Antibodies binding PD-l1 and uses thereof

Abstract

Disclosed is a monoclonal antibody that is able to specifically bind human PD-L1, or an antigen-binding portion thereof. A nucleic acid molecule encoding the antibody or the antigen-binding portion thereof, an expression vector, a host cell and a method for expressing the antibody or the antigen-binding portion thereof are also provided. The present disclosure further provides a bispecific molecule, an immunoconjugate, a chimeric antigen receptor, an oncolytic virus, and a pharmaceutical composition comprising the antibody or the antigen-binding portion thereof, as well as a treatment method using the anti-PD-L1 antibody or the antigen-binding portion thereof.

Description

ANTIBODIES BINDING PD-L1 AND USES THEREOF

[0001] This application claims priority to US provisional application No. 63 / 788,905 filed April 15, 2025. REFERENCE TO A “SEQUENCE LISTING”

[0002] The instant application contains a Sequence Listing XML labeled “55532-00203SLXML” which was created on April 8, 2026. The entire content of the sequence listing is incorporated herein by reference in its entirety.FIELD OF THE INVENTION

[0003] The present disclosure relates generally to an isolated monoclonal antibody, or an antigen-binding portion thereof, that is able to bind PD-L1 with high affinity and functionality, as well as its use in treatment of PD-L1 associated diseases such as cancers.BACKGROUND OF THE INVENTION

[0004] The immune system fights harmful substances from outside of the body or harmful changes occurring within the body, but needs to carefully spare normal heathy cells. Co-inhibitory immune checkpoint proteins, such as programmed death-1 (PD-1) and CTLA-4, serve as brakes for the immune responses, to prevent damages to such normal cells and inhibit hyperactivation of immune cells. Among these immune checkpoint proteins, the PD-1 expressed on e.g., activated T cells and natural killer (NK) cells, and programmed death-ligand 1 (PD-L1) found on a wide variety of cell types, are interacting ones, the engagement of PD-1 by PD-L1 may lead to anergy of PD-1+ immune cells (Wu Y et al., (2019) Front Immunol 10: 2022) .

[0005] PD-L1, also known as CD274 or B7-H1, is a type I transmembrane glycoprotein with two extracellular domains (IgV-and IgC-like) , a transmembrane region, and a short cytoplasmic tail without known signaling motifs (Dong H et al., (1999) Nat Med 5 (12) : 1365–1369) . Constitutive low-level PD-L1 expression can be found on e.g., resting lymphocytes and antigen-presenting cells that may contribute to tissue homeostasis, and PD-L1 expression may be upregulated during inflammation or infections to avoid overt tissue destruction (Kythreotou A et al., (2018) J Clin Pathol 71 (3) : 189-194) .

[0006] Studies have shown tumor cells in certain solid and hematological tumors may highly express PD-L1 molecules on the cell surface to evade immune surveillance. The PD-L1 molecules on tumor cell surfaces may bind PD-1 molecules on tumor-infiltrating T cells to activate Src homology region 2 domain-containing phosphatases (SPH2) , leading to T cell activity suppression and the resulting tumor growth or metastasis (Cha J-H et al., (2019) Mol Cell 76 (3) : 359-370) . For example, PD-L1-mediated T cell apoptosis was observed in a mouse tumor model (Dong H et al., (2002) 8 (8) : 793-800) . Particularly, the PD-L1 expressions in e.g., renal cell carcinoma (RCC) , breast, colorectal, gastric, non-small cell lung (NSCLC) , papillary thyroid, and testicular cancers have been found to be associated with poor prognosis.

[0007] Therapeutics targeting the PD-L1-PD-1 signaling have been or are being developed. For example, Atezolizumab an FcγR-binding deficient, non-glycosylated and humanized monoclonal IgG1 antibody, has been approved by FDA for the treatment of e.g., transitional cell carcinoma and triple-negative breast cancer (Reddy S. M. et al., (2020) Expert Rev Anticancer Ther 20 (3) : 151-158) . SGN-PDL1V, the first PD-L1-directed antibody-drug conjugate (ADC) that contains an anti-PD-L1 antibody SG-559-01 connected to monomethyl auristatin E (MMAE) via a cleavable linker, is now in the phase I clinical trial for advanced solid tumor treatment (WO2021067776A2; NCT05208762) .

[0008] The PD-1 / PD-L1 pathway blockade also showed efficacy in treating acute or chronic viral, bacterial and parasitic infections in pre-clinical and clinical researches (Jubel JM et al., (2020) Front Immunol. 11: 487) . For example, the administration of anti-PD-L1 antibodies increased IFN-γ, IL-2 and TNFα levels, enhanced T cell function, and alleviated viremia in chronic infection of e.g., hepatitis B virus (HBV) , hepatitis C virus (HCV) , human immunodeficiency virus (HIV) , or simian immunodeficiency virus (SIV) .

[0009] Despite of the advancement in this field, the choice for the patients is limited so far and there is a need for additional anti-PD-L1 antibodies with improved pharmaceutical characteristics. Particularly, more anti-PD-L1 antibodies may be needed to overcome the resistance issue in therapies. The intracellular PD-L1 molecules were recently reported to participate in certain protein-protein and protein-nucleic acid interactions which may regulate tumor pathogenic signals and render tumors refractory to the current PD-1-PD-L1 blockade therapies (Kornepati A. V. R. et al., (2022) Nat Rev Cancer 22 (3) : 174-189) . Furthermore, acquired homozygous loss of B2M that leads to lack of major histocompatibility complex (MHC) class I molecules on the surface of tumor cells has been found to be possibly associated with acquired resistance to the immune checkpoint blockade therapies (Gettinger S et al., (2017) Cancer Discov 7 (12) : 1420-1435) .

[0010] Citation or identification of any document in this application is not an admission that such document is available as prior art to the present invention.SUMMARY OF THE INVENTION

[0011] The inventors of the present application have prepared novel anti-PD-L1 antibodies that are able to i) specifically bind to the recombinant PD-L1 protein or the PD-L1-expressing cells (e.g., human PD-L1, and monkey PD-L1) at comparable, if not higher, binding affinity / capability, ii) block human PD-1-PD-L1 binding / interaction at comparable, if not higher, blocking activity, iii) reverse PD-1-PD-L1 induced immune cell suppression at comparable, if not higher, activity, and / or iv) internalized by PD-L1-expressing cells at comparable, if not higher, internalization rate, as compared to prior art anti-PD-L1 antibodies such as Tecentriq and SG-559-01. The antibodies of the application, in some embodiments, may be prepared to have the capability to induce antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC) , as the natural killer (NK) cells may show enhanced cytotoxicity against PD-L1-expressing cancer cells in the presence of anti-PD-L1 antibodies (Park J-E et al., (2020) J Immunother Cancer 8 (2) : e000873) . The NK cell-mediated cytotoxicity in an MHC class I independent manner may benefit patients with acquired resistance to currently available therapies caused by the reduction or elimination of MHC class I molecules on tumor cells.

[0012] The antibodies of the disclosure can be used for a variety of applications, including the detection of human and / or monkey PD-L1 proteins in vitro, and treatment of diseases associated with PD-L1 signaling, such as cancers and infectious diseases.

[0013] Accordingly, in one aspect, the disclosure pertains to an isolated monoclonal antibody (e.g., a mouse, chimeric or humanized antibody) , or an antigen-binding portion thereof, that is able to bind PD-L1 (e.g., the human and / or monkey PD-L1 protein (s) ) , comprising (i) a heavy chain variable region that may comprise a VH CDR1 region, a VH CDR2 region and a VH CDR3 region, wherein the VH CDR1 region, the VH CDR2 region and the VH CDR3 region may comprise amino acid sequences having at least 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%sequence identity to SEQ ID NOs: 1, 2 and 3 (X=G or X=A) , respectively; or (ii) a light chain variable region that may comprise a VL CDR1 region, a VL CDR2 region and a VL CDR3 region, wherein the VL CDR1 region, the VL CDR2 region and the VL CDR3 region may comprise amino acid sequences having at least 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%sequence identity to SEQ ID NOs: 4, 5 and 6, respectively.

[0014] The isolated monoclonal antibody or the antigen-binding portion thereof of the disclosure may comprise a heavy chain variable region and a light chain variable region, wherein the VH CDR1 region, the VH CDR2 region, the VH CDR3 region, the VL CDR1 region, the VL CDR2 region and the VL CDR3 region may comprise amino acid sequences having at least 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%sequence identity to SEQ ID NOs: 1, 2, 3 (X=G or X=A) , 4, 5 and 6, respectively.

[0015] The heavy chain variable region may comprise an amino acid sequence having at least 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%sequence identity to SEQ ID NOs: 7, 8 or 11.

[0016] The light chain variable region may comprise an amino acid sequence having at least 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%sequence identity to SEQ ID NOs: 9 or 10.

[0017] The isolated monoclonal antibody or the antigen-binding portion thereof of the disclosure may comprise a heavy chain variable region and a light chain variable region comprising amino acid sequences having at least 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%sequence identity to (1) SEQ ID NOs: 7 and 9, respectively; (2) SEQ ID NOs: 8 and 10, respectively; or (3) SEQ ID NOs: 11 and 10, respectively.

[0018] The isolated monoclonal antibody, or the antigen-binding portion thereof, of the present disclosure may comprise a heavy chain constant region, linked to the heavy chain variable region. The antibody, or the antigen-binding portion thereof, of the disclosure, may comprise a light chain constant region, linked to the light chain variable region.

[0019] The heavy chain constant region may be with Fc receptor binding affinity (e.g., enhanced FcR binding affinity) and / or complement system protein binding affinity (e.g., enhanced complement system protein binding affinity) . The heavy chain constant region, in certain embodiments, may be an IgG1 constant region, e.g., human IgG1 constant region comprising the amino acid sequence set forth in e.g., SEQ ID NO.: 13 or 14, or a genetically engineered IgG2 or IgG4 constant region, or a functional fragment thereof. The heavy chain constant region may also be with normal or reduced FcR binding affinity in certain embodiments. The light chain constant region may be a kappa constant region, e.g., human kappa constant region comprising the amino acid sequences set forth in e.g., SEQ ID NO.: 15, or a functional fragment thereof.

[0020] The antibody of the present disclosure in certain embodiments may comprise or consist of two heavy chains and two light chains, wherein each heavy chain may comprise the heavy chain constant region, heavy chain variable region or CDR sequences mentioned above, and each light chain may comprise the light chain constant region, light chain variable region or CDR sequences mentioned above, wherein the antibody binds to PD-L1. The antibody or the antigen-binding portion thereof of the present disclosure in other embodiments may be a single chain variable fragment (scFv) antibody, or antibody fragments, such as Fab or F (ab’) 2 fragments.

[0021] The disclosure also provides a bispecific molecule that may comprise the antibody, or the antigen-binding portion thereof, of the disclosure, linked to a second functional moiety (e.g., a second antibody or its antigen binding portion thereof) having a different binding specificity than the antibody, or the antigen-binding portion thereof of the disclosure. The antibody or the antigen binding portion thereof of the present disclosure can be made into part of a chimeric antigen receptor (CAR) or an engineered T cell receptor (TCR) . Also provided is an immune cell that may comprise the antigen chimeric receptor, such as a T cell and a NK cell. The antibody or the antigen binding portion thereof of the disclosure can also be encoded by or used in conjunction with an oncolytic virus.

[0022] The disclosure also provides an immunoconjugate, such as an antibody-drug conjugate (ADC) , that may comprise an antibody, or antigen-binding portion thereof, of the disclosure, linked to a therapeutic agent, such as a cytotoxin, with or without a linker. In certain embodiments, the immunoconjugate comprises an antibody, or antigen-binding portion thereof, of the disclosure conjugated to a toxic recombinant protein. The toxic recombinant protein may be DT3C, comprising e.g., the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12.

[0023] The disclosure further provides a nucleic acid molecule encoding the antibody or the antigen-binding portion thereof, the bispecific molecule, the CAR or TCR, or the immunoconjugate of the disclosure, as well as an expression vector comprising such a nucleic acid molecule and a host cell comprising such an expression vector or having the nucleic acid molecule integrated into its genome. A method for preparing the anti-PD-L1 antibody or antigen binding portion thereof, the bispecific molecule, the CAR or TCR, or the immunoconjugate, of the disclosure, using the host cell of the disclosure is provided, comprising steps of (i) expressing the antibody or antigen binding portion thereof, the bispecific molecule, the CAR or TCR, or the immunoconjugate, of the disclosure in the host cell, and (ii) isolating the antibody or antigen binding portion thereof, the bispecific molecule, the CAR or TCR, or the immunoconjugate of the disclosure from the host cell or its cell culture.

