Recombinant proteins, nucleic acid systems, vaccines, pharmaceutical compositions and uses thereof for preventing or treating cancer

Abstract

Provided is a recombinant protein, comprising an amino acid sequence encoding at least one fragment of CLDN6, wherein the at least one fragment of CLDN6 comprises: at least one T-cell specific epitope, or at least one fragment thereof, or at least one variant sequence thereof. Also provided are nucleic acid systems, vaccines, pharmaceutical compositions, and methods and uses thereof are effective in preventing or treating cancer, and they are safe for use.

Description

RECOMBINANT PROTEINS, NUCLEIC ACID SYSTEMS, VACCINES, PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS AND USES THEREOF FOR PREVENTING OR TREATING CANCERCROSS-REFERENCE TO RELATED APPLICATION

[0001] This application claims benefit under 35 U.S.C. § 119 (e) of U.S. Provisional Application having Serial No. 63 / 778,405 filed 27 March, 2025, the entire contents of which is / are hereby incorporated by reference herein. REFERENCE TO SEQUENCE LISTING

[0002] This application contains a sequence listing which has been submitted electronically in ST. 26 (xml) format and is hereby incorporated by reference in its entirety. Said ST. 26 copy, created on March 18, 2026, is named “C9030000006PCTCN. xml” and is 29.6 kilobytes in size.FIELD OF INVENTION

[0003] This application relates to recombinant proteins, pharmaceutical compositions, vaccines such as RNA vaccines, recombinant nucleic acid systems, methods and uses for preventing or treating cancers, or useful for preventing or treating complication (s) of cancer treatments.BACKGROUND OF INVENTION

[0004] Cancer is a major global public health burden causing significant societal and economic challenges. There has been a significant global rise in cancer cases in recent years. This global burden needs to be controlled through multiple approaches including effective prevention, early diagnosis, and affordable and effective medical treatments and care. Accordingly, there is an urgent need for new treatments for cancers.SUMMARY OF INVENTION

[0005] Disclosed herein are novel recombinant proteins or polypeptides, pharmaceutical compositions, vaccines such as RNA vaccines, recombinant nucleic acid systems thereof, uses thereof, and methods of preventing and treating cancers thereof. Also disclosed herein are processes for preparing the recombinant proteins and compositions, methods of using the compositions, and intermediates used in preparing the compositions.

[0006] In some embodiments, provided is a recombinant protein, comprising an amino acid sequence encoding at least one fragment of CLDN6, or at least one variant sequence having at least 75%identity thereof, wherein the at least one fragment of CLDN6 comprises: at least one T-cell specific epitope, or at least one fragment thereof, or at least one variant sequence having at least 75%, 80%, 85%, 90%, or 95%sequence identity thereof; and optionally, one more B-cell specific epitope, or at least one fragment thereof, or at least one variant sequence having at least 75%, 80%, 85%, 90%, or 95%sequence identity thereof.

[0007] In some embodiments, provided is a recombinant nucleic acid system, comprising a nucleic acid sequence encoding the recombinant protein as described herein.

[0008] In some embodiments, provided is an RNA vaccine, the RNA vaccine comprises an open reading frame comprising a sequence encoding the recombinant protein comprising at least one T-cell specific epitopes, and optionally, one or more B-cell specific epitope; or a sequence of the recombinant nucleic acid system as described herein.

[0009] In some embodiments, provided is a pharmaceutical composition, comprising the recombinant protein, the recombinant protein expressed by the recombinant nucleic acid system, or the RNA vaccine; and optionally, an adjuvant as described herein.

[0010] In some embodiments, provided is a vaccine, comprising the recombinant protein, the recombinant protein expressed by the recombinant nucleic acid system, the RNA vaccine, or the pharmaceutical composition as described herein.

[0011] In some embodiments, provided is a method of preventing or treating cancer in a subject in need thereof, comprising step of: administering to the subject an effective amount of the recombinant protein, the recombinant protein expressed by the recombinant nucleic acid system, the RNA vaccine, or the pharmaceutical composition, or the vaccine as described herein.

[0012] In some embodiments, provided is a use of the recombinant protein, the recombinant protein expressed by the recombinant nucleic acid system, the RNA vaccine, or the pharmaceutical composition, or the vaccine as described herein for the manufacture of a medicament in preventing or treating cancer.

[0013] In some embodiments, provided is a recombinant protein, the recombinant protein expressed by the recombinant nucleic acid system, the RNA vaccine, or the pharmaceutical composition, or the vaccine as described herein for use in preventing or treating cancer.

[0014] There are many advantages of the invention. In certain embodiments, the novel recombinant proteins or polypeptides, pharmaceutical compositions, vaccines such as RNA vaccines, recombinant nucleic acid systems thereof, uses thereof, and methods of preventing and treating cancers thereof are targeting or selective for CLDN6. In other embodiments, the novel recombinant proteins or polypeptides, pharmaceutical compositions, vaccines such as RNA vaccines, recombinant nucleic acid systems thereof, uses thereof, and methods of preventing and treating cancers thereof activate immune cytotoxicity to destroy or inhibit CLDN6+ cancer. In certain embodiments, the provided novel recombinant proteins or polypeptides, pharmaceutical compositions, vaccines such as RNA vaccines, recombinant nucleic acid systems thereof, uses thereof, and methods of preventing and treating cancers thereof effectively inhibit the growth of CLDN6+ tumors. In certain embodiments, the provided novel recombinant proteins or polypeptides, pharmaceutical compositions, vaccines such as RNA vaccines, recombinant nucleic acid systems thereof, uses thereof, and methods of preventing and treating cancers thereof stimulate cellular immunity / T-cell cytotoxicity, including potent IFNγ release activity. In certain embodiments, the provided novel recombinant proteins or polypeptides, pharmaceutical compositions, vaccines such as RNA vaccines, recombinant nucleic acid systems thereof, uses thereof, and methods of preventing and treating cancers thereof activate cellular immunity through MHC-I.

[0015] In certain embodiments, the provided novel recombinant proteins or polypeptides, pharmaceutical compositions, vaccines such as RNA vaccines, recombinant nucleic acid systems thereof, uses thereof, and methods of preventing and treating cancers thereof induce robust IFNγ release activity upon stimulation with T-cell epitopes. In certain embodiments, the provided novel recombinant proteins or polypeptides, pharmaceutical compositions, vaccines such as RNA vaccines, recombinant nucleic acid systems thereof, uses thereof, and methods of preventing and treating cancers thereof enable efficient generation and presentation of MHC peptides by both mouse MHC and human HLA (such as HLA*A02: 01) complex to induce cellular immune response. In certain embodiments, the provided novel recombinant proteins or polypeptides, pharmaceutical compositions, vaccines such as RNA vaccines, recombinant nucleic acid systems thereof, uses thereof, and methods of preventing and treating cancers thereof induce CLDN6-specific immune cytotoxicity to destroy CLDN6+ cancer cells. In certain embodiments, the provided novel recombinant proteins or polypeptides, pharmaceutical compositions, vaccines such as RNA vaccines, recombinant nucleic acid systems thereof, uses thereof, and methods of preventing and treating cancers thereof induce robust cellular immune response and robust activity suppressing the growth of CLDN6+ tumors. In certain embodiments, the provided novel recombinant proteins or polypeptides, pharmaceutical compositions, vaccines such as RNA vaccines, recombinant nucleic acid systems thereof, uses thereof, and methods of preventing and treating cancers thereof are useful and effective in preventing or treating cancers such as skin cancer, colon cancer, bladder cancer, lung cancer, head and neck cancer, gastric cancer, B-cell derived lymphoma, T-cell derived lymphoma, pancreatic cancer, brain cancer, monocytic leukemia, B-cell derived leukemia, T-cell derived leukemia, breast cancer, melanoma, hepatocellular carcinoma, small cell lung cancer, non-small cell lung cancer, Hodgkin lymphoma, kidney cancer, ovarian cancer, cancer of esophagus, cancer of testes, colorectal cancer, thyroid cancer, prostate cancer, stomach cancer, or cervical cancer, or any combination thereof and they are safe for use. BRIEF DESCRIPTION OF FIGURES

[0016] FIG. 1A is a schematic diagram showing an example structure or construct of an example recombinant protein CLDN6-B+T and amino acid sequences of immune enhancer, linkers, B and T motifs, according to an example embodiment.

[0017] FIG. 1B is a schematic diagram of the overall structures of four example recombinant proteins, CLDN6-B+T, CLDN6-T, CLDN6-B, and CLDN6-E, containing B, T, and / or E motifs, according to an example embodiment.

[0018] FIG. 2A is an SDS-PAGE gel photo showing CLDN6 recombinant protein CLDN6-B+T produced byE. coli, according to an example embodiment. M denotes molecular weight marker; 1 denotes the insoluble fraction of lysate; 2 denotes the soluble fraction of lysate; 3 denotes flow-through; 4 denotes wash; and 5 denotes eluate, according to an example embodiment.

[0019] FIG. 2B is an SDS-PAGE gel photo showing CLDN6 recombinant protein CLDN6-T produced byE. coli, according to the same example embodiment of FIG. 2A.

[0020] FIG. 2C is an SDS-PAGE gel photo showing CLDN6 recombinant protein CLDN6-B produced byE. coli, according to the same example embodiment of FIG. 2A.

[0021] FIG. 2D is an SDS-PAGE gel photo showing CLDN6 recombinant protein CLDN6-E produced byE. coli, according to the same example embodiment of FIG. 2A.

[0022] FIG. 3A is an example illustration of the schedules of vaccination and other procedures for determination of cellular immune response activated by CLDN6-B+T and CLDN6-T vaccines in HLA*A02: 01-humanized mice, according to an example embodiment.

[0023] FIG. 3B is an ELISpot plot showing the average body weights (mean±SD) of the mice during the study to determine the IFNγ release by splenocytes stimulated by CLDN6 recombinant proteins, according to the embodiment of FIG. 3A.

[0024] FIG. 3C shows the results of ELISpot assay to determine the IFNγ release by splenocytes, collected at Week 5, 6, and 7, after stimulation with CLDN6 T-cell epitope peptides, according to the embodiment of FIG. 3A.

[0025] FIG. 3D are plots showing the percentage of IFNγ-releasing CD4+ T-cells and CD8α+ T-cells in splenocytes upon stimulation with CLDN6 T-cell epitope peptides to determine the cellular immune response activated by CLDN6-B+T and CLDN6-T recombinant proteins in the HLA*A02: 01-humanized mice, according to the embodiment of FIG. 3A. The splenocytes were collected at Week 6 from the mice vaccinated with adjuvant only, CLDN6-B+T, and CLDN6-T.

[0026] FIG. 3E are plots showing the percentage of TNFα-releasing CD4+ T-cells and CD8α+ T-cells in splenocytes upon stimulation with CLDN6 T-cell epitope peptides to determine the cellular immune response activated by CLDN6-B+T and CLDN6-T recombinant proteins in the HLA*A02: 01-humanized mice, according to the embodiment of FIG. 3A. The splenocytes were collected at week 6 from the mice vaccinated with adjuvant only, CLDN6-B+T, and CLDN6-T.

[0027] FIG. 4A is an example illustration of the schedules of vaccination and other procedures for determining the ability of vaccine proteins CLDN6-B+T, CLDN6-B, CLDN6-T and CLDN6-E in activating cellular and humoral immunity in the wild-type C57BL / 6 mice, according to an example embodiment.

[0028] FIG. 4B is a plot showing the average body weights (mean±SD) of the mice during the study, according to the embodiment of FIG. 4A.

[0029] FIG. 4C are images of the IFNγ ELISpot assay to determine the IFNγ release by splenocytes collected from mice at Week 5 and 6 and stimulated with a mixture of CLDN6 T-cell epitope peptides, according to the embodiment of FIG. 4A.

[0030] FIG. 4D is a plot showing quantified results of the IFNγ ELISpot assay to determine the IFNγ release by splenocytes collected from mice at Week 5 and 6 and stimulated with a mixture of CLDN6 T-cell epitope peptides, according to the embodiment of FIG. 4A.

[0031] FIG. 5A is an example illustration of the schedules of vaccination and other procedures for determining anti-cancer efficacy of CLDN6-B+T and CLDN6-T in a syngenetic mouse colon cancer model using the CLDN6-humanized mouse colon cancer cell line MC38-hCLDN6 (K) , according to an example embodiment. The cells were inoculated subcutaneously in C57BL / 6 mice after being vaccinated once a week for 6 times with either CLDN6-B+T or CLDN6-T (n=8 per group) before subcutaneous inoculation of tumor cells (1×106 per injection per mouse) one day after the final vaccination. Mice receiving PBS (n=4) or adjuvant alone (n=8) were used as negative controls.

[0032] FIG. 5B is a plot showing the average body weights (mean±SE) of the mice during the study, according to the embodiment of FIG. 5A.

[0033] FIG. 5C is a plot showing the averages of tumor volumes of each group (mean±SE) , where tumor growth was recorded twice per week by measuring the width and length of the tumor, according to the embodiment of FIG. 5A. *indicates that the differences in the comparisons of either CLDN6-T or CLDN6-B+T groups with the adjuvant only or PBS controls are statistically significant; p-values<0.0001 (two-way ANOVA) .

