Method for synthesizing recombinant human keratin and use thereof

Abstract

The present invention discloses a method for synthesizing recombinant human keratin and the use thereof. The recombinant human keratin comprises an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 1. The rebombinant human keratin of the present invention has better hair care efficacy and can be used in the field of hair care, and can improve hair quality and improve antistatic efficacy in hair bundles.

Description

Method for synthesizing recombinant human keratin and use thereofTechnical Field

[0001] The present invention relates to the field of biotechnology, and in particular to a method for synthesizing recombinant human keratin and use thereof.Background Art

[0002] Keratin (also known as cytokeratin) is a structural protein present in epithelial cells of skin, hair, nails, and other tissues. They provide strength and elasticity to these tissues. There are at least 54 keratin genes in humans. Different kinds of keratin have specific functions and are expressed in different tissues and cell types. In 2006, the Keratin Nomenclature Committee renamed the original cytokeratin to keratin, with a molecular weight distribution ranging from 40 to 68 kDa. According to the different isoelectric points, keratin can be divided into acidic keratin (also known as type I keratin) and neutral or alkaline keratin (also known as type II keratin) . There are 28 kinds of type I keratin and 26 kinds of type II keratin. Among the 54 kinds of keratin, 17 are hair-specific keratin.

[0003] Protein is the main component of hair, accounting for 65%to 95%of its composition, most of which is keratin. Keratin provides the strength and structural support required by hair. The scale layer on the surface of hair, which is mainly composed of keratin, forms a protective covering layer to protect the proteins and moisture inside. Keratin can also maintain the moisture balance of hair, keeping it soft, elastic, and shiny. Lack of keratin may cause dry, brittle, and dull hair. Hair is constantly exposed to external environment, making it susceptible to damage from different external factors, such as light, chemical treatments, environmental pollution, mechanical stress, ect., leading to the lifting and fracture of the hair cuticle scales, as well as significant keratin loss, which is macroscopically manifested in the roughness of the hair feel, easy to break, reduced strength and so on.

[0004] Studies have proven the protective effect of keratin on hair. One study used a reduction method to prepare a feather keratin solution to treat damaged hair, and studied the affinity and repair effect of keratin on hair. The results showed that keratin had a good affinity for hair and can form a smooth film on the surface of damaged hair, repair the damaged parts of the hair cuticle scales, and improve the gloss and elasticity of the hair. After the hair was coated with keratin, its curl retention rate was significantly improved. In addition, keratin could absorb ultraviolet rays in the range of 200 to 300nm, effectively enhancing the hair's ability to resist ultraviolet radiation. In another study, L-cysteine was used as a reducing agent, and keratin was extracted from rabbit hair fibers using the cysteine method to prepare a new type of keratin conditioner, which was used for the care of damaged hair. The results showed that after treatment with a conditioner containing rabbit hair keratin, the hair exhibited improved moisture retention and styling performance. Rabbit hair keratin is a safe and effective natural additive for hair care products.

[0005] With rising per capita disposable income and increasing education levels, people are placing greater emphasis on quality of life and personal image management. The prevalence of the 'appearance economy'has spurred new consumer demands for shampoo and hair care products, driving steady growth in China’s shampoo and hair care market.

[0006] In 2023, the market size of shampoo and hair care products in China reached RMB 65.1 billion, with a compound annual growth rate of 3.24%from 2019 to 2023. Based on this growth rate, the market is expected to reach RMB 73.8 billion by 2025. With the increasing demand for hair care and treatment, keratin holds promising market potential in hair care products. Its ability to repair, protect, and enhance hair health has made it one of the most popular and important ingredients in the hair care market. Keratin is widely used in the manufacture of hair care products such as shampoos, conditioners, and hair masks. It can penetrate into the hair to repair damaged protein structures, making hair stronger and more elastic. As a natural protein, keratin aligns with the current market trend favoring natural, green, and sustainable products. As a result, hair care brands increasingly incorporate keratin as a key ingredient to meet consumers’ expectations for health-conscious and eco-friendly solutions.

[0007] According to statistics and forecasts by QYR (Hengzhou Bozhi) , the global keratin market sales reached US$160 million in 2022 and are projected to grow to US$240 million by 2029, with a compound annual growth rate (CAGR) of 6.4% (2023 to 2029) . In 2019, China's keratin market size was valued at US$11.33 million, and it is expected to reach US$17.77 million by 2026. The market is anticipated to maintain steady growth in the coming years, demonstrating promising prospects.

[0008] Currently, the primary sources of keratin are extracted from feathers and animal hair. Keratin molecules form a stable spatial structure mainly through hydrogen bonds, salt bonds, and disulfide bonds between different peptide chains. The abundance of disulfide bonds gives hair its stable physical and chemical properties, but also makes keratin insoluble in common solvents or mild acids and bases, rendering its extraction from hair particularly challenging. When stronger acids or bases are used to dissolve keratin, the resulting product consists of keratin molecules with smaller molecular weights. Researchers have been exploring extraction methods that break the disulfide bonds, hydrogen bonds, and salt bonds within keratin molecules while preserving their primary protein structure, aiming to obtain keratin with relatively high molecular weight and improved solubility.

[0009] With the rise of biosynthetic technology and the growing popularity of recombinant collagen, the use of biosynthetic methods to produce recombinant human keratin has emerged as a novel alternative to traditional extraction of keratin from animal feathers. Currently, there have been reports on biosynthetic keratin, such as the patent CN117430687A, which discloses a recombinant keratin with a triple-helical structure, produced using E. coli as the host cell. Compared to natural keratin, this recombinant keratin demonstrates superior improvements in hair gloss, combing, strength, and smoothness. Patent CN110117323B discloses a soluble human keratin, which is produced by cloning the intermediate sequence of the human K37 gene, constructing a recombinant vector, transforming bacteria, and inducing recombinant protein expression followed by purification. This keratin exhibits rapid swelling properties and promotes epidermal cell mitosis and migration, playing a significant role in skin regeneration, repair, and wound healing. Patent CN117486991A discloses a recombinant keratin with the effect of preventing hair loss and promoting hair growth. Patent CN112745383B discloses a recombinant human keratin mixed solution (asolution of tetrameric structure formed by polymerizing type II alkaline cytokeratin K1 and type I acidic cytokeratin K10 in a ratio of 1: 1) , which can enhance the protective function of normal skin epidermis and facilitate the repair of damaged stratum corneum of skin epidermis.

[0010] Contents of the present invention

[0011] The purpose of the present invention is to provide a method for synthesizing a recombinant human keratin and use thereof.

[0012] In the first aspect, the present invention provides a recombinant human keratin, which comprises or consists of an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 1 or variant thereof; wherein the variant has a sequence identity of at least 70%, at least 80%, at least 90%, at least 95%, or at least 99%as compared to the sequence as set forth in SEQ ID NO: 1, and substantially retains the biological function of the sequence from which it is derived.

