (2- (4- (4-chlorophenyl) -2, 3, 9-trimethyl-6H-thieno [3, 2-f] [1, 2, 4] triazolo [4, 3-a] [1, 4] diazepin-6-yl) acetamido) pentyl) butanamide (Compound I-16)

[0159] Step 1: Synthesis of tert-butyl (5- (4- (4- (bis (2-chloroethyl) amino) phenyl) butanamido) pentyl) carbamate (Compound 30) . To a solution of chlorambucil (91 mg, 0.3 mmol) in DCM (5 mL) was added tert-butyl (5-aminopentyl) carbamate 29 (79 mg, 0.39 mmol) , HOBt (53 mg, 0.39 mmol) , EDCI (92 mg, 0.39 mmol) , and DIPEA (157 μL, 0.9 mmol) under argon atmosphere. The reaction mixture was stirred at room temperature for 24 h. After that, the reaction was quenched with Sat. NaCl solution (5 mL) and extracted with DCM (15 mL × 2) . The combined organic layers were dried over Na2SO4, the solution was concentrated in vacuo and purified by flash chromatography (silica gel, 3%methanol in methylene chloride) to afford the desired product 30 (153 mg, Quant. ) .

[0160] 1H NMR (400 MHz CDCl3) : δ 7.08 (d, J = 8.4 Hz, 2H) , 6.67 (d, J = 8.8 Hz, 2H) , 5.46 (brs, 1H) , 4.54 (brs, 1H) , 3.71 (m, 4H) , 3.63 (m, 4H) , 3.24 (q, J = 6.4 Hz, 2H) , 3.10 (q, J = 6.4 Hz, 2H) , 2.56 (t, J = 7.6 Hz, 2H) , 2.16 (t, J = 7.6 Hz, 2H) , 1.92 (qui, J = 7.6 Hz, 2H) , 1.50 (m, 4H) , 1.44 (s, 9H) , 1.34 (m, 2H) .

[0161] Step 2: Synthesis of (S) -4- (4- (bis (2-chloroethyl) amino) phenyl) -N- (5- (2- (4- (4-chlorophenyl) -2, 3, 9-trimethyl-6H-thieno [3, 2-f] [1, 2, 4] triazolo [4, 3-a] [1, 4] diazepin-6-yl) acet amido) pentyl) butanamide (Compound I-16) . To a solution of Compound 30 (45.2 mg, 0.093 mmol) in DCM (2 mL) was added TFA (0.5 mL) under argon atmosphere. The reaction mixture was stirred at room temperature for 2 h. After that, the solutions were removed in vacuo. The residues were dissolved in i-PrOH / CHCl3 = 1: 3 (20 mL) and washed with Sat. NaHCO3 (10 mL) . The organic layer was collected and dried over Na2SO4, and the solvent was removed in vacuo to afford the desired product without further purification. The above residue was dissolved in DCM (4 mL) , (+) -JQ-1 carboxylic acid (28 mg, 0.07 mmol) , HOBt (13 mg, 0.093 mmol) , EDCI (22 mg, 0.114 mmol) , and DIPEA (37 μL, 0.213 mmol) were added to the solution under argon atmosphere. The reaction mixture was stirred at room temperature for 12 h. After that, the reaction was quenched with Sat. NaCl solution (5 mL) and extracted with DCM (15 mL × 2) . The combined organic layers were dried over Na2SO4, the solution was concentrated in vacuo and purified by flash chromatography (silica gel, 3～7%methanol in methylene chloride) to afford the desired product I-16 (47 mg, 89%) .

[0162] 1H NMR (400 MHz CDCl3) : δ 7.41 (d, J = 8.8 Hz, 2H) , 7.34 (d, J = 8.8 Hz, 2H) , 7.04 (t, J = 8.4 Hz, 2H) , 6.60 (d, J = 8.8 Hz, 2H) , 6.59 (brs, 1H) , 6.23 (brs, 1H) , 4.61 (t, J = 5.6 Hz, 1H) , 3.69 (m, 4H) , 3.60 (m, 4H) , 3.58 (m, 1H) , 3.32 (m, 3H) , 3.21 (m, 1H) , 3.12 (m, 1H) , 2.66 (s, 3H) , 2.53 (t, J = 7.6 Hz, 2H) , 2.40 (s, 3H) , 2.20 (t, J = 7.6 Hz, 2H) , 1.92 (qui, J = 7.6 Hz, 2H) , 1.67 (s, 3H) , 1.51 (m, 4H) , 1.38 (m, 2H) .

[0163] Example S17: Synthesis of (S) -4- (4- (bis (2-chloroethyl) amino) phenyl) -N- (8- (2- (4- (4-chlorophenyl) -2, 3, 9-trimethyl-6H-thieno [3, 2-f] [1, 2, 4] triazolo [4, 3-a] [1, 4] diazepin-6-yl) acetamido) octyl) butanamide (Compound I-17)

[0164] Step 1: Synthesis of tert-butyl (8- (4- (4- (bis (2-chloroethyl) amino) phenyl) butanamido) octyl) carbamate (Compound 32) . To a solution of chlorambucil (91 mg, 0.3 mmol) in DCM (5 mL) was added tert-butyl (8-aminooctyl) carbamate 31 (96 mg, 0.39 mmol) , HOBt (53 mg, 0.39 mmol) , EDCI (92 mg, 0.39 mmol) , and DIPEA (157 μL, 0.9 mmol) under argon atmosphere. The reaction mixture was stirred at room temperature for 24 h. After that, the reaction was quenched with Sat. NaCl solution (5 mL) and extracted with DCM (15 mL × 2) . The combined organic layers were dried over Na2SO4, the solution was concentrated in vacuo and purified by flash chromatography (silica gel, 3%methanol in methylene chloride) to afford the desired product 32 (174 mg, Quant. ) .

[0165] 1H NMR (400 MHz CDCl3) : δ 7.07 (d, J = 8.4 Hz, 2H) , 6.64 (d, J = 8.4 Hz, 2H) , 5.38 (brs, 1H) , 4.50 (brs, 1H) , 3.70 (m, 4H) , 3.62 (m, 4H) , 3.22 (q, J = 7.6 Hz, 2H) , 3.09 (q, J = 6.8 Hz, 2H) , 2.56 (t, J = 7.6 Hz, 2H) , 2.16 (t, J = 7.6 Hz, 2H) , 1.92 (qui, J = 7.6 Hz, 2H) , 1.45 (m, 13H) , 1.29 (s, 8H) .

[0166] Step 2: Synthesis of (S) -4- (4- (bis (2-chloroethyl) amino) phenyl) -N- (8- (2- (4- (4-chlorophenyl) -2, 3, 9-trimethyl-6H-thieno [3, 2-f] [1, 2, 4] triazolo [4, 3-a] [1, 4] diazepin-6-yl) acet amido) octyl) butanamide (Compound I-17) . To a solution of Compound 32 (50 mg, 0.094 mmol) in DCM (2 mL) was added TFA (0.5 mL) under argon atmosphere. The reaction mixture was stirred at room temperature for 2 h. After that, the solutions were removed in vacuo. The residues were dissolved in i-PrOH / CHCl3 = 1: 3 (20 mL) and washed with Sat. NaHCO3 (10 mL) . The organic layer was collected and dried over Na2SO4, and the solvent was removed in vacuo to afford the desired product without further purification. The above residue was dissolved in DCM (4 mL) , (+) -JQ-1 carboxylic acid (27 mg, 0.069 mmol) , HOBt (13 mg, 0.09 mmol) , EDCI (22 mg, 0.112 mmol) , and DIPEA (36 μL, 0.207 mmol) were added to the solution under argon atmosphere. The reaction mixture was stirred at room temperature for 12 h. After that, the reaction was quenched with Sat. NaCl solution (5 mL) and extracted with DCM (15 mL × 2) . The combined organic layers were dried over Na2SO4, the solution was concentrated in vacuo and purified by flash chromatography (silica gel, 3～5%methanol in methylene chloride) to afford the desired product I-17 (47 mg, 87%) .

[0167] 1H NMR (600 MHz CDCl3) : δ 7.40 (d, J = 8.4 Hz, 2H) , 7.33 (d, J = 8.4 Hz, 2H) , 7.06 (t, J = 9.0 Hz, 2H) , 6.61 (d, J = 8.4 Hz, 2H) , 6.49 (t, J = 6.0 Hz, 1H) , 5.57 (t, J = 6.0 Hz, 1H) , 4.61 (t, J = 7.2 Hz, 1H) , 3.69 (m, 4H) , 3.61 (m, 4H) , 3.55 (m, 1H) , 3.29 (m, 2H) , 3.22 (m, 3H) , 2.67 (s, 3H) , 2.54 (t, J = 7.2 Hz, 2H) , 2.40 (s, 3H) , 2.16 (t, J = 7.2 Hz, 2H) , 1.91 (qui, J = 7.8 Hz, 2H) , 1.67 (s, 3H) , 1.49 (m, 4H) , 1.29 (m, 8H) .

[0168] Example S18: Synthesis of (S) -4- (4- (bis (2-chloroethyl) amino) phenyl) -1- (4- ( (1- (2- (4- (4-chlorophenyl) -2, 3, 9-trimethyl-6H-thieno [3, 2-f] [1, 2, 4] triazolo [4, 3-a] [1, 4] diazepin-6-yl) acetyl) piperidin-4-yl) methyl) piperazin-1-yl) butan-1-one (Compound I-18)

[0169] Step 1: Synthesis of tert-butyl tert-butyl 4- ( (4- (4- (4- (bis (2-chloroethyl) amino) phenyl) butanoyl) piperazin-1-yl) methyl) piperidine-1-carboxylate (Compound 34) . To a solution of chlorambucil (91 mg, 0.3 mmol) in DCM (5 mL) was added tert-butyl 4- (piperazin-1-ylmethyl) piperidine-1-carboxylate 33 (111 mg, 0.39 mmol) , HOBt (53 mg, 0.39 mmol) , EDCI (92 mg, 0.39 mmol) , and DIPEA (157 μL, 0.9 mmol) under argon atmosphere. The reaction mixture was stirred at room temperature for 24 h. After that, the reaction was quenched with Sat. NaCl solution (5 mL) and extracted with DCM (15 mL × 2) . The combined organic layers were dried over Na2SO4, the solution was concentrated in vacuo and purified by flash chromatography (silica gel, 3%methanol in methylene chloride) to afford the desired product 34 (182 mg, Quant. ) .

[0170] 1H NMR (400 MHz CDCl3) : δ 7.07 (d, J = 8.8 Hz, 2H) , 6.62 (d, J = 8.4 Hz, 2H) , 4.08 (brs, 2H) , 3.70 (m, 4H) , 3.61 (m, 6H) , 3.39 (brs, 2H) , 2.68 (m, 2H) , 2.58 (t, J = 7.6 Hz, 2H) , 2.33 (m, 6H) , 2.16 (d, J = 7.2 Hz, 2H) , 1.91 (qui, J = 7.6 Hz, 2H) , 1.72 (m, 2H) , 1.60 (m, 1H) , 1.45 (s, 9H) , 1.06 (m, 2H) .

[0171] Step 2: Synthesis of (S) -4- (4- (bis (2-chloroethyl) amino) phenyl) -1- (4- ( (1- (2- (4- (4-chlorophenyl) -2, 3, 9-trimethyl-6H-thieno [3, 2-f] [1, 2, 4] triazolo [4, 3-a] [1, 4] diazepin-6-yl) acetyl) piperidin-4-yl) methyl) piperazin-1-yl) butan-1-one (Compound I-18) . To a solution of Compound 34 (49.5 mg, 0.087 mmol) in DCM (2 mL) was added TFA (0.5 mL) under argon atmosphere. The reaction mixture was stirred at room temperature for 2 h. After that, the solutions were removed in vacuo. The residues were dissolved in i-PrOH / CHCl3 = 1: 3 (20 mL) and washed with Sat. NaHCO3 (10 mL) . The organic layer was collected and dried over Na2SO4, and the solvent was removed in vacuo to afford the desired product without further purification. The above residue was dissolved in DCM (4 mL) , (+) -JQ-1 carboxylic acid (26 mg, 0.067 mmol) , HOBt (13 mg, 0.087 mmol) , EDCI (21 mg, 0.107 mmol) , and DIPEA (35 μL, 0.201 mmol) were added to the solution under argon atmosphere. The reaction mixture was stirred at room temperature for 12 h. After that, the reaction was quenched with Sat. NaCl solution (5 mL) and extracted with DCM (15 mL × 2) . The combined organic layers were dried over Na2SO4, the solution was concentrated in vacuo and purified by flash chromatography (silica gel, 3～5%methanol in methylene chloride) to afford the desired product I-18 (50 mg, 92%) .

[0172] 1H NMR (600 MHz CDCl3) : δ 7.40 (d, J = 8.8 Hz, 2H) , 7.32 (d, J = 8.4 Hz, 2H) , 7.08 (t, J = 8.4 Hz, 2H) , 6.63 (d, J = 8.8 Hz, 2H) , 4.81 (t, J = 6.4 Hz, 1H) , 4.62 (m, 1H) , 4.25 (m, 1H) , 3.70 (m, 4H) , 3.62 (m, 7H) , 3.41 (brs, 2H) , 3.16 (m, 2H) , 2.67 (s, 3H) , 2.58 (t, J = 7.6 Hz, 2H) , 2.39 (s, 3H) , 2.33 (m, 6H) , 2.21 (m, 2H) , 1.92 (qui, J = 7.6 Hz, 2H) , 1.80 (m, 2H) , 1.19 (m, 2H) .

[0173] Example S19: Synthesis of (S) -4- (4- (bis (2-chloroethyl) amino) phenyl) -N- (2- (2- (2- (2- (4- (2- (4- (4-chlorophenyl) -2, 3, 9-trimethyl-6H-thieno [3, 2-f] [1, 2, 4] triazolo [4, 3-a] [1, 4] diazepin-6-yl) acetamido) phenoxy) ethoxy) ethoxy) ethoxy) ethyl) butanamide (Compound I-19)

[0174] Step 1: Synthesis of tert-butyl (2- (2- (2- (2- (4-nitrophenoxy) ethoxy) ethoxy) ethoxy) ethyl) carbamate (Compound 37) . To a solution of tert-butyl (2- (2- (2- (2-bromoethoxy) ethoxy) ethoxy) ethyl) carbamate 35 (495 mg, 1.39 mmol) in DMF (4 mL) was added 4-nitrophenol 36 (161 mg, 1.16 mmol) and K2CO3 (320 mg, 2.32 mmol) under argon atmosphere. The reaction mixture was stirred at 80 ℃ for 24 h. After that, the reaction was quenched with Sat. NaCl solution (8 mL) and extracted with EtOAc (20 mL × 2) . The combined organic layers were dried over Na2SO4, the solution was concentrated in vacuo and purified by flash chromatography (silica gel, 2%methanol in methylene chloride) to afford the desired product 37 (531 mg, 96%) .

[0175] 1H NMR (400 MHz CDCl3) : δ 8.17 (d, J = 9.2 Hz, 2H) , 6.96 (d, J = 9.2 Hz, 2H) , 4.21 (t, J = 4.8 Hz, 2H) , 3.88 (t, J = 4.8 Hz, 2H) , 3.71 (m, 2H) , 3.66 (m, 2H) , 3.60 (m, 4H) , 3.51 (t, J = 4.8 Hz, 2H) , 3.28 (t, J = 4.8 Hz, 2H) , 1.41 (s, 9H) .

