Antibody-oligonucleotide conjugates, preparation method thereof and use thereof

Abstract

A preparation method of antibody-oligonucleotide conjugate (AOC) for preventing, alleviating or treating a cancer, the antibody-oligonucleotide conjugate prepared by the method, a pharmaceutical composition thereof and the use thereof.

Description

Antibody-oligonucleotide conjugates, preparation method thereof and use thereofTechnical Field

[0001] The present disclosure relates to the biopharmaceutical field, in particular, to a preparation method of an antibody-oligonucleotide conjugate (AOC) for preventing, alleviating or treating a cancer, the antibody-oligonucleotide conjugate prepared by the method, a pharmaceutical composition thereof and the use thereof.Background

[0002] RAS is the most frequently mutated oncogene, with KRAS being the most mutated RAS isoform that accounts for 85%of RAS mutations observed and about 20%of all human cancers. KRAS is a small GTPase that functions as a molecular switch cycling between guanosine triphosphate (GTP) -bound (on) and guanosine diphosphate (GDP) -bound (off) states to affect intracellular signaling through cell-surface receptors. Active KRAS binds to and activates several effector proteins to regulate cell growth and proliferation (1-3) .

[0003] The missense mutation of KRAS aberrantly activates the protein, driving it into a hyperexcitable state by attenuating its GTPase activity, which results in prolonged GTP-bound state and persistent activation of downstream signaling pathways (2, 3) . Mutant KRAS plays a crucial role in cancer initiation and progression. It promotes immune suppression, remodels the tumor microenvironment by secreting various cytokines, chemokines and growth factors, and inhibits T cell infiltration and CD8+ T cell mediated apoptosis (4, 5) . KRAS mutations are associated with poor prognosis in multiple cancers and confer resistance to treatment (2, 3) . KRAS mutation most frequently occurs at either the codon for Glycine-12 (G12) or Glycine-13 (G13) . These mutations are present in 90%of pancreatic ductal adenocarcinoma, with 41%of them being the G12D mutation, and 35%of lung adenocarcinoma, with 42%being G12C mutation (6, 7) .

[0004] Oncogenic KRAS has long been regarded as “undruggable” due to the absence of deep binding pockets. In 2013, the reactive cysteine residue of the G12C mutant was found to give rise to a new pocket that can be selectively targeted by small-molecule binders to trap KRAS in an inactive state. This breakthrough led to FDA’s accelerated approval of two KRASG12C inhibitors, sotorasib in 2021 and adagrasib in 2022, for the treatment of advanced non-small-cell lung carcinoma (2) . The clinical benefits of these inhibitors mark a significant advancement in precision oncology. However, the small-molecule inhibitors are limited regarding the depth and duration of response, and the emergence of secondary mutations continues to challenge the clinical treatment of non-G12C KRAS-mutant (KRASmt) cancers (8, 9) . The difficulties in developing small-molecule KRAS inhibitors and the inherent limitations of small molecules have heightened the importance of alternative modalities like antisense oligonucleotide (ASO) and a small interfering RNA (siRNA) that could target the oncogene KRAS with broader mutation coverage and silence its expression at the mRNA level to disrupt oncogenic signaling to inhibit tumor growth (10-13) . Progress has been achieved in the development of delivery systems for a KRASG12D-directed siRNA, including lipid nanoparticles and exosomes. These delivery systems are currently being evaluated in locally advanced pancreatic cancer (14, 15) .

[0005] c-Met, also known as the hepatocyte growth factor receptor (HGFR) , is a proto-oncogene that plays significant roles in both normal physiological processes and cancer development. Abnormalities in the c-Met gene, such as overexpression, mutation, and amplification, are closely associated with cancer. These abnormalities lead to the continuous activation of the c-Met protein, endowing tumor cells with a proliferation advantage, enhancing their invasion and metastasis capabilities, enabling them to resist apoptosis, and promoting tumor angiogenesis. Clinically, c-Met gene abnormalities have been detected in various types of cancer, including lung cancer, liver cancer, gastric cancer, and colorectal cancer. Due to its strong link with cancer, c-Met has become an important target in cancer therapy research.

[0006] Antibody-drug conjugate (ADC) is typically composed of an antibody covalently linked to a cytotoxic payload via a linker. ADCs, often referred to as “biological missiles” , combine both the advantages of the highly specific targeting ability of an antibody that binds to the tumor-enriched surface receptor and the highly potent killing effect of a small molecule cytotoxin payload. This combination enables the accurate and efficient elimination of cancer cells. Since the first ADC,  was approved by FDA in 2000, there have been 14 ADCs that have received market approval worldwide so far. The payloads of the ADCs have expanded beyond the classical cytotoxins. ASO and siRNA represent a new class of payloads with distinct properties. They hold the promise of treating cancer through oncogene inhibition, immune modulation and other mechanisms (16) .Summary

[0007] In a first aspect, the present invention provides a novel method to produce AOC for preventing, alleviating or treating a cancer, through site-specific conjugation of oligonucleotides, such as ASO and siRNA, to the antibody. Particularly, the present invention provides a method for preparing an antibody-oligonucleotide conjugate for preventing, alleviating or treating a cancer, comprising the following steps:

[0008] 1) providing an antibody comprising a glycosylation site;

[0009] 2) providing an oligonucleotide with an oxazoline motif attached to it;

[0010] 3) conjugating the oligonucleotide from 2) to the antibody from 1) through the catalysis of a glycosidase;

[0011] wherein the glycosylation site comprises glycan chains including N-acetylglucose-β- (1, 4) -N-acetylglucose, the oxazoline motif has a structure selected from the group below:

[0012] wherein

[0013] the oligonucleotide targets a gene related to cancer; and / or

[0014] the antibody targets cancer.

[0015] In a second aspect, the present invention also provides a method for preparing an antibody-oligonucleotide conjugate for preventing, alleviating or treating a cancer, comprising the following steps:

[0016] 1) providing an antibody comprising a glycosylation site;

[0017] 2) providing an oligonucleotide with a bioorthogonal reactive group attached to it;

[0018] 3) providing a linker with both an oxazoline motif and a bioorthogonal reactive group attached to it;

[0019] 4) linking the oligonucleotide from 2) to the linker from 3) through a bioorthogonal reaction, and then conjugating to the antibody from 1) through the catalysis of a glycosidase; or

[0020] conjugating the linker from 3) to the antibody from 1) through the catalysis of a glycosidase, and then linking to the oligonucleotide from 2) through a bioorthogonal reaction;

[0021] wherein the glycosylation site comprises glycan chains including N-acetylglucose-β- (1, 4) -N-acetylglucose, the oxazoline motif has a structure selected from the group below:

[0022] wherein the oligonucleotide targets gene related to cancer; and / or

[0023] the antibody targets cancer.

[0024] In some embodiments, the glycosylation site is located at Fc region.

[0025] In a third aspect, the present invention provides an antibody-oligonucleotide conjugate that is prepared by the method according to any one of the first aspect and the second aspect.

[0026] In a fourth aspect, the present invention provides a pharmaceutical composition comprising the antibody-oligonucleotide conjugate that is prepared by the method according to any one of the first aspect and the second aspect. In some embodiments, the pharmaceutical composition further comprises at least one pharmaceutically acceptable carrier.

[0027] In a fifth aspect, the present invention provides a method for preventing, alleviating or treating cancer, comprising administering a therapeutically effective amount of the antibody-oligonucleotide conjugate according to the third aspect or the pharmaceutical composition according to the fourth aspect.Brief Description of the Drawings

[0028] Figure 1 shows the exposure of oligonucleotide in the pancreatic tumor tissue of KRASG12D-mutated pancreatic patient-derived xenografts (PDXs) one day after the last administration of AOC1 at 37 mg / kg and one day after the last administration of the combination of AOC1 at 37 mg / kg with Gemcitabine at 60 mg / kg, respectively.

[0029] Figure 2 shows the exposure of oligonucleotide in the pancreatic tumor tissue of KRASG12V-mutated pancreatic patient-derived xenografts (PDXs) one day after the last administration of AOC1 at 37 mg / kg and one day after the last administration of the combination of AOC1 at 37 mg / kg with Gemcitabine at 60 mg / kg, respectively.

[0030] Figure 3 shows the exposure of oligonucleotide in the pancreatic tumor tissue of KRASG12R-mutated pancreatic patient-derived xenografts (PDXs) three days after the last administration of AOC1 at a low dose of 37 mg / kg and a high dose of 111 mg / kg, respectively.

[0031] Figure 4 shows the relative KRAS mRNA level in the pancreatic tumor tissue of KRASG12D-mutated pancreatic patient-derived xenografts (PDXs) one day after the last administration of AOC3 at a low dose of 15 mg / kg and a high dose of 45 mg / kg, respectively.

[0032] Figure 5 shows the relative KRAS mRNA level in the pancreatic tumor tissue of KRASG12D-mutated pancreatic patient-derived xenografts (PDXs) one day after the last administration of the combination of AOC3 at a high dose of 45 mg / kg with Gemcitabine at 60 mg / kg (as shown on the right) and one day after the last administration of Gemcitabine at 60 mg / kg (as shown on the left) , respectively.

[0033] Figure 6 shows the fluorescence images of the phosphorylation level of KRAS downstream effector in KRASG12D-mutated pancreatic patient-derived xenografts (PDXs) and KRASG12V-mutated pancreatic patient-derived xenografts (PDXs) , respectively.Detailed Description

[0034] The specific embodiments are provided below to illustrate technical contents of the present disclosure. Those skilled in the art can easily understand other advantages and effects of the present disclosure through the contents disclosed in the specification. The present disclosure can also be implemented or applied through other different specific embodiments. Various modifications and variations can be made by those skilled in the art without departing from the spirit of the present disclosure.

