T cell engager antibody

Abstract

Provided is a T cell engager antibody, comprising a first polypeptide and a second polypeptide, wherein said first polypeptide comprises a single chain variable fragment (scFv), and one chain of a Fab, wherein said Fab can bind with the tumor surface antigen expressing on the tumor cell; wherein said second polypeptide comprises a first masking domain (Ml) that can reduce the binding of said scFv to said effector molecule expressing on the T cell; a half-life extension domain that can extend the half-life of said T cell engager proteinaceous dimer; and another chain of a Fab.

Description

T CELL ENGAGER ANTIBODYFIELD OF THE INVENTION

[0001] The present application relates to the field of biomedicine, and specifically relates to a cell engager proteinaceous dimer and use thereof.BACKGROUND OF THE INVENTION

[0002] Two such issued patents are U.S. Patent Nos. 11,406,710 and 11,744,893 issued to May, entitled “Constrained conditionally activated binding proteins” . These applicants are said to teach Conditional Bispecific Redirected Activation constructs, or COBRAs, that are administered in an active pro-drug format. Upon exposure to tumor proteases, the constructs are cleaved and activated, such that they can bind both tumor target antigens (TTAs) as well as CD3, thus recruiting T cells expressing CD3 to the tumor, resulting in treatment.

[0003] Two such applications are International Publication WO2022 / 240637, filed by Campbell, entitled “Compositions and methods related to tumor activated antibodies targeting EGFR and effector cell antigens” and WO2022 / 046658, entitled “Antibodies targeting TROP2 and CD3 and uses thereof” . These applications are said to teach multi-specific antibodies that selectively bind to EGFR and effector cell antigens such as CD3 or that selectively bind to TROP2 and CD3, pharmaceutical compositions thereof, as well as nucleic acids, and methods for making and discovering the same.

[0004] Another two such applications are US2021 / 0292421 and WO2019 / 222283 filed by Lin, entitled “Binding moiety for conditional activation of immunoglobulin molecules” . These applications are said to teach binding moieties that comprise non-CDR loops for masking the binding of a binding molecule to its target and CDRs for binding bulk serum proteins. These conditionally active target binding proteins are provided as pharmaceutical compositions comprising the binding proteins disclosed herein and methods of using such formulations are further provided.

[0005] Despite these advances, a need remains for novel constructs that specifically target tumor cells by activating effector T cells at the tumor site, without the negative side effects of systemically targeting non-tumor cells, non-specifically.SUMMARY OF THE INVENTION

[0006] The present application provides a T cell engager proteinaceous dimer comprising a first polypeptide and a second polypeptide, wherein: said first polypeptide comprises a single chain variable fragment (scFv) that can bind to an effector molecule expressing on the T cell, and one chain of a Fab, wherein said Fab can bind with the tumor surface antigen expressing on the tumor cell; wherein said second polypeptide comprises a first masking domain (M1) that can reduce the binding of said scFv to said effector molecule expressing on the T cell; a half-life extension domain that can extend the half-life of said T cell engager proteinaceous dimer; and another chain of a Fab, wherein said Fab can bind with the tumor surface antigen expressing on the tumor cell; wherein said one chain of a Fab of said first polypeptide and said another chain of a Fab of said second polypeptide can form an intact Fab.

[0007] In some embodiments, the T cell engager proteinaceous dimer described in the present application, when compared with the TCE construct in which M1 directly fused to the scFv, exhibits equivalent attenuated binding efficacy of the scFv to the effector molecules expressed on the T cell. At the same time, the T cell engager proteinaceous dimer described in the present application exhibits one or more of the following enhanced properties:

[0008] (1) In the peripheral circulation / normal tissue microenvironment, the T cell engager proteinaceous dimer described in the present application exhibits weaker binding of the Fab fragment to antigen expressing normal tissue cells; a reduced ability to kill antigen expressing cells; and / or diminished T cell activation and IFNγ secretion; and / or,

[0009] (2) upon exposure to the tumor microenvironment, the T cell engager proteinaceous dimer described in the present application is cleaved by tumor‐specific proteases to remove the masking moiety, thereby exhibiting an enhanced ability to reduce the tumor volume, and / or increased T cell activation and tumor cell cytotoxicity.

[0010] In one aspect, the present application provides a T cell engager proteinaceous dimer comprising a first polypeptide and a second polypeptide, wherein: said first polypeptide comprises a single chain variable fragment (scFv) that can bind to an effector molecule expressing on the T cell, and one chain of a Fab, wherein said Fab can bind with the tumor surface antigen expressing on the tumor cell; wherein said second polypeptide comprises a first masking domain (M1) that can reduce the binding of said scFv to said effector molecule expressing on the T cell; a half-life extension domain that can extend the half-life of said T cell engager proteinaceous dimer; and another chain of a Fab, wherein said Fab can bind with the tumor surface antigen expressing on the tumor cell; wherein said one chain of a Fab of said first polypeptide and said another chain of a Fab of said second polypeptide can form an intact Fab.

[0011] In one aspect, the present application provides a T cell engager proteinaceous dimer comprises a first polypeptide and a second polypeptide, wherein: said first polypeptide comprises a single chain variable fragment (scFv) that can bind to an effector molecule expressing on the immune cell, and one chain of a Fab, wherein said Fab can bind with the tumor surface antigen expressing on the tumor cell; wherein said second polypeptide comprises a first masking domain (M1) that can reduce the binding of said scFv to said effector molecule expressing on the T cell; a half-life extension domain that can extend the half-life of said T cell engager proteinaceous dimer; and another chain of a Fab, wherein said Fab can bind with the tumor surface antigen expressing on the tumor cell; wherein said one chain of a Fab of said first polypeptide and said another chain of a Fab of said second polypeptide can form an intact Fab.

[0012] In some embodiment, said scFv comprises a heavy variable domain (VH) and a light variable domain (VL) ; and, said one chain of a Fab of said first polypeptide is a heavy chain, and said another chain of a Fab of said second polypeptide is a light chain; or, said one chain of a Fab of said first polypeptide is a light chain, and said another chain of a Fab of said second polypeptide is a heavy chain.

[0013] In some embodiment, said first polypeptide comprises, from N terminal to C terminal: said scFv and said one chain of a Fab; or, from N terminal to C terminal: said one chain of a Fab and said scFv.

[0014] In some embodiment, said second polypeptide comprises, from N terminal to C terminal: said first masking domain (M1) , said half-life extension domain and said another chain of a Fab.

[0015] In some embodiment, wherein said first polypeptide comprises, from N terminal to C terminal: said scFv and said one chain of a Fab; and, wherein said second polypeptide comprises, from N terminal to C terminal: said first masking domain (M1) , said half-life extension domain and said another chain of a Fab.

[0016] In some embodiment, wherein said first polypeptide comprises, from N terminal to C terminal: said one chain of a Fab and said scFv; and, wherein said second polypeptide comprises, from N terminal to C terminal: said first masking domain (M1) , said half-life extension domain and said another chain of a Fab.

[0017] In some embodiment, wherein said second polypeptide further comprises a second masking domain (M2) that can reduce the binding of said Fab to the tumor surface antigen.

[0018] In some embodiment, wherein in said second polypeptide, the C terminal of said second masking domain (M2) is directly or indirectly linked to the N terminal of said another chain of a Fab.

[0019] In some embodiment, wherein said second polypeptide comprises, from N terminal to C terminal: said first masking domain (M1) , said half-life extension domain, said second masking domain (M2) and said another chain of a Fab.

[0020] In some embodiment, wherein said first polypeptide comprises, from N terminal to C terminal: said scFv and said one chain of a Fab; and, wherein said second polypeptide comprises, from N terminal to C terminal: said first masking domain (M1) , said half-life extension domain, said second masking domain (M2) and said another chain of a Fab.

[0021] In some embodiment, wherein said first polypeptide comprises, from N terminal to C terminal: said one chain of a Fab and said scFv; and, wherein said second polypeptide comprises, from N terminal to C terminal: said first masking domain (M1) , said half-life extension domain, said second masking domain (M2) and said another chain of a Fab.

[0022] In some embodiment, wherein in said first polypeptide, from N terminal to C terminal: the C terminal of said VH of scFv is directly or indirectly linked to the N terminal of said one chain of Fab; or, from N terminal to C terminal: the C terminal of said VL of scFv is directly or indirectly linked to the N terminal of said one chain of Fab.

[0023] In some embodiment, wherein in said first polypeptide, from N terminal to C terminal: the C terminal of said scFv is directly or indirectly linked to the N terminal of said heavy chain of Fab; or, from N terminal to C terminal: the C terminal of said scFv is directly or indirectly linked to the N terminal of said light chain of Fab.

[0024] In some embodiment, wherein in said first polypeptide, from N terminal to C terminal: a) the C terminal of said VH of scFv is directly or indirectly linked to the N terminal of said heavy chain of Fab ; or, b) the C terminal of said VH of scFv is directly or indirectly linked to the N terminal of light chain of said Fab; or, c) the C terminal of said VL of scFv is directly or indirectly linked to the N terminal of heavy chain of said Fab; or, d) the C terminal of said VL of scFv is directly or indirectly linked to the N terminal of light chain of said Fab.

[0025] In some embodiment, wherein said first polypeptide comprises, from N terminal to C terminal: VL of scFv-VH of scFv -heavy chain of Fab; and, wherein said second polypeptide comprises, from N terminal to C terminal: M1-half-life extension domain-light chain of Fab, or, M1-half-life extension domain-M2-light chain of Fab.

[0026] In some embodiment, wherein said first polypeptide comprises, from N terminal to C terminal: VL of scFv-VH of scFv-light chain of Fab; and, wherein said second polypeptide comprises, from N terminal to C terminal: M1-half-life extension domain-heavy chain of Fab, or M1-half-life extension domain-M2-heavy chain of Fab.

[0027] In some embodiment, wherein said first polypeptide comprises, from N terminal to C terminal: VH of scFv-VL of scFv-heavy chain of Fab; and, wherein said second polypeptide comprises, from N terminal to C terminal: M1-half-life extension domain-light chain of Fab, or, M1-half-life extension domain-M2-light chain of Fab.

[0028] In some embodiment, wherein the first polypeptide comprises, from N terminal to C terminal: VH of scFv-VL of scFv-light chain of Fab; and, wherein said second polypeptide comprises, from N terminal to C terminal: M1-half-life extension domain-heavy chain of Fab, or, M1-half-life extension domain-M2-heavy chain of Fab.

[0029] In some embodiment, wherein the half-life extension domain is linked to M2 or Fab via a cleavable linker.

[0030] In some embodiment, wherein the cleavable linker can be activated by protease or proteases in the tumor environment, such that the scFv can bind the immune cell effector molecule and the Fab can bind with the tumor surface antigen.

[0031] In some embodiment, wherein said cleavable linker independently comprises one cleavage site for the same protease or for different proteases, or two or more cleavage sites that are capable of being cleaved by the same or different proteases.

[0032] In some embodiment, where the protease or proteases is a tumor-associated protease selected from the group consisting of matrix metalloproteinase-1 (MMP-1) , MMP-2, MMP-3, MMP-7, MMP-9, MMP-10, MMP-14, urokinase-type plasminogen activator (uPa) , matriptase, legumain, kallikrein-related peptidase-3, human neutrophil elastase, proteinase 3 (Pr3) , cathepsin B, cathepsin G, cathepsin K and cathepsin L.

[0033] In some embodiment, wherein said half-life extension domain comprises human serum albumin (HSA) , an antigen-binding polypeptide, or an immunoglobulin Fc.

[0034] In some embodiment, wherein said half-life extension domain comprises an antigen-binding polypeptide.

[0035] In some embodiment, wherein said antigen-binding polypeptide binds HSA.

[0036] In some embodiment, wherein said antigen-binding polypeptide comprises an antibody.

[0037] In some embodiment, wherein said antibody comprises a single domain antibody (VHH) , an scFv, or a full-length antibody.

[0038] In some embodiment, wherein said antibody comprises a single domain antibody (VHH) , wherein said VHH binds HSA (HSA VHH) .

[0039] In some embodiment, wherein in said second polypeptide, the C terminal of said M1 is linked to the N terminal of said half-life extension domain via a linker L1.

[0040] In some embodiment, wherein in said second polypeptide, the C terminal of said half-life extension domain is linked to the N terminal of said M2 via a linker L2.

[0041] In some embodiment, wherein in said first polypeptide, the C terminal of said scFv is linked to the N terminal of said Fab via a linker L3.

[0042] In some embodiment, wherein said first polypeptide comprises, from N terminal to C terminal:

[0043] (a) VL of scFv-VH of scFv-L3-heavy chain of Fab, or,

[0044] (b) VL of scFv-VH of scFv-L3-light chain of Fab, or,

[0045] (c) VH of scFv-VL of scFv-L3-heavy chain of Fab, or,

[0046] (d) VH of scFv-VL of scFv-L3-light chain of Fab;

[0047] and, wherein said second polypeptide comprises, from N terminal to C terminal:

[0048] (e) M1-linker L1-HSA VHH-linker L2-heavy chain of Fab, or,

[0049] (f) M1-linker L1-HSA VHH-linker L2-light chain of Fab, or,

[0050] (g) M1-linker L1-HSA VHH-linker L2-M2-cleavable linker-heavy chain of Fab, or,

[0051] (h) M1-linker L1-HSA VHH-linker L2-M2-cleavable linker-light chain of Fab.

[0052] In some embodiment, wherein said first polypeptide comprises, from N terminal to C terminal: VL of scFv-VH of scFv-L3-heavy chain of Fab; and, wherein said second polypeptide comprises, from N terminal to C terminal: M1-linker L1-HSA VHH-cleavable linker-light chain of Fab; or, from N terminal to C terminal: M1-linker L1-HSA VHH-linker L2-M2-cleavable linker-light chain of Fab.

[0053] In some embodiment, wherein said first polypeptide comprises, from N terminal to C terminal: VL of scFv-VH of scFv-L3-light chain of Fab; and, wherein said second polypeptide comprises, from N terminal to C terminal: M1-linker L1-HSA VHH-cleavable linker-heavy chain of Fab; or, from N terminal to C terminal: M1-linker L1-HSA VHH-linker L2-M2-cleavable linker-heavy chain of Fab.

[0054] In some embodiment, wherein said first polypeptide comprises, from N terminal to C terminal: VH of scFv-VL of scFv-L3-heavy chain of Fab; and, wherein said second polypeptide comprises, from N terminal to C terminal: M1-linker L1-HSA VHH-cleavable linker-light chain of Fab; or, from N terminal to C terminal: M1-linker L1-HSA VHH-linker L2-M2-cleavable linker-light chain of Fab.

[0055] In some embodiment, wherein said first polypeptide comprises, from N terminal to C terminal: VH of scFv-VL of scFv-L3-light chain of Fab; and, wherein said second polypeptide comprises, from N terminal to C terminal: M1-linker L1-HSA VHH-cleavable linker-heavy chain of Fab; or, from N terminal to C terminal: M1-linker L1-HSA VHH-linker L2-M2-cleavable linker-heavy chain of Fab.

[0056] In some embodiment, wherein said first polypeptide comprises, from N terminal to C terminal: VL of scFv-VH of scFv-L3-heavy chain of Fab; and, wherein said second polypeptide comprises, from N terminal to C terminal: M1-linker L1-HSA VHH-linker L2-M2-cleavable linker-light chain of Fab.

[0057] In some embodiment, wherein said first polypeptide is, from N terminal to C terminal: VL of scFv-VH of scFv-L3-heavy chain of Fab; and, wherein said second polypeptide is, from N terminal to C terminal: M1-linker L1-HSA VHH-linker L2-M2-cleavable linker-light chain of Fab.

[0058] In some embodiment, wherein said first polypeptide comprises from N terminal to C terminal: VH of scFv-VL of scFv-L3-light chain of Fab; and, wherein said second polypeptide comprises, from N terminal to C terminal: M1-linker L1-HSA VHH-cleavable linker-heavy chain of Fab.

[0059] In some embodiment, wherein said first polypeptide is from N terminal to C terminal: VH of scFv-VL of scFv-L3-light chain of Fab; and, wherein said second polypeptide is, from N terminal to C terminal: M1-linker L1-HSA VHH-cleavable linker-heavy chain of Fab.

[0060] In some embodiment, wherein said first polypeptide comprises, from N terminal to C terminal: VH of scFv-VL of scFv-L3-heavy chain of Fab; and, wherein said second polypeptide comprises, from N terminal to C terminal: M1-linker L1-HSA VHH-cleavable linker-light chain of Fab.

[0061] In some embodiment, wherein said first polypeptide is, from N terminal to C terminal: VH of scFv-VL of scFv-L3-heavy chain of Fab; and, wherein said second polypeptide is, from N terminal to C terminal: M1-linker L1-HSA VHH-cleavable linker-light chain of Fab.

[0062] In some embodiment, wherein said M1 comprises an amino acid sequence with at least 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, or 100%sequence identity to any one of SEQ ID NOS: 13 to 19.

[0063] In some embodiment, wherein said M1 comprises an amino acid sequence with at least 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, or 100%sequence identity to SEQ ID NO: 15.

[0064] In some embodiment, wherein said M1 comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 15.

[0065] In some embodiment, wherein said M2 comprises an amino acid sequence with at least 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, or 100%sequence identity to any one of SEQ ID NOS: 20 to 32.

[0066] In some embodiment, wherein said M2 an amino acid sequence with at least 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, or 100%sequence identity to SEQ ID NO: 20.

[0067] In some embodiment, wherein said M2 comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 20.

[0068] In some embodiment, wherein said HSA VHH comprises an amino acid sequence with at least 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, or 100%sequence identity to SEQ ID NOS: 471.

[0069] In some embodiment, wherein said HSA VHH comprises an amino acid sequence with at least 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, or 100%sequence identity to SEQ ID NO: 471.

[0070] In some embodiment, wherein said HSA VHH comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 471.

[0071] In some embodiment, wherein said cleavable linker comprises an amino acid sequence with at least 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, or 100%sequence identity to any one of SEQ ID NOS: 103-153, 190-337 and 458-466.

[0072] In some embodiment, wherein said cleavable linker comprises an amino acid sequence with at least 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, or 100%sequence identity to SEQ ID NO:461.

[0073] In some embodiment, wherein said cleavable linker comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 461.

[0074] In some embodiment, wherein said linker L1 comprises an amino acid sequence with at least 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, or 100%sequence identity to any one of SEQ ID NOS: 154-189, and 467-470.

[0075] In some embodiment, wherein said linker L1 comprises an amino acid sequence with at least 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, or 100%sequence identity to SEQ ID NO: 468.

[0076] In some embodiment, wherein said linker L1 comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 468.

[0077] In some embodiment, wherein said linker L 2 comprises an amino acid sequence with at least 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, or 100%sequence identity to ay one of SEQ ID NOS: 154-189, and 467-470.

[0078] In some embodiment, wherein said linker L2 comprises an amino acid sequence with at least 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, or 100%sequence identity to SEQ ID NO: 467.

[0079] In some embodiment, wherein said linker L2 comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 467.

[0080] In some embodiment, wherein said linker L 3 comprises an amino acid sequence with at least 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, or 100%sequence identity to any one of SEQ ID NOS: 154-189, and 467-470

[0081] In some embodiment, wherein said linker L3 comprises an amino acid sequence with at least 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, or 100%sequence identity to SEQ ID NO: 154.

[0082] In some embodiment, wherein said linker L3 comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 154.

[0083] In some embodiment, wherein said M1 comprises an amino acid sequence with at least 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, or 100%sequence identity to SEQ ID NO: 15 ; and, wherein said M2 comprises an amino acid sequence with at least 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, or 100%sequence identity to SEQ ID NO: 20; and, wherein said HSA VHH comprises an amino acid sequence with at least 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, or 100%sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 471; and, wherein said cleavable linker comprises an amino acid sequence with at least 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, or 100%sequence identity to SEQ ID NO: 461; and, wherein said linker L1 comprises an amino acid sequence with at least 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, or 100%sequence identity to SEQ ID NO: 468; and, wherein said linker L2 comprises an amino acid sequence with at least 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, or 100%sequence identity to SEQ ID NO: 467; and, wherein said linker L3 comprises an amino acid sequence with at least 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, or 100%sequence identity to SEQ ID NO:154.

[0084] In some embodiment, wherein said M1 comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 15; and, wherein said M2 comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 20; and, wherein said HSA VHH comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 471; and, wherein said cleavable linker comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 461; and, wherein said linker L1 comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 468; and, wherein said linker L2 comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 467; and, wherein said linker L3 comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 154.

[0085] In some embodiment, wherein said effector molecule is CD3 or CD28.

[0086] In some embodiment, wherein said tumor surface antigen is EGFR, PSMA, or STEAP1.

[0087] In some embodiment, wherein said scFv binds CD3 (CD3-scFv) and said Fab binds EGFR (EGFR-Fab) .

[0088] In some embodiment, wherein said scFv binds CD3 (CD3-scFv) and said Fab binds PSMA (PSMA-Fab) .

[0089] In some embodiment, wherein said scFv binds CD3 (CD3-scFv) and said Fab binds STEAP1 (STEAP1-Fab) .

[0090] In some embodiment, wherein said first polypeptide comprises, from N terminal to C terminal: CD3-scFv, and, said one chain of said EGFR-Fab; and, wherein said second polypeptide comprises, from N terminal to C terminal: said M1, said HSA VHH, said M2, and said another chain of said EGFR-Fab.

[0091] In some embodiment, wherein said first polypeptide comprises, from N terminal to C terminal: said CD3-scFv, and, said one chain of said EGFR-Fab; and, wherein said second polypeptide comprises, from N terminal to C terminal: said M1, said HSA VHH, and said another chain of said EGFR-Fab.

[0092] In some embodiment, wherein said first polypeptide comprises, from N terminal to C terminal: VH of CD3-scFv-VL of CD3-scFv-heavy chain of EGFR-Fab; and, wherein said second polypeptide comprises, from N terminal to C terminal: M1-HSA VHH-M2-light chain of EGFR-Fab.

[0093] In some embodiment, wherein said first polypeptide comprises, from N terminal to C terminal: VH of CD3-scFV-VL of CD3-scFv-heavy chain of EGFR-Fab; and, wherein said second polypeptide comprises, from N terminal to C terminal: M1-HSA VHH-light chain of EGFR-Fab.

[0094] In some embodiment, wherein said first polypeptide comprises, from N terminal to C terminal: VH of CD3-scFV-VL of CD3-scFv-linker L3-heavy chain of EGFR-Fab; and, wherein said second polypeptide comprises, from N terminal to C terminal: M1-linker L1-HSA VHH-linker L2-M2-cleavable linker-light chain of EGFR-Fab.

[0095] In some embodiment, wherein said first polypeptide is, from N terminal to C terminal: VH of CD3-scFV-VL of CD3-scFv-linker L3-heavy chain of EGFR-Fab; and, wherein said second polypeptide is, from N terminal to C terminal: M1-linker L1-HSA VHH-linker L2-M2-cleavable linker-light chain of EGFR-Fab.

[0096] In some embodiment, wherein said first polypeptide comprises, from N terminal to C terminal: VH of CD3-scFV-VL of CD3-scFv-linker L3-heavy chain of EGFR-Fab; and, wherein said second polypeptide comprises, from N terminal to C terminal: M1-linker L1-HSA VHH-cleavable linker-light chain of EGFR-Fab.

[0097] In some embodiment, wherein said first polypeptide is, from N terminal to C terminal: VH of CD3-scFV-VL of CD3-scFv-linker L3-heavy chain of EGFR-Fab; and, wherein said second polypeptide is, from N terminal to C terminal: M1-linker L1-HSA VHH-cleavable linker-light chain of EGFR-Fab.

[0098] In some embodiment, wherein said VH of said CD3-scFv comprises complementarity determining regions (HC-CDRs) : HC-CDR1, HC-CDR2 and HC-CDR3; and, wherein said VL of said CD3-scFv comprises complementarity determining regions (LC-CDRs) : LC-CDR1, LC-CDR2 and LC-CDR3.

[0099] In some embodiment, wherein said HC-CDR1 of CD3-scFv comprises amino acid sequence of SEQ ID NO: 341, wherein said HC-CDR2 of CD3-scFv comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 342, wherein said HC-CDR3 of CD3-scFv comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 343, wherein said LC-CDR1 of CD3-scFv comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 350, wherein said LC-CDR2 of CD3-scFv comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 351, and wherein said LC-CDR3 of CD3-scFv comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 352.

[0100] In some embodiment, wherein said HC-CDR1 of CD3-scFv comprises amino acid sequence of SEQ ID NO: 359, wherein said HC-CDR2 of CD3-scFv comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 360, wherein said HC-CDR3 of CD3-scFv comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 361, wherein said LC-CDR1 of CD3-scFv comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 368, wherein said LC-CDR2 of CD3-scFv comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 369, and wherein said LC-CDR3 of CD3-scFv comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 370.

[0101] In some embodiment, wherein said HC-CDR1 of CD3-scFv comprises amino acid sequence of SEQ ID NO: 377, wherein said HC-CDR2 of CD3-scFv comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 378, wherein said HC-CDR3 of CD3-scFv comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 379, wherein said LC-CDR1 of CD3-scFv comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 386, wherein said LC-CDR2 of CD3-scFv comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 369, and wherein said LC-CDR3 of CD3-scFv comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 370.

[0102] In some embodiment, wherein said HC-CDR1 of CD3-scFv comprises amino acid sequence of SEQ ID NO: 395, wherein said HC-CDR2 of CD3-scFv comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 396, wherein said HC-CDR3 of CD3-scFv comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 397, wherein said LC-CDR1 of CD3-scFv comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 404, wherein said LC-CDR2 of CD3-scFv comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 405, and wherein said LC-CDR3 of CD3-scFv comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 406.

[0103] In some embodiment, wherein said heavy chain of said EGFR -Fab comprises complementarity determining regions (HC-CDRs) : HC-CDR1, HC-CDR2 and HC-CDR3; and, wherein said light chain of EGFR-Fab comprises complementarity determining regions (LC-CDRs) : LC-CDR1, LC-CDR2 and LC-CDR3.