[0176] Step 2: Synthesis of 4- (4- (bis (2-chloroethyl) amino) phenyl) -N- (2- (2- (2- (2- (4-nitrophenoxy) ethoxy) ethoxy) ethoxy) ethyl) butanamide (Compound 38) . To a solution of Compound 37 (286 mg, 0.69 mmol) in DCM (8 mL) was added TFA (2 mL) under argon atmosphere. The reaction mixture was stirred at room temperature for 2 h. After that, the solutions were removed in vacuo. The residues were dissolved in i-PrOH / CHCl3 = 1: 3 (40 mL) and washed with Sat. NaHCO3 (10 mL) . The organic layer was collected and dried over Na2SO4, and the solvent was removed in vacuo to afford the desired product without further purification. The above residue was dissolved in DCM (10 mL) , chlorambucil (161 mg, 0.53 mmol) , HOBt (94 mg, 0.69 mmol) , EDCI (162 mg, 0.85 mmol) , and DIPEA (277 μL, 1.59 mmol) were added to the solution under argon atmosphere. The reaction mixture was stirred at room temperature for 12 h. After that, the reaction was quenched with Sat. NaCl solution (10 mL) and extracted with DCM (30 mL × 2) . The combined organic layers were dried over Na2SO4, the solution was concentrated in vacuo and purified by flash chromatography (silica gel, 3%methanol in methylene chloride) to afford the desired product 38 (293 mg, 92%) .

[0177] 1H NMR (400 MHz CDCl3) : δ 8.18 (d, J = 9.2 Hz, 2H) , 7.06 (d, J = 8.8 Hz, 2H) , 6.97 (d, J = 9.2 Hz, 2H) , 6.62 (d, J = 8.8 Hz, 2H) , 4.21 (t, J = 4.8 Hz, 2H) , 3.88 (t, J = 4.8 Hz, 2H) , 3.73-3.59 (m, 16H) , 3.55 (t, J = 4.8 Hz, 2H) , 3.44 (m, 2H) , 2.54 (t, J = 7.6 Hz, 2H) , 2.17 (t, J = 7.6 Hz, 2H) , 1.91 (qui, J = 7.6 Hz, 2H) .

[0178] Step 3: Synthesis of (S) -4- (4- (bis (2-chloroethyl) amino) phenyl) -N- (2- (2- (2- (2- (4- (2- (4- (4-chlorophenyl) -2, 3, 9-trimethyl-6H-thieno [3, 2-f] [1, 2, 4] triazolo [4, 3-a] [1, 4] diaze pin-6-yl) acetamido) phenoxy) ethoxy) ethoxy) ethoxy) ethyl) butanamide (Compound I-19) . To a solution of Compound 38 (120 mg, 0.2 mmol) in MeOH (4 mL) was added 10%Pd / C (55%wet, 30 mg) under argon atmosphere. Changed with H2 and the reaction mixture was stirred at room temperature for 20 h under H2 atmosphere. After that, Pd / C was removed through filtration and washed with MeOH. The filtrate was collected and dried in vacuo to afford the desired product without further purification. The above residue (51.8 mg, 0.09 mmol) was dissolved in DCM (4 mL) , (+) -JQ-1 carboxylic acid (28 mg, 0.07 mmol) , HOBt (13 mg, 0.09 mmol) , EDCI (22 mg, 0.112 mmol) , and DIPEA (37 μL, 0.21 mmol) were added to the solution under argon atmosphere. The reaction mixture was stirred at room temperature for 12 h. After that, the reaction was quenched with Sat. NaCl solution (5 mL) and extracted with DCM (15 mL × 2) . The combined organic layers were dried over Na2SO4, the solution was concentrated in vacuo and purified by flash chromatography (silica gel, 3～5%methanol in methylene chloride) to afford the desired product I-19 (48 mg, 72%) .

[0179] 1H NMR (400 MHz CDCl3) : δ 8.75 (s, 1H) , 7.46 (d, J = 8.8 Hz, 2H) , 7.41 (d, J = 8.8 Hz, 2H) , 7.32 (d, J = 8.8 Hz, 2H) , 7.05 (d, J = 8.8 Hz, 2H) , 6.84 (d, J = 8.8 Hz, 2H) , 6.60 (d, J = 8.8 Hz, 2H) , 6.16 (t, J = 5.6 Hz, 1H) , 4.65 (m, 1H) , 4.08 (t, J = 4.8 Hz, 2H) , 3.81 (t, J = 4.8 Hz, 2H) , 3.77-3.58 (m, 17H) , 3.52 (m, 3H) , 3.44 (m, 2H) , 2.67 (s, 3H) , 2.53 (t, J = 7.6 Hz, 2H) , 2.40 (s, 3H) , 2.17 (t, J = 7.6 Hz, 2H) , 1.90 (qui, J = 7.6 Hz, 2H) , 1.67 (s, 3H) .

[0180] Example S20: Synthesis of (S) -4- (4- (bis (2-chloroethyl) amino) phenyl) -N- (5- (4- (2- (4- (4-chlorophenyl) -2, 3, 9-trimethyl-6H-thieno [3, 2-f] [1, 2, 4] triazolo [4, 3-a] [1, 4] diazepin-6-yl) acetamido) phenoxy) pentyl) butanamide (Compound I-20)

[0181] Step 1: Synthesis of tert-butyl (5- (4-nitrophenoxy) pentyl) carbamate (Compound 40) . To a solution of tert-butyl (5-bromopentyl) carbamate 39 (245 mg, 0.92 mmol) in DMF (3 mL) was added 4-nitrophenol 36 (107 mg, 0.767 mmol) and K2CO3 (212 mg, 1.535 mmol) under argon atmosphere. The reaction mixture was stirred at 80 ℃ for 24 h. After that, the reaction was quenched with Sat. NaCl solution (8 mL) and extracted with EtOAc (20 mL × 2) . The combined organic layers were dried over Na2SO4, the solution was concentrated in vacuo and purified by flash chromatography (silica gel, 2%methanol in methylene chloride) to afford the desired product 40 (249 mg, Quant. ) .

[0182] 1H NMR (400 MHz CDCl3) : δ 8.16 (d, J = 9.2 Hz, 2H) , 6.98 (d, J = 9.2 Hz, 2H) , 4.09 (t, J = 4.8 Hz, 2H) , 3.18 (t, J = 4.8 Hz, 2H) , 1.50 (m, 4H) , 1.44 (s, 9H) , 1.34 (m, 2H) .

[0183] Step 2: Synthesis of 4- (4- (bis (2-chloroethyl) amino) phenyl) -N- (5- (4-nitrophen oxy) pentyl) butanamide (Compound 41) . To a solution of Compound 40 (112 mg, 0.345 mmol) in DCM (4 mL) was added TFA (1 mL) under argon atmosphere. The reaction mixture was stirred at room temperature for 2 h. After that, the solutions were removed in vacuo. The residues were dissolved in i-PrOH / CHCl3 = 1: 3 (30 mL) and washed with Sat. NaHCO3 (8 mL) . The organic layer was collected and dried over Na2SO4, and the solvent was removed in vacuo to afford the desired product without further purification. The above residue was dissolved in DCM (5 mL) , chlorambucil (70 mg, 0.23 mmol) , HOBt (47 mg, 0.345 mmol) , EDCI (79 mg, 0.414 mmol) , and DIPEA (120 μL, 0.69 mmol) were added to the solution under argon atmosphere. The reaction mixture was stirred at room temperature for 12 h. After that, the reaction was quenched with Sat. NaCl solution (8 mL) and extracted with DCM (20 mL ×2) . The combined organic layers were dried over Na2SO4, the solution was concentrated in vacuo and purified by flash chromatography (silica gel, 3%methanol in methylene chloride) to afford the desired product 41 (117 mg, Quant. ) .

[0184] 1H NMR (400 MHz CDCl3) : δ 8.17 (d, J = 9.2 Hz, 2H) , 7.05 (d, J = 8.8 Hz, 2H) , 6.98 (d, J = 9.2 Hz, 2H) , 6.61 (d, J = 8.8 Hz, 2H) , 4.10 (t, J = 4.8 Hz, 2H) , 3.73-3.59 (m, 8H) , 3.16 (t, J = 4.8 Hz, 2H) , 2.54 (t, J = 7.6 Hz, 2H) , 2.17 (t, J = 7.6 Hz, 2H) , 1.91 (qui, J = 7.6 Hz, 2H) , 1.50 (m, 4H) , 1.44 (s, 9H) , 1.34 (m, 2H) .

[0185] Step 3: Synthesis of (S) -4- (4- (bis (2-chloroethyl) amino) phenyl) -N- (5- (4- (2- (4- (4-chlorophenyl) -2, 3, 9-trimethyl-6H-thieno [3, 2-f] [1, 2, 4] triazolo [4, 3-a] [1, 4] diazepin-6-yl) acet amido) phenoxy) pentyl) butanamide (Compound I-20) . To a solution of Compound 41 (137 mg, 0.268 mmol) in MeOH (5 mL) was added 10%Pd / C (55%wet, 30 mg) under argon atmosphere. Changed with H2 and the reaction mixture was stirred at room temperature for 20 h under H2 atmosphere. After that, Pd / C was removed through filtration and washed with MeOH. The filtrate was collected and dried in vacuo to afford the desired product without further purification. The above residue (66.5 mg, 0.138 mmol) was dissolved in DCM (4 mL) , (+) -JQ-1 carboxylic acid (37 mg, 0.092 mmol) , HOBt (19 mg, 0.138 mmol) , EDCI (32 mg, 0.166 mmol) , and DIPEA (48 μL, 0.276 mmol) were added to the solution under argon atmosphere. The reaction mixture was stirred at room temperature for 12 h. After that, the reaction was quenched with Sat. NaCl solution (5 mL) and extracted with DCM (15 mL × 2) . The combined organic layers were dried over Na2SO4, the solution was concentrated in vacuo and purified by flash chromatography (silica gel, 3～4%methanol in methylene chloride) to afford the desired product I-20 (56 mg, 71%) .

[0186] 1H NMR (400 MHz CDCl3) : δ 7.44 (d, J = 8.8 Hz, 2H) , 7.39 (d, J = 8.8 Hz, 2H) , 7.31 (d, J = 8.8 Hz, 2H) , 7.06 (d, J = 8.8 Hz, 2H) , 6.86 (d, J = 8.8 Hz, 2H) , 6.59 (d, J = 8.8 Hz, 2H) , 4.64 (m, 1H) , 4.09 (t, J = 4.8 Hz, 2H) , 3.70-3.56 (m, 9H) , 3.42 (m, 1H) , 3.18 (t, J = 4.8 Hz, 2H) , 2.66 (s, 3H) , 2.52 (t, J = 7.6 Hz, 2H) , 2.41 (s, 3H) , 2.17 (t, J = 7.6 Hz, 2H) , 1.91 (qui, J = 7.6 Hz, 2H) , 1.67 (s, 3H) , 1.51 (m, 4H) , 1.33 (m, 2H) .

[0187] Example S21: Synthesis of (S) -4- (4- (bis (2-chloroethyl) amino) phenyl) -N- (2- (2- (4- (2- (4- (4-chlorophenyl) -2, 3, 9-trimethyl-6H-thieno [3, 2-f] [1, 2, 4] triazolo [4, 3-a] [1, 4] diazepin-6-yl) acetamido) phenoxy) ethoxy) ethyl) butanamide (Compound I-21)

[0188] Step 1: Synthesis of tert-butyl (2- (2- (4-nitrophenoxy) ethoxy) ethyl) carbamate (Compound 43) . To a solution of tert-butyl (2- (2-bromoethoxy) ethyl) carbamate 42 (247 mg, 0.92 mmol) in DMF (3 mL) was added 4-nitrophenol 36 (107 mg, 0.767 mmol) and K2CO3 (212 mg, 1.535 mmol) under argon atmosphere. The reaction mixture was stirred at 80 ℃ for 24 h. After that, the reaction was quenched with Sat. NaCl solution (8 mL) and extracted with EtOAc (20 mL × 2) . The combined organic layers were dried over Na2SO4, the solution was concentrated in vacuo and purified by flash chromatography (silica gel, 2%methanol in methylene chloride) to afford the desired product 43 (250 mg, Quant. ) .

[0189] 1H NMR (400 MHz CDCl3) : δ 8.18 (d, J = 9.2 Hz, 2H) , 6.98 (d, J = 9.2 Hz, 2H) , 4.24 (t, J = 7.2 Hz, 2H) , 3.75 (t, J = 7.2 Hz, 2H) , 3.66 (t, J = 7.2 Hz, 2H) , 3.18 (t, J = 7.2 Hz, 2H) , 1.41 (s, 9H) .

[0190] Step 2: Synthesis of 4- (4- (bis (2-chloroethyl) amino) phenyl) -N- (2- (2- (4-nitro phenoxy) ethoxy) ethyl) butanamide (Compound 44) . To a solution of Compound 43 (119 mg, 0.365 mmol) in DCM (4 mL) was added TFA (1 mL) under argon atmosphere. The reaction mixture was stirred at room temperature for 2 h. After that, the solutions were removed in vacuo. The residues were dissolved in i-PrOH / CHCl3 = 1: 3 (30 mL) and washed with Sat. NaHCO3 (8 mL) . The organic layer was collected and dried over Na2SO4, and the solvent was removed in vacuo to afford the desired product without further purification. The above residue was dissolved in DCM (5 mL) , chlorambucil (74 mg, 0.243 mmol) , HOBt (50 mg, 0.365 mmol) , EDCI (84 mg, 0.438 mmol) , and DIPEA (127 μL, 0.729 mmol) were added to the solution under argon atmosphere. The reaction mixture was stirred at room temperature for 12 h. After that, the reaction was quenched with Sat. NaCl solution (8 mL) and extracted with DCM (20 mL × 2) . The combined organic layers were dried over Na2SO4, the solution was concentrated in vacuo and purified by flash chromatography (silica gel, 3%methanol in methylene chloride) to afford the desired product 44 (124 mg, Quant. ) .

[0191] 1H NMR (400 MHz CDCl3) : δ 8.19 (d, J = 9.2 Hz, 2H) , 7.03 (d, J = 8.8 Hz, 2H) , 6.99 (d, J = 9.2 Hz, 2H) , 6.64 (d, J = 8.8 Hz, 2H) , 4.20 (t, J = 4.8 Hz, 2H) , 3.75-3.65 (m, 12H) , 3.18 (t, J = 7.2 Hz, 2H) , 2.55 (t, J = 7.6 Hz, 2H) , 2.16 (t, J = 7.6 Hz, 2H) , 1.90 (qui, J = 7.6 Hz, 2H) .