[0024] The disclosure provides a composition comprising the antibody or antigen binding portion thereof, the bispecific molecule, the immunoconjugate, the immune cell carrying the CAR or TCR, the oncolytic virus, the nucleic acid molecule, the expression vector, or the host cell of the disclosure. The composition may be a pharmaceutical composition further comprising a pharmaceutically acceptable carrier. In certain embodiments, the pharmaceutical composition may further contain a therapeutic agent, such as an anti-tumor agent, or an anti-infectious agent.

[0025] In yet another aspect, the disclosure provides a method for treating a disease associated with PD-1 or PD-L1 signaling (e.g., PD-L1 expression) in a subject in need thereof, which may comprise administering to the subject a therapeutically effective amount of the pharmaceutical composition of the present disclosure.

[0026] The disease may be a tumor or cancer. The tumor or cancer may be a solid one or a hematologic one. Examples of the solid cancer include, but not limited to, non-small cell lung cancer (NSCLC) , hepatocellular carcinoma (HCC) , metastatic urothelial cancer, triple-negative breast cancer (TNBC) , epithelial ovarian cancer, melanoma, colorectal cancer, cervical cancer, gastric cancer, bladder cancer, pancreatic cancer, endometrial cancer, renal cell carcinoma, prostate cancer, fallopian tube cancer, esophageal cancer, nasopharyngeal cancer, bile duct cancer, glioblastoma multiforme (GBM) , soft tissue sarcoma. Examples of the hematologic cancer include, but not limited to, non-Hodgkin lymphoma (NHL) , relapsed or refractory chronic lymphocytic leukemia (CLL) , chronic myelocytic leukemia (CML) , chronic myelomonocytic leukemia (CMML) , acute myelocytic leukemia (AML) , diffuse large B-cell lymphoma. In certain embodiments, the subject is human. In certain embodiments, the disease may be a PD-L1+ tumor or cancer.

[0027] The disease may be an infectious disease, caused by infection of e.g., a virus, a bacterium, a fungus, or a parasitic. Examples of the infectious disease include, but not limited to, human immunodeficiency virus (HIV) infections (AIDS) , hepatitis B, sepsis, and Q fever. In certain embodiments, the subject is human.

[0028] The disclosure may provide a method for diagnosis, disease monitoring, and / or prognosis of a cancer associated with PD-L1 signaling in a subject in need thereof, comprising i) collecting a sample from the subject, and ii) detecting the presence or expression level of PD-L1 using the antibody or antigen binding portion thereof of the disclosure, wherein the presence or increased expression level of PD-L1 may indicate the subject may be with a cancer, with disease progression, or with bad outcome. In certain embodiments, the subject is human.

[0029] The disclosure also provides the use of the antibody or antigen binding portion thereof, or the composition of the disclosure in diagnosis, disease monitoring, prognosis, or treatment of a disease associated with PD-L1 signaling, or in preparation of a medicament for treating a disease associated with PD-L1 signaling. In certain embodiments, the disease is a cancer, such as a solid cancer or a hematologic cancer.

[0030] Other features and advantages of the instant disclosure will be apparent from the following detailed description and examples, which should not be construed as limiting.

[0031] Accordingly, it is an object of the invention not to encompass within the invention any previously known product, process of making the product, or method of using the product such that Applicants reserve the right and hereby disclose a disclaimer of any previously known product, process, or method. It is further noted that the invention does not intend to encompass within the scope of the invention any product, process, or making of the product or method of using the product, which does not meet the written description and enablement requirements of the USPTO (35 U.S.C. §112, first paragraph) or the EPO (Article 83 of the EPC) , such that Applicants reserve the right and hereby disclose a disclaimer of any previously described product, process of making the product, or method of using the product. It may be advantageous in the practice of the invention to be in compliance with Art. 53 (c) EPC and Rule 28 (b) and (c) EPC. All rights to explicitly disclaim any embodiments that are the subject of any granted patent (s) of applicant in the lineage of this application or in any other lineage or in any prior filed application of any third party is explicitly reserved. Nothing herein is to be construed as a promise.

[0032] It is noted that in this disclosure and particularly in the claims and / or paragraphs, terms such as "comprises" , "comprised" , "comprising" and the like can have the meaning attributed to it in U.S. Patent law; e.g., they can mean "includes" , "included" , "including" , and the like; and that terms such as "consisting essentially of" and "consists essentially of" have the meaning ascribed to them in U.S. Patent law, e.g., they allow for elements not explicitly recited, but exclude elements that are found in the prior art or that affect a basic or novel characteristic of the invention.BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

[0033] The following detailed description, given by way of example, but not intended to limit the invention solely to the specific embodiments described, may best be understood in conjunction with the accompanying drawings.

[0034] FIG. 1 shows the binding capability of the mouse antibody D1G1A1H8 to human PD-L1-expressing cells in a cell-based binding FACS assay.

[0035] FIG. 2 shows the binding capability of humanized antibodies huD1G1A1H8-CDRV1-V13 (N297A, EM) and huD1G1A1H8-CDRV1-V15 (N297A, EM) to the recombinant human PD-L1 protein in a capture ELISA.

[0036] FIG. 3 shows the ability of humanized antibodies huD1G1A1H8-CDRV1-V13 (N297A, EM) and huD1G1A1H8-CDRV1-V15 (N297A, EM) to block Tecentriq-human PD-L1 binding in a benchmark blocking ELISA.

[0037] FIG. 4 shows the ability of humanized antibodies huD1G1A1H8-CDRV1-V13 (N297A, EM) and huD1G1A1H8-CDRV1-V15 (N297A, EM) to block human PD-1-PD-L1 binding in a ligand blocking ELISA.

[0038] FIG. 5 shows the capability of humanized antibodies huD1G1A1H8-CDRV1-V13 (N297A, EM) and huD1G1A1H8-CDRV1-V15 (N297A, EM) to reverse PD-1-PD-L1 induced Jurkat cell suppression in a cell based functional assay.

[0039] FIG. 6 shows the internalization-mediated cytotoxicity of huD1G1A1H8-CDRV1-V15 (AQQ, K447DEL) -DT3C conjugate against HCC1954 cells.DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

[0040] To ensure that the present disclosure may be more readily understood, certain terms are first defined. Additional definitions are set forth throughout the detailed description.

[0041] The term “PD-L1” refers to programmed death-ligand 1, also named as B7-H1 or CD274. The term “human PD-L1” refers to a PD-L1 protein having the amino acid sequence from human, such as the amino acid sequence of NCBI Ref Seq No. NP_054862.1. The term “cynomolgus PD-L1” refers to a PD-L1 protein having the amino acid sequence from cynomolgus monkey, such as the amino acid sequence of NCBI Ref Seq No. XP_015292694.1.

[0042] The term “antibody” as used herein refers to an immunoglobulin molecule that recognizes and specifically binds a target, such as PD-L1, through at least one antigen-binding site wherein the antigen-binding site is usually within the variable region of the immunoglobulin molecule. As used herein, the term encompasses intact polyclonal antibodies, intact monoclonal antibodies, single-chain Fv (scFv) antibodies, heavy chain antibodies (HCAbs) , light chain antibodies (LCAbs) , multi-specific antibodies, bispecific antibodies, monospecific antibodies, monovalent antibodies, fusion proteins comprising an antigen-binding site of an antibody, and any other modified immunoglobulin molecule comprising an antigen-binding site (e.g., dual variable domain immunoglobulin molecules) as long as the antibodies exhibit the desired biological activity. Antibodies also include, but are not limited to, mouse antibodies, chimeric antibodies, humanized antibodies, and human antibodies. An antibody can be any of the five major classes of immunoglobulins: IgA, IgD, IgE, IgG, and IgM, or subclasses (isotypes) thereof (e.g., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 and IgA2) , based on the identity of their heavy-chain constant domains referred to as alpha, delta, epsilon, gamma, and mu, respectively. The different classes of immunoglobulins have different and well-known subunit structures and three-dimensional configurations. Unless expressly indicated otherwise, the term “antibody” as used herein include “antigen-binding portion” of the intact antibodies. An immunoglobulin of the IgG class is a glycoprotein which may comprise two heavy (H) chains and two light (L) chains inter-connected by disulfide bonds. Each heavy chain may be comprised of a heavy chain variable region (abbreviated herein as VH) and a heavy chain constant region. The heavy chain constant region may be comprised of three domains, CH1, CH2 and CH3. Each light chain may be comprised of a light chain variable region (abbreviated herein as VL) and a light chain constant region. The light chain constant region may be comprised of one domain, CL. The VH and VL regions can be further subdivided into regions of hypervariability, termed complementarity determining regions (CDR) , interspersed with regions that are more conserved, termed framework regions (FR) . Each VH or VL is composed of three CDRs and four FRs, arranged from amino-terminus to carboxy-terminus in the following order: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. The variable regions of the heavy and light chains contain a binding domain that interacts with an antigen. The constant regions of the antibodies can mediate the binding of the immunoglobulin to host tissues or factors, including various cells of the immune system (e.g., effector cells) and the first component (C1q) of the classical complement system. A “functional fragment” of a heavy chain constant region refers to a part of the heavy chain constant region that retains certain desired or required abilities, including the ability to bind to host tissues or factors or to prolong antibody’s half-life. A “functional fragment” of a light chain constant region refers to a part of the light chain constant region that retains certain desired or required abilities, including the ability to stabilize antibody structure.

[0043] The term “antigen-binding portion” of an antibody (or simply “antibody portion” ) , as used herein, refers to one or more fragments of an antibody that retain the ability to specifically bind to an antigen (e.g., a PD-L1 protein) . It has been shown that the antigen-binding function of an antibody can be performed by fragments of a full-length antibody. Examples of binding fragments encompassed within the term “antigen-binding portion” of an antibody include (i) a Fab fragment, a monovalent fragment consisting of the VL, VH, CL and CH1 domains; (ii) a F (ab') 2 fragment, a bivalent fragment which may comprise two Fab fragments linked by a disulfide bridge at the hinge region; (iii) a Fd fragment consisting of the VH and CH1 domains; (iv) a Fv fragment consisting of the VL and VH domains of a single arm of an antibody, (v) an isolated complementarity determining region (CDR) ; and (vii) a nanobody, which consists of a VHH domain. Furthermore, although the two domains of the Fv fragment, VL and VH, are coded by separate genes, they can be joined, using recombinant methods, by a synthetic linker that enables them to be made as a single protein chain in which the VL and VH regions pair to form monovalent molecules (known as single chain Fv (scFv) ) . Such single chain antibodies are also intended to be encompassed within the term “antigen-binding portion” of an antibody. These antibody fragments are obtained using conventional techniques known to those with skill in the art, and the fragments are screened for utility in the same manner as are intact antibodies.

[0044] An “isolated antibody” , as used herein, is intended to refer to an antibody that is substantially free of other antibodies having different antigenic specificities (e.g., an isolated antibody that specifically binds a PD-L1 protein is substantially free of antibodies that specifically bind antigens other than PD-L1 proteins) . An isolated antibody that specifically binds a human PD-L1 protein may, however, have cross-reactivity to other antigens, such as PD-L1 proteins from other species. Moreover, an isolated antibody can be substantially free of other cellular material and / or chemicals.

[0045] The term “monoclonal antibody” as used herein refers to an antibody obtained from a population of substantially homogeneous antibodies, i.e., the individual antibodies comprising the population are identical except for possible naturally occurring mutations and / or post-translation modifications (e.g., isomerizations, amidations) that may be present in minor amounts. Monoclonal antibodies are highly specific, being directed against a single antigenic site. In contrast to polyclonal antibody preparations which typically include different antibodies directed against different determinants (epitopes) , each monoclonal antibody is directed against a single determinant on the antigen. In addition to their specificity, the monoclonal antibodies are advantageous in that they are synthesized by the hybridoma culture, uncontaminated by other immunoglobulins.