[0104] In some embodiment, wherein said HC-CDR1 of EGFR-Fab comprises amino acid sequence of SEQ ID NO: 413, wherein said HC-CDR2 of EGFR-Fab comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 414, wherein said HC-CDR3 of EGFR-Fab comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO:415, wherein said LC-CDR1 of EGFR-Fab comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 422, wherein said LC-CDR2 of EGFR-Fab comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 423, and wherein said LC-CDR3 of EGFR-Fab comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 424;

[0105] In some embodiment, wherein said HC-CDR1 of EGFR-Fab comprises amino acid sequence of SEQ ID NO: 431, wherein said HC-CDR2 of EGFR-Fab comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 432, wherein said HC-CDR3 of EGFR-Fab comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO:433; wherein said LC-CDR1 of EGFR-Fab comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 440, wherein said LC-CDR2 of EGFR-Fab comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 441, and wherein said LC-CDR3 of EGFR-Fab comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 442.

[0106] In some embodiment, wherein said HC-CDR1 of said CD3-scFv comprises amino acid sequence of SEQ ID NO: 341, wherein said HC-CDR2 of said CD3-scFv comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 342, wherein said HC-CDR3 of said CD3-scFv comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 343; and wherein said LC-CDR1 of said CD3-scFv comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 350, wherein said LC-CDR2 of said CD3-scFv comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 351, and wherein said LC-CDR3 of said CD3-scFv comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 352; and, wherein said HC-CDR1 of said EGFR-Fab comprises amino acid sequence of SEQ ID NO: 413, wherein said HC-CDR2 of said EGFR-Fab comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 414, wherein said HC-CDR3 of said EGFR-Fab comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 415; wherein said LC-CDR1 of said EGFR-Fab comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 422, wherein said LC-CDR2 of said EGFR-Fab comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 423, and wherein said LC-CDR3 of said EGFR-Fab comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 424.

[0107] In some embodiment, wherein said VH of CD3-scFv comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 447; and wherein said VL of CD3-scFv comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 446.

[0108] In some embodiment, wherein said VH of CD3-scFv comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 449; and wherein said VL of CD3-scFv comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 448.

[0109] In some embodiment, wherein said VH of CD3-scFv comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 451; and wherein said VL of CD3-scFv comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 450.

[0110] In some embodiment, wherein said VH of CD3-scFv comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 453; and wherein said VL of CD3-scFv comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 452.

[0111] In some embodiment, wherein said VH of EGFR-Fab comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 454; and wherein said VL of EGFR-Fab comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 455.

[0112] In some embodiment, wherein said VH of EGFR-Fab comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 456; and wherein said VL of EGFR-Fab comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 457.

[0113] In some embodiment, wherein said VH of CD3-scFv comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 447, and wherein said VL of scFv comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 446; and, wherein said VH of EGFR-Fab comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 454, and wherein said VL of EGFR-Fab comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 455.

[0114] In some embodiment, wherein said CD3-scFv comprising an amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 1-8.

[0115] In some embodiment, wherein the CD3-scFv comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.

[0116] In some embodiment, wherein said heavy chain of EGFR-Fab comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO: 9, and wherein said light chain of EGFR-Fab comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO: 10.

[0117] In some embodiment, wherein the heavy chain of EGFR-Fab comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO: 11, and wherein said light chain of EGFR-Fab comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO: 12.

[0118] In some embodiment, wherein said CD3-scFv comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO:1; and, wherein said heavy chain of EGFR-Fab comprising an amino acid sequence of any one of SEQ ID NO: 9, and wherein said light chain of EGFR-Fab comprising an amino acid sequence of any one of SEQ ID NO: 10.

[0119] In some embodiment, wherein said first polypeptide and said second polypeptide respectively comprise an amino acid sequence with at least 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, or 100%sequence identity to SEQ ID NOS: 33 and 34, 35 and 36, 37 and 38, 39, and 40, 41, and 42, 43 and 44, 45 and 46, 47 and 48, 49 and 50, 51 and 52, 53 and 54, 55 and 56, 57 and 58, 59 and 60, 61 and 62, 63 and 64, 65 and 66, 67 and 68, 69 and 70, 71 and 72, 73 and 74, 75 and 76, 77 and 78, 79 and 80, 81 and 82, 83 and 84, 85 and 86, 87 and 88, 89 and 90, 91 and 92, 93 and 94, 95 and 96, 97 and 98, 99 and 100, 101 and 102, 516 and 517, 518 and 519, 520 and 521, 522 and 523, 524 and 525, 526 and 527, 528 and 529, 530 and 531, 532 and 533, 534 and 535, 536 and 537, or, 538 and 539.

[0120] In some embodiment, wherein said first polypeptide and said second polypeptide respectively comprise an amino acid sequence with at least 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, or 100%sequence identity to SEQ ID NOS: 63 and 64.

[0121] In some embodiment, wherein said first polypeptide and said second polypeptide respectively comprise an amino acid sequence of SEQ ID NOS: 63 and 64.

[0122] In some embodiment, wherein said first polypeptide and said second polypeptide respectively comprise an amino acid sequence with at least 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, or 100%sequence identity to SEQ ID NOS: 57 and 58.

[0123] In some embodiment, wherein said first polypeptide and said second polypeptide respectively comprise an amino acid sequence of SEQ ID NOS: 57 and 58.

[0124] In some embodiment, wherein said VH of CD3-scFv comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 453 and wherein said VL of scFv comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 452; and, wherein said heavy chain of PSMA-Fab comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 514 and wherein said light chain of PSMA-Fab comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 515.

[0125] In some embodiment, wherein said first polypeptide comprises an amino acid sequence of SEQ ID NOS: 544 and wherein said second polypeptide comprises an amino acid sequence of SEQ ID NOS: 545.

[0126] In some embodiment, wherein said VH of CD3-scFv comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 449 and wherein said VL of CD3-scFv comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 448, wherein said heavy chain of STEAP1-Fab comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 512 and wherein said light chain of STEAP1-Fab comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 513.

[0127] In some embodiment, wherein said first polypeptide comprises an amino acid sequence of SEQ ID NOS: 540 and wherein said second polypeptide comprises an amino acid sequence of SEQ ID NOS: 541.

[0128] In another aspect, the present application provides a nucleic acid molecule comprising a polynucleotide sequence encoding said T cell engager proteinaceous dimer described herein.

[0129] In another aspect, the present application provides a vector comprising said nucleic acid molecular described herein.

[0130] In another aspect, the present application provides a cell comprising said nucleic acid molecular described herein or said vector described herein.

[0131] In another aspect, the present application provides a kit comprising said T cell engager proteinaceous dimer described herein.

[0132] In another aspect, the present application provides a pharmaceutical composition comprising said (1) T cell engager proteinaceous dimer described herein, said nucleic acid molecule described herein, said vector described herein, or, said cell described herein; and, (2) a pharmaceutically acceptable carrier.

[0133] In another aspect, the present application provides a method of treating a disease in a subject in need thereof, comprising administering to the subject a therapeutically effective amount of said T cell engager proteinaceous dimer described herein, said nucleic acid molecule described herein, said vector described herein, said cell described herein, or said kit described herein or a pharmaceutical composition described herein.

[0134] In some embodiment, the disease is a cancer.

[0135] In some embodiment, wherein the cancer is derived from a cancer selected from the group consisting of leukemia, myelodysplastic syndrome, malignant lymphoma, nasopharyngeal carcinoma, mesothelioma, lung cancer, pancreatic cancer, head and neck tumors, gastrointestinal tumors, endocrine tumors, mammary and other gynecological tumors, urological tumors, skin tumors, thymic carcinomas, sarcomas and a combination thereof.

[0136] In another aspect, the present application provides a method of making said T cell engager proteinaceous dimer of described herein, said nucleic acid molecule of described herein, said vector described herein, said cell described herein, or said kit described herein or a pharmaceutical composition described herein.

[0137] Those skilled in the art can easily perceive other aspects and advantages of the present disclosure from the detailed description below. In the following detailed description, only exemplary embodiments of the present disclosure are shown and described. As those skilled in the art will recognize, the content of the present disclosure enables those skilled in the art to make changes to the disclosed specific embodiments without departing from the spirit and scope of the invention involved in the present application. Correspondingly, the drawings and descriptions in the specification of the present application are merely exemplary, rather than restrictive.

[0138] BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWING

[0139] The specific features of the invention involved in the present application are shown in the appended claims. The features and advantages of the invention involved in the present application can be better understood by referring to the detailed description of exemplary embodiments and the attached drawings described below in detail. The drawings are briefly described as follows:

[0140] FIGS. 1A and 1B are illustrations of the masked TCEs in different formats expressed and purified for comparison of the mask efficiency.

[0141] FIGS. 2A to 2C are graphs that show the results of the mask (M1) against the anti-CD3 antibody. 105.3 and 105.9 molecules in Format 1 showed reduced binding ability to PBMCs. Molecules in Format 2 and 3 showed reduced binding ability of anti-CD3 scFv to the Jurkat cells.

[0142] FIGS. 3A and 3B are graphs that show the results of the mask effect of the masking peptide (M2) against the anti-EGFR Fab in cell binding. FIG. 3A showed that the masking peptide (M2) against the anti-EGFR antibody reduced the binding of the anti-EGFR antibody by 6～7 fold in Format 1 in HT29 binding. Meanwhile, the 105.19 and 105.24 (Format 3) showed reduced binding to the EGFR on the HCT116 cells (FIG. 3B) with >100-fold compared to the unmasked molecule, 105.16.

[0143] FIGS. 4A to 4C are graphs that show the results of different lengths of the CD3 M1, the length of linker between CD3 M1 and anti-CD3 scFv, the position of the anti-CD3 scFv and the position of the mask could affect the mask efficiency in the HT29 cell killing. FIG. 4C shows the results when the anti-CD3 scFv was linked to EGFR VH, it exhibited stronger cell killing than the molecules where the scFv was linked to EGFR VL (105.1 vs 105.5) .

[0144] FIGS. 5A to 5D are graphs that show the results in tumor cell cytotoxicity assay of masked molecules in Format 2 and 3. The masking peptide (M1) , connected to the N-terminus of the anti-CD3 scFv (Format 2) or the anti-HSA VHH (Format 3) , reduced HT29 and A375 cell killing. The dual-masked TCEs showed reduced potency in the cell killing and the IFNγ secretion of the EGFR-positive HCT116-luc compared to the unmasked molecules, 105.0-1.105.24 showed >100-fold mask efficiency against its unmasked control (FIGS. 5C and 5D) .

[0145] FIG. 6 is a graph that shows the average tumor volume in NCI-H292 xenograft model in hPBMC-reconstituted M-NSG mice after being treated with the TCEs.

[0146] FIGS. 7 shows the average tumor volume in HCT116 xenograft model in hPBMC-reconstituted M-NSG mice after treated with the TCEs. The dual-masked TCEs shows antitumor efficacy in HCT116 xenograft model in hPBMC-reconstituted M-NSG mice.

[0147] FIGS. 8A to 8G are graphs that show the CD3 and EGFR binding of the dual-masked TCEs measured by ELISA or cell binding. The masking efficacy of dual-masked TCE, 105.19 was >100-fold in binding to the human CD3 when compared to the unmasked 105.16 molecule (FIG. 8A) . M1 and anti-CD3 scFv, dual-masked TCEs could achieve different mask effects. 105.24 and 105.35 achieved the best mask effect of the CD3 binding (FIG. 8B) . FIG. 8C shows the Jurkat cell binding of the TCEs. With different anti-CD3 scFv used in the 105.28 and 105.29, these two molecules exhibited a relatively worse mask efficiency in the Jurkat cell binding, which was consistent with the results of ELISA binding. The masking efficacy of dual-masked TCE, 105.19 was >200-fold in binding to the human when compared to the unmasked 105.16 molecule. The presence of human albumin in the ELISA system had little effect in the binding of EGFR (FIG. 8D) . Similar mask effects were obtained in the dual-masked TCEs with different combinations of M1 and anti-CD3 scFv (FIG. 8E) . FIGS. 8F and 8G show the CD3 and EGFR binding of the dual-masked TCEs measured by ELISA. The masking efficacy of dual-masked TCE, 105.24 was >100-fold and >200-fold in binding to the human CD3 and human EGFR, respectively, when compared to the unmasked molecule.

[0148] FIGS. 9A to 9H are graphs that show the results of the dual-masked TCEs with different combination of M1 and anti-CD3 scFv in Jurkat cell activation with the target cells listed as Jurkat-NFAT+HT29 (FIG. 9A) , Jurkat-NFAT+COLO205 (FIG. 9B) , Jurkat-NFAT+HCT116 (FIG. 9C) , Jurkat-NFAT+A549 (FIG. 9D) , Jurkat-NFAT+293F (FIGS. 9E-G) and Jurkat-NFAT+CHO-K1 (FIG. 9H) . The masked molecules hardly activated Jurkat-NFAT at 500 nM in the absence of antigen as shown in FIG. 9H, showing that the Jurkat cell activation by these dual-masked TCEs is antigen-dependent.

[0149] FIGS. 10A to 10C are graphs that show the potency of the dual-masked TCEs in primary T cell activation and cell cytotoxicity. The masked molecules 105.19 and 105.35 exhibited weaker activation of primary T cell than unmasked molecule in the presence of tumor cells (FIG. 10A) . FIGS. 10B and 10C demonstrate the killing of EGFR-positive COLO205 and NCI-H1975 mediated by the dual-masked TCEs with different combination of M1 and anti-CD3 scFv.

[0150] FIGS. 11A to 11C are graphs that show the CD3 and EGFR binding of the dual-masked TCEs measured by ELISA or cell binding. FIG. 11A shows that although M2 was in the different chain from the anti-CD3 scFv, it could also affect the mask efficiency of M1 to the anti-CD3 scFv. FIG. 11B shows that similar mask effect was obtained with different M2 in EGFR binding with Fab 1 in which may result from the strong masking of the VHH and scFv at the N-terminal of the anti-EGFR Fab 1.

[0151] FIG. 11C shows that by changing the anti-EGFR Fab, it altered the EGFR binding of the unmasked TCE against 293F cells and the mask effect was changed slightly.

[0152] FIGS. 12A to 12G are graphs that show the ability of dual-masked TCEs with different M2 and / or anti-EGFR Fabs in Jurkat-NFAT cell activation. With different combinations of M2 and anti-EGFR Fabs, dual-masked TCEs could achieve different mask effects. 105.24, 105.1412 and 105.1441 achieved the best mask window in T cell activation among the dual-masked TCEs we screened.

[0153] FIGS. 13A and 13B are graphs that demonstrate the T cell activation and tumor cell cytotoxicity of dual-masked TCEs after MMP digestion.

[0154] FIGS. 14A to 14C are Western blots that demonstrate the ex vivo digestion of the dual-masked TCEs with different MMP linkers.

[0155] FIG. 15 is a graph that shows the average tumor volume in HCT116 xenograft model in hPBMC-reconstituted M-NSG mice after treated with the TCEs.

[0156] FIGS. 16 is a graph that shows the average tumor volume in Colo205 xenograft model in hPBMC-reconstituted M-NSG after being treated with the TCEs.

[0157] FIGS. 17 is a graph that shows the average tumor volume in HCT116 xenograft model in hPBMC-reconstituted M-NSG mice after being treated with the TCEs.

[0158] FIG. 18 is a graph that shows the results of the masked TCE 107.1909 and un-masked TCE 107.1911 in Jurkat-NFAT cell activation.

[0159] FIG. 19 is a graph that shows the results of the masked TCE 107.1909 and un-masked TCE 107.1911 in tumor cell cytotoxicity.

[0160] FIG. 20 is a graph that shows the body change weight in 22RV1 xenograft model in hPBMC-reconstituted M-NSG mice after treated with the dual-masked TCE 107.1909.

[0161] FIG. 21 is a graph that shows the results of the masked TCE 107.1803 and un-masked TCE 107.1863 in Jurkat-NFAT cell activation.DETAILED DESCRIPTION

[0162] Embodiments of the invention of the present application will be described in the following specific embodiments, and those skilled in the art can easily understand other advantages and effects of the invention of the present application from the content disclosed herein.

[0163] While preferred embodiments of the present disclosure have been shown and described herein, it will be obvious to those skilled in the art that such embodiments are provided by way of example only. Numerous variations, changes, and substitutions will now occur to those skilled in the art without departing from the disclosure. Various alternatives to the embodiments of the disclosure described herein may be employed in practicing the disclosure. It is intended that the following claims define the scope of the disclosure and that methods and structures within the scope of these claims and their equivalents be covered thereby.

[0164] DEFINITION OF TERMS

[0165] In the present application, the term “T cell engagers” or “TCEs” or “T cell engager proteinaceous dimer” generally refers to unmasked, mono-or dual-masked T cell engagers that bind to an immune cell effector molecule, such as T cell effector molecular CD3 or CD28, and also bind to an Tumor Antigen expressing on the tumor cell, such as Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) , Prostate-Specific Membrane Antigen (PSMA) or Six-Transmembrane Epithelial Antigen of Prostate 1(STEAP1) . TCE therapeutics have potent anti-tumor activity in hematological cancers. TCEs to treat solid tumors has faced challenges due to the limitations of prior TCE technologies, namely (i) overactivation of the immune system leading to cytokine release syndrome or cytokine storm, (ii) on-target, healthy tissue toxicities and (iii) poor pharmacokinetics (pK) leading to short half-life. Systemic use of TCEs, however, has led to severe and acute cytokine storm, thereby limiting the dose to the TCEs to suboptimal amounts, which have led to poor results in clinical studies. The toxicity of TCEs has been high because of on-target, healthy tissue toxicity. Thus, TCEs such as blinatumomab are typically administered by a low-dose, continuous infusion pump over a period of weeks to overcome the challenge of a short half-life and to maintain therapeutic levels of drug in the body, which is a significant burden for patients and significantly increases the costs of TCE therapies.

[0166] To overcome these challenges associated with the effectiveness of TCEs, the present disclosure includes novel polypeptides and polypeptide complexes that include binding domains that selectively bind to an effector T cell antigen and Tumor Antigen. In some embodiment, the constructs may include one or more binding domains that are selectively activated only in the tumor microenvironment. The novel TCEs show a reduction in cytokine storm and an increase in on-target target tissue toxicity, with a reduction in off-target binding. The novel TCEs also have improved stability in the bloodstream and serum half-life prior to activation. The polypeptide or polypeptide complexes described herein have activity at low levels of off-target binding.

[0167] In the present application, the term “masking domain” generally refers to a peptide that can impair / reduce the binding of the antigen binding domain to the target antigen. In the present application, the masking domain may impair the binding the scFv to the effector molecule expressing on T cell. In the present application, the masking domain may impair the binding the Fab to the tumor antigen expressing on tumor cell. In the present application, the masking domain may be bound to antigen binding domain through ionic interactions, electrostatic interactions, hydrophobic interactions, π-stacking interactions, and H-bonding interactions, or a combination thereof. In the present application, the masking domain may be bound to antigen binding domain through a cleavable linker which can be cleaved by the protease. In some embodiments, the protease may comprise a tumor specific protease. In some embodiments, the protease may comprise a matrix metalloprotease (MMP) or a serine protease. When the cleavable linker is cleaved by the protease, the masking domain M1 may become unbound from the antigen binding domain thereby exposing scFv to the effector molecule expressing on T cell and exposing Fab to the the tumor antigen expressing on tumor cell, such that the T cell engager proteinaceous dimer can be activated.

[0168] In the present application, the term "half-life extension domain" generally refers to a domain that is linked to a target component (e.g., the T cell engager proteinaceous dimer described in the present application) to extend the half-life of the target component in serum. The term "half-life extender" may encompass, for example, antibodies, antibody fragments, albumin, albumin binding proteins, polyamino acid sequences, and these derivatives. In some embodiments, the half-life extension domain may comprise an antigen binding peptide, such VHH, scFv or full-length antibody, that binds human serum albumin (HSA) . In some embodiments, the half-life extension domain may be directly linked to the target component. In some embodiments, the half-life extension domain may be linked to the target component by the linker.

[0169] In the present application, the term “antibody” generally refers to immunoglobulins reactive to specified proteins or peptides or fragments thereof. The antibody may be derived from antibodies of any type, comprising but not limited to IgG, IgA, IgM, IgD and IgE, and antibodies of any subtype (e.g., IgG1, IgG2, IgG3, and IgG4) . The antibody may have a heavy chain constant region selected from, e.g., IgG1, IgG2, IgG3, or IgG4. The antibody may also have a light chain selected from, e.g., kappa (κ) or lambda (λ) . The antibody of the present application may be derived from any species.

[0170] In the present application, the term “antigen binding fragment” generally refers to a portion of an antibody molecule containing an amino acid residue that interacts with an antigen and confers specificity and affinity to the antibody for the antigen. Examples of antigen binding fragments may comprise but not limited to, Fab, Fab′, F (ab) 2, an Fv fragment, F (ab′) 2, scFv, di-scFv, VHH and / or dAb.

[0171] In the present application, the term “Fab” generally refers to fragments containing a heavy chain variable domain and a light chain variable domain, which may also contain a constant domain of the light chain and a first constant domain (CH1) of the heavy chain. The heavy chain of Fab is linked to the light chain of Fab by at least one covalent disulfide bond. The term “Fab′” generally refers to a fragment that differs from Fab by the addition of a small number of residues (comprising one or more cysteines from the hinge region of the antibody) to the carboxyl terminus of the heavy chain CH1 domain. The term “F (ab′) 2” generally refers to a dimer of Fab′, which is an antibody fragment containing two Fab fragments linked by a disulfide bridge in the hinge region. The term “Fv” generally refers to the smallest antibody fragment containing an intact antigen recognition and binding site. In some cases, the fragment can be composed of a heavy chain variable region and a light chain variable region as a tightly non-covalently bound dimer. The term “dsFv” generally refers to a disulfide bond-stabilized Fv fragment, of which the bond between an individual light chain variable region and an individual heavy chain variable region is a disulfide bond. The term “dAb fragment” generally refers to an antibody fragment consisting of a VH domain. In the present application, the term “scFv” generally refers to a monovalent molecule formed by pairing a heavy chain variable domain and a light chain variable domain of an antibody through covalent linkage by a flexible peptide linker. Such scFv molecules may have a general structure of NH2-VL-linker-VH-COOH or NH2-VH-linker-VL-COOH.

[0172] In the present application, the term "single-domain antibody" or "VHH" generally refers to a class of antibodies that lack an antibody light chain and have only a heavy chain variable region. In certain cases, the single-domain antibody may be derived from Bactrian camels, dromedaries, alpacas, llamas, nurse sharks, smooth dogfishes or rays (see, e.g., Kang Xiaozhen et al., Chinese Journal of Biotechnology, 2018, 34 (12) : 1974-1984) . For example, the single-domain antibody may be derived from alpacas. The single-domain antibody may consist of a heavy chain variable region (VH) . The term "heavy chain variable region" generally refers to the amino-terminal domain of the heavy chain of an antigen-binding fragment. The heavy chain variable region may be further divided into hypervariable regions termed complementarity-determining regions (CDRs) , which are scattered over more conserved regions termed framework regions (FRs) . Each heavy chain variable region may consist of three CDRs and four FRs arranged from the amino-terminus to the carboxyl-terminus in the following order: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, and FR4. The heavy chain variable region comprises a binding domain that interacts with an antigen.

[0173] In the present application, the term “variable region” or “variable domain” generally refers to a domain of the heavy chain or the light chain of an antibody that is involved in the binding of the antibody to the antigen. The heavy chain and light chain variable domains may be referred to “VH” and “VL” (or referred to “VH” and “VL” ) , respectively. In the present application, the term “variable” generally means that, there are strong variations in some portions of the sequence of the variable domain of an antibody, thus forming the binding and specificity of various specific antibodies for their antigens. The variability is not evenly distributed throughout the variable region of the antibody, and it is concentrated in three segments in the light chain variable region and the heavy chain variable region, which are referred to as complementary determining regions (CDR) or hypervariable regions (HVR) , i.e., LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2 and HCDR3, respectively. The more highly conserved portions in the variable domain are referred to as framework regions (FR) . The variable domain of a natural heavy chain and light chain each comprises four FR regions (H-FR1, H-FR2, H-FR3, H-FR4, L-FR1, L-FR2, L-FR3, L-FR4) , most of which are of a β-folded conformation and linked by three CDR structural loop regions. The CDRs in each chain are held closely together by the FR regions and form the antigen binding sites of the antibody together with the CDRs from the other chain.

[0174] In the present application, the term “CDR” , also known as “complementary determining region” , generally refers to a region in an antibody variable domain, of which the sequence is highly variable and / or forms a structure-defining ring. Generally, an antibody includes six CDRs; three in the VH (HCDR1, HCDR2, HCDR3) and three in the VL (LCDR1, LCDR2, LCDR3) . In some embodiments, naturally occurring camel antibodies only composed of heavy chains function normally and are stable in the absence of light chains. See, for example, Hamers-Casterman et al., Nature 363: 446-448 (1993) ; Sheriff et al, Nature Struct. Biol. 3: 733-736 (1996) .

[0175] In the art, a variety of methods can be used to encode the variable regions of an antibody or to divide the CDRs of an antibody, e.g., Kabat numbering scheme and definition rules based on sequence variability (see, Kabat et, al., Protein Sequences in Immunology, 5th edition, National Institutes of Health, Bethesda, Maryland (1991) ) , Chothia numbering scheme and definition rules based on the location of structural loop regions (see, Al-Lazikani et, al., J Mol Biol 273: 927-48, 1997) , IMGT numbering scheme and definition rules based on the amino acid sequence comparison of germ line V genes to efranc et, al., and Honneger's numbering scheme (AHo's ) , Martin numbering scheme, Gelfand numbering scheme, etc., see Mathieu Dondelinger et, al., Understanding the Significance and Implications of Antibody Numbering and Antigen-Binding Surface / Residue Definition, Front. Immunol., 16 Oct. 2018.

[0176] In the present application, the term “humanized antibody” generally refers to an antibody in which some or all the amino acids other than the CDR region of a non-human antibody (e.g., a mouse antibody) are replaced with corresponding amino acids derived from human immunoglobulins. In CDR regions, additions, deletions, insertions, substitutions, or modifications of amino acids are also permissible as long as they still retain the ability of the antibody to bind a specific antigen. Humanized antibodies may optionally comprise at least a portion of the constant region of human immunoglobulin. “Humanized antibodies” retain the antigen specificity similar to that of original antibodies. “Humanized” forms of non-human (e.g., mouse) antibody may minimally comprise chimeric antibodies derived from the sequences of non-human immunoglobulins. In some cases, the CDR region residues in human immunoglobulins (receptor antibodies) can be replaced with the CDR region residues of non-human species (donor antibodies) (such as, mice, rats, rabbits, or non-human primates) having desired properties, affinity and / or abilities. In some cases, the FR region residues in human immunoglobulins can be replaced with corresponding non-human residues. In addition, humanized antibodies may comprise amino acid modifications that are not present in the receptor antibodies or donor antibodies.

