A method for modifying XYLT2 gene in a host cell

Abstract

Provided are fusion proteins, zinc finger nucleases, a system and a method for modulating expression of XYLT2 gene in host cells (e.g., CHO cells) and establishing a modified cell line with a modified XYLT2 gene.

Description

A METHOD FOR MODIFYING XYLT2 GENE IN A HOST CELL

[0001] CROSS-REFERENCE

[0002] This application claims priority to International Patent Application No. PCT / CN2025 / 089294, filed on April 16, 2025. The entire contents of the application are incorporated herein by reference.

[0003] SEQUENCE LISTING

[0004] The instant application contains a sequence listing which is hereby incorporated by reference in its entirety.FIELD

[0005] The present disclosure generally relates to the molecular biology and biopharmaceutical field. Especially, it relates to gene editing CHO cells to construct mammalian cell lines with reduced O-xylosylation activity by utilizing zinc finger nuclease technology.BACKGROUND

[0006] In recent years, with the great success of biopharmaceuticals, especially monoclonal antibodies, in the treatment of tumors and immune diseases, more complex biopharmaceuticals such as bispecific antibodies, antibody-drug conjugates (ADCs) , Fc fusion proteins, etc. are being developed to meet the growing clinical needs. The flexible linker (G4S) n, consists of repeated peptide segments of GGGGS (SEQ ID NO: 40) in different lengths, is widely used in various complex proteins to connect different peptide regions due to its high structural flexibility and resistance to protease degradation.

[0007] On the other side, the control of Post Translation Modification (PTM) of recombinant proteins is crucial for product quality. Glycosylation is the most common form of PTM in recombinant proteins, mainly including two forms: N-glycosylation and O-glycosylation. N-glycosylation generally occurs on asparagine residues at a consensus motif Asn-X-Ser / Thr. O-glycosylation often occurs on serine or threonine residues, but is not targeted to a consensus amino acid motif. The control of protein glycosylation patterns is an important consideration during biotherapeutic development due to the potential impact of glycosylation on the half-life, stability, activity, and immunogenicity of recombinant proteins in vivo.

[0008] Wen et al. reported for the first time that Ser residue in the (G4S) n linker with n>2 of bi-specific antibodies or fusion proteins expressed in Chinese hamster ovary (CHO) cells undergoes O-xylosylation modification. The level of O-xylosylation increases with the number of GSG repeats and has a certain degree of clone specificity (Analytical Chemistry 2013, 85 (9) , 4805-12) . Spencer et al. found that the O-glycosylation group occurring on the G4S linker is a xylose centered structure, which is very similar to the core sugar chain structure of proteoglycans such as chondroitin sulfate and heparin sulfate. Both xylose binding sites are located on serine, suggesting that they may be catalyzed by O-xylosyltransferase. In addition, the O-xylosylation level of G4S linker in the fusion protein expressed in HEK293 cells is about 10 times higher than that expressed in CHO cells (David Spencer et al., Journal of Pharmaceutical Sciences 2013, 102 (11) , 3920-3924) . O-xylosylation increases the heterogeneity of recombinant proteins, which may further affect product stability, activity, and immunogenicity. In addition, differences in production batches may pose a serious challenge to product quality control.

[0009] WO2012 / 088461 and WO2019 / 233842 disclose that changing the sequence of GSG residues in (G4S) n linker can reduce or eliminate O-xylosylation levels, and improve the homogeneity and stability of recombinant proteins. Wen et al. also reported that mutating Ser to Ala or the Gly residue after Ser to Proline in the G4S linker can completely eliminate O-xylose modification. However, due to the inherent characteristics of G4S linkers, changing their sequence may affect their flexibility or sensitivity to resist proteolytic enzymes.

[0010] Thus, there is need to develop new methods and expression cell lines for producing recombinant proteins, which can eliminate O-xylose modification without changing the G4S linker sequence.SUMMARY

[0011] The present disclosure describes fusion proteins, compositions and methods for modulating expression of XYLT2 gene in host cells (e.g., CHO cells) and establishing a modified cell line with a modified XYLT2 gene. The modified cell lines may have reduced or eliminated expression of the xylt2 enzyme, which can be utilized for the production of recombinant proteins with reduced O-xylosylation modification. The modification or disruption of the XYLT2 gene may have no or minimal adverse effects on the resultant host cells.

[0012] In certain aspects, provided herein are fusion proteins or engineered zinc finger nucleases comprising a DNA-binding domain that specifically binds to a XYLT2 gene, especially the XYLT2 gene in CHO cells. In some embodiments, such a fusion protein may also comprise a cleavage domain (e.g. cleavage half-domain) , such that the fusion protein may induce a targeted double-stranded break and effect cleavage of specific nucleic acid sequences within the XYLT2 gene.

[0013] In some embodiments, the DNA-binding domain may comprise 3 or more (e.g., 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or more) zinc finger modules, which can be engineered to bind to any sequence within a XYLT2 gene. Any of the fusion proteins described herein may bind to a target sequence within the coding sequence of the XYLT2 gene or within adjacent sequences (e.g., promoter or other expression elements) . In some embodiments, the zinc finger protein binds to a target site in exon 2 or exon 4 of the XYLT2 gene. The recognition helix regions of exemplary XYLT2-binding zinc finger modules are shown in Table A. One or more of the component zinc finger modules can be a canonical (C2H2) zinc finger or a non-canonical (e.g., C3H) zinc finger (e.g., the N-terminal and / or C-terminal zinc finger can be a non-canonical finger) .

[0014] In certain aspects, provided herein is a fusion protein comprising a DNA-binding domain and a cleavage domain, wherein the DNA-binding domain comprises 3 to 6 zinc finger modules that bind to a target sequence in Xylosyltransferase 2 (XYLT2) locus in a host cell, the cleavage domain cleaves within or near the target sequence, and wherein the target sequence is in exon 2 or exon 4 of the XYLT2 gene.

[0015] In some embodiments, the DNA-binding domain comprises:

[0016] (a) 5 zinc finger modules ZF1, ZF2, ZF3, ZF4 and ZF5 each comprising a recognition helix region, and the recognition helix region of the ZF1, ZF2, ZF3, ZF4 and ZF5 comprise SEQ ID NOs: 5, 6, 7, 8 and 9, respectively;

[0017] (b) 5 zinc finger modules ZF1, ZF2, ZF3, ZF4 and ZF5 each comprising a recognition helix region, and the recognition helix region of the ZF1, ZF2, ZF3, ZF4 and ZF5 comprise SEQ ID NOs: 11, 12, 13, 14 and 15, respectively;

[0018] (c) 4 zinc finger modules ZF1, ZF2, ZF3 and ZF4 each comprising a recognition helix region, and the recognition helix region of the ZF1, ZF2, ZF3 and ZF4 comprise SEQ ID NOs: 17, 18, 19 and 20, respectively;

[0019] (d) 4 zinc finger modules ZF1, ZF2, ZF3 and ZF4 each comprising a recognition helix region, and the recognition helix region of the ZF1, ZF2, ZF3 and ZF4 comprise SEQ ID NOs: 22, 23, 24 and 25, respectively;

[0020] (e) 4 zinc finger modules ZF1, ZF2, ZF3 and ZF4 each comprising a recognition helix region, and the recognition helix region of the ZF1, ZF2, ZF3 and ZF4 comprise SEQ ID NOs: 27, 28, 29 and 30, respectively; or

[0021] (f) 4 zinc finger modules ZF1, ZF2, ZF3 and ZF4 each comprising a recognition helix region, and the recognition helix region of the ZF1, ZF2, ZF3 and ZF4 comprise SEQ ID NOs: 32, 33, 34 and 35, respectively.

[0022] In some embodiments, the cleavage domain is a cleavage half-domain. The DNA-binding domain is operably linked to the cleavage domain, preferably via a linker, such as GS series linker.

[0023] In some embodiments, the target sequence is selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 4, 10, 16, 21, 26 and 31.

[0024] In certain aspects, provided herein is a pair of fusion proteins, comprising:

[0025] (1) a first fusion protein as defined in item (a) above and a second fusion protein as defined in item (b) above;

[0026] (2) a first fusion protein as defined in item (c) above and a second fusion protein as defined in item (d) above; or

[0027] (3) a first fusion protein as defined in item (e) above and a second fusion protein as defined in item (f) above.

[0028] In certain aspects, provided herein is a system for modifying Xylosyltransferase 2 (XYLT2) locus in a host cell, wherein the system comprises

[0029] (a) a first fusion protein, or a polynucleotide (e.g. in an expression cassette or vector) encoding the first fusion protein; and

[0030] (b) a second fusion protein, or a polynucleotide (e.g. in an expression cassette or vector) encoding the second fusion protein;

[0031] wherein the first and the second fusion proteins each comprises a DNA-binding domain and a cleavage domain, wherein the DNA-binding domain comprises 3 to 6 zinc finger modules that bind to a target sequence in the XYLT2 locus, the cleavage domain cleaves within or near the target sequence, and wherein the target sequence is in exon 2 or exon 4 of the XYLT2 gene;

[0032] wherein the first fusion protein binds to a first target sequence and the second fusion protein binds to a second target sequence, preferably the first target sequence and the second target sequence are on opposite DNA strands and separated by a spacer sequence of about 4-10 nucleotides in length; and

[0033] the cleavage domains of the first and the second fusion proteins are cleavage half-domains that act in pair to form a functional cleavage domain,

[0034] optionally, the functional cleavage domain generates a double strand break in the spacer sequence.

