Modified immune cells and calcineurin inhibitors and uses thereof

Abstract

Provided herein are methods of treating a disease or disorder or reducing immune clearance using modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) and a CNI.

Description

MODIFIED IMMUNE CELLS AND CALCINEURIN INHIBITORS AND USES THEREOF

[0001] CROSS REFERENCE TO RELATED APPLICATION

[0002] This application claims benefit of priority of International Patent Application No. PCT / CN2023 / 121132 filed on Sep 25, 2023, and Patent Application No. PCT / CN2023 / 141177 filed on Dec 22, 2023, the contents of which are incorporated herein by reference in its entirety.TECHNICAL FIELD

[0003] This disclosure relates to methods of treating a disease or disorder using modified immune cells and a calcineurin inhibitor (CNI) .BACKGROUND

[0004] The development of universal off-the-shelf cell therapy products (e.g., CAR-T) is a major goal of next-generation cell therapies. General-purpose cell therapies based on “allogeneic” cells generally have the issue of “transplantation rejection, ” where the transplanted cells induce Host-versus-Graft (HvG) reactions, and are cleared by the patient's immune system, especially by natural killer cells (NK cells) and T lymphocytes. This reduces the persistence and curative effects of the allogeneic cell therapies in the patient.

[0005] Natural killer (NK) cells have emerged as a promising source of cells for CAR-based therapies due to their ready availability and safety profile. One limitation of cell therapy products (e.g., CAR-NK therapy products) is the low tumor infiltration ability.

[0006] Thus, there is a need to prevent or reduce HvG reactions and at the same time, improve the efficacy and tumor infiltration ability of allogeneic cell therapies (e.g., CAR-NK therapies) .SUMMARY

[0007] The present disclosure relates to the prevention or mitigation of Host-versus-Graft (HvG) reactions related to cell therapies (e.g., CAR-NK therapies) and increasing the efficacy of the cell therapy. Specifically, the disclosure relates to a combination therapy using a calcineurin  inhibitor (CNI) and modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) for the prevention or mitigation of HvG reactions or immune clearance and enhancement of the efficacy of the cell therapy.

[0008] In one aspect, the disclosure is related to methods of treating a disease or disorder in a subject, the method comprising administering an effective amount of a calcineurin inhibitor (CNI) to the subject in need thereof, wherein the subject is or will be under the treatment of modified immune cells.

[0009] In some embodiments, the disease or disorder is a cancer, an autoimmune disease, or an infection.

[0010] The disclosure is also related to methods of reducing immune clearance of modified immune cells in a subject, comprising administering an effective amount of a calcineurin inhibitor (CNI) to the subject, wherein the subject is or will be under the treatment of modified immune cells.

[0011] In some embodiments, the modified immune cells are allogeneic cells isolated from a donor for being administered to a subject.

[0012] In some embodiments, the immune clearance of the modified immune cells is through host immune cell-mediated cytotoxicity.

[0013] In some embodiments, the immune clearance of the modified immune cells is through host T cell-mediated cytotoxicity.

[0014] In some embodiments, the administration of the CNI increases the expansion of the modified immune cells.

[0015] The disclosure is also related to methods of increasing the in vivo infiltration of a modified immune cell into a tissue in a subject, comprising administering an effective amount of a calcineurin inhibitor (CNI) to the subject.

[0016] In some embodiments, the tissue is a tumor tissue.

[0017] In some embodiments, the modified immune cell has an increased expression of CX3CR1.

[0018] In some embodiments, the increased in vivo infiltration of the modified immune cell into the tissue is via the interaction between CX3CR1 expressed on the modified immune cell and CX3CL1 expressed on the cells in the tissue.

[0019] In some embodiments, the modified immune cell is a modified natural killer (NK) cell.

[0020] In some embodiments, the modified NK cell is a CAR-NK cell that expresses a chimeric antigen receptor (CAR) .

[0021] In some embodiments, the CNI is Cyclosporine A (CsA) .

[0022] In some embodiments, the CsA is administered at a dosage of about 1 mg / kg / day to about 25 mg / kg / day. In some embodiments, the CsA is administered at a dosage of about 0.5 to about 12.5 / mg / kg / twice a day. In some embodiments, the CsA is administered at a dosage of about 5 mg / kg / day to about 15 mg / kg / day. In some embodiments, the CsA is administered at a dosage of about 2.5 to about 7.5 / mg / kg / twice a day. In some embodiments, the trough blood concentration of CsA is about 50 ng / ml to about 300 ng / ml.

[0023] In some embodiments, the CNI is tacrolimus.

[0024] In some embodiments, the tacrolimus is administered at a concentration of about 0.01 to 1 mg / kg / day. In some embodiments, the tacrolimus is administered at a concentration of about 0.1 to 0.3 mg / kg / day. In some embodiments, the trough blood concentration of Tac is about 5 ng / ml to about 15 ng / ml.

[0025] In some embodiments, the CAR receptor specifically binds to a target antigen.

[0026] In some embodiments, the target antigen is selected from the group consisting of BCMA, CLL1, CD4, GPC3, GPRC5D, GU2CYC, CD19, MUC16, MUC1, CAIX, CEA, CD8, CD7, CD10, CD20, CD22, CD30, CD33, CD34, CD38, CD41, CD44, CD49f, CD56, CD74, CD133, CD138, EGP-2, EGP-40, EpCAM, ERBB2, ERBB3, ERBB4, FBP, fetal acetylcholine receptor, folate receptor-α, GD2, GD3, HER-2, hTERT, IL-13R-α2, κ-light chain, KDR, LeY, L1 cell adhesion molecule, MAGE-A1, mesothelin, MAGEA3, p53, MART1, GP100, proteinase-3 (PR3) , tyrosinase, survivin, hTERT, EphA2, NY-ESO-1, h5T4, PSCA, PSMA, ROR1, TAG-72, VEGF-R2, WT-1, CD123, CD44V6, NKCS1, IGF1R, EGFR, EGFR-VIII, Claudin 18.2, Claudin 6, NKG2D, Delta-like 3 (DLL3) , CD70, CS-1, c-Met, Glycolipid F77, PD-L1, and PD-L2.

[0027] In some embodiments, the modified immune cells are not modified by gene-editing or knockout of FKBP12 or PPIA gene, which renders the cells resistant to CNI.

[0028] In some embodiments, the modified immune cells are not modified by overexpression of at least one miRNA of miR-17-92 cluster or paralogs thereof or inactivation of at least one miR-17-92 cluster target gene, which renders the cells resistant to CNI.

[0029] In some embodiments, the modified immune cells do not comprise any modification that renders the cells resistant to CNI.

[0030] In some embodiments, the modified immune cells are enriched in the bone marrow of the subject.

[0031] In some embodiments, the subject has a bone-marrow-related disease or disorder, or a hematological cancer, e.g., a lymphoma or a leukemia.

[0032] In some embodiments, the subject has acute lymphoblastic leukemia, acute myeloid leukemia, chronic lymphocytic leukemia, chronic myelogenous leukemia, Hodgkin lymphoma, non-Hodgkin lymphoma, Waldenstrom macroglobulinemia, follicular lymphoma, B-cell lymphoma, cutaneous T-cell lymphoma, multiple myeloma, plasmacytoma, or amyloidosis.

[0033] In some embodiments, the subject has a bone-marrow-related disease. In some embodiments, the subject has a bone-marrow-related autoimmune disease, e.g., a B-cell regulated autoimmune disease.