[0034] FIG. 5D is a plot showing the individual tumor volume records of the PBS group, according to the embodiment of FIG. 5A.

[0035] FIG. 5E is a plot showing the individual tumor volume records of the adjuvant only group, according to the embodiment of FIG. 5A.

[0036] FIG. 5F is a plot showing the individual tumor volume records of CLDN6-B+T group, according to the embodiment of FIG. 5A.

[0037] FIG. 5G is a plot showing the individual tumor volume records of CLDN6-T group, according to the embodiment of FIG. 5A.

[0038] FIG. 5H is a plot showing the final tumor weight (mean±SE) of each group to determine the anti-cancer efficacies of the CLDN6 recombinant proteins in the wildtype mice, according to the embodiment of FIG. 5A. Asterisks *and **indicate that the differences in the comparison with the adjuvant only control are statistically significant; p-value=0.0015 and 0.0012, respectively; one-way ANOVA.

[0039] FIG. 5I is a figure including images of all tumors collected from two control groups and the only tumor from the CLDN6-B+T-vaccinated groups at the end point of the study, according to the embodiment of FIG. 5A.

[0040] FIG. 6A is an example illustration of the schedules of vaccination and other procedures for a syngenetic mouse colon cancer model using the CLDN6-humanized mouse colon cancer cell line MC38-hCLDN6 (C) , according to an example embodiment.

[0041] FIG. 6B is a plot showing the average body weights (mean±SE) of the mice during the study, according to the embodiment of FIG. 6A.

[0042] FIG. 6C is a plot showing the averages of tumor volumes of each group (mean±SE) , according to the embodiment of FIG. 6A.

[0043] FIG. 6D is a plot showing the individual tumor volume records of the PBS group, according to the embodiment of FIG. 6A.

[0044] FIG. 6E is a plot showing the individual tumor volume records of the adjuvant only group, according to the embodiment of FIG. 6A.

[0045] FIG. 6F is a plot showing the individual tumor volume records of CLDN6-B+T group, according to the embodiment of FIG. 6A.

[0046] FIG. 6G is a plot showing the individual tumor volume records of CLDN6-T group, according to the embodiment of FIG. 6A.

[0047] FIG. 6H is a plot showing the final tumor weight (mean±SE) of each group to determine the anti-cancer efficacies of the CLDN6 recombinant proteins in the wildtype mice, according to the embodiment of FIG. 6A. Asterisks *and *indicate that the differences in the comparison with the adjuvant only control are statistically significant; p-value=0.0262 and 0.0272, respectively.

[0048] FIG. 6I is a figure including images of all tumors collected from two control groups and the CLDN6-B+T or CLDN6-T vaccinated groups at the end of the study, according to the embodiment of FIG. 6A.

[0049] FIG. 7A are well images of the IFNγ ELISpot assay showing IFNγ release by splenocytes collected from mice stimulated with a mixture of CLDN6 T-cell epitope peptides, according to an example embodiment.

[0050] FIG. 7B is a plot showing quantified spot counts of the IFNγ ELISpot assay showing IFNγ release by splenocytes collected from mice stimulated with a mixture of CLDN6 T-cell epitope peptides, according to an example embodiment.

[0051] FIG. 8A is an example illustration of the schedules of vaccination and other procedures for a therapeutic study using CLDN6 vaccine containing T2-1 and T4 peptides on MC38-hCLDN6 (C) mouse colon cancer model in wildtype C57BL / 6 mice, according to an example embodiment.

[0052] FIG. 8B is a plot showing the average body weights (mean±SE) of the mice during the study, according to the embodiment of FIG. 8A.

[0053] FIG. 8C is a plot showing the averages of tumor volumes of each group (mean±SE) , according to the embodiment of FIG. 8A.

[0054] FIG. 8D is a plot showing the individual tumor volume records of the adjuvant only group, according to the embodiment of FIG. 8A.

[0055] FIG. 8E is a plot showing the individual tumor volume records of CLDN6 T2-1 / T4 vaccinated group, according to the embodiment of FIG. 8A.

[0056] FIG. 8F is a plot showing the final tumor weight (mean±SE) of each group to determine the anti-cancer efficacies of the CLDN6 vaccine containing T2-1 and T4 peptides in wildtype C57BL / 6 mice, according to the embodiment of FIG. 8A. Asterisk *indicates statistically significant difference compared with the adjuvant‐only control (p-value<0.0001) .

[0057] FIG. 8G is a figure including images of all tumors collected from adjuvant only control and CLDN6 T2-1 / T4 vaccinated groups at the end of the study, according to the embodiment of FIG. 8A.DETAILED DESCRIPTION

[0058] As used herein and in the claims, the terms “comprising” (or any related form such as “comprise” and “comprises” ) , “including” (or any related forms such as “include” or “includes” ) , “containing” (or any related forms such as “contain” or “contains” ) , means including the following elements but not excluding others. It shall be understood that for every embodiment in which the term “comprising” (or any related form such as “comprise” and “comprises” ) , “including” (or any related forms such as “include” or “includes” ) , or “containing” (or any related forms such as “contain” or “contains” ) is used, this disclosure / application also includes alternate embodiments where the term “comprising” , “including, ” or “containing, ” is replaced with “consisting essentially of” or “consisting of” . These alternate embodiments that use “consisting of” or “consisting essentially of” are understood to be narrower embodiments of the “comprising” , “including, ” or “containing, ” embodiments.

[0059] For example, alternate embodiments of “a composition comprising A, B, and C” would be “a composition consisting of A, B, and C” and “a composition consisting essentially of A, B, and C. ” Even if the latter two embodiments are not explicitly written out, this disclosure / application includes those embodiments. Furthermore, it shall be understood that the scopes of the three embodiments listed above are different.

[0060] For the sake of clarity, “comprising” , including, and “containing” , and any related forms are open-ended terms which allows for additional elements or features beyond the named essential elements, whereas “consisting of” is a closed end term that is limited to the elements recited in the claim and excludes any element, step, or ingredient not specified in the claim.

[0061] For the sake of clarity, “characterized by” or “characterized in” (together with their related forms as described above) , does not limit or change the nature of whether the list of terms following it are open or closed. For example, in a claim directed towards “a composition comprising A, B, C, and characterized in D, E, and F” , the elements D, E, and F are still open-ended terms and the claim is meant to include other elements due to the use of the word “comprising” earlier in the claim.

[0062] “Consisting essentially of” limits the scope of a claim to the specified materials, components, or steps ( “essential elements” ) that do not materially affect the essential characteristic (s) of the claimed invention. In some embodiments, the essential characteristics are the basic and novel characteristic (s) of the claimed invention. For example, in some embodiments, the essential elements of a composition of the disclosure can be “Xmg to Ymg” of compound A. Even if the composition includes additional excipients, as long as the additional excipients do not materially affect the essential characteristics of the compound, e.g., in compound A’s ability to bind to XX target or to treat YY disease, then such embodiment that “consists essentially of compound A” still includes compositions with the aforementioned additional excipients.

[0063] As used herein, the singular forms “a” , “an” and “the” are intended to include the plural forms as well, unless the context clearly indicates otherwise. Where a range is referred in the specification, the range is understood to include each discrete point within the range. For example, 1-7 means 1, 2, 3, 4, 5, 6, and 7.

[0064] As used herein, the term “about” is understood as within a range of normal tolerance in the art and not more than ±10%of a stated value. By way of example only, about 50 means from 45 to 55 including all values in between. As used herein, the phrase “about” a specific value also includes the specific value, for example, about 50 includes 50.

[0065] As used herein and in the claims, an “effective amount” , is an amount that is effective to achieve at least a measurable amount of a desired effect. For example, the amount may be effective to elicit an immune response, and / or it may be effective to elicit a protective response, against a pathogen bearing the polypeptide of interest. In some embodiments, the amount may be effective to elicit an immune response against cancer or tumor.

[0066] As used herein, the term “claudins” refers to a family of four-transmembrane proteins which are the essential component of tight junctions, a complex laterally connecting adjacent epithelial or endothelial cells.

[0067] As used herein, the term “claudin 6” or “CLDN6” refers to a protein encoded by humanCLDN6gene and is a four-transmembrane protein containing multiple intracellular and extracellular domains. In some examples, CLDN6 refers to one of the claudins in human. In some examples, CLDN6 refers to all or a fragment of human amino acid sequence NP_067018.2, or variant thereof or functional homologue thereof.

[0068] As used herein and in the claims, the term “epitope” is the part of an antigen (e.g., a region of a protein or polypeptide) that is recognized by an immune system, such as by antibodies, B cells, T cells or through the antigen presentation process by antigen presenting cells (APCs) . In some examples, an epitope may be a motif of a protein, which may be associated with a specific function

[0069] As used herein and in the claims, the term “T-cell epitope” or “T-cell specific epitope” refers to a specific region of an antigen (e.g., CLDN6) that is substantially specific to or recognized by the T-cell receptor (TCR) of a T cell. The antigen may contain one or more different T-cell epitopes. For clarity’s sake, T-cell epitope and B-cell epitope are not mutually exclusive to each other. There may be certain portion of an antigen that is both specific to B-cell and T-cell.

[0070] As used herein and in the claims, the term “B-cell specific epitope” or “B-cell epitope” refers to a specific region of a tar epitope” or “B-cell epitope” refers to a specific region of a target protein or antigen (e.g., CLDN6) that is substantially specific to or recognized by the B-cell receptor (BCR) of a B cell or antibody. The antigen may contain one or more different B-cell epitopes.

[0071] As used herein and in the claims, the term “extracellular loop (ECL) epitope” or “ECL specific epitope” refers to a specific region of a protein that extends into the extracellular environment. The antigen may contain one or more different ECL epitopes. T-cell epitope or B-cell epitope can be at least partially positioned in the ECL region, trans-membrane domain and / or intracellular region.

[0072] As used herein and in the claims, a “subject” refers to animals such as mammals, including, but not limited to, primates (e.g., humans) , cows, sheep, goats, horses, dogs, cats, rabbits, rats, mice and the like. In some examples, subject refers to humans.

[0073] As used herein, the term “pharmaceutical composition” or “composition” refers to a formulation containing one or more active pharmaceutical ingredient (s) . In some examples, a pharmaceutical composition containing one or more polypeptides or proteins targeting CLDN6 and optionally an immune enhancer. In some examples, the pharmaceutical composition is used as a medicament or vaccine that is capable of inducing an immune response in a subject in need. In some examples, the pharmaceutical composition may also be referred to as a “vaccine” , or “peptide vaccine” . In some examples, the composition contains multiple epitopes / motifs of CLDN6 expressed as one fusion protein or separate proteins.

[0074] As used herein, the term “RNA vaccine” is a type of a vaccine that uses a copy of messenger RNA (mRNA) to produce an immune response. In some examples, the mRNA contains an open reading frame containing any one of the nucleotide sequences or nucleotide sequences encoding the corresponding amino acid sequences as described herein.

[0075] As used herein and in the claims, the term “prevent” , “preventing” , “preventive” , “preventative” or “prevention” refers to the methods of reducing the risk of the onset, relapse or spread of a disease or disorder (such as cancer) or one or more of their symptoms.

[0076] As used herein, the term “treat” , “treating” or “treatment” refers to methods of alleviating, abating or ameliorating a disease (such as cancer) or condition symptoms, preventing additional symptoms, ameliorating or preventing the underlying metabolic causes of symptoms, inhibiting the disease or condition, arresting the development of the disease or condition, relieving the disease or condition, causing regression of the disease or condition, relieving a condition caused by the disease or condition, or stopping the symptoms of the disease or condition either prophylactically and / or therapeutically.

[0077] As used herein, the term “variant sequence” refers to a nucleic acid or polypeptide sequence that displays certain degree of identity to a reference or wild-type nucleic acid or polypeptide sequence, for example, at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%or close to 100%. For example, a variant sequence has one or more additions, deletions, insertions, and / or substitutions or other modifications when compared to a reference or wild-type sequence. Variant sequence also includes a sequence of a functional homologue.

[0078] As used herein, the term “functional homologue” refers to a polypeptide that exhibits certain sequence identity with a reference or wild-type sequence and possess certain aspect of the reference or wild-type polypeptide’s functionality.

[0079] As used herein, the term “polypeptide” , “peptide” or “protein” may be used interchangeably herein and generally refer to a chain of two or more amino acids linked together by peptide bonds. In some examples, a protein refers to a recombinant protein having all or a fragment of one or more epitopes / motifs of CLDN6. In some examples, all or a fragment of one or more epitopes / motifs of CLDN6 are operatively linked together by linkers and they are expressed as one fusion protein. In some examples, polypeptide refers to an amino acid chain having an amino acid sequence spanning amino-acid residues at one or more certain specific region (s) of CLDN6 or a functional homologue thereof, or a variant sequence having at least 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%or 100%sequence identity. In some examples, the recombinant protein may also be referred to as a “vaccine” , or “peptide vaccine” .