[0177] In the present application, the term “full human antibody” generally refers to an antibody of which all the portions (comprising the variable regions and the constant regions of the antibody) are encoded by human-derived genes. Methods for obtaining full human antibodies in the art may comprise phage display technology, transgenic mice technology, ribosome display technology, RNA-polypeptide technology, etc.

[0178] In the present application, the term “binding” , “specific binding” or “being specific to” generally refers to measurable and reproducible interactions, such as the binding between an antigen and an antibody, which can determine the presence of a target in the presence of a heterogeneous population of molecules (comprising biological molecules) . For example, an antibody binds to an epitope through its antigen binding domain, and the binding requires some complementarity between the antigen binding domain and the epitope. For example, an antibody that specifically binds a target (which may be an epitope) is an antibody that binds this target with greater affinity, avidity, more readily and / or for a longer duration than it binds other targets. When an antibody is more likely to bind to an epitope through its antigen binding domain than it would bind to random and unrelated epitopes, the antibody is referred to as “specifically binding” to that antigen.

[0179] In the present application, the term “polypeptide” or “protein” can be used interchangeably and generally refers to a polymer of amino acid residues. This term also applies to amino acid polymers in which one or more amino acid residues are analogs or mimics of corresponding naturally occurring amino acids, as well as naturally occurring amino acid polymers. This term may also comprise modified amino acid polymers, for example, glycoproteins formed by adding sugar residues or modification by phosphorylation. Polypeptide and protein can be produced from naturally occurring and non-recombinant cells or genetically engineered or recombinant cells and may comprise molecules with amino acid sequences of natural protein, or molecules with deletions, additions and / or substitutions of one or more amino acids of natural sequences. The term “polypeptide” and “protein” particularly comprises sequences with deletions, additions and / or substitutions of one or more amino acids of the antigen binding protein of the present application.

[0180] In the present application, the term “directly linked” is opposite to the term “indirectly linked” . The term “directly linked” generally refers to direct linking. For example, the direct linking may be a case that the substances are directly linked without spacers. The spacers may be linkers. For example, the linkers may be peptide linkers. The term “indirectly linked” generally refers to a case that the substances are not directly linked. For example, the indirect linking may be linking through linkers.

[0181] In the present application, the term “isolated” generally refers to biological materials (e.g., viruses, nucleic acids or proteins) that are substantially free of components that are normally accompanied with or interact with them in their natural environment. The isolated biological materials optionally comprise additional materials that are not found in the biological materials in their natural environment (e.g., nucleic acids or proteins) . In the present application, when referring to a protein, “isolated” generally means that the molecule is isolated and separated from the entire organism in which the molecule is naturally found, or that there are essentially no other biological macromolecules of the same type. When referring to a nucleic acid molecule, the nucleic acid molecule is entirely or partially isolated from the sequences to which it binds naturally, or the nucleic acid has heterologous sequences to which it binds, or the nucleic acid is isolated from chromosomes.

[0182] In the present application, the term “nucleic acid” molecules generally refer to isolated nucleotides, deoxyribonucleotides or ribonucleotides of any length, or analogues thereof isolated from its natural environment or synthesized artificially.

[0183] In the present application, the term “vector” generally refers to a nucleic acid molecule capable of self-replication in a suitable host, which transfers the inserted nucleic acid molecule into and / or between host cells. The vector may comprise a vector mainly used for inserting DNA or RNA into cells, a vector mainly used for replicating DNA or RNA, and a vector mainly used for expression of DNA or RNA transcription and / or translation. The vector also comprises a vector with a variety of the above functions. The vector may be a polynucleotide that can be transcribed and translated into a polypeptide when introduced into a suitable host cell. Generally, by culturing a suitable host cell comprising the vector, the vector can produce desired expression products.

[0184] In the present application, the term “cell” generally refers to an individual cell, cell line, or cell culture that can comprise or has comprised a plasmid or vector comprising the nucleic acid molecule of the present application, or can express the antigen binding protein of the present application. The cells can comprise the progeny of a single cell. Due to natural, accidental or intentional mutations, the progeny cells may not necessarily be the same as the original parent cells in terms of morphology or genome, as long as they can express the antibody or the antigen-binding fragment thereof of the present application. The cells can be obtained by transfecting cells in vitro with the vector of the present application. The cells may be prokaryotic cells (e.g., Escherichia coli) or eukaryotic cells (e.g., yeast cells, e.g., COS cells, Chinese Hamster Ovary (CHO) cells, HeLa cells, HEK293 cells, COS-1 cells, NSO cells, or myeloma cells) . In some cases, the cells may be mammalian cells. For example, the mammalian cells may be CHO-K1 cells.

[0185] In the present application, the term “pharmaceutical composition” generally refers to a composition for preventing / treating a disease or disorder. The pharmaceutical composition may include the chimeric antigen receptor of the present application, the nucleic acid molecule of the present application, the vector of the present application and / or the cell of the present application, as well as optionally a pharmaceutically acceptable adjuvant. In addition, the pharmaceutical composition may further include one or more (pharmaceutically effective) carriers, stabilizers, excipients, diluents, solubilizers, surfactants, emulsifiers and / or preservatives and other suitable preparations. The acceptable ingredients of the composition are non-toxic to the recipient at the dosage and concentration used. The pharmaceutical composition of the present application includes, but not limited to, liquid, frozen and lyophilized compositions.

[0186] In the present application, the term “pharmaceutically acceptable carrier” generally includes pharmaceutically acceptable carriers, excipients or stabilizers that are non-toxic to cells or mammals to which they are exposed at the dosage and concentration used. Physiologically acceptable carriers may include, e.g., buffers, antioxidants, low molecular weight (less than about 10 residues) polypeptides, proteins, hydrophilic polymers, amino acids, monosaccharide, disaccharide, and other carbohydrates, chelating agents, sugar alcohols, salt-forming counter ions, e.g. sodium, and / or nonionic surfactants.

[0187] In the present application, the term “treatment” generally refers to clinical interventions that are intended to alter the natural course of a disease in an individual being treated and that may be undertaken to achieve prevention or treatment or during a clinical condition. Desirable therapeutic effects comprise, but not limited to, preventing the onset or recurrence of a disease, alleviating symptoms, attenuating any direct or indirect pathological consequences of the disease, preventing metastasis, decreasing the progression rate of the disease, ameliorating or alleviating the state of the disease, and moderating or improving the prognosis. In some instances, the antigen binding protein (e.g., anti-PD-L1 antibody) of the present application can be used to delay the development of a disease or slow down the progression of the disease.

[0188] In the present application, the term “administration” generally refers to a method for giving a subject (e.g., a patient) a certain dose of compounds (e.g., anti-cancer therapeutic agents) or pharmaceutical compositions (e.g., a pharmaceutical composition comprising an anti-cancer therapeutic agent) . The administration can be via any suitable routes, comprising parenteral, intrapulmonary and intranasal, and (if needed by local treatment) intralesional administration. Parenteral infusion comprises, e.g., intramuscular, intravenous, intraarterial, intraperitoneal or subcutaneous administration.

[0189] In the present application, the term “tumor” generally refers to all the neoplastic cell growth and proliferation (no matter malignant or benign) as well as all the precancerous and cancerous cells and tissues. In the present application, the tumor may be a tumor with high expression of EGFR or PSMA or STEAP1 in cells and tissues. The tumor may comprise a solid tumor and / or a non-solid tumor. The term “cancer” generally refers to diseases characterized by the rapid and uncontrolled growth of abnormal cells. Cancer cells can spread to other parts of the body, either locally or through the bloodstream and the lymphatic system. Cancers in the present application include, but not limited to, gastric cancer and / or colon cancer. The terms “tumor” and “cancer” can be used interchangeably. For example, the two terms encompass solid tumors and liquid tumors, e.g., diffuse or circulating tumors. As used herein, the term “cancer” or “tumor” may include premalignant and malignant cancers and tumors.

[0190] In the present application, the term “tumor antigen” generally refers to any molecules expressed on tumor cells (or related to the development of tumor cells) that are known or believed to have a role in the tumorigenic properties of tumor cells. These antigens generally have extracellular parts which can be present on the cell surface, and have transmembrane parts and cytoplasmic parts that are joined together with the extracellular parts. These antigens can sometimes be present only on the surface of tumor cells but not on the surface of normal cells. Tumor antigens can be expressed specifically on tumor cells, or have tumor-specific mutations compared to normal cells. In such cases, they are referred to as tumor-specific antigens (TSAs) . TSAs are unique to tumor cells, and do not occur on other cells of the body. Tumor antigens can be expressed not only in tumor cells, and can also be expressed on normal cells in conditions that cannot induce an immune tolerance state to the antigens, where they are referred to as tumor-associated antigens (TAAs) . Compared to normal cells, TAAs can be overexpressed on tumor cells, or are prone to bind to antibodies in tumor cells due to the less compact structure of tumor tissues compared to normal tissues.

[0191] In the present application, the term “subject” generally refers to human or non-human animals, including but not limited to cat, dog, horse, pig, cow, sheep, rabbit, mouse, rat, or monkey.

[0192] In the present application, the terms “peptide” , “polypeptide” and “protein” can be used interchangeably and generally refer to compounds composed of amino acid residues covalently linked by peptide bonds. The protein or peptide must contain at least two amino acids, and there is no limitation on the maximum number of amino acids that can be included in the protein or peptide sequence. The polypeptide may include any peptides or proteins that contain two or more amino acids linked to each other through peptide bonds. In the present application, this term refers to two short chains, which are also commonly known as peptides, oligopeptides and oligomers in the art, for example longs chains, which are commonly known as proteins in the art, of which there are many types. “Polypeptides” include, for example, bioactive fragments, substantially homologous polypeptides, oligopeptides, homodimers, heterodimers, variants of polypeptides, modified polypeptides, derivatives, analogues, fusion proteins, etc. Polypeptides include native peptides, recombinant peptides or combinations thereof.

[0193] The protein, polypeptide and / or amino acid sequences involved in the present application should also be understood to include at least the following ranges: variants or homologs having the same or similar functions as those of the protein or polypeptide.

[0194] In the present application, the variants may be, e.g., proteins or polypeptides with one or more amino acid substitutions, deletions or additions in the amino acid sequence of the protein and / or the polypeptide (e.g., an antibody or a fragment thereof specifically binding to CLDN18.2 protein) . For example, the functional variants may include proteins or polypeptides with amino acid changes by at least 1, for example, 1-30, 1-20 or 1-10, and further for example, 1, 2, 3, 4 or S amino acid substitutions, deletions and / or insertions. The functional variants can substantially maintain the biological properties of the protein or the polypeptide before change (e.g., substitution, deletion or addition) . For example, the functional variants can maintain at least 60%, 70%, 80%, 90%, or 100%of the biological activity (e.g., antigen binding ability) of the protein or the polypeptide before change. For example, the substitution may be conservative substitution.

[0195] In the present application, the term “percent (%) sequence identity” generally refers to a sequence is defined as the percentage of amino acid residues in a candidate sequence that are identical with the amino acid residues in the specific sequence, after aligning the sequences and introducing gaps, if necessary, to achieve the maximum percent sequence identity, and not considering any conservative substitutions as part of the sequence identity. The term “homology” may be equivalent to the “identity” of sequences. Homologous sequences may comprise amino acid sequences that are at least 80%, 85%, 90%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%or 99.9%the same as the subject sequence Alignment for purposes of determining percent amino acid sequence identity can be achieved in a variety of ways known in the art, for example, by using publicly available computer softwares, such as BLAST, BLAST-2, ALIGN or Megalign (DNASTAR) softwares. A person skilled in a can determine appropriate parameters for aligning sequences, including any algorithms needed to achieve the maximum alignment over the full-length sequence range being compared or within the target sequence region. The homology can also be determined by the following methods: FASTA and BLAST. A description of FASTA algorithm can be found in “Improved tools for biological sequence comparison” to W. R. Pearson and D. J. Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci., 85: 2444-2448, 1988; and “Rapid and Sensitive Protein Similarity Searches” to D. J. Lipman and W. R. Pearson, Science, 227: 1435-1441, 1989. A description of BLAST algorithm can be found in “Basic Local Alignment Search Tool” to S. Altschul, W. Gish, W. Miller, E. W. Myers and D. Lipman, Journal of Molecular Biology, 215: 403-410, 1990.

[0196] In the present application, the term “comprise” generally refers to the meaning of including, encompassing, containing, or embracing. In some cases, it also means “is / are” or “be composed of ... ” .

[0197] DETAILED DESCRIPTION of THE INVENTION

[0198] In one aspect, the present application provides a T cell engager proteinaceous dimer, which the T cell engager proteinaceous dimer may comprise a first a first polypeptide and a second polypeptide, wherein: the first polypeptide may comprise a single chain variable fragment (scFv) that can bind to an effector molecule expressing on the T cell, and one chain of a Fab, wherein the Fab can bind with the tumor surface antigen expressing on the tumor cell; wherein the second polypeptide may comprise a first masking domain (M1) that can reduce the binding of scFv to said effector molecule expressing on the T cell; a half-life extension domain that can extend the half-life of the T cell engager proteinaceous dimer; and another chain of a Fab, wherein the Fab can bind with the tumor surface antigen expressing on the tumor cell; wherein the one chain of a Fab of the first polypeptide and another chain of a Fab of the second polypeptide can form an intact Fab.

[0199] In some embodiments, the T cell engager proteinaceous dimer described in the present application, when compared with the TCE construct in which M1 directly fused to the scFv, exhibits equivalent attenuated binding efficacy of the scFv to the effector molecules expressed on the T cell. At the same time, the T cell engager proteinaceous dimer described in the present application exhibits one or more of the following enhanced properties:

[0200] (1) In the peripheral circulation / normal tissue microenvironment, the T cell engager proteinaceous dimer described in the present application exhibits weaker binding of the Fab fragment to antigen expressing normal tissue cells; a reduced ability to kill antigen expressing cells; and / or diminished T cell activation and IFNγ secretion; and / or,

[0201] (2) upon exposure to the tumor microenvironment, the T cell engager proteinaceous dimer described in the present application is cleaved by tumor‐specific proteases to remove the masking moiety, thereby exhibiting an enhanced ability to reduce the tumor volume, and / or increased T cell activation and tumor cell cytotoxicity.

[0202] Polypeptide of T cell engager proteinaceous dimer

[0203] In one aspect, the present application provides a T cell engager proteinaceous dimer, which the T cell engager proteinaceous dimer may comprise a first a first polypeptide and a second polypeptide, wherein: the first polypeptide may comprise a single chain variable fragment (scFv) that can bind to an effector molecule expressing on the T cell, and one chain of a Fab, wherein the Fab can bind with the tumor surface antigen expressing on the tumor cell; wherein the second polypeptide may comprise a first masking domain (M1) that can reduce the binding of scFv to said effector molecule expressing on the T cell; a half-life extension domain that can extend the half-life of the T cell engager proteinaceous dimer; and another chain of a Fab, wherein the Fab can bind with the tumor surface antigen expressing on the tumor cell; wherein the one chain of a Fab of the first polypeptide and another chain of a Fab of the second polypeptide can form an intact Fab.

[0204] In some embodiment, the scFv may comprise a heavy variable domain (VH) and a light variable domain (VL) .

[0205] In some embodiment, the one chain of a Fab of the first polypeptide may comprise a heavy chain; and, another chain of a Fab of the first polypeptide may comprise a light chain. In some embodiment, the one chain of a Fab of the first polypeptide may comprise a light chain; and, another chain of a Fab of the first polypeptide may comprise a heavy chain.

[0206] In some embodiment, the scFv may comprise a heavy variable domain (VH) and a light variable domain (VL) ; and the one chain of a Fab of the first polypeptide may comprise a heavy chain and another chain of a Fab of the first polypeptide may comprise a light chain. In some embodiment, the scFv may comprise a heavy variable domain (VH) and a light variable domain (VL) ; and the one chain of a Fab of the first polypeptide may comprise a light chain and another chain of a Fab of the first polypeptide may comprise a heavy chain.

[0207] In some embodiment, the scFv may comprise a heavy variable domain (VH) and a light variable domain (VL) ; and the one chain of a Fab of the first polypeptide may be a heavy chain and another chain of a Fab of the first polypeptide may be a light chain. In some embodiment, the scFv may comprise a heavy variable domain (VH) and a light variable domain (VL) ; and the one chain of a Fab of the first polypeptide may be a light chain and another chain of a Fab of the first polypeptide may be a heavy chain.

[0208] In some embodiment, the first polypeptide may comprise, from N terminal to C terminal: the scFv and the one chain of a Fab; or, from N terminal to C terminal: the one chain of a Fab and the scFv. In some embodiment, the first polypeptide may comprise, from N terminal to C terminal: the scFv and one chain of a Fab. In some embodiment, the first polypeptide may comprise, from N terminal to C terminal: the one chain of a Fab and the scFv.

[0209] In some embodiment, the second polypeptide may comprise, from N terminal to C terminal: the first masking domain (M1) , the half-life extension domain and another chain of a Fab.

[0210] In some embodiment, the first polypeptide may comprise, from N terminal to C terminal: the scFv and one chain of a Fab; and, the second polypeptide may comprise, from N terminal to C terminal: the first masking domain (M1) , the half-life extension domain and another chain of a Fab. In some embodiment, the first polypeptide may comprise, from N terminal to C terminal: one chain of a Fab and the scFv; and, the second polypeptide may comprise, from N terminal to C terminal: the first masking domain (M1) , the half-life extension domain and another chain of a Fab.

[0211] In some embodiment, the second polypeptide may comprise a second masking domain (M2) that can reduce the binding of said Fab to the tumor surface antigen. In some embodiment, in the second polypeptide, the C terminal of said second masking domain (M2) may be directly or indirectly linked to the N terminal of said another chain of a Fab. In some embodiment, the second polypeptide may comprise, from N terminal to C terminal: the first masking domain (M1) , the half-life extension domain, the second masking domain (M2) and another chain of a Fab.

[0212] In some embodiment, the first polypeptide may comprise, from N terminal to C terminal: the scFv and one chain of a Fab; and, the second polypeptide may comprise, from N terminal to C terminal: the first masking domain (M1) , the half-life extension domain, the second masking domain (M2) and another chain of a Fab. In some embodiment, the first polypeptide may comprise, from N terminal to C terminal: one chain of a Fab and the scFv; and, the second polypeptide may comprise, from N terminal to C terminal: the first masking domain (M1) , the half-life extension domain, the second masking domain (M2) and another chain of a Fab.

[0213] In some embodiment, the scFv may comprise a heavy variable domain (VH) and a light variable domain (VL) . In some embodiment, the one chain of a Fab of the first polypeptide may comprise a heavy chain, and another chain of a Fab of the second polypeptide may comprise a light chain. In some embodiment, one chain of a Fab of the first polypeptide may comprise a light chain, and another chain of a Fab of the second polypeptide may comprise a heavy chain.

[0214] In some embodiment, in the first polypeptide, from N terminal to C terminal: the C terminal of the VH of scFv may be directly or indirectly linked to the N terminal of the one chain of Fab. In some embodiment, in the first polypeptide, from N terminal to C terminal: the C terminal of said VL of scFv may be directly or indirectly linked to the N terminal of said one chain of Fab.

[0215] In some embodiment, the first polypeptide may comprise, from N terminal to C terminal: the VL of scFv and one chain of Fab; and the second polypeptide may comprise, from N terminal to C terminal: the first masking domain (M1) , the half-life extension domain and another chain of a Fab. In some embodiment, the first polypeptide may comprise, from N terminal to C terminal: the VH of scFv and one chain of Fab; and the second polypeptide may comprise, from N terminal to C terminal: the first masking domain (M1) , the half-life extension domain and another chain of a Fab.

[0216] In some embodiment, in the first polypeptide, from N terminal to C terminal: the C terminal of the scFv may be directly or indirectly linked to the N terminal of the heavy chain of the one chain of Fab. In some embodiment, in the first polypeptide, from N terminal to C terminal: the C terminal of the scFv may be directly or indirectly linked to the N terminal of the light chain of the one chain of Fab.

[0217] In some embodiment, the first polypeptide may comprise, from N terminal to C terminal: the C terminal of the scFv may be directly or indirectly linked to the N terminal of the heavy chain of the one chain of Fab; and the second polypeptide may comprise, from N terminal to C terminal: the first masking domain (M1) , the half-life extension domain and another chain of a Fab. In some embodiment, the first polypeptide may comprise, from N terminal to C terminal: the C terminal of the scFv may be directly or indirectly linked to the N terminal of the light chain of the one chain of Fab; and the second polypeptide may comprise, from N terminal to C terminal: the first masking domain (M1) , the half-life extension domain and another chain of a Fab.

[0218] In some embodiment, in the first polypeptide, from N terminal to C terminal: the C terminal of said VH of scFv may be directly or indirectly linked to the N terminal of said heavy chain of Fab. In some embodiment, in the first polypeptide, from N terminal to C terminal: the C terminal of said VH of scFv may be directly or indirectly linked to the N terminal of said light chain of Fab. In some embodiment, in the first polypeptide, from N terminal to C terminal: the C terminal of said VL of scFv may be directly or indirectly linked to the N terminal of said heavy chain of Fab. In some embodiment, in the first polypeptide, from N terminal to C terminal: the C terminal of said VL of scFv may be directly or indirectly linked to the N terminal of said light chain of Fab.

[0219] In some embodiment, the first polypeptide may comprise, from N terminal to C terminal: VL of scFv-VH of scFv -heavy chain of Fab; and, the second polypeptide may comprise, from N terminal to C terminal: M1-half-life extension domain-light chain of Fab. In some embodiment, the first polypeptide may comprise, from N terminal to C terminal: VL of scFv-VH of scFv -heavy chain of Fab; and, the second polypeptide may comprise, from N terminal to C terminal: M1-half-life extension domain-M2-light chain of Fab.

[0220] In some embodiment, the first polypeptide may comprise, from N terminal to C terminal: VL of scFv-VH of scFv-light chain of Fab; and, the second polypeptide may comprise, from N terminal to C terminal: M1-half-life extension domain-heavy chain of Fab. In some embodiment, the first polypeptide may comprise, from N terminal to C terminal: VL of scFv-VH of scFv-light chain of Fab; and, the second polypeptide may comprise, from N terminal to C terminal: M1-half-life extension domain-M2-heavy chain of Fab.

[0221] In some embodiment, the first polypeptide may comprise, from N terminal to C terminal: VH of scFv-VL of scFv-heavy chain of Fab; and, the second polypeptide may comprise, from N terminal to C terminal: M1-half-life extension domain-light chain of Fab. In some embodiment, the first polypeptide may comprise, from N terminal to C terminal: VH of scFv-VL of scFv-heavy chain of Fab; and, the second polypeptide may comprise, from N terminal to C terminal: M1-half-life extension domain-M2-light chain of Fab.

[0222] In some embodiment, the first polypeptide may comprise, from N terminal to C terminal: VH of scFv-VL of scFv-light chain of Fab; and, the second polypeptide may comprise, from N terminal to C terminal: M1-half-life extension domain-heavy chain of Fab. In some embodiment, the first polypeptide may comprise, from N terminal to C terminal: VH of scFv-VL of scFv-light chain of Fab; and, the second polypeptide may comprise, from N terminal to C terminal: M1-half-life extension domain-M2-heavy chain of Fab.

[0223] In some embodiment, the half-life extension domain may be linked to M2 or Fab via a cleavable linker. In some embodiment, the half-life extension domain may be linked to M2 via a cleavable linker when M2 is absent. In some embodiment, the half-life extension domain may be linked to Fab via a cleavable linker. In some embodiment, the cleavable linker may independently comprise one cleavage site for the same protease or for different proteases, or two or more cleavage sites that are capable of being cleaved by the same or different proteases. In some embodiment, the protease may comprise a tumor specific protease. In some embodiments, the protease may comprise a matrix metalloprotease (MMP) or a serine protease. In some embodiments, the matrix metalloprotease may comprise MMP1, MMP2, MMP3, MMP7, MMP9, MMP10, MMP 13, or MMP 14. In some embodiments, the serine protease may comprise hepsin, urokinase-type plasminogen activator (uPa) , matriptase, legumain, kallikrein-related peptidase-3, human neutrophil elastase, proteinase 3 (Pr3) , cathepsin B, cathepsin G, cathepsin K and cathepsin L.

[0224] In some embodiment, the half-life extension domain may comprise human serum albumin (HSA) , an antigen-binding polypeptide, or an immunoglobulin Fc. In some embodiment, the half-life extension domain may comprise an antigen-binding polypeptide. In some embodiment, the half-life extension domain may comprise antigen-binding polypeptide binds HAS. In some embodiment, the half-life extension domain may comprise an antibody that binds HSA. In some embodiment, the half-life extension domain may comprise a single domain antibody (VHH) that binds HSA, an scFv that binds HSA, or a full-length antibody that binds HAS. In some embodiment, the half-life extension domain may comprise a single domain antibody (VHH) that binds HSA.

[0225] In some embodiment, in the second polypeptide, the C terminal of M1 may be linked to the N terminal of the half-life extension domain via a linker L1. In some embodiment, in the second polypeptide, the C terminal of the half-life extension domain may be linked to the N terminal of M2 via a linker L2. In some embodiment, in the second polypeptide, the C terminal of the scFv is linked to the N terminal of the Fab via a linker L3.

[0226] In some embodiment, the first polypeptide may comprise, from N terminal to C terminal:

[0227] (a) VL of scFv-VH of scFv-L3-heavy chain of Fab, or, (b) VL of scFv-VH of scFv-L3-light chain of Fab, (c) VH of scFv-VL of scFv-L3-heavy chain of Fab, or, (d) VH of scFv-VL of scFv-L3-heavy chain of Fab.

[0228] In some embodiment, the second polypeptide may comprise, from N terminal to C terminal: (e) M1-linker L1-HSA VHH-cleavable linker -heavy chain of Fab, or, (f) M1-linker L1-HSA VHH-cleavable linker -light chain of Fab, or, (g) M1-linker L1-HSA VHH-linker L2-M1-cleavable linker-heavy chain of Fab, or (h) M1-linker L1-HSA VHH-linker L2-M1-cleavable linker-light chain of Fab.