[0013] In the second aspect, the present invention provides a fusion protein, which comprises the recombinant human keratin according to claim 1 and an additional protein or polypeptide.

[0014] In some embodiments, the additional protein or polypeptide is selected from the group consisting of tags, signal peptides, or any combination thereof.

[0015] In some embodiments, the additional protein or polypeptide is connected to the N-terminal or C-terminal of the recombinant human keratin optionally via a linker.

[0016] In the third aspect, the present invention provides a nucleic acid molecule, which comprises a nucleotide sequence encoding the recombinant human keratin described in the first aspect, or the fusion protein described in the second aspect.

[0017] In some embodiments, the nucleotide sequence is optimized with a codon for expression in prokaryotic cells or eukaryotic cells.

[0018] In some embodiments, the nucleotide sequence is as set forth in SEQ ID NO: 2.

[0019] In the fourth aspect, the present invention provides a vector, which comprises the nucleic acid molecule described in the third aspect.

[0020] In the fifth aspect, the present invention provides a host cell, which comprises the nucleic acid molecule described in the third aspect or the vector described in the forth aspect.

[0021] In the sixth aspect, the present invention provides a method for preparing the recombinant human keratin described in the first aspect or the fusion protein described in the second aspect, comprising culturing the host cell described in the fifth aspect under a condition that allows expression of the recombinant human keratin or fusion protein, and recovering the recombinant human keratin or fusion protein from the cultured host cell culture.

[0022] In some embodiments, wherein, the method for culturing the host cell is selected from the primary culture method, secondary culture method, adherent cell culture method, suspension cell culture method, or fermentation method.

[0023] In some embodiments, wherein, the method for culturing the host cell described in the fifth aspect is the fermentation method.

[0024] In some embodiments, the fermentation method involves culturing the host cell in a liquid culture medium in a seed shake bottle; after the culture is completed, the seed liquid is inoculated into a fermentation tank, fermentation, induced to express, to obtain a fermentation product, that is, the culture.

[0025] In the seventh aspect, the present invention provides a composition, which comprises the recombinant human keratin described in the first aspect or the fusion protein described in the second aspect, and an additional component.

[0026] In some embodiments, the additional component is a component in hair care or hair care products.

[0027] In some embodiments, the concentration of recombinant human keratin in the composition is 0.01%to 0.2% (w / v) .

[0028] In some embodiments, the concentration of recombinant human keratin in the composition is 0.02% (w / v) .

[0029] In some embodiments, wherein the composition further comprises a component selected from any one or more of the following:

[0030] Polyquaternium-10, Cocoamidopropyl betaine, Sodium alcohol polyoxyethylene ether sulfate, coconut monoethanol amide, NaCl, p-Hydroxyacetophenone, Phenoxyethanol, 3- [2- (Ethylhexyl) oxyl] -1, 2-propandio, Citric acid.

[0031] In the eighth aspect, the present invention provides the use of the recombinant human keratin described in the first aspect or the fusion protein described in the second aspect or the composition described in the seventh aspect in hair care and hair care products.

[0032] The technical solution of the present invention is:

[0033] a recombinant human keratin, the recombinant human keratin comprises an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 1 or a fragment containing the sequence as set forth in SEQ ID NO: 1, and the fragment is an amino acid sequence having at least 70%identity with SEQ ID NO: 1 or a mutant of the sequence of SEQ ID NO: 1.

[0034] The present invention also discloses a nucleotide sequence encoding the recombinant human keratin.

[0035] As a preferred embodiment, the nucleotide sequence is as set forth in SEQ ID NO: 2.

[0036] The present invention also discloses a recombinant cell, which comprises a nucleotide sequence encoding the recombinant human keratin.

[0037] The recombinant cell is one of a eukaryotic cell and a prokaryotic cell.

[0038] As a preferred embodiment, the eukaryotic cell is one of a human cell, a mouse cell, a hamster cell, an insect cell, a plant cell, a filamentous fungus and a yeast; the prokaryotic cell is one of a bacterium, an actinomycete, a rickettsia, a chlamydia, a mycoplasma, a cyanobacteria and an archaea.

[0039] In a further preferred embodiment, the filamentous fungus is one of Aspergillus, Mucor, Fusarium, Dermatophyte, Sporothrix, and Zygomycetes;

[0040] the yeast is one of Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Candida, Yarrowia lipolytica and Schizosaccharomyces;

[0041] the bacterium is one of Bacillus, Nocardia, Micrococcus, Pseudomonas, Escherichia coli, Rhodospira, Chlorobium, Chromatium and cyanobacteria.

[0042] The Escherichia coli includes but is not limited to wild-type Escherichia coli (e.g., K-12 MG650 and K-12 W3110) and commercial expression strains (e.g., BL21, BL21 (DE3) and BL21 Star (DE3) , BL21 AI, BL21 (DE3) pLysS, BL21 (DE3) pLysE, Lemo21 (DE3) , C41 (DE3) , C43 (DE3) and M15 pREP4, etc. ) , and derivative strains of the above strains.

[0043] The present invention also discloses a recombinant vector, which comprises a nucleotide sequence as set forth in SEQ ID NO: 2, and the recombinant vector is a prokaryotic cell recombinant expression vector.

[0044] The present invention also discloses a method for preparing recombinant human keratin, comprising the following steps:

[0045] 1) constructing a recombinant cell expressing the recombinant human keratin;

[0046] 2) culturing the recombinant cell to obtain a culture;

[0047] 3) separating and purifying from the culture to obtain the recombinant human keratin.

[0048] As a preferred embodiment, the recombinant cell in 2) is cultured by one of the primary culture methods, secondary culture methods, adherent cell culture methods, suspension cell culture methods and fermentation methods.

[0049] As a preferred embodiment, the recombinant cell in 2) is cultured by fermentation method, and the fermentation method comprises culturing the recombinant cell in a liquid culture medium in a seed shake bottle, and after the culture is completed, the seed liquid is inoculated into a fermentation tank, fermented, induced to express, to obtain a fermentation product, that is, the culture.

