Cluster based non-metallic radionuclide drug conjugate, precursor thereof and their applications

Abstract

Provided are a non-metallic radionuclide drug conjugate and a precursor thereof, a pharmaceutical composition based on the drug conjugate or a precursor thereof, as well as use of the same in the field of disease prevention and / or treatment. Specifically, the non-metallic radionuclide drug conjugate comprises a targeting ligand, an optional spacer and a linker, a cluster comprising one or more metal atoms, and a non-metallic radionuclide selected from iodine, astatine or fluorine connected to the cluster via multiple coordination bonds. A separate administration of the conjugate precursor and the radionuclide is also provided.

Description

CLUSTER BASED NON-METALLIC RADIONUCLIDE DRUG CONJUGATE, PRECURSOR THEREOF AND THEIR APPLICATIONSTECHNICAL FIELD

[0001] The present invention relates to the field of precision medicine, and in particular to a non-metallic radionuclide drug conjugate and a precursor thereof, a pharmaceutical composition comprising the drug conjugate or a precursor thereof, and their use for disease prevention and / or treatment.BACKGROUND OF THE INVENTION

[0002] In nuclear medicine, diseases such as cancers are commonly treated by irradiating diseased tissues with radiation emitted by radionuclides (e.g., alpha rays, beta rays, etc. ) . Radiopharmaceuticals are a special class of drugs that use particles or rays emitted by radionuclides for medical diagnosis and treatment. This category includes both radionuclides and compounds labeled therewith, which are useful in the study of human physiology, pathology and in vivo drug behaviour. Widely used in cancer diagnosis and treatment, myocardial imaging, early detection of neurodegenerative diseases, and the imaging and diagnosis of inflammatory tissues, etc., radiopharmaceuticals enable rapid, non-destructive, and real-time imaging of physiological and pathological processes. They serve as a significant cornerstone of molecular imaging and precision medicine, and provide novel means and approaches for early diagnosis and timely treatment.

[0003] Driven by the trend of precision medicine, nuclear medicine is advancing toward precision targeting. However, some physical methods or the tissue absorption specificity may lead to incomplete and imprecise targeting. For example, thyroid cancer and its metastases specifically absorb iodine, and thus can be treated with iodine-131 (I-131) . Yttrium-90 (Y-90) microspheres enable radioembolization therapy via minimally invasive placement. However, these approaches are not widely applicable and are confined to specific scenarios.

[0004] In recent years, with the widespread clinical application of ligands with targeting and positioning effects (e.g., antibody-drug conjugates (ADCs) , peptide-drug conjugates (PDCs) , small molecule-drug conjugates (SMDCs) , etc. ) , the combinations of these ligands and radioactive chelators have formed a new technique, namely radionuclide-drug conjugates (RDCs) . Similar to ADCs, RDCs use specific targeting of antibodies, small molecules or peptides to deliver radionuclides (used as radiation or imaging agents) to the target locations. This concentrates the radiation generated by radionuclides in local tissues, reducing damage to other tissues caused by systemic exposure while providing efficient and accurate diagnosis and treatment. RDCs differ from ADCs in that the radionuclide payload in RDCs can be used for both diagnosis and treatment. In addition, RDCs are different from ADCs in structure. Specifically, RDCs require the introduction of specific structural fragments -chelators -for chelating radionuclides.

[0005] Specifically, in terms of drug structure, RDC mainly consists of a targeting ligand (e.g., an antibody, a peptide, or a small molecule) , a spacer, a linker, a chelator, and a radioisotope. Depending on the type of ligand, RDC can be divided into antibody-targeted radionuclide-antibody conjugates, small molecule (including peptide) -based radionuclide drug conjugates, etc. Depending on the type of radionuclide, RDCs have different functions, such as imaging, treatment, or both.

[0006] Currently, only several therapeutic RDCs are approved, including Lutathera (Lu-177dotatate, for treating somatostatin receptor-positive gastrointestinal neuroendocrine tumors) and Pluvicto (177Lu-PSMA-617, for treating prostate-specific membrane antigen (PSMA) -positive metastatic castration-resistant prostate cancer) from Novartis, and Zevalin (Y-90 ibritumomab tiuxetan, for treating non-Hodgkin's lymphoma) from Biogen. These approved RDCs all use metal radionuclides. At present, there is no report of any RDC drugs using non-metallic radionuclides.

[0007] A major challenge in developing RDC drugs with non-metallic radionuclides is the efficient coupling of non-metallic radionuclides to targeting ligands. Current method for coupling halogen radioisotopes (astatine and iodine) with targeting molecules is mainly through an organic chemical reaction based on an organotin precursor (J Nucl Med 2008; 49: 3-38) . In this method, organotin is used to activate the benzene ring, and then astatine or iodine is oxidised to +1 valence and undergoes an electrophilic substitution reaction with the organotin-activated benzene ring. However, this method suffers from a complex process, long reaction time, low yield, and neurotoxicity of organotin, which restricts its clinical transformation. Although a few studies report the coupling of metal-containing molecules with non-metal radionuclides (Bioconjugate Chem. 2008, 19, 958-965) , the metal-to-non-metal ratios are generally 1, i.e., one metal molecule bound to one non-metal radionuclide, resulting in a weak binding insufficient for clinical application. In addition, such a method has disadvantages such as high reaction temperature, long reaction time and low yield, hindering its application.

[0008] There is a pressing need to develop more therapeutic RDCs, or diagnostic and therapeutic RDCs, to meet the growing demands of precision medicine.SUMMARY OF THE INVENTION

[0009] In order to solve the aforementioned technical problem, the present invention proposes a non-metallic radionuclide drug conjugate and a precursor thereof, a pharmaceutical composition based on the drug conjugate or a precursor thereof, as well as use of the same in the field of disease prevention and / or treatment.

[0010] In one aspect, the invention provides a non-metallic radionuclide drug conjugate having a structure according to Formula I, (LG) m- (S) o- (L) p-G-R (I)

[0011] wherein,

[0012] LG represents a targeting ligand;

[0013] S represents a spacer;

[0014] L represents a linker;

[0015] G represents a cluster comprising one or more metal atoms;

[0016] R represents a non-metallic radionuclide selected from iodine, astatine or fluorine;

[0017] m≥1;

[0018] o is 0 or 1;

[0019] p is 0 or 1;

[0020] when m≥2, each LG is the same or different from each other, and each LG is respectively connected to S, L or C, or each LG is connected to each other and then connected to S, L or C; and

[0021] wherein metal atoms in the cluster are connected to the non-metallic radionuclide via multiple coordination bonds.

[0022] In an embodiment, the targeting ligand is selected from a polypeptide, an antibody, a small molecule or other molecules capable of targeting a diseased tissue.

[0023] In an embodiment, the targeting ligand binds to PSMA, FRa, GPC3, FAP, PD1, PDL1, EGFR, HER2, αVβIII, SSTR, FORL1, TRPV6, FAP, C-MET, CAIX, RGD, RAZ8009, α-MSH, Hepsin or, Sigma, or other targets.

[0024] In the present invention, the LG can vary, and not limited to the above-mentioned targeting ligands. The present invention does not make specific limitations on LG. For example, it can be a monovalent group (i.e., a secondary amino group, which can be connected to a carboxyl group of other structural fragments in the coupled drug to form an amide group) obtained by losing a hydrogen atom from a primary amino group in the structure (preferably a primary amino group located at the end of the main chain) , or a monovalent group (i.e., a carboxyl group, which can be connected to a secondary amino group of other structural fragments in the coupled drug to form an amide group) obtained by losing a hydroxyl group in the structure (preferably a carboxyl group located at the end of the main chain) , or a monovalent group (such as an alkoxy group or an aryloxy group, which can be connected to a carboxyl group of other structural fragments in the coupled drug to form an ester group) obtained by losing a hydrogen atom from a hydroxyl group in the structure (preferably a hydroxyl group located at the end of the main chain) .

[0025] In an embodiment, the spacer comprises NHS or MAL (maleimide) , click chemistry module or other modules to form a chemical bond with NH2 or SH on the targeting ligand.