[0229] In some embodiment, the first polypeptide may comprise, from N terminal to C terminal: VL of scFv-VH of scFv-L3-heavy chain of Fab; and, the second polypeptide may comprise, from N terminal to C terminal: M1-linker L1-HSA VHH-cleavable linker-light chain of Fab. In some embodiment, the first polypeptide may comprise, from N terminal to C terminal: VL of scFv-VH of scFv-L3-heavy chain of Fab; and, the second polypeptide may comprise, from N terminal to C terminal: M1-linker L1-HSA VHH-linker L2-M2-cleavable linker-light chain of Fab

[0230] In some embodiment, the first polypeptide may be, from N terminal to C terminal: VL of scFv-VH of scFv-L3-heavy chain of Fab; and, the second polypeptide may be, from N terminal to C terminal: M1-linker L1-HSA VHH-cleavable linker-light chain of Fab. In some embodiment, the first polypeptide may be, from N terminal to C terminal: VL of scFv-VH of scFv-L3-heavy chain of Fab; and, the second polypeptide may be, from N terminal to C terminal: M1-linker L1-HSA VHH-linker L2-M2-cleavable linker-light chain of Fab.

[0231] In some embodiment, the first polypeptide may comprise, from N terminal to C terminal: VL of scFv-VH of scFv-L3-light chain of Fab; and, the second polypeptide may comprise, from N terminal to C terminal: M1-linker L1-HSA VHH-cleavable linker -heavy chain of Fab. In some embodiment, the first polypeptide may comprise, from N terminal to C terminal: VL of scFv-VH of scFv-L3-light chain of Fab; and, the second polypeptide may comprise, from N terminal to C terminal: M1-linker L1-HSA VHH-linker L2-M2-cleavable linker-heavy chain of Fab.

[0232] In some embodiment, the first polypeptide may be, from N terminal to C terminal: VL of scFv-VH of scFv-L3-light chain of Fab; and, the second polypeptide may be, from N terminal to C terminal: M1-linker L1-HSA VHH-cleavable linker -heavy chain of Fab. In some embodiment, the first polypeptide may be, from N terminal to C terminal: VL of scFv-VH of scFv-L3-light chain of Fab; and, the second polypeptide maybe, from N terminal to C terminal: M1-linker L1-HSA VHH-linker L2-M2-cleavable linker-heavy chain of Fab.

[0233] In some embodiment, the first polypeptide may comprise, from N terminal to C terminal: VH of scFv-VL of scFv-L3-heavy chain of Fab; and, the second polypeptide may comprise, from N terminal to C terminal: M1-linker L1-HSA VHH-cleavable linker -light chain of Fab. In some embodiment, the first polypeptide may comprise, from N terminal to C terminal: VH of scFv-VL of scFv-L3-heavy chain of Fab; and, the second polypeptide may comprise, from N terminal to C terminal: M1-linker L1-HSA VHH-linker L2-M2-cleavable linker-light chain of Fab.

[0234] In some embodiment, the first polypeptide may be, from N terminal to C terminal: VH of scFv-VL of scFv-L3-heavy chain of Fab; and, the second polypeptide may be, from N terminal to C terminal: M1-linker L1-HSA VHH-cleavable linker -light chain of Fab. In some embodiment, the first polypeptide may be, from N terminal to C terminal: VH of scFv-VL of scFv-L3-heavy chain of Fab; and, the second polypeptide may be, from N terminal to C terminal: M1-linker L1-HSA VHH-linker L2-M2-cleavable linker-light chain of Fab.

[0235] In some embodiment, the first polypeptide may comprise, from N terminal to C terminal: VH of scFv-VL of scFv-L3-light chain of Fab; and, the second polypeptide may comprise, from N terminal to C terminal: M1-linker L1-HSA VHH-cleavable linker -heavy chain of Fab. In some embodiment, the first polypeptide may comprise, from N terminal to C terminal: VH of scFv-VL of scFv-L3-light chain of Fab; and, the second polypeptide may comprise, from N terminal to C terminal: M1-linker L1-HSA VHH-linker L2-M2-cleavable linker-heavy chain of Fab.

[0236] In some embodiment, the first polypeptide may be, from N terminal to C terminal: VH of scFv-VL of scFv-L3-light chain of Fab; and, the second polypeptide may be, from N terminal to C terminal: M1-linker L1-HSA VHH-cleavable linker-heavy chain of Fab. In some embodiment, the first polypeptide may be, from N terminal to C terminal: VH of scFv-VL of scFv-L3-light chain of Fab; and, the second polypeptide may be, from N terminal to C terminal: M1-linker L1-HSA VHH-linker L2-M2-cleavable linker-heavy chain of Fab.

[0237] In some embodiment, compared to TCEs that do not contain a masking moiety, the TCEs described herein have lower affinity for effector molecules on T cells and / or tumor surface antigens. In some cases, the affinity of the TCEs described herein can be at least 5-fold, 10-fold, 15-fold, 20-fold, 25-fold, 30-fold, 35-fold, 40-fold, 45-fold, 50-fold, 60-fold, 70-fold, 80-fold, 90-fold, or 100-fold lower.

[0238] In some embodiment, when exposed to the tumor-microenvironment, the cleavable linker connecting the masking domain and the scFv / Fab may be cleaved and the masking domain M1 and / or M2 may be unbound from the scFv and / or Fab, such that the TCEs described herein may be activated and exert its tumor cytotoxicity.

[0239] Masking domain

[0240] In some embodiment, the masking domain may comprise a peptide that impairs the binding of the antigen binding domain to the target antigen. In some embodiment, the masking domain M1 may comprise a peptide that impairs the binding the scFv to the effector molecule expressing on T cell. In some embodiment, the masking domain M1 may be bound to scFv through ionic interactions, electrostatic interactions, hydrophobic interactions, π-stacking interactions, and H-bonding interactions, or a combination thereof. In some embodiment, the masking domain M1 may become unbound from scFv when the cleavable linker is cleaved by the protease thereby exposing scFv to the effector molecule expressing on T cell. In some embodiments, the protease may comprise a tumor specific protease. In some embodiments, the protease may comprise a matrix metalloprotease (MMP) or a serine protease. In some embodiments, the matrix metalloprotease may comprise MMP2, MMP7, MMP9, MMP 13, or MMP 14. In some embodiments, the serine protease may comprise matriptase, urokinase, or hepsin. In some embodiments, the masking domain M1 may impair binding of scFv to the effector molecule expressing on T cell by non-steric blocking. In some embodiments, the mask domain M1 may impair binding of scFv to the effector molecule expressing on T cell through covalent interactions.

[0241] In some embodiment, the masking domain M2 may comprise a peptide that impairs the binding the Fab to the tumor antigen on tumor cell. In some embodiment, the masking domain M2 may be bound to Fab through ionic interactions, electrostatic interactions, hydrophobic interactions, π-stacking interactions, and H-bonding interactions, or a combination thereof. In some embodiment, the masking domain M2 may become unbound from Fab when the cleavable linker is cleaved by the protease thereby exposing Fab to the tumor antigen on tumor cell. In some embodiments, the protease may comprise a tumor specific protease. In some embodiments, the protease may comprise a matrix metalloprotease (MMP) or a serine protease. In some embodiments, the matrix metalloprotease may comprise MMP2, MMP7, MMP9, MMP 13, or MMP 14. In some embodiments, the serine protease may comprise matriptase, urokinase, or hepsin. In some embodiments, the masking domain M2 may impair binding of Fab to the tumor antigen on tumor cell by non-steric blocking. In some embodiments, the mask domain M2 may impair binding of Fab to the tumor antigen on tumor cell through covalent interactions.

[0242] In some embodiment, the masking domain M1 may comprise an amino acid sequence with at least 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, or 100%sequence identity to any one of SEQ ID NOS: 13 to 19. In some embodiment, the masking domain M1 may comprise an amino acid sequence with at least 90%sequence identity to any one of SEQ ID NOS: 13 to 19. In some embodiment, the masking domain M1 may comprise an amino acid sequence with at least 95%sequence identity to any one of SEQ ID NOS: 13 to 19. In some embodiment, the masking domain M1 may comprise an amino acid sequence with at least 98%sequence identity to any one of SEQ ID NOS: 13 to 19. In some embodiment, the masking domain M1 may comprise an amino acid sequence with at least 99%sequence identity to any one of SEQ ID NOS: 13 to 19. In some embodiment, the masking domain M1 may comprise an amino acid sequence with at least 99%sequence identity to any one of SEQ ID NOS: 13 to 19. In some embodiment, the masking domain M1 may comprise an amino acid sequence of any one of SEQ ID NOS: 13, 14, 15, 16, 17, 18, or, 19. In some embodiment, the masking domain M1 may comprise an amino acid sequence with at least 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, or 100%sequence identity to SEQ ID NOS: 15. In some embodiment, the masking domain M1 may comprise an amino acid sequence with at least 90%sequence identity to SEQ ID NOS: 15. In some embodiment, the masking domain M1 may comprise an amino acid sequence with at least 95%sequence identity to SEQ ID NOS: 15. In some embodiment, the masking domain M1 may comprise an amino acid sequence with at least 98%sequence identity to SEQ ID NOS: 15. In some embodiment, the masking domain M1 may comprise an amino acid sequence with at least 99%sequence identity to SEQ ID NOS: 15. In some embodiment, the masking domain M1 may comprise an amino acid sequence of SEQ ID NOS: 15. In some embodiment, the masking domain M1 may be SEQ ID NOS: 15.

[0243] In some embodiment, the masking domain M2 may comprise an amino acid sequence with at least 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, or 100%sequence identity to any one of SEQ ID NOS: 20 to 32. In some embodiment, the masking domain M2 may comprise an amino acid sequence with at least 90%sequence identity to any one of SEQ ID NOS: 20 to 32. In some embodiment, the masking domain M2 may comprise an amino acid sequence with at least 95%sequence identity to any one of SEQ ID NOS: 20 to 32. In some embodiment, the masking domain M2 may comprise an amino acid sequence with at least 98%sequence identity to any one of SEQ ID NOS: 20 to 32. In some embodiment, the masking domain M2 may comprise an amino acid sequence with at least 99%sequence identity to any one of SEQ ID NOS: 20 to 32. In some embodiment, the masking domain M2 may comprise an amino acid sequence with at least 99%sequence identity to any one of SEQ ID NOS: 20 to 32. In some embodiment, the masking domain M2 may comprise an amino acid sequence of any one of SEQ ID NOS: 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, or 32. In some embodiment, the masking domain M2 may comprise an amino acid sequence with at least 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, or 100%sequence identity to SEQ ID NO: 20.In some embodiment, the masking domain M2 may comprise an amino acid sequence with at least 90%sequence identity to SEQ ID NO: 20. In some embodiment, the masking domain M2 may comprise an amino acid sequence with at least 95%sequence identity to SEQ ID NO: 20. In some embodiment, the masking domain M2 may comprise an amino acid sequence with at least 98%sequence identity to SEQ ID NO: 20. In some embodiment, the masking domain M2 may comprise an amino acid sequence with at least 99%sequence identity to SEQ ID NO: 20. In some embodiment, the masking domain M2 may comprise an amino acid sequence of SEQ ID NO 20. In some embodiment, the masking domain M2 may be SEQ ID NOS: 20.

[0244] Table 1 provides exemplary amino acid sequences of masking domain of the present application.

[0245] Table 1. Amino acid sequences of the masking domain M1 and M2

[0246] Cleavable linkers and other linkers

[0247] In some embodiment, the cleavable linker may be bond to C terminal of half-life extension when M2 is absent and may be bond to N terminal of Fab. In some embodiment, the cleavable linker may be bond to N terminal of half-life extension when M2 is absent and may be bond to N terminal of Fab. In some embodiment, the cleavable linker may be bond to C terminal of half-life extension when M2 is absent and may be bond to C terminal of Fab. In some embodiment, the cleavable linker may be bond to N terminal of half-life extension when M2 is absent and may be bond to C terminal of Fab.

[0248] In some embodiment, the cleavable linker may be bond to C terminal of M2 and may be bond to N terminal of Fab. In some embodiment, the cleavable linker may be bond to N terminal of M2 and may be bond to N terminal of Fab. In some embodiment, the cleavable linker may be bond to C terminal of M2 and may be bond to C terminal of Fab. In some embodiment, the cleavable linker may be bond to N terminal of M2 and may be bond to C terminal of Fab.

[0249] In some embodiment, the cleavable linker may be cleaved by the protease such that scFv binds the effector molecular expressing on the T cell and Fab binds the tumor antigen expressing on the tumor cell. In some embodiment, the cleavable linker may comprise a matriptase cleavable amino acid sequence.

[0250] In some embodiment, the cleavable linker may be cleaved by the protease. In some embodiment, the protease is present in higher levels in a disease-state microenvironment relative to levels in healthy tissue or a microenvironment that is not the disease-state microenvironment. In some embodiment, the protease may be a tumor specific protease. In some embodiments, the protease may comprise a matrix metalloprotease (MMP) or a serine protease. In some embodiments, the matrix metalloprotease may comprise MMP2, MMP7, MMP9, MMP 13, or MMP 14. In some embodiments, the serine protease may comprise matriptase, urokinase, or hepsin.

[0251] In some embodiment, the cleavable linker may comprise an amino acid with at least 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, or 100%sequence identity to any one of SEQ ID NOS: 103-153, 190-337 and 458-466. In some embodiment, the cleavable linker may comprise an amino acid with at least 90%sequence identity to any one of SEQ ID NOS: 103-153, 190-337 and 458-466. In some embodiment, the cleavable linker may comprise an amino acid with at least 95%sequence identity to any one of SEQ ID NOS: 103-153, 190-337 and 458-466. In some embodiment, the cleavable linker may comprise an amino acid with at least 98%sequence identity to any one of SEQ ID NOS: 103-153, 190-337 and 458-466. In some embodiment, the cleavable linker may comprise an amino acid with at least 99%sequence identity to any one of SEQ ID NOS: 103-153, 190-337 and 458-466. In some embodiment, the cleavable linker may comprise an amino acid of any one of SEQ ID NOS: 103-153, 190-337 and 458-466. In some embodiment, the cleavable linker may comprise an amino acid with at least 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, or 100%sequence identity to any one of SEQ ID NOS: 461. In some embodiment, the cleavable linker may comprise an amino acid with at least 90%sequence identity to SEQ ID NOS: 461. In some embodiment, the cleavable linker may comprise an amino acid with at least 95%sequence identity to SEQ ID NOS: 461. In some embodiment, the cleavable linker may comprise an amino acid with at least 98%sequence identity to SEQ ID NOS: 461. In some embodiment, the cleavable linker may comprise an amino acid with at least 99%sequence identity to SEQ ID NOS: 461. In some embodiment, the cleavable linker may comprise an amino acid with at least 99%sequence identity to SEQ ID NOS: 461. In some embodiment, the cleavable linker may comprise an amino acid of SEQ ID NOS: 461. In some embodiment, the cleavable linker may be SEQ ID NOS: 461.

[0252] In some embodiment, the masking domain M1 may be linked to the half-life extension domain by the linker L1. In some embodiment, the linker L1 may be bound to the N terminal of M1. In some embodiment, the linker L1 may be bound to the C terminal of M1. In some embodiment, the linker L1 may be bound to the N terminal of M2. In some embodiment, the linker L1 may be bound to the C terminal of M2.

[0253] In some embodiment, the half-life extension domain may be linked to the M2 by the linker L2. In some embodiment, the linker L2 may be bound to the N terminal of half-life extension domain. In some embodiment, the linker L2 may be bound to the C terminal of half-life extension domain. In some embodiment, the linker L2 may be bound to the N terminal of M2. In some embodiment, the linker L2 may be bound to the C terminal of M2.

[0254] In some embodiment, the scFv may be linked to the Fab by the linker L3. In some embodiment, the linker L3 may be bound to the N terminal of scFv. In some embodiment, the linker L3 may be bound to the C terminal of scFv. In some embodiment, the linker L3 may be bound to the N terminal of Fab. In some embodiment, the linker L3 may be bound to the C terminal of Fab.

[0255] In some embodiment, the linker L1, L2 or L3 may comprise a formula comprising (GS) n, wherein n may be an integer of at least 1. In some embodiment, the linker L1, L2 or L3 may comprise a formula comprising (GGS) n, wherein n may be an integer of at least 1. In some embodiment, the linker L1, L2 or L3 may comprise a formula comprising (GGGS) n, wherein n may be an integer of at least 1. In some embodiment, the linker L1, L2 or L3 may comprise a formula comprising (GGGGS) n, wherein n may be an integer of at least 1. In some embodiment, the linker L1, L2 or L3 may comprise a formula comprising (GKPGS) n, wherein n may be an integer of at least 1. In some embodiment, the linker L1, L2 or L3 may comprise a formula comprising (GEPGS) n, wherein n may be an integer of at least 1. In some embodiment, the linker L1, L2 or L3 may comprise a formula comprising (GRPGS) n, wherein n may be an integer of at least 1.

[0256] In some embodiment, the linker L1, L2 or L3 may comprise an amino acid sequence with at least 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, or 100%sequence identity to any one of SEQ ID NOS: 154-189, and 467-470. In some embodiment, the linker L1, L2 or L3 may comprise an amino acid sequence with at least 90%sequence identity to any one of SEQ ID NOS: 154-189, and 467-470. In some embodiment, the linker L1, L2 or L3 may comprise an amino acid sequence with at least 95%sequence identity to any one of SEQ ID NOS: 154-189, and 467-470. In some embodiment, the linker L1, L2 or L3 may comprise an amino acid sequence with at least 98%sequence identity to any one of SEQ ID NOS: 154-189, and 467-470. In some embodiment, the linker L1, L2 or L3 may comprise an amino acid sequence with at least 99%sequence identity to any one of SEQ ID NOS: 154-189, and 467-470. In some embodiment, the linker L1, L2 or L3 may comprise an amino acid sequence of any one of SEQ ID NOS: 154-189, and 467-470.

[0257] In some embodiment, the linker L1 may comprise an amino acid sequence with at least 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, or 100%sequence identity to SEQ ID NOS: 468. In some embodiment, the linker L1 may comprise an amino acid sequence with at least 90%sequence identity to SEQ ID NOS: 468. In some embodiment, the linker L1 may comprise an amino acid sequence with at least 95%sequence identity to SEQ ID NOS: 468. In some embodiment, the linker L1 may comprise an amino acid sequence with at least 98%sequence identity to SEQ ID NOS: 468. In some embodiment, the linker L1 may comprise an amino acid sequence with at least 99%sequence identity to SEQ ID NOS: 468. In some embodiment, the linker L1 may comprise an amino acid sequence of SEQ ID NOS: 468.

[0258] In some embodiment, the linker L2 may comprise an amino acid sequence with at least 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, or 100%sequence identity to SEQ ID NOS: 467. In some embodiment, the linker L2 may comprise an amino acid sequence with at least 90%sequence identity to SEQ ID NOS: 467. In some embodiment, the linker L2 may comprise an amino acid sequence with at least 95%sequence identity to SEQ ID NOS: 467. In some embodiment, the linker L2 may comprise an amino acid sequence with at least 98%sequence identity to SEQ ID NOS: 467. In some embodiment, the linker L2 may comprise an amino acid sequence with at least 99%sequence identity to SEQ ID NOS: 467. In some embodiment, the linker L2 may comprise an amino acid sequence of SEQ ID NOS: 467.

[0259] In some embodiment, the linker L3 may comprise an amino acid sequence with at least 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, or 100%sequence identity to SEQ ID NOS: 154. In some embodiment, the linker L3 may comprise an amino acid sequence with at least 90%sequence identity to SEQ ID NOS: 154. In some embodiment, the linker L23 may comprise an amino acid sequence with at least 95%sequence identity to SEQ ID NOS: 154. In some embodiment, the linker L3 may comprise an amino acid sequence with at least 98%sequence identity to SEQ ID NOS: 154. In some embodiment, the linker L3 may comprise an amino acid sequence with at least 99%sequence identity to SEQ ID NOS: 154. In some embodiment, the linker L3 may comprise an amino acid sequence of SEQ ID NOS: 154.

[0260] Table 2-4 provide the exemplary amino acid sequences of cleavable linkers and other linkers L1, L2 and L3 of the present application.

[0261] Table 2. Amino acid sequences of cleavable linkers

[0262] Table 3. Amino acid sequences of other linkers

[0263] Table 4. other cleavable linkers

[0264] Half-life extension domain

[0265] In some embodiment, the half-life extension domain may comprise albumin. In some embodiment, the albumin may be serum albumin. In some embodiment, the albumin may be human serum albumin. In some embodiment, the half-life extension domain may comprise an immunoglobulin Fc. In some embodiment, the half-life extension domain may comprise an antigen-binding polypeptide. In some embodiment, the antigen-binding polypeptide may be an antibody. In some embodiment, the antigen-binding polypeptide may be an antibody that binds human serum albumin. In some embodiment, the antibody may comprise a single domain antibody (VHH) , an scFv, or a Fab. In some embodiment, the antibody may comprise a VHH. In some embodiment, the VHH may be a human or humanized antibody. In some embodiment, the antibody may comprise a VHH that binds human serum albumin (HSA-VHH) .

[0266] In some embodiment, the VHH that binds human serum albumin may comprise an amino acid sequence with at least 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, or 100%sequence identity to SEQ ID NOS: 471. In some embodiment, the VHH that binds human serum albumin may comprise an amino acid sequence with at least 90%sequence identity to SEQ ID NOS: 471. In some embodiment, the VHH that binds human serum albumin may comprise an amino acid sequence with at least 95%sequence identity to SEQ ID NOS: 471. In some embodiment, the VHH that binds human serum albumin may comprise an amino acid sequence with at least 98%sequence identity to SEQ ID NOS: 471. In some embodiment, the VHH that binds human serum albumin may comprise an amino acid sequence with at least 99%sequence identity to SEQ ID NOS: 471. In some embodiment, the VHH that binds human serum albumin may comprise an amino acid sequence of SEQ ID NOS: 471.

[0267] Table 5. Amino acid sequences of half-life extension domain

[0268] scFv that binds an effector molecule expressing on T cell

[0269] In some embodiment, the effector molecular expressing on the T cell may be CD3. In some embodiment, the scFv may bind CD3 (CD3-scFv) . In some embodiment, the scFv that binds CD3 may comprise a heavy variable domain (VH) and a light variable domain (VL) . In some embodiment, the N terminal of the CD3-scFv may be directly or indirectly linked to the C terminal of one chain of the Fab. In some embodiment, the C terminal of the CD3-scFv may be directly or indirectly linked to the N terminal of one chain of the Fab.

[0270] In some embodiment, the C terminal of the VH of CD3-scFv may be directly or indirectly linked to the N terminal of one chain of the Fab. In some embodiment, the C terminal of the VL of CD3-scFv may be directly or indirectly linked to the N terminal of one chain of the Fab. In some embodiment, the C terminal of the VH of CD3-scFv may be directly or indirectly linked to the N terminal of the heavy chain of the Fab. In some embodiment, the C terminal of the VH of CD3-scFv may be directly or indirectly linked to the N terminal of the light chain of the Fab. In some embodiment, the C terminal of the VL of CD3-scFv may be directly or indirectly linked to the N terminal of heavy chain of the Fab. In some embodiment, the C terminal of the VL of CD3-scFv may be directly or indirectly linked to the N terminal of light chain of the Fab.

[0271] In some embodiment, the C terminal of the VH of CD3-scFv may be linked to the N terminal of one chain of the Fab by the linker L3. In some embodiment, the C terminal of the VL of CD3-scFv may be linked to the N terminal of one chain of the Fab by the linker L3. In some embodiment, the C terminal of the VH of CD3-scFv may be directly or indirectly linked to the N terminal of the heavy chain of the Fab by the linker L3. In some embodiment, the C terminal of the VH of CD3-scFv may be directly or indirectly linked to the N terminal of the light chain of the Fab by the linker L3. In some embodiment, the C terminal of the VL of CD3-scFv may be directly or indirectly linked to the N terminal of heavy chain of the Fab by the linker L3. In some embodiment, the C terminal of the VL of CD3-scFv may be directly or indirectly linked to the N terminal of light chain of the Fab by the linker L3.

[0272] In some embodiment, the first polypeptide may comprise, from N terminal to C terminal: VH of the CD3-scFV and one chain of the Fab; and the second polypeptide may comprise, from N terminal to C terminal: M1, HSA VHH, M2 and another chain of Fab. In some embodiment, the first polypeptide may comprise, from N terminal to C terminal: VH of the CD3-scFV and one chain of the Fab; and the second polypeptide may comprise, from N terminal to C terminal: M1, HSA VHH and another chain of Fab. In some embodiment, the first polypeptide may comprise, from N terminal to C terminal: VL of the CD3-scFV and one chain of the Fab; and the second polypeptide may comprise, from N terminal to C terminal: M1, HSA VHH, M2 and another chain of Fab. In some embodiment, the first polypeptide may comprise, from N terminal to C terminal: VL of the CD3-scFV and one chain of the Fab; and the second polypeptide may comprise, from N terminal to C terminal: M1, HSA VHH and another chain of Fab.

[0273] In some embodiment, the first polypeptide may comprise, from N terminal to C terminal: VH of the CD3-scFV, linker L3 and one chain of the Fab; and the second polypeptide may comprise, from N terminal to C terminal: M1, linker L1, HSA VHH, linker L2, M2, cleavable linker and another chain of Fab. In some embodiment, the first polypeptide may comprise, from N terminal to C terminal: VH of the CD3-scFV, linker L3 and one chain of the Fab; and the second polypeptide may comprise, from N terminal to C terminal: M1, linker L1, HSA VHH, cleavable linker and another chain of Fab. In some embodiment, the first polypeptide may comprise, from N terminal to C terminal: VL of the CD3-scFV, linker L3 and one chain of the Fab; and the second polypeptide may comprise, from N terminal to C terminal: M1, linker L1, HSA VHH, linker L2, M2, cleavable linker and another chain of Fab. In some embodiment, the first polypeptide may comprise, from N terminal to C terminal: VL of the CD3-scFV, linker L3 and one chain of the Fab; and the second polypeptide may comprise, from N terminal to C terminal: M1, linker L1, HSA VHH, cleavable linker and another chain of Fab.