[0080] As used herein, the term “nucleic acid system” , “nucleic acid construct” or “vector” may be used interchangeably herein and generally refers to a genetically engineered nucleic acid or a genetic circuit that includes one or more nucleic acid sequences encoding one or more polypeptides or fragments thereof, or complement thereof and optionally one or more promoters, enhancers, terminators, linkers, polyA tails, operative linkers, multiple cloning sites, markers, and / or other regulatory elements. The nucleic acid sequences and the promoters may be placed in any order, and they may be located in the same molecule or in different molecules. In some examples, the nucleic acid system contains an open reading frame having one or more nucleic acid sequences encoding one or more recombinant proteins having all or a fragment of one or more epitopes / motifs of CLDN6. In some examples, the recombinant proteins or fragments thereof are expressed separately in separate nucleic acid systems. In some examples, the recombinant proteins or fragments thereof are co-expressed in one nucleic acid system.

[0081] As used herein and in the claims, the term “immune enhancer” or “carrier” refers to a molecule or a protein which increases immune response of a subject. In some examples, the immune enhancer is operatively linked with the recombinant protein to form a fusion protein to enhance immune response.

[0082] As used herein, the term “linker” refers to an amino acid motif containing two or more amino acids in length that connects two components of a fusion protein. In some examples, a linker has 2 to 100 amino acids in length, such as between 2 and 50 amino acids in length, for example, 2, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, or 50 amino acids in length. In some embodiments, the linker amino acid sequences are or contain sequences of GPLS, GPGPG or multiple GGGGS (such as GGGGSGGGGSGGGGS) . Other suitable linker sequences may be used instead.

[0083] As used herein and in the claims, the term “operatively linked” means that the at least two nucleic acid or amino acid fragments are joined such that the nucleic acid or amino acid sequences remain in-frame.

[0084] As used herein, the term “adjuvant” refers to a molecule or substance whose mixing with an active ingredient upon administration to a subject in need which may increase immune response thereof.

[0085] As used herein, the term "amino acid location" or "amino acid residue” (at a certain location) refers to the specific position of an amino acid within a protein sequence, which is identified by a unique numerical designation corresponding to its position in the amino acid sequence. An "amino acid location spanning amino acid residues" refers to a contiguous region or segment of the protein sequence that includes a defined starting and ending position. For example, an amino acid location spanning amino acid residues 65-88 refers to a sequence of amino acids starting from the 65th amino acid residue and ending at the 88th amino acid residue in the protein sequence, inclusive of both the starting and ending amino acids. In some embodiments, these locations are used to locate specific regions, epitopes or motifs within the protein. In some embodiments, these locations can be used to locate specific T-cell or B-cell specific epitopes within CLDN6.

[0086] Although the description referred to particular embodiments, the disclosure should not be construed as limited to the embodiments set forth herein.

[0087] In some embodiments, provided is a recombinant protein, comprising or essentially consisting of an amino acid sequence encoding at least one fragment of CLDN6, or at least one variant sequence having at least 75%identity thereof, wherein the at least one fragment of CLDN6 comprises: at least one T-cell specific epitope, or at least one fragment thereof, or at least one variant sequence having at least 75%, 80%, 85%, 90%, or 95%sequence identity thereof.

[0088] In some embodiments, the at least one fragment of CLDN6 further comprises or essentially consists of: at least one B-cell specific epitope, or at least one fragment thereof, or at least one variant sequence having at least 75%, 80%, 85%, 90%, or 95%sequence identity thereof.

[0089] In some embodiments, the at least one B-cell specific epitope comprises or essentially consists of an amino acid sequence spanning amino-acid residues 40-68, and / or amino-acid residues 145-160 of CLDN6 protein, or a variant sequence having at least 75%, 80%, 85%, 90%, or 95%sequence identity thereof.

[0090] In some embodiments, the at least one B-cell specific epitope comprises or essentially consists of an amino acid sequence SEQ ID NO. : 1 and / or SEQ ID NO. : 2. In some embodiments, the at least one B-cell specific epitope comprises or essentially consists of an amino acid sequence SEQ ID NO. : 1 and SEQ ID NO. : 2 and they are operatively linked.

[0091] In some embodiments, the at least one T-cell specific epitope comprises or essentially consists of an amino acid sequence spanning amino-acid residues 65-88, amino-acid residues 117-133, amino-acid residues 141-166, and / or amino-acid residues 195-212 of CLDN6 protein, or a variant sequence having at least 75%, 80%, 85%, 90%, or 95%sequence identity thereof.

[0092] In some embodiments, the at least one T-cell specific epitope comprises or essentially consists of an amino acid sequence SEQ ID NO. : 3, SEQ ID NO. : 4, SEQ ID NO.: 5 and / or SEQ ID NO. : 6. In some embodiments, the at least one T-cell specific epitope comprises or essentially consists of amino acid sequences SEQ ID NO. : 3, SEQ ID NO. : 4, SEQ ID NO. : 5 and SEQ ID NO. : 6 and they are operatively linked.

[0093] In some embodiments, the recombinant protein further comprises an amino acid sequence comprising at least one immune enhancer.

[0094] In some embodiments, the at least one immune enhancer is or comprises all or a fragment of diphtheria toxin (DTT) .

[0095] In some embodiments, the diphtheria toxin (DTT) comprises or essentially consists of amino acid sequence SEQ ID NO. : 9.

[0096] In some embodiments, the at least one B-cell specific epitope, and / or the at least one T-cell specific epitope, if present, are operatively linked to each other by at least one linker, wherein individual linker comprises an amino acid sequence of GPLS, AAY, EAAAK, KK, a flexible glycine-rich motif, and combination thereof.

[0097] In some embodiments, the flexible glycine-rich motif is or comprises an amino acid sequence of GPGPG, GGGGS, or multiple repeats of GGGGS, e.g., GGGGSGGGGSGGGGS.

[0098] In some embodiments, provided is a recombinant protein, comprising or essentially consisting of an amino acid sequence having at least about 75%, 80%, 85%, 90%, or 95%sequence identity to all or a fragment of SEQ ID NO. : 10, or SEQ ID NO. : 11 .

[0099] In some embodiments, provided is a recombinant protein, comprising amino acid sequences: SEQ ID NO. : 1, SEQ ID NO. : 2, SEQ ID NO. : 3, SEQ ID NO. : 4 , SEQ ID NO.: 5, SEQ ID NO. : 6, and SEQ ID NO. : 9. In some embodiments, provided is a recombinant protein, comprising or essentially consisting of amino acid sequences: SEQ ID NO. : 3, SEQ ID NO. : 4 , SEQ ID NO. : 5, and SEQ ID NO. : 6, and SEQ ID NO. : 9.

[0100] In some embodiments, provided is a recombinant nucleic acid system, comprising or essentially consisting of a nucleic acid sequence encoding any one of the recombinant protein as described herein.

[0101] In some embodiments, provided is a recombinant nucleic acid system, further comprises or essentially consists of a nucleic acid sequence encoding a nucleotide sequence SEQ ID NO. : 15, or SEQ ID NO. : 16.

[0102] In some embodiments, provided is an RNA vaccine, wherein the RNA vaccine comprises an open reading frame comprising any one of the sequence encoding the recombinant protein, or the sequence of the recombinant nucleic acid system as described herein.

[0103] In some embodiments, provided is a pharmaceutical composition, comprising any one of the recombinant protein, the recombinant protein expressed by the recombinant nucleic acid system, or the RNA vaccine; and optionally, an adjuvant as described herein.

[0104] In some embodiments, provided is a vaccine, comprising any one of the recombinant protein, the recombinant protein expressed by the recombinant nucleic acid system, the RNA vaccine, or the pharmaceutical composition as described herein.

[0105] In some embodiments, provided is a method of preventing or treating cancer in a subject in need thereof, comprising step of: administering to the subject an effective amount of any one of the recombinant protein, the recombinant protein expressed by the recombinant nucleic acid system, the RNA vaccine, or the pharmaceutical composition, or the vaccine, the recombinant protein expressed by the recombinant nucleic acid system, the RNA vaccine, or the pharmaceutical composition, or the vaccine as described herein.

[0106] In some embodiments, provided is a use or application of any one of the recombinant protein, the recombinant protein expressed by the recombinant nucleic acid system, the RNA vaccine, or the pharmaceutical composition, or the vaccine for the manufacture of a medicament in preventing or treating cancer as described herein.

[0107] In some embodiments, provided is a recombinant protein, the recombinant protein expressed by the recombinant nucleic acid system, the RNA vaccine, or the pharmaceutical composition, or the vaccine for use in preventing or treating cancer.

[0108] In some embodiments, the cancer is, but not limited to, skin cancer, colon cancer, bladder cancer, lung cancer, head and neck cancer, gastric cancer, B-cell derived lymphoma, T-cell derived lymphoma, pancreatic cancer, brain cancer, monocytic leukemia, B-cell derived leukemia, T-cell derived leukemia, breast cancer, melanoma, hepatocellular carcinoma, small cell lung cancer, non-small cell lung cancer, Hodgkin lymphoma, kidney cancer, ovarian cancer, cancer of esophagus, cancer of testes, colorectal cancer, thyroid cancer, prostate cancer, stomach cancer, or cervical cancer.

[0109] In some embodiments, the recombinant protein comprises one or more of the T-cell specific epitopes (such as T1, T2, T3 and / or T4) as described herein, or at least one fragment thereof, or at least one variant sequence having at least 75%, 80%, 85%, 95%or 99%sequence identity thereof, and optionally further comprises one or more of the B-cell specific epitopes as described herein (such as B1 and / or B2) , or at least one fragment thereof, or at least one variant sequence having at least 75%, 80%, 85%, 90%, 95%or 99%sequence identity thereof. For example, in one embodiment, the recombinant protein comprises T2 and T4. Any other combination of the T-cell specific epitopes or plus the B-cell specific epitopes may be used.

[0110] In some embodiments, the recombinant protein comprises one or more of the T-cell specific epitopes (such as T1, T2, T2-1, T2-2, T2-3, T3 and / or T4) as described herein, or at least one fragment thereof, or at least one variant sequence having at least 75%, 80%, 85%, 90%, 95%or 99%sequence identity thereof, and optionally further comprises one or more of the B-cell specific epitopes as described herein (such as B1 and / or B2) , or at least one fragment thereof, or at least one variant sequence having at least 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, or 99%sequence identity thereof. For example, in one embodiment, the recombinant protein comprises T2-1 and / or T4. Any other combinations of the T-cell specific epitopes or the B-cell specific epitopes may be used instead. In some embodiments, the recombinant protein comprises any combination of the T-cell specific epitopes and / or the B-cell specific epitopes and they are operatively linked to each other to form a fusion protein.

[0111] In some embodiments, provided is a pharmaceutical composition comprising one or more of the recombinant proteins comprising one or more of the T-cell specific epitopes (such as T1, T2, T2-1, T2-2, T2-3, T3 and / or T4) as described herein, or at least one fragment thereof, or at least one variant sequence having at least 75%, 80%, 85%, 90%, or 95%sequence identity thereof, and optionally further comprises one or more of the B-cell specific epitopes as described herein (such as B1 and / or B2) , or at least one fragment thereof, or at least one variant sequence having at least 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, or 99%sequence identity thereof. For example, in one embodiment, the composition comprises one of the individual recombinant proteins as described herein. For example, in one embodiment, the composition comprises a mixture of the individual recombinant proteins as described herein. For example, in one embodiment, the composition comprises a first recombinant protein comprising T2-1 and a second recombinant protein comprising T4. Any other combination of recombinant protein comprising the T-cell specific epitopes or the B-cell specific epitopes may be used.

[0112] In some embodiments, provided is a recombinant protein comprising one or more amino acid sequences spanning amino acid residues at one or more locations on CLDN6 as described herein or at least one fragment thereof, or at least one variant sequence having at least 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, or 99%sequence identity thereof. In some embodiments, the amino acid sequence spans across a contiguous region, a fragment or segment of residues, which are located on ±1-10 residues upstream or downstream from the defined starting and ending positions, inclusive of both the starting and ending amino acids.

[0113] NUMBERED EMBODIMENTS

[0114] Set 1

[0115] Embodiment 1. A recombinant protein, comprising an amino acid sequence encoding at least one fragment of CLDN6, or at least one variant sequence having at least 75%identity thereof, wherein the at least one fragment of CLDN6 comprises: at least one T-cell specific epitope, or at least one fragment thereof, or at least one variant sequence having at least 75%, 80%, 85%, 90%, or 95%sequence identity thereof.

[0116] Embodiment 2. The recombinant protein of embodiment 1, wherein the at least one fragment of CLDN6 further comprises: at least one B-cell specific epitope, or at least one fragment thereof, or at least one variant sequence having at least 75%, 80%, 85%, 90%, or 95%sequence identity thereof.

[0117] Embodiment 3. The recombinant protein of embodiment 2, wherein the at least one B-cell specific epitope comprises an amino acid sequence spanning amino-acid residues 40-68, and / or amino-acid residues 145-160 of CLDN6 protein, or a variant sequence having at least 75%, 80%, 85%, 90%, or 95%sequence identity thereof.

[0118] Embodiment 4. The recombinant protein of embodiment 2 or 3, wherein the at least one B-cell specific epitope comprises an amino acid sequence SEQ ID NO. : 1 and / or SEQ ID NO. : 2.

[0119] Embodiment 5. The recombinant protein of any one of the preceding embodiments, wherein the at least one T-cell specific epitope comprises an amino acid sequence spanning amino-acid residues 65-88, amino-acid residues 117-133, amino-acid residues 141-166, and / or amino-acid residues 195-212 of CLDN6 protein, or a variant sequence having at least 75%, 80%, 85%, 90%, or 95%sequence identity thereof.