[0035] In some embodiments, the first target sequence and the second target sequence are selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 4, 10, 16, 21, 26 and 31.

[0036] In some embodiments, the first fusion protein and the second fusion protein bind to SEQ ID NOs: 4 and 10 respectively, or SEQ ID NOs: 16 and 21 respectively, or SEQ ID NOs: 26 and 31 respectively.

[0037] In some embodiments, the first fusion protein comprises 5 zinc finger modules ZF1, ZF2, ZF3, ZF4 and ZF5 each comprising a recognition helix region, and the recognition helix region of the ZF1, ZF2, ZF3, ZF4 and ZF5 comprise SEQ ID NOs: 5, 6, 7, 8 and 9, respectively, and the second fusion protein comprises 5 zinc finger modules ZF1, ZF2, ZF3, ZF4 and ZF5 each comprising a recognition helix region, and the recognition helix region of the ZF1, ZF2, ZF3, ZF4 and ZF5 comprise SEQ ID NOs: 11, 12, 13, 14 and 15, respectively.

[0038] In some embodiments, the first fusion protein comprises 4 zinc finger modules ZF1, ZF2, ZF3 and ZF4 each comprising a recognition helix region, and the recognition helix region of the ZF1, ZF2, ZF3 and ZF4 comprise SEQ ID NOs: 17, 18, 19 and 20, respectively, and

[0039] the second fusion protein comprises 4 zinc finger modules ZF1, ZF2, ZF3 and ZF4 each comprising a recognition helix region, and the recognition helix region of the ZF1, ZF2, ZF3 and ZF4 comprise SEQ ID NOs: 22, 23, 24 and 25, respectively.

[0040] In some embodiments, the first fusion protein comprises 4 zinc finger modules ZF1, ZF2, ZF3 and ZF4 each comprising a recognition helix region, and the recognition helix region of the ZF1, ZF2, ZF3 and ZF4 comprise SEQ ID NOs: 27, 28, 29 and 30, respectively, and

[0041] the second fusion protein comprises 4 zinc finger modules ZF1, ZF2, ZF3 and ZF4 each comprising a recognition helix region, and the recognition helix region of the ZF1, ZF2, ZF3 and ZF4 comprise SEQ ID NOs: 32, 33, 34 and 35, respectively.

[0042] In some embodiments, the cleavage domain is derived from a Type IIs restriction enzyme, such as FokI enzyme, optionally the cleavage domain comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3.

[0043] In certain aspects, provided herein is a composition comprising the first fusion protein and the second fusion as disclosed herein.

[0044] In certain aspects, provided herein is a nucleic acid molecule encoding the fusion protein (s) as disclosed herein.

[0045] In some embodiments, the nucleic acid molecule comprises a first and a second polynucleotides encoding the first fusion protein and the second fusion protein, respectively.

[0046] In certain aspects, provided herein is a vector comprising the nucleic acid molecule as disclosed herein.

[0047] In certain aspects, provided herein is a host cell comprising the nucleic acid molecule or the vector as disclosed herein.

[0048] In some embodiments, the cell is a eukaryotic cell, e.g. a mammalian cell, such as a CHO cell.

[0049] In certain aspects, provided herein is a method for modifying the XYLT2 locus of a cell (e.g. for reduced or eliminated xylt2 gene expression) , the method comprising:

[0050] introducing a fusion protein (s) comprising a DNA-binding domain and a cleavage domain or a polynucleotide encoding the fusion protein (s) into the cell,

[0051] wherein the DNA-binding domain binds to a target sequence in the XYLT2 locus and the cleavage domain cleaves at or near the target sequence.

[0052] In some embodiments, the DNA-binding domain comprises 3 or more zinc finger modules, such as 3 to 6 zinc finger modules, that recognize the target sequence.

[0053] In some embodiments, the cleavage domain is a cleavage half-domain and the method comprises introducing a pair of fusion proteins or a polynucleotide (s) encoding the pair of fusion proteins into the cell, wherein the DNA-binding domain of the first fusion protein binds to a first target sequence in the XYLT2 locus and the cleavage half-domain of the first fusion protein cleaves at or near the first target sequence, and the DNA-binding domain of the second fusion protein binds to a second target sequence in the XYLT2 locus and the cleavage half-domain of the second fusion protein cleaves at or near the second target sequence.

[0054] In some embodiments, the first target sequence and the second target sequence are on opposite DNA strands.

[0055] In some embodiments, the first target sequence and the second target sequence are separated by a spacer sequence of 4-10 nucleotides in length.

[0056] In some embodiments, the first target sequence and the second target sequence are located in exon 2 or exon 4 of the XYLT2 gene.

[0057] In some embodiments, the first fusion protein and the second fusion protein bind to SEQ ID NOs: 4 and 10 respectively, or SEQ ID NOs: 16 and 21 respectively, or SEQ ID NOs: 26 and 31 respectively.

[0058] In some embodiments, the first fusion protein comprises 5 zinc finger modules ZF1, ZF2, ZF3, ZF4 and ZF5 each comprising a recognition helix region, and the recognition helix region of the ZF1, ZF2, ZF3, ZF4 and ZF5 comprise SEQ ID NOs: 5, 6, 7, 8 and 9, respectively, and the second fusion protein comprises 5 zinc finger modules ZF1, ZF2, ZF3, ZF4 and ZF5 each comprising a recognition helix region, and the recognition helix region of the ZF1, ZF2, ZF3, ZF4 and ZF5 comprise SEQ ID NOs: 11, 12, 13, 14 and 15, respectively.

[0059] In some alternative embodiments, the first fusion protein comprises 4 zinc finger modules ZF1, ZF2, ZF3 and ZF4 each comprising a recognition helix region, and the recognition helix region of the ZF1, ZF2, ZF3 and ZF4 comprise SEQ ID NOs: 17, 18, 19 and 20, respectively, and the second fusion protein comprises 4 zinc finger modules ZF1, ZF2, ZF3 and ZF4 each comprising a recognition helix region, and the recognition helix region of the ZF1, ZF2, ZF3 and ZF4 comprise SEQ ID NOs: 22, 23, 24 and 25, respectively.

[0060] In some embodiments, the first fusion protein comprises 4 zinc finger modules ZF1, ZF2, ZF3 and ZF4 each comprising a recognition helix region, and the recognition helix region of the ZF1, ZF2, ZF3 and ZF4 comprise SEQ ID NOs: 27, 28, 29 and 30, respectively, and the second fusion protein comprises 4 zinc finger modules ZF1, ZF2, ZF3 and ZF4 each comprising a recognition helix region, and the recognition helix region of the ZF1, ZF2, ZF3 and ZF4 comprise SEQ ID NOs: 32, 33, 34 and 35, respectively.

[0061] In some embodiments, the cleavage domain is derived from a Type IIs restriction enzyme.

[0062] In some embodiments, the cleavage domain is derived from FokI enzyme, optionally the cleavage domain comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3.

[0063] In certain aspects, provided herein is a host cell (e.g., CHO cells) modified by the method as disclosed herein or a progeny thereof that retains the modified xylt2 locus or modified xylt2 gene expression.

[0064] In some embodiments, the cell is a eukaryotic cell, e.g. a mammalian cell, such as a CHO cell.

[0065] In certain aspects, provided herein is a method for producing a recombinant protein with reduced or eliminated O-xylosylation level, comprising:

[0066] expressing a nucleic acid molecule (s) encoding the recombinant protein in the host cell or progeny thereof as disclosed herein under a suitable culturing condition (s) ; and

[0067] optionally, recovering the recombinant protein from the culture supernatant.

[0068] The method herein is especially suitable for producing recombinant proteins comprising the GGGS linker sequence (SEQ ID NO: 40) . The O-xylosylation level in such recombinant proteins would be significantly reduced or eliminated compared to those expressed in host cells with unmodified XYLT2 locus. The recombinant protein refers to the desired product to be produced by a cell line, which may be an antibody including a monoclonal antibody, monospecific antibody, bispecific or multi-specific antibody, a chimeric antibody, a humanized antibody or a fully human antibody, a Fc-fusion protein.

[0069] In certain aspects, provided herein is a method of generating a modified host cell line which can express a recombinant protein with reduced or eliminated O-xylosylation level compared to unmodified host cell line, comprising:

[0070] introducing a fusion protein (s) comprising a DNA-binding domain and a cleavage domain or a polynucleotide encoding the fusion protein (s) into the host cell,

[0071] wherein the DNA-binding domain binds to a target sequence in a XYLT2 gene in the cell and the cleavage domain cleaves at or near the target sequence.

[0072] In some embodiments, the cleavage domain is a cleavage half-domain and the method comprises introducing a pair of fusion proteins or a polynucleotide (s) encoding the two fusion proteins into the cell, wherein the DNA-binding domain of the first fusion protein binds to a first target sequence in the XYLT2 gene and the cleavage half-domain of the first fusion protein cleaves at or near the first target sequence, and the DNA-binding domain of the second fusion protein binds to a second target sequence in the opposite DNA strand of the XYLT2 gene and the cleavage half-domain of the second fusion protein cleaves at or near the second target sequence.

[0073] In certain aspects, provided herein is a site-specific zinc finger nuclease that cleaves at or near a target sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 4, 10, 16, 21, 26 and 31 in XYLT2 locus.