[0026] In an embodiment, the linker is selected from the group consisting of -NH (CH2) nCO-, -NH (CH2) nNH-, -OC (CH2) nCO-, -OC (CH2CH2O) nCH2CH2CO-, -NH (CH2CH2O) nCH2CH2CO-, -NH (CH2CH2O) nCH2CH2NH-, -CO-CH2 (NH-) CH2CH2CH2NHC=NH2NH2, -COCH2 (NH-) CH2-imidazole, -CO-CH2 (NH-) CH2, -CO-CH (NH-) CH (CH2) 2, -CO-CH2 (NH-) CH (CH2) CH2CH2, -CO-CH (NH-) CH2CH (CH2) 2, -CO-CH (NH-) CH2CH2-S-CH2, -CO-CH (NH-) CH2-phenyl, -CO-CH (NH-) CH2-p-methoxyphenyl and -CO-CH (NH-) CH2-β-indole, -NH- (CH2) n-1, 2, 3-triazole, -NH- (CH2CH2On) -1, 2, 3-triazole, -CO- (CH2) n-1, 2, 3-triazole, -CO- (CH2CH2On) -1, 2, 3-triazole, -NH- (CH2) n-1, 2, 3-S- (succinimid-3-yl-N) -, -NH- (CH2CH2On) -S- (succinimid-3-yl-N) -, -CO- (CH2) n-S- (succinimid-3-yl-N) -, -CO- (CH2CH2O) n-S- (succinimid-3-yl-N) -, -NH- (CH2) n-1, 2, 3- (succinimid-3-yl-N) -S-, -NH- (CH2CH2On) - (succinimid-3-yl-N) -S-, -CO- (CH2) n- (succinimid-3-yl-N) -S-, -CO- (CH2CH2On) - (succinimid-3-yl-N) -S-, wherein n is independently selected from 1-10.

[0027] In an embodiment, the cluster comprises only one type of metal atoms; or comprises a combination of multiple different types of metal atoms; and optionally further comprises doped non-metallic elements.

[0028] In an embodiment, the metal atoms in the cluster are selected from Au, Ag, Pt, Pd, Ir, Rh, Ru, Cu, Zn, Fe, Ni, Mn, Ba, Cr, Cu, Mo, Li, Al, Mg, and / or Ca; preferably comprising Au (gold) , Ag (silver) , Pt (platinum) , Zn (zinc) , Cu (copper) and / or Fe (iron) atoms; more preferably comprising Au (gold) atoms.

[0029] In an embodiment, the cluster has a size of less than 10 nm, preferably less than 5 nm, more preferably less than 2 nm; preferably, the nanocluster is spherical.

[0030] In an embodiment, the number of metal atoms in the cluster is from 1 to 1000, preferably from 4 to 80, more preferably from 4 to 30.

[0031] In an embodiment, the cluster is selected from the following structures: [ (Ph3P) 6Au6Ag6Pt (AgI3) 2] 2+, [Au13 (PMe2Ph) 10Cl2] 3+, [Au25 (SCH2CH2Ph) 18] -, [Pt2 (AuPPh3) 10Ag13Cl7] , [Au38 (SC2H4Ph) 24] , [Au37 (PPh3) 10 (SC2H4Ph) 10Cl2] +, [ (p-Tol3P) 12Au18Ag20Cl14] , [Au60Se2 (PPh3) 10 (SePh) 15] +, [Au23 (SCH2CH2Ph) 16] - and Au23 (SCH2CH2Ph) 17; or the cluster is nanoparticle. In an embodiment, the cluster is nanoparticle.

[0032] In an embodiment, the cluster is selected from the following table:

[0033] In an embodiment, the number of metal atoms in the cluster connected to each of the non-metallic radionuclide via coordination bonds is from 1 to 1000, preferably from 4 to 80, more preferably from 4 to 30.

[0034] In an embodiment, the cluster is connected to the linker via S, O, N or P.

[0035] In the present invention, G formed by the cluster can be various, and the present invention does not impose specific limitations on this. For example, it may be a carboxylic acid group (which can be connected to a secondary amino group of other structural fragments in the coupled drug to form an amide group) obtained by losing a hydroxyl group from a carboxyl group in the structure (preferably a carboxyl group located at the end of the main chain) .

[0036] In an embodiment, LG and G can be directly linked to form a radionuclide drug conjugate precursor (i.e., a drug conjugate precursor as shown in Formula II) , for example, the targeting ligand is linked to the carboxylic acid group (-C (=O) -) of the cluster through its secondary amino group (-NH-) to form an amide group (-NH- (C=O) -) .

[0037] Furthermore, the linker (i.e., L) in the radionuclide drug conjugate of the present invention can serve as an intermediate fragment to connect the cluster (G) and the targeting ligand (LG) ; alternatively, L may serve as an intermediate fragment to connect G and S when there is a spacer (S) in the structure of the drug conjugate precursor. In the present invention, the linker can be either cleavable (or degradable) or non-cleavable (or non-degradable) , and the latter is preferred.

[0038] In the present invention, the aforesaid L may be connected to LG, G and optionally S. For example, by a condensation reaction between an amino group and a carboxyl group; specifically, either the primary amino group in the linker compound (preferably the primary amino group located at the end of the main chain) is condensed with the carboxyl group in the other compound to form an amide group, or the carboxyl group in the linker compound (preferably the carboxyl group located at the end of the main chain) is condensed with the primary amino group in the other compound to form an amide group.

[0039] In the present invention, the aforesaid S may be connected to LG, G and optionally L. For example, by a condensation reaction between an amino group and a carboxyl group; specifically, either the primary amino group in the spacer compound (preferably the primary amino group located at the end of the main chain) is condensed with the carboxyl group in the other compound to form an amide group, or the carboxyl group in the spacer compound (preferably the carboxyl group located at the end of the main chain) is condensed with the primary amino group in the other compound to form an amide group.

[0040] In an embodiment, the non-metallic radionuclide is selected from 123I, 124I, 125I, 131I, 211At and / or 18F.

[0041] In one aspect, the present invention provides a radionuclide drug conjugate precursor having a structure according to Formula II, (LG) m- (S) o- (L) p-G (II)

[0042] wherein,

[0043] LG represents a targeting ligand;

[0044] S represents a spacer;

[0045] L represents a linker;

[0046] G represents a cluster comprising one or more metal atoms;

[0047] m≥1;

[0048] o is 0 or 1;

[0049] p is 0 or 1;

[0050] when m≥2, each LG is the same or different from each other, and each LG is respectively connected to S, L or C at the same time, or each LG is connected to each other and then connected to S, L or C.

[0051] In one aspect, the present invention provides a method of preparing the non-metallic radionuclide drug conjugate of the present invention, comprising reacting the radionuclide drug conjugate precursor of the present invention with a salt of a non-metallic radionuclide selected from iodine, astatine, or fluorine such that the metal atoms in the cluster are connected to the non-metallic radionuclide via multiple coordinate bonds.

[0052] In an embodiment, the salt of the non-metallic radionuclide is an alkali metal salt, preferably a sodium salt or a potassium salt.

[0053] In an embodiment, the reaction is carried out at a temperature ranging from 12 to 80 degrees Celsius; the solvent of the reaction is water or another biocompatible solvent; and / or the reaction time is from 1 to 20 minutes.

[0054] In an embodiment, the reaction is carried out at a temperature ranging from 20 to 40 degrees Celsius; optionally the reaction comprises sonication or magnetic stirring.

[0055] In an embodiment, the method further comprises a step of passing the reaction solution through a chromatographic column to separate the product.

[0056] In the present invention, different structural fragments used to construct radionuclide drug conjugate precursor may be connected in series through amide groups, which can be formed by condensation reactions of primary amino groups (e.g., terminal amino groups in compounds forming linkers, spacers, or targeting ligands) and carboxyl groups (e.g., multiple carboxyl groups in compounds forming chelators) . Generally, the above condensation reaction may be carried out in the presence of a coupling reagent in order to activate the carboxylic acid as a better electrophilic reagent, which in turn facilitates the forward progress of the reaction.

[0057] Exemplary coupling reagents include, but are not limited to, EDC (1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide) , DCC (dicyclohexylcarbodiimide) , HOBt (1-hydroxybenzotriazole) , HATU (O- (7-azabenzotriazol-1-yl) -N, N, N', N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate) , etc. In addition, the formation of amide bonds can also be achieved by activating carboxylic acids with N-hydroxysuccinimide (NHS) to form succinimide esters, which can be further reacted with amines without any other coupling reagents.

[0058] In one aspect, the present invention provides a pharmaceutical composition comprising the radionuclide drug conjugate or the radionuclide drug conjugate precursor according to the present invention, and optionally at least one pharmaceutically acceptable excipient.

[0059] In an embodiment, the pharmaceutical composition is an injection or an implant, preferably an intravenous injection or an intratumoral injection.

[0060] In one aspect, the present invention provides a radionuclide drug conjugate or the radionuclide drug conjugate precursor according to the present invention, for use in the prevention and / or treatment of a disease or disorder.

[0061] In one aspect, the present invention provides the use of the radionuclide drug conjugate or the radionuclide drug conjugate precursor according to the present invention in the manufacture of a medicament for the prevention and / or treatment of a disease or disorder.

