Anti-ly6g6d antibodies and related bispecific binding proteins

Abstract

Provided are antibodies capable of recognizing the Lymphocyte Antigen 6 Family Member G6D (LY6G6D), as well as related bispecific binding proteins such as LY6G6D×CD3 bispecific binding proteins. Further provided is the use of said antibodies and binding proteins for the treatment of cancer, particularly colorectal cancer.

Description

ANTI-LY6G6D ANTIBODIES AND RELATED BISPECIFIC BINDING PROTEINS

[0001] Cross-Reference to Related Applications

[0002] This application is based on and claims priority to PCT Patent Application No. PCT / CN2025 / 089066, filed on April 15, 2026, and PCT Patent Application No. PCT / CN2026 / 086612, filed on March 27, 2026, the entire contents of which are incorporated herein by reference.Technical Field

[0003] The present disclosure relates to antibodies capable of recognizing the Lymphocyte Antigen 6 Family Member G6D (LY6G6D) , as well as related bispecific binding proteins such as LY6G6D×CD3 bispecific binding proteins. The present disclosure further relates to the use of said antibodies and binding proteins disclosed herein for the treatment of cancer, particularly colorectal cancer.Background

[0004] Colorectal cancer (CRC) is the second leading cause of cancer death worldwide and third most diagnosed cancer (Jemal A, et al. CA Cancer J Clin (2021) 71: 209–49) . Its incidence has dramatically increased over the past years, particularly early-onset colon and rectal cancer where rates are expected to increase more than 25%and 45%, respectively (Zheng, W. et al. Cancer Discov. 2023, 13, 570–579) . CRC is a heterogeneous disease composed of different subtypes characterized by genetic and epigenetic alterations of genes that encode mismatch repair (MMR) enzymes (Pawelec G. Front Immunol (2020) 11: 369) . Due to the heterogeneous genetic alterations in CRC, there is a diverse responsiveness of the different CRC subtypes to conventional chemotherapy, targeted therapies, and immunotherapy (Wullschleger S, et al. Nat Med (2013) 19: 619–25) . Immune checkpoint inhibitors (ICIs) showed remarkable efficacy in patients with mismatch-repair-deficient (dMMR) or microsatellite instability-high (MSI-H) colorectal cancer. However, patients with microsatellite-stable (MSS) or microsatellite instability-low (MSI-L) colorectal cancer, who constitute the vast majority of mCRC patients, have not benefited from ICI treatment (Eyring AD, et al. N Engl J Med (2015) 372: 2509–20) .

[0005] The Lymphocyte Antigen 6 Family Member G6D (LY6G6D) belongs to a cluster of leukocyte antigens located in the major histocompatibility complex (MHC) class III region on chromosome 6 with 8 conserved cysteine residues, known to be a glycosylphosphatidylinositol (GPI) -anchored cell surface protein (Aguado B. Genomics (2002) 80: 113–23) . According to the RNA expression analysis form TCGA database, LY6G6D was found to be differentially expressed in MSS subtype CRC cancer and had limited expression in normal tissues and other tumor types (Remo A. J Exp Clin Canc Res (2019) 38: 28) . The tumor specific expression of LY6G6D makes it a promising target for T-cell engagers, which action by redirecting cytotoxic T-cells to kill target-expressing tumor cells.

[0006] Bispecific T cell engagers (TCEs) targeting tumor-associated antigens have demonstrated therapeutic potential, especially in cancer immunotherapy. They function by redirecting T cell cytotoxicity toward malignant cells through engaging both a T-cell constant component (like CD3) and a tumor-associated antigen (TAA) . This technology offers various benefits, including redirecting cytotoxic T-cells in a non-MHC restricted manner, and has made significant strides in clinical advancements.

[0007] While bispecific T cell engagers offer significant promise for cancer treatment, their clinical development is challenged by issues related to efficacy, toxicity profiles, and manufacturability. Tumors often demonstrate considerable heterogeneity in tumor-associated antigen (TAA) expression, both within a single tumor and across different patients with the same type of cancer. This variability can result in varying sensitivities to T cell engager therapies targeting different TAAs. Moreover, in contrast to TCEs used for treating hematological malignancies, those targeting solid tumors typically require higher peripheral exposure, which increases the risk of off-target toxicities, commonly manifesting as cytokine release syndrome (CRS) . Addressing these challenges presented by such as tumor heterogeneity and solid tumors requires the exploration of new targets, novel formats, and strategies for T cell engagers to enhance specificity, efficacy, and safety and improve manufacturability. To date, several different LY6G6D×CD3 bispecific T-cell engagers were published or disclosed (doi: 10.3389 / fimmu. 2022.1008764. ; doi: 10. 1136 / jitc-2024-SITC2024. 1343; WO2024220256A1; WO2023201299A8) . However, none of them has shown meaningful activity with acceptable safety in clinical trials.

[0008] There is therefore still a pressing need to develop a differentiated LY6G6D-targeting TCE for the future treatment of CRC.Summary

[0009] The present disclosure relates to LY6G6D binding proteins such as antibodies, bispecific or multispecific binding proteins capable of binding LY6G6D, such as proteins capable of binding LY6G6D and CD3. Such antibodies, antigen-binding portions thereof, and bispecific / multispecific binding proteins are useful for treatment of cancers, such as colorectal cancer, through redirected T cell cytotoxicity.

[0010] In one aspect, the present disclosure provides an isolated antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to LY6G6D.

[0011] In another aspect, the present disclosure also provides bispecific binding proteins that specifically bind to LY6G6D and CD3, comprising a first antigen-binding portion that specifically binds LY6G6D, and a second antigen-binding portion that specifically binds CD3.

[0012] In one embodiment, the bispecific binding protein of the present disclosure is a bispecific Fabs-in-Tandem immunoglobulin (FIT-Ig) binding protein comprising first, second, and third polypeptide chains, wherein the first polypeptide chain comprises, from amino terminus to carboxyl terminus, 1) VLA-CL-VHB-CH1-hinge-CH2-CH3, or 2) VHB-CH1-VLA-CL-hinge-CH2-CH3; the second polypeptide chain comprises, from amino to carboxyl terminus, VHA-CH1; the third polypeptide chain comprises, from amino to carboxyl terminus, VLB-CL;

[0013] wherein the VLA-CL pairs with VHA-CH1 to form a first Fab that specifically binds antigen A, and VLB-CL pairs with VHB-CH1 to form a second Fab that specifically binds antigen B, and wherein antigen A is LY6G6D, and antigen B is CD3, or antigen A is CD3, and antigen B is LY6G6D;

[0014] wherein said three polypeptide chains as a half molecule associates with another said three polypeptide chains as the other half molecule to form a FIT-Ig protein.

[0015] In some embodiments, such FIT-Ig binding proteins have the structure as shown in Figure 1A.

[0016] In another embodiment, the binding protein of the present disclosure is a bispecific monovalent asymmetric tandem Fab (MAT-Fab) binding protein comprising first, second, third and fourth polypeptide chains, wherein: the first polypeptide chain comprises, from amino terminus to carboxyl terminus, VLA-CL-VHB-CH1-Fc, wherein CL is fused directly to VHB; the second polypeptide chain comprises, from amino to carboxyl terminus, VHA-CH1; the third polypeptide chain comprises, from amino to carboxyl terminus, VLB-CL; the fourth polypeptide chain comprises Fc;

[0017] wherein VL is a light chain variable domain, CL is a light chain constant domain, VH is a heavy chain variable domain, CH1 is a heavy chain constant domain 1, Fc is an immunoglobulin Fc region;

[0018] wherein the VLA-CL pairs with VHA-CH1 to form a first Fab that specifically binds antigen A, and VLB-CL pairs with VHB-CH1 to form a second Fab that specifically binds antigen B, and wherein antigen A is LY6G6D and antigen B is CD3, or wherein antigen A is CD3 and antigen B is LY6G6D.

[0019] In some embodiments, such MAT-Fab binding proteins have the structure as shown in Figure 1B.

[0020] In some embodiments, the bispecifc binding proteins described herein are useful to activate T cells to kill tumor cells expressing LY6G6D protein, while induce lower cytokine (such as human IL-2, IL-6, IL-10, TNFα and IFNγ) release by T cells in vivo and / or in vitro. In some embodiments, the bispecifc binding proteins described herein are useful to reduce tumor burden / growth / cell expansion.

[0021] In another aspect, the present disclosure also provides methods of making the anti-LY6G6D antibodies and LY6G6D×CD3 bispecific binding proteins or a functional fragment thereof described herein.

[0022] In another aspect, the present disclosure discloses various compositions / combinations comprising the anti-LY6G6D antibodies and LY6G6D×CD3 bispecific binding proteins or a functional fragment thereof described herein.

[0023] In a further aspect, the present disclosure provides the antibody, the binding protein or the fragment described herein for use as medicament, or for use in manufacture of a medicament. In another further aspect, the present disclosure provides methods for treating a LY6G6D-associated disorder or disease in a subject in need thereof, the method comprising administering to the subject an antibody, a binding protein or a functional fragment thereof as described herein. In some embodiments, the disease or disorder is cancer. In further embodiments, the disease or disporder is a hematopoietic and solid malignancy expressing LY6G6D on the cell surface of the malignant cells, e.g., LY6G6D-positive cancer, e.g., LY6G6D-positive solid or hematopoietic cancer, e.g., colorectal cancer.Brief Description of the Drawings

[0024] Figure 1: Illustration scheme of LY6G6D×CD3 FIT-Igs (1A) and MAT-Fab (1B) .

[0025] Figure 2: The binding activities of LY6G6D×CD3 FIT-Ig chimeric bispecific antibodies to LY6G6D-expressing cells

[0026] Figure 3: Redirected CD3 activation of LY6G6D×CD3 chimeric bispecific antibodies.

[0027] Figure 4: In-vitro killing of LY6G6D×CD3 chimeric bispecific antibodies.

[0028] Figure 5: Cell surface binding activity of humanized LY6G6D×CD3 bispecific antibodies to CD3-expressing Jurkat cell and LY6G6D-expressing HT-55, LS1034 and colo320DM cell lines.

[0029] Figure 6: Redirected CD3 activation of humanized LY6G6D×CD3 FIT-Ig bispecific antibodies.

[0030] Figure 7: Redirected T cell cytotoxicity of humanized LY6G6D×CD3 bispecific antibodies.

[0031] Figure 8: Cytokine release from PBMCs treated with LY6G6D×CD3 bispecific antibodies.

[0032] Figure 9: Tumor growth inhibition on HT-55 CDX mice model treated with LY6G6D×CD3 bispecific antibodies.

[0033] Figure 10: Tumor growth inhibition on LS1034 CDX mice model treated with LY6G6D×CD3 bispecific antibodies.

[0034] Figure 11: Tumor growth inhibition on COLO320DM CDX mice model treated with LY6G6D×CD3 bispecific antibodies.

[0035] Figure 12: Tumor growth inhibition on HT-55 CDX mice model treated with different dosages of LY6G6D×CD3 bispecific antibody.

[0036] Figure 13: Tumor growth inhibition on LS1034 CDX mice model treated with different dosages of LY6G6D×CD3 bispecific antibody.

[0037] Figure 14: Tumor growth inhibition on COLO320DM CDX mice model treated with different dosages of LY6G6D×CD3 bispecific antibody.

[0038] Figure 15: Tumor growth inhibition on colorectal cancer PDX mice model treated with different dosages of LY6G6D×CD3 bispecific antibody.Detailed Description

[0039] I. Definitions

[0040] Unless otherwise explained, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which this disclosure belongs. Other specifically defined terms are to be construed in a manner consistent with the definitions provided herein.

[0041] Unless otherwise required by context, singular terms shall include pluralities and plural terms shall include the singular. Also, terms such as “element” or “component” encompass both elements and components comprising one unit and elements and components that comprise more than one subunit unless specifically stated otherwise.

[0042] The term “about” used in conjunction with a numerical value is intended to encompass the numerical values in a range from a lower limit less than the specified numerical value by 5% (e.g., 4%, 3%, 2%or 1%) to an upper limit greater than the specified numerical value by 5% (e.g., 4%, 3%, 2%or 1%) .

[0043] The use of “or” means “and / or” , unless stated otherwise. As used herein, the term “and / or” , when used in conjunction with more than one options, refers to any one of the options, or any two or more or all of the options.

[0044] As used herein, the term “comprise” , “include” or the variants thereof is intended to mean that the described elements, integers or steps are included, but not to the exclusion of any other elements, integers or steps. The term “comprise” or “include” used herein, unless otherwise specified, also encompasses the situation where the entirety consists of the described elements, integers or steps. For example, when referring to an antibody variable region “comprising” a particular sequence, it is also intended to encompass an antibody variable region consisting of the particular sequence.

[0045] The term “isolated protein” or “isolated polypeptide” is a protein or polypeptide that by virtue of its origin or source of derivation is at least partially separated from naturally associated components that accompany it in its native state, is substantially free of other proteins from the same species, is expressed by a cell from a different species, or does not occur in nature. A polypeptide that is chemically synthesized or synthesized in a cellular system different from the cell from which it naturally originates may be “isolated” from its naturally associated components. A protein may also be rendered substantially free of naturally associated components by isolation, using protein purification techniques well known in the art. As measured by Size Exclusion Chromatography SEC-HPLC, an isolated protein may be of more than 80%, 85%, 90%, 95%or 99%purity.

[0046] The term “CD3” , as used herein, refers to an antigen which is expressed on T cells as part of the multimolecular T cell receptor (TCR) and which consists of a homodimer or heterodimer formed from the association of two of four receptor chains: CD3-epsilon, CD3-delta, CD3-zeta, and CD3-gamma. An amino acid sequence of a human CD3-epsilon is set forth under UniProtKB accession number P07766; an amino acid sequence of a human CD3-delta under UniProtKB accession number P04234; an amino acid sequence of a human CD3-zeta under UniProtKB accession number P20963; and an amino acid sequence of a CD3-gamma under UniProtKB accession number P09693.

[0047] “LY6G6D” (also known as LY6-D, LY6-G, G6D, NG25, MEGT1, C6orf23) is a member of the lymphocyte antigen-6 superfamily (Ly-6SF) and is positioned within the MHC class III region on chromosome 6. It encodes a polypeptide of approximately 13.7 kDa, containing a conserved Ly6 / uPAR (LU) domain characterized by a three-fingered protein structure, which is crucial for its biological functions. LY6G6D has emerged as a significant player in colorectal cancer (CRC) development. High levels of LY6G6D are associated with increased risk of metastatic recurrence and immunosuppressive cell infiltration. Additionally, LY6G6D-positive CRC cells suppress T cell proliferation by expanding myeloid-derived suppressor cells (MDSCs) . The amino acid sequence of human anti-LY6G6D can be found in UniProt accession number O95868. Various methods, including flow cytometry and immunohistochemistry, can be used to examine LY6G6D positive solid tumor and determine the LY6G6D positive tumor cell frequency in solid tumor tissues.

[0048] The term “specific binding” or “specifically binding” in reference to the interaction of an antibody, a binding protein, or a peptide with a second chemical species, means that the interaction is dependent upon the presence of a particular structure (e.g., an antigenic determinant or epitope) on the second chemical species. For example, an antibody recognizes and binds to a specific protein structure rather than to proteins generally. In general, if an antibody is specific for epitope “A” , the presence of a molecule containing epitope A (or free, unlabeled A) , in a reaction containing labeled “A” and the antibody, will reduce the amount of labeled A bound to the antibody.

[0049] As used herein, the term “antibody” refers to a binding protein comprising at least a light chain or heavy chain immunoglobulin variable region that specifically recognizes and binds to a particular antigen (e.g., CD3 or LY6G6D) . The term encompasses various antibody structures, including, but not limited to, monoclonal antibodies, single-chain antibodies or multi-chain antibodies, single valent or multivalent antibodies, monospecific or multispecific antibodies, chimeric or humanized antibodies, complete antibodies, and antibody fragments, as long as they exhibit the desired antigen-binding activity. Therefore, the term “antibody” includes immunoglobulin molecules comprising four polypeptide chains, two heavy (H) chains and two light (L) chains inter-connected by disulfide bonds, as well as multimers thereof (e.g., IgM) . The term “antibody” also includes any functional fragment, mutant, variant, or derivation of such immunoglobulin molecules, which retains the essential epitope binding features. Such functional fragment, mutant, variant, or derivative antibody formats are known in the art, and non-limiting embodiments (e.g., FIT-Ig and MAT-Fab binding proteins) are discussed below.

[0050] As used herein, the term “immunoglobulin (Ig) ” refers to heterodimeric proteins composed of two heavy (H) and two light (L) chains. Each heavy chain is comprised of a heavy chain variable region (abbreviated herein as VH) and a heavy chain constant region. The heavy chain constant region is comprised of three or four domains: CH1, CH2, CH3, and optionally CH4. Each light chain is comprised of a light chain variable region (abbreviated herein as VL) and a light chain constant region.

[0051] The light chain constant region is comprised of one domain, CL. The VH and VL regions can be further subdivided into regions of hypervariability, termed complementarity determining regions (CDRs) , interspersed with regions that are more conserved, termed framework regions (FRs) . Vκ is the variable region part of the κ-type light chain, and Vλ is the variable region part of the λ-type light chain. The light chain constant region is comprised of one domain, CL. The VH and VL regions can be further subdivided into regions of hypervariability, termed complementarity determining regions (CDRs) , interspersed with regions that are more conserved, termed framework regions (FRs) . Each VH and VL is comprised of three CDRs and four FRs, arranged from amino-terminus to carboxy-terminus in the following order: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. First, second and third CDRs of a VH domain are commonly enumerated as CDR-H1, CDR-H2, and CDR-H3; likewise, first, second and third CDRs of a VL domain are commonly enumerated as CDR-L1, CDR-L2, and CDR-L3. Depending on the sequences of heavy chain constant regions, immunoglobulins can be of any type (e.g., IgG, IgE, IgM, IgD, IgA and IgY) , subtype (e.g., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 and IgA2) or subclass.

[0052] The term “Fc region” is used to define the C-terminal region of an immunoglobulin heavy chain, which may be generated by papain digestion of an intact antibody. The Fc region may be a native sequence Fc region or a variant Fc region. The Fc region of an immunoglobulin generally comprises two constant domains, i.e., a CH2 domain and a CH3 domain, and optionally comprises a CH4 domain, for example, as in the case of the Fc regions of IgM and IgE antibodies. The Fc region of IgG, IgA, and IgD antibodies comprises a hinge region, a CH2 domain, and a CH3 domain. In contrast, the Fc region of IgM and IgE antibodies lacks a hinge region but comprises a CH2 domain, a CH3 domain and a CH4 domain. In one embodiment, a human IgG immunoglobulin Fc region is from Asp221 or from Cys226 or from Asp231 to the C-terminus of heavy chain. However, the lysine (Lys447) or glycine-lysine (Gly446Lys447) at the C-terminal end of the Fc region may be present or absent. All references to Fc region herein are intended to refere to a Fc region from Asp221 to the C-terminus to heavy chain unless explicitly specified.

[0053] Variant Fc regions having substitutions of amino acid residues in the Fc portion to alter antibody effector function are known in the art (see, e.g., Winter et al., US Patent NOs. 5,648,260 and 5,624,821) . The Fc portion of an antibody may mediate one or more effector functions, for example, cytokine induction, ADCC, phagocytosis, complement dependent cytotoxicity (CDC) , and / or half-life / clearance rate of antibody and antigen-antibody complexes. In some cases, these effector functions are desirable for therapeutic antibody but in other cases might be unnecessary or even deleterious, depending on the therapeutic objectives. Certain human IgG isotypes, particularly IgG1 and IgG3, mediate ADCC and CDC via binding to FcγRs and complement C1q, respectively. In still another embodiment at least one amino acid residue is replaced in the constant region of the antibody, for example the Fc region of the antibody, such that effector functions of the antibody are altered. The dimerization of two immunoglobulin Fc regions or two antibody chains may be mediated by the dimerization of CH3 domains, and further stabilized by the disulfide bonds within the hinge region that connects CH1 constant domains to the Fc constant domains (e.g., CH2 and CH3) , and / or artificially introduced into the Fc domains. The anti-inflammatory activity of IgG is dependent on sialylation of the N-linked glycan of the IgG Fc fragment. The precise glycan requirements for anti-inflammatory activity have been determined, such that an appropriate IgG1 Fc fragment can be created, thereby generating a fully recombinant, sialylated IgG1 Fc with greatly enhanced potency (see, Anthony et al., Science, 320: 373-376 (2008) ) .

[0054] The terms “antigen-binding portion (ABP) ” , “antigen-binding domain (ABD) ” and “antigen-binding fragment” or “functional fragment” of an antibody are used interchangeably and refer to one or more fragments or portions of an antibody that retain the ability to specifically bind to an antigen, i.e., the same antigen as the full-length antibody from which the portion or fragment is derived. It has been shown that the antigen-binding function of an antibody can be performed by fragments of a full-length antibody. Such antibody embodiments may also be bispecific, dual specific, or multi-specific formats; specifically binding to two or more different antigens. Examples of binding fragments encompassed within the term “antigen-binding portion” of an antibody include (i) a Fab fragment, a monovalent fragment consisting of the VL, VH, CL, and CH1 domains; (ii) a F (ab’ ) 2 fragment, a bivalent fragment comprising two Fab fragments linked by a disulfide bridge at the hinge region; (iii) an Fd fragment consisting of the VH and CH1 domains; (iv) a Fv fragment consisting of the VL and VH domains of a single arm of an antibody, (v) a dAb fragment (Ward et al., Nature, 341: 544-546 (1989) ; PCT Publication No. WO 90 / 05144) , which comprises a single variable domain; and (vi) an isolated complementarity determining region (CDR) . Furthermore, although the two domains of the Fv fragment, VL and VH, are coded for by separate genes, they can be joined, using recombinant methods, by a synthetic linker that enables them to be made as a single protein chain in which the VL and VH regions pair to form monovalent molecules (known as single chain Fv (scFv) ; see, for example, Bird et al., Science, 242: 423-426 (1988) ; and Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 5879-5883 (1988) ) . Such single chain antibodies are also intended to be encompassed within the term “antigen-binding portion” of an antibody and equivalent terms given above. Other forms of single chain antibodies, such as diabodies are also encompassed. Diabodies are bivalent, bispecific antibodies in which VH and VL domains are expressed on a single polypeptide chain, but using a linker that is too short to allow for pairing between the two domains on the same chain, thereby forcing the domains to pair with complementary domains of another chain and creating two antigen binding sites (see, for example, Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993) . Such antibody binding portions are known in the art (Kontermann and Dübel eds., Antibody Engineering (Springer-Verlag, New York, 2001) , p. 790 (ISBN 3-540-41354-5) ) . In addition, single chain antibodies also include “linear antibodies” comprising a pair of tandem Fv segments (VH-CH1-VH-CH1) which, together with complementary light chain polypeptides, form a pair of antigen binding portions (Zapata et al., Protein Eng., 8 (10) : 1057-1062 (1995) ; and US Patent No. 5,641,870) ) .

[0055] An immunoglobulin constant domain refers to a heavy (CH) or light (CL) chain constant domain. Murine and human IgG heavy chain and light chain constant domain amino acid sequences are known in the art.

[0056] The term “human sequence” or “from human” , in relation to the light chain constant domain CL, heavy chain constant domain CH, and Fc region of the antibody or the binding protein according to the present disclosure, means the sequence is of, or from, human immunoglobulin sequence. The human sequence of the present disclosure may be native human sequence, or a variant thereof including one or more (for example, up to 20, 15, 10) amino acid residue changes.

[0057] The term “linker” as used herein refers to an artificial molecule, including a peptide linker (e.g., having less than 50 amino acid residues) and a chemical non-peptide connector. Typically, linkers are used to conjugate or fuse one moiety to another, enabling each moiety to execute its individual function. In some embodiments of a FIT-Ig binding protein and a MAT-Fab binding protein of the present disclosure, preferably, there is no linker inserted between the immunological domains of their tandem Fab elements. However, as appreciated by persons skilled in the art, an antibody or a binding protein of the present disclosure, including a FIT-Ig binding protein and a MAT-Fab binding protein, may be conjugated or fused via a linker to an additional proteinaceous and non-proteinaceous moiety.

[0058] The term “monoclonal antibody” or “mAb” refers to an antibody obtained from a population of substantially homogeneous antibodies, i.e., the individual antibodies comprising the population are identical except for possible naturally occurring mutations that may be present in minor amounts. The modifier “monoclonal” is not to be construed as requiring production of the antibody by any particular method.

[0059] An “antibody that competes with a reference antibody for binding to its antigen” refers to an antibody that blocks 50%, 60%, 70%, 80%, 90%or 95%or more of the binding of the reference antibody to its antigen in a competition assay. Conversely, the reference antibody blocks 50%, 60%, 70%, 80%, 90%or 95%or more of the binding of the antibody to its antigen in a competition assay. Numerous types of competitive binding assays can be used to determine whether an antibody competes with another antibody, such as direct or indirect solid-phase radioimmunoassay (RIA) , direct or indirect solid-phase enzyme immunoassay (EIA) and sandwich competition assay.

[0060] An antibody that shows the same or similar binding affinity and / or specificity as a reference antibody refers to an antibody having at least 50%, 60%, 70%, 80%, 90%or 95%or more of the binding affinity and / or specificity of the reference antibody. This can be determined by any method known in the art for determining binding affinity and / or specificity.

[0061] The term “KD” , as used herein, is intended to refer to the “equilibrium dissociation constant” , and refers to the value obtained in a titration measurement at equilibrium, or by dividing the dissociation rate constant (koff) by the association rate constant (kon) . The association rate constant (kon) , the dissociation rate constant (koff) , and the equilibrium dissociation constant (KD) are used to represent the binding affinity of an antibody to an antigen. Methods for determining association and dissociation rate constants are well known in the art. Using fluorescence-based techniques offers high sensitivity and the ability to examine samples in physiological buffers at equilibrium. Other experimental approaches and instruments such as a   (biomolecular interaction analysis) assay can be used (e.g., instrument available from BIAcore International AB, a GE Healthcare company, Uppsala, Sweden) . Biolayer interferometry (BLI) using, e.g., the  RED96 system (Pall FortéBio LLC) , is another affinity assay technique. Additionally, a  (Kinetic Exclusion Assay) assay, available from Sapidyne Instruments (Boise, Idaho) can also be used. In some embodiments, KD values of antibodies or binding proteins of the present disclosure are measured by a grating-coupled interferometry (GCI) based assay.