[0192] Step 3: Synthesis of (S) -4- (4- (bis (2-chloroethyl) amino) phenyl) -N- (2- (2- (4- (2- (4- (4-chlorophenyl) -2, 3, 9-trimethyl-6H-thieno [3, 2-f] [1, 2, 4] triazolo [4, 3-a] [1, 4] diazepin-6-yl) acetamido) phenoxy) ethoxy) ethyl) butanamide (Compound I-21) . To a solution of Compound 44 (132 mg, 0.258 mmol) in MeOH (5 mL) was added 10%Pd / C (55%wet, 30 mg) under argon atmosphere. Changed with H2 and the reaction mixture was stirred at room temperature for 20 h under H2 atmosphere. After that, Pd / C was removed through filtration and washed with MeOH. The filtrate was collected and dried in vacuo to afford the desired product without further purification. The above residue (66.5 mg, 0.138 mmol) was dissolved in DCM (4 mL) , (+) -JQ-1 carboxylic acid (37 mg, 0.092 mmol) , HOBt (19 mg, 0.138 mmol) , EDCI (32 mg, 0.166 mmol) , and DIPEA (48 μL, 0.276 mmol) were added to the solution under argon atmosphere. The reaction mixture was stirred at room temperature for 12 h. After that, the reaction was quenched with Sat. NaCl solution (5 mL) and extracted with DCM (15 mL ×2) . The combined organic layers were dried over Na2SO4, the solution was concentrated in vacuo and purified by flash chromatography (silica gel, 3～4%methanol in methylene chloride) to afford the desired product I-21 (70.8 mg, 89%) .

[0193] 1H NMR (400 MHz CDCl3) : δ 7.48 (d, J = 8.8 Hz, 2H) , 7.40 (d, J = 8.8 Hz, 2H) , 7.33 (d, J = 8.8 Hz, 2H) , 7.03 (d, J = 8.8 Hz, 2H) , 6.82 (d, J = 8.8 Hz, 2H) , 6.59 (d, J = 8.8 Hz, 2H) , 4.66 (m, 1H) , 4.10 (t, J = 7.2 Hz, 2H) , 3.75-3.54 (m, 13H) , 3.42 (m, 1H) , 3.18 (t, J = 7.2 Hz, 2H) , 2.66 (s, 3H) , 2.52 (t, J = 7.6 Hz, 2H) , 2.41 (s, 3H) , 2.16 (t, J = 7.6 Hz, 2H) , 1.91 (qui, J = 7.6 Hz, 2H) , 1.67 (s, 3H) .

[0194] Example S22: Synthesis of (S) -N- (2- (2- (2- (4- (4-chlorophenyl) -2, 3, 9-trimethyl-6H-thieno [3, 2-f] [1, 2, 4] triazolo [4, 3-a] [1, 4] diazepin-6-yl) acetamido) ethoxy) ethyl) -4- (4- (dipropylamino) phenyl) butanamide (Compound I-22)

[0195] Step 1: Synthesis of tert-butyl (2- (2- (4- (4- (dipropylamino) phenyl) butanamido) ethoxy) ethyl) carbamate (Compound 45) . To a solution of Compound I-3 (57.3 mg, 0.218 mmol) in DCM (4 mL) was added tert-butyl (2- (2-aminoethoxy) ethyl) carbamate 21 (58 mg, 0.284 mmol) , HOBt (39 mg, 0.284 mmol) , EDCI (67 mg, 0.349 mmol) , and DIPEA (116 μL, 0.654 mmol) under argon atmosphere. The reaction mixture was stirred at room temperature for 24 h. After that, the reaction was quenched with Sat. NaCl solution (5 mL) and extracted with DCM (15 mL × 2) . The combined organic layers were dried over Na2SO4, the solution was concentrated in vacuo and purified by flash chromatography (silica gel, 3%methanol in methylene chloride) to afford the desired product 45 (97 mg, Quant. ) .

[0196] 1H NMR (400 MHz CDCl3) : δ 7.02 (d, J = 8.4 Hz, 2H) , 6.59 (d, J = 8.4 Hz, 2H) , 3.71-3.20 (m, 12H) , 2.52 (t, J = 7.6 Hz, 2H) , 2.27 (t, J = 7.6 Hz, 2H) , 1.92 (qui, J = 7.6 Hz, 2H) , 1.59 (m, 4H) , 1.45 (s, 9H) , 0.92 (t, J = 7.6 Hz, 6H) .

[0197] Step 2: Synthesis of (S) -N- (2- (2- (2- (4- (4-chlorophenyl) -2, 3, 9-trimethyl-6H-thieno [3, 2-f] [1, 2, 4] triazolo [4, 3-a] [1, 4] diazepin-6-yl) acetamido) ethoxy) ethyl) -4- (4-(dipropylamino) phenyl) butanamide (Compound I-22) . To a solution of Compound 45 (43 mg, 0.096 mmol) in DCM (2 mL) was added TFA (0.5 mL) under argon atmosphere. The reaction mixture was stirred at room temperature for 2 h. After that, the solutions were removed in vacuo. The residues were dissolved in i-PrOH / CHCl3 = 1: 3 (20 mL) and washed with Sat. NaHCO3 (10 mL) . The organic layer was collected and dried over Na2SO4, and the solvent was removed in vacuo to afford the desired product without further purification. The above residue was dissolved in DCM (4 mL) , (+) -JQ-1 carboxylic acid (27.4 mg, 0.0686 mmol) , HOBt (13 mg, 0.089 mmol) , EDCI (21 mg, 0.110 mmol) , and DIPEA (36 μL, 0.206 mmol) were added to the solution under argon atmosphere. The reaction mixture was stirred at room temperature for 12 h. After that, the reaction was quenched with Sat. NaCl solution (5 mL) and extracted with DCM (15 mL × 2) . The combined organic layers were dried over Na2SO4, the solution was concentrated in vacuo and purified by flash chromatography (silica gel, 3～5%methanol in methylene chloride) to afford the desired product I-22 (45.7 mg, 92%) .

[0198] 1H NMR (400 MHz CDCl3) : δ 7.43 (d, J = 8.4 Hz, 2H) , 7.34 (d, J = 8.4 Hz, 2H) , 7.21 (t, J = 5.6 Hz, 1H) , 7.13 (t, J = 6.0 Hz, 1H) , 7.01 (d, J = 8.4 Hz, 2H) , 6.59 (d, J = 8.4 Hz, 2H) , 4.55 (q, J = 4.8 Hz, 1H) , 3.69-3.21 (m, 14H) , 2.65 (s, 3H) , 2.52 (t, J = 7.6 Hz, 2H) , 2.41 (s, 3H) , 2.27 (t, J = 7.6 Hz, 2H) , 1.92 (qui, J = 7.6 Hz, 2H) , 1.68 (s, 3H) , 1.59 (m, 4H) , 0.92 (t, J = 7.6 Hz, 6H) .

[0199] Example S23: Synthesis of (S) -4- (4- ( (2-chloroethyl) (propyl) amino) phenyl) -N- (2- (2- (2- (4- (4-chlorophenyl) -2, 3, 9-trimethyl-6H-thieno [3, 2-f] [1, 2, 4] triazolo [4, 3-a] [1, 4] diazepin-6-yl) acetamido) ethoxy) ethyl) butanamide (Compound I-23)

[0200] Step 1: Synthesis of tert-butyl (2- (2- (4- (4- ( (2-chloroethyl) (propyl) amino) phenyl) butanamido) ethoxy) ethyl) carbamate (Compound 46) . To a solution of Compound 33 (59.8 mg, 0.211 mmol) in DCM (4 mL) was added tert-butyl (2- (2-aminoethoxy) ethyl) carbamate 1 (58 mg, 0.274 mmol) , HOBt (39 mg, 0.284 mmol) , EDCI (67 mg, 0.349 mmol) , and DIPEA (116 μL, 0.654 mmol) under argon atmosphere. The reaction mixture was stirred at room temperature for 24 h. After that, the reaction was quenched with Sat. NaCl solution (5 mL) and extracted with DCM (15 mL × 2) . The combined organic layers were dried over Na2SO4, the solution was concentrated in vacuo and purified by flash chromatography (silica gel, 3%methanol in methylene chloride) to afford the desired product 46 (86 mg, 87%) .

[0201] 1H NMR (400 MHz CDCl3) : δ 7.04 (d, J = 8.4 Hz, 2H) , 6.60 (d, J = 8.4 Hz, 2H) , 5.89 (brs, 1H) , 4.84 (brs, 1H) , 3.59 (m, 4H) , 3.51 (m, 4H) , 3.44 (m, 2H) , 3.31 (m, 2H) , 3.25 (t, J = 7.6 Hz, 2H) , 2.55 (t, J = 7.6 Hz, 2H) , 2.20 (t, J = 7.6 Hz, 2H) , 1.92 (qui, J = 7.6 Hz, 2H) , 1.60 (m, 2H) , 1.45 (s, 9H) , 0.92 (t, J = 7.6 Hz, 3H) .

[0202] Step 2: Synthesis of (S) -4- (4- ( (2-chloroethyl) (propyl) amino) phenyl) -N- (2- (2- (2- (4- (4-chlorophenyl) -2, 3, 9-trimethyl-6H-thieno [3, 2-f] [1, 2, 4] triazolo [4, 3-a] [1, 4] diazepin-6-yl) acetamido) ethoxy) ethyl) butan amide (Compound I-23) . To a solution of Compound 46 (52 mg, 0.11 mmol) in DCM (2 mL) was added TFA (0.5 mL) under argon atmosphere. The reaction mixture was stirred at room temperature for 2 h. After that, the solutions were removed in vacuo. The residues were dissolved in i-PrOH / CHCl3 = 1: 3 (20 mL) and washed with Sat. NaHCO3 (10 mL) . The organic layer was collected and dried over Na2SO4, and the solvent was removed in vacuo to afford the desired product without further purification. The above residue was dissolved in DCM (4 mL) , (+) -JQ-1 carboxylic acid (31.4 mg, 0.0786 mmol) , HOBt (14 mg, 0.102 mmol) , EDCI (25 mg, 0.126 mmol) , and DIPEA (41 μL, 0.236 mmol) were added to the solution under argon atmosphere. The reaction mixture was stirred at room temperature for 12 h. After that, the reaction was quenched with Sat. NaCl solution (5 mL) and extracted with DCM (15 mL × 2) . The combined organic layers were dried over Na2SO4, the solution was concentrated in vacuo and purified by flash chromatography (silica gel, 3～6%methanol in methylene chloride) to afford the desired product I-23 (59 mg, Quant. ) .

[0203] 1H NMR (400 MHz CDCl3) : δ 7.43 (d, J = 8.4 Hz, 2H) , 7.33 (d, J = 8.4 Hz, 2H) , 7.19 (t, J = 5.6 Hz, 1H) , 7.06 (t, J = 6.0 Hz, 1H) , 6.98 (d, J = 8.4 Hz, 2H) , 6.54 (d, J = 8.4 Hz, 2H) , 4.54 (q, J = 4.8 Hz, 1H) , 3.69-3.15 (m, 16H) , 2.64 (s, 3H) , 2.50 (t, J = 7.6 Hz, 2H) , 2.41 (s, 3H) , 2.27 (t, J = 7.6 Hz, 2H) , 1.92 (qui, J = 7.6 Hz, 2H) , 1.68 (s, 3H) , 1.57 (m, 2H) , 0.90 (t, J = 7.6 Hz, 3H) .

[0204] Example S24: Synthesis of (S) -4- (4- (bis (2-chloroethyl) amino) phenyl) -N- (4- (2- (2- (2- (4- (4-chlorophenyl) -2, 3, 9-trimethyl-6H-thieno [3, 2-f] [1, 2, 4] triazolo [4, 3-a] [1, 4] diazepin-6-yl) acetamido) ethoxy) ethoxy) phenyl) butanamide (Compound I-24)

[0205] Step 1: Synthesis of tert-butyl (2- (2- (4- (4- (4- (bis (2-chloroethyl) amino) phenyl) butan amido) phenoxy) ethoxy) ethyl) carbamate (Compound 47) . To a solution of Compound 43 (137 mg, 0.42 mmol) in MeOH (4 mL) was added 10%Pd / C (55%wet, 30 mg) under argon atmosphere. Changed with H2 and the reaction mixture was stirred at room temperature for 20 h under H2 atmosphere. After that, Pd / C was removed through filtration and washed with MeOH. The filtrate was collected and dried in vacuo to afford the desired product without further purification. The above residue was dissolved in DCM (5 mL) , chlorambucil (140 mg, 0.46 mmol) , HOBt (74 mg, 0.54 mmol) , EDCI (129 mg, 0.67 mmol) , and DIPEA (220 μL, 1.26 mmol) were added to the solution under argon atmosphere. The reaction mixture was stirred at room temperature for 12 h. After that, the reaction was quenched with Sat. NaCl solution (10 mL) and extracted with DCM (30 mL × 2) . The combined organic layers were dried over Na2SO4, the solution was concentrated in vacuo and purified by flash chromatography (silica gel, 3～4%methanol in methylene chloride) to afford the desired product 47 (175 mg, 72%) .

[0206] 1H NMR (400 MHz CDCl3) : δ 7.38 (d, J = 8.4 Hz, 2H) , 7.18 (brs, 1H) , 7.08 (d, J = 8.4 Hz, 2H) , 6.86 (d, J = 8.4 Hz, 2H) , 6.62 (d, J = 8.4 Hz, 2H) , 5.00 (brs, 1H) , 4.08 (t, J = 7.6 Hz, 2H) , 3.79 (t, J = 7.6 Hz, 2H) , 3.69 (m, 4H) , 3.61 (m, 6H) , 3.33 (m, 2H) , 2.61 (t, J = 7.6 Hz, 2H) , 2.32 (t, J = 7.6 Hz, 2H) , 2.00 (qui, J = 7.6 Hz, 2H) , 1.44 (s, 9H) .

[0207] Step 2: Synthesis of (S) -4- (4- (bis (2-chloroethyl) amino) phenyl) -N- (4- (2- (2- (2- (4- (4-chlorophenyl) -2, 3, 9-trimethyl-6H-thieno [3, 2-f] [1, 2, 4] triazolo [4, 3-a] [1, 4] diazepin-6-yl) acetamido) ethoxy) ethoxy) phenyl) butanamide (Compound I-24) . To a solution of Compound 47 (54.5 mg, 0.093 mmol) in DCM (2 mL) was added TFA (0.5 mL) under argon atmosphere. The reaction mixture was stirred at room temperature for 2 h. After that, the solutions were removed in vacuo. The residues were dissolved in i-PrOH / CHCl3 = 1: 3 (20 mL) and washed with Sat. NaHCO3 (10 mL) . The organic layer was collected and dried over Na2SO4, and the solvent was removed in vacuo to afford the desired product without further purification. The above residue was dissolved in DCM (4 mL) , (+) -JQ-1 carboxylic acid (27 mg, 0.066 mmol) , HOBt (12 mg, 0.086 mmol) , EDCI (21 mg, 0.106 mmol) , and DIPEA (35 μL, 0.2 mmol) were added to the solution under argon atmosphere. The reaction mixture was stirred at room temperature for 12 h. After that, the reaction was quenched with Sat. NaCl solution (5 mL) and extracted with DCM (15 mL × 2) . The combined organic layers were dried over Na2SO4, the solution was concentrated in vacuo and purified by flash chromatography (silica gel, 3～4%methanol in methylene chloride) to afford the desired product I-24 (53 mg, 91%) .