[0062] In one aspect, the present invention provides a method for the prevention and / or treatment of a disease or disorder, comprising administering the radionuclide drug conjugate or the radionuclide drug conjugate precursor according to the present invention;

[0063] optionally, the non-metallic radionuclide drug conjugate comprising 131I, 123I or 124I are administered to diagnose and obtain the distribution of the non-metallic radionuclide drug conjugates in vivo.

[0064] In an embodiment, the disease or disorder is selected from a cancer or an infectious disease.

[0065] In an embodiment, the cancer comprises solid tumor and / or non-solid tumor, for example, melanoma, non-small cell lung cancer, small cell lung cancer, head and neck cancer, urothelial carcinoma, breast cancer, gastrointestinal cancer, multiple myeloma, hepatocellular carcinoma, liver cancer, non-Hodgkin lymphoma, Hodgkin lymphoma, kidney cancer, mesothelioma, ovarian cancer, esophageal cancer, anal cancer, bile duct cancer, colorectal cancer, small intestine or appendix cancer, cervical cancer, thyroid cancer, salivary gland cancer, pancreatic cancer, bronchial cancer, prostate cancer, pancreatic cancer, gastric cancer, bladder cancer, brain or central nervous system cancer, peripheral nervous system cancer, uterine or endometrial cancer, oral or pharyngeal cancer, testicular cancer, adrenal cancer, osteosarcoma, chondrosarcoma and blood tissue cancer.

[0066] In an embodiment, the cancer is selected from prostate cancer, breast cancer, liver cancer, pancreatic cancer, ovarian cancer, gastric cancer, brain cancer, oral cancer, head and neck cancer, pharyngeal cancer, and lung cancer.

[0067] In an embodiment, the infectious disease is selected from bacterial and viral infections such as HIV infection, Ebola virus infection, tuberculosis, and plague.

[0068] In one aspect, the present invention provides a method of treating a disease in a patient with radiation therapy, comprising:

[0069] b) administering to the patient the radionuclide drug conjugate precursor of claim 13;

[0070] c) optionally, administering first non-metal radionuclides to the patient for imaging, wherein the first non-metal radionuclides are directly bound to the conjugate precursors in vivo, wherein the first non-metal radionuclides are 131I, 123I or 124I,

[0071] d) optionally, observing the distributions of the conjugate precursors in the patient in vivo by an imaging technique to screen patients being suitable for the radiation therapy and to obtain the relationship between the administered dose of the first non-metal radionuclides and the amount of the first non-metal radionuclides distributed in the tumor as the basis for calculating a suitable dose of the non-metal radionuclides for treatment, and

[0072] e) administering to the patient second non-metal radionuclides for treatment, wherein the second non-metal radionuclides are directly bound to the conjugate precursor in vivo, wherein the second non-metal radionuclides are 123I, 124I, 125I, 131I, 211At and / or 18F.

[0073] In an embodiment, before step b) , the method further comprises step a) saturating the patient by intravenously or orally administering KI, NaI, KClO4, NaClO4, methimazole or propylthiouracil; preferably saturating the patient’s thyroid by intravenously or orally administering KI, NaI, KClO4, NaClO4, methimazole or propylthiouracil.

[0074] In an embodiment, the method further comprises step f) monitoring the amount of the non-metal radionuclides in vivo by an imaging technique, and supplementing the second non-metal radionuclides when the amount is insufficient.

[0075] In an embodiment, the method comprises the following steps:

[0076] a) saturating the patient by intravenously or orally administering KI, NaI, KClO4, NaClO4, methimazole or propylthiouracil,

[0077] b) administering to the patient a plurality of conjugate precursors of claim 13,

[0078] c) optionally, administering first non-metal radionuclides to the patient for imaging, wherein the first non-metal radionuclides are directly bound to the conjugate precursors in vivo, wherein the first non-metal radionuclides are 131I, 123I or 124I,

[0079] d) optionally, observing the distributions of the conjugate precursors in the patient in vivo by an imaging technique to screen patients being suitable for the radiation therapy and to obtain the relationship between the administered dose of the first non-metal radionuclides and the amount of the first non-metal radionuclides distributed in the tumor as the basis for calculating a suitable dose of the non-metal radionuclides for treatment, and

[0080] e) administering to the patient second non-metal radionuclides for treatment, wherein the second non-metal radionuclides are directly bound to the conjugate precursors in vivo, wherein the second non-metal radionuclides are 123I, 124I, 125I, 131I, 211At and / or 18F and

[0081] f) monitoring the amount of the non-metal radionuclides in vivo by an imaging technique, and supplementing the second non-metal radionuclides when the amount is insufficient.

[0082] In an embodiment, wherein the imaging technique is a PET scan or an SPECT scan.

[0083] In an embodiment, wherein the administration route of the conjugate precursors is intra-arterial injection, intra-tumoral injection, intraperitoneal injection, oral administration, intra-vein administration, bladder instillation, or uterine instillation; and wherein the administration route of the non-metal radionuclides is oral administration, intravenous injection, intra-muscle injection or intra-peritoneal injection of non-metal radionuclide salts.

[0084] The present invention has the following advantages:

[0085] 1. The present invention connects non-metallic radionuclides with a cluster containing one or more metal atoms, which is different from the existing chelating agents such as DOTA that use non-metallic elements to chelate metal radionuclides, and is a completely novel concept. The non-metallic radionuclide drug conjugate of the present application can rapidly, efficiently, and easily couple iodine / astatine isotopes to target molecules, and is easier to translate into clinical applications compared to traditional labelling methods.

[0086] 2. The present invention uses metal atoms that have strong coordination ability with non-metallic radionuclides such as astatine or iodine. In addition, since a plurality of metal atoms form a cluster structure to bind non-metallic radionuclide ions, the binding capacity and binding stability of said structure for non-metallic radionuclides are greatly enhanced, and off-target effects and toxicity associated therewith can be effectively avoided.

[0087] 3. The non-metallic radionuclide drug conjugate of the present invention involves a simple preparation process, mild conditions and high product yield, and can be effectively applied to diagnosis and treatment based on non-metallic radionuclide.

[0088] 4. The size of the metal atoms in the cluster of the non-metallic radionuclide drug conjugate of the present invention is selected such that it has little impact on the targeting ability of the targeting molecule and has little toxicity due to its ability to be excreted from the kidney.

[0089] 5. The present invention first proposes the separate administration of the conjugate precursor and the radionuclide. This could significantly accelerate the removal of non-metallic radionuclides in vivo, and effectively addresses the issues, e.g., the nephrotoxicity and hematologic toxicity, presented in the existing radiopharmaceuticals. The conjugate precursor having a longer blood circulation time can be used to achieve higher tumor uptake. In addition, the conjugate precursor and the radionuclide can be stored separately, and the coupling between them occurs in vivo, which effectively solves the problem of radioactive self-destruction that occurs during the transportation and storage of traditional radiopharmaceutical molecules.BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

[0090] Figure 1 is the transmission electron microscope image of ultrasmall gold nanoparticles (gold atomic cluster) .

[0091] Figure 2 shows the dynamic light scattering pattern of ultrasmall gold nanoparticles (gold atomic cluster) .

[0092] Figure 3 shows the image of the product.

[0093] Figure 4 shows the FDG PET / CT imaging before and after treatment with the ultrasmall gold nanoparticles (gold atomic cluster) loaded with I-131.

[0094] Figure 5 shows the body weight of mice changed during treatment with radionuclide drug conjugate of this invention.

[0095] Figure 6 shows the tumor size change profile for the tumor-bearing mice treated with radionuclide drug conjugate of this invention in comparision to the control without treatment.DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

[0096] Unless otherwise stated, the terms used in the present invention have the following meanings.

[0097] As used herein, “target” or “drug target” refers to the binding site of a drug to a biological macromolecule of the body, primarily involving receptors, enzymes, ion channels, transporters, the immune system, genes, etc.

[0098] As used herein, “radionuclide” or “radioisotope” refers to unstable elements that can emit rays (or radiation) during the decay process. They include both naturally occurring elements and elements mainly produced by nuclear fission or nuclear fusion. According to the different rays released during the decay of radionuclides, they can be roughly divided into three categories: α, β, and γ.

[0099] As used herein, “drug conjugate” refers to a pharmaceutically acceptable compound that is formed by connecting fragments of different functions through optional connecting fragments and is able to exert corresponding activities, such as antibody-drug conjugates (ADCs) , polypeptide-drug conjugates (PDCs) , small molecule-drug conjugates (SMDCs) , radionuclide-drug conjugates (RDCs) , etc.