[0062] As used herein, the term “variable region” or “variable domain” refers to the domain of the heavy or light chain of an antibody that is involved in binding the antibody to an antigen. Typically, a heavy chain variable domain (VH) is paired with a light chain variable domain (VL) to confer antigen binding specificity; however, in some cases, a single VH domain (e.g., a single VHH domain from a heavy chain antibody) is also sufficient to confer antigen binding specificity. A heavy chain variable region and a light chain variable region both comprise four conserved framework regions (FRs) and three complementary determining regions (CDRs) , which are arranged in the order of FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CD3-FR4. In some aspects, the variable domain (s) of an antibody may be modified. For example, substitution, deletion and / or addition of one or more amino acid residues, especially conservative residue substitution, may be introduced into one or more CDR regions and / or one or more framework regions to obtain an antibody variant. Alternatively, the variable domain (s) of an antibody may be modified by CDR grafting. As known in the art, CDRs are primarily responsible for antibody-antigen interactions. Antibody variants can be constructed by grafting CDR sequences from a known antibody onto the framework regions of a different antibody having a desired property. In addition, one to several mutations can be further performed, such as back mutations, to refine the desired properties of the antibody variant. The properties of antibody variants can be assessed in vitro or in vivo assays. Preferably, antibody variants substantially retain at least one desired biological property (e.g., antigen binding ability) of their parent antibodies.

[0063] The term “CDR” refers to the complementarity determining regions within antibody variable domain sequences. There are three CDRs in each of the variable regions of the heavy chain and the light chain, which are designated CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2, and CDR-L3.

[0064] The growth and analysis of extensive public databases of amino acid sequences of variable heavy and light regions over the past twenty years have led to the understanding of the typical boundaries between framework regions (FRs) and CDR sequences within variable region sequences and have enabled persons skilled in the art to accurately determine the CDRs. The CDR definition schemes available in the art include e.g., Chothia scheme based on the three-dimensional structure of antibodies and the topology of the CDR loops (Chothia et al. (1989) Nature, 342: 877-883; Al-Lazikani et al., Standard conformations for the canonical structures of immunoglobulins, Journal of Molecular Biology, 273: 927-948 (1997) ) , Kabat scheme based on antibody sequence variability (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th Ed., U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987) ) , AbM scheme (University of Bath) , Contact scheme (University College London) , International ImMunoGeneTics database (IMGT) scheme (imgt. cines. fr / on the World Wide Web) , and North scheme based on the affinity propagation clustering using a large number of crystal structures. The boundaries of each CDRs according to several CDR definition schemes are presented below:

[0065] Unless otherwise indicated, when referring to CDRs contained in a variable domain, the CDRs can be determined using any one or a combination of the antibody CDR definition schemes mentioned above.

[0066] It should be noted that boundaries of CDRs in variable domains of an antibody determined by different definition schemes may differ. Therefore, the CDR sequences of variable regions of the same antibody defined by different schemes may differ. Accordingly, when it comes to defining an antibody with specific CDR sequences according to a specific definition scheme (e.g., Kabat Scheme) in the present disclosure, the scope of antibody encompasses any antibodies whose variable region sequences comprise the specific CDR sequences, but may have different CDR boundaries assigned by application of a different scheme.

[0067] As known in the art, CDRs vary from antibody to antibody. However, a limited number of the amino acid positions in a set of CDRs are directly involved in antigen binding. Using at least two of Kabat, Chothia, AbM and IMG schemes, the minimum overlapping regions for each CDRs can be determined, thereby providing a "minimum binding unit" for antigen binding. Such a minimum binding unit can be a subset of CDR residues of an antibody, while the remaining CDR residues, as those skilled in the art will appreciate, can be determined by analyzing the structure and folding of the antibody. Therefore, in some instances, CDR amino acid sequences as described herein may comprise a modification (s) . The modification may be amino acid substitution, deletion, and / or addition. Antibodies and antigen-binding fragments obtained in such manner can be easily tested for one or more desired property such as, improved binding specificity, increased binding affinity, improved or enhanced biological properties (as the case may be) , reduced immunogenicity, etc.

[0068] As used herein, unless otherwise indicated, the amino acid positions of CDRs and variable domains of an antibody are numbered according to the Kabat numbering system (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991) ) and is referred to as “numbering according to Kabat” or “Kabat numbering” herein.

[0069] As used herein, the amino acid positions of all constant regions and domains of the heavy and light chain of an antibody are numbered according to the Kabat numbering system described in Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991) and is referred to as “numbering according to Kabat” or “Kabat numbering” herein. Specifically, the Kabat numbering system (see pages 647-660) of Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991) is used for the light chain constant domain CL of kappa and lambda isotype, and the Kabat EU index numbering system (see pages 661-723) is used for the constant heavy chain domains (CH1, Hinge, CH2 and CH3, which is herein further clarified by referring to “numbering according to Kabat EU index” or “EU numbering” in this case) .

[0070] General information regarding the sequences of human immunoglobulins light and heavy chains is given in: Kabat, E. A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991) .

[0071] The term “multivalent binding protein” denotes a binding protein comprising two or more antigen binding domains. A multivalent binding protein is, in certain cases, engineered to have three or more antigen binding domains, and is generally not a naturally occurring antibody. The term “multispecific (e.g., bispecific) binding protein” (which can be used interchangeably with the term “multispecific (e.g., bispecific) antibody” , unless stated otherwise) refers to a binding protein capable of binding at least two different target antigens or different epitopes. Hence, a multispecific antigen-binding fragment of an antibody will typically comprise at least two different variable domains, wherein each variable domain is capable of specifically binding to a separate antigen or to a different epitope. FIT-Ig binding proteins of the present disclosure comprise four antigen binding sites and are typically tetravalent binding proteins. MAT-Fab binding proteins of the present disclosure comprise two antigen binding sites and are typically bivalent binding proteins. A FIT-Ig or MAT-Fab according to this disclosure binds both LY6G6D and CD3 and is bispecific.

[0072] As used herein, the term “FIT-Ig binding protein” is used interchangeably with “FIT-Ig antibody” , “FIT-Ig protein” and “FIT-Ig” , and refers to a multivalent antibody comprising two long (heavy) V-C-V-C-Fc chain polypeptides and four short (light) V-C chain polypeptides, which form a hexamer exhibiting four Fab antigen binding sites (VH-CH1 paired with VL-CL, sometimes notated VH-CH1:: VL-CL) . Each half of a FIT-Ig comprises a long chain polypeptide and two short chain polypeptides, and complementary immunoglobulin pairing of the VH-CH1 and VL-CL elements of the three chains results in two Fab-structured antigen binding sites, arranged in tandem. In the present disclosure, it is preferred that the immunoglobulin domains comprising the Fab elements are directly fused in the long chain polypeptide, without the use of interdomain linkers. That is, the N-terminal V-C element of the long (heavy) polypeptide chains is directly fused at its C-terminus to the N-terminus of another V-C element, which in turn is linked to a C-terminal Fc region. In bispecific FIT-Ig binding proteins, the tandem Fab elements may be reactive with different antigens. Each Fab antigen binding site comprises a heavy chain variable domain and a light chain variable domain with a total of six CDRs per antigen binding site.

[0073] A description of the design, expression, and characterization of FIT-Ig molecules is provided in PCT Publication WO 2015 / 103072. An example of such FIT-Ig molecules comprises a long chain and two different short chains. The long chain comprises the structural formula VLA-CL-VHB-CH1-Fc (namely “Format LH” ) , where CL is directly fused to VHB , or VHB-CH1-VLA-CL-Fc (namely “Format HL” ) , where CH1 is fused directly to VLA , and the two short polypeptide chains of the FIT-Ig correspondingly have the formulas VHA-CH1 and VLB-CL, respectively; wherein VLA is a variable light domain from a parental antibody that binds antigen A, VLB is a variable light domain from a parental antibody that binds antigen B, VHA is a variable heavy domain from a parental antibody that binds antigen A, VHB is a variable heavy domain from a parental antibody that binds antigen B, CL is a light chain constant domain, CH1 is a heavy chain constant domain 1, and Fc is an immunoglobulin Fc region (e.g., the C-terminal hinge-CH2-CH3 portion of a heavy chain of an IgG1 antibody) . In bispecific FIT-Ig embodiments, antigen A and antigen B are different antigens, or different epitopes of the same antigen. In the present disclosure, one of antigen A and antigen B is LY6G6D and the other is CD3, for example, antigen A is LY6G6D, and antigen B is CD3. Figures 1 provides schematic illustration of the domain structure of a FIT-Ig bispecific antibody.

[0074] As used herein, the term “MAT-Fab binding protein” is used interchangeably with “MAT-Fab antibody” , “MAT-Fab protein” and “MAT-Fab” , and refers to a multivalent binding protein comprising one long chain polypeptide V-C-V-C-Fc, two short chain polypeptides V-C, and one immunological Fc chain polypeptide, which form a tetramer exhibiting two Fab antigen binding sites arranged in tandem (VH-CH1 paired with VL-CL, sometimes notated VH-CH1:: VL-CL) , and one Fc: Fc dimer. Often modifications have been introduced into the CH3 domain of Fc region of the MAT-Fab long chain (abbreviated as CH3m1 domain) and also the CH3 domain of the MAT-Fab Fc polypeptide chain (abbreviated as CH3m2 domain) to favor the heterodimerization of the two CH3 domains. The modifications can be “knob-in-hole” (KIH) mutations, for instance, a mutation is made to form a structural knob in the CH3m1 domain of the long chain for pairing with a CH3m2 domain of the Fc chain that comprises a complementary structural hole or vice versa. However, other modifications such as those introduced into the domains salt bridges or electrostatic interactions are also useful. The constant regions may also include other modifications, for example, Cys residues to stable the MAT-Fab molecule, and / or mutations to prevent or impair the Fc effector functions. Preferably, a feature of the structure of a MAT-Fab bispecific antibody described herein is that all adjacent immunoglobulin heavy and light chain variable and constant domains are linked directly to one another without an intervening synthetic amino acid or peptide linker.

[0075] A description of the design, expression, and characterization of MAT-Fab molecules is provided in PCT Publication WO2018 / 035084. One example of such MAT-Fab molecules comprises a long chain with a “knob” in Fc region, two different short chains, and one Fc polypeptide chain with a “hole” . In some embodiments, the long chain comprises the structural formula VLA-CL-VHB-CH1-Fc1, where CL is directly fused to VHB, ; the two short polypeptide chains of the MAT-Fab correspondingly have the formulas VHA-CH1 and VLB-CL, respectively; and a Fc chain (Fc2, hinge-CH2-CH3m2) ; wherein Fc1 comprises hinge-CH2-CH3m1, VLA is a variable light domain from a parental antibody that binds antigen A, VLB is a variable light domain from a parental antibody that binds antigen B, VHA is a variable heavy domain from a parental antibody that binds antigen A, VHB is a variable heavy domain from a parental antibody that binds antigen B, CL is a light chain constant domain, CH1 is a heavy chain constant domain 1, and CH3m1 is a heavy chain constant domain 3 with knob mutation (s) such as T366Y or T366W. The Fc chain (Fc2) may be hinge-CH2-CH3m2 of a heavy chain of an immunoglobulin (such as IgG1 antibody) , with hole mutations in CH3m2 complementary to knob mutation (s) such as Y407T, or a combination of T366S, L368A and Y407V. In an alternative embodiment, the CH3m1 domain comprises “hole” mutation (s) , such as Y407T, or a combination of T366S, L368A and Y407V; and the CH3m2 domain comprises a complementary structural “knob” mutation such as T366Y or T366W. In a further embodiment, the Fc1 and Fc2 of MAT-Fab comprise one or more cysteine mutations in the flavoring of disulfide bond formation such as S354C or Y349C. In certain embodiments, in bispecific MAT-Fab embodiments, antigen A and antigen B are different antigens, or different epitopes of the same antigen. In the present disclosure, one of antigen A and antigen B is LY6G6D and the other is CD3, for example, antigen A is LY6G6D, and antigen B is CD3. Figures 2 provides schematic illustration of the domain structure of a MAT-Fab bispecific antibody.

[0076] “Percent (%) amino acid sequence identity” with respect to a reference polypeptide sequence is defined as the percentage of amino acid residues in a candidate sequence that are identical with the amino acid residues in the reference polypeptide sequence, after aligning the sequences and introducing gaps, if necessary, to achieve the maximum percent sequence identity, and not considering any conservative substitutions as part of the sequence identity. Alignment for purposes of determining percent amino acid sequence identity can be achieved in various ways in the art, for instance, using publicly available computer software such as BLAST, BLAST-2, ALIGN or MEGALIGN (DNASTAR) . Those skilled in the art can determine appropriate parameters for aligning sequences, including any algorithm needed to achieve maximal alignment over the full length of the sequences being compared.

[0077] When percentages of sequence identity are referred to in this application, these percentages are calculated relative to the full length of the longer sequence, unless otherwise specifically indicated. The calculation relative to the full length of the longer sequence applies to both the nucleic acid sequence and the polypeptide sequence.

[0078] The term “pharmaceutical composition” refers to such a composition that exists in a form allowing effective biological activity of the active ingredient contained therein, and does not contain additional ingredients having unacceptable toxicity to a subject to which the composition is administered.

[0079] The term “combination” or “pharmaceutical combination” or “combination product” refers to a non-fixed combination or a fixed combination, including but not limited to a kit and a pharmaceutical composition. The term “non-fixed combination” means that the active ingredients (e.g., (i) an anti-LY6G6D antibody or a fragment thereof, and (ii) an additional prophylactic or therapeutic agent) are administered, either simultaneously or sequentially (without specific time limitation or at identical or different time intervals) , to a patient as separate entities, wherein such administration provides two or more prophylactically or therapeutically effective agents in the patient. In some embodiments, the anti-LY6G6D antibody or the fragment thereof and the additional prophylactic or therapeutic agent used in the pharmaceutical combination are administered at levels that do not exceed their levels when used alone. The term “fixed combination” means that two or more agents are administered to a patient simultaneously in the form of a single entity. The dose and / or time intervals of two or more agents are preferably selected such that the combined use of the components can result in a prophylactic or therapeutic effect on the disease or disorder which is greater than that achieved by the use of either component alone. The ingredients may each take a separate formulation form and such separate formulation forms may be the same or different.

[0080] The term “combination therapy” refers to the administration of two or more therapeutic agents or modalities (e.g., radiotherapy or surgery) to prevent or treat the diseases as described herein. Such administration includes co-administration of these prophylactic or therapeutic agents in a substantially simultaneous manner, for example, in a single capsule with a fixed proportion of active ingredients. Alternatively, such administration includes co-administration of the active ingredients in a variety of or separate containers (such as tablets, capsules, powder and liquid) . The powder and / or liquid can be reconstituted or diluted to a desired dose before administration. In addition, such administration also includes using each type of the prophylactic or therapeutic agents at approximately the same time or in a sequential manner at different times. In any case, the prophylactic or therapeutic regimen will provide the beneficial effect of the pharmaceutical combination in the prevention or treatment of disorders or symptoms described herein.

[0081] The term “apharmaceutically acceptable carrier” refers to diluents, adjuvants (e.g., Freund’s adjuvants (complete and incomplete) ) , excipients, vehicles, stabilizers, or the like, which are administered with the active substance.

[0082] The term “cancer” refers to or describes a physiological disease in mammals that is typically characterized by unregulated cell growth. In certain embodiments, cancers suitable for treatment with the antibody or the binding protein of the present disclosure include metastatic forms of such cancers. The cancer can be solid cancer or hematopoietic cancer.

[0083] The term “tumor” refers to all neoplastic cell growth and proliferation, whether being malignant or benign, and all pre-cancerous and cancerous cells and tissues. Tumor includes both solid and hematopoietic tumors.

[0084] The terms “cancer” and “tumor” are not mutually exclusive when referred to herein.

[0085] The terms “individual” or “subject” as used herein is meant to refer to mammals, including, but not limited to, domestic animals (e.g., cattle, goats, cats, dogs, and horses) , primates (e.g., human and non-human primates such as monkeys) , rabbits, and rodents (e.g., mice and rats) . In some embodiments, the individual or subject is a human.

[0086] As used herein, the term “therapeutically effective amount” refers to the amount of a therapy that is sufficient to reduce or ameliorate the severity and / or duration of a disorder or one or more symptoms thereof; prevent the advancement of a disorder; cause regression of a disorder; prevent the recurrence, development, or progression of one or more symptoms associated with a disorder; or enhance or improve the prophylactic or therapeutic effect (s) of another therapy (e.g., prophylactic or therapeutic agent) .

[0087] As used herein, the term “treatment” , “treat” or “treating” refers to slowing, interrupting, arresting, alleviating, stopping, lowering, or reversing the progression or severity of an existing symptom, disorder, condition, or disease.

[0088] As used herein, the term “prevention” , “prevent” or “preventing” includes the inhibition of the development or progression of symptoms of a disease or disorder, or a specific disease or disorder. In some embodiments, subjects with family history of cancer are candidates for preventive regimens. Generally, in the context of cancer, the term “prevention” refers to the administration of a drug prior to the onset of signs or symptoms of a cancer, particularly in subjects at risk of cancer.

[0089] As used herein, the term “administering” , “administration” or “administered” refers to the physical introduction of a composition comprising a therapeutic agent to a subject, using any of the various methods and delivery systems known to those skilled in the art. Routes of administration include intravenous, intramuscular, subcutaneous, intraperitoneal, spinal or other parenteral routes of administration, for example by injection or infusion. The phrase “parenteral administration” as used herein means modes of administration other than enteral and topical administration, usually by injection, and includes, without limitation, intravenous, intramuscular, intraarterial, intrathecal, intralymphatic, intralesional, intracapsular, intraorbital, intracardiac, intradermal, intraperitoneal, transtracheal, subcutaneous, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subarachnoid, intraspinal, epidural and intrasternal injection and infusion, as well as in vivo electroporation. Other non-parenteral routes include a topical, epidermal or mucosal route of administration, for example, intranasally, vaginally, rectally, sublingually or topically.

[0090] II. LY6G6D binding proteins

[0091] In one aspect, the present disclosure relates to an isolated antibody that specifically binds to LY6G6D such as human anti-LY6G6D, or the antigen-binding fragment thereof.

[0092] In another aspect, the present disclosure further described a bispecific or multispecific antibody capable of binding LY6G6D and CD3. In some embodiments, the binding protein of the present disclosure can specially bind to the LY6G6D on the cell surface.

[0093] II-1. Anti-LY6G6D antibody or antigen-binding fragment thereof

[0094] In one aspect, the present disclosure relates to an isolated antibody that specifically binds to LY6G6D (e.g., human anti-LY6G6D) , e.g., an anti-LY6G6D antibody or the antigen-binding fragment thereof.

[0095] In some embodiments, the anti-LY6G6D antibody or the antigen-binding fragment thereof of the present disclosure comprises 3 complementarity determining regions from a heavy chain variable region (CDR-Hs) : CDR-H1, CDR-H2 and CDR-H3. In some embodiments, the anti-LY6G6D antibody or the antigen-binding fragment thereof of the present disclosure comprises 3 complementarity determining regions from a light chain variable region (CDR-Ls) : CDR-L1, CDR-L2 and CDR-L3.

[0096] In some embodiments, the anti-LY6G6D antibody or the antigen-binding fragment thereof of the present disclosure comprises 3 complementarity determining regions from a heavy chain variable region (CDR-Hs) and 3 complementarity determining regions from a light chain variable region (CDR-Ls) .

[0097] In some embodiments, the anti-LY6G6D antibody or the antigen-binding fragment thereof of the present disclosure comprises a heavy chain variable region (VH) . In some embodiments, the anti-LY6G6D antibody or the antigen-binding fragment thereof of the present disclosure comprises a light chain variable region (VL) . In some embodiments, the anti-LY6G6D antibody or the antigen-binding fragment thereof of the present disclosure comprises a heavy chain variable region (VH) and a light chain variable region (VL) . In some embodiments, the heavy chain variable region comprises 3 complementarity determining regions (CDRs) from the heavy chain variable region: CDR-H1, CDR-H2 and CDR-H3. In some embodiments, the light chain variable region comprises 3 complementarity determining regions (CDRs) from the light chain variable region: CDR-L1, CDR-L2 and CDR-L3.

[0098] In some embodiments, the anti-LY6G6D antibody or the antigen-binding fragment thereof of the present disclosure further comprises an antibody heavy chain constant region CH.In some embodiments, the anti-LY6G6D antibody or the antigen-binding fragment thereof of the present disclosure further comprises an antibody light chain constant region CL.In some embodiments, the anti-LY6G6D antibody or the antigen-binding fragment thereof of the present disclosure further comprises a heavy chain constant region CH and a light chain constant region CL.

[0099] In some embodiments, said heavy chain variable region of the anti-LY6G6D antibody or the antigen-binding fragment thereof of the present disclosure comprises or consists of:

[0100] (i) an amino acid sequence having at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%or 99%identity to an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 2, and 21-26;

[0101] (ii) an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 2, and 21-26; or

[0102] (iii) an amino acid sequence having one or more (preferably no more than 10, and more preferably no more than 5, 4, 3, 2 or 1) amino acid changes (preferably amino acid substitutions, and more preferably amino acid conservative substitutions) compared to an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 2, and 21-26, wherein preferably, the amino acid changes do not occur in CDRs.

[0103] In some embodiments, said light chain variable region of the anti-LY6G6D antibody or the antigen-binding fragment thereof of the present disclosure comprises or consists of:

[0104] (i) an amino acid sequence having at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%or 99%identity to an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 3, and 27-33;

[0105] (ii) an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 3, and 27-33; or

[0106] (iii) an amino acid sequence having one or more (preferably no more than 10, and more preferably no more than 5, 4, 3, 2 or 1) amino acid changes (preferably amino acid substitutions, and more preferably amino acid conservative substitutions) as compared to an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 3, and 27-33, wherein preferably, the amino acid changes do not occur in CDRs.

[0107] In some embodiments, the 3 complementarity determining regions CDR-H1, CDR-H2 and CDR-H3, are the three complementarity determining regions CDR-H1, CDR-H2 and CDR-H3 contained in a VH set forth in SEQ ID NO: 2, or 21-26, wherein the CDR-H1, CDR-H2 and CDR-H3 can be determined according to any CDR definition scheme, such as Kabat, AbM, IMGT, Contact or North, or any combination thereof; preferably, the CDR-H1, CDR-H2 and CDR-H3 are determined according to Kabat scheme respectively.

[0108] In some embodiments, the 3 complementarity determining regions CDR-L1, CDR-L2 and CDR-L3, are the three complementarity determining regions CDR-L1, CDR-L2 and CDR-L3 contained in a VH set forth in SEQ ID NO: 3, or 27-33, wherein the CDR-L1, CDR-L2 and CDR-L3 can be determined according to any CDR definition scheme, such as Kabat, AbM, IMGT, Contact or North, or any combination thereof; preferably, the CDR-L1, CDR-L2 and CDR-L3 are determined according to Kabat scheme respectively.

[0109] In some embodiments, the CDR-H1 comprises or consists of an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4, or the CDR-H1 comprises an amino acid sequence having one, two or three changes (preferably amino acid substitutions, and more preferably conservative substitutions) compared to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4.

[0110] In some embodiments, the CDR-H2 comprises or consists of an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 5 or 49, or the CDR-H2 comprises an amino acid sequence having one, two or three changes (preferably amino acid substitutions, and more preferably conservative substitutions) compared to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 5 or 49. Preferably, the CDR-H2 comprises a mutation to avoid deamination, e.g., the amino acids NG is mutated into NA. More preferably, the CDR-H2 comprising such mutation (e.g., a mutation from NG to NA) comprises or consists of an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 49.

[0111] In some embodiments, the CDR-H3 comprises or consists of an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 6, or the CDR-H3 comprises an amino acid sequence having one, two or three changes (preferably amino acid substitutions, and more preferably conservative substitutions) compared to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 6.

[0112] In some embodiments, the CDR-L1 comprises or consists of an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 7, or 50-52, or the CDR-L1 comprises an amino acid sequence having one, two or three changes (preferably amino acid substitutions, and more preferably conservative substitutions) compared to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 7, or 50-52. Preferably, the CDR-L1 comprises a mutation to avoid deamination and / or a mutation to avoid glycosylation. For example, the amino acids “NGS” in the CDR-L1 can be mutated into QGS, NAS, or NAA. More preferably, the CDR-L1 comprising such mutation comprises or consists of an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 50-52.

[0113] In some embodiments, the CDR-L2 comprises or consists of an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 8, or the CDR-L2 comprises an amino acid sequence having one, two or three changes (preferably amino acid substitutions, and more preferably conservative substitutions) compared to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 8.

[0114] In some embodiments, the CDR-L3 comprises or consists of an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 9, or the CDR-L3 comprises an amino acid sequence having one, two or three changes (preferably amino acid substitutions, and more preferably conservative substitutions) compared to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 9.

[0115] In some embodiments, the antibody heavy chain constant region CH of the present disclosure is or derived from a heavy chain constant region of (Human) IgG1, IgG2, IgG3 or IgG4, preferably a heavy chain constant region of (Human) IgG1. In some embodiments, the antibody light chain constant region CL of the present disclosure is or derived from a (human) lambda (λ) or kappa (κ) light chain constant region, preferably a kappa light chain constant region (also denoted as Cκ herein) .

[0116] In some preferred embodiments, the antibody heavy chain constant region CH of the present disclosure comprises or consists of:

[0117] (i) an amino acid sequence having at least 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%or 99%identity to an amino acid sequence selected from SEQ ID NO: 18, 43 or 44;

[0118] (ii) an amino acid sequence having at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18, preferably, comprising LALA mutation;

[0119] (iii) an amino acid sequence having at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 44, preferably, comprising LALA and YTE mutations;

[0120] (iv) an amino acid sequence selected from SEQ ID NO: 18, 43 or 44; or

[0121] (v) an amino acid sequence having one or more (preferably no more than 20 or 10, and more preferably no more than 5, 4, 3, 2 or 1) amino acid changes (preferably amino acid substitutions, and more preferably amino acid conservative substitutions) compared to an amino acid sequence selected from SEQ ID NO: 18, 43 or 44.

[0122] In some embodiments, the amino acid change occurs in an Fc region.

[0123] In some embodiments, the antibody light chain constant region CL of the present disclosure comprises or consists of:

[0124] (i) an amino acid sequence having at least 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%or 99%identity to an amino acid sequence of SEQ ID NO: 20;

[0125] (ii) an amino acid sequence of SEQ ID NO: 20; or

[0126] (iii) an amino acid sequence having one or more (preferably no more than 20 or 10, and more preferably no more than 5, 4, 3, 2 or 1) amino acid changes (preferably amino acid substitutions, and more preferably amino acid conservative substitutions) as compared to an amino acid sequence of SEQ ID NO: 20.

[0127] In some specific embodiments of the present disclosure, the anti-LY6G6D antibody or the antigen-binding fragment thereof of the present disclosure comprises:

[0128] three complementarity determining regions CDR-H1, CDR-H2 and CDR-H3 contained in a VH set forth in any one of SEQ ID NOs: 2, and 21-26, and three complementarity determining regions CDR-L1, CDR-L2 and CDR-L3 contained in a VL set forth in any one of SEQ ID NOs: 3, and 27-33;

[0129] wherein the CDR-H1, CDR-H2 and CDR-H3 can be determined according to any CDR definition scheme, such as Kabat, AbM, IMGT, Contact or North, or any combination thereof; preferably, the CDR-H1, CDR-H2 and CDR-H3 are determined according to Kabat scheme respectively.

