Lipid compounds for delivery of therapeutic agents and preparation method and its use thereof

Abstract

The present invention discloses lipid compounds for delivery of therapeutic agents and preparation method and its use thereof, specifically, the present invention discloses a compound of Formula I or a pharmaceutically acceptable salt, stereoisomer, tautomer, solvate, chelate, non-covalent complex, or precursor thereof, the ionizable lipid compounds of the present invention can effectively deliver nucleic acid molecules, small molecule compounds and other drugs, and by comparison, the lipid nanoparticles of the present invention have better particle size distribution, high encapsulation efficiency, and the delivery effect can be significantly better than the comparison lipid nanoparticles, which can meet the demand for in vivo delivery.

Description

Lipid compounds for delivery of therapeutic agents and preparation method and its use thereof

[0001] The present invention belongs to the field of biopharmaceuticals and, specifically, relates to lipid compounds for delivery of therapeutic agents and preparation method and its use thereof.Background

[0002] Gene therapy technology is a hot topic of research in modern biomedical field, and the nucleic acid drugs can prevent and treat cancer, bacterial and viral infections, and treat diseases with inherited pathogenic factor, etc. Since nucleic acid drugs are easily degradable and difficult to enter cells, they usually need to be encapsulated and delivered to target cells with the help of carriers, therefore, the development of safe and efficient delivery carriers is a precondition for the clinical application of gene therapy.

[0003] Lipid nanoparticle (LNP) is currently a hot research topic in the field of non-viral gene vectors. In 2018, FDA approved LNP delivery of patisiran (onpattro) for the treatment of hereditary transthyretin familial amyloidosis, and since then the research on the delivery of nucleic acid drugs using LNP technology has shown a burst of growth. In particular, in the end of 2020, the FDA approved Moderna and BioNtech &Pfizer's novel coronavirus vaccine for COVID 19, respectively, both of which use LNP technology to deliver mRNA drugs for the prevention of SARS-CoV-2. LNPs usually contain ionizable lipids which have an impact on the effectiveness of LNP delivery.

[0004] There is still a need to develop new lipid compounds to facilitate the in vitro or in vivo delivery of nucleic acid molecules for therapeutic and / or prophylactic purposes.Summary of the invention

[0005] It is an object of the present invention to provide novel lipid compounds to facilitate the in vitro or in vivo delivery of nucleic acid molecules for therapeutic and / or prophylactic purposes.

[0006] It is also an object of the present invention to provide a lipid compound or a pharmaceutically acceptable form thereof (e.g., salt, stereoisomer, tautomer, solvate, chelate, non-covalent complex, or precursor drug, etc. ) that can be used with other lipid compounds (e.g., neutral lipids, charged lipids, steroids) to prepare lipid nanoparticles for delivery of therapeutic agents (e.g., nucleic acid molecules, specifically also including mRNA) to enhance the delivery efficiency of nucleic acid drugs in vivo, and lipid compounds with specific structures can be used as lipid carriers depending on the organ where the nucleic acid drug needs to be enriched.

[0007] It is a further object of the present invention to provide lipid carriers comprising the above compounds or a pharmaceutically acceptable form thereof.

[0008] It is a further object of the present invention to provide nucleic acid lipid nanoparticle compositions comprising the above compounds or pharmaceutically acceptable forms thereof or the above lipid carriers.

[0009] It is a further object of the present invention to provide pharmaceutical formulations comprising the above compounds or pharmaceutically acceptable forms thereof, or the above lipid carriers, or the above nucleic acid lipid nanoparticle compositions.

[0010] It is a further object of the present invention to provide a method of delivering  a therapeutic or prophylactic agent to a subject cell.

[0011] It is a further object of the present invention to provide a method for producing a target protein or target polypeptide in a subject cell.

[0012] It is a further object of the present invention to provide a use of the above compounds or pharmaceutically acceptable forms thereof or the above lipid carriers or the above nucleic acid lipid nanoparticle compositions or the above pharmaceutical formulations in the preparation of nucleic acid drugs, gene vaccines, small molecule drugs, polypeptides or protein drugs.

[0013] It is a further object of the present invention to provide a method for delivering nucleic acid drugs in vivo, comprising administering the above nucleic acid lipid nanoparticle compositions or the above pharmaceutical formulations to a subject in need thereof.

[0014] In a first aspect of the invention, it provides a compound of Formula I or a pharmaceutically acceptable salt, stereoisomer, tautomer, solvate, chelate, non-covalent complex, or precursor thereof, having the following structure:

[0015] wherein

[0016] R1 is absent or selected from -OH and Ra (Rb) N-, wherein Ra and Rb are each independently hydrogen, C1-C10 alkyl or C1-C10 haloalkyl;

[0017] R2 is C1-C20 alkyl, C2-C20 alkenyl, C2-C20 alkynyl;

[0018] R3 is C1-C20 alkyl, C2-C20 alkenyl, C2-C20 alkynyl, or Rc- (CH2) n-, wherein n is a positive integer of 1-20, preferably, a positive integer of 1-14, more preferably a positive integer of 1-10;

[0019] Rc is selected from the structure as shown below: wherein represents a connection bond;

[0020] L1, L2, L3, L4, L5 are absent or each independently selected from the group consisting of:

[0021] X is absent or -CH-or N;

[0022] R4 is absent or C1-C20 alkyl, C2-C20 alkenyl, C2-C20 alkynyl;

[0023] R5 is absent or C1-C20 alkyl, C2-C20 alkenyl, C2-C20 alkynyl;

[0024] R6 is C1-C30 alkyl, C2-C30 alkenyl, C2-C30 alkynyl;

[0025] R7 is C1-C14 alkyl, C2-C14 alkenyl, C2-C14 alkynyl;

[0026] R8, R9 are absent or is each independently C1-C14 alkyl, C2-C14 alkenyl, C2-C14 alkynyl or -Rh-C1-C14 alkyl, -Rh-C2-C14 alkenyl, -Rh-C2-C14 alkynyl, wherein Rh is O or S;

[0027] R10, R11 is each independently C1-C14 alkyl, C2-C14 alkenyl, C2-C14 alkynyl, or -Rh-C1-C14 alkyl, -Rh-C2-C14 alkenyl, -Rh-C2-C14 alkynyl, wherein Rh is O or S.

[0028] In another embodiment, Ra and Rb are each independently hydrogen, C1-C6 alkyl or C1-C6 haloalkyl.

[0029] In another embodiment, R2 is selected from - (CH2) m-, wherein m is a positive integer from 1-20, preferably, a positive integer from 1-14, preferably, a positive integer from 1-10, more preferably, a positive integer from 1-6.

[0030] In another embodiment, R3 is C1-C10 alkyl, C2-C10 alkenyl, C2-C10 alkynyl.

[0031] In another embodiment, R3 is C1-C6 alkyl, C2-C6 alkenyl, C2-C6 alkynyl.

[0032] In another embodiment, R6 is C1-C20 alkyl, C2-C20 alkenyl, C2-C20 alkynyl.

[0033] In another embodiment, R2 is C1-C14 alkyl, C2-C14 alkenyl, C2-C14 alkynyl.

[0034] In another embodiment, R2, R7 is each independently C1-C10 alkyl, C2-C10 alkenyl, C2-C10 alkynyl.

[0035] In another embodiment, R4, R5 is each independently - (CH2) q-CH3, wherein q is selected from a positive integer of 1-20, preferably, a positive integer of 1-12, more preferably, a positive integer of 1-8.

[0036] In another embodiment, R4, R5 each independently has a structure -Rd-Re-;

[0037] wherein Rd is absent or selected from the following functional group: - (CH2) - (CH=CH) -;

[0038] Re is - (CH2) p-CH3, wherein p is selected from a positive integer of 0-20, preferably, p is selected from a positive integer of 0-12, preferably, p is selected from a positive integer of 0-8.

[0039] In another embodiment, R8, R9 is each independently - (CH2) q-CH3, wherein q is selected from a positive integer of 1-14, preferably, a positive integer of 1-12, and preferably, a positive integer of 1-8.

[0040] In another embodiment, R7 is - (CH2) q-CH3, wherein q is selected from a positive integer of 1-14, preferably, a positive integer of 1-12, and preferably, a positive integer of 1-8.

[0041] In another embodiment, R6 has a structure -Rf-Rg-;

[0042] wherein Rf is selected from the following functional group: - (CH2) s1- (CH=CH) -CH2- (CH=CH) - (CH2) s2-CH3, s1 is a positive integer of 1-14, preferably, a positive integer of 1-10, and s2 is a positive integer of 1-8, preferably, a positive integer of 1-6;

[0043] Rg is - (CH2) m-, wherein m is a positive integer of 1-14, preferably, a positive integer of 1-10, more preferably, a positive integer of 1-6.

[0044] In another embodiment, R10, R11 is each independently C1-C10 alkyl, C2-C10 alkenyl, C2-C10 alkynyl or -Rh-C1-C10 alkyl, -Rh-C2-C10 alkenyl, -Rh-C2-C10 alkynyl, wherein Rh is O or S.

[0045] In another embodiment, R11 is C1-C6 alkyl, C2-C6 alkenyl, C2-C6 alkynyl.

[0046] In another embodiment, R8, R9 is each independently C1-C10 alkyl, C2-C10 alkenyl, C2-C10 alkynyl or -Rh-C1-C10 alkyl, -Rh-C2-C10 alkenyl, -Rh-C2-C10 alkynyl, wherein Rh is O or S.

[0047] In another embodiment, R9 is C1-C6 alkyl, C2-C6 alkenyl, C2-C6 alkynyl.

[0048] In another embodiment, X is absent or -CH-.

[0049] In another embodiment, the compound of Formula I has a structure of Formula I-1 as follows:

[0050] wherein

[0051] R1-R2, R6-R11, L2-L5 are defined as above;

[0052] R3 is C1-C20 alkyl, C2-C20 alkenyl, C2-C20 alkynyl.

[0053] In another embodiment, R3 is C1-C10 alkyl, C2-C10 alkenyl, C2-C10 alkynyl.

[0054] In another embodiment, R3 is C1-C6 alkyl, C2-C6 alkenyl, C2-C6 alkynyl.

[0055] In another embodiment, the compound of Formula I has a structure of Formula I-2 as follows:

[0056] wherein

[0057] R1-R2, R6-R7, R10-R11, L1-L5 are defined as above;

[0058] R3 is C1-C20 alkyl, C2-C20 alkenyl, C2-C20 alkynyl, or Rc- (CH2) n-, wherein n is a positive integer of 1-20, preferably, a positive integer of 1-14, more preferably a positive integer of 1-10, Rc is defined as above;

[0059] R5 is C1-C20 alkyl, C2-C20 alkenyl, C2-C20 alkynyl;

[0060] R8, R9 is each independently C1-C14 alkyl, C2-C14 alkenyl, C2-C14 alkynyl.

[0061] In another embodiment, R5 is C1-C14 alkyl, C2-C14 alkenyl, C2-C14 alkynyl.

[0062] In another embodiment, R5 is C1-C10 alkyl, C2-C10 alkenyl, C2-C10 alkynyl.

[0063] In another embodiment, R3 is C1-C14 alkyl, C2-C14 alkenyl, C2-C14 alkynyl.

[0064] In another embodiment, R3 is C1-C10 alkyl, C2-C10 alkenyl, C2-C10 alkynyl.

[0065] In another embodiment, the compound of Formula I has a structure of Formula I-3 as follows:

[0066] Wherein

[0067] R1-R3, R6, R7, R10, R11, L1-L5 are defined as above;

[0068] R4 is C1-C20 alkyl, C2-C20 alkenyl, C2-C20 alkynyl;

[0069] R5 is C1-C20 alkyl, C2-C20 alkenyl, C2-C20 alkynyl;

[0070] R8, R9 is each independently C1-C14 alkyl, C2-C14 alkenyl, C2-C14 alkynyl.

[0071] In another embodiment, R4 is C1-C14 alkyl, C2-C14 alkenyl, C2-C14 alkynyl.

[0072] In another embodiment, R4 is C1-C10 alkyl, C2-C10 alkenyl, C2-C10 alkynyl.

[0073] In another embodiment, R5 is C1-C6 alkyl, C2-C6 alkenyl, C2-C6 alkynyl.

[0074] In another embodiment, R8, R9 is each independently C1-C10 alkyl, C2-C10 alkenyl, C2-C10 alkynyl.

[0075] In another embodiment, R9 is C1-C6 alkyl, C2-C6 alkenyl, C2-C6 alkynyl.

[0076] In another embodiment, the compound of Formula I has a structure of Formula I-4 as follows:

[0077] Wherein

[0078] R1-R7, R10-R11, L1-L3, L5 are defined as above.

[0079] In a second aspect of the invention, it provides a compound of Formula II or a pharmaceutically acceptable salt, stereoisomer, tautomer, solvate, chelate, non-covalent complex, or precursor thereof, having the following structure:

[0080] wherein

[0081] R1 is selected from -OH and Ra (Rb) N-, wherein Ra and Rb are each independently hydrogen, C1-C6 alkyl or C1-C6 haloalkyl;

[0082] R3 is C1-C15 alkyl, C2-C15 alkenyl, C2-C15 alkynyl, or Rc- (CH2) n-, wherein n is a positive integer of 1-20, preferably, a positive integer of 1-14, more preferably a positive integer of 1-10, more preferably a positive integer of 1-6;

[0083] Rc is selected from the structure as shown below: wherein represents a connection bond;

[0084] L1, L2, L3, L4, L5 are absent or each independently selected from the group consisting of:

[0085] R4 is absent or C1-C20 alkyl, C2-C20 alkenyl, C2-C20 alkynyl;

[0086] R5 is absent or C1-C20 alkyl, C2-C20 alkenyl, C2-C20 alkynyl;

[0087] R8, R9 is each independently C1-C14 alkyl, C2-C14 alkenyl, C2-C14 alkynyl or -Rh-C1-C14 alkyl, -Rh-C2-C14 alkenyl, -Rh-C2-C14 alkynyl, wherein Rh is O or S;

[0088] R10, R11 is each independently C1-C14 alkyl, C2-C14 alkenyl, C2-C14 alkynyl, or -Rh-C1-C14 alkyl, -Rh-C2-C14 alkenyl, -Rh-C2-C14 alkynyl, wherein Rh is O or S;

[0089] r is 2 or 3;

[0090] u is a positive integer of 1-10;

[0091] t is a positive integer of 1-10;

[0092] in addition, when R1 is selected from Ra (Rb) N-, r is 2.

[0093] In another embodiment, R3 is C1-C10 alkyl, C2-C10 alkenyl, C2-C10 alkynyl.

[0094] In another embodiment, R4 is absent or C1-C10 alkyl, C2-C10 alkenyl, C2-C10 alkynyl.

[0095] In another embodiment, R5 is absent or C1-C10 alkyl, C2-C10 alkenyl, C2-C10 alkynyl.

[0096] In another embodiment, R8 is C1-C10 alkyl, C2-C10 alkenyl, C2-C10 alkynyl.

[0097] In another embodiment, R9 is C1-C10 alkyl, C2-C10 alkenyl, C2-C10 alkynyl.

[0098] In another embodiment, R10 is C1-C10 alkyl, C2-C10 alkenyl, C2-C10 alkynyl.

[0099] In another embodiment, R11 is C1-C10 alkyl, C2-C10 alkenyl, C2-C10 alkynyl.

[0100] In another embodiment, u is a positive integer of 3-6, preferably, 3-5, more preferably, 4.

[0101] In another embodiment, t is a positive integer of 3-6, preferably, 3-5, more preferably, 4.

[0102] In another embodiment, L1, R4 and R5 is absent.

[0103] In another embodiment, L1, L2, L3, L4, L5 are each independently selected from the group consisting of:

[0104] In another embodiment, the compound of Formula II has a structure of Formula II-1 or II-2 as follows:

[0105] Wherein

[0106] in Formula II-1, R3, r, R8-R11, L2-L5 are defined as above;

[0107] in Formula II-2, r, R3-R5, R8-R11, L1-L5 are defined as above.

[0108] In another embodiment, the compound of Formula II has a structure of Formula II-3 as follows:

[0109] Wherein

[0110] Ra, Rb, R3-R5, R8-R11, r, L1-L5 are defined as above.

[0111] In another embodiment, the compound is each specific compound prepared in the embodiment, preferably selected from the group consisting of:

[0112] In a third aspect of the invention, it provides a compound of Formula III or a pharmaceutically acceptable salt, stereoisomer, tautomer, solvate, chelate, non-covalent complex, or precursor thereof, having the following structure:

[0113] wherein

[0114] Ra and Rb are each independently hydrogen, C1-C6 alkyl or C1-C6 haloalkyl;

[0115] Rc is selected from the structure as shown below: wherein represents a connection bond; s is a positive integer of 1-10;

[0116] L1, L2, L3, L4, L5 are absent or each independently selected from the group consisting of:

[0117] R4 is absent or C1-C20 alkyl, C2-C20 alkenyl, C2-C20 alkynyl;

[0118] R5 is absent or C1-C20 alkyl, C2-C20 alkenyl, C2-C20 alkynyl;

[0119] R8, R9 is each independently C1-C14 alkyl, C2-C14 alkenyl, C2-C14 alkynyl or -Rh-C1-C14 alkyl, -Rh-C2-C14 alkenyl, -Rh-C2-C14 alkynyl, wherein Rh is O or S;

[0120] R10, R11 is each independently C1-C14 alkyl, C2-C14 alkenyl, C2-C14 alkynyl, or -Rh-C1-C14 alkyl, -Rh-C2-C14 alkenyl, -Rh-C2-C14 alkynyl, wherein Rh is O or S;

[0121] r is a positive integer of at least 3;

[0122] u is a positive integer of 1-10;

[0123] t is a positive integer of 1-10.

[0124] In another embodiment, R4 and R5 are not present at the same time.

[0125] In another embodiment, R4 and R5 are present at the same time.

[0126] In another embodiment, when R4 is C1-C20 alkyl, C2-C20 alkenyl, C2-C20 alkynyl or C1-C10 alkyl, C2-C10 alkenyl, C2-C10 alkynyl, R5 is absent; or when R5 is C1-C20 alkyl, C2-C20 alkenyl, C2-C20 alkynyl or C1-C10 alkyl, C2-C10 alkenyl, C2-C10 alkynyl, R4 is absent.

[0127] In another embodiment, R4 is absent or C1-C10 alkyl, C2-C10 alkenyl, C2-C10 alkynyl.

[0128] In another embodiment, R5 is absent or C1-C10 alkyl, C2-C10 alkenyl, C2-C10 alkynyl.

[0129] In another embodiment, R8 is C1-C10 alkyl, C2-C10 alkenyl, C2-C10 alkynyl.

[0130] In another embodiment, R9 is C1-C10 alkyl, C2-C10 alkenyl, C2-C10 alkynyl.

[0131] In another embodiment, R10 is C1-C10 alkyl, C2-C10 alkenyl, C2-C10 alkynyl.

[0132] In another embodiment, R11 is C1-C10 alkyl, C2-C10 alkenyl, C2-C10 alkynyl.

[0133] In another embodiment, s is a positive integer of 1-8.

[0134] In another embodiment, r is a positive integer of 3-10, preferably 3-8.

[0135] In another embodiment, u is a positive integer of 3-6, preferably, 3-5, more preferably, 4.