[0274] In some embodiment, the VH of scFv may comprise complementarity determining regions (HC-CDRs) : HC-CDR1, HC-CDR2 and HC-CDR3; and the VL of scFv may comprise complementarity determining regions (LC-CDRs) : LC-CDR1, LC-CDR2 and LC-CDR3. In some embodiment, the HC-CDR1 of CD3-scFv may comprise amino acid sequence of SEQ ID NO: 341, HC-CDR2 of CD3-scFv may comprise an amino acid sequence of SEQ ID NO: 342, HC-CDR3 of CD3-scFv may comprise an amino acid sequence of SEQ ID NO: 343; and, LC-CDR1 of CD3-scFv may comprise an amino acid sequence of SEQ ID NO: 350, LC-CDR2 of CD3-scFv may comprise an amino acid sequence of SEQ ID NO: 351, and LC-CDR3 of CD3-scFv may comprise an amino acid sequence of SEQ ID NO: 352.

[0275] In some embodiment, the HC-CDR1 of CD3-scFv may comprise amino acid sequence of SEQ ID NO: 359, HC-CDR2 of CD3-scFv may comprise an amino acid sequence of SEQ ID NO: 360, HC-CDR3 of CD3-scFv may comprise an amino acid sequence of SEQ ID NO: 361; and, LC-CDR1 of CD3-scFv may comprise an amino acid sequence of SEQ ID NO: 368, LC-CDR2 of CD3-scFv may comprise an amino acid sequence of SEQ ID NO: 369, and LC-CDR3 of CD3-scFv may comprise an amino acid sequence of SEQ ID NO: 370.

[0276] In some embodiment, the HC-CDR1 of CD3-scFv may comprise amino acid sequence of SEQ ID NO: 377, HC-CDR2 of CD3-scFv may comprise an amino acid sequence of SEQ ID NO: 378, HC-CDR3 of CD3-scFv may comprise an amino acid sequence of SEQ ID NO: 379; and, LC-CDR1 of CD3-scFv may comprise an amino acid sequence of SEQ ID NO: 386, LC-CDR2 of CD3-scFv may comprise an amino acid sequence of SEQ ID NO: 387, and LC-CDR3 of CD3-scFv may comprise an amino acid sequence of SEQ ID NO: 388.

[0277] In some embodiment, the HC-CDR1 of CD3-scFv may comprise amino acid sequence of SEQ ID NO: 395, HC-CDR2 of CD3-scFv may comprise an amino acid sequence of SEQ ID NO: 396, HC-CDR3 of CD3-scFv may comprise an amino acid sequence of SEQ ID NO: 397; and, LC-CDR1 of CD3-scFv may comprise an amino acid sequence of SEQ ID NO: 404, LC-CDR2 of CD3-scFv may comprise an amino acid sequence of SEQ ID NO: 405, and LC-CDR3 of CD3-scFv may comprise an amino acid sequence of SEQ ID NO: 406.

[0278] In some embodiment, the VH of CD3-scFv may comprise an amino acid sequence of SEQ ID NO:447; and VL of CD3-scFv may comprise an amino acid sequence of SEQ ID NO: 446. In some embodiment, the VH of CD3-scFv may comprise an amino acid sequence of SEQ ID NO: 449; and VL of CD3-scFv may comprise an amino acid sequence of SEQ ID NO: 448. In some embodiment, the VH of CD3-scFv may comprise an amino acid sequence of SEQ ID NO: 451; and VL of CD3-scFv may comprise an amino acid sequence of SEQ ID NO: 450. In some embodiment, the VH of CD3-scFv may comprise an amino acid sequence of SEQ ID NO: 453; and VL of CD3-scFv may comprise an amino acid sequence of SEQ ID NO: 452.

[0279] In some embodiment, the VH of CD3-scFv may be linked to the VL of CD3-scFv by a linker. In some embodiment, the VH of CD3-scFv may be linked to the VL of CD3-scFv by a linker comprising an amino acid sequence of any one of SEQ ID NOS: 154-189, and 467-470. In some embodiment, the VH of CD3-scFv may be linked to the VL of CD3-scFv by a linker comprising an amino acid sequence of SEQ ID NOS: 156.

[0280] In some embodiment, the scFv may comprise an amino acid sequence with at least 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, or 100%sequence identity of any one of SEQ ID NO: 1-8. In some embodiment, the scFv may comprise an amino acid sequence with at least 90%sequence identity of any one of SEQ ID NO: 1-8. In some embodiment, the scFv may comprise an amino acid sequence with at least 95%sequence identity of any one of SEQ ID NO: 1-8. In some embodiment, the scFv may comprise an amino acid sequence with at least 98%sequence identity of any one of SEQ ID NO: 1-8. In some embodiment, the scFv may comprise an amino acid sequence with at least 99%sequence identity of any one of SEQ ID NO: 1-8. In some embodiment, the scFv may comprise an amino acid sequence any one of SEQ ID NO: 1-8.

[0281] In some embodiment, the scFv may comprise an amino acid sequence with at least 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, or 100%sequence identity of SEQ ID NO: 1. In some embodiment, the scFv may comprise an amino acid sequence with at least 90%sequence identity of SEQ ID NO: 1. In some embodiment, the scFv may comprise an amino acid sequence with at least 95%sequence identity of SEQ ID NO: 1. In some embodiment, the scFv may comprise an amino acid sequence with at least 98%sequence identity of SEQ ID NO: 1. In some embodiment, the scFv may comprise an amino acid sequence with at least 99%sequence identity of SEQ ID NO: 1. In some embodiment, the scFv may comprise an amino acid sequence SEQ ID NO: 1. In some embodiment, the scFv may be SEQ ID NO: 1.

[0282] Table 6 provides exemplary CDR combinations of scFv of the disclosure and Table 7 provides exemplary VH / VL combinations of scFv of the disclosure. Table 8 provides exemplary scFv sequences of the disclosure.

[0283] Table 6. CDR amino acid sequences of scFv

[0284] Table 7. VH and VL amino acid sequences of scFv

[0285] Table 8. Amino acid sequences of scFv

[0286] Fab that binds tumor surface antigen expressing on the tumor cell

[0287] In some embodiment, the Fab may comprise a heavy chain and a light chain. In some embodiment, the N terminal of Fab may be directly or indirectly linked to the C terminal of the scFv. In some embodiment, the C terminal of Fab may be directly or indirectly linked to the N terminal of the scFv.

[0288] In some embodiment, the N terminal of the heavy chain of the Fab may be directly or indirectly linked to the C terminal of the scFv. In some embodiment, the N terminal of the light chain of the Fab may be directly or indirectly linked to the C terminal of the scFv. In some embodiment, the N terminal of the heavy chain of the Fab may be directly or indirectly linked to the C terminal of the VH of scFv. In some embodiment, the N terminal of the light chain of the Fab may be directly or indirectly linked to the C terminal of the VH of scFv. In some embodiment, the N terminal of the light chain of the Fab may be directly or indirectly linked to the C terminal of the VL of scFv. In some embodiment, the N terminal of the heavy chain of the Fab may be directly or indirectly linked to the C terminal of the VL of scFv.

[0289] In some embodiment, the N terminal of the heavy chain of the Fab may be linked to the C terminal of the scFv by the linker L3. In some embodiment, the N terminal of the light chain of the Fab may be directly or indirectly linked to the C terminal of the scFv by the linker L3. In some embodiment, the N terminal of the heavy chain of the Fab may be directly or indirectly linked to the C terminal of the VH of scFv by the linker L3. In some embodiment, the N terminal of the light chain of the Fab may be directly or indirectly linked to the C terminal of the VH of scF by the linker L3v. In some embodiment, the N terminal of the light chain of the Fab may be directly or indirectly linked to the C terminal of the VL of scFv by the linker L3. In some embodiment, the N terminal of the heavy chain of the Fab may be directly or indirectly linked to the C terminal of the VL of scFv by the linker L3.

[0290] In some embodiment, the tumor antigen expressing on the tumor cell may be EGFR. In some embodiment, the Fab may bind EGFR (EGFR-Fab) . In some embodiment, the first polypeptide may comprise, from N terminal to C terminal: scFv and heavy chain of EGFR-Fab; and the second polypeptide may comprise, from N terminal to C terminal: M1, HSA VHH, M2 and light chain of EGFR-Fab. In some embodiment, the first polypeptide may comprise, from N terminal to C terminal: scFv and heavy chain of EGFR-Fab; and the second polypeptide may comprise, from N terminal to C terminal: M1, HSA VHH and light chain of EGFR-Fab. In some embodiment, the first polypeptide may comprise, from N terminal to C terminal: scFv and light chain of EGFR-Fab; and the second polypeptide may comprise, from N terminal to C terminal: M1, HSA VHH, M2 and heavy chain of EGFR-Fab. In some embodiment, the first polypeptide may comprise, from N terminal to C terminal: scFv and light chain of EGFR-Fab; and the second polypeptide may comprise, from N terminal to C terminal: M1, HSA VHH and heavy chain of EGFR-Fab.

[0291] In some embodiment, the tumor antigen expressing on the tumor cell may be PSMA. In some embodiment, the Fab may bind PSMA (PSMA-Fab) . In some embodiment, the first polypeptide may comprise, from N terminal to C terminal: scFv and heavy chain of PSMA-Fab; and the second polypeptide may comprise, from N terminal to C terminal: M1, HSA VHH, M2 and light chain of PSMA-Fab. In some embodiment, the first polypeptide may comprise, from N terminal to C terminal: scFv and heavy chain of PSMA-Fab; and the second polypeptide may comprise, from N terminal to C terminal: M1, HSA VHH and light chain of PSMA-Fab. In some embodiment, the first polypeptide may comprise, from N terminal to C terminal: scFv and light chain of PSMA-Fab; and the second polypeptide may comprise, from N terminal to C terminal: M1, HSA VHH, M2 and heavy chain of PSMA-Fab. In some embodiment, the first polypeptide may comprise, from N terminal to C terminal: scFv and light chain of PSMA-Fab; and the second polypeptide may comprise, from N terminal to C terminal: M1, HSA VHH and heavy chain of PSMA-Fab.

[0292] In some embodiment, the tumor antigen expressing on the tumor cell may be STEAP1. In some embodiment, the Fab may bind STEAP1 (STEAP1-Fab) . In some embodiment, the first polypeptide may comprise, from N terminal to C terminal: scFv and heavy chain of STEAP1-Fab; and the second polypeptide may comprise, from N terminal to C terminal: M1, HSA VHH, M2 and light chain of STEAP1-Fab. In some embodiment, the first polypeptide may comprise, from N terminal to C terminal: scFv and heavy chain of STEAP1-Fab; and the second polypeptide may comprise, from N terminal to C terminal: M1, HSA VHH and light chain of STEAP1-Fab. In some embodiment, the first polypeptide may comprise, from N terminal to C terminal: scFv and light chain of STEAP1-Fab; and the second polypeptide may comprise, from N terminal to C terminal: M1, HSA VHH, M2 and heavy chain of STEAP1-Fab. In some embodiment, the first polypeptide may comprise, from N terminal to C terminal: scFv and light chain of STEAP1-Fab; and the second polypeptide may comprise, from N terminal to C terminal: M1, HSA VHH and heavy chain of STEAP1-Fab.

[0293] In some embodiment, the heavy chain of EGFR-Fab may comprise VH and the light chain of EGFR-Fab may comprise VL. In some embodiment, the VH of EGFR-Fab may comprise complementarity determining regions (HC-CDRs) : HC-CDR1, HC-CDR2 and HC-CDR3; and the VL of scFv may comprise complementarity determining regions (LC-CDRs) : LC-CDR1, LC-CDR2 and LC-CDR3. In some embodiment, HC-CDR1 of EGFR-Fab may comprise amino acid sequence of SEQ ID NO: 413, HC-CDR2 of EGFR-Fab may comprise an amino acid sequence of SEQ ID NO: 414, HC-CDR3 of EGFR-Fab may comprise an amino acid sequence of SEQ ID NO: 415; and, LC-CDR1 of EGFR-Fab may comprise an amino acid sequence of SEQ ID NO: 422, LC-CDR2 of EGFR-Fab may comprise an amino acid sequence of SEQ ID NO: 423, and LC-CDR3 of EGFR-Fab may comprise an amino acid sequence of SEQ ID NO: 424. In some embodiment, HC-CDR1 of EGFR-Fab may comprise amino acid sequence of SEQ ID NO: 431, HC-CDR2 of EGFR-Fab may comprise an amino acid sequence of SEQ ID NO: 432, HC-CDR3 of EGFR-Fab may comprise an amino acid sequence of SEQ ID NO: 433; and, LC-CDR1 of EGFR-Fab may comprise an amino acid sequence of SEQ ID NO: 440, LC-CDR2 of EGFR-Fab may comprise an amino acid sequence of SEQ ID NO: 441, and LC-CDR3 of EGFR-Fab may comprise an amino acid sequence of SEQ ID NO: 442.

[0294] In some embodiment, VH of EGFR-Fab may comprise an amino acid sequence of SEQ ID NO: 454; and VL of EGFR-Fab may comprise an amino acid sequence of SEQ ID NO: 455. In some embodiment, VH of EGFR-Fab may comprise an amino acid sequence of SEQ ID NO: 456; and VL of EGFR-Fab may comprise an amino acid sequence of SEQ ID NO: 457.

[0295] In some embodiment, heavy chain of EGFR-Fab may comprise an amino acid sequence of SEQ ID NO: 9, and light chain of EGFR-Fab may comprise an amino acid sequence of SEQ ID NO: 10. In some embodiment, heavy chain of EGFR-Fab may comprise an amino acid sequence of SEQ ID NO:11, and light chain of EGFR-Fab may comprise an amino acid sequence of SEQ ID NO: 12.

[0296] In some embodiment, the heavy chain of PSMA-Fab may comprise VH and the light chain of PSMA-Fab may comprise VL. VH of PSMA -Fab may comprise an amino acid sequence of SEQ ID NO:510; and VL of PSMA -Fab may comprise an amino acid sequence of SEQ ID NO: 511. In some embodiment, heavy chain of PSMA -Fab may comprise an amino acid sequence of SEQ ID NO: 514, and light chain of PSMA -Fab may comprise an amino acid sequence of SEQ ID NO: 515.

[0297] In some embodiment, the heavy chain of STEAP1-Fab may comprise VH and the light chain of STEAP1-Fab may comprise VL. VH of STEAP1-Fab may comprise an amino acid sequence of SEQ ID NO: 508; and VL of STEAP1-Fab may comprise an amino acid sequence of SEQ ID NO: 509. In some embodiment, heavy chain of STEAP1-Fab may comprise an amino acid sequence of SEQ ID NO:512 and light chain of STEAP1 -Fab may comprise an amino acid sequence of SEQ ID NO: 513. Table 9 provides exemplary CDR combinations of Fab of the disclosure and Table 10 provides exemplary VH / VL combinations of Fab of the disclosure. Table 11 provides exemplary Fab sequences of the disclosure.

[0298] Table 9. CDR sequence of Fab

[0299] Table 10. VH and VL sequence of Fab

[0300] Table 11. Amino acid sequence of Fab

[0301] Exemplary Sequence of T cell engager proteinaceous dimer

[0302] In one aspect, the present application provides a T cell engager proteinaceous dimer, which the T cell engager proteinaceous dimer may comprise a first a first polypeptide and a second polypeptide, wherein: said first polypeptide may comprise a single chain variable fragment (scFv) that can bind CD3, and one chain of a Fab, wherein said Fab can bind EGFR; wherein said second polypeptide may comprise a first masking domain (M1) that can reduce the binding of said scFv to CD3; a half-life extension domain HSA VHH that can extend the half-life of said T cell engager proteinaceous dimer; and another chain of a Fab, wherein said Fab can bind with EGFR; wherein said one chain of a Fab of said first polypeptide and said another chain of a Fab of said second polypeptide can form an intact Fab. In some embodiment, in the first polypeptide may comprise, from N terminal to C terminal: CD3-scFv and EGFR-Fab; and the second polypeptide may comprise, from N terminal to C terminal: M1, HSA VHH, M2 and EGFR-Fab. In some embodiment, in the first polypeptide may comprise, from N terminal to C terminal: CD3-scFv and EGFR-Fab; and the second polypeptide may comprise, from N terminal to C terminal: M1, HSA VHH and EGFR-Fab. In some embodiment, in the first polypeptide may comprise, from N terminal to C terminal: CD3-scFv, linker L3 and EGFR-Fab; and the second polypeptide may comprise, from N terminal to C terminal: M1, linker L1, HSA VHH, linker L2, M2, cleavable linker and EGFR-Fab. In some embodiment, in the first polypeptide may comprise, from N terminal to C terminal: CD3-scFv, linker L3 and EGFR-Fab; and the second polypeptide may comprise, from N terminal to C terminal: M1, linker L1, HSA VHH, cleavable linker and EGFR-Fab.

[0303] In some embodiment, in the first polypeptide may comprise, from N terminal to C terminal: VL of CD3-scFv-VH of CD3-scFv and the heavy chain of EGFR-Fab; and the second polypeptide may comprise, from N terminal to C terminal: M1, HSA VHH, M2 and the light chain of EGFR-Fab. In some embodiment, in the first polypeptide may comprise, from N terminal to C terminal: VL of CD3-scFv-VH of CD3-scFv and the heavy chain of EGFR-Fab; and the second polypeptide may comprise, from N terminal to C terminal: M1, HSA VHH and the light chain of EGFR-Fab. In some embodiment, in the first polypeptide may comprise, from N terminal to C terminal: VL of CD3-scFv-VH of CD3-scFv and the light chain of EGFR-Fab; and the second polypeptide may comprise, from N terminal to C terminal: M1, HSA VHH, M2 and the heavy chain of EGFR-Fab. In some embodiment, in the first polypeptide may comprise, from N terminal to C terminal: VL of CD3-scFv-VH of CD3-scFv and the light chain of EGFR-Fab; and the second polypeptide may comprise, from N terminal to C terminal: M1, HSA VHH and the heavy chain of EGFR-Fab. In some embodiment, in the first polypeptide may comprise, from N terminal to C terminal: VH of CD3-scFv-VL of CD3-scFv and the heavy chain of EGFR-Fab; and the second polypeptide may comprise, from N terminal to C terminal: M1, HSA VHH, M2 and the light chain of EGFR-Fab. In some embodiment, in the first polypeptide may comprise, from N terminal to C terminal: VH of CD3-scFv-VL of CD3-scFv and the heavy chain of EGFR-Fab; and the second polypeptide may comprise, from N terminal to C terminal: M1, HSA VHH and the light chain of EGFR-Fab. In some embodiment, in the first polypeptide may comprise, from N terminal to C terminal: VH of CD3-scFv-VL of CD3-scFv and the light chain of EGFR-Fab; and the second polypeptide may comprise, from N terminal to C terminal: M1, HSA VHH, M2 and the heavy chain of EGFR-Fab. In some embodiment, in the first polypeptide may comprise, from N terminal to C terminal: VH of CD3-scFv-VL of CD3-scFv and the light chain of EGFR-Fab; and the second polypeptide may comprise, from N terminal to C terminal: M1, HSA VHH and the heavy chain of EGFR-Fab.

[0304] In some embodiment, in the first polypeptide may comprise, from N terminal to C terminal: VL of CD3-scFv-VH of CD3-scFv-linker L3-the heavy chain of EGFR-Fab; and the second polypeptide may comprise, from N terminal to C terminal: M1-linker L1-HSA VHH-linker L2-M2-cleavable linker-light chain of EGFR-Fab. In some embodiment, in the first polypeptide may comprise, from N terminal to C terminal: VL of CD3-scFv-VH of CD3-scFv-linker L3-the heavy chain of EGFR-Fab; and the second polypeptide may comprise, from N terminal to C terminal: M1-linker L1-HSA VHH-cleavable linker-light chain of EGFR-Fab. In some embodiment, in the first polypeptide may comprise, from N terminal to C terminal: VL of CD3-scFv-VH of CD3-scFv-linker L3-the light chain of EGFR-Fab; and the second polypeptide may comprise, from N terminal to C terminal: M1-linker L1-HSA VHH-linker L2-M2-cleavable linker-heavy chain of EGFR-Fab. In some embodiment, in the first polypeptide may comprise, from N terminal to C terminal: VL of CD3-scFv-VH of CD3-scFv-linker L3-the light chain of EGFR-Fab; and the second polypeptide may comprise, from N terminal to C terminal: M1-linker L1-HSA VHH-cleavable linker-heavy chain of EGFR-Fab. In some embodiment, in the first polypeptide may comprise, from N terminal to C terminal: VH of CD3-scFv-VL of CD3-scFv -linker L3-the heavy chain of EGFR-Fab; and the second polypeptide may comprise, from N terminal to C terminal: M1-linker L1-HSA VHH-linker L2-M2-cleavable linker-light chain of EGFR-Fab. In some embodiment, in the first polypeptide may comprise, from N terminal to C terminal: VH of CD3-scFv-VL of CD3-scFv-linker L3-the heavy chain of EGFR-Fab; and the second polypeptide may comprise, from N terminal to C terminal: M1-linker L1-HSA VHH-cleavable linker-light chain of EGFR-Fab. In some embodiment, in the first polypeptide may comprise, from N terminal to C terminal: VH of CD3-scFv-VL of CD3-scFv-linker L3-the light chain of EGFR-Fab; and the second polypeptide may comprise, from N terminal to C terminal: M1-linker L1-HSA VHH-linker L2-M2-cleavable linker-heavy chain of EGFR-Fab. In some embodiment, in the first polypeptide may comprise, from N terminal to C terminal: VH of CD3-scFv-VL of CD3-scFv-linker L3-the light chain of EGFR-Fab; and the second polypeptide may comprise, from N terminal to C terminal: M1-linker L1-HSA VHH-cleavable linker-heavy chain of EGFR-Fab.

[0305] In some embodiment, the T cell engager proteinaceous dimer described in the present application may have the structure format 3 showing in the Fig. 1B.

[0306] In one aspect, the present application provides a T cell engager proteinaceous dimer comprising a first a first polypeptide and a second polypeptide, wherein: the first polypeptide may comprise a single chain variable fragment (scFv) that can bind CD3, and one chain of a Fab, wherein the Fab can bind PSMA; wherein the second polypeptide may comprise a first masking domain (M1) that can reduce the binding of said scFv to CD3; a half-life extension domain HSA VHH that can extend the half-life of said T cell engager proteinaceous dimer; and another chain of a Fab, wherein said Fab can bind with PSMA; wherein the one chain of a Fab of the first polypeptide and another chain of a Fab of the second polypeptide can form an intact Fab. In some embodiment, in the first polypeptide may comprise, from N terminal to C terminal: VH of CD3-scFv-VL of CD3-scFv and the light chain of PSMA-Fab; and the second polypeptide may comprise, from N terminal to C terminal: M1, HSA VHH, M2 and the heavy chain of PSMA-Fab. In some embodiment, in the first polypeptide may comprise, from N terminal to C terminal: VH of CD3-scFv-VL of CD3-scFv and the light chain of PSMA-Fab; and the second polypeptide may comprise, from N terminal to C terminal: M1, HSA VHH and the heavy chain of PSMA-Fab. In some embodiment, in the first polypeptide may comprise, from N terminal to C terminal: VH of CD3-scFv-VL of CD3-scFv-linker L3-the light chain of PSMA-Fab; and the second polypeptide may comprise, from N terminal to C terminal: M1-linker L1-HSA VHH-linker L2-M2-cleavable linker-heavy chain of PSMA-Fab. In some embodiment, in the first polypeptide may comprise, from N terminal to C terminal: VH of CD3-scFv-VL of CD3-scFv-linker L3-the light chain of PSMA-Fab; and the second polypeptide may comprise, from N terminal to C terminal: M1-linker L1-HSA VHH-cleavable linker-heavy chain of PSMA-Fab.

[0307] In one aspect, the present application provides a T cell engager proteinaceous dimer comprising a first a first polypeptide and a second polypeptide, wherein: the first polypeptide may comprise a single chain variable fragment (scFv) that can bind CD3, and one chain of a Fab, wherein the Fab can bind STEAP1; wherein the second polypeptide may comprise a first masking domain (M1) that can reduce the binding of said scFv to CD3; a half-life extension domain HSA VHH that can extend the half-life of said T cell engager proteinaceous dimer; and another chain of a Fab, wherein said Fab can bind with STEAP1; wherein the one chain of a Fab of the first polypeptide and another chain of a Fab of the second polypeptide can form an intact Fab. In some embodiment, in the first polypeptide may comprise, from N terminal to C terminal: VH of CD3-scFv-VL of CD3-scFv and the heavy chain of STEAP1-Fab; and the second polypeptide may comprise, from N terminal to C terminal: M1, HSA VHH, M2 and the light chain of STEAP1-Fab. In some embodiment, in the first polypeptide may comprise, from N terminal to C terminal: VH of CD3-scFv-VL of CD3-scFv and the heavy chain of STEAP1-Fab; and the second polypeptide may comprise, from N terminal to C terminal: M1, HSA VHH and the light chain of STEAP1-Fab. In some embodiment, in the first polypeptide may comprise, from N terminal to C terminal: VH of CD3-scFv-VL of CD3-scFv -linker L3-the heavy chain of STEAP1-Fab; and the second polypeptide may comprise, from N terminal to C terminal: M1-linker L1-HSA VHH-linker L2-M2-cleavable linker-light chain of STEAP1-Fab. In some embodiment, in the first polypeptide may comprise, from N terminal to C terminal: VH of CD3-scFv-VL of CD3-scFv-linker L3-the heavy chain of STEAP1-Fab; and the second polypeptide may comprise, from N terminal to C terminal: M1-linker L1-HSA VHH-cleavable linker-light chain of STEAP1-Fab.