[0046] The term “mouse antibody” , as used herein, is intended to include antibodies having variable regions in which both the framework and CDR regions are derived from mouse germline immunoglobulin sequences. Furthermore, if the antibody contains a constant region, the constant region also is derived from mouse germline immunoglobulin sequences. The mouse antibodies of the disclosure can include amino acid residues not encoded by mouse germline immunoglobulin sequences (e.g., mutations introduced by random or site-specific mutagenesis in vitro or by somatic mutation in vivo) . However, the term “mouse antibody” , as used herein, is not intended to include antibodies in which CDR sequences derived from the germline of another mammalian species have been grafted onto mouse framework sequences.

[0047] The term “humanized antibody” , as used herein, refers to an antibody from non-human species whose protein sequences have been modified to increase similarity to antibody variants produced naturally in humans.

[0048] As used herein, an antibody that “specifically binds to human PD-L1” is intended to refer to an antibody that binds to human PD-L1 protein (and possibly a PD-L1 protein from one or more non-human species) but does not substantially bind to non-PD-L1 proteins. In certain embodiments, the antibody binds to human PD-L1 protein with “high affinity” , namely with a KD of 1.0 ×10-9 M or less, or even 3.0 ×10-10 M or less.

[0049] The term “Kassoc” or “Ka” , as used herein, is intended to refer to the association rate of a particular antibody-antigen interaction, whereas the term “Kdis” or “Kd” , as used herein, is intended to refer to the dissociation rate of a particular antibody-antigen interaction. The term “KD” , as used herein, is intended to refer to the dissociation constant, which is obtained from the ratio of Kd to Ka (i.e., Kd / Ka) and is expressed as a molar concentration (M) . KD values for antibodies can be determined using methods well established in the art. A method for determining the KD of an antibody is by using surface plasmon resonance, particularly using a biosensor system such as a BiacoreTM system.

[0050] The term “EC50” , also known as half maximal effective concentration, refers to the concentration of a molecule, e.g., an antibody or an antigen-binding portion thereof, or an immuneconjugate of the disclosure, which induces a half-maximal response after a specified exposure time.

[0051] The term “IC50” , also known as half maximal inhibitory concentration, refers to the concentration of a molecule, e.g., an antibody or an antigen-binding portion thereof, or an immuneconjugate of the disclosure, which induces a half-maximal inhibitory effect relative to the absence of the molecule.

[0052] The term "sequence identity" as used in the present invention refers to sequence similarity between two polynucleotide sequences or between two amino acid sequences. The percent identity can be measured using sequence comparison software or algorithms or by visual inspection. Various algorithms and software that can be used to obtain alignments of amino acid or nucleotide sequences are well-known in the art. These include, but are not limited to, BLAST, ALIGN, Megalign, BestFit, GCG Wisconsin Package, and variants thereof.

[0053] The term “subject” includes any human or nonhuman animal. The term “nonhuman animal” includes all vertebrates, e.g., mammals and non-mammals, such as non-human primates, sheep, dogs, cats, cows, horses, chickens, amphibians, and reptiles.

[0054] The term “therapeutically effective amount” means an amount of the antibody or the antigen binding portion of the present disclosure sufficient to prevent or ameliorate the symptoms associated with a disease or condition (such as a tumor or a chronic infection) and / or lessen the severity of the disease or condition. A therapeutically effective amount is understood to be in context to the condition being treated, where the actual effective amount is readily discerned by those of skill in the art.

[0055] The term “antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity” or “ADCC” is a mechanism of cell-mediated immune defense whereby an effector cell of the immune system actively lyses a target cell, whose membrane-surface antigens have been bound by the anti-PD-L1 antibody or its antigen-binding portion thereof of the disclosure.

[0056] Various aspects of the disclosure are described below in further detail.

[0057] The antibody, or the antigen-binding portion thereof, of the disclosure specifically binds to human and / or monkey PD-L1 and has i) higher binding affinity / capability to the recombinant human PD-L1 proteins, ii) higher binding affinity to the recombinant monkey PD-L1 proteins, iii) comparable, if not higher, binding capability to cells expressing human PD-L1 molecules, iv) higher ability to block human PD-1 / PD-L1 binding; and / or v) better ability to reverse PD-1-PD-L1 induced Jurkat cell suppression, as compared to prior art anti-PD-L1 antibodies such as Tecentriq, and is able to be internalized by PD-L1-expressing cells, at a higher rate than SG-559-01. The antibody or antigen binding portion thereof of the disclosure may be mouse, chimeric or humanized.

[0058] The antibody or antigen binding portion thereof of the disclosure is structurally and chemically characterized below. The amino acid sequence ID numbers of the heavy / light chain variable regions and CDRs of the antibodies or antigen binding portions thereof of the disclosure are summarized in Table 1 and Table 4 below, some antibodies sharing the same VH or VL. Table 1. Amino acid sequence ID numbers of heavy / light chain variable regions and CDRs

[0059] The heavy chain variable region CDRs and the light chain variable region CDRs in Table 1 have been defined by the Kabat numbering system. However, as is well known in the art, CDR regions can also be determined by other systems such as Chothia, and IMGT, AbM, or Contact numbering system / method, based on heavy chain / light chain variable region sequences.

[0060] The VH and VL sequences (or CDR sequences) of other anti-PD-L1 antibodies which bind to human PD-L1 can be “mixed and matched” with the VH and VL sequences (or CDR sequences) of the anti-PD-L1 antibody of the present disclosure. When VH and VL chains (or the CDRs within such chains) are mixed and matched, a VH sequence from a particular VH / VL pairing may be replaced with a structurally similar VH sequence. Likewise, a VL sequence from a particular VH / VL pairing may be replaced with a structurally similar VL sequence.

[0061] Accordingly, in one embodiment, an antibody of the disclosure, or an antigen binding portion thereof, may comprise: (a) a heavy chain variable region which may comprise an amino acid sequence listed above in Table 1; and (b) a light chain variable region which may comprise an amino acid sequence listed above in Table 1, or the VL of another Anti-PD-L1 antibody, wherein the antibody specifically binds human PD-L1.

[0062] In another embodiment, an antibody of the disclosure, or an antigen binding portion thereof, may comprise: (a) the CDR1, CDR2, and CDR3 regions of the heavy chain variable region listed above in Table 1; and (b) the CDR1, CDR2, and CDR3 regions of the light chain variable region listed above in Table 1 or the CDRs of another anti-PD-L1 antibody, wherein the antibody specifically binds human PD-L1.

[0063] In yet another embodiment, the antibody, or antigen binding portion thereof, includes the heavy chain variable CDR2 region of anti-PD-L1 antibody combined with CDRs of other antibodies which bind human PD-L1, e.g., CDR1 and / or CDR3 from the heavy chain variable region, and / or CDR1, CDR2, and / or CDR3 from the light chain variable region of a different anti-PD-L1 antibody.

[0064] In addition, it is well known in the art that the CDR3 domain, independently from the CDR1 and / or CDR2 domain (s) , alone can determine the binding specificity of an antibody for a cognate antigen and that multiple antibodies can predictably be generated having the same binding specificity based on a common CDR3 sequence. See, e.g., Klimka et al., British J. of Cancer 83 (2) : 252-260 (2000) ; Beiboer et al., J. Mol. Biol. 296: 833-849 (2000) ; Rader et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95: 8910-8915 (1998) ; Barbas et al., J. Am. Chem. Soc. 116: 2161-2162 (1994) ; Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92: 2529-2533 (1995) ; Ditzel et al., J. Immunol. 157: 739-749 (1996) ; Berezov et al., BIAjournal 8: Scientific Review 8 (2001) ; Igarashi et al., J. Biochem (Tokyo) 117: 452-7 (1995) ; Bourgeois et al., J. Virol 72: 807-10 (1998) ; Levi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90: 4374-8 (1993) ; Polymenis and Stoller, J. Immunol. 152: 5218-5329 (1994) and Xu and Davis, Immunity 13: 37-45 (2000) . See also, U.S. Pat. Nos. 6,951,646; 6,914,128; 6,090,382; 6,818,216; 6,156,313; 6,827,925; 5,833,943; 5,762,905 and 5,760,185.

[0065] Accordingly, in another embodiment, antibodies of the disclosure may comprise the CDR2 of the heavy chain variable region of the anti-PD-L1 antibody and at least the CDR3 of the heavy and / or light chain variable region of the anti-PD-L1 antibody, or the CDR3 of the heavy and / or light chain variable region of another anti-PD-L1 antibody, wherein the antibody is capable of specifically binding to human PD-L1. These antibodies may (a) compete for binding with PD-L1; (b) retain the functional characteristics; (c) bind to the same epitope; and / or (d) have a similar binding affinity as the anti-PD-L1 antibody of the present disclosure. In yet another embodiment, the antibodies further may comprise the CDR2 of the light chain variable region of the anti-PD-L1 antibody, or the CDR2 of the light chain variable region of another anti-PD-L1 antibody, wherein the antibody is capable of specifically binding to human PD-L1. In another embodiment, the antibodies of the disclosure may include the CDR1 of the heavy and / or light chain variable region of the anti-PD-L1 antibody, or the CDR1 of the heavy and / or light chain variable region of another anti-PD-L1 antibody, wherein the antibody is capable of specifically binding to human PD-L1.

[0066] In another embodiment, an antibody of the disclosure may comprise a heavy and / or light chain variable region sequences of CDR1, CDR2 and CDR3 sequences which differ from those of the anti-PD-L1 antibodies of the present disclosure by one or more conservative modifications. It is understood in the art that certain conservative sequence modification can be made which do not remove antigen binding. See, e.g., Brummell et al., (1993) Biochem 32: 1180-8; de Wildt et al., (1997) Prot. Eng. 10: 835-41; Komissarov et al., (1997) J. Biol. Chem. 272: 26864-26870; Hall et al., (1992) J. Immunol. 149: 1605-12; Kelley and O’Connell (1993) Biochem. 32: 6862-35; Adib-Conquy et al., (1998) Int. Immunol. 10: 341-6 and Beers et al., (2000) Clin. Can. Res. 6: 2835-43.

[0067] Accordingly, in one embodiment, the antibody may comprise a heavy chain variable region which may comprise CDR1, CDR2, and CDR3 sequences and / or a light chain variable region which may comprise CDR1, CDR2, and CDR3 sequences, wherein: (a) the heavy chain variable region CDR1 sequence may comprise a sequence listed in Table 1 above, and / or conservative modifications thereof; and / or (b) the heavy chain variable region CDR2 sequence may comprise a sequence listed in Table 1 above, and / or conservative modifications thereof; and / or (c) the heavy chain variable region CDR3 sequence may comprise a sequence listed in Table 1 above, and conservative modifications thereof; and / or (d) the light chain variable region CDR1, and / or CDR2, and / or CDR3 sequences may comprise the sequence (s) listed in Table 1 above; and / or conservative modifications thereof; and (e) the antibody specifically binds human PD-L1.

[0068] As used herein, the term “conservative sequence modifications” is intended to refer to amino acid modifications that do not significantly affect or alter the binding characteristics of the antibody containing the amino acid sequence. Such conservative modifications include amino acid substitutions, additions and deletions. Modifications can be introduced into an antibody of the disclosure by standard techniques known in the art, such as site-directed mutagenesis and PCR-mediated mutagenesis. Conservative amino acid substitutions are ones in which the amino acid residue is replaced with an amino acid residue having a similar side chain. Families of amino acid residues having similar side chains have been defined in the art. These families include amino acids with basic side chains (e.g., lysine, arginine, histidine) , acidic side chains (e.g., aspartic acid, glutamic acid) , uncharged polar side chains (e.g., glycine, asparagine, glutamine, serine, threonine, tyrosine, cysteine, tryptophan) , nonpolar side chains (e.g., alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, methionine) , beta-branched side chains (e.g., threonine, valine, isoleucine) and aromatic side chains (e.g., tyrosine, phenylalanine, tryptophan, histidine) . Thus, one or more amino acid residues within the CDR regions of an antibody of the disclosure can be replaced with other amino acid residues from the same side chain family and the altered antibody can be tested for retained function (i.e., the functions set forth above) using the functional assays described herein.

[0069] Antibodies of the disclosure can be prepared using an antibody having one or more of the VH / VL sequences of the anti-PD-L1 antibody of the present disclosure as the starting material to engineer a modified antibody. An antibody can be engineered by modifying one or more residues within one or both variable regions (i.e., VH and / or VL) , for example within one or more CDR regions and / or within one or more framework regions. Additionally or alternatively, an antibody can be engineered by modifying residues within the constant region (s) , for example to alter the effector function (s) of the antibody.

