FcRH5 BINDING MOLECULE AND METHODS OF USE THEREOF

Abstract

Provided are FcRH5 binding molecules and engineered cells expressing the FcRH5 binding molecules. Methods of making thereof and methods of treatment using thereof are also provided.

Description

FcRH5 BINDING MOLECULE AND METHODS OF USE THEREOF

[0001] CROSS REFERENCE TO RELATED APPLICATIONS

[0002] This application claims benefit of priority of International Patent Application No. PCT / CN2025 / 084470 filed on March 24, 2025, the content of which is incorporated herein by reference in its entirety.

[0003] REFERENCE TO AN ELECTRONIC SEQUENCE LISTING

[0004] The content of the following submission on XML file is incorporated herein by reference in its entirety: a computer readable form (CRF) of the Sequence Listing (file name: IEC260173PCT-seql. XML, date recorded: March 13, 2026, size: 66, 511 KB) .1. FIELD

[0005] The present disclosure relates to FcRH5 binding molecule. Provided are single domain antibodies targeting FcRH5, and chimeric antigen receptors comprising one or more anti-FcRH5 single domain antibodies. Further provided are engineered immune effector cells (such as T cells) comprising the chimeric antigen receptors. Pharmaceutical compositions, kits and methods of treating cancer are also provided.2. BACKGROUND

[0006] Fc receptor-like 5 (FcRH5) , also known as CD307, IRTA2, and FcRL5, is a member of the immunoglobulin receptor superfamily and the Fc-receptor family. The FcRH5 locus has three major mRNA isoforms (FcRH5a, FcRH5b, and FcRH5c) . FcRH5c is the domain isoform and encodes a 977-amino acid type I transmembrane glycoprotein with nine extracellular Ig-type domains. FcRH5 is exclusively expressed in the B-cell lineage and retained in plasma cells and is currently investigated as a therapeutic target in multiple myeloma.

[0007] Multiple myeloma (MM) is an incurable aggressive plasma malignancy characterized by clonal expansion of malignant plasma cells. Chimeric antigen receptor T (CAR-T) cell therapy is an emerging and effective cancer immunotherapy, especially in hematological malignancies. B-cell maturation antigen (BCMA) -targeted CAR T-cells have proven to be the most potent treatment for patients with multiple myeloma.

[0008] Despite the remarkable success of CAR T-cell therapy, a significant portion of patients with multiple myeloma still relapse following treatment. Therefore, improved binding molecules and engineered cells are needed. For example, there is a need to develop stable and therapeutically effective FcRH5 binding molecules for use in more effective or efficient CAR-T therapies.3. SUMMARY

[0009] Based on the shortcomings of the prior art, one of the main objects of the present disclosure is to provide anti-FcRH5 binding molecules. Thus, the present disclosure provides anti-FcRH5 antibodies or antigen binding fragment thereof (e.g., VHHs) , chimeric antigen receptors (CARs) , pharmaceutical compositions comprising these binding molecules, nucleic acids encoding these binding molecules, vectors, and host cells for making these binding molecules, methods of treating a subject using these binding molecules, and the binding molecules of the present disclosure can be used for detection and / or treatment of a tumor.

[0010] In one aspect, provided herein is a FcRH5 binding molecule, comprising:

[0011] (1) a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of the CDR1, CDR2, and CDR3, respectively, as set forth in SEQ ID NO: 5;

[0012] (2) a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of the CDR1, CDR2, and CDR3, respectively, as set forth in SEQ ID NO: 11;

[0013] (3) a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of the CDR1, CDR2, and CDR3, respectively, as set forth in SEQ ID NO: 12; and / or

[0014] (4) a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of the CDR1, CDR2, and CDR3, respectively, as set forth in SEQ ID NO: 18.

[0015] In certain embodiments, the CDR1, CDR2 and / or CDR3 are determined according to the AbM numbering scheme, the Kabat numbering scheme, the IMGT numbering scheme, the Chothia numbering scheme, the Contact numbering scheme, or any combination thereof.

[0016] In certain embodiments, the CDR1, CDR2 and / or CDR3 are determined according to the AbM numbering scheme.

[0017] In certain embodiments, the CDR1, CDR2 and / or CDR3 are determined according to the Kabat numbering scheme.

[0018] In another aspect, the present disclosure provides a FcRH5 binding molecule, comprising:

[0019] (1) a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, and SEQ ID NO: 10, respectively;

[0020] (2) a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, and SEQ ID NO: 10, respectively;

[0021] (3) a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, and SEQ ID NO: 17, respectively;

[0022] (4) a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, and SEQ ID NO: 17, respectively; and / or

[0023] (5) a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 19, and SEQ ID NO: 17, respectively.

[0024] In certain embodiments, the FcRH5 binding molecule further comprising framework regions (FRs) .

[0025] In certain embodiments, the framework regions are derived from a human immunoglobulin heavy chain variable region sequence.

[0026] In certain embodiments, the FcRH5 binding molecule comprises the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 5, 11-12, and 18; or an amino acid sequence having at least 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%sequence identity to the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 5, 11-12, and 18.

[0027] In certain embodiments, the binding molecule is a fusion protein, or an immunoconjugate.

[0028] In certain embodiments, the binding molecule is an antibody or antigen binding fragment thereof.

[0029] In certain embodiments, the antibody or antigen binding fragment thereof is a murine, camelid, chimeric, human, or humanized antibody or fragment.

[0030] In certain embodiments, the antibody or antigen binding fragment thereof is monospecific, bispecific or multispecific.

[0031] In certain embodiments, the antibody or antigen binding fragment thereof is a mAb, a Fab, a Fab′, a F(ab′) 2, a Fv, a VHH, a single chain Fv (scFv) , a single domain antibody (sdAb) , a minibody, a diabody, an antibody mimetic or chemically linked F (ab′) 2, optionally the antibody or antigen binding fragment thereof is a sdAb.

[0032] In certain embodiments, the antibody or antigen binding fragment thereof comprises a Fc region, optionally the Fc region is the Fc of IgG1, IgG2, IgG3 or IgG4.

[0033] In certain embodiments, the antibody or antigen binding fragment thereof comprises the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 5, 11-12, and 18; or an amino acid sequence having at least 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%sequence identity to the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 5, 11-12, and 18.

[0034] In certain embodiments, the antibody or antigen binding fragment thereof comprises the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 34-37; or an amino acid sequence having at least 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%sequence identity to the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 34-37.

[0035] In another aspect, the present disclosure provides a chimeric antigen receptor (CAR) , comprising: (a) an extracellular antigen binding domain comprising the antibody or antigen binding fragment of provided herein; (b) a transmembrane domain; and (c) an intracellular signaling domain.

[0036] In certain embodiments, the extracellular antigen binding domain further comprises one or more additional antibody (ies) or antigen binding fragment (s) .

[0037] In certain embodiments, the additional antibody (ies) or antigen binding fragment (s) bind (s) to at least one tumor antigen (s) or autoimmune disease antigen (s) .

[0038] In certain embodiments, the extracellular antigen binding domain comprises two or three of the antibody or antigen binding fragment of provided herein.

[0039] In certain embodiments, the extracellular antigen binding domain comprising a first antibody or antigen binding fragment and a second antibody or antigen binding fragment,

[0040] (1) the first antibody or antigen binding fragment comprises a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of the CDR1, CDR2, and CDR3, respectively, as set forth in SEQ ID NO: 11; and the second antibody or antigen binding fragment comprises a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of the CDR1, CDR2, and CDR3, respectively, as set forth in SEQ ID NO: 18;

[0041] (2) the first antibody or antigen binding fragment comprises a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of the CDR1, CDR2, and CDR3, respectively, as set forth in SEQ ID NO: 18; and the second antibody or antigen binding fragment comprises a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of the CDR1, CDR2, and CDR3, respectively, as set forth in SEQ ID NO: 11;

[0042] (3) the first antibody or antigen binding fragment comprises a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of the CDR1, CDR2, and CDR3, respectively, as set forth in SEQ ID NO: 5; and the second antibody or antigen binding fragment comprises a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of the CDR1, CDR2, and CDR3, respectively, as set forth in SEQ ID NO: 12;

[0043] (4) the first antibody or antigen binding fragment comprises a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of the CDR1, CDR2, and CDR3, respectively, as set forth in SEQ ID NO: 12; and the second antibody or antigen binding fragment comprises a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of the CDR1, CDR2, and CDR3, respectively, as set forth in SEQ ID NO: 5;

[0044] (5) the first antibody or antigen binding fragment comprises a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of the CDR1, CDR2, and CDR3, respectively, as set forth in SEQ ID NO: 12; and the second antibody or antigen binding fragment comprises a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of the CDR1, CDR2, and CDR3, respectively, as set forth in SEQ ID NO: 11;

[0045] (6) the first antibody or antigen binding fragment comprises a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of the CDR1, CDR2, and CDR3, respectively, as set forth in SEQ ID NO: 11; and the second antibody or antigen binding fragment comprises a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of the CDR1, CDR2, and CDR3, respectively, as set forth in SEQ ID NO: 12;

[0046] (7) the first antibody or antigen binding fragment comprises a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of the CDR1, CDR2, and CDR3, respectively, as set forth in SEQ ID NO: 5; and the second antibody or antigen binding fragment comprises a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of the CDR1, CDR2, and CDR3, respectively, as set forth in SEQ ID NO: 18; or

[0047] (8) the first antibody or antigen binding fragment comprises a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of the CDR1, CDR2, and CDR3, respectively, as set forth in SEQ ID NO: 18; and the second antibody or antigen binding fragment comprises a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of the CDR1, CDR2, and CDR3, respectively, as set forth in SEQ ID NO: 5.

[0048] In certain embodiments, the extracellular antigen binding domain comprising a first antibody or antigen binding fragment and a second antibody or antigen binding fragment,

[0049] (1) the first antibody or antigen binding fragment comprises a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, and SEQ ID NO: 10, respectively; and the second antibody or antigen binding fragment comprises a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, and SEQ ID NO: 17, respectively;

[0050] (2) the first antibody or antigen binding fragment comprises a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, and SEQ ID NO: 17, respectively; and the second antibody or antigen binding fragment comprises a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, and SEQ ID NO: 10, respectively;

[0051] (3) the first antibody or antigen binding fragment comprises a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, and SEQ ID NO: 10, respectively; and the second antibody or antigen binding fragment comprises a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, and SEQ ID NO: 17, respectively;

[0052] (4) the first antibody or antigen binding fragment comprises a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, and SEQ ID NO: 17, respectively; and the second antibody or antigen binding fragment comprises a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, and SEQ ID NO: 10, respectively;

[0053] (5) the first antibody or antigen binding fragment comprises a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, and SEQ ID NO: 10, respectively; and the second antibody or antigen binding fragment comprises a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 19, and SEQ ID NO: 17, respectively; or

[0054] (6) the first antibody or antigen binding fragment comprises a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 19, and SEQ ID NO: 17, respectively; and the second antibody or antigen binding fragment comprises a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, and SEQ ID NO: 10, respectively.

[0055] In certain embodiments, the extracellular antigen binding domain comprising from the N-terminus to the C-terminus:

[0056] (1) a first antibody or antigen binding fragment comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11, and a second antibody or antigen binding fragment comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18;

[0057] (2) a first antibody or antigen binding fragment comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18, and a second antibody or antigen binding fragment comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11;

[0058] (3) a first antibody or antigen binding fragment comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, and a second antibody or antigen binding fragment comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12;

[0059] (4) a first antibody or antigen binding fragment comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12, and a second antibody or antigen binding fragment comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5;

[0060] (5) a first antibody or antigen binding fragment comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12, and a second antibody or antigen binding fragment comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11;

[0061] (6) a first antibody or antigen binding fragment comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11, and a second antibody or antigen binding fragment comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12;

[0062] (7) a first antibody or antigen binding fragment comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, and a second antibody or antigen binding fragment comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18; or

[0063] (8) a first antibody or antigen binding fragment comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18, and a second antibody or antigen binding fragment comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5.

[0064] In certain embodiments, the first antibody or antigen binding fragment and the second antibody or antigen binding fragment are linked by a peptide linker.

[0065] In certain embodiments, the first antibody or antigen binding fragment and the second antibody or antigen binding fragment are linked by a peptide linker, and the peptide linker comprises the amino acid sequence of any one of SEQ ID NO: 30-32.

[0066] In certain embodiments, the transmembrane domain is derived from a molecule selected from a group consisting of CD8α, CD4, CD28, CD137, CD80, CD86, CD152, and PD-1.

[0067] In certain embodiments, the intracellular signaling domain comprises a primary intracellular signaling domain of an immune effector cell.

[0068] In certain embodiments, the primary intracellular signaling domain is derived from CD3ζ.

[0069] In certain embodiments, the intracellular signaling domain comprises a co-stimulatory signaling domain.

[0070] In certain embodiments, the co-stimulatory signaling domain is derived from a co-stimulatory molecule selected from the group consisting of CD27, CD28, CD137, OX40, CD30, CD40, CD3, LFA-1, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, ligands of CD83, and any combination thereof.

[0071] In certain embodiments, the CAR further comprising a hinge domain.

[0072] In certain embodiments, the hinge domain is derived from CD8α.

[0073] In certain embodiments, the CAR comprising an amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 38-39, and 42-45.

[0074] In certain embodiments, the CAR further comprising a signal peptide.

[0075] In certain embodiments, the signal peptide is derived from CD8α.

[0076] In certain embodiments, the CAR comprising an amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 40-41, and 46-49.

[0077] In another aspect, the present disclosure provides a nucleic acid comprising a sequence encoding the FcRH5 binding molecule provided herein, or the CAR provided herein.

[0078] In another aspect, the present disclosure provides a vector comprising the nucleic acid provided herein.

[0079] In another aspect, the present disclosure provides a cell, comprising the CAR provided herein, the nucleic acid provided herein, or the vector provided herein.

[0080] In certain embodiments, the cell is an engineered cell.

[0081] In certain embodiments, the engineered cell is selected from the group consisting of T cell (e.g., αβ T cell, γδ T cell, NKT cell) , NK cell, monocyte, dendritic cell, macrophage, B cell, stem cell, and any combination thereof.

[0082] In certain embodiments, the cell or the engineered cell further comprising an additional CAR that binds to at least one tumor antigen (s) or autoimmune disease antigen (s) .

[0083] In another aspect, the present disclosure provides a pharmaceutical composition, comprising (i) the binding molecule provided herein, the CAR provided herein, the nucleic acid provided herein, the vector provided herein, or the cell provided herein; and (ii) a pharmaceutically acceptable carrier and / or excipient.

[0084] In another aspect, the present disclosure provides a method for preventing and / or treating a disease or disorder in a subject, wherein the method comprises administering to a subject in need thereof the pharmaceutical composition provided herein.

[0085] In certain embodiments, the disease or disorder is cancer or autoimmune disease.

[0086] In certain embodiments, the cancer is multiple myeloma.4. DESCRIPTION OF DRAWINGS

[0087] FIGS. 1A-1F show binding of selected anti FcRH5 HCAbs to FcRH family molecules by ELISA.

[0088] FIGS. 2A-2C show binding of selected anti FcRH5 HCAbs to truncated domain of human FcRH5 proteins by ELISA.

[0089] FIG. 3 shows epitope binning of camelid HCAbs by SPR.

[0090] FIGS. 4A-4F show binding of anti FcRH5 tandem antibodies to FcRH family molecules by ELISA.

[0091] FIG. 5 shows binding of anti FcRH5 tandem antibodies to truncated domain of human FcRH5 proteins by ELISA. FIG. 5A shows binding of anti FcRH5 tandem antibodies to D9-MPD; FIG. 5B shows binding of anti FcRH5 tandem antibodies to D1-D9; FIG. 5C shows binding of anti FcRH5 tandem antibodies to human FcRH5a.

[0092] FIG. 6 shows in vitro cytotoxicity assessment of FcRH5 CAR-T cells against tumor cells (K562-FcRH5-Luc) .

[0093] FIGS. 7A-7B show cytotoxicity of FcRH5 CAR-T cells after multiple rounds of target cell addition. FIG. 7A shows the result of M3133 and M3286; FIG. 7B shows the result of tandem CAR-T cells; UnT as negative control.

[0094] FIG. 8 shows soluble FcRH5 protein does not affect the in vitro cytotoxicity of CAR-T cells against target cells.

[0095] FIGS. 9A-9C show the effect of FcRH5 CAR-T cells (M3286 and M3133) on the growth of Mino subcutaneous tumors in mice. UnT as negative control and M2901 as benchmark.

[0096] FIGS. 10A-10C show the effect of FcRH5 CAR-T cells (M3498 and M3502) on the growth of Mino subcutaneous tumors in mice. UnT as negative control and M2901 as benchmark.5. DETAILED DESCRIPTION

[0097] The present disclosure is based in part on a novel antibody or antigen binding fragment thereof that binds to FcRH5, chimeric antigen receptors comprising said antibody or fragment, engineered cells expressing said antibody, fragment, or receptors, and improved properties of any of the foregoing.

[0098] 5.1 Definitions

[0099] Techniques and procedures described or referenced herein include those that are generally well understood and / or commonly employed using conventional methodology by those skilled in the art, such as, for example, the widely utilized methodologies described in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3d ed. 2001) ; Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al. eds., 2003) ; Therapeutic Monoclonal Antibodies: From Bench to Clinic (An ed. 2009) ; Monoclonal Antibodies: Methods and Protocols (Albitar ed. 2010) ; and Antibody Engineering Vols 1 and 2 (Kontermann and Dübel eds., 2d ed. 2010) . Unless otherwise defined herein, technical and scientific terms used in the present description have the meanings that are commonly understood by those of ordinary skill in the art. For purposes of interpreting this specification, the following description of terms will apply and whenever appropriate, terms used in the singular will also include the plural and vice versa.

[0100] The term “binding molecule” as used herein refers to any molecule capable of specifically binding to a target of interest (e.g., FcRH5) . The binding molecule may comprise naturally occurring, synthetic, or engineered structures, and includes molecules that incorporate at least one functional region (e.g., one or more complementarity-determining region (CDR) ) derived from an antibody or antibody-like scaffold. The binding molecule provided herein may be selected from the group consisting of an antibody or antigen binding fragment thereof, a fusion protein or chimeric protein (e.g., a chimeric receptor) , an immunoconjugate (e.g., an antibody-drug conjugate (ADC) ) , an antibody-siRNA conjugate (ARC) , an antibody-oligonucleotide conjugate (AOC) , an antibody-detection tag conjugate, and an immunocytokine.

[0101] The term “antibody, ” “immunoglobulin, ” or “Ig” is used interchangeably herein, and is used in the broadest sense and specifically covers, for example, monoclonal antibodies (including agonist, antagonist, neutralizing antibodies, full length or intact monoclonal antibodies) , antibody compositions with polyepitopic or monoepitopic specificity, polyclonal or monovalent antibodies, multivalent antibodies, multispecific antibodies (e.g., bispecific antibodies) , single chain antibodies, and fragments thereof (e.g., domain antibodies) , as described below. An antibody can be human, humanized, chimeric and / or affinity matured, as well as an antibody from other species, for example, mouse, rabbit, llama, etc. The antibody can be an intact immunoglobulin molecule or four immunoglobulin chain antibodies comprising two heavy chains and two light chains. The antibodies provided herein can be of any class (e.g., IgG, IgE, IgM, IgD, and IgA) or any subclass (e.g., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, and IgA2) of immunoglobulin molecule. Antibodies may be agonistic antibodies or antagonistic antibodies. Antibodies may be neither agonistic nor antagonistic.

[0102] The term “antigen binding fragment” as used herein refers to an antibody fragment including, for example, a diabody, a Fab, a Fab’ , a F (ab’ ) 2, an Fv fragment, a disulfide stabilized Fv fragment (dsFv) , a (dsFv) 2, a bispecific dsFv (dsFv-dsFv’ ) , a disulfide stabilized diabody (ds diabody) , a single-chain Fv (scFv) , an scFv dimer (bivalent diabody) , a multispecific antibody formed from a portion of an antibody comprising one or more CDRs, a single domain antibody (sdAb) (e.g., a VHH) , a nanobody, a domain antibody, a bivalent domain antibody, or any other antibody fragment that binds to an antigen but does not comprise a complete antibody structure. An antigen binding fragment is capable of binding to the same antigen to which the parent antibody or a parent antibody fragment (e.g., a parent scFv) binds.

[0103] An “antigen” is a structure to which an antibody can selectively bind. A target antigen may be a polypeptide, carbohydrate, nucleic acid, lipid, hapten, or other naturally occurring or synthetic compound. The target antigen can be a polypeptide. An antigen may be associated with a cell, for example, is present on or in a cell.

[0104] “Single-chain Fv” also abbreviated as “sFv” or “scFv” are antibody fragments that comprise the VH and VL antibody domains connected into a single polypeptide chain. The scFv polypeptide may further comprise a polypeptide linker between the VH and VL domains which enables the scFv to form the desired structure for antigen binding.

[0105] The term “heavy chain-only antibody” or “HCAb” refers to a functional antibody, which comprises heavy chains, but lacks the light chains usually found in 4-chain antibodies. For example, camelid animals (such as camels, llamas, or alpacas) are known to produce HCAbs.

[0106] “Single domain antibody” or “sdAb” as used herein refers to a single monomeric variable antibody domain and which is capable of antigen binding. Single domain antibodies include VHH domains as described herein. Examples of single domain antibodies include, but are not limited to, antibodies naturally devoid of light chains such as those from Camelidae species (e.g., llama) , single domain antibodies derived from conventional 4-chain antibodies, engineered antibodies and single domain scaffolds other than those derived from antibodies. Single domain antibodies (e.g., VHH domains) may be derived from any species including, but not limited to mouse, human, camel, llama, goat, rabbit, and bovine. For example, a single domain antibody can be derived from antibodies raised in Camelidae species, for example in camel, llama, dromedary, alpaca, and guanaco, as described herein. Other species besides Camelidae may produce heavy chain antibodies naturally devoid of light chain; VHHs derived from such other species are within the scope of the disclosure. The single domain antibody (e.g., VHH domain) provided herein has a structure of FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4. Single domain antibodies may be genetically fused or chemically conjugated to another molecule (e.g., an agent) . Single domain antibodies may be part of a bigger binding molecule (e.g., a multispecific antibody or a chimeric antigen receptor) .

[0107] The terms “binds” or “binding” refer to an interaction between molecules including, for example, to form a complex. Interactions can be, for example, non-covalent interactions including hydrogen bonds, ionic bonds, hydrophobic interactions, and / or van der Waals interactions. A complex can also include the binding of two or more molecules held together by covalent or non-covalent bonds, interactions, or forces. The strength of the total non-covalent interactions between a single antigen-binding site on a binding molecule and a single epitope of a target molecule, such as an antigen, is the affinity of the binding molecule or functional fragment for that epitope.

[0108] The binding molecules can comprise “chimeric” sequences in which a portion of the heavy and / or light chain is identical with or homologous to corresponding sequences in antibodies derived from a particular species or belonging to a particular antibody class or subclass, while the remainder of the chain (s) is identical with or homologous to corresponding sequences in antibodies derived from another species or belonging to another antibody class or subclass, as well as fragments of such antibodies, so long as they exhibit the desired biological activity (see U.S. Pat. No. 4,816,567; and Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851-55) . Chimeric sequences may include humanized sequences.

[0109] The term “Fab” or “Fab region” refers to an antibody region that binds to antigens. A conventional IgG usually comprises two Fab regions, each residing on one of the two arms of the Y-shaped IgG structure. Each Fab region is typically composed of one variable region and one constant region of each of the heavy and the light chain. More specifically, the variable region and the constant region of the heavy chain in a Fab region are VH and CH1 regions, and the variable region and the constant region of the light chain in a Fab region are VL and CL regions. The VH, CH1, VL, and CL in a Fab region can be arranged in various ways to confer an antigen binding capability according to the present disclosure. For example, VH and CH1 regions can be on one polypeptide, and VL and CL regions can be on a separate polypeptide, similarly to a Fab region of a conventional IgG. Alternatively, VH, CH1, VL and CL regions can all be on the same polypeptide and oriented in different orders as described in more detail the sections below.