[0035] Definitions

[0036] Unless otherwise defined hereinafter, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by those skilled in the art. The techniques used herein refer to those that are generally understood in the art, including the variants and equivalent substitutions that are obvious to those skilled in the art. While the following terms are believed to be readily comprehensible by those skilled in the art, the following definitions are set forth to better illustrate the present disclosure. When a trade name is present herein, it refers to the corresponding commodity or the active ingredient thereof. All patents, published patents applications and publications cited herein are hereby incorporated by reference.

[0037] When a certain amount, concentration, or other value or parameter is set forth in the form of a range, a preferred range, or a preferred upper limit or a preferred lower limit, it should be understood that it is equivalent to specifically revealing any range formed by combining any upper limit or preferred value with any lower limit or preferred value, regardless of whether the said range is explicitly recited. Unless otherwise stated, the numerical ranges listed herein are intended to include the endpoints of the range and all integers and fractions (decimals) within the range. For example, the expression “i is an integer of 1 to 20” means that i is any integer of 1 to 20, for example, i can be 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 or 20. Other similar expressions such as j, k1, k2, n , k and z should also be understood in a similar manner.

[0038] Unless otherwise stated herein, singular forms like “a” and “the” include the plural forms. The expression “one or more” or “at least one” may mean 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or more.

[0039] The terms “about” and “approximately” , when used in connection with a numerical variable, generally mean that the value of the variable is within experimental error (for example, within a 95%confidence interval for the mean) or within ± 10%of a specified value, or a wider range.

[0040] The term “optional” or “optionally” means the event described subsequent thereto may, but not necessarily happen, and the description includes the cases wherein said event or circumstance happens or does not happen.

[0041] The expression “comprising” or similar expressions “including” , “containing” and “having” are open-ended, and do not exclude additional unrecited elements, steps, or ingredients. The expression “consisting of” excludes any element, step, or ingredient not designated. The expression “consisting essentially of” means that the scope is limited to the designated elements, steps or ingredients, plus elements, steps or ingredients that are optionally present that do not substantially affect the essential and novel characteristics of the claimed subject matter. It should be understood that the expression “comprising” encompasses the expressions “consisting essentially of” and “consisting of” .

[0042] As used herein, the term “antibody” is used in a broad way and particularly includes an intact monoclonal antibody, a polyclonal antibody, a monospecific antibody, a multispecific antibody (e.g., a bispecific antibody) , and an antibody fragment, as long as they have the desired biological activity. The antibody may be of any subtype (such as IgG, IgE, IgM, IgD, and IgA) or subclass, and may be derived from any suitable species. In some embodiments, the antibody is of human or murine origin. The antibody may also be a fully human antibody, humanized antibody or chimeric antibody prepared by recombinant methods.

[0043] Monoclonal antibodies are used herein to refer to antibodies obtained from a substantially homogeneous population of antibodies, i.e., the individual antibodies constituting the population are identical except for a small number of possible natural mutations. Monoclonal antibodies are highly specific for a single antigenic site, multiple antigenic sites or different epitopes of the same antigen. The word “monoclonal” refers that the characteristics of the antibody are derived from a substantially homogeneous population of antibodies and are not to be construed as requiring some particular methods to produce the antibody.

[0044] An intact antibody or full-length antibody essentially comprises the antigen-binding variable region (s) as well as the light chain constant region (s) (CL) and heavy chain constant region (s) (CH) , which could include CH1, CH2, CH3 and / or CH4, depending on the subtype of the antibody. An antigen-binding variable region (also known as a fragment variable region, Fv fragment) typically comprises a light chain variable region (VL) and a heavy chain variable region (VH) . A constant region can be a constant region with a native sequence (such as a constant region with human native sequences) or an amino acid sequence variant thereof. The variable region recognizes and interacts with the target antigen. The constant region can be recognized by and interacts with the immune system.

[0045] As used herein, the term “heavy chain constant region (CH) ” includes amino acid sequences derived from an intact antibody or full-length antibody heavy chain. A polypeptide comprising a heavy chain constant region comprises at least one of: a CH1 domain, a hinge (e.g., upper, middle, and / or lower hinge region) domain, a CH2 domain, a CH3 domain, and / or a CH4 domain, or a variant or fragment thereof. For example, an antigen-binding polypeptide for use in the disclosure may comprise a polypeptide chain comprising a CH1 domain; a polypeptide chain comprising a CH1 domain, at least a portion of a hinge domain, and a CH2 domain; a polypeptide chain comprising a CH1 domain and a CH3 domain; a polypeptide chain comprising a CH1 domain, at least a portion of a hinge domain, and a CH3 domain, or a polypeptide chain comprising a CH1 domain, at least a portion of a hinge domain, a CH2 domain, and a CH3 domain.

[0046] As used herein, “CL” refers to a constant region of a light chain.

[0047] The subunit structures and three-dimensional configuration of the constant regions of the various antibody classes are well known. As used herein, the term “VH domain” includes the amino terminal variable domain of an antibody heavy chain and the term “CH1 domain” includes the first (most amino terminal) constant region domain of an antibody heavy chain. The CH1 domain is adjacent to the VH domain and is amino terminal to the hinge region of an antibody heavy chain molecule.

[0048] As used herein, “VL” refers to a variable region of a light chain.

[0049] An antibody fragment may comprise a portion of an intact antibody, preferably its antigen binding region or variable region. Examples of antibody fragments include Fab, Fab', F (ab') 2, Fd fragment consisting of VH and CH1 domains, Fv fragment, single-domain antibody (sdAb, also known as nanobody or “VHH” ) fragment, and isolated complementarity determining region (CDR) . The Fab fragment is an antibody fragment obtained by papain digestion of a full-length immunoglobulin, or a fragment having the same structure produced by, for example, recombinant expression. A Fab fragment comprises a light chain (comprising a VL and a CL) and another chain, wherein the said other chain comprises a variable domain of the heavy chain (VH) and a constant region domain of the heavy chain (CH1) . The F (ab') 2 fragment is an antibody fragment obtained by pepsin digestion of an immunoglobulin at pH 4.0-4.5, or a fragment having the same structure produced by, for example, recombinant expression. The F (ab') 2 fragment essentially comprises two Fab fragments, wherein each heavy chain portion comprises a few additional amino acids, including the cysteines that form disulfide bonds connecting the two fragments. A Fab' fragment is a fragment comprising one half of a F (ab') 2 fragment (one heavy chain and one light chain) . The antibody fragment may comprise a plurality of chains joined together, for example, via a disulfide bond and / or via a peptide linking unit. Examples of antibody fragments also include single-chain Fv (scFv) , Fv, dsFv, diabody, Fd and Fd' fragments, and other fragments, including modified fragments. An antibody fragment typically comprises at least or about 50 amino acids, and typically at least or about 200 amino acids. An antigen-binding fragment can include any antibody fragment that, when inserted into an antibody framework (e.g., by substitution of the corresponding region) , can result in an antibody that immunospecifically binds to the antigen.

[0050] “VHH” as used herein correspond to the variable region of heavy chain only camelid antibodies that are naturally devoid of light chains. VHH has very small molecular weight of around 12-15 kDa. They contain a single chain molecule that can bind its cognate antigen using a single domain. The antigen-binding surfaces of VHHs are usually more convex (or protruding) than those of conventional antibodies, which are usually flat or concave. More specifically, VHHs are composed of 4 Framework Regions (or FRs) whose sequences and structures are defined as conserved, and three Complementarity Determining Regions (or CDRs) showing high variability both in sequence content and structure conformation, which are involved in antigen binding and provide antigen specificity. VHH molecules of the invention typically comprise or consist of the formula: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4, wherein FRn (for example, FR1, FR2, FR3 and FR4) designates framework regions and CDRs (for example, CDR1, CDR2 and CDR3) designates complementarity determining regions. Compared to conventional human antibody VH, a few amino acids are substituted in the FR2 region and complementarity-determining regions (CDRs) of VHH. For instance, highly conserved hydrophobic amino acids (such as Val42, Gly49, Leu50, and / or Trp52) in FR2 region are often replaced by hydrophilic amino acids (Phe42, Glu49, Arg50, Gly52) , rendering the overall structure more hydrophilic and contributing to high stability, solubility and resistance to aggregation.

[0051] “Fc” as used herein corresponds to Fc fragment of an immunoglobulin. Typically, “Fc” is an Fc fragment of a human IgG1 or IgG4, preferably IgG1.

[0052] In the case where there are two or more definitions of a term which is used and / or accepted within the art, the definition of the term as used herein is intended to include all such meanings unless explicitly stated to the contrary. A specific example is the use of the term “complementarity determining region” ( “CDR” ) to describe the non-contiguous antigen combining sites found within the variable region of both heavy and light chain polypeptides. This particular region has been described by Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, “Sequences of Proteins of Immunological Interest” (1983) and by Chothia et al., J. MoI. Biol. 196: 901-917 (1987) , which are incorporated herein by reference in their entireties. The CDR definitions according to Kabat and Chothia include overlapping or subsets of amino acid residues when compared against each other. Nevertheless, application of either definition to refer to a CDR of an antibody or variants thereof is intended to be within the scope of the term as defined and used herein. The exact residue numbers which encompass a particular CDR will vary depending on the sequence and size of the CDR. Those skilled in the art can routinely determine which residues comprise a particular CDR given the variable region amino acid sequence of the antibody.