[0050] As a preferred embodiment, the method for preparing recombinant human keratin comprises the following steps:

[0051] 1) construction of the recombinant cell expressing the recombinant human keratin

[0052] A nucleotide sequence as set forth in SEQ ID NO: 2 for encoding the recombinant human keratin is synthesized, then cloned into a recombinant expression vector to obtain an expression plasmid, the expression plasmid is transferred into an Escherichia coli host cell, and a transformant colony is collected;

[0053] 2) cultivation

[0054] The single colony of the transformant is inoculated into a liquid culture medium in a seed shake flask for cultivation; after the seed shake flask cultivation is completed, the seed liquid is inoculated into a fermentation medium in a fermentation tank for initial fermentation; with the fermentation progressing, the dissolved oxygen concentration drops below the set value of dissolved oxygen, the agitation speed, ventilation volume and fermentation tank pressure are adjusted in turn to control the stability of the dissolved oxygen concentration; when the fermentation progresses, the substrate of the fermentation medium is exhausted, the dissolved oxygen concentration rises rapidly, the fed-batch fermentation is started, meanwhile, the culture temperature is lowered to room temperature, when the temperature in the fermentation tank is stable at room temperature, ITPG solution (1 mL / L) is pumped therein to induce the culture and obtain a fermentation product;

[0055] 3) separation and purification

[0056] The fermentation product is centrifuged for solid-liquid separation, the bacterial cells are collected and homogenized, the supernatant is collected by centrifugation, adjusted to the desired pH, controlled to the desired conductivity, and purified by column chromatography to obtain the recombinant human keratin.

[0057] The present invention also discloses a use of recombinant human keratin in hair care or hair nourishment products, wherein the recombinant human keratin comprises an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 1 or variant thereof.

[0058] As a preferred embodiment, the product is selected from the following preparation forms: slurry, solution, suspension, emulsion, ointment, foam, paste, gel, cream, lotion, spray, or powder.

[0059] As a preferred embodiment, the preparation is shampoo, hair conditioner, hair growth liquid, hair conditioner, hair growth essence, or hair growth cream.

[0060] Advantages of the present invention:

[0061] The recombinant human keratin synthesized by the present invention has a significant hair care effect, has the value of being widely used in the field of hair care, can significantly improves the quality of hair, and significantly improve the anti-static effect of hair bundles. Specifically, the recombinant human keratin of the present invention can significantly reduce the friction of hair strands, reduce the maximum force and total energy required for dry combing, and improve the smoothness of hair strands; it can significantly reduce the crack density of damaged hair strands, repair and protect hair strands; it can significantly improve the tensile strength of hair strands and enhance their resilience; it can significantly reduce the area of frizzy parts of hair strands and improve their anti-static effect. Even at low concentrations (e.g., 0.1%, 0.02%) , the recombinant human keratin of the present invention can produce the aforementioned effects. Furthermore, the recombinant human keratin of the present invention outperforms commercially available keratins in terms of improving hair strand smoothness and enhancing hair strand anti-static effects.

[0062] In the present invention, a fragment of about 100 amino acid sequences on keratin K33B is selected by comparing the sequences of keratin on hair, which is recombinantly expressed and purified to obtain a water-soluble recombinant keratin. The recombinant human keratin prepared by the present invention has been experimentally proven to significantly improve the combing smoothness, dry combing effect, stretching force, and frizz resistance of hair bundles by using aqueous solution or shampoo formula containing 0.1%and 0.02%of the recombinant protein.Brief Description of the Drawings

[0063] Fig. 1 shows the diagrams of the friction force test results of hair bundles in the test of the present invention;

[0064] Fig. 2 shows the scanning electron microscope image of the in vitro hair bundles in the test of the present invention;

[0065] Fig. 3 shows a graph showing the change rate of the maximum force required for dry combing of hair bundles before and after treatment in the test of the present invention;

[0066] Fig. 4 shows a graph showing the change rate of the total work required for dry combing of hair bundles before and after treatment in the test of the present invention;

[0067] Fig. 5 shows a graph showing the change rate of the force required for stretching hair bundles before and after treatment in the test of the present invention;

[0068] Fig. 6 shows a graph showing the change rate of the work done by stretching hair bundles before and after treatment in the test of the present invention;

[0069] Fig. 7 shows a graph showing the change rate of the proportions of the frizzy hair part area to the whole hair bundle area before and after treatment of hair bundles in the test of the present invention.

[0070] Fig. 8 shows the structure of 5-6 carboxy-X-rhodamine.

[0071] Fig. 9 shows the Cross-section of virgin hair treated with dye 5-6CXR.

[0072] Fig. 10 shows the Cross-section of damaged (DBP) hair treated with dye 5-6CXR.

[0073] Fig. 11 shows the structure of 5 (6) carboxytetramethylrhodamine N-succinimidyl ester.

[0074] Fig. 12 shows confocal Microscopy (40x oil) analysis of DBP (double-bleached &permed) hair (detector gain =500) soaked 3 hours in 0.14%Keratin + 1%phenoxyethanol

[0075] Fig. 13 shows confocal Microscopy (40x oil) analysis of DBP hair (detector gain =500) that was Keratin treated, subsequently soaked for 6 hours in water.

[0076] Specific Models for Carrying Out the present invention

[0077] In order to make the technical means, creative features, purpose, and efficacy of the present invention easy to understand, the present invention is further described in conjunction with specific examples.

[0078] Example 1:

[0079] 1. Construction of keratin expression strain

[0080] The amino acid sequence (SEQ ID NO: 1) of a polypeptide fragment of human keratin KRT33B (Uniprot ID: Q14525) was codon optimized to obtain its gene coding sequence (SEQ ID NO: 2) containing a start codon and a stop codon. The sequence was synthesized by Beijing Liuhe BGI Gene Technology Co., Ltd (BGI) and cloned into the expression vector pET-28a (+) provided by BGI to obtain an expression plasmid. The full sequence of the expression plasmid was SEQ ID NO: 3, named pKRT33B_18. The plasmid was transformed into BL21 (DE3) chemical transformation competent cells (CAT#: EC1002) purchased from Shanghai Weidi Biotechnology Co., Ltd. The resulting strain was named S1.

[0081] 2. Protein fermentation process

[0082] A fermentation medium was prepared, which contained yeast extract, glycerol, monopotassium phosphate, potassium hydrogen phosphate, magnesium sulfate heptahydrate, ammonium sulfate, citric acid, and a defoamer. After being sterilized at 121℃ for 30 minutes, it was cooled to 28℃ for later use. After cooling, VB1 and trace elements were added. Among them, magnesium sulfate heptahydrate was sterilized separately, while Vb1 (its concentration was 5 mg / L) and trace element solution were filtered to sterilized. The monoclonal S1 colony was added to more than 50 mL of a liquid culture medium and cultured at 30℃ and 200 rpm for 15 hours to obtain a seed for the tank.

[0083] The seed for the tank was added in the fermentation tank containing the above fermentation medium, the ratio of the seed to the fermentation medium was 7.5%. Fermentation lasted for 4 to 6 hours, and the dissolved oxygen rose. At this time, glycerol was added and the temperature was lowered to 24℃. After the temperature dropped to 24℃, the prepared IPTG was pumped in for induction, and the induction time was 20 hours.