[0034] In some embodiments, the subject has systemic lupus erythematosus (SLE) , rheumatoid arthritis, Wegener's disease, inflammatory bowel disease, ulcerative colitis, idiopathic thrombocytopenic purpura (ITP) , thrombotic throbocytopenic purpura (TTP) , autoimmune thrombocytopenia, multiple sclerosis (MS) , Systemic sclerosis / scleroderma (SSc) , Idiopathic inflammatory myopathy (IIM) , antiphospholipid syndrome (APS) , psoriasis, IgA nephropathy, IgM polyneuropathies, myasthenia gravis (MG) , ANCA (Anti-neutrophil cytoplastic antibodies) associated vasculitis, diabetes mellitus, Reynaud's syndrome, Sjorgen's syndrome, Neuromyelitis Optica (NMO) , glomerulonephritis, and myelin oligodendrocyte glycoprotein-IgG associated disorders (MOGAD) .

[0035] In some embodiments, the CNI is administered prior to, during, and / or after the administration of the modified immune cells.

[0036] In some embodiments, the CNI is administered at least 1 day, at least 2 days, at least 3 days, at least 4 days, at least 5 days, at least 6 days, or at least 7 days prior to the administration of the modified immune cells.

[0037] In some embodiments, the CNI is administered throughout the administration of the modified immune cells.

[0038] In some embodiments, the CNI is administered after the administration of the modified immune cells for at least 15 days, at least 20 days, at least 1 month, 2 months or 3 months.

[0039] In some embodiments, a lymphodepletion is performed in the subject prior to or after the administration of the CNI and prior to the administration of the modified immune cells.

[0040] In some embodiments, the CNI is administered by intravenous injection and / or oral administration.

[0041] In some embodiments, the CNI is administered by oral administration after the subject is discharged from the hospital.

[0042] In some embodiments, the modified immune cells have been expanded in vitro before administered to the subject.

[0043] The disclosure is also related to methods of enhancing degranulation of a modified immune cell (e.g., CAR-NK cells) in a subject, the method comprising administering an effective amount of a calcineurin inhibitor (CNI) to the subject, wherein the subject is or will be under the treatment of modified immune cells.

[0044] In some embodiments, the degranulation of the modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) is enhanced.

[0045] In some embodiments, the expression of CD107a on the modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) is increased.

[0046] Other features and advantages of the invention will be apparent from the following detailed description and figures, and from the claims.DESCRIPTION OF DRAWINGS

[0047] FIGs. 1A-1B show a model of allogeneic cell therapy. The window of the efficacy of the therapy can be increased by increasing the efficacy of the allogeneic cell therapy product and decreasing the Host-versus-Graft (HvG) reactions, illustrated by the transition from FIG. 1A to FIG. 1B.

[0048] FIG. 2 shows that calcineurin inhibitors Tacrolimus (Tac) and Cyclosporine A (CsA) inhibited the killing of target cells by CAR-T cells.

[0049] FIGs. 3A-3C show that calcineurin inhibitors Tacrolimus (Tac) and Cyclosporine A (CsA) enhanced the killing of target cells by CAR-NK cells. FIG. 3A shows the percentage of live H929 cells. FIG. 3B shows the percentage of CD107a+ CAR-NK cells after treatment with CsA. FIG. 3C shows the expression of CD107a on CAR-NK cells after the treatment with CsA.

[0050] FIGs. 4A-4B show that CsA enhanced the killing of target cells by CAR-NK cells in the NCG tumor mouse model. FIG. 4A shows that 50 mg / kg CsA enhanced the targeted killing of  tumor cells by CAR-NK cells. FIG. 4B shows that CsA alone did not have direct inhibiting effects on the growth of the tumor.

[0051] FIGs. 5A-5B show the expression of CX3CR1 on CAR-NK cells after the treatment with CsA. FIG. 5A shows flow cytometry results of the expression CX3CR1 on CAR-NK cells with treatment of CsA or Tac at concentrations correlating to the clinically relevant concentration of the drugs. FIG. 5B shows MFI results of the expression CX3CR1 on CAR-NK cells with treatment of CsA or Tac at concentrations correlating to the clinically relevant concentration of the drugs. These results show that the expression of CX3CR1 was upregulated with the treatment of CsA or Tac.

[0052] FIGs. 6A-6C show the distribution of CAR-NK in bone marrow (FIG. 6A) , in peripheral blood (FIG. 6B) and the CX3CR1+ CAR-NK percentage in bone marrow isolated CAR-NK (FIG. 6C) after the treatment with CsA. CsA was used at a dosage of 50 mg / kg, and Ctrl shows the results for the control group without the treatment of CsA.

[0053] FIGs. 7A-7B show that co-administration of CsA inhibited the immune clearance of CAR-NK mediated by PBMC in the Mixed Lymphocyte Reactions (MLR) . Allogeneic PBMC, CAR-NK, H929 cells were co-cultured at a ratio of 50: 1: 4, establishing a mixed lymphocyte system. The number of CAR-NK cells were monitored every two days. The number of CAR-NK cells were normalized by the number of initially seeded CAR-NK cells, and the fold changes were recorded. FIG. 7A shows that co-administration of CsA inhibited the immune clearance of CAR-NK mediated by PBMC in the MLR. CsA was used at a concentration of 200 ng / ml, and Ctrl shows the results for the control group without the treatment of CsA. FIG. 7B shows that co-administration of Tac inhibited the immune clearance of CAR-NK mediated by PBMC in the MLR. Tac was used at a concentration of 10 ng / ml, and Ctrl shows the results for the control group without the treatment of Tac.

[0054] FIGs. 8A-8C show the in vivo efficacy, the expansion and the gene enrichment analysis of CAR-NK treated by CsA or Tac. FIG. 8A shows that CsA or Tac treatment did not suppress but increase the tumoricidal effect of CAR-NK, comparing to that treated with vehicle. FIG. 8B shows that the CAR-NK counts in peripheral blood were comparable among CsA, Tac, or vehicle treated groups. FIG. 8C lists the enriched pathways that were upregulated by CsA or Tac treatment, as compared to vehicle treated CAR-NK. Specifically, CsA, Tac or vehicle treated CAR-NK were isolated from the mouse spleen at the end point of the experiment. RNA sequencing was performed  and the differentially expressed genes, comparing CsA or Tac to vehicle treated CAR-NK, were calculated and KEGG enrichments were analyzed. CsA was used at a dose of 50 mg / kg / day, Tac was used at a dose of 5 mg / kg / day.

[0055] FIGs. 9A-9E show that CsA suppressed CAR-NK rejection by allogenic PBMC and promoted CAR-NK persistence in vivo in a HvG model. FIG. 9A shows the schematic of HvG model design. FIG. 9B shows the dynamic changes of CAR-NK counts in peripheral blood in the HvG model. FIG. 9C shows the dynamic changes in T cells counts of PBMC origin. FIG. 9D shows the expression of CD38 in T cells of PBMC origin. FIG. 9E shows the expression of CD71 in T cells of PBMC origin.

[0056] FIG. 10 shows that CsA promoted CAR-NK persistence in a dose dependent manner in vivo (an HvG model similar to that mentioned in FIG. 9A) . Higher CsA doses were associated with increased Cmax and prolonged CAR-NK expansion.