[0136] In another embodiment, t is a positive integer of 3-6, preferably, 3-5, more  preferably, 4.

[0137] In another embodiment, L1, L2, L3, L4, L5 are each independently selected from the group consisting of:

[0138] In another embodiment, the compound is each specific compound prepared in the embodiment, preferably selected from the group consisting of:

[0139] In a fourth aspect of the invention, it provides a compound of Formula IV or a pharmaceutically acceptable salt, stereoisomer, tautomer, solvate, chelate, non-covalent complex, or precursor thereof, having the following structure:

[0140] wherein

[0141] Ra and Rb are each independently hydrogen, C1-C6 alkyl or C1-C6 haloalkyl;

[0142] R3 is C1-C15 alkyl, C2-C15 alkenyl, C2-C15 alkynyl, or Rc- (CH2) n-, wherein n is a positive integer of 1-20, preferably, a positive integer of 1-14, more preferably a positive integer of 1-10;

[0143] Rc is selected from the structure as shown below: wherein represents a connection bond;

[0144] L1, L2, L3, L4, L5 are absent or each independently selected from the group  consisting of:

[0145] R4 is absent or C1-C20 alkyl, C2-C20 alkenyl, C2-C20 alkynyl;

[0146] R5 is absent or C1-C20 alkyl, C2-C20 alkenyl, C2-C20 alkynyl;

[0147] R8, R9 is each independently C1-C14 alkyl, C2-C14 alkenyl, C2-C14 alkynyl or -Rh-C1-C14 alkyl, -Rh-C2-C14 alkenyl, -Rh-C2-C14 alkynyl, wherein Rh is O or S;

[0148] R10, R11 is each independently C1-C14 alkyl, C2-C14 alkenyl, C2-C14 alkynyl, or -Rh-C1-C14 alkyl, -Rh-C2-C14 alkenyl, -Rh-C2-C14 alkynyl, wherein Rh is O or S;

[0149] r is a positive integer of at least 3;

[0150] u is a positive integer of 1-10;

[0151] t is a positive integer of 1-10.

[0152] In another embodiment, R3 is C1-C10 alkyl, C2-C10 alkenyl, C2-C10 alkynyl.

[0153] In another embodiment, R4 is absent or C1-C10 alkyl, C2-C10 alkenyl, C2-C10 alkynyl.

[0154] In another embodiment, R5 is absent or C1-C10 alkyl, C2-C10 alkenyl, C2-C10 alkynyl.

[0155] In another embodiment, R4 and R5 are not present at the same time.

[0156] In another embodiment, R4 and R5 are present at the same time.

[0157] In another embodiment, when R4 is C1-C20 alkyl, C2-C20 alkenyl, C2-C20 alkynyl or C1-C10 alkyl, C2-C10 alkenyl, C2-C10 alkynyl, R5 is absent; or when R5 is C1-C20 alkyl, C2-C20 alkenyl, C2-C20 alkynyl or C1-C10 alkyl, C2-C10 alkenyl, C2-C10 alkynyl, R4 is absent.

[0158] In another embodiment, R8 is C1-C10 alkyl, C2-C10 alkenyl, C2-C10 alkynyl.

[0159] In another embodiment, R9 is C1-C10 alkyl, C2-C10 alkenyl, C2-C10 alkynyl.

[0160] In another embodiment, R10 is C1-C10 alkyl, C2-C10 alkenyl, C2-C10 alkynyl.

[0161] In another embodiment, R11 is C1-C10 alkyl, C2-C10 alkenyl, C2-C10 alkynyl.

[0162] In another embodiment, r is a positive integer of 3-10, preferably 3-8.

[0163] In another embodiment, u is a positive integer of 3-6, preferably, 3-5, more preferably, 4.

[0164] In another embodiment, u is a positive integer of 3-6, preferably, 3-5, more preferably, 4.

[0165] In another embodiment, L1, L2, L3, L4, L5 are each independently selected from the group consisting of:

[0166] In another embodiment, the compound is each specific compound prepared in the embodiment, preferably selected from the group consisting of:

[0167] In a fifth aspect of the invention, it provides a compound of Formula V or a pharmaceutically acceptable salt, stereoisomer, tautomer, solvate, chelate, non-covalent complex, or precursor thereof, having the following structure:

[0168] wherein

[0169] Ra and Rb are each independently hydrogen, C1-C6 alkyl or C1-C6 haloalkyl;

[0170] Rc is selected from the structure as shown below: wherein represents a connection bond;

[0171] L1, L2, L3, L5 are absent or each independently selected from the group consisting of:

[0172] R4 is C1-C20 alkyl, C2-C20 alkenyl, C2-C20 alkynyl;

[0173] R5 is C1-C20 alkyl, C2-C20 alkenyl, C2-C20 alkynyl;

[0174] R6 is C1-C30 alkyl, C2-C30 alkenyl, C2-C30 alkynyl;

[0175] R10, R11 is each independently C1-C14 alkyl, C2-C14 alkenyl, C2-C14 alkynyl, or -Rh-C1-C14 alkyl, -Rh-C2-C14 alkenyl, -Rh-C2-C14 alkynyl, wherein Rh is O or S;

[0176] r is a positive integer of at least 3;

[0177] t is a positive integer of 1-10.

[0178] In another embodiment, R4 is C1-C10 alkyl, C2-C10 alkenyl, C2-C10 alkynyl.

[0179] In another embodiment, R5 is C1-C10 alkyl, C2-C10 alkenyl, C2-C10 alkynyl.

[0180] In another embodiment, R6 is C1-C20 alkyl, C2-C20 alkenyl, C2-C20 alkynyl.

[0181] In another embodiment, R10 is absent or C1-C10 alkyl, C2-C10 alkenyl, C2-C10 alkynyl.

[0182] In another embodiment, R11 is absent or C1-C10 alkyl, C2-C10 alkenyl, C2-C10 alkynyl.

[0183] In another embodiment, r is a positive integer of 3-10, preferably 3-8.

[0184] In another embodiment, t is a positive integer of 3-6, preferably, 3-5, more preferably, 4.

[0185] In another embodiment, L1, L2, L3, L5 are each independently selected from the group consisting of:

[0186] In another embodiment, the compound is each specific compound prepared in the embodiment, preferably selected from the group consisting of:

[0187] In another embodiment, R1-R11, L1-L5, X are the specific groups corresponding to each specific compound in the embodiment.

[0188] In another embodiment, the compound is each specific compound prepared in the embodiment, preferably selected from the group consisting of (Table 1) :

[0189] Table 1

[0190] In another embodiment, the compound preferably has the structure as shown below:

[0191] In another embodiment, the compound of Formula I preferably has the structure as shown below:

[0192] In another embodiment, the compound of Formula I or Formula II or Formula IIII or Formula IV or Formula V can be used to prepare a drug delivery system, comprising a lipid nanoparticle (LNP) , liposome, polymer nanoparticle, etc., preferably for preparing a lipid nanoparticle.

[0193] In a second aspect of the present invention, it provides a lipid carrier, comprising a compound of Formula I or Formula II or Formula IIII or Formula IV or Formula V or a pharmaceutically acceptable salt, stereoisomer, tautomer, solvate, chelate, non-covalent complex, or precursor thereof, as described in the first aspect of the present invention.

[0194] In another embodiment, the lipid carrier further comprises an auxiliary lipid.

[0195] In another embodiment, in the lipid carrier, the content of the compound of Formula I is in the range of 30-65%molar ratio of the total lipid content.

[0196] In another embodiment, in the lipid carrier, the content of the compound of Formula I is in the range of 40-60%molar ratio of the total lipid content; preferably, 50%molar ratio.

[0197] In another embodiment, the auxiliary lipid comprises one or a combination of more than two of an anionic lipid, a neutral lipid, a steroid and a polymer-bound lipid.

[0198] In another embodiment, the lipid carrier further comprises other cationic or ionizable lipid compounds.

[0199] In another embodiment, the lipid carrier comprises a first lipid compound and a second lipid compound, wherein the first lipid compound comprises the compound of Formula I or a pharmaceutically acceptable salt, stereoisomer, tautomer, solvate, chelate, non-covalent complex, or precursor thereof of any of claims 1-5 and optionally other ionizable lipids, and the second lipid compound comprises one or a combination of more than two of an anionic lipid, a neutral lipid, a steroid and a polymer-bound lipid.

[0200] In another embodiment, the first lipid compound is a combination of a compound of Formula I or Formula II or Formula IIII or Formula IV or Formula V or a pharmaceutically acceptable form thereof such as a salt, stereoisomer, reciprocal isomer, solvate, chelate, non-covalent complex or a precursor drug and other cationic or ionizable lipids.

[0201] In another embodiment, the other cationic or ionizable lipid compounds include one or a combination of more than two of 1, 2-diolethoxy-N, N-dimethylaminopropane (DLinDMA) , 1, 2-diolethoxy-N, N-dimethylaminopropane (DODMA) , DLin-MC2-MPZ, 2, 2-diolethoxy-4- (2-dimethylaminoethyl) - [1, 3] -dioxolane pentane (DLin-KC2-DMA) , 1, 2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane (DOTAP) , 1, 1’ - (2- (4- (2- ( (2- (bis (2-hydroxydodecyl) amino) ethyl) (2-hydroxydodecyl) amino) ethyl) piperazin-1-yl) ethylazanediyl) didodecan-2-ol (C12-200) , 3β [N-N 'N' -dimethylaminoethane) -carbamoyl] cholesterol (DC-Chol) and N- (1- (2, 3-dioleyloxy) propyl) -N, N, N-trimethylammonium chloride (DOTMA) .

[0202] In another embodiment, the anionic lipid comprises one or a combination of more than two of phosphatidylserine, phosphatidylinositol, phosphatidic acid, phosphatidylglycerol, dioleoylphosphatidylglycerol (DOPG) , 1, 2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (DOPS) , and dimyristoylphosphatidylglycerol.

[0203] In another embodiment, the neutral lipid comprises at least one of 1, 2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) ,

[0204] 1, 2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC) ,

[0205] 1, 2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC) ,

[0206] 1, 2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) ,

[0207] Dipalmitoylphosphatidylglycerol (DPPG) ,

[0208] 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC) , palmitoyloleoyl phosphatidylethanolamine (POPE) , dipalmitoyl phosphatidylethanolamine (DPPE) , dimyristoylphosphoethanolamine (DMPE) , distearoyl-phosphatidyl-ethanolamine (DSPE) , and 1-stearoyl-2-oleoyl phosphatidy ethanolamine (SOPE) or a lipid modified by an anionic or cationic modification group thereof. The anionic or cationic modification groups are not limited.

[0209] In another embodiment, the steroids include one or more of cholesterol, nonsterol, sitosterol, ergosterol, campesterol, stigmasterol, brassinosteroids, tomatidine, ursolic acid, alpha totaxin, coprosterol, and corticosteroids.

[0210] In another embodiment, the polymer-bound lipid comprises one or a combination of two or more of 1- (monomethoxy-polyethyleneglycol) -2, 3-dimyristoylglycerol (PEG-DMG) , α - (3 ′ - { [1, 2-di (myristyloxy) propanoxy] carbonylamino} propyl) -ω-methoxy, polyoxyethylene (PEG-c-DMG) , PEG-1, 2-dimyristoxypropyl-3-amine (PEG-c-DMA) , 1.2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N- [amino (polyethylene glycol) ] (PEG-DSPE) , pegylated phosphatidylethanoloamine (PEG-PE) , PEG-modified ceramide, PEG-modified  dialkylamine, PEG-modified diacylglycerol, Tween-20, Tween-80, 1, 2-dipalmitoyl-sn-glycerol, methoxypolyethylene glycol (PEG-DPG) ,

[0211] 4-O- (2’ , 3’ -di (tetradecanoyloxy) propyl-1-O- (ω-methoxy (polyethoxy) ethyl) butanedioate (PEG-S-DMG) , PEG-dialkoxypropyl (PEG-DAA) ,

[0212] mPEG2000-1, 2-di-O-alkyl-sn3-carbomoylglyceride (PEG-c-DOMG) and N-Acetylgalactosamine- ( (R) -2, 3-bis (octadecyloxy) propyl-l- (methoxy polyethylene glycol) 2000) propylcarbamate) ) (GalNAc-PEG-DSG) .

[0213] In another embodiment, in the lipid carrier, the molar ratio of the first lipid compound, the anionic lipid, the neutral lipid, the steroid and the polymer-bound lipid is (20 to 65) : (0 to 20) : (5 to 25) : (25 to 55) : (0.3 to 15) ; exemplarily, the molar ratio may be 20: 20: 5: 50: 5, 30: 5: 25: 30: 10, 20: 5: 5: 55: 15, 65: 0: 9.7: 25: 0.3, etc.; wherein, in the first lipid compound, the compound of Formula I or a pharmaceutically acceptable salt, stereoisomer, tautomer, solvate, chelate, non-covalent complex, or precursor drug thereof and other cationic or ionizable ionizable lipids in a molar ratio of (1 to 10) : (0 to 10) ; exemplarily, the molar ratio may be 1: 1, 1: 2, 1: 5, 1: 7.5, 1: 10, 2:1, 5: 1, 7.5: 1, 10: 1, etc.

[0214] In another embodiment, in the lipid carrier, the molar ratio of the first lipid compound, the anionic lipid, the neutral lipid, the steroid and the polymer-bound lipid is (20 to 55) : (0 to 13) : (5 to 25) : (25 to 51.5) : (0.5 to 15) ; wherein, in the first lipid compound, the compound of Formula I or a pharmaceutically acceptable form thereof such as salt, stereoisomer, tautomer, solvate, chelate, non-covalent complex, or precursor drug and other cationic or ionizable lipids in a molar ratio of (3-4) : (0-5) .

[0215] In another embodiment, the lipid carrier further comprises a bioactive substance encapsulated in the lipid carrier.

[0216] In another embodiment, the bioactive substance is selected from the group consisting of: a nucleic acid, protein, polypeptide, small molecule, and a combination thereof.

[0217] In another embodiment, the nucleic acid comprises RNA, DNA, antisense nucleic acid, aptamer, ribozyme, immunostimulatory nucleic acid, or PNA.

[0218] In another embodiment, the antisense nucleic acid is an antisense oligonucleic acid.

[0219] In another embodiment, the RNA is mRNA, rRNA, circRNA, siRNA, saRNA, tRNA, snRNA, antagomir, microRNA inhibitor, microRNA activator, or shRNA.

[0220] In another embodiment, the DNA comprises a plasmid.

[0221] In another embodiment, the mRNA comprises a sequence encoding an RNA-directed DNA-binding agent, and more specifically, comprises an mRNA encoding a nuclease or a base editor.

[0222] In another embodiment, the nucleic acid further comprises a guide RNA, specifically, the guide RNA comprises a gRNA nucleic acid.

[0223] In another embodiment, the nucleic acid comprises an mRNA encoding a nuclease or a base editor and a gRNA.

[0224] In another embodiment, the gRNA is a modified or unmodified gRNA.

[0225] In another embodiment, the lipid carrier is highly efficient in encapsulating the bioactive substance and greatly enhances the efficiency of delivery of the bioactive substance in vivo.

[0226] In another embodiment, the lipid carrier comprises a first lipid compound and a second lipid compound, wherein the first lipid compound comprises the compound  of Formula I or Formula II or Formula IIII or Formula IV or Formula V according to the first aspect of the present invention and optionally other ionizable lipids, and the second lipid compound comprises one or a combination of more than two of an anionic lipid, a neutral lipid, a steroid and a polymer-bound lipid.

[0227] In another embodiment, the first lipid compound is any of the above compounds or a pharmaceutically acceptable form thereof such as a salt, stereoisomer, reciprocal isomer, solvate, chelate, non-covalent complex or a precursor drug.

[0228] In another embodiments, the first lipid compound is a combination of any of the above compounds or a pharmaceutically acceptable form thereof such as a salt, stereoisomer, reciprocal isomer, solvate, chelate, non-covalent complex or a precursor drug and other cationic or ionizable lipids.

[0229] In another embodiments, the other cationic or ionizable lipid compounds include one or a combination of more than two of 1, 2-diolethoxy-N, N-dimethylaminopropane (DLinDMA) , 1, 2-diolethoxy-N, N-dimethylaminopropane (DODMA) , DLin-MC2-MPZ, 2, 2-diolethoxy-4- (2-dimethylaminoethyl) - [1, 3] -dioxolane pentane (DLin-KC2-DMA) , 1, 2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane (DOTAP) , 1, 1’ - (2- (4- (2- ( (2- (bis (2-hydroxydodecyl) amino) ethyl) (2-hydroxydodecyl) amino) ethyl) piperazin-1-yl) ethylazanediyl) didodecan-2-ol (C12-200) , 3β [N-N 'N' -dimethylaminoethane) -carbamoyl] cholesterol (DC-Chol) and N- (1- (2, 3-dioleyloxy) propyl) -N, N, N-trimethylammonium chloride (DOTMA) .

[0230] In another embodiment, the anionic lipid comprises one or a combination of more than two of phosphatidylserine, phosphatidylinositol, phosphatidic acid, phosphatidylglycerol, dioleoylphosphatidylglycerol (DOPG) , 1, 2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (DOPS) , and dimyristoylphosphatidylglycerol.

[0231] In another embodiment, the neutral lipid comprises at least one of 1, 2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) , 1, 2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC) , 1, 2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC) , 1, 2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) ,

[0232] Dipalmitoylphosphatidylglycerol (DPPG) , 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC) ,

[0233] palmitoyloleoyl phosphatidylethanolamine (POPE) ,

[0234] 1, 2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine DPPE,

[0235] dipalmitoyl phosphatidylethanolamine (DPPE)

[0236] Dimyristoylphosphoethanolamine (DMPE) , distearoyl-phosphatidyl-ethanolamine (DSPE) , and 1-stearoyl-2-oleoyl phosphatidy ethanolamine (SOPE) or a lipid modified by an anionic or cationic modification group thereof. The anionic or cationic modification groups are not limited.

[0237] In another embodiment, the steroids include one or more of cholesterol, nonsterol, sitosterol, ergosterol, campesterol, stigmasterol, brassinosteroids, tomatidine, ursolic acid, alpha totaxin, coprosterol, and corticosteroids.

[0238] In another embodiment, the polymer-bound lipid comprises one or a combination of two or more of 1- (monomethoxy-polyethyleneglycol) -2, 3-dimyristoylglycerol (PEG-DMG) , α- (3′ - { [1, 2-di (myristyloxy) propanoxy] carbonylamino} propyl) -ω-methoxy, polyoxyethylene (PEG-c-DMG) , PEG-1, 2-dimyristoxypropyl-3-amine (PEG-c-DMA) , 1.2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N- [amino (polyethylene glycol) ] (PEG-DSPE) , pegylated  phosphatidylethanoloamine (PEG-PE) , PEG-modified ceramide, PEG-modified dialkylamine, PEG-modified diacylglycerol, Tween-20, Tween-80, 1, 2-dipalmitoyl-sn-glycerol, methoxypolyethylene glycol (PEG-DPG) , 4-O- (2’ , 3’ -di (tetradecanoyloxy) propyl-1-O- (ω-methoxy (polyethoxy) ethyl) butanedioate (PEG-S-DMG) , PEG-dialkoxypropyl (PEG-DAA) , mPEG2000-1, 2-di-O-alkyl-sn3-carbomoylglyceride (PEG-c-DOMG) and N-acetylgalactosamine ( (R) -2, 3-bis (octadecyloxy) propyl-1- (methoxy polyethylene glycol) 2000) propylcarbamate) ) (GalNAc-PEG-DSG) .

