Methods for producing target-specific megaserr recombinases

Abstract

本发明涉及用于生成靶标特异性大型丝氨酸重组酶(LSR)的方法，该方法包括以下步骤：a)通过将一个或多个突变引入对LSR进行编码的序列中来生成LSR的多个第一变体；b)生成表达载体文库，其中每个表达载体包含第一区域和第二区域，该第一区域对LSR的第一变体中的一个第一变体进行编码，该第二区域包含LSR的至少两个第一靶标位点，其中该两个第一靶标位点彼此不同；c)将表达载体文库引入宿主细胞中；d)培养宿主细胞并表达第一变体LSR；e)从宿主细胞的培养物中分离质粒DNA；f)确定该两个第一靶标位点之间表达载体的第二区域的一部分是否已被变体LSR切除；g)通过将一个或多个突变引入对这些第一LSR变体进行编码的序列中来生成多个第二LSR变体，该第一LSR变体切除两个第一靶标位点之间表达载体的第二区域的该部分；以及h)任选地以至少一个第二靶标位点重复步骤b)至f)，其中至少一个第二靶标位点在至少一个核苷酸上不同于第一靶标位点。本发明进一步提供了通过该方法获得的变体LSR、对变体LSR进行编码的核酸或核酸组、包含所述核酸的载体；用于将供体DNA整合到靶标核酸中的系统；以及该LSR、核酸或载体的用途。

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