[0120] Embodiment 6. The recombinant protein of any one of the preceding embodiments, wherein the at least one T-cell specific epitope comprises an amino acid sequence SEQ ID NO. : 3, SEQ ID NO. : 4, SEQ ID NO. : 5 and / or SEQ ID NO. : 6.

[0121] Embodiment 7. The recombinant protein of any one of the preceding embodiments, further comprises an amino acid sequence comprising at least one immune enhancer.

[0122] Embodiment 8. The recombinant protein of embodiment 7, wherein the at least one immune enhancer is or comprises all or a fragment of diphtheria toxin (DTT) .

[0123] Embodiment 9. The recombinant protein of embodiment 8, wherein the diphtheria toxin (DTT) comprises amino acid sequence SEQ ID NO. : 9.

[0124] Embodiment 10. The recombinant protein of any of the preceding embodiments, wherein the at least one B-cell specific epitope, and / or the at least one T-cell specific epitope, if present, are operatively linked to each other by at least one linker, wherein individual linker comprises an amino acid sequence of GPLS, AAY, EAAAK, KK, a flexible glycine-rich motif, and combination thereof.

[0125] Embodiment 11. The recombinant protein of embodiment 10, wherein the flexible glycine-rich motif is or comprises an amino acid sequence of GPGPG, GGGGS, or multiple repeats of GGGGS.

[0126] Embodiment 12. A recombinant protein of any one of the preceding embodiments, comprising an amino acid sequence having at least about 75%, 80%, 85%, 90%, or 95%sequence identity to all or a fragment of SEQ ID NO. : 10, or SEQ ID NO. : 11.

[0127] Embodiment 13. A recombinant protein of any one of the preceding embodiments, comprising amino acid sequences: SEQ ID NO. : 1, SEQ ID NO. : 2, SEQ ID NO.: 3, SEQ ID NO. : 4 , SEQ ID NO. : 5, SEQ ID NO. : 6, and SEQ ID NO. : 9; or SEQ ID NO.: 3, SEQ ID NO. : 4 , SEQ ID NO. : 5, and SEQ ID NO. : 6, and SEQ ID NO. : 9.

[0128] Embodiment 14. A recombinant nucleic acid system, comprising a nucleic acid sequence encoding the recombinant protein of any of embodiments 1-13.

[0129] Embodiment 15. The recombinant nucleic acid system of embodiment 14, further comprises a nucleic acid sequence encoding a nucleotide sequence SEQ ID NO. : 15, or SEQ ID NO. : 16.

[0130] Embodiment 16. An RNA vaccine, wherein the RNA vaccine comprises an open reading frame comprising a sequence encoding the recombinant protein of any of embodiments 1-13; or a sequence of the recombinant nucleic acid system of any one of embodiments 14-15.

[0131] Embodiment 17. A pharmaceutical composition, comprising the recombinant protein of any one of embodiments 1-14, the recombinant protein expressed by the recombinant nucleic acid system of any one of embodiments 14-15, or the RNA vaccine of embodiment 16; and optionally, an adjuvant.

[0132] Embodiment 18. A vaccine, comprising any one of the recombinant protein as described in any one of embodiments 1-13, the recombinant protein expressed by the recombinant nucleic acid system of any one of embodiments 14-15, the RNA vaccine of embodiment 16, or the pharmaceutical composition as described in embodiment 17.

[0133] Embodiment 19. A method of preventing or treating cancer in a subject in need thereof, comprising step of: administering to the subject an effective amount of the recombinant protein of any one of embodiments 1-13, the recombinant protein expressed by the recombinant nucleic acid system of any one of embodiments 14-15, the RNA vaccine of embodiment 16, or the pharmaceutical composition as described in embodiment 17, or the vaccine of embodiment 18.

[0134] Embodiment 20. Use of the recombinant protein of any one of embodiments 1 to 13, the recombinant protein expressed by the recombinant nucleic acid system of any one of embodiments 14-15, the RNA vaccine of embodiment 16, or the pharmaceutical composition as described in embodiment 17, or the vaccine of embodiment 18 for the manufacture of a medicament in preventing or treating cancer.

[0135] Embodiment 21. The recombinant protein of any one of embodiments 1 to 13, the recombinant protein expressed by the recombinant nucleic acid system of any one of embodiments 14-15, the RNA vaccine of embodiment 16, or the pharmaceutical composition as described in embodiment 17, or the vaccine of embodiment 18 for use in preventing or treating cancer.

[0136] Set 2

[0137] Embodiment 1. A recombinant protein, comprising an amino acid sequence encoding at least one fragment of CLDN6, wherein the at least one fragment of CLDN6 comprises: at least one T-cell specific epitope, or at least one fragment thereof, or at least one variant sequence thereof.

[0138] Embodiment 2. The recombinant protein of embodiment 1, wherein the at least one T-cell specific epitope comprises: (c) an amino acid sequence spanning amino acid residues 65-88; (d) an amino acid sequence spanning amino acid residues 111-142 or a fragment thereof; (e) an amino acid sequence spanning amino acid residues 141-166; and / or (f) an amino acid sequence spanning amino acid residues 195-212, of the CLDN6 protein, or a variant sequence thereof.

[0139] Embodiment 3. The recombinant protein of embodiment 2, wherein (d) the amino acid sequence spanning amino acid residues 111-142 or a fragment thereof comprises: amino acid residues 117-133, amino acid residues 111-126 or amino acid residues 125-142 of the CLDN6 protein, or a variant sequence thereof.

[0140] Embodiment 4. The recombinant protein of any one of the preceding embodiments, wherein the at least one T-cell specific epitope comprises an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO. : 3, SEQ ID NO. : 4, SEQ ID NO. : 5, SEQ ID NO. : 6, SEQ ID NO. : 12, SEQ ID NO. : 13, SEQ ID NO. : 14, and / or any combination thereof.

[0141] Embodiment 5. The recombinant protein of any one of the preceding embodiments, wherein the at least one T-cell specific epitope comprises an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO. : 12 and / or SEQ ID NO. : 6.

[0142] Embodiment 6. The recombinant protein of embodiment 1, wherein the at least one fragment of CLDN6 further comprises: at least one B-cell specific epitope or at least one fragment thereof, or at least one variant sequence thereof.

[0143] Embodiment 7. The recombinant protein of embodiment 6, wherein the at least one B-cell specific epitope comprises: (a) an amino acid sequence spanning amino acid residues 40-68; and / or (b) an amino acid sequence spanning amino acid residues 145-160, of CLDN6 protein, or a variant sequence thereof.

[0144] Embodiment 8. The recombinant protein of any one of embodiments 1, 6 and 7, wherein the at least one B-cell specific epitope comprises an amino acid sequence SEQ ID NO.: 1 and / or SEQ ID NO. : 2.

[0145] Embodiment 9. The recombinant protein of any one of embodiments 2-8, wherein the CLDN6 protein comprises amino acid sequence of NP_067018.2.

[0146] Embodiment 10. The recombinant protein of any one of the preceding embodiments, further comprising an amino acid sequence comprising at least one immune enhancer.

[0147] Embodiment 11. The recombinant protein of embodiment 10, wherein the at least one immune enhancer is or comprises all or a fragment of diphtheria toxin (DTT) .

[0148] Embodiment 12. The recombinant protein of embodiment 11, wherein the diphtheria toxin (DTT) comprises an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO. : 9.

[0149] Embodiment 13. The recombinant protein of any of the preceding embodiments, wherein the at least one B-cell specific epitope, and / or the at least one T-cell specific epitope, if present, are operatively linked to each other by at least one linker, wherein an individual linker comprises an amino acid sequence of GPLS, AAY, EAAAK, KK, a flexible glycine-rich motif, and a combination thereof.

[0150] Embodiment 14. The recombinant protein of embodiment 13, wherein the flexible glycine-rich motif is or comprises an amino acid sequence of GPGPG, GGGGS, or multiple repeats of GGGGS.

[0151] Embodiment 15. A recombinant protein of any one of the preceding embodiments, comprising an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO. : 10, or SEQ ID NO. : 11, or a fragment thereof or a variant sequence thereof.

[0152] Embodiment 16. A recombinant protein of any one of the preceding embodiments, comprising amino acid sequences as shown in: SEQ ID NO. : 1, SEQ ID NO.: 2, SEQ ID NO. : 3, SEQ ID NO. : 4, SEQ ID NO. : 5, SEQ ID NO. : 6, and SEQ ID NO.: 9; SEQ ID NO. : 3, SEQ ID NO. : 4, SEQ ID NO. : 5, SEQ ID NO. : 6, and SEQ ID NO.: 9; or SEQ ID NO. : 12 and SEQ ID NO. : 6.

[0153] Embodiment 17. A recombinant nucleic acid system, comprising at least one nucleic acid sequence encoding the recombinant protein of any of embodiments 1-16, or any combination thereof.

[0154] Embodiment 18. The recombinant nucleic acid system of embodiment 17, comprising a first nucleic acid sequence encoding a first recombinant protein comprising amino acid sequence as shown in SEQ ID NO. : 12, and a second nucleic acid sequence encoding a second recombinant protein comprising amino acid sequence as shown in SEQ ID NO. : 6.

[0155] Embodiment 19. The recombinant nucleic acid system of embodiment 17, further comprises at least one nucleic acid sequence encoding a nucleotide sequence shown in SEQ ID NO. : 15, or SEQ ID NO. : 16, or a fragment thereof.

[0156] Embodiment 20. An RNA vaccine, wherein the RNA vaccine comprises an open reading frame comprising a nucleic sequence encoding the recombinant protein of any of embodiments 1-16; or a nucleic sequence of the recombinant nucleic acid system of any one of claims 17-19.

[0157] Embodiment 21. A pharmaceutical composition, comprising: the recombinant protein of any one of embodiments 1-16, or any combination thereof; the recombinant protein expressed by the recombinant nucleic acid system of any one of claims 17-19, or any combination thereof; and / or the RNA vaccine of claim 20, and optionally, an adjuvant.

[0158] Embodiment 22. The pharmaceutical composition of embodiment 21, comprising: a first recombinant protein comprising an amino acid sequence shown in SEQ ID NO. : 12; and a second recombinant protein comprising an amino acid sequence shown in SEQ ID NO. : 6.

[0159] Embodiment 23. A vaccine, comprising any one of the recombinant proteins as claimed in any one of embodiments 1-16, the recombinant protein expressed by the recombinant nucleic acid system of any one of claims 17-19, the RNA vaccine of claim 20, or the pharmaceutical composition as claimed in claims 21-22.

[0160] Embodiment 24. A method of preventing or treating cancer in a subject in need thereof, comprising the step of: administering to the subject an effective amount of the recombinant protein of any one of embodiments 1-16, the recombinant protein expressed by the recombinant nucleic acid system of any one of claims 17-19, the RNA vaccine of claim 20, or the pharmaceutical composition as claimed in claims 21-22, or the vaccine of claim 23.

[0161] Embodiment 25. Use of the recombinant protein of any one of embodiments 1-16, the recombinant protein expressed by the recombinant nucleic acid system of any one of claims 17-19, the RNA vaccine of claim 20, or the pharmaceutical composition as claimed in claims 21-22, or the vaccine of claim 23 for the manufacture of a medicament in preventing or treating cancer.

[0162] Embodiment 26. The recombinant protein of any one of embodiments 1-16, the recombinant protein expressed by the recombinant nucleic acid system of any one of claims 17-19, the RNA vaccine of claim 20, or the pharmaceutical composition as claimed in claims 21-22, or the vaccine of claim 23 for use in preventing or treating cancer. EXAMPLES

[0163] Provided herein are examples that describe in more detail certain embodiments of the present disclosure. The examples provided herein are merely for illustrative purposes and are not meant to limit the scope of the invention in any way. All references given below and elsewhere in the present application are hereby included by reference.Example 1: Recombinant Proteins, Nucleic Acid systems, Vaccines, Pharmaceutical Compositions and Uses Thereof for Preventing or Treating Cancer

[0164] Materials and Methods

[0165] 1. Recombinant protein design, gene synthesis, production, and purification

[0166] Human and mouse CLDN6 amino acid sequences, NP_067018.2 and NP_001400943.1, were obtained from the Identical Protein Groups (IPG) resource at the National Center for Biotechnology Information (NCBI) .

[0167] Human CLDN6 amino acid sequence was analyzed for predicting human B-cell epitopes using Prediction of linear epitopes from protein sequence and T-cell epitopes using NetMHCIpan 4.1 BA, Consensus (Low percentile ranks) and NetMHCIpan 4.1 EL (High scores) . These computation prediction programs are available as the B Cell Tools and T Cell Tools at the Immune Epitope Database (IEDB) .

[0168] Human CLDN6 T1-T4 motifs containing T-cell epitopes were predicted by computation. To determine whether splenocytes collected from the vaccinated mice can be specifically activated upon stimulation by T-cell epitope peptides, the corresponding recombinant proteins or polypeptides were synthesized. The entire T1, T3, and T4 were predicted to be hydrophilic and soluble in the medium and were successfully synthesized. T2 is in the hydrophobic transmembrane domain 3 and was predicted to be insoluble in the medium. Therefore, three additional T2 peptides, T2-1, T2-2, and T2-3, which included a few upstream and downstream amino acid residues to improve solubility were synthesized. The positions and amino acid sequences of these six polypeptides are listed in Table 1.