[0308] In another aspect, the present application provides a T cell engager proteinaceous dimer, which the T cell engager proteinaceous dimer may comprise a first a first polypeptide and a second polypeptide, wherein: said first polypeptide may comprise a single chain variable fragment (scFv) that can bind CD3, and one chain of a Fab, wherein said Fab can bind EGFR; wherein said second polypeptide may comprise a first masking domain (M1) that can reduce the binding of said scFv to CD3; a half-life extension domain HSA VHH that can extend the half-life of said T cell engager proteinaceous dimer; and another chain of a Fab, wherein said Fab can bind with EGFR; wherein said one chain of a Fab of said first polypeptide and said another chain of a Fab of said second polypeptide can form an intact Fab. In some embodiment, the HC-CDR1 of CD3-scFv may comprise amino acid sequence of SEQ ID NO: 341, HC-CDR2 of CD3-scFv may comprise an amino acid sequence of SEQ ID NO: 342, HC-CDR3 of CD3-scFv may comprise an amino acid sequence of SEQ ID NO: 343, LC-CDR1 of CD3-scFv may comprise an amino acid sequence of SEQ ID NO: 350, LC-CDR2 of CD3-scFv may comprise an amino acid sequence of SEQ ID NO: 351, LC-CDR3 of CD3-scFv may comprise an amino acid sequence of SEQ ID NO: 352; and, the HC-CDR1 of EGFR-Fab may comprise amino acid sequence of SEQ ID NO: 413, HC-CDR2 of EGFR-Fab may comprise an amino acid sequence of SEQ ID NO: 414, HC-CDR3 of EGFR-Fab may comprise an amino acid sequence of SEQ ID NO: 415; and, LC-CDR1 of EGFR-Fab may comprise an amino acid sequence of SEQ ID NO:422, LC-CDR2 of EGFR-Fab may comprise an amino acid sequence of SEQ ID NO: 423, and LC-CDR3 of EGFR-Fab may comprise an amino acid sequence of SEQ ID NO: 424. In some embodiment, the VH of CD3-scFv may comprise an amino sequence of SEQ ID NO: 447, the VL of scFv may comprise an amino sequence of SEQ ID NO: 446; and, the VH of EGFR-Fab may comprise an amino sequence of SEQ ID NO: 454, and the VL of EGFR-Fab may comprise an amino sequence of SEQ ID NO: 455. In some embodiment, the CD3-scFv may comprise an amino sequence of SEQ ID NO: 1; and, the heavy chain of EGFR-Fab may comprise an amino acid sequence of any one of SEQ ID NO: 9, and the light chain of EGFR-Fab may comprise an amino acid sequence of any one of SEQ ID NO: 10.

[0309] In another aspect, the present application provides a T cell engager proteinaceous dimer, which the T cell engager proteinaceous dimer may comprise a first a first polypeptide and a second polypeptide, wherein: said first polypeptide may comprise a single chain variable fragment (scFv) that can bind CD3, and one chain of a Fab, wherein said Fab can bind EGFR; wherein said second polypeptide may comprise a first masking domain (M1) that can reduce the binding of said scFv to CD3; a half-life extension domain HSA VHH that can extend the half-life of said T cell engager proteinaceous dimer; and another chain of a Fab, wherein said Fab can bind with EGFR; wherein said one chain of a Fab of said first polypeptide and said another chain of a Fab of said second polypeptide can form an intact Fab. In some embodiment, the first polypeptide and the second polypeptide may respectively comprise an amino acid sequence with at least 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, or 100%sequence identity to any one of combinations: SEQ ID NOS: 33 and 34, 35 and 36, 37 and 38, 39, and 40, 41, and 42, 43 and 44, 45 and 46, 47 and 48, 49 and 50, 51 and 52, 53 and 54, 55 and 56, 57 and 58, 59 and 60, 61 and 62, 63 and 64, 65 and 66, 67 and 68, 69 and 70, 71 and 72, 73 and 74, 75 and 76, 77 and 78, 79 and 80, 81 and 82, 83 and 84, 85 and 86, 87 and 88, 89 and 90, 91 and 92, 93 and 94, 95 and 96, 97 and 98, 99 and 100, 101 and 102, 516 and 517, 518 and 519, 520 and 521, 522 and 523, 524 and 525, 526 and 527, 528 and 529, 530 and 531, 532 and 533, 534 and 535, 536 and 537, or, 538 and 539. In some embodiment, the first polypeptide and the second polypeptide respectively comprise an amino acid sequence with at least 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, or 100%sequence identity to SEQ ID NOS: 63 and 64. In some embodiment, the first polypeptide and the second polypeptide respectively comprise an amino acid sequence with at least 90%sequence identity to SEQ ID NOS: 63 and 64. In some embodiment, the first polypeptide and the second polypeptide respectively comprise an amino acid sequence with at least 95%sequence identity to SEQ ID NOS: 63 and 64. In some embodiment, the first polypeptide and the second polypeptide respectively comprise an amino acid sequence with at least 98%sequence identity to SEQ ID NOS: 63 and 64. In some embodiment, the first polypeptide and the second polypeptide respectively comprise an amino acid sequence with at least 99%sequence identity to SEQ ID NOS: 63 and 64. In some embodiment, the first polypeptide and the second polypeptide respectively comprise an amino acid sequence of SEQ ID NOS: 63 and 64.In some embodiment, the first polypeptide and the second polypeptide respectively comprise an amino acid sequence with at least 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, or 100%sequence identity to SEQ ID NOS: 57 and 58. In some embodiment, the first polypeptide and the second polypeptide respectively comprise an amino acid sequence with at least 90%sequence identity to SEQ ID NOS: 57 and 58. In some embodiment, the first polypeptide and the second polypeptide respectively comprise an amino acid sequence with at least 95%sequence identity to SEQ ID NOS: 57 and 58. In some embodiment, the first polypeptide and the second polypeptide respectively comprise an amino acid sequence with at least 98%sequence identity to SEQ ID NOS: 57 and 58. In some embodiment, the first polypeptide and the second polypeptide respectively comprise an amino acid sequence with at least 99%sequence identity to SEQ ID NOS: 57 and 58. In some embodiment, the first polypeptide and the second polypeptide respectively comprise an amino acid sequence of SEQ ID NOS: 57 and 58.

[0310] In another aspect, the present application provides a T cell engager proteinaceous dimer, which the T cell engager proteinaceous dimer may comprise a first a first polypeptide and a second polypeptide, wherein: said first polypeptide may comprise a single chain variable fragment (scFv) that can bind CD3, and one chain of a Fab, wherein said Fab can bind PSMA; wherein said second polypeptide may comprise a first masking domain (M1) that can reduce the binding of said scFv to CD3; a half-life extension domain HSA VHH that can extend the half-life of said T cell engager proteinaceous dimer; and another chain of a Fab, wherein said Fab can bind with PSMA; wherein said one chain of a Fab of said first polypeptide and said another chain of a Fab of said second polypeptide can form an intact Fab. In some embodiment, the VH of CD3-scFv may comprise an amino acid sequence of SEQ ID NO: 453, the VL of scFv may comprise an amino acid sequence of SEQ ID NO: 452; and, the VH of PSMA-Fab may comprise an amino acid sequence of SEQ ID NO: 510, and the VL of PSMA-Fab may comprise an amino acid sequence of SEQ ID NO: 511. In some embodiment, the CD3-scFv may comprise an amino acid sequence of SEQ ID NO: 8; and, the heavy chain of PSMA-Fab may comprise an amino acid sequence of any one of SEQ ID NO: 514, and the light chain of PSMA-Fab may comprise an amino acid sequence of any one of SEQ ID NO: 515. In some embodiment, the first polypeptide and the second polypeptide respectively comprise an amino acid sequence with at least 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, or 100%sequence identity to SEQ ID NOS: 544 and 545. In some embodiment, the first polypeptide and the second polypeptide respectively comprise an amino acid sequence with at least 90%sequence identity to SEQ ID NOS: 536 and 537. In some embodiment, the first polypeptide and the second polypeptide respectively comprise an amino acid sequence with at least 95%sequence identity to SEQ ID NOS: 536 and 537. In some embodiment, the first polypeptide and the second polypeptide respectively comprise an amino acid sequence with at least 98%sequence identity to SEQ ID NOS: 536 and 537. In some embodiment, the first polypeptide and the second polypeptide respectively comprise an amino acid sequence with at least 99%sequence identity to SEQ ID NOS: 536 and 537. In some embodiment, the first polypeptide and the second polypeptide respectively comprise an amino acid sequence of SEQ ID NOS: 536 and 537.

[0311] In another aspect, the present application provides a T cell engager proteinaceous dimer, which the T cell engager proteinaceous dimer may comprise a first a first polypeptide and a second polypeptide, wherein: said first polypeptide may comprise a single chain variable fragment (scFv) that can bind CD3, and one chain of a Fab, wherein said Fab can bind STEAP1; wherein said second polypeptide may comprise a first masking domain (M1) that can reduce the binding of said scFv to CD3; a half-life extension domain HSA VHH that can extend the half-life of said T cell engager proteinaceous dimer; and another chain of a Fab, wherein said Fab can bind with STEAP1; wherein said one chain of a Fab of said first polypeptide and said another chain of a Fab of said second polypeptide can form an intact Fab. In some embodiment, the VH of CD3-scFv may comprise an amino acid sequence of SEQ ID NO: 449, the VL of scFv may comprise an amino acid sequence of SEQ ID NO: 448; and, the VH of STEAP1-Fab may comprise an amino acid sequence of SEQ ID NO:508, and the VL of STEAP1-Fab may comprise an amino acid sequence of SEQ ID NO: 509. In some embodiment, the CD3-scFv may comprise an amino acid sequence of SEQ ID NO: 4; and, the heavy chain of STEAP1-Fab may comprise an amino acid sequence of any one of SEQ ID NO: 512, and the light chain of STEAP1-Fab may comprise an amino acid sequence of any one of SEQ ID NO: 513. In some embodiment, the first polypeptide and the second polypeptide respectively comprise an amino acid sequence with at least 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, or 100%sequence identity to SEQ ID NOS: 532 and 533. In some embodiment, the first polypeptide and the second polypeptide respectively comprise an amino acid sequence with at least 90%sequence identity to SEQ ID NOS: 532 and 533. In some embodiment, the first polypeptide and the second polypeptide respectively comprise an amino acid sequence with at least 95%sequence identity to SEQ ID NOS: 532 and 533. In some embodiment, the first polypeptide and the second polypeptide respectively comprise an amino acid sequence with at least 98%sequence identity to SEQ ID NOS: 532 and 533. In some embodiment, the first polypeptide and the second polypeptide respectively comprise an amino acid sequence with at least 99%sequence identity to SEQ ID NOS: 532 and 533. In some embodiment, the first polypeptide and the second polypeptide respectively comprise an amino acid sequence of SEQ ID NOS: 532 and 533.

[0312] Table 12 provides the exemplary constructs of the TCEs described herein. Among them, every molecule in column 1 represents an individual TCE construct and the column 2 of Table 12 explains the structures components and orders of the first polypeptide and the second polypeptide of every construct, where the upper-level structure in the second column is the first polypeptide comprising scFv and one chain of Fab and the lower-level structure is the first polypeptide comprising another chain of Fab. The column 3 format refers to the format in FIG. 1A and 1B and the column 4-7 respectively represents the scFv in table 6-8, the masking domain in table 1, the Fab in table 9-11 and the masking domain in table 1. N / Aindicates the absence of this component.

[0313] Table 13 provides sequences for the construct in Table 12, in which the molecule has a pair of A (the first polypeptide, corresponding to the upper-level structure in the second column of Table 12) and B (the second polypeptide, corresponding to the lower-level structure in the second column of Table 12) .

[0314] Table 12. The constructs of TCEs

[0315] Table 13. Full length sequence of the first polypeptide and the second of polypeptide

[0316] Polynucleotides, vectors, and cells

[0317] In another aspect, the present application further provides one or more isolated polynucleotides, which can encode the polypeptides of T cell engager proteinaceous dimer of the present application. In the present application, the nucleic acid molecule can comprise a sequence encoding a signal peptide. In the present application, the nucleic acid molecule can be produced or synthesized by (i) amplification in vitro, for example, produced by polymerase chain reaction (PCR) amplification, (ii) produced by cloning recombination, (iii) purified, for example, by enzyme digestion and gel electrophoresis fractionation, or (iv) synthesized, for example, by chemical synthesis. In the present application, the nucleic acid molecule can be DNA and / or RNA. In the present application, the nucleic acid molecule can be an artificially synthesized nucleic acid analogue.

[0318] In another aspect, the present application further provides one or more vectors comprising one or more polynucleotides molecules described in the present application. Each vector may include one or more of the nucleic acid molecules. Moreover, the vector may further include other genes, such as marker genes allowing the vector to be selected in appropriate host cells and under appropriate conditions. In addition, the vector may further include expression control elements allowing a coding region to be correctly expressed in an appropriate host. Such control elements are well-known to those skilled in the art, for example, may include promoters, ribosome binding sites, enhancers, other control elements adjusting gene transcription or mRNA translation, and the like. In some embodiments, the expression control sequence is a adjustable element. A specific structure of the expression control sequence may vary according to the function of a species or cell type, but generally includes 5′ non-transcriptional sequences and 5′ and 3′ non-translational sequences involved in transcription and translation initiation, respectively, such as a TATA box, a capped sequence, and a CAAT sequence. For example, the 5′ non-transcriptional expression control sequence may include a promoter region, which may include a promoter sequence used for transcriptional control functional linkage of nucleic acids. The expression control sequence may further include an enhancer sequence or an upstream activator sequence. In the present application, an appropriate promoter may include, for example, promoters for SP6, T3, and T7 polymerase, a human U6RNA promoter, a CMV promoter and an artificial hybrid promoter thereof (such as CMV) , where a portion of the promoter can fuse with a portion of other cell protein (such as human GAPDH and glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) gene promoters, which may or may not include additional introns. The one or more nucleic acid molecules described in the present application may be operably connected to the expression control element.

[0319] The vector may include, for example, plasmids, cosmids, viruses, bacteriophages, or other vectors commonly used in genetic engineering. For example, the vector may be an expression vector. For example, the vector may be a viral vector. The viral vector may be administered to a patient (in vivo) directly or indirectly, for example, by treating cells with a virus in vitro and then administering the treated cells to a patient (in vitro) . The virus vector technology is well known in the art and has been described by Sambrook et al. (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York) and in other virology and molecular biology manuals. Conventional virus-based systems may include retroviral vectors, lentiviral vectors, adenoviral vectors, adeno-associated virus vectors, and herpes simplex virus vectors for gene transfer. In some cases, genes may be transferred and integrated into host genomes by retroviruses, lentiviruses, and adeno-associated viruses to express the inserted genes for a long term. The lentiviral vectors are retroviral vectors that can transduce or infect non-dividing cells and typically generate high viral titers. The lentiviral vector may include a long terminal repeat sequence 5′ LTR and truncated 3′ LTR, RRE, rev response element (cPPT) , central termination sequence (CTS) and / or a translated regulatory element (WPRE) . The vector described in the present application can be introduced into cells

[0320] In another aspect, the present application provides a cell. The cell may comprise the polypeptides of T cell engager proteinaceous dimer, the one or more polynucleotides, and / or the one or more vectors described in the present application. For example, each type of cells or each cell may include the one or more nucleic acid molecules or vectors described in the present application. For example, each type of cells or each cell may include a plurality of (such as 2 or more) or multiple types of (such as 2 or more types of) nucleic acid molecules or vectors described in the present application. For example, the vector described in the present application can be introduced into the host cells, such as prokaryotic cells (such as bacterial cells) , CHO cells, NS / 0 cells, HEK293T cells, 293F cells, or HEK293A cells, or other eukaryotic cells, such as cells from plants, fungi, or yeast cells. The vector described in the present application can be introduced into the host cells by methods known in the art, such as electroporation, lipofectine transfection, and lipofectamine transfection. For example, the cells may include yeast cells. For example, the cells may include Escherichia coli cells. For example, the cells may include mammalian cells. For example, the cells may include immune cells. The cells may include immune cells. In some cases, the cells may include immune cells. For example, the cells may include T cells, B cells, natural killer (NK) cells, macrophages, NKT cells, monocytes, dendritic cells, granulocytes, lymphocytes, white blood cells, and / or peripheral blood mononuclear cells.

[0321] Kits

[0322] In another aspect, the present application provides a kit, which may comprise the polypeptides of T cell engager proteinaceous dimer described in the present application. In the present application, the kit may further include instructions for use, which document methods for detecting the presence and / or content of tumor antigen. For example, the methods may include in vitro methods, in vitro methods, and non-diagnostic or non-therapeutic methods.

[0323] In another aspect, the present application provides a use of the polypeptides of T cell engager proteinaceous dimer in preparation of a kit for methods for detecting the presence and / or content of tumor antigen. For example, the methods may include in vitro methods, ex vivomethods, and non-diagnostic or non-therapeutic methods.

[0324] Pharmaceutical composition

[0325] In another aspect, the present application provides a pharmaceutical composition. The pharmaceutical composition may comprise the polypeptides of T cell engager proteinaceous dimer, the one or more polynucleotides, the one or more vectors, or the cell described in the present application; and / or pharmaceutically acceptable adjuvants and / or excipients.

[0326] In some embodiment, the pharmaceutically acceptable adjuvants may include buffering agents, antioxidants, preservatives, low molecular weight polypeptides, proteins, hydrophilic polymers, amino acids, saccharides, chelating agents, counter ions, metal complexes, and / or non-ionic surfactants. Unless incompatible with the cells described in the present application, any conventional medium or reagent can be considered for use in the pharmaceutical composition of the present application. In some embodiment, the pharmaceutically acceptable excipients may include additives in the pharmaceutical formulation other than the main drug, or may be referred to as accessories. For example, the excipients may include adhesives, fillers, disintegrants, and lubricants in tablets. For example, the excipients may include alcohol, vinegar, medicinal juice, and the like in traditional Chinese medicine pills. For example, the excipients may include matrix portions in semi-solid formulation ointments or creams. For example, the excipients may include preservatives, antioxidants, flavoring agents, aromatics, cosolvents, emulsifiers, solubilizers, osmotic pressure regulators, and colorants in liquid formulations.

[0327] In some embodiment, the pharmaceutical composition can comprise parenteral, transdermal, intracavitary, intraarterial, intrathecal and / or intranasal administration or direct injection into tissue. For example, the pharmaceutical composition can be administered to a patient or subject by infusion or injection. In certain embodiments, administration of the pharmaceutical composition can be performed in different ways, for example, intravenous, intraperitoneal, subcutaneous, intramuscular, topical or intradermal administration.

[0328] Method of treatment

[0329] In another aspect, the present application further provides the use of the polypeptides of T cell engager proteinaceous dimer for treatment a disease / disorder in a subject in need thereof. In some embodiment, the subject may be a human. In some embodiment, the disease and / or disorder may be a cancer. In some embodiment, the tumor may be a solid cancer and / or a hematological cancer. In some embodiment, the cancer may be selected from the group consisting of leukemia, myelodysplastic syndrome, malignant lymphoma, nasopharyngeal carcinoma, mesothelioma, lung cancer, pancreatic cancer, head and neck tumors, gastrointestinal tumors, endocrine tumors, mammary and other gynecological tumors, urological tumors, skin tumors, thymic carcinomas, sarcomas and a combination thereof. In some embodiment, the polypeptides of T cell engager proteinaceous dimer described in the present application may be useful for the treatment of tumors that express EGFR, e.g., colorectal cancer (CRC) , squamous cell carcinoma of the head and Neck (SCCHN) , non-small cell lung cancer (NSCLC) , prostate cancer, breast cancer, colon / rectum cancer, head and neck cancer, nasopharyngeal carcinoma, Lung adenocarcinoma, esophagogastric cancer, liver cancer, glioblastoma, cervical cancer, ovarian cancer, bladder cancer, kidney cancer, or pancreatic cancer.

[0330] Preparation method

[0331] In another aspect, the present application provides a method for preparing the polypeptides of T cell engager proteinaceous dimer, the one or more polynucleotides, the one or more vectors, the cell or the pharmaceutical composition described in the present application. For example, the method can comprise culturing the cell under conditions such that the polypeptides of T cell engager proteinaceous dimer are expressed. For example, the method can comprise introducing the vector into the cell.

[0332] Without wishing to be bound by any theory, the examples below are merely to illustrate the T cell engager proteinaceous dimers, methods of making and uses of the present application and are not intended to limit the scope of the present application.

[0333] EXAMPLES

[0334] Example 1. General Experimental Protocols.

[0335] T Cell Engagers (TCEs) Expression and Purification. T cell engagers (TCEs) were expressed in mammalian cells using a standard transfection kit (Life Technologies) . Briefly, 293 / CHO cells were transfected with plasmids using a lipid-based system following the manufacturer’s recommended protocol. The TCEs were purified from cell-free supernatant using MabSelectTM VL resin (Cytiva) . Purified proteins were characterized by SDS-PAGE and high-performance liquid chromatography (HPLC) -SEC for purity assessment.

[0336] ELISA Binding to EGFR, CD3 and albumin. The unmasked and the mono or dual-masked TCEs were evaluated for their ability to bind EGFR, CD3 as well as albumin in a standard enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) . Antigen proteins (human CD3 protein, Sino Biological, Catalog #10977-H08H; human EGFR protein, Sino Biological, Catalog #10001-H08H; human serum albumin, sigma, Catalog #A3782) were coated on the plates at 2 μg / mL at 4℃ overnight and blocked by Superblock (Thermo Fisher, Catalog #37517) for 1 hour at room temperature the other day. Purified TCEs were diluted in buffer and added into the antigen-coated plates. Bound TCEs were detected using a horse radish peroxidase-conjugated anti-human IgG kappa antibody (Thermo Fisher, #A18859 1: 10,000) . The binding curve was fitted with GraphPad Prism 8 software to calculate the concentration of TCEs required to achieve 50%maximal signal (EC50) .

[0337] Cell Binding. PBMCs (sailybio) were cultured in RPMI-1640 medium with 10%heat inactivated-FBS (BI, Catalog 04-001-1A) . HCT116 and HT29 cells were cultured in McCoy’s 5A medium and Jurkat cells in RPMI-1640 medium with 10%heat-inactivated FBS (BI, Catalog 04-001-1A) , 100U / ml penicillin and 100μg / ml streptomycin (KEL Biotech, Catalog KC110-02) supplemented in both medium. HCT116 and HT29 cells were detached with 0.25%Trypsin-EDTA (MeilunBio, Catalog MA0233-2) . Cells were harvested, washed and plated in 96-well plates at 200,000 cells / well. Purified TCEs were serially diluted in the FACS Staining Buffer (BD Pharmingen, Catalog 554656) and added into the cells. Cells were then incubated at 4℃ for 1 hour and washed with 200 μL of FACS Staining Buffer twice. Cells were stained with APC-conjugated anti-human light chain kappa (Invitrogen, #MH10515) in 50 μL at 4℃ for 30 min. Then the cells were harvested, washed, and resuspended in a final volume of 200 μL of FACS Staining Buffer. Data were acquired with AttuneTM NxT (Invitrogen) and the median fluorescence intensity (MFl) was calculated. The MFI results were analyzed and calculated using the nonlinear regression fitting.

[0338] T Cell Activation. To determine the potency of T-cell engagers, the T-cell activation bioassay was performed following the manufacturer’s instructions. In brief, 5x104 of HCT116, COLO205, A549, HT-29, 293F or CHO cells were seeded in sterile 96-well plates and 5x104 of Jurkat-NFAT-luc cells were added together with the indicated TCEs. The co-culture was incubated for 6 h at 37℃, 5%CO2. The fluorescent signal was detected by the GMBright One-Step Luciferase Reporter Gene Assay Kit (Genomeditech, #GM-040505C) . Then the plate was measured with the luminescence plate reader.

[0339] Tumor Cytotoxicity and IFNγ Release of TCEs. Human PBMCs and EGFR-expressing HCT116-luc, HT29, COLO205 and NCI-H1975 cells were co-cultured at a ratio of 5: 1 or 3: 1 in RPMI-1640 supplemented with 5～10%FBS. Purified TCEs were added into the cells. After 48 hours, cytotoxicity was evaluated using the GMBrightOne-Step Luciferase Reporter Gene Assay Kit (Genomeditech, #GM-040505C) or Cytotoxicity Detection Kit PLUS (LDH) ( Catalog #04744926001) according to the manufacturer’s instructions. Luminescence or OD490 was measured with the CLARIOstar Plus (BMG Labtech) . Percentages of the cytotoxicity calculated with the equation [Cytotoxicity (%) = (experimental value-low control)  /  (high control-low control) *100%] were plotted and analyzed using the nonlinear regression fitting in GraphPad Prism 8.

[0340] The supernatants were collected for cytokine analysis. The secretion of IFNγ was quantified via ELISA (Mabtech, Catalog #3420-1H) following the manufacturer’s instructions. Dose-response curve was fitted with GraphPad Prism 8.

[0341] Example 2. Design and Characterization of Masked TCEs in Different Formats.

[0342] Cell Binding. Masked TCEs in different formats were expressed and purified for comparison of the mask efficiency with the diagram of the major formats are shown in FIGS. 1A and 1B, and a summary of the information are listed in Table 1. To determine if the masked TCEs in different formats could exhibit reduced cell binding ability, flow cytometry-based cell binding assay was performed.

[0343] As shown in FIGS. 2A to 2C, with the mask (M1) against the anti-CD3 antibody, 105.3 and 105.9 molecules in Format 1 showed reduced binding ability to PBMCs. The linkers between M1 and anti-CD3 scFv of different lengths in 105.3 and 105.9 did not show significant difference in the mask effect. However, the masking of M1 in Format 1 only reduced the binding of the anti-CD3 scFv by ～2 fold. The masked molecules in Format 2 and 3, with the masking peptide (M1) connected to the N-terminus of the anti-CD3 scFv (Format 2) or the anti-HSA VHH (Format 3) , showed significant reduced binding of anti-CD3 scFv to the Jurkat cells by more than 100 fold, compared to that of the unmasked molecule, 105.16, as shown in FIG. 2B and 2C, indicating a better masked effect of M1 when it was linked in the way of Format 2 and 3.

[0344] In FIG. 2C, TCEs 105.19, 105.20, 105.24 and 105.35 all has the same feature: the anti-CD3-scFv masking domain M1 is linked to the N terminal of anti-EGFR-Fab, which differs from TCE 105.17 with M1 linked to the N terminal of anti-CD3-scFv. We originally expected that the more distal conjugation position of M1, without direct linkage to anti-CD3 scFv, would result in a weaker masking effect on anti-CD3-scFv and reduced binding inhibition. However, surprisingly, it was found that conjugating M1 to the N-terminus of the Fab, without directly linking it to the anti-CD3-scFv, still achieved comparable CD3 binding inhibition ability.