[0084] 3. Separation and purification process

[0085] The fermentation product was centrifuged at 10, 000rcf and 20℃ for 10 minutes for solid-liquid separation, and the bacterial cells were collected. The bacterial cells were added with 4 x 20 mM PB (pH 8) and stirred well at room temperature, homogenized twice at 800 bar at room temperature with a high-pressure homogenizer, then centrifuged at 10, 000 rcf for 20 minutes. The supernatant was collected at 20℃, adjusted to pH 8.0 with 2N NaOH, and purified by column chromatography.

[0086] Buffer A1 (50 mM Tris-HCl, pH 8.0) was used to balance to reach the pH and UV baseline levels, and loading was carried out at a flow rate of 100 to 200 cm / h. After loading, rinsing was performed with Buffer A1 for 2 to 4 CV to reach the UV baseline level, the flow rate was 150 cm / h, and breakthrough effluent and washing effluent were collected, target sample 1.

[0087] The chromatography column was eluted with Buffer B1 (50mM Tris-HCl + 300mM NaCl, pH 8.0) for 2 to 4 CV, the flow rate was 100 to 200 cm / h. Washing was performed with 1M NaCl and 1M NaOH, respectively. Then, target sample 1 was concentrated with a 3KD ultrafiltration membrane, subjected to replacement with pure water by ultrafiltration, and finally concentrated to the required volume. Finally, it was filtered and sterilized with a 0.22μm filter membrane to obtain a sample concentrate, thereby obtaining a recombinant human keratin, which was freeze-dried for later for use.

[0088] I. The recombinant human keratin in Example 1 was used in shampoo products to participate in the following experiments.

[0089] Preparation of shampoo products containing recombinant keratin (the recombinant human keratin prepared in Example 1)

[0090] Table of shampoo formula:

[0091] Preparation process of the above shampoos:

[0092] The equipment was cleaned thoroughly, air-dried for later use. The materials of items C, D and E in the above table were weighed and dissolved for later use.

[0093] The materials of item A were weighed and added into a beaker, heated to 80 to 83 ℃, stirred until completely dissolved, and then slowly added to the materials of item B in sequence while stirring.

[0094] The mixture was cooled to 45 to 50 ℃, added with the materials of item C until completely dissolved. When the temperature reached 40 to 45 ℃, the materials of item D were added, and stirred until completely dissolved. When the temperature reached 35 to 40 ℃, the materials of item F were added, and stirred until fully dissolved. When the temperature reached 25 to 32 ℃, the material of item E was added to adjust the pH. Then the mixture was discharged to obtain the shampoo.

[0095] Among them, the positive control protein WLM-01 is commercially available hydrolyzed wheat protein. Unless otherwise specified, the recombinant keratin in the present invention is measured in weight-to-volume percentage (w / v) . For example, a shampoo containing 0.02%recombinant keratin sample means that the shampoo contains 0.02% (w / v) recombinant keratin in the present invention.

[0096] II. The recombinant human keratin in Example 1 was used in aqueous solution products to participate in the following experiments.

[0097] Preparation of aqueous solution products containing recombinant keratin (the recombinant human keratin prepared in Example 1) .

[0098] Table of aqueous solution formula:

[0099] Aqueous solution operation process:

[0100] The equipment was cleaned thoroughly, air-dried for later use. The materials of item A were weighed and added into a beaker, heated to 70 ℃, and stirred until completely dissolved. When the temperature reached room temperature, i.e., about 25℃, the materials of item B were added, thereby obtaining the aqueous solution.

[0101] III. Experimental test

[0102] 1. In vitro friction test of hair bundles

[0103] Test method:

[0104] 1) Testing instruments and materials: Friction tester MTT175 (Dia-Stron Limited, UK) . Black healthy hair strands of Asian people (2.5 g, 15 cm) .

[0105] 2) Test samples: Shampoo 1 with 0.1%recombinant keratin sample added, Shampoo 2 with 0.02%recombinant keratin sample added, as described in the above shampoo products; negative control, which was the control group shampoo with water added; positive control, which was Shampoo 3 with 0.1%commercially available keratin sample added.

[0106] 3) Selection and grouping of hair bundles: Identical hair bundles were selected, and randomly grouped to ensure that there were 5 bundles in the test product group, and 5 bundles in the control group;

[0107] 4) Pretreatment of hair bundles: Hair bundles were coated with 14%sodium dodecyl ether sulfate evenly at a dose of 0.1g / g hair, rubbed for 30 seconds, rinsed with water at a temperature of 37℃ and a flow rate of 4L / min for 30 seconds, squeezed out water every 5 seconds during rinsing, finally squeezed out water completely, and combed with a narrow-tooth comb 10 times. After pretreatment, the hair bundles were hung in a constant temperature and humidity chamber at a temperature of 20±1℃ and a relative humidity of 50±5%to dry, and balanced for 24 hours.

[0108] 5) Treatment with test sample and control: The hair bundles were coated with the test product at a dose of 0.1g / g hair, rubbed for 30 seconds, rinsed with water at a temperature of 37℃ and a flow rate of 4L / min for 30 seconds, squeezed out water every 5 seconds during rinsing. The above steps were repeated once, twice in total. Finally, the hair bundles were squeezed out water completely, and combed with a narrow-tooth comb for 10 times. The control group product instead of the test product was used to treat the hair bundles in the same way as the test product group. After completion, the hair bundles were hung in a constant temperature and humidity chamber at a temperature of 20±1℃ and a relative humidity of 50±5%to dry, and balanced for 24 hours.

[0109] 6) Friction test: After 24 hours, friction tester MTT175 (Dia-Stron Limited, UK) was used to measure the friction work parameter values of the hair bundles.

[0110] Statistical method:

[0111] SPSS software was used to perform descriptive statistics on the test values of the hair bundles after treatment with the test product and the control product, including quantity, mean, standard deviation, etc. Shapiro-Wilk Test was used to test the significance of normal distribution of data. If Sig. (bilateral) >0.01, it was normally distributed. The independent sample t-test was performed for parallel control, and the significant difference level α was 0.05; if Sig. (bilateral) <0.01, it was non-normally distributed. The Mann-Whitney U test was performed for parallel control, and the significant difference level α was 0.05.

[0112] Results:

[0113] Compared with the control shampoo, all of Shampoo 1 with 0.1%recombinant keratin sample added, Shampoo 2 with 0.02%recombinant keratin sample added, and Shampoo 3 with 0.1%commercial keratin sample added could significantly reduce the friction of hair bundles and improve the smoothness of hair. Moreover, Shampoo 1 had a better effect on improving hair smoothness than Shampoo 2, indicating that the high-concentration keratin sample exhibited a better effect on smoothing hair than the low-concentration keratin sample; Shampoo 1 also had a better effect on improving hair smoothness than Shampoo 3, indicating that at the same concentration, the recombinant keratin sample prepared by the present invention exhibited a better effect than the commercially available keratin sample (Fig. 1) . Among them, shampoos containing 0.1%and 0.02%recombinant keratin showed significant effects on reducing the friction of hair bundles, with concentration-dependency.

