Large-scale production method for lentiviruses using GMP-level serum-free suspension cells
Patent Information
- Authority / Receiving Office
- JP · JP
- Patent Type
- Applications
- Current Assignee / Owner
- SHANGHAI ABELZETA LTD
- Filing Date
- 2026-03-04
- Publication Date
- 2026-06-09
AI Technical Summary
【0011】 本発明の第1の態様において、無血清懸濁細胞からレンチウイルスを製造するための方 法が提供される。当該方法以下の工程を含む: (a) レンチウイルスの産生のためのパッケージング細胞のシード溶液を提供する工程で あって、前記パッケージング細胞が、懸濁液中で増殖するパッケージング細胞である、該 工程; (b) 前記シード溶液を培養容器内の第1培養液に接種して、第1培養物を得る工程で あって、前記第1培養液が無血清細胞培養液であり、接種濃度が1×106~5×106 細胞/mlであり、および前記第1培養液の体積が3~100Lである、該工程; (c) 前記第1培養物を、温度30~38℃、溶存酸素35~55%、CO2濃度2~1 0%、pH6.9~7.4の条件下で、前記パッケージング細胞を継代培養し;継代培養 工程における第1培養物のリアルタイムpH値をモニターし;および、前記リアルタイム pH値に基づいて溶存酸素及び/又はCO2の濃度を制御することにより、pH値を6. 9~7.4に維持する工程; (d) 液体交換トリガ条件が満たされたときに液体交換処理を開始する工程であって、 前記液体交換トリガ条件が (s1)リアルタイムpH値が、6.9以下、好ましくは7.0以下、より好ましくは 7.05以下であること; (s2)酸素、空気、窒素および/またはCO2の濃度を調整することにより、前記リ アルタイムpH値は依然として下降傾向を示すこと;および (s3)継代培養時間が72時間以上であること; を含み、 前記液体交換処理が、前記培養容器から培養物中の無細胞上清を排出し、ここで、前記 上清の排出前における前記培養物の体積をVq1とし、前記上清の排出後における前記培 養物の体積をVh1とした場合に、Vq1/Vh1比が3~15であり;次いで、前記培 養容器に培養液を補充して、パッケージング細胞の培養物を形成することを含む、該工程 ; (e) 工程(c)および(d)をn回繰り返す工程であって、nが1、2または3である 、該工程; (f) トランスフェクショントリガ条件が満たされたときにトランスフェクション処理を 開始する工程であって、前記トランスフェクショントリガ条件が (t1)総細胞量が0.05~2×1011細胞であること; (t2)細胞濃度が0.5~5×106細胞/mlであること; (t3)細胞の生存率が90%以上であること; (t4)総培養時間が72時間以上であること; を含み、 前記トランスフェクション処理が、前記レンチウイルスの産生のための産生プラスミド およびトランスフェクション試薬を混合し、それらを培養容器に添加し、それによって、 前記パッケージング細胞を導入し、トランスフェクトされたパッケージング細胞を形成す ることを含む、該工程; (g) 場合によって、トランスフェクション後に液体交換を行う工程; (h) 前記トランスフェクトされたパッケージング細胞を、温度30~37℃、溶存酸 素35~55%、CO2濃度2~10%、pH6.9~7.4の条件下で継代培養し;継 代培養工程における第1培養物のリアルタイムpH値をモニターし;および、前記リアル タイムpH値に基づいて溶存酸素及び/又はCO2の濃度を制御することにより、pH値 を6.9~7.4に維持する工程; (i) 液体交換トリガー条件が満たされたときに採取及び液体交換処理を開始する工程で あって、前記液体交換トリガー条件は以下を含む: (s1)リアルタイムpH値が、6.9以下であること; (s2)酸素、空気、窒素および/またはCO2の濃度を調整することにより、前記リ アルタイムpH値は依然として減少を示すこと;および (s3)継代培養時間が72時間以上であること; を含み、 ここで、前記液体交換処理が、前記培養物中の無細胞ウイルス含有供給液を回収すること を含み、前記供給液の回収前における培養物の体積をVq2とし、上清の回収後における 培養物の体積をVh2とした場合に、Vq2/Vh2比が3~15である、該工程; (j) 工程(h)および(i)をm回繰り返す工程であって、mが1、2または3であり 、当該繰り返しの前に、培養液を前記培養容器に補充してトランスフェクション細胞培養 物を形成する、該工程; (k) 回収された液体の各々を混合し、混合ウイルス含有上清を得る工程; (l) 前記混合ウイルス含有上清を精製し、精製レンチウイルスベクターを得る工程。
Abstract
Claims
1. A method for producing lentiviruses from serum-free cell suspensions, comprising the following steps: (a) In the step of providing a seed solution for packaging cells for lentivirus production The packaging cells are packaging cells that proliferate in a suspension. Process; (b) In the step of inoculating the seed solution into the first culture medium in the culture vessel to obtain the first culture: The first culture medium is a serum-free cell culture medium, and the inoculation concentration is 1 × 10⁻⁶. ６ ~5 x 10 ６ The step is characterized by a cell / ml ratio and a volume of 3 to 100 L of the first culture medium; (c) The first culture is heated at a temperature of 30-38°C, with dissolved oxygen of 35-55%, and CO2. 2 Concentration 2-1 The packaging cells are subcultured under conditions of 0% and pH 6.9–7.4; subculture Monitor the real-time pH value of the first culture in the process; and the real-time Based on the pH value, dissolved oxygen and / or CO2 2 By controlling the concentration, the pH value can be set to 6. A process to maintain a temperature of 9-7.4; (d) A step of starting the liquid exchange process when the liquid exchange trigger condition is met, The aforementioned liquid exchange trigger condition is (s1) The real-time pH value is 6.9 or less, preferably 7.0 or less, more preferably It must be 7.05 or less; (s2) Oxygen, air, nitrogen and / or CO 2 By adjusting the concentration of the above-mentioned The real-time pH value continues to show a downward trend; and (s3) The subculture period must be 72 hours or longer; Includes, The aforementioned liquid exchange process involves draining the cell-free supernatant from the culture from the culture vessel, and here, Let Vq1 be the volume of the culture before the