[0057] FIGs. 11A-11B show that CsA treatment durations determined CAR-NK persistence in vivo in an HvG model similar to that mentioned in FIG. 9A. FIG. 11A shows that longer CsA treatment durations were associated with increased Cmax and prolonged CAR-NK expansion. FIG. 11B shows that discontinuation of CsA treatment led to peripheral T cell recovery.

[0058] FIGs. 12A-12B show that CsA promoted the tumoricidal effect of CAR-NK in a tumor bearing HvG model. This model, in which tumor cells were additionally inoculated, is based on the previously described HvG model in FIG. 9A. FIG. 12A shows that CsA treatment suppressed tumor progression compared to vehicle treated group. FIG. 12B shows that CsA treatment promoted CAR-NK expansion. CsA was used at a dose of 50 mg / kg / day.DETAILED DESCRIPTION

[0059] Cell therapies based on "allogeneic" cells generally have the issues of "transplantation rejection. " Usually, the transplanted cells can induce Host-versus-Graft (HvG) reactions, and these cells are killed by the subject's immune system, e.g., by T lymphocytes. This may reduce the persistence and efficacy of the allogeneic cell products.

[0060] In tissue transplantation patients, immunosuppressants are used to prevent or mitigate HvG reactions. CNIs are also used for long-term maintenance of immunosuppression to control HvG reactions.

[0061] The present disclosure is based on, in part, that CNIs such as CsA or Tac can inhibit the target killing effect of certain immune cells (e.g., T cells or CAR-T cells) but enhance the target killing effect of other immune cells (e.g., CAR-NK cells) . Therefore, co-administering a CNI and engineered immune cells such as CAR-NK cells can prevent or mitigate the host immune clearance mediated by, e.g., T cells, and enhance the efficacy of the cell therapy of the engineered immune cells (e.g., CAR-NK cells) . In addition, CNIs can increase the tumor infiltration of the modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) and promote the expansion of the modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) .

[0062] Accordingly, in one aspect, the disclosure provides methods of treating a disease or disorder in a subject, the method comprising administering an effective amount of a calcineurin inhibitor (CNI) to the subject in need thereof, wherein the subject is or will be under the treatment of modified immune cells.

[0063] In one aspect, the disclosure provides methods of treating a disease or disorder in a subject, the method comprising administering an effective amount of modified immune cells and a calcineurin inhibitor (CNI) to a subject in need thereof.

[0064] In one aspect, the disclosure provides methods of reducing immune clearance of modified immune cells in a subject, comprising administering an effective amount of a calcineurin inhibitor (CNI) to the subject, wherein the subject is or will be under the treatment of modified immune cells.

[0065] In one aspect, the disclosure provides methods of reducing immune clearance of modified immune cells in a subject, comprising administering an effective amount of the modified immune cells and a calcineurin inhibitor (CNI) to the subject.

[0066] In one aspect, the disclosure provides methods of increasing the in vivo infiltration of a modified immune cell into a tissue in a subject, comprising administering an effective amount of a calcineurin inhibitor (CNI) to the subject.

[0067] As used herein, the term “chimeric antigen receptor” or “CAR” as used herein refers to genetically engineered receptors, which can be used to graft one or more antigen specificity onto immune effector cells, such as NK cells. Some CARs are also known as “chimeric immune receptors. ” A CAR may comprise an extracellular ligand binding domain or an extracellular antigen binding domain specific for one or more ligands or antigens (such as tumor antigens,  autoimmune disease antigens) , a transmembrane domain, and an intracellular signaling domain. A “CAR-NK cell” refers to an NK cell that expresses a CAR.

[0068] As used herein, the term “cancer” refers to cells having the capacity for autonomous growth. Examples of such cells include cells having an abnormal state or condition characterized by rapidly proliferating cell growth. The term is meant to include cancerous growths, e.g., tumors; oncogenic processes, metastatic tissues, and malignantly transformed cells, tissues, or organs, irrespective of histopathologic type or stage of invasiveness. Also included are malignancies of the various organ systems, such as respiratory, cardiovascular, renal, reproductive, hematological, neurological, hepatic, gastrointestinal, and endocrine systems; as well as adenocarcinomas which include malignancies such as most colon cancers, renal-cell carcinoma, prostate cancer and / or testicular tumors, non-small cell carcinoma of the lung, and cancer of the small intestine. Cancer that is “naturally arising” includes any cancer that is not experimentally induced by implantation of cancer cells into a subject, and includes, for example, spontaneously arising cancer, cancer caused by exposure of a patient to a carcinogen (s) , cancer resulting from insertion of a transgenic oncogene or knockout of a tumor suppressor gene, and cancer caused by infections, e.g., viral infections. The term “carcinoma” is art recognized and refers to malignancies of epithelial or endocrine tissues. The term also includes carcinosarcomas, which include malignant tumors composed of carcinomatous and sarcomatous tissues. An “adenocarcinoma” refers to a carcinoma derived from glandular tissue or in which the tumor cells form recognizable glandular structures. The term “sarcoma” is art recognized and refers to malignant tumors of mesenchymal derivation. The term “hematopoietic neoplastic disorders” includes diseases involving hyperplastic / neoplastic cells of hematopoietic origin. A hematopoietic neoplastic disorder can arise from myeloid, lymphoid or erythroid lineages, or precursor cells thereof.

[0069] As used herein, the term “a bone-marrow-related autoimmune disease” indicates a group of diseases that affect the bone marrow. Some pathogenic cells of these diseases can be located in the bone marrow, develop in the bone marrow, and / or invade the bone marrow, thereby affecting the function of the bone marrow. The bone-marrow-related autoimmune disease includes a B-cell regulated autoimmune disease. The term "a B-cell regulated autoimmune disease" is an autoimmune disorder that involves misregulation of B-cells. The B-cell regulated autoimmune disease can be an autoimmune disorder associated with autoreactive plasma cells and / or autoreactive memory B cells.

[0070] As used herein, the terms “subject” and “patient” are used interchangeably throughout the specification and describe an animal, human or non-human, to whom treatment according to the methods of the present disclosure is provided. Veterinary and non-veterinary applications are contemplated by the present disclosure. Human patients can be adult humans or juvenile humans (e.g., humans below the age of 18 years old) . In addition to humans, patients include but are not limited to mice, rats, hamsters, guinea-pigs, rabbits, ferrets, cats, dogs, and primates. Included are, for example, non-human primates (e.g., monkey, chimpanzee, gorilla, and the like) , rodents (e.g., rats, mice, gerbils, hamsters, ferrets, rabbits) , lagomorphs, swine (e.g., pig, miniature pig) , equine, canine, feline, bovine, and other domestic, farm, and zoo animals.

[0071] As used herein, the term “donor” represents an organism from which a biological sample is produced from, for example, a human from whom cells can be obtained. The organism includes mammals such as rats, mice, rabbits, sheep, cats, dogs, cows, pigs, and non-human primates. The term “donor” also encompasses any vertebrate including but not limited to mammals, reptiles, amphibians and fish. A “donor” can also refer to more than one donor, for example one or more humans or non-human animals or non-human mammals. However, advantageously, the donor is a mammal such as a human. The donor can be a cancer patient that is to be treated with a population of cells generated by the methods described herein (i.e., an autologous donor) , or can be an individual who donates a sample that, upon generation of the population of cells generated by the methods described herein, will be used to treat a different individual or cancer patient (i.e., an allogeneic donor) .