[0208] 1H NMR (400 MHz CDCl3) : δ 7.44 (d, J = 8.4 Hz, 2H) , 7.38 (d, J = 8.4 Hz, 2H) , 7.33 (d, J = 8.4 Hz, 2H) , 7.06 (d, J = 8.4 Hz, 2H) , 6.88 (d, J = 8.4 Hz, 2H) , 6.62 (d, J = 8.4 Hz, 2H) , 4.55 (q, J = 4.8 Hz, 1H) , 4.08 (t, J = 7.6 Hz, 2H) , 3.79 (t, J = 7.6 Hz, 2H) , 3.69-3.21 (m, 14H) , 2.62 (t, J = 7.6 Hz, 2H) , 2.32 (t, J = 7.6 Hz, 2H) , 2.01 (qui, J = 7.6 Hz, 2H) .

[0209] Example S25: Synthesis of (R) -N- (9- (3- (4-amino-3- (4-phenoxyphenyl) -1H-pyrazolo [3, 4-d] pyrimidin-1-yl) piperidin-1-yl) -9-oxononyl) -4- (4- (bis (2-chloroethyl) amino) phenyl) butanamide (I-25) .

[0210] Step 1: Synthesis of tert-butyl 9- (4- (4- (bis (2-chloroethyl) amino) phenyl) butanamido) nonanoate (Compound 49) . To a solution of chlorambucil (132 mg, 0.43 mmol) in DCM (3 mL) was added tert-butyl 9-aminononanoate 48 (100 mg, 0.43 mmol) , HOBt (77 mg, 0.57 mmol) , EDCI (109 mg, 0.57 mmol) , and DIPEA (100 μL, 0.57 mmol) under argon atmosphere. The reaction mixture was stirred at room temperature for 24 h. After that, the reaction was quenched with Sat. NaCl solution (5 mL) and extracted with DCM (15 mL × 2) . The combined organic layers were dried over Na2SO4, the solution was concentrated in vacuo and purified by flash chromatography (silica gel, 50%EtOAc in petrol ether) to afford the desired product 49 (160 mg, 71%) .

[0211] 1H NMR (400 MHz CDCl3) : δ 7.07 (d, J = 8.8 Hz, 2H) , 6.63 (d, J = 8.8 Hz, 2H) , 3.69 (m, 4H) , 3.61 (m, 4H) , 3.21 (q, J = 7.6 Hz, 2H) , 2.54 (t, J = 7.6 Hz, 2H) , 2.16 (m, 4H) , 1.91 (qui, J = 7.6 Hz, 2H) , 1.55 (m, 2H) , 1.42 (s, 9H) , 1.27 (m, 10H) .

[0212] Step 2: Synthesis of (R) -N- (9- (3- (4-amino-3- (4-phenoxyphenyl) -1H-pyrazolo [3, 4-d] pyrimidin-1-yl) piperidin-1-yl) -9-oxononyl) -4- (4- (bis (2-chloroethyl) amino) phenyl) butanamide (I-25) . To a solution of Compound 49 (100 mg, 0.19 mmol) in DCM (4 mL) was added TFA (2 mL) under argon atmosphere. The reaction mixture was stirred at room temperature for 2 h. After that, the solutions were removed in vacuo. The residues were dissolved in i-PrOH / CHCl3 = 1: 3 (20 mL) and washed with Sat. NaHCO3 (10 mL) . The organic layer was collected and dried over Na2SO4, and the solvent was removed in vacuo to afford the desired product without further purification. The above residue (25 mg, 0.055 mmol) was dissolved in DCM (2 mL) , IBT6A (24 mg, 0.060 mmol) , HOBt (9.5 mg, 0.07 mmol) , EDCI (14 mg, 0.07 mmol) , and DIPEA (20 μL, 0.11 mmol) were added to the solution under argon atmosphere. The reaction mixture was stirred at room temperature for 12 h. After that, the reaction was quenched with Sat. NaCl solution (5 mL) and extracted with DCM (15 mL × 2) . The combined organic layers were dried over Na2SO4, the solution was concentrated in vacuo and purified by prep-TLC (DCM / MeOH = 10: 1) to afford the desired product I-25 (18 mg, 40%) .

[0213] 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.33 (d, J = 12.0 Hz, 1H) , 7.62 (dd, J = 8.4, 6.2 Hz, 2H) , 7.38 (t, J = 7.2 Hz, 2H) , 7.19–7.11 (m, 3H) , 7.05 (dd, J = 10.9, 8.6 Hz, 4H) , 6.59 (d, J = 8.5 Hz, 2H) , 5.50 (s, 1H) , 4.93–4.72 (m, 1H) , 4.66–4.46 (m, 0.5H) , 4.10–3.80 (m, 1H) , 3.67 (t, J = 6.9 Hz, 4H) , 3.59 (t, J = 6.9 Hz, 4H) , 3.34–3.05 (m, 3H) , 2.74 (t, J = 12.6 Hz, 0.5H) , 2.52 (t, J = 7.5 Hz, 2H) , 2.41–2.30 (m, 2H) , 2.29–2.18 (m, 2H) , 2.14 (t, J = 7.0 Hz, 2H) , 2.0 –1.83 (m, 3H) , 1.74–1.64 (m, 1H) , 1.50–1.39 (m, 2H) , 1.35–1.25 (m, 10H) .

[0214] Example S26: Synthesis of (R) -1- (4- (3- (3- (4-amino-3- (4-phenoxyphenyl) -1H-pyrazolo [3, 4-d] pyrimidin-1-yl) piperidin-1-yl) -3-oxopropyl) piperazin-1-yl) -4- (4- (bis (2-chloroethyl) amino) phenyl) butan-1-one hydrochloride (I-26) .

[0215] Step 1: Synthesis of tert-butyl (R) -4- (3- (3- (4-amino-3- (4-phenoxyphenyl) -1H-pyrazolo [3, 4-d] pyrimidin-1-yl) piperidin-1-yl) -3-oxo propyl) piperazine-1-carboxylate (Compound 51) . To a solution of IBT6A (77.2 mg, 0.2 mmol) in DCM (3 mL) was added 3- (4- (tert-butoxycarbonyl) piperazin-1-yl) propanoic acid 50 (51.6 mg, 0.2 mmol) , HOBt (35 mg, 0.26 mmol) , EDCI (50 mg, 0.26 mmol) , and DIPEA (46 μL, 0.26 mmol) under argon atmosphere. The reaction mixture was stirred at room temperature for 24 h. After that, the reaction was quenched with Sat. NaCl solution (5 mL) and extracted with DCM (15 mL × 2) . The combined organic layers were dried over Na2SO4, the solution was concentrated in vacuo and purified by flash chromatography (silica gel, 10%methanol in methylene chloride) to afford the desired product 51 (100 mg, 79%) .

[0216] 1H NMR (400 MHz CDCl3) : δ 8.37 (s, 1H) , 7.64 (d, J = 7.2 Hz, 2H) , 7.40 (m, 2H) , 7.16 (m, 3H) , 7.09 (m, 2H) , 4.75 (m, 1H) , 4.50 (m, 1H) , 4.06 (m, 1H) , 3.88 (m, 1H) , 3.68 (m, 1H) , 3.58 (m, 2H) , 3.03 (m, 4H) , 2.58 (m, 2H) , 2.42 (m, 4H) , 2.18 (m, 1H) , 1.84 (m, 1H) , 1.65 (m, 2H) , 1.45 (s, 9H) .

[0217] Step 2: Synthesis of (R) -1- (4- (3- (3- (4-amino-3- (4-phenoxyphenyl) -1H-pyrazolo [3, 4-d]pyrimidin-1-yl) piperidin-1-yl) -3-oxopropyl) piperazin-1-yl) -4- (4- (bis (2-chloroethyl) amino) phenyl) butan-1-one hydrochloride (I-26) . To a solution of Compound 51 (90 mg, 0.14 mmol) in DCM (4 mL) was added TFA (2 mL) under argon atmosphere. The reaction mixture was stirred at room temperature for 2 h. After that, the solutions were removed in vacuo. The residues were dissolved in i-PrOH / CHCl3 = 1: 3 (20 mL) and washed with Sat. NaHCO3 (10 mL) . The organic layer was collected and dried over Na2SO4, and the solvent was removed in vacuo to afford the desired product without further purification. The above residue (60 mg, 0.114 mmol) was dissolved in DCM (2 mL) , chlorambucil (35 mg, 0.114 mmol) , HOBt (20 mg, 0.148 mmol) , EDCI (28 mg, 0.148 mmol) , and DIPEA (42 μL, 0.228 mmol) were added to the solution under argon atmosphere. The reaction mixture was stirred at room temperature for 12 h. After that, the reaction was quenched with Sat. NaCl solution (5 mL) and extracted with DCM (15 mL × 2) . The combined organic layers were dried over Na2SO4, the solution was concentrated in vacuo and purified by reversed-phase column (ACN / 0.05%hydrochloric acid in water, 5%to 90%) to afford the desired product I-26 as a white solid (14.8 mg, 15%) .

[0218] 1H NMR (400 MHz, MeOH-d4) δ 8.23 (d, J = 11.0 Hz, 1H) , 7.64 (dd, J = 8.5, 1.6 Hz, 2H) , 7.38 (t, J = 7.9 Hz, 2H) , 7.13 (dd, J = 10.5, 8.0 Hz, 3H) , 7.09–6.97 (m, 4H) , 6.69–6.59 (m, 2H) , 4.84–4.69 (m, 1H) , 4.52 (dd, J = 12.8, 3.7 Hz, 0.5H) , 4.29–3.98 (m, 1H) , 3.90 (d, J = 14.2 Hz, 0.5H) , 3.78 (dd, J = 13.5, 9.4 Hz, 1H) , 3.72–3.57 (m, 10H) , 3.57–3.40 (m, 2H) , 3.16–3.03 (m, 2H) , 3.02–2.73 (m, 6H) , 2.72–2.59 (m, 1H) , 2.57–2.37 (m, 2H) , 2.41–2.25 (m, 3H) , 2.22–2.13 (m, 1H) , 2.0 –1.91 (m, 1H) , 1.89–1.77 (m, 2H) , 1.76–1.61 (m, 1H) .

[0219] Example S27: Synthesis of (R) -N- (2- (2- (2- (3- (4-amino-3- (4-phenoxyphenyl) -1H-pyrazolo [3, 4-d] pyrimidin-1-yl) piperidin-1-yl) ethoxy) ethoxy) ethyl) -4- (4- (bis (2-chloroethyl) amino) phenyl) butan amide (I-27) .

[0220] Step 1: Synthesis of tert-butyl (R) - (2- (2- (2- (3- (4-amino-3- (4-phenoxyphenyl) -1H-pyra zolo [3, 4-d] pyrimidin-1-yl) piperidin-1-yl) eth oxy) ethoxy) ethyl) carbamate (Compound 53) . To a solution of IBT6A (50 mg, 0.13 mmol) in DMF (3 mL) was added tert-butyl (2- (2- (2-iodoethoxy) ethoxy) ethyl) carbamate 52 (56 mg, 0.16 mmol) and triethylamine (55 μL, 0.39 mmol) under argon atmosphere. The reaction mixture was stirred at 80 ℃ for 16 h. After that, the reaction was quenched with Sat. NaCl solution (5 mL) and extracted with EtOAc (15 mL × 2) . The combined organic layers were dried over Na2SO4, the solution was concentrated in vacuo and purified by Pre-TLC (DCM / MeOH = 10: 1) to afford the desired product 53 (70 mg, 87%) .

[0221] 1H NMR (400 MHz CDCl3) : δ 8.39 (s, 1H) , 7.66 (d, J = 7.2 Hz, 2H) , 7.42 (m, 2H) , 7.19 (m, 3H) , 7.07 (m, 2H) , 3.72 (m, 1H) , 3.62 (m, 8H) , 3.01 (m, 3H) , 2.52 (m, 5H) , 2.07 (m, 1H) , 1.81 (m, 2H) , 1.52 (m, 1H) , 1.44 (s, 9H) .

[0222] Step 2: Synthesis of (R) -N- (2- (2- (2- (3- (4-amino-3- (4-phenoxyphenyl) -1H-pyrazolo [3, 4-d] pyrimidin-1-yl) piperidin-1-yl) ethoxy) eth oxy) ethyl) -4- (4- (bis (2-chloroethyl) amino) phenyl) butanamide (I-27) . To a solution of Compound 53 (140 mg, 0.23 mmol) in DCM (4 mL) was added TFA (1.5 mL) under argon atmosphere. The reaction mixture was stirred at room temperature for 2 h. After that, the solutions were removed in vacuo. The residues were dissolved in i-PrOH / CHCl3 = 1: 3 (30 mL) and washed with Sat. NaHCO3 (10 mL) . The organic layer was collected and dried over Na2SO4, and the solvent was removed in vacuo to afford the desired product without further purification. The above residue (40 mg, 0.077 mmol) was dissolved in DCM (3 mL) , chlorambucil (24 mg, 0.077 mmol) , HOBt (13.5 mg, 0.10 mmol) , EDCI (19.2 mg, 0.10 mmol) , and DIPEA (28 μL, 0.154 mmol) were added to the solution under argon atmosphere. The reaction mixture was stirred at room temperature for 12 h. After that, the reaction was quenched with Sat. NaCl solution (5 mL) and extracted with DCM (15 mL × 2) . The combined organic layers were dried over Na2SO4, the solution was concentrated in vacuo and purified by reversed-phase column (ACN / 0.05%hydrochloric acid in water, 5%to 90%) to afford the desired product I-27 (11.1mg, 17%) .

[0223] 1H NMR (400 MHz, MeOH-d4) δ 8.50 (d, J = 10.6 Hz, 1H) , 7.83–7.63 (m, 2H) , 7.43–7.32 (m, 6H) , 7.20–7.12 (m, 3H) , 7.08 (d, J = 8.2 Hz, 2H) , 5.45 (d, J = 32.1 Hz, 1H) , 4.03–3.83 (m, 7H) , 3.77–3.71 (m, 1H) , 3.67–3.56 (m, 8H) , 3.53–3.45 (m, 3H) , 3.41–3.31 (m, 2H) , 3.19 (s, 1H) , 2.69–2.68 (m, 2H) , 2.32–2.15 (m, 5H) , 2.13 (d, J = 1.5 Hz, 2H) , 2.09–1.95 (m, 1H) , 1.93–1.83 (m, 2H) .

[0224] Example S28: Synthesis of (R) -N- (2- (2- (3- (4-amino-3- (4-phenoxyphenyl) -1H-pyrazolo [3, 4-d] pyrimidin-1-yl) piperidin-1-yl) ethoxy) ethyl) -4- (4- (bis (2-chloroethyl) amino) phenyl) butanamide (I-28) .

[0225] Step 1: Synthesis of tert-butyl (R) - (2- (2- (3- (4-bromo-3- (4-phenoxyphenyl) -1H-pyrazolo [3, 4-d] pyrimidin-1-yl) piperidin-1-yl) ethoxy) ethyl) carbamate (Compound 55) . To a solution of IBT6A (38.7 mg, 0.1 mmol) in DMF (2.5 mL) was added tert-butyl (2- (2-bromoethoxy) ethyl) carbamate 54 (41 mg, 0.15 mmol) and triethylamine (35 μL, 0.25 mmol) under argon atmosphere. The reaction mixture was stirred at 120 ℃ for 20 h. After that, the reaction was quenched with Sat. NaCl solution (5 mL) and extracted with EtOAc (15 mL × 2) . The combined organic layers were dried over Na2SO4, the solution was concentrated in vacuo and purified by flash chromatography (silica gel, 3～10%methanol in methylene chloride) to afford the desired product 55 (57 mg, Quant. ) .