[0053] The amino acid sequences of the CDRs in this invention are all depicted according to the Kabat definition rules. However, it is well known to those skilled in the art that there are multiple methods to define the CDRs of antibodies, such as the Chothia method (see, for example, Chothia, C. et al., Nature, 342, 877-883 (1989) ; and Al-Lazikani, B. et al., J. Mol. Biol., 273, 927-948 (1997) ) , the Kabat method based on the variability of antibody sequences (see, for example, Kabat, E. A. et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242) , AbM (Martin, A.C.R. and J. Allen (2007) “Bioinformatics tools for antibody engineering, ” in S. Dübel (ed. ) , Handbook of Therapeutic Antibodies. Weinheim: Wiley-VCH Verlag, pp. 95–118) , Contact (MacCallum, R. M. et al., (1996) J. Mol. Biol. 262: 732-745) , IMGT (Lefranc, M.-P., 2011 (6) , IMGT, the International ImMunoGeneTics Information System Cold Spring Harb Protoc.; and Lefranc, M. -P. et al., Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77 (2003) ) , and the North CDR definition based on affinity propagation clustering utilizing a large number of crystal structures. In this document, multiple CDR numbering systems can be used for the same variable region, such as Chothia, Abm, Kabat, Contact, and IMGT. It should be understood by those skilled in the art that although CDRs defined by different numbering systems may differ, the CDRs corresponding to the same numbering system represent the effective antigen-binding sites capable of binding to antigenic epitopes. Unless otherwise specified, the term "CDR" and "complementarity-determining region" for a given antibody or its region (such as the variable region) should be understood to encompass any defined complementarity-determining region by the known schemes described in this invention. Although the scope of protection requested in the claims of this invention is based on the sequences shown by the Kabat definition rules, the amino acid sequences corresponding to other CDR definition rules should also fall within the scope of protection of this invention.

[0054] Therefore, when defining antibodies with specific CDR sequences defined in this invention, the scope of the antibodies also covers such antibodies whose variable region sequences include the specific CDR sequences but have different claimed CDR boundaries due to the application of different schemes (such as different assignment system rules or combinations) .

[0055] As used herein, “HCDR” refers to a complementarity determining region of a heavy chain.

[0056] As used herein, “LCDR” refers to a complementarity determining region of a light chain.

[0057] As used in this document, the terms “framework region” and “scaffold region” can be used interchangeably. As used in this document, the terms “framework region” , “scaffold region” , or “FR” residues refer to those amino acid residues in the variable region of an antibody other than the CDR sequences as defined above.

[0058] The term “disulfide bond” as used in this document includes covalent bonds formed between two sulfur atoms. The amino acid cysteine contains a thiol group capable of forming a disulfide bond or bridging a second thiol group.

[0059] Antibody according to the present disclosure can be prepared using techniques well known in the art, such as the following techniques or a combination thereof: recombinant techniques, phage display techniques, synthetic techniques, or other techniques known in the art. For example, a genetically engineered recombinant antibody (or antibody mimic) can be expressed by a suitable culture system (e.g., E. coli or mammalian cells) . The engineering of antibody can refer to, for example, the introduction of a ligase-specific recognition sequence at its terminals.

[0060] A small molecule compound refers to a molecule with a size comparable to that of an organic molecule commonly used in medicine. The term does not encompass biological macromolecules (e.g., proteins, nucleic acids, etc. ) , but encompasses low molecular weight peptides or derivatives thereof, such as dipeptides, tripeptides, tetrapeptides, pentapeptides, and the like. Typically, the molecular weight of the small molecule compound can be, for example, about 100 to about 2000 Da, about 200 to about 1000 Da, about 200 to about 900 Da, about 200 to about 800 Da, about 200 to about 700 Da, about 200 to about 600 Da, about 200 to about 500 Da.

[0061] As used in this document, the terms “%identity” , “percent (%) sequence identity” and “sequence identity” have the recognized definition in the field, referring to the percentage of identity between two polypeptide sequences determined by sequence alignment (such as by manual inspection or known algorithms) . It can be determined using methods known to those skilled in the art, such as using publicly available computer software like BLAST, BLAST-2, Clustal Omega, and FASTA software.

[0062] Linking unit refers to a functional group that covalently bonds two or more moieties in a compound or material. For example, the linking unit can serve to covalently bond adjuvant moieties of targeting molecule (s) and / or payload (s) .

[0063] A spacer is a structure that is located between different structural modules and can spatially separate the structural modules. The definition of spacer is not limited by whether it has a certain function or whether it can be cleaved or degraded in vivo. Examples of spacers include but are not limited to amino acids and non-amino acid structures, wherein non-amino acid structures can be, but are not limited to, amino acid derivatives or analogues. “Spacer sequence” refers to an amino acid sequence serving as a spacer, and examples thereof include but are not limited to a single amino acid such as Leu, Gln, etc., a sequence containing a plurality of amino acids, for example, a sequence containing two amino acids such as GA, etc., or, for example, GGGGS (SEQ ID NO: 7) , GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 8) , GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 9) , etc. Other examples of spacers include, for example, self-immolative spacers such as PABC (p-benzyloxycarbonyl) , and the like.

[0064] The term “alkyl” refers to a straight or branched saturated aliphatic hydrocarbon group consisting of carbon atoms and hydrogen atoms, which is connected to the rest of the molecule through a single bond. The alkyl group may contain 1 to 20 carbon atoms, referring to C1-C20 alkyl group, for example, C1-C4 alkyl group, C1-C3 alkyl group, C1-C2 alkyl, C3 alkyl, C4 alkyl, C3-C6 alkyl. Non-limiting examples of alkyl groups include but are not limited to methyl, ethyl, propyl, butyl, pentyl, hexyl, isopropyl, isobutyl, sec-butyl, tert-butyl, isopentyl, 2-methylbutyl, 1-methylbutyl, 1-ethylpropyl, 1, 2-dimethylpropyl, neopentyl, 1, 1-dimethylpropyl, 4-methylpentyl, 3-methylpentyl, 2-methylpentyl, 1-methylpentyl, 2-ethylbutyl, 1-ethylbutyl, 3, 3-dimethylbutyl, 2, 2-dimethyl butyl, 1, 1-dimethylbutyl, 2, 3-dimethylbutyl, 1, 3-dimethylbutyl or 1, 2-dimethylbutyl, or their isomers. A bivalent radical refers to a group obtained from the corresponding monovalent radical by removing one hydrogen atom from a carbon atom with free valence electron (s) . A bivalent radical has two connecting sites which are connected to the rest of the molecule. For example, an “alkylene” or an “alkylidene” refers to a saturated divalent hydrocarbon group, either straight or branched. Examples of alkylene groups include but are not limited to methylene (-CH2-) , ethylene (-C2H4-) , propylene (-C3H6-) , butylene (-C4H8-) , pentylene (-C5H10-) , hexylene (-C6H12-) , 1-methylethylene (-CH (CH3) CH2-) , 2-methylethylene (-CH2CH (CH3) -) , methylpropylene, ethylpropylene, and the like.

[0065] As used herein, when a group is combined with another group, the connection of the groups may be linear or branched, provided that a chemically stable structure is formed. The structure formed by such a combination can be connected to other moieties of the molecule via any suitable atom in the structure, preferably via a designated chemical bond. For example, when describing a combination of a C1-4 alkylene with one of the groups including -CH2-, -NH-, - (CO) -, -NH (CO) -, - (CO) NH-, the C1-4 alkylene may form a linear connection with the above groups, such as C1-4 alkylene-CH2-, C1-4 alkylene-NH-, C1-4 alkylene- (CO) -, C1-4 alkylene-NH (CO) -, C1-4 alkylene- (CO) NH-, -CH2-C1-4 alkylene, -NH-C1-4 alkylene, - (CO) -C1-4 alkylene, -NH (CO) -C1-4 alkylene, - (CO) NH-C1-4 alkylene. The resulting bivalent structure can be further connected to other moieties of the molecule.

[0066] Non-critical regions in polypeptides can be modified, for example, by substitution, addition, and / or deletion of one or more amino acids without altering the function of the polypeptide. Suitable conservative amino acid substitutions in peptides or proteins are known to those skilled in the art and can generally be made without altering the biological activity of the resulting molecule. Typically, those skilled in the art recognize that single amino acid substitutions in non-essential regions of a polypeptide essentially do not change the biological activity (see, for example, Watson et al., Molecular Biology of the Gene, 4th Edition, 1987, The Benjamin / Cummings Pub. co., p. 224) .

[0067] Conjugation method

[0068] In some embodiments, provided is a method for preparing an antibody-oligonucleotide conjugate for preventing, alleviating or treating a cancer, comprising the following steps:

[0069] 1) providing an antibody comprising a glycosylation site;

[0070] 2) providing an oligonucleotide with an oxazoline motif attached to it;

[0071] 3) conjugating the oligonucleotide from 2) to the antibody from 1) through the catalysis of a glycosidase;

[0072] wherein the glycosylation site comprises glycan chains including N-acetylglucose-β- (1, 4) -N-acetylglucose, the oxazoline motif has a structure selected from the group below:

[0073] wherein

[0074] the oligonucleotide targets a gene related to cancer; and / or

[0075] the antibody targets cancer.

[0076] In some embodiments, wherein the oxazoline motif connects oligonucleotide via linker, wherein the linker is directly attached to carbonyl in oxazoline motif via -NH-.

[0077] In some embodiments, wherein the antibody comprises Fc region. In some embodiments, the glycosylation site is located at Fc region.

[0078] In some embodiments, provided is a method for preparing an antibody-oligonucleotide conjugate for preventing, alleviating or treating a cancer, comprising the following steps:

[0079] 1) providing an antibody with a Fc region;

[0080] 2) providing an oligonucleotide with an oxazoline motif attached to it;

[0081] 3) conjugating the oligonucleotide from 2) to the antibody from 1) through the catalysis of a glycosidase;

[0082] wherein the oxazoline motif has a structure selected from the group below:

[0083] wherein

[0084] the oligonucleotide targets a gene related to cancer; and / or

[0085] the antibody targets cancer.