[0072] As used herein, the term “derived from” indicates a relationship between a first and a second molecule. It generally refers to structural similarity between the first molecule and a second molecule and does not connotate or include a process or source limitation on a first molecule that is derived from a second molecule. For example, in the case of an intracellular signaling domain that is derived from a CD3 zeta molecule, the intracellular signaling domain retains sufficient CD3 zeta sequence / structure such that is has the required function, namely, the ability to generate a signal under the appropriate conditions. It does not connotate or include a limitation to a particular process of producing the intracellular signaling domain, for example, it does not mean that, to provide the intracellular signaling domain, one must start with a CD3 zeta sequence and delete unwanted sequence, or impose mutations, to arrive at the intracellular signaling domain. A domain derived from a particular protein may have a sequence that is at least 50%, at least 60%, at least  70%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%identical to the relevant functional portion of the particular protein.

[0073] Unless otherwise defined, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which this disclosure belongs. Methods and materials are described herein for use in the present disclosure; other, suitable methods and materials known in the art can also be used. The materials, methods, and examples are illustrative only and not intended to be limiting. All publications, patent applications, patents, sequences, database entries, and other references mentioned herein are incorporated by reference in their entirety. In case of conflict, the present specification, including definitions, will control.

[0074] HvG Reactions Against Engineered Immune Cells

[0075] Adoptive immunotherapy with T cells or NK cells that were engineered by transient or stable gene transfer to express a chimeric antigen receptor (CAR) is highly effective treatment for advanced chemotherapy-and radiotherapy-refractory malignancies in hematology and oncology. One of the greatest obstacles for the application of adoptive immunotherapy is host versus graft (HvG) reactions against allo-products, due to an immune response of the patient’s immune system against the transferred cells (e.g., CAR-NK cells) . The HvG reactions significantly reduce the persistence and efficacy of the cell therapies. Further, HvG reactions can cause side effects (e.g., fever) and safety concerns.

[0076] The highly polymorphic HLA molecules in the population are the main cause of T cell-mediated HvG. Since β2-microglobulin (B2M) is essential for the stable existence of HLA class I molecules on the cell membrane, knocking out B2M can remove HLA class I molecules from the cell surface, thereby effectively mitigate T cell-mediated HvG responses. Loss of B2M, however, significantly increases the sensitivity of allogeneic cells to NK cell mediated cytotoxicity, predisposing them to be cleared by NK cells.

[0077] At present, three common strategies exist for addressing HvG problems in allogeneic cell therapy (Table 1) . Firstly, lymphocyte depletion drugs, including antibody drugs and bispecific chimeric antigen receptors (CAR) , can be used to eliminate immune cells (especially NK cells and T cells) in the subject, thereby weakening or inhibiting the HvG response and prolong the persistence of allogeneic cell therapy products in the subject. Secondly, the allogeneic cell  products could be modified by naturally occurring immunosuppressive molecules (by overexpressing, knocking down or knocking out) , to reduce the activation of the subject's immune system, or to inhibit the subject's immune cells (especially NK cells and T cells) , thereby reducing the rate at which allogeneic cell therapy products are cleared by the subject's immune system. Finally, according to the frequency and distribution of polymorphic HLA alleles across the population in a specific area, a variety of HLA haploidentical cells can be prepared, and a limited cell bank that covers most of the HLA types in the population can be established. Using the cell bank, the immune response between HLA-incompatible donor and recipient cells can be reduced, and a longer persistence of allogeneic cell therapy products in the subject can be achieved.

[0078] Table 1 Common strategies for addressing HvG reactions

[0079] However, the above three strategies all have obvious and insurmountable drawbacks. Using lymphodepletion agents to clear or suppress the subject's immune system often increases the risk of infection, and antibody drug-mediated targeted cell clearance is expensive and often accompanied by obvious side effects. Due to a lack of clinical data, the effects of modifying naturally occurring immunosuppressive molecules (e.g., HLA-E overexpression and HLA-A / B / C knockout) are uncertain. Finally, building cell banks only partially avoids, and do not solve the HvG problem of allogeneic cell therapies.

[0080] The present disclosure provides methods of preventing, inhibiting, or reducing HvG reactions related to cell therapies (e.g., CAR-NK therapies) .

[0081] Calcineurin Inhibitors (CNIs)

[0082] Calcineurin inhibitors (CNIs) are immunosuppressants used to manage autoimmune conditions including but not limited to lupus nephritis, idiopathic inflammatory myositis,  interstitial lung disease, and atopic dermatitis. In addition, they are used as mainstays for immunosuppression in solid organ transplants.

[0083] · Cyclosporine A (CsA)

[0084] Cyclosporin A is a cyclic nonribosomal peptide of eleven amino acids; an immunosuppressant drug widely used in post-allogeneic organ transplant to reduce the activity of the patient's immune system, and therefore the risk of organ rejection. The structure and chemical and physical properties of CsA is known in the art (see, e.g., the PubChem website, PubChem CID 5284373) . Cyclosporine is used together with other medicines to prevent the body from rejecting a transplanted organ (e.g., kidney, liver, or heart) . Cyclosporine is also used to treat severe rheumatoid arthritis in patients who have failed treatment with methotrexate. This medicine is also used to treat adults with severe plaque psoriasis after other treatments (e.g., PUVA, retinoids, methotrexate) failed.

[0085] The mechanism of action of cyclosporine is as a calcineurin inhibitor, a cytochrome P450 3A4 inhibitor, and a P-glycoprotein inhibitor. CsA inhibits the synthesis of interleukins (IL) , including IL-2, which is essential for the self-activation of T lymphocytes (LT) and their differentiation. Cyclosporine is effective due to specific and reversible inhibition of immunocompetent lymphocytes in the G0 and G1-phase of the cell cycle. The T-helper cell is the primary target, although it may also suppress T-suppressor cells. The LT-B-lymphocyte (LB) co-operation is essential for activation of LB; the latter also gets inhibited. In addition, research has demonstrated that CsA had an inhibiting effect on CD4+ CD25+ Tregs, which might block the host immune tolerance potentiality.