[0114] 2. In vitro scanning electron microscopy (SEM) test of hair bundles

[0115] Test method:

[0116] 1) Testing instrument and materials: Hitachi S-3400N scanning electron microscope, resolution of 1.0 nm (5 kV) to 1.4 nm (1 kV) , vacuum degree of 1.2 to 1.6 ×10-6 mPa, focusing range of 300μm x 200μm, acceleration voltage of 5 kV, magnification of 1000 times. Mildly chemically damaged hair bundles of the Asian population (2.5 g, 15 cm) .

[0117] 2) Test samples: The aqueous solution containing 0.1%recombinant keratin and aqueous solution containing 0.02%recombinant keratin as described in the above aqueous solution products; negative control, which was an aqueous solution without keratin (i.e., control aqueous solution) ; positive control, which was an aqueous solution containing 0.1%commercially available keratin (i.e., WLM-02 aqueous solution) .

[0118] 3) Selection and grouping of hair bundles: Identical hair bundles were selected and randomly grouped to ensure that there was one bundle in the test product group and one bundle in the control group;

[0119] 4) Pretreatment of hair bundles: Hair bundles were coated with 14%sodium dodecyl ether sulfate evenly at a dose of 0.1g / g hair, rubbed for 30 seconds, rinsed with water at a temperature of 37℃ and a flow rate of 4L / min for 30 seconds, squeezed out water every 5 seconds during rinsing, and finally squeezed out water completely, and combed with a narrow-tooth comb 10 times. After pretreatment, the hair bundles were hung in a constant temperature and humidity chamber at a temperature of 20±1℃ and a relative humidity of 50±5%to dry, and balanced for 24 hours.

[0120] 5) Treatment with test sample and control product: The hair bundles were coated with the test product evenly at a dose of 0.01g / g hair, allowed to stand at a temperature of 37℃ and rubbed for 1 minute, and combed with a narrow-tooth comb 20 times (10 times on each of the front and back sides of the hair bundle) . The control product instead of the test product was used to treat hair bundles in the same way as the test product group.

[0121] 6) Test by scanning electron microscopy: A few hairs were cut from the hair bundle before sample treatment and their electron microscope photos (Before) were taken; after sample treatment, a few hairs were cut from the hair bundle again and their electron microscope photos (After) were taken.

[0122] Results:

[0123] Compared with the negative control aqueous solution of the control group, the aqueous solution containing 0.1%recombinant keratin, the aqueous solution containing 0.02%recombinant keratin, and the aqueous solution containing 0.1%commercially available keratin in the positive control could all effectively protect the hair scales (Fig. 2) . It could be seen that the aqueous solutions containing 0.1%and 0.02%recombinant keratin of the present invention exhibited significant protective effects on the hair scales. Specifically, based on the crack density of the hair strands before and after treatment, it can be seen that the hair strands treated with an aqueous solution containing the recombinant keratin of the present invention exhibit a significant reduction in crack density. An aqueous solution containing 0.02%of the recombinant keratin of the present invention is sufficient to produce a significant repair and protective effect; an aqueous solution containing 0.1%of the recombinant keratin of the present invention achieves a protective and repair effect on damaged hair strands equivalent to that of a commercially available aqueous solution containing 0.1%keratin.

[0124] 3. In vitro dry combing test of hair bundles

[0125] Test method:

[0126] 1) Testing instruments and materials: Dia-Stron fibra. one hair multifunctional test system ---combing test accessories: Combing; chemically damaged hair bundles of the Far Eastern population (15 cm*3.0 cm*4 g) .

[0127] 2) Test samples: Shampoo 1 with 0.1%recombinant keratin sample added, Shampoo 2 with 0.02%recombinant keratin sample added, as described in the above shampoo products; negative control, which was the control group shampoo with water added; positive control, which was Shampoo 3 with 0.1%commercial keratin sample added.

[0128] 3) Preparation and cleaning of hair bundles: Hair bundles were randomly divided into groups, with 5 hair bundles in each group; after marking, they were placed in a constant temperature and humidity room with a temperature of 21±1℃ and a humidity of 50±10%for 24 hours. Then the hair bundles were coated with 14%SDS for 1 minute, combed for 2 minutes with the same gesture as milking a cow to evenly distribute the SDS on the surface of the hair bundles, and allowed to stand. Then the hair bundles were rinsed with warm water for 1 minute (water temperature: 37±0.5℃; water flow rate 75±5mL / s; water hardness: 80±10ppm) , combed thoroughly, and air-dried for later use.

[0129] 4) Application of product: The sample was coated on the corresponding hair bundles of each group (1 minute) . The hair bundles were rubbed evenly from the root to the end with fingers to make foams on the hair bundles (2 minutes) , and allowed to stand for 3 minutes. Then the hair bundles were rinsed gently with clean water (1 minute) . The product application steps were repeated once, and then the hair bundles were air-dried naturally in a constant temperature and humidity room with a temperature of 21±1℃ and a humidity of 50±10%.

[0130] 5) Dry combing test:

[0131] Measurement for basic value and data after sample treatment: Fibra. one was used to test the dry combing properties (total combing work, maximum combing force parameter) of hair bundles of each group.

[0132] Statistical method:

[0133] The SPSS statistical analysis software was used for the statistical analysis of the original data of the experiment. The independent sample T test was used for normal distribution, otherwise, the rank sum test was performed.

[0134] Results:

[0135] Compared with the shampoo of the negative control group, Shampoo 1 containing 0.1%recombinant keratin, Shampoo 2 containing 0.02%recombinant keratin, and Shampoo 3 containing 0.1%commercial keratin all showed significantly reduced maximum forces and work used for dry combing the treated hair bundles. The experimental products of the three groups could all significantly improve the dry combing effects of hair bundles, and there was no significant difference between the products of the three groups in terms of the maximum force (Fig. 3) and total work (Fig. 4) required for dry combing. In other words, shampoo containing 0.02%recombinant keratin in the present invention can produce effects superior to or equivalent to shampoo containing 0.1%commercially available keratin.

[0136] 4. In vitro tensile test of hair bundles

[0137] Test method:

[0138] 1) Testing instrument and materials: Dia-Stron fibra. one hair multifunctional testing system ---Combing test accessories: Combing; chemically damaged hair bundles of Far Eastern population (15 cm*3.0 cm*4 g) .

[0139] 2) Test samples: Aqueous solution containing 0.1%recombinant keratin and aqueous solution containing 0.02%recombinant keratin as described in the above aqueous solution products; the negative control, which was an aqueous solution without keratin (i.e., the control aqueous solution) ; the positive control, which was an aqueous solution containing 0.1%commercially available keratin (i.e., the WLM-02 aqueous solution) .