[0239] In another embodiment, in the lipid carrier, the molar ratio of the first lipid compound, the anionic lipid, the neutral lipid, the steroid and the polymer-bound lipid is (20 to 65) : (0 to 20) : (5 to 25) : (25 to 55) : (0.3 to 15) ; exemplarily, the molar ratio may be 20: 20: 5: 50: 5, 30: 5: 25: 30: 10, 20: 5: 5: 55: 15, 65: 0: 9.7: 25: 0.3, etc.; wherein, in the first lipid compound, the compound of Formula I or a pharmaceutically acceptable salt, stereoisomer, tautomer, solvate, chelate, non-covalent complex, or precursor drug thereof and other cationic or ionizable ionizable lipids in a molar ratio of (1 to 10) : (0 to 10) ; exemplarily, the molar ratio may be 1: 1, 1: 2, 1: 5, 1: 7.5, 1: 10, 2:1, 5: 1, 7.5: 1, 10: 1, etc.

[0240] In another embodiment, in the lipid carrier, the molar ratio of the first lipid compound, the anionic lipid, the neutral lipid, the steroid and the polymer-bound lipid is (20 to 55) : (0 to 13) : (5 to 25) : (25 to 51.5) : (0.5 to 15) ; wherein, in the first lipid compound, the compound of Formula I or a pharmaceutically acceptable form thereof such as salt, stereoisomer, tautomer, solvate, chelate, non-covalent complex, or precursor drug and other cationic or ionizable lipids in a molar ratio of (3-4) : (0-5) .

[0241] In a third aspect of the present invention, it provides a lipid nanoparticle (LNP) , comprising a compound of Formula I, or a pharmaceutically acceptable salt, stereoisomer, tautomer, solvate, chelate, non-covalent complex, or precursor thereof, as described in the first aspect of the present invention.

[0242] In another embodiment, the lipid nanoparticle further comprises an auxiliary lipid.

[0243] In another embodiment, the lipid nanoparticle further comprises a bioactive substance encapsulated in the lipid nanoparticle.

[0244] In a fourth aspect of the present invention, it provides a lipid nanoparticle composition comprising a lipid carrier as described in a second aspect of the present invention or a lipid nanoparticle as described in a third aspect of the present invention, and a bioactive substance encapsulated in the lipid carrier or the lipid nanoparticle.

[0245] In another embodiment, the mass ratio of the bioactive substance to the lipid carrier in the composition is 1: (3 to 40) , exemplarily, the mass ratio is 1: 3, 1: 5, 1: 10, 1:15, 1: 20, 1: 30, 1: 40, etc.

[0246] In another embodiment, the ratio (w / w) of the nuclease or base editor mRNA to gRNA in the bioactive substance is from about 10: 1 to about 1: 10.

[0247] In another embodiment, the ratio (w / w) of the nuclease or base editor mRNA to gRNA of in the bioactive substance is from about 3: 1 to about 1: 3.

[0248] In another embodiment, the ratio (w / w) of the nuclease or base editor mRNA to gRNA in the bioactive substance is about 3: 2.

[0249] In another embodiment, the composition comprises a pharmaceutical composition.

[0250] In a fifth aspect of the present invention, it provides a pharmaceutical  composition comprising a lipid carrier as described in a second aspect of the present invention or a lipid nanoparticle as described in a third aspect of the present invention, and a bioactive substance encapsulated in the lipid carrier or the lipid nanoparticle, and a pharmaceutically acceptable excipient, carrier or diluent.

[0251] In a sixth aspect of the present invention, it provides a pharmaceutical formulation comprising a lipid carrier as described in the second aspect of the present invention or a lipid nanoparticle as described in the third aspect of the present invention, and a bioactive substance encapsulated in the lipid carrier or the lipid nanoparticle, and a pharmaceutically acceptable excipient, carrier or diluent; or the pharmaceutical formulation comprising a lipid nanoparticle composition as described in the fourth aspect of the present invention, and a pharmaceutically acceptable excipient, carrier or diluent.

[0252] In another embodiment, the pharmaceutical formulation has a particle size of 30 to 500 nm, exemplarily, the particle size may be 30 nm, 50 nm, 100 nm, 150 nm, 250 nm, 350 nm, 500 nm, etc.

[0253] In another embodiment, the encapsulation efficiency of the bioactive substance in the pharmaceutical formulation is greater than 50%. Exemplarily, the encapsulation efficiency may be 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 79%, 80%, 85%, 89%, 90%, 93%, 95%, etc.

[0254] In another embodiment, the drug has a hydrated particle size of 50-200 nm, preferably 70-150 nm, more preferably 75-110 nm.

[0255] In another embodiment, the pharmaceutical formulation can be applied for the treatment and / or prevention of a disease.

[0256] In another embodiment, the disease is selected from the group consisting of a metabolic disease, genetic disease, cancer, cardiovascular disease, infectious disease, and a combination thereof, preferably the metabolic disease comprises familial hypercholesterolemia (FH) , the genetic disease includes transthyretin amyloidosis (ATTR) , primary hyperoxuria (PH1) , and hereditary angioedema (HAE) , and the infectious disease includes hepatitis B (HEPATITIS B) .

[0257] In another embodiment, the pharmaceutical formulation is in a dosage form selected from the group consisting of: injection, lyophilized agent, aerosol inhalation, smearing preparation.

[0258] In another embodiment, the pharmaceutical agent is administered by injection, i.e. intravenously, intramuscularly, intradermally, subcutaneously, intrathecally, intraduodenally or intraperitoneally.

[0259] In another embodiment, the pharmaceutical formulation is administered by inhalation, for example intranasally.

[0260] In another embodiment, the pharmaceutical formulation is administered transdermally, such as transdermal application administration or electrode introduction administration.

[0261] In a seventh aspect of the present invention, it provides a use of a compound of Formula I or Formula II or Formula IIII or Formula IV or Formula V or a pharmaceutically acceptable salt, stereoisomer, tautomer, solvate, chelate, non-covalent complex, or precursor thereof as described in the first aspect of the present invention in the preparation of a lipid nanoparticle.

[0262] In an eighth aspect of the present invention, it provides a use of a compound of  Formula I or Formula II or Formula IIII or Formula IV or Formula V or a pharmaceutically acceptable salt, stereoisomer, tautomer, solvate, chelate, non-covalent complex, or precursor thereof described in the first aspect of the present invention or a lipid carrier described in the second aspect of the present invention or a lipid nanoparticle described in the third aspect of the present invention or a lipid nanoparticle composition described in the fourth aspect of the present invention or a pharmaceutical composition described in the fifth aspect of the present invention or a pharmaceutical formulation described in the sixth aspect of the present invention in the preparation of a nucleic acid drug, a genetic vaccine, a small molecule drug, a polypeptide or a protein drug.

[0263] In a ninth aspect of the present invention, it provides a method for preparing a lipid nanoparticle composition as described in a fourth aspect of the present invention, comprising:

[0264] (a) Mixing a compound of Formula I or Formula II or Formula IIII or Formula IV or Formula V or a pharmaceutically acceptable salt, stereoisomer, tautomer, solvate, chelate, non-covalent complex, or precursor thereof, as described in the first aspect of the present invention with an optionally auxiliary lipid and an organic solvent, thereby obtaining a lipid organic phase;

[0265] (b) Mixing the bioactive substance with an aqueous solvent, thereby obtaining an aqueous phase containing the bioactive substance;

[0266] (c) Mixing the lipid organic phase in step (a) with the aqueous phase in step (b) , thereby obtaining the lipid nanoparticle composition.

[0267] In another embodiment, the organic solvent comprises ethanol, methanol, isopropanol, acetonitrile, dimethylformamide, dimethyl sulfoxide, dioxane, tetrahydrofuran, or a combination thereof.

[0268] In another embodiment, the aqueous solvent is a buffer.

[0269] In another embodiment, the aqueous solvent is a buffer in the pH range of 3-7.

[0270] In another embodiment, the acidic buffer is a citrate buffer of pH 4.0.

[0271] In another embodiment, the volume ratio of the lipid organic phase to the aqueous phase containing the bioactive substance is 1: (2-5) , preferably 1: (3-4) .

[0272] In another embodiment, in step (c) , the lipid organic phase and the aqueous phase are mixed by means of a microfluidic chip.

[0273] In another embodiment, the method further comprises step (d) : the lipid nanoparticle composition obtained in step (c) is purified and concentrated and filtered for sterilization.

[0274] In a tenth aspect of the present invention, it provides a use of a compound of Formula I or Formula II or Formula IIII or Formula IV or Formula V or a pharmaceutically acceptable salt, stereoisomer, tautomer, solvate, chelate, non-covalent complex, or precursor thereof as described in the first aspect of the present invention for the preparation of a drug delivery system.

[0275] In another embodiment, the delivery system comprises lipid nanoparticle (LNP) , liposome, polymeric nanoparticle, etc., preferably for the preparation of lipid nanoparticle.

[0276] In another embodiment, the drug delivery system is used to deliver drugs for the treatment and / or prevention of tumors, infectious diseases and rare diseases.

[0277] In an eleventh aspect of the present invention, it provides a use of a compound of Formula I or a pharmaceutically acceptable salt, stereoisomer, tautomer, solvate, chelate,  non-covalent complex, or precursor thereof as described in a first aspect of the present invention or a lipid carrier as described in a second aspect of the present invention or lipid nanoparticle as described in a third aspect of the present invention or a lipid nanoparticle composition as described in a fourth aspect of the present invention or a pharmaceutical composition as described in a fifth aspect of the present invention or a pharmaceutical formulation as described in a sixth aspect of the present invention for the preparation of drugs for the treatment and / or prevention of a disease.

[0278] In another embodiment, the disease is selected from the group consisting of a metabolic disease, genetic disease, cancer, cardiovascular disease, infectious disease, and a combination thereof, preferably the metabolic disease comprises familial hypercholesterolemia (FH) , the genetic disease includes transthyretin amyloidosis (ATTR) , primary hyperoxuria (PH1) , and hereditary angioedema (HAE) , and the infectious disease includes hepatitis B (HEPATITIS B) .

[0279] In a twelfth aspect of the present invention, it provides a method of delivering a therapeutic or prophylactic agent to a cell, tissue or organ in a subject, comprising contacting the cell, tissue or organ in the subject with a lipid nanoparticle composition as described in the fourth aspect of the present invention, a pharmaceutical composition as described in the fifth aspect of the present invention or a pharmaceutical formulation as described in the sixth aspect of the present invention.

[0280] In another embodiment, the therapeutic agent or prophylactic agent is a bioactive substance, preferably mRNA.

[0281] In another embodiment, the cell is selected from the group consisting of: a hepatocyte, lung cell, epithelial cell, hematopoietic cell, endothelial cell, bone cell, stem cell, mesenchymal cell, nerve cell, photoreceptor cell, retinal pigment epithelium cell, secretory cell, heart cell, adipocyte, smooth muscle cell, cardiomyocyte, skeletal muscle cell, β cell, pituicyte, synovial lining cell, ovarian cell, testicular cell, fibroblast, lymphocyte, B cell, T cell, antigen presenting cell, reticulocyte, leukocyte, granulocyte, and tumor cell.

[0282] In another embodiment, the tumor cell includes lung cancer cell, colon cancer cell, rectal cancer cell, anal cancer cell, bile duct cancer cell, small intestine cancer cell, stomach cancer cell, esophageal carcinoma cell, gallbladder carcinoma cell, liver cancer cell, pancreatic cancer cell, appendix cancer cell, breast cancer cell, ovarian cancer cell, cervical cancer cell, prostate cancer cell, kidney cancer cell, cancer cell of the central nervous system, glioblastoma tumor cell, skin cancer cell, lymphoma cell, choriocarcinoma tumor cell, head and neck cancer cell, osteogenic sarcoma tumor cell, and blood cancer cell.

[0283] In another embodiment, the tissue or organ is selected from the group consisting of:heart, liver, spleen, lung, kidney, brain, lymph node, muscle, blood, spine, bone, and a combination thereof.

[0284] In another embodiment, the subject is a human or non-human mammal (such as mouse, rat, rabbit, monkey) .

[0285] In a thirteenth aspect of the present invention, it provides a method for producing a target protein or target polypeptide in a subject cell, comprising contacting the subject cell with a lipid nanoparticle composition as described in a fourth aspect of the present invention, a pharmaceutical composition as described in  a fifth aspect of the present invention, or a pharmaceutical formulation as described in a sixth aspect of the present invention.

[0286] In another embodiment, wherein the bioactive substance in the lipid nanoparticle composition, the pharmaceutical composition or pharmaceutical formulation is mRNA, wherein the mRNA encodes a target protein or polypeptide, whereby the mRNA is capable of being translated in the cell to produce the target protein or target polypeptide.

[0287] It should be understood that within the scope of the present invention, the above-mentioned technical features of the present invention and the technical features described in detail below (such as embodiments) can be combined with each other to form a new or preferred technical solution. Due to space constraints, I will not repeat them here.Description of Drawings

[0288] Figure 1 shows a schematic diagram of the delivery strategy for PCSK9 gene base editing in mouse liver cells in the present invention.

[0289] Figure 2 shows base editing efficiencies for editing of PCSK9 gene in mouse liver cells using lipid nanoparticles (LNPs) containing different compounds.DETAILED DESCRIPTION

[0290] After a long and thorough research, the present inventors have accidentally discovered for the first time an ionizable lipid compound for delivering therapeutic agents, and the ionizable lipid compound can effectively deliver drugs such as nucleic acid molecules and small molecule compounds, and by comparison, the lipid nanoparticles of the present invention have better particle size distribution, high encapsulation efficiency, and the delivery effect can be significantly better than that of the comparison lipid nanoparticles, which can meet the demand for in vivo delivery. On this basis, the present invention is completed.

[0291] For easier understanding of the invention, certain technical and scientific terms are specifically defined below. Unless otherwise expressly defined herein, all other technical and scientific terms used herein have the meanings commonly understood by those skilled in the art.

[0292] In this specification, the range of values indicated by the use of "value A to value B" refers to the range that includes the endpoint values A and B.

[0293] In this specification, the use of "basically " or "substantially" indicates that the standard deviation from the theoretical model or theoretical data is within 5%, preferably 3%, and more preferably 1%.

[0294] In this specification, the use of "may" means both to perform a certain treatment and not to perform a certain treatment.

[0295] In this specification, "optional" or "optionally" means that the next described event or situation may or may not occur, and the description includes the event occurs and the event does not occur.

[0296] In this specification, references to "some specific / preferred embodiments" , "other specific / preferred embodiments" , "embodiments" , etc. refer to the particular  elements (e.g., features, structures, properties, and / or characteristics) described in connection with the embodiment are included in at least one of the embodiments described herein and may or may not be present in other embodiments. Further, it should be understood that the elements described may be combined in any suitable manner in various embodiments.

[0297] Before describing the invention further, it should be understood that the invention is not limited to the particular embodiments described herein; it should also be understood that the terms used herein are used only to describe, and not to limit, particular embodiments.

[0298] Unless otherwise stated, the following terms have the following meanings:

[0299] The term "pharmaceutically acceptable salt" refers to a salt of a compound of the present invention that is substantially non-toxic to the organism. A pharmaceutically acceptable salt generally includes, but is not limited to, a salt formed by reaction of a compound of the invention with a pharmaceutically acceptable inorganic / organic acid or inorganic / organic base, which are also referred to as acid addition salts or base addition salts. Common inorganic acids include (but are not limited to) hydrochloric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, phosphoric acid, etc., common organic acids include (but are not limited to) trifluoroacetic acid, citric acid, maleic acid, fumaric acid, succinic acid, tartaric acid, lactic acid, pyruvic acid, oxalic acid, formic acid, acetic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, p-toluenesulfonic acid, etc., common inorganic bases include (but are not limited to) sodium hydroxide, potassium hydroxide, calcium hydroxide, barium hydroxide etc. Common organic bases include (but are not limited to) diethylamine, triethylamine, ethambutal, etc.

[0300] The term "stereoisomer " (or " optical isomer " ) refers to stable isomers having a vertical plane of asymmetry due to having at least one chiral factor (including a chiral center, a chiral axis, a chiral plane, etc. ) , and thus capable of rotating plane-polarized light. Since there are asymmetric centers as well as other chemical structures in the compounds of the present invention that may lead to stereoisomerism, the present invention also includes these stereoisomer and mixtures thereof. Since the compounds of the present invention and their salts include asymmetric carbon atoms, they can exist as mixtures of single stereoisomer, racemates, enantiomers and diastereoisomers. Typically, these compounds can be prepared in the form of racemic mixtures. However, if desired, such compounds can be prepared or isolated to obtain pure stereoisomer, i.e., single enantiomers or diastereoisomers, or mixtures of single stereoisomer enrichment (Purity ≥98%, purity ≥95%, ≥93%, ≥90%, ≥88%, ≥85%or ≥80%) . Single stereoisomers of compounds were prepared synthetically from spin starting materials containing the desired chiral center, or were prepared by preparing a mixture of enantiomeric products followed by separation or splitting, e.g., conversion to a mixture of diastereoisomers followed by separation or recrystallization, chromatography treatment, use of chiral splitting reagents, or direct separation of the enantiomers on a chiral column. Starting compounds with specific stereochemistry can either be commercially available or can be prepared as described herein and then split by methods well known in the art.

[0301] The term "tautomer " (or " tautomeric forms " ) refers to structural isomers with different energies that can be transformed into each other through low energy barriers. If tautomerizm is possible (e.g., in solution) , chemical equilibrium of the tautomer  can be achieved. For example, proton tautomer (or proton transfer tautomer) include (but are not limited to) interconversions via proton migration, such as keto-enol isomerization, imine-enamine isomerization, amide-imidohydrine isomerization, etc. Unless otherwise indicated, all tautomer forms of the compounds of the present invention are within the scope of the present invention.

[0302] The term "solvate" refers to a substance formed by combining a compound of the present invention or a pharmaceutically acceptable salt thereof with at least one solvent molecule by non-covalent intermolecular forces. Common solvate includes (but is not limited to) hydrate, an ethanolate, an acetonide, etc.

[0303] The term "chelate" refers to a complex with a ring structure, obtained by chelating two or more ligands with the same metal ion to form a chelate ring.

[0304] The term "non-covalent complex" is formed by the interaction of a compound with another molecule, where no covalent bond is formed between the compound and the molecule. For example, compounding can occur through van der Waals interactions, hydrogen bonding, and electrostatic interactions (also called ionic bonding) .

[0305] The term "precursor drug" refers to a derivative compound that, when applied to a patient, can directly or indirectly provide a compound of the present invention. Particularly preferred derivative compounds or precursors are compounds that, when administered to a patient, enhance the bioavailability of the compounds of the invention (e.g., are more readily absorbed into the blood) or facilitate the delivery of the parent compound to the site of action (e.g., the lymphatic system) . Unless otherwise noted, all prodrug forms of the compounds of the present invention are within the scope of the present invention, and the various prodrug forms are well known in the art.