[0110] The term “variable region, ” “variable domain, ” “V region, ” or “V domain” refers to a portion of the light or heavy chains of an antibody that is generally located at the amino-terminal of the light or heavy chain and has a length of about 120 to 130 amino acids in the heavy chain and about 100 to 110 amino acids in the light chain, and are used in the binding and specificity of each particular antibody for its particular antigen. The variable region of the heavy chain may be referred to as “VH” . The variable region of the light chain may be referred to as “VL” . The term “variable” refers to the fact that certain segments of the variable regions differ extensively in sequence among antibodies. The V region mediates antigen binding and defines specificity of a particular antibody for its particular antigen. However, the variability is not evenly distributed across the 110-amino acid span of the variable regions. Instead, the V regions consist of less variable (e.g., relatively invariant) stretches called framework regions (FRs) of about 15-30 amino acids separated by shorter regions of greater variability (e.g., extreme variability) called “hypervariable regions” that are each about 9-12 amino acids long.

[0111] The term “heavy chain” when used in reference to an antibody refers to a polypeptide chain of about 50-70 kDa, wherein the amino-terminal portion includes a variable region of about 120 to 130 or more amino acids, and a carboxy-terminal portion includes a constant region. The constant region can be one of five distinct types, (e.g., isotypes) referred to as alpha (α) , delta (δ) , epsilon (ε) , gamma (γ) , and mu (μ) , based on the amino acid sequence of the heavy chain constant region. The distinct heavy chains differ in size: α, δ, and γ contain approximately 450 amino acids, while μ and ε contain approximately 550 amino acids. When combined with a light chain, these distinct types of heavy chains give rise to five well known classes (e.g., isotypes) of antibodies, IgA, IgD, IgE, IgG, and IgM, respectively, including four subclasses of IgG, namely IgG1, IgG2, IgG3, and IgG4.

[0112] The term “light chain” when used in reference to an antibody refers to a polypeptide chain of about 25 kDa, wherein the amino-terminal portion includes a variable region of about 100 to about 110 or more amino acids, and a carboxy-terminal portion includes a constant region. The approximate length of a light chain is 211 to 217 amino acids. There are two distinct types, referred to as kappa (κ) or lambda (λ) based on the amino acid sequence of the constant domains.

[0113] As used herein, the terms “hypervariable region, ” “HVR, ” “Complementarity Determining Region, ” and “CDR” are used interchangeably. A “CDR” refers to one of three hypervariable regions (H1, H2 or H3) within the non-framework region of the immunoglobulin (Ig or antibody) VH β-sheet framework, or one of three hypervariable regions (L1, L2 or L3) within the non-framework region of the antibody VL β-sheet framework. CDR1, CDR2 and CDR3 in VH domain are also referred to as HCDR1, HCDR2 and HCDR3, respectively. CDR1, CDR2 and CDR3 in VL domain are also referred to as LCDR1, LCDR2 and LCDR3, respectively. Accordingly, CDRs are variable region sequences interspersed within the framework region sequences.

[0114] The CDRs of an antibody are defined by those skilled in the art using a variety of methods / systems. These systems and / or definitions have been developed and refined over a number of years and include Kabat, Chothia, IMGT, AbM, and Contact. The Kabat CDRs are based on sequence variability and are the most commonly used (see, e.g., Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (5th ed. 1991) ; Nick Deschacht et al., J Immunol 2010; 184: 5696-5704) . Chothia refers instead to the location of the structural loops (see, e.g., Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196: 901-17 (1987) ) . The end of the Chothia CDR-H1 loop when numbered using the Kabat numbering convention varies between H32 and H34 depending on the length of the loop (this is because the Kabat numbering scheme places the insertions at H35A and H35B; if neither 35A nor 35B is present, the loop ends at 32; if only 35A is present, the loop ends at 33; if both 35A and 35B are present, the loop ends at 34) . The AbM hypervariable regions represent a compromise between the Kabat CDRs and Chothia structural loops, and are used by Oxford Molecular’s AbM antibody modeling software (see, e.g., Antibody Engineering Vol. 2 (Kontermann and Dübel eds., 2d ed. 2010) ) . Another universal numbering system that has been developed and widely adopted is ImMunoGeneTics (IMGT) Information   (Lafranc et al., Dev. Comp. Immunol. 27 (1) : 55-77 (2003) ) . Herein, the CDRs are referred to in terms of both the amino acid sequence and the location within the light or heavy chain. As the “location” of the CDRs within the structure of the immunoglobulin variable domain is conserved between species and present in structures called loops, by using numbering systems that align variable domain sequences according to structural features, CDR and framework residues are readily identified. This information can be used in grafting and replacement of CDR residues from immunoglobulins of one species into an acceptor framework from, typically, a human antibody. An additional numbering system (AHon) has been developed by Honegger and Plückthun, J. Mol. Biol. 309: 657-70 (2001) . Correspondence between the numbering system, including, for example, the Kabat numbering and the IMGT unique numbering system, is well known to one skilled in the art. However, it will be understood that reference to a variable domain CDR or CDRs of a specific antibody will encompass all CDR definitions as known to those of skill in the art.

[0115] The boundaries of a given CDR may vary depending on the scheme used for identification. Thus, unless otherwise specified, the terms “CDR” and “complementary determining region” of a given antibody or region thereof, such as a variable region, as well as individual CDRs (e.g., CDR-H1, CDR-H2) of the antibody or region thereof, should be understood to encompass the complementary determining region as defined by any of the known schemes described herein above. In some instances, the scheme for identification of a particular CDR or CDRs is specified, such as the CDR as defined by the IMGT, AbM, Kabat, Chothia, or Contact method. In other cases, the particular amino acid sequence of a CDR is given. It should be noted that CDR regions may also be defined by any combination of various numbering systems, e.g., a combination of Kabat and Chothia numbering systems, a combination of Kabat and AbM numbering systems, or a combination of Kabat and IMGT numbering systems. Therefore, the term such as “aCDR1 as set forth in a specific VH” includes any CDR1 as defined by the exemplary CDR numbering systems described above but is not limited thereby. Once a variable region (e.g., a VH or VL) is given, those skilled in the art would understand that CDRs within the region can be defined by different numbering systems or combinations thereof.

[0116] The term “constant region” or “constant domain” refers to a carboxy terminal portion of the light and heavy chain which is not directly involved in binding of the antibody to antigen but exhibits various effector function, such as interaction with the Fc receptor. The term refers to the portion of an immunoglobulin molecule having a more conserved amino acid sequence relative to the other portion of the immunoglobulin, the variable region, which contains the antigen binding site. The constant region may contain the CH1, CH2, and CH3 regions of the heavy chain and the CL region of the light chain.

[0117] The term “framework” or “FR” refers to those variable region residues flanking the CDRs. FR residues are present, for example, in chimeric, humanized, human, domain antibodies, diabodies, linear antibodies, and bispecific antibodies. FR residues are those variable domain residues other than the hypervariable region residues or CDR residues.

[0118] The term “Fc region” herein is used to define a C-terminal region of an immunoglobulin heavy chain, including, for example, native sequence Fc regions, recombinant Fc regions, and variant Fc regions. Although the boundaries of the Fc region of an immunoglobulin heavy chain might vary, the human IgG heavy chain Fc region is often defined to stretch from an amino acid residue at position Cys226, or from Pro230, to the carboxyl-terminus thereof. The C-terminal lysine (residue 447 according to the EU numbering system) of the Fc region may be removed, for example, during production or purification of the antibody, or by recombinantly engineering the nucleic acid encoding a heavy chain of the antibody. Accordingly, a composition of intact antibodies may comprise antibody populations with all K447 residues removed, antibody populations with no K447 residues removed, and antibody populations having a mixture of antibodies with and without the K447 residue. A “functional Fc region” possesses an “effector function” of a native sequence Fc region. Exemplary “effector functions” include C1q binding; CDC; Fc receptor binding; ADCC; phagocytosis; downregulation of cell surface receptors (e.g., B cell receptor) , etc. Such effector functions generally require the Fc region to be combined with a binding region or binding domain (e.g., an antibody variable region or domain) and can be assessed using various assays known to those skilled in the art. A “variant Fc region” comprises an amino acid sequence which differs from that of a native sequence Fc region by virtue of at least one amino acid modification (e.g., substituting, addition, or deletion) . In certain embodiments, the variant Fc region has at least one amino acid substitution compared to a native sequence Fc region or to the Fc region of a parent polypeptide, for example, from about one to about ten amino acid substitutions, or from about one to about five amino acid substitutions in a native sequence Fc region or in the Fc region of a parent polypeptide. The variant Fc region herein can possess at least about 80%homology with a native sequence Fc region and / or with an Fc region of a parent polypeptide, or at least about 90%homology therewith, for example, at least about 95%homology therewith.

[0119] As used herein, an “epitope” is a term in the art and refers to a localized region of an antigen to which a binding molecule (e.g., an antibody) can specifically bind. An epitope can be a linear epitope or a conformational, non-linear, or discontinuous epitope. In the case of a polypeptide antigen, for example, an epitope can be contiguous amino acids of the polypeptide (a “linear” epitope) , or an epitope can comprise amino acids from two or more non-contiguous regions of the polypeptide (a “conformational, ” “non-linear” or “discontinuous” epitope) . It will be appreciated by one of skill in the art that, in general, a linear epitope may or may not be dependent on secondary, tertiary, or quaternary structure. For example, a binding molecule may bind to a group of amino acids regardless of whether they are folded in a natural three-dimensional protein structure. A binding molecule may require amino acid residues making up the epitope to exhibit a particular conformation (e.g., bend, twist, turn or fold) in order to recognize and bind the epitope.

[0120] “Percent (%) amino acid sequence identity” and “homology” with respect to a peptide, polypeptide or antibody sequence are defined as the percentage of amino acid residues in a candidate sequence that are identical with the amino acid residues in the specific peptide or polypeptide sequence, after aligning the sequences and introducing gaps, if necessary, to achieve the maximum percent sequence identity, and not considering any conservative substitutions as part of the sequence identity. Alignment for purposes of determining percent amino acid sequence identity can be achieved in various ways that are within the skill in the art, for instance, using publicly available computer software such as BLAST. Those skilled in the art can determine appropriate parameters for measuring alignment, including any algorithms needed to achieve maximal alignment over the full length of the sequences being compared.

[0121] The term “specificity” refers to selective recognition of a binding molecule (such as a CAR or an antibody) for a particular epitope of an antigen. Natural antibodies, for example, are monospecific. The term “multispecific” as used herein denotes that a binding molecule has two or more antigen-binding sites of which at least two bind different epitopes. “Bispecific” as used herein denotes that a binding molecule has two different antigen-binding specificities. The term “monospecific” as used herein denotes a binding molecule that has one or more binding sites each of which bind the same epitope.

[0122] The term “host” refers to a recipient who receives transplantation of a graft. In some embodiments, it may be an individual, such as a human, who receives transplantation of exogenous cells.

[0123] A “blocking” or “antagonist” antibody is one that inhibits or reduces a biological activity of the antigen to which it binds. For example, the blocking antibodies or antagonist antibodies substantially or completely inhibit the biological activity of the antigen. An "agonist" or activating antibody is one that enhances or initiates signaling by the antigen to which it binds. In some embodiments, the agonist antibodies cause or activate the signaling without the presence of the natural ligand.

[0124] “Chimeric antigen receptor” or “CAR” as used herein refers to genetically engineered receptors, which can be used to graft one or more antigen specificity onto immune effector cells, such as T cells. Some CARs are also known as “artificial T-cell receptors, ” “chimeric T cell receptors, ” or “chimeric immune receptors. ” The CAR may comprise an extracellular antigen binding domain specific for one or more antigens (such as tumor antigens) , a transmembrane domain, and an intracellular signaling domain of a T cell and / or other receptors. “CAR-T cell” refers to a T cell that expresses a CAR.

[0125] The terms “polypeptide” and “peptide” and “protein” are used interchangeably herein and refer to polymers of amino acids of any length. The polymer may be linear or branched, it may comprise modified amino acids, and it may be interrupted by non-amino acids. The terms also encompass an amino acid polymer that has been modified naturally or by intervention; for example, disulfide bond formation, glycosylation, lipidation, acetylation, phosphorylation, or any other manipulation or modification. Also included within the definition are, for example, polypeptides containing one or more analogs of an amino acid, including but not limited to, unnatural amino acids, as well as other modifications known in the art. It is understood that, because the polypeptides of this disclosure may be based upon antibodies or other members of the immunoglobulin superfamily, a “polypeptide” can occur as a single chain or as two or more associated chains.

[0126] “Polynucleotide” or “nucleic acid, ” as used interchangeably herein, refers to polymers of nucleotides of any length and includes DNA and RNA. The nucleotides can be deoxyribonucleotides, ribonucleotides, modified nucleotides or bases, and / or their analogs, or any substrate that can be incorporated into a polymer by DNA or RNA polymerase or by a synthetic reaction. A polynucleotide may comprise modified nucleotides, such as methylated nucleotides and their analogs. “Oligonucleotide, ” as used herein, refers to short, generally single-stranded, synthetic polynucleotides that are generally, but not necessarily, fewer than about 200 nucleotides in length. The terms “oligonucleotide” and “polynucleotide” are not mutually exclusive. The description above for polynucleotides is equally and fully applicable to oligonucleotides. A cell that produces a binding molecule of the present disclosure may include a parent hybridoma cell, as well as bacterial and eukaryotic host cells into which nucleic acids encoding the antibodies have been introduced. Unless specified otherwise, the left-hand end of any single-stranded polynucleotide sequence disclosed herein is the 5′ end; the left-hand direction of double-stranded polynucleotide sequences is referred to as the 5′ direction. The direction of 5′ to 3′ addition of nascent RNA transcripts is referred to as the transcription direction; sequence regions on the DNA strand having the same sequence as the RNA transcript that are 5′ to the 5′ end of the RNA transcript are referred to as “upstream sequences” ; sequence regions on the DNA strand having the same sequence as the RNA transcript that are 3′ to the 3′ end of the RNA transcript are referred to as “downstream sequences. ”

[0127] The term “vector” refers to a substance that is used to carry or include a nucleic acid sequence, including for example, a nucleic acid sequence encoding a binding molecule (e.g., an antibody) as described herein, in order to introduce a nucleic acid sequence into a host cell. Vectors applicable for use include, for example, expression vectors, plasmids, phage vectors, viral vectors, episomes, and artificial chromosomes, which can include selection sequences or markers operable for stable integration into a host cell’s chromosome. Additionally, the vectors can include one or more selectable marker genes and appropriate expression control sequences.

[0128] The term “host cell” as used herein refers to a particular subject cell that may be transfected with a nucleic acid molecule and the progeny or potential progeny of such a cell. Progeny of such a cell may not be identical to the parent cell transfected with the nucleic acid molecule due to mutations or environmental influences that may occur in succeeding generations or integration of the nucleic acid molecule into the host cell genome.

[0129] As used herein, the term “autologous” is meant to refer to any material derived from the same individual to whom it is later to be re-introduced into the individual. “Allogeneic” refers to a graft derived from a different individual of the same species.

[0130] “In vivo cell therapy” refers to a therapeutic approach wherein therapeutic cells, such as immune cells (e.g., T cells, NK cells) or stem cells, are genetically modified or engineered directly within the patient’s body to achieve specific therapeutic outcomes. This can include the introduction of new genetic material, such as chimeric antigen receptors (CARs) , the knockout or knockdown of specific genes, or other forms of gene editing to enhance or alter cellular function. Unlike ex vivo cell therapy, which involves extracting, modifying, and reintroducing cells into the patient, in vivo cell therapy performs these genetic modifications directly within the patient’s physiological environment.

[0131] The term “transfected” or “transformed” or “transduced” as used herein refers to a process by which exogenous nucleic acid is transferred or introduced into the host cell. A “transfected” or “transformed” or “transduced” cell is one which has been transfected, transformed or transduced with exogenous nucleic acid. The cell includes the primary subject cell and its progeny.

[0132] The term “pharmaceutically acceptable” as used herein means being approved by a regulatory agency of the Federal or a state government, or listed in United States Pharmacopeia, European Pharmacopeia, or other generally recognized Pharmacopeia for use in animals, and more particularly in humans.

[0133] The term “effective amount” or “therapeutically effective amount” as used herein refers to the amount or dosage of a therapeutic agent or composition sufficient to effect beneficial or desired results including halting, slowing, retarding, or inhibiting progression of a disease, e.g., a cancer. An effective amount will vary depending upon, e.g., an age and a body weight of a subject to which the therapeutic agent and / or therapeutic compositions is to be administered, a severity of symptoms and a route of administration, and thus administration can be determined on an individual basis.

[0134] The terms “subject, ” “individual, ” and “patient” may be used interchangeably. As used herein, in certain embodiments, a subject or an individual is a mammal, such as a non-primate or a primate (e.g., human) . In one embodiment, the individual is a mammal, e.g., a human, diagnosed with a disease or disorder, or at risk of developing a disease or disorder.

[0135] “Administer” or “administration” refers to the act of injecting or otherwise physically delivering a substance as it exists outside the body into a patient, such as by mucosal, intradermal, intravenous, intramuscular delivery, and / or any other method of physical delivery described herein or known in the art.

[0136] As used herein, the terms “treat, ” “treatment” and “treating” refer to the reduction or amelioration of the progression, severity, and / or duration of a disease or condition resulting from the administration of one or more therapies. Treating may be determined by assessing whether there has been a decrease, alleviation and / or mitigation of one or more symptoms associated with the underlying disorder such that an improvement is observed with the patient, despite that the patient may still be afflicted with the underlying disorder. The term “treating” includes both managing and ameliorating the disease. The terms “manage, ” “managing, ” and “management” refer to the beneficial effects that a subject derives from a therapy which does not necessarily result in a cure of the disease.

[0137] The terms “prevent, ” “preventing, ” and “prevention” refer to reducing the likelihood of the onset (or recurrence) of a disease, disorder, condition, or associated symptom (s) (e.g., an autoimmune disease or a cancer) .

[0138] As used herein, the term “derived from” refers to a molecule, domain, or sequence that is obtained directly or indirectly from a specified source, including but not limited to isolation, synthesis, modification, or genetic engineering of the source material. “Derived from” as that term is used herein, indicates a relationship between a first and a second molecule. It generally refers to structural similarity between the first molecule and a second molecule and does not connotate or include a process or source limitation on a first molecule that is derived from a second molecule. For example, in the case of an intracellular signaling domain that is derived from a CD3zeta molecule, the intracellular signaling domain retains sufficient CD3zeta sequence / structure such that is has the required function, namely, the ability to generate a signal under the appropriate conditions. It does not connotate or include a limitation to a particular process of producing the intracellular signaling domain, for example, it does not mean that, to provide the intracellular signaling domain, one must start with a CD3zeta sequence and delete unwanted sequence, or impose mutations, to arrive at the intracellular signaling domain. A domain derived from a particular protein may have a sequence that is at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%identical to the relevant functional portion of the particular protein.

[0139] The terms “about” and “approximately” mean within 20%, within 15%, within 10%, within 9%, within 8%, within 7%, within 6%, within 5%, within 4%, within 3%, within 2%, within 1%, or less of a given value or range.

[0140] As used in the present disclosure and claims, the singular forms “a” , “an” and “the” include plural forms unless the context clearly dictates otherwise.

[0141] The term “between” as used in a phrase as such “between A and B” or “between A-B” refers to a range including both A and B.

[0142] The term “and / or” as used in a phrase such as “A and / or B” herein is intended to include both A and B; A or B; A (alone) ; and B (alone) . Likewise, the term “and / or” as used in a phrase such as “A, B, and / or C” is intended to encompass each of the following embodiments: A, B, and C; A, B, or C; A or C; A or B; B or C; A and C; A and B; B and C; A (alone) ; B (alone) ; and C (alone) .

[0143] 5.2 FcRH5 binding molecule

[0144] Provided herein are binding molecules that specifically bind to FcRH5. A FcRH5 binding molecule may specifically binds human FcRH5. A FcRH5 binding molecule may specifically binds an extracellular domain of FcRH5.

[0145] In some embodiments, the FcRH5 binding molecule is derived from any species, including but not limited to human, murine, or synthetic sources. In some embodiments, the FcRH5 binding molecule is produced by any method, including but not limited to recombinant expression, chemical synthesis, or hybridoma technology. The FcRH5 binding molecule can bind FcRH5 derived from any organism, including but not limited to, dogs, cats, pigs, cows, sheep, goats, horses, rats, rabbits, hamsters, guinea pigs, monkeys, mice, and humans.

[0146] One aspect of the present disclosure provides a FcRH5 binding molecule comprising a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of the CDR1, CDR2, and CDR3, respectively, as set forth in SEQ ID NO: 5; a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of the CDR1, CDR2, and CDR3, respectively, as set forth in SEQ ID NO: 11; a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of the CDR1, CDR2, and CDR3, respectively, as set forth in SEQ ID NO: 12; and / or a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of the CDR1, CDR2, and CDR3, respectively, as set forth in SEQ ID NO: 18.

[0147] Other aspect of the present disclosure provides a FcRH5 binding molecule comprising a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, and SEQ ID NO: 10, respectively; a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, and SEQ ID NO: 10, respectively; a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, and SEQ ID NO: 17, respectively; a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, and SEQ ID NO: 17, respectively; and / or a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 19, and SEQ ID NO: 17, respectively.

[0148] In some embodiments, the CDR1, CDR2 and / or CDR3 are determined according to the AbM numbering scheme, the IMGT numbering scheme, the Kabat numbering scheme, the Chothia numbering scheme, the Contact numbering scheme, or any combination thereof. In some embodiments, the CDR1, CDR2 and / or CDR3 are determined according to the AbM numbering scheme. In some embodiments, the CDR1, CDR2 and / or CDR3 are determined according to the Kabat numbering scheme. In some embodiments, the binding molecule further comprises framework regions (FRs) . In some embodiments, the FRs are derived from a human immunoglobulin heavy chain variable region sequence. In some embodiments, the binding molecule comprises the amino acid sequence of one or more of SEQ ID NOs: 5, 11-12, and 18, or an amino acid sequence having at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%sequence identity to the amino acid sequence of one or more of SEQ ID NOs: 5, 11-12, and 18.

[0149] In some embodiments, the FcRH5 binding molecule provided herein is selected from the group consisting of an antibody or antigen binding fragment thereof, a fusion protein or chimeric protein (e.g., a chimeric receptor) , an immunoconjugate (e.g., an antibody-drug conjugate (ADC) ) , an antibody-siRNA conjugate (ARC) , an antibody-oligonucleotide conjugate (AOC) , an antibody-detection tag conjugate, and an immunocytokine.

[0150] 5.2.1 Antibody or antigen binding fragment

[0151] The present disclosure provides an antibody or antigen-binding fragment thereof that binds to FcRH5. In some embodiments, the FcRH5 binding molecule described above is the antibody or antigen-binding fragment thereof that binds to FcRH5.

[0152] One aspect of the present disclosure provides an anti-FcRH5 antibody or antigen-binding fragment thereof comprising a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of the CDR1, CDR2, and CDR3, respectively, as set forth in SEQ ID NO: 5; a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of the CDR1, CDR2, and CDR3, respectively, as set forth in SEQ ID NO: 11; a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of the CDR1, CDR2, and CDR3, respectively, as set forth in SEQ ID NO: 12; and / or a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of the CDR1, CDR2, and CDR3, respectively, as set forth in SEQ ID NO: 18.

[0153] Other aspect of the present disclosure provides an anti-FcRH5 antibody or antigen-binding fragment thereof comprising a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, and SEQ ID NO: 10, respectively; a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, and SEQ ID NO: 10, respectively; a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, and SEQ ID NO: 17, respectively; a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, and SEQ ID NO: 17, respectively; and / or a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 19, and SEQ ID NO: 17, respectively.