[0140] 3) Preparation and cleaning of hair bundles: Hair bundles were randomly divided into groups, with 5 hair bundles in each group; after marking, they were placed in a constant temperature and humidity room at 21±1℃ and 50±10%for 24 hours. Then the hair bundles were coated with 14%SDS for 1 minute, and combed for 2 minutes with the same gesture as milking a cow to evenly distribute the SDS on the surface of the hair bundles, allowed to stand, rinsed with warm water for 1 minute (water temperature: 37±0.5℃; water flow rate 75±5 mL / s; water hardness: 80±10 ppm) , combed the hair bundles thoroughly, and air-dried for later use.

[0141] 4) Application of product: The sample was coated in an S shape on the corresponding hair bundles of each group evenly (1 minute) , and smeared evenly from the root to the end of the hair with fingers (2 minutes) . Then the hair bundles were air-dried in a constant temperature and humidity room.

[0142] 5) Tensile test of single hair bundle:

[0143] Measurement of baseline value: 6 hairs were taken from each hair bundle before treatment, each of the hairs was threaded on two brass tubes, then they were flattened with a special tool, and Fibra. one was used to perform a single hair bundle tensile test (force required for breaking, work required for breaking) .

[0144] Data measurement after sample treatment: 6 hairs were taken from each hair bundle after treatment, each of the hairs were threaded on two brass tubes, then they were flattened with a special tool, and Fibra. one was used to perform a single hair bundle tensile test (force required for breaking, work required for breaking) .

[0145] Statistical method:

[0146] Statistical analysis of the original experimental data was performed using SPSS statistical analysis software. For normal distribution, the independent sample T test was performed, otherwise, the rank sum test was performed.

[0147] Results:

[0148] Compared with the negative control aqueous solution, the aqueous solution containing 0.1%recombinant keratin, the aqueous solution containing 0.02%recombinant keratin, and the aqueous solution containing 0.1%commercial keratin all showed significantly increased maximum forces required and total work used for stretching the treated hairs, indicating that the products of the three groups could make the hair stronger. In addition, from the change rates of the maximum force (Fig. 5) and total work (Fig. 6) used for stretching before and after treating with the products, there was no significant difference between the products of the three groups.

[0149] 5. In vitro antistatic test of hair bundles

[0150] Experimental process:

[0151] 1) Testing instruments and materials: Dia-Stron fibra. one hair multifunctional test system ---combing work test accessories: Combing; chemically damaged hair bundles of Far Eastern population (15cm*3.0cm*4g) .

[0152] 2) Test samples: Shampoo 1 with 0.1%recombinant keratin sample added, Shampoo 2 with 0.02%recombinant keratin sample added, as described in the above shampoo products; negative control, which was the control group shampoo with water added; positive control, which was Shampoo 3 with 0.1%commercial keratin sample added.

[0153] 3) Preparation and cleaning of hair bundles: Identical hair bundles were selected and randomly divided into groups to ensure that there were 5 bundles in the test product group and 5 bundles in the control group; after marking, the hair bundles were placed in a constant temperature and humidity room with a temperature of 21±1℃ and a humidity of 50±10%for 24 hours. Then the hair bundles were coated with 14%SDS for 1 minute, combed for 2 minutes with the same gesture as milking a cow to evenly distribute the SDS on the surface of the hair, and allowed to stand. The hair bundles were rinsed with warm water for 1 minute (water temperature: 37±0.5℃; water flow rate 75±5mL / s; water hardness: 80±10ppm) , combed thoroughly, and air-dried for later use.

[0154] 4) Application of product: The sample was coated on the corresponding hair bundles of each group (1 minute) . Then the hair bundles are rubbed evenly from the root to the end with fingers to make foams on the hair bundles (2 minutes) , allowed to stand for 3 minutes, and then rinsed gently with clean water (1 minute) . The product application steps were repeated once, and the hair bundles were naturally air-dried in a constant temperature and humidity room with a temperature of 21±1℃ and a humidity of 50±10%.

[0155] 5) Anti-static test:

[0156] Measurement of basic value: Before using the product, each hair bundle was combed at least 10 times at a fixed speed and procedure to cause friction static electricity, and pictures of the corresponding hair bundles were taken by image camera VISIA. The pictures were downloaded and analyzed to record the proportion of the frizzy part area of the hair bundle to the whole hair bundle area.

[0157] Data measurement after sample treatment: After using the product according to step 4) , each hair bundle was combed in the same way at least 10 times at a fixed speed and procedure to cause friction static electricity, and pictures of the corresponding hair bundles were taken by image camera VISIA. The pictures were downloaded and analyzed to record the proportion of the frizzy part area of the hair bundle to the whole hair bundle area. By comparing the improvement rates of hair bundle area proportion across different product groups, the anti-static effects of the products on the hair bundles were evaluated.

[0158] Statistical method:

[0159] SPSS statistical analysis software was used for the statistical analysis of the original experimental data. For normal distribution, the independent sample T test was performed, otherwise, the rank sum test was performed.

[0160] Results:

[0161] Compared with the control group, Shampoo 1 containing 0.1%recombinant keratin, Shampoo 2 containing 0.02%recombinant keratin, and Shampoo 3 containing 0.1%commercially available keratin all showed significantly improved hair bundle area proportions in the treated hair bundles, indicating that the three products could significantly improve the antistatic effect of hair bundles (Fig. 7) . Specifically, an aqueous solution containing 0.1%recombinant keratin of the present invention can achieve an antistatic effect equivalent to that of an aqueous solution containing 0.1%commercially available keratin; an aqueous solution containing 0.02%recombinant keratin of the present invention can even produce a better antistatic effect.

[0162] Example 2: Tensile testing

[0163] Pre-treatment and Treatment Protocol for Hair Tresses:

[0164] Hair tresses that have been double bleached (bleached twice) , each weighing 4 grams, are used for testing. The tresses are first thoroughly wetted with water for 1 minute. They are then washed using a 14%sodium laureth sulfate (SLES) solution, applied at a rate of 0.1g of solution per gram of hair. Washing is performed by massaging the tresses with the solution for 30 seconds, followed by rinsing with water for 30 seconds. After washing, the tresses are dried overnight in a climate-controlled room maintained at 21℃ and 50%relative humidity.

[0165] Treatment protocol for hair tresses:

[0166] After pre-treatment, the hair tresses are subjected to the following treatment methods:

[0167] Leave on application method:

[0168] The pre-treated tresses are wetted with water for 30 seconds. The keratin solution (containing 0.14%recombinant keratin of the present invention) is then applied at a rate of 0.25ml per gram of hair and distributed along the length of the tresses for 1 minute. The tresses are then dried overnight (approximately 16 hours) in a climate controlled room maintained at 21℃ and 50%relative humidity.

