Combination for treating glioma

Abstract

Provided is a combination of oncolytic virus and temozolomide (TMZ) for use in treating glioma and a method of treating TMZ-resistant glioma, wherein the oncolytic virus expresses an interferon encoded by SEQ ID NO: 2, 3 or 4. A kit for treating glioma is also provided, which comprises an oncolytic adenovirus and TMZ, wherein the oncolytic adenovirus expresses consensus interferon and the oncolytic adenovirus and TMZ are in the same or different containers.

Description

COMBINATION FOR TREATING GLIOMA

[0001] CROSS REFERENCE TO RELATED APPLICATIONS

[0002] This application claims the priority of PCT Application No. PCT / CN2023 / 122421, filed on September 28, 2023 and titled with “COMBINATION FOR TREATING GLIOMA” , and the disclosure of which is hereby incorporated by reference in its entirety.FIELD

[0003] The present invention relates to the field of tumor therapy, particularly to a combination of oncolytic virus and temozolomide (TMZ) for use in treating glioma and a method of treating TMZ-resistant glioma.BACKGROUND

[0004] Glioblastoma (GBM) , which accounts for 55% of all primary malignant brain tumors, is characterized by its highly malignant nature, poor prognosis, and tendency to recur. Newly diagnosed GBM patients have a median survival time of less than 20 months, with a 5-year survival rate of only 5%. The primary treatment approaches for GBM include surgical resection and postoperative chemoradiotherapy, while alternative methods encompass targeted therapy, immunotherapy, and tumor electric field therapy. Despite these efforts, the survival time of GBM patients remains unacceptably static, and the development of novel drugs faces substantial obstacles and a high failure rate. Furthermore, recurrent GBM lacks proven interventions and standardized therapy. Consequently, GBM's five-year survival rate has exhibited meager progress over the past three decades, highlighting a pressing need for effective interventions.

[0005] Notably, the use of oncolytic viruses has shown significant efficacy in treating recurrent GBM. The oncolytic virus Delytact (G47Δ) , in particular, has obtained conditional approval for market release in Japan based on its impressive survival benefits, observed in a Phase II clinical trial. Following OV treatment, the median overall survival for recurrent glioblastoma was 20.2 months.

[0006] OVs are viruses that occur naturally or are genetically modified to have the ability to replicate within tumor cells. Their antineoplastic efficacy stems primarily from their direct tumor-killing effect and their indirect antitumor immunity effect. OVs can cause direct lysis of tumor cells by propagating within them. Additionally, by recruiting immune cells to the site of infection and exposing tumor antigens subsequent to tumor cell lysis, oncolytic virus therapy can indirectly alter the local tumor immune environment from "cold" to "hot, " triggering an antitumor immune response. This effect has been implicated as a possible reason for long-term survival in cases of recurrent glioblastoma multiforme (GBM) in clinical trials. However, the immune environment also plays a role in clearing OVs. Therefore, accurately regulating the tumor immune environment in relation to OVs at various stages while facilitating effective viral replication and inducing long-term antitumor immune effects simultaneously has become an important direction for the next generation of OV therapy.SUMMARY

[0007] In the study, the inventors unexpected found that oncolytic adenovirus (for example YSCH-01, disclosed in CN111363726A) could be used to treat glioma and particularly, shows a surprising therapeutic effect on TMZ-resistant glioma. In addition, the combination therapy of oncolytic adenovirus and TMZ shows a surprising therapeutic effect on treating glioma. On this basis, the present invention is completed.

[0008] The inventors have developed a Cancer Targeting Gene-Viro-Therapy (CTGVT) strategy by creating an oncolytic adenovirus (named YSCH-01) that incorporates an interferon-like immune anticancer gene (L-IFN) . Bases on the previous study, a new recombinant interferon termed sIFN-I was optimized, which was verified to possess a better affinity for IFNAR1 and exhibited an extended half-life in mice against solid tumors. Therefore, an interferon-like immune anticancer gene (L-IFN) carried by a double-regulated replicating human adenovirus type 5 was developed and YSCH-01 was constructed. The inserted L-IFN gene replicates within the tumor cells, along with the viral vector. Consequently, a substantial amount of L-IFN protein is expressed within the tumor cells and secreted into the extracellular space. By administering the L-IFN drug with the OV through direct injection, the CTGVT strategy of the present invention capitalizes on an optimal time-window for virus replication and therapeutic gene expression (L-IFN) . Comprehensive in vitro and in vivo studies have been conducted to validate the safety and efficacy of the oncolytic adenovirus. These investigations strongly support the modification strategy of the present invention, which exhibits enhanced potential for achieving an impactful oncolytic effect on tumor treatment.

[0009] In the first aspect, the present invention provides a method of treating temozolomide (TMZ) -resistant glioma, comprising administering a therapeutically effective amount of an oncolytic adenovirus expressing consensus interferon to the subject in need thereof. The present invention provides the oncolytic adenovirus expressing consensus interferon for use in the treatment of TMZ-resistant glioma.