[0070] In certain embodiments, CDR grafting can be used to engineer variable regions of antibodies. Antibodies interact with target antigens predominantly through amino acid residues that are located in the six heavy and light chain complementarity determining regions (CDRs) . For this reason, the amino acid sequences within CDRs are more diverse between individual antibodies than sequences outside of CDRs. Because CDR sequences are responsible for most antibody-antigen interactions, it is possible to express recombinant antibodies that mimic the properties of specific naturally occurring antibodies by constructing expression vectors that include CDR sequences from the specific naturally occurring antibody grafted onto framework sequences from a different antibody with different properties (see, e.g., Riechmann et al., (1998) Nature 332: 323-327; Jones et al., (1986) Nature 321: 522-525; Queen et al., (1989) Proc. Natl. Acad. See also U.S.A. 86: 10029-10033; U.S. Pat. Nos. 5,225,539; 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 and 6,180,370) .

[0071] Accordingly, another embodiment of the disclosure pertains to an isolated monoclonal antibody, or antigen binding portion thereof, which may comprise a heavy chain variable region that may comprise CDR1, CDR2, and CDR3 sequences which may comprise the sequences of the present disclosure, as described above, and / or a light chain variable region which may comprise CDR1, CDR2, and CDR3 sequences which may comprise the sequences of the present disclosure, as described above. While these antibodies contain the VH and VL CDR sequences of the monoclonal antibody of the present disclosure, they can contain different framework sequences.

[0072] Such framework sequences can be obtained from public DNA databases or published references that include germline antibody gene sequences. For example, germline DNA sequences for human heavy and light chain variable region genes can be found in the “VBase” human germline sequence database (available on the Internet at www. mrc-cpe. cam. ac. uk) , as well as in Kabat et al., (1991) , cited supra; Tomlinson et al., (1992) J. Mol. Biol. 227: 776-798; and Cox et al., (1994) Eur. J. Immunol. 24: 827-836. As another example, the germline DNA sequences for human heavy and light chain variable region genes can be found in the Genbank database. For example, the following heavy chain germline sequences found in the HCo7 HuMAb mouse are available in the accompanying Genbank Accession Nos.: 1-69 (NG--0010109, NT--024637 &BC070333) , 3-33 (NG--0010109 &NT--024637) and 3-7 (NG--0010109 &NT--024637) . As another example, the following heavy chain germline sequences found in the HCo12 HuMAb mouse are available in the accompanying Genbank Accession Nos.: 1-69 (NG--0010109, NT--024637 &BC070333) , 5-51 (NG--0010109 &NT--024637) , 4-34 (NG--0010109 &NT--024637) , 3-30.3 (CAJ556644) &3-23 (AJ406678) .

[0073] Antibody protein sequences are compared against a compiled protein sequence database using one of the sequence similarity searching methods called the Gapped BLAST (Altschul et al., (1997) , supra) , which is well known to those skilled in the art.

[0074] The framework sequences for use in the antibodies of the disclosure may be those that are structurally similar to the framework sequences used by antibodies of the disclosure. The VH CDR1, CDR2, and CDR3 sequences can be grafted onto framework regions that have the identical sequence as that found in the germline immunoglobulin gene from which the framework sequence derives, or the CDR sequences can be grafted onto framework regions that contain one or more mutations as compared to the germline sequences. For example, it has been found that in certain instances it is beneficial to mutate residues within the framework regions to maintain or enhance the antigen binding ability of the antibody (see e.g., U.S. Pat. Nos. 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 and 6,180,370) .

[0075] Another type of variable region modification is to mutate amino acid residues within the VH and / or VL CDR1, CDR2 and / or CDR3 regions to thereby improve one or more binding properties (e.g., affinity) of the antibody of interest. Site-directed mutagenesis or PCR-mediated mutagenesis can be performed to introduce the mutation (s) and the effect on antibody binding, or other functional property of interest, can be evaluated in in vitro or in vivo assays as known in the art. In certain embodiments, conservative modifications (as known in the art) are introduced. The mutations can be amino acid substitutions, additions or deletions. Moreover, typically no more than one, two, three, four or five residues within a CDR region are altered.

[0076] Accordingly, in another embodiment, the disclosure provides isolated anti-PD-L1 monoclonal antibodies, or antigen binding portions thereof, which may comprise a heavy chain variable region that may comprise: (a) a VH CDR1 region which may comprise the sequence of the present disclosure, or an amino acid sequence having one, two, three, four or five amino acid substitutions, deletions or additions; (b) a VH CDR2 region which may comprise the sequence of the present disclosure, or an amino acid sequence having one, two, three, four or five amino acid substitutions, deletions or additions; (c) a VH CDR3 region which may comprise the sequence of the present disclosure, or an amino acid sequence having one, two, three, four or five amino acid substitutions, deletions or additions; (d) a VL CDR1 region which may comprise the sequence of the present disclosure, or an amino acid sequence having one, two, three, four or five amino acid substitutions, deletions or additions; (e) a VL CDR2 region which may comprise the sequence of the present disclosure, or an amino acid sequence having one, two, three, four or five amino acid substitutions, deletions or additions; and (f) a VL CDR3 region which may comprise the sequence of the present disclosure, or an amino acid sequence having one, two, three, four or five amino acid substitutions, deletions or additions.

[0077] Engineered antibodies of the disclosure include those in which modifications have been made to framework residues within VH and / or VL, e.g., to improve the properties of the antibody. Typically, such framework modifications are made to decrease the immunogenicity of the antibody. For example, one approach is to “back-mutate” one or more framework residues to the corresponding germline sequence. More specifically, an antibody that has undergone somatic mutation can contain framework residues that differ from the germline sequence from which the antibody is derived. Such residues can be identified by comparing the antibody framework sequences to the germline sequences from which the antibody is derived.

[0078] Another type of framework modification involves mutating one or more residues within the framework region, or even within one or more CDR regions, to remove T cell epitopes to thereby reduce the potential immunogenicity of the antibody. This approach is also referred to as “deimmunization” and is described in further detail in U.S. Patent Publication No. 20030153043.

[0079] In addition, or as an alternative to modifications made within the framework or CDR regions, antibodies of the disclosure can be engineered to include modifications within the Fc region, typically to alter one or more functional properties of the antibody, such as serum half-life, complement fixation, Fc receptor binding, and / or antigen-dependent cellular cytotoxicity. Furthermore, an antibody of the disclosure can be chemically modified (e.g., one or more chemical moieties can be attached to the antibody) or be modified to alter its glycosylation, again to alter one or more functional properties of the antibody.

[0080] In one embodiment, the hinge region of CH1 is modified in such that the number of cysteine residues in the hinge region is altered, e.g., increased or decreased. This approach is described further in U.S. Pat. No. 5,677,425. The number of cysteine residues in the hinge region of CH1 is altered to, for example, facilitate assembly of the light and heavy chains or to increase or decrease the stability of the antibody.

[0081] In another embodiment, the Fc hinge region of an antibody is mutated to increase or decrease the biological half-life of the antibody. More specifically, one or more amino acid mutations are introduced into the CH2-CH3 domain interface region of the Fc-hinge fragment such that the antibody has impaired Staphylococcyl protein A (SpA) binding relative to native Fc-hinge domain SpA binding. This approach is described in further detail in U.S. Pat. No. 6,165,745.

[0082] In still another embodiment, the glycosylation of an antibody is modified. For example, an deglycosylated antibody can be made (i.e., the antibody lacks glycosylation) . Glycosylation can be altered to, for example, increase the affinity of the antibody for antigen. Such carbohydrate modifications can be accomplished by, for example, altering one or more sites of glycosylation within the antibody sequence. For example, one or more amino acid substitutions can be made that result in elimination of one or more variable region framework glycosylation sites to thereby eliminate glycosylation at that site. Such aglycosylation may increase the affinity of the antibody for antigen. See, e.g., U.S. Pat. Nos. 5,714,350 and 6,350,861.

[0083] Additionally or alternatively, an antibody can be made that has an altered type of glycosylation, such as a hypofucosylated antibody having reduced amounts of fucosyl residues or an antibody having increased bisecting GlcNac structures. Such altered glycosylation patterns have been demonstrated to increase or reduce the ADCC ability of antibodies. Such carbohydrate modifications can be accomplished by, for example, expressing the antibody in a host cell with altered glycosylation machinery. Cells with altered glycosylation machinery have been described in the art and can be used as host cells in which to express recombinant antibodies of the disclosure to thereby produce an antibody with altered glycosylation. For example, the cell lines Ms704, Ms705, and Ms709 lack the fucosyltransferase gene, FUT8 (α (1, 6) -fucosyltransferase) , such that antibodies expressed in the Ms704, Ms705, and Ms709 cell lines lack fucose on their carbohydrates. The Ms704, Ms705, and Ms709 FUT8- / -cell lines were created by the targeted disruption of the FUT8 gene in CHO / DG44 cells using two replacement vectors (see U.S. Patent Publication No. 20040110704 and Yamane-Ohnuki et al., (2004) Biotechnol Bioeng 87: 614-22) . As another example, EP 1,176,195 describes a cell line with a functionally disrupted FUT8 gene, which encodes a fucosyl transferase, such that antibodies expressed in such a cell line exhibit hypofucosylation by reducing or eliminating the α-1, 6 bond-related enzyme.

[0084] Another modification of the antibodies herein that is contemplated by this disclosure is pegylation. An antibody can be pegylated to, for example, increase the biological (e.g., serum) half-life of the antibody. To pegylate an antibody, the antibody, or fragment thereof, typically is reacted with polyethylene glycol (PEG) , such as a reactive ester or aldehyde derivative of PEG, under conditions in which one or more PEG groups become attached to the antibody or antibody fragment. In certain embodiments, the pegylation is carried out via an acylation reaction or an alkylation reaction with a reactive PEG molecule (or an analogous reactive water-soluble polymer) . As used herein, the term “polyethylene glycol” is intended to encompass any of the forms of PEG that have been used to derivatize other proteins, such as mono (C1-C10) alkoxy-or aryloxy-polyethylene glycol or polyethylene glycol-maleimide. In certain embodiments, the antibody to be pegylated is an aglycosylated antibody. Methods for pegylating proteins are known in the art and can be applied to the antibodies of the disclosure. See, e.g., EP 0 154 316 and EP 0 401 384.

[0085] Antibodies of the disclosure can be characterized by their various physical properties, to detect and / or differentiate different classes thereof.

[0086] For example, antibodies can contain one or more glycosylation sites in either the light or heavy chain variable region. Such glycosylation sites may result in increased immunogenicity of the antibody or an alteration of the pK of the antibody due to altered antigen binding (Marshall et al (1972) Annu Rev Biochem 41: 673-702; Gala and Morrison (2004) J Immunol 172: 5489-94; Wallick et al (1988) J Exp Med 168: 1099-109; Spiro (2002) Glycobiology 12: 43R-56R; Parekh et al (1985) Nature 316: 452-7; Mimura et al., (2000) Mol Immunol 37: 697-706) . Glycosylation has been known to occur at motifs containing an N-X-S / T sequence. In some instances, an anti-PD-L1 antibody does not contain variable region glycosylation. This can be achieved either by selecting antibodies that do not contain the glycosylation motif in the variable region or by mutating residues within the glycosylation region.

[0087] In an embodiment, the antibodies do not contain asparagine isomerism sites. The deamidation of asparagine may occur on N-G or D-G sequences and result in the creation of an isoaspartic acid residue that introduces a link into the polypeptide chain and decreases its stability (isoaspartic acid effect) .

[0088] Each antibody will have a unique isoelectric point (pI) , which generally falls in the pH range between 6 and 9.5. The pI for an IgG1 antibody typically falls within the pH range of 7-9.5 and the pI for an IgG4 antibody typically falls within the pH range of 6-8. There is speculation that antibodies with a pI outside the normal range may have some unfolding and instability under in vivo conditions. Thus, an anti-PD-L1 antibody may contain a pI value that falls in the normal range. This can be achieved either by selecting antibodies with a pI in the normal range or by mutating charged surface residues.