supernatant is discharged, and let Vq1 be the volume of the culture after the supernatant is discharged. When the volume of the nutrient is Vh1, the Vq1 / Vh1 ratio is 3 to 15; then, the following The process includes replenishing the culture medium in the culture container to form a culture of packaging cells. ； (e) A step of repeating steps (c) and (d) n times, where n is 1, 2, or 3. , the process; (f) When the transfection trigger condition is met, perform the transfection process. The process to start, wherein the transfection trigger condition is (t1) Total cell volume is 0.05 to 2 × 10 １１ Being a cell; (t2) Cell concentration is 0.5 to 5 × 10 ６ Being cells / ml; (t3) The survival rate of cells must be 90% or higher; (t4) The total culture time must be 72 hours or more; Includes, The transfection process is performed to produce the lentivirus-producing plasmid. The transfection reagents are mixed and added to the culture vessel, thereby, The aforementioned packaging cells are introduced to form transfected packaging cells. The process includes; (g) A step in which, if applicable, fluid exchange is performed after transfection; (h) The transfected packaged cells are subjected to a temperature of 30-37°C and dissolved acid 35-55%, CO 2 Subculture under conditions of 2-10% concentration and pH 6.9-7.4; Monitor the real-time pH value of the first culture in the substitute culture process; and the real Based on the time pH value, by controlling the concentration of dissolved oxygen and / or CO 2 the pH value can be A process to maintain the temperature between 6.9 and 7.4; (i) In the process of starting sampling and liquid exchange when the liquid exchange trigger conditions are met The liquid exchange trigger conditions include: (s1) The real-time pH value is 6.9 or less; (s2) Oxygen, air, nitrogen and / or CO 2 By adjusting the concentration of the above-mentioned The time pH value still shows a decrease; and (s3) The subculture period must be 72 hours or longer; Includes, Here, the liquid exchange process involves recovering the cell-free virus-containing supply solution from the culture. The volume of the culture before the collection of the supply solution is Vq2, and the volume after the collection of the supernatant is The process is such that, when the volume of the culture is Vh2, the Vq2 / Vh2 ratio is 3 to 15; (j) A step in which steps (h) and (i) are repeated m times, where m is 1, 2 or 3 Before repeating the process, the culture medium is replenished in the culture vessel for transfection cell culture. The process of forming an object; (k) A step of mixing each of the recovered liquids to obtain a mixed virus-containing supernatant; (l) A step of purifying the mixed virus-containing supernatant to obtain a purified lentiviral vector; The method, wherein the culture medium used in each of the above steps is a serum-free cell culture medium.
2. In step (c) and / or (h), the culture is carried out under shaking conditions, according to claim 1. Method of description.
3. In process (c) and / or (h), the pH value is maintained within the range of 7.0 to 7.
35. The method according to claim 1.
4. In process (d) and / or (i), the Vq1 / Vh1 ratio is 5:10, claim The method described in item 1.
5. The total time for steps (c), (d), and (e) is 72 to 216 hours, as described in claim 1. Method of loading.
6. In step (f), the multiplasmid transfection used is 3 plus Claim 1 comprises midotransfection and 4-plasmid transfection. Method of description.
7. The method according to claim 1, wherein the culture vessel is a disposable culture vessel.
8. The total number of viruses contained in the aforementioned mixed virus-containing supernatant is 1 × 10 １２ Tu is The method according to claim 1.
9. The method according to claim 1, wherein the packaging cells are human embryonic renal epithelial cells.
10. In step (l), the purification comprises ultrafiltration and chromatography, claim The method described in 1.