[0010] In some embodiments, the consensus interferon is encoded by SEQ ID NO: 2, 3 or 4. In some other embodiments, the oncolytic adenovirus is deposited at China Center for Type Culture Collection, under Accession number CCTCC NO: V201871, CCTCC NO: V201957 or CCTCC NO: V201958. In some embodiments, the oncolytic adenovirus is administered by intratumoral injection, intravenous injection intraperitoneal injection or perfusion, preferably intratumoral injection.

[0011] In the second aspect, the present invention provides a combination therapy method of treating glioma, comprising administering a therapeutically effective amount of an oncolytic adenovirus expressing consensus interferon and TMZ to the subject in need thereof.

[0012] In some embodiments, the consensus interferon is encoded by SEQ ID NO: 2, 3 or 4. In some other embodiments, the oncolytic adenovirus is deposited at China Center for Type Culture Collection, under Accession number CCTCC NO: V201871, CCTCC NO: V201957 or CCTCC NO: V201958.

[0013] In some embodiments, the oncolytic adenovirus is administered by intratumoral injection, intravenous injection intraperitoneal injection or perfusion, preferably intratumoral injection; and TMZ is administered by oral route. In some other embodiments, the oncolytic adenovirus and TMZ are administered in the same treatment cycle or different treatment cycles.

[0014] In the third aspect, the present invention provides a combination of an oncolytic adenovirus and TMZ for use in treating glioma, wherein the oncolytic adenovirus expresses consensus interferon.

[0015] In some embodiments, the consensus interferon is encoded by SEQ ID NO: 2, 3 or 4. In some other embodiments, the oncolytic adenovirus is deposited at China Center for Type Culture Collection, under Accession number CCTCC NO: V201871, CCTCC NO: V201957 or CCTCC NO: V201958.

[0016] In some embodiments, the oncolytic adenovirus is administered by intratumoral injection, intravenous injection intraperitoneal injection or perfusion, preferably intratumoral injection; and TMZ is administered by oral route. In some other embodiments, the oncolytic adenovirus and TMZ are administered in the same treatment cycle or different treatment cycles.

[0017] In the fourth aspect, the present invention provides a kit for treating glioma, comprising an oncolytic adenovirus and TMZ, wherein the oncolytic adenovirus expresses consensus interferon, the oncolytic adenovirus and TMZ are in different containers.BRIEF DESCRIPTION OF DRAWINGS

[0018] FIG. 1. Modified oncolytic adenovirus armed with recombinant Type I interferon (L-IFN) specifically targeted glioma cells. (A) Schematic representation of viral genetic modification. The upper represents OncoMul-V2 and the lower is YSCH-01. (B) Four glioma cell lines, one GBM patient-derived primary cell, and HFF-1 lines were respectively incubated with the virus for 96 h and cell viability assays were performed to evaluate IC50. (C) The representative images of 3D culture of patient derived glioma tumor tissue administrated with modified oncolytic adenovirus carrying GFP gene. (D) Concentration of L-IFN in supernatant of GBM patient-derived primary cell 72 h after YSCH-01 / Replication-defective YSCH-01 / OncoMul-V2 / Mock treatment.

[0019] FIG. 2. Syrian hamster model verified the safety of intracranial injection of YSCH-01. (A) Syrian hamsters permitted adenovirus multiplicities of infection. YSCH-01 was injected into healthy hamsters’ hemiencephalon. (B) The body weight of male (n = 4) and female (n = 4) hamsters after virus injection. (C-E) We injected YSCH-01 into a group of healthy hamsters and perfused hamsters (n = 6) in batches to detect L-IFN expression and YSCH-01 copies in brain and peripheral organs. (F) The representative HE staining images of organ slices after YSCH-01 treatment.

[0020] FIG. 3. Growth suppression of glioma subcutaneous xenografts by intratumoral injection of YSCH-01. (A) Flow diagram of experiments to test the efficacy of YSCH-01 in subcutaneous LN-229 xenograft immunodeficient mice models. (B) The time plot of Balb / c-nude mice’s LN-229 tumor volumes after drug treatment (Vehicle, OncoMul-V2, YSCH-01, n = 5) . (C) The representative HE staining images of LN-229 xenograft tumor sections (injection site) 13 days after drug treatments. Scale bar (upper 400μm; nether 100μm) . (D) Flow diagram of experiments to test the efficacy of YSCH-01 in subcutaneous U-118 MG xenograft immunodeficient mice models. (E) The time plot of Balb / c-nude mice’s U-118 MG tumor volumes after drug treatment (Vehicle, OncoMul-V2, YSCH-01) . (F) The representative HE staining images of U-118 MG xenograft tumor sections (injection site) 13 days after drug treatments. Scale bar (upper 400μm; nether 100μm) . Tumor volume = (long axis x minor axis2)  / 2.