[0154] In some embodiments, the CDR1, CDR2 and / or CDR3 are determined according to the AbM numbering scheme, the IMGT numbering scheme, the Kabat numbering scheme, the Chothia numbering scheme, the Contact numbering scheme, or any combination thereof. In some embodiments, the CDR1, CDR2 and / or CDR3 are determined according to the AbM numbering scheme. In some embodiments, the CDR1, CDR2 and / or CDR3 are determined according to the Kabat numbering scheme. In some embodiments, the binding molecule further comprises framework regions (FRs) . In some embodiments, the FRs are derived from a human immunoglobulin heavy chain variable region sequence. In some embodiments, the binding molecule comprises the amino acid sequence of one or more of SEQ ID NOs: 5, 11-12, and 18, or an amino acid sequence having at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%sequence identity to the amino acid sequence of one or more of SEQ ID NOs: 5, 11-12, and 18.

[0155] In some embodiments, the antibody or antigen binding fragment thereof provided herein is a murine, camelid, chimeric, human or humanized single domain antibody, or an antigen binding fragment thereof. In some embodiments, the antibody is isolated. In some embodiments, the antibody is substantially pure.

[0156] In some embodiments, the antibody or antigen-binding fragment thereof is monospecific. In some embodiments, the antibody or antigen-binding fragment thereof is bispecific. In some embodiments, the antibody or antigen-binding fragment thereof is multispecific.

[0157] In some embodiments, the antibody or antigen-binding fragment thereof is monovalent. In some embodiments, the antibody or antigen-binding fragment thereof is bivalent. In some embodiments, the antibody or antigen-binding fragment thereof is multivalent.

[0158] In some embodiments, the antibody or antigen-binding fragment thereof is a humanized antibody. Various methods for generating humanized antibodies are known in the art and as described in more detail below. In some embodiments, a humanized antibody comprises one or more amino acid residues that have been introduced into its sequence from a source that is non-human.

[0159] In some embodiments, the antibody or antigen binding fragment thereof is a monoclonal antibody (mAb) , a Fab, a Fab′, a F (ab′) 2, a Fv, VHH, a single chain Fv (scFv) , a single domain antibody (sdAb) , a minibody, a diabody, an antibody mimetic or chemically linked F (ab′) 2.

[0160] In some embodiments, the antibody or antigen binding fragment is a single domain antibody. In some embodiments, the single domain antibody is a heavy chain-only antibody (HCAb) , and the antigen binding fragment is a variable region of heavy chain-only antibody (HCAb) , i.e., a VHH fragment, or a VHH fragment with a complete or partial heavy chain constant region. In some embodiments, the antibody or antigen binding fragment comprises at least two VHH fragments connected by linker (s) , wherein the VHH fragments bind to a same antigen epitope. In some embodiments, the antibody or antigen binding fragment comprises at least two VHH fragments connected by linker (s) , wherein these VHH fragments bind to different antigen epitopes. In some embodiments, the antibody or antigen binding fragment comprises one or more VHH domains linked to a complete or partial heavy chain constant region. In some embodiments, the heavy chain constant region is an immunoglobin heavy chain constant region or a portion of an immunoglobin heavy chain constant region, such as a hinge-CH2-CH3 domain of an immunoglobin heavy chain constant region. In some embodiments, the heavy chain constant region is an IgG1, IgG2, IgG3 or IgG4 heavy chain constant region, or a portion thereof, such as a hinge-CH2-CH3 domain of an IgG1, IgG2, IgG3 or IgG4 heavy chain constant region. In some embodiments, heavy chain constant region is a hinge-CH2-CH3 domain of a human, mouse, or camelid IgG1, IgG2, IgG3 or IgG4 heavy chain constant region.

[0161] In some embodiments, the FcRH5 binding molecule provides a binding moiety comprising (i) the anti-FcRH5 single domain antibody or an antigen binding fragment linked to (ii) an antibody light chain or a portion thereof. For example, two parts linked by disulfite bonds. In some embodiments, the binding moiety is a mAb, a Fab, a Fab’ , a F (ab’ ) 2, a Fv, a scFv, a (scFv) 2, an IgG1 antibody, an IgG2 antibody, an IgG3 antibody, or an IgG4 antibody.

[0162] The FcRH5 binding molecules provided herein include anti-FcRH5 single domain antibodies provided herein, and humanized versions thereof, and antigen binding fragments thereof, with CDR1, CDR2, CDR3 defined according to AbM numbering scheme or Kabat numbering scheme.

[0163] In some embodiments, a FcRH5 binding molecule is an anti-FcRH5 single domain antibody that comprises one, two, and / or three CDRs of any one of the antibodies described herein. In some embodiments, the anti-FcRH5 single domain antibody contains a constant region linked to the C-terminus of the VHH domain.

[0164] In some embodiments, there is provided an anti-FcRH5 single domain antibody (sdAb) comprising one, two, or all three CDRs of the amino acid sequence of any of SEQ ID NOs: 5, 11, 12, and 18, or variants of any CDR regions thereof comprising up to 5 (e.g., 5, 4, 3, 2, or 1) amino acid variations (e.g., insertion, deletion, or substitution, such as conservative substitution) . In some embodiments, the anti-FcRH5 single domain antibody is camelid. In some embodiments, the anti-FcRH5 single domain antibody is humanized. In some embodiments, the anti-FcRH5 single domain antibody comprises an acceptor human framework, e.g., a human immunoglobulin framework or a human consensus framework.

[0165] In some embodiments, the single domain antibody has a CDR1 having an amino acid sequence of the CDR1 as set forth in SEQ ID NO: 6 or 8. In some embodiments, the single domain antibody has a CDR2 having an amino acid sequence of the CDR2 as set forth in SEQ ID NO: 7 or 9. In some embodiments, the single domain antibody has a CDR3 having an amino acid sequence of the CDR3 as set forth in SEQ ID NO: 10. In some embodiments, the single domain antibody has a CDR1 and a CDR2 having amino acid sequences of the CDR1 and the CDR2 as set forth in SEQ ID NO: 5 or 11. In some embodiments, the single domain antibody has a CDR1 and a CDR3 having amino acid sequences of the CDR1 and the CDR3 as set forth in SEQ ID NO: 5 or 11. In some embodiments, the single domain antibody has a CDR2 and a CDR3 having amino acid sequences of the CDR2 and the CDR3 as set forth in SEQ ID NO: 5 or 11. In some embodiments, the single domain antibody has a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having amino acid sequences of the CDR1, the CDR2, and the CDR3 as set forth in SEQ ID NO: 5 or 11.

[0166] In some embodiments, the single domain antibody has a CDR1 having an amino acid sequence of the CDR1 as set forth in SEQ ID NO: 13 or 15. In some embodiments, the single domain antibody has a CDR2 having an amino acid sequence of the CDR2 as set forth in SEQ ID NO: 14, 16 or 19. In some embodiments, the single domain antibody has a CDR3 having an amino acid sequence of the CDR3 as set forth in SEQ ID NO: 17. In some embodiments, the single domain antibody has a CDR1 and a CDR2 having amino acid sequences of the CDR1 and the CDR2 as set forth in SEQ ID NO: 12 or 18. In some embodiments, the single domain antibody has a CDR1 and a CDR3 having amino acid sequences of the CDR1 and the CDR3 as set forth in SEQ ID NO: 12 or 18. In some embodiments, the single domain antibody has a CDR2 and a CDR3 having amino acid sequences of the CDR2 and the CDR3 as set forth in SEQ ID NO: 12 or 18. In some embodiments, the single domain antibody has a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having amino acid sequences of the CDR1, the CDR2, and the CDR3 as set forth in SEQ ID NO: 12 or 18.

[0167] In some embodiments, the single domain antibody has a CDR1 having an amino acid sequence of the CDR1 as set forth in SEQ ID NO: 6, has a CDR2 having an amino acid sequence of the CDR2 as set forth in SEQ ID NO: 7, and has a CDR3 having an amino acid sequence of the CDR3 as set forth in SEQ ID NO: 10.

[0168] In some embodiments, the single domain antibody has a CDR1 having an amino acid sequence of the CDR1 as set forth in SEQ ID NO: 8, has a CDR2 having an amino acid sequence of the CDR2 as set forth in SEQ ID NO: 9, and has a CDR3 having an amino acid sequence of the CDR3 as set forth in SEQ ID NO: 10.

[0169] In some embodiments, the single domain antibody has a CDR1 having an amino acid sequence of the CDR1 as set forth in SEQ ID NO: 13, has a CDR2 having an amino acid sequence of the CDR2 as set forth in SEQ ID NO: 14, and has a CDR3 having an amino acid sequence of the CDR3 as set forth in SEQ ID NO: 17.

[0170] In some embodiments, the single domain antibody has a CDR1 having an amino acid sequence of the CDR1 as set forth in SEQ ID NO: 15, has a CDR2 having an amino acid sequence of the CDR2 as set forth in SEQ ID NO: 16, and has a CDR3 having an amino acid sequence of the CDR3 as set forth in SEQ ID NO: 17.

[0171] In some embodiments, the single domain antibody has a CDR1 having an amino acid sequence of the CDR1 as set forth in SEQ ID NO: 15, has a CDR2 having an amino acid sequence of the CDR2 as set forth in SEQ ID NO: 19, and has a CDR3 having an amino acid sequence of the CDR3 as set forth in SEQ ID NO: 17.

[0172] In some embodiments, the CDRs are determined according to AbM numbering. In some embodiments, the CDRs are determined according to Kabat numbering. In some embodiments, the CDRs are determined according to IMGT numbering. In other embodiments, the CDRs are determined according to Chothia numbering. In other embodiments, the CDRs are determined according to Contact numbering. In other embodiments, the CDRs are determined according to a combination of various numbering systems, e.g., a combination of Kabat and Chothia numbering systems, or a combination of Kabat and IMGT numbering systems.

[0173] In some embodiments, the anti-FcRH5 single domain antibody is camelid. In some embodiments, the anti-FcRH5 single domain antibody is humanized. In some embodiments, the anti-FcRH5 single domain antibody comprises an acceptor human framework, e.g., a human immunoglobulin framework or a human consensus framework.

[0174] In some embodiments, the single domain antibody further comprises one or more framework region (s) .

[0175] In some embodiments, the single domain antibody provided herein is a humanized single domain antibody. In some embodiments, humanized single domain antibodies can be generated using the methods described in the section below.

[0176] In some embodiments, there is provided an anti-FcRH5 single domain antibody comprising a VHH domain having the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 5, 11, 12 and 18, or an amino acid sequence having at least 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%sequence identity to the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 5, 11, 12 and 18. In some embodiments, there is provided a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, 11, 12 and 18, or an amino acid sequence having at least 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%sequence identity to the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 5, 11, 12 and 18.

[0177] In some embodiments, there is provided an anti-FcRH5 single domain antibody comprising a VHH domain having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, or an amino acid sequence having at least 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5. In some embodiments, there is provided a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, or an amino acid sequence having at least 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5.

[0178] In some embodiments, there is provided an anti-FcRH5 single domain antibody comprising a VHH domain having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11, or an amino acid sequence having at least 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11. In some embodiments, there is provided a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11, or an amino acid sequence having at least 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11.

[0179] In some embodiments, there is provided an anti-FcRH5 single domain antibody comprising a VHH domain having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12, or an amino acid sequence having at least 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12. In some embodiments, there is provided a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12, or an amino acid sequence having at least 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12.

[0180] In some embodiments, there is provided an anti-FcRH5 single domain antibody comprising a VHH domain having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18, or an amino acid sequence having at least 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18. In some embodiments, there is provided a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18, or an amino acid sequence having at least 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18.

[0181] In certain embodiments, an antibody described herein, or an antigen-binding fragment thereof comprises amino acid sequences with certain percent identity relative to any one of antibodies described above.

[0182] In some embodiments, there is provided an anti-FcRH5 sdAb comprising three CDRs comprising: (a) a CDR1 having at least about 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%sequence identity to an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 6, 8, 13, and 15; (b) a CDR2 having at least about 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%sequence identity to an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 7, 9, 14, 16 and 19; and (c) a CDR3 having at least about 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%sequence identity to an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 10 and 17. In some embodiments, a CDR having at least about any one of 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%identity contains substitutions (e.g., conservative substitutions) , insertions, or deletions relative to the reference sequence, but the anti-FcRH5 sdAb comprising that sequence retains the ability to bind to FcRH5. In some embodiments, there is provided an anti-FcRH5 sdAb comprising three CDRs comprising: (a) a CDR1 having about any one of 1, 2, 3, 4 or 5 amino acid substitutions (e.g., conservative substitutions) , insertions, or deletions to an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 6, 8, 13 and 15; (b) a CDR2 having about any one of 1, 2, 3, 4 or 5 amino acid substitutions (e.g., conservative substitutions) , insertions, or deletions to an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 7, 9, 14, 16 and 19; and (c) a CDR3 having about any one of 1, 2, 3, 4 or 5 amino acid substitutions (e.g., conservative substitutions) , insertions, or deletions to an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 10 and 17. In some embodiments, the anti-FcRH5 sdAb is affinity matured. In some embodiments, the anti-FcRH5 sdAb is camelid. In some embodiments, the anti-FcRH5 sdAb is humanized. In some embodiments, the anti-FcRH5 sdAb comprises an acceptor human framework, e.g., a human immunoglobulin framework or a human consensus framework.

[0183] In certain embodiments, the single domain antibody described herein comprises a VHH domain having at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, or at least 99%sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, wherein the single domain antibody binds to FcRH5. In certain embodiments, the single domain antibody described herein comprises a VHH domain having at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, or at least 99%sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11, wherein the single domain antibody binds to FcRH5. In certain embodiments, the single domain antibody described herein comprises a VHH domain having at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, or at least 99%sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12, wherein the single domain antibody binds to FcRH5. In certain embodiments, the single domain antibody described herein comprises a VHH domain having at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, or at least 99%sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18, wherein the single domain antibody binds to FcRH5. In some embodiments, a VHH sequence having at least about any one of 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%identity contains substitutions (e.g., conservative substitutions) , insertions, or deletions relative to the reference sequence, but the anti-FcRH5 single domain antibody comprising that sequence retains the ability to bind to FcRH5. In some embodiments, a total of 1 to 10 amino acid (s) has (have) been substituted, inserted, and / or deleted in an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 5, 11, 12, and 18. In some embodiments, substitutions, insertions, or deletions occur in regions outside the CDRs (i.e., in the FRs) .

[0184] In some embodiments, functional epitopes can be mapped, e.g., by combinatorial alanine scanning, to identify amino acids in the FcRH5 protein that are necessary for interaction with anti-FcRH5 single domain antibodies provided herein. In some embodiments, conformational and crystal structure of anti-FcRH5 single domain antibody bound to FcRH5 may be employed to identify the epitopes. In some embodiments, the present disclosure provides an antibody that specifically binds to the same epitope as any of the anti-FcRH5 single domain antibodies provided herein. For example, in some embodiments, an antibody is provided that binds to the same epitope as an anti-FcRH5 single domain antibody comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 or 11. In some embodiments, an antibody is provided that binds to the same epitope as an anti-FcRH5 single domain antibody comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12 or 18.

[0185] In some embodiments, provided herein is an anti-FcRH5 antibody, or antigen binding fragment thereof, that specifically binds to FcRH5 competitively with any one of the anti-FcRH5 single domain antibodies described herein. In some embodiments, competitive binding may be determined using an ELISA assay. For example, in some embodiments, an antibody is provided that specifically binds to FcRH5 competitively with an anti-FcRH5 single domain antibody comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 or 11. In some embodiments, an antibody is provided that specifically binds to FcRH5 competitively with an anti-FcRH5 single domain antibody comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12 or 18.

[0186] In some embodiments, the anti-FcRH5 single domain antibody comprises a Fc region. In some embodiments, the Fc region is the Fc of human IgG1, IgG2, IgG3, or IgG4. In some embodiments, a FcRH5 binding molecule comprises a variant of an anti-FcRH5 single domain antibody described herein. In some embodiments, a variant of the anti-FcRH5 single domain antibody comprises one to thirty conservative amino acid substitutions. In some embodiments, a variant of the anti-FcRH5 single domain antibody comprises one to twenty-five conservative amino acid substitutions. In some embodiments, a variant of the anti-FcRH5 single domain antibody comprises one to twenty conservative amino acid substitutions. In some embodiments, a variant of the anti-FcRH5 single domain antibody comprises one to fifteen conservative amino acid substitutions. In some embodiments, a variant of the anti-FcRH5 single domain antibody comprises one to ten conservative amino acid substitutions. In some embodiments, a variant of the anti-FcRH5 single domain antibody comprises one to five conservative amino acid substitutions. In some embodiments, a variant of the anti-FcRH5 single domain antibody comprises one to three conservative amino acid substitutions. In some embodiments, the conservative amino acid substitution is in a CDR of the antibody. In some embodiments, the conservative amino acid substitution is not in a CDR of the antibody. In some embodiments, the conservative amino acid substitution is in a framework region of the antibody.

[0187] In some embodiments, there is provided an anti-FcRH5 antibody or antigen binding protein comprising any one of the anti-FcRH5 sdAbs described above. In some embodiments, the anti-FcRH5 antibody is a monoclonal antibody, including a camelid, chimeric, humanized or human antibody. In some embodiments, the anti-FcRH5 antibody is an antibody fragment, e.g., a VHH fragment. In some embodiments, the anti-FcRH5 antibody is a full-length heavy-chain only antibody comprising an Fc region of any antibody class or isotype, such as IgG1 or IgG4. In some embodiments, the Fc region has reduced or minimized effector function, if needed. In some embodiments, provided herein is an isolated nucleic acid encoding any of the FcRH5 binding molecules provided herein. More detailed descriptions regarding nucleic acid sequences and vectors are provided below.

[0188] In some embodiments, the anti-FcRH5 antibody (such as anti-FcRH5 single domain antibody) or antigen binding fragment according to any of the above embodiments may incorporate any of the features, singly or in combination, as described below. Various aspects mentioned above are also further described with more details in the following sections.

[0189] Humanized Antibody or antigen binding fragment

[0190] The antibodies or antigen binding fragments (e.g., sdAbs) described herein include humanized antibodies or fragments.

[0191] Humanized antibodies, such as the humanized single domain antibodies disclosed herein can also be produced using a variety of techniques known in the art, including but not limited to, CDR-grafting (European Patent No. EP239, 400; International publication No. WO 91 / 09967; and U.S. Patent Nos. 5,225,539, 5,530,101, and 5,585,089) , veneering or resurfacing (European Patent Nos. EP592,106 and EP519,596; Padlan, Molecular Immunology 28 (4 / 5) : 489-498 (1991) ; Studnicka et al., Protein Engineering 7 (6) : 805-814 (1994) ; and Roguska et al., PNAS 91: 969-973 (1994) ) , chain shuffling (U.S. Patent No. 5,565,332) , and techniques disclosed in, e.g., U.S. Pat. No. 6,407,213, U.S. Pat. No. 5,766,886, WO 9317105, Tan et al., J. Immunol. 169: 1119 25 (2002) , Caldas et al., Protein Eng. 13 (5) : 353-60 (2000) , Morea et al., Methods 20 (3) : 267 79 (2000) , Baca et al., J. Biol. Chem. 272 (16) : 10678-84 (1997) , Roguska et al., Protein Eng. 9 (10) : 895 904 (1996) , Couto et al., Cancer Res. 55 (23 Supp) : 5973s-5977s (1995) , Couto et al., Cancer Res. 55 (8) : 1717-22 (1995) , Sandhu JS, Gene 150 (2) : 409-10 (1994) , and Pedersen et al., J. Mol. Biol. 235 (3) : 959-73 (1994) . See also U.S. Patent Pub. No. US 2005 / 0042664 A1, each of which is incorporated by reference herein in its entirety.

[0192] Antibody Variants

[0193] In some embodiments, amino acid sequence modification (s) of the antibodies or antigen binding fragments thereof that bind to FcRH5 described herein are contemplated. For example, it may be desirable to optimize the binding affinity and / or other biological properties of the antibody, including but not limited to specificity, thermostability, expression level, effector functions, glycosylation, reduced immunogenicity, or solubility. Thus, in addition to the antibodies or antigen binding fragments thereof that bind to FcRH5 described herein, it is contemplated that variants of the antibodies or the fragments that bind to FcRH5 described herein can be prepared. For example, antibody or fragment variants can be prepared by introducing appropriate nucleotide changes into the encoding DNA, and / or by synthesis of the desired antibody or polypeptide. Those skilled in the art who appreciate that amino acid changes may alter post-translational processes of the antibody or antigen binding fragment thereof.

[0194] In some embodiments, the antibodies or antigen binding fragments thereof provided herein are chemically modified, for example, by the covalent attachment of any type of molecule to the antibody or fragment. The antibody derivatives may include antibodies that have been chemically modified, for example, by glycosylation, acetylation, pegylation, phosphorylation, amidation, derivatization by known protecting / blocking groups, proteolytic cleavage, linkage to a cellular ligand or other protein, or conjugation to one or more immunoglobulin domains (e.g., Fc or a portion of an Fc) . Any of numerous chemical modifications may be carried out by known techniques, including, but not limited to, specific chemical cleavage, acetylation, formulation, metabolic synthesis of tunicamycin, etc. Additionally, the antibody may contain one or more non-classical amino acids.

[0195] Variations may be a substitution, deletion, or insertion of one or more codons encoding the single domain antibody or polypeptide that results in a change in the amino acid sequence as compared with the original antibody or polypeptide. Sites of interest for substitutional mutagenesis include the CDRs and FRs.

[0196] Amino acid substitutions can be the result of replacing one amino acid with another amino acid having similar structural and / or chemical properties, such as the replacement of a leucine with a serine, e.g., conservative amino acid replacements. Standard techniques known to those of skill in the art can be used to introduce mutations in the nucleotide sequence encoding a molecule provided herein, including, for example, site-directed mutagenesis and PCR-mediated mutagenesis which results in amino acid substitutions. Insertions or deletions may optionally be in the range of about 1 to 5 amino acids. In certain embodiments, the substitution, deletion, or insertion includes fewer than 25 amino acid substitutions, fewer than 20 amino acid substitutions, fewer than 15 amino acid substitutions, fewer than 10 amino acid substitutions, fewer than 5 amino acid substitutions, fewer than 4 amino acid substitutions, fewer than 3 amino acid substitutions, or fewer than 2 amino acid substitutions relative to the original molecule. In a specific embodiment, the substitution is a conservative amino acid substitution made at one or more predicted non-essential amino acid residues. The variation allowed may be determined by systematically making insertions, deletions, or substitutions of amino acids in the sequence and testing the resulting variants for activity exhibited by the parental antibodies.

[0197] Amino acid sequence insertions include amino-and / or carboxyl-terminal fusions ranging in length from one residue to polypeptides containing multiple residues, as well as intrasequence insertions of single or multiple amino acid residues. Examples of terminal insertions include an antibody with an N-terminal methionyl residue.

[0198] In some embodiments, substitutions, insertions, or deletions may occur within one or more CDRs so long as such alterations do not substantially reduce the ability of the antibody to bind antigen. For example, conservative alterations (e.g., conservative substitutions as provided herein) that do not substantially reduce binding affinity may be made in CDRs. In some embodiments of the variant VHH sequences provided herein, each CDR either is unaltered, or contains no more than one, two or three amino acid substitutions.

[0199] In some embodiments, a variant of a FcRH5 binding molecule disclosed herein can retain the ability to recognize a target (e.g., FcRH5) to a similar extent, the same extent, or to a higher extent, as the parent binding molecule. In some embodiments, the variant can be at least about 80%, about 85%, about 90%, about 91%, about 92%, about 93%, about 94%, about 95%, about 96%, about 97%, about 98%, or about 99%identical in amino acid sequence to the parent binding molecule. In some embodiments, the variant can have an amino acid sequence that is at least about 80%, about 85%, about 90%, about 91%, about 92%, about 93%, about 94%, about 95%, about 96%, about 97%, about 98%, or about 99%identical to the antibodies or antigen binding fragments disclosed herein.