[0306] The term "each independently" means that at least two groups (or ring systems) having the same or similar range of values present in the structure may have the same or different meanings in a particular case. For example, if substituent X and substituent Y are each independently hydrogen, halogen, hydroxy, cyano, alkyl or aryl, then when substituent X is hydrogen, substituent Y can be either hydrogen, halogen, hydroxyl, cyano, alkyl or aryl; similarly, when substituent Y is hydrogen, substituent X can be either hydrogen, halogen, hydroxyl, cyano, alkyl or aryl.

[0307] The terms "comprising" and "including" are used in their open, non-limiting sense.

[0308] The term "alkyl" refers to a monovalent straight or branched alkyl group consisting solely of carbon and hydrogen atoms, containing no unsaturation, and connected by a single bond to other fragments, including (but not limited to) methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl, sec-butyl, isobutyl, and tert-butyl. For example, the term "C1-30 alkyl" refers to a saturated monovalent straight or branched chain hydrocarbon group containing 1 to 30 carbon atoms.

[0309] The term "alkylene " refers to a divalent straight or branched alkyl group consisting of only carbon and hydrogen atoms, containing no saturation, and connected by two single bonds to other fragments, respectively, including (but not limited to) methylene, 1, 1-ethylidene and 1, 2-ethylidene. For example, "C1-30 alkylene " refers to a saturated, divalent straight or branched alkyl group comprising 1 to 30 carbon atoms.

[0310] The term "cycloalkyl" refers to a saturated, monocyclic or polycyclic (e.g.,  bicyclic, tricyclic or tetracyclic) non-aromatic hydrocarbon group consisting of only carbon and hydrogen atoms. Cycloalkyl groups may include parallel, bridged or spiro ring systems. For example, the term "C3-6 cycloalkyl" as used in the present invention refers to a cycloalkyl group having from 3 to 6 carbon atoms. For example, a cycloalkyl group may be cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyl, cyclohexyl or bicyclo [2.2.1] heptyl, etc.

[0311] The term "cycloalkylene " refers to a divalent group obtained by removing the hydrogen atom from a cycloalkyl group as defined above, including (but not limited to) cyclopropylidene, cyclobutylidene, cyclopentylidene, cyclohexylidene, cycloheptylidene, etc. For example, "C3-30 cycloalkylene " refers to a divalent group obtained by removing the hydrogen atom from a cycloalkyl group containing 3 to 30 carbon atoms.

[0312] The term "branched alkyl" refers to an alkane radical that is linked to the parent molecule and forms at least two branching structures of its own. For example,

[0313] The term "alkenyl" refers to a monovalent straight or branched alkane group consisting of only carbon and hydrogen atoms, containing at least one double bond, and connected by a single bond to other fragments, including (but not limited to) vinyl, propenyl, allyl, isopropenyl, butenyl and isobutenyl. For example, the term "C2-30 alkenyl" refers to a monovalent straight or branched hydrocarbyl containing 2 to 30 carbon atoms and having at least one carbon-carbon double bond (>C=C<) .

[0314] The term "alkenylene" refers to a divalent straight or branched alkane group consisting of only carbon and hydrogen atoms, containing at least one double bond, and connected by two single bonds to other fragments, respectively, including (but not limited to) a ethenylidene. For example, the term "C2-30 alkenylene " refers to a divalent straight or branched hydrocarbyl containing 2 to 30 carbon atoms and having at least one carbon-carbon double bond (>C=C<) .

[0315] The term "alkynyl" refers to a monovalent straight or branched alkyl group consisting of only carbon and hydrogen atoms, containing at least one carbon-carbon triple bond, and connected by a single bond to other fragments, including (but not limited to) acetenyl, propinyl, butynyl and pentynyl. For example, the term "C2-30 alkynyl" refers to a monovalent straight or branched chain hydrocarbyl containing 2 to 30 carbon atoms and having at least one carbon-carbon triple bond.

[0316] The term " alkynylene " refers to a divalent straight or branched alkyl group consisting of only carbon and hydrogen atoms, containing at least one carbon-carbon triple bond, and connected to other fragments by two single bonds each, including (but not limited to) anethynylene, etc. For example, " C2-30 alkynylene " refers to a divalent straight or branched hydrocarbyl comprising 2 to 30 carbon atoms and having at least one carbon-carbon triple bond.

[0317] The term "cycloalkenyl group" refers to an unsaturated, monocyclic or polycyclic (e.g., bicyclic, tricyclic or tetracyclic) non-aromatic hydrocarbyl consisting of only carbon and hydrogen atoms. Cycloalkenyl group may include merged, bridged or spiro ring systems. Examples include cyclopropanyl and cyclobutene.

[0318] The term "cycloalkenylene" refers to a divalent group obtained by removing the  hydrogen atom from a cycloalkenyl group as defined above, including (but not limited to) subcyclopropanyl and subcyclobutene, etc. For example, the term "C3-30 cycloalkenylene" refers to a divalent group obtained by removing hydrogen atoms from a cycloalkenyl group comprising 3 to 30 carbon atoms.

[0319] The term "branched alkenyl" refers to an alkenes radical that is linked to the parent molecule and forms at least two branching structures of its own. For example

[0320] The term "heterocyclyl" refers to a saturated or partially saturated, monocyclic or polycyclic (e.g., bicyclic, e.g., a parallel ring, bridging or spirocyclic) non-aromatic group whose ring atom comprises a carbon atom and at least one heteroatom selected from N, O and S, wherein the S atom is optionally substituted to form S (=O) , S (=O) 2 or S (=O) (=NRx) , Rx being independently selected from H or C1-4 alkyl. The heterocyclic group may be attached to the rest of the molecule by any one of the ring atoms if the valence bond requirement is met. For example, the term "3-8-membered heterocyclic group" as used in the present invention refers to a heterocyclic group having from 3 to 8 ring atoms. For example (but are not limited to) , oxiranyl, aziridinyl, azetidinyl, oxetanyl, tetrahydrofuranyl, dioxolyl, pyrolidinyl, pyrrolidonyl, imidazolidinyl, pyrazolidinyl, tetrahydropyranyl, piperidinyl, piperazinyl, morpholinyl, thiomorpholinyl, dithianyl or trithianyl.

[0321] The term "aryl" refers to a monocyclic or dense polycyclic aromatic hydrocarbyl having a conjugated π-electron system. For example, the term "C6-10 aryl" as used in the present invention refers to an aryl group having 6 to 10 carbon atoms. For example, aryl can be phenyl, naphthyl, anthryl, phenanthryl, acenaphthenyl, azulenyl, fluorenyl, indenyl, pyrenyl, etc.

[0322] The term "heteroaryl" refers to a monocyclic or dense polycyclic aromatic group having a conjugated π-electron system, where the ring atom consists of a carbon atom and at least one heteroatom selected from N, O and S. The heteroaromatic group can be attached to the rest of the molecule through any one of the ring atoms if the valence bonding requirement is met. For example, the term "5-10-membered heteroaryl" as used in the present invention refers to a heteroaryl group having 5 to 10 ring atoms. Common heteroaryl groups include (but are not limited to) thienyl, furanyl, pyrrolyl, oxazolyl, thiazolyl, imidazolyl, pyrazolyl, isoxazolyl, isothiazolyl, oxadiazolyl, triazolyl, thiadiazolyl, pyridyl, pyridazinyl, pyrimidinyl, pyrazinyl, triazinyl and the benzo derivatives thereof, pyrrolopyridyl, pyrrolopyridinyl, pyrazolopyridyl, imidazolopyridyl, pyrrolopyrimidinyl, pyrazolopyrimidinyl, purinyl, and the like..

[0323] The term "halogen" refers to fluorine (F) , chlorine (Cl) , bromine (Br) and iodine (I) .

[0324] The term "hydroxyl" refers to -OH.

[0325] The term "cyano" refers to -CN.

[0326] The term "amino" refers to -NH2.

[0327] The term "nitro" refers to -NO2.

[0328] The term "oxo group" refers to (=O) .

[0329] The term "subject" includes both human and non-human animals. Non-human animals include vertebrates, such as mammals, and non-mammals, such as non-human primates, sheep, cats, horses, cattle, chickens, dogs, mice, rats, goats, rabbits, and pigs. Preferably, the subject is a human. The terms "patient" or "subject" are used  interchangeably herein except when indicated.

[0330] The term "nuclease" refers to an enzyme that catalyzes the breaking of phosphodiester bonds between nucleotides in a nucleic acid molecule. In some embodiments, the nuclease is selected from a broad range of nucleases, zinc-finger nucleases (ZFNs) , TAL-effector DNA-binding domain-nuclease fusion proteins (TALEN) , and RNA-directed nucleases or variants thereof in which the nuclease activity has been reduced or inhibited.

[0331] In some embodiments, the RNA-guided nucleases are naturally occurring CRISPR-Cas proteins or active variants or fragments thereof. CRISPR-Cas systems are classified as either class I or class II systems. Class II systems contain single effector nucleases and include types II, V, and VI. Each category is subdivided into types (types I, II, III, IV, V, VI) , some of which are further subdivided into subtypes (e.g., type II-A, II-B, II-C, V-A, V-B) .

[0332] The terms "type II CRISPR-Cas protein" , "type II CRISPR-Cas effector protein" , or "Cas9" refer to CRISPR-Cas effector proteins that require trans-activated RNA (tracrRNA) and contain two nuclease structural domains (RuvC and HNH) (each of which is responsible for cleaving a single strand of a double-stranded DNA molecule) . In other embodiments, the CRISPR-Cas protein is a naturally occurring V-type CRISPR-Cas protein or an active variant or fragment thereof.

[0333] As used herein, the terms "V-type CRISPR-Cas protein, " "V-type CRISPR-Cas effector protein, " or "Cas12" refer to CRISPR-Cas effector protein that cuts dsDNA and contains a single RuvC nuclease domain or a split RuvC nuclease domain and lacks the HNH domain. In other embodiments, the CRISPR-Cas protein is a naturally occurring type VI CRISPR-Cas protein or an active variant or fragment thereof. As used herein, the terms "type VI CRISPR-Cas protein, " "type VI CRISPR-Cas effector protein, " or "Cas13" refer to CRISPR-Cas effector proteins that do not require tracrRNA and contain two HEPN domains that cut RNA.

[0334] The term "gRNA" refers to nucleotide sequences that are sufficiently complementary to the target nucleotide sequence to hybridize to the target sequence and direct sequence-specific binding of the associated nuclease to the target nucleotide sequence. For CRISPR-Cas enzyme, the corresponding guide RNA is one or more RNA molecules (typically one or two) that bind the Cas enzyme and direct the Cas enzyme to bind a specific target nucleotide sequence and also cleave the target nucleotide sequence in those cases where the Cas enzyme has a nickase or nuclease activity.

[0335] Definition of groups

[0336] As used herein, the terms "C1-C30 alkyl" or "C1-C20 alkyl" or "C1-C14 alkyl" or "C1-C10 alkyl" or "C1-C6 alkyl" refers to a straight or branched alkyl group having 1-30, or 1-20, or 1-14, or 1-10 or 1-6 carbon atoms, such as methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl, isobutyl, sec-butyl, tert-butyl, or the like.

[0337] As used herein, the terms "C2-C30 alkenyl " or "C2-C20 alkenyl" or "C2-C14 alkenyl" or “C2-C10 alkenyl" or “C2-C6 alkenyl" refer to straight or branched alkenyl having 2-30 or 2-20 or 2-14 or 2-10 or 2-6 carbon atoms, respectively, such as ethenyl, allyl, 1-propenyl, isopropenyl, 1-butenyl, 2-butenyl, or the like.

[0338] As used herein, the terms "C2-C30 alkynyl" or "C2-C20 alkynyl" or "C2-C14 alkynyl" or "C2-C10 alkynyl" or "C2-C6 alkynyl" refer to straight or branched alkynyl  having 2-30 or 2-20 or 2-14 or 2-10 or 2-6 carbon atoms, such as an ethynyl, propinyl, or the like.

[0339] As used herein, the term "halogenated" refers to a group substituted with the same or different one or more of the above halogen atoms, either partially or fully halogenated, such as trifluoromethyl, pentafluoroethyl, heptafluoroisopropyl, or the like.

[0340] As used herein, the term "C1-C10 haloalkyl" or "C1-C6 haloalkyl" refers to a straight or branched alkyl group having 1-10 or 1-6 carbon atoms with hydrogen substituted with one or more halogens, for example, a halogenated methyl, halogenated ethyl, halogenated propyl, halogenated isopropyl, or the like, preferably trifluoromethyl.

[0341] The compounds of the present invention may contain one or more asymmetric centers and thus appear as racemates, racemic mixtures, single enantiomers, diastereoisomeric compounds, and single diastereomers. The asymmetric centers that can exist depend on the nature of the various substituents on the molecule. Each such asymmetric center will independently give rise to two optical isomers, and all possible mixtures of optical isomers and diastereomers and pure or partially pure compounds are included in the scope of the present invention. The present invention includes all isomeric forms of the compounds

[0342] Ionizable Lipids

[0343] As used herein, the terms "ionizable lipid of the present invention" and "ionizable cationic lipid of the present invention" are used interchangeably to refer to a compound of Formula I or a pharmaceutically acceptable salt, stereoisomer, tautomer, solvate, chelate, non-covalent complex, or precursor thereof.

[0344] Ionizable lipids are protonated and converted to cationic lipids at low pH and then to auxiliary phospholipids at normal physiological pH. Auxiliary phospholipids interact less with the anionic cell membrane of blood cells and improve the biocompatibility of lipid nanoparticles. When lipid nanoparticles are endocytosed, the pH in the endosomes is lower, the lipids are protonated and positively charged, and the stability of the membrane structure becomes less stable or even destroyed, which facilitates the escape of lipid nanoparticle endosomes. In general, it is the pH-sensitive properties of lipids that facilitate the in vivo delivery of lipid nanoparticles encapsulating bioactive components (e.g., mRNA molecules) .

[0345] In one aspect of the present invention, it provides an ionizable lipid having a structure as shown in Formula I:

[0346] wherein

[0347] R1 is selected from -OH and Ra (Rb) N-, wherein Ra and Rb are each independently hydrogen, C1-C10 alkyl or C1-C10 haloalkyl;

[0348] R2 is C1-C20 alkyl, C2-C20 alkenyl, C2-C20 alkynyl;

[0349] R3 is C1-C20 alkyl, C2-C20 alkenyl, C2-C20 alkynyl, or Rc- (CH2) n-, wherein n is a positive integer of 1-20, preferably, a positive integer of 1-14, more preferably a positive integer of 1-10;

[0350] Rc is selected from the structure as shown below: wherein represents a connection bond;

[0351] L1, L2, L3, L4, L5 are absent or each independently selected from the group consisting of:

[0352] X is absent or -CH-or N;

[0353] R4 is absent or C1-C20 alkyl, C2-C20 alkenyl, C2-C20 alkynyl;

[0354] R5 is absent or C1-C20 alkyl, C2-C20 alkenyl, C2-C20 alkynyl;

[0355] R6 is C1-C30 alkyl, C2-C30 alkenyl, C2-C30 alkynyl;

[0356] R7 is C1-C14 alkyl, C2-C14 alkenyl, C2-C14 alkynyl;

[0357] R8, R9 are absent or is each independently C1-C14 alkyl, C2-C14 alkenyl, C2-C14 alkynyl or -Rh-C1-C14 alkyl, -Rh-C2-C14 alkenyl, -Rh-C2-C14 alkynyl, wherein Rh is O or S;

[0358] R10, R11 is each independently C1-C14 alkyl, C2-C14 alkenyl, C2-C14 alkynyl, or -Rh-C1-C14 alkyl, -Rh-C2-C14 alkenyl, -Rh-C2-C14 alkynyl, wherein Rh is O or S.

[0359] In a preferred embodiment of the present invention, the ionizable lipids have the substructures shown in the following structures I-1, I-2, I-3, I-4, respectively:

[0360] In Formula I-1, R1-R2, R6-R11, L2-L5 are defined as above;

[0361] R3 is C1-C20 alkyl, C2-C20 alkenyl, C2-C20 alkynyl.

[0362] In Formula I-2, R1-R2, R6-R7, R10-R11, L1-L5 are defined as above;

[0363] R3 is C1-C20 alkyl, C2-C20 alkenyl, C2-C20 alkynyl, or Rc- (CH2) n-, wherein n is a positive integer of 1-20, preferably, a positive integer of 1-14, more preferably a positive integer of 1-10, Rc is defined as above;

[0364] R5 is C1-C20 alkyl, C2-C20 alkenyl, C2-C20 alkynyl;

[0365] R8, R9 is each independently C1-C14 alkyl, C2-C14 alkenyl, C2-C14 alkynyl.

[0366] In Formula I-3, R1-R3, R6, R7, R10, R11, L1-L5 are defined as above;

[0367] R4 is C1-C20 alkyl, C2-C20 alkenyl, C2-C20 alkynyl;

[0368] R5 is C1-C20 alkyl, C2-C20 alkenyl, C2-C20 alkynyl;

[0369] R8, R9 is each independently C1-C14 alkyl, C2-C14 alkenyl, C2-C14 alkynyl or -Rh-C1-C14 alkyl, -Rh-C2-C14 alkenyl, -Rh-C2-C14 alkynyl, wherein Rh is O or S;

[0370] In Formula I-4, R1-R7, R10-R11, L1-L3, L5 are defined as above.

[0371] In a second aspect of the invention, it provides a compound of Formula II or a pharmaceutically acceptable salt, stereoisomer, tautomer, solvate, chelate, non-covalent complex, or precursor thereof, having the following structure:

[0372] wherein

[0373] R1 is selected from -OH and Ra (Rb) N-, wherein Ra and Rb are each independently hydrogen, C1-C6 alkyl or C1-C6 haloalkyl;

[0374] R3 is C1-C15 alkyl, C2-C15 alkenyl, C2-C15 alkynyl, or Rc- (CH2) n-, wherein n is a positive integer of 1-20, preferably, a positive integer of 1-14, more preferably a positive integer of 1-10, more preferably a positive integer of 1-6;

[0375] Rc is selected from the structure as shown below: wherein represents a connection bond;

[0376] L1, L2, L3, L4, L5 are absent or each independently selected from the group consisting of:

[0377] R4 is absent or C1-C20 alkyl, C2-C20 alkenyl, C2-C20 alkynyl;

[0378] R5 is absent or C1-C20 alkyl, C2-C20 alkenyl, C2-C20 alkynyl;

[0379] R8, R9 is each independently C1-C14 alkyl, C2-C14 alkenyl, C2-C14 alkynyl or -Rh-C1-C14 alkyl, -Rh-C2-C14 alkenyl, -Rh-C2-C14 alkynyl, wherein Rh is O or S;

[0380] R10, R11 is each independently C1-C14 alkyl, C2-C14 alkenyl, C2-C14 alkynyl, or -Rh-C1-C14 alkyl, -Rh-C2-C14 alkenyl, -Rh-C2-C14 alkynyl, wherein Rh is O or S;

[0381] r is 2 or 3;

[0382] u is a positive integer of 1-10;

[0383] t is a positive integer of 1-10;

[0384] in addition, when R1 is selected from Ra (Rb) N-, r is 2.