[0074] In some embodiments, the zinc finger nuclease comprises:

[0075] (a) 5 zinc finger modules ZF1, ZF2, ZF3, ZF4 and ZF5 each comprising a recognition helix region, and the recognition helix region of the ZF1, ZF2, ZF3, ZF4 and ZF5 comprise SEQ ID NOs: 5, 6, 7, 8 and 9, respectively;

[0076] (b) 5 zinc finger modules ZF1, ZF2, ZF3, ZF4 and ZF5 each comprising a recognition helix region, and the recognition helix region of the ZF1, ZF2, ZF3, ZF4 and ZF5 comprise SEQ ID NOs: 11, 12, 13, 14 and 15, respectively;

[0077] (c) 4 zinc finger modules ZF1, ZF2, ZF3 and ZF4 each comprising a recognition helix region, and the recognition helix region of the ZF1, ZF2, ZF3 and ZF4 comprise SEQ ID NOs: 17, 18, 19 and 20, respectively;

[0078] (d) 4 zinc finger modules ZF1, ZF2, ZF3 and ZF4 each comprising a recognition helix region, and the recognition helix region of the ZF1, ZF2, ZF3 and ZF4 comprise SEQ ID NOs: 22, 23, 24 and 25, respectively;

[0079] (e) 4 zinc finger modules ZF1, ZF2, ZF3 and ZF4 each comprising a recognition helix region, and the recognition helix region of the ZF1, ZF2, ZF3 and ZF4 comprise SEQ ID NOs: 27, 28, 29 and 30, respectively; or

[0080] (f) 4 zinc finger modules ZF1, ZF2, ZF3 and ZF4 each comprising a recognition helix region, and the recognition helix region of the ZF1, ZF2, ZF3 and ZF4 comprise SEQ ID NOs: 32, 33, 34 and 35, respectively.

[0081] In certain aspects, provided herein are methods for disrupting or knocking out or knocking down a XYLT2 gene, especially the XYLT2 gene in CHO cells.

[0082] The foregoing is a summary and thus contains, by necessity, simplifications, generalizations, and omissions of detail; consequently, those skilled in the art will appreciate that the summary is illustrative only and is not intended to be in any way limiting.

[0083] BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES

[0084] Figure 1A shows the design of two pairs of ZFNs in Exon 2 and one pair of ZFNs in Exon 4 of the Xylt2 gene.

[0085] Figure 1B shows the targeted sequences of XL3 and XR3 pair, XL7 and XR7 pair in Exon 2, and XL9 and XR9 pair in Exon 4. The sequences for cleavage are underlined in Figure 1B. Panel a) : SEQ ID NOs: 41 and 42; panel b) : SEQ ID NOs: 43 and 44; panel c) : SEQ ID NOs: 45 and 46.

[0086] Figure 2 shows the schematic diagram of a CMV expression plasmid of the DNA binding zinc finger protein. The DNA binding domain zinc finger protein and the restriction enzyme FokI cleavage domain were fused into one protein and cloned into a plasmid. The fusion protein is initiated by CMV promoter.

[0087] Figure 3 shows the result of T7E1 enzymatic digestion to verify whether ZFN plasmid effectively removes the target gene sequence. Lane XLR3 refers to sample transfected with XL3 and XR3 plasmids, Lane XLR7 refers to sample transfected with XL7 and XR7, Lane XLR9 refers to sample transfected with XL9 and XR9. NC1, NC2, and NC3 are the corresponding negative control groups, which are the genomic DNA of cells without knocking out Xylt2 gene.DETAILED DESCRIPTION

[0088] While the present disclosure may be embodied in many different forms, disclosed herein are specific illustrative embodiments thereof that exemplify the principles of the disclosure. It should be emphasized that the present disclosure is not limited to the specific embodiments illustrated. Moreover, any section headings used herein are for organizational purposes only and are not to be construed as limiting the subject matter described.

[0089] Unless otherwise defined herein, scientific, and technical terms used in connection with the present disclosure shall have the meanings that are commonly understood by those of ordinary skill in the art. Further, unless otherwise required by context, singular terms shall include pluralities and plural terms shall include the singular. More specifically, as used in this specification and the appended claims, the singular forms “a, ” “an” and “the” include plural referents unless the context clearly dictates otherwise. Thus, for example, reference to “aprotein” includes a plurality of proteins; reference to “acell” includes mixtures of cells, and the like. In this application, the use of “or” means “and / or” unless stated otherwise. Furthermore, the use of the term “comprising, ” as well as other forms, such as “comprises" and “comprised” , is not limiting. In addition, ranges provided in the specification and appended claims include both end points and all points between the end points.

[0090] Definitions

[0091] To better understand the disclosure, the definitions and explanations of the relevant terms are provided as follows.

[0092] Unless specified otherwise, all the nucleotide sequences herein are provided from 5’ to 3’ direction, and the amino acid sequences herein are provided from N to C terminal.

[0093] As used herein, the term “fusion protein” may be used interchangeably with “chimeric nuclease” or “chimeric zinc-finger nuclease (chimeric ZFN) ” and refers to a bifunctional protein comprising two fused polypeptide portions, namely a DNA-recognition domain (also referred to as a DNA-binding domain) for binding to a target site in a DNA molecule and a DNA cleavage domain for cleaving at or near the target site. The DNA-recognition domain herein comprises zinc finger modules for the specific binding. Zinc finger nucleases are powerful tools for genome editing but require careful design to ensure specificity and minimize off-target effects.

[0094] As used herein, the term “cleave” or “cleavage” refers to the breakage of the covalent backbone of a DNA molecule, either in one strand or in both strands. Double-stranded cleavage can occur as a result of two distinct single stranded cleavage events. In certain embodiments, a pair of fusion proteins each comprising a cleavage half-domain are used for targeted double-stranded DNA cleavage.

[0095] As used herein, the term “cleavage domain” refers to a polypeptide sequence which possesses catalytic activity for DNA cleavage. Cleavage domain encompasses cleavage half-domains which act in pair to form a functional cleavage domain that preferably has a double-strand cleavage activity. A cleavage half-domain can be any portion of a protein that retains cleavage activity and retains the ability to multimerize (e.g., dimerize) to form a functional cleavage domain. When the fusion protein utilizes a cleavage half-domain, a pair of fusion proteins are needed to effect a double strand break (DSB) in a DNA molecule. The two fusion proteins are designed to bind to their respective target sequences in opposite strands of the DNA, and their cleavage half-domains dimerize, which activates the nuclease activity, introducing a DSB in the DNA. In some embodiments, the DSB is generated in the spacer region between the first target sequence and the second target sequence. The terms "first and second fusion proteins" and "left and right fusion proteins" are used interchangeably to refer to a pair of fusion proteins each comprising a cleavage half-domain that can dimerize to form a functional cleavage domain. The cleavage half-domain and domain may be derived from a wild-type protein with DNA cleavage activity or further modified.

[0096] As used herein, the term “target site” or “target sequence” is a nucleic acid sequence recognized by the DNA-binding domain of a fusion protein. A single target site typically has about 6 to about 18 nucleotides.

[0097] As used herein, the term “DNA-recognition domain” or “DNA-binding domain” refers to a polypeptide sequence comprising two or more (typically 3-6) tandemly repeated or contiguous zinc finger modules with specific recognition and binding abilities for a target sequence. The zinc finger modules may be combined in a flexible manner to recognize a diverse set of DNA sequences.

[0098] A zinc finger module is a small, stable polypeptide sequence characterized by a consensus sequence forming a compact globular structure that contains a β sheet and an α helix held together by a central Zn ion. The α-helix serves as the recognition element, inserting into the DNA major groove where side chains may form specific contacts with three consecutive base pairs. Each zinc finger module recognizes and binds to a specific 3-base pair (bp) DNA sequence. Multiple zinc finger modules are typically combined to recognize longer DNA sequences. Typically, a DNA-recognition domain having three zinc finger modules recognizes a target sequence with a length of 9 bp, and a DNA-recognition domain having four zinc finger modules recognizes a target sequence with a length of 12 bp. These modules are typically 30-100 amino acids in length and are found in a wide variety of proteins, particularly those involved in DNA, RNA, or protein binding. For Zinc coordination, the zinc ion is usually coordinated by a combination of cysteine and histidine residues, often in a Cys2-His2 (C2H2) configuration, though other configurations like Cys4 or Cys6 also exist. Adjacent zinc finger modules arranged in tandem are generally joined together by linker sequences. Natural zinc finger modules have been well studied and described in the literature, see for example, Miller et al., (1985) EMBO J. 4 1609-1614; Berg (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 99-102; and Lee et al., (1989) Science 245: 635-637. A zinc finger module typically recognizes and binds to a nucleic acid triplet or an overlapping quadruplet in a double-stranded DNA target sequence. However, zinc fingers are also known to bind RNA and proteins (Clemens, K.R. et al. (1993) Science 260: 530-533; Bogenhagen, D.F. (1993) Mol. Cell. Biol. 13: 5149-5158; Searles, M.A. et al. (2000) J. Mol. Biol. 301: 47-60; Mackay, J.P. &Crossley, M. (1998) Trends Biochem. Sci. 23: 1-4) .