[0226] 1H NMR (400 MHz CDCl3) : δ 8.36 (s, 1H) , 7.64 (d, J = 8.8 Hz, 2H) , 7.38 (m, 2H) , 7.15 (m, 3H) , 7.07 (m, 2H) , 3.56 (m, 5H) , 3.08 (m, 3H) , 2.68 (m, 3H) , 2.17 (m, 2H) , 1.91 (m, 2H) , 1.52 (m, 2H) , 1.43 (s, 9H) .

[0227] Step 2: Synthesis of (R) -N- (2- (2- (3- (4-amino-3- (4-phenoxyphenyl) -1H-pyrazolo [3, 4-d] pyrimidin-1-yl) piperidin-1-yl) ethoxy) ethyl) -4- (4- (bis (2-chloroethyl) amino) phenyl) butanamide (I-28) . To a solution of Compound 55 (57 mg, 0.1 mmol) in DCM (2 mL) was added TFA (0.5 mL) under argon atmosphere. The reaction mixture was stirred at room temperature for 2 h. After that, the solutions were removed in vacuo. The residues were dissolved in i-PrOH / CHCl3 = 1: 3 (20 mL) and washed with Sat. NaHCO3 (10 mL) . The organic layer was collected and dried over Na2SO4, and the solvent was removed in vacuo to afford the desired product without further purification. The above residue was dissolved in DCM (4 mL) , chlorambucil (30.4 mg, 0.1 mmol) , HOBt (18 mg, 0.13 mmol) , EDCI (31 mg, 0.16 mmol) , and DIPEA (53 μL, 0.3 mmol) were added to the solution under argon atmosphere. The reaction mixture was stirred at room temperature for 12 h. After that, the reaction was quenched with Sat. NaCl solution (5 mL) and extracted with DCM (15 mL × 2) . The combined organic layers were dried over Na2SO4, the solution was concentrated in vacuo and purified by flash chromatography (silica gel, 3～10%methanol in methylene chloride) to afford the desired product I-28 as a white solid (53 mg, 71%) .

[0228] 1H NMR (400 MHz, MeOH-d4) δ 8.38 (s, 1H) , 7.65 (d, J = 8.8 Hz, 2H) , 7.37 (m, 2H) , 7.16 (m, 3H) , 7.06 (m, 4H) , 6.64 (d, J = 8.4 Hz, 2H) , 3.68 (m, 8H) , 3.52 (m, 5H) , 3.09 (m, 3H) , 2.69 (m, 3H) , 2.56 (t, J = 7.2 Hz, 2H) , 2.17 (m, 4H) , 1.91 (m, 4H) , 1.52 (m, 2H) .

[0229] Example S29: Synthesis of (R) -N- (2- (2- (2- (2- (3- (4-amino-3- (4-phenoxyphenyl) -1H-pyrazolo [3, 4-d] pyrimidin-1-yl) piperidin-1-yl) ethoxy) ethoxy) ethoxy) ethyl) -4- (4- (bis (2-chloroethyl) amino) phenyl) butanamide (I-29) .

[0230] Step 1: Synthesis of tert-butyl (R) - (2- (2- (3- (4-bromo-3- (4-phenoxyphenyl) -1H-pyrazolo [3, 4-d] pyrimidin-1-yl) piperidin-1-yl) ethoxy) ethyl) carbamate (Compound 57) . To a solution of IBT6A (38.7 mg, 0.1 mmol) in DMF (2.5 mL) was added tert-butyl (2- (2-bromoethoxy) ethyl) carbamate 56 (41 mg, 0.15 mmol) and triethylamine (35 μL, 0.25 mmol) under argon atmosphere. The reaction mixture was stirred at 120 ℃ for 20 h. After that, the reaction was quenched with Sat. NaCl solution (5 mL) and extracted with EtOAc (15 mL × 2) . The combined organic layers were dried over Na2SO4, the solution was concentrated in vacuo and purified by flash chromatography (silica gel, 3～10%methanol in methylene chloride) to afford the desired product 57 (66 mg, Quant. ) .

[0231] 1H NMR (400 MHz CDCl3) : δ 8.36 (s, 1H) , 7.64 (d, J = 8.8 Hz, 2H) , 7.38 (m, 2H) , 7.15 (m, 3H) , 7.07 (m, 2H) , 3.56 (m, 13H) , 3.30 (m, 3H) , 2.72 (m, 3H) , 2.18 (m, 2H) , 1.90 (m, 2H) , 1.48 (m, 2H) , 1.43 (s, 9H) .

[0232] Step 2: Synthesis of (R) -N- (2- (2- (2- (2- (3- (4-amino-3- (4-phenoxyphenyl) -1H-pyrazolo [3, 4-d] pyrimidin-1-yl) piperidin-1-yl) ethoxy) ethoxy) ethoxy) ethyl) -4- (4- (bis (2-chloroethyl) amino) phenyl) butanamide (I-29) . To a solution of Compound 57 (66 mg, 0.1 mmol) in DCM (2 mL) was added TFA (0.5 mL) under argon atmosphere. The reaction mixture was stirred at room temperature for 2 h. After that, the solutions were removed in vacuo. The residues were dissolved in i-PrOH / CHCl3 = 1: 3 (20 mL) and washed with Sat. NaHCO3 (10 mL) . The organic layer was collected and dried over Na2SO4, and the solvent was removed in vacuo to afford the desired product without further purification. The above residue was dissolved in DCM (4 mL) , chlorambucil (30.4 mg, 0.1 mmol) , HOBt (18 mg, 0.13 mmol) , EDCI (31 mg, 0.16 mmol) , and DIPEA (53 μL, 0.3 mmol) were added to the solution under argon atmosphere. The reaction mixture was stirred at room temperature for 12 h. After that, the reaction was quenched with Sat. NaCl solution (5 mL) and extracted with DCM (15 mL × 2) . The combined organic layers were dried over Na2SO4, the solution was concentrated in vacuo and purified by flash chromatography (silica gel, 3～10%methanol in methylene chloride) to afford the desired product I-29 (67 mg, 79%) .

[0233] 1H NMR (400 MHz, MeOH-d4) δ 8.37 (s, 1H) , 7.66 (d, J = 8.8 Hz, 2H) , 7.36 (m, 2H) , 7.15 (m, 3H) , 7.06 (m, 4H) , 6.63 (d, J = 8.4 Hz, 2H) , 3.69 (m, 8H) , 3.54 (m, 13H) , 3.27 (m, 3H) , 2.71 (m, 3H) , 2.56 (t, J = 7.2 Hz, 2H) , 2.17 (m, 4H) , 1.90 (m, 4H) , 1.48 (m, 2H) .

[0234] Example S30: Synthesis of N- (4- (4- (6- ( (6-acetyl-8-cyclopentyl-5-methyl-7-oxo-7, 8-dihydropyrido [2, 3-d] pyrimidin-2-yl) amino) pyridin-3-yl) piperazin-1-yl) -4-oxobutyl) -4- (4- (bis (2-chloroethyl) amino) phenyl) butanamide (I-30) .

[0235] Step 1: Synthesis of tert-butyl 4- (4- (4- (bis (2-chloroethyl) amino) phenyl) butanamido) butanoate (Compound 59) . To a solution of chlorambucil (91 mg, 0.3 mmol) in DCM (5 mL) was added tert-butyl 4-aminobutanoate 58 (77 mg, 0.39 mmol) , HOBt (53 mg, 0.39 mmol) , EDCI (92 mg, 0.48 mmol) , and DIPEA (157 μL, 0.9 mmol) under argon atmosphere. The reaction mixture was stirred at room temperature for 24 h. After that, the reaction was quenched with Sat. NaCl solution (5 mL) and extracted with DCM (15 mL × 2) . The combined organic layers were dried over Na2SO4, the solution was concentrated in vacuo and purified by flash chromatography (silica gel, 20～40%EtOAc in petrol ether) to afford the desired product 59 (130 mg, 98%) .

[0236] 1H NMR (400 MHz CDCl3) : δ 7.06 (d, J = 8.4 Hz, 2H) , 6.62 (d, J = 8.8 Hz, 2H) , 5.66 (brs, 1H) , 3.70 (m, 4H) , 3.62 (m, 4H) , 3.27 (q, J = 6.4 Hz, 2H) , 2.55 (t, J = 7.6 Hz, 2H) , 2.27 (t, J = 7.2 Hz, 2H) , 2.16 (t, J = 7.6 Hz, 2H) , 1.91 (qui, J = 7.6 Hz, 2H) , 1.78 (qui, J = 7.2 Hz, 2H) , 1.44 (s, 9H) .

[0237] Step 2: Synthesis of N- (4- (4- (6- ( (6-acetyl-8-cyclopentyl-5-methyl-7-oxo-7, 8-di hydropyrido [2, 3-d] pyrimidin-2-yl) amino) pyri din-3-yl) piperazin-1-yl) -4-oxobutyl) -4- (4- (bis (2-chloroethyl) amino) phenyl) butanamide (I-30) . To a solution of Compound 59 (50 mg, 0.111 mmol) in DCM (2 mL) was added TFA (0.5 mL) under argon atmosphere. The reaction mixture was stirred at room temperature for 2 h. After that, the solutions were removed in vacuo. The residues were dissolved in i-PrOH / CHCl3 = 1: 3 (20 mL) and washed with Sat. NaHCO3 (10 mL) . The organic layer was collected and dried over Na2SO4, and the solvent was removed in vacuo to afford the desired product without further purification. The above residue was dissolved in DCM (4 mL) , Palbociclib (70 mg, 0.156 mmol) , HOBt (20 mg, 0.144 mmol) , EDCI (34 mg, 0.177 mmol) , and DIPEA (58 μL, 0.333 mmol) were added to the solution under argon atmosphere. The reaction mixture was stirred at room temperature for 12 h. After that, the reaction was quenched with Sat. NaCl solution (5 mL) and extracted with DCM (15 mL × 2) . The combined organic layers were dried over Na2SO4, the solution was concentrated in vacuo and purified by flash chromatography (silica gel, 3～5%methanol in methylene chloride) to afford the desired product I-30 (76 mg, 83%) .

[0238] 1H NMR (400 MHz, CDCl3) : δ 8.83 (s, 1H) , 8.31 (brs. 1H) , 8.20 (d, J = 8.8 Hz, 1H) , 8.03 (d, J = 2.8 Hz, 1H) , 7.33 (dd, J = 8.8, 2.8 Hz, 1H) , 7.06 (d, J = 8.0 Hz, 2H) , 6.61 (d, J = 8.4 Hz, 2H) , 6.06 (t, J = 6.0 Hz, 1H) , 5.87 (qui, J = 8.8 Hz, 1H) , 3.79 (t, J = 5.2 Hz, 2H) , 3.65 (m, 10H) , 3.32 (q, J = 6.4 Hz, 2H) , 3.14 (m, 4H) , 2.55 (m, 5H) , 2.45 (t, J = 6.8 Hz, 2H) , 2.35 (m, 5H) , 2.17 (t, J = 7.2 Hz, 2H) , 2.07 (m, 2H) , 1.89 (m, 6H) , 1.70 (m, 2H) .

[0239] Example S31: Synthesis of N- (6- (4- (6- ( (6-acetyl-8-cyclopentyl-5-methyl-7-oxo-7, 8-dihydropyrido [2, 3-d] pyrimidin-2-yl) amino) pyridin-3-yl) piperazin-1-yl) -6-oxohexyl) -4- (4- (bis (2-chloroethyl) amino) phenyl) butanamide (I-31) .

[0240] Step 1: Synthesis of tert-butyl 6- (4- (4- (bis (2-chloroethyl) amino) phenyl) butanamido) hexanoate (Compound 61) . To a solution of chlorambucil (91 mg, 0.3 mmol) in DCM (5 mL) was added tert-butyl 6-aminohexanoate 60 (73 mg, 0.39 mmol) , HOBt (53 mg, 0.39 mmol) , EDCI (92 mg, 0.48 mmol) , and DIPEA (157 μL, 0.9 mmol) under argon atmosphere. The reaction mixture was stirred at room temperature for 24 h. After that, the reaction was quenched with Sat. NaCl solution (5 mL) and extracted with DCM (15 mL × 2) . The combined organic layers were dried over Na2SO4, the solution was concentrated in vacuo and purified by flash chromatography (silica gel, 2～3%methanol in methylene chloride) to afford the desired product 61 (142 mg, Quant. ) .

[0241] 1H NMR (400 MHz CDCl3) : δ 7.07 (d, J = 8.4 Hz, 2H) , 6.63 (d, J = 8.8 Hz, 2H) , 5.46 (brs, 1H) , 3.70 (m, 4H) , 3.62 (m, 4H) , 3.24 (q, J = 6.8 Hz, 2H) , 2.55 (t, J = 7.6 Hz, 2H) , 2.21 (t, J = 7.6 Hz, 2H) , 2.15 (t, J = 7.6 Hz, 2H) , 1.91 (qui, J = 7.6 Hz, 2H) , 1.59 (m, 2H) , 1.50 (m, 2H) , 1.43 (s, 9H) , 1.34 (m, 4H) .

[0242] Step 2: Synthesis of N- (6- (4- (6- ( (6-acetyl-8-cyclopentyl-5-methyl-7-oxo-7, 8-dihydropyrido [2, 3-d] pyrimidin-2-yl) amino) pyridin-3-yl) piperazin-1-yl) -6-oxohexyl) -4- (4- (bis (2-chloroethyl) amino) phenyl) butanamide (I-31) . To a solution of Compound 61 (41 mg, 0.086 mmol) in DCM (2 mL) was added TFA (0.5 mL) under argon atmosphere. The reaction mixture was stirred at room temperature for 2 h. After that, the solutions were removed in vacuo. The residues were dissolved in i-PrOH / CHCl3 = 1: 3 (20 mL) and washed with Sat. NaHCO3 (10 mL) . The organic layer was collected and dried over Na2SO4, and the solvent was removed in vacuo to afford the desired product without further purification. The above residue was dissolved in DCM (4 mL) , Palbociclib (35 mg, 0.078 mmol) , HOBt (13 mg, 0.092 mmol) , EDCI (21 mg, 0.110 mmol) , and DIPEA (32 μL, 0.183 mmol) were added to the solution under argon atmosphere. The reaction mixture was stirred at room temperature for 12 h. After that, the reaction was quenched with Sat. NaCl solution (5 mL) and extracted with DCM (15 mL × 2) . The combined organic layers were dried over Na2SO4, the solution was concentrated in vacuo and purified by flash chromatography (silica gel, 3～4%methanol in methylene chloride) to afford the desired product I-31 (62 mg, 94%) .

[0243] 1H NMR (400 MHz, CDCl3) : δ 8.83 (s, 1H) , 8.34 (brs. 1H) , 8.23 (d, J = 9.2 Hz, 1H) , 8.03 (d, J = 2.8 Hz, 1H) , 7.36 (dd, J = 9.2, 2.8 Hz, 1H) , 7.06 (d, J = 8.8 Hz, 2H) , 6.62 (d, J = 8.8 Hz, 2H) , 5.87 (qui, J = 8.8 Hz, 1H) , 5.61 (t, J = 6.0 Hz, 1H) , 3.80 (t, J = 5.2 Hz, 2H) , 3.65 (m, 10H) , 3.26 (q, J = 6.4 Hz, 2H) , 3.15 (m, 4H) , 2.55 (m, 5H) , 2.36 (m, 7H) , 2.17 (t, J = 7.2 Hz, 2H) , 2.07 (m, 2H) , 1.90 (m, 4H) , 1.69 (m, 4H) , 1.54 (m, 2H) , 1.39 (m, 2H) .