[0021] FIG. 4. The oncolytic effect of YSCH-01 was further verified by intracranial glioma xenograft and patient-derived tumor xenograft. (A) Flow diagram of testing the efficacy of YSCH-01 in intracranial U-87 MG xenograft immunodeficient mice models. (B) Changes in tumor fluorescence intensity after drug administration (Vehicle, YSCH-01, triple injection of YSCH-01, n = 6 for each group) . (C) Survival curves after drug administration (Vehicle, YSCH-01, triple injection of YSCH-01, n = 6 for each group) (Vehicle-YSCH-01: P=0.0029; Vehicle-YSCH-01QW3: P=0.0014; YSCH-01- YSCH-01QW3: P=0.2693) , n. s., not significant, **P < 0.01, Log-rank (Mantel-Cox) test. (D) The representative fluorescence imaging of the U-87 MG tumor. (E) The time plot of U-87 MG tumor volumes after drug treatment (Vehicle, OncoMul-V2, YSCH-01, n = 5 for each group) in subcutaneous xenograft immunodeficient mice models. (F) Flow diagram of establishing subcutaneous patient-derived tumor xenograft immunodeficient mice models. (G) The time plot of Balb / c-nude mice’s PDX tumor volumes after drug treatment (Vehicle, TMZ, YSCH-01, n = 10 for each group) . (H) Long efficacy of YSCH-01 with a single dose of YSCH-01 (n = 5 for each group) .

[0022] FIG. 5. Exploration on the antitumor mechanism of YSCH-01. (A) Flow cytometry was used to detect the apoptosis of LN-18 tumor cells after treatment. (B) Under 10 MOI of virus treatments, the comparation of PI proportion among Annexin V-FITC-positive LN-18 cells. (C) Flow cytometry was used to detect the apoptosis of LN-229 tumor cells after treatment. (D) Under 10 MOI of virus treatments, the comparation of PI proportion among Annexin V-FITC-positive LN-229 cells. (E) Western Blot to detect makers related to cell apoptosis. (F) The representative immunohistochemical staining images of CD31, Ki67, CD45 in U-118 MG xenograft tumor sections 13 days after drug treatments. Scale bar, 100μm. (G) The representative TUNEL immunofluorescent staining images of U-118 MG xenograft tumor sections 13 days after drug treatments. Scale bar, 1 mm. n. s., not significant, *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001, one-way ANOVA followed by Tukey's multiple comparisons test.DETAILED DESCRIPTION

[0023] The term used in this application has the same meaning as in the prior art. In order to clearly explain the meaning of the terms used, the specific meanings of some terms in this application are given below. When the definition herein conflicts with the conventional meaning of the term, the definition herein shall prevail.

[0024] Unless otherwise defined, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by those of ordinary skill in the art to which the present disclosure belongs. All publications mentioned herein are incorporated herein by reference for the purpose of describing and disclosing the cell lines, vectors, and methods reported in the publications, which can be used in the present disclosure. Nothing can be considered admitted herein, and the present disclosure does not have the right to precede such disclosures based on previous inventions.

[0025] The term “oncolytic virus” refers to a virus capable of selectively replicating in and slowing down the cell growth or inducing the death of a cancerous or hyperproliferative cell, while having no or minimal effect on normal cells. Exemplary oncolytic viruses include vesicular stomatitis virus (VSV) , Newcastle disease virus (NDV) , herpes simplex virus (HSV) , reovirus, measles virus, retrovirus, influenza virus, Sinbis virus, vaccinia virus, and adenovirus.

[0026] The term “interferon” refers to a family of secreted proteins produced by a variety of eukaryotic cells after exposure to various environmental stimuli (including viral infection or exposure to mitogens) . In addition to having antiviral properties, interferon has also been shown to affect a variety of cell functions. There are three main interferon, IFN-α, IFN-β and IFN-γ. Interferon was originally classified according to its cellular origin (leukocytes, fibroblasts or T cells) . Leukocyte-derived interferon is currently called IFN-α, fibroblast-derived interferon is IFN-β, and T cell-derived interferon is IFN-γ.

[0027] Consensus interferon (CIFN) is an artificially engineered interferon that reflects most of the human type I interferons and shows a higher biological and antiviral capacity. Interferon-like immune anticancer gene (L-IFN) , which has an optimized coding sequence, was disclosed by the inventor in CN111363726A and WO 2020135390 A1, which are incorporated into the present application by reference in their entirety. In some embodiments of the present invention, the L-IFN has an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.

[0028] In some embodiments, the L-IFN is encoded by SEQ ID NO: 2, 3 and 4, preferably SEQ ID NO: 2.

[0029] Temozolomide (TMZ) is an anticancer medication used to treat brain tumors such as glioblastoma and anaplastic astrocytoma.

[0030] Temozolomide (TMZ) -resistant glioma refers to a glioma which could not be effectively treated by TMZ. Surgical resection, combined radiotherapy and TMZ chemotherapy are the standard treatment for gliomas. However, once patients become resistant to TMZ, they are essentially drug-free. The prognosis of glioblastoma multiforme (GBM) patients treated with standard therapies is still reported to be poor, with a recurrence rate of up to 90% and a 5-year survival rate of less than 10%. In clinical practice, there are two types of TMZ-resistant glioma patients: 1) primary gliomas with poor response to TMZ; 2) patients with tumor recurrence after TMZ treatment. The former is due to different tumor molecular subtypes. The latter means that 80% of primary malignant gliomas will have tumor recurrence in situ after surgery, radiotherapy and chemotherapy. The recurrent tumor cells acquired resistance to TMZ through functional mutation mismatch repair or base excision repair. Therefore, the vast majority of patients with recurrent GBM do not benefit significantly from TMZ, and there is no approved and accepted alternative drug treatment.