[0169] Protocol for Measuring the Mechanical Properties of Individual Hair Fibers by Tensile Testing:

[0170] The mechanical properties of individual hair fibers are measured using an automated tensile tester (MTT690) . This device is designed to stretch each hair fiber to a specified elongation percentage or until breakage, in order to determine its mechanical characteristics.

[0171] Hair fiber samples are mounted using brass crimps to ensure optimal fixation of the ends. The diameter of each fiber is measured with a laser micrometer, with five measurements taken per fiber to ensure accuracy. The prepared fibers are then placed on a rotating cassette.

[0172] During the test, a clamp stretches each fiber at a constant speed of 20 mm / min, either to a predefined elongation percentage or until the fiber breaks. The force applied to each sample is continuously recorded, allowing the generation of the corresponding stress-strain curve.

[0173] The data collected from these tensile tests are used to calculate key parameters such as break stress, elastic modulus, and break extension. These results can be used to support claims related to hair strength, damage repair, or damage protection.

[0174] Statistical Data Analysis:

[0175] The obtained data are then analyzed using a statistical study based on the ANOVA method followed by the Tukey test, in order to compare the different groups with a 95%confidence interval (CI 95%) .

[0176] Break stress, or tensile strength at break, refers to the maximum stress that a fiber can withstand before breaking during a tensile test. It is calculated as the maximum force applied to the fiber at the moment of rupture divided by the initial cross-sectional area of the fiber (expressed in MPa) . This parameter is a key indicator of the mechanical strength of the fiber, reflecting its ability to resist breaking under tensile force. The results show that the keratin in the present invention can effectively improve the strength and resilience of bleached hair.

[0177] Results Tensile testing

[0178] Table of tensile (leave-on Caucasian hair double bleached 0.14%Keratin)

[0179] Example 3: Differential Scanning Calorimetry (DSC)

[0180] The denaturation temperature (℃) was measured using the thermal analysis technique called Differential Scanning Calorimetry (DSC) . According to Wortmann, 2002, the keratin denaturation temperature is related to the matrix crosslink density of hair, notably it correlates with the cross-linking density of the keratin-associated proteins, and is the point at which the keratin proteins undergo irreversible structural changes, leading to the loss of their native conformation. DSC measures the heat flow associated with the thermal transitions in a material as a function of temperature.

[0181] European double bleached hair tresses, obtained from SP Equation, Rousset, France, were cleaned with a 14%Sodium Laureth Sulfate solution in water, then dried overnight in a climate-controlled room at 21℃ and 50%relative humidity. Next, the tresses were individually soaked in a keratin solution (containing 0.14%recombinant keratin of the present invention) for 3 hours. After this treatment, the tresses were rinsed for 30 seconds and then dried again overnight in a climate-controlled room at 21℃ and 50%relative humidity.

[0182] The tresses were then cut into uniform lengths from the middle section. The prepared hair samples (6 mg of hair fibers) were placed in medium-pressure DSC crucibles, tightly closed together with 50 mg of water for at least 20 hours to reach equilibrium. DSC analysis was performed using a Netzsch Phenix 204 DSC and the Wet DSC methodology under a controlled temperature program. The temperature was ramped from 50℃ to 200℃ at a rate of 10℃ / min. As the temperature increased, the DSC recorded the heat flow into the sample and reference crucibles. The denaturation of keratin in the hair fibers was detected as an endothermic peak in the DSC thermogram, corresponding to the absorption of heat.

[0183] Denaturation enthalpy (J / g) : This was measured using the Wet DSC methodology described above. The keratin denaturation enthalpy (ΔH) is related to the structural integrity of ordered hair proteins, notably the intermediate filaments (clusters of protofilaments) . The enthalpy change associated with the denaturation process was also quantified from the area under the endothermic peak. The results indicate that the keratin of the present invention significantly increased the denaturation enthalpy of hair, indicating that it effectively increased the matrix crosslink density of hair, particularly the cross-linking density of the keratin-associated proteins.

[0184] Table of results of DSC

[0185] Example 4: Confocal microscopy experiment

[0186] The surface and inner cortex of the hair was analyzed using laser confocal microscopy, an advanced imaging technique that is suitable for samples of hair which typically have a cross-sectional dimension of 50-125 microns. For the purpose of this example, a Leica TCS SP8 inverted confocal microscope was used to study the Keratin penetration. It is an optical imaging tool that uses a pinhole to restrict out-of-focus light. It enables 3D reconstructions of thick samples by combining images taken from different depths within the sample in a process called optical sectioning. The Leica TCS SP8 is diffraction limited, with lateral resolution of a few hundred nm, and axial resolution < 1 micron.

[0187] Penetration of Keratin into the hair:

[0188] In order to validate that the Keratin is able to accomplish internal hair repair, it is critical to demonstrate that the Keratin is able to penetrate into the cortex of damaged hair. This is accomplished by tagging Keratin with a fluorescent dye and experimentally measuring the penetration using laser confocal microscopy.

[0189] Penetration of Fluorescent Dye in Hair:

[0190] An initial investigation of adsorption and penetration of fluorescent dyes into hair fibers was conducted. For this evaluation, 5-6 carboxy-X-rhodamine (5-6CXR) was used as shown in Fig. 8.

[0191] Hair swatches of European Virgin Hair bleached twice obtained from SP Equation, Rousse, France were relaxed using the commercially available kit (Permed hair) were soaked in the dye solution for 3 hours. The samples were subsequently patted dry at room temperature and imaged using confocal microscopy. The resulting images (Fig. 9 and Fig. 10) highlight the differences in dye penetration between virgin and damaged (DBP-double-bleached &permed) hair. Fig. 9 shows the effect of dye on virgin hair. The image is the cross-sectional view of virgin hair treated with dye, showing that the dye remained on the surface, without penetrating the fiber. In contrast, for double-bleached and permed hair (Fig. 10) , the dye successfully penetrated the hair shaft, indicating structural damage.

[0192] The same experiment was conducted using a fluorescent dye, with a molecular weight of 135 g / mol. This dye also did not penetrate virgin hair, suggesting that virgin hair has smaller pores compared to bleached hair, which makes it less permeable to the dye. In the subsequent examples of penetration we will focus only on DBP hair.

[0193] Penetration of tagged Keratin in Hair:

[0194] To evaluate the penetration of Keratin peptides into the hair, it is essential to consider the differences in hair structure. As shown above, virgin hair has very small pores, which limits the penetration of even small molecules. In contrast, bleached hair has larger pores due to the damage caused by the bleaching process, allowing for better penetration of peptides with a lower molecular weight. (Typically less than 10 kDa, preferably less than 5 kDa) . This characteristic of bleached hair is crucial for evaluating how effectively the biobased peptides can diffuse into the hair fibers and their potential impact.

[0195] Penetration of Keratin inside the hair fiber was verified by laser confocal microscopy, using an amine-reactive probe, 5 (6) carboxytetramethylrhodamine N-succinimidyl ester (5-6CTMRNS) shown in Fig. 11.