[0100] As used herein, “radionuclide drug conjugate” or “radioisotope drug conjugate” refers to a pharmaceutically acceptable compound formed by connecting fragments, including a chelator containing a radioisotope and a targeting ligand directed to at least one target, optionally via linkers and spacers, which can exert targeted radiotherapy activity. Specifically, the chelator moiety is used to chelate the radioisotope, the targeting ligand part is used to target one or more specific targets (e.g., receptors) , and the linker moiety and spacer moiety are used to connect the chelator moiety and the targeting ligand moiety to form the complete structure of the radionuclide drug conjugate. As used herein, “aradionuclide drug conjugate precursor” or “a radioisotope drug conjugate precursor” refers to the precursor form of the radionuclide drug conjugate where the chelator moiety has not yet chelated the radioisotope.

[0101] As used herein, “targeting ligand” refers to any molecule or moiety that can be targeted to a target site, target tissue, target organ, target cell or any molecular or moiety in the intracellular region of the target cell. In some embodiments, compared to non-target sites, non-target tissues, non-target organs, non-target cells, or non-target intracellular regions, the targeted ligand causes the portion attached to the targeted ligand to be distributed more in the target sites, target tissues, target organs, target cells, or target intracellular regions, for example, by at least 10%, 20%, 50%, 80%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400%, 500%, or more. In some embodiments, the targeted ligand can trigger or enhance the specific binding of conjugate compounds containing the targeted ligand with the target molecule, trigger or promote the endocytosis of the conjugate compounds by target cells, and trigger or promote the accumulation of the conjugate compounds around the target cells and / or their entry into the target cells.

[0102] As used herein, “ligand” may include a variety of chemical molecules or polypeptides, which have specific binding affinity for a selected target. The selected target may be a cell surface protein (e.g., a cell surface receptor or a cell surface antigen) , a specific protein, a cell, a tissue, an organ, etc. In some embodiments, the ligand can specifically bind to a cell surface receptor. In some embodiments, the ligand can specifically bind to a cell surface antigen.

[0103] As used herein, “pharmaceutical composition" refers to a composition for pharmaceutical use, which contains a small molecule drug, a polypeptide, an antibody (or an antibody-like ligand) or a conjugate thereof as an active pharmaceutical ingredient (API) , as well as other components (e.g., pharmaceutically acceptable excipients) . The pharmaceutical composition can be prepared through any method known to those skilled in the art. For example, conventional mixing, dissolving, granulating, emulsifying, grinding, encapsulating, embedding and / or lyophilizing processes.

[0104] As used herein, “pharmaceutically acceptable excipient” refers to auxiliary materials widely used in the field of medicament manufacture. The primary purpose of using excipients is to provide a pharmaceutical composition that is safe to use, stable in nature and / or has specific functional properties, and also to provide a method for dissolving the active ingredient at a desired rate after administration of the medicament to a subject or for facilitating efficient in vivo absorption of the active ingredient in the subject being administrated. A pharmaceutically acceptable excipient may be inert fillers or functional ingredients that provide a certain function to the pharmaceutical composition (such as stabilizing the overall pH of the composition or preventing the degradation of the active ingredients in the composition) . Examples of “apharmaceutically acceptable excipient” include, but are not limited to, binders, suspending agents, emulsifiers, diluents (or fillers) , granulating agents, adhesives, disintegrants, lubricants, anti-adhesive agents, glidants, wetting agents, gelling agents, absorption delay agents, dissolution inhibitors, enhancers, adsorbents, buffers, chelating agents, preservatives, colorants, flavoring agents, sweeteners, etc.

[0105] As used herein, the “two-step administration” and “separate administration” can be used interchangeably, and mean a separate administration of the conjugate precursor and the radionuclide.

[0106] The technical solutions of the present invention will be described hereinafter in connection with specific examples, and the following examples are provided for the purpose of further illustrating the present invention and not for limiting the scope of the present invention. Without departing from the spirit and scope of the present invention, various variations and improvements for specific embodiments of the present invention will be apparent to those skilled in the art.

[0107] The starting materials used in the present invention can be synthesized by methods known in the art or purchased by conventional commercial means. The isolation and purification of the compounds of the present invention can be achieved by methods known to those skilled in the art, including, but not limited to, column chromatography (CC) , high performance liquid chromatography (HPLC) , ultra-high performance liquid chromatography (UPLC) and the like. Structural identification of the compounds of the present invention may be achieved by methods known to those skilled in the art, including but not limited to nuclear magnetic resonance (NMR) , mass spectrometry (MS) and the like.

[0108] EXAMPLES

[0109] To make the objects and technical solutions of the present invention clearer, the present invention will be further described below in conjunction with specific examples. It should be understood that the examples are not intended to limit the scope of the invention. Further, specific experimental methods not mentioned in the following examples were carried out in accordance with a conventional experimental method.

[0110] Example 1: Exemplary synthesis of Au-based cluster and radionuclide drug conjugate of the present invention

[0111] 1.1 Synthesis of Ultrasmall Gold Nanoparticles (gold atomic cluster)

[0112] 1 mL of a 2.5%HAuCl4·3H2O solution and 1 mL of a 15 mg / mL trisodium citrate (Na3Cit·H2O) solution were added sequentially to 100 mL of pre-cooled deionized water at 4℃, and stirred thoroughly. 1 mL of 1.2 mg / mL NaBH4 solution was prepared in cold water. 0.2 mL of the prepared NaBH4 solution was added in a single step, followed by the slow dropwise addition of the remaining solution to the reaction system. The colour of the solution gradually changed to reddish-orange, indicating that the gold nanoparticles formed. The reaction system was stirred in an ice bath at 4℃ for 5 minutes. Then, 4 mg of SH-PEG (molecular weight: 4000) was added and stirred in an ice bath for 5 minutes to achieve surface modification and stabilization of the particles.

[0113] The average particle size of the ultrasmall gold nanoparticles is approximately 3.94 nm (see Figure 1) . The dynamic light scattering pattern of the ultrasmall gold nanoparticles indicates a dynamic optical size of 4.15 nm (see Figure 2) . Figure 3 shows the morphology of the obtained product.

[0114] 1.2 Synthesis of Ultrasmall Gold Nanoparticle Targeting Molecules

[0115] Different targeting ligands, including a short-chain α-MSH peptide derivative (430 μg) , a long-chain α-MSH peptide derivative (630 μg) , PSMA-PEG4-SH (300 μg) , PSMA-PEG8-SH (360 μg) , RAZ8009-SH (737 μg) , and a HER2 nanobody-SH (12.5 μg) , were added to 1 mg of ultrasmall gold nanoparticles respectively. The mixture was shaken at 37℃ for 60 minutes to promote the binding of thiol groups to the gold surface. After the reaction was completed, the mixture was purified by ultrafiltration to obtain the desired ultrasmall gold nanoparticle targeting molecules.

[0116] 1.3 131I-labeled Ultrasmall Gold Nanoparticle Targeting Molecules

[0117] The synthesized ultrasmall gold nanoparticle targeting molecules were mixed with the solution of Na131I and shaken at 37℃ for 10 minutes. After the reaction was completed, unbound or free 131I was removed by ultrafiltration. The product was collected and concentrated to obtain 131I-labeled ultrasmall gold nanoparticle targeting molecules. The radiolabeling rate of the obtained 131I-labeled ultrasmall gold nanoparticle targeting molecules could reach 99.9%.

[0118] Example 2: Synthesis of Other Ultrasmall Metal Nanoparticles

[0119] 2.1 Synthesis of Ultrasmall Silver Nanoparticles

[0120] 1 mL of a 2.5%AgNO3 solution and 1 mL of a 15 mg / mL trisodium citrate (Na3Cit·H2O) solution were added sequentially to 100 mL of pre-cooled deionized water at 4℃, and stirred thoroughly. 1 mL of 1.2 mg / mL NaBH4 solution was prepared in cold water. 0.2 mL of this prepared solution was added in a single step, followed by the slow dropwise addition of the remaining solution to the reaction system. The colour of the solution gradually changes from colourless to pale yellow with a slight opalescence, indicating the silver nanoparticles formed. The reaction system was stirred in an ice bath at 4℃ for 5 minutes. Then, 4 mg of SH-PEG (molecular weight: 4000) was added and stirred in an ice bath for 5 minutes to achieve surface modification and stabilization of the particles.

[0121] 2.2 Synthesis of Ultrasmall Pt Nanoparticles

[0122] 1 mL of a 2.5%H2PtCl6·6H2O solution and 1 mL of a 15 mg / mL trisodium citrate (Na3Cit·H2O) solution were added sequentially to 100 mL of pre-cooled deionized water at 4℃, and stirred thoroughly. 1 mL of 1.2 mg / mL NaBH4 solution was prepared in cold water. 0.2 mL of this prepared solution was added in a single step, followed by the slow dropwise addition of the remaining solution to the reaction system. The color of the solution gradually changed from light yellow to gray-black, indicating that the Pt nanoparticles had formed. The reaction system was stirred in an ice bath at 4℃ for 5 minutes. Then, 4 mg of SH-PEG (molecular weight: 4000) was added and stirred in an ice bath for 5 minutes to obtain surface-modified ultrasmall Pt nanoparticles.