[0385] In a third aspect of the invention, it provides a compound of Formula III or a pharmaceutically acceptable salt, stereoisomer, tautomer, solvate, chelate, non-covalent complex, or precursor thereof, having the following structure:

[0386] wherein

[0387] Ra and Rb are each independently hydrogen, C1-C6 alkyl or C1-C6 haloalkyl;

[0388] Rc is selected from the structure as shown below: wherein represents a connection bond; s is a positive integer of 1-10;

[0389] L1, L2, L3, L4, L5 are absent or each independently selected from the group consisting of:

[0390] R4 is absent or C1-C20 alkyl, C2-C20 alkenyl, C2-C20 alkynyl;

[0391] R5 is absent or C1-C20 alkyl, C2-C20 alkenyl, C2-C20 alkynyl;

[0392] R8, R9 is each independently C1-C14 alkyl, C2-C14 alkenyl, C2-C14 alkynyl or -Rh-C1-C14 alkyl, -Rh-C2-C14 alkenyl, -Rh-C2-C14 alkynyl, wherein Rh is O or S;

[0393] R10, R11 is each independently C1-C14 alkyl, C2-C14 alkenyl, C2-C14 alkynyl, or -Rh-C1-C14 alkyl, -Rh-C2-C14 alkenyl, -Rh-C2-C14 alkynyl, wherein Rh is O or S;

[0394] r is a positive integer of at least 3;

[0395] u is a positive integer of 1-10;

[0396] t is a positive integer of 1-10.

[0397] In a fourth aspect of the invention, it provides a compound of Formula IV or a pharmaceutically acceptable salt, stereoisomer, tautomer, solvate, chelate, non-covalent complex, or precursor thereof, having the following structure:

[0398] wherein

[0399] Ra and Rb are each independently hydrogen, C1-C6 alkyl or C1-C6 haloalkyl;

[0400] R3 is C1-C15 alkyl, C2-C15 alkenyl, C2-C15 alkynyl, or Rc- (CH2) n-, wherein n is a positive integer of 1-20, preferably, a positive integer of 1-14, more preferably a positive integer of 1-10;

[0401] Rc is selected from the structure as shown below: wherein represents a connection bond;

[0402] L1, L2, L3, L4, L5 are absent or each independently selected from the group consisting of:

[0403] R4 is absent or C1-C20 alkyl, C2-C20 alkenyl, C2-C20 alkynyl;

[0404] R5 is absent or C1-C20 alkyl, C2-C20 alkenyl, C2-C20 alkynyl;

[0405] R8, R9 is each independently C1-C14 alkyl, C2-C14 alkenyl, C2-C14 alkynyl or -Rh-C1-C14 alkyl, -Rh-C2-C14 alkenyl, -Rh-C2-C14 alkynyl, wherein Rh is O or S;

[0406] R10, R11 is each independently C1-C14 alkyl, C2-C14 alkenyl, C2-C14 alkynyl, or -Rh-C1-C14 alkyl, -Rh-C2-C14 alkenyl, -Rh-C2-C14 alkynyl, wherein Rh is O or S;

[0407] r is a positive integer of at least 3;

[0408] u is a positive integer of 1-10;

[0409] t is a positive integer of 1-10.

[0410] In a fifth aspect of the invention, it provides a compound of Formula V or a pharmaceutically acceptable salt, stereoisomer, tautomer, solvate, chelate, non-covalent complex, or precursor thereof, having the following structure:

[0411] wherein

[0412] Ra and Rb are each independently hydrogen, C1-C6 alkyl or C1-C6 haloalkyl;

[0413] Rc is selected from the structure as shown below: wherein represents a connection bond;

[0414] L1, L2, L3, L5 are absent or each independently selected from the group consisting of:

[0415] R4 is C1-C20 alkyl, C2-C20 alkenyl, C2-C20 alkynyl;

[0416] R5 is C1-C20 alkyl, C2-C20 alkenyl, C2-C20 alkynyl;

[0417] R6 is C1-C30 alkyl, C2-C30 alkenyl, C2-C30 alkynyl;

[0418] R10, R11 is each independently C1-C14 alkyl, C2-C14 alkenyl, C2-C14 alkynyl, or -Rh-C1-C14 alkyl, -Rh-C2-C14 alkenyl, -Rh-C2-C14 alkynyl, wherein Rh is O or S;

[0419] r is a positive integer of at least 3;

[0420] t is a positive integer of 1-10.

[0421] In a more preferred embodiment of the present invention, the ionizable lipid has a structure selected from those shown in Table 1, wherein, preferably, the following compounds of Table 1 are selected:

[0422] More preferably, The following compounds in Table 1:

[0423] Auxiliary lipids

[0424] As used herein, the term "auxiliary lipids" refers in lipid nanoparticles, other types of lipids besides ionizable lipids, including one or a combination of more than two of anionic lipids, neutral lipids, steroids, and polymer-bound lipids.

[0425] In some embodiments, auxiliary lipids can be used to improve the properties of lipid nanoparticles, such as enhancing nanoparticle stability, membrane fusion (fusogenicity) , and / or mobility and the like.

[0426] In another embodiment, the anionic lipid comprises one or a combination of more than two of phosphatidylserine, phosphatidylinositol, phosphatidic acid, phosphatidylglycerol, dioleoylphosphatidylglycerol (DOPG) , 1, 2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (DOPS) , and dimyristoylphosphatidylglycerol.

[0427] In another embodiment, the neutral lipid comprises at least one of 1, 2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) , 1, 2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC) , 1, 2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC) , 1, 2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) ,

[0428] Dipalmitoylphosphatidylglycerol (DPPG) , 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC) ,

[0429] palmitoyloleoyl phosphatidylethanolamine (POPE) ,

[0430] dipalmitoyl phosphatidylethanolamine (DPPE)

[0431] Dimyristoylphosphoethanolamine (DMPE) , distearoyl-phosphatidyl-ethanolamine (DSPE) , and 1-stearoyl-2-oleoyl phosphatidy ethanolamine (SOPE) or a lipid modified by an anionic or cationic modification group thereof. The anionic or cationic modification groups are not limited.

[0432] In another embodiment, the steroids include one or more of cholesterol, nonsterol, sitosterol, ergosterol, campesterol, stigmasterol, brassinosteroids, tomatidine, ursolic acid, alpha totaxin, coprosterol, and corticosteroids.

[0433] In another embodiment, the polymer-bound lipid comprises one or a combination of two or more of 1- (monomethoxy-polyethyleneglycol) -2, 3-dimyristoylglycerol  (PEG-DMG) , α- (3′ - { [1, 2-di (myristyloxy) propanoxy] carbonylamino} propyl) -ω-methoxy, polyoxyethylene (PEG-c-DMG) , PEG-1, 2-dimyristoxypropyl-3-amine (PEG-c-DMA) , 1.2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N- [amino (polyethylene glycol) ] (PEG-DSPE) , pegylated phosphatidylethanoloamine (PEG-PE) , PEG-modified ceramide, PEG-modified dialkylamine, PEG-modified diacylglycerol, Tween-20, Tween-80, 1, 2-dipalmitoyl-sn-glycerol, methoxypolyethylene glycol (PEG-DPG) , 4-O- (2’ , 3’ -di (tetradecanoyloxy) propyl-1-O- (ω-methoxy (polyethoxy) ethyl) butanedioate (PEG-S-DMG) , PEG-dialkoxypropyl (PEG-DAA) , mPEG2000-1, 2-di-O-alkyl-sn3-carbomoylglyceride (PEG-c-DOMG) and N-acetylgalactosamine ( (R) -2, 3-bis (octadecyloxy) propyl-1- (methoxy polyethylene glycol) 2000) propylcarbamate) ) (GalNAc-PEG-DSG) .

[0434] In another embodiment, in the lipid carrier, the molar ratio of the first lipid compound, the anionic lipid, the neutral lipid, the steroid and the polymer-bound lipid is (20 to 65) : (0 to 20) : (5 to 25) : (25 to 55) : (0.3 to 15) ; exemplarily, the molar ratio may be 20: 20: 5: 50: 5, 30: 5: 25: 30: 10, 20: 5: 5: 55: 15, 65: 0: 9.7: 25: 0.3, etc.; wherein, in the first lipid compound, the compound of Formula I or a pharmaceutically acceptable salt, stereoisomer, tautomer, solvate, chelate, non-covalent complex, or precursor drug thereof and other cationic or ionizable lipids in a molar ratio of (1 to 10): (0 to 10) ; exemplarily, the molar ratio may be 1: 1, 1: 2, 1: 5, 1: 7.5, 1: 10, 2: 1, 5: 1, 7.5: 1, 10: 1, etc.

[0435] In another embodiment, in the lipid carrier, the molar ratio of the first lipid compound, the anionic lipid, the neutral lipid, the steroid and the polymer-bound lipid is (20 to 55) : (0 to 13) : (5 to 25) : (25 to 51.5) : (0.5 to 15) ; wherein, in the first lipid compound, the compound of Formula I or a pharmaceutically acceptable form thereof such as salt, stereoisomer, tautomer, solvate, chelate, non-covalent complex, or precursor drug and other cationic or ionizable lipids in a molar ratio of (3-4) : (0-5) .

[0436] In a preferred embodiment of the present invention, the auxiliary lipid is selected from DSPC, cholesterol, and PEG-DMG.

[0437] In another embodiment, the auxiliary lipid comprises DSPC, cholesterol, and PEG-DMG.

[0438] Lipid Nanoparticles (LNP)

[0439] As used herein, the terms "lipid nanoparticles" , or "LNP" refer to particles with a diameter of about 5 to 500 nm. In some embodiments, the lipid nanoparticles contain one or more active agents (bioactive substances) . In some embodiments, the lipid nanoparticles comprise nucleic acids. In some embodiments, the nucleic acids are condensed in the interior of the nanoparticles with cationic lipids, polymers or multivalent small molecules and an external lipid coating that interacts with the biological environment. Due to the repulsive forces between phosphate groups, nucleic acids are naturally rigid polymers, preferring an elongated conformation. In cells, to cope with volume limitations, DNA can package itself in appropriate solution conditions with the help of ions and other molecules. Typically, DNA condensation is defined as the collapse of an extended DNA strand into a compact and ordered particle containing only one or a few molecules. By binding to phosphate groups, cationic lipids can condense DNA by neutralizing the phosphate charge and allowing it to stack tightly.

[0440] In some embodiments, the bioactive substance is encapsulated into the LNP. In some embodiments, the bioactive substance can be an anionic compound including, but not limited to, DNA (including plasmids) , RNA (mRNA, rRNA, circRNA, siRNA, saRNA, tRNA, snRNA, antagomir, microRNA inhibitor, microRNA activator, or shRNA, etc. ) , natural and synthetic oligonucleotides (including antisense oligonucleotides, interfering RNAs and small interfering RNAs) , nuclear proteins, peptides, nucleic acids, ribozyme, aptamers, immunostimulatory nucleic acids or PNAs, DNA-containing nuclear proteins, such as complete or partially deproteinized viral particles (viral particles) , oligomeric and polymeric anionic compounds other than DNA (e.g., acidic polysaccharides and glycoproteins) ) . In some embodiments, the bioactive substance may be mixed with an adjuvant. In a preferred embodiment, said mRNA comprises sequences encoding RNA-directed DNA binding agents, and more specifically, mRNA encoding a nuclease or base editor.

[0441] In a preferred embodiment, said nucleic acid further comprises a guide RNA, specifically, said guide RNA comprises a gRNA nucleic acid.

[0442] In another embodiment, said nucleic acid comprises an mRNA encoding a nuclease or a base editor; and a gRNA.

[0443] In LNP vaccine products, the bioactive substance is typically contained within the LNP. In some embodiments, the bioactive substance comprises nucleic acids. Typically, water-soluble nucleic acids are condensed with cationic lipids or polycationic polymers inside the particle, and the surface of the particle is enriched with auxiliary phospholipid or PEG lipid derivatives. Additional ionizable cationic lipids may also be located on the surface, and when entering cytolysosome, ionizable cationic lipids are positively charged by ionization through the acidic environment of the lysosome, interacting with the lysosomal membrane and promoting endosomal escape.

[0444] Regarding LNP, ionizable lipids can have different properties or functions. Due to the pKa of the amino group, when the external pH is lower than the pKa of the lipid molecule, it can be protonated and positively charged. Under these conditions, the lipid molecule can electrostatically bind to the phosphate group of the nucleic acid, which allows LNP formation and nucleic acid encapsulation, and the LNP has an essentially neutral surface charge in biological fluids of physiological pH (e.g., blood) . High LNP surface charge is associated with rapid clearance of circulating, hemolytic toxicity, including immune activation, by toxic, fixed and free macrophages (Filion et al. Biochim Biophys Acta. 1997 Oct 23; 1329 (2) : 345-56) .

[0445] In some embodiments, pKa can be sufficiently high such that ionizable cationic lipids can adopt a positively charged form at acidic endosomal pH. In this way, cationic lipids can bind to endogenous endosomal anionic lipids to promote membrane cleavage of non-bilayer structures, such as hexagonal HII phases, to produce more efficient intracellular delivery. In some embodiments, pKa ranges from 6.2 to 6.5. For example, pKa may be about 6.2, about 6.3, about 6.4, about 6.5. Unsaturated tails also contribute to the ability of lipids to adopt non-bilayer structures. (Jayaraman et al. Angew Chem Int Ed Engl. 2012 Aug 20; 51 (34) : 8529-33) .

[0446] The release of nucleic acids from LNP formulations, as well as other characteristics such as liposome clearance and circulating half-life, can be altered by the presence of polyethylene glycols and / or sterols (e.g., cholesterol) or other potential additives in the LNP, as well as the overall chemical structure, including  the pKa of any ionizable cationic lipids that are part of the formulation.

[0447] In one aspect of the present invention, a lipid nanoparticle (LNP) is provided, said lipid nanoparticle comprising a compound of Formula I o or a pharmaceutically acceptable salt, stereoisomer, tautomer, solvate, chelate, non-covalent complex, or precursor thereof as described in a first aspect of the present invention. Further, said lipid nanoparticles further comprise one or more auxiliary lipids, said auxiliary lipids comprising one or a combination of more than two of anionic lipids, neutral lipids, steroids, and polymer-bound lipids.

[0448] Pharmaceutical formulation

[0449] In a further aspect of the present invention, it provides a pharmaceutical formulation (or lipid nanoparticle composition, or LNP composition) , said pharmaceutical formulation comprising a lipid carrier as described in a third aspect of the present invention, and a bioactive substance encapsulated in said lipid carrier, and a pharmaceutically acceptable carrier. Said pharmaceutical formulation is used to deliver a bioactive substance to cells in a subject in need thereof.

[0450] In some embodiments, the bioactive substance is encapsulated into an LNP. In some embodiments, the bioactive substance may be an anionic compound including, but not limited to, DNA (including plasmids) , RNA (mRNA, rRNA, circRNA, siRNA, saRNA, tRNA, snRNA, antagomir, microRNA inhibitor, microRNA activator, or shRNA, etc. ) , natural and synthetic oligonucleotides (including antisense oligonucleotides, interfering RNAs and small interfering RNAs) , nuclear proteins, peptides, nucleic acids, ribozyme, aptamers, immunostimulatory nucleic acids or PNAs, DNA-containing nuclear proteins, such as complete or partially deproteinized viral particles (viral particles) , oligomeric and polymeric anionic compounds other than DNA (e.g., acidic polysaccharides and glycoproteins) . In some embodiments, the bioactive substance may be mixed with an adjuvant. In some embodiments, the LNP composition comprises: a nucleic acid, an ionizable lipid having the structure shown in Formula I or Formula II or Formula IIII or Formula IV or Formula V, optionally an auxiliary phospholipid (e.g., Distearoyl Phosphatidylcholine) . In some embodiments, the LNP composition comprises: a nucleic acid; an ionizable lipid having the structure shown in Formula I in an amount of 30-65% (molar ratio) of the total lipid of the composition; and optionally an auxiliary phospholipid (e.g., Distearoyl Phosphatidylcholine) in an amount of 1-10%of the total lipid of the composition.

[0451] In addition, in another embodiment, in the LNP composition, the molar ratio of the first lipid compound (ionizable lipids of the structure shown in Formula (I) and optionally other cationic or ionizable lipids) , the anionic lipid, the neutral lipid, the steroid and the polymer-bound lipid is (20 to 65) : (0 to 20) : (5 to 25) : (25 to 55) : (0.3 to 15) ; exemplarily, the molar ratio may be 20: 20: 5: 50: 5, 30: 5: 25: 30: 10, 20:5: 5: 55: 15, 65: 0: 9.7: 25: 0.3, etc.

[0452] In another embodiment, in the first lipid compound, the compound of Formula I or Formula II or Formula IIII or Formula IV or Formula V or a pharmaceutically acceptable salt, stereoisomer, tautomer, solvate, chelate, non-covalent complex, or precursor drug thereof and other cationic or ionizable lipids in a molar ratio of (1 to 10): (0 to 10) ; exemplarily, the molar ratio may be 1: 1, 1: 2, 1: 5, 1: 7.5, 1: 10, 2: 1, 5: 1, 7.5: 1, 10: 1, etc.

[0453] In another embodiment, in the lipid carrier, the molar ratio of the first lipid compound, the anionic lipid, the neutral lipid, the steroid and the polymer-bound lipid is (20 to 55) : (0 to 13) : (5 to 25) : (25 to 51.5) : (0.5 to 15) ; wherein, in the first lipid compound, any of the above compounds or a pharmaceutically acceptable form thereof such as salt, stereoisomer, tautomer, solvate, chelate, non-covalent complex, or precursor drug and other cationic or ionizable lipids in a molar ratio of (3-4) : (0-5) .

[0454] As used herein, the terms "encapsulating" and "encapsulated" mean that the mRNA, DNA, siRNA or other nucleic acid drug is inside the lipid nanoparticle or bound to the lipid nanoparticle. As used herein, the term "encapsulated" refers to fully or partially encapsulated. For example, mRNA may be selected to treat and / or prevent a disease of interest when administering a lipid nanoparticle composition comprising mRNA to a subject in need thereof.

[0455] As used herein, the term "pharmaceutically acceptable carrier" includes, but is not limited to, any adjuvant, carrier, excipient, scintillant, sweetener, diluent, preservative, dye / colorant, flavor enhancer, surfactant, wetting agent, dispersant, suspending agent, stabilizer, isotonic agent, solvent, or emulsifiers approved by the Food and Drug Administration for use in humans or domestic animals.

[0456] The present invention also provides a method for in vivo delivery of nucleic acid drugs, comprising administering to a subject in need thereof said lipid nanoparticle composition or said pharmaceutical formulation.

[0457] In some embodiments, said lipid nanoparticle composition or said pharmaceutical formulation is administered by one of the following routes of administration: orally, intranasally, intravenously, intraperitoneally, intramuscularly, intra-articularly, intralesionally, intratracheally, subcutaneously, and intradermally. In some embodiments, the above lipid nanoparticle compositions or the above pharmaceutical formulations are administered, for example, via an enteral or parenteral route of administration. In some embodiments, said lipid nanoparticle composition or pharmaceutical formulation is administered to said subject at a dose of about 0.001 mg / kg to about 10 mg / kg.

[0458] Method of preparation of a pharmaceutical formulation

[0459] In another aspect of the present invention, it provides a method of preparing a pharmaceutical formulation, comprising: (a) mixing a compound of Formula I or Formula II or Formula IIII or Formula IV or Formula V as described in a first aspect of the present invention and optionally an auxiliary lipid with an organic solvent, thereby obtaining a lipid organic phase; (b) mixing a bioactive substance with an aqueous solvent, thereby obtaining an aqueous phase containing the bioactive substance; (c) mixing the lipid organic phase in step (a) with the aqueous phase in step (b) , thereby obtaining said lipid nanoparticle composition. Further, said method further comprises step (d) : purifying and concentrating and filtering the lipid nanoparticle drug obtained in step (c) to remove bacteria.