[0200] In vitro affinity maturation

[0201] In some embodiments, antibody variants having an improved property such as affinity, stability, or expression level as compared to a parent antibody may be prepared by in vitro affinity maturation. Like the natural prototype, in vitro affinity maturation is based on the principles of mutation and selection. Libraries of antibodies are displayed on the surface of an organism (e.g., phage, bacteria, yeast, or mammalian cell) or in association (e.g., covalently or non-covalently) with their encoding mRNA or DNA. Affinity selection of the displayed antibodies allows isolation of organisms or complexes carrying the genetic information encoding the antibodies. Two or three rounds of mutation and selection using display methods such as phage display usually results in antibody fragments with affinities in the low nanomolar range. Affinity matured antibodies can have nanomolar or even picomolar affinities for the target antigen. In vitro affinity maturation can be accomplished by various methods known in the art, see for example, Hoogenboom, Nature Biotechnology 23: 1105-16 (2005) ; Quiroz and Sinclair, Revista Ingeneria Biomedia 4: 39-51 (2010) ; and references therein.

[0202] Modifications of antibodies

[0203] Covalent modifications of antibodies or antigen binding fragments thereof are included within the scope of the present disclosure. Covalent modifications include reacting targeted amino acid residues of an antibody or antigen binding fragment thereof with an organic derivatizing agent that is capable of reacting with selected side chains or the N-or C-terminal residues of the antibody or fragment. Other modifications include deamidation of glutaminyl and asparaginyl residues to the corresponding glutamyl and aspartyl residues, respectively, hydroxylation of proline and lysine, phosphorylation of hydroxyl groups of seryl or threonyl residues, methylation of the α-amino groups of lysine, arginine, and histidine side chains (see, e.g., Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties 79-86 (1983) ) , acetylation of the N-terminal amine, and amidation of any C-terminal carboxyl group.

[0204] Other types of covalent modification of the antibody or antigen binding fragment thereof included within the scope of this present disclosure include altering the native glycosylation pattern of the antibody or polypeptide as described above (see, e.g., Beck et al., Curr. Pharm. Biotechnol. 9: 482-501 (2008) ; and Walsh, Drug Discov. Today 15: 773-80 (2010) ) and linking the antibody to one of a variety of nonproteinaceous polymers, e.g., polyethylene glycol (PEG) , polypropylene glycol, or polyoxyalkylenes, in the manner set forth, for example, in U.S. Pat. Nos. 4,640,835; 4,496,689; 4,301,144; 4,670,417; 4,791,192; or 4,179,337. The antibody or fragment thereof that binds to FcRH5 of the disclosure may also be genetically fused or conjugated to one or more immunoglobulin constant regions or portions thereof (e.g., Fc) to extend half-life and / or to impart known Fc-mediated effector functions.

[0205] Also provided herein are panels of antibodies that bind to a FcRH5 antigen. In specific embodiments, the panels of antibodies have different association rates, different dissociation rates, different affinities for a FcRH5 antigen, and / or different specificities for a FcRH5 antigen. In some embodiments, the panels comprise or consist of about 10 to about 1000 antibodies or more. Panels of antibodies can be used, for example, in 96-well or 384-well plates, for assays such as ELISAs.

[0206] 5.2.2 Binding molecules comprising the antibody or antigen binding fragment thereof

[0207] In another aspect, provided herein is a FcRH5 binding molecule comprising an antibody or antigen binding fragment (e.g., a single domain antibody against FcRH5) provided herein. In some embodiments, an anti-FcRH5 antibody or antigen binding fragment (e.g., a single domain antibody against FcRH5) provided herein is part of other binding molecules. In some embodiments, the FcRH5 binding molecule provided herein is a fusion protein. In some embodiments, the FcRH5 binding molecule provided herein is an immunoconjugate. Exemplary binding molecules of the present disclosure are described herein.

[0208] Fusion Protein

[0209] In various embodiments, the antibody or antigen binding fragment thereof provided herein can be genetically fused or chemically conjugated to another agent, for example, protein-based entities. The antibody or antigen binding fragment thereof may be chemically conjugated to the agent, or otherwise non-covalently conjugated to the agent. The agent can be a peptide or an antibody (or a fragment thereof) . The fusion proteins provided herein can be produced using various techniques known in the art.

[0210] Thus, in some embodiments, provided herein are antibodies or antigen binding fragments (e.g., single domain antibodies) that are recombinantly fused or chemically conjugated (covalent or non-covalent conjugations) to a heterologous protein or polypeptide (or fragment thereof, for example, to a polypeptide of about 10, about 20, about 30, about 40, about 50, about 60, about 70, about 80, about 90, about 100, about 150, about 200, about 250, about 300, about 350, about 400, about 450 or about 500 amino acids, or over 500 amino acids) to generate fusion proteins, as well as uses thereof. In particular, provided herein are fusion proteins comprising hypervariable regions (e.g., CDR1, CDR2, and / or CDR3) of the antibodies or antigen binding fragments thereof provided herein and a heterologous protein, polypeptide, or peptide.

[0211] Moreover, antibodies or antigen binding fragments thereof provided herein can be fused to marker or “tag” sequences, such as a peptide, to facilitate purification. In specific embodiments, the marker or tag amino acid sequence is a hexa-histidine peptide, hemagglutinin ( “HA” ) tag, and “FLAG” tag.

[0212] Methods for fusing or conjugating moieties (including polypeptides) to antibodies or antigen binding fragments thereof are known (see, e.g., Arnon et al., Monoclonal Antibodies for Immunotargeting of Drugs in Cancer Therapy, in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy 243-56 (Reisfeld et al. eds., 1985) ; Hellstrom et al., Antibodies for Drug Delivery, in Controlled Drug Delivery 623-53 (Robinson et al. eds., 2d ed. 1987) ; Thorpe, Antibody Carriers of Cytotoxic Agents in Cancer Therapy: A Review, in Monoclonal Antibodies: Biological and Clinical Applications 475-506 (Pinchera et al. eds., 1985) ; Analysis, Results, and Future Prospective of the Therapeutic Use of Radiolabeled Antibody in Cancer Therapy, in Monoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapy 303-16 (Baldwin et al. eds., 1985) ; Thorpe et al., Immunol. Rev. 62: 119-58 (1982) ; U.S. Pat. Nos. 5,336,603; 5,622,929; 5,359,046; 5,349,053; 5,447,851; 5,723,125; 5,783,181; 5,908,626; 5,844,095; and 5,112,946; EP307,434; EP367,166; EP394,827; PCT publications WO91 / 06570, WO96 / 04388, WO96 / 22024, WO97 / 34631, and WO99 / 04813; Ashkenazi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 10535-39 (1991) ; Traunecker et al., Nature, 331: 84-86 (1988) ; Zheng et al., J. Immunol. 154: 5590-600 (1995) ; and Vil et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 11337-41 (1992) ) .

[0213] Fusion proteins may be generated, for example, through the techniques of gene-shuffling, motif-shuffling, exon-shuffling, and / or codon-shuffling (collectively referred to as “DNA shuffling” ) . DNA shuffling may be employed to alter the activities of the single domain antibodies as provided herein, including, for example, antibodies with higher affinities and lower dissociation rates (see, e.g., U.S. Pat. Nos. 5,605,793; 5,811,238; 5,830,721; 5,834,252; and 5,837,458; Patten et al., Curr. Opinion Biotechnol. 8: 724-33 (1997) ; Harayama, Trends Biotechnol. 16 (2) : 76-82 (1998) ; Hansson et al., J. Mol. Biol. 287: 265-76 (1999) ; and Lorenzo and Blasco, Biotechniques 24 (2) : 308-13 (1998) ) . Antibodies, or the encoded antibodies, may be altered by being subjected to random mutagenesis by error-prone PCR, random nucleotide insertion, or other methods prior to recombination. A polynucleotide encoding an antibody provided herein may be recombined with one or more components, motifs, sections, parts, domains, fragments, etc. of one or more heterologous molecules.

[0214] In some embodiments, an antibody or antigen binding fragment thereof provided herein (e.g., single domain antibody) is conjugated to a second antibody or antigen binding fragment to form an antibody heteroconjugate.

[0215] In various embodiments, the antibody or antigen binding fragment thereof is genetically fused to the agent. Genetic fusion may be accomplished by placing a linker (e.g., a polypeptide) between the antibody or antigen binding fragment thereof and the agent. The linker may be a flexible linker.

[0216] In various embodiments, the antibody or antigen binding fragment thereof is genetically conjugated to a therapeutic molecule, with a hinge region linking the antibody or fragment to the therapeutic molecule.

[0217] Immunoconjugates

[0218] In some embodiments, the present disclosure also provides immunoconjugates comprising any of the antibodies or antigen binding fragments (such as anti-FcRH5 single domain antibodies) described herein conjugated to one or more cytotoxic agents, such as chemotherapeutic agents or drugs, growth inhibitory agents, toxins (e.g., protein toxins, enzymatically active toxins of bacterial, fungal, plant, or animal origin, or fragments thereof) , or therapeutic radioisotopes.

[0219] In some embodiments, an immunoconjugate is an antibody-drug conjugate (ADC) in which an antibody is conjugated to one or more drugs, including but not limited to: microtubule inhibitors: Monomethyl auristatin E (MMAE) and Monomethyl auristatin F (MMAF) (see U.S. Patent Nos. 5,635,483, 5,780,588, and 7,498,298) , Maytansinoids (e.g., DM1 and DM4) (see U.S. Patent Nos. 5,208,020, 5,416,064, and European patent EP 0 425235 B1) , Tubulysins (see U.S. Patent No. 7,741,319) , and Hemiasterlins (see U.S. Patent No. 7,276,497) ; DNA-damaging agents: Pyrrolobenzodiazepines (PBDs) and their dimers (e.g., SG3199) (see U.S. Patent Nos. 7,049,311 and 8,163,736) , Duocarmycins and their analogs (e.g., CC-1065 and its derivatives) (see U.S. Patent No. 5,475,092) , Calicheamicins (see U.S. Patent Nos. 5,712,374, 5,714,586, 5,739,116, 5,767,285, 5,770,701, 5,770,710, 5,773,001, and 5,877,296) , and Indolinobenzodiazepines (IGNs) (see U.S. Patent No. 9,676,880) ; topoisomerase inhibitors: exatecan derivatives (e.g., DXd, used in trastuzumab deruxtecan) (see U.S. Patent No. 9,840,739) , SN-38 (the active metabolite of irinotecan) (see U.S. Patent No. 7,498,298) ; other cytotoxic agents: Amatoxins (e.g., α-amanitin) (see U.S. Patent No. 10,106,634) , Tubulin polymerization inhibitors (e.g., Eribulin analogs) (see U.S. Patent No. 8,524,698) , and Kinesin spindle protein (KSP) inhibitors (e.g., Ispinesib derivatives) (see U.S. Patent No. 8,293,710) .

[0220] In some embodiments, an immunoconjugate comprises an antibody or antigen binding fragment thereof as described herein conjugated to an enzymatically active toxin or fragment thereof, including but not limited to diphtheria A chain, nonbinding active fragments of diphtheria toxin, exotoxin A chain (from Pseudomonas aeruginosa) , ricin A chain, abrin A chain, modeccin A chain, alpha-sarcin, Aleurites fordii proteins, dianthin proteins, Phytolaca americana proteins (PAPI, PAPII, and PAP-S) , momordica charantia inhibitor, curcin, crotin, sapaonaria officinalis inhibitor, gelonin, mitogellin, restrictocin, phenomycin, enomycin, and the tricothecenes.

[0221] In some embodiments, an immunoconjugate comprises an antibody or antigen binding fragment thereof as described herein conjugated to a radioactive atom to form a radioconjugate. A variety of radioactive isotopes are available for the production of radioconjugates. Examples include At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 and radioactive isotopes of Lu. When the radioconjugate is used for detection, it may comprise a radioactive atom for scintigraphic studies, for example tc99m or I123, or a spin label for nuclear magnetic resonance (NMR) imaging (also known as magnetic resonance imaging, MRI) , such as iodine-123 again, iodine-131, indium-111, fluorine-19, carbon-13, nitrogen-15, oxygen-17, gadolinium, manganese or iron.

[0222] Conjugates of an antibody and cytotoxic agent may be made using a variety of bifunctional protein coupling agents such as N-succinimidyl-3- (2-pyridyldithio) propionate (SPDP) , succinimidyl-4- (N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate (SMCC) , iminothiolane (IT) , bifunctional derivatives of imidoesters (such as dimethyl adipimidate HCl) , active esters (such as disuccinimidyl suberate) , aldehydes (such as glutaraldehyde) , bis-azido compounds (such as bis (p-azidobenzoyl) hexanediamine) , bis-diazonium derivatives (such as bis- (p-diazoniumbenzoyl) -ethylenediamine) , diisocyanates (such as toluene 2, 6-diisocyanate) , and bis-active fluorine compounds (such as 1, 5-difluoro-2, 4-dinitrobenzene) . For example, a ricin immunotoxin can be prepared as described in Vitetta et al., Science 238: 1098 (1987) . Carbon-14-labeled 1-isothiocyanatobenzyl-3-methyldiethylene triaminepentaacetic acid (MX-DTPA) is an exemplary chelating agent for conjugation of radionucleotide to the antibody. See WO94 / 11026.

[0223] The linker may be a “cleavable linker” facilitating release of the conjugated agent in the cell, but non-cleavable linkers are also contemplated herein. Linkers for use in the conjugates of the present disclosure include, without limitation, acid labile linkers (e.g., hydrazone linkers) , disulfide-containing linkers, peptidase-sensitive linkers (e.g., peptide linkers comprising amino acids, for example, valine and / or citrulline such as citrulline-valine or phenylalanine-lysine) , photolabile linkers, dimethyl linkers, thioether linkers, or hydrophilic linkers designed to evade multidrug transporter-mediated resistance.

[0224] The immunoconjugates or ADCs herein contemplate, but are not limited to such conjugates prepared with cross-linker reagents including, but not limited to, BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC, and sulfo-SMPB, and SVSB (succinimidyl- (4-vinylsulfone) benzoate) which are commercially available (e.g., from Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., U.S.A) . The immunoconjugates or ADCs herein may also be prepared with glycosylation site-specific conjugation strategies to enhance ADC homogeneity and efficacy. These methods target conserved antibody glycans (e.g., Fc N-glycans at Asn297) for precise payload attachment, including but not limited to: glycan oxidation: periodate-oxidized glycans react with hydrazide / aminooxy-functionalized linkers (e.g., MC-Val-Cit-PAB-Hydrazide or SMCC-Hydrazide) for cleavable or stable drug conjugation; enzymatic remodeling: glycosidases (Endo-S / Endo-F) or glycosyltransferases introduce bioorthogonal groups (azide, keto) for click chemistry-based conjugation (e.g., DBCO-PEG4-Maleimide, TCO-PEG4-Val-Cit-PAB) ; click chemistry: azide / alkyne-modified glycans enable copper-free conjugation with linkers such as DBCO-SMCC or TCO-Sulfo-SMCC; proprietary platforms: technologies like GlycoConnectTM (Synaffix) or ThioBridgeTM (Abzena) utilize glycan-specific enzymes or engineered linkers (e.g., Maleimide-PEG-GlycanLinkers) for site-directed payload attachment.

[0225] In other embodiments, antibodies or fragments provided herein are conjugated or recombinantly fused, e.g., to a diagnostic molecule. Such diagnosis and detection can be accomplished, for example, by coupling the antibody to detectable substances including, but not limited to, various enzymes, such as, but not limited to, horseradish peroxidase, alkaline phosphatase, beta-galactosidase, or acetylcholinesterase; prosthetic groups, such as, but not limited to, streptavidin / biotin or avidin / biotin; fluorescent materials, such as, but not limited to, umbelliferone, fluorescein, fluorescein isothiocynate, rhodamine, dichlorotriazinylamine fluorescein, dansyl chloride, or phycoerythrin; luminescent materials, such as, but not limited to, luminol; bioluminescent materials, such as, but not limited to, luciferase, luciferin, or aequorin; chemiluminescent material, such as, 225Acγ-emitting, Auger-emitting, β-emitting, an alpha-emitting or positron-emitting radioactive isotope.

[0226] 5.2.3 Chimeric receptors

[0227] One aspect of the present application provides a chimeric receptor comprising an extracellular antigen-binding domain comprising a FcRH5 binding molecule described herein, such as an antibody or antigen binding fragment thereof (e.g., a sdAb) . In some embodiments, the FcRH5-binding molecule described above is a chimeric receptor comprising an extracellular antigen-binding domain. Any of the anti-FcRH5 antibodies or antigen binding fragments thereof described above can be used in the chimeric receptors described herein.

[0228] The anti-FcRH5 chimeric receptor can be any chimeric receptor that specifically recognizes FcRH5. In some embodiments, the anti-FcRH5 chimeric receptor is an anti-FcRH5 T cell receptor (TCR) , an anti-FcRH5 chimeric TCR (cTCR) , an anti-FcRH5 T cell antigen coupler (TAC) , an anti-FcRH5 T cell antigen coupler-like (TAC) -like, or an anti-FcRH5 chimeric antigen receptor (CAR) . In some embodiments, the chimeric receptor comprises (a) an extracellular antigen binding domain comprising an anti-FcRH5 antibody or antigen binding fragment thereof; (b) a transmembrane domain; and (c) an intracellular signaling domain. In some embodiments, the anti-FcRH5 antibody or antigen binding fragment thereof can be camelid, chimeric or humanized. In some embodiments, the chimeric receptor comprises one or more anti-FcRH5 antibody or antigen binding fragment thereof described above.

[0229] Extracellular Antigen Binding Domain

[0230] In some embodiments, the extracellular antigen binding domain provided herein comprises at least one binding domain, and the at least one binding domain comprises an antibody or antigen binding fragment thereof that binds to FcRH5 as provided herein, e.g., the anti-FcRH5 single domain antibodies described in Section 5.2.1 above.

[0231] In some embodiments, provided herein is a CAR comprising a polypeptide comprising: (a) an extracellular antigen binding domain comprising an anti-FcRH5 single domain antibody (sdAb) ; (b) a transmembrane domain; and (c) an intracellular signaling domain, wherein the anti-FcRH5 sdAb is any one of anti-FcRH5 sdAbs as described in Section 5.2.1 above. In some embodiments, the anti-FcRH5 sdAb is camelid, chimeric, human, or humanized.

[0232] In some embodiments, provided herein is a CAR comprising a polypeptide comprising: (a) an extracellular antigen binding domain comprising an anti-FcRH5 sdAb; (b) a transmembrane domain; and (c) an intracellular signaling domain, wherein the anti-FcRH5 sdAb comprises a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of the CDR1, CDR2, and CDR3, respectively, as set forth in SEQ ID NO: 5; a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of the CDR1, CDR2, and CDR3, respectively, as set forth in SEQ ID NO: 11; a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of the CDR1, CDR2, and CDR3, respectively, as set forth in SEQ ID NO: 12;and / or a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of the CDR1, CDR2, and CDR3, respectively, as set forth in SEQ ID NO: 18.

[0233] CDR sequences can be determined according to well-known numbering systems. In some embodiments, the CDRs are determined according to IMGT numbering, Kabat numbering, AbM numbering, Chothia numbering, Contact numbering, or any combinations of various numbering systems. In some embodiments, the CDRs are determined according to AbM numbering scheme. In some embodiments, the CDRs are determined according to Kabat numbering scheme.

[0234] In some embodiments, provided herein is a CAR comprising a polypeptide comprising: (a) an extracellular antigen binding domain comprising an anti-FcRH5 sdAb; (b) a transmembrane domain; and (c) an intracellular signaling domain, wherein the anti-FcRH5 sdAb comprises a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, and SEQ ID NO: 10, respectively; a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, and SEQ ID NO: 10, respectively; a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, and SEQ ID NO: 17, respectively; a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, and SEQ ID NO: 17, respectively; and / or a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 19, and SEQ ID NO: 17, respectively.

[0235] In some embodiments, provided herein is a CAR comprising a polypeptide comprising: (a) an extracellular antigen binding domain comprising an anti-FcRH5 sdAb; (b) a transmembrane domain; and (c) an intracellular signaling domain, wherein the anti-FcRH5 sdAb comprises the amino acid sequence of any one of SEQ ID NO: 5, 11-12, and 18. In other embodiments, provided herein is a CAR comprising a polypeptide comprising: (a) an extracellular antigen binding domain comprising an anti-FcRH5 sdAb; (b) a transmembrane domain; and (c) an intracellular signaling domain, wherein the anti-FcRH5 sdAb comprises an amino acid sequence having at least 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%sequence identify to the amino acid sequence of any one of SEQ ID NO: 5, 11-12, and 18.

[0236] In other embodiments, the extracellular antigen binding domain comprises two or more antigen binding domains. Among these two or more antigen binding domains, at least one is a VHH that binds to FcRH5 as provided herein. In some embodiments, the one or more additional binding domain (s) is / are also VHH (s) that bind (s) to FcRH5. In other embodiments, the one or more additional binding domain (s) bind (s) to one or more additional different antigen (s) , e.g., 1, 2, 3, 4 or more additional sdAbs targeting one or more additional different antigen (s) .

[0237] In some embodiments, provided herein is a multivalent (such as bivalent and trivalent) CAR comprising a polypeptide comprising: (a) an extracellular antigen binding domain comprising two or more sdAbs specifically binding to FcRH5; (b) a transmembrane domain; and (c) an intracellular signaling domain. In some embodiments, the extracellular antigen binding domain comprises two sdAbs specifically binding to FcRH5 provided herein. In other embodiments, the extracellular antigen binding domain comprises three sdAbs specifically binding to FcRH5 provided herein. In some embodiments, the two or more anti-FcRH5 sdAbs are selected from those anti-FcRH5 sdAbs described in Section 5.2.1 above. In some embodiments, the anti-FcRH5 sdAb is camelid, chimeric, human, or humanized. In other embodiments, provided herein is a multispecific (such as bispecific and trispecific) CAR comprising a polypeptide comprising: (a) an extracellular antigen binding domain comprising a first antigen binding fragment (e.g., sdAb) specifically binding to FcRH5; (b) a transmembrane domain; and (c) an intracellular signaling domain. In some embodiments, the CAR further comprises a second antigen binding fragment (e.g., sdAb) specifically binding to a second antigen (such as a second tumor antigen) . In some embodiments, the CAR further comprises a second antigen binding fragment (e. g, sdAb) specifically binding to a second antigen (such as a second tumor antigen) ; and a third antigen binding fragment (e. g, sdAb) specifically binding to a third antigen (such as a third tumor antigen) .

[0238] In some embodiments, the additional antigen (s) targeted by the CARs of the present disclosure are cell surface molecules. The antigen binding fragment may be chosen to recognize an antigen that acts as a cell surface marker on target cells associated with a special disease state. In some embodiments, the antigen is a tumor antigen. Tumors express a number of proteins that can serve as a target antigen for an immune response, particularly T cell mediated immune responses. The antigens targeted by the CAR may be antigens on a single diseased cell or antigens that are expressed on different cells that each contribute to the disease. The antigens targeted by the CAR may be directly or indirectly involved in the diseases.

[0239] Tumor antigens are proteins that are produced by tumor cells that can elicit an immune response, particularly T-cell mediated immune responses. The selection of the additional targeted antigen of the present disclosure will depend on the particular type of cancer to be treated. Exemplary tumor antigens include, but not limited to, CD19, CD20, CD22, CD33, BCMA, DLL3, B7H3, PD-L1, PD-L2, CLL1, GPC3, GUCY2C, CD7, CD38, CD41, CD123, Claudin 18.2, Claudin 6, NKG2D, CD70, FcRH5 and any combination thereof. In some embodiments, the anti-FcRH5 chimeric receptor is an anti-FcRH5 chimeric antigen receptor (CAR) . In addition to the one or more antigen binding domain (s) provided herein, the CAR provided herein may further comprise one or more of the following: a linker (e.g., a peptide linker) , a transmembrane domain, a hinge region, a signal peptide, an intracellular signaling domain, a co-stimulatory signaling domain, each of which is described in more detail below.