[0086] The CNI used in the methods described herein may be CsA. The CsA may be administered at any suitable dosage. The CsA may be administered at a dosage of about 1 to about 200 mg / kg / day, about 1 to about 175 mg / kg / day, about 1 to about 150 mg / kg / day, about 1 to about 125 mg / kg / day, about 1 to about 100 mg / kg / day, about 1 to about 75 mg / kg / day, about 1 to about 50 mg / kg / day, about 1 to about 25 mg / kg / day, about 1 to about 12.5 mg / kg / day, 5 to about 200 mg / kg / day, about 5 to about 175 mg / kg / day, about 5 to about 150 mg / kg / day, about 5 to about 125 mg / kg / day, about 5 to about 100 mg / kg / day, about 5 to about 75 mg / kg / day, about 5 to about 50 mg / kg / day, about 5 to about 25 mg / kg / day, 10 to about 200 mg / kg / day, about 10 to about 175 mg / kg / day, about 10 to about 150 mg / kg / day, about 10 to about 125 mg / kg / day, about 10 to about 100 mg / kg / day, about 10 to about 75 mg / kg / day, about 10 to about 50 mg / kg / day, about 10 to  about 25 mg / kg / day, about 10 to about 12.5 mg / kg / day, about 12.5 to about 200 mg / kg / day, about 12.5 to about 175 mg / kg / day, about 12.5 to about 150 mg / kg / day, about 12.5 to about 125 mg / kg / day, about 12.5 to about 100 mg / kg / day, about 12.5 to about 75 mg / kg / day, about 12.5 to about 50 mg / kg / day, about 12.5 to about 25 mg / kg / day, about 15 to about 200 mg / kg / day, about 15 to about 175 mg / kg / day, about 15 to about 150 mg / kg / day, about 15 to about 125 mg / kg / day, about 15 to about 100 mg / kg / day, about 15 to about 75 mg / kg / day, about 15 to about 50 mg / kg / day, about 15 to about 25 mg / kg / day, about 20 to about 200 mg / kg / day, about 20 to about 175 mg / kg / day, about 20 to about 150 mg / kg / day, about 20 to about 125 mg / kg / day, about 20 to about 100 mg / kg / day, about 20 to about 75 mg / kg / day, about 20 to about 50 mg / kg / day, about 20 to about 25 mg / kg / day, about 25 to about 200 mg / kg / day, about 25 to about 175 mg / kg / day, about 25 to about 150 mg / kg / day, about 25 to about 125 mg / kg / day, about 25 to about 100 mg / kg / day, about 25 to about 75 mg / kg / day, about 25 to about 50 mg / kg / day, about 50 to about 200 mg / kg / day, about 50 to about 175 mg / kg / day, about 50 to about 150 mg / kg / day, about 50 to about 125 mg / kg / day, about 50 to about 100 mg / kg / day, about 50 to about 75 mg / kg / day, about 75 to about 200 mg / kg / day, about 75 to about 175 mg / kg / day, about 75 to about 150 mg / kg / day, about 75 to about 125 mg / kg / day, about 75 to about 100 mg / kg / day, about 100 to about 200 mg / kg / day, about 100 to about 175 mg / kg / day, about 100 to about 150 mg / kg / day, about 100 to about 125 mg / kg / day, about 125 to about 200 mg / kg / day, about 125 to about 175 mg / kg / day, about 125 to about 150 mg / kg / day, about 150 to about 200 mg / kg / day, or about 150 to about 175 mg / kg / day. The CsA may be administered at a dosage of about 1 to about 25 mg / kg / day. The CsA may be administered at a dosage of about 5 to about 15 mg / kg / day. The CsA may be administered at a dosage of about 0.5 to about 12.5 / mg / kg / twice a day. The CsA may be administered at a dosage of about 2.5 to about 7.5 / mg / kg / twice a day. The trough blood concentration of CsA may be about 50 ng / ml to about 300 ng / ml.

[0087] · Tacrolimus (Tac)

[0088] Tacrolimus (anhydrous) is a macrolide lactam containing a 23-membered lactone ring, originally isolated from the fermentation broth of a Japanese soil sample that contained the bacteria Streptomyces tsukubaensis. It has a role as an immunosuppressive agent and a bacterial metabolite. The structure and chemical and physical properties of Tac is known in the art (see, e.g., the PubChem website, PubChem CID 445643) .

[0089] Tacrolimus (also FK-506 or Fujimycin) is an immunosuppressive drug whose main use is after organ transplant to reduce the activity of the patient's immune system and so the risk of organ rejection. It is also used in a topical preparation in the treatment of severe atopic dermatitis, severe refractory uveitis after bone marrow transplants, and the skin condition vitiligo. Tacrolimus is chemically known as a macrolide. It reduces peptidyl-prolyl isomerase activity by binding to the immunophilin FKBP-12 (FK506 binding protein) creating a new complex. This FKBP12-FK506 complex inhibits calcineurin which inhibits T-lymphocyte signal transduction and IL-2 transcription.

[0090] Other uses of tacrolimus include prophylaxis for prevention of corneal, pancreatic, renal, and small intestine transplant rejection, induction therapy of lupus nephritis, treatment of Crohn disease, membranous glomerulonephritis, and myasthenia gravis, and to reduce the incidence of pancreatitis in patients undergoing liver transplantation after endoscopic retrograde cholangiopancreatography.

[0091] The CNI used in the methods described herein may be Tac. The Tac may be administered at any suitable dosage. The Tac may be administered at a dosage of about 0.01 to about 20 mg / kg / day, about 0.01 to about 17.5 mg / kg / day, about 0.01 to about 15 mg / kg / day, about 0.01 to about 12.5 mg / kg / day, about 0.01 to about 10 mg / kg / day, about 0.01 to about 7.5 mg / kg / day, about 0.01 to about 5 mg / kg / day, about 0.01 to about 2.5 mg / kg / day, about 0.01 to about 1.25 mg / kg / day, about 0.01 to about 1 mg / kg / day, 0.5 to about 20 mg / kg / day, about 0.5 to about 17.5 mg / kg / day, about 0.5 to about 15 mg / kg / day, about 0.5 to about 12.5 mg / kg / day, about 0.5 to about 10 mg / kg / day, about 0.5 to about 7.5 mg / kg / day, about 0.5 to about 5 mg / kg / day, about 0.5 to about 2.5 mg / kg / day, about 1 to about 20 mg / kg / day, about 1 to about 17.5 mg / kg / day, about 1 to about 15 mg / kg / day, about 1 to about 12.5 mg / kg / day, about 1 to about 10 mg / kg / day, about 1 to about 7.5 mg / kg / day, about 1 to about 5 mg / kg / day, about 1 to about 2.5 mg / kg / day, about 2.5 to about 20 mg / kg / day, about 2.5 to about 17.5 mg / kg / day, about 2.5 to about 15 mg / kg / day, about 2.5 to about 12.5 mg / kg / day, about 2.5 to about 10 mg / kg / day, about 2.5 to about 7.5 mg / kg / day, about 2.5 to about 5 mg / kg / day, about 5 to about 20 mg / kg / day, about 5 to about 17.5 mg / kg / day, about 5 to about 15 mg / kg / day, about 5 to about 12.5 mg / kg / day, about 5 to about 10 mg / kg / day, about 5 to about 7.5 mg / kg / day, about 7.5 to about 20 mg / kg / day, about 7.5 to about 17.5 mg / kg / day, about 7.5 to about 15 mg / kg / day, about 7.5 to about 12.5 mg / kg / day, about 7.5 to about 10 mg / kg / day, about 10 to about 20 mg / kg / day, about 10 to about 17.5 mg / kg / day, about 10  to about 15 mg / kg / day, or about 10 to about 12.5 mg / kg / day. The Tac may be administered at a dosage of about 0.01 to about 1 mg / kg / day. The Tac may be administered at a dosage of about 0.1 to about 0.3 mg / kg / day.

[0092] · Pimecrolimus

[0093] Pimecrolimus is approved as a 1%topical formulation and is FDA-approved for the treatment of mild to moderate atopic dermatitis. Its other uses include oral lichen planus, psoriasis on the face and intertriginous areas, vitiligo, lichen sclerosis of the vulva, and seborrheic dermatitis (see, e.g., Ayer J, Young HS. Pimecrolimus for psoriasis. Expert Opin Pharmacother. 2013 Apr; 14 (6) : 767-74) .

[0094] The CNI used in the methods described herein may be pimecrolimus. The pimecrolimus may be administered at any suitable dosage.