[0460] In some embodiments, the organic solvent comprises (but is not limited to) ethanol, methanol, isopropanol, acetonitrile, dimethylformamide, dimethyl sulfoxide, dioxane, or tetrahydrofuran, or combinations thereof. In some embodiments, the lipid organic phase comprises a small percentage of water or pH buffer. The lipid organic phase may comprise up to 60 vol%water, such as up to about 0.05%, 0.1%, 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, or  60%by volume. In one embodiment, the lipid organic phase comprises between about 0.05%and 60%water by volume, for example, between about 0.05%and 50%, between about 0.05%and 40%, or between about 5%and 20%water by volume.

[0461] In some embodiments, the aqueous solvent is water. In some embodiments, the aqueous solvent is an aqueous buffer having a pH between 3 and 8 (e.g., a pH of about 3, about 4, about 5, or about 6, etc. ) . A bioactive substance such as a nucleic acid (e.g., mRNA) is dissolved in said aqueous solvent to obtain an aqueous phase containing the bioactive substance. Said aqueous phase may comprise a small percentage of an aqueous miscible organic solvent. Said aqueous phase may comprise up to 60 volume %of at least one organic solvent miscible with water, such as up to about 0.05%, 0.1%, 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%or any volume in between %of an organic solvent (e.g., an aqueous miscible organic solvent) . In one embodiment, said aqueous phase comprises between about 0.05%and 60%by volume of an organic solvent, e.g., between about 0.05%and 50%by volume, between about 0.05%and 40%by volume, or between about 5%and 20%by volume of an organic solution (e.g., an aqueous miscible organic solvent) . The aqueous phase buffer may be a citrate buffer, a Tris-Hcl buffer solution, a sodium acetate buffer solution, a PBS buffer solution, or a combination thereof, etc. In some embodiments, the aqueous buffer is a citrate buffer with a pH between 4 and 6 (e.g., a pH of about 4, about 5, or about 6) . In one embodiment, the aqueous buffer solution is a citrate buffer with a pH of about 4.

[0462] In some embodiments, a solution comprising a mixture of a lipid organic phase and an aqueous phase containing a bioactive substance can be diluted, the mixture comprising an LNP suspension. In some embodiments, the pH of the solution of the mixture of the lipid organic phase comprising the LNP suspension and the aqueous phase containing the bioactive substance can be adjusted. the pH of the LNP suspension can be diluted or adjusted by adding water, an acid, a base, or an aqueous buffer. in some embodiments, no dilution or adjustment of the pH of the LNP suspension is performed. In some embodiments, dilution and adjustment of the pH of the LNP suspension is performed.

[0463] In some embodiments, excess reagents, solvents, unencapsulated nucleic acids may be removed from the LNP suspension by tangential flow filtration (TFF) (e.g., permeation filtration) . Organic solvents (e.g., ethanol) and buffers can also be removed from the LNP suspension by TFF. In some embodiments, the LNP suspension is dialyzed. In some embodiments, the LNP suspension is subjected to TFF. in some embodiments, the LNP suspension is subjected to dialysis and TFF.

[0464] The main advantages of the present invention include:

[0465] (1) The present invention provides a series of structurally novel compounds of Formula I, which can be used as ionizable lipids to prepare lipid carriers with other lipid compounds with controllable particle size and uniform distribution and high encapsulation efficiency.

[0466] (2) The lipid compounds of the present invention are synthesized in a simple method with high yield, and can be synthesized rapidly and at low cost. The compounds of the present invention can be used to deliver nucleic acid drugs, gene vaccines, small molecule drugs, polypeptide or protein drugs, enriching the variety  of ionizable lipid compounds, which is especially important for the development and application of nucleic acid prophylactic and therapeutic agents.

[0467] The present invention is further described below in connection with specific embodiments. It should be understood that these embodiments are intended to illustrate the invention only and are not intended to limit the scope of the invention. Experimental methods for which specific conditions are not indicated in the following embodiments are generally in accordance with conventional conditions, or in accordance with the conditions recommended by the manufacturer. Percentages and parts are percentages by weight and parts by weight unless otherwise noted.

[0468] Reagents and materials used in embodiments of the present invention are commercially available products unless otherwise noted.

[0469] The experimental methods described in the following embodiments are conventional methods, if not specified, and the reagents and materials described are commercially available, if not specified.

[0470] In the present invention, "moderate amount" means that the amount of solvent or drug added is adjustable in a wide range and has a small effect on the synthesis results, so that no specific limitation can be made.

[0471] In the following examples, the solvents and drugs used are analytically or chemically pure; the solvents are redistilled before use; the anhydrous solvents are treated according to standard methods or literature methods.

[0472] Where specific conditions were not indicated in the embodiments, conventional conditions or those recommended by the manufacturer were followed. The reagents or instruments used, where the manufacturer is not specified, are conventional products available commercially. It is known to those skilled in the art that the embodiments describe the invention by way of example and are not intended to limit the scope of the protection claimed by the invention. The technical features involved in the various embodiments of the invention can be combined with each other as long as they do not constitute a conflict between them. All disclosures and other references mentioned herein are incorporated herein by reference in their entirety.

[0473] EXAMPLE 1: Synthesis of compound 1

[0474] ( (2- ( ( (3-hydroxypropyl) (propyl) amino) methyl) propane-1, 3-diyl) bis (oxy) ) bis (5-oxopentane-5, 1-diyl) bis (2-butyloctanoate)

[0475] Intermediate 1-2: benzyl 5-hydroxypentanoate

[0476] The solution of tetrahydro-2H-pyran-2-one (25.00 g, 249.70 mmol, 1.0 eq) and NaOH (10.99 g, 274.67 mmol, 1.1 eq) in H2O (20 mL) and ethanol (200 mL) was stirred at 70 ℃ for 3 hours and concentrated under reduced pressure. Then acetone (200 mL) , TBAI (4.61 g, 12.48 mmol, 0.05 eq) , BnBr (51.25 g, 299.64 mmol, 1.2 eq) was added, the resulting solution was stirred at 70 ℃ for 16 hours and diluted with H2O (500 mL) , then extracted with EtOAc (250 mL x 2) , the organic layers were combined and dried over anhydrous Na2SO4, then concentrated under reduced pressure, the residue was purified by silica column (PE / EtOAc = 10 / 1 to 2 / 1) , the desired product was obtained as a colorless oil (37.00 g, 71.2%yield) .

[0477] Intermediate 1-4: 5- (benzyloxy) -5-oxopentyl 2-butyloctanoate

[0478] A solution of benzyl 5-hydroxypentanoate (37.00 g, 177.67 mmol, 1.0 eq) , 2-butyloctanoic acid (35.59 g, 177.67 mmol, 1.0 eq) , DMAP (21.70 g, 177.67 mmol, 1.0 eq) and EDCI (51.09 g, 266.50 mmol, 1.5 eq) in DCM (250 mL) was stirred at 25 ℃ for 4 hours. The reaction solution was diluted with H2O (500 mL) and extracted with DCM (200 mL x 2) , the organic layers were combined and dried over anhydrous Na2SO4, then concentrated under reduced pressure, the residue was purified by silica column (PE / EtOAc = 20 / 1 to 4 / 1) , the desired product was obtained as a colorless oil (64.00 g, 92.2%yield) .

[0479] Intermediate 1-5: 5- ( (2-butyloctanoyl) oxy) pentanoic acid

[0480] The solution of 5- (benzyloxy) -5-oxopentyl 2-butyloctanoate (64.00 g, 163.87 mmol, 1.0 eq) and Pd / C (3.49 g, 32.78 mmol, 0.2 eq, 10%purity) in MeOH (75 mL) and THF (75 mL) was stirred at 25 ℃ for 16 hours with a H2 balloon. The reaction solution was filtered and concentrated under reduced pressure, the desired product was obtained as a colorless oil (45.00 g, 91.4%yield) which can be used for the next step without further purification.

[0481] Intermediate 1-7: ( (2- (hydroxymethyl) propane-1, 3-diyl) bis (oxy) ) bis (5-oxopentane-5, 1-diyl) bis (2-butyloctanoate)

[0482] A solution of 5- ( (2-butyloctanoyl) oxy) pentanoic acid (10.00 g, 33.29 mmol, 1.0 eq) , 2- (hydroxymethyl) propane-1, 3-diol (3.53 g, 33.29 mmol, 1.0 eq) , DMAP (0.81 g, 6.66 mmol, 0.2 eq) , EDCI (9.57 g, 49.94 mmol, 1.5 eq) and (8.60 g, 66.58 mmol, 2.0 eq) in DCM (100 mL) was stirred at 25 ℃ for 4 hours. The reaction solution was diluted with H2O (100 mL) and extracted with DCM (100 mL x 2) , the organic layers were combined and dried over anhydrous Na2SO4, then concentrated under reduced  pressure, the residue was purified by silica column (PE / EtOAc = 20 / 1 to 3 / 1) , the desired product was obtained as a colorless oil (7.80 g, 69.9%yield) .

[0483] Intermediate 1-8: ( (2- ( ( (methylsulfonyl) oxy) methyl) propane-1, 3-diyl) bis (oxy) ) bis (5-oxopentane-5, 1-diyl) bis (2-butyloctanoate)

[0484] A solution of ( (2- (hydroxymethyl) propane-1, 3-diyl) bis (oxy) ) bis (5-oxopentane-5, 1-diyl) bis (2-butyloctanoate) (3.90 g, 5.81 mmol, 1.0 eq) , TEA (1.76 g, 17.43 mmol, 3.0 eq) in DCM (30 mL) was cooled in an ice bath, Ms2O (2.02 g, 11.62 mmol, 2.0 eq) was added dropwise. Then reaction solution was warmed and kept at 25 ℃ for 4 hours. The solution was diluted with H2O (30 mL) and extracted with DCM (50 mL x 2) , the organic layers were combined and dried over anhydrous Na2SO4, then concentrated under reduced pressure, the residue was purified by silica column (PE / EtOAc = 50 / 1 to 5 / 1) , the desired product was obtained as a colorless oil (3.85 g, 88.4%yield) .

[0485] Compound 1: ( (2- ( ( (3-hydroxypropyl) (propyl) amino) methyl) propane-1, 3-diyl) bis (oxy) ) bis (5-oxopentane-5, 1-diyl) bis (2-butyloctanoate)

[0486] A solution of ( (2- ( ( (methylsulfonyl) oxy) methyl) propane-1, 3-diyl) bis (oxy) ) bis (5-oxopentane-5, 1-diyl) bis (2-butyloctanoate) (410.0 mg, 0.55 mmol, 1.0 eq) , 3-(propylamino) propan-1-ol (65.0 mg, 0.55 mmol, 1.0 eq) , K2CO3 (190.0 mg, 1.38 mmol, 2.5 eq) and KI (91.0 mg, 0.55 mmol, 1.0 eq) in CH3CN (5 mL) was stirred at 90 ℃ for 16 hours. The reaction solution was diluted with H2O (10 mL) and extracted with EtOAc (10 mL x 2) , the organic layers were combined and dried over anhydrous Na2SO4, then concentrated under reduced pressure, the residue was purified by silica column (DCM / MeOH = 50 / 1 to 20 / 1) , the desired product was obtained as a colorless oil (154.8 mg, 36.2%yield) . MS: m / z [M+H] + = 770.6. 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 4.18 (dd, J = 11.1, 4.9 Hz, 2H) , 4.09 (dd, J = 11.6, 5.7 Hz, 6H) , 3.78 (t, J = 5.4 Hz, 2H) , 2.62 (s, 2H) , 2.45-2.27 (m, 10H) , 1.75-1.66 (m, 10H) , 1.64-1.54 (m, 5H) , 1.49 (dd, J = 14.8, 6.9 Hz, 7H) , 1.33-1.20 (m, 25H) , 0.94-0.83 (m, 15H) .

[0487] EXAMPLE 2: Synthesis of compound 2

[0488] ( (2- ( (ethyl (3-hydroxypropyl) amino) methyl) propane-1, 3-diyl) bis (oxy) ) bis (5-oxopentane-5, 1-diyl) bis (2-butyloctanoate)

[0489] Compound 2 was prepared according to the procedure of compound 1 from 3- (ethylamino) propan-1-ol.

[0490] 40.8%yield. MS: m / z [M+H] + = 756.6. 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 4.18 (dd, J = 11.2, 5.0 Hz, 2H) , 4.10 (dd, J = 10.3, 5.7 Hz, 6H) , 3.78 (t, J = 5.3 Hz, 2H) , 2.69 (s, 3H) , 2.49 (s, 2H) , 2.43-2.27 (m, 7H) , 1.71 (dd, J = 9.0, 5.9 Hz, 9H) , 1.64-1.55 (m, 4H) , 1.51-1.39 (m, 5H) , 1.34-1.21 (m, 25H) , 1.08 (t, J = 6.6 Hz, 4H) , 0.93-0.83 (m, 12H) .

[0491] EXAMPLE 3: Synthesis of compound 3

[0492] ( (2- ( ( (3-hydroxypropyl) (methyl) amino) methyl) propane-1, 3- diyl) bis (oxy) ) bis (5-oxopentane-5, 1-diyl) bis (2-butyloctanoate)

[0493] Compound 3 was prepared according to the procedure of compound 1 from 3- (methylamino) propan-1-ol.

[0494] 46.9%yield. MS: m / z [M+H] + = 742.6. 1HNMR (400 MHz-CDCl3) δ 4.17 (dd, J = 11.2, 4.8 Hz, 2H) , 4.08 (dd, J = 11.4, 5.7 Hz, 6H) , 3.78 (t, J = 5.3 Hz, 2H) , 2.57 (t, J = 5.8 Hz, 2H) , 2.44-2.22 (m, 11H) , 1.81-1.64 (m, 10H) , 1.63-1.52 (m, 5H) , 1.45 (dd, J = 7.4, 5.1 Hz, 5H) , 1.30 (dd, J = 18.8, 12.5 Hz, 24H) , 0.99-0.74 (m, 12H) .

[0495] EXAMPLE 4: Synthesis of compound 4

[0496] ( (2- ( (ethyl (2-hydroxyethyl) amino) methyl) propane-1, 3-diyl) bis (oxy) ) bis (5-oxopentane-5, 1-diyl) bis (2-butyloctanoate)

[0497] Compound 4 was prepared according to the procedure of compound 1 from 2- (ethylamino) ethan-1-ol.

[0498] 40.2%yield. MS: m / z [M+H] + = 742.6. 1HNMR (400 MHz-CDCl3) δ 4.13 (d, J = 31.4 Hz, 8H) , 3.55 (s, 2H) , 2.60 (s, 5H) , 2.34 (dd, J = 56.7, 37.9 Hz, 9H) , 1.64 (d, J = 41.8 Hz, 12H) , 1.45 (s, 5H) , 1.26 (s, 23H) , 1.03 (s, 4H) , 0.88 (s, 11H) .

[0499] EXAMPLE 5: Synthesis of compound 5

[0500] ( (2- ( ( (9- ( (2-butyloctanoyl) oxy) nonyl) (3-hydroxypropyl) amino) methyl) propane-1, 3-diyl) bis (oxy) ) bis (5-oxopentane-5, 1-diyl) bis (2-butyloctanoate)

[0501] Intermediate 5-2: ( (2- ( ( (3-hydroxypropyl) amino) methyl) propane-1, 3-diyl) bis (oxy) ) bis (5-oxopentane-5, 1-diyl) bis (2-butyloctanoate)

[0502] A solution of 1-8 (600.0 mg, 0.80 mmol, 1.0 eq) , 3-aminopropan-1-ol (300.0 mg, 3.99 mmol, 5.0 eq) , K2CO3 (280.0 mg, 2.00 mmol, 2.5 eq) , KI (130.0 mg, 0.80 mmol, 1.0 eq) in CH3CN (10 mL) was stirred at 90 ℃ for 16 hours. The reaction solution was diluted with H2O (10 mL) and extracted with EtOAc (10 mL x 2) , the organic layers were combined and dried over anhydrous Na2SO4, then concentrated under reduced pressure, the residue was purified by silica column (DCM / MeOH = 40 / 1 to 20 / 1) , the desired product was obtained as a colorless oil (210.0 mg, 36.1%yield) . MS: m / z [M+H] + = 728.6.

[0503] Compound 5: ( (2- ( ( (9- ( (2-butyloctanoyl) oxy) nonyl) (3-hydroxypropyl) amino) methyl) propane-1, 3-diyl) bis (oxy) ) bis (5-oxopentane-5, 1-diyl) bis (2-butyloctanoate)

[0504] The solution of 5-2 (210.0 mg, 0.29 mmol, 1.0 eq) , 9-bromononyl 2-butyloctanoate (130.0 mg, 0.32 mmol, 1.1 eq) , K2CO3 (120.0 mg, 0.87 mmol, 3.0 eq) , KI (48.0 mg, 0.29 mmol, 1.0 eq) in CH3CN (5 mL) was stirred at 90 ℃ for 16 hours. The reaction solution was diluted with H2O (10 mL) and extracted with EtOAc (10 mL x 2) , the organic layers were combined and dried over anhydrous Na2SO4, then concentrated under reduced pressure, the residue was purified by silica column (DCM / MeOH = 50 / 1 to 15 / 1) , the desired product was obtained as a colorless oil (72.0 mg, 23.7%) . MS: m / z [M+H] + = 1052.9. 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 4.20-4.16 (m, 2H) , 4.15-4.01 (m, 8H) , 3.83-3.66 (m, 2H) , 2.68-2.59 (m, 4H) , 2.47-2.30 (m, 12H) , 1.76-1.53 (m, 28H) , 1.49-1.22 (m, 42H) , 0.94-0.83 (m, 18H) .

[0505] EXAMPLE 6: Synthesis of compound 6

[0506] ( (2- ( (5- ( (2-butyloctanoyl) oxy) -N- (3- (diethylamino) propyl) pentanamido) methyl) propane-1, 3-diyl) bis (oxy) ) bis (5-oxopentane-5, 1-diyl) bis (2-butyloctanoate)

[0507] Intermediate 6-3: 5-chloro-5-oxopentyl 2-butyloctanoate

[0508] To a solution of 1-5 (2.00 g, 6.66 mmol, 1.0 eq) and DMF (49.0 mg, 0.67 mmol, 0.1 eq) in DCM (20 mL) was slowly added oxalyl chloride (2.54 g, 19.98 mmol, 3.0 eq) . The reaction solution was stirred at 0 ℃ for 3 hours under N2, then concentrated under reduced pressure, the desired product was obtained as a colorless oil (2.00 g, 94.2%yield) which can be used for the next step without further purification.

[0509] Intermediate 6-2: ( (2- ( ( (3- (diethylamino) propyl) amino) methyl) propane-1, 3-diyl) bis (oxy) ) bis (5-oxopentane-5, 1-diyl) bis (2-butyloctanoate)

[0510] A solution of 1-9 (1.00 g, 1.34 mmol, 1.0 eq) , N, N-diethylpropane-1, 3-diamine (870.0 mg, 6.70 mmol, 5.0 eq) , K2CO3 (560.0 mg, 4.02 mmol, 3.0 eq) , KI (220.0 mg, 1.34 mmol, 1.0 eq) in CH3CN (20 mL) was stirred at 90 ℃ for 16 hours. The reaction solution was diluted with EtOAc (20 mL x 2) , the organic layers were combined and  dried over anhydrous Na2SO4, then concentrated under reduced pressure, the residue was purified by silica column (DCM / MeOH = 50 / 1 to 10 / 1) , the desired product was obtained as a colorless oil (700.0 mg, 66.9%yield) . MS: m / z [M+H] + = 783.6.