[0240] In some embodiments, the extracellular antigen binding domain comprising a first antibody or antigen binding fragment and a second antibody or antigen binding fragment, wherein:

[0241] (1) the first antibody or antigen binding fragment comprises a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of the CDR1, CDR2, and CDR3, respectively, as set forth in SEQ ID NO: 11; and the second antibody or antigen binding fragment comprises a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of the CDR1, CDR2, and CDR3, respectively, as set forth in SEQ ID NO: 18;

[0242] (2) the first antibody or antigen binding fragment comprises a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of the CDR1, CDR2, and CDR3, respectively, as set forth in SEQ ID NO: 18; and the second antibody or antigen binding fragment comprises a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of the CDR1, CDR2, and CDR3, respectively, as set forth in SEQ ID NO: 11;

[0243] (3) the first antibody or antigen binding fragment comprises a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of the CDR1, CDR2, and CDR3, respectively, as set forth in SEQ ID NO: 5; and the second antibody or antigen binding fragment comprises a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of the CDR1, CDR2, and CDR3, respectively, as set forth in SEQ ID NO: 12;

[0244] (4) the first antibody or antigen binding fragment comprises a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of the CDR1, CDR2, and CDR3, respectively, as set forth in SEQ ID NO: 12; and the second antibody or antigen binding fragment comprises a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of the CDR1, CDR2, and CDR3, respectively, as set forth in SEQ ID NO: 5;

[0245] (5) the first antibody or antigen binding fragment comprises a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of the CDR1, CDR2, and CDR3, respectively, as set forth in SEQ ID NO: 12; and the second antibody or antigen binding fragment comprises a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of the CDR1, CDR2, and CDR3, respectively, as set forth in SEQ ID NO: 11;

[0246] (6) the first antibody or antigen binding fragment comprises a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of the CDR1, CDR2, and CDR3, respectively, as set forth in SEQ ID NO: 11; and the second antibody or antigen binding fragment comprises a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of the CDR1, CDR2, and CDR3, respectively, as set forth in SEQ ID NO: 12;

[0247] (7) the first antibody or antigen binding fragment comprises a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of the CDR1, CDR2, and CDR3, respectively, as set forth in SEQ ID NO: 5; and the second antibody or antigen binding fragment comprises a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of the CDR1, CDR2, and CDR3, respectively, as set forth in SEQ ID NO: 18;

[0248] (8) the first antibody or antigen binding fragment comprises a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of the CDR1, CDR2, and CDR3, respectively, as set forth in SEQ ID NO: 18; and the second antibody or antigen binding fragment comprises a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of the CDR1, CDR2, and CDR3, respectively, as set forth in SEQ ID NO: 5;

[0249] (9) the first antibody or antigen binding fragment comprises a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of the CDR1, CDR2, and CDR3, respectively, as set forth in SEQ ID NO: 5; and the second antibody or antigen binding fragment comprises a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of the CDR1, CDR2, and CDR3, respectively, as set forth in SEQ ID NO: 5;

[0250] (10) the first antibody or antigen binding fragment comprises a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of the CDR1, CDR2, and CDR3, respectively, as set forth in SEQ ID NO: 5; and the second antibody or antigen binding fragment comprises a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of the CDR1, CDR2, and CDR3, respectively, as set forth in SEQ ID NO: 11;

[0251] (11) the first antibody or antigen binding fragment comprises a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of the CDR1, CDR2, and CDR3, respectively, as set forth in SEQ ID NO: 11; and the second antibody or antigen binding fragment comprises a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of the CDR1, CDR2, and CDR3, respectively, as set forth in SEQ ID NO: 5;

[0252] (12) the first antibody or antigen binding fragment comprises a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of the CDR1, CDR2, and CDR3, respectively, as set forth in SEQ ID NO: 12; and the second antibody or antigen binding fragment comprises a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of the CDR1, CDR2, and CDR3, respectively, as set forth in SEQ ID NO: 12;

[0253] (13) the first antibody or antigen binding fragment comprises a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of the CDR1, CDR2, and CDR3, respectively, as set forth in SEQ ID NO: 12; and the second antibody or antigen binding fragment comprises a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of the CDR1, CDR2, and CDR3, respectively, as set forth in SEQ ID NO: 18;

[0254] (14) the first antibody or antigen binding fragment comprises a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of the CDR1, CDR2, and CDR3, respectively, as set forth in SEQ ID NO: 18; and the second antibody or antigen binding fragment comprises a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of the CDR1, CDR2, and CDR3, respectively, as set forth in SEQ ID NO: 12;

[0255] (15) the first antibody or antigen binding fragment comprises a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of the CDR1, CDR2, and CDR3, respectively, as set forth in SEQ ID NO: 11; and the second antibody or antigen binding fragment comprises a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of the CDR1, CDR2, and CDR3, respectively, as set forth in SEQ ID NO: 11; or

[0256] (16) the first antibody or antigen binding fragment comprises a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of the CDR1, CDR2, and CDR3, respectively, as set forth in SEQ ID NO: 18; and the second antibody or antigen binding fragment comprises a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of the CDR1, CDR2, and CDR3, respectively, as set forth in SEQ ID NO: 18.

[0257] In some embodiments, the extracellular antigen binding domain comprising a first antibody or antigen binding fragment and a second antibody or antigen binding fragment, wherein:

[0258] (1) the first antibody or antigen binding fragment comprises a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, and SEQ ID NO: 10, respectively; and the second antibody or antigen binding fragment comprises a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, and SEQ ID NO: 17, respectively;

[0259] (2) the first antibody or antigen binding fragment comprises a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, and SEQ ID NO: 17, respectively; and the second antibody or antigen binding fragment comprises a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, and SEQ ID NO: 10, respectively;

[0260] (3) the first antibody or antigen binding fragment comprises a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, and SEQ ID NO: 10, respectively; and the second antibody or antigen binding fragment comprises a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, and SEQ ID NO: 17, respectively;

[0261] (4) the first antibody or antigen binding fragment comprises a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, and SEQ ID NO: 17, respectively; and the second antibody or antigen binding fragment comprises a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, and SEQ ID NO: 10, respectively;

[0262] (5) the first antibody or antigen binding fragment comprises a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, and SEQ ID NO: 10, respectively; and the second antibody or antigen binding fragment comprises a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 19, and SEQ ID NO: 17, respectively;

[0263] (6) the first antibody or antigen binding fragment comprises a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 19, and SEQ ID NO: 17, respectively; and the second antibody or antigen binding fragment comprises a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, and SEQ ID NO: 10, respectively;

[0264] (7) the first antibody or antigen binding fragment comprises a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, and SEQ ID NO: 10, respectively; and the second antibody or antigen binding fragment comprises a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, and SEQ ID NO: 10, respectively;

[0265] (8) the first antibody or antigen binding fragment comprises a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, and SEQ ID NO: 10, respectively; and the second antibody or antigen binding fragment comprises a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, and SEQ ID NO: 10, respectively;

[0266] (9) the first antibody or antigen binding fragment comprises a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, and SEQ ID NO: 17, respectively; and the second antibody or antigen binding fragment comprises a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, and SEQ ID NO: 17, respectively;

[0267] (10) the first antibody or antigen binding fragment comprises a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, and SEQ ID NO: 17, respectively; and the second antibody or antigen binding fragment comprises a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, and SEQ ID NO: 17, respectively;

[0268] (11) the first antibody or antigen binding fragment comprises a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 19, and SEQ ID NO: 17, respectively; and the second antibody or antigen binding fragment comprises a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 19, and SEQ ID NO: 17, respectively;

[0269] (12) the first antibody or antigen binding fragment comprises a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, and SEQ ID NO: 17, respectively; and the second antibody or antigen binding fragment comprises a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 19, and SEQ ID NO: 17, respectively; or

[0270] (13) the first antibody or antigen binding fragment comprises a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 19, and SEQ ID NO: 17, respectively; and the second antibody or antigen binding fragment comprises a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, and SEQ ID NO: 17, respectively.

[0271] In some embodiments, the extracellular antigen binding domain comprising from the N-terminus to the C-terminus:

[0272] (1) a first antibody or antigen binding fragment comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11, and a second antibody or antigen binding fragment comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18;

[0273] (2) a first antibody or antigen binding fragment comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18, and a second antibody or antigen binding fragment comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11;

[0274] (3) a first antibody or antigen binding fragment comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, and a second antibody or antigen binding fragment comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12;

[0275] (4) a first antibody or antigen binding fragment comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12, and a second antibody or antigen binding fragment comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5;

[0276] (5) a first antibody or antigen binding fragment comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12, and a second antibody or antigen binding fragment comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11;

[0277] (6) a first antibody or antigen binding fragment comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11, and a second antibody or antigen binding fragment comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12;

[0278] (7) a first antibody or antigen binding fragment comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, and a second antibody or antigen binding fragment comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18;

[0279] (8) a first antibody or antigen binding fragment comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18, and a second antibody or antigen binding fragment comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5;

[0280] (9) a first antibody or antigen binding fragment comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, and a second antibody or antigen binding fragment comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5;

[0281] (10) a first antibody or antigen binding fragment comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, and a second antibody or antigen binding fragment comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11;

[0282] (11) a first antibody or antigen binding fragment comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11, and a second antibody or antigen binding fragment comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5;

[0283] (12) a first antibody or antigen binding fragment comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12, and a second antibody or antigen binding fragment comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12;

[0284] (13) a first antibody or antigen binding fragment comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12, and a second antibody or antigen binding fragment comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18;

[0285] (14) a first antibody or antigen binding fragment comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18, and a second antibody or antigen binding fragment comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12;

[0286] (15) a first antibody or antigen binding fragment comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11, and a second antibody or antigen binding fragment comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11; or

[0287] (16) a first antibody or antigen binding fragment comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18, and a second antibody or antigen binding fragment comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18.

[0288] In some embodiments, the first antibody or antigen binding fragment and the second antibody or antigen binding fragment are linked by a peptide linker. In some embodiments, the peptide linker comprises the amino acid sequence of any one of SEQ ID NO: 30-32.

[0289] In some embodiments, the FcRH5 CAR is monospecific. In other embodiments, the FcRH5 CAR is multispecific. In some embodiments, the FcRH5 CAR is monovalent. In other embodiments, the FcRH5 CAR is multivalent.

[0290] Transmembrane domain

[0291] The chimeric receptors (e.g., CARs) of the present disclosure comprise a transmembrane domain that can be directly or indirectly fused to the extracellular antigen binding domain. The transmembrane domain may be derived either from a natural or from a synthetic source. As used herein, a “transmembrane domain” refers to any protein structure that is thermodynamically stable in a cell membrane, preferably a eukaryotic cell membrane. Transmembrane domains compatible for use in the CARs described herein may be obtained from a naturally occurring protein. Alternatively, it can be a synthetic, non-naturally occurring protein segment, e.g., a hydrophobic protein segment that is thermodynamically stable in a cell membrane.

[0292] In some embodiments, the transmembrane domain of the CAR comprises a transmembrane domain chosen from the transmembrane domain of an alpha, beta or zeta chain of a T-cell receptor, CD28, CD3 epsilon, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154, KIRDS2, OX40, CD2, CD27, LFA-1 (CD11a, CD18) , ICOS (CD278) , 4-1BB (CD137) , GITR, CD40, BAFFR, HVEM (LIGHTR) , SLAMF7, NKp80 (KLRF1) , CD19, IL-2R beta, IL-2R gamma, IL-7Rα, ITGA1, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, ITGB7, TNFR2, DNAM1 (CD226) , SLAMF4 (CD244, 2B4) , CD84, CD96 (Tactile) , CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229) , CD160 (BY55) , PSGL1, CD100 (SEMA4D) , SLAMF6 (NTB-A, Ly108) , SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3) , BLAME (SLAMF8) , SELPLG (CD162) , LTBR, PAG / Cbp, NKp44, NKp30, NKp46, NKG2D, and / or NKG2C. In some embodiments, the transmembrane domain is derived from a molecule selected from the group consisting of CD8α, CD4, CD28, CD137, CD80, CD86, CD152 and PD1.

[0293] In some specific embodiments, the transmembrane domain is derived from CD8α. In some embodiments, the transmembrane domain is a transmembrane domain of CD8α comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26.

[0294] Intracellular signaling domain

[0295] The chimeric receptors (e.g., CARs) of the present disclosure comprise an intracellular signaling domain. The intracellular signaling domain is responsible for activation of at least one of the normal effector functions of the immune effector cell expressing the CARs. The term “effector function” refers to a specialized function of a cell. Effector function of a T cell, for example, may be cytolytic activity or helper activity including the secretion of cytokines. Thus, the term “cytoplasmic signaling domain” refers to the portion of a protein which transduces the effector function signal and directs the cell to perform a specialized function. While usually the entire cytoplasmic signaling domain can be employed, in many cases it is not necessary to use the entire chain. To the extent that a truncated portion of the cytoplasmic signaling domain is used, such truncated portion may be used in place of the intact chain as long as it transduces the effector function signal. The term cytoplasmic signaling domain is thus meant to include any truncated portion of the cytoplasmic signaling domain sufficient to transduce the effector function signal.

[0296] In some embodiments, the intracellular signaling domain comprises a primary intracellular signaling domain of an immune effector cell. In some embodiments, the CAR comprises an intracellular signaling domain consisting essentially of a primary intracellular signaling domain of an immune effector cell. “Primary intracellular signaling domain” refers to cytoplasmic signaling sequence that acts in a stimulatory manner to induce immune effector functions. In some embodiments, the primary intracellular signaling domain contains a signaling motif known as immunoreceptor tyrosine-based activation motif, or ITAM. An “ITAM, ” as used herein, is a conserved protein motif that is generally present in the tail portion of signaling molecules expressed in many immune cells. The motif may comprises two repeats of the amino acid sequence YxxL / I separated by 6-8 amino acids, wherein each x is independently any amino acid, producing the conserved motif YxxL / Ix (6-8)YxxL / I. ITAMs within signaling molecules are important for signal transduction within the cell, which is mediated at least in part by phosphorylation of tyrosine residues in the ITAM following activation of the signaling molecule. ITAMs may also function as docking sites for other proteins involved in signaling pathways. Exemplary ITAM-containing primary cytoplasmic signaling sequences include those derived from CD3ζ, FcR gamma (FCER1G) , FcR beta (Fc Epsilon Rib) , CD3 gamma, CD3 delta, CD3 epsilon, CD5, CD22, CD79a, CD79b, and CD66d.

[0297] In some embodiments, the primary intracellular signaling domain is derived from CD3ζ. In some embodiments, the intracellular signaling domain consists of the cytoplasmic signaling domain of CD3ζ. In some embodiments, the primary intracellular signaling domain of CD3ζ comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 28. In some embodiments, the primary intracellular signaling domain is a cytoplasmic signaling domain of wild-type CD3ζ. In some embodiments, the primary intracellular signaling domain is a functional mutant of the cytoplasmic signaling domain of CD3ζcontaining one or more mutations, such as Q65K.

[0298] Co-stimulatory signaling domain

[0299] Many immune effector cells require co-stimulation, in addition to stimulation of an antigen-specific signal, to promote cell proliferation, differentiation and survival, as well as to activate effector functions of the cell. In some embodiments, the CAR described herein comprises at least one co-stimulatory signaling domain. The term “co-stimulatory signaling domain, ” as used herein, refers to at least a portion of a protein that mediates signal transduction within a cell to induce an immune response such as an effector function. The co-stimulatory signaling domain of the chimeric receptor described herein can be a cytoplasmic signaling domain from a co-stimulatory protein, which transduces a signal and modulates responses mediated by immune cells, such as T cells, NK cells, macrophages, neutrophils, or eosinophils. “Co-stimulatory signaling domain” can be the cytoplasmic portion of a co-stimulatory molecule. The term "co-stimulatory molecule" refers to a cognate binding partner on an immune cell (such as T cell) that specifically binds with a co-stimulatory ligand, thereby mediating a co-stimulatory response by the immune cell, such as, but not limited to, proliferation and survival.

[0300] Activation of a co-stimulatory signaling domain in a host cell (e.g., an immune cell) may induce the cell to increase or decrease the production and secretion of cytokines, phagocytic properties, proliferation, differentiation, survival, and / or cytotoxicity. The co-stimulatory signaling domain of any co-stimulatory molecule may be compatible for use in the CARs described herein. The type (s) of co-stimulatory signaling domain is selected based on factors such as the type of the immune effector cells in which the effector molecules would be expressed (e.g., T cells, NK cells, macrophages, neutrophils, or eosinophils) and the desired immune effector function (e.g., ADCC effect) . Examples of co-stimulatory signaling domains for use in the CARs can be the cytoplasmic signaling domain of co-stimulatory proteins, including, without limitation, members of the B7 / CD28 family (e.g., B7-1 / CD80, B7-2 / CD86, B7-H1 / PD-L1, B7-H2, B7-H3, B7-H4, B7-H6, B7-H7, BTLA / CD272, CD28, CTLA-4, Gi24 / VISTA / B7-H5, ICOS / CD278, PD-1, PD-L2 / B7-DC, and PDCD6) ; members of the TNF superfamily (e.g., 4-1BB / TNFSF9 / CD137, 4-1BB Ligand / TNFSF9, BAFF / BLyS / TNFSF13B, BAFF-R / TNFRSF13C, CD27 / TNFRSF7, CD27 Ligand / TNFSF7, CD30 / TNFRSF8, CD30 Ligand / TNFSF8, CD40 / TNFRSF5, CD40 Ligand / TNFSF5, DR3 / TNFRSF25, GITR / TNFRSF18, GITR Ligand / TNFSF18, HVEM / TNFRSF14, LIGHT / TNFSF14, Lymphotoxin-alpha / TNF-beta, OX40 / TNFRSF4, OX40 Ligand / TNFSF4, RELT / TNFRSF19L, TACI / TNFRSF13B, TL1A / TNFSF15, TNF-alpha, and TNF RII / TNFRSF1B) ; members of the SLAM family (e.g., 2B4 / CD244 / SLAMF4, BLAME / SLAMF8, CD2F-10 / SLAMF9, CD48 / SLAMF2, CD2, CD58 / LFA-3, CD84 / SLAMF5, CD229 / SLAMF3, CRACC / SLAMF7, NTB-A / SLAMF6, and SLAM / CD150) ; and any other co-stimulatory molecules, such as CD2, CD7, CD53, CD82 / KAI-1, CD90 / Thy1, CD96, CD160, Claudin18.2, CD300a / LMIR1, HLA Class I, HLA-DR, Ikaros, Integrin alpha 4 / CD49d, Integrin alpha 4 beta 1, Integrin alpha 4 beta 7 / LPAM-1, LAG-3, TCL1A, TCL1B, CRTAM, DAP12, Dectin-1 / CLEC7A, DPPIV / CD26, EphB6, TIM-1 / KIM-1 / HAVCR, TIM-4, TSLP, TSLPR, lymphocyte function associated antigen-1 (LFA-1) , and NKG2C.

[0301] In some embodiments, the one or more co-stimulatory signaling domains are selected from the group consisting of CD27, CD28, CD137, OX40, CD30, CD40, CD3, lymphocyte function-associated antigen-1 (LFA-1) , CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3 and ligands that specially bind to CD83 (such as CD83 and MD-2) and combinations thereof.

[0302] In some embodiments, the intracellular signaling domain in the CAR of the present disclosure comprises a co-stimulatory signaling domain derived from CD137 (i.e., 4-1BB) . In some embodiments, the co-stimulatory signaling domain comprises a cytoplasmic domain of CD28 and / or a cytoplasmic domain of CD137. In some embodiments, the intracellular signaling domain comprises a cytoplasmic signaling domain of CD3ζ and a co-stimulatory signaling domain of CD137. In some embodiments, the intracellular signaling domain comprises a co-stimulatory signaling domain of CD137 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 27.

[0303] Hinge region

[0304] The chimeric receptor (e.g., CARs) of the present disclosure may comprise a hinge domain that is located between the extracellular antigen binding domain and the transmembrane domain. A hinge domain is an amino acid segment that is generally found between two domains of a protein and may allow for flexibility of the protein and movement of one or both of the domains relative to one another. Any amino acid sequence that provides such flexibility and movement of the extracellular antigen binding domain relative to the transmembrane domain of the effector molecule can be used.

[0305] In some embodiments, the hinge domain is a hinge domain of a naturally occurring protein. Hinge domains of any protein known in the art to comprise a hinge domain are compatible for use in the chimeric receptors described herein. In some embodiments, the hinge domain is at least a portion of a hinge domain of a naturally occurring protein and confers flexibility to the chimeric receptor. In some embodiments, the hinge domain is derived from CD8α. In some embodiments, the hinge domain is a portion of the hinge domain of CD8α, e.g., a fragment containing at least 15 (e.g., 20, 25, 30, 35, or 40) consecutive amino acids of the hinge domain of CD8α. In some embodiments, the hinge domain of CD8α comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 25.

[0306] In some embodiments, the extracellular antigen binding domain and the hinge domain are linked by a linker. In some embodiments, the linker comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 33.

[0307] Signal peptide

[0308] The chimeric receptors (e.g., CARs) of the present disclosure may comprise a signal peptide (also known as a signal sequence) at the N-terminus of the polypeptide. In general, signal peptides are peptide sequences that target a polypeptide to the desired site in a cell. In some embodiments, the signal peptide targets the effector molecule to the secretory pathway of the cell and will allow for integration and anchoring of the effector molecule into the lipid bilayer. Signal peptides including signal sequences of naturally occurring proteins or synthetic, non-naturally occurring signal sequences, which are compatible for use in the chimeric receptors described herein will be evident to one of skill in the art. In some embodiments, the signal peptide is derived from a molecule selected from the group consisting of CD8α, GM-CSF receptor α, and IgG1 heavy chain. In some embodiments, the signal peptide is derived from CD8α. In some embodiments, the signal peptide of CD8α comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 29.

[0309] Peptide linkers

[0310] The antibodies or antigen binding fragments thereof (e.g., sdAb) in the FcRH5 binding molecule (e.g., a chimeric receptor described herein) may be fused to each other or fused to other proteins via peptide linkers. The various antibodies or fragments thereof in the multispecific or multivalent chimeric receptors described herein may be fused to each other via peptide linkers. In some embodiments, the antibodies or fragments thereof are directly fused to each other without any peptide linkers. The peptide linkers connecting different antibodies or fragments (e.g., VHH) may be the same or different. Different domains of the chimeric receptors (e.g., CARs) may also be fused to each other via peptide linkers.

[0311] Each peptide linker in a chimeric receptor may have the same or different length and / or sequence depending on the structural and / or functional features of the single domain antibodies and / or the various domains. Each peptide linker may be selected and optimized independently. The length, the degree of flexibility and / or other properties of the peptide linker (s) used in the chimeric receptors may have some influence on properties, including but not limited to the affinity, specificity or avidity for one or more particular antigens or epitopes. For example, longer peptide linkers may be selected to ensure that two adjacent domains do not sterically interfere with one another. In some embodiments, a short peptide linker may be disposed between the transmembrane domain and the intracellular signaling domain of a chimeric receptor (e.g., CAR) . In some embodiment, a peptide linker comprises flexible residues (such as glycine and serine) so that the adjacent domains are free to move relative to each other. For example, a glycine-serine doublet can be a suitable peptide linker.