[0345] The mask effect of the masking peptide (M2) was also evaluated with the cell binding assay.

[0346] As shown in FIG. 3A, HT29 binding showed that the masking peptide (M2) against the anti-EGFR antibody reduced the binding of the anti-EGFR antibody by 6～7 fold in Format 1.

[0347] Meanwhile, the 105.19 and 105.24 (Format 3) showed reduced binding to the EGFR on the HCT116 cells with >100-fold compared to the unmasked molecule, 105.16 as shown in FIG. 3B, indicating better mask efficiency of the M2 was achieved with the Format 3.

[0348] Cell Cytotoxicity. The masked TCEs of Format 1 were tested in the tumor cell cytotoxicity assay. A variety of optimization strategies have been tested in molecules in Format 1.

[0349] As shown in FIGS. 4A and 4B, different lengths of the CD3 M1 and the linker between CD3 M1 and anti-CD3 scFv could affect the mask efficiency in the HT29 cell killing. With longer CD3 M1, 105.3 exhibited better mask effect than 105.2. With a 26-amino acid linker, 105.9 showed better mask effect than 105.3, with a 13-amino acid linker.

[0350] The position of the anti-CD3 scFv could affect the potency of the tumor cell killing. As shown in FIG. 4C, when the anti-CD3 scFv was linked to EGFR VH, it exhibited stronger cell killing than the molecules where the scFv was linked to EGFR VL (105.1 vs 105.5) . However, the mask efficiency of M1 in Format 1 was not enough with the EC50 of cytotoxicity of the mono-masked TCEs (with M1 only) in pM range.

[0351] With M2 added, the dual-masked TCEs could be masked better. The position of the mask could affect the mask efficiency. With the M2 attached to the N-terminus of VL of anti-EGFR antibody, 105.6 showed a wider window than the 105.8 as shown in FIG. 4C, although their mask effects were similar in HT29 cell binding assay in FIG. 3A.

[0352] The masked TCEs of Format 2 and 3 were also tested in the tumor cell cytotoxicity assay.

[0353] As shown in FIGS. 5A and 5B, the masked molecules in Format 2 and 3, with the masking peptide (M1) connected to the N-terminus of the anti-CD3 scFv (Format 2) or the anti-HSA VHH (Format 3) , showed reduced HT29 and A375 cell killing compared to the unmasked molecule, 105.16.

[0354] As shown in the FIGS. 5C and 5D, the dual-masked TCEs showed reduced potency in the cell killing and the IFNγ secretion compared to the unmasked molecules, 105.0-1.105.24 showed >100-fold mask efficiency against its unmasked control.

[0355] In vivo Anti-tumor Activity. The anti-tumor activity of the masked TCEs of Formats 2 and 3 were tested in huPBMC reconstituted M-NSG mice bearing colon cancer HCT116 or lung cancer NCI-H292.

[0356] FIG. 6 shows the average tumor volume in NCI-H292 xenograft model in hPBMC-reconstituted M-NSG mice after treated with the TCEs. The final TGI% (20 days after treatment) of 105.17 at doses of 1.07mg / kg and 5.35mg / kg were both 100%. No obvious change of body weight was observed during the dosing period, indicating the masked molecule was well tolerated.

[0357] FIGS. 7 shows the average tumor volume in HCT116 xenograft model in hPBMC-reconstituted M-NSG mice after treated with the TCEs. The dual-masked TCEs shows antitumor efficacy in HCT116 xenograft model in hPBMC-reconstituted M-NSG mice. The final TGI% (15 days after treatment) of 105.18 and 105.19 at doses of 1 mg / kg were 68%and 88%. 105.19 showed a better anti-tumor activity.

[0358] The difference between 105.18 and 105.19 lies in the location of the CD3-scfv masking domain M1, which the M1 of 105.19 is linked to the N terminal of HAS-VHH and Fab (according to FIG. 1B dual-masked Format 3) , and the M1 of 105.18 is linked to the N terminal of CD3-scFv (according to FIG. 1B dual-masked Format 2) . The results show that format-3 with the CD3-scfv masking domain M1 linked to the N terminal of TAA-Fab, not to the N terminal of CD3-scFv, have a better tumor cell cytotoxicity and anti-tumor activity in the tumor environment.

[0359] Example 3. Characterization of Masked TCEs with Different M1 and Anti-CD3 Antibodies.

[0360] ELISA and Cell Binding. Masked TCEs with different combinations of M1 and anti-CD3 scFv were expressed and purified for comparison of the mask efficiency with summary of the information are listed in Table 3 and FIG. 18.

[0361] Firstly, the unmasked and the dual-masked TCEs were evaluated for their ability to bind EGFR and CD3. FIGS. 8A-8G show the CD3 and EGFR of the dual-masked TCEs measured by ELISA or cell binding.

[0362] As shown in FIG. 8A, the masking efficacy of dual-masked TCE, binding of 105.19 to the human CD3 was reduced by >100-fold when compared to the unmasked 105.16 molecule. The presence of human albumin in the ELISA system had little effect in the binding of CD3.

[0363] With different combination of M1 and anti-CD3 scFv, dual-masked TCEs could achieve different mask effect. 105.24 and 105.35 achieved the best mask effect of the CD3 binding as shown in FIG. 8B.

[0364] FIG. 8C shows the Jurkat cell binding of the TCEs. With different anti-CD3 scFv used in the 105.28 and 105.29, these two molecules exhibited a relatively worse mask efficiency in the Jurkat cell binding, which was consistent with the results of ELISA binding.

[0365] As shown in FIG. 8D, the masking efficacy of dual-masked TCE, 105.19 was >200-fold in binding to the human when compared to the unmasked 105.16 molecule. The presence of human albumin in the ELISA system had little effect in the binding of EGFR. Similar mask effect were obtained in the dual-masked TCEs with different combination of M1 and anti-CD3 scFv as shown in FIG. 8E.

[0366] FIGS. 8F and 8G show the CD3 and EGFR binding of the dual-masked TCEs measured by ELISA. The masking efficacy of dual-masked TCE, 105.24 was >100-fold and >200-fold in binding to the human CD3 and human EGFR, respectively, when compared to the unmasked molecule.

[0367] Jurkat-NFAT-Luc Cell Activation. Next, the dual-masked TCEs were evaluated for their ability of activation of the Jurkat cells. FIGS. 9A-9G show the results of the Jurkat cell activation with the dual-masked TCEs with different combination of M1 and anti-CD3 scFv.

[0368] As shown in FIGS. 9A to 9G, the dual-masked TCEs showed reduced potency in the T cell activation assays compared to the unmasked molecules. With different combination of M1 and anti-CD3 scFv, dual-masked TCEs could achieve different mask effect. 105.19 and 105.24 showed a wider window against its unmasked control 105.16 than the 105.28 and 105.29 against 105.30 in the presence of various EGFR-positive cells. 105.19, 105.24 and 105.35 achieved the best mask window in T cell activation among the dual-masked TCEs were screened. The masked molecules hardly activated Jurkat-NFAT at 500 nM in the absence of antigen as shown in FIG. 9H, showing that the Jurkat cell activation by these dual-masked TCEs is antigen-dependent.

[0369] Primary T Cell Activation and Cell Cytotoxicity. Primary T cells were also used to evaluate the activation of the TCEs with flow cytometry. Human PBMCs were incubated with serial diluted TCEs with or without co-cultured with A375, COLO205 or NCI-H1975 cells in RPMI-1640+glutamax supplemented with 10%heat-inactivated FBS (BI, Catalog 04-001-1A) . After 48 hours, cells were pelleted and resuspended in 50 μl of a cocktail containing FITC anti-human CD8a antibody (Biolegend, Catalog 300906) , PE anti-human CD4 antibody (Biolegend, Catalog 300508) and APC anti-human CD69 antibody (Biolegend, Catalog 310910) in FACS buffer. Cells were stained for 1 h at 4℃, washed and re-suspended in 200 μL FACS buffer. Data were acquired with AttuneTM NxT (Invitrogen) and the percentage of CD69+CD8+ T cells was quantified. Data was plotted and analyzed using the nonlinear regression fitting.

[0370] The dual-masked TCEs were evaluated for their potency of primary T cell activation and cell cytotoxicity. FIG. 10A shows the primary T cell activation in the presence of tumor cells and FIGS. 10B and 10C demonstrate the killing of EGFR-positive COLO205 and NCI-H1975 mediated by the dual-masked TCEs with different combination of M1 and anti-CD3 scFv.

[0371] As shown in FIG. 10A, the masked molecules 105.19 and 105.35 exhibited weaker activation of primary T cells than the unmasked molecules in the presence of tumor cells. As shown in the FIGS. 10B and 10C, the dual-masked TCEs showed reduced potency in the cell killing of the EGFR-positive cells compared to the unmasked molecules. With different CD3 scFvs, the mask window could be modified to varying degrees. 105.19 and 105.24 showed a wider window of >100-fold against its unmasked control 105.16 than the 105.28 and 105.29 against 105.30, which was consistent with the results of Jurkat cell activation.

[0372] Example 4. Characterization of Masked TCEs with Different M2 and Anti-EGFR Antibodies.

[0373] ELISA and Cell Binding. Masked TCEs with different combinations of M2 and anti-EGFR antibodies were expressed and purified for comparison of the mask efficiency with summary of the information are listed in Table 3 and FIG. 18.

[0374] The dual-masked TCEs were evaluated for their ability to bind EGFR and CD3 protein. FIGS. 11A-11C show the CD3 and EGFR binding of the dual-masked TCEs measured by ELISA or cell binding. As shown in FIG. 11A, although M2 was in the different chain from the anti-CD3 scFv, it could also affect the mask efficiency of M1 to the anti-CD3 scFv. Similar mask effects were obtained with different M2 in EGFR binding with Fab 1 as shown in FIG. 11B, which may result from the strong masking of the VHH and scFv at the N-terminal of the anti-EGFR Fab 1. However, by changing the anti-EGFR Fab, it altered the EGFR binding of the unmasked TCE against 293F cells and the mask effect was changed slightly as shown in FIG. 11C.

[0375] Jurkat-NFAT Cell Activation. The dual-masked TCEs of different M2 were evaluated for their ability in Jurkat-NFAT cell activation. FIGS. 12A to 12G shows the results of the Jurkat cell activation with the dual-masked TCEs with different combination of M2 and anti-EGFR Fabs.

[0376] As shown in FIGS. 12A to 12G, the dual-masked TCEs showed reduced potency in the T cell activation assays compared to the unmasked molecules. With different combination of M2 and anti-EGFR Fabs, dual-masked TCEs all showed a certain degree of mask effect. 105.24, 105.1412 and 105.1441 achieved the best mask window in T cell activation among the dual-masked TCEs we screened. For different anti-EGFR Fabs, different M2s were used to achieve the best mask effect.

[0377] Example 5. Cleavage of Masked TCEs with Different Tumor-specific Linkers

[0378] In vitro Digestion with Purified MMP. MMP2 (Sino Biological, Catalog #10082-HNAH) , MMP9 (Sino Biological, Catalog #10327-HNAH) and MMP-14 (R&D, Catalog #918-MP-010) were activated following the manufacturer’s instructions. TCEs were digested with the activated MMP2, MMP9 or MMP14 following the manufacturer’s protocol at 37℃ for 2～24 hours. The same conditions were set for mock control without adding MMP. The potency of the T cell activation and tumor cell cytotoxicity were evaluated after the digestion. As shown in FIG. 13A and 13B, the reduced potency of dual-masked TCEs in Jurkat cell activation and HT29 cell cytotoxicity could be fully recovered by the MMP digestion.

[0379] Ex vivo cleavage with HCT116 tumor and liver tissue. M-NSG mice (Shanghai Model Organisms Center, female, 6–8-week-old) were reconstituted with 5x106 of human PBMC cells (sailybio) one day before tumor inoculation. 5x106 of human colon cancer HCT116 cells were subcutaneously implanted into the mice. Mice were sacrificed when tumor volume reached 800～1000 mm3. Tumor and liver tissue were collected and dissociated into single cell. Cells were resuspended in serum-free RPMI-1640 medium, diluted to 2x106 / ml, and plated into a 96 well plate of 100μl / well. The TCEs were diluted with serum-free RPMI-1640 to 10μg / ml, with or without 4mg / ml HSA, and added to the wells. After incubation at 37 ℃ for 6～24 hours, the supernatant containing the TCEs were centrifuged and collected. Western blot was used to analyze the ex vivo cleavage efficiency by tumor or liver tissues. TCEs on the blot were detected using a horse radish peroxidase-conjugated anti-human IgG kappa antibody (Thermo Fisher, Catalog #A18859, 1: 5000) .

[0380] FIGS. 14A to 14C demonstrate the ex vivo digestion of the dual-masked TCEs with different MMP linkers detected with western blot. In the ex vivo system, the dual-masked TCEs with different tumor-specific linkers all shown to be cleavable. 105.24 was shown to be cleaved most efficiently with the least intact TCE remaining after 24 hours. 105.19, 105.22 and 105.25 were less tumor-specific in the ex vivo system and were shown to be cleaved in a slower manner than the 105.24.

[0381] Example 6. Tumor Growth Inhibition of the Dual-Masked TCEs in Mice.

[0382] M-NSG mice (Shanghai Model Organisms Center, female, 6–8-week-old) were reconstituted with 5x106 of human PBMC cells (sailybio) one day before tumor inoculation. 5x106 of human colon cancer HCT116 or Colo205 cells were subcutaneously implanted into Mice. Mice were grouped and treated as indicated when tumor volume reached 100 mm3.

[0383] Tumor growth inhibition rate (TGI%) was calculated with the following equation. TGI%= (1-T / C) ×100% (T: average tumor volume or weight in the treatment group; C: average tumor volume or weight in the control group)

[0384] FIG. 15 shows the average tumor volume in HCT116 xenograft model in hPBMC-reconstituted M-NSG mice after being treated with the TCEs.

[0385] The dual-masked TCEs show anti-tumor efficacy in HCT116 xenograft model hPBMC-reconstituted M-NSG. The final TGI% (19 days after treatment) of 105.28, 105.19 and 105.29 at doses of 2 mg / kg were 98.3%, 94%and 77%, respectively. 105.19 and 105.28 showed better anti-tumor activity than 105.29.

[0386] FIGS. 16 shows the average tumor volume in Colo205 xenograft model in hPBMC-reconstituted M-NSG after being treated with the TCEs.

[0387] The dual-masked TCEs shows antitumor efficacy in Colo205 xenograft model in hPBMC-reconstituted M-NSG. The final TGI% (23 days after treatment) of 105.19 and 105.24 at doses of 3 mg / kg were 50.3%and 68%respectively.

[0388] FIGS. 17 shows the average tumor volume in HCT116 xenograft model in hPBMC-reconstituted M-NSG mice after being treated with the TCEs.

[0389] The dual-masked TCEs shows antitumor efficacy in HCT116 xenograft model in hPBMC-reconstituted M-NSG mice.

[0390] Example 7. Characterization of dual-mask format 3 with different targets-CD3 and PSMA binding domain

[0391] T Cell Activation (Reporter assay) : To determine the potency of T-cell engagement, the T-cell activation bioassay was performed following the manufacturer’s instructions. In brief, 5x104 of LNCap cells (from Procell, CL-0143) were seeded per well in sterile 96-well plates and 5x104 of Jurkat-NFAT-luc (from sanyou) cells were added per well together with the indicated TCEs at a serial of 10-fold dilution from 1000 nM to 0.238 pM. The co-culture was incubated for 6 h at 37℃, 5%CO2, followed by the addition of fluorescent reagent in the GMBrightOne-Step Luciferase Reporter Gene Assay Kit (Genomeditech, Catalog GM-040505C) . Then the plate was measured with the luminescence plate reader.

[0392] Tumor Cytotoxicity: Human PBMCs and PSMA-expressing LNCaP-luc cells were co-cultured at a ratio of 10: 1 in RPMI-1640 supplemented with 2%human serum. Purified TCEs were added into the cells at a serial of 8-fold dilution from 10 nM to 0.0031pM. After 24 hours, cytotoxicity was evaluated using the GMBrightOne-Step Luciferase Reporter Gene Assay Kit (Genomeditech, Catalog#GM-040505C) according to the manufacturer’s instructions. Luminescence was measured with the CLARIOstar Plus (BMG Labtech) . Percentages of the cytotoxicity calculated with the equation [Cytotoxicity (%) = (experimental value-low control)  /  (high control-low control) *100%] were plotted and analyzed using the nonlinear regression fitting in GraphPad Prism 8.

[0393] In Vivo Anti-tumor Efficacy in huPBMC Reconstituted Mouse Model

[0394] M-NOG mice (Shanghai Model Organisms Center, female, 6-8 week-old) were reconstituted with 5x106 of human PBMC cells (sailybio) one day before tumor inoculation. 5x106 of human 22RV1 cells (from Procell, CL-0004 ) were subcutaneously implanted into Mice. Mice were grouped and treated as indicated when tumor volume reached 100 mm3. The tumor volumes and body weights were measured twice weekly during the study.

[0395] Tumor growth inhibition rate (TGI%) was calculated with the following equation. TGI%= (1-T / C) ×100% (T: average tumor volume or weight in the treatment group; C: average tumor volume or weight in the control group)

[0396] As shown in FIG. 18 and FIG. 19, the reduced potency of 107.1909 in Jurkat cell activation and LNCaP cell cytotoxicity could be fully recovered by the MMP digestion. As shown in FIG 20, the final TGI% (15 days after treatment) of 107.1909 at doses of 1.0 mg / kg were 100%.

[0397] The results showed that with the CD3 masking domain M1 linked to the N terminal of the HAS VHH-anti-PSMA Fab, the TCE can effectively inhibit the T cell activation and tumor cytotoxicity, regardless whether the presence of the M2. Furthermore, upon exposed the tumor environment, TCE can effectively inhibit the tumor volume.

[0398] This indicates that the TCE provided by the present invention, which has the feature that CD3 masking domain M1 linked to the N terminal of the HSA VHH-anti-TAA Fab, can be effectively applied in different tumor antigens and in the treatment of tumors, while also effectively avoiding the side effects that may occur in non-tumor environments.

[0399] Example 8. Characterization of dual-mask format 3 with different targets-CD3 and STEAP1 binding domain

[0400] T Cell Activation (Reporter assay) : To determine the potency of T-cell engagement, the T-cell activation bioassay was performed following the manufacturer’s instructions. In brief, 5x104 of LNCap cells (from Procell, CL-0143) were seeded per well in sterile 96-well plates and 5x104 of Jurkat-NFAT-luc (from sanyou) cells were added per well together with the indicated TCEs at a serial of 4-fold dilution from 100 nM to 0.0977nM. The co-culture was incubated for 6 h at 37℃, 5%CO2, followed by the addition of fluorescent reagent in the GMBrightOne-Step Luciferase Reporter Gene Assay Kit (Genomeditech, Catalog GM-040505C) . Then the plate was measured with the luminescence plate reader.

[0401] FIG. 21 shows the results of the Jurkat cell activation with TCE 107.1803. As shown in FIGS. 21, 107.1803 showed reduced potency in the T cell activation assays compared to the unmasked molecules 107.1863. This indicates that TCE with the CD3 masking domain M1 linked to the N terminal of the HAS VHH-anti-TAA Fab, can applied to different tumor antigen and all can show a good ability to reduce the T cell activation.

[0402] [Rectified under Rule 91, 08.06.2026]

[0403] The foregoing detailed description is provided by way of explanation and examples, and is not intended to limit the scope of the appended claims. Various changes of the embodiments listed herein are obvious to those of ordinary skills in the art, and are reserved within the scope of the appended claims and their equivalents.