[0095] · Voclosporin

[0096] Voclosporin is a novel drug of the class and got FDA approval in 2021 in its oral form to be used with other immunosuppressants for the treatment of active lupus nephritis in adults (see, e.g., Rovin BH, et al., . Efficacy and safety of voclosporin versus placebo for lupus nephritis (AURORA 1) : a double-blind, randomised, multicentre, placebo-controlled, phase 3 trial. Lancet. 2021 May 29; 397 (10289) : 2070-2080; and Ponticelli C et al., . Old and New Calcineurin Inhibitors in Lupus Nephritis. J Clin Med. 2021 Oct 21; 10 (21) ) .

[0097] The CNI used in the methods described herein may be voclosporin. The voclosporin may be administered at any suitable dosage.

[0098] The voclosporin may be administered at a dosage of about 0.1 to about 200 mg / kg / day, about 0.1 to about 175 mg / kg / day, about 0.1 to about 150 mg / kg / day, about 0.1 to about 125 mg / kg / day, about 0.1 to about 100 mg / kg / day, about 0.1 to about 75 mg / kg / day, about 0.1 to about 50 mg / kg / day, about 0.1 to about 25 mg / kg / day, about 0.1 to about 12.5 mg / kg / day, about 0.1 to about 1 mg / kg / day, about 1 to about 200 mg / kg / day, about 1 to about 175 mg / kg / day, about 1 to about 150 mg / kg / day, about 1 to about 125 mg / kg / day, about 1 to about 100 mg / kg / day, about 1 to about 75 mg / kg / day, about 1 to about 50 mg / kg / day, about 1 to about 25 mg / kg / day, about 1 to about 12.5 mg / kg / day, 1 to about 10 mg / kg / day, 10 to about 200 mg / kg / day, about 10 to about 175 mg / kg / day, about 10 to about 150 mg / kg / day, about 10 to about 125 mg / kg / day, about 10 to about 100 mg / kg / day, about 10 to about 75 mg / kg / day, about 10 to about 50 mg / kg / day, about 10 to about 25 mg / kg / day, about 10 to about 12.5 mg / kg / day, about 12.5 to about 200 mg / kg / day, about  12.5 to about 175 mg / kg / day, about 12.5 to about 150 mg / kg / day, about 12.5 to about 125 mg / kg / day, about 12.5 to about 100 mg / kg / day, about 12.5 to about 75 mg / kg / day, about 12.5 to about 50 mg / kg / day, about 12.5 to about 25 mg / kg / day, about 15 to about 200 mg / kg / day, about 15 to about 175 mg / kg / day, about 15 to about 150 mg / kg / day, about 15 to about 125 mg / kg / day, about 15 to about 100 mg / kg / day, about 15 to about 75 mg / kg / day, about 15 to about 50 mg / kg / day, about 15 to about 25 mg / kg / day, about 20 to about 200 mg / kg / day, about 20 to about 175 mg / kg / day, about 20 to about 150 mg / kg / day, about 20 to about 125 mg / kg / day, about 20 to about 100 mg / kg / day, about 20 to about 75 mg / kg / day, about 20 to about 50 mg / kg / day, about 20 to about 25 mg / kg / day, about 25 to about 200 mg / kg / day, about 25 to about 175 mg / kg / day, about 25 to about 150 mg / kg / day, about 25 to about 125 mg / kg / day, about 25 to about 100 mg / kg / day, about 25 to about 75 mg / kg / day, about 25 to about 50 mg / kg / day, about 50 to about 200 mg / kg / day, about 50 to about 175 mg / kg / day, about 50 to about 150 mg / kg / day, about 50 to about 125 mg / kg / day, about 50 to about 100 mg / kg / day, about 50 to about 75 mg / kg / day, about 75 to about 200 mg / kg / day, about 75 to about 175 mg / kg / day, about 75 to about 150 mg / kg / day, about 75 to about 125 mg / kg / day, about 75 to about 100 mg / kg / day, about 100 to about 200 mg / kg / day, about 100 to about 175 mg / kg / day, about 100 to about 150 mg / kg / day, about 100 to about 125 mg / kg / day, about 125 to about 200 mg / kg / day, about 125 to about 175 mg / kg / day, about 125 to about 150 mg / kg / day, about 150 to about 200 mg / kg / day, or about 150 to about 175 mg / kg / day. The voclosporin may be administered at any suitable or recommended amount or dosage, e.g., about 27.3 mg administered to a human subject, twice a day.

[0099] Engineered Receptor

[0100] The present disclosure relates to methods of treating a disease or disorder, reducing immune clearance of modified immune cells, or increasing the in vivo infiltration of a modified immune cell into a tissue (e.g., a tumor tissue) in a subject, comprising administering to the subject an effective amount of modified immune cells and a CNI.

[0101] The modified immune cells may express a chimeric antigen receptor (CAR) . A chimeric antigen receptor (CAR) typically comprises an extracellular domain capable of binding to an antigen, and an intracellular domain comprising one or more intracellular signaling domains derived from signal transducing proteins. These intracellular signaling domains are typically different from the polypeptide from which the extracellular domain is derived. The extracellular  domain can be any proteinaceous molecule or part thereof that can specifically bind to a predetermined antigen. The extracellular domain may comprise an antibody or antigen binding fragment thereof. The intracellular signaling domain may be any oligopeptide or polypeptide domain known to function to transmit a signal causing activation or inhibition of a biological process in a cell, for example, activation of an immune cell such as an NK cell.

[0102] Chimeric antigen receptors (CARs) combine many facets of normal T cell or NK cell activation into a single protein. They link an extracellular antigen recognition domain to an intracellular signaling domain, which activates the T cell or NK cell when an antigen is bound. CARs typically have the following regions: an antigen binding domain, an extracellular hinge region, a transmembrane domain, and an intracellular domain. The intracellular region comprises an intracellular signaling domain or an intracellular signaling region.

[0103] A detailed review of CARs and CAR-expressing cells can be found in, e.g., J Exp Clin Cancer Res, 2022 Mar 31; 41 (1) : 119; Mol Cancer, 2023 Jan 30; 22 (1) : 20; and Br J Haematol, 2021 Apr; 193 (2) : 216-230. doi: 10.1111 / bjh. 17186. Epub 2020 Nov 20, each of which is incorporated by reference in its entirety. Exemplary structure of antigen receptors, including the hinge, the transmembrane domain, and the intracellular cell signaling domain, and methods for engineering and introducing such receptors into cells, are described, for example, in Chandran et al., "T cell receptor-based cancer immunotherapy: Emerging efficacy and pathways of resistance. " Immunological reviews 290.1 (2019) : 127-147; Cartellieri, Marc, et al., "Chimeric antigen receptor-engineered T cells for immunotherapy of cancer. " BioMed Research International 2010 (2010) ; and PCT publication No. WO2017173256A1; US2002 / 131960, US2013 / 287748, US2013 / 0149337, U.S. 6,451,995, U.S. 7,446,190, U.S. 8,252,592; each of which is incorporated herein by reference in its entirety.

[0104] CARs expressed on the modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) of the present disclosure may comprise an extracellular domain comprising at least one antigen binding domain that specifically binds at least one target antigen, a transmembrane region, and an intracellular signaling domain. The intracellular signaling domain may generate a signal that promotes an immune effector function of the CAR-containing cell, e.g., a CAR-NK cell. “Immune effector function or immune effector response” refers to function or response, e.g., of an immune effector cell, that enhances or promotes an immune attack of a target cell. For example, an immune effector function or response can refer to a property of an NK cell that promotes killing or the inhibition of  growth or proliferation, of a target cell. The intracellular signaling domain may generate a signal that promotes proliferation and / or survival of the CAR containing cell. The CAR may comprise one or more intracellular signaling domains. The signaling domain of a naturally occurring molecule can comprise the entire intracellular or cytoplasmic portion, or the entire native intracellular signaling domain, of the molecule, or a fragment or derivative thereof.