[0130] In some specific embodiments of the present disclosure, the anti-LY6G6D antibody or the antigen-binding fragment thereof of the present disclosure comprises CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 and CDR-L3; or comprises VH comprising CDR-H1, CDR-H2 and CDR-H3 and VL comprising CDR-L1, CDR-L2 and CDR-L3, wherein the CDR-H1 comprises or consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4; the CDR-H2 comprises or consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 or 49; the CDR-H3 comprises or consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6; the CDR-L1 comprises or consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, 50, 51 or 52; the CDR-L2 comprises or consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8; the CDR-L3 comprises or consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9.

[0131] In some specific embodiments of the present disclosure, the anti-LY6G6D antibody or the antigen-binding fragment thereof of the present disclosure comprises CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 and CDR-L3; or comprises VH comprising CDR-H1, CDR-H2 and CDR-H3, and VL comprising CDR-L1, CDR-L2 and CDR-L3, wherein the CDR-H1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4; the CDR-H2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 or 49; the CDR-H3 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6; the CDR-L1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, 50, 51 or 52; the CDR-L2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8; the CDR-L3 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9.

[0132] In some specific embodiments of the present disclosure, the anti-LY6G6D antibody or the antigen-binding fragment thereof of the present disclosure comprises CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 and CDR-L3; or comprises VH comprising CDR-H1, CDR-H2 and CDR-H3 and VL comprising CDR-L1, CDR-L2 and CDR-L3, wherein the CDR-H1 consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4; the CDR-H2 consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 or 49; the CDR-H3 consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6; the CDR-L1 consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, 50, 51 or 52; the CDR-L2 consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8;the CDR-L3 consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9.

[0133] In some specific embodiments of the present disclosure, the anti-LY6G6D antibody or the antigen-binding fragment thereof of the present disclosure comprises CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 and CDR-L3; or comprises VH comprising CDR-H1, CDR-H2 and CDR-H3 and VL comprising CDR-L1, CDR-L2 and CDR-L3, wherein the CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 and CDR-L3 respectively comprises or consists of the amino acid sequence as set forth in

[0134] (i) SEQ ID NO: 4, 5, 6, 7, 8, and 9;

[0135] (ii) SEQ ID NO: 4, 49, 6, 7, 8, and 9;

[0136] (iii) SEQ ID NO: 4, 5, 6, 50, 8, and 9;

[0137] (iv) SEQ ID NO: 4, 49, 6, 50, 8, and 9;

[0138] (v) SEQ ID NO: 4, 5, 6, 51, 8, and 9;

[0139] (vi) SEQ ID NO: 4, 49, 6, 51, 8, and 9;

[0140] (vii) SEQ ID NO: 4, 5, 6, 52, 8, and 9; or

[0141] (viii) SEQ ID NO: 4, 49, 6, 52, 8, and 9.

[0142] In some specific embodiments of the present disclosure, the anti-LY6G6D antibody or the antigen-binding fragment thereof of the present disclosure comprises the following pair of VH and VL:

[0143] In one embodiment of the present disclosure, said amino acid change described herein includes amino acid substitution, insertion or deletion. Preferably, the amino acid change described herein is an amino acid substitution, preferably a conservative substitution. In a preferred embodiment, the amino acid change described herein occurs in a region outside the CDRs (e.g., in FR) . More preferably, the amino acid change described herein occurs in a region outside the heavy chain variable region and / or outside the light chain variable region. In some embodiments, the amino acid change described herein occurs in the Fc region of the antibody heavy chain constant region.

[0144] In certain embodiments, the substitution occurs in the CDRs of the antibody. Generally, the obtained variant has modifications (e.g., improvements) in certain biological properties (e.g., increased / reduced affinity) relative to the parent antibody and / or will substantially retain certain biological properties of the parent antibody. Exemplary substitution variants are affinity-matured antibodies. In some embodiments, the substitution may be present in CDR, e.g., in CDR-H2 or CDR-L1, to avoid deamination and / or heterogeneity during manufacturing. Specifically, the substitution can be an NG(Asn-Gly) to NA (Asn-Ala) modification, or a modification of NGS (Asn-Gly-Ser) to NAS(Asn-Ala-Ser) , or NAA (Asn-Ala-Ala) in VH and / or VL domains, e.g., CDRs such as CDR-H2 or CDR-L1. In some embodiments, CDR-H2 has a modification of NG (Asn-Gly) to NA (Asn-Ala) . In some embodiments, CDR-L1 has a modification of NGS (Asn-Gly-Ser) to NAS (Asn-Ala-Ser) , or NAA (Asn-Ala-Ala) .

[0145] In certain embodiments, the antibody provided herein is altered to increase or decrease the extent to which the antibody is glycosylated. Addition or deletion of glycosylation sites of an antibody can be conveniently achieved by altering the amino acid sequence to create or remove one or more glycosylation sites. Specifically, a modification of NGS (Asn-Gly-Ser) to QGS (Gln-Gly-Ser) or NAA (Asn-Ala-Ala) can be found in an antibody, for example in CDRs such as CDR-L1 to remove the glycosylation. In some embodiments of the present disclosure, the CDR-L1 has a modification of NGS (Asn-Gly-Ser) to QGS (Gln-Gly-Ser) or NAA (Asn-Ala-Ala) to remove the glycosylation.

[0146] In certain embodiments, CDR-H2 has a modification of NG (Asn-Gly) to NA (Asn-Ala) and CDR-L1 has a modification of NGS (Asn-Gly-Ser) to NAS (Asn-Ala-Ser) , QGS(Gln-Gly-Ser) , or NAA (Asn-Ala-Ala) .

[0147] In some embodiments, the substitution is a conservative substitution. A conservative substitution refers to the substitution of an amino acid by another amino acid of the same class, e.g., the substitution of an acidic amino acid by another acidic amino acid, the substitution of a basic amino acid by another basic amino acid, or the substitution of a neutral amino acid by another neutral amino acid.

[0148] In certain embodiments, antibodies modified by cysteine engineering may need to be produced, such as “sulfo-Mab” , wherein one or more residues of the antibodies are replaced by cysteine residues.

[0149] In certain embodiments, the antibody provided herein can be further modified to comprise other non-protein portions known in the art and readily available.

[0150] In some embodiments, the anti-LY6G6D antibody or the antigen-binding fragment thereof of the present disclosure has one or more of the following properties:

[0151] (i) showing the same or similar binding affinity and / or specificity for LY6G6D as the antibody of the present disclosure;

[0152] (ii) inhibiting (e.g., competitively inhibiting) the binding of the antibody of the present disclosure to LY6G6D;

[0153] (iii) binding to the same or overlapping epitope as the antibody of the present disclosure;

[0154] (iv) competing with the antibody of the present disclosure for binding to LY6G6D;

[0155] (v) having one or more biological properties of the antibody of the present disclosure.

[0156] In some embodiments, the anti-LY6G6D antibody or antigen-binding fragment according to the present disclosure is a chimeric antibody or a humanized antibody. In some embodiments, the anti-LY6G6D antibody or its antigen-binding fragment is a humanized antibody.

[0157] In some embodiments of an anti-LY6G6D antibody or antigen-binding fragment thereof according to the present disclosure, the antibody or antigen-binding fragment comprises an Fc region, which may be a native or a variant Fc region. In particular embodiments, the Fc region is a human Fc region derived from IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgM, IgE, or IgD. Depending on the utility of the antibody, it may be desirable to use a variant Fc region to change (for example, reduce or eliminate) at least one effector function, for example, ADCC and / or CDC. In some embodiments, the present disclosure provides an anti-LY6G6D antibody or antigen-binding fragment comprising an Fc region with one or more mutation to change at least one effector function, for example, L234A and L235A (abbreviated as LALA mutation hereafter) . In some embodiments, the Fc region can be any Fc region as defined herein.

[0158] In some embodiments, antigen-binding fragments of an anti-LY6G6D antibody according to the present disclosure may be for example, Fv, Fab, Fab’ , Fab’ -SH, F (ab’ ) 2; diabodies; linear antibodies; or single-chain antibody molecules (e.g., scFv) .

[0159] II-2. Bispecific or multispecific binding proteins

[0160] In another aspect, the present disclosure provides a binding protein that specifically binds to:

[0161] (i) a first antigen of human LY6G6D, and

[0162] (ii) at least a second antigen.

[0163] In some embodiments, the binding protein is a bispecific binding protein (e.g., bispecific antibody) that specifically binds to LY6G6D and a second antigen. In some embodiment, the binding protein is a multi-specific (e.g., tri-specific or tetra-specific) binding protein (e.g. antibody) that specifically binds to LY6G6D and two or more other antigens.

[0164] In one aspect, the present disclosure provides a bispecific binding protein (e.g., bispecific antibody) , which comprises a first binding region that specifically binds to LY6G6D, and a second binding region that specifically binds to CD3.

[0165] In some embodiments, a binding protein according to the present application comprises:

[0166] a) a first antigen-binding region that specifically binds LY6G6D (LY6G6D-binding region) ; and

[0167] b) a second antigen-binding region that specifically binds CD3 (CD3-binding region) .

[0168] In one aspect, the present disclosure provides LY6G6D×CD3 bispecific binding proteins, especially Fabs-in-Tandem immunoglobulins (FIT-Ig) or Monovalent Asymmetric Tandem Fab bispecific antibodies (MAT-Fab) , that are capable of binding to both LY6G6D and CD3. Each variable domain (VH or VL) in a FIT-Ig or a MAT-Fab may be obtained from one or more "parental" monoclonal antibodies that bind one of the target antigens, i.e., LY6G6D or CD3. FIT-Ig or MAT-Fab binding proteins may be produced using variable domain sequences of anti-LY6G6D and anti-CD3 monoclonal antibodies. For instance, the parental antibody may be the Anti-LY6G6D antibodies described herein.

[0169] In some embodiments, bispecific FIT-Ig and MAT-Fab proteins according to the present disclosure are configured without any interdomain peptide linker. Whereas in multivalent engineered immunoglobulin formats having tandem binding sites, it was commonly understood in the field that the adjacent binding sites would interfere with each other unless a flexible linker was used to separate the binding sites spatially. It has been discovered for the LY6G6D×CD3 FIT-Ig and MAT-Fab of the present disclosure, however, that the arrangement of the immunoglobulin domains according to the chain formulas disclosed herein results in polypeptide chains that are well-expressed in transfected mammalian cells, assemble appropriately, and are secreted as bispecific, multivalent immunoglobulin-like binding proteins that bind the target antigens LY6G6D and CD3. See, Examples, infra. Moreover, omission of synthetic linker sequences from the binding proteins can avoid the creation of antigenic sites recognizable by mammalian immune systems, and in this way the elimination of linkers decreases possible immunogenicity of the FIT-Igs and MAT-Fab and leads to a half-life in circulation that is like a natural antibody, that is, the FIT-Ig and MAT-Fab are not rapidly cleared through immune opsonization and capture in the liver.

[0170] Various elements and components constituting the antibodies and the binding proteins of the present disclosure will be described in detail below. Unless indicated otherwise, any combination of any technical features of these components or elements is within the scope of the present invention. Moreover, unless indicated otherwise, the binding protein the present disclosure (including any form of binding proteins) may include any such combination of features.

[0171] II-2-1. LY6G6D-binding region

[0172] The LY6G6D-binding region may be an antigen-binding fragment thereof of the anti-LY6G6D antibody according to the present disclosure, as long as it’s capable of specifically binding to LY6G6D, including but not limited to, single-chain Fv (scFv) , Fab, Fab', (Fab) 2, single-domain antibodies, VHH or heavy chain antibodies that specifically binds to LY6G6D, etc.

[0173] In some embodiments, the LY6G6D-binding region is derived from the anti-LY6G6D antibody of the present disclosure as described above, e.g., the Fab fragment of the anti-LY6G6D antibody of the present disclosure as described above.

[0174] In one embodiment, the bispecific binding proteins as described herein comprise the set of six CDRs, CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2, and CDR-L3 derived from any anti-LY6G6D antibody or antigen-binding fragment thereof according to the present disclosure and described herein to form the LY6G6D-binding region of the bispecific binding protein. In some further embodiments, the bispecific binding proteins as described herein comprise the VH and VL derived from any anti-LY6G6D antibody or antigen-binding fragment thereof according to the present disclosure and described herein to form the LY6G6D-binding region of the bispecific binding protein.

[0175] In some embodiments, the LY6G6D-binding region according to the present disclosure is derived from an isolated anti-LY6G6D antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to LY6G6D, which binds to a human anti-LY6G6D, with a KD value of less than about 10nM, less than about 5nM, or less than about 3nM, preferably 1nM to 5nM, as measured by a grating-coupled interferometry (GCI) based assay.

[0176] In some embodiments, the LY6G6D-binding region according to the present disclosure comprises CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2, and CDR-L3 of the anti-LY6G6D antibodies as defined in the present disclosure, e.g., in Section II-1.

[0177] In some embodiments, the LY6G6D-binding region according to the present disclosure comprises VH and VL of the anti-LY6G6D antibodies as defined in the present disclosure, e.g., in Section II-1.

[0178] In some embodiments, the LY6G6D-binding region according to the present disclosure is a Fab (FabLY6G6D) of the anti-LY6G6D antibodies as defined in the present disclosure, e.g., in Section II-1.

[0179] As used herein, the VH contained in the LY6G6D-binding region is also represented as VHLY6G6D. As used herein, the VL of contained in the LY6G6D-binding region is also represented as VLLY6G6D.

[0180] II-2-2. CD3-binding region

[0181] The CD3-binding region may be an antigen-binding fragment thereof of an anti-CD3 antibody (e.g., an anti-CD3 antibody as described in PCT / CN2020 / 131767, incorporated herein by reference in its entirety) , as long as it can specifically bind to CD3, including but not limited to, single-chain Fv, Fab, Fab’ , (Fab) 2, single-domain antibodies, VHH or heavy chain antibodies that specifically bind to CD3, etc.

[0182] In one embodiment, the bispecific binding proteins as described herein comprise a set of six CDRs, CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2, and CDR-L3 derived from an anti-CD3 antibody (e.g., an anti-CD3 antibody as described in PCT / CN2020 / 131767) to form the CD3-binding region of the bispecific binding protein. In some further embodiments, the bispecific binding proteins as described herein comprise the VH and VL derived from an anti-CD3 antibody (e.g., an anti-CD3 antibody as described in PCT / CN2020 / 131767) to form the CD3-binding region of the bispecific binding protein.

[0183] In some embodiments, the CD3 binding region according to the present disclosure is derived from an isolated anti-CD3 antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to CD3, which has one or more of the following properties:

[0184] (a) the CD3 binding region binds to a human CD3 (especially, CD3ε / δ antigen) , with a KD value of less than about 50nM, less than about 30nM, or less than about 20nM, preferably 10nM to 20nM, as measured by a grating-coupled interferometry (GCI) based assay; and

[0185] (b) the second antigen-binding region binds to the same or overlapping epitope, and / or competes with a reference antigen-binding region comprising a VH sequence of SEQ ID NO: 10 and a VL sequence of SEQ ID NO: 11 for binding to a human CD3.

[0186] In some embodiments, the CD3-binding region according to the present disclosure comprises CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2, and CDR-L3 of the anti-CD3 antibody as described in PCT / CN2020 / 131767.

[0187] In some embodiments, the CD3-binding region according to the present disclosure comprises VH and VL of the anti-CD3 antibody as described in PCT / CN2020 / 131767.

[0188] In some embodiments, the CD3-binding region according to the present disclosure comprises CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2, and CDR-L3 of a heavy chain variable domain VH and a light chain variable domain VL, selected from the group consisting of the following VH / VL sequence pair: SEQ ID NOs: 10 and 11. In some preferable embodiments, the CD3-binding region according to the present disclosure comprises CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3 of a heavy chain variable domain VH having the sequence as shown in SEQ ID NO: 10, and CDR-L1, CDR-L2, and CDR-L3 of a light chain variable domain VL having the sequence as shown in SEQ ID NO: 11.

[0189] The CDRs can be determined by a person skilled in the art using any of CDR definition schemes well-known in the art. In one embodiment, the CDRs are defined according to Kabat, AbM, IMGT, Contact or North scheme, or any combination thereof. In another embodiment, the CDRs are defined according to Kabat scheme.

[0190] In some embodiments, the CD3-binding region according to the present disclosure comprises CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2, and CDR-L3; or comprises a VH comprising CDR-H1, CDR-H2 and CDR-H3 and a VL comprising CDR-L1, CDR-L2 and CDR-L3, wherein:

[0191] CDR-H1 comprises the sequence of SEQ ID NO: 12,

[0192] CDR-H2 comprises the sequence of SEQ ID NO: 13,

[0193] CDR-H3 comprises the sequence of SEQ ID NO: 14,

[0194] CDR-L1 comprises the sequence of SEQ ID NO: 15,

[0195] CDR-L2 comprises the sequence of SEQ ID NO: 16, and

[0196] CDR-L3 comprises the sequence of SEQ ID NO: 17.

[0197] In some embodiments, the CD3 binding region according to the present disclosure comprises CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2, and CDR-L3; or comprises a VH comprising CDR-H1, CDR-H2 and CDR-H3 and a VL comprising CDR-L1, CDR-L2 and CDR-L3, wherein:

[0198] CDR-H1 consists of the sequence of SEQ ID NO: 12,

[0199] CDR-H2 consists of the sequence of SEQ ID NO: 13,

[0200] CDR-H3 consists of the sequence of SEQ ID NO: 14,

[0201] CDR-L1 consists of the sequence of SEQ ID NO: 15,

[0202] CDR-L2 consists of the sequence of SEQ ID NO: 16, and

[0203] CDR-L3 consists of the sequence of SEQ ID NO: 17.

[0204] In some embodiments, the CD3 binding region according to the present disclosure comprises a heavy chain variable domain VH and a light chain variable domain VL, wherein: the VH domain comprises the sequence of SEQ ID NO: 10, or a sequence having at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or more identity therewith, and the VL domain comprises the sequence of SEQ ID NO: 11, or a sequence having at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or more identity therewith.

[0205] In some embodiments, the VH sequence having at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%identity according to the present disclosure contains substitutions (e.g., conservative substitutions) , insertions, or deletions relative to the reference sequence, while retains the ability to bind to the CD3 with the same or improved binding properties. In certain embodiments, substitutions, insertions, or deletions occur in regions outside the CDRs (i.e., in the FRs) . In a particular embodiment, the VH comprises one, two or three CDRs selected from: (a) a CDR-H1 comprising or consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12, (b) a CDR-H2 comprising or consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13, and (c) a CDR-H3 comprising or consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14. In some embodiments, the VH sequence is a humanized VH sequence.

[0206] In some embodiments, the VL sequence having at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%identity according to the present disclosure contains substitutions (e.g., conservative substitutions) , insertions, or deletions relative to the reference sequence, while retains the ability to bind to the CD3 with the same or improved binding properties. In certain embodiments, substitutions, insertions, or deletions occur in regions outside the CDRs (i.e., in the FRs) . In a particular embodiment, the VL comprises one, two or three CDRs selected from: (a) a CDR-L1 comprising or consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15, (b) a CDR-L2 comprising or consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16, and (c) a CDR-L3 comprising or consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17. In some embodiments, the VL sequence is a humanized VL sequence.

[0207] In some embodiments, the CD3 binding region according to the present disclosure comprises a heavy chain variable domain VH and a light chain variable domain VL, wherein: the VH domain comprises the sequence of SEQ ID NO: 10, and the VL domain comprises the sequence of SEQ ID NO: 11.

[0208] In some embodiments, the CD3 binding region according to the present disclosure comprises a heavy chain variable domain VH and a light chain variable domain VL, wherein: the VH domain consists of the sequence of SEQ ID NO: 10, and the VL domain consists of the sequence of SEQ ID NO: 11.

[0209] In some embodiments, the CD3-binding region according to the present disclosure is a Fab specifically binds to CD3 (FabCD3) .

[0210] As used herein, the VH contained in the CD3-binding region is also represented as VHCD3. As used herein, the VL of contained in the CD3-binding region is also represented as VLCD3.

[0211] II-2-3. Bispecific binding proteins

[0212] In one aspect, the present disclosure provides a bispecific binding protein (e.g., bispecific antibody) , which comprises a LY6G6D-binding region that specifically binds to LY6G6D, and a CD3-binding region that specifically binds to CD3, wherein:

[0213] a) the LY6G6D-binding region comprises CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 and CDR-L3; or comprises VHLY6G6D comprising CDR-H1, CDR-H2 and CDR-H3 and VLLY6G6D comprising CDR-L1, CDR-L2 and CDR-L3, wherein the CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 and CDR-L3 respectively comprises or consists of amino acid sequences selected from the group consisting of:

[0214] (i) SEQ ID NO: 4, 5, 6, 7, 8, and 9;

[0215] (ii) SEQ ID NO: 4, 49, 6, 7, 8, and 9;

[0216] (iii) SEQ ID NO: 4, 5, 6, 50, 8, and 9;

[0217] (iv) SEQ ID NO: 4, 49, 6, 50, 8, and 9;

[0218] (v) SEQ ID NO: 4, 5, 6, 51, 8, and 9;

[0219] (vi) SEQ ID NO: 4, 49, 6, 51, 8, and 9;

[0220] (vii) SEQ ID NO: 4, 5, 6, 52, 8, and 9; or

[0221] (viii) SEQ ID NO: 4, 49, 6, 52, 8, and 9; and

[0222] b) the CD3-binding region comprises CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 and CDR-L3; or comprises VHLY6G6D comprising CDR-H1, CDR-H2 and CDR-H3 and VLLY6G6D comprising CDR-L1, CDR-L2 and CDR-L3, wherein the CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 and CDR-L3 respectively comprises or consists of SEQ ID NO: 12, 13, 14, 15, 16 and 17.

[0223] In one aspect, the present disclosure provides a bispecific binding protein (e.g., bispecific antibody) , which comprises a LY6G6D-binding region that specifically binds to LY6G6D, and a CD3-binding region that specifically binds to CD3, wherein the LY6G6D-binding region comprises VHLY6G6D and VLLY6G6D, and the CD3-binding region comprises VHCD3 and VLCD3, wherein the VHLY6G6D, VLLY6G6D, VHCD3 and VLCD3 are selected from the following combination:

[0224] II-2-3-1. FIT-Ig binding proteins

[0225] In one embodiment, the bispecific binding protein according to the present disclosure is a bispecific FIT-Ig binding protein capable of binding LY6G6D and the second antigen. A Fabs-in-Tandem immunoglobulin (FIT-Ig) binding protein is a monomeric, dual-specific, tetravalent binding protein comprising six polypeptide chains, and having four functional Fab binding regions with two outer Fab binding regions and two inner Fab binding regions.

[0226] As shown in Figure 1, the binding protein adopts the format (outer Fab-inner Fab-Fc)x2, and binds both antigen A and antigen B. In one aspect, the bispecific binding protein according to the present disclosure is a bispecific FIT-Ig binding protein, wherein two Fab domains of the FIT-Ig protein form the first antigen-binding region that specifically binds LY6G6D; and the other two Fab domains of the FIT-Ig protein form CD3-binding region that specifically binds the second antigen. In some embodiments, a FIT-Ig binding protein according to the present disclosure employs no linker between immunoglobulin domains. When expressed recombinantly in a suitable host cell, the three chains of a FIT-Ig typically associate, in the same manner as a natural immunoglobulin, into a six-chain, multivalent, monomeric protein.

[0227] In a further embodiment, the present disclosure provides a bispecific Fabs-in-Tandem immunoglobulin (FIT-Ig) binding protein comprising a first polypeptide chain, a second polypeptide chain and a third polypeptide chain, wherein

[0228] (i) in Format LH, the first polypeptide chain comprises or consists of, from amino terminus to carboxyl terminus, VLA-CL-VHB-CH1-Fc, wherein CL is fused directly to VHB; the second polypeptide chain comprises or consists of, from amino terminus to carboxyl terminus, VHA-CH1; the third polypeptide chain comprises or consists of, from amino terminus to carboxyl terminus, VLB-CL; or

[0229] (ii) in Format HL, the first polypeptide chain comprises or consists of, from amino terminus to carboxyl terminus, VHB-CH1-VLA-CL-Fc wherein CH1 is fused directly to VLA; the second polypeptide chain comprises or consists of, from amino terminus to carboxyl terminus, VHA-CH1; the third polypeptide chain comprises or consists of, from amino terminus to carboxyl terminus, VLB-CL;

[0230] wherein VL is a light chain variable domain, CL is a light chain constant domain, VH is a heavy chain variable domain, CH1 is a heavy chain constant domain 1, Fc is an immunoglobulin Fc region, for example, the Fc of IgG1 (for instance, the Fc comprising, from amino terminus to carboxyl terminus, hinge-CH2-CH3) ,

[0231] wherein VLA-CL pairs with VHA-CH1 to form a first Fab that specifically binds antigen A (A-binding region) , and VLB-CL pairs with VHB-CH1 to form a second Fab that specifically binds antigen B (B-binding region) ,

[0232] wherein antigen A is LY6G6D and antigen B is CD3, or wherein antigen A is CD3 and antigen B is LY6G6D, and

[0233] wherein two of the first polypeptide chains, two of the second polypeptide chains, and two of the third polypeptide chains are associated to form a FIT-Ig binding protein.

[0234] In some embodiments of the bispecific FIT-Ig binding protein according to the present disclosure, the first polypeptide chain comprises or consists of, from amino terminus to carboxyl terminus, VLA-CL-VHB-CH1-Fc, wherein antigen A is LY6G6D and antigen B is CD3, or antigen A is CD3 and antigen B is LY6G6D.