[0169] Using these motifs, 4 example recombinant proteins (vaccine antigen) were designed with different features: 1) CLDN6-B+T, containing all B1-B2 and T1-T4 motifs; 2) CLDN6-T, containing only T1-T4 motifs; 3) CLDN6-B, containing only B1-B2 motifs; and 4) CLDN6-E, containing two extracellular loops (ECL1 and ECL2) where B1, B2, T1, and T3 are located. These vaccine antigens were constructed by linking multiple B-and / or T-cell epitopes together with linkers and fused with an N-terminal carrier protein DTT and a C-terminal 6×His tag. FIG. 1A illustrates the amino acid sequences of the linkers / His tag, immune enhancer (DTT) and individual motifs (B1, B2, T1, T2, T3, T4) respectively. Recombinant proteins, CLDN6-T, CLDN6-B, and CLDN6-E containing only the B (B1+B2) , T (T1+T2+T3+T4) , and ECL (ECL1+ECL2) motifs, respectively, were constructed and used to compare the cellular and humoral immune responses induced by recombinant protein, CLDN6-B+T, which contains both B and T motifs (B1+B2+T1+T2+T3+T4) . FIG. 1B illustrates the overall constructs of the 4 example recombinant polypeptides. For the sequences of the individual linkers / His tag or motifs used in FIG. 1B, please refer to FIG. 1A. The corresponding nucleic acid sequences of the four recombinant polypeptides were obtained and prepared. After the codon optimization for E. coli expression, the expression fragments were synthesized and cloned into pET-22B(+) expression vector at NdeI and XhoI sites, which was carried out through the service provided by Gene Universal Inc. (Newark, DE, USA) to obtain corresponding example nucleic acid systems. All expression fragments were validated by sequencing. Recombinant proteins were expressed by E. coli BL21 (DE3) strain induced by 1 mM IPTG (Amresco, Albany, NY, USA) at 15℃ for 16 hours. Results showed that these recombinant proteins were found in the soluble fraction of the lysates. These His-tagged proteins were purified using Ni-NTA Agarose columns (Huiyan bio, Wuhan, China) from the soluble fraction in the native condition and then eluted using 500 mM Imidazole solution (Sinopharm, Beijing, China) after the extensive wash. The standard procedures for His-tagged protein purification were conducted according to the standard protocol (available at Qiagen, Venlo, Netherlands) . In brief, bacteria were harvested by centrifugation at 5,000×g after the induction and lysed by sonication in Phosphate-buffered saline buffer (PBS; pH 7.4) containing 300 mM NaCl on ice. The soluble fraction was obtained after centrifugation at 10,000×g for 30 minutes twice and then loaded onto a Ni-NTA Agarose column. After washing with ice-cold PBS three times plus 50mM Imidazole (Sinopharm, Beijing, China) in PBS for twice, each His-tagged protein bound to the column was eluted using 500 mM Imidazole in PBS. The eluted product was buffer exchanged and concentrated to PBS using Millipore Amicon Ultra centrifugal filter (Merck KGaA, Darmstadt, Germany) , by following the manufacturer’s protocol. Endotoxin was then removed by Endotoxin Removal Beads to <50 EU / mg (Smart Life Sciences, Changzhou, China) . The concentrations of the final products were determined using Pierce BCA Protein Assay Kits (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA) . Samples from the major steps were collected and examined on sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) .

[0170] 2. Animal procedures and studies

[0171] All mouse models and procedures used in this example were in accordance with the study protocols approved by the Institutional Animal Care and Use Committee of the Applicant and the Contract Research Organizations (CROs) . In the in-house study, mice were maintained in an animal facility under a standard 12h light / dark cycle, with diet and water provided ad libitum. Mice and lab chow diet used in the in-house studies were purchased from the Laboratory Animal Services Centre of the Chinese University of Hong Kong (Hong Kong SAR, China) . Immunogenicity study using HLA*A02: 01-humanized C57BL / 6 mice was carried out through the service provided by Biocytogen (Beijing, China) , an accredited animal study CRO by the American Association for Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC) . Anti-cancer study using a syngeneic mouse cancer model was carried out through the service provided by KYinno Biotechnology Co., Ltd (Beijing, China) . The CLDN6-humanized mouse colon cancer cell line MC38-hCLDN6 (K) , provided by KYinno, was used. Female C57BL / 6 background mice were used in the studies described here.

[0172] Mouse vaccination was carried out by subcutaneous injections of 100 μl freshly prepared vaccine containing 80 μl of 50μg vaccine protein and 20 μl of 1.0 mg / ml CpG-ODN (InvivoGen, San Diego, CA; Catalog number: tlrl-1826) . Mice received the initial dose at 6-7 weeks of age and then booster dose once a week for 4-5 times. The body weights were recorded twice a week. Blood samples (50-100 μl) were collected once a week from saphenous vein to determine the levels of the vaccine-induced antibody using ELISA described below. At a week after the 3rd, 4th, and 5th booster, one mouse in each group was euthanized by CO2 inhalation to retrieve the spleen for the collection of splenocytes to determine the vaccine-activated cellular immunity using the IFNγ ELISpot assay as described below. The schedules of vaccination and other procedures in each study were illustrated in FIGS. 3A, 4A, and 5A, respectively.

[0173] To assess the anti-cancer efficacy of the example recombinant proteins, a CLDN6-humanized mouse cancer cell line, MC38-hCLDN6 (K) , was used. This cell line was established by KYinno Biotechnology Co. and the expression of human CLDN6 was validated by flow cytometry. MC38-hCLDN6 (K) was provided for this study through the service provided by KYinno. MC38-hCLDN6 (K) was routinely maintained in RPMI medium supplemented with 10%fetal bovine serum, 2 mM L-glutamine, 100 U / ml of penicillin, and 5μg / mL Puromycin (Thermo Fisher Scientific) in a 37℃ and 5%CO2 tissue culture incubator. To prepare MC38-hCLDN6 (K) cell inoculation in mice, the cultured cells were collected and washed with PBS three times and then mixed with ice-cold Matrigel (Corning Inc., Corning, NY, USA; Catalog number: 354230) at a 1: 1 ratio. Then, MC38-hCLDN6 (K) cells (1×106 in 100 μl per mouse) were inoculated subcutaneously in the mice one day after the last booster dose. The schedule is illustrated in FIG. 5A. The lengths and widths of tumors were measured three times a week. Tumor volume was calculated using the following formula: tumor volume (mm3) = 0.5 x length (mm) x (width (mm) 2. Once the volume of the largest tumor was >2,000 mm3, the study was ended, and all mice were sacrificed to retrieve tumors for images and recording tumor weights.

[0174] 3. ELISA

[0175] Mouse blood samples were collected through the saphenous vein typically a week after the boost vaccinations. After the collection, the microtubes containing blood samples were placed at room temperature for 20-30 minutes to allow blood to clot. Then, the samples were centrifuged at 1,000-2,000 x g for 10 minutes at 4℃. Supernatants (i.e., serum) were transferred to new microtubes and stored at -80℃. These serum samples were diluted by 1: 500, 1: 2, 500, 1: 5,000, and 1: 125,000 in PBS and used to determine the vaccine-induced humoral responses via the vaccine-induced antibody against CLDN6 by ELISA. In brief, the ELISA was carried out using the 96-well plate (Corning; Catalog Number: 9018, ) coated with 0.1 μg / 100 μl / well of recombinant his-tagged human CLDN6 protein (ACROBiosystems Group, Newark, DE, USA; Catalog number: CL6-H5286) and blocked with 200 μl of 2%BSA (Solarbio Life Sciences, Beijing, China; Catalog number: A8020) . Each of the diluted samples as well as negative (the sera collected from the mice without any vaccination treatment) and positive controls (diluted mouse monoclonal antibody against hCLDN6 (Creative Biolabs, Shirley, NY, USA; Catalog number: MOB-3290z) were loaded into the wells at 50 μl per well in duplication and incubated at 37℃for 1 hour. Then, the standard ELISA procedures were carried out with HRP-conjugated goat anti-mouse IgG (Novus Biologicals LLC, Centennial, CO, USA; Catalog number: NB7561) , and the plate was developed with the chromogenic 3, 3′, 5, 5′-Tetramethylbenzidine (TMB) substrate (50 μl / well; Abcam Ltd, Cambridge, MA, USA; Cat. #: ab171523) for 15-30 minutes and stopped with the Stop solution (50 μl / well; Abcam; Catalog number: ab171529) . The absorbance at 450nm was collected using the BioTek 800 TS Absorbance Microplate Reader (Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA, USA) . The well / sample with value of A450 ≥ 2.1-fold of negative controls was considered as positive.

[0176] 4. IFNγ ELISpot assay

[0177] The vaccine-activated cellular immunity in the immunized mice was assessed by the mouse IFNγ ELISpot assay using splenocytes collected from the experimental mice. In brief, to collect splenocytes, the spleen was excised out and placed in a 100 μm cell strainer (Biologix Group Ltd., Jinan, Shandong, China; Catalog number: 15-1100) in a 10 cm cell culture plate with 5 ml of RPMI medium containing 0.5%FBS after a mouse was euthanized and sterilized with 70%ethanol. All the rest of the procedures were processed in the sterilized environment inside the tissue culture hood. The spleen was then cut into small pieces and mashed / pressed through the strainer with the plunger end of a syringe. This procedure was repeated after adding 5 ml RPMI to the inside of the strainer. Then, the residue tissue was washed with 5 ml RPMI through the strainer. All the through materials were combined and passed through a 70 μm cell strainer (Biologix; Catalog number: 15-1070) . Splenocytes were collected after a 5-minute centrifugation at 700×g at 4℃ and then washed with cold RPMI. The final cell pellet was resuspended in 10 ml RPMI and counted. Cell suspension was diluted with RPMI to 2 times of the final cell density used for the assay. 50 μl of the cells was added to each well loaded with 50 μl of RPMI medium with or without antigen peptide (final concentration: 50 μg / ml) on the 96-well assay plate of the mouse IFNγ pre-coated ELISpot assay kit (Dakewe; Catalog number: 2210005) . Wells added with phorbol myristate acetate (PMA; final concentration: 50ng / ml) and Ionomycin (final concentration: 1 μg / ml) were used as the positive control. Wells added with medium without cells were used as blank control. Typically, peptide stimulation was performed in duplication. The plate was then transferred gently to a cell culture incubator and cultured for around 24 hours without moving or shaking. Finally, the plate was probed with the detection antibody and developed using chromogenic reaction according to Dakewe’s protocol. The results were collected by IRIS 2 ELISpot reader (Mabtech AB, Nacka Strand, Sweden) according to manufacturer’s protocol.

[0178] 5. Flow cytometer

[0179] To identify the IFNγ-releasing cells, splenocytes collected above were also analyzed by flow cytometer after being stained with cell surface markers to identify CD4+and CD8α+ T-cells using the standard protocol to characterize mouse T-cells via flow cytometry. In brief, splenocytes were counted and resuspended in RPMI medium at the density of 1×106 cells per 50 μl, and 50 μl of cells was added into each well of a 96-well plate. Then, the cells were stimulated with 40 μl of RPMI medium containing T-cell epitope peptide (final concentration: 50 μg / ml) while medium without T-cell epitope peptide was used as negative control and medium with 50 ng / ml PMA and 1 μg / ml Ionomycin was used as positive control. After 1 hour of stimulation in the cell culture incubator, 10 μl of Protein Transport Inhibitor Cocktail (eBiosciences / Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) was added into each well to block cytokine secretion, and the culture was continued for an additional 5 hours. The cells were collected and washed with PBS by centrifugation at 500×g and 4℃ for 10 min and blocked with Blocking Solution containing purified anti-mouse CD16 / 32 monoclonal antibody (Biolegend, San Diego, CA, USA) on ice for 15 minutes, followed by cell surface staining using APC / Cy7 anti-mouse CD45, PerCP / Cyanine5.5 anti-mouse CD3, Brilliant Violet 711 anti-mouse CD4, and FITC anti-mouse CD8α antibodies (Biolegend) on ice for 30 minutes, and then Fixable Viability Dye eFluor506 (eBiosciences / ThermoFisher Scientific) staining on ice for 30 minutes. Then, the cells were fixed using IC Fixation Buffer (eBiosciences) for 60 minutes at room temperature and then permeabilized using Permeabilization Buffer (eBiosciences) overnight at 4℃. Intracellular IFNγ and TNFα were characterized by intracellular staining using PE anti-mouse IFNγ and APC anti-mouse TNFα antibodies (Biolegend) in Permeabilization Buffer for 30 minutes at room temperature. The stained cells were resuspended in 250 μl BD Horizon Brilliant Stain Buffer Plus (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA) and analyzed using Attune NxT Flow Cytometer (ThermoFisher Scientific) according to manufacturer’s protocol.

[0180] The above flow cytometry analysis staining procedure is also detailed in the protocol provided by manufacturer (ThermoFisher Scientific) (titled: BestProtocols: Staining Intracellular Antigens for Flow Cytometry) .