[0086] In some embodiments, the conjugation reaction can be represented by the following scheme:

[0087] wherein represents antisense oligonucleotide (ASO) ,  represents siRNA.

[0088] The glycosylation site and the oxazoline motif can interact under the catalysis of glycosidase, enabling the conjugation of the respective moieties to which they are attached. In some embodiments, the glycosidase is immobilized on a support. WO2024002330A can be referred to and is hereby incorporated by reference in its entitrely.

[0089] In some embodiments, provided is a method for preparing an antibody-oligonucleotide conjugate for preventing, alleviating or treating a cancer, comprising the following steps:

[0090] 1) providing an antibody comprising a glycosylation site;

[0091] 2) providing an oligonucleotide with a bioorthogonal reactive group attached to it;

[0092] 3) providing a linker with both an oxazoline motif and a bioorthogonal reactive group attached to it;

[0093] 4) linking the oligonucleotide from 2) to the linker from 3) through a bioorthogonal reaction, and then conjugating to the antibody from 1) through the catalysis of a glycosidase; or

[0094] conjugating the linker from 3) to the antibody from 1) through the catalysis of a glycosidase, and then linking to the oligonucleotide from 2) through a bioorthogonal reaction;

[0095] wherein the glycosylation site comprises glycan chains including N-acetylglucose-β- (1, 4) -N-acetylglucose, the oxazoline motif has a structure selected from the group below:

[0096] wherein the oligonucleotide targets gene related to cancer; and / or

[0097] the antibody targets cancer.

[0098] In some embodiments, the linker is directly attached to carbonyl in oxazoline motif via -NH-. In some embodiments, wherein the antibody comprises Fc region. In some embodiments, the glycosylation site is located at Fc region.

[0099] In some embodiments, provided is a method for preparing an antibody-oligonucleotide conjugate for preventing, alleviating or treating a cancer, comprising the following steps:

[0100] 1) providing an antibody with a Fc region;

[0101] 2) providing an oligonucleotide with a bioorthogonal reactive group attached to it;

[0102] 3) providing a linker with both an oxazoline motif and a bioorthogonal reactive group attached to it;

[0103] 4) linking the oligonucleotide from 2) to the linker from 3) through a bioorthogonal reaction, and then conjugating to the antibody from 1) through the catalysis of a glycosidase; or

[0104] conjugating the linker from 3) to the antibody from 1) through the catalysis of a glycosidase, and then linking to the oligonucleotide from 2) through a bioorthogonal reaction;

[0105] wherein the oxazoline motif has a structure selected from the group below:

[0106] wherein the oligonucleotide targets gene related to cancer; and / or

[0107] the antibody targets cancer.

[0108] In some embodiments, the conjugation reaction can be represented by the following scheme:

[0109] wherein represents ASO,  represents siRNA.

[0110] The glycosylation site and the oxazoline motif can interact under the catalysis of glycosidase, enabling the conjugation of the respective moieties to which they are attached. The biorthogonal reactive group means the group that can interact with each other under a biorthogonal reaction condition, linking the respective moieties to which they are attached. In some embodiments, the glycosidase is immobilized on a support.

[0111] The antibody targeting cancer encompasses the situation that the antibody binds to a surface receptor on a cancer cell. In some embodiments, the antibody binds to Trop2 or c-Met.

[0112] In some embodiments, the antibody is selected from the group consisting of: IgG antibody, VHH-Fc fusion protein and scFv-Fc fusion protein.

[0113] In some embodiments, the glycosylation site comprises the glycosylation site of the Fc region. In some embodiments, the glycosylation site is located in the Fc region. In some embodiments, the glycosylation site is located at Asn297 of the Fc region (EU numbering) . The glycosylation site also encompasses the mutated glycosylation site.

[0114] In some embodiments, an Asn297 in glycosylation site is mutated to an amino acid other than Asn. In some particular embodiments, an Asn297 in glycosylation site is mutated to Ala or Gly. In some embodiments, the Fc region comprises Knob-into-Hole mutations. In some embodiments, the Asn297 in glycosylation site of one chain of the Fc region can be mutated to an amino acid other than Asn. In some embodiments, the Asn297 in glycosylation site of Fc chain corresponding to the “knob” is mutated to Ala. In some embodiments, the Asn297 in glycosylation site of Fc chain corresponding to the “hole” is mutated to Ala.

[0115] In some embodiments, when the antibody is VHH-Fc fusion protein and scFv-Fc fusion protein, the mutated Asn297 glycosylation site is located in the Fc chain that is fused with VHH or scFv (i.e., corresponding to the “knob” or “hole” ) . In some embodiments, when the antibody is VHH-Fc fusion protein and scFv-Fc fusion protein, the mutated Asn297 glycosylation site is located in the Fc chain that is not fused with VHH or scFv (i.e., corresponding to the “hole” or “knob” ) .

[0116] In some embodiments, the antibody-oligonucleotide conjugate comprises general formula VHH-Fc, for example, the antibody-oligonucleotide conjugate presents as VHH-Fc-siRNA or VHH-Fc-ASO.

[0117] In some embodiments, the glycosidase is selected from the group consisting of: Endo S (Streptococcus pyogenes endoglycosidase -S) , Endo F3 (Elizabethkingia miricola endoglycosidase -F3) , Endo S2 (Endoglycosidase S2, Streptococcus pyogenes endoglycosidase -S2) , Endo Sd (Endoglycosidase-Sd, Streptococcus pyogenes endoglycosidase -Sd) and Endo CC (Endoglycosidase-CC, Streptococcus pyogenes endoglycosidase -CC) or a variant thereof. In some preferable embodiments, the glycosidase is Endo S2 or a variant thereof.

[0118] In some embodiments, the linker described herein is a cleavable linker or a non-cleavable linker. In some embodiments, the linker is a cleavable linker. In some embodiments, the linker is an acid cleavable linker. In some embodiments, the linker is a non-cleavable linker. In some embodiments, the linker includes a C1-C6 alkyl group (e.g., a C5, C4, C3, C2, or C1 alkyl group) . In some embodiments, the linker includes homobifunctional cross linkers, heterobifunctional cross linkers, and the like. In some embodiments, the linker is a traceless linker (or a zero-length linker) . In some embodiments, the linker is a non-polymeric linker. In some embodiments, the linker is a non-peptide linker or a linker that does not contain an amino acid residue. In some embodiments, the linker comprises an amino acid residue. In some embodiments, the linker comprises suitable moieties for bioorthogonal reaction, which are listed below:

[0119] In some embodiments, the biorthogonal reaction comprises Click Chemistry Reaction. In some embodiments, the biorthogonal reaction condition is at 4-40℃ for 0.5-20 hours. In some embodiments, the linker comprises suitable moieties for bioorthogonal reactive group. In some particular embodiments, the biorthogonal reactive group comprises dibenzocyclooctyne (DBCO) and azide group (N3) .

[0120] The present invention provides an antibody-oligonucleotide conjugate that is prepared by the methods described above. In some embodiments, the antibody-oligonucleotide conjugate is used for preventing, alleviating or treating a cancer.

[0121] The therapeutic effect on cancer can originate from multiple mechanisms. In some embodiments, the therapeutic effect of antibody-oligonucleotide conjugate on cancer is mediated by the mechanism selected from silencing an mRNA of an oncogene and / or preventing a ribosome from binding to an mRNA of an oncogene.

[0122] In some embodiments, the oligonucleotide silences an mRNA of an oncogene. In some other embodiments, the oligonucleotide prevents a ribosome from binding to an mRNA of an oncogene.

[0123] In some embodiments, the oncogene comprises RAS gene and c-Met gene. In some preferable embodiments, the oncogene comprises KRAS gene. In some particular embodiments, the oncogene is RAS gene. In some preferable particular embodiments, the oncogene is KRAS gene.

[0124] In some embodiments, the oligonucleotide is selected from the group consisting of: antisense oligonucleotide (ASO) and siRNA. In some preferable embodiments, the oligonucleotide is ASO. In some other preferable embodiments, the oligonucleotide is siRNA.

[0125] The antibody-oligonucleotide conjugate prepared by the methods described in the present invention has an appropriate drug-antibody ratio (DAR) . In some embodiments, the DAR of the antibody-oligonucleotide conjugate is 0.8-2.0. For example, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9 and 2.0.

[0126] The present invention also provides a pharmaceutical composition that comprises the antibody-oligonucleotide conjugate. In some embodiments, the pharmaceutical composition further comprises one pharmaceutically acceptable carrier.

[0127] The present invention provides use of the antibody-oligonucleotide conjugate in the manufacture of a medicament for preventing, alleviating or treating a cancer by silencing a mRNA of an oncogene and / or preventing a ribosome from binding to an mRNA of an oncogene.

[0128] The present invention further provides a method for preventing, alleviating or treating cancer, comprising administering a therapeutically effective amount of the antibody-oligonucleotide conjugate or the pharmaceutical composition described herein to a subject in need thereof.

[0129] In some embodiments, after administering the antibody-oligonucleotide conjugate or the pharmaceutical composition described herein, the cancer associated mRNA level is decreased. In some particular embodiments, after administering the antibody-oligonucleotide conjugate or the pharmaceutical composition described herein, the KRAS gene expression is inhibited. In some other embodiments, after administering the antibody-oligonucleotide conjugate or the pharmaceutical composition described herein, the phosphorylation level of a cancer-associated downstream effector is decreased. In some particular embodiments, after administering the antibody-oligonucleotide conjugate or the pharmaceutical composition described herein, the phosphorylation level of KRAS downstream effector is decreased.

[0130] Antibody and modification

[0131] Antibody

[0132] The antibody involved in the antibody-oligonucleotide conjugate targets a cancer. In some embodiments, the antibody targeting cancer encompasses the situation that the antibody binds to a surface receptor on a cancer cell. In some particular embodiments, the antibody binds to Trop2 or c-Met.