[0312] The peptide linker can be of any suitable length. In some embodiments, the peptide linker is at least about any of 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100 or more amino acids long. In some embodiments, the peptide linker is no more than about any of 100, 75, 50, 40, 35, 30, 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5 or fewer amino acids long. In some embodiments, the length of the peptide linker is any of about 1 amino acid to about 10 amino acids, about 1 amino acids to about 20 amino acids, about 1 amino acid to about 30 amino acids, about 5 amino acids to about 15 amino acids, about 10 amino acids to about 25 amino acids, about 5 amino acids to about 30 amino acids, about 10 amino acids to about 30 amino acids long, about 30 amino acids to about 50 amino acids, about 50 amino acids to about 100 amino acids, or about 1 amino acid to about 100 amino acids.

[0313] The peptide linker may have a naturally occurring sequence, or a non-naturally occurring sequence. For example, a sequence derived from the hinge region of heavy chain only antibodies may be used as the linker. See, for example, WO1996 / 34103. In some embodiments, the peptide linker is a flexible linker. Exemplary flexible linkers include but not limited to glycine polymers (G) n, glycine-serine polymers (including, for example, (GS) n, (GSGGS) n (SEQ ID NO: 50) , (GGGS) n (SEQ ID NO: 51) , and (GGGGS) n (SEQ ID NO: 52) , where n is an integer of at least one) , glycine-alanine polymers, alanine-serine polymers, and other flexible linkers known in the art. In a specific embodiment, the peptide linker that connects two or more anti-FcRH5 variable domains provided herein is GGGGSGGGGSGGGGS (L1, SEQ ID NO: 30) , GGGGS (L2, SEQ ID NO: 31) , or GSTSGSGKPGSGEGSTKG (L3, SEQ ID NO: 32) .

[0314] Other linkers known in the art, for example, as described in WO2016014789, WO2015158671, WO2016102965, US20150299317, WO2018067992, US7741465, Colcher et al., J. Nat. Cancer Inst. 82: 1191-1197 (1990) , and Bird et al., Science 242: 423-426 (1988) may also be included in the chimeric receptors (e.g., CARs) provided herein, the disclosure of each of which is incorporated herein by reference.

[0315] Exemplary CARs

[0316] In some embodiments, the present disclosure provides a FcRH5 CAR comprising: from N-terminus to C-terminus, a VHH domain of any one of SEQ ID NO: 5, 11, 12, 18 and 34-37, a hinge domain of SEQ ID NO: 25, a transmembrane domain of SEQ ID NO: 26, a CD137 cytoplasmic domain of SEQ ID NO: 27, and a CD3-zeta’s cytoplasmic domain of SEQ ID NO: 28. In some embodiments, provided herein is a CAR comprising or consisting of the amino acid sequence of any one of SEQ ID NO: 38-39, and 42-45. In some embodiments, the present disclosure provides a FcRH5 CAR comprising: from N-terminus to C-terminus, in turn a signal peptide of SEQ ID NO: 29, a VHH domain of any one of SEQ ID NO: 5, 11, 12, 18 and 34-37, a hinge domain of SEQ ID NO: 25, a transmembrane domain of SEQ ID NO: 26, a CD137 cytoplasmic domain of SEQ ID NO: 27, and a CD3-zeta’s cytoplasmic domain of SEQ ID NO: 28. In some embodiments, provided herein is a CAR comprising or consisting of the amino acid sequence of any one of SEQ ID NO: 40-41, and 46-49.

[0317] In some embodiments, provided herein is a FcRH5 CAR comprising a polypeptide having at least 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%sequence identity to the amino acid sequence of any one of SEQ ID NO: 38-39, and 42-45. In some embodiments, provided herein is a FcRH5 CAR comprising a polypeptide having at least 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 40-41, and 46-49.

[0318] In some embodiments, provided herein is a nucleic acid encoding any of the FcRH5 CARs provided herein. More detailed descriptions regarding nucleic acid sequences and vectors are provided below.

[0319] 5.3 Nucleic acids and Vectors

[0320] The present disclosure provides nucleic acids and vectors for cloning and expressing any of the FcRH5 binding molecules (e.g., anti-FcRH5 antibodies or antigen binding fragments thereof, anti-FcRH5 CARs) described herein. In some embodiments, the FcRH5 binding molecules (e.g., anti-FcRH5 CARs) described herein is expressed by introducing the nucleic acid or the vector comprising a sequence encoding the FcRH5 binding molecules (e.g., anti-FcRH5 CARs) into a cell in vivo (in vivo cell therapy) or in vitro (including autologous cell therapy and allogeneic cell therapy) . In some embodiments, the vector is suitable for replication and integration in eukaryotic cells, such as mammalian cells. Non-limiting examples of vectors include viral vectors (which can be used to generate recombinant virus) , naked DNA or RNA, plasmids, cosmids, phage vectors, and DNA or RNA expression vectors associated with cationic condensing agents. In some embodiments, the vector is a viral vector. Examples of viral vectors include, but are not limited to, adenoviral vectors, adeno-associated virus vectors, lentiviral vector, retroviral vectors, vaccinia vector, herpes simplex viral vector, and derivatives thereof. Viral vector technology is well known in the art and is described, for example, in Sambrook et al. (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York) , and in other virology and molecular biology manuals. Any vector or vector type can be used to deliver genetic material to the cell. These vectors include but are not limited to plasmid vectors, viral vectors, bacterial artificial chromosomes (BACs) , yeast artificial chromosomes (YACs) , and human artificial chromosomes (HACs) . Viral vectors can include but are not limited to recombinant retroviral vectors, recombinant lentiviral vectors, recombinant adenoviral vectors, foamy virus vectors, recombinant adeno-associated viral (AAV) vectors, hybrid vectors, and plasmid transposons (e.g., sleeping beauty transposon system, and PiggyBac transposon system) or integrase-based vector systems. Other vectors that are known in the art can also be used in connection with the methods described herein. Vectors can be directly administered to patients (in vivo) , or they can be used to treat cells in vitro and the modified cells thereof can be administered to patients (ex vivo) .

[0321] A number of viral based systems have been developed for gene transfer into mammalian cells. For example, retroviruses provide a convenient platform for gene delivery systems. The heterologous nucleic acid can be inserted into a vector and packaged in retroviral particles using techniques known in the art. The recombinant virus can then be isolated and delivered to the engineered mammalian cell in vitro or ex vivo. A number of retroviral systems are known in the art. In some embodiments, adenovirus vectors are used. A number of adenovirus vectors are known in the art. In some embodiments, adeno-associated viral (AAV) vectors are used. A number of adeno-associated viral (AAV) vectors are known in the art. In some embodiments, lentivirus vectors are used. In some embodiments, self-inactivating lentiviral vectors are used. For example, self-inactivating lentiviral vectors carrying the immunomodulator (such as immune checkpoint inhibitor) coding sequence and / or self-inactivating lentiviral vectors carrying chimeric antigen receptors can be packaged with protocols known in the art. The resulting lentiviral vectors can be used to transduce a mammalian cell (such as primary human T cells) using methods known in the art. Vectors derived from retroviruses such as lentivirus are suitable tools to achieve long-term gene transfer, because they allow long-term, stable integration of a transgene and its propagation in progeny cells. Lentiviral vectors also have low immunogenicity, and can transduce non-proliferating cells.

[0322] In some embodiments, the vector is a non-viral vector (e.g., lipid nanoparticles (LNPs) ) . In some embodiments, the vector is a virus-like particles (VLPs) , or enveloped delivery vehicles (EDVs) .

[0323] In some embodiments, the vector is a non-viral vector. In some embodiments, the non-viral vector is or includes a polynucleotide, e.g., a DNA or RNA polynucleotide, that is suitable for transduction and / or transfection by any suitable and / or known non-viral method for gene delivery, such as but not limited to microinjection, electroporation, transient cell compression or squeezing (e.g., as described in Lee, et al. (2012) Nano Lett 12: 6322-27) , lipid-mediated transfection, peptide-mediated delivery, or a combination thereof.

[0324] In some embodiments, the vector comprises or is a polymer. In some embodiments, the polymer comprises a polymer nanoparticle. In some embodiments, the vector comprises or is a lipid nanoparticle. In some embodiments, the vector comprises or is a cell penetrating peptide.

[0325] Any viral vectors described herein can be introduced into a cell in vivo using any suitable techniques known in the art. The viral based systems can be engineered to target (i.e. infect) a range of cells, target a narrow subset of cells, or target a specific type of cell. In general, the envelope protein chosen for the viral based systems will determine the viral tropism. In some embodiments, the virus used in the viral based systems can be pseudotyped to target a specific cell type of interest. For example, the envelope protein on the viral vectors can be modified to have reduced binding affinity to its natural receptor on host cells and the viral vectors can be modified to display a ligand (e.g., antibody or fragment thereof) that specifically binds to a cell surface marker. In some embodiments, the cell is an immune cell. Exemplary envelope proteins include, but are not limited to, VSV-G (vesicular stomatitis virus glycoprotein) , COCAL-G (cocal virus glycoprotein) and their known mutants that have a reduced binding affinity with low-density lipoprotein receptor (LDL-R) . Accordingly, one skilled in the art can select the appropriate tropism, pseudotype, and / or envelope protein that are well known for targeting a desired cell type.

[0326] A number of non-viral vectors have also been developed for gene transfer into mammalian cells. The non-viral vectors include but are not limited to, lipid nanoparticles (LNPs) , and stimuli-responsive polymer / inorganic nanoparticles. Any non-viral vectors described herein can be introduced into a cell in vivo using any suitable techniques known in the art. In some embodiments, LNPs are used. In some embodiments, LNPs are conjugated to a ligand (e.g., antibody or fragment thereof) that specifically binds to a cell surface marker (targeting moiety) . In some embodiments, the cell is an immune cell.

[0327] In some embodiments, the vector comprises at least one targeting moiety that specifically targets a T cell (e.g., αβT, γδT, NKT) , an NK cell, a spleen, or a lymph node.

[0328] In some embodiments, the vector comprises at least one targeting moiety that binds CD2, CD3, CD4, CD5, CD6, CD7, CD8, TCR, CD9, CD11a, CD16, CD18, CD25, CD27, CD28, CD44, CD45, CD45RA, CD45RB, CD45RO, CD47, CD53, CD56, CD57, CD62L, CD63, CD69, CD80, CD81, CD82, CD94, CD95, CD103, CD122, CD127, CD137, CD161, CD183 (CXCR3) , CD184 (CXCR4) , CD185 (CXCR5) , CD193 (CCR3) , CD194 (CCR4) , CD195 (CCR5) , CD196 (CCR6) , CD197 (CCR7) , CCR10, CTLA4, DNAM1, HLA-DR, ICOS, 4-1BB, AhR, IL-2 receptor, IL-6ST, IL-7 receptor, IL-15 receptor, KAR receptors, KIR receptors, KIR2DL1, KIR3D51, KIR3DS1, LAG3, NKG2A, NKG2C, NKG2D, NKp30, NKp44, NKp46, NTBA, OX40, P2RX7, PD1, SIGLEC-7, TIGIT, TIM3, TLR2, TLR4, TLR5. In some embodiments, the vector comprises at least one targeting moiety that binds CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, TCR, CD8, CD56, CD16, and / or NKG2D. In some embodiments, the targeting moiety described above is an antibody or fragment thereof (e.g., scFv, VHHs) .

[0329] Exemplary targeting moieties can be found in e.g., US11174481B2, US11191784B2, US2015 / 0320693A1, WO2022 / 058298A1, US11337929B2, US11324837B2, and WO 2017 / 165683A1, the contents of which are hereby incorporated in their entirety.

[0330] In some embodiments, the vector comprises any of the nucleic acids encoding a FcRH5 binding molecule described herein. The nucleic acid can be cloned into the vector using any known molecular cloning methods in the art, including, for example, using restriction endonuclease sites and one or more selectable markers. In some embodiments, the nucleic acid is operably linked to a promoter. Varieties of promoters have been explored for gene expression in mammalian cells, and any of the promoters known in the art may be used in the present disclosure. Promoters may be roughly categorized as constitutive promoters or regulated promoters, such as inducible promoters.

[0331] In some embodiments, the nucleic acid encoding the FcRH5 binding molecule is operably linked to a constitutive promoter. Constitutive promoters allow heterologous genes (also referred to as transgenes) to be expressed constitutively in the host cells. Exemplary constitutive promoters contemplated herein include, but are not limited to, Cytomegalovirus (CMV) promoters, human elongation factors-1 alpha (hEF1α) , ubiquitin C promoter (UbiC) , phosphoglycerokinase promoter (PGK) , simian virus 40 early promoter (SV40) , and chicken β-Actin promoter coupled with CMV early enhancer (CAGG) . The efficiencies of such constitutive promoters on driving transgene expression have been widely compared in a huge number of studies. For example, Michael C. Milone et al compared the efficiencies of CMV, hEF1α, UbiC and PGK to drive chimeric antigen receptor expression in primary human T cells, and concluded that hEF1α promoter not only induced the highest level of transgene expression, but was also optimally maintained in the CD4 and CD8 human T cells (Molecular Therapy, 17 (8) : 1453-1464 (2009) ) . In some embodiments, the nucleic acid encoding the FcRH5 binding molecule is operably linked to a hEF1α promoter.

[0332] In some embodiments, the nucleic acid encoding the FcRH5 binding molecule is operably linked to an inducible promoter. Inducible promoters belong to the category of regulated promoters. The inducible promoter can be induced by one or more conditions, such as a physical condition, microenvironment of the engineered immune effector cell, or the physiological state of the engineered immune effector cell, an inducer (i.e., an inducing agent) , or a combination thereof.

[0333] In some embodiments, the inducing condition does not induce the expression of endogenous genes in the engineered mammalian cell, and / or in the subject that receives the pharmaceutical composition. In some embodiments, the inducing condition is selected from the group consisting of inducer, irradiation (such as ionizing radiation, light) , temperature (such as heat) , redox state, tumor environment, and the activation state of the engineered mammalian cell.

[0334] In some embodiments, the vector also contains a selectable marker gene or a reporter gene to select cells expressing the FcRH5 binding molecule from the population of host cells transfected through lentiviral vectors. Both selectable markers and reporter genes may be flanked by appropriate regulatory sequences to enable expression in the host cells. For example, the vector may contain transcription and translation terminators, initiation sequences, and promoters useful for regulation of the expression of the nucleic acid sequences.

[0335] The present disclosure provides a nucleic acid encoding a FcRH5 binding molecule (e.g., anti-FcRH5 antibody or antigen binding fragment thereof, anti-FcRH5 chimeric receptor) . In some embodiments, the nucleic acid encodes a polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 5, 11-12, 18, 34-39, and 42-45. In some embodiments, the nucleic acid further encodes a signal peptide (e.g., comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 29) at the N-terminus.

[0336] The present disclosure provides a vector encoding a FcRH5 binding molecule (e.g., anti-FcRH5 antibody or antigen binding fragment thereof, anti-FcRH5 chimeric receptor) . In some embodiments, the vector encodes a polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 5, 11-12, 18, 34-39, and 42-45. In some embodiments, the vector further encodes a signal peptide (e.g., comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 29) at the N-terminus.

[0337] In some embodiments, the vector comprises more than one nucleic acid encoding FcRH5 binding molecules. In some embodiments, the vector comprises a nucleic acid comprising a first nucleic acid sequence encoding a first FcRH5 binding molecule and a second nucleic acid sequence encoding a second FcRH5 binding molecule, wherein the first nucleic acid is operably linked to the second nucleic acid via a third nucleic acid sequence encoding a peptide linker or self-cleaving peptide. In some embodiments, the self-cleaving peptide is selected from the group consisting of T2A, P2A and F2A.

[0338] In some embodiments, the nucleic acid described herein can be introduced into a cell in vivo using any suitable techniques known in the art. In some embodiments, the cell is an immune cell. In some embodiments, the nucleic acid can be modified to make it suitable for in vivo gene therapy.

[0339] 5.4 Engineered cells

[0340] The present disclosure provides engineered cells (e.g., engineered immune cells) that express the FcRH5 binding molecule (e.g., anti-FcRH5 antibody or antigen binding fragment thereof, anti-FcRH5 CAR) described herein. These engineered cells can be used to treat various disorders or diseases as described herein (e.g., FcRH5-associated cancer) . In some embodiments, the engineered cells are produced in vivo. In some embodiments, the cell that is engineered can be obtained from e.g., humans and non-human animals. In some embodiments, the cell that is engineered can be obtained from bacteria, fungi, humans, rats, mice, rabbits, monkeys, pigs or any other species. In some embodiments, the cell is obtained from humans. In various embodiments, the cell that is engineered is a blood cell. Preferably, the cell is a leukocyte (e.g., a T cell) , lymphocyte or any other suitable blood cell type. In some embodiments, the engineered cells are engineered immune cells. In some embodiments, the immune cells are in vivo cells (e.g., cells in an individual) . In some embodiments, the engineered immune cells are produced in vivo. In some embodiments, the cell is a peripheral blood cell. In some embodiments, the cell is a tumor-infiltrating lymphocyte (TIL) . In some embodiments, the cell is a monocyte, dendritic cell, macrophage, T cell, B cell or natural killer (NK) cell. In some embodiments, the cells are human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) . In some embodiments, the human PBMCs are CD3+ cells. In some embodiments, the human PBMCs are CD8+ cells or CD4+ cells.

[0341] In some embodiments, the cells that are engineered are T cells. In some embodiments, the T cells are CD4+ / CD8-, CD4- / CD8+, CD4+ / CD8+, CD4- / CD8-, or combinations thereof. In some embodiments, the T cells produce IL-2, IFN, and / or TNF upon expressing the FcRH5 binding molecule and binding to the target cells, such as FcRH5-positive tumor cells. In some embodiments, the CD8+ T cells lyse antigen-specific target cells upon expressing the FcRH5 binding molecule and binding to the target cells. T cells can be obtained by various methods known in the art, e.g., in vitro culture of T cells isolated from a subject. Genetically modified T cells can be obtained by various methods known in the art, e.g., by transducing T cells (e.g., isolated from the peripheral blood of a subject) with a viral vector. In some embodiments, the T cells are CD4+ T cells, CD8+ T cells, or regulatory T cells. In some embodiments, the T cells are T helper type 1 T cells and T helper type 2 T cells. In some embodiments, the T cell is an αβT cell. In alternate embodiments, the T cell is a γδT cell. In some embodiments, the T cell is an αβT cell. In some embodiments, the T cell is a natural killer T (NKT) cell. In some embodiments, the T cells are central memory T cells. In some embodiments, the T cells are effector memory T cells. In some embodiments, the T cells are  T cells.

[0342] In some embodiments, the cells that are engineered NK cells. In other embodiments, the cells that are engineered can be established cell lines, for example, NK-92 cells.

[0343] In some embodiments, the engineered cells are stem cells, such as a hematopoietic stem cell, a pluripotent stem cell, an iPS, or an embryonic stem cell. In some embodiments, the engineered cells are differentiated from a stem cell, such as a hematopoietic stem cell, a pluripotent stem cell, an iPS, or an embryonic stem cell.

[0344] The engineered cells are prepared by introducing the FcRH5 binding molecules into the cells, such as T cells. In some embodiments, the FcRH5 binding molecule is introduced to the cells by transfecting any of the nucleic acids or any of the vectors described above. In some embodiments, the FcRH5 binding molecule is introduced to the cells by inserting proteins into the cell membrane while passing cells through a microfluidic system, such as CELL  (see, e.g., U.S. Patent Application Publication No. 20140287509) .

[0345] Methods of introducing vectors or nucleic acids into a mammalian cell are known in the art. The vectors described can be transferred into a cell by physical, chemical, or biological methods. In some embodiments, a FcRH5 binding molecule (e.g., anti-FcRH5 CAR) described herein is expressed by introducing a nucleic acid encoding the FcRH5 binding molecule (e.g., anti-FcRH5 CAR) into a cell in vivo (in vivo cell therapy) or in vitro (including autologous cell therapy and allogeneic cell therapy) . In some of the embodiments, the cell is immune cell.

[0346] Physical methods for introducing the vector into a cell include calcium phosphate precipitation, lipofection, particle bombardment, microinjection, electroporation, and the like. Methods for producing cells comprising vectors and / or exogenous nucleic acids are well-known in the art. See, e.g., Sambrook et al. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York. In some embodiments, the vector is introduced into the cell by electroporation.

[0347] Biological methods for introducing the vector into a cell include the use of DNA and RNA vectors. Viral vectors have become the most widely used method for inserting genes into mammalian, e.g., human cells.

[0348] Chemical means for introducing the vector into a cell include colloidal dispersion systems, such as macromolecule complexes, nanocapsules, microspheres, beads, and lipid-based systems including oil-in-water emulsions, micelles, mixed micelles, and liposomes. An exemplary colloidal system for use as a delivery vehicle in vitro is a liposome (e.g., an artificial membrane vesicle) .

[0349] In some embodiments, RNA molecules encoding any of the FcRH5 antigen binding molecules described herein may be prepared by a conventional method (e.g., in vitro transcription) and then introduced into the cells (e.g., immune cells) via known methods such as mRNA electroporation. See, e.g., Rabinovich et al., Human Gene Therapy 17: 1027-1035 (2006) .

[0350] In some embodiments, the transduced or transfected cell is propagated ex vivo after introduction of the vector or nucleic acid. In some embodiments, the transduced or transfected cell is cultured to propagate for at least about any of 30min, 40min, 45min, 50min, 1h, 2h, 3h, 4h, 5h, 6h, 7h, 8h, 9h, 10h, 11h, 12h, 13h, 14h, 15h, 16h, 17h, 18h, 19h, 20h, 21h, 22h, 23h, 1 day, 2 days, 3 days, 4 days, 5 days, 6 days, 7 days, 10 days, 12 days, or 14 days. In some embodiments, the transduced or transfected cell is further evaluated or screened to select the engineered cell.

[0351] Method for preparation of engineered cells

[0352] The present disclosure provides a method or process for preparing, manufacturing and / or using the engineered cells for treatment of pathological diseases or conditions.

[0353] The cells for introduction of the FcRH5 binding molecules described herein, can be isolated from a sample, such as a biological sample, e.g., one obtained from or derived from a subject. In some embodiments, the engineered cells are produced in vivo. In some embodiments, the engineered cells are engineered immune cells. In some embodiments, the immune cells are in vivo cells (e.g., cells in an individual) . In some embodiments, the engineered immune cells are produced in vivo.

[0354] Accordingly, the cells in some embodiments are primary cells, e.g., primary human cells. The samples include tissue, fluid, and other samples taken directly from the subject, as well as samples resulting from one or more processing steps, such as separation, centrifugation, genetic engineering (e.g., transduction with viral vector) , washing, and / or incubation. The biological sample can be a sample obtained directly from a biological source or a sample that is processed. Biological samples include, but are not limited to, body fluids, such as blood, plasma, serum, cerebrospinal fluid, synovial fluid, urine and sweat, tissue and organ samples, including processed samples derived therefrom.

[0355] In some aspects, the sample from which the cells are derived or isolated is blood or a blood-derived sample, or is derived from an apheresis or leukapheresis product. Exemplary samples include whole blood, peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) , leukocytes, bone marrow, thymus, tissue biopsy, tumor, leukemia, lymphoma, lymph node, gut associated lymphoid tissue, mucosa associated lymphoid tissue, spleen, other lymphoid tissues, liver, lung, stomach, intestine, colon, kidney, pancreas, breast, bone, prostate, cervix, testes, ovaries, tonsil, or other organ, and / or cells derived therefrom. Samples include, in the context of cell therapy, e.g., adoptive cell therapy, samples from autologous and allogeneic sources.

[0356] In some embodiments, the cells are derived from cell lines, e.g., T cell lines. The cells in some embodiments are obtained from a xenogeneic source, for example, from mouse, rat, or non-human primate. In some embodiments, the cells are isolated from mouse lymph nodes.