[0235] In some embodiments of the bispecific FIT-Ig binding protein according to the present disclosure, the present disclosure provides a LY6G6D×CD3 bispecific FIT-Ig binding protein, which comprises first, second, and third polypeptide chains, wherein

[0236] the first polypeptide chain comprises or consists of, from amino terminus to carboxyl terminus, VLLY6G6D-CL-VHCD3-CH1-Fc wherein CL is directly fused to VHCD3,

[0237] the second polypeptide chain comprises or consists of, from amino terminus to carboxyl terminus, VHLY6G6D-CH1; and

[0238] the third polypeptide chain comprises or consists of, from amino terminus to carboxyl terminus, VLCD3-CL;

[0239] or

[0240] the first polypeptide chain comprises or consists of, from amino terminus to carboxyl terminus, VLCD3-CL-VHLY6G6D-CH1-Fc wherein CL is directly fused to VHLY6G6D,

[0241] the second polypeptide chain comprises or consists of, from amino terminus to carboxyl terminus, VHCD3-CH1; and

[0242] the third polypeptide chain comprises or consists of, from amino terminus to carboxyl terminus, VLLY6G6D -CL;

[0243] wherein VL is a light chain variable domain, CL is a light chain constant domain, VH is a heavy chain variable domain, CH1 is a heavy chain constant domain 1, Fc is an immunoglobulin Fc region, for example, the Fc of IgG1 (for instance, the Fc comprising, from amino terminus to carboxyl terminus, hinge-CH2-CH3) ,

[0244] wherein VLLY6G6D represents light chain variable domain of LY6G6D-binding region, and VHLY6G6D represents heavy chain variable domain of LY6G6D-binding region; and wherein VLCD3 represents light chain variable domain of CD3-bindign region, and VHCD3 represents heavy chain variable domain of CD3-binding region;

[0245] wherein VLLY6G6D -CL pairs with VHLY6G6D -CH1 to form a FabLY6G6D that specifically binds LY6G6D, and VLCD3-CL pairs with VHCD3-CH1 to form a FabCD3 that specifically binds CD3,

[0246] wherein two of the first polypeptide chains, two of the second polypeptide chains, and two of the third polypeptide chains are associated to form a FIT-Ig binding protein.

[0247] In alternative embodiments of the bispecific FIT-Ig binding protein according the present disclosure, the present disclosure provides a LY6G6D×CD3 bispecific FIT-Ig binding protein, which comprises first, second, and third polypeptide chains, wherein

[0248] the first polypeptide chain comprises or consists of, from amino terminus to carboxyl terminus, VHLY6G6D-CH1-VLCD3-CL-Fc wherein CH1 is directly fused to VLCD3,

[0249] the second polypeptide chain comprises or consists of, from amino terminus to carboxyl terminus, VHCD3-CH1; and

[0250] the third polypeptide chain comprises or consists of, from amino terminus to carboxyl terminus, VLLY6G6D-CL; or

[0251] the first polypeptide chain comprises or consists of, from amino terminus to carboxyl terminus, VHCD3-CH1-VLLY6G6D-CL-Fc wherein CH1 is directly fused to VLLY6G6D,

[0252] the second polypeptide chain comprises or consists of, from amino terminus to carboxyl terminus, VHLY6G6D-CH1; and

[0253] the third polypeptide chain comprises or consists of, from amino terminus to carboxyl terminus, VLCD3-CL;

[0254] wherein VL is a light chain variable domain, CL is a light chain constant domain, VH is a heavy chain variable domain, CH1 is a heavy chain constant domain 1, Fc is an immunoglobulin Fc region, for example, the Fc of IgG1 (for instance, the Fc comprising, from amino terminus to carboxyl terminus, hinge-CH2-CH3) ,

[0255] wherein VLLY6G6D represents light chain variable domain of LY6G6D-binding region, and VHLY6G6D represents heavy chain variable domain of LY6G6D-binding region; and wherein VLCD3 represents light chain variable domain of CD3-bindign region, and VHCD3 represents heavy chain variable domain of CD3-binding region,

[0256] wherein VLLY6G6D-CL pairs with VHLY6G6D-CH1 to form a FabLY6G6D that specifically binds LY6G6D, and VLCD3-CL pairs with VHCD3-CH1 to form a FabCD3 that specifically binds CD3,

[0257] wherein two of the first polypeptide chains, two of the second polypeptide chains, and two of the third polypeptide chains are associated to form a FIT-Ig binding protein.

[0258] In some embodiments, VLLY6G6D is a light chain variable domain of an LY6G6D-binding region, CL is a light chain constant domain, VHLY6G6D is a heavy chain variable domain of an LY6G6D-binding region, CH1 is a heavy chain constant domain 1, VLCD3 is a light chain variable domain of a CD3-binding region, VHCD3 is a heavy chain variable domain of a CD3-binding region; and optionally, VLCD3-CL domains are derived from the light chain of an anti-CD3 parental antibody, VHCD3-CH1 domains are derived from the heavy chain of the anti-CD3 parental antibody, VLLY6G6D-CL domains are derived from the light chain of an anti-LY6G6D parental antibody, and VHLY6G6D-CH1 domains are derived from heavy chain of the anti-LY6G6D parental antibody.

[0259] In some embodiments of the bispecific FIT-Ig binding protein according to the present disclosure, the FabLY6G6D binding to LY6G6D formed by VL-CL pairing with VH-CH1 in the FIT-Ig binding protein (for example, when A is LY6G6D, formed by VLA-CL and VHA-CH1; or when B is LY6G6D, formed by VLB-CL and VHB-CH1) is the LY6G6D binding region of the bispecific binding protein as dercribed herein, e.g., the LY6G6D binding region as defined in Secion II-2-1.

[0260] In some embodiments, the Fab binding to CD3 formed by VL-CL pairing with VH-CH1 in the FIT-Ig binding protein (for example, when A is CD3, formed by VLA-CL and VHA-CH1; or when B is CD3, formed by VLB-CL and VHB-CH1) is the CD3 binding region of the bispecific binding protein as dercribed herein, e.g., the CD3 binding region as defined in Secion II-2-2.

[0261] In some embodiments of a FIT-Ig binding protein according to the present disclosure, CH1, CL and Fc domains are of or from human sequences.

[0262] In the foregoing formulas for a FIT-Ig binding protein, an Fc region may comprise rom N-terminus to C-terminus: CH2-CH3, or from N-terminus to C-terminus: hinge-CH2-CH3. An Fc region may be a native or a variant Fc region. In particular embodiments, the Fc region is a human Fc region derived from IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgM, IgE, or IgD. In some embodiments, the Fc region suitable for use in an antibody or bispecific antibody of the invention is a human IgG Fc, e.g., human IgGl Fc, human IgG2 Fc, human IgG3 or human IgG4 Fc.

[0263] In one embodiment, the Fc region comprises or consists of the amino acid sequence SEQ ID NO: 45 or an amino acid sequence having at least 90%identity thereto, e.g., 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or more.

[0264] The Fc region of the binding protein of the present disclosure can be mutated or modified for desired properties. Such mutations or modifications to the Fc region are well-known in the art.

[0265] In one embodiment, the Fc region is modified for the properties of the effector function of the Fc region (e.g., the complement activation function of the Fc region) . In one embodiment, the effector function has been reduced or eliminated relative to the wild-type isotype Fc region. In one embodiment, effector function is reduced or eliminated by a method selected from using Fc isotypes that naturally have reduced or eliminated effector function, and Fc region modification.

[0266] In a preferred embodiment, the Fc region has reduced effector function mediated by the Fc region, e.g., reduced or eliminated ADCC or ADCP or CDC effector function, e.g., comprises mutations to achieve the above functions.

[0267] In another embodiment, the Fc region is modified to alter the binding affinity for one or more Fc receptors. In one embodiment, the Fc receptor is an Fcγ receptor, in particular, a human Fcγ receptor. In some embodiments, the Fc region comprises a mutation that reduces binding to Fcγ receptors. For example, in some embodiments, the Fc region used in the present disclosure has one or more of the L234A / L235A (LALA) mutations that reduces binding to Fcγ receptors. In yet another preferred embodiment, the Fc fragment may have a mutation that results in increased serum half-life, e.g., a YTE mutation M252Y / S254T / T256E that improves the binding of the Fc fragment to FcRn. In some embodiments, the Fc region comprises LALA and YTE mutations.

[0268] In some embodiments, the Fc region comprises or consists of an amino acid sequence having at least 90%identity, e.g., 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or higher identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 46 or 47. In some embodiments, the Fc region comprises an amino acid sequence having at least 90%, e.g., 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or higher identity to SEQ ID NO: 46, and comprises L234A / L235A. In some embodiments, the Fc region comprises an amino acid sequence having at least 90%, e.g., 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or higher identity to SEQ ID NO: 47, and comprises mutations of M252Y / S254T / T256E and L234A / L235A.

[0269] In some embodiments of a FIT-Ig binding protein according to the present disclosure, CH1 is or derived from a human IgG1, IgG2, IgG3 or IgG4 constant CH1 domain, for example, IgG1 constant CH1 domain e.g., comprising or consisting of the sequence of SEQ ID NO: 19, or a sequence having at least 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or more identity herewith.

[0270] In some embodiments of a FIT-Ig binding protein according to the present disclosure, CH1-Fc is a heavy chain constant region from a human IgG1, IgG2, IgG3 or IgG4 constant domain, for example, IgG1 constant region. In some embodiments, the CH1-Fc sequence comprises or consists of an amino acid sequence having at least 90%identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 43, e.g., 95%, 96%, 97%, 99%or higher identity.

[0271] In some embodiments, the CH1-Fc comprises or consists of an amino acid sequence having at least 90%identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18, e.g., 95%, 96%, 97%, 99%or higher identity, preferably, comprising LALA mutation.

[0272] In some embodiments, the CH1-Fc comprises or consists of an amino acid sequence having at least 90%identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 44, e.g., 95%, 96%, 97%, 99%or higher identity, preferably, comprising LALA and YTE mutations.

[0273] In some embodiments of a FIT-Ig binding protein according to the present disclosure, CL is or from a human constant kappa or lambda CL domain, for example, Kappa CL domain, e.g., comprising or consisting of the sequence of SEQ ID NO: 20, or a sequence having at least 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or more identity herewith.

[0274] In an embodiment, FIT-Ig binding proteins of the present disclosure retain one or more properties of the parental antibodies. In some embodiments, the FIT-Ig retains binding affinity for the target antigens (i.e., CD3 and LY6G6D) comparable to that of the parental antibodies, meaning that the binding affinity of the FIT-Ig binding protein for the LY6G6D and CD3 antigen targets does not vary by greater than 10-fold in comparison to the binding affinity of the parental antibodies for their respective target antigens, as measured by surface plasmon resonance, biolayer interferometry or GCI assay.

[0275] In some embodiments, a FIT-Ig binding protein of the present disclosure binds LY6G6D and CD3, and comprises a first polypeptide chain, a second polypeptide chain, and a third polypeptide chain, wherein:

[0276] - the first polypeptide chain comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 34, 37, 39 or 40, or a sequence having at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or more identity therewith,

[0277] - the second polypeptide chain comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 35 or 38, or a sequence having at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or more identity therewith, and

[0278] - the third polypeptide chain comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 36, or a sequence having at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or more identity therewith.

[0279] In some embodiments, a FIT-Ig binding protein of the present disclosure binds LY6G6D and CD3, and comprises a first polypeptide chain, a second polypeptide chain, and a third polypeptide chain, wherein:

[0280] - the first polypeptide chain comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 34, 39 or 40 or a sequence having at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or more identity therewith,

[0281] - the second polypeptide chain comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 35, or a sequence having at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or more identity therewith, and

[0282] - the third polypeptide chain comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 36, or a sequence having at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or more identity therewith.

[0283] In some embodiments, a FIT-Ig binding protein of the present disclosure binds LY6G6D and CD3, and comprises a first polypeptide chain, a second polypeptide chain, and a third polypeptide chain, wherein:

[0284] - the first polypeptide chain comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 37, 39 or 40 or a sequence having at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or more identity therewith,

[0285] - the second polypeptide chain comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 38, or a sequence having at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or more identity therewith, and

[0286] - the third polypeptide chain comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 36, or a sequence having at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or more identity therewith.

[0287] In some embodiments, a FIT-Ig binding protein of the present disclosure binds LY6G6D and CD3, and comprises a first polypeptide chain, a second polypeptide chain, and a third polypeptide chain, wherein:

[0288] - the first polypeptide chain comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 34, 37, 39 or 40,

[0289] - the second polypeptide chain comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 35 or 38 and

[0290] - the third polypeptide chain comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 36.

[0291] In some embodiments, a FIT-Ig binding protein of the present disclosure binds LY6G6D and CD3, and comprises a first polypeptide chain, a second polypeptide chain, and a third polypeptide chain, wherein:

[0292] - the first polypeptide chain consists of an amino acid sequence of SEQ ID NO: 34, 37, 39 or 40,

[0293] - the second polypeptide chain consists of an amino acid sequence of SEQ ID NO: 35 or 38, and

[0294] - the third polypeptide chain consists of an amino acid sequence of SEQ ID NO: 36.

[0295] In some embodiments, a FIT-Ig binding protein of the present disclosure binds LY6G6D and CD3, and comprises a first polypeptide chain, a second polypeptide chain, and a third polypeptide chain, wherein:

[0296] - the first polypeptide chain comprises or consists of an amino acid sequence of SEQ ID NO: 34,

[0297] - the second polypeptide chain comprises or consists of an amino acid sequence of SEQ ID NO: 35, and

[0298] - the third polypeptide chain comprises or consists of an amino acid sequence of SEQ ID NO: 36.

[0299] In some embodiments, a FIT-Ig binding protein of the present disclosure binds LY6G6D and CD3, and comprises a first polypeptide chain, a second polypeptide chain, and a third polypeptide chain, wherein:

[0300] - the first polypeptide chain comprises or consists of an amino acid sequence of SEQ ID NO: 37,

[0301] - the second polypeptide chain comprises or consists of an amino acid sequence of SEQ ID NO: 38, and

[0302] - the third polypeptide chain comprises or consists of an amino acid sequence of SEQ ID NO: 36.

[0303] In some embodiments, a FIT-Ig binding protein of the present disclosure binds LY6G6D and CD3, and comprises a first polypeptide chain, a second polypeptide chain, and a third polypeptide chain, wherein:

[0304] - the first polypeptide chain comprises or consists of an amino acid sequence of SEQ ID NO: 39,

[0305] - the second polypeptide chain comprises or consists of an amino acid sequence of SEQ ID NO: 35, and

[0306] - the third polypeptide chain comprises or consists of an amino acid sequence of SEQ ID NO: 36.

[0307] In some embodiments, a FIT-Ig binding protein of the present disclosure binds LY6G6D and CD3, and comprises a first polypeptide chain, a second polypeptide chain, and a third polypeptide chain, wherein:

[0308] - the first polypeptide chain comprises or consists of an amino acid sequence of SEQ ID NO: 39,

[0309] - the second polypeptide chain comprises or consists of an amino acid sequence of SEQ ID NO: 38, and

[0310] - the third polypeptide chain comprises or consists of an amino acid sequence of SEQ ID NO: 36.

[0311] In some embodiments, a FIT-Ig binding protein of the present disclosure binds LY6G6D and CD3, and comprises a first polypeptide chain, a second polypeptide chain, and a third polypeptide chain, wherein:

[0312] - the first polypeptide chain comprises or consists of an amino acid sequence of SEQ ID NO: 40,

[0313] - the second polypeptide chain comprises or consists of an amino acid sequence of SEQ ID NO: 35, and

[0314] - the third polypeptide chain comprises or consists of an amino acid sequence of SEQ ID NO: 36.

[0315] In some embodiments, a FIT-Ig binding protein of the present disclosure binds LY6G6D and CD3, and comprises a first polypeptide chain, a second polypeptide chain, and a third polypeptide chain, wherein:

[0316] - the first polypeptide chain comprises or consists of an amino acid sequence of SEQ ID NO: 40,

[0317] - the second polypeptide chain comprises or consists of an amino acid sequence of SEQ ID NO: 38, and

[0318] - the third polypeptide chain comprises or consists of an amino acid sequence of SEQ ID NO: 36.

[0319] II-2-3-2. MAT-Fab binding proteins

[0320] In one embodiment, the bispecific binding protein according to the present application is a bispecific MAT-Fab binding protein capable of binding LY6G6D and CD3. A Monovalent Asymmetric Tandem Fab (MAT-Fab) bispecific binding protein is a monomeric, dual-specific, bi-valent binding protein comprising four polypeptide chains and having two functional Fab binding regions in tandem. As shown in Figure 1, the binding protein adopts the outer Fab-inner Fab-Fc: Fc dimer format, and binds both antigen A and antigen B. In some embodiments, the LY6G6D×CD3 bispecific binding protein according to the present disclosure is a bispecific MAT-Fab binding protein, wherein one Fab domain of the MAT-Fab protein forms the first antigen-binding region that specifically binds LY6G6D; and the other Fab domain of the MAT-Fab protein forms the second antigen-binding region that specifically binds CD3. When expressed recombinantly in a suitable host cell, the four chains of a MAT-Fab typically associate, in the same manner as a natural immunoglobulin, into a four chain, multivalent, monomeric protein.

[0321] In a further embodiment, the present disclosure provides a bispecific monovalent asymmetric tandem Fab (MAT-Fab) binding protein comprising a first polypeptide chain, a second polypeptide chain, a third polypeptide chain and a fourth polypeptide chain, wherein

[0322] the first polypeptide chain comprises or consists of, from amino terminus to carboxyl terminus, VLA-CL-VHB-CH1-Fc1 wherein CL is fused directly to VHB; the second polypeptide chain comprises or consists of, from amino terminus to carboxyl terminus, VHA-CH1; the third polypeptide chain comprises or consists of, from amino terminus to carboxyl terminus, VLB-CL; and the fourth polypeptide chain comprises a Fc (Fc2) ;

[0323] wherein VL is a light chain variable domain, CL is a light chain constant domain, VH is a heavy chain variable domain, CH1 is a heavy chain constant domain 1, Fc is an immunoglobulin Fc region, for example, the Fc of IgG1 (for instance, the Fc comprising, from amino terminus to carboxyl terminus, hinge-CH2-CH3) ,

[0324] wherein VLA-CL pairs with VHA-CH1 to form a first Fab that specifically binds antigen A (A-binding region) , and VLB-CL pairs with VHB-CH1 to form a second Fab that specifically binds antigen B (B-binding region) , and

[0325] the two Fc regions (Fc1 and Fc2) form a Fc dimer;

[0326] wherein antigen A is LY6G6D, and antigen B is CD3, or wherein antigen A is CD3, and antigen B is LY6G6D,

[0327] wherein the first polypeptide chain, the second polypeptide chain, the third polypeptide chain and the fourth polypeptide chain are associated to form a MAT-Fab binding protein.

[0328] In some embodiments, the present disclosure provides an anti-LY6G6D×CD3 MAT-Fab binding protein comprising first, second, third and fourth polypeptide chains, wherein

[0329] the first polypeptide chain comprises or consists of, from amino terminus to carboxyl terminus, VLLY6G6D-CL-VHCD3-CH1-Fc1 wherein CL is directly fused to VHCD3;

[0330] the second polypeptide chain comprises or consists of, from amino terminus to carboxyl terminus, VHLY6G6D-CH1;

[0331] the third polypeptide chain comprises or consists of, from amino terminus to carboxyl terminus, VLCD3-CL; and

[0332] the fourth polypeptide chain is Fc2;

[0333] or

[0334] the first polypeptide chain comprises or consists of, from amino terminus to carboxyl terminus, VLCD3-CL-VHLY6G6D-CH1-Fc1 wherein CL is directly fused to VHLY6G6D;

[0335] the second polypeptide chain comprises or consists of, from amino terminus to carboxyl terminus, VHCD3-CH1;

[0336] the third polypeptide chain comprises or consists of, from amino terminus to carboxyl terminus, VLLY6G6D-CL; and

[0337] the fourth polypeptide chain is Fc2;

[0338] wherein VL is a light chain variable domain, CL is a light chain constant domain, VH is a heavy chain variable domain, CH1 is a heavy chain constant domain 1, Fc1 and Fc2 each is an immunoglobulin Fc region, for example, the Fc of IgG1 (for instance, the Fc comprising, from amino terminus to carboxyl terminus, hinge-CH2-CH3) ,

[0339] wherein VLLY6G6D represents light chain variable domain of LY6G6D-binding region, and VHLY6G6D represents heavy chain variable domain of LY6G6D-binding region; and wherein VLCD3 represents light chain variable domain of CD3-bindign region, and VHCD3 represents heavy chain variable domain of CD3-binding region,

[0340] wherein VLLY6G6D -CL pairs with VHLY6G6D -CH1 to form a FabLY6G6D that specifically binds LY6G6D, and VLCD3-CL pairs with VHCD3-CH1 to form a FabCD3 that specifically binds CD3,

[0341] Fc1 and Fc2 are different and form a dimer; and

[0342] wherein the first polypeptide chain, the second polypeptide chain, the third polypeptide chain and the fourth polypeptide chain are associated to form a MAT-Fab binding protein.

[0343] In some embodiments, VLLY6G6D is a light chain variable domain of an anti-LY6G6D antibody, CL is a light chain constant domain, VHLY6G6D is a heavy chain variable domain of an anti-LY6G6D antibody, CH1 is a heavy chain constant domain 1, VLCD3 is a light chain variable domain of an anti-CD3 antibody, VHCD3 is a heavy chain variable domain of an anti-CD3 antibody. In some embodiments, Fc1 comprises hinge-CH2-CH3m1 and Fc2 comprises hinge-CH2-CH3m2. In some embodiments, one or more “knob-in-hole” mutations are introduced into CH3m1 and CH3m2 domains to favor heterodimerization of the CH3m1 and CH3m2 domains.

[0344] In some embodiments, VLCD3-CL domains are derived from the light chain of an anti-CD3 parental antibody, VHCD3-CH1 domains are derived from the heavy chain of the anti-CD3 parental antibody, VLLY6G6D-CL domains are derived from the light chain of an anti-LY6G6D parental antibody, and VHLY6G6D-CH1 domains are derived from heavy chain of the anti-LY6G6D parental antibody.

[0345] In some embodiments of the MAT-Fab binding protein according to the present disclosure, the Fab binding to LY6G6D formed by VL-CL pairing with VH-CH1 in the MAT-Fab binding protein (for example, when A is LY6G6D, formed by VLA-CL and VHA-CH1; or when B is LY6G6D, formed by VLB-CL and VHB-CH1) is the LY6G6D binding region of the bispecific binding protein as dercribed herein, e.g., the LY6G6D binding region as defined in Secion II-2-1.

[0346] In some embodiments, the Fab binding to CD3 formed by VL-CL pairing with VH-CH1 in the MAT-Fab binding protein (for example, when A is CD3, formed by VLA-CL and VHA-CH1; or when B is CD3, formed by VLB-CL and VHB-CH1) is the CD3 binding region of the bispecific binding protein as dercribed herein, e.g., the CD3 binding region as defined in Secion II-2-2.

[0347] In the foregoing formulas for a MAT-Fab binding protein, each Fc region may comprise rom N-terminus to C-terminus: CH2-CH3, or from N-terminus to C-terminus: hinge-CH2-CH3. Each Fc region may be a native or a variant Fc region. In particular embodiments, the Fc region is a human Fc region from IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgM, IgE, or IgD. In some embodiments, the Fc region suitable for use in an antibody or bispecific antibody of the invention is a human IgG Fc, e.g., human IgGl Fc, human IgG2 Fc, human IgG3 or human IgG4 Fc.

[0348] In one embodiment, the Fc region comprises or consists of the amino acid sequence SEQ ID NO: 45 or an amino acid sequence having at least 90%identity thereto, e.g., 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or more.

[0349] The Fc region of the binding protein of the present disclosure can be mutated or modified for desired properties. Such mutations or modifications to the Fc region are well-known in the art.

[0350] In one embodiment, the Fc region is modified for the properties of the effector function of the Fc region (e.g., the complement activation function of the Fc region) . In one embodiment, the effector function has been reduced or eliminated relative to the wild-type isotype Fc region. In one embodiment, effector function is reduced or eliminated by a method selected from using Fc isotypes that naturally have reduced or eliminated effector function, and Fc region modification.

[0351] In a preferred embodiment, the Fc region has reduced effector function mediated by the Fc region, e.g., reduced or eliminated ADCC or ADCP or CDC effector function, e.g., comprises mutations to achieve the above functions.

[0352] In another embodiment, the Fc region is modified to alter the binding affinity for one or more Fc receptors. In one embodiment, the Fc receptor is an Fcγ receptor, in particular, a human Fcγ receptor. In some embodiments, the Fc region comprises a mutation that reduces binding to Fcγ receptors. For example, in some embodiments, the Fc region used in the present disclosure has one or more of the L234A / L235A mutations that reduces binding to Fcγ receptors. In yet another preferred embodiment, the Fc fragment may have a mutation that results in increased serum half-life, e.g., a YTE mutation M252Y / S254T / T256E that improves the binding of the Fc fragment to FcRn. In some embodiments, the Fc region comprises L234A / L235A mutations and M252Y / S254T / T256E.

[0353] In some embodiments, the Fc region comprises or consists of an amino acid sequence having at least 90%identity, e.g., 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or higher identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 46 or 47. In some embodiments, the Fc region comprises an amino acid sequence having at least 90%, e.g., 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or higher identity to SEQ ID NO: 46, and comprises L234A / L235A. In some embodiments, the Fc region comprises an amino acid sequence having at least 90%, e.g., 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or higher identity to SEQ ID NO: 47, and comprises mutations of M252Y / S254T / T256E and L234A / L235A.

[0354] In some embodiments of the MAT-Fab binding protein according to the present disclosure, the Fc region of the first polypeptide chain (Fc1) and the Fc region of the fourth polypeptide chain (Fc2) , comprise heterodimerizing modifications, to favor heterodimerization over homodimerization of the two Fc regions. In some embodiments, knob-into-hole (KIH) heterodimerization is used herein. Optionally, the MAT-Fab binding protein further comprises mutation (s) in Fc1 and Fc2 to introduce cysteine residue (s) to favor disulfide bond formation. In some specific embodiments, one of Fc region comprises an S354C mutation, and the other comprises Y349C.

[0355] In some embodiments, one or more knob-into-hole (KiH) mutations are introduced into the Fc1 of the first chain and the Fc2 of the fourth chain. In a further embodiment, when Fc1 has been mutated to form a structural knob, Fc2 to form a complementary structural hole; or when Fc1 has been mutated to form a structural hole, Fc2 to form a complementary structural. In some embodiments, the “knob” mutation (s) is a substitution of T366Y or T366W, and the complementary “hole” mutation (s) is Y407T or a combination of T366S, L368A and Y407V substitution (s) .

[0356] In some specific embodiments, the bispecific binding protein according to the present disclosure is a MAT-Fab protein with a typical knob (T366W) substitution in Fc1 and the corresponding hole substitutions (T366S, L368A and Y407V) in the Fc2, and optionally with two additional introduced cysteine residues S354C / Y349C (contained in the respective corresponding Fc regions) . For example, Fc1 may comprise a substitute of T366W as a knob substitution and an introduced cysteine residue S354C, and Fc2 comprises T366S, L368A and Y407V as hole substitutions and an introduced cysteine residue Y349C.

[0357] The knob-into-hole dimerization modules and their use in antibody engineering are well-known in the art and described, e.g., in Ridgway et al., 1996, Protein Engineering 9 (7) 617-621. The introducing of additional disulfide bridge in the CH3 domain is reported, e.g., in Merchant, A.M., et al., Nat. Biotechnol. 16 (1998) 677-681.