[0244] Example S32: Synthesis of N- (2- (2- (2- (3- (4- (6- ( (6-acetyl-8-cyclopentyl-5-methyl-7-oxo-7, 8-dihydropyrido [2, 3-d] pyrimidin-2-yl) amino) pyridin-3-yl) piperazin-1-yl) -3-oxopropoxy) ethoxy) ethoxy) ethyl) -4- (4- (bis (2-chloroethyl) amino) phenyl) butanamide (I-32) .

[0245] Step 1: Synthesis of tert-butyl 17- (4- (bis (2-chloroethyl) amino) phenyl) -14-oxo-4, 7, 10-trioxa-13-azaheptadecanoate (Compound 63) . To a solution of chlorambucil (91 mg, 0.3 mmol) in DCM (5 mL) was added tert-butyl 3- (2- (2- (2-aminoethoxy) ethoxy) ethoxy) propano

[0246] ate 62 (108 mg, 0.39 mmol) , HOBt (53 mg, 0.39 mmol) , EDCI (92 mg, 0.48 mmol) , and DIPEA (157 μL, 0.9 mmol) under argon atmosphere. The reaction mixture was stirred at room temperature for 24 h. After that, the reaction was quenched with Sat. NaCl solution (5 mL) and extracted with DCM (15 mL × 2) . The combined organic layers were dried over Na2SO4, the solution was concentrated in vacuo and purified by flash chromatography (silica gel, 3%methanol in methylene chloride) to afford the desired product 63 (169 mg, Quant. ) .

[0247] 1H NMR (400 MHz CDCl3) : δ 7.08 (d, J = 8.4 Hz, 2H) , 6.66 (d, J = 8.4 Hz, 2H) , 6.17 (brs, 1H) , 3.70 (m, 6H) , 3.62 (m, 12H) , 3.55 (t, J = 5.2 Hz, 2H) , 3.45 (q, J = 5.2 Hz, 2H) , 2.56 (t, J = 7.6 Hz, 2H) , 2.50 (t, J = 6.8 Hz, 2H) , 2.19 (t, J = 7.6 Hz, 2H) , 1.92 (qui, J = 7.6 Hz, 2H) , 1.44 (s, 9H) .

[0248] Step 2: Synthesis of N- (2- (2- (2- (3- (4- (6- ( (6-acetyl-8-cyclopentyl-5-methyl-7-oxo-7, 8-dihydropyrido [2, 3-d] pyrimidin-2-yl) amin o) pyridin-3-yl) piperazin-1-yl) -3-oxopropoxy) ethoxy) ethoxy) ethyl) -4- (4- (bis (2-chloroethyl) amino) phenyl) butanamide (I-32) . To a solution of Compound 63 (51 mg, 0.09 mmol) in DCM (2 mL) was added TFA (0.5 mL) under argon atmosphere. The reaction mixture was stirred at room temperature for 2 h. After that, the solutions were removed in vacuo. The residues were dissolved in i-PrOH / CHCl3 = 1: 3 (20 mL) and washed with Sat. NaHCO3 (10 mL) . The organic layer was collected and dried over Na2SO4, and the solvent was removed in vacuo to afford the desired product without further purification. The above residue was dissolved in DCM (4 mL) , Palbociclib (37 mg, 0.083 mmol) , HOBt (13 mg, 0.096 mmol) , EDCI (22 mg, 0.115 mmol) , and DIPEA (34 μL, 0.192 mmol) were added to the solution under argon atmosphere. The reaction mixture was stirred at room temperature for 12 h. After that, the reaction was quenched with Sat. NaCl solution (5 mL) and extracted with DCM (15 mL × 2) . The combined organic layers were dried over Na2SO4, the solution was concentrated in vacuo and purified by flash chromatography (silica gel, 3～5%methanol in methylene chloride) to afford the desired product I-32 (69 mg, 89%) .

[0249] 1H NMR (400 MHz, CDCl3) : δ 8.83 (s, 1H) , 8.36 (brs. 1H) , 8.22 (d, J = 8.8 Hz, 1H) , 8.03 (d, J = 2.8 Hz, 1H) , 7.35 (dd, J = 9.2, 2.8 Hz, 1H) , 7.06 (d, J = 8.8 Hz, 2H) , 6.61 (d, J = 8.8 Hz, 2H) , 6.24 (t, J = 5.6 Hz, 1H) , 5.87 (qui, J = 8.8 Hz, 1H) , 3.81 (m, 4H) , 3.68 (m, 6H) , 3.62 (m, 12H) , 3.54 (t, J = 8.8 Hz, 2H) , 3.44 (q, J = 5.2 Hz, 2H) , 3.15 (m, 4H) , 2.68 (t, J = 6.4 Hz, 2H) , 2.54 (m, 5H) , 2.35 (m, 5H) , 2.18 (t, J = 7.6 Hz, 2H) , 2.07 (m, 2H) , 1.90 (m, 4H) , 1.69 (m, 2H) .

[0250] Example S33: Synthesis of N- (2- (2- (2- (4- (6- ( (6-acetyl-8-cyclopentyl-5-methyl-7-oxo-7, 8-dihydropyrido [2, 3-d] pyrimidin-2-yl) amino) pyridin-3-yl) piperazin-1-yl) ethoxy) ethoxy) ethyl) -4- (4- (bis (2-chloroethyl) amino) phenyl) butanamide (I-33) .

[0251] Step 1: Synthesis of tert-butyl (2- (2- (2- (4- (6- ( (6-acetyl-8-cyclopentyl-5-methyl-7-oxo -7, 8-dihydropyrido [2, 3-d] pyrimidin-2-yl) ami no) pyridin-3-yl) piperazin-1-yl) ethoxy) ethoxy) ethyl) carbamate (Compound 65) . To a solution of Palbociclib (44.8 mg, 0.1 mmol) in DMF (2.5 mL) was added tert-butyl (2- (2- (2-iodoethoxy) ethoxy) ethyl) carbamate 64 (47 mg, 0.13 mmol) and DIPEA (52 μL, 0.3 mmol) under argon atmosphere. The reaction mixture was stirred at 80 ℃ for 12 h. After that, the reaction was quenched with Sat. NaCl solution (5 mL) and extracted with EtOAc (15 mL × 2) . The combined organic layers were dried over Na2SO4, the solution was concentrated in vacuo and purified by flash chromatography (silica gel, 3～7%methanol in methylene chloride) to afford the desired product 65 (53 mg, 78%) .

[0252] 1H NMR (600 MHz, CDCl3) : δ 8.80 (s, 1H) , 8.18 (brs, 1H) , 8.04 (s, 1H) , 7.89 (brs, 1H) , 7.35 (s, 1H) , 5.87 (qui, J = 9.0 Hz, 1H) , 3.64 (m, 6H) , 3.55 (t, J = 5.4 Hz, 2H) , 3.27 (m, 6H) , 2.73 (m, 4H) , 2.55 (s, 3H) , 2.35 (m, 5H) , 2.06 (m, 2H) , 1.89 (m, 2H) , 1.70 (m, 2H) , 1.59 (m, 2H) , 1.44 (s, 9H) .

[0253] Step 2: Synthesis of N- (2- (2- (2- (4- (6- ( (6-acetyl-8-cyclopentyl-5-methyl-7-oxo-7, 8-dihydropyrido [2, 3-d] pyrimidin-2-yl) amino) py ridin-3-yl) piperazin-1-yl) ethoxy) ethoxy) ethyl) -4- (4- (bis (2-chloroethyl) amino) phenyl) butan amide (I-33) . To a solution of Compound 65 (58 mg, 0.085 mmol) in DCM (2 mL) was added TFA (0.5 mL) under argon atmosphere. The reaction mixture was stirred at room temperature for 2 h. After that, the solutions were removed in vacuo. The residues were dissolved in i-PrOH / CHCl3 = 1: 3 (20 mL) and washed with Sat. NaHCO3 (10 mL) . The organic layer was collected and dried over Na2SO4, and the solvent was removed in vacuo to afford the desired product without further purification. The above residue was dissolved in DCM (4 mL) , chlorambucil (23 mg, 0.077 mmol) , HOBt (14 mg, 0.1 mmol) , EDCI (24 mg, 0.123 mmol) , and DIPEA (41 μL, 0.231 mmol) were added to the solution under argon atmosphere. The reaction mixture was stirred at room temperature for 12 h. After that, the reaction was quenched with Sat. NaCl solution (5 mL) and extracted with DCM (15 mL × 2) . The combined organic layers were dried over Na2SO4, the solution was concentrated in vacuo and purified by flash chromatography (silica gel, 3～7%methanol in methylene chloride) to afford the desired product I-33 (65 mg, Quant. ) .

[0254] 1H NMR (600 MHz, CDCl3) : δ 8.80 (s, 1H) , 8.17 (d, J = 9.0 Hz, 1H) , 8.02 (d, J = 3.0 Hz, 1H) , 7.33 (dd, J = 9.0, 3.0 Hz, 1H) , 7.06 (d, J = 8.4 Hz, 2H) , 6.60 (d, J = 7.8 Hz, 2H) , 6.12 (brs, 1H) , 5.87 (qui, J = 9.0 Hz, 1H) , 3.63 (m, 14H) , 3.56 (t, J = 5.4 Hz, 2H) , 3.46 (q, J = 5.4 Hz, 2H) , 3.23 (m, 4H) , 2.71 (m, 4H) , 2.54 (m, 5H) , 2.35 (m, 5H) , 2.18 (t, J = 7.8 Hz, 2H) , 2.06 (m, 2H) , 1.90 (m, 4H) , 1.70 (m, 4H) .

[0255] Example S34: Synthesis of 6- ( (5- (4- (4- (bis (2-chloroethyl) amino) phenyl) butanamido) pentyl) amino) -N- ( (1r, 4r) -4- (3-chloro-4-cyanophenoxy) cyclohexyl) pyridazine-3-carboxamide (I-34) .

[0256] Step 1: Synthesis of tert-butyl (5- ( (6- ( ( (1r, 4r) -4- (3-chloro-4-cyanophenoxy) cyclo hexyl) carbamoyl) pyridazin-3-yl) amino) pentyl) carbamate (Compound 67) . To a solution of 6-chloro-N- ( (1r, 4r) -4- (3-chloro-4-cyanophenoxy) cyclohexyl) pyridazine-3-carboxamide 66 (50 mg, 0.128 mmol) in DMF (2.5 mL) was added tert-butyl (5-aminopentyl) carbamate 29 (34 mg, 0.166 mmol) and DIPEA (45 μL, 0.256 mmol) under argon atmosphere. The reaction mixture was stirred at 100 ℃ for 24 h. After that, the reaction was quenched with Sat. NaCl solution (5 mL) and extracted with EtOAc (15 mL × 2) . The combined organic layers were dried over Na2SO4, the solution was concentrated in vacuo and purified by flash chromatography (silica gel, 2～3%methanol in methylene chloride) to afford the desired product 67 (64 mg, 90%) .

[0257] 1H NMR (400 MHz CDCl3) : δ 7.91 (d, J = 9.6 Hz, 1H) , 7.85 (d, J = 8.4 Hz, 1H) , 7.55 (d, J = 8.8 Hz, 1H) , 7.02 (d, J = 2.4 Hz, 1H) , 6.84 (dd, J = 8.8, 2.4 Hz, 1H) , 6.76 (d, J = 9.2 Hz, 1H) , 4.33 (m, 1H) , 4.07 (m, 1H) , 3.48 (q, J = 6.4 Hz, 2H) , 3.28 (q, J = 6.4 Hz, 2H) , 2.17 (m, 4H) , 1.71 (m, 4H) , 1.55 (m, 2H) , 1.44 (m, 4H) .

[0258] Step 2: Synthesis of 6- ( (5- (4- (4- (bis (2-chloroethyl) amino) phenyl) butanamido) pentyl) amino) -N- ( (1r, 4r) -4- (3-chloro-4-cyanophenox y) cyclohexyl) pyridazine-3-carboxamide (I-34) . To a solution of Compound 67 (64 mg, 0.115 mmol) in DCM (2 mL) was added TFA (0.5 mL) under argon atmosphere. The reaction mixture was stirred at room temperature for 2 h. After that, the solutions were removed in vacuo. The residues were dissolved in i-PrOH / CHCl3 = 1: 3 (20 mL) and washed with Sat. NaHCO3 (10 mL) . The organic layer was collected and dried over Na2SO4, and the solvent was removed in vacuo to afford the desired product without further purification. The above residue was dissolved in DCM (4 mL) , chlorambucil (23 mg, 0.077 mmol) , HOBt (14 mg, 0.1 mmol) , EDCI (24 mg, 0.123 mmol) , and DIPEA (41 μL, 0.231 mmol) were added to the solution under argon atmosphere. The reaction mixture was stirred at room temperature for 12 h. After that, the reaction was quenched with Sat. NaCl solution (5 mL) and extracted with DCM (15 mL × 2) . The combined organic layers were dried over Na2SO4, the solution was concentrated in vacuo and purified by flash chromatography (silica gel, 3～4%methanol in methylene chloride) to afford the desired product I-34 (45 mg, 81%) .

[0259] 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.92 (d, J = 9.6 Hz, 1H) , 7.84 (d, J = 8.4 Hz, 1H) , 7.55 (d, J = 8.8 Hz, 1H) , 7.05 (d, J = 8.8 Hz, 2H) , 7.00 (d, J = 2.4 Hz, 1H) , 6.85 (dd, J = 8.8, 2.4 Hz, 1H) , 6.75 (d, J = 9.2 Hz, 1H) , 6.61 (d, J = 8.4 Hz, 2H) , 5.50 (m, 2H) , 4.32 (m, 1H) , 4.04 (m, 1H) , 3.69 (m, 4H) , 3.61 (m, 4H) , 3.49 (q, J = 6.4 Hz, 2H) , 3.28 (q, J = 6.4 Hz, 2H) , 2.55 (t, J = 7.6 Hz, 2H) , 2.17 (m, 6H) , 1.91 (qui, J = 7.6 Hz, 2H) , 1.70 (m, 4H) , 1.54 (m, 2H) , 1.45 (m, 4H) .

[0260] Example S35: Synthesis of 6- (4- ( (1- (4- (4- (bis (2-chloroethyl) amino) phenyl) butanoyl) piperidin-4-yl) methyl) piperazin-1-yl) -N- ( (1r, 4r) -4- (3-chloro-4-cyanophenoxy) cyclohexyl) pyridazine-3-carboxamide (I-35) .