[0196] The 5-6CTMRNS is frequently used in the art to tag proteins, as an amine-reactive reagent that reacts with non-protonated aliphatic amine groups, including the amine terminus of proteins and the ε-amino group of lysines. The ε-amino group has a pKa of around 10.5, and to keep this amine group in its non-protonated form, the conjugation is usually carried out in a buffer with a basic pH.

[0197] A 15 mL aqueous solution containing 0.2%Keratin peptide, 1%phenoxyethanol, 0.126g of sodium bicarbonate (100 mMol) was prepared, yielding a clear solution that was buffered at a pH of 8.3. The amine-reactive 5-6CTMRNS dye is hydrophobic, so an aliquot of 2 mg of dye was initially dissolved in 0.1 mL dimethyl sulfoxide (DMSO) . The protein and dye solutions were mixed and agitated at 400 rpm overnight to allow for the conjugation to occur. Though the method ensures that the dye is bound to Keratin peptides, the reaction is not complete, leaving some free dye in the solution. The tagged protein was separated from unreacted 5-6CTMRNS using dialysis, to allow for the removal of unbound dye, leaving only the conjugated peptide in the solution. A semipermeable cellulose membrane with a molecular weight cut off (MWCO) of 1 kDa was used for dialysis. The dye 5-6CTMRNS has a molar mass of 527.52 g / mol, allowing the tagged peptide to be retained within the dialysis bag, while the unreacted dye diffuses out. Dialysis was performed for one week against water to remove any unreacted dye.

[0198] Typically, after dialysis the double-bleached and permed hair samples were prepared for penetration studies. They were first washed under running tap water at 25℃ with a flow rate of 1.5 L / min for 20 seconds. The hair was then cleaned with a 10%SLES (shampoo) solution and rinsed again for 20 seconds. Following the cleaning process, the hair fibers were soaked in tagged Keratin peptide solution (adjusted to pH 7) for a determined period of time. After the soaking period, the hair was rinsed for 20 seconds and dried at room temperature. Confocal microscopy was used to capture 3D images to observe the penetration of the tagged peptides inside the hair. The natural fluorescence of the hair fibers could only be detected with a gain of 700 on the detector. However, for the analysis of the tagged peptides, a lower gain of 500 was used. As a result, the displayed images show only the fluorescence from the tagged peptides, allowing for an accurate visualization of their penetration into the hair fibers.

[0199] The penetration of Keratin into the hair was studied using the protocol above. A solution of 0.14%Keratin and 1%Phenoxyethanol was prepared and the hair sample was soaked in it for the requisite time. The results in Fig. 12 below clearly show significant penetration into the hair cortex after just 3 hours of soaking. The Keratin is seen to permeate across the bulk of the fiber throughout the cortex.

[0200] To further understand the durability of the treatment, a release experiment was conducted. The DBP hair sample were first soaked in Keratin for 3 hrs allowing it to permeate into the hair. Keratin treated DBP hair was rinsed for 20 seconds, and dried at room temperature. Finally, this Keratin treated DBP hair was soaked overnight in water to allow the peptide to diffuse out. Subsequent confocal imaging (at the identical signal gain=500) in Fig. 13 below showed little or no change in the intensity of fluorescence throughout the bulk / cross-section of the hair. The data shows that Keratin is adsorbed into the hair matrix suggesting durable retention in the hair cortex.

[0201] The basic principles, main features and advantages of the present invention have been illustrated and described above. The technicians in this industry should understand that the present invention is not limited to the above examples. The above examples and descriptions are only to illustrate the principles of the present invention. Without departing from the spirit and scope of the present invention, the present invention will have various changes and improvements, which fall within the scope of the present invention. The scope of protection claimed by the present invention is defined by the appended claims and equivalents thereof.

Claims

1.A recombinant human keratin, which comprises or consists of an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 1 or variant thereof; wherein the variant has a sequence identity of at least 70%, 80%, 90%, 95%, or 99%as compared to the sequence as set forth in SEQ ID NO: 1, and the variant substantially retains the biological function of the sequence from which it is derived.2.A fusion protein, which comprises the recombinant human keratin according to claim 1 and an additional protein or polypeptide.3.The fusion protein according to claim 2, the additional protein or polypeptide is selected from the group consisting of tags, signal peptides, or any combination thereof;preferably, the additional protein or polypeptide is connected to the N-terminal or C-terminal of the recombinant human keratin optionally via a linker.4.A nucleic acid molecule, which comprises a nucleotide sequence encoding the recombinant human keratin according to claim 1, or the fusion protein according to claim 2 or 3.5.The nucleic acid molecule according to claim 4, the nucleotide sequence is optimized with a codon for expression in prokaryotic cells or eukaryotic cells.6.The nucleic acid molecule according to claim 4 or 5, the nucleotide sequence is as set forth in SEQ ID NO: 2.7.A vector, which comprises the nucleic acid molecule according to claim 6.8.A host cell, which comprises the nucleic acid molecule according to any one of claim 4-6 or the vector according to claim 7.9.A method for preparing the recombinant human keratin according to claim 1 or the fusion protein according to claim 2 or 3, comprising culturing the host cell according to claim 8 under a condition that allows expression of the recombinant human keratin or fusion protein, and recovering the recombinant human keratin or fusion protein from the cultured host cell culture.10.The method according to claim 9, wherein, the method for culturing the host cell is selected from the primary culture method, secondary culture method, adherent cell culture method, suspension cell culture method, or fermentation method.11.The method according to claim 9 or 10, wherein, the method for culturing the host cell according to claim 8 is the fermentation method;preferably, the fermentation method involves culturing the host cell in a liquid culture medium in a seed shake bottle; after the culture is completed, the seed liquid is inoculated into a fermentation tank, fermentation, induced to express, to obtain a fermentation product, that is, the culture.12.A composition, which comprises the recombinant human keratin according to claim 1 or the fusion protein according to claim 2 or 3, and an additional component;preferably, the additional component is a component in hair care or hair care products;preferably, the concentration of recombinant human keratin in the composition is 0.01%to 0.2% (w / v) ;preferably, the concentration of recombinant human keratin in the composition is 0.02%(w / v) .13.The composition according to claim 12, wherein the composition further comprises a component selected from any one or more of the following:Polyquaternium-10, Cocoamidopropyl betaine, Sodium alcohol polyoxyethylene ether sulfate, coconut monoethanol amide, NaCl, p-Hydroxyacetophenone, Phenoxyethanol, 3- [2- (Ethylhexyl) oxyl] -1, 2-propandio, Citric acid.14.Use of the recombinant human keratin according to claim 1 or the fusion protein according to claim 2 or 3 or the composition according to claim 12 or 13 in hair care and hair care products.

Images