[0105] The intracellular signaling domain of a CAR may comprise a primary intracellular signaling domain. “Primary intracellular signaling domain” refers to cytoplasmic signaling sequence that acts in a stimulatory manner to induce immune effector functions. The primary intracellular signaling domain may contain a signaling motif known as Immunoreceptor Tyrosine-based Activation Motif, or ITAM. The primary intracellular signaling domain may comprise a functional signaling domain of a protein selected from the group consisting of CD3 zeta, CD3 gamma, CD3 delta, CD3 epsilon, common FcR gamma (FCER1G) , FcR beta (Fc Epsilon Rib) , CD79a, CD79b, FcgammaRIIa, DAP10, and DAP12. The primary intracellular signaling domain may comprise a nonfunctional or attenuated signaling domain of a protein selected from the group consisting of CD3 zeta, CD3 gamma, CD3 delta, CD3 epsilon, common FcR gamma (FCER1G) , FcR beta (Fc Epsilon Rib) , CD79a, CD79b, FcgammaRIIa, DAP10, and DAP12. The primary intracellular signaling domain may comprise a functional signaling domain of CD3 zeta.

[0106] The intracellular signaling domain of a CAR may comprise one or more (such as any of 1, 2, 3, or more) co-stimulatory signaling domains. “Co-stimulatory signaling domain” can be the intracellular portion of a co-stimulatory molecule. The term “co-stimulatory molecule” refers to a cognate binding partner on an immune cell (such as NK cell) that specifically binds with a co-stimulatory ligand, thereby mediating a co-stimulatory response by the immune cell, such as, but not limited to, proliferation and survival. Co-stimulatory molecules are cell surface molecules other than antigen receptors or their ligands that contribute to an efficient immune response. A co-stimulatory molecule can be represented in the following protein families: TNF receptor proteins, Immunoglobulin-like proteins, cytokine receptors, integrins, signaling lymphocytic activation molecules (SLAM proteins) , and activating NK cell receptors. Co-stimulatory molecules include, but are not limited to an MHC class I molecule, BTLA and a Toll ligand receptor, as well as OX40, DAP12, DAP10, CD27, CD28, CD5, ICAM-1, LFA-1 (CD11a / CD18) , ICOS (CD278) , and 4-1BB (CD137) . Further examples of such co-stimulatory molecules include GITR, BAFFR, HVEM (LIGHTR) , SLAMF7, NKp80 (KLRF1) , NKp44, NKp30, NKp46, CD160, CD19, CD4,  CD8alpha, CD8beta, IL-2R beta, IL-2R gamma, IL-7R alpha, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE / RANKL, DNAM1 (CD226) , SLAMF4 (CD244, 2B4) , CD84, CD96 (Tactile) , CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229) , CD160 (BY55) , PSGL1, CDIOO (SEMA4D) , CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108) , SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3) , BLAME (SLAMF8) , SELPLG (CD162) , LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG / Cbp, CD19a, and a ligand that specifically binds with CD83.

[0107] The CAR may comprise a single co-stimulatory signaling domain. The CAR may comprise two or more co-stimulatory signaling domains. The intracellular signaling domain may comprise a functional primary intracellular signaling domain and one or more co-stimulatory signaling domains. The one or more co-stimulatory signaling domains may be derived from one or more molecules selected from the group consisting of CD27, CD28, 4-1BB (i.e., CD137) , OX40, CD30, CD40, CD3, lymphocyte function-associated antigen-1 (LFA-1) , CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3 and ligands that specially bind to CD83. The co-stimulatory signaling domains may be derived from CD137.

[0108] The CAR may further comprise a DAP12 intracellular signaling domain, and the DAP12 intracellular signaling domain may be located at the C-terminus of the intracellular signaling domain. The intracellular signaling domain may comprise a functional primary intracellular signaling domain and one or more co-stimulatory signaling domains, and a DAP12 intracellular signaling domain. The intracellular signaling domain may comprise from N-terminus to the C-terminus as following: a CD137 co-stimulatory signaling domain, a CD3 zeta primary intracellular signaling domain, and a DAP12 intracellular signaling domain.

[0109] The antigen binding domain of a CAR may be an antibody or an antibody fragment, such as an scFv, a Fv, a Fab, a (Fab′) 2, a single domain antibody (sdAb) , or a VHH domain. The antigen binding domain of a CAR may comprise a ligand or an extracellular portion of a receptor that specifically binds to a target antigen. The CAR may be a monospecific, bispecific or multispecific CAR. The antigen binding domain of a CAR may specifically bind a single target antigen. The antigen binding domain of a CAR may bind two or more target antigens.

[0110] The target antigen may be selected from a tumor antigen, an autoimmune disease antigen, an inflammatory disease antigen, a neuronal disorder antigen, HIV / AIDS, a diabetes  antigen, a cardiovascular disease antigen, and an infectious disease antigen (including a viral antigen, a protozoan antigen, a bacterial antigen, and an allergen) , or combinations thereof.

[0111] The target antigen may be selected from the group consisting of BCMA, CLL1, CD4, GPC3, GPRC5D, GU2CYC, CD19, MUC16, MUC1, CAIX, CEA, CD8, CD7, CD10, CD20, CD22, CD30, CD33, CD34, CD38, CD41, CD44, CD49f, CD56, CD74, CD133, CD138, EGP-2, EGP-40, EpCAM, ERBB2, ERBB3, ERBB4, FBP, fetal acetylcholine receptor, folate receptor-α, GD2, GD3, HER-2, hTERT, IL-13R-α2, κ-light chain, KDR, LeY, L1 cell adhesion molecule, MAGE-A1, mesothelin, MAGEA3, p53, MART1, GP100, proteinase-3 (PR3) , tyrosinase, survivin, hTERT, EphA2, NY-ESO-1, h5T4, PSCA, PSMA, ROR1, TAG-72, VEGF-R2, WT-1, CD123, CD44V6, NKCS1, IGF1R, EGFR, EGFR-VIII, Claudin 18.2, Claudin 6, NKG2D, Delta-like 3 (DLL3) , CD70, CS-1, c-Met, Glycolipid F77, PD-L1, and PD-L2, and other target antigens with clinical significance, and combinations thereof.

[0112] The target antigen may be a tumor antigen. The tumor antigen may comprise one or more antigenic cancer epitopes associated with a malignant tumor. Malignant tumors express a number of proteins that can serve as target antigens for an immune attack. These molecules include but are not limited to tissue-specific antigens such as MART-1, tyrosinase and gp100 in melanoma and prostatic acid phosphatase (PAP) and prostate-specific antigen (PSA) in prostate cancer. Other target molecules belong to the group of transformation-related molecules such as the oncogene HER2 / Neu / ErbB-2. Yet another group of target antigens are onco-fetal antigens such as carcinoembryonic antigen (CEA) . In B-cell lymphoma the tumor-specific idiotype immunoglobulin constitutes a truly tumor-specific immunoglobulin antigen that is unique to the individual tumor. B cell differentiation antigens such as CD19, CD20 and CD37 are other candidates for target antigens in B-cell lymphoma.