[0099] As used herein, the term “operably linked” with respect to nucleic acid sequence means a first nucleic acid sequence is operably linked to a second nucleic acid sequence when the first nucleic acid sequence is in a functional relationship with the second nucleic acid sequence. For instance, a promoter is operably linked with a coding sequence when the promoter affects the transcription or expression of the coding sequence. When recombinantly produced, operably linked nucleic acid sequences are generally contiguous and, where necessary to join two protein-coding regions, in the same reading frame. However, elements need not be contiguous to be operably linked.

[0100] As used herein, the term "introduced, " when referring to translocation of an exogenous nucleic acid into a cell, refers to the incorporation of the nucleic acid into the cell using any methodology available in the art. This term encompasses nucleic acid introduction methods including, for example and without limitation, transfection, transformation, and transduction.

[0101] As used herein, the term "vector" refers to a polynucleotide or other molecule that is capable of transferring at least one nucleic acid segment into a cell. A vector may optionally comprise components / elements that mediate vector maintenance and / or enable its intended use (e.g., sequences necessary for replication, genes imparting drug or antibiotic resistance, a multiple cloning site, and / or operably linked promoter / enhancer elements that enable the expression of a cloned gene) . Vectors may be derived, for example, from plasmids, bacteriophages, or plant or animal viruses. An expression vector generally comprises operably linked elements to facilitate cloning or subcloning steps (e.g., a multiple cloning site containing multiple restriction endonuclease sites) .

[0102] The term “transfection” or “transfect” , as used herein, refers to a process by which nucleic acids are introduced into eukaryotic cells, particularly mammalian cells. Protocols and techniques for transfection include but not limited to lipid transfection and chemical and physical methods such as electroporation. A number of transfection techniques are well known in the art and are disclosed herein. See, e.g., Graham et al., 1973, Virology 52: 456; Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, supra; Davis et al., 1986, Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier; Chu et al, 1981, Gene 13: 197.

[0103] Method in principle

[0104] Described herein are methods for modifying, disrupting or editing a target gene in a host cell. Gene targeting introduces genetic change into specific locations in the genome of a cell. The targeted introduction of genetic changes can be used as a powerful experimental approach, including the usage of specific DNA recognition and cleavage proteins, for example and without limitation, a ZFN; a TALEN; a RNA-guided CRISPR-Cas system, a recombinase (e.g., Cre, Hin, RecA, Tre, and FLP recombinases) ; a meganuclease, and an engineered protein derived from any of the foregoing or their equivalents. Zinc finger nuclease (ZFN) technology is an established gene-targeting tool that can recognize and cut various DNA base sequences using a zinc finger nuclease (ZFN) . The ZFN is a chimeric nuclease comprising a zinc finger DNA-recognition domain and a DNA-cleavage domain. Zinc finger nuclease can be used for efficient genetic modifications of mammalian, plant, or other cells, since it is able to make a targeted double strand break (DSB) in the genomic DNA when introduced into cells. When a double strand break occurs in cells, the damaged region is repaired by the cell’s own repair system. For desired modification in a specific site of the genome, a donor DNA having a similar DNA sequence to the damaged region may be introduced into the cells, leading to homologous recombination (HR) between the damaged DNA and donor template. In the absence of a donor DNA, the damaged region can be repaired by non-homologous end-joining (NHEJ) , which repairs the damaged DNA by joining two broken ends together and usually produces no mutations. In some instances, the repair will be error-prone, resulting in insertion or deletion of base-pairs at the broken DNA ends. Taken together, a double strand break at a specific base sequence by zinc finger nuclease causes non-homologous end-joining, and thus the resulting DNA contains mutations, thereby producing target gene knock-out cell lines. The present application utilizes the DSB to obtain a knock-out or knock-down of the target gene, specifically the Xylt2 gene, in a host cell.

[0105] Engineered ZFNs have significant potential as tools for gene regulation and genome modification because they can be used to target functional domains to virtually any desired location in any genome. The Cys2His2 zinc fingers are of particular interest in this regard. Each individual finger contacts primarily three consecutive base pairs of DNA in a modular fashion. By manipulating the number of finger modules and the nature of critical amino acid residues that contact DNA directly, binding domains with novel specificities can be evolved and selected (see, e.g., Segal et al., 1999, Proc. Natl Acad. Sci. USA, 96: 2758-2763) . In principle, a very broad range of DNA sequences can serve as specific recognition targets for ZFNs. Chimeric nucleases with several different specificities based on zinc finger recognition can be constructed and characterized.

[0106] In the DNA-recognition domain, individual finger modules may be linked in tandem repeats to allow recognition of extended target surfaces such as DNA grooves. Novel DNA-binding zinc fingers have been routinely engineered which can be fused with suitable effector domains to generate effective gene transcription activators and repressors. The present application uses a DNA cleavage domain as the effector domain, however other domains may also be used or included, depending on the purpose.

[0107] The zinc finger DNA-recognition domain of zinc finger nucleases may comprise 3 or more tandemly arrayed zinc finger modules, each of which recognizes 3 bp (base-pair) sub-sites. Since each module independently recognizes DNA sequences, zinc finger domains comprising 3-6 modules are able to bind to 9-to 18-bp sequence. In some instances, zinc finger nucleases function as dimmers and, therefore, a pair of zinc finger nuclease each comprising 3-6 zinc finger modules may specifically recognize a 9-18 bp sequence on opposite strands of the DNA. The zinc finger modules that constitute the DNA-recognition domains may be wild-type zinc finger modules or engineered zinc finger modules.

[0108] One method for generating ZFNs is to assemble pre-characterized single zinc finger modules into a zinc finger DNA-recognition domain with a desired specificity by standard recombinant DNA technology. Each zinc finger module recognizes 3 bp (base pairs) of DNA and, when appropriately joined together, the resulting DNA-recognition domain of the ZFN is capable of specifically recognizing longer DNA sequence motifs. By using this method, ZFNs that recognize specific base sequences can be readily constructed. The zinc finger modules in the DNA-recognition domain can be engineered to bind to a predetermined nucleotide sequence, for example via engineering (altering one or more amino acids) of the recognition helix region of a naturally occurring zinc finger protein. Non-limiting examples of methods for engineering DNA-recognition proteins are rational design and various types of selection. Rational design includes, for example, using databases comprising triplet (or quadruplet) nucleotide sequences and individual zinc finger amino acid sequences, in which each triplet or quadruplet nucleotide sequence is associated with one or more amino acid sequences of zinc fingers which bind the particular triplet or quadruplet sequence. See, for example, U.S. Patents 6,453,242 and 6,534,261, incorporated by reference herein in their entireties. Rational criteria for design include application of substitution rules and computerized algorithms for processing information in a database storing information of existing ZFP and / or TALE designs and binding data.

[0109] Thus, one or more zinc finger modules may be engineered and combined into the DNA-recognition domain of a ZFN, which is introduced into a host cell to interact with a target DNA sequence. The target nucleotide sequence may be rare within the genome of the organism (e.g., fewer than about 10, about 9, about 8, about 7, about 6, about 5, about 4, about 3, about 2, or about 1 copy (ies) of the target sequence may exist in the genome) . For example, the target sequence may be unique within the genome of the host cell or have homologues.

[0110] ZFNs that target Xylt2 gene

[0111] The present disclosure provides a fusion protein or a chimeric zinc finger nuclease (ZFN) that comprises a DNA-recognition domain and a cleavage domain, wherein the DNA-recognition domain can recognize and bind to a target nucleotide sequence in the Xylt2 gene in a site-specific manner. The efficacy and specificity of particular ZFNs designed to bind and induce double stranded breaks in the Xylt2 gene in a host cell is demonstrated. The fusion proteins may be used for modifying a Xylt2 gene present in host cells for expressing recombinant proteins, preferably in CHO cells.

[0112] In some embodiments, the introduction of the fusion protein or polynucleotide encoding the fusion protein into host cells leads to site-specific double-stranded DNA cleavage within the Xylt2 gene. The double-stranded break in the Xylt2 gene can result in a substantially reduced or eliminated expression of the Xylt2 gene.

[0113] In the fusion protein, the DNA-recognition domain is operably linked to the cleavage domain, either directly or indirectly via a linker. The linker may be a peptide linker, such as a GS series linker, including (G4S) n, (GS) n, (GGS) n, (GGSG) n, (SGGG) n, wherein n may be a integer of 1-5.

[0114] The DNA-recognition domain as disclosed herein may comprise or consist of 3 or more (e.g. 4, 5 or 6) zinc finger (ZF) modules. The use of zinc finger modules is particularly advantageous, not only as the zinc finger module can be designed to recognize very diverse DNA sequences but also the structure of the zinc finger modules is known in the art as modular. The zinc finger modules in the present disclosure have been engineered (non-naturally occurring) to bind a target sequence within the Xylt2 gene. One or more of the zinc finger modules can be a canonical (C2H2) zinc finger or a non-canonical (e.g., C3H) zinc finger (e.g., the N-terminal and / or C-terminal zinc finger module can be a non-canonical finger) . The recognition helix region is a critical part of the zinc finger structure that enables the module to bind specifically to DNA, RNA, or other targets. This region is typically an α-helix that interacts directly with the target molecule, and the vast majority of base-specific interactions between DNA and a zinc finger module come from this relatively short stretch of amino acids. It is convenient to define the sequence of the zinc finger module from -1 to +6 (i.e. residues -1, 1, 2, 3, 4, 5 and 6) as a zinc finger recognition sequence or recognition helix region herein. The often invariant histidine residue that coordinates the zinc ion is position (+) 7 of the zinc finger module. The remainder of the zinc finger module (i.e. either side of the recognition sequence) can be referred to as the zinc finger module scaffold or framework, since it functions to support the recognition α-helix in a position suitable for interacting with bases of the nucleic acid target site.