[0123] The synthesized ultrasmall Pt nanoparticle targeting molecule was mixed with a Na131I solution and reacted at 37℃ with shaking for 10 minutes. After the reaction was completed, unbound or free 131I was removed by ultrafiltration. The product was collected and concentrated to obtain 131I-labeled ultrasmall Pt nanoparticle targeting molecules. The radiolabeling rate of the obtained 131I-labeled ultrasmall Pt nanoparticle targeting molecules could reach 97.5%.

[0124] 2.3 Synthesis of Ultrasmall Copper Nanoparticles

[0125] 1 mL of 2.5%CuSO4·5H2O solution and 1 mL of 15 mg / mL trisodium citrate (Na3Cit·H2O) solution were added sequentially to 100 mL of pre-cooled deionized water at 4℃, and stirred thoroughly. 1 mL of 1.2 mg / mL NaBH4 solution was prepared in cold water. 0.2 mL of this prepared solution was added in a single step, followed by the slow dropwise addition of the remaining solution to the reaction system. The color of the solution gradually changed from light blue to reddish-brown, indicating the copper nanoparticles formed. To prevent oxidation, the entire process was performed under a nitrogen atmosphere. The reaction system was stirred in an ice bath at 4 ℃ for 5 minutes. Then, 4 mg of SH-PEG (molecular weight: 4000) was added and stirred in an ice bath for 5 minutes to improve the dispersibility and antioxidant stability of the particles.

[0126] Example 3: High-dose Labeling of Ultrasmall Gold Nanoparticles

[0127] 1 mg of PEG-SH (molecular weight: 2000) was added to 20 mL of ultrasmall gold nanoparticle solution (50 μg / mL) , mixed thoroughly and shaken for 30 minutes for reaction. The solution was then centrifuged at 4000 rpm for 5 minutes using a 100 kDa ultrafiltration tube and concentrated to 200 μL. The concentrated nanoparticle solution showed no precipitation, indicating good stability. A solution of 178.15 mCi of 131I was added and shaken at 37℃ for 10 minutes. The solution was then centrifuged at 300 rpm for 5 minutes using a 100 kDa ultrafiltration tube. The supernatant and filtrate were collected respectively, and their radioactive activities were measured to assess the radiolabeling rate of 131I on the nanoparticles. The results showed that 1 mg of ultrasmall gold nanoparticles could be labeled with 178 mCi of 131I, with a radiolabeling rate of 99.96%.

[0128] Example 4: Radiolabeling Stability of 131I-labeled Ultrasmall Gold Nanoparticles

[0129] Labeling Method: Following the aforementioned procedure, the labeling was performed by shaking ultrasmall gold nanoparticles and Na131I solution at 37℃ for 10 minutes. After purification, 131I-labeled ultrasmall gold nanoparticles were obtained.

[0130] 131I-labeled ultrasmall gold nanoparticles were added to different test media (specific media compositions are shown in Table 1) and incubated at 37℃ with shaking for 1 hour. After incubation, the nanoparticles were purified by ultrafiltration, and their radioactive activities were measured and the radioactive activity retention rate was calculated. The experimental results showed that the radiolabeling rate remained between 94.8%and 97.5%in serum and highly oxidizing conditions, indicating that binding is stable. The binding rate in whole blood was 87.7%, indicating that the binding strength remained high in the actual in vivo environment and met the stability requirements during blood perfusion.

[0131] Table 1 Radiolabeling Stability of 131I-labeled Ultrasmall Gold Nanoparticles

[0132] Example 5: Radiolabeling Stability of Ultrasmall Gold Nanoparticle-Based RDC

[0133] Labeling Method: Following the aforementioned procedure, the labeling was performed by shaking ultrasmall gold nanoparticles and Na131I solution at 37℃ for 10 minutes. After purification, ultrasmall gold nanoparticle-based radionuclide drug conjugates (RDC) were obtained.

[0134] Both radionuclide drug conjugates (RDC) were added to culture medium and incubated at 37℃ with shaking for 1 hour. After incubation, the conjugates were purified by ultrafiltration, their radioactive activities were measured, and the individual radioactive activity retention rate was calculated. As shown in Table 2, the experimental results showed that the radioactive activity retention rates of both RDCs in culture medium were above 96%, meeting the stability requirements for cell-based experiments.

[0135] Table 2

[0136] Example 6: Cell-Targeted Binding of Ultrasmall Gold Nanoparticle-Based Radioactive Drug Conjugates (RDCs)

[0137] 1. Plating: 106 cells / well were seeded and 3 ml of fresh culture medium was added in a six-well plate, and incubated overnight.

[0138] 2. Preparation for Administration: An appropriate amount of fresh culture medium was pipetted into a 50 ml centrifuge tube, and then an appropriate amount of ultrasmall gold nanoparticle-based radionuclide drug conjugate (RDC) was added and mixed gently.

[0139] 3. Treatment for Administration: Discarded the culture medium with a pipette and added 300 μL of fresh culture medium in step 2. Incubated for three time periods: 1, 2 and 4 hours.

[0140] 4. Sampling and Processing: Taken four tubes, and labeled as Tube 1, Tube 2, Tube 3 and Tube 4. The culture medium from each well were added in Tube 1. Washed three times with 1× PBS. The first two washes were added to Tube 2, and the third washes was added to Tube 3. Then, 500 μL of trypsin was added to digest 1-3 minutes. 500 μL of fresh culture medium was added to terminate the digestion. The resulting digestion solution was added to Tube 4, for determining the Counts.

[0141] 5. Data Processing: The ratio of cell uptake Counts in each well to the total Counts in each well was calculated.

[0142] Cell binding of ultrasmall gold nanoparticle-based radionuclide drug conjugates (RDC) with different targeting molecules and drug concentrations (incubation for 1 h) . Ultrasmall gold nanoparticles modified with RAZ8009-SH, α-MSH short chain and α-MSH long chain were co-incubated with cells at different drug concentrations (2, 0.2, and 0.02 ng) for 1h. The percent of cellular binding to the total radioactivity was measured and calculated.

[0143] Polypeptide 1 (α-MSH short-chain) : Cys-Gly-Gly-Nle-cyc (Asp-His-D-Phe-Arg-Trp-Lys)

[0144] Polypeptide 2 (α-MSH long chain) : Cys-Gly-Ser-Gly-Ser-Gly-Ser-Gly-Gly-Nle-cyc (Asp-His-D-Phe-Arg-Trp-Lys)

[0145] Experimental Results: As shown in Table 3, radionuclide drug conjugates with all three targeting molecules exhibited excellent cell-targeting binding properties. The radionuclide drug conjugate with RAZ8009-SH targeting molecule achieved a cellular binding percent of 79.00%, and the radionuclide drug conjugates with the two α-MSH targeting molecules achieved respectively a maximum cellular binding percent of above 33%.

[0146] These experimental results showed preliminarily that the RDC of the present invention could achieve target recognition and radiolabel delivery at the cellular level, supporting further in vivo efficacy verification.

[0147] Table 3

[0148] Example 7: Biodistribution study of the radionuclide drug conjugate of the present invention

[0149] The radionuclide drug conjugate used in this example was prepared according to the above Examples.

[0150] 7.1 The in vivo distribution of One-step Administration

[0151] Objective: To investigate the in vivo distribution pattern of gold-based RDC drugs in C57BL / 6J mice, providing a basis for evaluating their metabolic behavior and targeting performance in vivo.

[0152] Establishment of Animal Model: Several 5-week-old male C57BL / 6J mice were selected and fed in an SPF-level animal facility for one week to acclimatize. When the state of mice was stable, the hair on their right hind legs was shaved. B16 melanoma cells in the logarithmic growth phase were taken the next day, digested with trypsin, resuspended in PBS, and washed three times by centrifugation. By counting, the cell concentration was adjusted to 1×107 cells / mL. 50 μL (approximately 5×105 cells) of B16 cell suspension was subcutaneously inoculated into the right hind leg of each mouse. Approximately 5 days after inoculation, when the tumor volume reached 50-60 mm3, it was ready for subsequent experiments.

[0153] Dosage Regimen: The drugs used in this experiment are gold-based RDC radionuclide drug labeled with 131I. Administration route is tail vein injection. Each mouse received 300 μg of the RDC drug (calculated based on the mass of gold) , corresponding to radioactive activity of 1 mCi.