[0133] In some embodiments, the antibody used herein is an intact monoclonal antibody.

[0134] In some embodiments, the antibody used herein is a polyclonal antibody.

[0135] In some embodiments, the antibody used herein is a monospecific antibody.

[0136] In some embodiments, the antibody used herein is a bispecific antibody.

[0137] In some embodiments, the antibody used herein is an antibody fragment.

[0138] In some embodiments, the antibody used herein is a VHH or scFv, optionally fused to a Fc fragment.

[0139] In some other embodiments, the antibody used herein is selected from the group consisting of: IgG antibody, VHH-Fc fusion protein and scFv-Fc fusion protein.

[0140] In some embodiments, the VHH binds human and / or mouse Trop2 or c-Met. In some embodiments, the scFv binds human and / or mouse Trop2 or c-Met.

[0141] The present invention relates to an antibody which comprises a glycosylation site. In some embodiments, the glycosylation site of the antibody is located in the Fc region. The glycosylation site also encompasses the mutated glycosylation site. In some embodiments, an Asn297 in glycosylation site is mutated to an amino acid other than Asn. In some particular embodiments, an Asn297 in glycosylation site is mutated to Ala or Gly. In some embodiments, the Fc region comprises Knob-into-Hole mutations. In some embodiments, the Asn297 in glycosylation site of one chain of the Fc region can be mutated to an amino acid other than Asn. In some embodiments, the Asn297 in glycosylation site of one chain of the Fc region is mutated to Ala or Gly. In some other embodiments, the Asn297 in glycosylation site of the Fc region is mutated to Ala.

[0142] In some embodiments, when the antibody is VHH-Fc fusion protein and scFv-Fc fusion protein, the mutated Asn297 glycosylation site is located in the Fc chain that is fused with VHH or scFv (i.e., corresponding to “knob” arm or “hole” arm ) . In some embodiments, when the antibody is VHH-Fc fusion protein and scFv-Fc fusion protein, the mutated Asn297 glycosylation site is located in the Fc chain that is not fused with VHH or scFv (i.e., corresponding to “hole” arm or “knob” arm) .

[0143] Oligonucleotides and their modification

[0144] The present invention relates to an oligonucleotide for prevention, alleviation or treatment of a cancer. In some embodiments, the oligonucleotide silences an mRNA of an oncogene. In some other embodiments, the oligonucleotide prevents a ribosome from binding to an mRNA of an oncogene.

[0145] In some embodiments, the oncogene comprises RAS gene and c-Met gene. In some preferable embodiments, the oncogene comprises KRAS gene. In some particular embodiments, the oncogene is RAS gene. In some preferable particular embodiments, the oncogene is KRAS gene.

[0146] The oligonucleotide used herein are selected from any single-or double-stranded oligonucleotide such as small interfering RNA (siRNA) , small activating RNAs (saRNA) , gapmer, antisense oligonucleotide (ASO) , shRNA, miRNA, aptamer RNA or bridged nucleic acid (BNA) , which are capable of specifically binding to a target mRNA, thereby modulating gene expression in the cell.

[0147] In some embodiments, the oligonucleotide comprises RNA and / or DNA. In some embodiments, the oligonucleotides comprise RNA. In some embodiments, RNA comprises short interfering RNA (siRNA) , short hairpin RNA (shRNA) , microRNA (miRNA) , double-stranded RNA (dsRNA) , transfer RNA (tRNA) , ribosomal RNA (rRNA) , or heterogeneous nuclear RNA (hnRNA) . In some embodiments, RNA comprises shRNA. In some embodiments, RNA comprises miRNA. In some embodiments, RNA comprises dsRNA. In some embodiments, RNA comprises tRNA. In some embodiments, RNA comprises rRNA. In some embodiments, RNA comprises hnRNA. In some embodiments, the RNA comprises siRNA. In some embodiments, the oligonucleotide comprises siRNA. In some embodiments, the oligonucleotide comprises siRNA.

[0148] In some embodiments, the oligonucleotide is from about 10 to about 50 nucleotides in length. In some embodiments, the oligonucleotide is from about 10 to about 30, from about 15 to about 30, from about 18 to about 25, from about 18 to about 24, from about 19 to about 23, or from about 20 to about 22 nucleotides in length.

[0149] In some embodiments, the oligonucleotide is about 50 nucleotides in length. In some embodiments, the oligonucleotide is about 45 nucleotides in length. In some embodiments, the oligonucleotide is about 40 nucleotides in length. In some embodiments, the oligonucleotide is about 35 nucleotides in length. In some embodiments, the oligonucleotide is about 30 nucleotides in length. In some embodiments, the oligonucleotide is about 25 nucleotides in length. In some embodiments, the oligonucleotide is about 20 nucleotides in length. In some embodiments, the oligonucleotide is about 19 nucleotides in length. In some embodiments, the oligonucleotide is about 18 nucleotides in length. In some embodiments, the oligonucleotide is about 17 nucleotides in length. In some embodiments, the oligonucleotide is about 16 nucleotides in length. In some embodiments, the oligonucleotide is about 15 nucleotides in length. In some embodiments, the oligonucleotide is about 14 nucleotides in length. In some embodiments, the oligonucleotide is about 13 nucleotides in length. In some embodiments, the oligonucleotide is about 12 nucleotides in length. In some embodiments, the oligonucleotide is about 11 nucleotides in length. In some embodiments, the oligonucleotide is about 10 nucleotides in length. In some embodiments, the oligonucleotide is from about 10 to about 50 nucleotides in length. In some embodiments, the oligonucleotide is from about 10 to about 45 nucleotides in length. In some embodiments, the oligonucleotide is from about 10 to about 40 nucleotides in length. In some embodiments, the oligonucleotide is from about 10 to about 35 nucleotides in length. In some embodiments, the oligonucleotide is from about 10 to about 30 nucleotides in length. In some embodiments, the oligonucleotide is from about 10 to about 25 nucleotides in length. In some embodiments, the oligonucleotide is from about 10 to about 20 nucleotides in length. In some embodiments, the oligonucleotide is from about 15 to about 25 nucleotides in length. In some embodiments, the oligonucleotide is from about 15 to about 30 nucleotides in length. In some embodiments, the oligonucleotide is from about 12 to about 30 nucleotides in length.

[0150] In some embodiments, the oligonucleotide comprises natural, synthetic, or artificial nucleotide analogues or bases. In some embodiments, the oligonucleotide comprises combinations of DNA, RNA and / or nucleotide analogues. In some embodiments, the synthetic or artificial oligonucleotide analogues or bases comprise modifications at one or more of ribose moiety, phosphate moiety, nucleoside moiety, or a combination thereof.

[0151] In some embodiments, an oligonucleotide analogue or artificial oligonucleotide base described above comprises a 5'-vinylphosphonate modified nucleotide nucleic acid with a modification at a 5' hydroxyl group of the ribose moiety. In some embodiments, the 5'-vinylphosphonate modified nucleotide is selected from the nucleotide provided below.

[0152] In some embodiments, the modification at the 2' hydroxyl group is a 2'-0-aminopropyl modification in which an extended amine group comprising a propyl linker binds the amine group to the 2' oxygen. In some embodiments, this modification neutralizes the phosphate -derived overall negative charge of the oligonucleotide molecule by introducing one positive charge from the amine group per sugar and thereby improves cellular uptake properties due to its zwitterionic properties.

[0153] In some embodiments, an oligonucleotide described herein is constructed using chemical synthesis and / or enzymatic ligation reactions using procedures known in the art.

[0154] Chemically modified Oligonucleotides

[0155] Addition of functional groups to the 3’ or 5’-terminus of oligonucleotides

[0156] The 3’ or 5’-terminus of an oligonucleotide can be modified with various functional groups using the commonly known methods in nucleotide chemistry field. The functional groups comprise linker (or linker2) to the 3’ or 5’-end of the oligonucleotides.

[0157] In some embodiments, the functional group described herein is installed on the 3’ or 5’-terminus of the oligonucleotide via forming a P-O bond. In some embodiments, the functional group is installed on the 3’ or 5’-terminus of the oligonucleotide via forming a P-N bond. In some embodiments, the functional group is installed via the reaction of oligonucleotides or immobilized oligonucleotides with phosphoramidite derivatives or phosphoramidite derivatives of nucleotide. In some embodiments, the functional group is installed on the 3’ or 5’-terminus of the oligonucleotide via solid phase oligonucleotide synthesis protocol. In some embodiments, the functional group is installed on the 3’ or 5’-terminus of the oligonucleotide via homogenous liquid phase oligonucleotide synthesis protocol. In some embodiments, the function group is amino group or thiol group or carbonyl group or azido group. In some embodiments, the reagent used for the modification of 3’ or 5’-terminus of an oligonucleotide is ethylenediamine or alkyl-diamine.

[0158] In some embodiments, provided is an oligonucleotide with an oxazoline motif attached to it; the oxazoline motif has a structure selected from the group below:

[0159] In some embodiments, the oxazoline can be synthesized according to the detailed description in WO2023232144A1.

[0160] In some embodiments, provided is an oligonucleotide with a bioorthogonal reactive group attached to it. At least one bioorthogonal reaction group is selected from azides, alkynes, alkenes, heterocycles, dienes, and / or a functional group containing one or more heteroatoms, wherein the heteroatoms are selected from S, N, Se, P, and O, such as thiol groups containing sulfur, amino groups containing nitrogen, etc. In some preferable embodiments, the bioorthogonal reaction group is selected from azides, dibenzyl cyclooctynes, tetrazines, and trans-cyclooctenes. In some embodiments, the bioorthogonal reaction group can be introduced via a carbon chain (optionally substituted or replaced with alkyl, phenyl, halogens, O, OH, alkoxy) .