[0358] In one embodiment, the first polypeptide chain of a MAT-Fab binding protein comprises a Fc1 comprising Y349C, T336S, L368A and Y407V with LALA substitutions, and the fourth polypeptide chain comprises a Fc2 comprising S354C and T366W with L234A and L235A substitutions. In one embodiment, the first polypeptide chain of a MAT-Fab binding protein comprises a Fc1 comprising S354C and T366W with LALA substitutions, and the fourth polypeptide chain comprises a Fc2 comprising Y349C, T336S, L368A and Y407V with LALA substitutions.

[0359] In one embodiment, Fc1 comprises an amino acid sequence having at least 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or more identity to SEQ ID NO: 48 and comprises S354C and T366W with L234A and L235A substitutions, and Fc2 comprises an amino acid sequence having at least 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or more identity to SEQ ID NO: 42 and comprises Y349C, T336S, L368A and Y407V with L234A and L235A substitutions; or vice versa.

[0360] In one embodiment, the first polypeptide chain comprises a Fc comprising or consisting of a sequence of SEQ ID NO: 48 and the fourth polypeptide chain comprises a Fc comprising or consisting of a sequence of SEQ ID NO: 42; or the first polypeptide chain comprises a Fc comprising or consisting of a sequence of SEQ ID NO: 42 and the fourth polypeptide chain comprises a Fc comprising or consisting of a sequence of SEQ ID NO: 48.

[0361] In some embodiments of a MAT-Fab binding protein according to the present disclosure, CH1, CL and Fc domains are of or from human sequences.

[0362] In some embodiments of a MAT-Fab binding protein according to the present disclosure, CH1 is or from a human IgG1, IgG2, IgG3 or IgG4 constant CH1 domain, for example, IgG1 constant CH1 domain e.g., comprising or consisting of the sequence of SEQ ID NO: 19, or a sequence having at least 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or more identity herewith.

[0363] In some embodiments of a MAT-Fab binding protein according to the present disclosure, CL is or from a human constant kappa or lambda CL domain, for example, Kappa CL domain, e.g., comprising or consisting of the sequence of SEQ ID NO: 20, or a sequence having at least 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or more identity herewith.

[0364] In some embodiments, a MAT-Fab binding protein according to the present disclosure employs no linker between the immunoglobulin domains.

[0365] In an embodiment, MAT-Fab binding proteins of the present disclosure retain one or more properties of the parental antibodies. In some embodiments, the MAT-Fab retains binding affinity for the target antigens (i.e., CD3 and LY6G6D) comparable to that of the parental antibodies, meaning that the MAT-Fab binding protein exhibits binding affinity for the LY6G6D and CD3 antigen targets within 10-fold in variance from that of the parental antibodies, for instance, as measured by surface plasmon resonance or biolayer interferometry.

[0366] In one embodiment, a MAT-Fab binding protein of the present disclosure binds LY6G6D and CD3 and comprises or consists of a first polypeptide chain, a second polypeptide chain, and a third polypeptide chain and a fourth polypeptide, wherein:

[0367] - the first polypeptide chain comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 41, or a sequence having at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or more identity therewith,

[0368] - the second polypeptide chain comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 35, or a sequence having at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or more identity therewith,

[0369] - the third polypeptide chain comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 36, or a sequence having at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or more identity therewith; and

[0370] - the fourth polypeptide chain comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 42, or a sequence having at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or more identity therewith.

[0371] In one embodiment, a MAT-Fab binding protein of the present disclosure binds LY6G6D and CD3 and comprises or consists of a first polypeptide chain, a second polypeptide chain, and a third polypeptide chain and a fourth polypeptide, wherein:

[0372] - the first polypeptide chain comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 41,

[0373] - the second polypeptide chain comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 35,

[0374] - the third polypeptide chain comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 36; and

[0375] - the fourth polypeptide chain comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 42.

[0376] In one embodiment, a MAT-Fab binding protein of the present disclosure binds LY6G6D and CD3 and comprises or consists of a first polypeptide chain, a second polypeptide chain, and a third polypeptide chain and a fourth polypeptide, wherein:

[0377] - the first polypeptide chain consists of an amino acid sequence of SEQ ID NO: 41,

[0378] - the second polypeptide chain consists of an amino acid sequence of SEQ ID NO: 35,

[0379] - the third polypeptide chain consists of an amino acid sequence of SEQ ID NO: 36; and

[0380] - the fourth polypeptide chain consists of an amino acid sequence of SEQ ID NO: 42.

[0381] II-2-4. Properties of bispecific binding proteins

[0382] In one embodiment, a bispecific LY6G6D×CD3 FIT-Ig or MAT-Fab binding protein capable of binding both CD3 and LY6G6D as described herein comprises a LY6G6D binding region. In one embodiment, a FIT-Ig binding protein antibody described herein or antigen-binding fragment thereof has a dissociation constant (KD) to LY6G6D in the 10-8 to 10-10 range, for example, less than 1 × 10-8 M, less than 8 × 10-9 M, less than 6 × 10-9 M, less than 5 × 10-9 M, less than 4 × 10-9 M, or less than 3 × 10-9 M.

[0383] In one embodiment, a bispecific LY6G6D×CD3 FIT-Ig or MAT-Fab binding protein capable of binding both CD3 and LY6G6D as described herein comprises a humanized CD3 binding region. In one embodiment, a FIT-Ig binding protein antibody described herein or antigen-binding fragment thereof has a dissociation constant (KD) to CD3 in the 10-8 to 10-10 range, for example, less than 8 × 10-8 M, less than 5 × 10-8 M, less than 3 × 10-8 M, less than 2 × 10-8 M or less than 1.5 × 10-8 M.

[0384] In some embodiments, the KD values are measured by a GCI based assay. Grating-coupled interferometry (GCI) is a surface based, label-free optical sensing technique used for real-time binding kinetic measurements. Typically, GCI is used to detect binding events between a target molecule and an analyte. When a protein immobilized on the sensor surface binds to an analyte, there is a light phase shift, which is read out interferometrically. The binding kinetics are analyzed by measuring these phase-shift signals in real time. See, e.g., Patko, D., et al., (2012) . Optics Express, 20 (21) , p. 23162. https:  / / doi. org / 10.1364 / oe. 20.023162. In some further embodiments, the KD values are measured by a GCI based assay as described in Example 2.3.

[0385] In one embodiment, a bispecific LY6G6D×CD3 FIT-Ig binding protein or MAT-Fab binding protein capable of binding CD3 and LY6G6D as described herein can be expressed in cultures of transfected mammalian host cells such as CHO cells or HEK293 cells at levels greater than 10 mg of LY6G6D×CD3 binding protein per liter of cell culture (>10 mg / L) . In one embodiment, the expression level of the FIT-Ig binding protein is greater than 50 mg / L or greater than 60mg / L, for example, 50 mg / L to 120 mg / L, or more. In another embodiment, the expression level of FIT-Ig binding protein is greater than 60 mg / L.

[0386] In one embodiment, a bispecific LY6G6D×CD3 FIT-Ig binding protein or MAT-Fab binding protein capable of binding CD3 and LY6G6D as described herein, after a one-step purification from cell culture media using a Protein A affinity chromatography, have a purity of no less than 70%as detected by SEC-HPLC. In one embodiment, the one-step purified binding proteins have a purity of no less than 70%, 75%, 80%, 85%or 90%as detected by SEC-HPLC.

[0387] In some embodiments, the expression level and the purity are measured as described in Example 2.1 or 4.1.

[0388] In one embodiment, a bispecific LY6G6D×CD3 FIT-Ig binding protein or MAT-Fab binding protein as described herein is capable of binding LY6G6D-expressing cells, and optionally CD3-expressing cells. In one embodiment, the CD3-expressing cells are human T cells. In one embodiment, the LY6G6D-expressing cells are LY6G6D-expressing tumor cells, for example, human Colorectal cancer (CRC) cells. In some embodimetns, the binding property are measured as described in Exampels 2.2 or 4.2.

[0389] In one embodiment, a bispecific binding protein described herein is capable of modulating a biological function of LY6G6D, CD3, or both. In one embodiment, the bispecific LY6G6D×CD3 FIT-Ig binding protein or MAT-Fab binding protein as described herein is capable of activating CD3 signaling in terms of LY6G6D dependence. In one embodiment, the bispecific binding proteins of the present disclosure exhibit LY6G6D-dependent activation of T cells. In one embodiment, a bispecific LY6G6D×CD3 FIT-Ig binding protein or MAT-Fab binding protein as described herein exhibits LY6G6D-redirected T cell cytotoxicity. In one embodiment, the bispecific binding proteins of the present disclosure is used for redirecting the cytotoxic activity of T-cells towards LY6G6D expressing cells in a non-MHC restricted fashion.

[0390] In one embodiment, a bispecific LY6G6D×CD3 FIT-Ig binding protein or MAT-Fab binding protein as described herein exhibits LY6G6D-dependent CD3 activation. In one embodiment, upon binding to LY6G6D-expressing cells, the bispecific LY6G6D×CD3 antibodies induce the crosslink of CD3 / TCR complex on T cells and activation of CD3 signaling. In a further embodiment, the bispecific LY6G6D×CD3 binding proteins exhibit increased T cell activation in the presence of LY6G6D-expressing target cells, and much less non-target redirected CD3 activation in the absence of LY6G6D-expressing target cells, in comparison to corresponding parental anti-CD3 monoclonal IgG antibodies comprising the same VH / VL sequence pairs for CD3 binding as the bispecific FIT-Ig or MAT-Fab proteins.

[0391] In one embodiment, a bispecific LY6G6D×CD3 FIT-Ig binding protein or MAT-Fab binding protein as described herein redirect T cell cytotoxicity to LY6G6D-expressing tumor cells. In another embodiment, a bispecific LY6G6D×CD3 FIT-Ig binding protein or MAT-Fab binding protein as described herein exhibits anti-tumor activities, such as reducing tumor burden, inhibiting tumor growth, or suppressing neoplastic cell expansion.

[0392] In one embodiment, a bispecific LY6G6D×CD3 FIT-Ig binding protein or MAT-Fab binding protein as described herein has one or more of the following properties:

[0393] (a) the antigen binding molecule activates T cells in the presence of human anti-LY6G6D-expressing tumor cells in vitro, e.g., as described in Examples 2.3 or 5;

[0394] (b) the antigen-binding molecule mediates in vitro T cell killing of tumor cell lines expressing a human anti-LY6G6D antigen, as measured by a cell-based reporter gene assay, e.g., as described in Example 2.4;

[0395] (c) the antigen binding molecule induces a cytokine release much lower than a reference bispecific antibody (e.g., R reference (20A12QNT. V12×38E4V1. MD1) from US Patent Publications NO. 20210179715A1) , or a reference anti-CD3 antibody, as measured in the absence of human anti-LY6G6D-expressing cells in a PBMC assay, e.g., as described in Example 7; and

[0396] (d) the antigen-binding molecule inhibits LY6G6D expressing tumor growth in vivo, as measured in an animal model, e.g., in cell line-derived xenograft model (CDX) with human PBMC engrafted NCG mice, as described in Example 8.

[0397] III. Nucleic acid, vector, and host cells

[0398] The present disclosure provides isolated nucleic acids, recombinant expression vectors and host cells, which is useful for making the binding proteins (e.g., the anti-LY6G6D antibody or an antigen-binding fragment thereof of this disclosure, or the bispecific or multi-specific binding protein, including FIT-Ig binding proteins or MAT-Fab binding proteins of the present disclosure) according to the present disclosure.

[0399] In a further aspect, this disclosure provides isolated nucleic acids encoding one or more amino acid sequences of the anti-LY6G6D antibody or an antigen-binding fragment thereof of this disclosure; or an isolated nucleic acid encoding one or more amino acid sequences of the bispecific or multi-specific binding protein, including FIT-Ig binding proteins or MAT-Fab binding proteins of the present disclosure. Such nucleic acids may be inserted into a vector for carrying out various genetic analyses or for expressing, characterizing, or improving one or more properties of an antibody or binding protein described herein. A vector may comprise one or more nucleic acid molecules encoding one or more amino acid sequences of an antibody or binding protein described herein in which the one or more nucleic acid molecules is operably linked to appropriate transcriptional and / or translational sequences that permit expression of the antibody or binding protein in a particular host cell carrying the vector. Examples of vectors for cloning or expressing nucleic acids encoding amino acid sequences of binding proteins described herein include, but are not limited to, pcDNA (e.g., pcDNA3.1) , pTT, pTT3, pEFBOS, pBV, pJV, and pBJ, and derivatives thereof.

[0400] The present disclosure also provides a host cell expressing, or capable of expressing, a vector comprising a nucleic acid encoding one or more amino acid sequences of an antibody or binding protein described herein. The vector (s) comprising nucleic acid (s) encoding the binding proteins according to the present disclosure can be introduced into a host cell (s) by transformation.

[0401] Host cells useful in the present disclosure may be prokaryotic or eukaryotic. An exemplary prokaryotic host cell is Escherichia coli. Eukaryotic cells useful as host cells in the present disclosure include protist cells, animal cells, plant cells, and fungal cells. An exemplary fungal cell is a yeast cell, including Saccharomyces cerevisiae. An exemplary animal cell useful as a host cell according to the present disclosure includes, but is not limited to, a mammalian cell, an avian cell, and an insect cell. Exemplary mammalian cells include, but are not limited to, CHO cells, HEK cells, and COS cells.

[0402] In some embodiments, mammalian host cells for expressing the recombinant antibodies of the present disclosure are Chinese Hamster Ovary (CHO cells) (including dhfr–CHO cells, described in Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4216-4220 (1980) , used with a DHFR selectable marker, e.g., as described in Kaufman and Sharp, J. Mol. Biol., 159: 601-621 (1982) ) , HEK293 cells, NS0 myeloma cells, COS cells, and SP2 cells. When recombinant expression vectors encoding antibody genes are introduced into mammalian host cells, the antibodies are produced by culturing the host cells for a period sufficient to allow for expression of the antibody in the host cells, or further secretion of the antibody into the culture medium in which the host cells are grown. Antibodies can be recovered from the culture medium using standard protein purification methods.

[0403] Host cells can also be used to produce functional antibody fragments, such as Fab fragments or scFv molecules or variable regions of heavy chain or light chain. It will be understood that variations on the above procedure are within the scope of the present disclosure. For example, it may be desirable to transfect a host cell with DNA encoding functional fragments of either the light chain and / or the heavy chain of an antibody of this disclosure. Recombinant DNA technology may also be used to remove some, or all, of the DNA encoding either or both light and heavy chains that is not necessary for binding to the antigens of interest. The molecules expressed from such truncated DNA molecules are also encompassed by the antibodies of the present disclosure.

[0404] The term “isolated nucleic acid” , as used herein, means a polynucleotide (e.g., of genomic, cDNA, or synthetic origin, or some combination thereof) that, by human intervention, is not associated with all or a portion of the polynucleotides with which it is found in nature; is operably linked to a polynucleotide that it is not linked to in nature; or does not occur in nature as part of a larger sequence.

[0405] The term “vector” , as used herein, is intended to refer to a nucleic acid molecule capable of transporting another nucleic acid to which it has been linked. One type of vector is a “plasmid” , which refers to a circular double stranded DNA loop into which additional DNA segments may be ligated.

[0406] The term “transformation” , as defined herein, refers to any process by which exogenous DNA enters a host cell. Transformation may occur under natural or artificial conditions using various methods well known in the art.

[0407] The term “host cell” , is intended to refer to a cell into which exogenous DNA has been introduced. In an embodiment, the host cell comprises two or more (e.g., multiple) nucleic acids encoding antibodies, such as the host cells described in US Patent No. 7,262,028, for example. Such terms are intended to refer not only to the particular subject cell, but also to the progeny of such a cell.

[0408] IV. Production Method

[0409] In another aspect, the present disclosure provides a method of producing an anti-LY6G6D antibody or a functional fragment thereof comprising culturing a host cell comprising an expression vector encoding the antibody or functional fragment in culture medium under conditions sufficient to cause the host cell to express the antibody or fragment capable of binding LY6G6D.

[0410] In another aspect, the present disclosure provides a method of producing a bispecific binding protein capable of binding LY6G6D and CD3, specifically a FIT-Ig binding protein or MAT-Fab binding protein, comprising culturing a host cell comprising an expression vector encoding the FIT-Ig binding protein in culture medium under conditions sufficient to cause the host cell to express the binding protein capable of binding LY6G6D and CD3. The proteins produced by the methods disclosed herein can be isolated and used in various compositions and methods described herein.

[0411] In an exemplary system for recombinant expression of the antibody or antigen-binding portion thereof or the bispecific or multi-specific binding protein (e.g., in the FIT-Ig form or Mat-Fab form) of the present disclosure, a mixture of the recombinant expression vectors encoding each of the chains of the antibody or the antibody-binding portion thereof or the binding protein is introduced into HEK293 or CHO by transfection. The selected transfected host cells are cultured to allow expression of the chains of the antibody or the antibody-binding portion thereof or the binding protein and intact antibody or antigen-binding portion thereof or binding protein is recovered from the culture medium. Standard molecular biology techniques are used to prepare the recombinant expression vector, transfect the host cells, select for transfectants, culture the host cells and recover the antibody or the antibody-binding portion thereof or the binding protein from the culture medium. The present disclosure further provides a method of making an antibody or antigen-binding portion thereof or a binding protein by culturing a transfected host cell of the present disclosure in a suitable culture medium until a recombinant binding protein of the present disclosure is produced. The method can further comprise isolating the recombinant antibody or antigen-binding portion thereof or binding protein from the culture medium.

[0412] In an exemplary system for recombinant expression of an antibody, or antigen-binding portion thereof, of the present disclosure, a recombinant expression vector encoding both the antibody heavy chain and the antibody light chain or each chains of the binding proteins is introduced into dhfr–CHO cells by calcium phosphate-mediated transfection. Within the recombinant expression vector, the antibody heavy and light chain genes or each chain genes of the binding proteins are each operatively linked to CMV enhancer / AdMLP promoter regulatory elements to drive high levels of transcription of the genes. The recombinant expression vector also carries a DHFR gene, which allows for selection of CHO cells that have been transfected with the vector using methotrexate selection / amplification. The selected transfected host cells are cultured to allow expression of the antibody heavy and light chains or the binding protein chains and intact antibody or binding protein is recovered from the culture medium. Standard molecular biology techniques are used to prepare the recombinant expression vector, transfect the host cells, select for transfectants, culture the host cells and recover the antibody or the binding protein from the culture medium. The present disclosure further provides a method of making a recombinant anti-LY6G6D antibody or binding protein by culturing a transfected host cell of the present disclosure in a suitable culture medium until a recombinant antibody of the present disclosure is produced. The method can further comprise isolating the recombinant antibody or the binding protein from the culture medium.

[0413] Standard techniques may be used for recombinant DNA, oligonucleotide synthesis, and tissue culture and transformation (e.g., electroporation, lipofection) . Enzymatic reactions and purification techniques may be performed according to manufacturer's specifications or as commonly accomplished in the art or as described herein. The foregoing techniques and procedures may be generally performed according to conventional methods well known in the art and as described in various general and more specific references that are cited and discussed throughout the present specification. See e.g., Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 1989) .

[0414] Antibodies, functional fragments thereof, and binding proteins according to the present disclosure may be purified (for an intended use) by using one or more of a variety of methods and materials available in the art for purifying antibodies and binding proteins. Such methods and materials include, but are not limited to, affinity chromatography (e.g., using resins, particles, or membranes conjugated to Protein A, Protein G, Protein L, or a specific ligand of the antibody, functional fragment thereof, or binding protein) , ion exchange chromatography (for example, using ion exchange particles or membranes) , hydrophobic interaction chromatography ( "HIC" ; for example, using hydrophobic particles or membranes) , ultrafiltration, nanofiltration, diafiltration, size exclusion chromatography ( "SEC" ) , low pH treatment (to inactivate contaminating viruses) , and combinations thereof, to obtain an acceptable purity for an intended use. A non-limiting example of a low pH treatment to inactivate contaminating viruses comprises reducing the pH of a solution or suspension comprising an antibody, functional fragment thereof, or binding protein of the present disclosure to pH 3.5 with 0.5 M phosphoric acid, at 18℃ -25℃, for 60 to 70 minutes.

[0415] V. Conjugate and Fusion

[0416] The present disclosure provides conjugates and fusions comprising the binding proteins (e.g., the anti-LY6G6D antibody or an antigen-binding fragment thereof of this disclosure, or the bispecific or multi-specific binding protein, including FIT-Ig binding proteins or MAT-Fab binding proteins of the present disclosure) according to the present disclosure.

[0417] The terms “conjugate” , “immunoconjugate” , “fusion” and “immunofusion” can be used interchangeably herein, and refer to an antibody or a binding protein or functional fragments (e.g., Fab fragments of FIT-Ig) of the present disclosure conjugated to one or more other substances, including but not limited to a therapeutic agent, a diagnostic agent, a detectable agent, a cytotoxic agent, and small molecule drug.

[0418] In an embodiment, the present disclosure provides a conjugate or a fusion comprising the binding proteins (e.g., the anti-LY6G6D antibody or an antigen-binding fragment thereof of this disclosure, or the bispecific or multi-specific binding protein, including FIT-Ig binding proteins or MAT-Fab binding proteins of the present disclosure) according to the present disclosure conjugated to a therapeutic agent.

[0419] The term “therapeutic agent” used herein encompasses any substance that is effective in preventing or treating a tumor, e.g., cancer, including a chemotherapeutic agent, a cytokine, a cytotoxic agent, an antibody of different specificity or functional fragment thereof, a small molecule drug or an immunosuppressant (e.g., an immunosuppressive agent) . In some embodiments, the therapeutic agent to be conjugated is a cytotoxic agent that inhibits or prevents cell functions and / or causes cell death or cell destruction. In some embodiments, the therapeutic agent to be conjugated is a chemotherapeutic agent useful in the treatment of immune system diseases. In some embodiments, the therapeutic agent to be conjugated is a small molecule drug having a molecular weight of less than 10 Kd, usually less than 2 Kd and preferably less than 1 Kd. As therapeutic agents, small molecules penetrate cells better, are less susceptible to degradation and are less likely to induce an immune response compared with large molecules.

[0420] In an embodiment, the present disclosure provides a conjugate or a fusion comprising the binding proteins (e.g., the anti-LY6G6D antibody or an antigen-binding fragment thereof of this disclosure, or the bispecific or multi-specific binding protein, including FIT-Ig binding proteins or MAT-Fab binding proteins of the present disclosure) according to the present disclosure conjugated to a diagnostic agent or a detectable agent.

[0421] VI. Pharmaceutical compositions

[0422] The present disclosure provides pharmaceutical compositions comprising the binding proteins (e.g., the anti-LY6G6D antibody or an antigen-binding fragment thereof of the present disclosure, or the bispecific or multi-specific binding protein, including FIT-Ig binding proteins or MAT-Fab binding proteins of the present disclosure) according to the present disclosure (i.e., the primary active ingredient) and a pharmaceutically acceptable carrier. In a specific embodiment, a composition comprises one or more binding proteins (e.g., the anti-LY6G6D antibody or an antigen-binding fragment thereof of the present disclosure, or the bispecific or multi-specific binding protein, including FIT-Ig binding proteins or MAT-Fab binding proteins of the present disclosure) .

[0423] The present disclosure also provides pharmaceutical compositions comprising the binding proteins (e.g., the anti-LY6G6D antibody or an antigen-binding fragment thereof of the present disclosure, or the bispecific or multi-specific binding protein, including FIT-Ig binding proteins or MAT-Fab binding proteins of the present disclosure) according to the present disclosure and a pharmaceutically acceptable carrier. In particular, the present disclosure provides pharmaceutical compositions comprising at least one anti-LY6G6D antibody or an antigen-binding fragment thereof and a pharmaceutically acceptable carrier. In particular, the present disclosure provides pharmaceutical compositions comprising at least one FIT-Ig binding protein capable of binding LY6G6D and CD3 and a pharmaceutically acceptable carrier. In particular, the present disclosure provides pharmaceutical compositions comprising at least one MAT-Fab binding protein capable of binding LY6G6D and CD3 and a pharmaceutically acceptable carrier. Pharmaceutical compositions of the present disclosure may further comprise at least one additional active ingredient. In some embodiments, such an additional ingredient includes, but is not limited to, a prophylactic and / or therapeutic agent, a detection agent, such as an anti-tumor drug, a cytotoxic agent, an antibody of different specificity or functional fragment thereof, a detectable label or reporter. In an embodiment, the pharmaceutical composition comprises one or more additional prophylactic or therapeutic agents, i.e., agents other than the antibodies or binding proteins of the present disclosure, for treating a LY6G6D-associated disorder. In an embodiment, the additional prophylactic or therapeutic agents are known to be useful for, have been used, or are currently being used in the prevention, treatment, management, or amelioration of, a LY6G6D-associated disorder or one or more symptoms thereof.

[0424] The pharmaceutical compositions comprising the binding proteins of the present disclosure are for use in, but not limited to, diagnosing, detecting, or monitoring a disorder; treating, managing, or ameliorating a disorder or one or more symptoms thereof; and / or research. In some embodiments, the composition may further comprise a carrier, diluent, or excipient. An excipient or carrier is generally any compound or combination of compounds that provides a desired feature to a composition other than that of the primary active ingredient (i.e., other than an antibody, functional portion thereof, or binding protein of the present disclosure) .

[0425] The present disclosure further provides pharmaceutical combination comprising the binding proteins (e.g., the anti-LY6G6D antibody or an antigen-binding fragment thereof of the disclosure, or the bispecific or multi-specific binding protein, including FIT-Ig binding proteins or MAT-Fab binding proteins of the present disclosure) according to the present disclosure and one or more additional prophylactic or therapeutic agents, i.e., agents other than the antibodies or binding proteins of the present disclosure, for treating a LY6G6D-associated disorder. In an embodiment, the additional prophylactic or therapeutic agents are known to be useful for, have been used, or are currently being used in the prevention, treatment, management, or amelioration of, a LY6G6D-associated disorder or one or more symptoms thereof.

[0426] The “LY6G6D-associated disorder” is defined elsewhere herein, such as in Section VII.

[0427] VII. Medical Uses

[0428] In a further aspect, the present disclosure provides the binding proteins (e.g., the anti-LY6G6D antibody or an antigen-binding fragment thereof of the present disclosure, or the bispecific or multi-specific binding protein, including FIT-Ig binding proteins or MAT-Fab binding proteins of the present disclosure) according to the present disclosure for use as medicament, or for use in manufacture of a medicament, preferably the medicament is for treating or preventing a LY6G6D-associated disorder.

[0429] In another further aspect, the present disclosure provides methods for treating a LY6G6D-associated disorder in a subject in need thereof, the method comprising administering to the subject the binding proteins (e.g., the anti-LY6G6D antibody or an antigen-binding fragment thereof of the present disclosure, or the bispecific or multi-specific binding protein, including FIT-Ig binding proteins or MAT-Fab binding proteins of the present disclosure) according to the present disclosure.