[0089] In another aspect, the disclosure provides a nucleic acid molecule that encodes the heavy and / or light chain variable regions, or CDRs, of the antibody or antigen-binding portion thereof of the disclosure. The nucleic acid molecule can be present in whole cells, in a cell lysate, or in a partially purified or substantially pure form. A nucleic acid molecule is “isolated” or “rendered substantially pure” when purified away from other cellular components or other contaminants, e.g., other cellular nucleic acids or proteins, by standard techniques. A nucleic acid molecule of the disclosure can be, e.g., DNA or RNA and may or may not contain intronic sequences. In an embodiment, the nucleic acid molecule is a cDNA molecule.

[0090] The nucleic acid molecule of the disclosure can be obtained using standard molecular biology techniques. For antibodies expressed by hybridomas (e.g., hybridomas prepared from transgenic mice carrying human immunoglobulin genes as described further below) , cDNAs encoding the light and heavy chains of the antibody made by the hybridoma can be obtained by standard PCR amplification or cDNA cloning techniques. For antibodies obtained from an immunoglobulin gene library (e.g., using phage display techniques) , a nucleic acid molecule encoding such antibodies can be recovered from the gene library.

[0091] The nucleic acids molecules of the disclosure may include those encoding the VH and VL sequences of the PD-L1 monoclonal antibody or the CDRs. Once DNA fragments encoding VH and VL segments are obtained, these DNA fragments can be further manipulated by standard recombinant DNA techniques, for example to convert the variable region genes to full-length antibody chain genes, to Fab fragment genes or to a scFv gene. In these manipulations, a VL-or VH-encoding DNA fragment is operatively linked to another DNA fragment encoding another protein, such as an antibody constant region or a flexible linker. The term “operatively linked” , as used in this context, is intended to mean that the two DNA fragments are joined such that the amino acid sequences encoded by the two DNA fragments remain in-frame.

[0092] The isolated DNA encoding the VH region can be converted to a full-length heavy chain gene by operatively linking the VH-encoding DNA to another DNA molecule encoding heavy chain constant regions (CH1, CH2 and CH3) . The sequences of human heavy chain constant region genes are known in the art and DNA fragments encompassing these regions can be obtained by standard PCR amplification. The heavy chain constant region can be an IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM or IgD constant region. For a Fab fragment heavy chain gene, the VH-encoding DNA can be operatively linked to another DNA molecule encoding only the heavy chain CH1 constant region.

[0093] The isolated DNA encoding the VL region can be converted to a full-length light chain gene (as well as a Fab light chain gene) by operatively linking the VL-encoding DNA to another DNA molecule encoding the light chain constant region, CL. The sequences of human light chain constant region genes are known in the art and DNA fragments encompassing these regions can be obtained by standard PCR amplification. In certain embodiments, the light chain constant region can be a kappa or lambda constant region.

[0094] To create a scFv gene, the VH-and VL-encoding DNA fragments are operatively linked to another fragment encoding a flexible linker, e.g., encoding the amino acid sequence (Gly4-Ser) 3, such that the VH and VL sequences can be expressed as a contiguous single-chain protein, with the VL and VH regions joined by the flexible linker (see e.g., Bird et al., (1988) Science 242: 423-426; Huston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883; McCafferty et al., (1990) Nature 348: 552-554) .

[0095] Monoclonal antibodies (mAbs) of the present disclosure can be produced using the well-known somatic cell hybridization (hybridoma) technique of Kohler and Milstein (1975) Nature 256: 495. Other embodiments for producing monoclonal antibodies include viral or oncogenic transformation of B lymphocytes and phage display techniques. Chimeric or humanized antibodies are also well known in the art. See e.g., U.S. Pat. Nos. 4,816,567; 5,225,539; 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 and 6,180,370.

[0096] Antibodies of the disclosure also can be produced in a host cell transfectoma using, for example, a combination of recombinant DNA techniques and gene transfection methods as is well known in the art (e.g., Morrison, S. (1985) Science 229: 1202) . In one embodiment, DNA encoding partial or full-length light and heavy chains obtained by standard molecular biology techniques is inserted into one or more expression vectors such that the genes are operatively linked to transcriptional and translational regulatory sequences. In this context, the term “operatively linked” is intended to mean that an antibody gene is ligated into a vector such that transcriptional and translational control sequences within the vector serve their intended function of regulating the transcription and translation of the antibody gene.

[0097] The term “regulatory sequence” is intended to include promoters, enhancers and other expression control elements (e.g., polyadenylation signals) that control the transcription or translation of the antibody genes. Such regulatory sequences are described, e.g., in Goeddel (Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990) ) . In some embodiments, the regulatory sequences for mammalian host cell expression include viral elements that direct high levels of protein expression in mammalian cells, such as promoters and / or enhancers derived from cytomegalovirus (CMV) , Simian Virus 40 (SV40) , adenovirus, e.g., the adenovirus major late promoter (AdMLP) and polyomavirus enhancer. Alternatively, non-viral regulatory sequences can be used, such as the ubiquitin promoter or β-globin promoter. Still further, regulatory elements composed of sequences from different sources, such as the SRα promoter system, which contains sequences from the SV40 early promoter and the long terminal repeat of human T cell leukemia virus type 1 (Takebe et al., (1988) Mol. Cell. Biol. 8: 466-472) . The expression vector and expression control sequences are chosen to be compatible with the expression host cell used.

[0098] The antibody light chain gene and the antibody heavy chain gene can be inserted into the same or separate expression vectors. In certain embodiments, the variable regions are used to create full-length antibody genes of any antibody isotype by inserting them into expression vectors already encoding heavy chain constant and light chain constant regions of the desired isotype such that the VH segment is operatively linked to the CH segment (s) within the vector and the VL segment is operatively linked to the CL segment within the vector. Additionally or alternatively, the recombinant expression vector can encode a signal peptide that facilitates secretion of the antibody chain from a host cell. The antibody chain gene can be cloned into the vector such that the signal peptide is linked in-frame to the amino terminus of the antibody chain gene. The signal peptide can be an immunoglobulin signal peptide or a heterologous signal peptide (i.e., a signal peptide from a non-immunoglobulin protein) .

[0099] In addition to the antibody chain genes and regulatory sequences, the recombinant expression vectors of the disclosure can carry additional sequences, such as sequences that regulate replication of the vector in host cells (e.g., origins of replication) and selectable marker genes. The selectable marker gene facilitates selection of host cells into which the vector has been introduced (see, e.g., U.S. Pat. Nos. 4,399,216; 4,634,665 and 5,179,017) . For example, typically the selectable marker gene confers resistance to drugs, such as G418, hygromycin or methotrexate, on a host cell into which the vector has been introduced. In certain embodiments, the selectable marker genes include the dihydrofolate reductase (DHFR) gene (for use in dhfr-host cells with methotrexate selection / amplification) and the neo gene (for G418 selection) .

[0100] For expression of the light and heavy chains, the expression vector (s) encoding the heavy and light chains is transfected into a host cell by standard techniques. The various forms of the term “transfection” are intended to encompass a wide variety of techniques commonly used for the introduction of exogenous DNA into a prokaryotic or eukaryotic host cell, e.g., electroporation, calcium-phosphate precipitation, DEAE-dextran transfection and the like. Although it is theoretically possible to express the antibodies of the disclosure in either prokaryotic or eukaryotic host cells, expression of antibodies in eukaryotic cells such as mammalian host cells, is preferred because such eukaryotic cells, and in particular mammalian cells, are more likely than prokaryotic cells to assemble and secrete a properly folded and immunologically active antibody.

[0101] In certain embodiments, the mammalian host cells for expressing the recombinant antibodies of the disclosure include Chinese Hamster Ovary (CHO cells) (including dhfr-CHO cells, described in Urlaub and Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216-4220, used with a DHFR selectable marker, e.g., as described in R. J. Kaufman and P. A. Sharp (1982) J. Mol. Biol. 159: 601-621) , NSO myeloma cells, COS cells and SP2 cells. In particular for use with NSO myeloma cells, the expression system may be the GS gene expression system disclosed in WO 87 / 04462, WO 89 / 01036 and EP 338,841. When recombinant expression vectors encoding antibody genes are introduced into mammalian host cells, the antibodies are produced by culturing the host cells for a period of time sufficient to allow for expression of the antibody in the host cells or, more particularly, secretion of the antibody into the culture medium in which the host cells are grown. Antibodies can be recovered from the culture medium using standard protein purification methods.

[0102] In another aspect, the present disclosure features bispecific molecules which may comprise one or more antibodies of the disclosure linked to at least one other functional molecule, e.g., another peptide or protein (e.g., another antibody or ligand for a receptor) to generate a bispecific molecule that binds to at least two different binding sites or target molecules. Thus, as used herein, “bispecific molecule” includes molecules that have three or more specificities.

[0103] Bispecific molecules may be in many different formats and sizes. At one end of the size spectrum, a bispecific molecule retains the traditional antibody format, except that, instead of having two binding arms of identical specificity, it has two binding arms each having a different specificity. At the other extreme are bispecific molecules consisting of two single-chain antibody fragments (scFv's) linked by a peptide chain, a so-called Bs (scFv) 2 construct. Intermediate-sized bispecific molecules include two different F (ab) fragments linked by a peptidyl linker. Bispecific molecules of these and other formats can be prepared by genetic engineering, somatic hybridization, or chemical methods. See, e.g., Kufer et al, cited supra; Cao and Suresh, Bioconjugate Chemistry, 9 (6) , 635-644 (1998) ; and van Spriel et al., Immunology Today, 21 (8) , 391-397 (2000) , and the references cited therein.

[0104] An oncolytic virus preferentially infects and kills cancer cells. The antibody or antigen binding portion thereof of the disclosure may be used in conjunction with the oncolytic virus. Alternatively, an oncolytic virus encoding the antibody or antigen binding portion thereof of the disclosure can be introduced into human body.

[0105] Also provided herein are a chimeric antigen receptor (CAR) containing an anti-PD-L1 scFv, the anti-PD-L1 scFv may comprise CDRs and heavy / light chain variable regions described herein.

[0106] The anti-PD-L1 CAR may comprise (a) an extracellular antigen binding domain which may comprise an anti-PD-L1 scFv; (b) a transmembrane domain; and (c) an intracellular signaling domain.

[0107] The CAR may contain a signal peptide at the N-terminus of the extracellular antigen binding domain that directs the nascent receptor into the endoplasmic reticulum, and a hinge peptide at the N-terminus of the extracellular antigen binding domain that makes the receptor more available for binding. In certain embodiments, the CAR comprises, at the intracellular signaling domain, a primary intracellular signaling domain and one or more co-stimulatory signaling domains. The mainly used and most effective primary intracellular signaling domain is CD3-zeta cytoplasmic domain which contains ITAMs, the phosphorylation of which results in T cell activation. The co-stimulatory signaling domain may be derived from the co-stimulatory proteins such as CD28, CD137 and OX40. The CARs may further add factors that enhance T cell expansion, persistence, and anti-tumor activity, such as cytokines, and co-stimulatory ligands.

[0108] Also provided are engineered immune effector cells, which may comprise the CAR provided herein. In certain embodiments, the immune effector cell is a T cell, an NK cell, a peripheral blood mononuclear cell (PBMC) , a hematopoietic stem cell, a pluripotent stem cell, or an embryonic stem cell. In certain embodiments, the immune effector cell is a T cell.

[0109] Antibodies of the disclosure can be conjugated to a therapeutic agent to form an immunoconjugate such as an antibody-drug conjugate (ADC) . Suitable therapeutic agents include an anti-cancer agent. In the ADC, the antibody and therapeutic agent may be conjugated via a linker cleavable such as a peptidyl, disulfide, or hydrazone linker. In certain embodiments, the linker is a peptidyl linker such as Val-Cit, Ala-Val, Val-Ala-Val, Lys-Lys, Ala-Asn-Val, Val-Leu-Lys, Ala-Ala-Asn, Cit-Cit, Val-Lys, Lys, Cit, Ser, or Glu. The ADCs can be prepared as described in U.S. Pat. Nos. 7,087,600; 6,989,452; and 7,129,261; PCT Publications WO 02 / 096910; WO 07 / 038,658; WO 07 / 051,081; WO 07 / 059,404; WO 08 / 083,312; and WO 08 / 103,693; U.S. Patent Publications 20060024317; 20060004081; and 20060247295. In certain embodiments, the anti-PD-L1 antibody or antigen binding portion thereof may be conjugated to a toxic recombinant protein. The toxic recombinant protein may be DT3C having e.g., the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12.