[0511] Compound 6: ( (2- ( (5- ( (2-butyloctanoyl) oxy) -N- (3- (diethylamino) propyl) pentanamido) methyl) propane-1, 3-diyl) bis (oxy) ) bis (5-oxopentane-5, 1-diyl) bis (2-butyloctanoate)

[0512] To a solution of 6-2 (500.0 mg, 0.64 mmol, 1.0 eq) and TEA (190.0 mg, 1.92 mmol, 3.0 eq) in DCM (2 mL) was added a solution of 5-chloro-5-oxopentyl 2-butyloctanoate (310.0 mg, 0.96 mmol, 1.5 eq) in DCM (1 mL) , the resulting solution was stirred at 25 ℃ for 3 hours. The reaction solution was diluted with H2O (10 mL) and extracted with DCM (10 mL x 2) , the organic layers were combined and dried over anhydrous Na2SO4, then concentrated under reduced pressure, the residue was purified by silica column (DCM / MeOH = 40 / 1 to 15 / 1) , the desired product was obtained as a colorless oil (410.0 mg, 60.3%yield) . MS: m / z [M+H] + = 1065.9. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 4.28-3.95 (m, 11H) , 3.46-3.26 (m, 5H) , 2.87-2.64 (m, 3H) , 2.57 (dd, J = 14.2, 7.0 Hz, 3H) , 2.50-2.25 (m, 12H) , 1.80-1.52 (m, 22H) , 1.44 (dd, J = 24.0, 18.7 Hz, 8H) , 1.33-1.20 (m, 34H) , 1.04 (t, J = 7.1 Hz, 4H) , 0.88 (dt, J = 7.3, 3.6 Hz, 16H) .

[0513] EXAMPLE 7: Synthesis of compound 7

[0514] ( (2- ( (5- ( (2-butyloctanoyl) oxy) -N- (4- (diethylamino) butyl) pentanamido) methyl) propane-1, 3-diyl) bis (oxy) ) bis (5-oxopentane-5, 1-diyl) bis (2-butyloctanoate)

[0515] Compound 7 was prepared according to the procedure of compound 6 from N1, N1-diethylbutane-1, 4-diamine.

[0516] 51.7%yield. MS: m / z [M+H] + = 1079.9. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 4.25-3.95 (m, 10H) , 3.44-3.23 (m, 4H) , 3.01-2.68 (m, 6H) , 2.32 (ddd, J = 22.7, 13.3, 6.0 Hz, 10H) , 1.61 (ddd, J = 21.7, 19.1, 4.9 Hz, 22H) , 1.51-1.37 (m, 8H) , 1.21 (dt, J = 14.4, 9.0 Hz, 40H) , 1.00 -0.74 (m, 18H) .

[0517] EXAMPLE 8: Synthesis of compound 8

[0518] ( (2- ( (5- ( (2-butyloctanoyl) oxy) -N- (3- (dimethylamino) propyl) pentanamido) methyl) propane-1, 3-diyl) bis (oxy) ) bis (5-oxopentane-5, 1-diyl) bis (2-butyloctanoate)

[0519] Compound 8 was prepared according to the procedure of compound 6 from N1, N1-dimethylpropane-1, 3-diamine.

[0520] 51.2%yield. MS: m / z [M+H] + = 1037.8. 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 4.07 (d, J = 12.5 Hz, 10H) , 3.4-3.26 (m, 4H) , 2.55-2.16 (m, 17H) , 1.85-1.52 (m, 20H) , 1.43 (d, J = 12.4 Hz, 7H) , 1.27 (d, J = 12.5 Hz, 36H) , 0.88 (t, J = 6.6 Hz, 18H) .

[0521] EXAMPLE 9: Synthesis of compound 9

[0522] ( (2- ( (5- ( (2-butyloctanoyl) oxy) -N- (2- (diethylamino) ethyl) pentanamido) methyl) propane-1, 3-diyl) bis (oxy) ) bis (5-oxopentane-5, 1-diyl) bis (2-butyloctanoate)

[0523] Compound 9 was prepared according to the procedure of compound 6 from N1, N1-diethylethane-1, 2-diamine.

[0524] 46.7%yield. MS: m / z [M+H] + = 1051.8. 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 4.39-3.87 (m, 10H) , 3.54-3.24 (m, 4H) , 2.54 (d, J = 6.9 Hz, 4H) , 2.46-2.26 (m, 8H) , 1.76-1.53 (m, 16H) , 1.45 (s, 8H) , 1.26 (s, 38H) , 1.03 (t, J = 7.0 Hz, 6H) , 0.88 (t, J = 6.4 Hz, 20H) .

[0525] EXAMPLE 10: Synthesis of compound 10

[0526] ( (2- ( ( (9- ( (2-butyloctanoyl) oxy) nonyl) (3- (diethylamino) propyl) amino) methyl) propane-1, 3-diyl) bis (oxy) ) bis (5-oxopentane-5, 1-diyl) bis (2-butyloctanoate)

[0527] A solution of 6-2 (500.0 mg, 0.64 mmol, 1.0 eq) , 5-3 (390.0 mg, 0.96 mmol, 1.5 eq) , K2CO3 (270.0 mg, 1.92 mmol, 3.0 eq) and KI (110.0 mg, 0.64 mmol, 1.0 eq) in CH3CN (10 mL) was stirred at 90 ℃ for 16 hours. The reaction solution was diluted  with H2O (20 mL) and extracted with EtOAc (20 mL x 2) , the organic layers were combined and dried over anhydrous Na2SO4, then concentrated under reduced pressure, the residue was purified by silica column (DCM / MeOH = 50 / 1 to 20 / 1) , the desired product was obtained as a colorless oil (132.8 mg, 18.8%yield) . MS: m / z [M+H] + = 1107.9. 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 4.15-4.01 (m, 10 H) , 3.44-3.20 (m, 4H) , 2.71-2.50 (m, 6H) , 2.39-2.23 (m, 12H) , 2.02-1.40 (m, 28H) , 1.38-1.22 (m, 48H) , 0.92-0.75 (m, 18 H) .

[0528] EXAMPLE 11: Synthesis of compound 11

[0529] ( (2- ( (7- ( (2-butyloctanoyl) oxy) -N- (3- (diethylamino) propyl) heptanamido) methyl) propane-1, 3-diyl) bis (oxy) ) bis (5-oxopentane-5, 1-diyl) bis (2-butyloctanoate)

[0530] Compound 11 was prepared according to the procedure of compound 6 from 7-chloro-7-oxoheptyl 2-butyloctanoate which was prepared according to the procedure of 6-3.

[0531] 31.4%yield. MS: m / z [M+H] + = 1093.9. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 4.16-4.02 (m, 10H) , 3.56-3.14 (m, 2H) , 2.53 (q, J = 7.1 Hz, 3H) , 2.42-2.31 (m, 10H) , 2.03 (d, J = 48.7 Hz, 1H) , 1.70 (d, J = 6.5 Hz, 9H) , 1.66-1.57 (m, 9H) , 1.46 (dd, J = 13.0, 5.3 Hz, 6H) , 1.40-1.36 (m, 4H) , 1.33-1.23 (m, 40H) , 1.03 (t, J = 7.2 Hz, 6H) , 0.96-0.83 (m, 20H) .

[0532] EXAMPLE 12: Synthesis of compound 12

[0533] ( (2- ( (9- ( (2-butyloctanoyl) oxy) -N- (3- (diethylamino) propyl) nonanamido) methyl) propane-1, 3-diyl) bis (oxy) ) bis (5-oxopentane-5, 1-diyl) bis (2-butyloctanoate)

[0534] Compound 12 was prepared according to the procedure of compound 6 from 9-chloro-9-oxononyl 2-butyloctanoate which was prepared according to the procedure of 6-3.

[0535] 41.2%yield. MS: m / z [M+H] + = 1121.9. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 4.15-4.04 (m, 10H) , 3.61-3.18 (m, 2H) , 2.53 (q, J = 7.1 Hz, 4H) , 2.43-2.31 (m, 10H) , 1.90 (s, 1H) , 1.70 (d, J = 4.2 Hz, 10H) , 1.61 (dd, J = 14.0, 7.5 Hz, 9H) , 1.50-1.42 (m, 6H) , 1.35-1.24 (m, 47H) , 1.03 (t, J = 7.1 Hz, 6H) , 0.92-0.88 (m, 19H) .

[0536] EXAMPLE 13: Synthesis of compound 13

[0537] ( (2- ( ( (5- ( (2-butyloctanoyl) oxy) pentyl) (3- (diethylamino) propyl) amino) methyl) propane-1, 3-diyl) bis (oxy) ) bis (5-oxopentane-5, 1-diyl) bis (2-butyloctanoate)

[0538] Compound 13 was prepared according to the procedure of compound 10 from 5-bromopentyl 2-butyloctanoate.

[0539] 44.4%yield. MS: m / z [M+H] + = 1051.9. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 4.22-3.99 (m, 10H) , 2.81-2.50 (m, 7H) , 2.47-2.26 (m, 13H) , 2.23-2.07 (m, 2H) , 1.78-1.52 (m, 18H) , 1.46 (dd, J = 14.6, 6.9 Hz, 8H) , 1.38-1.19 (m, 37H) , 1.11 (t, J = 6.8 Hz, 6H) , 0.89 (dd, J = 9.4, 4.4 Hz, 17H) .

[0540] EXAMPLE 14: Synthesis of compound 14

[0541] ( (2- ( ( (7- ( (2-butyloctanoyl) oxy) heptyl) (3- (diethylamino) propyl) amino) methyl) propane-1, 3-diyl) bis (oxy) ) bis (5-oxopentane-5, 1-diyl) bis (2-butyloctanoate)

[0542] Compound 14 was prepared according to the procedure of compound 10 from 7-bromoheptyl 2-butyloctanoate.

[0543] 23.6%yield. MS: m / z [M+H] + = 1079.9. 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 4.17-3.96 (m, 10 H) , 3.44-3.15 (m, 4H) , 2.77-2.54 (m, 6H) , 2.40-2.30 (m, 8H) , 2.28-2.19 (m, 4H) , 2.10-1.73 (m, 20H) , 1.70-1.40 (m, 8 H) , 1.40-1.18 (m, 44H) , 0.92-0.75 (m, 18 H) .

[0544] EXAMPLE 15: Synthesis of compound 15

[0545] (Z) - ( (2- ( (N- (3- (diethylamino) propyl) -6- (non-2-en-1-yloxy) -6-oxohexanamido) methyl) propane-1, 3-diyl) bis (oxy) ) bis (5-oxopentane-5, 1-diyl) bis (2-butyloctanoate)

[0546] Intermediate 15-3: (Z) -6- (non-2-en-1-yloxy) -6-oxohexanoic acid

[0547] A solution of 15-1 (6.16 g, 42.18 mmol, 3.0 eq) , DIEA (5.45 g, 42.18 mmol, 3.0 eq) , DMAP (1.72 g, 14.06 mmol, 1 eq) and EDCI (5.39 g, 28.12 mmol, 2.0 eq) in DCM (20 mL) was stirred at 25 ℃ for 0.5 hours before 15-2 (2.00 g, 14.06 mmol, 1.0 eq) was added. The resulting solution was stirred at 25 ℃ for another 2.5 hours and extracted with DCM (20 mL x 3) , the organic layers were combined and washed with saturated aqueous NaCl solution, dried over anhydrous Na2SO4 and concentrated under reduced pressure, the residue was purified by silica column (PE / EtOAc = 10 / 1 to 1 / 1) , the desired product was obtained as a colorless oil (2.90 g, 76.3%yield) .

[0548] Intermediate 15-4: (Z) -non-2-en-1-yl 6-chloro-6-oxohexanoate

[0549] A solution of 15-3 (500.0 mg, 1.85 mmol, 1.0 eq) , oxalyl chloride (700.0 mg, 5.55 mmol, 3.0 eq) , DMF (14.0 mg, 0.19 mmol, 0.1 eq) in DCM (20 mL) was stirred at 0 ℃ for 3 hours. The reaction solution was concentrated under reduced pressure, the crude product was obtained as a colorless oil (490.0 mg, 91.7%) which can be used for the next step without further purification.

[0550] Compound 15: (Z) - ( (2- ( (N- (3- (diethylamino) propyl) -6- (non-2-en-1-yloxy) -6-oxohexanamido) methyl) propane-1, 3-diyl) bis (oxy) ) bis (5-oxopentane-5, 1-diyl) bis (2-butyloctanoate)

[0551] Compound 15 was prepared according to the procedure of compound 6 from Intermediate 15-4.45.0%yield. MS: m / z [M+H] + = 1035.8. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.65 (dd, J = 18.3, 7.6 Hz, 1H) , 5.56-5.48 (m, 1H) , 4.63 (d, J = 6.8 Hz, 2H) , 4.22-3.98 (m, 8H) , 3.44-3.28 (m, 4H) , 2.66-2.24 (m, 17H) , 2.10 (dd, J = 14.3, 7.3 Hz, 2H) , 1.86 (s, 2H) , 1.78-1.55 (m, 17H) , 1.52-1.12 (m, 36H) , 1.01 (t, J = 7.0 Hz, 6H) , 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 14H) .

[0552] Example 16: Preparation and characterization of lipid nanoparticles and in vivo editing experiments

[0553] 1. Animal experimental design

[0554] Delivery experiments of mRNA and sgRNA for the base editor, ABE8e, targeting PCSK9

[0555] Cholesterol in the blood is mainly synthesized by the liver, which is also the main organ for breaking down excess cholesterol. The presence of an LDL receptor (LDLR) on the surface of the liver that binds to cholesterol circulating back to the liver, which in turn breaks it down into bile acids that are excreted out of the body via the intestine; PCSK9 is a liver-synthesized protease that binds to LDL receptors and promotes LDL receptor entry into hepatocytes, leading to LDL receptor degradation by lysosomes and a decrease in the number of LDL receptors; thus,  inhibition of the activity of PSCK9, can increase the number of LDLR, thereby enhancing the uptake and decomposition of cholesterol. Basic and clinical studies have shown that the PCSK9 gene is an effective target for the treatment of hyperlipidemia and atherosclerosis. Figure 1 illustrates the changes in the number of LDL receptors and the eventual changes in cholesterol metabolism that result before and after site-specific editing of the PCSK9 gene.

[0556] The strategy of PCSK9 gene editing delivery to mouse hepatocytes is shown in Figure 1, and the main process is as follows: mRNA and sgRNA encoding ABE8e are targeted to be delivered to mouse hepatocytes by intravenous injection using prepared lipid nanoparticles, and mutations are introduced in the PCSK9 gene in the presence of ABE8e, sgRNA, and base A to G mutations are achieved at specific sites, and the editing efficiency is calculated by sequencing..

[0557] The specific experimental design is as follows:

[0558] 1.1 Selection of suitable mutation sites and editing design

[0559] The single-base editor ABE8e achieves precise A-to-G base substitution without donor template and without causing DSB. Based on this, the first exon of PCSK9 gene was selected as the screening mutation site. Co-delivery of mRNA and sgRNA encoding the single-base editing tool ABE8e into animals via lipid nanoparticles, the mRNA encoding the base editor ABE8e was translated into protein in the cytoplasm and entered the nucleus after forming a complex with sgRNA, and under the guidance of sgRNA, the base editor ABE8e targeted the first exon of PCSK9 gene to splice the donor site, and deamination of adenine (A) on the template strand of the first exon into inosine (I) , I will be read and replicated as G at the DNA level, eventually achieving an A-to-G substitution, which disrupts the splice donor site allowing early termination of the PCSK9 gene reading frame.

[0560] 1.2 Preparation of mRNA, sgRNA for base editor ABE8e

[0561] The sequences of the first exon and first intron of the mouse PCSK9 gene (NCBI Gene ID: 100102) were selected as the targeting region, and the target sequence PCSK9-sgRNA for single-base editing of PCSK9 gene was determined.

[0562] By analyzing the sequences of PCSK9 gene across the first exon and intron, the sgRNA of the target region was designed: PCSK9-sgRNA (synthesized by Nanjing GenScript) , and the PCSK9-sgRNA sequence was:

[0563] PCSK9-sgRNA: 5'-CCCATACCTTGGAGCAACGG-3' (SEQ ID NO: 1) ;

[0564] The sgRNAs were designed according to the target sequences and oligonucleotide (oligos) were synthesized, and the sequences of the sgRNAs used are shown in SEQ ID NO: 1. The CACC sequence was added to the 5' end of the upstream sequence and the AAAC sequence to the 5' end of the downstream sequence of each sgRNA. After synthesis, the upstream and downstream sequences were annealed by a preset program (95℃, 5 min; 95℃-85℃ at -2℃ / s; 85℃-25℃ at -0.1℃ / s; kept at 4℃) , and the annealed products were ligated to the lenti U6-sgRNA / EF1a-mCherry vector linearized by BbsI (NEB, R3539S) (Addgene, Plasmid, #114199) .

[0565] Among them, the system used in the sgRNA plasmid construction was as follows:

[0566] The linearization system for the lenti U6-sgRNA / EF1a-mCherry vector was as follows: vector 3 μg; buffer (NEB: R0539L) 6 μL; BbsI 2 μL; ddH2O was made up to 60 μL, and enzymatic digestion was performed overnight at 37℃.

[0567] The ligation system of sgRNA annealing product and linearized vector was as  follows: T4 ligase buffer (NEB: M0202L) 1μL, linearized vector 20ng, annealed oligo fragment (10μM) 5μL, T4 ligase (NEB: M0202L) 0.5μL, ddH2O was made up to 10μL, ligation overnight at 16℃.

[0568] The ligated vector was transformed into E. coli DH5a competent cells (Weidi Bio, DL1001) . The procedure was as follows: DH5α competent cells were taken out from -80℃, quickly inserted into ice, allowed to melt after 5 min, added the ligation product and gently mixed with your hand by tapping the bottom of the centrifuge tube, and left in ice for 25 min. 42℃ water bath thermal excitation for 45 s, quickly put back into ice and left for 2 min. Added 700 μl of sterile LB medium without antibiotics to the centrifuge tube, mixed well and resuscitate at 37℃ for 60 min at 200 rpm. Centrifuged at 5000 rpm for one minute to collect the bacteria, left about 100 μl of supernatant to resuspend gently by blowing and spreaded onto the LB medium with Amp antibiotics. Placed the plate upside down in a 37℃ incubator overnight. Single colonies were picked, confirmed by sequencing and then shaken for positive clones and the plasmid (TIANGEN: DP120-01) was extracted and the concentration was measured and stored in the refrigerator at -20℃, ready for use.