[0161] In some embodiments, the bioorthogonal reaction groups can be selected from those known in the art, for example, see the article: Scinto, S. L., Bilodeau, D. A., Hincapie, R. et al. Bioorthogonal chemistry. Nat Rev Methods Primers 1, 30 (2021) , https:  / / doi. org / 10.1038 / s43586-021-00028-z.

[0162] In some embodiments, the bioorthogonal reactive group is selected from the group consisting of:

[0163] The present invention provides a pharmaceutical composition comprising the antibody-oligonucleotide conjugate prepared by the method described herein. In some embodiments, the pharmaceutical composition further comprises at least one pharmaceutically acceptable carrier.

[0164] The present invention also provides the use of the antibody-oligonucleotide conjugate or the pharmaceutical composition described herein in the manufacture of a medicament for preventing, alleviating or treating cancer by silencing an mRNA of an oncogene or preventing a ribosome from binding to an mRNA of an oncogene.

[0165] The present invention further provides a method for preventing, alleviating or treating cancer, comprising administering a therapeutically effective amount of the antibody-oligonucleotide conjugate or the pharmaceutical composition described herein to a subject in need thereof.

[0166] Beneficial effects

[0167] The conjugation method of the present invention yields unprecedented pure DAR1 pan-KRASmt AOCs, with over 98%purity confirmed by high-performance liquid chromatography (HPLC) analysis. The AOCs present the therapeutic effect of tumor xenograft regression with reduced mean tumor volume. The present invention unveils a new path toward addressing KRAS-driven refractory cancers with tumor targeting ASO / siRNA therapy covering multiple KRAS mutations.

[0168] Examples

[0169] In order to more clearly illustrate the objects and technical solutions, the present disclosure is further described below with reference to specific examples. It is to be understood that the examples are not intended to limit the scope of the disclosure. The specific experimental methods which were not mentioned in the following examples were carried out according to conventional experimental methods.

[0170] Unless otherwise stated, the instruments and reagents used in the examples are commercially available. The reagents can be used directly without further purification.

[0171] Example1 Preparation of oligonucleotides and modification thereof

[0172] Solid-phase synthesis:

[0173] Oligonucleotides were synthesized on a 400 μmol scale using a DNA / RNA synthesizer, following similar solid-phase synthesis protocols reported in the literature. Each synthesis cycle, which was used to add one nucleotide, consisted of the following steps: detritylation, coupling, oxidation (or sulfurization) , and capping.

[0174] Ammonolysis:

[0175] The residual reagent was dried from the solid-phase carrier using a vacuum filtration flask. Then, it was transferred into a pressure-resistant bottle. The ammonolysis solution was added at a ratio of 100 μm / 20 mL. The mixture was heated in a water bath for 1-3 hours and then cooled to room temperature. Five microliters were taken for LC-MS analysis. If the test results met the required standards, the next production step was performed.

[0176] Example 1.1 Synthesis of KRAS ASO and KRAS siRNA

[0177] 5’-Gk*meCk*Tk*Ad*Td*Td*Ad*Gd*Gd*Ad*Gd*Td*meCd*Tk*Tk*Tk-3’ (SEQ ID NO: 10)

[0178] 5’-mC*mU*mUmGmAmCfGmAfUfAfCmAmGmCmUmAmAmUmU*mC*mA-3’ (sense) (SEQ ID NO: 11)

[0179] 5’VP-mU*fG*mAmAmUfUgnAfGfCmUmGmUmAfUmCfGmUmCmAmAmG*mG*mC-3’ (antisense) (SEQ ID NO: 12)

[0180] "me" : 5-methylcytosine; "m" : 2'-o-methyl; "f" : 2'-fluoro; "*" : a phosphorothioate P=S bond; "d" : 2'-deoxy; "gn" : glycol nucleic acid; "VP" : vinyl phosphonate; “k” : cEt-modified bases

[0181] Example 1.2 Synthesis of Compound 1 (5’-hexylamino-ASO)

[0182] Compound 1 was also synthesized following reported solid-phase oligonucleotide synthesis conditions, and the MS data was consistent with the theoretical value.

[0183] Example 1.3 Synthesis of Compound 2 (5'-N3-C4-ASO)

[0184] The mixture of 100 mg lyophilized Compound 1 in 2 mL DMSO was heated at 65℃ for five minutes and dissolved by vortex mixing. Followed by the addition of 3 equivalents of N3-C3-NHS ester (CAS No. 943858-70-6) , the resulting solution was then placed in a shaker at 37℃. Upon completion of the reaction monitored by UPLC-MS, the reaction was purified by pre-HPLC followed by ultrafiltration and lyophilization to afford Compound 2.

[0185] Example 1.4 Synthesis of Compound 3 (5'-N3-C4-siRNA)

[0186] The difference between Compound 3 and Compound 2 is that the oligonucleotide in Compound 3 is siRNA. The synthesis of Compound 3 can be carried out by referring to the synthesis of Compound 2. Upon completion of the reaction monitored by UPLC-MS, the reaction was purified by prep-HPLC followed by ultrafiltration and lyophilization to afford Compound 3.

[0187] Example 1.5 Synthesis of Compound 4 (GGG-PEG4-DBCO)

[0188] Fmoc-GGG-PEG4-COOH was synthesized by conventional solid-phase synthesis methods. MS (ESI) calcd for C32H42N4O11 [M+H] +: 659.29. Found: 659.21.

[0189] To a stirred solution of Fmoc-GGG-PEG4-COOH and Compound i were added DIEA and HATU, and the resulting mixture was stirred at a certain temperature (e.g. -20℃ to 40℃) . After completion, diethylamine was added to the reaction mixture. The mixture was stirred at a certain temperature (e.g. -20℃ to 40℃) , and after reaction completion was monitored by HPLC, the reaction mixture was directly purified by prep-HPLC to afford Compound 4 as a white solid (512 mg, 67%) . MS (ESI) calcd for C35H47N6O9 [M+H] +: 695.34. Found: 695.47.

[0190] Example 1.6 Synthesis of Compound 5 (Oxa-DS1-GGG-PEG4-DBCO)

[0191] Step A: To a stirred solution of DS1 and Compound 4 were added DIEA and HATU. The resulting mixture was stirred at a certain temperature (e.g. -20℃ to 40℃) . Upon completion of the stirring, the reaction mixture was directly purified by prep-HPLC to afford Compound 5b as a white solid (237 mg, 40%yield) . MS (ESI) calcd for C49H68N7O20 [M+H] +: 1074.45. Found: 1074.47. The synthesis of DS1 can refer to WO2023232144A1.

[0192] Step B: To a stirred solution of Compound 5b in water was added Et3N and 2-Chloro-1, 3-dimethylimidazolidinium chloride (DMC, CAS: 37091-73-9) . The resulting mixture was stirred at a certain temperature (e.g. -20℃ to 40℃) . After reaction completion was monitored by HPLC, the reaction mixture was directly purified by prep-HPLC to afford Compound 5 as a white solid (151 mg, 67%yield) . MS (ESI) calcd for C49H65N7O19 [M+H] +: 1056.4. Found: 1056.24.

[0193] Example 2 Preparation of antibody

[0194] The DNA sequence encoding the TROP2 or c-Met targeting monoclonal IgG1 was cloned into the pcDNA3.4-IgG1 vector (Biointron) . Subsequently, the antibody was expressed in the CHO system according to Biointron’s standard procedure. Seventy-two hours post transfection of pcDNA3.4-IgG1, the antibody was harvested from the supernatant and purified using a protein A GraviTrap Column (GE Healthcare) . The concentration of the purified antibody was measured using the ThermoFisher Nanodrop Spectrophotometer.

[0195] Table 1 Sequences

[0196] Example 3 Preparation of AOCs catalyzed by glycosidase

[0197] Example 3.1 Endoglycosidase immobilized resin preparation

[0198] Endoglycosidase was mixed and incubated with agarose filler at room temperature for 10 minutes to 24 hours. Then the mixture was washed three times with a buffer of 50 mM Tris-HCl + 150 mM NaCl (pH 6.0-10.0) . Subsequently, this endoglycosidase immobilized resin was then tested for activity, and cleaned with a buffer of 50 mM Tris-HCl + 150 mM NaCl (pH 7.0) , and then stored at 2-8℃.

[0199] Example 3.2 Enzymatic site-specific conjugation of AOC

[0200] Principle:

[0201] The specific recognition and cleavage of the Asn297 glycosylation site of the Fc fragment were catalyzed by the immobilized glycosidase, and the glycan was coupled with the linker to form the Intermediate Product. This Intermediate Product was then coupled with oligonucleotide through a click chemical reaction to form the AOC.

[0202] Sample buffer exchange:

[0203] The antibody was processed using ultrafiltration, dialysis, or desalting column filtration to replace the storage buffer with 50 mM Tris-HCl (pH 5.0 to 8.0) + 150 mM NaCl.

[0204] Solid phase conjugation:

[0205] The coupling reaction between the antibody and the linker was catalyzed by the immobilized glycosidase to prepare the Intermediate Product. Specifically, the antibody and linker were thoroughly mixed in the 1×endonuclease buffer at an appropriate molar ratio (1: 1 to 1: 100) , and added to the immobilized enzyme resin. The matrix of the enzyme resin had immobilized glycosidase to catalyze the coupling reaction between the antibody and the linker. The coupling reaction was carried out at 4-40℃ for 0.5-20 hours. The mixture was centrifuged, the solid phase was collected, and the unreacted antibody and linker were removed by purification, ultrafiltration, or dialysis to obtain the Intermediate Product.