[0181] 6. Statistical analysis

[0182] Statistical analysis in the comparisons among multiple groups was carried out by one-way or two-way analysis of variance (ANOVA) followed by Dunnett’s multiple comparison tests using the Prism 5 or Prism 10 software (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA) . Statistical analysis in the comparisons between two groups was carried out by Student’s t-test. Statistical significance was indicated by p-value <0.05.

[0183] Results

[0184] 1. Vaccine antigen design and production

[0185] To develop a recombinant protein targeting CLDN6+ cancer, fusion proteins containing multiple CLDN6 T-cell epitopes targeting to activate cellular immunity (i.e., cytotoxicity) to destroy cancer cells and a bacterial carrier protein as an immune enhancer for breaking immune tolerance for self-antigen were constructed. Whether including B-cell epitopes in the vaccine to activate humoral response strengthens the overall anti-cancer activity was tested.

[0186] Human CLDN6 amino acid sequences and identified human B-and T-cell epitopes using B Cell Tools and T Cell Tools at IEDB were analyzed. Human B-cell epitopes positioned in the ECL1 and ECL2 respectively, also referred to as B1 and B2 motifs, were selected. Human T-cell epitopes with better MHC I / II binding scores were found enriched in several regions, referred to as T1-T4 motifs. There are overlaps between the B and T motifs. The amino acid sequences and their positions in CLDN6 of these motifs that are selected to construct the recombinant proteins are listed in Table 1.

[0187] Table 1: The amino acid sequences and their positions in hCLDN6 of selected motifs

[0188] To test these vaccines in mouse models, human and mouse CLDN6 were compared and found that human B1, B2, T1, T2, T3, and T4 are 97%, 93%, 92%, 88%, 88%, and 78%identical to their mouse counterparts. The relatively lower homology of T motifs suggested that some human T-cell epitope motifs may not be highly presented by mouse MHCs. In these 4-transmembrane domain proteins, B1 is entirely and T1 is mainly positioned in the extracellular loop 1 (ECL1) and they are overlapped by 4 amino acid residues. B2 is entirely included in T3, positioned in the extracellular domain 2 (ECL2) . T2 is entirely positioned in the third transmembrane domain, T3 is mainly positioned in ECL2, and T4 is positioned in the intracellular domain near the C-terminal. Compared to human CLDN9 that shares high homology with hCLDN6, B1, B2, T1, T2, T3, and T4 are 100%, 93%, 100%, 93%, 100%and 92%identical, respectively. According to MHC I / II peptide prediction, T2 and T4 are hCLDN6-specific.

[0189] To include all B and T motifs, recombinant protein CLDN6-B+T, which contains all B1-B2 and T1-T4 motifs fused with a DTT at the N-terminal was constructed. The amino acid sequence of DTT is shown in SEQ ID NO. : 9. Based on CLDN6-B+T, recombinant proteins, CLDN6-T and CLDN6-B, which carry only T1-T4 or B1-B2 motifs to activate cellular or humoral immunity, were constructed respectively. Because these motifs include most of ECL1 and ECL2, recombinant protein CLDN6-E, which contains ECL1 and ECL2, was also constructed and used as a comparison in the study (the sequences and positions of ECL1 and ECL2 are listed in Table 1) . A C-terminal 6XHis tag was added to each recombinant protein for purification purposes. In other examples, His tag is not included in the recombinant proteins. The amino acid sequences of CLDN6-B+T was shown in SEQ ID NO. : 10 and CLDN6-T was shown in SEQ ID NO. : 11 in Table 2, respectively.

[0190] Table 2: The amino acid sequences of the four recombinant proteins

[0191] In other examples, other example linkers may be used instead, including but not limited to, GPLS, AAY, EAAAK, KK, and flexible glycine-rich motifs such as GPGPG, GGGGS and multiple repeats of GGGGS (e.g., GGGGSGGGGSGGGGS) .

[0192] The corresponding nucleic acid sequences were obtained and codon optimized and were shown as SEQ ID NOs. : 15 and 16, respectively, and are listed in Table 3. The expression fragments were synthesized and cloned into pET-22B (+) expression vector. The nucleic acid systems containing the nucleotide sequences were constructed. Recombinant proteins, CLDN6-B+T and CLDN6-T, were expressed inE. coli and found in the soluble fraction of the lysates. These His-tagged proteins were purified using Ni-NTA Agarose columns from the soluble fraction in the native condition and then eluted using Imidazole solution. Samples from the major steps were collected and examined on the SDS-PAGE. The SDS-PAGE results were shown in FIGS. 2A-2D. Endotoxin was removed from the products. Endotoxin levels were <50 EU / mg in the final purified products, suggesting that they were suitable for mouse study. Table 3: The nucleic acid sequences of recombinant proteins CLDN6-B+T and CLDN6-T

[0193] 2. Immunogenicity of CLDN6 vaccines in the HLA*A02: 01-humanized mice.

[0194] To test whether the example recombinant proteins can be successfully presented in vivo, MHC-I-humanized mice were utilized since activating cellular immunity i.e., cytotoxicity to destroy cancer cells is mediated through the MHC-I antigen presentation pathway and the MHC-I-humanized mice are available. In this transgenic model, mouse MHC-I α-chain protein is replaced by a hybrid α chain protein containing the α1 and α2 domains from human MHC-I (e.g., one frequent human MHC-I allele HLA-A*02: 01) , and the α3, transmembrane, and cytoplasmic domains from mouse α-chain protein. This hybrid α chain protein forms a functional MHC-I complex with mouse β chain through its mouse α3 domain, and recognizes and binds human MHC-I peptides through its human HLA-A*02: 01 α1 and α2 domains, which resembles an in vivo antigen peptide recognition and binding by human MHC-I (i. e, . HLA-A*02: 01) but is able to form a functional complex with other components to carry out antigen presentation to T-cells in mice. In this example, the experiment was carried out through the service provided by Biocytogen, a CRO for animal studies, who developed HLA-A*02: 01-humanized mouse models for service study, according to our experimental study design described herein. In this example, the HLA-A*02: 01-humanized mice were chosen because HLA-A*02: 01 is one of the most frequent alleles in humans and all T motifs consist of computer-predicated sequences for HLA-A*02: 01.

[0195] To determine the activity of the example recombinant proteins in activating cellular immune response through human MHC-I, the HLA*A02: 01-humanized mice were vaccinated once a week for 6 times with the vaccine protein containing T-cell epitopes, CLDN6-B+T and CLDN6-T. CpG-ODN was used as the adjuvant. Mice that received CpG-ODN only were used as negative controls. Each group started with 3-4 mice at 6 weeks of age. Three mice were sacrificed at the same time points for retrieving spleens to collect splenocytes.

[0196] In this example, mice at 6 weeks of age were vaccinated with CLDN6-B+T or CLDN6-T, which were designed for activating T-cell responses (the schedules of vaccination and procedures are illustrated in FIG. 3A) . CpG-ODN was used as the vaccine adjuvant. Mice receiving CpG-ODN only were used as negative controls. During the study, mouse body weights were recorded and showed normal growth, suggesting that the vaccines were well-tolerated (FIG. 3B) . At Week 5, 6, and 7, splenocytes were collected for ELISpot assay to determine the IFNγ release from immune cells after stimulating with T-cell epitope peptides. T1, T3, and T4, which were predicted to be hydrophilic and soluble in the medium and were successfully synthesized. T2, which was predicted to be insoluble in the medium, was further synthesized as three T2 peptides, T2-1, T2-2, and T2-3, which each incorporated a few upstream or downstream amino acid residues to improve solubility. Amino acid positions and sequences of these stimulating peptides are listed in Table 4.

[0197] Human CLDN6 B-and T-cell epitopes were predicted by computation programs in the B Cell Tools and T Cell Tools at IEDB. There are 2 regions, B1 and B2, and 4 regions, T1-T4, containing multiple high score B-and T-cell epitopes, respectively, were recognized. They are selected to construct the vaccine antigen proteins. Sequences of these motifs are listed in Table 1. Because these motifs include most of the extracellular loops 1 and 2 (ECL1 and 2) , these two domains were also included in some of the studies. The sequences and positions of ECL1 and ECL2 are also listed in Table 1. Table 4: Amino acid sequences of the stimulating peptides derived from CLDN6 T-cell epitopes

[0198] By using IFNγ ELISpot assay to determine the response of splenocytes to the peptides representing the T-cell epitopes selected in the CLDN6 vaccines, 1) T1 and T3 induced very weak but positive responses at all 3 time points; 2) T2-1 induced strong responses at week 6 and 7, while T2-2 and T2-3 induced much weaker responses; and 3) T4 induced strong responses at all 3 time points (FIG. 3C) were found. The responses were at the similar levels in the splenocytes collected from mice vaccinated with CLDN6-B+T or CLDN6-T. In the splenocytes collected from mice that received adjuvant as the negative control, none of the peptides induced response. During the assay, splenocytes treated with PMA / Ionomycin were used as the positive assay control and showed strong IFNγ releasing activity, and splenocytes that received no challenges were used as the negative control and showed no activity. Overall, these results suggested that CLDN6-B+T and CLDN6-T, which were designed based on human T-cell epitopes, were immunogenic and activated cellular immunity in HLA-A*02: 01-humanized mice. The potent activity was induced by T2 / T4, which do not share the same MHC-I peptides with their counterparts in hCLDN9, suggesting that the cellular immunity is most likely hCLDN6-specific and does not recognize hCLDN9.

[0199] To characterize the T-cell epitope peptide-activated cells, flow cytometer study using the cell surface markers, CD45, CD3, CD4, and CD8α have been performed to identify CD4+ and CD8α+ T-cells and intracellular staining to characterize the levels of IFNγ and TNFα in these T-cells using the splenocytes collected at Week 6. After stimulation with these T-cell epitope peptides, the numbers / percentages of CD4+ and CD8α+ T-cells that were positive for IFNγ and / or TNFα were increased. The quantified results of flow cytometry analyses to determine the numbers / percentages of CD4+ and CD8α+ T-cells in the splenocytes that release IFNγ (FIG. 3D) and TNFα (FIG. 3E) upon stimulation with CLDN6 T-cell epitope peptides. The splenocytes were collected at week 6 from the mice vaccinated with adjuvant only, CLDN6-B+T, and CLDN6-T. Since the activations of CD4+ and CD8α+ T-cells are mediated by MHC-II and MHC-I complexes, respectively, these results suggested that the increase of IFNγ or TNFα in CD8α+ T-cells is most likely mediated by the HLA-A*02: 01 portion of the hybrid MHC-I in HLA-A*02: 01-humanized mice. Therefore, the results strongly suggested that the example recombinant proteins can be successfully processed and presented by DCs in humans and can be used for treating CLDN6+ cancer in humans.

[0200] 3. Immunogenicity of CLDN6 vaccines in the wild type C57BL / 6 mice.

[0201] Next, the immunogenicity (e.g. the ability to activate cellular and humoral immunities) of all 4 example recombinant proteins in the wildtype C57BL / 6 mice was determined because the wildtype mice were needed to develop a syngeneic tumorigenesis model for studying the efficacy of CLDN6 vaccines. CLDN6-B+T, -B, -T, and -E, were used to vaccinate the wildtype C57BL / 6 mice at 6 weeks of age. The CpG-ODN was used as the adjuvant. Mice that received CpG-ODN only were used as negative controls. Each group started with 4-5 mice at 6 weeks of age. Blood samples were collected 7 days after the 4th and 5th vaccinations and referred to as the Week 5 and 6 samples, respectively. At the same timepoint, one mouse from each group was sacrificed for retrieving spleens to collect splenocytes. The vaccination and procedure schedules are illustrated in FIG. 4A. FIG. 4B illustrates mouse body weights, showing normal growth during the study, suggesting that the vaccines were well-tolerated. FIG. 4C shows the well images and FIG. 4D shows the quantified results of ELISpot assay to determine the IFNγ release by splenocytes collected from mice at Week 5 and 6 and stimulated with a mixture of CLDN6 T-cell epitope peptides. The images were collected and quantified using Mabtech IRIS 2 ELISpot reader.

[0202] To determine the vaccine-activated cellular immunity, the IFNγ ELISpot assay using splenocytes collected at Week 5 and 6 was conducted. The results showed that, after stimulating with a mixture of T-epitope stimulating peptides (listed in Table 4) , there were significant numbers of splenocytes collected from the mice vaccinated with the T-epitope vaccines, CLDN6-B+T or CLDN6-T, releasing IFNγ, reaching 408 and 285 spots per 5×105 splenocytes at Week 5, and 56 and 512 spots per 5×105 splenocytes at Week 6, respectively (FIGS. 4C-4D) . IFNγ releasing activity of the splenocytes of mice vaccinated with CLDN6-B and CLDN6-E was at the basal level, similar to adjuvant controls that showed no IFNγ release. In the assay, splenocytes challenged with PMA / Iomyocin were used as positive controls and showed strong IFNγ release while splenocytes receiving no T-cell peptide challenge were used as negative controls and did not release IFNγ. On the assay plate, the wells without cells were used as blank controls. Results from this example demonstrated that CLDN6-B+T and CLDN6-T effectively activated T-cell epitope-specific cellular immunity in the wildtype C57BL / 6 mice, when compared to CLDN6-B and CLDN6-E. Although T-motifs significantly overlap with B-motifs and ECL1 / ECL2, these results suggested that the specific regions and integrity of the selected T1-T4 motifs are required for activating cellular immunity while having B-motifs and / or ECL1 / ECL2 are not sufficient.