[0031] Gliomas are the most common type of tumor of the central nervous system (i.e., brain and spinal cord) . They originate from glial cells that grow uncontrollably. Gliomas can affect all ages, but they are most often seen in adults. About 33 percent of all brain tumors are gliomas. Based on the 2021 WHO classification, the 3 main types of glioma in adults are astrocytoma, oligodendroglioma and glioblastoma. Glioblastoma, previously known as glioblastoma multiforme (GBM) , is the most aggressive and most common type of cancer that originates in the brain, and has very poor prognosis for survival.

[0032] The term “pharmaceutical composition” as used herein means a combination of at least one drug and optionally a pharmaceutically acceptable carrier or excipient that are combined together to achieve a particular purpose. In certain embodiments, the pharmaceutical composition includes combinations that are separated in time and / or space as long as they can work together to achieve the purpose of the present disclosure. For example, the components of the pharmaceutical composition may be administered to the subject as a whole or separately. When the ingredients contained in the pharmaceutical composition are separately administered to a subject, the ingredients may be administered to the subject simultaneously or sequentially. Preferably, the pharmaceutically acceptable carrier is water, a buffered aqueous solution, an isotonic saline solution such as PBS (phosphate buffered saline) , glucose, mannitol, dextrose, lactose, starch, magnesium stearate, cellulose, magnesium carbonate, 0.3% glycerol, hyaluronic acid, or polyalkylene glycols such as polypropylene glycol, triglycerides and the like. The type of the pharmaceutically acceptable carrier used depends in particular on whether the composition according to the present disclosure is formulated for oral, nasal, intratumoral, perfusion, intradermal, subcutaneous, intramuscular, or intravenous administration. The composition according to the present disclosure may contain a lubricant, a preservative, a stabilizer, a wetting agent, an emulsifier, salts that affect osmotic pressure, a buffer, coloring substances, flavoring substances and / or aromatic substances, etc., as an additive.

[0033] “Administration” or “administering” means to provide a substance, such as a pharmaceutical composition, to a subject in a pharmacologically acceptable manner.

[0034] The dosage of a pharmaceutical composition provided to a subject refers to a dose sufficient to show its benefit to the administered subject, and may also be referred to herein as a “pharmaceutical effective amount” or “effective amount” . The actual amount administered, as well as the rate and time-course of administration, will depend on the condition and severity of the subject being treated. Prescription of treatment, e.g., decisions on dosage, etc., is ultimately within the responsibility of general practitioners and other medical doctors and relies on decisions of them, and typically takes account of the disease being treated, the condition of the individual patient, the site of delivery, the method of administration, and other factors known to physicians.

[0035] The term “subject” as used herein means animals, including warm-blooded mammals such as human and primate; birds; domesticated domestic or farm animals such as cats, dogs, sheep, goats, cattle, horses and pigs; laboratory animals such as mice, rats and guinea pigs; fish; reptiles; zoo animals and wild animals, etc.

[0036] It should also be noted that if a specific numerical value is mentioned herein, at least that value will be included, unless the context clearly indicates that it refers otherwise. When a numerical value represents an approximate value, it should be understood that the specific numerical value forms another embodiment. As used herein, “about X” (where X is a number) means ±10% (inclusive) of the listed value. If present, all ranges are inclusive and combinable.

[0037] Terms such as “comprising” , “including” , and “containing” as used herein are not intended to be limiting. In addition, unless otherwise indicated, “or” means “and / or” .

[0038] In some embodiments, the oncolytic virus is an oncolytic virus with an accession number of CCTCC NO: V201957. The deposit information is as follows: Depositary Authority: China Center for Type Culture Collection. Address: Wuhan, China. Deposit date: August 27, 2019. Name / Reference: Recombinant Human Type 5 Adenovirus rAd-IFN-1-SP-E1A (Δ24bp) -E1B. Accession number: CCTCC NO: V201957.

[0039] In other embodiments, the oncolytic virus is an oncolytic virus with an accession number of CCTCC NO: V201958. The deposit information is as follows: Depositary Authority: China Center for Type Culture Collection. Address: Wuhan, China. Deposit date: August 27, 2019. Name / Reference: Recombinant Human Type 5 Adenovirus rAd-IFN-2-SP-E1A (Δ24bp) -E1B. Accession number: CCTCC NO: V201958.

[0040] In other embodiments, the oncolytic virus is an oncolytic virus with an accession number of CCTCC NO: V201871, and its deposit information is as follows: Depositary Authority: China Center for Type Culture Collection. Address: Wuhan, China. Deposit date: December 12, 2018. Name / Reference: Recombinant Human Type 5 Adenovirus rAd-IFN-3-SP-E1A (Δ24bp) -E1B. Accession number: CCTCC NO: V201871.

[0041] Unless otherwise specified, any component, element, attribute or step disclosed in an embodiment of the method and product can be applied to any other method and product disclosed herein.

[0042] Each patent, patent application, cited publication, or description in this document of this disclosure is incorporated herein by reference in its entirety.