[0154] In vivo Distribution Experiment: Mice were sacrificed at 1 h, 2 h, 4 h, 8 h, 24 h, 7 d and 14 d after administration of drug. The heart, liver, spleen, lungs, kidneys, stomach, brain, thyroid, large intestine, small intestine, urine, bladder, bones and muscles were taken sequentially. Each tissue was weighed and measured for the radioactive activity, and the radioactive uptake rate of each tissue was calculated (expressed as ID% / g, where ID represents the total injected radioactive dose) .

[0155] The in vivo distribution of one-step distribution of 131I-ultrasmall gold nanoparticles: The experimental protocol was as follows: α-MSH functionalized ultrasmall gold nanoparticles (300 μg, 1 mCi) was administered via tail vein injection. Four hours after administration, the heart, liver, spleen, lungs, kidneys, stomach, thyroid, muscle, bone and tumor were taken sequentially. Each tissue was weighted and then measured for the radioactive activity. The percentage of radiotracer uptaken by tissue (expressed as ID% / g, ID represents the total injected radioactive dose) was calculated.

[0156] 7.2 The in vivo distribution of Two-step Administration

[0157] Objective: To investigate the in vivo capture capacity of gold-based RDC drugs for free 131I and their distribution pattern in vivo.

[0158] Establishment of Animal Model: Several 5-week-old male C57BL / 6J mice were selected and fed in an SPF-level animal facility for one week to acclimatize. When the state of mice was stable, the hair on their right hind legs was shaved. B16 melanoma cells in the logarithmic growth phase were taken the next day, digested with trypsin, resuspended in PBS, and washed three times by centrifugation. By counting, the cell concentration was adjusted to 1×107 cells / mL. 50 μL (approximately 5×105 cells) of B16 cell suspension was subcutaneously inoculated into the right hind leg of each mouse. Approximately 5 days after inoculation, when the tumor volume reached 50-60 mm3, it was ready for subsequent experiments.

[0159] Dosage Regimen: This experiment used a two-step administration. First, the gold-based RDC drugs not labeled with radionuclide were subcutaneously injected into the tumors of mice, 10 mg for each mouse. Then, the solution of 1 mCi of free Na131I was injected via the tail vein.

[0160] In vivo Distribution Experiment: Mice were sacrificed at 1 h, 2 h, 4 h, 8 h, 24 h, 7 d and 14 d after administration of Na131I. The heart, liver, spleen, lungs, kidneys, stomach, brain, thyroid, large intestine, small intestine, urine, bladder, bones and muscles were taken sequentially. Each tissue was weighed and measured for the radioactive activity, and the radioactive uptake rate of each tissue was calculated (expressed as ID% / g, where ID represents the total injected radioactive dose) .

[0161] Example 8: Toxicity study of the radionuclide drug conjugate of the present invention

[0162] The radionuclide drug conjugate used in this example was prepared according to the above Examples.

[0163] The toxicity of the compound was studied by the dose escalation method. After intravenous injection of radionuclide drug conjugate through the tail vein, mice from each toxicity experimental group were observed for abnormalities, such as death, bleeding, diarrhea, and skin redness and ulceration at the injection site. After dissection, the organs from mice in different injection dose groups of radionuclide drug conjugate were compared with those in the saline group in terms of size, color, shape, texture, and other manifestations. Specifically, the high-dose group received 1 mCi; the medium-dose group received 0.5 mCi; and the low-dose group received 0.1 mCi. The sections were stained, and observed under a microscope by two professional pathologists.

[0164] Example 9: In vivo imaging study of the radionuclide drug conjugate of the present invention in mice

[0165] The radionuclide drug conjugate used in this example was prepared according to the above Examples.

[0166] 9.1 The in vivo imaging of One-step Administration

[0167] Objective: To observe the in vivo distribution pattern and tumor-targeting enrichment characteristics of gold-based RDC drugs using SPECT / CT dynamic imaging.

[0168] Imaging Experiment: The drugs used in this experiment are gold-based RDC radionuclide drug labeled with 131I. Administration route is tail vein injection. Each mouse received 300 μg of the RDC drug (calculated based on the mass of gold) , corresponding to radioactive activity of 1 mCi. SPECT / CT imaging was performed 10 min, 30 min, 1 h, 2 h, 4 h, 8 h, 24 h, 7 d and 14 d after administration. During scanning, mice were maintained anesthesia in oxygen flow containing 1.5%of isoflurane (300 mL / min) . All imaging was performed using MILabs animal SPECT / CT system. The obtained SPECT / CT images were reconstructed using MILabs software, and post-processed and analyzed using PMOD software. Volumetric Interest Areas (VOI) of each organ and tumor were plotted in PMOD. The radioactive signal intensity of each tissue was calculated using quantitative tools to achieve the analysis of the spatiotemporal distribution of drugs in vivo.

[0169] 9.2 The in vivo imaging of Two-step Administration

[0170] Objective: To observe the in vivo capture effect of gold-based RDC drugs for free 131I and their retention characteristics in tumors, providing a basis for feasibility of the two-step administration of the radionuclide drug.

[0171] Imaging Experiment: This experiment used a two-step administration. First, the gold-based RDC drugs not labeled with radionuclide were subcutaneously injected into the tumors of mice, 10 mg for each mouse. Then, the solution of 1 mCi of free Na131I was injected via the tail vein. SPECT / CT imaging was performed 10 min, 30 min, 1 h, 2 h, 4 h, 8 h, 24 h, 7 d and 14 d after injection of free Na131I. During scanning, mice were maintained anesthesia in oxygen flow containing 1.5%of isoflurane (300 mL / min) . All imaging was performed using MILabs animal SPECT / CT system. The obtained SPECT / CT images were reconstructed using MILabs software, and analyzed using PMOD software. By selecting the Volumetric Interest Areas (VOI) of each organ and tumor in PMOD, quantitative analysis for the radioactive signal was performed using quantitative tools to evaluate the adsorption and enrichment capacity in vivo of the RDC material for free 131I.

[0172] Example 10: Study on the uptake of radionuclide drug conjugate of the present invention by animal tumor cell

[0173] The radionuclide drug conjugate used in this example was prepared according to Example 3.

[0174] 10.1 Animal Pharmacodynamic experiment for One-step Administration

[0175] Objective: To evaluate the therapeutic effect of the gold-based RDC radionuclide drug labeled with 131I (One-step Administration) on the subcutaneous B16 tumors in C57BL / 6J mice, and compared to control group in survival rate, tumor volume and weight changes.

[0176] Pharmacodynamic Experiment: A subcutaneous B16 tumor model in right hind legs of C57BL / 6J mice was established using the same method as described in Example 4. Administration began when the tumor volume reached 50-60 mm3. The mice were randomly divided into two groups: Experimental Group (One-step Administration; n=6-8 / group) : mice were administrated with 300 μg / mouse (based on mass of gold) of a gold-based RDC radionuclide drug via a tail vein injection, corresponding to a radioactive activity of 1 mCi 131I / mouse (injection intervals followed the established protocol) . Control Group (n=6-8 / group) : mice were administrated with an equal volume of physiological saline (or carrier solvent) via tail vein injection using the same treatment as that in Experimental Group. All mice were observed and recorded on days 1, 2, 4, 7, 14, 21 and 28 after administration.

[0177] Survival Observation: The survival status and death date of the mice from each group were recorded until the experimental endpoint (28 days) or upon meeting the euthanasia criteria. Kaplan-Meier survival curves were plotted based on the records.

[0178] Tumor Volume Measurement: The longest diameter (L, length) and the shortest diameter (W, width) perpendicular to the longest diameter of the tumor were measured using vernier calipers. The tumor volume was calculated using the formula: V (tumor volume) = L × W 2 / 2 (L is the length of the tumor, and W is the width of the tumor) . Measurements were taken and recorded at each specified time point. The mean tumor volume of each group was plotted as a Time-Volume curve (tumor growth curve) .

[0179] Record of Weight: The weights (g) of the mice were measured and recorded at each follow-up visit, and body weight change curves over time were plotted for each group.

[0180] Additional Endpoint: Tumors and major organs were collected for pathological or radiological / biochemical analysis at the experimental endpoint or upon meeting the criteria for euthanasia.

[0181] Experimental Procedure: α-MSH functionalized 131I-labeled ultrasmall gold nanoparticles (1 mg, 4.0 mCi) was injected intratumorally. The mice were conducted 18F-FDG-PET scans to determine the tumor activity one day before the injection and three days after injection. One mouse was in treatment group, and one mouse was in control group. Body weight and tumor size time curves were plotted.