[0115] There are a number of natural zinc finger frameworks known in the art, and any of these frameworks may be suitable for use in the zinc finger module frameworks herein. In general, a natural zinc finger framework has the sequence, Formula 1: X0-2 C X1-5 C X9-14 H X3-6 H / C; or Formula 2: X0-2 C X1-5 C X2-7 X-1X+1X+2X+3X+4X+5X+6H X3-6 H / C, where X is any amino acid, the numbers in subscript indicate the possible numbers of residues represented by X, the numbers in superscript indicate the position of the amino acid in the α-helix, and H / C means that the amino acid in that position can be either H or C (for a review explaining this terminology, see: Encyclopedia of Biological Chemistry III (Third Edition) Volume 3, 2021, Pages 506-516 https:  / / doi. org / 10.1016 / B978-0-12-809633-8.21266-1) . In some embodiments, the zinc finger module framework is based on an array of zinc finger modules of Formula 1 or 2. Alternatively, the zinc finger module may be represented by the general sequence, Formula 3: X2 C X2, 4 C X12 H X3, 4, 5 H / C; or Formula 4: X2 C X2, 4 C X5 X-1X+1X+2X+3X+4X+5X+6H X3, 4, 5 H / C. Other formulas of the zinc finger modules are also well known in the art (see, e.g. WO 2012 / 049332 and WO 2017 / 077329, incorporated herein by reference in their entireties) . Accordingly, the zinc finger module framework of the invention may be based on any of these formulas, joined together into a module using the linker sequences.

[0116] Adjacent zinc finger modules may be separated by relatively short or long, flexible linker sequences. Such adjacent zinc fingers can readily bind to contiguous nucleic acid sequences, although it is also possible for them to bind to non-contiguous sequences.

[0117] During binding, the α-helix or recognition helix region of the zinc finger module almost invariably lies within the major groove of dsDNA and aligns antiparallel to the target nucleic acid strand. Accordingly, the primary nucleic acid sequence is arranged 3'to 5'in order to correspond with the N-terminal to C-terminal sequence of the zinc finger peptide.

[0118] Zinc finger modules herein are engineered and suitably contain 3 or more, for example, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 or more zinc finger modules arranged adjacent one another in tandem. In the DNA-binding domain of the present disclosure, adjacent zinc finger modules can be joined to one another by linker sequences that may be canonical, canonical-like, flexible or structured, as described, for example, in WO 01 / 53480; Moore et al., (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 1437-1441; WO2012 / 049332; WO2017 / 077329 and W02022 / 003361.

[0119] More specifically, the DNA-recognition domain may recognize and bind to a target sequence in the exon region of the Xylt2 gene in CHO cells, e.g. in exon 2, exon 4, exon 1 or exon 3 of the Xylt2 gene. The DNA-recognition domain may bind to a target nucleotide sequence comprising 9 or more (e.g. 12, 15 or 18) designated nucleotides.

[0120] In some embodiments, the target sequence may comprise a nucleotide sequence that is specifically hybridizable to the complement of a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 4, 10, 16, 21, 26 and 31. For example, a pair of fusion proteins are utilized and the first target sequence may comprise a nucleotide sequence that is substantially identical to SEQ ID NO: 4, and the second target sequence may comprise a nucleotide sequence that is substantially identical to SEQ ID NO: 10. In some embodiments, the Xylt2 gene is a Xylt2 homologue (e.g., an ortholog or a paralog) that comprises a nucleotide sequence that is at least about 85%identical (e.g. at least about 90%; at least about 91%; at least about 92%; at least about 93%; at least about 94%; at least about 95%; at least about 96%; at least about 97%; at least about 98%; at least about 99%; at least about 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%and / or at least about 99.9%identical) to a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 4, 10, 16, 21, 26 and 31. A Xylt2 homologue may be readily identified and isolated from any complete or partial genome readily available to those of skill in the art for a variety of organisms.

[0121] In some embodiments, the DNA-recognition domain may recognize and bind to any of SEQ ID NOs: 4, 10, 16, 21, 26 and 31. Moreover, two fusion proteins recognizing two target sequences on opposite strands intervened by a short spacer sequence may act in pair, wherein the DNA-recognition domain of the first fusion protein and the second fusion protein recognizes SEQ ID NOs: 4 and 10 respectively; or recognizes SEQ ID NOs: 16 and 21 respectively; or recognizes SEQ ID NOs: 26 and 31 respectively.

[0122] In some embodiments, the first fusion protein comprises a DNA-recognition domain that recognizes the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4, wherein the DNA-recognition domain contains 5 zinc finger modules ZF1, ZF2, ZF3, ZF4 and ZF5 comprising the amino acid sequence of SEQ ID Nos: 5, 6, 7, 8 and 9 in the recognition helix region, respectively. In some embodiments, the second fusion protein comprises a DNA-recognition domain that recognizes the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 10, wherein the DNA-recognition domain contains 5 modules ZF1, ZF2, ZF3, ZF4 and ZF5 comprising the amino acid sequence of SEQ ID Nos: 11, 12, 13, 14 and 15, respectively.

[0123] In some embodiments, the first fusion protein comprises a DNA-recognition domain that recognizes the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 16, wherein the DNA-recognition domain contains 4 modules ZF1, ZF2, ZF3 and ZF4 comprising the amino acid sequence of SEQ ID Nos: 17, 18, 19 and 20, respectively. In some embodiments, the second fusion protein comprises a DNA-recognition domain that recognizes the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 21, wherein the DNA-recognition domain contains 4 modules ZF1, ZF2, ZF3 and ZF4 comprising the amino acid sequence of SEQ ID Nos: 22, 23, 24 and 25, respectively.

[0124] In some embodiments, the first fusion protein comprises a DNA-recognition domain that recognizes the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 26, wherein the DNA-recognition domain contains 4 modules ZF1, ZF2, ZF3 and ZF4 comprising the amino acid sequence of SEQ ID Nos: 27, 28, 29 and 30, respectively. In some embodiments, the second fusion protein comprises a DNA-recognition domain that recognizes the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 31, wherein the DNA-recognition domain contains 4 modules ZF1, ZF2, ZF3 and ZF4 comprising the amino acid sequence of SEQ ID Nos: 32, 33, 34 and 35, respectively.

[0125] In addition, the zinc finger modules in the DNA-recognition domain may be linked together using any suitable linker sequences, including for example, linkers of 5 or more amino acids in length. See, also, U. S. Patent Nos. 6, 479, 626; 6, 903, 185; and 7, 153, 949 for exemplary linker sequences 6 or more amino acids in length. The proteins described herein may include any combination of suitable linkers between the individual zinc modules.

[0126] The method as disclosed herein may further comprise integration of an exogenous nucleic acid into at least one Xylt2 locus in a host cell, wherein recombination of the exogenous nucleic acid into a nucleic acid of the host cell is facilitated by site-specific recognition and binding of the ZFN to the target sequence and subsequent cleavage of the Xylt2 gene.

[0127] Cleavage domain

[0128] The cleavage domain comprised in the fusion proteins herein may derive from any nuclease, e.g. any endo-or exonuclease, that has DNA cleavage activity. It may be a wild-type domain from proteins with DNA cleavage activity or modified versions thereof. Examples of protein types having cleavage domains include restriction enzymes, topoisomerases, recombinases, integrases, homing endonucleases, DNases, ZFNs, transposases, TAL domains, TALENs, RNA-guided CRISP -Cas9, and a ligase. These enzymes can be used as a source of cleavage domains. Construction of a chimeric nuclease will generally be simplified if the cleavage domain is obtained from a nuclease that has separate domains for sequence recognition and DNA cleavage. For example, the cleavage domain may be derived from a type IIs restriction endonuclease, such as the cleavage domain of FokI. Enzymes of this group generally have separate cleavage and sequence recognition domains.

[0129] Restriction endonucleases are present in many species and are capable of sequence-specific binding to DNA (at a recognition site) , and cleaving DNA at or near the site of binding. Certain restriction enzymes (e.g., Type IIs) cleave DNA at sites separate from the recognition site and have separable binding and cleavage domains. Examples of the Type IIs restriction enzymes include FokI, AarI, AceIII, AciI, AloI, BaeI, Bbr7I, CdiI, CjePI, EciI, Esp3I, FinI, MboI, SapI, or SspD51, but are not limited thereto, more specifically, see Roberts et al. (2003) Nucleic acid Res. 31: 418-420. For example, the FokI cleavage domain, obtained by separating a DNA binding domain from the Type IIs restriction enzyme FokI, was used as a cleavage domain (or half cleavage domain) . The FokI enzyme catalyzes double-stranded cleavage of DNA, at 9 nucleotides from its recognition site on one strand and 13 nucleotides from its recognition site on the other. Thus, in some embodiments, the fusion protein herein comprises a DNA-recognition domain as described above and the cleavage domain of the FokI restriction enzyme (also referred to herein as the FokI cleavage domain) . FokI enzyme from various species (e.g. from flavobacterium okeanokoites) may be utilized.

[0130] The FokI restriction enzyme must dimerize via the nuclease domain in order to cleave DNA and introduce a double-strand break. Consequently, fusion proteins or ZFNs containing a cleavage domain from such an endonuclease also require dimerization of two fusion proteins or ZFNs in order to cleave target DNA. Dimerization of the ZFN can be facilitated by two adjacent, oppositely oriented DNA-binding sites.