[0043] The present disclosure is further defined in the following examples. It should be understood that these examples are provided for illustration only and are not intended to limit the scope of the present disclosure. From the above discussion and these examples, those skilled in the art can determine the essential characteristics of the present disclosure, and make various changes and modifications to the present disclosure to adapt it to various usages and conditions without departing from the spirit and scope of the present disclosure.

[0044] Examples

[0045] Materials and Methods

[0046] Ethics Statement

[0047] All human sample were collected under the approval of China Ethics Committee of Registering Clinical Trials (ChiECRCT20190201) . All patient information and tumor samples were obtained with the informed consent of the patient before surgery.

[0048] Cell Culture

[0049] The glioma cells included U-138 MG, LN-18, T-98G, LN-229, U-118 MG, U-87 MG, HFF-1, and U-87 MG-Luc were purchased from National Collection of Authenticated Cell Cultures, Shanghai, China, which also provides STR profiling information. All glioma cells were maintained in DMEM containing 10%FBS, except for U-138 MG which required an additional 1% non-essential amino acids. In addition, HFF-1 cell line maintained in DMEM medium supplemented with 15% FBS. The culture conditions for all cells were 37 ℃and 5% CO2.

[0050] Establishment of oncolytic adenoviruses

[0051] The oncolytic adenovirus utilized in our study was developed by Shanghai Yuansong Biotechnology Co, Ltd. and is currently being used in a clinical trial (NCT05180851) for the treatment of various solid tumors, including breast cancer, lung cancer, and melanoma. The OncoMul-V2 used the human adenovirus type 5 (Ad5) genome as the backbone 16. Its E1A gene was deleted with a 24-bp sequence17, and its wild-type promoter was replaced with survivin promoter. The YSCH-01 was constructed by inserting the complete expression cassette of the L-IFN gene, a modified type I interferon gene, between the packaging signal region of Ad5 and the survivin promoter based on the structure of OncoMul-V2. The gene sequence of L-IFN was synthesized by multiplex PCR technique (General Biosystems, Anhui, China) , and its expression was controlled by a human cytomegalovirus (HCMV) promoter.

[0052] Detection of the L-IFN proteins in supernatant

[0053] Briefly, GBM patient-derived primary tumor cells were seeded in 24-well plates at a density of 1 ×105 cells per well. After overnight incubation, those cells were treated with vehicle or infected with Mock (PBS) , OncoMul-V2, replication-defective YSCH-01 or YSCH-01 at 1 ifu / cell. After 72 hours, the L-IFN concentration in the cell culture supernatant was measured using a commercially available human IFNα ELISA assay kit (#41100, PBL Assay Science, Piscataway, NJ, USA) .

[0054] In vitro cytotoxicity assay

[0055] Cells were plated on 96-well plates at a density of 4 × 103 cells per well except U-87 MG at 1 × 103 cells per well. After overnight incubation, those cells were infected with 10 μl oAds at different MOIs. Cell viability was determined 4 days after viral infection by Cell Counting Kit-8 (CCK8) assay (#40203ES80, Yeasen Biotechnology, Shanghai, China) , and the IC50 value was calculated with GraphPad Prism (ver. 8.0) . All assays were performed at least three times.

[0056] In vivo study to evaluate the antitumor efficacy of OVs

[0057] Female Balb / c nude mice at 4-5 weeks of age were purchased from Lingchang Biotechnology Co., Ltd. (Shanghai, China) . The mice were housed in a specific pathogen free (SPF) grade animal house, and the environment was controlled at a temperature of 20 to 26 ℃, a humidity level of 40 to 70%, and a light cycle consisting of 12 hours of light, followed by 12 hours of dark. All animal experiments were carried out in accordance with the National Institute of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals.

[0058] Briefly, as for cell-derived xenograft (CDX) tumors, aliquots of 2 x 106 glioma cells were subcutaneously (s. c. ) injected into both flanks of the mice. When the tumor volume reached approximately 120 mm3, the animals were divided and received treatment into one side of the tumors. The tumor growth was measured every 3 days. The experiment was terminated when the mean tumor volume in the Vehicle group reached about 2000 mm3.

[0059] For the intracranial glioma model, the subcutaneous U-87 MG-Luc tumor was were removed and cut into tumor masses with a diameter of 0.5 to 1mm. A tumor mass was transplanted intracranially (i. c) into the right lobe of nude mouse. After 7 days, the mice received treatments and the bioluminescence imaging (BLI) was performed (Viewworks, KOREA) every 7 days for 4 times.

[0060] For the Patient-derived tumor xenograft (PDX) model, human patient tissue samples were collected under the approval of China Ethics Committee of Registering Clinical Trials (ChiECRCT20190201) . The recurrent glioblastoma tumor masses, which had been acclimatised to the fifth generation in immunodeficient mice, were transplanted on the right flank of nude mice. When the tumor volume reached about 150 mm3, the nude mice received treatment.

[0061] Detection of apoptosis

[0062] Glioma cells were plated on 12-well plates at a density of 2x105 cells per well. Following an overnight incubation, the cells were subjected to vehicle or infected with OVs at 10 MOI (LN-18, LN-229) in triplicate. After 48 hours, the cells were harvested for apoptosis detection (#40302ES60, Yeasen) . The FACS assay was then performed with a flow cytometer (Agilent Technologies, USA) .