[0203] To determine the vaccine-activated humoral immunity, ELISA was conducted to determine the titers of serum antibody against CLDN6 using serum samples collected from mice at Week 5 and 6. The samples were diluted serially for the assay. Mouse antibody against CLDN6 was used as the standard. The reading values of the absorbance at 450 nm larger than 2 folds of corresponding negative control were defined as positive. Table 5 listed the results that all vaccine antigens induced the antibody against CLDN6. Among them, CLDN6-B+T and CLDN6-E induced significantly higher antibody titers than CLDN6-B and CLDN6-T. It was surprising that CLDN6-B was not performing equally well. Table 5: The titers of the serum antibody against CLDN6 determined by ELISA using the diluted serum samples collected from mice at Week 5 and 6 showing immunogenicity of CLDN6 vaccines in the wildtype C57BL / 6 mice.

[0204] Collectively, the results showed that CLDN6-B+T effectively induced both cellular and humoral immunity, CLDN6-T effectively induced cellular immunity, and CLDN6-E effectively induced humoral immunity, whereas CLDN6-B induced weaker humoral immunity.

[0205] 4. Prophylactic anti-cancer study of CLDN6 T-cell epitope vaccines in syngeneic MC38-hCLDN6 (K) mouse tumorigenesis models.

[0206] In this example, the anti-cancer efficacies of CLDN6-B+T and CLDN6-T were studied in a syngeneic mouse colon cancer model using CLDN6-humanized mouse colon cancer cell line MC38-hCLDN6 (K) , in which mouse CLDN6 is replaced with human CLDN6. The wildtype C57BL / 6 mice were first vaccinated once a week for 6 times with CLDN6-B+T or CLDN6-T (n=8 in each group) and then subcutaneously inoculated with MC38-hCLDN6 (K) cells (1×106 cells per injection per mouse) one day after the last vaccination. Mice receiving PBS (n=4) or adjuvant only (n=8) were used as negative controls.

[0207] The procedures and schedules are illustrated in FIG. 5A. FIG. 5B shows the average body weights (mean±SD) of the mice during the study, which showed normal growth, suggesting that the vaccines were well-tolerated. The tumor growth was recorded twice per week by measuring the length and width of the tumor. By monitoring tumor growth, the growth of all tumors inhibited in two groups of vaccinated mice was found. The averages of volumes of each group (mean±SE) were plotted in FIG. 5C. The individual tumors in each group were plotted in FIGS. 5D-5G. In the group vaccinated with CLDN6-B+T, 7 of 8 tumors showed complete response and disappeared within 3 weeks and the last tumor stopped growing after the second week (FIG. 5F) . In the group vaccinated with CLDN6-T, all 8 tumors showed complete response and disappeared within 4 weeks (FIG. 5G) . Tumors in adjuvant controls (FIG. 5E) showed the same growth rate as that in mice treated with PBS (FIG. 5D) . Since some tumors were estimated to be 10%of the animal body weight on 28 days of inoculation, the study was ended at this time point. The final examination showed that 7 of 8 mice vaccinated with CLDN6-B+T were tumor-free and the only remaining tumor was much smaller than tumors collected from the PBS or adjuvant controls, and 8 of 8 mice vaccinated with CLDN6-T were tumor-free. FIG. 5H summarized the final tumor weight (mean±SE) (*and **indicate that the differences in the comparison with the adjuvant only control are statistically significant; p-values<0.05) . The images of all tumors collected from two control groups and the only tumor from the CLDN6-B+T-vaccinated group were shown in FIG. 5I. Results demonstrated that CLDN6 vaccines that contain T-cell epitopes effectively inhibited tumor growth of MC38-hCLDN6 (K) cells.

[0208] Summary of Results

[0209] In this example, vaccine proteins or recombinant proteins, CLDN6-B+T, which contains multiple human B-and T-cell epitopes, and CLDN6-T, which contains multiple T-cell epitopes only (i.e., without B-cell epitopes) were designed and provided. Both proteins were fused with a built-in immune enhancer, and their immunogenicity and anti-cancer efficacy were investigated in mice. First, the wildtype and MHC-I / HLA*A02: 01-humanized C57BL / 6 mice were vaccinated and splenocytes were collected for IFNγELISpot assays. The results showed that splenocytes from vaccinated mice displayed potent IFNγ release activity after being stimulated with T-cell epitope peptides, demonstrating that CLDN6 T-cell epitopes were effectively presented by not only mouse MHC and but also HLA*A02: 01 to activate cellular immunity. This result suggested that CLDN6 vaccines could activate immune cytotoxicity to destroy CLDN6+ cancer cells. The tumor growth of CLDN6-humanized MC38 mouse colon cancer cells inoculated in C57BL / 6 wildtype mice vaccinated with either CLDN6-B+T or CLDN6-T (N=8 in each group) was further studied. In the CLDN6-B+T vaccinated mice, 7 of 8 tumors disappeared within 3 weeks and the only remaining tumor stopped growing after the second week were found. In the CLDN6-T vaccinated mice, all 8 tumors disappeared within 4 weeks were found. Collectively, the results demonstrated that the CLDN6 vaccines effectively inhibited the growth of CLDN6+ tumors in mice, suggesting that CLDN6 vaccines hold promise for preventing or treating CLDN6+ cancers in humans.

[0210] In this example, 4 novel recombinant proteins by fusing different motifs of CLDN6 containing multiple predetermined human B-and / or T-cell epitopes with diphtheria toxin (DTT) , an immune enhancer, were designed and provided. HLA*A02: 01-humanized mice were vaccinated with the recombinant proteins containing human T-cell epitopes. Using splenocytes collected from the vaccinated mice, it demonstrated that, after being stimulated with T-cell epitope peptides, the splenocytes display potent IFNγ release activity in the ELISpot assay. Using the flow cytometer, significant numbers of CD8α+ T-cells releasing IFNγ and TNFα were determined. These data suggested that T-cell epitope vaccines activated cellular immunity such as CD8+ cytotoxic T-cells through the presentation by MHC-I (i.e., human MHC-I HLA*A02: 01 allele) . These two vaccines were also effectively presented in the wildtype mice, confirming that the wildtype mice are suitable for studying the anticancer activity of these vaccines. Then, a CLDN6-humanized mouse colon cancer cell line, MC38-hCLDN6, was utilized and its growth in mice vaccinated with either T-cell epitope vaccines was studied. Results showed that the two vaccines, CLDN6-B+T and CLDN6-T, effectively inhibited the tumor growth of MC38-hCLDN6 cancer cells, supporting the potential of the vaccines in treating CLDN6+ cancer in humans.

[0211] Conclusion

[0212] To target CLDN6+ cancer, CLDN6 vaccines were developed. The vaccine antigens, CLDN6-B+T and CLDN6-T, which contain human T-cell epitopes, effectively activated the cellular immunity in wildtype and HLA-A*02: 01-humanized mice. This suggests that the T-cell epitopes in the vaccines can be effectively presented by both mouse and human MHC-I to activate cytotoxicity to destroy CLDN6+ cancer cells. To determine the anti-cancer efficacies of CLDN6-B+T and CLDN6-T vaccines, a syngenetic mouse colon cancer model was utilized using CLDN6-humanized MC38 cells and the tumor growth was effectively inhibited in the mice vaccinated with either vaccine was found. The results from the examples suggested that CLDN6 vaccines are promising for further development to treat CLDN6+ cancers in humans.

[0213] The exemplary embodiments of the present invention are thus fully described. Although the description referred to particular embodiments, it will be clear to one skilled in the art that the present invention may be practiced with variation of these specific details. Hence, this invention should not be construed as limited to the embodiments set forth herein.

[0214] For example, in some embodiments, the sequences of the B-cell epitopes and / or T-cell epitopes are operatively linked together as one single peptide, but in other examples, recombinant proteins comprising the B-cell epitopes and / or T-cell epitopes are prepared, expressed individually and formulated as a mixture. In some embodiments, the sequences of the B-cell epitopes and / or T-cell epitopes are operatively linked in the defined sequence order, but in other embodiments, the sequences may be operatively linked in other order or combination.

[0215] For example, in some embodiments, the fusion proteins contain a C-terminal 6×His tag for purification, and are expressed byE. coli using pET-22B (+) expression vector, but other tag sequences (such as glutathione S-transferase and FLAG tag (DYKDDDDK) ) , other host organisms (such as yeast cells, insect cells and mammalian cells) and other expression vectors or systems may be used. In some embodiments, the recombinant proteins do not contain His tag. In some embodiments, the recombinant proteins are chemically synthesized.Example 2: Prophylactic anti-cancer study of CLDN6 T-cell epitope vaccines in syngeneic MC38-hCLDN6 (C) mouse tumorigenesis models.

[0216] Mouse cancer cell lines disclosed herewith included CLDN6-humanized MC38 cell lines from two different sources. The first cell line, as described in Example 1, was established and validated for hCLDN6 cell surface expression by KYinno Biotechnology Co., Ltd (Beijing, China) for an anticancer study in C57BL / 6 mice as part of a contracted service and is referred to as MC38-hCLDN6 (K) . The second cell line, as used in studies of Examples 2 and 4, was purchased from Nanjing Cobioer Biosciences Co., Ltd. (Nanjing, China) and is referred to as MC38-hCLDN6 (C) . Expression of hCLDN6 in MC38-hCLDN6 (C) cells have been confirmed using cell surface staining with Human Claudin-6 Alexa 488-conjugated Antibody (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) followed by flow cytometry analysis.

[0217] The cells were routinely maintained in RPMI medium supplemented with 10%fetal bovine serum, 2 mM L-glutamine, and 100 U / ml of Penicillin-Streptomycin in a 37℃and 5%CO2 tissue culture incubator (all reagents from GIBCO / Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) . In examples where the cell lines were established using lentivirus with a puromycin selection marker, the medium was also supplemented with 2.0 μg / ml puromycin (Sigma-aldrich / Merck KGaA, Burlington, MA, USA) . For mouse inoculation, cells were trypsinized and followed by washing 3 times with PBS and then counted for cell numbers. For the inoculation, cells were diluted to a density of 1×106 / 100 μl / mouse. In some examples, the cells were used within 10 passages.

[0218] In this example, the prophylactic study of Example 1 was repeated with a CLDN6-humanized mouse colon cancer cell line obtained from a different source. This line was purchased from Nanjing Cobioer Biosciences and is referred to as MC38-hCLDN6 (C) throughout this example. As in the prophylactic anti-cancer experiment described previously in Example 1, C57BL / 6 mice were vaccinated once a week for 6 times with either CLDN6-B+T or CLDN6-T (n=10 per group) and then subcutaneously inoculated with MC38-hCLDN6 (C) cells (1×106 cells per injection per mouse) one day after the last vaccination. Mice receiving PBS (n=5) or adjuvant only (n=10) were used as negative controls.

[0219] The schedule of vaccination and other procedures is illustrated in FIG. 6A. Mouse body weights showed normal growth, suggesting that the vaccines were well tolerated (FIG. 6B) . The tumor growth was recorded twice per week by measuring the width and length of the tumor. The averages of volumes of each group (mean±SE) were plotted in FIG. 6C, and the individual tumors in each group are plotted in FIGS. 6D-6G. This study was terminated on Day 28 post tumor cell inoculation because some tumors in the control groups approached 10%of the animal body weight. In contrast, tumor growth was significantly inhibited in mice vaccinated with either CLDN6-B+T or CLDN6-T (FIGS. 6C-6G) . Notably, only 1 of 10 mice in the CLDN6-B+T group remained tumor-free. Compared with the adjuvant-only control, tumor growth inhibition was confirmed in the final tumor with a rate of 72.6%by CLDN6-B+T (indicated by asterisk *; p-value=0.0275; one-way ANOVA) and 73.2%by CLDN6-T (indicated by double asterisks *; p-value=0.0262; one-way ANOVA) (FIGS. 6H-6I) . Again, the comparable inhibition rates observed with CLDN6-B+T and CLDN6-T vaccines indicate that B-cell epitopes in CLDN6-B+T did not contribute to the anti-cancer activity.Example 3: IFNγ ELISpot assay using the splenocytes collected from the mice bearing MC38-hCLDN6 (C) tumors in the prophylactic anti-cancer study

[0220] To assess the cellular immune response induced by CLDN6 vaccines in the prophylactic anti-cancer study using MC38-hCLDN6 (C) cells, splenocytes collected from two mice randomly selected from each group at the endpoint of Example 2 were analyzed using an IFNγ ELISpot assay. The splenocytes were challenged with a mixture of T-cell epitope peptides. Samples treated with stimulating peptides were duplicated. The ELISpot plate was scanned and quantified using the Mabtech IRIS 2 ELISpot reader.