[0182] Figure 4 shows the FDG PET / CT imaging before and after treatment with ultrasmall gold nanoparticles loaded with I-131. It can be seen that the tumor high-signal area in mice in the treatment group disappeared, while the tumor in mice in the control group developed rapidly and developed from low-signal to high-signal. This significantly demonstrated the effective therapeutic effect of ultrasmall gold nanoparticles on melanoma.

[0183] Table 5 below shows the SUV value of tumor site in FDG PET / CT imaging before and after treatment with the ultrasmall gold nanoparticles loaded with I-131 of this present application, wherein the SUV value of muscle is about 0.3. Results demonstrated that treating with ultrasmall gold nanoparticles can effectively delay tumor development. The SUV values in treatment group (using high dose 4 mCi of I-131) decreased from 3.1 to 2.0, and the SUV values in control group increased from 1.8 to 2.3.

[0184] Table 5

[0185] As shown in Figure 5, body weights of mouse changed during treatment. Due to the high malignancy of melanoma, all mouse experienced varying degrees of weight loss.

[0186] As shown in Figure 6, tumor volume in mice changed during treatment. Results demonstrated that α-MSH functionalized 131I-labeled ultrasmall gold nanoparticles showed significant inhibitory effect on melanoma in mouse. The tumor volume in the treatment group did not increase significantly, while the tumor volume in the control group increased to 3 times the original volume within 6 days.

[0187] 10.2 Animal Pharmacodynamic experiment for Two-step Administration

[0188] Objective: To evaluate the therapeutic effect of the gold-based RDC drug in combination with free 131I (Two-step Administration) on the subcutaneous B16 tumors in C57BL / 6J mice, and compared to control group in survival rate, tumor volume and weight changes.

[0189] Pharmacodynamic Experiment: A subcutaneous B16 tumor model in right hind legs of C57BL / 6J mice was established using the same method as described in Example 4. Administration began when the tumor volume reached 50-60 mm3. The mice were randomly divided into two groups: Experimental Group (Two-step Administration; n=6-8 / group) : mice were administrated with gold-based RDC drugs not labeled with radionuclide, 10 mg for each mouse. Then, the solution of 1 mCi of free Na131I / mouse was injected via the tail vein (injection intervals followed the established protocol) . Control Group (n=6-8 / group) : mice were administrated with an equal volume of physiological saline via intra-tumoral injection or vein administration (or RDC empty solvent was injected intratumorally and physiological saline was injected intravenously, to ensure consistent treatment) . All mice were observed and recorded on days 1, 2, 4, 7, 14, 21 and 28 after administration.

[0190] Survival Observation: The survival status and death date of the mice from each group were recorded until the experimental endpoint (28 days) or upon meeting the euthanasia criteria. Kaplan-Meier survival curves were plotted based on the records.

[0191] Tumor Volume Measurement: The longest diameter (L, length) and the shortest diameter (W, width) perpendicular to the longest diameter of the tumor were measured using vernier calipers. The tumor volume was calculated using the formula: V (tumor volume) = (L × W2)  / 2 (L is the length of the tumor, and W is the width of the tumor) . Measurements were taken and recorded at each specified time point. The mean tumor volume of each group was plotted as a Time-Volume curve (tumor growth curve) .

[0192] Record of Weight: The weights (g) of the mice were measured and recorded at each follow-up visit, and body weight change curves over time were plotted for each group.

[0193] Additional Endpoint: Tumors and major organs were collected for pathological or radiological / biochemical analysis at the experimental endpoint or upon meeting the criteria for euthanasia.

[0194] Example 11: The pharmacodynamic experiment of radionuclide drug conjugate in cell

[0195] This example conducted a crystal violet cell pharmacodynamic assay, the experimental procedure was as follow:

[0196] Step 1: Cells were plated in a 6-well plate with 50W or 100W per well. Cells were cultured for 12 hours until adherence.

[0197] Step 2: Cells were treated with different drugs (500 μL) for 2 hours, washed twice with PBS, and then were cultured after adding 2mL of fresh culture medium.

[0198] Step 3: Observing the status of cells after 2 or 3 days. Crystal violet staining was performed. Cell culture medium was removed, then adding 1mL of 4%paraformaldehyde (Servicebio, G1101) for fixation for 15 minutes, following by removing paraformaldehyde. Washing three times with PBS (Solarbio, P1020) . Each well was added 1.5mL of crystal violet staining solution (Servicebio, G101 4-50mL) , and incubated at room temperature for 10 minutes. Removing crystal violet staining solution, and washing three times with PBS.

[0199] Step 4: Observing and recording using a Leica microscope. Deeper blue represents more cells / higher activity; lighter blue represents fewer cells / lower activity.

[0200] While embodiments of the present invention have been shown and described above, it will be understood that they have been presented by way of example instead of limitation. Without departing from the principles and purposes of the present invention, those skilled in the art may make changes, modifications, substitutions and variations to the above embodiments within the scope of the present invention, and the changes, modifications, substitutions and variations are intended to be encompassed by the present invention.