[0063] Western blot analysis of cell death-related proteins

[0064] Glioma cells were plated on 6-well plates at a density of 4x105 cells per well. After overnight incubation, the cells were treated with vehicle or infected with OVs at 10 MOI (LN-18, LN-229) . Briefly, after 48 hours later, aliquots of total 20 ug protein mixture were separated and transferred to polyvinylidene fluoride (PVDF) membranes. Protein bands were visualized using a chemiluminescence system (Tanon, Shanghai, China) in combination with enhanced chemiluminescence (ECL) detection reagents (#36208ES60, Yeasen) . The primary antibodies included: а-caspase 3 (#19677-1Ap, Proteintech, Wuhan, China) , а-caspase 9 (#10380-1Ap, Proteintech) , а-poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) (#9542, Cell Signaling, Danvers, MA, USA) , а-LC3B (#2775s, Cell Signaling) , and а-GAPDH (#CY6717, Abways, Shanghai, China) . The secondary antibody (#33101ES60, Yeasen) was obtained from Yeasen Biotechnology Co., Ltd. (Shanghai, China) .

[0065] Staining of tumor tissue sections

[0066] In subcutaneously CDX models, tumors were collected 13 days after the initial drug administration. The tissues were fixed and embedded in paraffin, cut into 3 um sections. For histological analysis, the sections were deparaffinized and stained with hematoxylin and eosin (H&E) . Immunohistochemical analysis was performed on other sections. The primary antibodies used were а-Ki67 (#ab15580, abcam, Cambridge, MA, USA) , а-CD45 (#ab208022, abcam) , and а-CD31 (#ab182981, abcam) . The HRP polymer secondary antibody and DAB reagents were obtained from the En Vision kit (#K5007, Dako, Denmark) . Hematoxylin was used as a counterstain. Furthermore, additional sections underwent the TUNEL assay with In Situ Cell Death Detection kit (#11684795910, Roche, USA) .

[0067] Toxicity and pharmacokinetics evaluation of YSCH-01 intracranial injection

[0068] Four to five-week-old hamsters were purchased from Beijing Vital River Lab Animal Technology Co., Ltd. and housed in a SPF environment, following a protocol approved by the Institutional Animal Care and Use Committee. Prior to the experiments, the hamsters were acclimatised for 1-2 weeks.

[0069] To assess toxicity of YSCH-01, Syrian hamsters were randomly assigned into three groups at random. Each group consisted of 4 male and 4 female hamsters. After anesthetizing, intracranial injections of the drugs were performed using a stereotaxic apparatus. Body weight were measured throughout the experiment. Brain tissues and major organs from hamsters treated with the drug were collected. Additionally, peripheral blood samples were collected from hamsters to analyze hemogram and liver function.

[0070] To quantifiy the copies of YSCH-01 vector, DNA was extracted from the samples using the tissue DNA extraction kit (#DE0596B, Emerther, China) . Blood DNA was directly extracted from 200 μl thawed samples using blood genome extraction kit (#DE17002, Emerther) and the automatic nucleic acid extractor. The copies of the YSCH-01 vector in the tissue or blood DNA were determined using real-time PCR with Probe qPCR Mix (#RR392A, TAKARA, Japan) .

[0071] To determine the content of L-IFN in the right brain, the collected tissues at different time points were dissolved in PBS (1g in 4ml) , homogenized, and centrifuged at 12000 rpm for 10 min at a low temperature. The supernatants were then used for quantification using a human IFNa ELISA assay kit.

[0072] Statistical Analysis

[0073] All the data were expressed as the mean ± standard deviations (SDs) . GraphPad Prism (ver. 8.0) was utilized for charting and statistical analysis. Certain specific analyses were performed using a one-way analysis of variance (ANOVA) or Log-rank (Mantel-Cox) test. Statistical significance was considered at a P-value of < 0.05.

[0074] The details of methods can be found in the supplementary materials.

[0075] Example 1 Oncolytic adenovirus YSCH-01 targets glioma cells in vitro

[0076] Modified oncolytic adenovirus armed with recombinant Type I interferon that specifically targets glioma cells and be safe in the Syrian hamster model.

[0077] To enhance the targeting and efficacy of the oncolytic adenovirus, we implemented genetic engineering from two perspectives: modifying virus-specific initiation conditions and incorporating therapeutic genes. Initially, we modified the oncolytic adenovirus, named OncoMul-V2, by incorporating the survivin promoter and deleting 24 base pairs from the viral E1A genomic region (FIG. 1A) . These double modifications significantly improved the virus’s targeting ability towards glioma cells and tissues. Our findings demonstrated that the IC50 of the modified virus on human foreskin fibroblasts (HFF-1) cells was significantly higher compared to human glioma cell lines (U-87 MG, U-118 MG, LN-229, LN18) and GBM patient-derived primary tumor cell, indicating the safety of the modified oncolytic adenovirus on normal cells (FIG. 1B) . In addition, we employed a 3D culture of patient-derived glioma tissue and found that the modified oncolytic adenovirus, labeled with the green fluorescent protein (GFP) gene, expressed itself in tumor tissue, reaching its peak fluorescence intensity on the 14th day (FIG. 1C) . Subsequently, we further equipped OncoMul-V2 with a gene encoding a novel recombinant Type I interferon (L-IFN) , previously designed by our team (named YSCH-01) (FIG. 1A) . This recombinant L-IFN exhibited a greater affinity for the IFNAR1 chain of the IFN1 receptor, leading to stronger IFN1 signaling and expression of IFN-inducible genes in human cells. As the virus infected and proliferated, the L-IFN gene was transcribed, translated, and released into the extracellular fluid in GBM patient-derived primary tumor cells (FIG. 1D) . Our triple modifications have endowed the adenovirus with enhanced targeting towards glioma and increased oncolytic potency.