[0430] In another embodiment, the present disclosure provides use of the binding proteins (e.g., the anti-LY6G6D antibody or an antigen-binding fragment thereof of the present disclosure, or the bispecific or multi-specific binding protein, including FIT-Ig binding proteins or MAT-Fab binding proteins of the present disclosure) according to the present disclosure in the treatment of a LY6G6D-associated disorder.

[0431] In another embodiment, the present disclosure provides use of the binding proteins (e.g., the anti-LY6G6D antibody or an antigen-binding fragment thereof of the present disclosure, or the bispecific or multi-specific binding protein, including FIT-Ig binding proteins or MAT-Fab binding proteins of the present disclosure) according to the present disclosure in the manufacture of a composition or a medicament for the treatment of a LY6G6D-associated disorder.

[0432] In another embodiment, the present disclosure provides the binding proteins (e.g., the anti-LY6G6D antibody or an antigen-binding fragment thereof of the present disclosure, or the bispecific or multi-specific binding protein, including FIT-Ig binding proteins or MAT-Fab binding proteins of the present disclosure) according to the present disclosure for use in the treatment of a LY6G6D-associated disorder.

[0433] In some embodiments, the LY6G6D-associated disorder is a disorder in which LY6G6D activity is detrimental. In one embodiment, the LY6G6D-associated disorder is a condition where LY6G6D-mediated signaling activity is associated or detrimental (e.g., a LY6G6D positive solid tumor) in a subject in need thereof.

[0434] In some embodiments, LY6G6D-associated disorder includes various hematopoietic and solid malignancies expressing LY6G6D on the cell surface of the malignant cells. In another embodiment, the binding protein inhibits the growth or survival of the malignant cells. In another embodiment, the binding protein reduces the tumor burden.

[0435] In some embodiments, the disorders which can be treated with the binding protein according to the present disclosure is cancer, e.g., solid or hematopoietic cancer. In one embodiment, said cancer is a cancer typically responsive to immunotherapy. In another embodiment, said cancer is a cancer that has not been associated with immunotherapy. In another embodiment, said cancer is a cancer that is a refractory or a recurring malignancy. In another embodiment, the cancer is a LY6G6D-positive cancer. In another embodiment, the cancer is colorectal cancer.

[0436] “LY6G6D-positive cancer” herein refers to a cancer wherein the tumor cells or tumor tissues express LY6G6D, or express higher LY6G6D, e.g., compared to normal cells or tissues adjacent to the tumor cells or tissues in the same subject, or compared to compared to normal cells or tissues in a heathy subject.

[0437] Methods of treatment described herein may further comprise administering to a subject in need thereof, of additional active ingredient, which is suitably present in combination with the present antibody or binding protein for the prevention or treatment purpose intended, for example, another drug having ant-tumor activity. In some embodiments, such an additional active ingredient includes, but is not limited to, a prophylactic and / or therapeutic agent, such as an anti-tumor drug, a cytotoxic agent, an antibody of different specificity or functional fragment thereof. In an embodiment, the additional prophylactic or therapeutic agents are for example agents other than the antibodies or binding proteins of the present disclosure, for treating a LY6G6D-associated disorder. In an embodiment, the additional prophylactic or therapeutic agents are known to be useful for, have been used, or are currently being used in the prevention, treatment, management, or amelioration of, a LY6G6D-associated disorder or one or more symptoms thereof.

[0438] In a method of treatment of the present disclosure, the additional active ingredient may be incorporated into a composition comprising the binding protein of the present disclosure, and the composition administered to a subject in need of treatment. In another embodiment, a method of treatment of the present disclosure may comprise a step of administering to a subject in need of treatment the binding protein described herein and a separate step of administering the additional active ingredient to the subject before, concurrently, or after the step of administering to the subject an antibody or binding protein of the present disclosure.

[0439] VIII. Specific embodiments

[0440] 1. An isolated antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to LY6G6D, comprising a set of six CDRs, CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2, and CDR-L3, wherein:

[0441] the CDR-H1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4;

[0442] the CDR-H2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 or 49;

[0443] the CDR-H3 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6;

[0444] the CDR-L1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, 50, 51 or 52;

[0445] the CDR-L2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8; and

[0446] the CDR-L3 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9;

[0447] optionally wherein the CDRs are defined according to Kabat numbering.

[0448] 2. An isolated antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to LY6G6D, comprising a set of six CDRs, CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2, and CDR-L3, wherein the CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 and CDR-L3 respectively comprises or consists of:

[0449] (ix) SEQ ID NO: 4, 5, 6, 7, 8, and 9;

[0450] (x) SEQ ID NO: 4, 49, 6, 7, 8, and 9;

[0451] (xi) SEQ ID NO: 4, 5, 6, 50, 8, and 9;

[0452] (xii) SEQ ID NO: 4, 49, 6, 50, 8, and 9;

[0453] (xiii) SEQ ID NO: 4, 5, 6, 51, 8, and 9;

[0454] (xiv) SEQ ID NO: 4, 49, 6, 51, 8, and 9;

[0455] (xv) SEQ ID NO: 4, 5, 6, 52, 8, and 9; or

[0456] (xvi) SEQ ID NO: 4, 49, 6, 52, 8, and 9.

[0457] 3. The isolated antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to LY6G6D, wherein the CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 and CDR-L3 respectively comprises or consists of the amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 4, 49, 6, 52, 8, and 9.

[0458] 4. The isolated antibody or antigen-binding fragment of anyone of embodiments 1 to 3, wherein the antibody comprises a variable heavy chain domain VH and a variable light chain domain VL, wherein:

[0459] the VH domain comprises an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 2, and 21-26, or an amino acid sequence having at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%or 99%identity with any one of SEQ ID NO: 2, and 21-26;

[0460] and / or

[0461] the VL domain comprises an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 3, and 27-33 or an amino acid sequence having at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%or 99%identity with any one of SEQ ID NO: 3, and 27-33.

[0462] 5. The isolated antibody or antigen-binding fragment of anyone of embodiments 1 to 4, wherein the antibody comprises a combination of VH and VL sequences selected from the group consisting of:

[0463] 6. The isolated antibody or antigen-binding fragment of anyone of embodiments 1 to 4, wherein the antibody comprises a combination of VH sequence comprising or consisting of the amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 24; and the VL sequence comprising or consisting of the amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 33.

[0464] 7. The isolated antibody or antigen-binding fragment of any one of embodiments 1-7, wherein:

[0465] the antibody further comprises a heavy chain constant region CH, derived from a heavy chain constant region of (human) IgG1, IgG2, IgG3 or IgG4, optionally a heavy chain constant region of (human) IgG1, further optionally, the heavy chain constant region CH comprises:

[0466] (i) an amino acid sequence having at least 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%or 99%identity to the sequence selected from SEQ ID NO: 18, 43 or 44; or

[0467] (ii) an amino acid sequence selected from SEQ ID NO: 18, 43 or 44;and / or

[0468] the antibody further comprises a light chain constant region CL, derived from a (human) lambda or kappa light chain constant region, optionally a kappa light chain constant region, further optionally, the CL comprises:

[0469] (i) an amino acid sequence having at least 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%or 99%identity to an amino acid sequence of SEQ ID NO: 20; or

[0470] (ii) an amino acid sequence of SEQ ID NO: 20.

[0471] 8. The isolated antibody or antigen-binding fragment of any one of embodiments 1-7, wherein the antibody further comprises a heavy chain constant region CH comprising or consisting of the amino acid sequence selected from SEQ ID NO: 18, 43 or 44 and a light chain constant region CL comprising or consisting of SEQ ID NO: 20.

[0472] 9. The isolated antibody or antigen-binding fragment of any one of embodiments 1-8, wherein the antibody is a chimeric antibody or a humanized antibody.

[0473] 10. The isolated antibody or antigen-binding fragment of any one of embodiments 1-9, wherein the antigen binding fragment is selected from Fv, Fab, Fab’ , Fab’ -SH, F (ab’ ) 2; diabody; and single-chain antibody molecule (e.g., scFv) .

[0474] 11. A bispecific binding protein that specifically binds to LY6G6D and CD3, comprising a LY6G6D-binding region, and a CD3-binding region, wherein

[0475] the LY6G6D-binding region comprises a set of six CDRs, CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2, and CDR-L3 as defined in anyone of embodiments 1 to 3; or the LY6G6D-binding region comprises a VH domain comprising CDR-H1, CDR-H2, and CDR-H3 and a VL domain comprising CDR-L1, CDR-L2, and CDR-L3, and wherein the CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2, and CDR-L3 are defined in anyone of embodiments 1 to 3;

[0476] the LY6G6D-binding region comprises a VH domain and a VL domain as defined in anyone of embodiments 4-6, or

[0477] the LY6G6D-binding region is an antigen-binding fragment of any one of embodiments 1 to 10.

[0478] 12. The bispecific binding protein of claim 11, wherein the LY6G6D-binding region is an Fab fragment.

[0479] 13. The bispecific binding protein of claim 11 or 12, wherein the CD3-binding region comprises a set of six CDRs, CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2, and CDR-L3, wherein:

[0480] the CDR-H1 comprises or consists of the sequence of SEQ ID NO: 12,

[0481] the CDR-H2 comprises or consists of the sequence of SEQ ID NO: 13,

[0482] the CDR-H3 comprises or consists of the sequence of SEQ ID NO: 14,

[0483] the CDR-L1 comprises or consists of the sequence of SEQ ID NO: 15,

[0484] the CDR-L2 comprises or consists of the sequence of SEQ ID NO: 16, and

[0485] the CDR-L3 comprises the sequence of SEQ ID NO: 17;

[0486] optionally wherein the CDRs are defined according to Kabat numbering.

[0487] 14. The bispecific binding protein of anyone of embodiments 11 to 13, wherein the CD3-binding region comprises a heavy chain variable domain VH and a light chain variable domain VL, wherein:

[0488] the VH domain comprises the sequence of SEQ ID NO: 10, or a sequence having at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or more identity with SEQ ID NO: 10, and

[0489] the VL domain comprises the sequence of SEQ ID NO: 11, or a sequence having at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or more identity with SEQ ID NO: 11.

[0490] 15. The bispecific binding protein of anyone of embodiments 11 to 14, wherein the CD3-binding region comprises a heavy chain variable domain VH and a light chain variable domain VL, wherein

[0491] the VH domain comprises or consists of the sequence of SEQ ID NO: 10, and the VL domain comprises or consists of the sequence of SEQ ID NO: 11.

[0492] 16. The bispecific binding protein of anyone of embodiments 11 to 15, wherein the CD3-binding region is an Fab fragment.

[0493] 17. The bispecific binding protein of any one of embodiments 11 to 16, comprising a first polypeptide chain, a second polypeptide chain and a third polypeptide chain, wherein

[0494] the first polypeptide chain comprises or consists of, from amino terminus to carboxyl terminus, VLLY6G6D-CL-VHCD3-CH1-Fc wherein CL is directly fused to VHCD3,

[0495] the second polypeptide chain comprises or consists of, from amino terminus to carboxyl terminus, VHLY6G6D-CH1; and

[0496] the third polypeptide chain comprises or consists of, from amino terminus to carboxyl terminus, VLCD3-CL;

[0497] wherein VL is a light chain variable domain, CL is a light chain constant domain, VH is a heavy chain variable domain, CH1 is a heavy chain constant domain 1, Fc is an immunoglobulin Fc region, for example, the Fc of IgG1 (for instance, the Fc comprising, from amino terminus to carboxyl terminus, hinge-CH2-CH3) ,

[0498] wherein VLLY6G6D represents light chain variable domain of LY6G6D-binding region, and VHLY6G6D represents heavy chain variable domain of LY6G6D-binding region; and wherein VLCD3 represents light chain variable domain of CD3-binding region, and VHCD3 represents heavy chain variable domain of CD3-binding region;

[0499] wherein VLLY6G6D-CL pairs with VHLY6G6D-CH1 to form a FabLY6G6D that specifically binds LY6G6D, and VLCD3-CL pairs with VHCD3-CH1 to form a FabCD3 that specifically binds CD3,

[0500] wherein two of the first polypeptide chains, two of the second polypeptide chains, and two of the third polypeptide chains are associated to form a FIT-Ig binding protein.

[0501] 18. The bispecific binding protein of any one of embodiments 11 to 16, comprising a first polypeptide chain, a second polypeptide chain and a third polypeptide chain, wherein

[0502] the first polypeptide chain comprises or consists of, from amino terminus to carboxyl terminus, VLCD3-CL-VHLY6G6D-CH1-Fc wherein CL is directly fused to VHLY6G6D,

[0503] the second polypeptide chain comprises or consists of, from amino terminus to carboxyl terminus, VHCD3-CH1; and

[0504] the third polypeptide chain comprises or consists of, from amino terminus to carboxyl terminus, VLLY6G6D-CL;

[0505] wherein VL is a light chain variable domain, CL is a light chain constant domain, VH is a heavy chain variable domain, CH1 is a heavy chain constant domain 1, Fc is an immunoglobulin Fc region, for example, the Fc of IgG1 (for instance, the Fc comprising, from amino terminus to carboxyl terminus, hinge-CH2-CH3) ,

[0506] wherein VLLY6G6D represents light chain variable domain of LY6G6D-binding region, and VHLY6G6D represents heavy chain variable domain of LY6G6D-binding region; and

[0507] wherein VLCD3 represents light chain variable domain of CD3-binding region, and VHCD3 represents heavy chain variable domain of CD3-binding region;

[0508] wherein VLLY6G6D-CL pairs with VHLY6G6D-CH1 to form a FabLY6G6D that specifically binds LY6G6D, and VLCD3-CL pairs with VHCD3-CH1 to form a FabCD3 that specifically binds CD3,

[0509] wherein two of the first polypeptide chains, two of the second polypeptide chains, and two of the third polypeptide chains are associated to form a FIT-Ig binding protein.

[0510] 19. The bispecific binding protein of claim 17 or 18, wherein the Fc is a human IgG Fc, e.g., human IgGl Fc, human IgG2 Fc, human IgG3 or human IgG4 Fc,

[0511] optionally, the Fc comprises a mutation that reduces binding to Fcγ receptors, such as a LALA mutation of L234A / L235A, and / or a mutation that results in increased serum half-life, such as a YTE mutation of M252Y / S254T / T256E;

[0512] optionally, the Fc comprises:

[0513] (i) the amino acid sequence selected from SEQ ID NO: 45, 46, and 47;

[0514] (ii) an amino acid sequence having at least 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or more identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 45, 46, or 47;

[0515] (iii) an amino acid sequence having at least 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or more identity to SEQ ID NO: 46, and comprises a mutation of L234A / L235A; or

[0516] (iv) an amino acid sequence having at least 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or more identity to SEQ ID NO: 47, and comprises mutations of M252Y / S254T / T256E and L234A / L235A.

[0517] 20. The bispecific binding protein of anyone of embodiments 17 to 20, wherein the Fc is a human IgG Fc and comprises mutations of M252Y / S254T / T256E and L234A / L235A; optionally, the Fc comprises or consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 47.

[0518] 21. The bispecific binding protein of any one of embodiments 17 to 20, comprising a first polypeptide chain, a second polypeptide chain, and a third polypeptide chain, wherein:

[0519] - the first polypeptide chain comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 34, 37, 39, or 40, or a sequence having at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or more identity therewith,

[0520] - the second polypeptide chain comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 35 or 38, or a sequence having at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or more identity therewith, and

[0521] - the third polypeptide chain comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 36, or a sequence having at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or more identity therewith;

[0522] optionally,

[0523] - the first polypeptide chain comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 34, 37, 39, or 40,

[0524] - the second polypeptide chain comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 35 or 38, and

[0525] - the third polypeptide chain comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 36.

[0526] 22. The bispecific binding protein of any one of embodiments 17 to 21, comprising a first polypeptide chain, a second polypeptide chain, and a third polypeptide chain, wherein:

[0527] - the first polypeptide chain comprises or consists of an amino acid sequence of SEQ ID NO: 37, the second polypeptide chain comprises or consists of an amino acid sequence of SEQ ID NO: 38, and the third polypeptide chain comprises or consists of an amino acid sequence of SEQ ID NO: 36;

[0528] - the first polypeptide chain comprises or consists of an amino acid sequence of SEQ ID NO: 39, the second polypeptide chain comprises or consists of an amino acid sequence of SEQ ID NO: 35, and the third polypeptide chain comprises or consists of an amino acid sequence of SEQ ID NO: 36;

[0529] - the first polypeptide chain comprises or consists of an amino acid sequence of SEQ ID NO: 39, the second polypeptide chain comprises or consists of an amino acid sequence of SEQ ID NO: 38, and the third polypeptide chain comprises or consists of an amino acid sequence of SEQ ID NO: 36;

[0530] - the first polypeptide chain comprises or consists of an amino acid sequence of SEQ ID NO: 40, the second polypeptide chain comprises or consists of an amino acid sequence of SEQ ID NO: 35, and the third polypeptide chain comprises or consists of an amino acid sequence of SEQ ID NO: 36; or

[0531] - the first polypeptide chain comprises or consists of an amino acid sequence of SEQ ID NO: 40, the second polypeptide chain comprises or consists of an amino acid sequence of SEQ ID NO: 38, and the third polypeptide chain comprises or consists of an amino acid sequence of SEQ ID NO: 36.

[0532] 23. The bispecific binding protein of any one of embodiments 11 to 16, comprising first, second, third and fourth polypeptide chains, wherein

[0533] the first polypeptide chain comprises or consists of, from amino terminus to carboxyl terminus, VLLY6G6D-CL-VHCD3-CH1-Fc1 wherein CL is directly fused to VHCD3;

[0534] the second polypeptide chain comprises or consists of, from amino terminus to carboxyl terminus, VHLY6G6D-CH1;

[0535] the third polypeptide chain comprises or consists of, from amino terminus to carboxyl terminus, VLCD3-CL; and

[0536] the fourth polypeptide chain is Fc2;

[0537] wherein VL is a light chain variable domain, CL is a light chain constant domain, VH is a heavy chain variable domain, CH1 is a heavy chain constant domain 1, Fc1 and Fc2 each is an immunoglobulin Fc region, for example, the Fc of IgG1 (for instance, the Fc comprising, from amino terminus to carboxyl terminus, hinge-CH2-CH3) ,

[0538] wherein VLLY6G6D represents light chain variable domain of LY6G6D-binding region, and VHLY6G6D represents heavy chain variable domain of LY6G6D-binding region; and wherein VLCD3 represents light chain variable domain of CD3-bindign region, and VHCD3 represents heavy chain variable domain of CD3-binding region,

[0539] wherein VLLY6G6D-CL pairs with VHLY6G6D-CH1 to form a FabLY6G6D that specifically binds LY6G6D, and VLCD3-CL pairs with VHCD3-CH1 to form a FabCD3 that specifically binds CD3,

[0540] Fc1 and Fc2 are different and form a dimer; and

[0541] wherein the first polypeptide chain, the second polypeptide chain, the third polypeptide chain and the fourth polypeptide chain are associated to form a MAT-Fab binding protein.

[0542] 24. The bispecific binding protein of any one of embodiments 11 to 16, comprising first, second, third and fourth polypeptide chains, wherein

[0543] the first polypeptide chain comprises or consists of, from amino terminus to carboxyl terminus, VLCD3-CL-VHLY6G6D-CH1-Fc1 wherein CL is directly fused to VHLY6G6D;

[0544] the second polypeptide chain comprises or consists of, from amino terminus to carboxyl terminus, VHCD3-CH1;

[0545] the third polypeptide chain comprises or consists of, from amino terminus to carboxyl terminus, VLLY6G6D-CL; and

[0546] the fourth polypeptide chain is Fc2;

[0547] wherein VL is a light chain variable domain, CL is a light chain constant domain, VH is a heavy chain variable domain, CH1 is a heavy chain constant domain 1, Fc1 and Fc2 each is an immunoglobulin Fc region, for example, the Fc of IgG1 (for instance, the Fc comprising, from amino terminus to carboxyl terminus, hinge-CH2-CH3) ,

[0548] wherein VLLY6G6D represents light chain variable domain of LY6G6D-binding region, and VHLY6G6D represents heavy chain variable domain of LY6G6D-binding region; and wherein VLCD3 represents light chain variable domain of CD3-bindign region, and VHCD3 represents heavy chain variable domain of CD3-binding region,

[0549] wherein VLLY6G6D-CL pairs with VHLY6G6D-CH1 to form a FabLY6G6D that specifically binds LY6G6D, and VLCD3-CL pairs with VHCD3-CH1 to form a FabCD3 that specifically binds CD3,

[0550] Fc1 and Fc2 are different and form a dimer; and

[0551] wherein the first polypeptide chain, the second polypeptide chain, the third polypeptide chain and the fourth polypeptide chain are associated to form a MAT-Fab binding protein.

[0552] 25. The bispecific binding protein of claim 23 or 24, wherein the Fc1 or Fc2 each is a human IgG Fc, e.g., human IgGl Fc, human IgG2 Fc, human IgG3 or human IgG4 Fc, wherein

[0553] 1) Fc1 comprises mutation (s) to form a structural knob, and Fc2 comprises mutation (s) to form a complementary structural hole to favor dimerization of Fc1 andFc2; or

[0554] 2) Fc1 comprises mutation (s) to form a structural hole, and Fc2 comprises mutation (s) to form a complementary structural knob to favor dimerization of Fc1 andFc2,

[0555] optionally, the “knob” mutation (s) is selected from a substitution of T366Y or T366W, and the complementary “hole” mutation (s) is selected from Y407T substitution or a combination of T366S, L368A and Y407V;

[0556] optionally, Fc1 comprises a substitution T366W and an introduced cysteine residue S354C, and Fc2 comprises T366S, L368A and Y407V substitutions and an introduced cysteine residue Y349C;

[0557] optionally, Fc1 or Fc2 each further comprises a mutation that reduces binding to Fcγreceptors, such as a LALA mutation of L234A / L235A; optionally, each of the Fc1 or Fc2 comprises an amino acid sequence having at least 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or more identity to the amino acid sequence SEQ ID NO: 45 or 46.

[0558] 26. The bispecific binding protein of anyone of embodiments 23 to 25, wherein Fc1 comprises an amino acid sequence having at least 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or more identity to SEQ ID NO: 48 and comprises S354C and T366W with L234A and L235A substitutions; and Fc2 comprises an amino acid sequence having at least 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or more identity to SEQ ID NO: 42 and comprises Y349C, T336S, L368A and Y407V with L234A and L235A substitutions; or vice versa;

[0559] preferably, the Fc1 comprises the amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 48, and Fc2 comprises the amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 48; or vice versa.

[0560] 27. The bispecific binding protein of any one of embodiments 17 to 26, wherein CH1 is a human IgG1, IgG2, IgG3 or IgG4 constant CH1 domain, for example, IgG1 constant domain 1, optionally, CH1 comprises the sequence of SEQ ID NO: 19, or a sequence having at least 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or more identity with SEQ ID NO: 19.

[0561] 28. The bispecific binding protein of any one of embodiments 17 to 27, wherein CL is a human constant kappa or lambda CL domain, for example, Kappa CL domain, optionally CL comprises the sequence of SEQ ID NO: 20, or a sequence having at least 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or more identity with SEQ ID NO: 20.

[0562] 29. The bispecific binding protein of any one of embodiments 17 to 28; wherein the VHLY6G6D comprises the CDR-H1, CDR-H2, and CDR-H3, and the VLLY6G6D comprises the CDR-L1, CDR-L2, and CDR-L3, wherein the CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 and CDR-L3 respectively comprises or consists of the amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 4, 49, 6, 52, 8, and 9.

[0563] 30. The bispecific binding protein of anyone of any one of embodiments 17 to 29; wherein the VHLY6G6D comprises or consists of the amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 24; and the VLLY6G6D sequence comprises or consists of the amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 33.

[0564] 31. The bispecific binding protein of anyone of embodiments 17 to 30; wherein the VHCD3 comprises the CDR-H1, CDR-H2, and CDR-H3, and the VLCD3 comprises the CDR-L1, CDR-L2, and CDR-L3, wherein

[0565] the CDR-H1 comprises or consists of the sequence of SEQ ID NO: 12,

[0566] the CDR-H2 comprises or consists of the sequence of SEQ ID NO: 13,

[0567] the CDR-H3 comprises or consists of the sequence of SEQ ID NO: 14,

[0568] the CDR-L1 comprises or consists of the sequence of SEQ ID NO: 15,

[0569] the CDR-L2 comprises or consists of the sequence of SEQ ID NO: 16, and

[0570] the CDR-L3 comprises the sequence of SEQ ID NO: 17.

[0571] 32. The bispecific binding protein of anyone of embodiments 17 to 31; wherein the VHCD3 domain comprises or consists of the sequence of SEQ ID NO: 10, and the VLCD3 domain comprises or consists of the sequence of SEQ ID NO: 11.

[0572] 33. The bispecific binding protein of any one of embodiments 23 to 32, comprising a first polypeptide chain, a second polypeptide chain, and a third polypeptide chain and a fourth polypeptide, wherein:

[0573] - the first polypeptide chain comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 41, or a sequence having at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or more identity therewith,

[0574] - the second polypeptide chain comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 35, or a sequence having at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or more identity therewith,

[0575] - the third polypeptide chain comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 36, or a sequence having at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or more identity therewith; and

[0576] - the fourth polypeptide chain comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 42, or a sequence having at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or more identity therewith;

[0577] optionally,

[0578] - the first polypeptide chain comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 41,

[0579] - the second polypeptide chain comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 35,

[0580] - the third polypeptide chain comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 36; and

[0581] - the fourth polypeptide chain comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 42.

[0582] 34. A nucleic acid molecule encoding the antibody or antigen-binding fragment of any one of embodiments 1 to 10, or the bispecific binding protein of any one of embodiments 11-33.

[0583] 35. A vector comprising the nucleic acid molecule of claim 34.

[0584] 36. A host cell comprising the nucleic acid molecule of claim 34, or the vector of claim 35.

[0585] 37. A method of preparing the antibody or antigen-binding fragment of any one of embodiments 1 to 10, or the bispecific binding protein of any one of embodiments 11-33, comprising:

[0586] culturing the host cell of claim 36 under conditions that allow the production of the antibody, antigen-binding fragment, or bispecific binding protein; and

[0587] recovering the antibody, antigen-binding fragment, or bispecific binding protein from the culture.

[0588] 38. A pharmaceutical composition comprising the antibody or antigen-binding fragment of any one of embodiments 1 to 10, or the bispecific binding protein of any one of embodiments 11-33, the nucleic acid of claim 34, the vector of claim 35, or the host cell of claim 36.

[0589] 39. A pharmaceutical combination comprising the antibody or antigen-binding fragment of any one of embodiments 1 to 10, or the bispecific binding protein of any one of embodiments 11-33, the nucleic acid of claim 34, the vector of claim 35, or the host cell of claim 36 and one or more additional prophylactic or therapeutic agents for treating a disorder associated with LY6G6D.