Claims

1.A T cell engager proteinaceous dimer comprises a first polypeptide and a second polypeptide, wherein:said first polypeptide comprises a single chain variable fragment (scFv) that can bind to an effector molecule expressing on the immune cell, and one chain of a Fab, wherein said Fab can bind with the tumor surface antigen expressing on the tumor cell;wherein said second polypeptide comprises a first masking domain (M1) that can reduce the binding of said scFv to said effector molecule expressing on the T cell; a half-life extension domain that can extend the half-life of said T cell engager proteinaceous dimer; and another chain of a Fab, wherein said Fab can bind with the tumor surface antigen expressing on the tumor cell; wherein said one chain of a Fab of said first polypeptide and said another chain of a Fab of said second polypeptide can form an intact Fab.2.The T cell engager proteinaceous dimer of claim 1, wherein said scFv comprises a heavy variable domain (VH) and a light variable domain (VL) ; and,wherein said one chain of a Fab of said first polypeptide is a heavy chain, and said another chain of a Fab of said second polypeptide is a light chain; or, wherein said one chain of a Fab of said first polypeptide is a light chain, and said another chain of a Fab of said second polypeptide is a heavy chain.3.The T cell engager proteinaceous dimer of any one of claims 1-2, wherein said first polypeptide comprises, from N terminal to C terminal: said scFv and said one chain of a Fab; or, from N terminal to C terminal: said one chain of a Fab and said scFv.4.The T cell engager proteinaceous dimer of any one of claims 1-3, wherein said second polypeptide comprises, from N terminal to C terminal: said first masking domain (M1) , said half-life extension domain and said another chain of a Fab.5.The T cell engager proteinaceous dimer of any one of claims 1-4, wherein said first polypeptide comprises, from N terminal to C terminal: said scFv and said one chain of a Fab; and, wherein said second polypeptide comprises, from N terminal to C terminal: said first masking domain (M1) , said half-life extension domain and said another chain of a Fab.6.The T cell engager proteinaceous dimer of any one of claims 1-4, wherein said first polypeptide comprises, from N terminal to C terminal: said one chain of a Fab and said scFv; and, wherein said second polypeptide comprises, from N terminal to C terminal: said first masking domain (M1) , said half-life extension domain and said another chain of a Fab.7.The T cell engager proteinaceous dimer of any one of claims 1-6, wherein said second polypeptide further comprises a second masking domain (M2) that can reduce the binding of said Fab to the tumor surface antigen.8.The T cell engager proteinaceous dimer of any one of claims 1-7, wherein in said second polypeptide, the C terminal of said second masking domain (M2) is directly or indirectly linked to the N terminal of said another chain of a Fab.9.The T cell engager proteinaceous dimer of any one of claims 1-8, wherein said second polypeptide comprises, from N terminal to C terminal: said first masking domain (M1) , said half-life extension domain, said second masking domain (M2) and said another chain of a Fab.10.The T cell engager proteinaceous dimer of any one of claims 1-9, wherein said first polypeptide comprises, from N terminal to C terminal: said scFv and said one chain of a Fab; and, wherein said second polypeptide comprises, from N terminal to C terminal: said first masking domain (M1) , said half-life extension domain, said second masking domain (M2) and said another chain of a Fab.11.The T cell engager proteinaceous dimer of any one of claims 1-9, wherein said first polypeptide comprises, from N terminal to C terminal: said one chain of a Fab and said scFv; and, wherein said second polypeptide comprises, from N terminal to C terminal: said first masking domain (M1) , said half-life extension domain, said second masking domain (M2) and said another chain of a Fab.12.The T cell engager proteinaceous dimer of any one of claims 1-11, wherein in said first polypeptide, from N terminal to C terminal: the C terminal of said VH of scFv is directly or indirectly linked to the N terminal of said one chain of Fab; or,from N terminal to C terminal: the C terminal of said VL of scFv is directly or indirectly linked to the N terminal of said one chain of Fab.13.The T cell engager proteinaceous dimer of any one of claims 1-12, wherein in said first polypeptide, from N terminal to C terminal: the C terminal of said scFv is directly or indirectly linked to the N terminal of said heavy chain of Fab; or,from N terminal to C terminal: the C terminal of said scFv is directly or indirectly linked to the N terminal of said light chain of Fab.14.The T cell engager proteinaceous dimer of any one of claims 1-13, wherein in said first polypeptide, from N terminal to C terminal:a) the C terminal of said VH of scFv is directly or indirectly linked to the N terminal of heavy chain of said Fab; or,b) the C terminal of said VH of scFv is directly or indirectly linked to the N terminal of light chain of said Fab; or,c) the C terminal of said VL of scFv is directly or indirectly linked to the N terminal of heavy chain of said Fab; or,d) the C terminal of said VL of scFv is directly or indirectly linked to the N terminal of light chain of said Fab.15.The T cell engager proteinaceous dimer of any one of claims 1-14, wherein said first polypeptide comprises, from N terminal to C terminal: VL of scFv-VH of scFv-heavy chain of Fab; and,wherein said second polypeptide comprises, from N terminal to C terminal: M1-half-life extension domain-light chain of Fab, or, M1-half-life extension domain-M2-light chain of Fab.16.The T cell engager proteinaceous dimer of any one of claims 1-14, wherein said first polypeptide comprises, from N terminal to C terminal: VL of scFv-VH of scFv-light chain of Fab; and,wherein said second polypeptide comprises, from N terminal to C terminal: M1-half-life extension domain-heavy chain of Fab, or M1-half-life extension domain-M2-heavy chain of Fab.17.The T cell engager proteinaceous dimer of any one of claims 1-14, wherein said first polypeptide comprises, from N terminal to C terminal: VH of scFv-VL of scFv-heavy chain of Fab; and,wherein said second polypeptide comprises, from N terminal to C terminal: M1-half-life extension domain-light chain of Fab, or, M1-half-life extension domain-M2-light chain of Fab.18.The T cell engager proteinaceous dimer of any one of claims 1-14, wherein the first polypeptide comprises, from N terminal to C terminal: VH of scFv-VL of scFv-light chain of Fab; and,wherein said second polypeptide comprises, from N terminal to C terminal: M1-half-life extension domain-heavy chain of Fab, or, M1-half-life extension domain-M2-heavy chain of Fab.19.The T cell engager proteinaceous dimer of any one of claims 1-18, wherein said half-life extension domain is linked to M2 or Fab via a cleavable linker.20.The T cell engager proteinaceous dimer of claims 19, wherein said cleavable linker can be activated by protease or proteases in the tumor environment, such that the scFv can bind the T cell effector molecule and the Fab can bind with the tumor surface antigen.21.The T cell engager proteinaceous dimer of claims 19 or 20, wherein said cleavable linker independently comprises one cleavage site for the same protease or for different proteases, or two or more cleavage sites that are capable of being cleaved by the same or different proteases.22.The T cell engager proteinaceous dimer of claims 20 or 21, where the protease or proteases is a tumor-associated protease selected from the group consisting of matrix metalloproteinase-1 (MMP-1) , MMP-2, MMP-3, MMP-7, MMP-9, MMP-10, MMP-14, urokinase-type plasminogen activator (uPa) , matriptase, legumain, kallikrein-related peptidase-3, human neutrophil elastase, proteinase 3 (Pr3) , cathepsin B, cathepsin G, cathepsin K and cathepsin L.23.The T cell engager proteinaceous dimer of any one of claims 1-22, wherein said half-life extension domain comprises human serum albumin (HSA) , an antigen-binding polypeptide, or an immunoglobulin Fc.24.The T cell engager proteinaceous dimer of any one of claims 1-23, wherein said half-life extension domain comprises an antigen-binding polypeptide.25.The T cell engager proteinaceous dimer of claims 23 or 24, wherein said antigen-binding polypeptide binds HSA.26.The T cell engager proteinaceous dimer of any one of claims 23-25, wherein said antigen-binding polypeptide comprises an antibody.27.The T cell engager proteinaceous dimer of any one of claims 23-26, wherein said antibody comprises a single domain antibody (VHH) , an scFv, or a full-length antibody.28.The T cell engager proteinaceous dimer of any one of claims 23-27, wherein said antibody comprises a single domain antibody (VHH) , wherein said VHH binds HSA (HSA VHH) .29.The T cell engager proteinaceous dimer of any one of claims 1-28, wherein in said second polypeptide, the C terminal of said M1 is linked to the N terminal of said half-life extension domain via a linker L1.30.The T cell engager proteinaceous dimer of any one of claims 1-29, wherein in said second polypeptide, the C terminal of said half-life extension domain is linked to the N terminal of said M2 via a linker L2.31.The T cell engager proteinaceous dimer of any one of claims 1-30, wherein in said first polypeptide, the C terminal of said scFv is linked to the N terminal of said Fab via a linker L3.32.The T cell engager proteinaceous dimer of any one of claims 1-31, wherein said first polypeptide comprises, from N terminal to C terminal:(a) VL of scFv-VH of scFv-L3-heavy chain of Fab, or,(b) VL of scFv-VH of scFv-L3-light chain of Fab, or,(c) VH of scFv-VL of scFv-L3-heavy chain of Fab, or,(d) VH of scFv-VL of scFv-L3-light chain of Fab;and, wherein said second polypeptide comprises, from N terminal to C terminal:(e) M1-linker L1-HSA VHH-linker L2-heavy chain of Fab, or,(f) M1-linker L1-HSA VHH-linker L2-light chain of Fab, or,(g) M1-linker L1-HSA VHH-linker L2-M2-cleavable linker-heavy chain of Fab, or,(h) M1-linker L1-HSA VHH-linker L2-M2-cleavable linker-light chain of Fab.33.The T cell engager proteinaceous dimer of any one of claims 1-32, wherein said first polypeptide comprises, from N terminal to C terminal: VL of scFv-VH of scFv-L3-heavy chain of Fab; and,wherein said second polypeptide comprises, from N terminal to C terminal: M1-linker L1-HSA VHH-cleavable linker-light chain of Fab; or, from N terminal to C terminal: M1-linker L1-HSA VHH-linker L2-M2-cleavable linker-light chain of Fab.34.The T cell engager proteinaceous dimer of any one of claims 1-32, wherein said first polypeptide comprises, from N terminal to C terminal: VL of scFv-VH of scFv-L3-light chain of Fab; and,wherein said second polypeptide comprises, from N terminal to C terminal: M1-linker L1-HSA VHH-cleavable linker-heavy chain of Fab; or, from N terminal to C terminal: M1-linker L1-HSA VHH-linker L2-M2-cleavable linker-heavy chain of Fab.35.The T cell engager proteinaceous dimer of any one of claims 1-32, wherein said first polypeptide comprises, from N terminal to C terminal: VH of scFv-VL of scFv-L3-heavy chain of Fab; and,wherein said second polypeptide comprises, from N terminal to C terminal: M1-linker L1-HSA VHH-cleavable linker-light chain of Fab; or, from N terminal to C terminal: M1-linker L1-HSA VHH-linker L2-M2-cleavable linker-light chain of Fab.36.The T cell engager proteinaceous dimer of any one of claims 1-32, wherein said first polypeptide comprises, from N terminal to C terminal: VH of scFv-VL of scFv-L3-light chain of Fab; and,wherein said second polypeptide comprises, from N terminal to C terminal: M1-linker L1-HSA VHH-cleavable linker-heavy chain of Fab; or, from N terminal to C terminal: M1-linker L1-HSA VHH-linker L2-M2-cleavable linker-heavy chain of Fab.37.The T cell engager proteinaceous dimer of any one of claims 1-32, wherein said first polypeptide comprises, from N terminal to C terminal: VL of scFv-VH of scFv-L3-heavy chain of Fab; and,wherein said second polypeptide comprises, from N terminal to C terminal: M1-linker L1-HSA VHH-linker L2-M2-cleavable linker-light chain of Fab.38.The T cell engager proteinaceous dimer of any one of claims 1-32 and 37, wherein said first polypeptide is, from N terminal to C terminal: VL of scFv-VH of scFv-L3-heavy chain of Fab; and,wherein said second polypeptide is, from N terminal to C terminal: M1-linker L1-HSA VHH-linker L2-M2-cleavable linker-light chain of Fab.39.The T cell engager proteinaceous dimer of any one of claims 1-32, wherein said first polypeptide comprises from N terminal to C terminal: VH of scFv-VL of scFv-L3-light chain of Fab; and,wherein said second polypeptide comprises, from N terminal to C terminal: M1-linker L1-HSA VHH-cleavable linker-heavy chain of Fab.40.The T cell engager proteinaceous dimer of any one of claims 1-32 and 39, wherein said first polypeptide is from N terminal to C terminal: VH of scFv-VL of scFv-L3-light chain of Fab; and, wherein said second polypeptide is, from N terminal to C terminal: M1-linker L1-HSA VHH-cleavable linker-heavy chain of Fab.41.The T cell engager proteinaceous dimer of any one of claims 1-32, wherein said first polypeptide comprises, from N terminal to C terminal: VH of scFv-VL of scFv-L3-heavy chain of Fab; and,wherein said second polypeptide comprises, from N terminal to C terminal: M1-linker L1-HSA VHH-cleavable linker-light chain of Fab.42.The T cell engager proteinaceous dimer of any one of claims 1-32 and 41, wherein said first polypeptide is, from N terminal to C terminal: VH of scFv-VL of scFv-L3-heavy chain of Fab; and,wherein said second polypeptide is, from N terminal to C terminal: M1-linker L1-HSA VHH-cleavable linker-light chain of Fab.43.The T cell engager proteinaceous dimer of any one of claims 1-42, wherein said M1 comprises an amino acid sequence with at least 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, or 100%sequence identity to any one of SEQ ID NOS: 13 to 19.44.The T cell engager proteinaceous dimer of any one of claims 1-43, wherein said M1 comprises an amino acid sequence with at least 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, or 100%sequence identity to SEQ ID NO: 15.45.The T cell engager proteinaceous dimer of any one of claims 1-44, wherein said M1 comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 15.46.The T cell engager proteinaceous dimer of any one of claims 1-45, wherein said M2 comprises an amino acid sequence with at least 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, or 100%sequence identity to any one of SEQ ID NOS: 20 to 32.47.The T cell engager proteinaceous dimer of any one of claims 1-46, wherein said M2 an amino acid sequence with at least 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, or 100%sequence identity to SEQ ID NO: 20.48.The T cell engager proteinaceous dimer of any one of claims 1-47, wherein said M2 comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 20.49.The T cell engager proteinaceous dimer of any one of claims 1-48, wherein said HSA VHH comprises an amino acid sequence with at least 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, or 100%sequence identity to SEQ ID NOS: 471.50.The T cell engager proteinaceous dimer of any one of claims 1-49, wherein said HSA VHH comprises an amino acid sequence with at least 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, or 100%sequence identity to SEQ ID NO: 471.51.The T cell engager proteinaceous dimer of any one of claims 1-50, wherein said HSA VHH comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 471.52.The T cell engager proteinaceous dimer of any one of claims 1-51, wherein said cleavable linker comprises an amino acid sequence with at least 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, or 100%sequence identity to any one of SEQ ID NOS: 103-153, 190-337 and 458-466.53.The T cell engager proteinaceous dimer of any one of claims 1-52, wherein said cleavable linker comprises an amino acid sequence with at least 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, or 100%sequence identity to SEQ ID NO: 461.54.The T cell engager proteinaceous dimer of any one of claims 1-53, wherein said cleavable linker comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 461.55.The T cell engager proteinaceous dimer of any one of claims 1-54, wherein said linker L1 comprises an amino acid sequence with at least 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, or 100%sequence identity to any one of SEQ ID NOS: 154-189, and 467-470.56.The T cell engager proteinaceous dimer of any one of claims 1-55, wherein said linker L1 comprises an amino acid sequence with at least 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, or 100%sequence identity to SEQ ID NO: 468.57.The T cell engager proteinaceous dimer of any one of claims 1-56, wherein said linker L1 comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 468.58.The T cell engager proteinaceous dimer of any one of claims 1-57, wherein said linker L2 comprises an amino acid sequence with at least 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, or 100%sequence identity to ay one of SEQ ID NOS: 154-189, and 467-470.59.The T cell engager proteinaceous dimer of any one of claims 1-58, wherein said linker L2 comprises an amino acid sequence with at least 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, or 100%sequence identity to SEQ ID NO: 467.60.The T cell engager proteinaceous dimer of any one of claims 1-59, wherein said linker L2 comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 467.61.[Rectified under Rule 91, 08.06.2026]The T cell engager proteinaceous dimer of any one of claims 1-60, wherein said linker L3 comprises an amino acid sequence with at least 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, or 100%sequence identity to any one of SEQ ID NOS: 154-189, and 467-470.62.The T cell engager proteinaceous dimer of any one of claims 1-61, wherein said linker L3 comprises an amino acid sequence with at least 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, or 100%sequence identity to SEQ ID NO: 154.63.The T cell engager proteinaceous dimer of any one of claims 1-62, wherein said linker L3 comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 154.64.The T cell engager proteinaceous dimer of any one of claims 1-63, wherein said M1 comprises an amino acid sequence with at least 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, or 100%sequence identity to SEQ ID NO: 15; and, wherein said M2 comprises an amino acid sequence with at least 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, or 100%sequence identity to SEQ ID NO: 20; and, wherein said HSA VHH comprises an amino acid sequence with at least 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, or 100%sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 471; and, wherein said cleavable linker comprises an amino acid sequence with at least 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, or 100%sequence identity to SEQ ID NO: 461; and, wherein said linker L1 comprises an amino acid sequence with at least 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, or 100%sequence identity to SEQ ID NO: 468; and, wherein said linker L2 comprises an amino acid sequence with at least 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, or 100%sequence identity to SEQ ID NO: 467; and, wherein said linker L3 comprises an amino acid sequence with at least 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, or 100%sequence identity to SEQ ID NO: 154.65.The T cell engager proteinaceous dimer of any one of claims 1-64, wherein said M1 comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 15; and, wherein said M2 comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 20; and, wherein said HSA VHH comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 471; and, wherein said cleavable linker comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 461; and, wherein said linker L1 comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 468; and, wherein said linker L2 comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 467; and, wherein said linker L3 comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 154.66.The T cell engager proteinaceous dimer of any one of claims 1-65, wherein said effector molecule is CD3 or CD28.67.The T cell engager proteinaceous dimer of any one of claims 1-66, wherein said tumor surface antigen is EGFR, PSMA, or STEAP1.68.The T cell engager proteinaceous dimer of any one of claims 1-67, wherein said scFv binds CD3(CD3-scFv) and said Fab binds EGFR (EGFR-Fab) .69.claimsThe T cell engager proteinaceous dimer of any one of claims 1-67, wherein said scFv binds CD3 (CD3-scFv) and said Fab binds PSMA (PSMA-Fab) .70.The T cell engager proteinaceous dimer of any one of claims 1-67, wherein said scFv binds CD3(CD3-scFv) and said Fab binds STEAP1 (STEAP1-Fab) .71.The T cell engager proteinaceous dimer of any one of claims 1-68, wherein said first polypeptide comprises, from N terminal to C terminal: CD3-scFv, and, said one chain of said EGFR-Fab; and, wherein said second polypeptide comprises, from N terminal to C terminal: said M1, said HSA VHH, said M2, and said another chain of said EGFR-Fab.72.The T cell engager proteinaceous dimer of any one of claims 1-68, wherein said first polypeptide comprises, from N terminal to C terminal: said CD3-scFv, and, said one chain of said EGFR-Fab; and, wherein said second polypeptide comprises, from N terminal to C terminal: said M1, said HSA VHH, and said another chain of said EGFR-Fab.73.The T cell engager proteinaceous dimer of any one of claims 1-68 and 71, wherein said first polypeptide comprises, from N terminal to C terminal: VL of CD3-scFv-VH of CD3-scFv-heavy chain of EGFR-Fab; and, wherein said second polypeptide comprises, from N terminal to C terminal: M1-HSA VHH-M2-light chain of EGFR-Fab.74.The T cell engager proteinaceous dimer of any one of claims 1-68 and 72, wherein said first polypeptide comprises, from N terminal to C terminal: VL of CD3-scFV-VH of CD3-scFv-heavy chain of EGFR-Fab; and, wherein said second polypeptide comprises, from N terminal to C terminal: M1-HSA VHH-light chain of EGFR-Fab.75.The T cell engager proteinaceous dimer of any one of claims 1-68, 71 and 73, wherein said first polypeptide comprises, from N terminal to C terminal: VL of CD3-scFV-VH of CD3-scFv-linker L3-heavy chain of EGFR-Fab; and, wherein said second polypeptide comprises, from N terminal to C terminal: M1-linker L1-HSA VHH-linker L2-M2-cleavable linker-light chain of EGFR-Fab.76.The T cell engager proteinaceous dimer of any one of claims 1-68, 71 and 73, wherein said first polypeptide is, from N terminal to C terminal: VL of CD3-scFV-VH of CD3-scFv-linker L3-heavy chain of EGFR-Fab; and, wherein said second polypeptide is, from N terminal to C terminal: M1-linker L1-HSA VHH-linker L2-M2-cleavable linker-light chain of EGFR-Fab.77.The T cell engager proteinaceous dimer of any one of claims 1-68, 72 and 74, wherein said first polypeptide comprises, from N terminal to C terminal: VL of CD3-scFV-VH of CD3-scFv-linker L3-heavy chain of EGFR-Fab; and, wherein said second polypeptide comprises, from N terminal to C terminal: M1-linker L1-HSA VHH-cleavable linker-light chain of EGFR-Fab.78.The T cell engager proteinaceous dimer of any one of claims 1-68, 72 and 74, wherein said first polypeptide is, from N terminal to C terminal: VL of CD3-scFV-VH of CD3-scFv-linker L3-heavy chain of EGFR-Fab; and, wherein said second polypeptide is, from N terminal to C terminal: M1-linker L1-HSA VHH-cleavable linker-light chain of EGFR-Fab.79.The T cell engager proteinaceous dimer of any one of claims 1-78, wherein said VH of said CD3-scFv comprises complementarity determining regions (HC-CDRs) : HC-CDR1, HC-CDR2 and HC-CDR3; and, wherein said VL of said CD3-scFv comprises complementarity determining regions (LC-CDRs) : LC-CDR1, LC-CDR2 and LC-CDR3.80.The T cell engager proteinaceous dimer of any one of claims 1-79, wherein said HC-CDR1 of CD3-scFv comprises amino acid sequence of SEQ ID NO: 341, wherein said HC-CDR2 of CD3-scFv comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 342, wherein said HC-CDR3 of CD3-scFv comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 343, wherein said LC-CDR1 of CD3-scFv comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 350, wherein said LC-CDR2 of CD3-scFv comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 351, and wherein said LC-CDR3 of CD3-scFv comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 352.81.The T cell engager proteinaceous dimer of any one of claims 1-79, wherein said HC-CDR1 of CD3-scFv comprises amino acid sequence of SEQ ID NO: 359, wherein said HC-CDR2 of CD3-scFv comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 360, wherein said HC-CDR3 of CD3-scFv comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 361, wherein said LC-CDR1 of CD3-scFv comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 368, wherein said LC-CDR2 of CD3-scFv comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 369, and wherein said LC-CDR3 of CD3-scFv comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 370.82.The T cell engager proteinaceous dimer of any one of claims 1-79, wherein said HC-CDR1 of CD3-scFv comprises amino acid sequence of SEQ ID NO: 377, wherein said HC-CDR2 of CD3-scFv comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 378, wherein said HC-CDR3 of CD3-scFv comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 379, wherein said LC-CDR1 of CD3-scFv comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 386, wherein said LC-CDR2 of CD3-scFv comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 387, and wherein said LC-CDR3 of CD3-scFv comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 388.83.The T cell engager proteinaceous dimer of any one of claims 1-79, wherein said HC-CDR1 of CD3-scFv comprises amino acid sequence of SEQ ID NO: 395, wherein said HC-CDR2 of CD3-scFv comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 396, wherein said HC-CDR3 of CD3-scFv comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 397, wherein said LC-CDR1 of CD3-scFv comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 404, wherein said LC-CDR2 of CD3-scFv comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 405, and wherein said LC-CDR3 of CD3-scFv comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 406.84.The T cell engager proteinaceous dimer of any one of claims 1-83, wherein said heavy chain of said EGFR-Fab comprises complementarity determining regions (HC-CDRs) : HC-CDR1, HC-CDR2 and HC-CDR3; and, wherein said light chain of EGFR-Fab comprises complementarity determining regions (LC-CDRs) : LC-CDR1, LC-CDR2 and LC-CDR3.85.The T cell engager proteinaceous dimer of any one of claims 1-84, wherein said HC-CDR1 of EGFR-Fab comprises amino acid sequence of SEQ ID NO: 413, wherein said HC-CDR2 of EGFR-Fab comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 414, wherein said HC-CDR3 of EGFR-Fab comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 415, wherein said LC-CDR1 of EGFR-Fab comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 422, wherein said LC-CDR2 of EGFR-Fab comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 423, and wherein said LC-CDR3 of EGFR-Fab comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 424.86.The T cell engager proteinaceous dimer of any one of claims 1-84, wherein said HC-CDR1 of EGFR-Fab comprises amino acid sequence of SEQ ID NO: 431, wherein said HC-CDR2 of EGFR-Fab comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 432, wherein said HC-CDR3 of EGFR-Fab comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 433; wherein said LC-CDR1 of EGFR-Fab comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 440, wherein said LC-CDR2 of EGFR-Fab comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 441, and wherein said LC-CDR3 of EGFR-Fab comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 442.87.The T cell engager proteinaceous dimer of any one of claims 1-86, wherein said HC-CDR1 of said CD3-scFv comprises amino acid sequence of SEQ ID NO: 341, wherein said HC-CDR2 of said CD3-scFv comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 342, wherein said HC-CDR3 of said CD3-scFv comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 343; and wherein said LC-CDR1 of said CD3-scFv comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 350, wherein said LC-CDR2 of said CD3-scFv comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 351, and wherein said LC-CDR3 of said CD3-scFv comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 352; and, wherein said HC-CDR1 of said EGFR-Fab comprises amino acid sequence of SEQ ID NO: 413, wherein said HC-CDR2 of said EGFR-Fab comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 414, wherein said HC-CDR3 of said EGFR-Fab comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 415; wherein said LC-CDR1 of said EGFR-Fab comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 422, wherein said LC-CDR2 of said EGFR-Fab comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 423, and wherein said LC-CDR3 of said EGFR-Fab comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 424.88.The T cell engager proteinaceous dimer of any one of claims 1-87, wherein said VH of CD3-scFv comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 447; and wherein said VL of CD3-scFv comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 446.89.The T cell engager proteinaceous dimer of any one of claims 1-87, wherein said VH of CD3-scFv comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 449; and wherein said VL of CD3-scFv comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 448.90.The T cell engager proteinaceous dimer of any one of claims 1-87, wherein said VH of CD3-scFv comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 451; and wherein said VL of CD3-scFv comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 450.91.The T cell engager proteinaceous dimer of any one of claims 1-87, wherein said VH of CD3-scFv comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 453; and wherein said VL of CD3-scFv comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 452.92.The T cell engager proteinaceous dimer of any one of claims 1-91, wherein said VH of EGFR-Fab comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 454; and wherein said VL of EGFR-Fab comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 455.93.The T cell engager proteinaceous dimer of any one of claims 1-91, wherein said VH of EGFR-Fab comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 456; and wherein said VL of EGFR-Fab comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 457.94.The T cell engager proteinaceous dimer of any one of claims 1-93, wherein said VH of CD3-scFv comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 447, and wherein said VL of scFv comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 446; and,wherein said VH of EGFR-Fab comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 454, and wherein said VL of EGFR-Fab comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 455.95.The T cell engager proteinaceous dimer of any one of claims 1-94, wherein said CD3-scFv comprising an amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 1-8.96.The T cell engager proteinaceous dimer of any one of claims 1-94, wherein the CD3-scFv comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.97.The T cell engager proteinaceous dimer of any one of claims 1-96, wherein said heavy chain of EGFR-Fab comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO: 9, and wherein said light chain of EGFR-Fab comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO: 10.98.The T cell engager proteinaceous dimer of any one of claims 1-96, wherein the heavy chain of EGFR-Fab comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO: 11, and wherein said light chain of EGFR-Fab comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO: 12.99.The T cell engager proteinaceous dimer of any one of claims 1-98, wherein said CD3-scFv comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO: 1; and,wherein said heavy chain of EGFR-Fab comprising an amino acid sequence of any one of SEQ ID NO: 9, and wherein said light chain of EGFR-Fab comprising an amino acid sequence of any one of SEQ ID NO: 10.100.The T cell engager proteinaceous dimer of any one of claims 1-99, wherein said first polypeptide and said second polypeptide respectively comprise an amino acid sequence with at least 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, or 100%sequence identity to SEQ ID NOS: 33 and 34, 35 and 36, 37 and 38, 39, and 40, 41, and 42, 43 and 44, 45 and 46, 47 and 48, 49 and 50, 51 and 52, 53 and 54, 55 and 56, 57 and 58, 59 and 60, 61 and 62, 63 and 64, 65 and 66, 67 and 68, 69 and 70, 71 and 72, 73 and 74, 75 and 76, 77 and 78, 79 and 80, 81 and 82, 83 and 84, 85 and 86, 87 and 88, 89 and 90, 91 and 92, 93 and 94, 95 and 96, 97 and 98, 99 and 100, 101 and 102, 516 and 517, 518 and 519, 520 and 521, 522 and 523, 524 and 525, 526 and 527, 528 and 529, 530 and 531, 532 and 533, 534 and 535, 536 and 537, or, 538 and 539.101.The T cell engager proteinaceous dimer of any one of claims 1-100, wherein said first polypeptide and said second polypeptide respectively comprise an amino acid sequence with at least 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, or 100%sequence identity to SEQ ID NOS: 63 and 64.102.The T cell engager proteinaceous dimer of any one of claims 1-101, wherein said first polypeptide and said second polypeptide respectively comprise an amino acid sequence of SEQ ID NOS: 63 and 64.103.The T cell engager proteinaceous dimer of any one of claims 1-100, wherein said first polypeptide and said second polypeptide respectively comprise an amino acid sequence with at least 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, or 100%sequence identity to SEQ ID NOS: 57 and 58.104.The T cell engager proteinaceous dimer of any one of claims 1-100 and 103, wherein said first polypeptide and said second polypeptide respectively comprise an amino acid sequence of SEQ ID NOS: 57 and 58.105.The T cell engager proteinaceous dimer of any one of claims 1-68 and 69, wherein said VH of CD3-scFv comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 453 and wherein said VL of scFv comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 452; and,wherein said heavy chain of PSMA-Fab comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 514 and wherein said light chain of PSMA-Fab comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 515.106.The T cell engager proteinaceous dimer of any one of claims 1-68, 69 and 105, wherein said first polypeptide comprises an amino acid sequence of SEQ ID NOS: 536 and wherein said second polypeptide comprises an amino acid sequence of SEQ ID NOS: 537.107.The T cell engager proteinaceous dimer of any one of claims 1-68, 70, wherein said VH of CD3-scFv comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 449 and wherein said VL of CD3-scFv comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 448,wherein said heavy chain of STEAP1-Fab comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 512 and wherein said light chain of STEAP1-Fab comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 513.108.The T cell engager proteinaceous dimer of any one of claims 1-68, 70 and 107, wherein said first polypeptide comprises an amino acid sequence of SEQ ID NOS: 532 and wherein said second polypeptide comprises an amino acid sequence of SEQ ID NOS: 533.109.A nucleic acid molecule comprising a polynucleotide sequence encoding said T cell engager proteinaceous dimer of any one of claims 1-108.110.A vector comprising said nucleic acid molecular of claim 109.111.A cell comprising said nucleic acid molecular of claim 109 or said vector of claim 110.112.A kit comprising said T cell engager proteinaceous dimer of any one of claims 1-111.113.A pharmaceutical composition comprising said (1) T cell engager proteinaceous dimer of any one of claims 1-108, said nucleic acid molecule of claim 109, said vector of claim 110, or, said cell of claim 111; and, (2) a pharmaceutically acceptable carrier.114.A method of treating a disease in a subject in need thereof, comprising administering to the subject a therapeutically effective amount of said T cell engager proteinaceous dimer of any one of claims 1-108, said nucleic acid molecule of claim 109, said vector of claim 110, said cell of claim 111, or said kit of claim 112 or a pharmaceutical composition of claim 76.115.The method of claim 114, wherein the disease is a cancer.116.The method of claim 115, wherein the cancer is derived from a cancer selected from the group consisting of leukemia, myelodysplastic syndrome, malignant lymphoma, nasopharyngeal carcinoma, mesothelioma, lung cancer, pancreatic cancer, head and neck tumors, gastrointestinal tumors, endocrine tumors, mammary and other gynecological tumors, urological tumors, skin tumors, thymic carcinomas, sarcomas and a combination thereof.117.A method of making said T cell engager proteinaceous dimer of any one of claims 1-108, said nucleic acid molecule of claim 109, said vector of claim 110, said cell of claim 111, or said kit of claim 112 or a pharmaceutical composition of claim 113.

Images