[0078] Example 2 Safety evaluation of YSCH-01

[0079] Considering that adenoviruses replicate 1000-fold less efficiently in mouse cells than in human cells, we conducted intracranial injections of YSCH-01 (0.25 x 109  /  1 x 1010 VP per hamster) into the brains of Syrian hamsters. Syrian hamsters, one of the only two small mammals that support efficient adenovirus replication, were chosen to precisely evaluate the safety of the virus (FIG. 2A) . Following virus injection, the hamsters exhibited a temporary decrease in body weight, which gradually returned to normal levels (FIG. 2B) . Additionally, time-series experiments were conducted to examine the viral pharmacokinetics in the brain and major peripheral organs post-injection (FIG. 2C) . The expression of L-IFN peaked on the first day after injection and then gradually decreased, only to increase again on the 7th day due to virus replication. Subsequently, the expression levels gradually declined, with only a few detectable samples remaining after the 14th day (FIG. 2D) . Similar trends were observed in the YSCH-01 genomic copy numbers in brain tissue, major peripheral organs, and blood (FIG. 2E) . Collectively, the Syrian hamster model confirmed the replication capacity of the virus and the efficacy of L-IFN gene-expression following intracranial administration.

[0080] Example 3 Tumor killing effectiveness of YSCH-01

[0081] YSCH-01 had better tumor killing effectiveness in glioma subcutaneous xenografts and a distal tumor inhibition effect.

[0082] To validate the therapeutic efficacy of YSCH-01, we utilized different glioma cell lines to establish subcutaneous xenograft models in nude mice. For the LN-229 xenograft model, LN-229 cells were subcutaneously injected into the bilateral flank of nude mice. Once the tumors reached approximately 100 mm3 (24 days later) , the mice were randomly divided into three groups and injected with different drugs (vehicle, OncoMul-V2, YSCH-01) into unilateral tumor at a dosage of 1 x 1010 VP / mouse. Tumor volumes were measured every 3 days. After 27 days of virus injection, the mice were euthanized for further analysis (FIG. 3A) . Our results demonstrated that YSCH-01 significantly reduced the tumor volumes on both the injection and contralateral sides. In contrast, treatment with OncoMul-V2 only mildly suppressed the growth of the injected side tumor, without affecting the contralateral side (FIG. 3B) . Histological examination of tumor sections stained with HE revealed a significant reduction in the number of tumor cells and an increased infiltration of immune cells in tissues following YSCH-01 treatment (FIG. 3C) .

[0083] Similar experiments were also conducted using U-118 MG cells (FIG. 3D) . However, in contrast to the LN-229 mode, OncoMul-V2 exhibited a comparable tumor killing effect to YSCH-01 at the injection site. Similar to the LN-229 model, OncoMul-V2 failed to suppress tumor growth in the contralateral site, whereas YSCH-01 consistently demonstrated excellent efficacy (FIG. 3E) . The findings from HE staining images were in line with the tumor growth observed in the animal model. In tumors located on the injection side, both OncoMul-V2 and YSCH-01 led to a reduction in tumor cells and increased immune infiltration. However, only YSCH-01 exhibited the ability to inhibit tumor cells (FIG. 3F) .

[0084] Example 4 Tumor killing effectiveness of YSCH-01

[0085] The oncolytic effect of YSCH-01 was further verified by intracranial glioma xenograft and patient-derived tumor xenograft.

[0086] To further confirm the efficacy of YSCH-01 in situ, we subcutaneously injected U-87 MG cells labelled with Luciferase into the unilateral hemisphere of nude mice. Bioluminescence imaging was performed 8 days after tumor implantation to monitor tumor growth. The mice were then divided into three groups and treated with either a vehicle, a single dose of YSCH-01, or three doses of YSCH-01 (FIG. 4A) . Based on the fluorescence signal intensity and survival time, the results showed that a single injection of YSCH-01 significantly suppressed the growth of intracranial tumors and extended the survival time of the mice. While the three-time repeat injections of YSCH-01 did not demonstrate a statistically significant advantage over the single injection (FIG. 4B-4D) . Moreover, the inhibitory effect of YSCH-01 on distal tumors was confirmed in bilateral subcutaneous xenograft models (FIG. 4E) .