[0357] In some embodiments, the blood cells collected from the subject are washed, e.g., to remove the plasma fraction and to place the cells in an appropriate buffer or media for subsequent processing steps. In some embodiments, the cells are washed with phosphate buffered saline (PBS) . In some embodiments, the wash solution lacks calcium and / or magnesium and / or many or all divalent cations. In some aspects, a washing step is accomplished a semi-automated "flow-through" centrifuge. In some aspects, a washing step is accomplished by tangential flow filtration (TFF) . In some embodiments, the cells are resuspended in a variety of biocompatible buffers after washing, such as, for example, Ca2+ / Mg2+ free PBS. In certain embodiments, components of a blood cell sample are removed, and the cells directly resuspended in culture media. In some embodiments, the methods include density-based cell separation methods, such as the preparation of white blood cells from peripheral blood by lysing the red blood cells and centrifugation through a Percoll or Ficoll gradient.

[0358] In some embodiments, the method comprises one or more steps of: e.g., isolating the T cells from a subject’s blood; transducing the population T cells with a viral vector including the nucleic acid construct encoding a FcRH5 binding molecule; expanding the transduced cells in vitro; and / or infusing the expanded cells into a patient, where the engineered T cells will seek and destroy antigen positive tumor cells. In some embodiments, the method comprises infusing the viral vector containing the nucleic acid construct into a subject, e.g. a human.

[0359] In some embodiments, the methods involve introducing any vectors or nucleic acids described herein into a cell in vitro or ex vivo. In some embodiments, the vector is a viral vector and the introducing is carried out by transduction. In some embodiments, the cell is transduced for at least or about 1 hour, 2 hours, 3 hours, 4 hours, 5 hours, 6 hours, 8 hours, 12 hours, 14 hours, 16 hours, 18 hours, 20 hours, 22 hours, 1 day, 2 days, 3 days, 4 days, 5 days, 6 days, 1 week, 2 weeks, 3 weeks, or longer. In some embodiments, the methods involve introducing any vectors or nucleic acids described herein into a cell in vivo using any suitable techniques known in the art. In some embodiments, the methods further involve introducing into the cell one or more agent, wherein each of the one or more agent is independently capable of inducing a genetic disruption of a target gene, e.g., T cell receptor alpha constant (TRAC) gene and / or a T cell receptor beta constant (TRBC) gene. In some embodiments, the one or more agent is an inhibitory nucleic acid (e.g., siRNA) . In some embodiments, the one or more agent is a fusion protein comprising a DNA-targeting protein and a nuclease or an RNA-guided nuclease (e.g., a clustered regularly interspaced short palindromic nucleic acid (CRISPR) -associated nuclease) .

[0360] The transfection of T cells can be achieved by using any standard method such as calcium phosphate, electroporation, liposomal mediated transfer, microinjection, biolistic particle delivery system, or any other known methods by skilled artisan. In some embodiments, transfection of T cells is performed using the calcium phosphate method.

[0361] The present disclosure provides a method to create a personalized anti-tumor immunotherapy. The engineered cells can be produced from a patient’s blood cells and these engineered cells are then reinfused into the patient as an autologous cellular therapy product. The engineered cells can be produced from a healthy subject’s blood cells and these engineered cells are then infused into a patient as an allogeneic cellular therapy product.

[0362] 5.5 Pharmaceutical Compositions and Kits

[0363] Also provided are pharmaceutical compositions comprising any of the engineered cells described herein (e.g., engineered immune cells expressing an FcRH5-binding molecule) , and optionally a pharmaceutically acceptable excipient. Also provided are pharmaceutical compositions comprising any of the antibodies or antigen binding fragments thereof as described herein, nucleic acids or vectors encoding the same, and optionally a pharmaceutically acceptable excipient. Any excipient suitable for the storage and administration of engineered cells, nucleic acids, vectors, and / or protein constructs (e.g., FcRH5 binding molecules described herein) can be used herein. The excipient may not affect the viability and / or bioactivity of the encoded FcRH5 binding molecule of the engineered cells.

[0364] Excipient means a pharmaceutically acceptable material, composition, or vehicle, such as a liquid or solid filler, diluent, solvent, or encapsulating material. Excipients include, for example, encapsulating materials or additives such as absorption accelerators, antioxidants, binders, buffers, carriers, coating agents, coloring agents, diluents, disintegrating agents, emulsifiers, extenders, fillers, flavoring agents, humectants, lubricants, perfumes, preservatives, propellants, releasing agents, sterilizing agents, sweeteners, solubilizers, wetting agents and mixtures thereof. The term “excipient” can also refer to a diluent, adjuvant (e.g., Freunds’a djuvant (complete or incomplete) or vehicle.

[0365] Excipients may be pharmaceutically acceptable excipients. Examples of pharmaceutically acceptable excipients include buffers, such as phosphate, citrate, and other organic acids; antioxidants, including ascorbic acid; low molecular weight (e.g., fewer than about 10 amino acid residues) polypeptide; proteins, such as serum albumin, gelatin, or immunoglobulins; hydrophilic polymers, such as polyvinylpyrrolidone; amino acids, such as glycine, glutamine, asparagine, arginine, or lysine; monosaccharides, disaccharides, and other carbohydrates, including glucose, mannose, or dextrins; chelating agents, such as EDTA; sugar alcohols, such as mannitol or sorbitol; salt-forming counterions, such as sodium; and / or nonionic surfactants, such as TWEENTM, polyethylene glycol (PEG) , and PLURONICSTM. Other examples of pharmaceutically acceptable excipients are described in Remington and Gennaro, Remington’s Pharmaceutical Sciences (18th ed. 1990) .

[0366] In one embodiment, each component is “pharmaceutically acceptable” in the sense of being compatible with the other ingredients of a pharmaceutical formulation, and suitable for use in contact with the tissue or organ of humans and animals without excessive toxicity, irritation, allergic response, immunogenicity, or other problems or complications, commensurate with a reasonable benefit / risk ratio. See, e.g., Lippincott Williams &Wilkins: Philadelphia, PA, 2005; Handbook of Pharmaceutical Excipients, 6th ed. ; Rowe et al., Eds. ; The Pharmaceutical Press and the American Pharmaceutical Association: 2009; Handbook of Pharmaceutical Additives, 3rd ed. ; Ash and Ash Eds. ; Gower Publishing Company: 2007; Pharmaceutical Preformulation and Formulation, 2nd ed. ; Gibson Ed. ; CRC Press LLC: Boca Raton, FL, 2009. In some embodiments, pharmaceutically acceptable excipients are nontoxic to the cell or mammal being exposed thereto at the dosages and concentrations employed. In some embodiments, a pharmaceutically acceptable excipient is an aqueous pH buffered solution.

[0367] Excipients may be sterile liquids, such as water and oils, including those of petroleum, animal, vegetable, or synthetic origin, such as peanut oil, soybean oil, mineral oil, sesame oil, and the like. Water is an exemplary excipient when a composition (e.g., a pharmaceutical composition) is administered intravenously. Saline solutions and aqueous dextrose and glycerol solutions can also be employed as liquid excipients, particularly for injectable solutions. An excipient can also include starch, glucose, lactose, sucrose, gelatin, malt, rice, flour, chalk, silica gel, sodium stearate, glycerol monostearate, talc, sodium chloride, dried skim milk, glycerol, propylene, glycol, water, ethanol, and the like. The composition, if desired, can also contain minor amounts of wetting or emulsifying agents, or pH buffering agents. Compositions can take the form of solutions, suspensions, emulsion, powders (e.g., freeze-dried) , sustained-release formulations, and the like. In some embodiments, the composition can be reconstituted.

[0368] Compositions, including pharmaceutical compositions, may contain a binding molecule (e.g., an antibody) , for example, in isolated or purified form, together with a suitable amount of excipients.

[0369] In some embodiments, there is provided a pharmaceutical composition comprising: i) a FcRH5 binding molecule described herein, such as an anti-FcRH5 antibody or antigen binding fragment, or an anti-FcRH5 chimeric receptor (e.g., anti-FcRH5 CAR) , and optionally ii) a pharmaceutically acceptable excipient.

[0370] In some embodiments, provided herein is a pharmaceutical composition comprising: i) a nucleic acid comprising a sequence encoding a FcRH5 binding molecule described herein, such as an anti-FcRH5 antibody or antigen binding fragment, or an anti-FcRH5 chimeric receptor (e.g., anti-FcRH5 CAR) , and ii) optionally a pharmaceutically acceptable excipient.

[0371] In some embodiments, provided herein is a pharmaceutical composition comprising: i) a vector comprising a nucleic acid comprising a sequence encoding a FcRH5 binding molecule described herein, such as an anti-FcRH5 antibody or antigen binding fragment, or an anti-FcRH5 chimeric receptor (e.g., anti-FcRH5 CAR) , and ii) optionally a pharmaceutically acceptable excipient.

[0372] In some embodiments, there is provided a pharmaceutical composition comprising: i) an engineered cell (e.g., engineered T cell) expressing a FcRH5 binding molecule described herein, such as an anti-FcRH5 antibody or antigen binding fragment, or an anti-FcRH5 chimeric receptor (e.g., anti-FcRH5 CAR) , and optionally ii) a pharmaceutically acceptable excipient.

[0373] In other embodiments, provided herein is a pharmaceutical composition comprising: i) an engineered cell comprising: a nucleic acid or vector comprising a sequence encoding a FcRH5 binding molecule described herein, such as an anti-FcRH5 antibody or antigen binding fragment, or an anti-FcRH5 chimeric receptor (e.g., anti-FcRH5 CAR) , and ii) optionally a pharmaceutically acceptable excipient.

[0374] The choice of excipient may be determined in part by the particular cell, binding molecule, antibody construct, vector, and / or by the method of administration. Accordingly, there are a variety of suitable formulations. In some embodiments, the pharmaceutical composition described herein can be introduced into a cell in vivo using any suitable techniques known in the art.

[0375] In some embodiments, there is provided a kit comprising any of the FcRH5 binding molecules (or nucleic acids or vectors encoding thereof, or pharmaceutical composition thereof) , and / or the engineered cells described herein. In some embodiments, the kit may further comprise instruction (s) on methods of using the FcRH5 binding molecules (or nucleic acids or vectors encoding thereof, or pharmaceutical composition thereof) , and / or the engineered cells, such as uses or methods described herein. The kits described herein may further include other materials desirable from a commercial and user standpoint, including other buffers, diluents, filters, needles, syringes, intravenous injectors or drips, and package inserts with instructions for performing any methods described herein.

[0376] 5.6 Methods of Treating Disease or Disorder

[0377] In another aspect, provided herein are methods for using and uses of the FcRH5 binding molecules described herein, the nucleic acid or vector encoding the same, the engineered cells containing the nucleic acid or vector, and / or the pharmaceutical compositions comprising any of the foregoing. Without being bound by theory, the FcRH5 binding molecules and the engineered cells may specifically target FcRH5-expressing cancer cells in vivo, thereby exerting their therapeutic effect of eliminating, lysing and / or killing cancer cells.

[0378] In some embodiments, provided herein is a method of treating a disease or disorder in a subject in need thereof, comprising administering to the subject a therapeutically effective amount of the FcRH5 binding molecules described herein, the nucleic acid or vector encoding the same, the engineered cells containing the nucleic acid or vector, and / or the pharmaceutical compositions comprising any of the foregoing.

[0379] In some embodiments, the disease or disorder is cancer or tumor. As a non-limiting example, the cancer or tumor is a hematological malignancy, e.g., B cell malignancy, leukemia, lymphoma and myeloma, including acute myeloid leukemia, adult T-cell leukemia, T-cell large granular lymphocyte leukemia, acute lymphoblastic leukemia, chronic lymphocytic leukemia, chronic myelogenous leukemia, acute monocytic leukemia, Hodgkin's and Non-Hodgkin's lymphoma and multiple myeloma. Suitably the disease or disorder may be a plasma cell disorder or plasma cell dyscrasias, in particular a plasma cell disorder or plasma cell dyscrasias associated with FcRH5 expression. As a non-limiting example, the disease or disorder is a plasma cell disorder or plasma cell dyscrasias selected from: plasmacytoma, solitary plasmacytoma, extramedullary plasmacytoma, plasma cell leukemia, multiple myeloma, macroglobulinemia, amyloidosis, Waldenstrom's macroglobulinemia, solitary bone plasmacytoma, extramedullary plasmacytoma, osteosclerotic myeloma, heavy chain diseases, monoclonal gammopathy of undetermined significance (MGUS) , non-lgM MGUS, IgM MGUS, light chain MGUS and smoldering multiple myeloma. As a non-limiting example, the cancer or tumor is a solid tumor, e.g., ovarian cancer, endometrial cancer, breast cancer, lung cancer (small cell or non-small cell) , colon cancer, prostate cancer, cervical cancer, pancreatic cancer, gastric cancer, esophageal cancer, hepatocellular carcinoma (liver cancer) , renal cell carcinoma (kidney cancer) , head-and-neck tumors, mesothelioma, melanoma, sarcomas, or brain tumors (e.g., gliomas, such as glioblastomas) .

[0380] In some embodiments, the cancer or tumor is multiple myeloma.

[0381] In some embodiments, the disease or disorder is an autoimmune disease; preferably, the autoimmune disease is associated with inappropriate or enhanced B cell numbers and / or activation; the autoimmune disease is systemic lupus erythematosus (SLE) .

[0382] In some embodiments, the methods disclosed herein can decrease the number of FcRH5 positive tumor cells in a subject. In some embodiments, the methods disclosed herein can decrease tumor burden in a subject. In some embodiments, a FcRH5 binding molecule disclosed herein can be used to harness a subject’s natural defense mechanisms including CDC and ADCC to eliminate malignant or cancer cells.

[0383] Methods for monitoring patient response to administration of a pharmaceutical composition disclosed herein are known in the art and can be employed in accordance with methods disclosed herein. In some embodiments, methods known in the art can be employed to monitor the patient’s response to administration of a pharmaceutical composition disclosed herein. In some embodiments, methods known in the art can be used to monitor lesion sizes, and / or lymph node sizes.

[0384] Exemplary routes of administration of the pharmaceutical composition, include, but are not limited to, intravenous, intracavitary, intraarterial, intramuscular, subcutaneous, parenteral, or intraperitoneal routes, or be delivered into lymph glands, body spaces, organs, or tissues known to contain FcRH5-positive target cells. In some embodiments, the pharmaceutical composition is administered intravenously, such as by infusion.

[0385] The dosing regimen of the pharmaceutical composition administered to the individual (such as a human) may vary with the particular composition, the method of administration, and the particular type of disease or disorder being treated. In some embodiments, the pharmaceutical composition is below the level that induces a toxicological effect (i.e., an effect above a clinically acceptable level of toxicity) or is at a level where a potential side effect can be controlled or tolerated when the composition is administered to the individual.

[0386] In some embodiments, the pharmaceutical composition provided herein contains the FcRH5 binding molecules described herein, the nucleic acid or vector encoding the same, and / or the engineered cells containing the nucleic acid or vector, in amounts effective to treat or prevent the condition, disease, or disorder, such as a therapeutically effective or prophylactically effective amount. Therapeutic or prophylactic efficacy in some embodiments is monitored by periodic assessment of treated subjects. For repeated administrations over several days or longer, depending on the condition, the treatment is repeated until a desired suppression of cancer symptoms occurs. However, other dosage regimens may be useful and can be determined.

[0387] The optimal dosage and treatment regime for a particular patient can be determined by one skilled in the art of medicine by monitoring the patient for signs of disease and adjusting the treatment accordingly. In certain embodiments, once the pharmaceutical composition is administered to an individual (e.g., human) , the pharmaceutical composition is measured by any of a number of known methods. Parameters to assess include specific binding of an engineered cell or non-engineered cell (e.g., bystanders) to antigen, in vivo, e.g., by imaging, or ex vivo, e.g., by ELISA or flow cytometry. In certain embodiments, the ability of the engineered cells or non-engineered cells (e.g., bystanders) to destroy target cells can be measured using any suitable method known in the art, such as cytotoxicity assays described in, for example, Kochenderfer et al., J. Immunotherapy, 32 (7) : 689-702 (2009) , and Herman et al. J. Immunological Methods, 285 (1) : 25-40 (2004) . In certain embodiments, the biological activity of the engineered cells or non-engineered cells (e.g., bystanders) also can be measured by assaying expression and / or secretion of certain cytokines, such as CD107a, IFNγ, IL-2, and TNFα. In some aspects, the biological activity is measured by assessing clinical outcome, such as reduction (e.g., by at least about 50%, such as by at least about any of 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, or more) in tumor cell number or a reduction in disease severity.

[0388] In some embodiments, the individual to whom the pharmaceutical composition is administered is a primate, such as a human, monkey, gorilla, chimpanzee, etc. In some embodiments, the individual is a human. The individual can be male or female and can be any suitable age, including infant, juvenile, adolescent, adult, and geriatric individuals. In some embodiments, the individual is a mammal, including but are not limited to, mice, rats, hamsters, guinea pigs, rabbits, chinchillas, cats, dogs, horses, donkeys, cows, goats, sheep, deer, monkeys, apes, etc. In some embodiments, the individual is a livestock. In some embodiments, the individual is a companion animal. In some examples, the individual is a validated animal model for disease, adoptive cell therapy, and / or for assessing toxic outcomes.EXAMPLES

[0389] The disclosure is further described in the following examples, which do not limit the scope of the disclosure described in the claims.

[0390] Example 1: Anti-FcRH5 Antibody Generation

[0391] Two camels and two llamas were immunized with the membrane-proximal Ig-domain of human FcRH5 in accordance with all current animal welfare regulations. For the primary immunization, D9-MPD protein (Domain 9-membrane-proximal domain of human FcRH5, SEQ ID No: 1, produced in house) with a C-terminal camel Fc tag was emulsified with CFA (Sigma-aldrich, Cat. #F5881) and administered via double-spot subcutaneous injection at the neck. For the booster immunizations, D9-MPD protein with a C-terminal camel Fc tag or an N-terminal Flag-avi tag was emulsified with IFA (Sigma-aldrich, Cat. #F5506) and similarly administered. The animals received five emulsion injections, each containing 50-200 μg of protein, at two-week intervals. Three days after the final immunization, a 150 mL blood sample was collected from each immunized animal. Approximately 3×108 peripheral blood lymphocytes (PBLs) , serving as the genetic source of heavy chain antibodies, were isolated from the blood.

[0392] Total RNA was extracted from the lymphocytes of immunized camels or llamas using  Reagent (InvitrogenTM, Cat. #15596026) . Subsequently, cDNA synthesis was performed using the PRIMESCRIPTTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit with an oligo (dT) 20 primer (Takara, Cat. #6110A) . The DNAs encoding VHHs were amplified from the cDNA, purified, and ligated into an in-house phagemid vector (refer to Patent No. US20170089914A1, Fig. 1) . The ligation product was then used to transform SS320 electrocompetent cells, resulting in the creation of sdAb phagemid libraries, which were supplemented with 20%glycerol and stored at -80℃.

[0393] The sdAb phagemid libraries were rescued and the resulting phage libraries were stored after filter sterilization at 4℃ for further use. Binders were isolated from phage libraries using protein-based panning. One round of panning was carried out for protein-based panning approaches. The percentage of FcRH5 positive clones identified by ELISA reached at least 50%and the sequence diversity of FcRH5-specific clones was high for all output phages. These outputs were used for subsequent high-throughput screening.

[0394] Thousands of colonies from the output phages were individually picked and cultured in 96-deep-well plates containing 1.4 mL 2YT medium. The phages displaying sdAb were analyzed for their ability to bind human FcRH5 protein (ACRO, Cat. #FC5-H52H3) , human FcRH1 protein (SEQ ID No: 2, produced in house) with an N terminal Flag-Avi tag, human FcRH2 protein (SEQ ID No: 3, produced in house) with an N terminal Flag-Avi tag, human FcRH3 protein (SEQ ID No: 4, produced in house) with a C terminal Avi-His tag, D9-MPD protein with an N terminal Flag-avi tag by ELISA. The human FcRH5 binders with unique sequences were selected for further characterization. The binding activity of selected clones were summarized in Table 1. The IDs of full-length sdAb and CDR sequences were listed in Table 2. CDRs were defined according to the AbM and Kabat numbering system, respectively.

[0395] Table 1. Anti-FcRH5 antibodies binding to target proteins

[0396] Table 2. Camelid anti-FcRH5 antibody sequences

[0397] Example 2: Humanization of Anti-FcRH5 antibody

[0398] Two camelid sdAbs were humanized using CDR grafting technology. The camelid sdAb sequences were BLASTed in NCBI human germline V gene database so the human VH germline sequences with the highest identity to camelid sdAbs were identified. The most appropriate human frameworks on which to build the CDR grafted VH (henceforth called human acceptor) were listed in Table 3.

[0399] Table 3. Human acceptors selected for camelid sdAbs

[0400] In CDR grafting approach, CDRs of the human acceptor were replaced by those of the parental sdAbs, which made the straight-graft sequence. Straight-graft antibody usually loses binding activity, which can be restored by gradually replacing the framework residues that are critical for the activity of the antibody with camelid residues (i.e. back mutation) , resulting in humanized sdAbs with varying degrees of humanness.

[0401] The camelid and humanized sdAb sequences were fused with mouse IgG1 hinge and Fc fragment to construct heavy chain-only antibodies (HCAbs) . The DNAs encoding these fusion proteins were synthesized and inserted into pcDNA3.4 vector. Fusion protein expression plasmids were used to transfect HEK293 cells. Crude fusion proteins secreted to the medium were subjected to human FcRH5 protein binding affinity assessment by surface plasmon resonance (SPR) on a BIAcore T200 instrument (GE Healthcare) . The experiment was carried out as follows: Antibodies were captured onto the sensor chip pre-coated with goat-anti-mouse pAb (Jackson ImmunoResearch, Cat. #115-055-071) through the interaction between polyclonal antibody and mouse Fc. Increasing concentrations (ranging from 10 nM to 640 nM) of human FcRH5 were injected over the sensorchip surface, and were allowed to bind the captured antibody for 100 s followed by injection of the running buffer to allow dissociation of the complex for 300 s. After each cycle the surfaces were regenerated by an injection of 10 mM glycine-HCl buffer, pH2.0. The Langmuir model, which describes a simple 1: 1 interaction where one ligand molecule interacts with one analyte, was used to fit the experimental data to obtain the kinetic values of the on-rate (ka) and off-rate (kd) , which were used to calculate the equilibrium dissociation constant (KD) . The human FcRH5 protein binding affinity of selected clones were summarized in Table 4. The IDs of humanized sdAb and CDR sequences were listed in Table 5. According to the summarized result, the antibodies bind human FcRH5 with affinity (KD) ranging from 100 nM to 300 nM. Final humanized sdAb sequences exhibiting comparable human FcRH5 affinity to the parent were selected for further characterization.

[0402] Table 4. Binding affinity of HCAbs supernatant to human FcRH5 protein

[0403] Table 5. Humanization anti-FcRH5 antibody sequences

[0404] Example 3: Anti-FcRH5 Antibody Characterization

[0405] Two camelid and two humanization sequences were fused with the mouse IgG1 hinge and Fc region to construct HCAbs. The benchmark antibody 1G7, with VH (SEQ ID NO: 20) and VL (SEQ ID NO: 21) sequences (from patent No. US20190315860A1, hu1G7. v85) derived from Cevostamab, was used to construct a conventional mouse IgG1 chimeric antibody. The HCAbs and mouse IgG1 chimeric antibody protein were produced by GenScript.

[0406] To investigate the cross-reactivity to Fc receptor homolog (FcRH) family molecules, the selected HCAbs were analyzed for their binding ability to human FcRH5 protein, human FcRH1 protein with an N terminal Flag-Avi tag, human FcRH2 protein with an N terminal Flag-Avi tag, human FcRH3 protein with a C terminal Avi-His tag, human FcRH4 protein (SEQ ID No: 22, produced in house) with a C terminal Avi-His tag, human FcRH6 protein (Kactus, Cat. #FCR-HM206) by ELISA. The binding activity of selected clones were summarized in Figure 1A-1F. All selected clones show no cross-reactivity to other FcRH family molecules.