[0110] In another aspect, the present disclosure provides a pharmaceutical composition comprising the antibody or antigen binding portion thereof, the immunoconjugate, the bispecific molecule, the CAR -carrying immune cell, the oncolytic virus, the nucleic acid molecule, the expression vector, and / or the host cell of the present disclosure formulated together with a pharmaceutically acceptable carrier. The composition may optionally contain one or more additional pharmaceutically active ingredients, such as an anti-tumor agent, an anti-infective agent, or an agent for immunity enhancement. The pharmaceutical composition of the disclosure may be administered in a combination therapy with, for example, an anti-tumor agent, an anti-infective agent, or an agent for immunity enhancement.

[0111] The pharmaceutical composition may comprise any number of excipients. Excipients that can be used include carriers, surface active agents, thickening or emulsifying agents, solid binders, dispersion or suspension aids, solubilizers, colorants, flavoring agents, coatings, disintegrating agents, lubricants, sweeteners, preservatives, isotonic agents, and combinations thereof. The selection and use of suitable excipients are taught in Gennaro, ed., Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Ed. (Lippincott Williams &Wilkins 2003) .

[0112] The pharmaceutical composition may be suitable for intravenous, intramuscular, subcutaneous, parenteral, spinal or epidermal administration (e.g., by injection or infusion) . Depending on the route of administration, the active ingredient can be coated in a material to protect it from the action of acids and other natural conditions that may inactivate it. The phrase “parenteral administration” as used herein means modes of administration other than enteral and topical administration, usually by injection, and includes, without limitation, intravenous, intramuscular, intra-arterial, intrathecal, intracapsular, intraorbital, intracardiac, intradermal, intraperitoneal, transtracheal, subcutaneous, subcuticular, intra-articular, subcapsular, subarachnoid, intraspinal, epidural and intrasternal injection and infusion. Alternatively, an antibody of the disclosure can be administered via a non-parenteral route, such as a topical, epidermal or mucosal route of administration, e.g., intranasally, orally, vaginally, rectally, sublingually or topically.

[0113] Pharmaceutical compositions can be in the form of sterile aqueous solutions or dispersions. They can also be formulated in a microemulsion, liposome, or other ordered structure suitable to high drug concentration.

[0114] The amount of active ingredient which can be combined with a carrier material to produce a single dosage form will vary depending upon the subject being treated and the particular mode of administration and will generally be that amount of the composition which produces a therapeutic effect. Generally, out of one hundred percent, this amount will range from about 0.01%to about ninety-nine percent of active ingredient in combination with a pharmaceutically acceptable carrier.

[0115] Dosage regimens are adjusted to provide the optimum desired response (e.g., a therapeutic response) . For example, a single bolus can be administered, several divided doses can be administered over time or the dose can be proportionally reduced or increased as indicated by the exigencies of the therapeutic situation. It is especially advantageous to formulate parenteral compositions in dosage unit form for ease of administration and uniformity of dosage. Dosage unit form as used herein refers to physically discrete units suited as unitary dosages for the subjects to be treated; each unit contains a predetermined quantity of active ingredient calculated to produce the desired therapeutic effect in association with the required pharmaceutical carrier. Alternatively, antibody can be administered as a sustained release formulation, in which case less frequent administration is required.

[0116] For administration of the composition, the dosage may range from about 0.0001 to 100 mg / kg. An exemplary treatment regime entails administration once per week.

[0117] A “therapeutically effective dosage” of the composition of the disclosure may result in a decrease in severity of disease symptoms, an increase in frequency and duration of disease symptom-free periods, or a prevention of impairment or disability due to the disease affliction. For example, for the treatment of tumor-bearing subjects, a “therapeutically effective dosage” may inhibit tumor growth by at least about 20%, 40%, 60%, or even 80%relative to untreated subjects.

[0118] The pharmaceutical composition can be a controlled release formulation, including implants, transdermal patches, and microencapsulated delivery systems. Biodegradable, biocompatible polymers can be used, such as ethylene vinyl acetate, polyanhydrides, polyglycolic acid, collagen, polyorthoesters, and polylactic acid. See, e.g., Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978.

[0119] Therapeutic compositions can be administered via medical devices such as (1) needleless hypodermic injection devices (e.g., U.S. Pat. Nos. 5,399,163; 5,383,851; 5,312,335; 5,064,413; 4,941,880; 4,790,824; and 4,596,556) ; (2) micro-infusion pumps (U.S. Pat. No. 4,487,603) ; (3) transdermal devices (U.S. Pat. No. 4,486,194) ; (4) infusion apparatuses (U.S. Pat. Nos. 4,447,233 and 4,447,224) ; and (5) osmotic devices (U.S. Pat. Nos. 4,439,196 and 4,475,196) .

[0120] In certain embodiments, the monoclonal antibodies or antigen binding portions thereof of the disclosure can be formulated to ensure proper distribution in vivo. For example, to ensure that the therapeutic antibody of the disclosure cross the blood-brain barrier, they can be formulated in liposomes, which may additionally comprise targeting moieties to enhance selective transport to specific cells or organs. See, e.g. U.S. Pat. Nos. 4,522,811; 5,374,548; 5,416,016; and 5,399,331; V. V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29: 685; Umezawa et al., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153: 1038; Bloeman et al., (1995) FEBS Lett. 357: 140; M. Owais et al., (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39: 180; Briscoe et al., (1995) Am. J. Physiol. 1233: 134; Schreier et al., (1994) J. Biol. Chem. 269: 9090; Keinanen and Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346: 123; and Killion and Fidler (1994) Immunomethods 4: 273.

[0121] The pharmaceutical composition of the present disclosure may have numerous in vitro and in vivo utilities involving, for example, treatment of infectious disorders, and cancers where PD-L1 targeting or PD-1-PD-L1 blockade is beneficial.

[0122] The disclosure provides a method for treating a disease where PD-L1 targeting or PD-1-PD-L1 blockade is beneficial in a subject in need thereof, which may comprise administering to a subject a therapeutically effective amount of the pharmaceutical composition of the present disclosure.

[0123] The disease may be a tumor or cancer. The tumor or cancer may be a solid one or a hematologic one. Exemplary examples of the solid cancer include, but not limited to, non-small cell lung cancer (NSCLC) , hepatocellular carcinoma (HCC) , metastatic urothelial cancer, triple-negative breast cancer (TNBC) , epithelial ovarian cancer, melanoma, colorectal cancer, cervical cancer, gastric cancer, bladder cancer, pancreatic cancer, endometrial cancer, renal cell carcinoma, prostate cancer, fallopian tube cancer, esophageal cancer, nasopharyngeal cancer, bile duct cancer, glioblastoma multiforme (GBM) , soft tissue sarcoma. Exemplary examples of the hematologic cancer include, but not limited to, non-Hodgkin lymphoma (NHL) , relapsed or refractory chronic lymphocytic leukemia (CLL) , chronic myelocytic leukemia (CML) , chronic myelomonocytic leukemia (CMML) , acute myelocytic leukemia (AML) , diffuse large B-cell lymphoma. In certain embodiments, the subject is human.

[0124] The disease may be an infectious disease. Examples of the infectious disease include, but not limited to, human immunodeficiency virus (HIV) infections (AIDS) , hepatitis B, sepsis, and Q fever. In certain embodiments, the subject is human.

[0125] The present disclosure also provides a method for enhancing an immune response in a subject in need thereof, comprising administering to the subject the pharmaceutical composition of the disclosure.

[0126] In another aspect, the disclosure provides methods of combination therapy in which the pharmaceutical composition of the present disclosure is co-administered with one or more additional antibodies that are effective in inhibiting tumor growth or lowering viral, bacterial, fungal or parasitic loads in a subject. In one embodiment, the disclosure provides a method for inhibiting tumor growth in a subject which may comprise administering to the subject the pharmaceutical composition of the disclosure and one or more additional antibodies, such as an anti-VEGF antibody, an anti-OX40 antibody, or an anti-TIM-3 antibody. In certain embodiments, the subject is human. The anti-PD-L1 administration can also be further combined with standard cancer treatments.

[0127] The combination of therapeutic agents discussed herein can be administered concurrently as a single composition in a pharmaceutically acceptable carrier, or concurrently as separate compositions with each agent in a pharmaceutically acceptable carrier. In another embodiment, the combination of therapeutic agents can be administered sequentially.

[0128] Furthermore, if more than one dose of the combination therapy is administered sequentially, the order of the sequential administration can be reversed or kept in the same order at each time point of administration, sequential administrations can be combined with concurrent administrations, or any combination thereof.

[0129] The present disclosure is further illustrated by the following examples, which should not be construed as further limiting. ExamplesExample 1. Generation of Anti-PD-L1 Monoclonal Antibodies Using Hybridoma Technology Immunization

[0130] Mice were immunized according to the method described in E Harlow, D. Lane, Antibody: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 1998. A recombinant human PD-L1-Fc protein (prepared in-house with SEQ ID NO: 16) was used as the immunogen, and a recombinant human PD-L1-his protein (SinoBiological, Cat#10084-H08H) was used for determining anti-sera titers and for screening hybridomas secreting antigen-specific antibodies.

[0131] Immunizing dosages contained 50 μg recombinant human PD-L1-Fc protein per mouse per injection for the primary immunization, and 25 μg per mouse per injection for boost immunizations. To increase immune responses, the complete Freud's adjuvant and incomplete Freud's adjuvant (Sigma, St. Louis, Mo., USA) were used respectively for primary and boost immunizations. Briefly, the adjuvant-immunogen mixture was prepared as follows. First, the adjuvant was gently shaken in a vial using a vortex, and the desired amount of adjuvant was transferred to an autoclaved 1.5 mL micro-centrifuge tube. The immunogen was prepared in PBS or saline with the concentration ranging from 0.25 to 0.5 mg / ml, and added at a calculated amount to the micro-centrifuge tube with the adjuvant. The resulting adjuvant-antigen mixture was mixed by gently vortexing for 2 minutes to generate a water-in-oil emulsion, and the emulsion was then drawn into a proper syringe for animal injection. A total of 50 or 25 μg of immunogen was injected in a volume of 150-200 μl. Each animal was immunized, and then boosted for 3 to 4 times depending on the anti-sera titers. Animals with good titers, as measured by ELISA, were given a final boost by intraperitoneal injection before hybridoma fusion. Hybridoma fusion and screening

[0132] Cells of murine myeloma cell line (SP2 / 0-Ag14, ATCC#CRL-1581) were cultured to reach the log phase right before hybridoma fusion. Spleen cells from the immunized mice were prepared sterilely and fused with the myeloma cells according to the method as described in Kohler G, and Milstein C, "Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity, " Nature, 256: 495-497 (1975) . Fused "hybrid cells" were subsequently dispensed into 96-well cell culture plates in DMEM / 20%FCS / HAT media. Surviving hybridoma colonies were observed under the microscope seven to ten days post fusion. After two weeks, the supernatant from each well was subjected to Indirect ELISA using the human PD-L1-his protein. Positive hybridomas secreting antibodies that bound to the human PD-L1-his protein were selected and transferred to 24-well plates. Hybridoma clones producing antibodies that showed high specific human PD-L1 binding were subcloned by limited dilution to ensure the clonality of the cell line, and then monoclonal antibodies were purified. Briefly, Protein A sepharose columns (bestchrom (Shanghai) Biosciences, Cat#AA0273) were washed using PBS buffer in 5 to 10 column volumes. Cell supernatants from the monoclonal hybridomas of the disclosure were passed through the columns, and then the columns were washed using PBS buffer until the absorbance for proteins reached the baseline. The columns were eluted with elution buffer (0.1 M Glycine-HCl, pH 2.7) , which was immediately collected into tubes with neutralizing buffer (1 M Tris-HCl, pH 9.0) . Fractions containing immunoglobulins were pooled and dialyzed in PBS overnight at 4℃.Example 2. Binding Affinity Determination of Mouse Anti-PD-L1 Monoclonal Antibody Using BIACORE Surface Plasmon Resonance Technology

[0133] The purified anti-PD-L1 mouse monoclonal antibody D1G1A1H8 generated in Example 1 was characterized for its binding affinity and binding kinetics by Biacore T200 system (GE healthcare, Pittsburgh, PA, USA) .