[0131] In some embodiments, the fusion protein comprises a DNA binding domain comprising 4-5 zinc finger modules and recognizing a recognition sequence comprising 12-15 designated nucleotides, and further comprises a cleavage domain of a FokI restriction endonuclease. In some embodiments, the fusion protein comprises a DNA binding domain comprising 5 zinc finger modules and recognizing a recognition sequence comprising 15 designated nucleotides, and further comprises a cleavage domain of a FokI restriction endonuclease. In some embodiments, the fusion protein comprises a DNA binding domain comprising 4 zinc finger modules and recognizing a recognition sequence comprising 12 designated nucleotides, and further comprises a cleavage domain of a FokI restriction endonuclease.

[0132] When the fusion protein comprises a cleavage half-domain, two fusion proteins may be required for cleavage. Alternatively, a single protein comprising two cleavage half-domains can be used. The two cleavage half-domains can be derived from the same endonuclease (or functional fragments thereof) , or each cleavage half-domain can be derived from a different endonuclease (or functional fragments thereof) . In addition, the target sequences for the two fusion proteins are preferably disposed, with respect to each other, such that binding of the two fusion proteins to their respective target sequences places the cleavage half-domains in a spatial orientation to each other that allows the cleavage half-domains to form a functional cleavage domain, e.g., by dimerizing. Thus, in certain embodiments, the near edges of the two target sequences are separated by 4-10 nucleotides. However, any integral number of nucleotides or nucleotide pairs can intervene between two target sequences (e.g., 5, 6, 7, 8, 9, 10 nucleotide pairs) . In some preferable embodiments, the site of cleavage is within the spacer sequence located between the two target sequences.

[0133] The cleavage domain of the fusion protein may comprise one or more cleavage half-domain (s) that has been engineered to promote or prevent homodimerization, depending on the needs. For example, amino acid residues at positions 446, 447, 479, 483, 484, 486, 487, 490, 491, 496, 498, 499, 500, 531, 534, 537, and 538 of Fok I are all targets for influencing dimerization of the Fok I cleavage half-domains. In some embodiments, the cleavage domain of the fusion protein comprises a wild-type FokI cleavage domain or a variant thereof. The variant may be a Sharkey FokI cleavage domain, e.g. comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 or comprising an amino acid sequence that has at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%sequence identity to SEQ ID NO: 3. It has been reported that Sharkey FokI cleavage domain is much more active than wild-type FokI cleavage domain on a diverse panel of cleavage sites. Other variants may also be used, especially those with improved cleavage abilities.

[0134] A pair of fusion proteins / ZFNs

[0135] In some embodiments, the cleavage domain of the fusion protein is a cleavage half-domain and two fusion proteins are needed to associate with each other for forming a functional cleavage domain having double-strand cleavage activity. Each of two monomeric fusion proteins that compose a pair binds to one of the two targeted sequences that are separated by a spacer sequence. For each of the two targeted sequences, multiple monomeric fusion proteins that comprise different sets of ZF modules with identical or similar DNA-binding specificities can be designed. In some embodiments, the spacer sequence between the two targeted sequences is 5-10 nucleotides in length.

[0136] In some embodiments, the first and second fusion proteins recognize the first target sequence and the second target sequence respectively, when the two target sequences are close (5-8 bp) , the two zinc-finger nucleases act conjointly to generate a double stranded break (DSB) in the DNA. The FokI cleavage domains of the first fusion protein and the second fusion protein form a dimer. Optionally, the first cleavage half-domain from the first fusion protein and the second cleavage half-domain from the second fusion protein are identical.

[0137] In general, if two fusion proteins are used, each comprising a cleavage half-domain, the primary contact strand for the zinc finger portion of each fusion protein will be on a different DNA strand and in opposite orientation. That is, for a pair of fusion proteins, the target sequences are on opposite strands and the two proteins bind in opposite orientations.

[0138] In some embodiments, the first fusion protein recognizes a first target sequence within exon 2 of the Xylt2 gene in CHO cells, and the second fusion protein recognizes a second target sequence within exon 2 of the Xylt2 gene in CHO cells, wherein the first target sequence and the second target sequence are on opposite strands and are separated by a spacer of 5-6 nucleotides. Specifically, the first target sequence and the second target sequence are SEQ ID NOs: 4 and 10. More specifically, the first fusion protein comprises 5 zinc finger modules comprising the amino acid sequence of SEQ ID Nos: 5, 6, 7, 8 and 9, respectively; the second fusion protein comprises 5 zinc finger modules comprising the amino acid sequence of SEQ ID Nos: 11, 12, 13, 14 and 15, respectively.

[0139] In some other embodiments, the first fusion protein recognizes a first target sequence within exon 2 of the Xylt2 gene in CHO cells, and the second fusion protein recognizes a second target sequence within exon 2 of the Xylt2 gene in CHO cells, wherein the first target sequence and the second target sequence are on opposite strands and are separated by a spacer of 5-6 nucleotides. Specifically, the first target sequence and the second target sequence are SEQ ID NOs: 16 and 21. More specifically, the first fusion protein comprises 4 zinc finger modules comprising the amino acid sequence of SEQ ID Nos: 17, 18, 19 and 20, respectively; the second fusion protein comprises 4 zinc finger modules comprising the amino acid sequence of SEQ ID Nos: 22, 23, 24 and 25, respectively.

[0140] Still in some other embodiments, the first fusion protein recognizes a first target sequence within exon 4 of the Xylt2 gene in CHO cells, and the second fusion protein recognizes a second target sequence within exon 4 of the Xylt2 gene in CHO cells, wherein the first target sequence and the second target sequence are on opposite strands and are separated by a spacer of 5-6 nucleotides. Specifically, the first target sequence and the second target sequence are SEQ ID NOs: 26 and 31. More specifically, the first fusion protein comprises 4 zinc finger modules comprising the amino acid sequence of SEQ ID Nos: 27, 28, 29 and 30, respectively; the second fusion protein comprises 4 zinc finger modules comprising the amino acid sequence of SEQ ID Nos: 32, 33, 34 and 35, respectively.

[0141] Polynucleotides and vectors

[0142] The present disclosure also provides a polynucleotide encoding the fusion protein as disclosed herein and in case a pair of fusion proteins are utilized, polynucleotides encoding the two fusion proteins. The polynucleotides encoding the two fusion proteins may be comprised in one nucleic acid molecule (e.g. a vector) or in separate nucleic acid molecules.

[0143] In some embodiments, at least one nucleic acid molecule (s) comprising at least one polynucleotide sequence encoding the fusion protein may be introduced into a cell, tissue, or organism for expression therein. Optionally, a nucleic acid molecule comprising a polynucleotide sequence encoding a polypeptide of interest may further be introduced into the cell, such that the polynucleotide sequence encoding the polypeptide of interest is integrated into the Xylt2 locus, e.g., by homologous recombination following introduction of a double strand break at the locus, and the polypeptide of interest is expressed from the integrated polynucleotide sequence.

[0144] In some embodiments, the polynucleotide (s) may be comprised in a vector including, for example and without limitation, a linear plasmid, or a closed circular plasmid. The vector may be an expression vector. Nucleic acid sequences may be integrated into a vector, such that the nucleic acid sequence is operably linked to one or more regulatory sequences. Many vectors are available for this purpose, and selection of the particular vector may depend, for example, on the size of the nucleic acid to be inserted into the vector, the particular host cell to be transformed with the vector, and or the amount of any encoded polypeptide that is desired to be expressed. A vector typically contains various components, the identity of which depends on a function of the vector (e.g., amplification of DNA or expression of DNA) , and the particular host cell (s) with which the vector is compatible.

[0145] In some embodiments, a regulatory sequence operably linked to one or more coding sequence (s) may be a promoter sequence that functions in a host cell, such as a mammalian cell or a bacterial cell, wherein the nucleic acid molecule is to be amplified or expressed.

[0146] Promoters suitable for use in nucleic acid molecules include those that are inducible, viral, synthetic, or constitutive, all of which are well known in the art. Non-limiting examples of promoters that may be useful herein include those used in eukaryotic systems, including CMV (Cytomegalovirus) promoter, SV40 (Simian Virus 40) promoter, EF1α (Elongation Factor 1-alpha) promoter, and Actin promoter.

[0147] Additional regulatory sequences that may be operably linked to a nucleic acid molecule include 5'UTRs located between a promoter sequence and a coding sequence that function as a translation leader sequence. The translation leader sequence is present in the fully-processed mRNA, and it may affect processing of the primary transcript, and / or RNA stability.

[0148] Additional regulatory sequences that may be operably linked to a nucleic acid molecule also include 3'non-translated sequences, 3'transcription termination regions, or poly-adenylation regions. These are genetic elements located downstream of a nucleotide sequence, and include polynucleotides that provide polyadenylation signal, and / or other regulatory signals capable of affecting transcription or mRNA processing. The polyadenylation signal functions to cause the addition of polyadenylate nucleotides to the 3'end of the mRNA precursor.

[0149] Additional information regarding regulatory sequences that may be useful herein may be found, for example, in Goeddel (1990) "Gene Expression Technology, " Methods Enzymol. 185, Academic Press, San Diego, CA.