[0569] The base editor used in this experiment, ABE8e, is the highly efficient base editor ABE8e evolved by David R. Liu's team (Richter MF, Zhao KT, Eton E, Lapinaite A, Newby GA, Thuronyi BW, Wilson C, Koblan LW, Zeng J, Bauer DE, Doudna JA, Liu DR. Phage-assisted evolution of an adenine base editor with improved Cas domain compatibility and activity. Nat Biotechnol. 2020 Jul. 38(7) : 883-891. doi: 10.1038 / s41587-020-0453-z. Epub 2020 Mar 16. erratum in: Nat Biotechnol. 2020 May 20; PMID: 32433547; PMCID: PMC7357821) . Plasmid ABE8e (Plasmid#138489) was obtained from Addgene and the mRNA of ABE8e was expressed and purified by the laboratory for use.

[0570] 2 Lipid nanoparticles can be prepared by ionizing lipids or compounds of the present invention / DSPC / cholesterol / PEG-lipids in a molar ratio of 50: 10: 38.5: 1.5.

[0571] 2.1 Dissolve dilinoleylmethyl-4-dimethylaminobutyrate (DLin-MC3-DMA, commonly abbreviated as MC3) and compounds 1-compound 10 of the present invention with DSPC, cholesterol, and PEG-DMG, respectively, in anhydrous ethanol in the above molar ratios.

[0572] 2.2 The ethanol solutions of the different lipid carriers were mixed with the buffer of mRNA at 1: 3 (v / v) (where the mass ratio of total lipid to mRNA (w / w) was 40:1 and the mass ratio of ABE8e mRNA: sgRNA (w / w) was 3: 2) and passed through the microfluidic nanopharmaceutical manufacturing system at a flow rate of 12 ml / min (NanoAssemblr Ignite, Canada) to obtain nucleic acid lipid nanoparticles 1-10. The obtained nucleic acid lipid nanoparticles were immediately diluted in 40-fold volume into 1× DPBS buffer. The diluted nucleic acid lipid nanoparticle solution was passed through an ultracentrifuge tube and concentrated to the target volume. Diluted for DLS particle size measurement and encapsulation efficiency testing.

[0573] 2.3 The particle size and polydispersity index of lipid nanoparticles were determined by dynamic light scattering using a Malvern Zetasizer Nano ZS (Malvern UK) in 173° backscatter detection mode. The encapsulation efficiency of lipid nanoparticles was determined using Quant-it Ribogreen RNA Quantification Kit (ThermoFisher Scientific, UK) according to the manufacturer's instructions, and the test results are shown in Table 2.

[0574] Table 2 Characterization of nano-lipid particles

[0575] 3 Evaluation of in vivo editing experiments

[0576] 3.1 Lipid nanoparticles encapsulating mRNA and sgRNA encoding the base editor ABE8e prepared in step 2 and containing dilinoleylmethyl-4-dimethylaminobutyrate (DLin-MC3-DMA, usually abbreviated to MC3) , the compound of the present invention (see Table 2) , were injected via tail vein at a dose of 0.1 mg / kg into 6-7 week old C57BL / 6 female mice (purchased from Gempharmatech Co., Ltd) , respectively. Lipid nanoparticles containing dilinoleylmethyl-4-dimethylaminobutyrate (DLin-MC3-DMA, usually abbreviated to MC3) encapsulating mRNA and sgRNA of base editor ABE8e were administered to mice of comparable week age and sex groups as positive controls. In addition, PBS buffer was also injected caudally intravenously in a similar manner into mice of comparable week age and sex groups as a negative control.

[0577] 3.2 Editing efficiency assay

[0578] Mice were tested for editing efficiency one week after administration. Liver tissues were taken from mice after execution, and the genome was extracted after lysis and analyzed for efficiency by deep sequencing.

[0579] The steps of deep sequencing were as follows:

[0580] (1) Design primers according to the target gene location, see Table 3 for details.

[0581] Table 3 Primer design for targeting PCSK9 gene

[0582] (2) Editing efficiency assay.

[0583] The PCR procedure was as follows: 94℃, 2 min; 98℃ 10s, 60℃ 30s, 68℃ 20s, 34 cycles; 68℃, 5 min. Verified by gel electrophoresis after the completion of PCR, and the right size and  single band was selected to determine the correct amplification product, and the obtained PCR product was sent to Nanjing Genscript for sequencing.

[0584] (3) The deep sequencing results were analyzed by crispresso software to analyze the reads and perform site-specific analysis to realize the editing efficiency calculation, and the calculation results are shown in Table 4, and the editing efficiency corresponding to each lipid nanoparticle can be seen in Figure 2.

[0585] Table 4 In vivo editing efficiency assessment

[0586] As shown in Table 4, the ionizable lipid compounds used in the present invention can effectively deliver nucleic acid molecules, small molecule compounds and other drugs; and by comparison, the lipid nanoparticles of the present invention have better particle size distribution and high encapsulation efficiency, and the delivery effect can be significantly better than that of the comparison lipid nanoparticles, which can meet the demand of in vivo delivery.

[0587] The description presented in the above exemplary embodiments is intended only to illustrate the technical solutions of the present invention and is not intended to be exhaustive, nor is it intended to limit the invention to the precise form described. It is clear that many changes and variations are possible for those of ordinary skill in the art based on the above teachings. The exemplary embodiments have been selected and described in order to explain the particular principles of the invention and its practical application, thereby making it easy for others of skill in the art to understand, realize and utilize the various exemplary embodiments of the invention and its various alternative and modified forms. The scope of protection of the invention is intended to be limited by the requested scope of protection and its equivalent forms.

Claims

1.A compound of Formula I or a pharmaceutically acceptable salt, stereoisomer, tautomer, solvate, chelate, non-covalent complex, or precursor thereof, having the following structure: whereinR1 is selected from -OH and Ra (Rb) N-, wherein Ra and Rb are each independently hydrogen, C1-C10 alkyl or C1-C10 haloalkyl;R2 is C1-C20 alkyl, C2-C20 alkenyl, C2-C20 alkynyl;R3 is C1-C20 alkyl, C2-C20 alkenyl, C2-C20 alkynyl, or Rc- (CH2) n-, wherein n is a positive integer of 1-20, preferably, a positive integer of 1-14, more preferably a positive integer of 1-10;Rc is selected from the structure as shown below:whereinrepresents a connection bond;L1, L2, L3, L4, L5 are absent or each independently selected from the group consisting of:X is absent or -CH-or N;R4 is absent or C1-C20 alkyl, C2-C20 alkenyl, C2-C20 alkynyl;R5 is absent or C1-C20 alkyl, C2-C20 alkenyl, C2-C20 alkynyl;R6 is C1-C30 alkyl, C2-C30 alkenyl, C2-C30 alkynyl;R7 is C1-C14 alkyl, C2-C14 alkenyl, C2-C14 alkynyl;R8, R9 are absent or is each independently C1-C14 alkyl, C2-C14 alkenyl, C2-C14 alkynyl or -Rh-C1-C14 alkyl, -Rh-C2-C14 alkenyl, -Rh-C2-C14 alkynyl, wherein Rh is O or S;R10, R11 is each independently C1-C14 alkyl, C2-C14 alkenyl, C2-C14 alkynyl, or -Rh-C1-C14 alkyl, -Rh-C2-C14 alkenyl, -Rh-C2-C14 alkynyl, wherein Rh is O or S.2.The compound of Formula I or a pharmaceutically acceptable salt, stereoisomer, tautomer, solvate, chelate, non-covalent complex, or precursor thereof of claim 1,  wherein the compound of Formula I has a structure of Formula I-1 as follows: whereinR1-R2, R6-R11, L2-L5 are defined as above;R3 is C1-C20 alkyl, C2-C20 alkenyl, C2-C20 alkynyl.3.The compound of Formula I or a pharmaceutically acceptable salt, stereoisomer, tautomer, solvate, chelate, non-covalent complex, or precursor thereof of claim 1, wherein the compound of Formula I has a structure of Formula I-2 as follows: whereinR1-R2, R6-R7, R10-R11, L1-L5 are defined as above;R3 is C1-C20 alkyl, C2-C20 alkenyl, C2-C20 alkynyl, or Rc- (CH2) n-, wherein n is a positive integer of 1-20, preferably, a positive integer of 1-14, more preferably a positive integer of 1-10, Rc is defined as above;R5 is C1-C20 alkyl, C2-C20 alkenyl, C2-C20 alkynyl;R8, R9 is each independently C1-C14 alkyl, C2-C14 alkenyl, C2-C14 alkynyl.4.The compound of Formula I or a pharmaceutically acceptable salt, stereoisomer, tautomer, solvate, chelate, non-covalent complex, or precursor thereof of claim 1, wherein the compound of Formula I has a structure of Formula I-3 as follows: WhereinR1-R3, R6, R7, R10, R11, L1-L5 are defined as above;R4 is C1-C20 alkyl, C2-C20 alkenyl, C2-C20 alkynyl;R5 is C1-C20 alkyl, C2-C20 alkenyl, C2-C20 alkynyl;R8, R9 is each independently C1-C14 alkyl, C2-C14 alkenyl, C2-C14 alkynyl.5.The compound of Formula I or a pharmaceutically acceptable salt, stereoisomer, tautomer, solvate, chelate, non-covalent complex, or precursor thereof of claim 1, wherein the compound of Formula I has a structure of Formula I-4 as follows: WhereinR1-R7, R10-R11, L1-L3, L5 are defined as above.6.A compound of Formula II or a pharmaceutically acceptable salt, stereoisomer, tautomer, solvate, chelate, non-covalent complex, or precursor thereof, having the following structure: whereinR1 is selected from -OH and Ra (Rb) N-, wherein Ra and Rb are each independently hydrogen, C1-C6 alkyl or C1-C6 haloalkyl;R3 is C1-C15 alkyl, C2-C15 alkenyl, C2-C15 alkynyl, or Rc- (CH2) n-, wherein n is a positive integer of 1-20, preferably, a positive integer of 1-14, more preferably a positive integer of 1-10, more preferably a positive integer of 1-6;Rc is selected from the structure as shown below:whereinrepresents a connection bond;L1, L2, L3, L4, L5 are absent or each independently selected from the group consisting of:R4 is absent or C1-C20 alkyl, C2-C20 alkenyl, C2-C20 alkynyl;R5 is absent or C1-C20 alkyl, C2-C20 alkenyl, C2-C20 alkynyl;R8, R9 is each independently C1-C14 alkyl, C2-C14 alkenyl, C2-C14 alkynyl or -Rh-C1-C14 alkyl, -Rh-C2-C14 alkenyl, -Rh-C2-C14 alkynyl, wherein Rh is O or S;R10, R11 is each independently C1-C14 alkyl, C2-C14 alkenyl, C2-C14 alkynyl, or -Rh-C1-C14 alkyl, -Rh-C2-C14 alkenyl, -Rh-C2-C14 alkynyl, wherein Rh is O or S;r is 2 or 3;u is a positive integer of 1-10;t is a positive integer of 1-10;in addition, when R1 is selected from Ra (Rb) N-, r is 2.7.A compound of Formula III or a pharmaceutically acceptable salt, stereoisomer, tautomer, solvate, chelate, non-covalent complex, or precursor thereof, having the following structure: whereinRa and Rb are each independently hydrogen, C1-C6 alkyl or C1-C6 haloalkyl;Rc is selected from the structure as shown below:whereinrepresents a connection bond;s is a positive integer of 1-10;L1, L2, L3, L4, L5 are absent or each independently selected from the group consisting of:R4 is absent or C1-C20 alkyl, C2-C20 alkenyl, C2-C20 alkynyl;R5 is absent or C1-C20 alkyl, C2-C20 alkenyl, C2-C20 alkynyl;R8, R9 is each independently C1-C14 alkyl, C2-C14 alkenyl, C2-C14 alkynyl or -Rh-C1-C14 alkyl, -Rh-C2-C14 alkenyl, -Rh-C2-C14 alkynyl, wherein Rh is O or S;R10, R11 is each independently C1-C14 alkyl, C2-C14 alkenyl, C2-C14 alkynyl, or -Rh-C1-C14 alkyl, -Rh-C2-C14 alkenyl, -Rh-C2-C14 alkynyl, wherein Rh is O or S;r is a positive integer of at least 3;u is a positive integer of 1-10;t is a positive integer of 1-10.8.A compound of Formula IV or a pharmaceutically acceptable salt, stereoisomer, tautomer, solvate, chelate, non-covalent complex, or precursor thereof, having the  following structure: whereinRa and Rb are each independently hydrogen, C1-C6 alkyl or C1-C6 haloalkyl;R3 is C1-C15 alkyl, C2-C15 alkenyl, C2-C15 alkynyl, or Rc- (CH2) n-, wherein n is a positive integer of 1-20, preferably, a positive integer of 1-14, more preferably a positive integer of 1-10;Rc is selected from the structure as shown below:whereinrepresents a connection bond;L1, L2, L3, L4, L5 are absent or each independently selected from the group consisting of:R4 is absent or C1-C20 alkyl, C2-C20 alkenyl, C2-C20 alkynyl;R5 is absent or C1-C20 alkyl, C2-C20 alkenyl, C2-C20 alkynyl;R8, R9 is each independently C1-C14 alkyl, C2-C14 alkenyl, C2-C14 alkynyl or -Rh-C1-C14 alkyl, -Rh-C2-C14 alkenyl, -Rh-C2-C14 alkynyl, wherein Rh is O or S;R10, R11 is each independently C1-C14 alkyl, C2-C14 alkenyl, C2-C14 alkynyl, or -Rh-C1-C14 alkyl, -Rh-C2-C14 alkenyl, -Rh-C2-C14 alkynyl, wherein Rh is O or S;r is a positive integer of at least 3;u is a positive integer of 1-10;t is a positive integer of 1-10.9.A compound of Formula V or a pharmaceutically acceptable salt, stereoisomer, tautomer, solvate, chelate, non-covalent complex, or precursor thereof, having the following structure: whereinRa and Rb are each independently hydrogen, C1-C6 alkyl or C1-C6 haloalkyl;Rc is selected from the structure as shown below:whereinrepresents a connection bond;L1, L2, L3, L5 are absent or each independently selected from the group consisting of:R4 is C1-C20 alkyl, C2-C20 alkenyl, C2-C20 alkynyl;R5 is C1-C20 alkyl, C2-C20 alkenyl, C2-C20 alkynyl;R6 is C1-C30 alkyl, C2-C30 alkenyl, C2-C30 alkynyl;R10, R11 is each independently C1-C14 alkyl, C2-C14 alkenyl, C2-C14 alkynyl, or -Rh-C1-C14 alkyl, -Rh-C2-C14 alkenyl, -Rh-C2-C14 alkynyl, wherein Rh is O or S;r is a positive integer of at least 3;t is a positive integer of 1-10.10.The compound of Formula I or Formula II or Formula IIII or Formula IV or Formula V or a pharmaceutically acceptable salt, stereoisomer, tautomer, solvate, chelate, non-covalent complex, or precursor thereof of any of claims 1-9, the compound is selected from the group consisting of (Table 1) :Table 111.The compound of claim 10, wherein the compound has the structure as  shown below: 12.A lipid carrier, comprising a compound of Formula I or Formula II or Formula IIII or Formula IV or Formula V or a pharmaceutically acceptable salt, stereoisomer, tautomer, solvate, chelate, non-covalent complex, or precursor thereof of any of claims 1-11.13.A lipid nanoparticle (LNP) , comprising a compound of Formula I or Formula II or Formula IIII or Formula IV or Formula V or a pharmaceutically acceptable salt, stereoisomer, tautomer, solvate, chelate, non-covalent complex, or precursor thereof of any of claims 1-11.14.A lipid nanoparticle composition comprising a lipid carrier of claim 12 or a lipid nanoparticle of claim 13, and a bioactive substance encapsulated in the lipid carrier or the lipid nanoparticle.15.A pharmaceutical composition comprising a lipid carrier of claim 12 or a lipid nanoparticle of claim 13, and a bioactive substance encapsulated in the lipid carrier or the lipid nanoparticle, and a pharmaceutically acceptable excipient, carrier or diluent.16.A pharmaceutical formulation comprising a lipid carrier of claim 12 or a lipid nanoparticle of claim 13, and a bioactive substance encapsulated in the lipid carrier or the lipid nanoparticle, and a pharmaceutically acceptable excipient, carrier or diluent; or the pharmaceutical formulation comprising a lipid nanoparticle composition of claim 14, and a pharmaceutically acceptable excipient, carrier or diluent.17.Use of a compound of Formula I or Formula II or Formula IIII or Formula IV or Formula V or a pharmaceutically acceptable salt, stereoisomer, tautomer, solvate, chelate, non-covalent complex, or precursor thereof of any of claims 1-11 in the preparation of a lipid nanoparticle.18.Use of a compound of Formula I or Formula II or Formula IIII or Formula IV or Formula V or a pharmaceutically acceptable salt, stereoisomer, tautomer, solvate, chelate, non-covalent complex, or precursor thereof of any of claims 1-11 or a lipid carrier of claim 12 or a lipid nanoparticle of claim 13 or a lipid nanoparticle composition of claim 14 or a pharmaceutical composition of claim 15 or a pharmaceutical formulation of claim 16 in the preparation of a nucleic acid drug, a genetic vaccine, a small molecule drug, a polypeptide or a protein drug.19.A method for preparing a lipid nanoparticle composition of claim 14, comprising:(a) Mixing a compound of Formula I or Formula II or Formula IIII or Formula IV or Formula V or a pharmaceutically acceptable salt, stereoisomer, tautomer, solvate, chelate, non-covalent complex, or precursor thereof of any of claims 1-11 with an optionally auxiliary lipid and an organic solvent, thereby obtaining a lipid organic phase;(b) Mixing the bioactive substance with an aqueous solvent, thereby obtaining an aqueous phase containing the bioactive substance;(c) Mixing the lipid organic phase in step (a) with the aqueous phase in step (b) , thereby obtaining the lipid nanoparticle composition.20.Use of a compound of Formula I or Formula II or Formula IIII or Formula IV or Formula V or a pharmaceutically acceptable salt, stereoisomer, tautomer, solvate, chelate, non-covalent complex, or precursor thereof of any of claims 1-11 for the preparation of a drug delivery system.21.Use of a compound of Formula I or Formula II or Formula IIII or Formula IV or Formula V or a pharmaceutically acceptable salt, stereoisomer, tautomer, solvate, chelate, non-covalent complex, or precursor thereof of any of claims 1-11 or a lipid carrier of claim 12 or a lipid nanoparticle of claim 13 or a lipid nanoparticle composition of claim 14 or a pharmaceutical composition of claim 15 or a pharmaceutical formulation of claim 16 for the preparation of drugs for the treatment and / or prevention of a disease.22.The use of claim 21, wherein the disease is selected from the group consisting of a metabolic disease, genetic disease, cancer, cardiovascular disease, infectious disease, and a combination thereof, preferably the metabolic disease comprises familial hypercholesterolemia (FH) , the genetic disease includes transthyretin amyloidosis (ATTR) , primary hyperoxuria (PH1) , and hereditary angioedema (HAE) , and the infectious disease includes hepatitis B (HEPATITIS B) .23.A method of delivering a therapeutic or prophylactic agent to a cell, tissue or organ in a subject, comprising contacting the cell, tissue or organ in the subject with a lipid nanoparticle composition of claim 14, a pharmaceutical composition of claim 15 or a pharmaceutical formulation of claim 16.24.A method for producing a target protein or target polypeptide in a subject cell, comprising contacting the subject cell with a lipid nanoparticle composition of claim 14, a pharmaceutical composition of claim 15, or a pharmaceutical formulation of claim 16.

Images