[0134] Briefly, goat anti-mouse antibodies from the Mouse Antibody Capture Kit (Cytiva, Cat#BR100838) were covalently linked to a CM5 chip (a carboxy methyl dextran coated chip, Cytiva, Cat#BR100530) via primary amines using a standard amine coupling kit (Cytiva, Cat#BR100050) provided by Biacore. Un-reacted moieties on the biosensor surface were blocked with ethanolamine. The anti-PD-L1 antibody D1G1A1H8 at the concentration of 2 μg / ml was flowed onto the chip at a flow rate of 10 μl / min. Then, serially diluted recombinant human PD-L1-his proteins (SinoBiological, Cat#10084-H08H) , 2-fold dilution in HBS-EP+ buffer (provided by Biacore) starting at 80 nM, were respectively flowed onto the chip at a flow rate of 30 μl / min. The antigen-antibody association kinetics was followed for 2 minutes and the dissociation kinetics was followed for 10 minutes. The association and dissociation curves were fit to a 1: 1 Langmuir binding model using the Biacore evaluation software. The KD, Ka and Kd values were determined and summarized in Table 2 below. Table 2. Binding Affinity of D1G1A1H8 to Human PD-L1

[0135] It can be seen the anti-PD-L1 antibody D1G1A1H8 of the disclosure specifically bound to the human PD-L1 protein with the KD at the picomolar level.Example 3. Binding Activity of Mouse Anti-PD-L1 Antibody by Flow Cytometry

[0136] The binding activity of the anti-PD-L1 antibody D1G1A1H8 to the cell surface human PD-L1s was evaluated by flow cytometry (FACS) , using the CHOK1-OKT3-PDL1 cell line overexpressing human PD-L1 on the membrane. The CHOK1-OKT3-PD-L1 cell line was prepared following the instruction of lipofectamine 3000 transfection reagent (Thermo Fisher) , by transfecting CHOK1 cells (purchased from Shanghai Suer Biotech, China) with OKT3 plasmids (obtained by inserting the gene coding for the antiCD3 scFv (from OKT3, amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 17) into the pcBSD vector) and pcDNA3.1 plasmids inserted with the nucleotides encoding human PD-L1 (amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 18) . Tecentriq, an anti-PD-L1 antibody (purchased from Roche Inc., NDC Code: 50242-917-01) , was used as the positive control or benchmark.

[0137] Briefly, the CHOK1-OKT3-PDL1 cells were harvested from cell culture flasks, washed twice and resuspended in phosphate buffered saline (PBS) containing 2%v / v Fetal Bovine Serum (FACS buffer) . Then, 1 × 105 cells in 100 μl FACS buffer in 96 well-plates were incubated respectively with 100 μl serially diluted D1G1A1H8, Tecentriq, and hIgG, a negative control (human immunoglobulin (pH4) for intravenous injection, Hualan Biological Engineering Inc. ) , 5-fold serial dilution in FACS buffer starting at 66.7 nM, for 50 minutes on ice. Cells were washed twice with FACS buffer, and added with 100 μl R-Phycoerythrin AffiniPure F (ab’) 2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG (H+L) (Cat#115-116-146, Jackson Immuno Research) or R-Phycoerythrin AffiniPure Goat Anti-Human IgG, Fcγ fragment specific (Cat#109-115-098, Jackson Immuno Research) 1: 1000 diluted in FACS buffer. Following an incubation of 50 minutes at 4℃ in dark, cells were washed three times and resuspended in FACS buffer. Fluorescence was measured using a Becton Dickinson FACS Canto II-HTS equipment, and the MFI (mean fluorescence intensity) was plotted against the antibody concentration. Data was analyzed using Graphpad Prism and EC50 values were reported. The results were shown in FIG. 1.

[0138] It can be seen from FIG. 1 that the anti-PD-L1 antibody D1G1A1H8 exhibited high binding activity to the CHOK1-OKT3-PDL1 cells in the cell based binding FACS test, with a bit higher Bmax (maximal binding) and comparable EC50 as compared to the Tecentriq analog.Example 4. Engineering and Humanization of D1G1A1H8

[0139] The aspartic acid residue in an antibody, especially those followed by a glycine residue, is prone to isomerization and likely to cause antibody degradation. To avoid amino acid isomerization during production, storage, and in vivo metabolism of the antibodies of the disclosure, the antibody sequences may be optimized.

[0140] Specifically, there is a high isomerization risk site, namely Asp101Gly102 (DG) , in the heavy chain CDR3 region of D1G1A1H8. To eliminate such an isomerization risk, a G102A mutation was made, and the resulting modified antibody was designated as D1G1A1H8-CDRV1. Then D1G1A1H8-CDRV1 was further humanized using the well-established CDR-grafting method as described in detail below.

[0141] To select the acceptor frameworks for humanization of the antibody D1G1A1H8-CDRV1, the light and heavy chain variable region sequences of the antibody were blasted against the human immunoglobulin gene database. The human germlines with the highest homology were selected as the acceptor frameworks for humanization. The antibody heavy / light chain variable region CDRs were inserted into the selected frameworks, and certain residue (s) in the frameworks was / were further back-mutated to obtain more candidate heavy chain / light chain variable regions. A total of 19 variants were obtained, with two exemplary antibodies, i.e., huD1G1A1H8-CDRV1-V13 and huD1G1A1H8-CDRV1-V15’s heavy / light chain variable region sequence ID numbers set forth in Table 1.

[0142] The vectors each containing a nucleotide encoding a humanized heavy chain variable region linked to human IgG1 heavy chain constant region (SEQ ID NO: 13 or 14) , and the vectors each containing a nucleotide encoding humanized light chain variable region linked to human kappa light-chain constant region (SEQ ID NO: 15) were transiently transfected into 50 ml of 293F suspension cell cultures in a ratio of 1.1: 1 light to heavy chain construct, with 1 mg / mL PEI. The heavy chain constant region of SEQ ID NO: 13 contained a N297A mutation to remove a glycosylation site, and the one of SEQ ID NO: 14 contained a K447del mutation to enhance the C-terminal stability and therefore reduce the heterogeneity.Example 5. Characterization of Humanized Anti-PD-L1 Antibodies

[0143] Cell supernatants containing the humanized D1G1A1H8-CDRV1 antibodies were harvested after six-day cell culture in shaking flasks, from which antibodies were purified. The humanized antibodies, including huD1G1A1H8-CDRV1-V13 (N297A, EM) and huD1G1A1H8-CDRV1-V15(N297A, EM) , were tested in Biacore, capture ELISA, benchmark blocking ELISA, ligand-blocking ELISA and cell-based functional assay, following the protocols described below or in the foregoing Examples with minor modifications.Biacore

[0144] For the Biacore test, a Protein A chip (Cytiva, Cat#29127556) was used for testing the antibodies’ binding affinity to human PD-L1-his (SinoBiological, Cat#10084-H08H) and also to cynomolgus monkey PD-L1-his (SinoBiological, Cat#90251-C08H) . The KD, Ka and Kd values were determined and summarized in Table 3 below. Table 3. Binding Affinity of Humanized D1G1A1H8-CDRV1 mAbs to Human and Monkey PD-L1 Proteins

[0145] The data indicated that the humanized PD-L1 antibodies, including huD1G1A1H8-CDRV1-V13 (N297A, EM) and huD1G1A1H8-CDRV1-V15 (N297A, EM) , specifically bound to human PD-L1 and cynomolgus monkey PD-L1 with much higher binding affinity than the benchmark.Capture ELISA

[0146] Briefly, 96-well micro plates were coated with 100 μl 2 μg / ml AffiniPure Goat Anti-Human IgG F (ab’) 2 fragment specific (Cat#: 109-005-097, Jackson ImmunoResearch) in PBS overnight at 4℃. Plates were washed once with the wash buffer (PBST, PBS+0.05%Tween-20) and then blocked with 200 μl / well blocking buffer (5%w / v non-fatty milk in PBST) overnight at 4℃. Plates were washed again, respectively incubated with 100 μl / well serially diluted humanized anti-PD-L1 antibodies of the disclosure, Tecentriq, and hIgG, 5-fold dilution in PBST with 2.5%non-fatty milk starting at 66.7 nM, for 40 minutes at 37℃, and then washed 4 times. Plates containing the captured anti-PD-L1 antibodies were added and incubated with biotin-labeled human PD-L1-Fc protein (in house made with SEQ ID NO: 16, 19.6 ng / mL in 2.5%non-fatty milk in PBST) , 100 μl / well, for 40 minutes at 37℃, washed 4 times, and incubated with Peroxidase Streptavidin (1: 10000 dilution in PBST, Cat#016-030-084, Jackson ImmunoResearch, 100 μl / well) for 40 minutes at 37℃. After a final wash, the plates were incubated with 100 μl / well TMB (Cat#TMB-S-002, Innoreagents) at room temperature. The reaction was stopped 3-10 minutes later with 50 μl / well 1M H2SO4, and the absorbance was read on a microplate reader using the dual wavelength mode with 450 nm for TMB and 630 nm as the reference wavelength. The OD (450-630) values were plotted against the antibody concentrations. Data was analyzed using GraphPad Prism and EC50 values were reported. The results were shown in FIG. 2.

[0147] It can be seen from FIG. 2 that the humanized antibodies of the disclosure, including huD1G1A1H8-CDRV1-V13 (N297A, EM) and huD1G1A1H8-CDRV1-V15 (N297A, EM) , specifically bound to human PD-L1, with higher Bmax (maximal binding) and lower EC50 compared to Tecentriq.Benchmark Blocking ELISA

[0148] The ability of the anti-PD-L1 antibodies of the disclosure to block benchmark (Tecentriq) binding to human PD-L1-Fc protein was measured in a competitive ELISA assay. Briefly, 100 μl 2 μg / mL Tecentriq in PBS was coated on 96-well micro plates overnight at 4℃. ELISA plates were washed once with wash buffer (PBST, PBS+0.05%Tween-20) and then blocked with 200 μl / well blocking buffer (5%w / v non-fatty milk in PBST) overnight at 4℃. While blocking, the anti-PD-L1 antibodies of the disclosure or controls were serially diluted with biotin labeled human PD-L1-Fc protein (in house made with SEQ ID NO: 16, 49 ng / ml in 2.5%non-fatty milk in PBST) , starting at 66.7 nM with a 5-fold serial dilution, and the resultant mixtures were incubated at room temperature for 40 minutes. After plate washing, the Tecentriq coated plates were added with the antibody / human PD-L1-Fc protein mixtures, 100 μl per well. After incubation at 37℃ for 40 minutes, the plates were washed using the wash buffer, added and incubated with 100 μl / well Peroxidase Streptavidin for 40 minutes at 37℃. Plates were washed again using wash buffer. Finally, TMB was added and the reaction was stopped using 1M H2SO4. The absorbance was read on a microplate reader using the dual wavelength mode with 450 nm for TMB and 630 nm as the reference wavelength, and the OD (450-630) values were plotted against the antibody concentrations. Data was analyzed using Graphpad Prism software and IC50 values were reported. The results were shown in FIG. 3.

[0149] According to FIG. 3, the humanized PD-L1 antibodies, including huD1G1A1H8-CDRV1-V13 (N297A, EM) and huD1G1A1H8-CDRV1-V15 (N297A, EM) , were able to block PD-L1 binding to Tecentriq, suggesting that they might bind to the same or similar epitopes as Tecentriq did.Ligand-blocking ELISA

[0150] The ability of the anti-PD-L1 antibodies of the disclosure to block human PD-1-PD-L1 binding was measured in a competitive ELISA assay. Briefly, 100 μl of human PD-L1-Fc protein (in house made with SEQ ID NO: 16) at 2 μg / mL in carbonate / bicarbonate buffer (pH 9.6) was coated on 96-well micro plates for 2 hours at 37℃. ELISA plates were washed once with wash buffer (PBS+0.05%Tween-20, PBST) and then blocked with 200 μl blocking buffer (5%w / v non-fatty milk in PBST) for 2 hours at 37℃. While blocking, the anti-PD-L1 antibodies or controls were serially diluted with 2.5%non-fatty milk in PBST, starting at 66.67 nM with a 5-fold serial dilution, and added to the PD-L1-coating plates, 100 μl per well. The plates were incubated for 40 minutes at 37℃, washed for three times, and added with biotin labeled human PD-1-Fc protein (SEQ ID NO: 22, 166.67 ng / ml in 2.5%non-fatty milk in PBST) , 100 μl per well. After incubation at 37℃ for 40 minutes, the plates were washed using wash buffer. Then 100 μl Peroxidase Streptavidin was added, and the plates were incubated for 40 minutes at 37℃ to detect biotin-labeled human PD-1-Fc bound to PD-L1. Plates were washed again using wash buffer. Finally, TMB was added and the reaction was stopped using 1 M H2SO4. The absorbance of each well was read on a microplate reader using the dual wavelength mode with 450 nm for TMB and 630 nm as the reference wavelength, and the OD (450-630) values were plotted against the antibody concentration. Data was analyzed using Graphpad Prism and IC50 values were reported. The results were shown in FIG. 4.