Claims

1.A non-metallic radionuclide drug conjugate having a structure of Formula I,(LG) m- (S) o- (L) p-G-R(I)wherein,LG represents a targeting ligand;S represents a spacer;L represents a linker;G represents a cluster comprising one or more metal atoms;R represents a non-metallic radionuclide selected from iodine, astatine or fluorine;m≥1;o is 0 or 1;p is 0 or 1;when m≥2, each LG is the same or different from each other, and each LG is respectively connected to S, L or C, or each LG is connected to each other and then connected to S, L or C; andwherein metal atoms in the cluster are connected to the non-metallic radionuclide via multiple coordination bonds.2.The non-metallic radionuclide drug conjugate of claim 1, wherein the targeting ligand is selected from a polypeptide, an antibody, a small molecule or other molecules capable of targeting a diseased tissue.3.The non-metallic radionuclide drug conjugate of claim 1 or 2, wherein the targeting ligand binds to PSMA, FRa, GPC3, FAP, PD1, PDL1, EGFR, HER2, αVβIII, SSTR, FORL1, TRPV6, FAP, C-MET, CAIX, RGD, RAZ8009, α-MSH, Hepsin, Sigma, or other targets.4.The non-metallic radionuclide drug conjugate of any one of claims 1-3, wherein the spacer comprises NHS or MAL (maleimide) , click chemistry module or other modules to form a chemical bond with NH2 or SH on the targeting ligand.5.The non-metallic radionuclide drug conjugate of any one of claims 1-4, wherein the linker is selected from the group consisting of -NH(CH2) nCO-, -NH (CH2) nNH-, -OC (CH2) nCO-, -OC(CH2CH2O) nCH2CH2CO-, -NH (CH2CH2O) nCH2CH2CO-, -NH(CH2CH2O) nCH2CH2NH-, -CO-CH2 (NH-) CH2CH2CH2NHC=NH2NH2, -COCH2 (NH-) CH2-imidazole, -CO-CH2 (NH-) CH2, -CO-CH(NH-) CH (CH2) 2, -CO-CH2 (NH-) CH (CH2) CH2CH2, -CO-CH(NH-) CH2CH (CH2) 2, -CO-CH (NH-) CH2CH2-S-CH2, -CO-CH(NH-) CH2-phenyl, -CO-CH (NH-) CH2-p-methoxyphenyl and -CO-CH(NH-) CH2-β-indole, -NH- (CH2) n-1, 2, 3-triazole, -NH- (CH2CH2On) -1,2, 3-triazole, -CO- (CH2) n-1, 2, 3-triazole, -CO- (CH2CH2On) -1, 2, 3-triazole, -NH- (CH2) n-1, 2, 3-S- (succinimid-3-yl-N) -, -NH- (CH2CH2On) -S-(succinimid-3-yl-N) -, -CO- (CH2) n-S- (succinimid-3-yl-N) -, -CO-(CH2CH2O) n-S- (succinimid-3-yl-N) -, -NH- (CH2) n-1, 2, 3- (succinimid-3-yl-N) -S-, -NH- (CH2CH2On) - (succinimid-3-yl-N) -S-, -CO- (CH2) n-(succinimid-3-yl-N) -S-, -CO- (CH2CH2On) - (succinimid-3-yl-N) -S-, wherein n is independently selected from 1-10.6.The non-metallic radionuclide drug conjugate of any one of claims 1-5, wherein the cluster comprises only one type of metal atoms; or comprises a combination of multiple different types of metal atoms; and optionally further comprises doped non-metallic elements.7.The non-metallic radionuclide drug conjugate of any one of claims 1-6, wherein the metal atoms in the cluster are selected from Au, Ag, Pt, Pd, Ir, Rh, Ru, Cu, Zn, Fe, Ni, Mn, Ba, Cr, Cu, Mo, Li, Al, Mg, and / or Ca; preferably comprising Au (gold) , Ag (silver) , Pt (platinum) , Zn (zinc) , Cu (copper) and / or Fe (iron) atoms; more preferably comprising Au (gold) atoms.8.The non-metallic radionuclide drug conjugate of any one of claims 1-7, wherein the cluster has a size of less than 10 nm, preferably less than 5 nm, more preferably less than 2 nm.9.The non-metallic radionuclide drug conjugate of any one of claims 1-8, wherein the number of metal atoms in the cluster is from 1 to 1000, preferably from 4 to 80, more preferably from 4 to 30.10.The non-metallic radionuclide drug conjugate of any one of claims 1-9, wherein the cluster is selected from the following structures: [(Ph3P) 6Au6Ag6Pt (AgI3) 2] 2+, [Au13 (PMe2Ph) 10Cl2] 3+, [Au25 (SCH2CH2Ph) 18] -, [Pt2 (AuPPh3) 10Ag13Cl7] , [Au38 (SC2H4Ph) 24] , [Au37 (PPh3) 10 (SC2H4Ph) 10Cl2] +, [ (p-Tol3P) 12Au18Ag20Cl14] , [Au60Se2 (PPh3) 10 (SePh) 15] +, [Au23 (SCH2CH2Ph) 16] -and Au23 (SCH2CH2Ph) 17; or the cluster is nanoparticle.11.The non-metallic radionuclide drug conjugate of any one of claims 1-10, wherein the number of metal atoms in the cluster connected to each of the non-metallic radionuclide via coordination bonds is from 1 to 1000, preferably from 4 to 80, more preferably from 4 to 30.12.The non-metallic radionuclide drug conjugate of any one of claims 1-11, wherein the cluster is connected to the linker via S, N, O or P.13.The non-metallic radionuclide drug conjugate of any one of claims 1-12, wherein the non-metallic radionuclide is selected from 123I, 124I, 125I, 131I, 211At and / or 18F.14.A radionuclide drug conjugate precursor having a structure according to Formula II,(LG) m- (S) o- (L) p-G(II)wherein,LG represents a targeting ligand;S represents a spacer;L represents a linker;G represents a cluster comprising one or more metal atoms;m≥1;o is 0 or 1;p is 0 or 1;when m≥2, each LG is the same or different from each other, and each LG is respectively connected to S, L or C, or each LG is connected to each other and then connected to S, L or C.15.A method of preparing the non-metallic radionuclide drug conjugate of any one of claims 1-13, comprising reacting the radionuclide drug conjugate precursor of claim 14 with a salt of a non-metallic radionuclide selected from iodine, astatine, or fluorine such that the metal atoms in the cluster are connected to the non-metallic radionuclide via multiple coordinate bonds.16.The method of claim 15, wherein the salt of the non-metallic radionuclide is an alkali metal salt, preferably a sodium salt or a potassium salt.17.The method of claim 15 or 16, wherein the reaction is carried out at a temperature ranging from 12 to 80 degrees Celsius; the solvent of the reaction is water or other biocompatible solvent; and / or the reaction time is from 1 to 20 minutes.18.The method of any one of claims 15-17, wherein the reaction is carried out at a temperature ranging from 20 to 40 degrees Celsius; optionally the reaction comprises sonication or magnetic stirring.19.The method of any one of claims 15-18, further comprising a step of passing the reaction solution through a chromatographic column to separate the product.20.A pharmaceutical composition comprising the non-metallic radionuclide drug conjugate of any one of claims 1-13 or the radionuclide drug conjugate precursor of claim 14, and optionally at least one pharmaceutically acceptable excipient.21.The pharmaceutical composition of claim 20, which is an injection or an implant, preferably an intravenous injection or an intratumoral injection.22.The non-metallic radionuclide drug conjugate of any one of claims 1-13 or the radionuclide drug conjugate precursor of claim 14, for use in the prevention and / or treatment of a disease or disorder.23.Use of the non-metallic radionuclide drug conjugate of any one of claims 1-13 or the radionuclide drug conjugate precursor of claim 14 in the manufacture of a medicament for the prevention and / or treatment of a disease or disorder.24.A method for the prevention and / or treatment of a disease or disorder, comprising administrating the non-metallic radionuclide drug conjugate of any one of claims 1-13, or the combination of the radionuclide drug conjugate precursor of claim 14 and a non-metallic radionuclide selected from iodine, astatine or fluorine;optionally, the non-metallic radionuclide drug conjugate comprising 131I, 123I or 124I are firstly administrated for diagnosis to obtain the in vivo distribution of the non-metallic radionuclide drug conjugates by SPECT / CT or PET / CT imaging. If the in vivo distribution results meet expection, a following administration of radionuclide drug conjugate comprising 211At and / or 131I is performed for treatment.25.The method of claim 24, wherein the method further comprises saturating the target of the targeting ligand before the administration of the conjugate or the conjugate precursor, for example, by the administration of a targeting ligand that is the same as or different from the targeting ligand of the conjugate or the conjugate precursor.26.The use or method of any one of claims 23-25, wherein the disease or disorder is selected from a cancer or an infectious disease.27.The use or method of claim 26, wherein the cancer is selected from prostate cancer, breast cancer, liver cancer, pancreatic cancer, ovarian cancer, gastric cancer, brain cancer, oral cancer, head and neck cancer, pharynx cancer and lung cancer.28.The use or method of claim 26, wherein the cancer is brain cancer; and / or the conjugate or the conjugate precursor is brain-targeted.29.The use or method of claim 26, wherein the infectious disease is selected from bacterial and viral infections such as HIV infection, Ebola virus infection, tuberculosis, and plague.30.A method of treating a disease in a patient with radiation therapy, comprising:b) administering to the patient the radionuclide drug conjugate precursor of claim 14;c) optionally, administering to the patient first non-metal radionuclides for imaging, wherein the first non-metal radionuclides are directly bound to the conjugate precursors in vivo, wherein the first non-metal radionuclides are 131I, 123I or 124I,d) optionally, observing the distributions of the conjugate precursors in the patient in vivo by an imaging technique to screen patients suitable for the radiation therapy and to obtain the relationship between the administered dose of the first non-metal radionuclides and the amount of the first non-metal radionuclides distributed in the tumor as the basis for calculating a suitable dose of the non-metal radionuclides for treatment, ande) administering to the patient second non-metal radionuclides for treatment, wherein the second non-metal radionuclides are directly bound to the conjugate precursor in vivo, wherein the second non-metal radionuclides are 123I, 124I, 125I, 131I, 211At and / or 18F.31.The method of claim 30, wherein before step b) , the method further comprises step a) saturating the patient by intravenously or orally administering KI, NaI, KClO4, NaClO4, methimazole or propylthiouracil; preferably saturating the patient’s thyroid by intravenously or orally administering KI, NaI, KClO4, NaClO4, methimazole or propylthiouracil.32.The method of claim 30 or 31, further comprising step f) monitoring the amount of the non-metal radionuclides in vivo by an imaging technique, and supplementing the second non-metal radionuclides when the amount is insufficient.33.The method of any one of claims 30-32, wherein the method comprising the following steps:a) saturating the patient by intravenously or orally administering KI, NaI, KClO4, NaClO4, methimazole or propylthiouracil,b) administering to the patient a plurality of conjugate precursors of claim 14,c) optionally, administering to the patient first non-metal radionuclides for imaging, wherein the first non-metal radionuclides are directly bound to the conjugate precursors in vivo, wherein the first non-metal radionuclides are 131I, 123I or 124I,d) optionally, observing the distributions of the conjugate precursors in the patient in vivo by an imaging technique to screen patients suitable for the radiation therapy and to obtain the relationship between the administered dose of the first non-metal radionuclides and the amount of the first non-metal radionuclides distributed in the tumor as the basis for calculating a suitable dose of the non-metal radionuclides for treatment, ande) administering to the patient second non-metal radionuclides for treatment, wherein the second non-metal radionuclides are directly bound to the conjugate precursors in vivo, wherein the second non-metal radionuclides are 123I, 124I, 125I, 131I, 211At and / or 18F andf) monitoring the amount of the non-metal radionuclides in vivo by an imaging technique, and supplementing the second non-metal radionuclides when the amount is insufficient.34.The method of any one of claims 30-33, wherein the imaging technique is a PET scan or a SPECT scan.35.The method of any one of claims 30-34, wherein the administration route of the conjugate precursors is intra-arterial injection, intra-tumoral injection, intraperitoneal injection, oral administration, intra-vein administration, bladder instillation, or uterine instillation; and wherein the administration route of the non-metal radionuclides is oral administration, intravenous injection, intra-muscle injection or intra-peritoneal injection of the salt of the non-metal radionuclide.

Images