[0087] Furthermore, we aimed to investigate the oncolytic effect of YSCH-01 on heterogeneous tumor components. To achieve this, we established a recurrent glioblastoma patient-derived tumor xenograft by grafting cell suspensions derived from the patient’s tumor samples into immunodeficient mice (FIG. 4F) . Notably, YSCH-01 exhibited significantly superior inhibition of tumor growth compared to treatment with TMZ (FIG. 4G) . Furthermore, to examine the long efficacy of YSCH-01, we added a new cohort of PDX animals, and all the animals that were treated with a single dose of YSCH-01 survived well for more than 136 days. They were then euthanized. YSCH-01 demonstrated sustained tumor suppression even after a single dose (FIG. 4H) .

[0088] The results of in situ cell-derived xenograft and subdermal patient-derived xenograft further  confirmed the therapeutic efficacy of YSCH-01. The incorporation of dual promoter modifications on the adenovirus, along with the addition of the L-IFN gene, not only enhanced the killing effect on glioma models but also demonstrated a potential advantage over TMZ treatment for recurrent glioblastoma.

[0089] Example 5 YSCH-01 increases tumor cell apoptosis and inhibites tumor proliferation and angiogenesis

[0090] In this study, we have successfully validated the safety and efficacy of YSCH-01 as a potential treatment for malignant glioma, both in vitro and in vivo. Additionally, we conducted molecular biochemical investigations to elucidate the underlying mechanism of YSCH-01 in inhibiting tumor cells. Our findings demonstrated that YSCH-01 induced a significant increase in apoptosis in LN-18 human glioma cells, as evidenced by the results of flow cytometry (FIG. 5A, 5B) . However, this effect was less pronounced in LN-229 cells (FIG. 5C, D) . The results observations were consistent with the results obtained from Western Blot analysis. Specifically, YSCH-01 treatment led to the up-regulation of Cleaved Caspase 3 and PARP cleavage in LN-18 cells, indicating the activation of the apoptotic pathway. In contrast, these effects were not as prominent in LN-229 cells (FIG. 5E) . Furthermore, immuno-histochemical staining images taken 13 days after YSCH-01injection demonstrated a significant reduction in Ki67-positive U-118 MG tumor cells (FIG. 5F) , indicating a suppression of tumoral cell proliferation. Additioanlly, YSCH-01 treatment resulted in a decrease in CD31-positive cells, suggesting a significant reduction in angiogenesis within the tumor tissue at the injection site (FIG. 5F) . There was an increase in CD45-positive tumor cells after oncolytic viral therapy (FIG. 5F) . The TUNEL tests indicated confirmed that tumor cell apoptosis was enhanced following YSCH-01 treatment (FIG. 5G) .

[0091] Although the present disclosure has been described hereinabove, it should be understood by those skilled in the art that various modifications and changes to the present disclosure may be made without departing from the spirit and scope of the present disclosure. The scope of the present disclosure is not limited to the details described above, but rather to the claims.

Claims

1.A method of treating temozolomide (TMZ) -resistant glioma, comprising administering a therapeutically effective amount of an oncolytic adenovirus expressing consensus interferon to the subject in need thereof.2.The method according to claim 1, wherein the consensus interferon is encoded by SEQ ID NO: 2, 3 or 4.3.The method according to claim 1 or 2, wherein the oncolytic adenovirus is administered by intratumoral injection, intravenousinjection intraperitoneal injection or perfusion, preferably intratumoral injection.4.A combination therapy method of treating glioma, comprising administering a therapeutically effective amount of an oncolytic adenovirus expressing consensus interferon and TMZ to the subject in need thereof.5.The method according to claim 4, wherein the consensus interferon is encoded by SEQ ID NO: 2, 3 or 4.6.The method according to claim 4 or 5, wherein the oncolytic adenovirus is administered by intratumoral injection, intravenous injection intraperitoneal injection or perfusion, preferably intratumoral injection; and TMZ is administered by oral route.7.The method according to any one of claims 4 to 6, wherein the oncolytic adenovirus and TMZ are administered in the same treatment cycle or different treatment cycles.8.A combination of an oncolytic adenovirus and TMZ for use in treating glioma, wherein the oncolytic adenovirus expresses consensus interferon.9.The combination for use according to claim 8, wherein the consensus interferon is encoded by SEQ ID NO: 2, 3 or 4.10.The combination for use according to claim 8 or 9, wherein the oncolytic adenovirus is administered by intratumoral injection, intravenous injection intraperitoneal injection or perfusion, preferably intratumoral injection; and TMZ is administered by oral route.11.The combination for use according to any one of claims 8 to 10, wherein the oncolytic adenovirus and TMZ are administered in the same treatment cycle or different treatment cycles.12.A kit for treating glioma, comprising an oncolytic adenovirus and TMZ, wherein the oncolytic adenovirus expresses consensus interferon, the oncolytic adenovirus and TMZ are in different containers.13.The kit according to claim 12, wherein the consensus interferon is encoded by SEQ ID NO: 2, 3 or 4.14.A composition for use in the manufacture of a medicament for treating glioma, wherein the composition comprises an oncolytic adenovirus and TMZ and the oncolytic adenovirus expresses consensus interferon.15.The composition according to claim 14, wherein the consensus interferon is encoded by SEQ ID NO: 2, 3 or 4.

Images