[0206] Bioorthogonal reaction (Click Chemistry) to ligate Intermediate Product and ASO

[0207] Modified oligonucleotide was dissolved in the RNase-free ultra-pure water, and the Intermediate Product was thoroughly mixed with the oligonucleotide at an appropriate molar ratio (1: 1 to 1: 100) . The click chemical reaction was carried out at 4-40℃ for 0.5-20 hours. After the reaction, the mixture was centrifuged and the precipitate was collected. The unreacted Intermediate Product and oligonucleotide were removed by purification, ultrafiltration, or dialysis to obtain the AOC, and the purified AOC was then stored in the phosphate buffer at 4℃ or -80℃. AOCs prepared are listed in Table 2 below.

[0208] Table 2

[0209] Example 4 Analysis and characterization of AOCs

[0210] Example 4.1 SAX-HPLC analysis

[0211] The SAX-HPLC analysis of AOC was performed on ProPacTM SAX-10 BioLCTM Analytical. A 4*250 mm chromatographic column (ThermoFisher) was used for the filtration, 20 mM Tris pH 9.0 + 20%ethanol was used for the mobile phase A, 20 mM Tris + 1.5M NaCl pH 9.0 + 20%ethanol was used for the mobile phase B. The flow rate was set at 0.6 mL / min. A gradient method was utilized where phase B increasing from 0%to 100%within 7 minutes. The detection wavelength was set at 280 nm to detect the DAR distribution of the AOC.

[0212] Example 4.2 SEC-HPLC analysis

[0213] The SEC-HPLC analysis of AOC was performed. The BioCore SEC-150 5 μm, 7.8*300 mm, 5 μm column (PN: B213-050030-07830S) was used for the filtration. 2 x PBS with 10%ACN was used for the mobile phase. The flow rate was set at 1.0mL / min and ran for 10-30 minutes; the detection wavelength was set at 280nm to analyze the high molecular weight aggregation in the AOC.

[0214] SAX-HPLC and SEC-HPLC results are listed in Tables 3-4 below.

[0215] Table 3 The results of SAX-HPLC analysis

[0216] Table 4 The results of SEC-HPLC analysis

[0217] Taking all the SAX-HPLC and SEC-HPLC data into consideration, the conjugation process catalyzed by glycosidase enables the ligation of the oligonucleotide to the antibody in a highly efficient manner that yielded over 90%DAR1 purity in the final AOC products. The high DAR1 homogeneity of the AOC results in better stability, a longer PK half-life, efficient barrier crossing with widespread tissue exposure, and stronger target engagement with unprecedented RNA reduction. The proportions of unconjugated TROP2 antibody and c-Met antibody were less than 5%and 9%, respectively, and the successfully conjugated AOCs exhibited high DAR1 purity with the actual DAR value at 0.95 and 0.91, respectively.

[0218] For both TROP2 and c-Met targeting AOCs, the content of high molecular weight aggregates was less than 2%, and the final AOC product exhibited a high proportion of monomers, as indicated by the peak eluting at 8.7 minutes.

[0219] Example 5 Surface plasmon resonance (SPR) binding assay

[0220] Example 5.1 Ligand capture

[0221] A Series S Sensor Chip ProA was used to capture ligands. The ligands (TROP2 antibody and c-Met antibody) were diluted to 1 μg / mL with running reagent 3, and then injected into the human Fc capture chip experimental channel (Fc 2, 3, 4) at a flow rate of 10 μL / min. The capture level of the ligands was about 250 RU. The reference channel (Fc1) did not capture ligands.

[0222] Example 5.2 Multi-cycle kinetics

[0223] Human TROP2 and human c-Met were diluted to appropriate concentrations with running reagent 3 at a ratio of 2 times. The diluted samples were injected into the experimental channel and the reference channel at a flow rate of 30 μL / min and ran for corresponding association and dissociation time. The association and dissociation were carried out in the corresponding running reagent. After each concentration analysis, the chip was regenerated with glycine buffer (pH 1.5) at a flow rate of 30 μL / min for 30 s to wash off the ligands and undissociated analytes. For the next concentration analysis, the experimental channel needs to recapture the same amount of ligand.

[0224] The binding affinity for each sample was calculated using Biacore Insight Evaluation Software (the Biacore T200 analysis software) . The reference channel (Fc 1 or Fc 3) was used for background deductions. The Ka, Kd and KD values from the SPR assay are shown in the table below. The analysis of the antibody binding with the antigens, human TROP2 and human c-Met, was performed with the 1: 1 binding fitting method.

[0225] Table 5

[0226] The SPR kinetic curves confirmed the high binding affinity of both TROP2 antibody and c-Met antibody with human TROP2 and human c-Met, and the KD values ranged in sub-nM level.

[0227] Example 6 The effect of TROP2 / c-Met mAb-pan KRASmt oligonucleotide AOCs on tumor regression in the KRASmt pancreatic and lung PDX mice

[0228] Patient-derived xenograft (PDX) models are thought to be more biologically relevant to human disease than standard cell line derived xenograft models and reflect the histological characteristics of human tumors better. PDX mouse studies were performed at the contract research organizations. Female immunodeficient NU / NU or NOD / SCID mice aged 4-6 weeks were arbitrarily numbered during tumor implantation. Tumor fragments were obtained from xenografts in serial passage in the donor nude mice. After removal from donor mice, tumors were cut into fragments (3-4 mm edge length) and placed in PBS containing 10%penicillin / streptomycin. Immunodeficient recipient animals were anesthetized by inhalation of isoflurane and received unilateral tumor implants subcutaneously in the flank. Animals and tumor implants were monitored daily until clear signs of beginning solid tumor growth were detectable in a sufficient number of animals. Animals fulfilling the randomization criteria (approximately 150-200 mm3 tumor volume) were then distributed into experimental groups as appropriate.

[0229] The dosing regimen of the PDX studies is shown in the following experimental design table. “BIW x 4 wks” means that the drug was administrated twice per week for 4 weeks.

[0230] Table 6-1 Pancreatic KRASG12D PDX mice

[0231] Table 6-2 Pancreatic KRASG12D PDX mice

[0232] Table 7 Pancreatic KRASG12V PDX mice

[0233] Table 8 Pancreatic KRASG12R PDX mice

[0234] Animal body weight was recorded twice weekly for the duration of the study, tumors were measured twice weekly by a caliper, and the volume was expressed in mm3 using the formula: V = 0.5 x a x b2 where a and b are the long and short diameters of the tumor, respectively. The tumor sizes were then used for the calculations of both TGI and T / C values. TGI is calculated for each group using the formula: TGI (%) = [1- (Ti-T0)  /  (Vi-V0) ] ×100 (%) ; Ti is the average tumor volume of a treatment group on a given day, T0 is the average tumor volume of the treatment group on the first day of treatment, Vi is the average tumor volume of the vehicle control group on the same day with Ti, and V0 is the average tumor volume of the vehicle control group on the first day of treatment. The T / C (%) value is calculated for each group using the formula: T / C %= TRTV  / CRTV × 100 % (TRTV: relative average tumor volume (RTV) of the treatment group; CRTV: relative average tumor volume (RTV) of the vehicle control group on the same day with TRTV) . The relative tumor volume (RTV) is calculated for each group using the formula: RTV = Vt  / V0; V0 is the tumor volume on the first day of treatment, Vt is the tumor volume on a given day.

[0235] Any animal exhibiting 20%body weight loss and unable to eat or drink on any one day will be euthanized. Tumor burden should not exceed 2000 mm3. An individual animal will be sacrificed immediately when its tumor volume reaches 2000 mm3.

[0236] The TGI data from the above three PDX models are shown in the table below.

[0237] Table 9-1 The results regrading TGI (%) of AOC1

[0238] Table 9-2 The results regarding TGI (%) of AOC3

[0239] Example 7 Pan-KRASmt oligonucleotide tissue exposure and KRAS mRNA reduction in the tumor xenografts of KRASmt pancreatic and lung PDX mice

[0240] One day (for pancreatic KRASG12D and KRASG12V PDX, and lung KRASG12C PDX) or three days (for pancreatic KRASG12R PDX) after the last dose, the animals were sacrificed and tumor samples were collected. Half of each tumor was immersed in RNALater and stored at -80℃ for oligonucleotide tumor exposure and target mRNA knockdown analysis, and the other half was fixed with 4%paraformaldehyde and then embedded in frozen medium OCT for immunofluorescence (IF) staining. The administration schemes were as shown below.

[0241] Table 10

[0242] Total RNA was isolated from tumor lysates and complementary DNA was synthesized. Real-time reverse transcription-PCRs (RT-PCRs) were performed with Taqman assay (ThermoFisher) . The gene expression of KRAS was determined compared to beta-actin. The relative difference in gene expression was calculated with comparative 2 (-ΔΔCt) method where amplification data obtained from the gene of interest were normalized to the housekeeping gene expression (ΔCt = Ct (KRAS) –Ct (beta-actin) ) and then with the data from control (untreated) samples (ΔΔCt = ΔCt (AOC treated sample) –ΔCt (untreated sample) ) . Control sample data was set to have 100%expression and other groups were normalized to control group for illustration.

[0243] Hybridization ELISA (hELISA) was performed on the tumor lysates based on the protocol adapted from Burki’s 2015 paper (17) , to determine the tissue exposure level of pan-KRASmt oligonucleotide. The results are shown in Figures 1-5.

[0244] As shown in Figure 1, AOC1 promoted the accumulation of ASO in the tumors of KRASG12D PDX mice; when gemcitabine was combined with tumor-targeting AOC, it further enhanced the accumulation of ASO in the tumors of KRASG12D PDX mice.

[0245] As shown in Figure 2, AOC1 promoted the accumulation of ASO in the tumors of KRASG12V PDX mice.