[0150] A recombinant nucleic acid molecule or vector may comprise a selectable marker that confers a selectable phenotype on a transformed cell, such as a CHO cell. Selectable markers may also be used to select for cells or organisms that comprise a nucleic acid molecule comprising the selectable marker. A marker may encode biocide resistance or antibiotic resistance (e.g., kanamycin, Geneticin, bleomycin, and hygromycin) . Multiple selectable markers are available that confer resistance to chemical agents including, for example and without limitation, ampicillin; bleomycin; chloramphenicol; gentamycin; hygromycin; kanamycrn; lincomycin; methotrexate; phospnothricin; puromycin; spectinomycin; rifampicin; streptomycin; and tetracycline. Examples of such selectable markers are illustrated in, e.g., U.S. Patents 5,550,318; 5,633,435; 5,780,708 and 6,118,047.

[0151] A nucleic acid molecule or vector may also or alternatively include a screenable marker. Screenable markers may be used to monitor expression. Exemplary screenable markers include a β-glucuronidase or uidA gene (GUS) which encodes an enzyme for which various chromogenic substrates are known; an R-locus gene, which encodes a product that regulates the production of anthocyanin pigments (red color) in plant tissues; a β-lactamase gene, a gene which encodes an enzyme for which various chromogenic substrates are known; a luciferase gene; a xylE gene that encodes a catechol dioxygenase that converts chromogenic catechols; an amylase gene; a tyrosinase gene which encodes an enzyme capable of oxidizing tyrosine to DOPA and dopaquinone, which in turn condenses to melanin; and an α-galactosidase.

[0152] In some embodiments, it may be desirable to modify the nucleotides of a nucleic acid, for example, to enhance expression of a polynucleotide sequence comprised within the nucleic acid in a particular host. Thus, codons may be substituted to reflect the preferred codon usage of a particular host in a process sometimes referred to as "codon optimization” . Optimized coding sequences containing codons preferred by a particular prokaryotic or eukaryotic host may be prepared, for example, to increase the rate of translation or to produce recombinant transcripts having desirable properties (e.g., a longer half-life, as compared with transcripts produced from a non-optimized sequence) .

[0153] Methods for introducing the nucleic acids into a host cell

[0154] The present disclosure also involves a method ofintroducing a polynucleotide encoding the fusion protein or a pair of fusion proteins as disclosed herein into the host cell (e.g. by transfection or transformation) . The fusion proteins or polynucleotides encoding the fusion proteins may be provided by contacting them with the host cell, or by expressing the fusion proteins within the host cells.

[0155] Nucleic acids may be introduced into a host cell by any method known to those of skill in the art, including, for example, by electroporation; by liposomes; by microinjection; by calcium phosphate; by cationic polymer; by transformation of protoplasts; by desiccation / inhibition-mediated DNA uptake; by agitation with silicon carbide fibers; and by acceleration of DNA-coated particles. Through the application of techniques such as these, the cells of virtually any species, including but not limited to mammalian cells, insect cells, fish cells, yeast and primary cells, may be stably transformed. Preferably, the cells are CHO cells.

[0156] After providing exogenous DNA to recipient cells, transfected or transformed cells may be identified by employing a selectable or screenable marker. Further, the cleavage efficiency may be evaluated by e.g. T7 endonuclease I (T7E1) experiment, which can detect DNA mismatches, insertions, deletions, or other mutations, particularly in the context of gene editing. T7E1 is an enzyme that recognizes and cleaves mismatched DNA, making it a useful tool for assessing the efficiency and accuracy of gene editing.

[0157] Summary of the sequences

[0158] SEQ ID NO. 1: Exon 2 sequence of CHO Xylt2 gene

[0159] SEQ ID NO. 2: Exon 4 sequence of CHO Xylt2 gene

[0160] SEQ ID NO. 3: Amino acid sequence of restriction enzyme Sharkey FokI

[0161] Table A. Target sequence and corresponding recognition helix region in the zinc finger modules

[0162] Table B. Primer sequence for T7E1 analysis

[0163] Table C. Sequences in Figure 1B (5’ to 3’ )

[0164] EXAMPLES

[0165] The present disclosure, thus generally described, will be understood more readily by reference to the following Examples, which are provided by way of illustration and are not intended to be limiting of the present disclosure. The Examples are not intended to represent that the experiments below are all or the only experiments performed.

[0166] Example 1: Xylt2 knockout in CHO cells by ZFN method

[0167] Design and construction of the expression plasmid

[0168] Two pairs of ZFN sequences were designed in exon 2 (SEQ ID NO. 1) and one pair of ZFN sequences was designed in exon 4 (SEQ ID NO. 2) of the Xylt2 gene in Chinese hamster ovary (CHO) cells genome (Figures 1A and 1B) . Sharkey FokI (SEQ ID NO. 3) has stronger cutting ability than Wildtype FokI in this knockout. The nucleic acid sequences encoding the DNA binding protein (XL3 and XR3, XL7 and XR7, or XL9 and XR9) and the FokI cleavage domain were integrated into an expression plasmid (Figure 2) .

[0169] Transfection of host cells

[0170] 1×107 vigorously growing CHO-K1 cells (WuXi Bio) were centrifuged and the supernatant was discarded. 30 μg plasmids were added into 250 μl DPBS solution (Corning, Cat#21-031-V) and well mixed. Then, the cells and the plasmid solution were well mixed and transferred to a cuvette for electrotransfection with Biorad Gene Pulser 1652661. After electrotransfection, the electroporated cells were transferred to a 50 mL tube containing 10 mL of preheated culture medium and placed on a shaker at 225 RPM. The cultivation conditions were 30.0 ℃, 5%CO2 and 85%humidity.

[0171] After transfection for 48 hours, the cells were transferred to a 36.5 ℃ incubator. After culturing for 48 hours, 1×106 cells were taken from the sample for genomic DNA extraction, and quantified using a micro UV spectrophotometer. 100 ng～200 ng genomic DNA was subjected to PCR with high fidelity DNA polymerase and suitable primers (SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39) for amplification of the target gene sequence. Then, the system was denatured and annealed again. After annealing, 1 μL of T7E1 enzyme (10 U / μL, Invitrogen, Cat#AM1344) was added to the system and incubated at 37 ℃ for 15 minutes. After digestion, 2%agarose gel electrophoresis was performed to detect the bands and editing efficiency.

[0172] The results of the enzyme digestion experiment verified that the ZFN plasmid can effectively remove the target gene sequence (as shown in Figure 3) . The editing efficiency for XL3 and XR3 was 11%, for XL7 and XR7 was 12.4%, for XL9 and XR9 was 5.6%. Thus, the zinc finger nucleases of the present invention showed significant activity in the T7E1 assay.