[0590] 40. A method of treating or preventing a LY6G6D-associated disorder, comprising administering the antibody or antigen-binding fragment of any one of embodiments 1 to 10, or the bispecific binding protein of any one of embodiments 11-33, the nucleic acid of claim 34, the vector of claim 35, the host cell of claim 36, the pharmaceutical composition of claim 38 or the pharmaceutical combination of claim 39.

[0591] 41. Use of the antibody or antigen-binding fragment of any one of embodiments 1 to 10, or the bispecific binding protein of any one of embodiments 11-33, the nucleic acid of claim 34, the vector of claim 35, the host cell of claim 36, the pharmaceutical composition of claim 38 or the pharmaceutical combination of claim 39 in the manufacture of a medicament for treating or preventing a LY6G6D-associated disorder.

[0592] 42. The antibody or antigen-binding fragment of any one of embodiments 1 to 10, or the bispecific binding protein of any one of embodiments 11-33, the nucleic acid of claim 34, the vector of claim 35, the host cell of claim 36, the pharmaceutical composition of claim 38 or the pharmaceutical combination of claim 39, for use in treating or preventing a LY6G6D-associated disorder.

[0593] 43. The method according to claim 40, the use according to claim 41 or the antibody or antigen-binding fragment, the bispecific binding protein, the nucleic acid, the vector, the host cell, the pharmaceutical composition or the pharmaceutical combination for use according to claim 42, wherein the LY6G6D-associated disorder is a hematopoietic and solid malignancy expressing LY6G6D on the cell surface of the malignant cells.

[0594] 44. The method according to claim 40 or 43, the use according to claim 41 or 43 or the antibody or antigen-binding fragment, the bispecific binding protein, the nucleic acid, the vector, the host cell, the pharmaceutical composition or the pharmaceutical combination for use according to claim 42 or 43, wherein the LY6G6D-associated disorder is a disorder in which LY6G6D activity is detrimental.

[0595] 45. The method according to anyone of embodiments 40 and 43-44, the use according to anyone of embodiments 41 and 43-44 or the antibody or antigen-binding fragment, the bispecific binding protein, the nucleic acid, the vector, the host cell, the pharmaceutical composition or the pharmaceutical combination for use according to anyone of embodiments 42-44, wherein the LY6G6D-associated disorder is a condition where LY6G6D-mediated signaling activity is associated or detrimental.

[0596] 46. The method according to anyone of embodiments 40 and 43-45, the use according to anyone of embodiments 41 and 43-45 or the antibody or antigen-binding fragment, the bispecific binding protein, the nucleic acid, the vector, the host cell, the pharmaceutical composition or the pharmaceutical combination for use according to anyone of embodiments 42-45, wherein the LY6G6D-associated disorder is LY6G6D-positive cancer, preferably LY6G6D-positive solid or hematopoietic cancer.

[0597] 47. The method according to anyone of embodiments 40 and 43-46, the use according to anyone of embodiments 41 and 43-46 or the antibody or antigen-binding fragment, the bispecific binding protein, the nucleic acid, the vector, the host cell, the pharmaceutical composition or the pharmaceutical combination for use according to anyone of embodiments 42-46, wherein the LY6G6D-associated disorder is a colorectal cancer.

[0598] Examples

[0599] Generally, in the present disclosure, conventional hybridoma technology was used to generate de-novo anti-LY6G6D monoclonal antibodies, which were later humanized using CDR-grafting method. Novel LY6G6D×CD3 bispecific antibodies were constructed based on FIT-Ig (WO2015103072) .

[0600] Example 1: Generation of anti-LY6G6D antibodies

[0601] Anti-LY6G6D antibodies were obtained by immunizing Balb / c mice with a human anti-LY6G6D (NP_067069.2) encoded mRNA-LNP complex. The sequence of HUMAN_LY6G6D_CDS is shown as follows:

[0602] >HUMAN_LY6G6D_CDS

[0603] Mice were immunized at 2-week intervals and monitored for serum titer once a week after the second injection. After 2 immunizations, splenocytes were harvested and fused with mouse myeloma cells to form hybridoma cell lines by conventional electrofusion technology. Hybridoma cells were plated in 384-well plates containing selection media with hypoxanthine-aminopterin-thymidine (HAT) at a density of 2.5×104 cells per well. Seven to ten days later, supernatants of each well were screened against recombinant human anti-LY6G6D protein by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) or human anti-LY6G6D-expressing cell lines by flowcytometry. Binding positive hybridoma clones that produce specific anti-LY6G6D antibodies were then cherry picked and expanded for following immunoglobulin variable gene (IgV) sequencing.

[0604] To amplify heavy and light chain variable regions, total RNA of each hybridoma clone was isolated from more than 5×106 cells with TRIzolTM RNA extraction reagent (Invitrogen, Cat. #15596018) . cDNA was synthesized using an InvitrogenTM SuperScriptTM III First-Strand Synthesis SuperMix kit (ThermoFisher Scientific Cat. #18080) following manufacturer's instructions, and the cDNAs encoding the variable regions for light and heavy mouse immunoglobulin chains were amplified using a MilliporeSigmaTM NovagenTM Mouse Ig-Primer Set (Fisher Scientific Cat. #698313) . PCR products were analyzed by electrophoresis on a 1.2%agarose gel with SYBRTM Safe DNA gel stain (ThermoFisher Cat. #S33102) . DNA fragments with correct size were purified using a  Gel and PCR Clean-up kit (Macherey-Nagel, Cat. #740609) according to manufacturer's instructions and were subcloned into pMD18-T vector individually. Fifteen colonies from each transformation were selected and sequences of insert fragments were analyzed by DNA sequencing. The protein sequences of murine mAb variable regions were analyzed by sequence homology alignment.

[0605] The variable domain sequence for the selected anti-LY6G6D antibody is set out in Table 1. Complementarity determining regions (CDRs) are underlined based on Kabat numbering.

[0606] Table 1: Amino acid sequences of variable regions of anti-LY6G6D antibody F0926-090

[0607] CDRs according to Kabat numbering underlined.

[0608] Example 2: Construction of LY6G6D×CD3 FIT-Ig bispecific antibodies

[0609] 2.1: Generation of LY6G6D×CD3 chimeric FIT-Ig bispecific antibodies

[0610] A group of FIT-Ig proteins recognizing both human anti-LY6G6D and human CD3 were constructed using selected anti-LY6G6D VH / VL sequences in Table 1, anti-CD3 VH / VL sequences and human constant region sequences in Table 2.

[0611] Table 2: Amino acid sequences of anti-CD3 variable domains and human IgG constant regions

[0612] *CDRs according to Kabat numbering system underlined, Fc mutation in bold italic.

[0613] FIT-Ig molecules were constructed following the general procedures described in PCT Publication No. WO 2015 / 103072. Each FIT-Ig consisted of three polypeptide chains having the following structures:

[0614] Chain #1 (long chain) : VLA-CL-VHB-CH1-hinge-CH2-CH3;

[0615] Chain #2 (short chain 1) : VHA-CH1;

[0616] Chain #3 (short chain 2) : VLB-CL;

[0617] wherein A stands for LY6G6D and B stands for CD3, and VLLY6G6D is the light chain variable domain of antibody recognizing LY6G6D, VHCD3 is the heavy chain variable domain of a antibody recognizing CD3, VLCD3 is the light chain variable domain of a antibody recognizing CD3, VHLY6G6D is the heavy chain variable domain of a antibody recognizing LY6G6D, each CL is a light chain constant domain (SEQ ID NO: 20) , each CH1 is a first heavy chain constant domain (SEQ ID NO: 19) , and CH1-hinge-CH2-CH3 is the C-terminal heavy chain constant region from CH1 through the terminus of the Fc region (SEQ ID NO: 18) .

[0618] To construct the long chain vector, cDNA encoding the VLLY6G6D-CL-VHCD3 segment was synthesized de novo and inserted into the multiple cloning site (MCS) of a vector (pcDNA3.1) including coding sequences for human CH1-hinge-CH2-CH3. In the resulting vector, the MCS sequence was eliminated during homologous recombination to ensure that all the domain fragments were in the correct reading frame. Similarly, to construct the first and second short chains, VHLY6G6D and VLCD3 structural genes were de novo synthesized and inserted into the MCS of the appropriate vectors including coding segments for human CH1 and CL domains, respectively. Therefore, 3 plasmids encoding each chains were constructed. Then the 3 plasmids were co-transfected into Expi293 cells. After approximately six days of post-transfection cell culture, the supernatants were harvested and subjected to Protein A affinity chromatography. The composition and purity of the purified antibodies were analyzed by size exclusion chromatography (SEC) . Purified antibody, in PBS, was applied to a TSKgel SuperSW3000, 300×4.6 mm, SEC column (TOSOH) . A DIONEXTM UltiMate 3000 HPLC instrument (Thermo Scientific) was used for SEC using UV detection at 280 nm and 214 nm.

[0619] The pairing of the VH and the VL creating the chimeric LY6G6D×CD3 FIT-Ig binding proteins is listed in Table 3.

[0620] Table 3: Production of FIT-Ig proteins with anti-LY6G6D and anti-CD3 VH / VLs

[0621] 2.2: Cell surface binding of LY6G6D×CD3 chimeric bispecific antibodies

[0622] Cell surface binding activity of chimeric bispecific LY6G6D×CD3 FIT-Ig antibodies were measured with human anti-LY6G6D transfected CHO cell line (CHOK1 / huLY6G6D, human LY6G6D gene was cloned into lenti-CMV-MCS-PGK-Puro vector, and CHOK1 cell was infected by packaged lentivirus vector) .

[0623] Briefly, 2×105 cells per well were seeded into a 96-well plate. Plate was centrifuged at 400g for 5 minutes and supernatants were discarded. 100 μL of serial diluted antibodies were added into each well and mixed with the cells. After 40 minutes incubation at 4℃, the plate was washed 2-3 times to remove excess antibodies. Fluorochrome-conjugated goat anti-human IgG antibody was then added and incubated with cells at 4℃ for 30 minutes. After another round of centrifugation and washing, cells were resuspended in flowcytometry buffer and measured with iQue3 (Sartorius) . Median Fluorescence Intensity (MFI) readouts were plotted against antibody concentrations and analyzed with GraphPad Prism 6.0 software. The results shown in Figure 2 illustrate the binding activities of LY6G6D×CD3 FIT-Ig chimeric bispecific antibodies to LY6G6D-expressing cells. Human IgG1 (hIgG) was used as negative control.

[0624] 2.3: Redirected CD3 activation of LY6G6D×CD3 chimeric bispecific antibodies

[0625] To measure redirected CD3 activation by LY6G6D×CD3 chimeric bispecific FIT-Ig antibodies, a co-cultured NFAT-luciferase reporter gene assay was used. Upon the simultaneous binding of LY6G6D×CD3 bispecific antibody to the human anti-LY6G6D-expressing cells (HT-55 (Cobioer, Cat#CBP60012) , and GP2D (Cobioer, Cat#CBP60010) ) and the human CD3-expressing Jurakt-NFAT-luc cells (Chempartner, Jurkat T cell lines expressing a luciferase reporter driven by an NFAT-response element) , the transcription factor Nuclear factor of activated T-cells (NFAT) of Jurkat-NFAT-luc cells will be activated and upregulate the expression of luciferase, which can be measured with a bioluminescent luciferase assay.

[0626] Briefly, Jurkat-NFAT-luc and LY6G6D-expressing cells were resuspended in assay medium (RPMI1640 plus with 10%FBS) and seeded into 96-well plates (Costar, Cat#3917) at 4×104 cells per well for each. Antibodies were added and mixed with the cells and incubated for 4-6 hours at 37℃. At the end of incubation, reagents of ONE-GloTM luminescence assay kit (Promega, Cat#E6130) were prepared and added into wells according to the manufacturer's instructions. Plates were read for luminescence signals with VarioskanTM LUX microplate reader (ThermoFisher Scientific) .

[0627] As shown in Figure 3, LY6G6D×CD3 bispecific antibodies (FIT1034-10a) promoted more potent activation signal compared to anti-CD3 monoclonal antibody (huEM0006-01-24, variable region sequences as shown in Table 2, constructed following Example 2 of International PCT publication NO. WO2021 / 104371, incorporated herein by reference in its entirety) in both HT-55 and GP2D co-culture assays.

[0628] 2.4: In-vitro killing of LY6G6D×CD3 chimeric bispecific antibodies

[0629] A cocultured HT-55 and primary human T-cells assay was used for the evaluation of in-vitro killing efficacy of LY6G6D×CD3 chimeric bispecific antibodies. Briefly, primary human T cells purified from human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were mixed with HT-55 cells at an Effector to Target (E: T) ratio of 5: 1 (T cells: 1×105 cells per well, HT-55 cells: 2×104 cells per well) and incubated with antibodies for 48h at 37℃. The redirected T-cell cytotoxicity to HT-55 was measured and calculated using  Luminescent cell viability assay (Promega, Cat#G7573) following manufacturer’s instructions.

[0630] As shown in Figure 4, FIT1034-10a exhibited significant killing efficacy against HT-55 cells, while the parental anti-CD3 monoclonal antibody (huEM0006-01-24) showed no killing activity.

[0631] Example 3: Generation and characterization of humanized anti-LY6G6D×CD3 FIT-Ig and MAT-Fab bispecific antibodies

[0632] 3.1: Humanization of anti-LY6G6D antibodies

[0633] The variable region genes of the anti-LY6G6D antibodies were employed for humanization design. In the first step of this process, the amino acid sequences of the VH and VL domains of the anti-LY6G6D antibodies were compared against the available database of human Ig V-gene sequences in order to find the overall best-matching human germline Ig V-gene sequences. Additionally, J-region sequences of the VH or VL was compared against the J-region database to find the human framework having the highest homology to the murine VH and VL regions, respectively. Three-dimensional Fv models of anti-LY6G6D antibodies were then generated to determine if there were any framework positions where mouse amino acids were involved in supporting loop structures or the VH / VL interface. These residues in humanized sequences could be back mutated to mouse residues at the same positions to retain affinity / activity.

[0634] Several desirable back-mutations were indicated for FIT1034-10a-VH / Vκ, and and alternative VH and Vκ designs were constructed as shown in Table 4.

[0635] Table 4: VH / VL humanization and point-mutation design for anti-LY6G6D antibodies

[0636] CDR sequences according to the Kabat numbering system single underlined; framework back-mutations   mutations to avoid deamidation in italic bold.

[0637] 3.2: Construction and expression of LY6G6D×CD3 FIT-Igs

[0638] A group of humanized FIT-Ig proteins recognizing both human anti-LY6G6D and human CD3 were constructed utilizing anti-LY6G6D VH / VL sequences in, anti-CD3 VH / VL sequences, and human constant region sequences in Table 2.

[0639] FIT-Ig molecules were constructed following the general procedures described in PCT Publication WO 2015 / 103072, and the structures were described in Example 2.1.

[0640] The pairing of the VH and the VL creatingd the humanized LY6G6D×CD3 FIT-Ig binding proteins is listed in Table 5.

[0641] To extend half-life of the proteins, the YTE mutation (M252Y / S254T / T256E) was introduced into the Fc region of huFIT1034-10a-18, huFIT1034-10a-18 (GAGA) , huFIT1034-10a-18 (VLGASA) , huFIT1034-10a-18 (GASAGA) , huFIT1034-10a-18 (VLNQ) , and huFIT1034-10a-18 (NQGA) . The full-length sequences of above FIT-Igs are listed in Table 6.

[0642] Recombinant FIT-Ig proteins listed in Table 6 were transiently expressed and purified as described herein. For each FIT-Ig construct, 3 plasmids respectively for the 3 polypeptide chains (as constructed similarly in Example 2.1, except that CH1-hinge-CH2-CH3 has YTE mutation and was represented in SEQ ID NO: 44 ) were co-transfected into Expi293 cells. After approximately six days of post-transfection cell culture, the supernatants were harvested and subjected to Protein A affinity chromatography. The composition and purity of the purified antibodies were analyzed by size exclusion chromatography (SEC) . Purified antibody, in PBS, was applied to a TSKgel SuperSW3000, 300×4.6 mm, SEC column (TOSOH) . A DIONEXTM UltiMate 3000 HPLC instrument (Thermo Scientific) was used for SEC using UV detection at 280 nm and 214 nm. The expression and SEC-HPLC results were shown in Table 9.

[0643] 3.3: Construction of LY6G6D×CD3 humanized MAT-Fab

[0644] An anti-LY6G6D×CD3 humanized MAT-Fab protein was also generated according to the method as described in International publication No. WO2018035084, incorporated by reference herein in its entirety. The obtained protein is named with prefix “MAT” as shown in Table 7 and Figure 1B, and the sequence for the MAT-Fab protein is also provided herein in Table 8.

[0645] Table 7: Production of MAT-Fab bispecific binding protein

[0646] Table 8: Amino acid sequences of LY6G6D×CD3 MAT-Fab

[0647] Variable domains in bold; Fc mutations in bold italic.

[0648] Recombinant MAT-Fab proteins listed in Table 8 were transiently expressed and purified as described herein. For each MAT-Fab construct, 4 plasmids respectively for the 4 polypeptide chains were co-transfected into Expi293 cells. After approximately six days of post-transfection cell culture, the supernatants were harvested and subjected to Protein A affinity chromatography. The composition and purity of the purified antibodies were analyzed by size exclusion chromatography (SEC) . Purified antibody, in PBS, was applied to a TSKgel SuperSW3000, 300×4.6 mm, SEC column (TOSOH) . A DIONEXTM UltiMate 3000 HPLC instrument (Thermo Scientific) was used for SEC using UV detection at 280 nm and 214 nm. The expression and SEC-HPLC results were shown in Table 9.

[0649] The bispecific proteins were assayed for and ranked by dissociation rate constant (koff, "off-rate" ) using an  RED96 biolayer interferometry (Sartorius FortéBio LLC) . Anti-hIgG Fc Capture (AHC) Biosensors (Sartorius) were first exposed to antibody at a concentration of 20 nM for 240 seconds to capture antibody, then dipped into running buffer (1X PBS pH 7.2, 0.05%Tween 20, 0.1%BSA) for 180 seconds to check baseline. Sensors with captured antibody were dipped into recombinant human anti-LY6G6D protein at 1.233 ug / ml for 300 seconds to measure association, followed by dipped into running buffer for 360 seconds to measure dissociation. The association and dissociation curves were fitted to a 1: 1 Langmuir binding model using FortéBio Data Analysis software (Sartorius) . Results are shown in Table 9 below. The off-rate ratios were calculated by the off-rate of antibody to that of chimeric bispecific FIT-Igs, respectively. Lower ratio indicates slower dissociation of the antibody in comparison with the parental chimeric antibodies.

[0650] Table 9: Generation and off-rate ranking of LY6G6D×CD3 bispecific antibodies

[0651] ND: No Data

[0652] Example 4: Binding characterization of humanized LY6G6D×CD3 bispecific antibodies

[0653] 4.1: Binding kinetics

[0654] Binding affinities and kinetics constants of humanized LY6G6D×CD3 FIT-Igs were determined using a grating-coupled interferometry (GCI) based WAVEsystem (Creoptix AG, Switzerland) . Briefly, goat anti-human IgG Fc antibody was immobilized onto a PCP WAVEchip (Creoptix AG) to a density of 6000 pg / mm2 by amine coupling. FIT-Ig was then captured onto the PCP WAVEchip to a density of 350-400 pg / mm2. Recombinant human (Kactusbio, Cat#LYD-HM16D) or cynomolgus monkeys (Kactusbio, Cat#LYD-CM16D) LY6G6D proteins were serial diluted to the concentrations of 1.23 nM, 3.7 nM, 11.11nM, 33.33nM and 100 nM, respectively in kinetics buffer (GE, Cat#BR100669) and injected as analytes at a flow rate of 60 μL / min for the association period. Immediately after the association step, kinetics buffer was injected for 1000s at 60 μL / min for the dissociation period. For the measurement of binding to CD3, recombinant human CD3εδ heterodimers (Kactusbio, CD3-HM105) were injected at concentrations of 0.25 nM, 0.74 nM, 2.22nM, 6.67nM and 20 nM, respectively with association step set for 250s at 80 μL / min and dissociation step for 300s. After each round of association and dissociation, WAVEchip surface was regenerated by injection of Glycine-HCl buffer at pH 1.5 for 120s at a flow rate of 80 μL / min. All sensorgrams were recorded at 25℃ and the data analyzed on the WAVEcontrol (Creoptix AG) . Data were double referenced by subtracting the signals from blank injections and from the reference channel. 1: 1 binding kinetics model or the conformational change model was used for data fitting. Kinetics constants were shown in Table 10.

[0655] Table 10: Binding kinetics of humanized LY6G6D×CD3 bispecific antibodies

[0656] ND=No Data

[0657] 4.2: Cell binding activity

[0658] Cell surface binding activity of humanized LY6G6D×CD3 bispecific antibodies were measured with the same method as described in Example 2.2.

[0659] The results of cell surface binding to CD3-expressing Jurkat cell and LY6G6D-expressing HT-55, LS1034 (ATCC, CRL-2158) and colo320DM (Cobioer, CBP60027) cell lines were shown in Figure 5.

[0660] Example 5: Redirected CD3 activation of humanized LY6G6D×CD3 FIT-Ig bispecific antibodies

[0661] A similar cocultured Jurkat-NFAT-luc reporter gene assay as described in Example 2.3 was used for the characterization for the humanized LY6G6D×CD3 FIT-Igs. In this assay, LY6G6D-expressing tumor cell lines of HT-55, Colo320DM and SW480 (ATCC, CCL-228) were used as the target cells. Tumor independent CD3 activation was tested in the absence of target cells.

[0662] As shown in Figure 6, huFIT1034-10a-18 showed tumor target dependent activation in this reporter gene assay, and all huFIT1034-10a-18 mutants showed similar reporter gene stimulation activity against LY6G6D expressed SW480 tumor cells, while the anti-CD3 monoclonal antibody huEM0006-01-24 showed mild but tumor independent activity.

[0663] Example 6: Redirected T cell cytotoxicity of humanized LY6G6D×CD3 bispecific antibodies

[0664] The tumor cell killing efficacy of humanized LY6G6D×CD3 FIT-Ig was measured using a redirected T-cell cytotoxicity assay. The colorectal cancer cell line HT-55, LS1034, COLO320DM and SW480 were as target cells and human primary T cells as effector cells. For HT-55 and LS1034 cells, a similar method as described in Example 2.4 was used for the coculture assay and cytotoxicity measurement.

[0665] For COLO320DM cells, the endpoint of tumor cells viability was measured with flowcytometry. Briefly, COLO320DM were pre-stained with 0.5uM of CellTraceTM Far Red before seeding into 96-well plates (Corning, Cat#3903) at 2×104 cells per well. T cells were purified from human PBMC with a commercial PBMC isolation kit (EasySepTM, Stemcell Technologies, Cat#17951) and added at 1×105 cells per well. Test antibodies were added and incubated with the mixture of the cells for 48 hours at 37℃. At the end of the coculture, cells were centrifugated and washed with PBS buffer following the addition of Non-Enzymatic Cell Dissociation Solution (GibcoTM, Cat#13151014) at 100 μL / well. After 3 minutes, FACS buffer was used as stop solution and added for 100 μL / well. Plates were then centrifuged at 400g for 5min and mixed with 0.5 ug / mL of the Propidium Iodide (Biolegend, Cat#421301) at 100 μL / well. After a 5 min incubation at room temperature, cells were analyzed with flowcytometry (iQue3, Sartorius) for the count of Far Red positive and PI negative cells (live tumor cells) .

[0666] For SW480 cells, primary human T cells purified from human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were mixed with SW480 cells at an Effector to Target (E: T) ratio of 10: 1 (T cells: 1×105 cells per well, SW480 cells: 1×104 cells per well) and incubated with antibodies for 96h at 37℃. The redirected T-cell cytotoxicity was measured and calculated using  Luminescent cell viability assay (Promega, Cat#G7573) following manufacturer’s instructions.

[0667] The percentage of cytotoxicity was calculated by subtracting from the average live cells count from the wells with no treatment (no-Ab ctrl) and divided by the live cells count of no-Ab ctrl. [Percentage of cytotoxicity = (no-Ab ctrl -Ab-treated)  /  (no-Ab ctrl) × 100%] .

[0668] A reference LY6G6D×CD3 bispecific antibody (R reference) was produced according to the disclosed method and antibody sequences respectively. An irrelevant TCE was also produced according to the disclosed method and used as a negative control.

[0669] As shown in Figure 7, the LY6G6D×CD3 antibodies according to the present disclosure showed potent tumor lysis compared to R reference molecule across the four CRC tumor cell lines. The irrelevant TCE (no binding with LY6G6D) with the same CD3 binding domain showed no killing activities.

[0670] Example 7: Cytokine release from PBMCs treated with LY6G6D×CD3 bispecific antibodies

[0671] The ability of test articles to induce in vitro cytokine release from PBMC was assessed. Cryopreserved PBMC from normal healthy human volunteers were thawed and cultured in RPMI 1640 medium (Gibco RPMI-1640 Medium supplemented with 10%FCS, 100 IU / mL penicillin, 100 pg / mL streptomycin) with viability >85%as determined automated cell counter prior to experiments. PBMCs were seeded at a density of 2×107 cells per well into 96-well-plate, followed by incubation for 48 hours at 37℃, 5%CO2. PBMCs were then re-seeded at a density of 2 × 105 cells per well on a 96 well plate prior to the addition of test antibodies, or controls for 24 hours at 37℃, 5%CO2. Then 96-well plates were centrifuged, supernatant was harvested and detection of IL-2, IL-6, IL-10, TNFα and IFNγwas performed using an antibody capture bead-based kit (LEGENDplexTM HU Th1 Panel (5-plex) w / VbP V02, Biolegend) and flow cytometric analysis.

[0672] Figure 8 shows that huFIT1034-10a-18 and huMAT1034-10a-18 induced much lower cytokines compared to OKT3 (Ultra-LEAFTM Purified anti-human CD3 Antibod, Biolegend, Cat#317326) , while R reference induced significantly higher cytokines of all.