[0261] Step 1: Synthesis of tert-butyl 4- ( (4- (6- ( ( (1r, 4r) -4- (3-chloro-4-cyanophenoxy) cyclohe xyl) carbamoyl) pyridazin-3-yl) piperazin-1-yl) methyl) piperidine-1-carboxylate (Compound 68) . To a solution of 6-chloro-N- ( (1r, 4r) -4- (3-chloro-4-cyanophenoxy) cyclohexyl) pyridazin e-3-carboxamide 66 (50 mg, 0.128 mmol) in DMF (2.5 mL) was added tert-butyl 4- (piperazin-1-ylmethyl) piperidine-1-carboxylat e 33 (48 mg, 0.166 mmol) and DIPEA (45 μL, 0.256 mmol) under argon atmosphere. The reaction mixture was stirred at 100 ℃ for 24 h. After that, the reaction was quenched with Sat. NaCl solution (5 mL) and extracted with EtOAc (15 mL × 2) . The combined organic layers were dried over Na2SO4, the solution was concentrated in vacuo and purified by flash chromatography (silica gel, 2～3%methanol in methylene chloride) to afford the desired product 68 (73 mg, 89%) .

[0262] 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.97 (d, J = 9.6 Hz, 1H) , 7.85 (d, J = 8.4 Hz, 1H) , 7.54 (d, J = 8.8 Hz, 1H) , 6.99 (d, J = 2.4 Hz, 1H) , 6.95 (d, J = 9.6 Hz, 1H) , 6.85 (dd, J = 8.8, 2.4 Hz, 1H) , 4.61 (d, J = 13.2 Hz, 1H) , 4.32 (m, 1H) , 4.02 (m, 1H) , 3.72 (m, 5H) , 2.95 (t, J = 8.8 Hz, 1H) , 2.56 (m, 5H) , 2.18 (m, 6H) , 1.78 (m, 3H) , 1.70 (m, 4H) , 1.44 (m, 2H) .

[0263] Step 2: Synthesis of 6- (4- ( (1- (4- (4- (bis (2-chloroethyl) amino) phenyl) butanoyl) pip eridin-4-yl) methyl) piperazin-1-yl) -N- ( (1r, 4r) -4- (3-chloro-4-cyanophenoxy) cyclohexyl) pyrid azine-3-carboxamide (I-35) . To a solution of Compound 68 (73 mg, 0.115 mmol) in DCM (2 mL) was added TFA (0.5 mL) under argon atmosphere. The reaction mixture was stirred at room temperature for 2 h. After that, the solutions were removed in vacuo. The residues were dissolved in i-PrOH / CHCl3 = 1: 3 (20 mL) and washed with Sat. NaHCO3 (10 mL) . The organic layer was collected and dried over Na2SO4, and the solvent was removed in vacuo to afford the desired product without further purification. The above residue was dissolved in DCM (4 mL) , chlorambucil (23 mg, 0.077 mmol) , HOBt (14 mg, 0.1 mmol) , EDCI (24 mg, 0.123 mmol) , and DIPEA (41 μL, 0.231 mmol) were added to the solution under argon atmosphere. The reaction mixture was stirred at room temperature for 12 h. After that, the reaction was quenched with Sat. NaCl solution (5 mL) and extracted with DCM (15 mL × 2) . The combined organic layers were dried over Na2SO4, the solution was concentrated in vacuo and purified by flash chromatography (silica gel, 3～4%methanol in methylene chloride) to afford the desired product I-35 (47 mg, 76%) .

[0264] 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.99 (d, J = 9.6 Hz, 1H) , 7.85 (d, J = 8.4 Hz, 1H) , 7.55 (d, J = 8.8 Hz, 1H) , 7.08 (d, J = 8.4 Hz, 2H) , 7.00 (d, J = 2.4 Hz, 1H) , 6.96 (d, J = 9.6 Hz, 1H) , 6.85 (dd, J = 8.8, 2.4 Hz, 1H) , 6.62 (d, J = 8.8 Hz, 2H) , 4.63 (d, J = 13.2 Hz, 1H) , 4.31 (m, 1H) , 4.04 (m, 1H) , 3.74 (m, 5H) , 3.69 (m, 4H) , 3.62 (m, 4H) , 2.97 (t, J = 8.8 Hz, 1H) , 2.55 (m, 7H) , 2.33 (t, J = 7.6 Hz, 2H) , 2.20 (m, 6H) , 1.91 (qui, J = 7.6 Hz, 2H) , 1.80 (m, 3H) , 1.69 (m, 4H) , 1.46 (m, 2H) .

[0265] Example S36: Synthesis of 6- ( (7- (4- (4- (bis (2-chloroethyl) amino) phenyl) butanamido) heptyl) amino) -N- ( (1r, 4r) -4- (3-chloro-4-cyanophenoxy) cyclohexyl) pyridazine-3-carboxamide (I-36) .

[0266] Step 1: Synthesis of tert-butyl (7- ( (6- ( ( (1r, 4r) -4- (3-chloro-4-cyanophenoxy) cyclohe xyl) carbamoyl) pyridazin-3-yl) amino) heptyl) carbamate (Compound 70) . To a solution of 6-chloro-N- ( (1r, 4r) -4- (3-chloro-4-cyanophenoxy) cyclohexyl) pyridazine-3-carboxamide 66 (50 mg, 0.128 mmol) in DMF (2.5 mL) was added tert-butyl (7-aminoheptyl) carbamate 69 (39 mg, 0.166 mmol) and DIPEA (45 μL, 0.256 mmol) under argon atmosphere. The reaction mixture was stirred at 100 ℃ for 24 h. After that, the reaction was quenched with Sat. NaCl solution (5 mL) and extracted with EtOAc (15 mL × 2) . The combined organic layers were dried over Na2SO4, the solution was concentrated in vacuo and purified by flash chromatography (silica gel, 2～3%methanol in methylene chloride) to afford the desired product 70 (69 mg, 92%) .

[0267] 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.94 (d, J = 9.2 Hz, 1H) , 7.81 (d, J = 8.0 Hz, 1H) , 7.55 (d, J = 8.8 Hz, 1H) , 7.00 (d, J = 2.4 Hz, 1H) , 6.85 (dd, J = 8.8, 2.4 Hz, 1H) , 6.74 (d, J = 9.2 Hz, 1H) , 4.32 (m, 1H) , 4.04 (m, 1H) , 3.44 (q, J = 6.4 Hz, 2H) , 3.26 (q, J = 6.4 Hz, 2H) , 2.14 (m, 4H) , 1.70 (m, 4H) , 1.42 (m, 10H) .

[0268] Step 2: Synthesis of 6- ( (7- (4- (4- (bis (2-chloroethyl) amino) phenyl) butanamido) heptyl) amino) -N- ( (1r, 4r) -4- (3-chloro-4-cyanophenoxy) cyclohexyl) pyridazine-3-carboxamide (I-36) . To a solution of Compound 70 (69 mg, 0.117 mmol) in DCM (2 mL) was added TFA (0.5 mL) under argon atmosphere. The reaction mixture was stirred at room temperature for 2 h. After that, the solutions were removed in vacuo. The residues were dissolved in i-PrOH / CHCl3 =1: 3 (20 mL) and washed with Sat. NaHCO3 (10 mL) . The organic layer was collected and dried over Na2SO4, and the solvent was removed in vacuo to afford the desired product without further purification. The above residue was dissolved in DCM (4 mL) , chlorambucil (24 mg, 0.079 mmol) , HOBt (14 mg, 0.103 mmol) , EDCI (25 mg, 0.126 mmol) , and DIPEA (42 μL, 0.237 mmol) were added to the solution under argon atmosphere. The reaction mixture was stirred at room temperature for 12 h. After that, the reaction was quenched with Sat. NaCl solution (5 mL) and extracted with DCM (15 mL × 2) . The combined organic layers were dried over Na2SO4, the solution was concentrated in vacuo and purified by flash chromatography (silica gel, 1～3%methanol in methylene chloride) to afford the desired product I-36 (30 mg, 49%) .

[0269] 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.96 (d, J = 9.2 Hz, 1H) , 7.82 (d, J = 8.0 Hz, 1H) , 7.56 (d, J = 8.8 Hz, 1H) , 7.06 (d, J = 8.4 Hz, 2H) , 7.00 (d, J = 2.4 Hz, 1H) , 6.85 (dd, J = 8.8, 2.4 Hz, 1H) , 6.74 (d, J = 9.2 Hz, 1H) , 6.62 (d, J = 8.8 Hz, 2H) , 5.42 (m, 2H) , 4.32 (m, 1H) , 4.04 (m, 1H) , 3.69 (m, 4H) , 3.62 (m, 4H) , 3.46 (q, J = 6.4 Hz, 2H) , 3.24 (q, J = 6.4 Hz, 2H) , 2.55 (t, J = 7.6 Hz, 2H) , 2.16 (m, 6H) , 1.91 (qui, J = 7.6 Hz, 2H) , 1.68 (m, 4H) , 1.40 (m, 10H) .

[0270] Example S37: Synthesis of 6- (4- (4- (4- (4- (bis (2-chloroethyl) amino) phenyl) butanoyl) piperazin-1-yl) piperidin-1-yl) -N- ( (1r, 4r) -4- (3-chloro-4-cyanophenoxy) cyclohexyl) pyridazine-3-carboxamide (I-37) .

[0271] Step 1: Synthesis of tert-butyl 4- (1- (6- ( ( (1r, 4r) -4- (3-chloro-4-cyanophenoxy) cyclohe xyl) carbamoyl) pyridazin-3-yl) piperidin-4-yl) p iperazine-1-carboxylate (Compound 72) . To a solution of 6-chloro-N- ( (1r, 4r) -4- (3-chloro-4-cyanophenoxy) cyclohexyl) pyridazine-3-carboxamide 66 (50 mg, 0.128 mmol) in DMF (2.5 mL) was added tert-butyl 4- (piperidin-4-yl) piperazine-1-carboxylate 71 (45 mg, 0.166 mmol) and DIPEA (45 μL, 0.256 mmol) under argon atmosphere. The reaction mixture was stirred at 100 ℃ for 24 h. After that, the reaction was quenched with Sat. NaCl solution (5 mL) and extracted with EtOAc (15 mL × 2) . The combined organic layers were dried over Na2SO4, the solution was concentrated in vacuo and purified by flash chromatography (silica gel, 3%methanol in methylene chloride) to afford the desired product 72 (64 mg, 81%) .

[0272] 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.96 (d, J = 9.6 Hz, 1H) , 7.86 (d, J = 8.4 Hz, 1H) , 7.54 (d, J = 8.8 Hz, 1H) , 6.99 (m, 2H) , 6.84 (dd, J = 8.4, 2.4 Hz, 1H) , 4.51 (m, 2H) , 4.32 (m, 1H) , 4.07 (m, 1H) , 3.70 (m, 4H) , 3.61 (m, 6H) , 3.40 (brs, 2H) , 3.02 (t, J = 11.6 Hz, 2H) , 2.57 (m, 5H) , 2.18 (m, 4H) , 1.92 (m, 2H) , 1.68 (m, 2H) , 1.48 (m, 4H) .

[0273] Step 2: Synthesis of 6- (4- (4- (4- (4- (bis (2-chloroethyl) amino) phenyl) butanoyl) pip erazin-1-yl) piperidin-1-yl) -N- ( (1r, 4r) -4- (3-chl oro-4-cyanophenoxy) cyclohexyl) pyridazine-3-carboxamide (I-37) . To a solution of Compound 72 (64 mg, 0.103 mmol) in DCM (2 mL) was added TFA (0.5 mL) under argon atmosphere. The reaction mixture was stirred at room temperature for 2 h. After that, the solutions were removed in vacuo. The residues were dissolved in i-PrOH / CHCl3 = 1: 3 (20 mL) and washed with Sat. NaHCO3 (10 mL) . The organic layer was collected and dried over Na2SO4, and the solvent was removed in vacuo to afford the desired product without further purification. The above residue was dissolved in DCM (4 mL) , chlorambucil (24 mg, 0.079 mmol) , HOBt (14 mg, 0.103 mmol) , EDCI (25 mg, 0.126 mmol) , and DIPEA (42 μL, 0.237 mmol) were added to the solution under argon atmosphere. The reaction mixture was stirred at room temperature for 12 h. After that, the reaction was quenched with Sat. NaCl solution (5 mL) and extracted with DCM (15 mL × 2) . The combined organic layers were dried over Na2SO4, the solution was concentrated in vacuo and purified by flash chromatography (silica gel, 3～4%methanol in methylene chloride) to afford the desired product I-37 (70 mg, Quant. ) .

[0274] 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.98 (d, J = 9.6 Hz, 1H) , 7.85 (d, J = 8.4 Hz, 1H) , 7.56 (d, J = 8.8 Hz, 1H) , 7.07 (d, J = 8.4 Hz, 2H) , 6.99 (m, 2H) , 6.85 (dd, J = 8.4, 2.4 Hz, 1H) , 6.62 (d, J = 8.4 Hz, 2H) , 4.54 (m, 2H) , 4.32 (m, 1H) , 4.06 (m, 1H) , 3.70 (m, 4H) , 3.62 (m, 6H) , 3.43 (brs, 2H) , 3.06 (t, J = 11.6 Hz, 2H) , 2.56 (m, 7H) , 2.31 (t, J = 7.6 Hz, 2H) , 2.18 (m, 4H) , 1.93 (m, 4H) , 1.69 (m, 2H) , 1.47 (m, 4H) .

[0275] Biological Examples B1-B3

[0276] Auxiliary experimental materials:

[0277] GAPDH: Glyceraldehyde-3-Phosphate Dehydrogenase, used as a reference substance in Western blot (WB) to standardize the experimental results;

[0278] SOD1: superoxide dismutase 1, used as a reference substance in WB to standardize the experimental results;

[0279] Tubulin: used as a reference substance in immunoblot to standardize the experimental results;

[0280] DMSO: dimethyl sulfoxide, used to protect the structure of proteins from denaturation or degradation during immunoblot;

[0281] ARV-825: a BRD4 degrader based on PROTAC technology, which induces the degradation of BRD4 protein by recruiting the E3 ubiquitin ligase;

[0282] Ibrutinib: inhibiting BTK activity by forming an irreversible covalent bond with a cysteine residue in the active site of BTK.

[0283] Example B1: Discovery of chlorambucil as the binder of E3 ubiquitin ligase RNF113A.

[0284] The cellular thermal shift assay (CETSA) is an efficient approach to assess the binding of small molecules to proteins according to the thermal stabilization of proteins after ligand binding. Furthermore, when coupling with quantitative mass spectrometry, CETSA can achieve systematic mapping of cellular protein binding by small molecules. We observed that the FDA-approved drug chlorambucil (structure showed in Figure 1A) used presently for the treatment of specific types of leukemias and lymphomas could induce the destabilization of both RNF114 and RNF113A E3 ubiquitin ligases.

[0285] To confirm the chlorambucil-RNF113A / RNF114 interaction, WB-CETSA assay was performed. For temperature-dependent experiments, the prepared HEK293T lysates were incubated with the chlorambucil for 10 minutes, followed by heating at the designated temperatures for 3 minutes. In the dose-response experiments, chlorambucil was first diluted to the appropriate concentrations, then mixed with the lysates, and heated at a specific temperature for 3 minutes. Both sets of suspensions were centrifuged at 21,000 rcf for 20 minutes at 4 ℃. The soluble proteins were collected, combined with 5X loading buffer, and heated in a metal bath at 95℃ for 10 minutes. The protein intensity was detected through immunoblot. WB-CETSA analysis showed that chlorambucil could decrease the thermal stability of RNF113A (Figure 1B) and RNF114 (Figure 1C) at different heating temperatures in HEK293T cell lysates. Figure 1D showed that chlorambucil could decrease the thermal stability of RNF113A in a dose-dependent manner. These results support chlorambucil serves as the binder of E3 ubiquitin ligases RNF113A and RNF114.