[0407] The epitope grouping of selected HCAbs was performed using ELISA with truncated domains of human FcRH5 proteins, including D9-MPD protein with an N-terminal Flag-Avi tag, D1-D9 (Domain 1-Domain 9 of human FcRH5, SEQ ID No: 23, produced in house) with a C-terminal Avi-His tag, and human FcRH5a (human FcRH5 soluble isoform, SEQ ID No: 24, produced in house) with a C-terminal Avi-His tag. The binding activity of the selected clones is summarized in Figure 2A-2C. All selected clones exhibit minimal to no cross-reactivity with soluble isoforms of FcRH5a. AS340639 demonstrates binding to D1-D9, whereas AS330782 shows no binding to D1-D9. This indicates that the D9 domain contributes to the binding epitopes of AS340639, while the membrane-proximal domain (MPD) contributes more significantly to the binding epitopes of AS330782.

[0408] The binding affinity of selected HCAbs to human FcRH5 protein was determined by SPR. The experiment was carried out as follows: antibodies were captured onto the sensor chip pre-coated with goat-anti-mouse pAb through the interaction between polyclonal antibody and mouse Fc. Increasing concentrations (ranging from 10 nM to 2560 nM) of human FcRH5 were injected over the sensor chip surface, and were allowed to bind the captured antibody for 100 s followed by injection of the running buffer to allow dissociation of the complex for 300 s. After each cycle the surfaces were regenerated by an injection of 10 mM glycine-HCl buffer, pH2.0. The Langmuir model, which describes a simple 1: 1 interaction where one ligand molecule interacts with one analyte, was used to fit the experimental data to obtain the kinetic values of the on-rate (ka) and off-rate (kd) , which were used to calculate the equilibrium dissociation constant (KD) . According to the result summarized in Table 6, the selected anti FcRH5 HCAbs bound human FcRH5 with affinity (KD) ranging from 200 nM to 400 nM. In this experiment, the affinity of the purified protein was lower compared to that of the supernatant protein. The main reason for this was the higher concentration of the antigen used, which resulted in an overall decrease in affinity levels.

[0409] Table 6. Binding affinity of selected anti FcRH5 HCAbs to human FcRH5 protein

[0410] To analyze the direct competitive binding characteristics of two camelid proteins, epitope binning was performed using SPR. The experiment was conducted as follows: human FcRH5 antigen was immobilized on a CM5 sensor chip via amine coupling. In Association 1 phase, Ab1 (1280 nM) was injected over the sensor chip surface for 300s, then followed by a mixture of Ab1 (1280 nM) and Ab2 (200 nM) for 100s in Association 2 phase. After each cycle, the surfaces were regenerated by injecting 10 mM glycine-HCl buffer at pH 2.0. Select the Resonance unit value at the start and end of the Association 1 phase as 0%and 100%, respectively. The binding curves were normalized to the response curves ranging from 0%to 100%, which were obtained from the instrument. The normalized response R1 and R2 are collected at 300s in the Association 1 phase and at 100s in the Association 2 phase, respectively. Experimental data were analyzed using SPR software and GraphPad. The epitope binning results of the selected antibodies are presented in Table 7 and Figure 3.

[0411] Table 7. Epitope binning of camelid HCAbs

[0412] To determine the binding activity of selected molecules to human FcRH5-expressing cells, Mino cell (human FcRH5-postive) and HEK239T cell (human FcRH5-negative) were incubated with gradient concentrations of all HCAbs, followed by incubation with an Alexa Fluor 647-fluorescently-labeled goat anti-mouse IgG secondary antibody (Jackson ImmunoResearch, Cat. #115-605-071) at 4℃ for 30 minutes. Samples were analyzed with flow cytometry and the results show that all selected anti-FcRH5 HCAbs exhibited clear binding to Mino cells and minimal to no binding to HEK293T cells.

[0413] Example 4: Tandem antibodies construction and characterization

[0414] AS330782VH9 and AS340639VH6 were selected to be used for anti FcRH5 tandem antibodies construction. The IDs of full-length tandem sequences were listed in Table 8.

[0415] Table 8. Anti-FcRH5 tandem antibody sequences

[0416] The tandem sequences were also fused with mouse IgG1 hinge and Fc region to construct HCAbs and the HCAbs protein were produced by GenScript. To investigate the cross reactivity to FcRH family molecules and binding activity to truncated domain of human FcRH5 proteins, the ELISA experiment was performed according to condition shown in Example 3. The binding activity of selected clones were summarized in Figure 4A-4F and Figure 5. All tandem antibodies maintained no cross-reactivity with other FcRH family molecules and exhibited minimal to no cross-reactivity with soluble isoforms of FcRH5a.

[0417] The binding affinity of Bi-VHH antibodies to human FcRH5 protein was determined by SPR. The experiment was carried out as condition shown in Example 3. According to the summarized result in Table 9, the binding affinity of the tandem antibodies to human FcRH5 increased by 10～100 times compared to monomer antibodies AS330782VH9 and AS340639VH6.

[0418] Table 9. Binding affinity of anti FcRH5 tandem antibodies to human FcRH5 protein

[0419] To determine the binding activity of tandem antibodies to human FcRH5-expressing cells, cell binding test was performed followed by the condition shown in Example 3. All anti FcRH5 tandem HCAbs exhibited clear binding to Mino cells and no binding to HEK293T cells.

[0420] Example 5: Preparation of FcRH5 CAR-T Cells

[0421] Generation of FcRH5 VHH CARs

[0422] A nucleic acid molecule encoding a chimeric antigen receptor (CAR) backbone polypeptide comprising from the N-terminus to the C-terminus an optional linker (L4, SEQ ID NO: 33) , a CD8αhinge domain (SEQ ID NO: 25) , a CD8α transmembrane domain (SEQ ID NO: 26) , a CD137 co-stimulatory signaling domain (SEQ ID NO: 27) , and a CD3ζ primary intracellular signaling domain (SEQ ID NO: 28) were synthesized and cloned into a pre-modified lentiviral vector (pLSINK-BBzBB) downstream and operably linked to a constitutive hEF1α promoter. Multi-cloning sites (MCS) in the vector allowed insertion of a nucleic acid sequence comprising a Kozak sequence operably linked to a nucleic acid sequence encoding a CD8α signal peptide (SEQ ID NO: 29) fused to one of anti-FcRH5 VHH fragments above into the CAR backbone vector, upstream and operably linked to the CAR backbone sequence. The nucleic acid sequence encoding the CD8α signal peptide and the anti-FcRH5 VHH fragment was chemically synthesized and cloned into pLSINK-BBzBB CAR backbone via the EcoRI (5′-GAATTC-3′) and SpeI (5′-ACTAGT-3′) restriction sites by molecular cloning techniques known in the art. At the same time, the scFv fragment from Cevostamab (see US20190315860A1) was fused to human CD8α hinge and transmembrane region, named M2901, as a benchmark.

[0423] Table 10. Structures of CAR Constructs

[0424] Lentivirus Preparation

[0425] The FcRH5 CAR recombinant plasmid was mixed with the psPAX2 and pMD2. G helper plasmids in a specific ratio and co-transfected into HEK 293T cells. After 60 hours of transfection, the culture supernatant containing the virus was collected and centrifuged at 3000 rpm for 5 minutes at 4℃. The supernatant was filtered through a 0.45 μm filter, followed by further concentration using ultracentrifugation to prepare the lentivirus concentrated solution, which was stored at -80℃ for future use.

[0426] Cell Preparation

[0427] For the preparation of autologous FcRH5 CAR-T cells, PBMCs were used. The process involved the following steps: First, CD4+ and CD8+ T cells were separated using CD4+CD8 magnetic beads (Beckman Coulter) . The isolated T cells were then activated by adding CD3 / CD28 beads (T Cell TransAct, Miltenyi Biotec) to the culture. After activation, the cells were transduced with the CAR lentivirus. The CAR-T cells were allowed to expand or not before they were fully prepared for use.

[0428] This procedure results in the production of FcRH5 CAR-T cells that can specifically target and kill FcRH5-expressing cells, with high specificity and cytotoxicity, making them suitable for use in therapeutic applications such as treating multiple myeloma.

[0429] Example 6: High Specificity of FcRH5 CAR-T Cells in Killing Target Cells

[0430] 6.1 Evaluation of the Cytotoxicity of FcRH5 CAR-T Cells Against FcRH5 Overexpressing Tumor Cells

[0431] Two FcRH5 CAR-T cells (M3133, M3286) as well as UnT cells and M2901 as a benchmark were incubated overnight with K562-H5 cells at various effector-to-target (E: T) ratios (8: 1, 4: 1, 2: 1) in Corning 96-well white plates. After the incubation, half of the culture medium was discarded, and 50 μL of One-Lite (Vazyme, catalog number DD1203-03) was added to each well. The luciferase fluorescence was measured using a microplate reader (TECAN, Spark 10M) , and the cytotoxicity of the CAR-T cells against the target cells was calculated.

[0432] As shown in Figure 6, all FcRH5 CAR-T cells were maintained a high level of specificity and cytotoxicity against K562-H5.

[0433] 6.2 Evaluation of the Long-Term Cytotoxicity of FcRH5 CAR-T Cells Against Target Cells

[0434] To evaluate whether the FcRH5 CAR-T cells prepared in this disclosure possess long-term cytotoxicity against target cells, the CAR-T cells were co-cultured with target cells for a period of time, and their cytotoxicity was measured. After this initial co-culture, fresh target cells were added to continue the assay for three or four rounds in total.

[0435] As shown in Figure 7A-7B, the FcRH5 CAR-T cells maintained a high level of cytotoxicity against target cells even after three or four rounds of continued target cell addition. This indicates that the CAR-T cells retained their killing ability over an extended period, demonstrating their potential for sustained therapeutic effects in vivo.

[0436] These results highlight the long-lasting effectiveness of the FcRH5 CAR-T cells, making them a promising treatment option for patients with FcRH5-positive tumors, offering prolonged therapeutic activity with minimal loss of efficacy over time.

[0437] Example 7: Influence of Soluble FcRH5 Protein on the Cytotoxicity of FcRH5 CAR-T Cells

[0438] To demonstrate that the FcRH5 CAR-T cells prepared in this disclosure can specifically recognize epitopes distinct from soluble FcRH5 protein, and that their cytotoxicity is not affected by soluble FcRH5 protein (IRTA2a) , soluble FcRH5 protein was added during the co-culture of the CAR-T cells and target cells. After incubating for a period of time, the luciferase fluorescence signal was measured.

[0439] As shown in Figure 8, the addition of soluble FcRH5 protein did not affect the cytotoxicity of the FcRH5 CAR-T cells against the Mino target cells. This confirms that the FcRH5 CAR-T cells maintained their ability to recognize and kill FcRH5-expressing cells, despite the presence of soluble FcRH5 protein, indicating that the CAR-T cells specifically target a membrane-bound epitope distinct from the soluble form of FcRH5.

[0440] Example 8: In Vivo Tumor Cell Killing Capacity of FcRH5 CAR-T Cells

[0441] To evaluate the anti-tumor efficacy of the FcRH5 CAR-T cells prepared in this disclosure in vivo, an NCG mouse Mino xenograft model was established.

[0442] As shown in Figure 9A-9C, the FcRH5 CAR-T cells (M3286 and M3133) demonstrated excellent tumor control efficacy after being infused into the tumor-bearing mice. In contrast, the benchmark M2901 CAR-T cells failed to suppress tumor growth and showed no significant difference from the UnT (untreated) group. Importantly, the infusion of all CAR-T cell preparations did not affect the body weight of the mice, suggesting that the treatment was well-tolerated and did not induce systemic toxicity.

[0443] As shown in Figure 10A-10C, the FcRH5 CAR-T cells (M3498 and M3502) demonstrated excellent tumor control efficacy after being infused into the tumor-bearing mice. In contrast, the benchmark M2901 CAR-T cells failed to suppress tumor growth and showed no significant difference from the UnT (untreated) group. Importantly, the infusion of all CAR-T cell preparations did not affect the body weight of the mice, suggesting that the treatment was well-tolerated and did not induce systemic toxicity. M3583 and M3586 also exhibit good anti-tumor effects, indicating good control over the expansion and persistence of the tumor cells.

[0444] These results confirm the strong in vivo anti-tumor effects of the FcRH5 CAR-T cells, highlighting their potential for clinical application in treating FcRH5-expressing tumors like multiple myeloma.

[0445] OTHER EMBODIMENTS

[0446] It is to be understood that while the disclosure has been described in conjunction with the detailed description thereof, the foregoing description is intended to illustrate and not limit the scope of the disclosure, which is defined by the scope of the appended claims. Other aspects, advantages, and modifications are within the scope of the following claims.

[0447] SEQUENCES

Claims

1.A FcRH5 binding molecule, comprising:(1) a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of the CDR1, CDR2, and CDR3, respectively, as set forth in SEQ ID NO: 5;(2) a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of the CDR1, CDR2, and CDR3, respectively, as set forth in SEQ ID NO: 11;(3) a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of the CDR1, CDR2, and CDR3, respectively, as set forth in SEQ ID NO: 12; and / or(4) a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of the CDR1, CDR2, and CDR3, respectively, as set forth in SEQ ID NO: 18.2.The FcRH5 binding molecule of claim 1, wherein the CDR1, CDR2 and / or CDR3 are determined according to the AbM numbering scheme, the IMGT numbering scheme, the Kabat numbering scheme, the Chothia numbering scheme, the Contact numbering scheme, or any combination thereof.3.A FcRH5 binding molecule, comprising:(1) a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, and SEQ ID NO: 10, respectively;(2) a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, and SEQ ID NO: 10, respectively;(3) a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, and SEQ ID NO: 17, respectively;(4) a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, and SEQ ID NO: 17, respectively; and / or(5) a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 19, and SEQ ID NO: 17, respectively.4.The FcRH5 binding molecule of any one of claims 1-3, further comprising framework regions (FRs) .5.The FcRH5 binding molecule of claim 4, wherein the framework regions are derived from a human immunoglobulin heavy chain variable region sequence.6.The FcRH5 binding molecule of any one of claims 1-5, wherein the binding molecule comprises the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 5, 11-12, and 18; or an amino acid sequence having at least 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%sequence identity to the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 5, 11-12, and 18.7.The FcRH5 binding molecule of any one of claims 1-6, wherein the binding molecule is an antibody or antigen binding fragment thereof.8.The FcRH5 binding molecule of claim 7, wherein the antibody or antigen binding fragment thereof is a murine, camelid, chimeric, human, or humanized antibody or fragment.9.The FcRH5 binding molecule of claim 7 or 8, wherein the antibody or antigen binding fragment thereof is monospecific, bispecific or multispecific.10.The FcRH5 binding molecule of any one of claims 7-9, wherein the antibody or antigen binding fragment thereof is a mAb, a Fab, a Fab′, a F (ab′) 2, a Fv, a VHH, a single chain Fv (scFv) , a single domain antibody (sdAb) , a minibody, a diabody, an antibody mimetic or chemically linked F (ab′) 2, optionally the antibody or antigen binding fragment thereof is a sdAb.11.The FcRH5 binding molecule of any one of claims 7-10, wherein the antibody or antigen binding fragment thereof comprises a Fc region, optionally the Fc region is the Fc of IgG1, IgG2, IgG3 or IgG4.12.The FcRH5 binding molecule of any one of claims 7-11, wherein:(1) the antibody or antigen binding fragment thereof comprises the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 5, 11-12, and 18; or an amino acid sequence having at least 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%sequence identity to the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 5, 11-12, and 18; or(2) the antibody or antigen binding fragment thereof comprises the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 34-37; or an amino acid sequence having at least 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%sequence identity to the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 34-37.13.The FcRH5 binding molecule of any one of claims 1-6, wherein the binding molecule is a fusion protein, or an immunoconjugate.14.A chimeric antigen receptor (CAR) , comprising:(a) an extracellular antigen binding domain comprising the antibody or antigen binding fragment of any one of claims 7 to 12;(b) a transmembrane domain; and(c) an intracellular signaling domain.15.The CAR of claim 14, wherein the extracellular antigen binding domain further comprises one or more additional antibody (ies) or antigen binding fragment (s) .16.The CAR of claim 15, wherein the additional antibody (ies) or antigen binding fragment (s) bind (s) to at least one tumor antigen (s) or autoimmune disease antigen (s) .17.The CAR of any one of claims 14-16, wherein the extracellular antigen binding domain comprises two or three of the antibody or antigen binding fragment of any one of claims 7 to 12.18.The CAR of any one of claims 14-17, wherein the extracellular antigen binding domain comprising a first antibody or antigen binding fragment and a second antibody or antigen binding fragment,(1) the first antibody or antigen binding fragment comprises a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of the CDR1, CDR2, and CDR3, respectively, as set forth in SEQ ID NO: 11; and the second antibody or antigen binding fragment comprises a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of the CDR1, CDR2, and CDR3, respectively, as set forth in SEQ ID NO: 18;(2) the first antibody or antigen binding fragment comprises a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of the CDR1, CDR2, and CDR3, respectively, as set forth in SEQ ID NO: 18; and the second antibody or antigen binding fragment comprises a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of the CDR1, CDR2, and CDR3, respectively, as set forth in SEQ ID NO: 11;(3) the first antibody or antigen binding fragment comprises a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of the CDR1, CDR2, and CDR3, respectively, as set forth in SEQ ID NO: 5; and the second antibody or antigen binding fragment comprises a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of the CDR1, CDR2, and CDR3, respectively, as set forth in SEQ ID NO: 12;(4) the first antibody or antigen binding fragment comprises a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of the CDR1, CDR2, and CDR3, respectively, as set forth in SEQ ID NO: 12; and the second antibody or antigen binding fragment comprises a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of the CDR1, CDR2, and CDR3, respectively, as set forth in SEQ ID NO: 5;(5) the first antibody or antigen binding fragment comprises a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of the CDR1, CDR2, and CDR3, respectively, as set forth in SEQ ID NO: 12; and the second antibody or antigen binding fragment comprises a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of the CDR1, CDR2, and CDR3, respectively, as set forth in SEQ ID NO: 11;(6) the first antibody or antigen binding fragment comprises a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of the CDR1, CDR2, and CDR3, respectively, as set forth in SEQ ID NO: 11; and the second antibody or antigen binding fragment comprises a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of the CDR1, CDR2, and CDR3, respectively, as set forth in SEQ ID NO: 12;(7) the first antibody or antigen binding fragment comprises a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of the CDR1, CDR2, and CDR3, respectively, as set forth in SEQ ID NO: 5; and the second antibody or antigen binding fragment comprises a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of the CDR1, CDR2, and CDR3, respectively, as set forth in SEQ ID NO: 18; or(8) the first antibody or antigen binding fragment comprises a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of the CDR1, CDR2, and CDR3, respectively, as set forth in SEQ ID NO: 18; and the second antibody or antigen binding fragment comprises a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of the CDR1, CDR2, and CDR3, respectively, as set forth in SEQ ID NO: 5.19.The CAR of any one of claims 14-17, wherein the extracellular antigen binding domain comprising a first antibody or antigen binding fragment and a second antibody or antigen binding fragment,(1) the first antibody or antigen binding fragment comprises a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, and SEQ ID NO: 10, respectively; and the second antibody or antigen binding fragment comprises a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, and SEQ ID NO: 17, respectively;(2) the first antibody or antigen binding fragment comprises a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, and SEQ ID NO: 17, respectively; and the second antibody or antigen binding fragment comprises a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, and SEQ ID NO: 10, respectively;(3) the first antibody or antigen binding fragment comprises a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, and SEQ ID NO: 10, respectively; and the second antibody or antigen binding fragment comprises a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, and SEQ ID NO: 17, respectively;(4) the first antibody or antigen binding fragment comprises a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, and SEQ ID NO: 17, respectively; and the second antibody or antigen binding fragment comprises a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, and SEQ ID NO: 10, respectively;(5) the first antibody or antigen binding fragment comprises a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, and SEQ ID NO: 10, respectively; and the second antibody or antigen binding fragment comprises a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 19, and SEQ ID NO: 17, respectively; or(6) the first antibody or antigen binding fragment comprises a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 19, and SEQ ID NO: 17, respectively; and the second antibody or antigen binding fragment comprises a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, and SEQ ID NO: 10, respectively.20.The CAR of any one of claims 14-19, wherein the extracellular antigen binding domain comprising from the N-terminus to the C-terminus:(1) a first antibody or antigen binding fragment comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11, and a second antibody or antigen binding fragment comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18;(2) a first antibody or antigen binding fragment comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18, and a second antibody or antigen binding fragment comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11;(3) a first antibody or antigen binding fragment comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, and a second antibody or antigen binding fragment comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12;(4) a first antibody or antigen binding fragment comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12, and a second antibody or antigen binding fragment comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5;(5) a first antibody or antigen binding fragment comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12, and a second antibody or antigen binding fragment comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11;(6) a first antibody or antigen binding fragment comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11, and a second antibody or antigen binding fragment comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12;(7) a first antibody or antigen binding fragment comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, and a second antibody or antigen binding fragment comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18; or(8) a first antibody or antigen binding fragment comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18, and a second antibody or antigen binding fragment comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5.21.The CAR of any one of claims 18-20, wherein the first antibody or antigen binding fragment and the second antibody or antigen binding fragment are linked by a peptide linker, optionally the peptide linker comprises the amino acid sequence of any one of SEQ ID NO: 30-32.22.The CAR of any one of claims 14-21, wherein the transmembrane domain is derived from a molecule selected from a group consisting of CD8α, CD4, CD28, CD137, CD80, CD86, CD152, and PD-1.23.The CAR of any one of claims 14-22, wherein the intracellular signaling domain comprises a primary intracellular signaling domain of an immune effector cell.24.The CAR of claim 23, wherein the primary intracellular signaling domain is derived from CD3ζ.25.The CAR of any one of claims 14-24, wherein the intracellular signaling domain comprises a co-stimulatory signaling domain.26.The CAR of claim 25, wherein the co-stimulatory signaling domain is derived from a co-stimulatory molecule selected from the group consisting of CD27, CD28, CD137, OX40, CD30, CD40, CD3, LFA-1, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, ligands of CD83, and any combination thereof.27.The CAR of any one of claims 14-26, further comprising a hinge domain.28.The CAR of claim 27, wherein the hinge domain is derived from CD8α.29.The CAR of any one of claims 14-28, comprising an amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 38-39, and 42-45.30.The CAR of any one of claims 14-29, further comprising a signal peptide.31.The CAR of claim 30, wherein the signal peptide is derived from CD8α.32.The CAR of claim 30 or 31, comprising an amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 40-41, and 46-49.33.A nucleic acid comprising a sequence encoding the FcRH5 binding molecule of any one of claims 1-13, or the CAR of any one of claims 14-32.34.A vector comprising the nucleic acid of claim 33.35.A cell, comprising the CAR of any one of claims 14-32, the nucleic acid of claim 33, or the vector of claim 34.36.The cell of claim 35, wherein the cell is an engineered cell, and the engineered cell is selected from the group consisting of T cell (e.g., αβ T cell, γδ T cell, NKT cell) , NK cell, monocyte, dendritic cell, macrophage, B cell, stem cell, and any combination thereof.37.The cell of claim 35 or 36, wherein the cell further comprising an additional CAR that binds to at least one tumor antigen (s) or autoimmune disease antigen (s) .38.A pharmaceutical composition, comprising(i) the binding molecule of any one of claims 1 to 13, the CAR of any one of claims 14 to 32, the nucleic acid of claim 33, the vector of claim 34, or the cell of any one of claims 35 to 37; and(ii) a pharmaceutically acceptable carrier and / or excipient.39.A method for preventing and / or treating a disease or disorder in a subject, wherein the method comprises administering to a subject in need thereof the pharmaceutical composition of claim 38.40.The method of claim 39, wherein the disease or disorder is cancer or autoimmune disease.41.The method of claim 40, wherein the cancer is multiple myeloma.

Images