[0151] FIG. 4 showed that the anti-PD-L1 antibodies of the disclosure, including huD1G1A1H8-CDRV1-V13 (N297A, EM) and huD1G1A1H8-CDRV1-V15 (N297A, EM) , were able to block human PD-1-PD-L1 binding, with higher blocking activity than Tecentriq.Cell-based Functional Assay (reporter assay)

[0152] The antibodies of the disclosure were tested for their ability to block PD-L1-PD-1 binding / interaction, using the CHOK1-OKT3-PD-L1 cells as described above in Example 3, and Jurkat-NFAT-PD1 cells prepared following the instruction of lipofectamine 3000 transfection reagent (Thermo Fisher) by transfecting Jurkat cells (purchased from ATCC, catalog No. TIB-152) with pGL4.30 [Luc2P / NFAT-RE / Hygro] vectors (Promega, Part No. E848A) and pcDNA3.1 plasmids inserted with the nucleotide encoding human PD1 (amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 19) .

[0153] Briefly, 10,000 CHOK1-OKT3-PD-L1 cells in 20 μL DMEM (Cat#10566-016, Gibco) with 10%FBS (Cat#10099-141, Gibco) were seeded onto 384-well plates, and incubated in a 5%CO2 incubator at 37℃ overnight. The anti-PD-L1 antibodies of the disclosure or controls (including an in house made anti-CD22 antibody as the negative control) were serially diluted in RPMI-1640 (Cat#A10491-01, Gibco) with 1%FBS, starting at 120 nM with a 3-fold serial dilution, 10 concentration gradients in total. After discarding the cell culture supernatants, the plates were added with 20 μL of the serially diluted anti-PD-L1 antibodies or controls as prepared above, and incubated in a 5%CO2 incubator at 37℃ for 1 hour. Then, the plates were added 15,000 Jurkat-NFAT-PD1 cells in 20 μL RPMI-1640 with 1%FBS, and incubated in the 5%CO2 incubator at 37℃ for 6 hours. The plates were added and incubated with 30 μL Bio-Lite Luciferase reagent (Vazyme Inc., Cat#: DD1201-02) for 5 minutes, and luminescence signals were measured using the microplate reader. The results were shown in FIG. 5.

[0154] According to FIG. 5, the co-culture of the PD-L1-expressing cells and the PD-1-expressing Jurkat cells induced Jurkat cell anergy, while the addition of the antibodies of the disclosure, including huD1G1A1H8-CDRV1-V13 (N297A, EM) and huD1G1A1H8-CDRV1-V15 (N297A, EM) , reversed Jurkat cell suppression at a bit higher activity than Tecentriq.Example 6. Cell-Based Internalization Assay of huD1G1A1H8-CDRV1-V15 (AQQ, K447Del)

[0155] The anti-PD-L1 antibodies of the disclosure were conjugated with DT3C, a recombinant protein composed of i) diphtheria toxin (DT) without receptor-binding domain and ii) the C1, C2 and C3 domains of Streptococcus protein G (3C) , and tested for their internalization efficiency in a cell-based internalization assay, wherein the DT3C protein can reduce cell viability when internalized into cells with the antibodies. SG-559-01, prepared with the heavy chain and light chain amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 20 and 21 respectively, was used as the positive control or benchmark and named as SG-559-01 (IgG1, AQQ, K447Del) .

[0156] Briefly, 1500 HCC1954 human breast cancer cells (Cat#CRL-2338, ATCC) in 150 μL RPMI-1640 (Cat#A10491-01, Gibco) supplemented with 10%FBS (Cat#10091-148, Gibco) were plated onto each well of 96 well-plates (Cat#062096, In Vitro Scientific) , and incubated in a 5%CO2 incubator at 37℃. Meanwhile, the anti-PD-L1 antibodies of the disclosure or the positive control, 133 nM in RPMI-1640 buffer, were respectively mixed with the DT3C proteins (SEQ ID NO: 12) , 293 nM in RPMI-1640 buffer, at a 1: 1 volume ratio, and incubated at room temperature for 30 minutes. Then, the antibody / DT3C mixtures were 5-fold serially diluted in culture medium, added to the cell plates with the HCC1954 cells at 50 μl / well, and incubated in a CO2 incubator at 37℃ for 6 days. The plates were added with 50 μl / well Cell Titer Glo reagent (Cat#DD1101-02, Vazyme Biotech Co., Ltd) and incubated for 5 minutes in dark. The cell culture plates were then analyzed by Tecan infinite 200Pro plate-reader. Data were analyzed using Graphpad prism and IC50 values were reported as the antibody concentrations that achieved 50%of maximal inhibition on cell viability.

[0157] The results were shown in FIG. 6. The DT3C conjugate of huD1G1A1H8-CDRV1-V15 (AQQ, K447Del) was more efficiently internalized by the target cells than the SG-559-01 (IgG1, AQQ, K447Del) , causing target cell death in a more efficient manner.

[0158] The sequences in the present application were set forth below.

[0159] VH CDR3 of D1G1A1H8, huD1G1A1H8-CDRV1-V13 and huD1G1A1H8-CDRV1-V15 SYDXYNGAMDY (SEQ ID NO: 3)

[0160] VH CDR1 of D1G1A1H8, huD1G1A1H8-CDRV1-V13 and huD1G1A1H8-CDRV1-V15 SYSIT (SEQ ID NO: 1)

[0161] VH CDR2 of D1G1A1H8, huD1G1A1H8-CDRV1-V13 and huD1G1A1H8-CDRV1-V15 EIFPGNTNTYYNENFKG (SEQ ID NO: 2)

[0162] VH CDR3 of D1G1A1H8 SYDGYNGAMDY (SEQ ID NO: 3, X=G)

[0163] VH CDR3 of huD1G1A1H8-CDRV1-V13 and huD1G1A1H8-CDRV1-V15 SYDAYNGAMDY (SEQ ID NO: 3, X=A)

[0164] VL CDR1 of D1G1A1H8, huD1G1A1H8-CDRV1-V13 and huD1G1A1H8-CDRV1-V15 RASKSVSTSAYSYLH (SEQ ID NO: 4)

[0165] VL CDR2 of D1G1A1H8, huD1G1A1H8-CDRV1-V13 and huD1G1A1H8-CDRV1-V15 LASNLES (SEQ ID NO: 5)

[0166] VL CDR3 of D1G1A1H8, huD1G1A1H8-CDRV1-V13 and huD1G1A1H8-CDRV1-V15 QHSSQLPYT (SEQ ID NO: 6)

[0167] VH of D1G1A1H8

[0168] VH of huD1G1A1H8-CDRV1-V13

[0169] VH of huD1G1A1H8-CDRV1-V15

[0170] VL of D1G1A1H8

[0171] VL of huD1G1A1H8-CDRV1-V13 and huD1G1A1H8-CDRV1-V15

[0172] Human IgG1 heavy chain constant region (N297A, EM)

[0173] Human IgG1 heavy chain constant region (AQQ, K447Del)

[0174] Human light chain constant region

[0175] Human PD-L1-Fc

[0176] OKT3ScFv

[0177] Human PD-L1

[0178] Human PD-1

[0179] Heavy chain of SG-559-01 (IgG1, AQQ, K447Del)

[0180] Light chain of SG-559-01

[0181] DT3C protein

[0182] Human PD-1-Fc ***

[0183] While the disclosure has been described above in connection with one or more embodiments, it should be understood that the disclosure is not limited to those embodiments, and the description is intended to cover all alternatives, modifications, and equivalents, as may be included within the spirit and scope of the appended claims.

Claims

1.An antibody, or an antigen-binding portion thereof, specifically binding to PD-L1, comprising (i) a heavy chain variable region comprising a VH CDR1, a VH CDR2 and a VH CDR3, and (ii) a light chain variable region comprising a VL CDR1, a VL CDR2 and a VL CDR3,wherein the VH CDR1 comprises the amino acid sequence SYSIT (SEQ ID NO: 1) ,the VH CDR2 comprises the amino acid sequence EIFPGNTNTYYNENFKG (SEQ ID NO: 2) ,the VH CDR3 comprises the amino acid sequence SYDXYNGAMDY (SEQ ID NO: 3) , wherein X is A or G,the VL CDR1 comprises the amino acid sequence RASKSVSTSAYSYLH (SEQ ID NO: 4) ,the VL CDR2 comprises the amino acid sequence LASNLES (SEQ ID NO: 5) , andthe VL CDR3 comprises the amino acid sequence QHSSQLPYT (SEQ ID NO: 6) .2.The antibody, or the antigen-binding portion thereof, of claim 1, wherein the heavy chain variable region comprises an amino acid sequence having at least 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%sequence identity to SEQ ID NOs: 8, 11 or 7.3.The antibody, or the antigen-binding portion thereof, of claim 1, wherein the light chain variable region comprises an amino acid sequence having at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%sequence identity to SEQ ID NOs: 10 or 9.4.The antibody, or the antigen-binding portion thereof, of claim 2, wherein the heavy chain variable region and the light chain variable region comprise amino acid sequences having at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%sequence identity to (1) SEQ ID NOs: 8 and 10, respectively; (2) SEQ ID NOs: 11 and 10, respectively, or (3) SEQ ID NOs: 7 and 9, respectively.5.The antibody, or the antigen-binding portion thereof, of claim 1, comprising a heavy chain constant region, linked to the heavy chain variable region, that comprises Fc receptor binding affinity and / or complement system protein binding affinity, and / or a light chain constant region, linked to the light chain variable region.6.The antibody, or the antigen-binding portion thereof, of claim 5, wherein the heavy chain constant region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NOs: 13 or 14, the light chain constant region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15.7.The antibody, or the antigen-binding portion thereof, of claim 1, which is mouse, chimeric or humanized.8.A nucleic acid molecule encoding the antibody or the antigen-binding portion thereof of any one of claims 1 to 7.9.An expression vector comprising the nucleic acid molecule of claim 8.10.A host cell comprising the expression vector of claim 9 or having the nucleic acid molecule of claim 8 incorporated into its genome.11.An immunoconjugate comprising the antibody or the antigen-binding portion thereof of any one of claims 1 to 7 linked to a therapeutic agent.12.The immunoconjugate of claim 11, wherein the therapeutic agent is a cytotoxin.13.A pharmaceutical composition comprising the antibody or the antigen-binding portion thereof of any one of claims 1 to 7, the nucleic acid molecule of claim 8, the expression vector of claim 9, the host cell of claim 10, or the immunoconjugate of claim 11 or 12, and a pharmaceutically acceptable carrier.14.A method for treating a disease associated with PD-L1 signaling in a subject in need thereof, comprising administering to the subject a therapeutically effective amount of the pharmaceutical composition of claim 13.15.The method of claim 14, wherein the disease is cancer.16.The method of claim 15, wherein the cancer is non-small cell lung cancer (NSCLC) , hepatocellular carcinoma (HCC) , metastatic urothelial cancer, triple-negative breast cancer (TNBC) , epithelial ovarian cancer, melanoma, colorectal cancer, cervical cancer, gastric cancer, bladder cancer, pancreatic cancer, endometrial cancer, renal cell carcinoma, prostate cancer, fallopian tube cancer, esophageal cancer, nasopharyngeal cancer, bile duct cancer, glioblastoma multiforme (GBM) , soft tissue sarcoma, non-Hodgkin lymphoma (NHL) , relapsed or refractory chronic lymphocytic leukemia (CLL) , chronic myelocytic leukemia (CML) , chronic myelomonocytic leukemia (CMML) , acute myelocytic leukemia (AML) , or diffuse large B-cell lymphoma.17.The method of claim 14, wherein the disease is an infectious disease.18.The method of claim 17, wherein the infectious disease is human immunodeficiency virus (HIV) infections (AIDS) , hepatitis B, sepsis, or Q fever.

Images