[0286] Strict structure-activity analysis was performed by modifying chlorambucil at different sites to generate its analogues I-1～I-11 (Figure 1A &TABLE 1) . As showed in Figure 1F, I-3 abolished the destabilization effect after replacing the two chlorine atoms with methyl groups, indicating its importance of the two atoms in maintaining the degradation property of the molecule. To our delight, I-1 generated by modification in the carboxylic group showed the similar destabilization effect compared with the parental compound (Fig. 1E) . These results suggest that the carboxylic group could be employed as the site to connect the linker in the PROTAC design.

[0287] Example B2: Degradation of BRD4 by PROTAC I-12

[0288] BRD4 is selected as the degradation target to demonstrate our application as it has been widely studied and several PROTACs have been developed based on CRBN and VHL. BRD4 PROTACs by connecting chlorambucil and JQ1 with linkers to generate I-12～I-24 were synthesized (Figure 2A &TABLE 2) .

[0289] HEK293T cells were incubated with I-12～I-24 in various concentrations at 37 ℃ 5%CO2 for 24 h, the degradation of BRD4 was analyzed by immunoblot. The results as shown in Table 3 below demonstrate that some of them could degrade BRD4 efficiently. Among them, I-12 showed the best BRD4 degradation ability in HEK293T cells and was selected for further studies.

[0290] HEK293T cells were incubated with I-12 in various concentrations at 37 ℃ 5%CO2 for 24h, where the abundance of BRD4 exhibited a dose-dependent decrease that reached saturation at 1 μM (Figure 2B) . Obvious degradation was observed at 3 h and started to reach saturation at 6 h (Figure 2C) . Proteasome inhibitor MG132 and NEDD8 inhibitor MLN4924 could block BRD4 degradation caused by I-12 efficiently (Figure 2D) , suggesting that the degradation of BRD4 induced by I-12 is a ubiquitin-dependent manner. A negative control PROTAC I-22 without RNF113A binding ability was designed and synthesized (Figure 2A) . No BRD4 degradation was observed under the treatment of I-22 even up to 10 μM concentration (Figure 2E) . BRD4 degradation induced by I-12 could be rescued in RNF113A knockdown HEK293T cells (i.e. RNF113A-KD) (Figure 2F) .

[0291] TABLE 3

[0292] Example B3: Degradation of BTK by PROTAC I-27

[0293] Several BTK PROTACs I-26～I-29 were synthesized by connecting chlorambucil and Ibrutinib with chemical linkers (Figure 3A &TABLE 2) . Jeko-1 cells were incubated with I-26～I-29 in various concentrations at 37 ℃ 5%CO2 for 24 h, the degradation of BTK was analyzed by immunoblot. The results as shown in Table 4 below demonstrate that some of them could degrade BTK efficiently. Among them, I-27 showed the best BTK degradation ability in Jeko-1 cells and was selected for further studies.

[0294] I-27 could induce BTK degradation in a dose-dependent manner, which reached to 90%degradation at 10 μM concentration (Figure 3B) . Efficient degradation was observed at 24 h (Figure 3C) .

[0295] TABLE 4 Industrial applicability

[0296] The present disclosure provides compounds of E3 ubiquitin ligase binders. In an aspect is provided a PROTAC comprising 1) a protein of interest binder (POIB) , 2) an E3 ubiquitin ligase binder (ELB) , wherein the E3 ubiquitin ligase is human RNF113A or human RNF114, and 3) a chemical linker connecting the POIB and the ELB. Also provided herein are pharmaceutical compositions comprising the E3 ubiquitin ligase binders or PROTAC, and applications of the E3 ubiquitin ligase binders or PROTAC for decreasing thermal stability of the proteins of interest and for degrading the proteins of interest.

Claims

1.An E3 ubiquitin ligase binder (ELB) of formula (I) , or a stereoisomer or a pharmaceutically acceptable salt thereof, wherein:x is an integer selected from 0, 1, 2, 3, and 4,R is independently selected from the group consisting of -H, -NO2, -CN, -F, -Cl, -Br, -I, -N3, -ORa, -SRa, -N (Ra) 2, -NHRa, -C (O) Ra, -C (O) ORa, -C (O) NHRa, -C (O) N (Ra) 2, -OC (O) Ra, -OC (O) NHRa, -OC (O) N (Ra) 2, -NHC (O) Ra, -NHC (O) NHRa, -NHC (O) N (Ra) 2, substituted or unsubstituted alkyl, substituted or unsubstituted heteroalkyl, substituted or unsubstituted aryl, substituted or unsubstituted heteroaryl, substituted or unsubstituted cycloalkyl, and substituted or unsubstituted heterocycloalkyl, wherein Ra is selected from the group consisting of hydrogen, substituted or unsubstituted alkyl, substituted or unsubstituted heteroalkyl, substituted or unsubstituted aryl, substituted or unsubstituted heteroaryl, substituted or unsubstituted cycloalkyl, and substituted or unsubstituted heterocycloalkyl;R1 and R2 are independently selected from the group consisting of - (CH2) bRb, -C (O) CH2Rb, -C (O) CH=CHRb, -C (O) CH=C (Rb) 2, and -C (O) C≡CRb, wherein b is an integer selected from 0-10; Rb is selected from the group consisting of -H, -NO2, -CN, -F, -Cl, -Br, -I, -N3, -ORc, -SRc, -N (Rc) 2, -NHRc, -C (O) Rc, -C (O) ORc, -C (O) NHRc, -C (O) N (Rc) 2, -OC (O) Rc, -OC (O) NHRc, -OC (O) N (Rc) 2, -NHC (O) Rc, -NHC (O) NHRc, -NHC (O) N (Rc) 2, substituted or unsubstituted alkyl, substituted or unsubstituted heteroalkyl, substituted or unsubstituted aryl, substituted or unsubstituted heteroaryl, substituted or unsubstituted cycloalkyl, and substituted or unsubstituted heterocycloalkyl, wherein the substituted alkyl is preferably -CY3, -CHY2, or -CH2Y, Y being selected from the group consisting of -F, -Cl, -Br, and -I; Rc is selected from the group consisting of hydrogen, substituted or unsubstituted alkyl, substituted or unsubstituted heteroalkyl, substituted or unsubstituted aryl, substituted or unsubstituted heteroaryl, substituted or unsubstituted cycloalkyl, and substituted or unsubstituted heterocycloalkyl;a is an integer selected from 0-10;R3 is selected from the group consisting of -H, -ORd, -SRd, -N (Rd) 2, -NHRd, -OC (O) Rd, -OC (O) NHRd, -OC (O) N (Rd) 2, -NHC (O) Rd, -NHC (O) NHRd, -NHC (O) N (Rd) 2, substituted or unsubstituted alkyl, substituted or unsubstituted heteroalkyl, substituted or unsubstituted aryl, substituted or unsubstituted heteroaryl, substituted or unsubstituted cycloalkyl, and substituted or unsubstituted heterocycloalkyl, wherein Rd is selected from the group consisting of hydrogen, substituted or unsubstituted alkyl, substituted or unsubstituted heteroalkyl, substituted or unsubstituted aryl, substituted or unsubstituted heteroaryl, substituted or unsubstituted cycloalkyl, and substituted or unsubstituted heterocycloalkyl.2.The E3 ubiquitin ligase binder of formula (I) , or a stereoisomer or a pharmaceutically acceptable salt thereof of claim 1, wherein x is 0.3.The E3 ubiquitin ligase binder of formula (I) , or a stereoisomer or a pharmaceutically acceptable salt thereof of claim 1, wherein a is 1.4.The E3 ubiquitin ligase binder of formula (I) , or a stereoisomer or a pharmaceutically acceptable salt thereof of claim 1, wherein R1 and R2 are independently selected from the group consisting of -CH2CH2Cl, -CH2CH2CH3, -CH2CH2F, -CH2CH2CF3, -CH2CH2CN, -CH2CH2CH2Cl, and -C (O) CH=CH2.5.The E3 ubiquitin ligase binder of formula (I) , or a stereoisomer or a pharmaceutically acceptable salt thereof of claim 1, wherein R3 is selected from the group consisting of -OH, -OEt, -NHPrn,  6.The E3 ubiquitin ligase binder of formula (I) , or a stereoisomer or a pharmaceutically acceptable salt thereof of claim 1, wherein the E3 ubiquitin ligase is any one of HECT family or RING-finger family, and preferably is RNF114 or RNF113A.7.The E3 ubiquitin ligase binder of formula (I) , or a stereoisomer or a pharmaceutically acceptable salt thereof of claim 1, wherein the E3 ubiquitin ligase binder is selected from the group consisting of: 8.Use of the compound of formula (I) or a stereoisomer or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an E3 ubiquitin ligase binder (ELB) ,  wherein R, R1, R2, R3, x and a are as defined in claim 1.9.A proteolysis targeting chimera (PROTAC) of formula (Ⅱ) , or a stereoisomer or a pharmaceutically acceptable salt thereof, wherein the PROTAC comprising 1) a protein of interest binder (POIB) , 2) an E3 ubiquitin ligase binder (ELB) of any one of claims 1 to 7, and 3) a chemical linker L connecting the POIB and the ELB, wherein:R, R1, R2, x, and a are as defined in any one of claims 1 to 7.10.[Corrected under Rule 26, 11.04.2025]The PROTAC of formula (Ⅱ) , or a stereoisomer or a pharmaceutically acceptable salt thereof of claim 9, wherein L is selected from the group consisting of: a bond, -NH (CH2) nCH2-, -NH (CH2) nO-, -NH (CH2) nNH-, -NH (CH2) nC (O) -, -NH (CH2CH2O) nCH2CH2-, -NH (CH2CH2O) nCH2CH2O-, -NH (CH2CH2O) nCH2CH2NH-, -NH (CH2CH2O) nCH2CH2C (O) -, -NH (CH2) nNH (CH2) m CH2-, -NH (CH2) nNH (CH2) mO-, NH (CH2) nNH (CH2) mNH-, -NH (CH2) nNH (CH2) mC (O) , -NH (CH2CH2O) nNH (CH2) mCH2CH2-, -NH (CH2CH2O) nNH (CH2) mCH2CH2O-, -NH (CH2CH2O) nNH (CH2) mCH2CH2NH-, -NH (CH2CH2O) nNH (CH2) mCH2CH2C (O) -, -NH (CH2) nNHC (O) (CH2) mCH2-, -NH (CH2) nNHC (O) (CH2) mO-, -NH (CH2) nNHC (O) (CH2) mNH-, NH (CH2) nC (O) -, NH (CH2CH2O) nNHC (O) (CH2) mCH2-, -NH (CH2CH2O) nNHC (O) (CH2) mO-, -NH (CH2CH2O) nNHC (O) (CH2) mNH-, -NH (CH2CH2O) nNHC (O) (CH2) mC (O) -, and RL1RL2, wherein RL1 and RL2 are each independently selected from the group consisting of substituted or unsubstituted alkyl, substituted or unsubstituted heteroalkyl, substituted or unsubstituted aryl, substituted or unsubstituted heteroaryl, substituted or unsubstituted cycloalkyl, and substituted or unsubstituted heterocycloalkyl, m and n are independently an integer selected from 0-10.11.The PROTAC of formula (Ⅱ) , or a stereoisomer or a pharmaceutically acceptable salt thereof of claim 9, wherein the POIB is selected from disease related protein binders, and the disease related protein binders include: AKT1, AKT3, ALK, AR, AR-V7, AURKA, BCL2, BCL-xL, BCR-ABL, BRAF, BRD2, BRD4, BRD9, BTK, CDK2, CDK4, CDK6, CDK9, CSK, CYP1B1, DAPK1, EGFR, EML4-ALK, EPHA1, ER, ERK1, ERK5, FGFR2, FLT1, FLT3, GPX4, GSK3A, GSPT1, HDAC1, HDAC6, IDO1, IRAK1, IRAK4, ITK, JAK1, JAK3, KRAS, LDHA, LRRK2, MAP3K1, MAP4K1, MAPK8, MARK2, MEK1, MYC, NEK1, NEK3, NSD2, p38alpha, PARP1, PI3Kalpha, PI3Kbeta, PIM1, PLK1, PYK2, RIPK1, RPS6KA1, SGK3, SHP2, SIK2, SIRT2, SMARCA2, SMARCA4, SOS1, STAT3, STAT6, STING, STK10, Tau, TESK2, TRKA, TRKC, ULK1, and VEGFR-2.12.The PROTAC of formula (Ⅱ) , or a stereoisomer or a pharmaceutically acceptable salt thereof of claim 9, wherein R1 and R2 are independently -CH2CH2Cl, or -CH2CH2CH3.13.The PROTAC of formula (Ⅱ) , or a stereoisomer or a pharmaceutically acceptable salt thereof of claim 9, wherein L is selected from the group consisting of: 14.The PROTAC of formula (Ⅱ) , or a stereoisomer or a pharmaceutically acceptable salt thereof of claim 9, wherein POIB is selected from the group consisting of: 15.The PROTAC of formula (Ⅱ) , or a stereoisomer or a pharmaceutically acceptable salt thereof of claim 9, wherein the E3 ubiquitin ligase is RNF114 or RNF113A.16.The PROTAC of formula (Ⅱ) , or a stereoisomer or a pharmaceutically acceptable salt thereof of claim 9, wherein the PROTAC is selected from the group consisting of: 17.A pharmaceutical composition comprising the E3 ubiquitin ligase binder of formula (I) , or a stereoisomer or a pharmaceutically acceptable salt thereof of any one of claims 1 to 7, or PROTAC of formula (Ⅱ) , or a stereoisomer or a pharmaceutically acceptable salt thereof of any one of claims 9 to 16; and a pharmaceutically acceptable excipient.18.A method for decreasing thermal stability of a protein, comprising administering the E3 ubiquitin ligase binder of formula (I) , or a stereoisomer or a pharmaceutically acceptable salt thereof of any one of claims 1 to 7, or PROTAC of formula (Ⅱ) , or a stereoisomer or a pharmaceutically acceptable salt thereof of any one of claims 9 to 16, or the pharmaceutical composition of claim 17.19.The method of claim 18, wherein the E3 ubiquitin ligase is any one of HECT family or RING-finger family, and preferably is RNF113A or RNF114.20.A method for degrading the cellular protein level, comprising administering the E3 ubiquitin ligase binder of formula (I) , or a stereoisomer or a pharmaceutically acceptable salt thereof of any one of claims 1 to 7, or PROTAC of formula (Ⅱ) , or a stereoisomer or a pharmaceutically acceptable salt thereof of any one of claims 9 to 16, or the pharmaceutical composition of claim 17.21.The method of claim 20, wherein the cellular protein is disease related protein, preferably BRD4 or BTK.22.The method of claim 20, wherein the method comprises a PROTAC process to degrade cellular protein through ubiquitin proteosome system, preferably the method comprises the steps of:1) allowing the PROTAC to induce interaction between E3 ubiquitin ligase and cellular protein to generate E3 ubiquitin ligase -PROTAC-cellular protein ternary complex;2) attaching a ubiquitin tag to the cellular protein;3) a proteosome recognizing the ubiquitinated cellular protein and forming a ubiquitinated cellular protein-proteosome complex; and4) carrying out proteolysis of the cellular protein by the proteosome.

Images