[0673] Example 8: In vivo efficacy evaluation in cell line-derived xenograft model (CDX) with human PBMC engrafted NCG mice

[0674] 8.1: HT-55 tumor volume in human PBMC engrafted NCG mice treated with LY6G6D×CD3 bispecific antibodies

[0675] Anti-tumor efficacy was evaluated in HT-55 human melanoma xenograft model in PBMC engraft NCG mice, which is an immunodeficient strain lacking T cells, B cells and natural killer cell. Female NCG mice aged 8-10 weeks (Gempharmatech) were used for human PBMC reconstitution and HT-55 tumor model establishment. Briefly, the mice received a single intraperitoneal injection of 5×106 human PBMCs. After 2 days, 2×106 HT-55 cells suspended in 0.2ml DPBS containing 50%ABW Matrigel were subcutaneously injected into the right flank of each mouse. 10 days after tumor cell inoculation, huCD45 cells in mouse peripheral blood were detected using FACS, and tumor-bearing mice with tumor size of 78-153 mm3 were selected. Based on the tumor size and huCD45 counts, the selected mice were randomized (blocked randomization) divided into 6 groups of 8 mice each, and treatment was initiated on the same day (Day 0) . Mice were treated once a week for 2 weeks (QW × 2) with 0.1 mg / kg of huFIT1034-10a-18, 0.06 mg / kg of R reference, and DPBS (as vehicle) by intraperitoneal (i.p. ) injection.

[0676] Tumor volumes were measured 2-3 times per week with calipers, and calculated at different time points using the formula: Tumor volume (mm3) = length (mm) × width (mm) 2 × 0.5

[0677] For all groups, percentages of tumor growth inhibition (TGI) of treatment groups were defined as follow:

[0678] All treatment groups were well tolerated (data not shown) . Figure 9 shows the average tumor volumes of mice on different time points. TGI values are 113.55%, and 91.44%for huFIT1034-10a-18, and R reference at Day 14, respectively.

[0679] 8.2: LS1034 tumor volume in human PBMC engrafted NCG mice treated with LY6G6D×CD3 bispecific antibodies

[0680] Anti-tumor efficacy was also evaluated in LS1034 human melanoma xenograft model in PBMC engraft NCG mice, which is an immunodeficient strain lacking T cells, B cells and natural killer cell. Female NCG mice aged 8-10 weeks (Gempharmatech) were used for human PBMC reconstitution and LS1034 tumor model establishment. Briefly, the mice received a single intraperitoneal injection of 5×106 human PBMC. After 3 days, 2×106 LS1034 cells suspended in 0.2ml DPBS containing 50%ABW Matrigel per animal were subcutaneously injected into the right flank of female NCG mice. 10 days after tumor cell inoculation, huCD45 cells in mouse peripheral blood were detected using FACS, and tumor bearing mice with tumor size of 68-174 mm3 were selected. Based on the tumor size and huCD45 counts, the selected mice were randomized (blocked randomization) divided into 3 groups of 10 mice each, and treatment was initiated on the same day (Day 0) . Mice were treated once a week for 2 weeks (QW × 2) with 1 mg / kg of huFIT1034-10a-18, and DPBS (as vehicle) by intraperitoneal (i.p. ) injection.

[0681] Tumor volumes were measured 2-3 times per week with calipers and calculated at different time points using the formula: Tumor volume (mm3) = length (mm) × width (mm) 2 × 0.5

[0682] For all groups, percentages of tumor growth inhibition (TGI) of treatment groups were defined as follow:

[0683] All treatment groups were well tolerated (data not shown) . Figure 10 shows the average tumor volumes of mice on different time points, indicating the inhibition of tumor growth by various treatments. TGI ratio values based on tumor volume were 108.59%for huFIT1034-10a-18 at Day 22.

[0684] 8.3: Colo320DM tumor volume in human PBMC engrafted NCG mice treated with LY6G6D×CD3 bispecific antibodies

[0685] Anti-tumor efficacy was also evaluated in Colo320DM human melanoma xenograft model in PBMC engraft NCG mice, which is an immunodeficient strain lacking T cells, B cells and natural killer cell. Female NCG mice aged 8-10 weeks (Gempharmatech) were used for human PBMC reconstitution and Colo320DM tumor model establishment. Briefly, the mice received a single intraperitoneal injection of 4.5×106 human PBMC. 7 days after tumor cell inoculation, huCD45 cells in mouse peripheral blood were detected using FACS, and tumor bearing mice with tumor size of 100-161 mm3 were selected. Based on the tumor size and huCD45 counts, the selected mice were randomized (blocked randomization) divided into 4 groups of 7 mice each, and treatment was initiated on the same day (Day 0) . Mice were treated once a week for 2 weeks (QW × 2) with 1 mg / kg of huFIT1034-10a-18, 3 mg / kg of huMAT1034-10a-18, 0.6 mg / kg of R reference and DPBS (as vehicle) by intraperitoneal (i.p. ) injection.

[0686] Tumor volumes were measured 2-3 times per week with calipers, and calculated at different time points using the formula: Tumor volume (mm3) = length (mm) × width (mm) 2 × 0.5

[0687] For all groups, percentages of tumor growth inhibition (TGI) of treatment groups were defined as follow:

[0688] All treatment groups were well tolerated (data not shown) . Figure 11 shows the average tumor volumes of mice on different time points, indicating the inhibition of tumor growth by various treatments. TGI ratio values based on tumor volume were 97.82%, 56.65%and 34.14%for huFIT1034-10a-18, huMAT1034-10a-18 and R reference at Day 9 respectively.

[0689] 8.4: HT-55 tumor volume in human PBMC engrafted NCG mice treated with LY6G6D×CD3 bispecific antibodies

[0690] Anti-tumor efficacy was evaluated in HT-55 human melanoma xenograft model in PBMC engraft NCG mice, which is an immunodeficient strain lacking T cells, B cells and natural killer cell. Female NCG mice aged 8-10 weeks (Gempharmatech) were used for human PBMC reconstitution and HT-55 tumor model establishment. Briefly, the mice received a single intraperitoneal injection of 5×106 human PBMCs from healthy donor. After 2 days, 1×106 HT-55 cells suspended in 0.2 ml DPBS containing 50%ABW Matrigel were subcutaneously injected into the right flank of each mouse. 10 days after tumor cell inoculation, huCD45 cells in mouse peripheral blood were detected using FACS (Biolegend, Cat#368511) , and tumor-bearing mice with tumor size of 58-146 mm3 were selected. Based on the tumor size and huCD45 counts, the selected mice were randomized (blocked randomization) divided into 6 groups of 8 mice each, and treatment was initiated on the same day (Day 0) . Mice were treated once a week for 2 weeks (QW × 2) with 0.1 mg / kg , 0.03 mg / kg, 0.01 mg / kg of huFIT1034-10a-18 (NQGA) , 0.02 mg / kg of R reference, 0.02 mg / kg Q reference (hu2G8. B6_1B4_G1AAA_hole_RF_QL, from International Publication NO. WO2024220256A1) and DPBS (as vehicle) by intraperitoneal (i.p. ) injection.

[0691] Tumor volumes and percentages of tumor growth inhibition (TGI) of treatment groups were defined as mentioned in Example 8.1.

[0692] All treatment groups were well tolerated (data not shown) . Figure 12 shows the average tumor volumes of mice on different time points. TGI values are 105.99%, 57.99%and 10.36%for 0.03 mg / kg huFIT1034-10a-18 (NQGA) , 0.02 mg / kg Q reference and R reference at Day 21, respectively.

[0693] 8.5: LS1034 tumor volume in human PBMC engrafted NCG mice treated with LY6G6D×CD3 bispecific antibodies

[0694] Anti-tumor efficacy was also evaluated in LS1034 human melanoma xenograft model in PBMC engraft NCG mice, which is an immunodeficient strain lacking T cells, B cells and natural killer cell. Female NCG mice aged 8-10 weeks (Gempharmatech) were used for human PBMC reconstitution and LS1034 tumor model establishment. Briefly, the mice received a single intraperitoneal injection of 6×106 human PBMC. After 3 days, 1×106 LS1034 cells suspended in 0.2ml DPBS containing 50%ABW Matrigel per animal were subcutaneously injected into the right flank of female NCG mice. 10 days after tumor cell inoculation, huCD45 cells in mouse peripheral blood were detected using FACS, and tumor bearing mice with tumor size of 60-119 mm3 were selected. Based on the tumor size and huCD45 counts, the selected mice were randomized (blocked randomization) divided into 6 groups of 8 mice each, and treatment was initiated on the same day (Day 0) . Mice were treated once a week for 2 weeks (QW × 2) with 1 mg / kg, 0.1 mg / kg, 0.01 mg / kg of huFIT1034-10a-18 (NQGA) , 0.06 mg / kg R reference , 0.07 mg / kg Q reference and DPBS (as vehicle) by intraperitoneal (i.p. ) injection.

[0695] Tumor volumes and percentages of tumor growth inhibition (TGI) of treatment groups were defined as mentioned in Example 8.1.

[0696] All treatment groups were well tolerated (data not shown) . Figure 13 shows the average tumor volumes of mice on different time points, indicating the inhibition of tumor growth by various treatments. TGI ratio values based on tumor volume were 94.36%, 102.88%and 18.05%for 0.1 mg / kg huFIT1034-10a-18 (NQGA) , 0.07 mg / kg Q reference and 0.06 mg / kg R reference at Day 21.

[0697] 8.6: Colo320DM tumor volume in human PBMC engrafted NCG mice treated with LY6G6D×CD3 bispecific antibodies

[0698] Anti-tumor efficacy was also evaluated in Colo320DM human melanoma xenograft model in PBMC engraft NCG mice, which is an immunodeficient strain lacking T cells, B cells and natural killer cell. Female NCG mice aged 8-10 weeks (Gempharmatech) were used for human PBMC reconstitution and Colo320DM tumor model establishment. Briefly, the mice received a single intraperitoneal injection of 5×106 human PBMC. After 2 days, 1x106 Colo320DM cell suspended in 0.2 ml DPBS containing 50%ABW Matrigel per animal were subcutaneously injected into the right of female NCG mice. 10 days after tumor cell inoculation, huCD45 cells in mouse peripheral blood were detected using FACS, and tumor bearing mice with tumor size of 61-185 mm3 were selected. Based on the tumor size and huCD45 counts, the selected mice were randomized (blocked randomization) divided into 6 groups of 8 mice each, and treatment was initiated on the same day (Day 0) . Mice were treated once a week for 2 weeks (QW × 2) with 1 mg / kg , 0.2 mg / kg and 0.04 mg / kg of huFIT1034-10a-18 (NQGA) , 0.14 mg / kg of Q reference, 0.12 mg / kg of R reference and DPBS (as vehicle) by intraperitoneal (i.p. ) injection.

[0699] Tumor volumes and percentages of tumor growth inhibition (TGI) of treatment groups were defined as mentioned in Example 8.1.

[0700] All treatment groups were well tolerated (data not shown) . Figure 14 shows the average tumor volumes of mice on different time points, indicating the inhibition of tumor growth by various treatments. TGI ratio values based on tumor volume were 78.25%, 83.50%, 22.27%for 0.2 mg / kg huFIT1034-10a-18 (NQGA) , 0.14 mg / kg Q reference and 0.12 mg / kg R reference at Day 14 respectively.

[0701] Example 9: Colorectal cancer patient-derived tumor volume in human PBMC engrafted NCG mice treated with LY6G6D×CD3 bispecific antibodies

[0702] Anti-tumor efficacy was also evaluated in Colorectal cancer patient derived xenograft model in PBMC engraft NCG mice, which is an immunodeficient strain lacking T cells, B cells and natural killer cell. Female NCG mice aged 8-10 weeks (Gempharmatech) were used for human PBMC reconstitution and CRC patient-derived tumor model establishment. Briefly, tumor tissues were harvested from CRC patient-derived xenograft-bearing mice and cut into pieces of 2-3mm in diameter, then implanted subcutaneously into mice. Mice received a single intraperitoneal injection of 8×106 human PBMC when tumor volumes reached 30-50mm3. 7-10 days after PBMC injection, huCD45 cells in mouse peripheral blood were detected using FACS, and tumor bearing mice with tumor size of 112-148 mm3 were selected. Based on the tumor size and huCD45 counts, the selected mice were randomized (blocked randomization) divided into 5 groups of 8 mice each, and treatment was initiated on the same day (Day 0) . Mice were treated twice a week for 3 weeks (BIW × 3) with 1 mg / kg, 0.1mg / kg of huFIT1034-10a-18 (NQGA) , 0.07 mg / kg of Q reference, 0.06 mg / kg of R reference and DPBS (as vehicle) by intraperitoneal (i.p. ) injection.

[0703] Tumor volumes and percentages of tumor growth inhibition (TGI) of treatment groups were defined as mentioned in Example 8.1.

[0704] All treatment groups were well tolerated (data not shown) . Figure 15 shows the average tumor volumes of mice on different time points, indicating the inhibition of tumor growth by various treatments. TGI ratio values based on tumor volume were 87.27%, 86.34%and 17.69%for 0.1 mg / kg huFIT1034-10a-18 (NQGA) , 0.07 mg / kg Q reference and 0.06 mg / kg R reference at Day 17 respectively.

[0705] All patents, applications, and publications cited in the above text are incorporated herein by reference in its entirety.

[0706] While specific embodiments of the present disclosure have been discussed, the above specification is illustrative and not restrictive. Other variations and embodiments of the disclosure described herein will now be apparent to those of skill in the art without departing from the present disclosure or the claims below.

[0707] List of Sequences

Claims

1.An isolated antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to LY6G6D, comprising a set of six CDRs, CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2, and CDR-L3, wherein:the CDR-H1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4;the CDR-H2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 or 49;the CDR-H3 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6;the CDR-L1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, 50, 51 or 52;the CDR-L2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8; andthe CDR-L3 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9;optionally wherein the CDRs are defined according to Kabat numbering.2.The isolated antibody or antigen-binding fragment of claim 1, wherein the antibody comprises a variable heavy chain domain VH and a variable light chain domain VL, wherein:the VH domain comprises an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 2, and 21-26, or an amino acid sequence having at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%or 99%identity with any one of SEQ ID NO: 2, and 21-26;and / orthe VL domain comprises an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 3, and 27-33 or an amino acid sequence having at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%or 99%identity with any one of SEQ ID NO: 3, and 27-33.3.The isolated antibody or antigen-binding fragment of claim 1 or 2, wherein the antibody comprises a combination of VH and VL sequences selected from the group consisting of: 4.The isolated antibody or antigen-binding fragment of any one of claims 1-3, wherein:the antibody further comprises a heavy chain constant region CH, derived from a heavy chain constant region of (human) IgG1, IgG2, IgG3 or IgG4, optionally a heavy chain constant region of (human) IgG1, further optionally, the heavy chain constant region CH comprises:(i) an amino acid sequence having at least 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%or 99%identity to the sequence selected from SEQ ID NO: 18, 43 or 44; or(ii) an amino acid sequence selected from SEQ ID NO: 18, 43 or 44;and / orthe antibody further comprises a light chain constant region CL, derived from a (human) lambda or kappa light chain constant region, optionally a kappa light chain constant region, further optionally, the CL comprises:(i) an amino acid sequence having at least 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%or 99%identity to an amino acid sequence of SEQ ID NO: 20; or(ii) an amino acid sequence of SEQ ID NO: 20.5.The isolated antibody or antigen-binding fragment of any one of claims 1-4, wherein the antibody is a chimeric antibody or a humanized antibody.6.The isolated antibody or antigen-binding fragment of any one of claims 1-5, wherein the antigen binding fragment is selected from Fv, Fab, Fab’ , Fab’ -SH, F (ab’ ) 2; diabody; and single-chain antibody molecule (e.g., scFv) .7.A bispecific binding protein that specifically binds to LY6G6D and CD3, comprising a LY6G6D-binding region, and a CD3-binding region, whereinthe LY6G6D-binding region comprises CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2, and CDR-L3 as defined in claim 1; orthe LY6G6D-binding region comprises a VH domain comprising CDR-H1, CDR-H2, and CDR-H3 and a VL domain comprising CDR-L1, CDR-L2, and CDR-L3, and wherein the CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2, and CDR-L3 are defined in any one of claims 1 to 3;the LY6G6D-binding region comprises a VH domain and a VL domain as defined in claim 2 or 3, orthe LY6G6D-binding region is an antigen-binding fragment of any one of claims 1 to 6.8.The bispecific binding protein of claim 7, wherein the CD3-binding region comprises a set of six CDRs, CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2, and CDR-L3, wherein:the CDR-H1 comprises the sequence of SEQ ID NO: 12,the CDR-H2 comprises the sequence of SEQ ID NO: 13,the CDR-H3 comprises the sequence of SEQ ID NO: 14,the CDR-L1 comprises the sequence of SEQ ID NO: 15,the CDR-L2 comprises the sequence of SEQ ID NO: 16, andthe CDR-L3 comprises the sequence of SEQ ID NO: 17;optionally wherein the CDRs are defined according to Kabat numbering.9.The bispecific binding protein of claim 7 or 8, wherein the CD3-binding region comprises a heavy chain variable domain VH and a light chain variable domain VL, wherein:the VH domain comprises the sequence of SEQ ID NO: 10, or a sequence having at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or more identity with SEQ ID NO: 10, andthe VL domain comprises the sequence of SEQ ID NO: 11, or a sequence having at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or more identity with SEQ ID NO: 11;optionally, the VH domain comprises the sequence of SEQ ID NO: 10, and the VL domain comprises the sequence of SEQ ID NO: 11.10.The bispecific binding protein of any one of claims 7 to 9, comprising a first polypeptide chain, a second polypeptide chain and a third polypeptide chain, wherein(i) the first polypeptide chain comprises or consists of, from amino terminus to carboxyl terminus, VLLY6G6D-CL-VHCD3-CH1-Fc wherein CL is directly fused to VHCD3,the second polypeptide chain comprises or consists of, from amino terminus to carboxyl terminus, VHLY6G6D-CH1; andthe third polypeptide chain comprises or consists of, from amino terminus to carboxylterminus, VLCD3-CL;or(ii) the first polypeptide chain comprises or consists of, from amino terminus to carboxyl terminus, VLCD3-CL-VHLY6G6D-CH1-Fc wherein CL is directly fused to VHLY6G6D,the second polypeptide chain comprises or consists of, from amino terminus to carboxyl terminus, VHCD3-CH1; andthe third polypeptide chain comprises or consists of, from amino terminus to carboxyl terminus, VLLY6G6D-CL;wherein VL is a light chain variable domain, CL is a light chain constant domain, VH is a heavy chain variable domain, CH1 is a heavy chain constant domain 1, Fc is an immunoglobulin Fc region, for example, the Fc of IgG1 (for instance, the Fc comprising, from amino terminus to carboxyl terminus, hinge-CH2-CH3) ,wherein VLLY6G6D represents light chain variable domain of LY6G6D-binding region, and VHLY6G6D represents heavy chain variable domain of LY6G6D-binding region; and wherein VLCD3 represents light chain variable domain of CD3-binding region, and VHCD3 represents heavy chain variable domain of CD3-binding region;wherein VLLY6G6D-CL pairs with VHLY6G6D-CH1 to form a FabLY6G6D that specifically binds LY6G6D, and VLCD3-CL pairs with VHCD3-CH1 to form a FabCD3 that specifically binds CD3,wherein two of the first polypeptide chains, two of the second polypeptide chains, and two of the third polypeptide chains are associated to form a FIT-Ig binding protein.11.The bispecific binding protein of claim 10, wherein the Fc is a human IgG Fc, e.g., human IgGl Fc, human IgG2 Fc, human IgG3 or human IgG4 Fc,optionally, the Fc comprises a mutation that reduces binding to Fcγ receptors, such as a LALA mutation of L234A / L235A, and / or a mutation that results in increased serum half-life, such as a YTE mutation of M252Y / S254T / T256E;optionally, the Fc comprises:(i) the amino acid sequence selected from SEQ ID NO: 45, 46, and 47;(ii) an amino acid sequence having at least 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or more identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 45, 46, or 47;(iii) an amino acid sequence having at least 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or more identity to SEQ ID NO: 46, and comprises a mutation of L234A / L235A; or(iv) an amino acid sequence having at least 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or more identity to SEQ ID NO: 47, and comprises mutations of M252Y / S254T / T256E and L234A / L235A.12.The bispecific binding protein of any one of claims 7 to 11, comprising a first polypeptide chain, a second polypeptide chain, and a third polypeptide chain, wherein:-the first polypeptide chain comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 34, 37, 39, or 40, or a sequence having at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or more identity therewith,-the second polypeptide chain comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 35 or 38, or a sequence having at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or more identity therewith, and-the third polypeptide chain comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 36, or a sequence having at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or more identity therewith;optionally,-the first polypeptide chain comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 34, 37, 39, or 40,-the second polypeptide chain comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 35 or 38, and-the third polypeptide chain comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 36.13.The bispecific binding protein of any one of claims 7 to 9, comprising first, second, third and fourth polypeptide chains, wherein(i) the first polypeptide chain comprises or consists of, from amino terminus to carboxyl terminus, VLLY6G6D-CL-VHCD3-CH1-Fc1 wherein CL is directly fused to VHCD3;the second polypeptide chain comprises or consists of, from amino terminus to carboxyl terminus, VHLY6G6D-CH1;the third polypeptide chain comprises or consists of, from amino terminus to carboxyl terminus, VLCD3-CL; andthe fourth polypeptide chain is Fc2;or(ii) the first polypeptide chain comprises or consists of, from amino terminus to carboxyl terminus, VLCD3-CL-VHLY6G6D-CH1-Fc1 wherein CL is directly fused to VHLY6G6D;the second polypeptide chain comprises or consists of, from amino terminus to carboxyl terminus, VHCD3-CH1;the third polypeptide chain comprises or consists of, from amino terminus to carboxyl terminus, VLLY6G6D-CL; andthe fourth polypeptide chain is Fc2;wherein VL is a light chain variable domain, CL is a light chain constant domain, VH is a heavy chain variable domain, CH1 is a heavy chain constant domain 1, Fc1 and Fc2 each is an immunoglobulin Fc region, for example, the Fc of IgG1 (for instance, the Fc comprising, from amino terminus to carboxyl terminus, hinge-CH2-CH3) ,wherein VLLY6G6D represents light chain variable domain of LY6G6D-binding region, and VHLY6G6D represents heavy chain variable domain of LY6G6D-binding region; and wherein VLCD3 represents light chain variable domain of CD3-bindign region, and VHCD3 represents heavy chain variable domain of CD3-binding region,wherein VLLY6G6D-CL pairs with VHLY6G6D-CH1 to form a FabLY6G6D that specifically binds LY6G6D, and VLCD3-CL pairs with VHCD3-CH1 to form a FabCD3 that specifically binds CD3,Fc1 and Fc2 are different and form a dimer; andwherein the first polypeptide chain, the second polypeptide chain, the third polypeptide chain and the fourth polypeptide chain are associated to form a MAT-Fab binding protein.14.The bispecific binding protein of claim 13, wherein the Fc1 or Fc2 each is a human IgG Fc, e.g., human IgGl Fc, human IgG2 Fc, human IgG3 or human IgG4 Fc, wherein1) Fc1 comprises mutation (s) to form a structural knob, and Fc2 comprises mutation (s) to form a complementary structural hole to favor dimerization of Fc1 andFc2; or2) Fc1 comprises mutation (s) to form a structural hole, and Fc2 comprises mutation (s) to form a complementary structural knob to favor dimerization of Fc1 andFc2,optionally, the “knob” mutation (s) is selected from a substitution of T366Y or T366W, and the complementary “hole” mutation (s) is selected from Y407T substitution or a combination of T366S, L368A and Y407V;optionally, Fc1 comprises a substitution T366W and an introduced cysteine residue S354C, and Fc2 comprises T366S, L368A and Y407V substitutions and an introduced cysteine residue Y349C;optionally, Fc1 or Fc2 each further comprises a mutation that reduces binding to Fcγreceptors, such as a LALA mutation of L234A / L235A; optionally, each of the Fc1 or Fc2 comprises an amino acid sequence having at least 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or more identity to the amino acid sequence SEQ ID NO: 45 or 46;optionally, Fc1 comprises an amino acid sequence having at least 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or more identity to SEQ ID NO: 48 and comprises S354C and T366W with L234A and L235A substitutions; and Fc2 comprises an amino acid sequence having at least 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or more identity to SEQ ID NO: 42 and comprises Y349C, T336S, L368A and Y407V with L234A and L235A substitutions; or vice versa.15.The bispecific binding protein of any one of claims 10 to 14, wherein CH1 is a human IgG1, IgG2, IgG3 or IgG4 constant CH1 domain, for example, IgG1 constant domain 1, optionally, CH1 comprises the sequence of SEQ ID NO: 19, or a sequence having at least 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or more identity with SEQ ID NO: 19; and / orCL is a human constant kappa or lambda CL domain, for example, Kappa CL domain, optionally CL comprises the sequence of SEQ ID NO: 20, or a sequence having at least 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or more identity with SEQ ID NO: 20.16.The bispecific binding protein of any one of claims 13 to 15, comprisinga first polypeptide chain, a second polypeptide chain, and a third polypeptide chain and a fourth polypeptide, wherein:-the first polypeptide chain comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 41, or a sequence having at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or more identity therewith,-the second polypeptide chain comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 35, or a sequence having at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or more identity therewith,-the third polypeptide chain comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 36, or a sequence having at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or more identity therewith; and-the fourth polypeptide chain comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 42, or a sequence having at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or more identity therewith;optionally,-the first polypeptide chain comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 41,-the second polypeptide chain comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 35,-the third polypeptide chain comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 36; and-the fourth polypeptide chain comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 42.17.A nucleic acid molecule encoding the antibody or antigen-binding fragment of any one of claims 1 to 6, or the bispecific binding protein of any one of claims 7-16.18.A vector comprising the nucleic acid molecule of claim 17.19.A host cell comprising the nucleic acid molecule of claim 17, or the vector of claim 18.20.A method of preparing the antibody or antigen-binding fragment of any one of claims 1 to 6, or the bispecific binding protein of any one of claims 7-16, comprising:culturing the host cell of claim 19 under conditions that allow the production of the antibody, antigen-binding fragment, or bispecific binding protein; andrecovering the antibody, antigen-binding fragment, or bispecific binding protein from the culture.21.A pharmaceutical composition comprising the antibody or antigen-binding fragment of any one of claims 1 to 6, or the bispecific binding protein of any one of claims 7-16, the nucleic acid of claim 17, the vector of claim 18, or the host cell of claim 19.22.A pharmaceutical combination comprising the antibody or antigen-binding fragment of any one of claims 1 to 6, or the bispecific binding protein of any one of claims 7-16, the nucleic acid of claim 17, the vector of claim 18, or the host cell of claim 19 and one or more additional prophylactic or therapeutic agents for treating a disorder associated with LY6G6D.23.A method of treating or preventing a LY6G6D-associated disorder, comprising administering the antibody or antigen-binding fragment of any one of claims 1 to 6, or the bispecific binding protein of any one of claims 7-16, the nucleic acid of claim 17, the vector of claim 18, the host cell of claim 19, the pharmaceutical composition of claim 21 or the pharmaceutical combination of claim 22,optionally, the LY6G6D-associated disorder is a hematopoietic and solid malignancy expressing LY6G6D on the cell surface of the malignant cells, e.g., LY6G6D-positive cancer, e.g., LY6G6D-positive solid or hematopoietic cancer, e.g., colorectal cancer.

Images