[0221] In the control mice, splenocytes showed a modest number of positive spots (FIGS. 7A-7B) , which was higher than the background observed in the adjuvant only controls in the previous immunogenicity study (FIGS. 4C-4D) . This elevated background is likely to be caused by hCLDN6 expressed in the inoculated MC38-hCLDN6 (C) tumors. In contrast, splenocytes from vaccinated mice exhibited substantially higher spot numbers (FIGS. 7A-7B) , demonstrating that CLDN6 vaccines effectively induced a robust cellular immune response.

[0222] Together, two prophylactic studies of Examples 1 and 2, using MC38-hCLDN6 cells from different sources, demonstrated robust tumor growth inhibitory activity of CLDN6-B+T and CLDN6-T vaccines. The present example demonstrated that CLDN6 vaccines that contain T-epitopes effectively inhibited the growth of CLDN6+ cancer cells in mice.Example 4: Therapeutic anti-cancer study of CLDN6 vaccine containing T2 and T4 peptides in the MC38-hCLDN6 (C) mouse colon cancer model in C57BL / 6 mice.

[0223] To assess if the strongest immunogenic fragments, T2 and T4, possess sufficient activity to suppress tumor growth, a therapeutic study was conducted to evaluate the efficacy of vaccine containing T2 and T4. In this study, MC38-hCLDN6 (C) cells were inoculated in two groups of C57BL / 6 mice subcutaneously (3×106 cells / injection / mouse; n=13 / group) . Mice were vaccinated with 4 doses of CLDN6 vaccine containing T2-1 (the T2 peptide exhibiting the strongest immunogenic activity) and T4 (80 ug / injection / mouse) on day 1, 4, 8, and 15 post-inoculation (the schedules and procedures are illustrated in FIG. 8A) . Mice that received adjuvant only were used as negative controls.

[0224] Tumor growth was recorded by measuring the length and width. The study was concluded on day 27 post-inoculation because some tumors were over 10%of body weight. Throughout the study, mice showed normal growth, indicating that the CLDN6 peptide vaccine was well tolerated (FIG. 8B) . According to tumor growth, CLDN6 vaccine containing T2-1 and T4 significantly suppressed the growth of MC38-hCLDN6 (C) tumors (FIGS. 8C-8E) . In the T2-1 / T4-vaccinated group, 7 of 13 mice (53.8%) achieved complete tumor regression by the study endpoint (FIGS. 8F-8G) . Analysis of final tumor weights revealed that the CLDN6 peptide vaccine induced 96.3%tumor growth inhibition (p-value<0.0001; Student’s t-test) . Collectively, these results demonstrated a strong therapeutic efficacy of the CLDN6 T2-1 / T4 peptide vaccine in this syngeneic tumor model. Example 5: Summary of results and conclusion

[0225] In some of the examples above, recombinant proteins were designed and produced as vaccine antigens: CLDN6-B+T, which incorporates multiple predicted human B-and T-cell epitopes, and CLDN6-T, which contains only T-cell epitopes, as vaccine antigens. Both recombinant proteins were fused with an immune enhancer, the transmembrane domain of diphtheria toxin (DTT) . To evaluate the immunogenicity, both wildtype and MHC-I / HLA*A02: 01-humanized C57BL / 6 mice were immunized with these vaccines formulated with CpG oligonucleotide (ODN) as an adjuvant. Splenocytes harvested from vaccinated mice were analyzed using IFNγ ELISpot assay, revealing robust IFNγ release activity upon stimulation with T-cell epitope peptides. This demonstrated that MHC peptides were efficiently generated and presented by both mouse MHC and Human HLA*A02: 01 complex to induce cellular immune response in these mouse models, indicating that these vaccines can induce CLDN6-specific immune cytotoxicity to destroy CLDN6+ cancer cells. Tumor growth in C57BL / 6 wildtype mice inoculated with CLDN6-humanized MC38 colon cancer cells (MC38-hCLDN6) from two different sources have been assessed in the examples, following vaccination with either CLDN6-B+T or CLDN6-T. In the mice immunized with either vaccine, tumor growth was significantly suppressed. Moreover, a therapeutic study in which MC38-hCLDN6 cells were inoculated in mice and then treated with the vaccines consisting of two most active T-cell epitope peptides demonstrated robust efficacy. Collectively, recombinant CLDN6 protein vaccines induced robust cellular immune response and demonstrated robust activity suppressing the growth of CLDN6+ tumors in mouse models, supporting their promising potential for the treatment of CLDN6+ cancers in humans.

[0226] In some of the examples above, , 2 novel recombinant vaccine proteins have been designed and produced by incorporating of predicted human B-and / or T-cell epitopes of CLDN6 fused with an immune enhancer, the transmembrane domain of diphtheria toxin (DTT) . Additionally, two control proteins which consist of only B-cell epitopes (CLDN6-B) or extracellular loops (CLDN6-E) fused with DTT were also produced. To evaluate the immunogenicity, MHC-I / HLA*A02: 01-humanized C57BL / 6 mice were immunized with these vaccines formulated with CpG oligonucleotide (ODN) as an adjuvant. Splenocytes harvested from vaccinated mice were analyzed using IFNγ ELISpot assay, revealing robust IFNγ release upon stimulation with T-cell epitope peptides. This demonstrated that human MHC-I peptides were efficiently generated and presented by human HLA*A02: 01 complex to induce cellular immune response. IFNγ ELISpot assay using splenocytes collected from the wildtype of C57BL / 6 mice vaccinated with CLDN6-B+T, CLDN6-B, CLDN6-T, or CLDN6-E demonstrated that cellular immune response was robustly induced by vaccines using recombinant proteins containing T-cell epitopes, CLDN6-B+T and CLDN6-T, but not those without T-cell epitopes, CLDN6-B and CLDN6-E. Using CLDN6-humanized MC38 colon cancer cells (MC38-hCLDN6) from two different sources, prophylactic studies have been conducted: after C57BL / 6 mice were vaccinated weekly for 7 times with adjuvant only, CLDN6-B+T, or CLDN6-T, MC38-hCLDN6 cells were inoculated in the mice. Tumor growth was significantly inhibited in the mice vaccinated either CLDN6-B+T or CLDN6-T. Moreover, the following therapeutic study has been conducted: the mice were inoculated with MC38-hCLDN6 cells and then treated with the vaccines. Both CLDN6-B+T and CLDN6-T vaccines demonstrated robust therapeutic efficacy.

[0227] In some of the examples above, the efficacy of a CLDN6 vaccine containing T2-1 and T4 peptides was evaluated in a therapeutic study of syngeneic mouse colon cancer model using MC38-hCLDN6 (C) cells. Mice inoculated with MC38-hCLDN6 (C) cells were treated with the vaccine on days 1, 4, 8, and 15 post-inoculation. The results showed that the CLDN6 vaccine significantly suppressed the growth of MC38-hCLDN6 (C) tumors, with 7 of 13 mice achieving complete tumor regression by the study endpoint, and induced 96.3%tumor growth inhibition, demonstrating a strong therapeutic efficacy of the CLDN6 T2-1 / T4 peptide vaccine in this syngeneic tumor model.

Claims

1.A recombinant protein, comprising an amino acid sequence encoding at least one fragment of CLDN6, wherein the at least one fragment of CLDN6 comprises: at least one T-cell specific epitope, or at least one fragment thereof, or at least one variant sequence thereof.2.The recombinant protein of claim 1, wherein the at least one T-cell specific epitope comprises:(c) an amino acid sequence spanning amino acid residues 65-88;(d) an amino acid sequence spanning amino acid residues 111-142 or a fragment thereof;(e) an amino acid sequence spanning amino acid residues 141-166; and / or(f) an amino acid sequence spanning amino acid residues 195-212, of the CLDN6 protein, or a variant sequence thereof.3.The recombinant protein of claim 2, wherein (d) the amino acid sequence spanning amino acid residues 111-142 or a fragment thereof comprises: amino acid residues 117-133, amino acid residues 111-126 or amino acid residues 125-142 of the CLDN6 protein, or a variant sequence thereof.4.The recombinant protein of any one of the preceding claims, wherein the at least one T-cell specific epitope comprises an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO. : 3, SEQ ID NO. : 4, SEQ ID NO. : 5, SEQ ID NO. : 6, SEQ ID NO. : 12, SEQ ID NO. : 13, SEQ ID NO. : 14, and / or any combination thereof.5.The recombinant protein of any one of the preceding claims, wherein the at least one T-cell specific epitope comprises an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO. : 12 and / or SEQ ID NO. : 6.6.The recombinant protein of claim 1, wherein the at least one fragment of CLDN6 further comprises: at least one B-cell specific epitope or at least one fragment thereof, or at least one variant sequence thereof.7.The recombinant protein of claim 6, wherein the at least one B-cell specific epitope comprises:(a) an amino acid sequence spanning amino acid residues 40-68; and / or(b) an amino acid sequence spanning amino acid residues 145-160, of CLDN6 protein, or a variant sequence thereof.8.The recombinant protein of any one of claims 1, 6 and 7, wherein the at least one B-cell specific epitope comprises an amino acid sequence SEQ ID NO. : 1 and / or SEQ ID NO. : 2.9.The recombinant protein of any one of claims 2-8, wherein the CLDN6 protein comprises amino acid sequence of NP_067018.2.10.The recombinant protein of any one of the preceding claims, further comprising an amino acid sequence comprising at least one immune enhancer.11.The recombinant protein of claim 10, wherein the at least one immune enhancer is or comprises all or a fragment of diphtheria toxin (DTT) .12.The recombinant protein of claim 11, wherein the diphtheria toxin (DTT) comprises an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO. : 9.13.The recombinant protein of any of the preceding claims, wherein the at least one B-cell specific epitope, and / or the at least one T-cell specific epitope, if present, are operatively linked to each other by at least one linker, wherein an individual linker comprises an amino acid sequence of GPLS, AAY, EAAAK, KK, a flexible glycine-rich motif, and a combination thereof.14.The recombinant protein of claim 13, wherein the flexible glycine-rich motif is or comprises an amino acid sequence of GPGPG, GGGGS, or multiple repeats of GGGGS.15.A recombinant protein of any one of the preceding claims, comprising an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO. : 10, or SEQ ID NO. : 11, or a fragment thereof or a variant sequence thereof.16.A recombinant protein of any one of the preceding claims, comprising amino acid sequences as shown in:SEQ ID NO. : 1, SEQ ID NO. : 2, SEQ ID NO. : 3, SEQ ID NO. : 4, SEQ ID NO. : 5, SEQ ID NO. : 6, and SEQ ID NO. : 9;SEQ ID NO. : 3, SEQ ID NO. : 4, SEQ ID NO. : 5, SEQ ID NO. : 6, and SEQ ID NO. : 9; or SEQ ID NO. : 12 and SEQ ID NO. : 6.17.A recombinant nucleic acid system, comprising at least one nucleic acid sequence encoding the recombinant protein of any of claims 1-16, or any combination thereof.18.The recombinant nucleic acid system of claim 17, comprising a first nucleic acid sequence encoding a first recombinant protein comprising amino acid sequence as shown in SEQ ID NO. : 12, and a second nucleic acid sequence encoding a second recombinant protein comprising amino acid sequence as shown in SEQ ID NO. : 6.19.The recombinant nucleic acid system of claim 17, further comprises at least one nucleic acid sequence encoding a nucleotide sequence shown in SEQ ID NO. : 15, or SEQ ID NO. : 16, or a fragment thereof.20.An RNA vaccine, wherein the RNA vaccine comprises an open reading frame comprising a nucleic sequence encoding the recombinant protein of any of claims 1-16; or a nucleic sequence of the recombinant nucleic acid system of any one of claims 17-19.21.A pharmaceutical composition, comprising:the recombinant protein of any one of claims 1-16, or any combination thereof;the recombinant protein expressed by the recombinant nucleic acid system of any one of claims 17-19, or any combination thereof; and / orthe RNA vaccine of claim 20, andoptionally, an adjuvant.22.The pharmaceutical composition of claim 21, comprising:a first recombinant protein comprising an amino acid sequence shown in SEQ ID NO. : 12; anda second recombinant protein comprising an amino acid sequence shown in SEQ ID NO. : 6.23.A vaccine, comprising any one of the recombinant proteins as claimed in any one of claims 1-16, the recombinant protein expressed by the recombinant nucleic acid system of any one of claims 17-19, the RNA vaccine of claim 20, or the pharmaceutical composition as claimed in claims 21-22.24.A method of preventing or treating cancer in a subject in need thereof, comprising the step of: administering to the subject an effective amount of the recombinant protein of any one of claims 1-16, the recombinant protein expressed by the recombinant nucleic acid system of any one of claims 17-19, the RNA vaccine of claim 20, or the pharmaceutical composition as claimed in claims 21-22, or the vaccine of claim 23.25.Use of the recombinant protein of any one of claims 1-16, the recombinant protein expressed by the recombinant nucleic acid system of any one of claims 17-19, the RNA vaccine of claim 20, or the pharmaceutical composition as claimed in claims 21-22, or the vaccine of claim 23 for the manufacture of a medicament in preventing or treating cancer.26.The recombinant protein of any one of claims 1-16, the recombinant protein expressed by the recombinant nucleic acid system of any one of claims 17-19, the RNA vaccine of claim 20, or the pharmaceutical composition as claimed in claims 21-22, or the vaccine of claim 23 for use in preventing or treating cancer.

Images