Claims

1.A fusion protein comprising a DNA-binding domain and a cleavage domain, wherein the DNA-binding domain comprises 3 to 6 zinc finger modules that bind to a target sequence in Xylosyltransferase 2 (XYLT2) locus in a host cell, the cleavage domain cleaves within or near the target sequence, and wherein the target sequence is in exon 2 or exon 4 of the XYLT2 gene.2.The fusion protein of claim 1, wherein the DNA-binding domain comprises:(a) 5 zinc finger modules ZF1, ZF2, ZF3, ZF4 and ZF5 each comprising a recognition helix region, and the recognition helix region of the ZF1, ZF2, ZF3, ZF4 and ZF5 comprise SEQ ID NOs: 5, 6, 7, 8 and 9, respectively;(b) 5 zinc finger modules ZF1, ZF2, ZF3, ZF4 and ZF5 each comprising a recognition helix region, and the recognition helix region of the ZF1, ZF2, ZF3, ZF4 and ZF5 comprise SEQ ID NOs: 11, 12, 13, 14 and 15, respectively;(c) 4 zinc finger modules ZF1, ZF2, ZF3 and ZF4 each comprising a recognition helix region, and the recognition helix region of the ZF1, ZF2, ZF3 and ZF4 comprise SEQ ID NOs: 17, 18, 19 and 20, respectively;(d) 4 zinc finger modules ZF1, ZF2, ZF3 and ZF4 each comprising a recognition helix region, and the recognition helix region of the ZF1, ZF2, ZF3 and ZF4 comprise SEQ ID NOs: 22, 23, 24 and 25, respectively;(e) 4 zinc finger modules ZF1, ZF2, ZF3 and ZF4 each comprising a recognition helix region, and the recognition helix region of the ZF1, ZF2, ZF3 and ZF4 comprise SEQ ID NOs: 27, 28, 29 and 30, respectively; or(f) 4 zinc finger modules ZF1, ZF2, ZF3 and ZF4 each comprising a recognition helix region, and the recognition helix region of the ZF1, ZF2, ZF3 and ZF4 comprise SEQ ID NOs: 32, 33, 34 and 35, respectively.3.The fusion protein of claim 1 or 2, wherein the cleavage domain is a cleavage half-domain.4.The fusion protein of claim 1 or 2, wherein the target sequence is selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 4, 10, 16, 21, 26 and 31.5.A pair of fusion proteins, comprising:(1) a first fusion protein as defined in item (a) of claim 2 and a second fusion protein as defined in item (b) of claim 2;(2) a first fusion protein as defined in item (c) of claim 2 and a second fusion protein as defined in item (d) of claim 2; or(3) a first fusion protein as defined in item (e) of claim 2 and a second fusion protein as defined in item (f) of claim 2.6.A system for modifying Xylosyltransferase 2 (XYLT2) locus in a host cell, wherein the system comprises(a) a first fusion protein, or a polynucleotide encoding the first fusion protein; and(b) a second fusion protein, or a polynucleotide encoding the second fusion protein;wherein the first and the second fusion proteins each comprises a DNA-binding domain and a cleavage domain, wherein the DNA-binding domain comprises 3 to 6 zinc finger modules that bind to a target sequence in the XYLT2 locus, the cleavage domain cleaves within or near the target sequence, and wherein the target sequence is in exon 2 or exon 4 of the XYLT2 gene; wherein the first fusion protein binds to a first target sequence and the second fusion protein binds to a second target sequence, the first target sequence and the second target sequence are on opposite DNA strands and separated by a spacer sequence of 4-10 nucleotides in length; andthe cleavage domains of the first and the second fusion proteins are cleavage half-domains that act in pair to form a functional cleavage domain,optionally the functional cleavage domain generates a double strand break in the spacer sequence.7.The system of claim 6, wherein the first target sequence and the second target sequence are selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 4, 10, 16, 21, 26 and 31.8.The system of claim 6, wherein the first fusion protein and the second fusion protein bind to SEQ ID NOs: 4 and 10 respectively, or SEQ ID NOs: 16 and 21 respectively, or SEQ ID NOs: 26 and 31 respectively.9.The system of claim 8, wherein the first fusion protein comprises 5 zinc finger modules ZF1, ZF2, ZF3, ZF4 and ZF5 each comprising a recognition helix region, and the recognition helix region of the ZF1, ZF2, ZF3, ZF4 and ZF5 comprises SEQ ID NOs: 5, 6, 7, 8 and 9, respectively, andthe second fusion protein comprises 5 zinc finger modules ZF1, ZF2, ZF3, ZF4 and ZF5 each comprising a recognition helix region, and the recognition helix region of the ZF1, ZF2, ZF3, ZF4 and ZF5 comprises SEQ ID NOs: 11, 12, 13, 14 and 15, respectively.10.The system of claim 8, wherein the first fusion protein comprises 4 zinc finger modules ZF1, ZF2, ZF3 and ZF4 each comprising a recognition helix region, and the recognition helix region of the ZF1, ZF2, ZF3 and ZF4 comprises SEQ ID NOs: 17, 18, 19 and 20, respectively, and the second fusion protein comprises 4 zinc finger modules ZF1, ZF2, ZF3 and ZF4 each comprising a recognition helix region, and the recognition helix region of the ZF1, ZF2, ZF3 and ZF4 comprises SEQ ID NOs: 22, 23, 24 and 25, respectively.11.The system of claim 8, wherein the first fusion protein comprises 4 zinc finger modules ZF1, ZF2, ZF3 and ZF4 each comprising a recognition helix region, and the recognition helix region of the ZF1, ZF2, ZF3 and ZF4 comprises SEQ ID NOs: 27, 28, 29 and 30, respectively, and the second fusion protein comprises 4 zinc finger modules ZF1, ZF2, ZF3 and ZF4 each comprising a recognition helix region, and the recognition helix region of the ZF1, ZF2, ZF3 and ZF4 comprises SEQ ID NOs: 32, 33, 34 and 35, respectively.12.The fusion protein of any of claims 1-3, the pair of fusion proteins of claim 4 or 5, or the system of any of claims 6-11, wherein the cleavage domain is derived from a Type IIs restriction enzyme, such as FokI enzyme, optionally the cleavage domain comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3.13.A composition comprising the first fusion protein and the second fusion protein as defined in any of claims 5-12.14.A nucleic acid molecule encoding the fusion protein (s) of any of claims 1-13.15.The nucleic acid molecule of claim 14, comprising a first and second polynucleotides encoding the first fusion protein and the second fusion protein, respectively.16.A vector comprising the nucleic acid molecule of claim 14 or 15.17.A host cell comprising the nucleic acid molecule of claim 14 or 15, or the vector of claim 16.18.The host cell of claim 17, wherein the cell is a eukaryotic cell, e.g. a mammalian cell, such as a CHO cell.19.A method for modifying the Xylosyltransferase 2 (XYLT2) locus of a cell, the method comprising:introducing a fusion protein (s) comprising a DNA-binding domain and a cleavage domain or a polynucleotide encoding the fusion protein (s) into the cell,wherein the DNA-binding domain binds to a target sequence in the XYLT2 gene in the cell and the cleavage domain cleaves within or near the target sequence.20.The method of claim 19, wherein the DNA-binding domain comprises 3 or more zinc finger modules, such as 3 to 6 zinc finger modules, that recognize the target sequence.21.The method of claim 19 or 20, wherein the cleavage domain is a cleavage half-domain and the method comprises introducing a pair of fusion proteins or a polynucleotide (s) encoding the pair of fusion proteins into the cell, wherein the DNA-binding domain of the first fusion protein binds to a first target sequence in the XYLT2 locus and the cleavage half-domain of the first fusion protein cleaves at or near the first target sequence, and the DNA-binding domain of the second fusion protein binds to a second target sequence in the XYLT2 locus and the cleavage half-domain of the second fusion protein cleaves at or near the second target sequence.22.The method of claim 21, wherein the first target sequence and the second target sequence are on opposite DNA strands.23.The method of claim 21 or 22, wherein the first target sequence and the second target sequence are separated by a spacer sequence of 4-10 nucleotides in length.24.The method of claim 21, wherein the first target sequence and the second target sequence are located in exon 2 or exon 4 of the XYLT2 gene.25.The method of claim 24, wherein the first fusion protein and the second fusion protein bind to SEQ ID NOs: 4 and 10 respectively, or SEQ ID NOs: 16 and 21 respectively, or SEQ ID NOs: 26 and 31, respectively.26.The method of claim 25, wherein the first fusion protein comprises 5 zinc finger modules ZF1, ZF2, ZF3, ZF4 and ZF5 each comprising a recognition helix region, and the recognition helix region of the ZF1, ZF2, ZF3, ZF4 and ZF5 comprise SEQ ID NOs: 5, 6, 7, 8 and 9, respectively, andthe second fusion protein comprises 5 zinc finger modules ZF1, ZF2, ZF3, ZF4 and ZF5 each comprising a recognition helix region, and the recognition helix region of the ZF1, ZF2, ZF3, ZF4 and ZF5 comprise SEQ ID NOs: 11, 12, 13, 14 and 15, respectively.27.The method of claim 25, wherein the first fusion protein comprises 4 zinc finger modules ZF1, ZF2, ZF3 and ZF4 each comprising a recognition helix region, and the recognition helix region of the ZF1, ZF2, ZF3 and ZF4 comprise SEQ ID NOs: 17, 18, 19 and 20, respectively, and the second fusion protein comprises 4 zinc finger modules ZF1, ZF2, ZF3 and ZF4 each comprising a recognition helix region, and the recognition helix region of the ZF1, ZF2, ZF3 and ZF4 comprise SEQ ID NOs: 22, 23, 24 and 25, respectively.28.The method of claim 25, wherein the first fusion protein comprises 4 zinc finger modules ZF1, ZF2, ZF3 and ZF4 each comprising a recognition helix region, and the recognition helix region of the ZF1, ZF2, ZF3 and ZF4 comprise SEQ ID NOs: 27, 28, 29 and 30, respectively, and the second fusion protein comprises 4 zinc finger modules ZF1, ZF2, ZF3 and ZF4 each comprising a recognition helix region, and the recognition helix region of the ZF1, ZF2, ZF3 and ZF4 comprise SEQ ID NOs: 32, 33, 34 and 35, respectively.29.The method of any of claims 19-28, wherein the cleavage domain is derived from a Type IIs restriction enzyme.30.The method of claim 29, wherein the cleavage domain is derived from FokI enzyme, optionally the cleavage domain comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3.31.A host cell modified by the method of any of claims 19-30 or a progeny thereof that retains the modification to the XYLT2 locus.32.The host cell or a progeny thereof of claim 31, wherein the cell is a cell line for producing recombinant proteins, preferably the cell is a eukaryotic cell, e.g. a mammalian cell, such as a CHO cell.33.A method for producing a recombinant protein with reduced or eliminated O-xylosylation level, comprising:expressing a nucleic acid molecule (s) encoding the recombinant protein in the host cell of any of claims 17-18 or the host cell or a progeny thereof of any of claims 31-32 under a suitable culturing condition (s) ; andoptionally, recovering the recombinant protein from the culture supernatant.34.A method of generating a host cell line which can express a recombinant protein with reduced or eliminated O-xylosylation level, comprising:introducing a fusion protein (s) comprising a DNA-binding domain and a cleavage domain or a polynucleotide encoding the fusion protein (s) into the host cell,wherein the DNA-binding domain binds to a target sequence in a Xylosyltransferase 2 (XYLT2) gene in the cell and the cleavage domain cleaves at or near the target sequence.35.The method of claim 34, wherein the cleavage domain is a cleavage half-domain and the method comprises introducing a pair of fusion proteins or a polynucleotide (s) encoding the pair of fusion proteins into the cell, wherein the DNA-binding domain of the first fusion protein binds to a first target sequence in the XYLT2 locus and the cleavage half-domain of the first fusion protein cleaves at or near the first target sequence, and the DNA-binding domain of the second fusion protein binds to a second target sequence in the opposite DNA strand of the XYLT2 locus and the cleavage half-domain of the second fusion protein cleaves at or near the second target sequence.

Images