[0246] As shown in Figure 3, AOC1 achieved dose dependent ASO tumor exposure in the KRASG12R PDX mice.

[0247] As shown in Figure 4, in KRASG12D PDX mice treated with AOC3, a dose-dependent reduction in KRAS mRNA levels was observed.

[0248] As shown in Figure 5, the incorporation of gemcitabine further enhanced the extent of KRAS mRNA knockdown.

[0249] In conclusion, the antibody-oligonucleotide conjugates of the present disclosure are capable of promoting the accumulation of antisense oligonucleotides in tumors and effectively knocking down the mRNA of specific oncogenes, thereby demonstrating promising potential for cancer-targeted therapy.

[0250] Example 8 The phosphorylation level of KRAS downstream effector in the tumor xenografts of KRASmt pancreatic and lung PDX mice

[0251] Paraformaldehyde--fixed frozen tumor sections were blocked with 10%BSA. They were incubated with anti-human-pERK (Cell Signaling Technology) primary antibody and antibody binding was visualized by Alexa555-conjugated secondary antibody (Abcam) together with DAPI (Sigma-Aldrich) . Images were taken with a fluorescence microscope and analyses were performed using ImageJ software (NIH Image) .

[0252] As shown in Figure 6, the immunofluorescence (IF) staining of human pERK on the frozen tissue sections detected a reduction in phosphorylated ERK protein level in the tumor xenografts of KRASG12D mice treated with AOC1 and KRASG12D inhibitor MRTX1133, compared to the vehicle control. And a reduction in phosphorylated ERK protein level in the tumor xenografts of KRASG12V PDX mice treated with AOC1 was also observed compared to the vehicle control.

[0253] References:

[0254] 1. Schulze CJ et al. Chemical remodeling of a cellular chaperone to target the active state of mutant KRAS. Science, 2023. doi: 10.1126 / science. adg9652.

[0255] 2. Wang D et al. Targeting oncogenic KRAS with molecular brush-conjugated antisense oligonucleotides. The Proceedings of the National Academy of Sciences, 2022. doi. org / 10.1073 / pnas. 2113180119.

[0256] 3. Ross SJ et al. Targeting KRAS-dependent tumors with AZD4785, a high-affinity therapeutic antisense oligonucleotide inhibitor of KRAS. Science Translational Medicine, 2017. DOI: 10.1126 / scitranslmed. aal5253.

[0257] 4. Mahadevan KK et al. KRASG12D inhibition reprograms thevmicroenvironment of early and advanced pancreaticvcancer to promote FAS-mediated killing by CD8+ T cells. Cancer Cell, 2023. doi. org / 10.1016 / j. ccell. 2023.07.002.

[0258] 5. Mahadevan KK et al. Elimination of oncogenic KRAS in genetic mouse models eradicates pancreatic cancer by inducing FAS-dependent apoptosis by CD8+ T cells. Developmental Cell, 2023. doi. org / 10.1016 / j. devcel. 2023.07.025.

[0259] 6. Reck M et al. Targeting KRAS in non-small-cell lung cancer: recent progress and new approaches. ESMO Annals of Oncology, 2021. DOI: 10.1016 / j. annonc. 2021. 06. 001.

[0260] 7. Waters AM and Der CJ. KRAS: the critical driver and therapeutic target for pancreatic cancer. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine, 2018. DOI: 10.1101 / cshperspect. a031435.

[0261] 8. Kim D et al. Pan-KRAS inhibitor disables oncogenic signalling and tumour growth. Nature, 2023. doi. org / 10.1038 / s41586-023-06123-3.

[0262] 9. Yang J et al. A pan-KRAS degrader for the treatment of KRAS-mutant cancers. Cell Discovery, 2024. doi: 10.1038 / s41421-024-00699-4.

[0263] 10. Werner K et al. Simultaneous gene silencing of KRAS and anti-apoptotic genes as a multitarget therapy. Oncotarget, 2015. doi: 10.18632 / oncotarget. 6766.

[0264] 11.  Set al. Antibody-mediated delivery of anti-KRAS-siRNA in vivo overcomes therapy resistance in colon cancer. Clinical Cancer Research, 2015. doi: 10.1158 / 1078-0432. CCR-13-2017.

[0265] 12. Papke B et al. Silencing of oncogenic KRAS by mutant-selective small interfering RNA. ACS Pharmacology &Translational Science, 2021. dx.doi. org / 10.1021 / acsptsci. 0c00165.

[0266] 13. Golan T et al. RNAi therapy targeting KRAS in combination with chemotherapy for locally advanced pancreatic cancer patients. Oncotarget, 2015. doi: 10.18632 / oncotarget. 4183.

[0267] 14. Kamerkar S et al. Exosomes facilitate therapeutic targeting of oncogenic KRAS in pancreatic cancer. Nature, 2017. doi: 10.1038 / nature22341.

[0268] 15. Anthiya S et al. Targeted siRNA lipid nanoparticles for the treatment of KRAS-mutant tumors. Journal of Controlled Release, 2023. doi. org / 10.1016 / j. jconrel. 2023. 03. 016.

[0269] 16. Fu Z et al. Antibody drug conjugate: the “biological missile” for targeted cancer therapy. Signal Transduction and Targeted Therapy, 2022. doi. org / 10.1038 / s41392-022-00947-7.

[0270] 17. Burki U et al. Development and application of an ultrasensitive hybridization-based ELISA method for the determination of peptide-conjugated phosphorodiamidate morpholino oligonucleotides. Nucleic Acid Therapeutics, 2015, DOI: 10.1089 / nat. 2014. 0528.

Claims

1.A method for preparing an antibody-oligonucleotide conjugate for preventing, alleviating or treating a cancer, comprising the following steps:1) providing an antibody comprising a glycosylation site;2) providing an oligonucleotide with an oxazoline motif attached to it;3) conjugating the oligonucleotide from 2) to the antibody from 1) through the catalysis of a glycosidase;wherein the glycosylation site comprises glycan chain including N-acetylglucose-β- (1, 4) -N-acetylglucose, the oxazoline motif has a structure selected from the group below:whereinthe oligonucleotide targets a gene related to cancer; and / orthe antibody targets cancer.2.A method for preparing an antibody-oligonucleotide conjugate for preventing, alleviating or treating a cancer, comprising the following steps:1) providing an antibody comprising a glycosylation site;2) providing an oligonucleotide with a bioorthogonal reactive group attached to it;3) providing a linker with both an oxazoline motif and a bioorthogonal reactive group attached to it;4) linking the oligonucleotide from 2) to the linker from 3) through a bioorthogonal reaction, and then conjugating to the antibody from 1) through the catalysis of a glycosidase; orconjugating the linker from 3) to the antibody from 1) through the catalysis of a glycosidase, and then linking to the oligonucleotide from 2) through a bioorthogonal reaction;wherein the glycosylation site comprises glycan chain including N-acetylglucose-β- (1, 4) -N-acetylglucose, the oxazoline motif has a structure selected from the group below:wherein the oligonucleotide targets gene related to cancer; and / orthe antibody targets cancer.3.The method according to claim 1 or 2, wherein the oligonucleotide silences an mRNA of an oncogene; and / orthe oligonucleotide prevents a ribosome from binding to an mRNA of an oncogene.4.The method according to claim 3, wherein the oncogene comprises RAS gene and c-Met gene, preferably KRAS gene.5.The method according to any one of claims 1-4, wherein the oligonucleotide is selected from the group consisting of: antisense oligonucleotide (ASO) and siRNA.6.The method according to any one of claims 1-5, wherein the glycosylation site is located at Fc region.7.The method according to any one of claims 1-6, wherein the antibody is selected from the group consisting of: IgG antibody, VHH-Fc fusion protein and scFv-Fc fusion protein.8.The method according to any one of claims 1-6, wherein the antibody binds to a surface receptor on a cancer cell.9.The method according to claim 8, wherein the antibody binds to Trop2 or c-Met.10.The method according to any one of claims 1-9, wherein an Asn297 in glycosylation site of one chain of the Fc region is mutated to an amino acid other than Asn.11.The method according to claim 10, wherein the Asn297 in glycosylation site of the Fc region is mutated to Ala or Gly.12.The method according to claim 6, wherein the Fc region comprises Knob-into-Hole mutations.13.The method according to any one of claims 1-12, wherein the glycosidase is selected from the group consisting of: Endo S (Streptococcus pyogenes endoglycosidase -S) , Endo F3 (Elizabethkingia miricola endoglycosidase -F3) , Endo S2 (Endoglycosidase S2, Streptococcus pyogenes endoglycosidase -S2) , Endo Sd (Endoglycosidase-Sd, Streptococcus pyogenes endoglycosidase -Sd) and Endo CC (Endoglycosidase-CC, Streptococcus pyogenes endoglycosidase -CC) or a variant thereof; preferably, the glycosidase is Endo S2 or a variant thereof.14.The method according to any one of claims 1-13, wherein the glycosidase is immobilized on a support.15.An antibody-oligonucleotide conjugate, prepared by the method of any one of claims 1-14.16.The antibody-oligonucleotide conjugate according to claim 15, wherein the drug-antibody ratio (DAR) thereof is 0.8-2.17.A pharmaceutical composition, comprising the antibody-oligonucleotide conjugate prepared by the method of any one of claims 1-14.18.Use of the antibody-oligonucleotide conjugate according to claim 15 or the pharmaceutical composition according to claim 17 in the manufacture of a medicament for preventing, alleviating or treating a cancer by silencing an mRNA of an oncogene or preventing a ribosome from binding to an mRNA of an oncogene.19.A method for preventing, alleviating or treating cancer, comprising administering a therapeutically effective amount of the antibody-oligonucleotide conjugate according to claim 15 or the pharmaceutical composition according to claim 17 to a subject in need thereof.

Images