[0113] The tumor antigen may be a tumor-specific antigen (TSA) or a tumor-associated antigen (TAA) . A TSA is unique to tumor cells and does not occur on other cells in the body. A TAA associated antigen is not unique to a tumor cell, and instead is also expressed on a normal cell under conditions that fail to induce a state of immunologic tolerance to the antigen. The expression of the antigen on the tumor can occur under conditions that enable the immune system to respond to the antigen. TAAs can be antigens that are expressed on normal cells during fetal development, when the immune system is immature, and unable to respond or they can be antigens  that are normally present at extremely low levels on normal cells, but which are expressed at much higher levels on tumor cells.

[0114] The tumor antigen may be derived from an intracellular protein of tumor cells. The tumor antigen may be expressed on the surface of tumor cells. Many TCRs specific for tumor antigens (including tumor-associated antigens) have been described, including, for example, NY-ESO-1 cancer-testis antigen, the p53 tumor suppressor antigens, TCRs for tumor antigens in melanoma (e.g., MARTI, gp 100) , leukemia (e.g., WT1, minor histocompatibility antigens) , and breast cancer (e.g., HER2, NY-BR1) .

[0115] The target antigen may be an autoimmune disease antigen. The autoimmune disease antigen, as used herein, refers to a self antigen or an antigen that cross reacts with a self antigen to which the body produces a dysfunctional immune response that causes disease. The autoimmune disease antigen can be a nucleic acid, protein, or and / or polypeptide encoding the autoimmune disease antigen. The autoimmune disease antigen can be associated with any autoimmune disease.

[0116] Many CARs targeting different target antigens have been widely disclosed in the field, such as CD19 CARs or BCMA CARs. The extracellular antigen-binding domain of CD19 CARs can be or include the CD19 binding fragment (e.g., FMC63, SJ25C1, or those disclosed in different patents or patent publications such as PCT Publication No. WO 2022 / 012683, etc) . BCMA CARs also have been well described, related patents include but not limited to PCT Publication Nos. WO 2016 / 014789, WO 2016 / 014565, WO 2013 / 154760, and WO 2018 / 028647, etc.

[0117] The transmembrane region of a CAR may comprise or be chosen from the transmembrane region of an alpha, beta or zeta chain of a T-cell receptor, CD28, CD3 epsilon, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154, KIRDS2, OX40, CD2, CD27, LFA-1 (CD11a, CD18) , ICOS (CD278) , 4-1BB (CD137) , GITR, CD40, BAFFR, HVEM (LIGHTR) , SLAMF7, NKp80 (KLRF1) , CD160, CD19, IL-2R beta, IL-2R gamma, IL-7R a, ITGA1, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, TNFR2, DNAM1 (CD226) , SLAMF4 (CD244, 2B4) , CD84, CD96 (Tactile) , CEACAM1, CRT AM, Ly9 (CD229) , CD160 (BY55) , PSGL1, CDIOO (SEMA4D) , SLAMF6 (NTB-A, Ly108) , SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3) ,  BLAME (SLAMF8) , SELPLG (CD162) , LTBR, PAG / Cbp, NKp44, NKp30, NKp46, NKG2D, and / or NKG2C. The transmembrane region may comprise a transmembrane region of CD8α.

[0118] The extracellular domain may be connected to the transmembrane region by a hinge region. The hinge region may comprise a hinge region of CD8α.

[0119] The CAR may comprise a signal peptide (SP) , such as a CD8α signal peptide.

[0120] The CAR may be a BCMA CAR. A wide variety of antigen binding domain sequences can be used as the antigen binding domain of the CAR. The CAR may specifically bind to BCMA-positive tumor cells.

[0121] The CAR may be a single CAR, dual CAR, tandem CAR or split CAR.

[0122] Modified Immune Cells

[0123] The present disclosure relates to methods of treating a disease or disorder, reducing immune clearance of modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) , or increasing the in vivo infiltration of a modified immune cell into a tissue (e.g., a tumor tissue) in a subject, comprising administering to the subject an effective amount of CNI (e.g., CsA or Tac) , wherein the subject is or will be under the treatment of modified immune cells.

[0124] The modified immune cells may comprise a CAR described herein. The modified immune cells can be NK cell, NKT, peripheral blood mononuclear cell (PBMC) , hematopoietic stem cell, pluripotent stem cell, an embryonic stem cell, or a combination thereof.

[0125] The modified cell may comprise one or more polynucleotides encoding a CAR described herein. Accordingly, such modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) possess the specificity directed by the engineered receptor (e.g., CAR) that is expressed therein. For example, a modified cell of the present disclosure comprising a CAR possesses specificity for one or more antigen (s) on a target cell (e.g., one or more tumor antigen (s) on a cancer cell) .

[0126] The modified immune cells may be NK cells expressing a CAR (i.e., CAR-NK cells) . Human natural killer cells (NK cells) play an important role in innate immune defense against malignant lymphoma cells, and thus are suitable for adoptive immune therapy (i.e., adoptive cellular immunotherapy) . The CAR-NK cells may express an armor protein. The armor protein may be secreted IL-15 (e.g., wild type IL-15, preprotein IL-15 or mutant IL-15, see, e.g., PCT Publication No. WO2023280307A1. The entire content of which is incorporated herein by reference) . The CAR may be fused with secreted IL-15 by P2A.

[0127] NK cells are part of the innate immune system, providing the first line of defense against pathogens and cancer cells. They produce cytokines and mediate cytotoxicity without the need for prior sensitization and have the ability to interact with, and activate other immune cells. NK cells for immunotherapy can be generated from multiple sources, such as expanded autologous or allogeneic peripheral blood, umbilical cord blood, hematopoietic stem cells, induced pluripotent stem cells, as well as cell lines.

[0128] NK cells activation and effector function is a complex process as it depends upon the integration of signals from two distinct types of receptors-activating and inhibitory receptors. Normal healthy cells express MHC class I molecules on their surface, which act as ligands for inhibitory receptors and contribute to self-tolerance of NK cells. Cellular stress associated with viral infection or tumor development such as DNA damage, senescence or tumor suppressor genes upregulate ligands for activating receptors. This results in shift of balance to NK cells activation. Transmembrane and cytoplasmic stimulatory / activator molecules in NK cells can affect NK cell differentiation pathways, metabolic cycles, apoptosis as well as activation induced cell death.

[0129] The modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) may be autologous cells, syngeneic cells, allogeneic cells, or xenogeneic cells with respect to the individual receiving them.

[0130] The modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) described herein may be eukaryotic cells, e.g., mammalian cells. The modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) may be human cells. The modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) may be equine, bovine, murine, ovine, canine, or feline cells.

[0131] The modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) may be allogeneic cells obtained from a donor (e.g., a human) to be administered to the human subject receiving them. The modified immune cells may be modified allogeneic NK cells (e.g., allogeneic CAR-NK cells) obtained from a donor (e.g., a human) to be administered to the human subject receiving them.

[0132] The modified immune cells may be modified CAR-NK cells. The expression of CAR by the modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) can be determined by flow cytometry (FACS) . The modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) can have a CAR positive rate of more than 5%, more than 10%, more than 15%, more than 20%, more than 25%, more than 30%, more than 35%, more than 40%, more than 45%, more than 50%, more than 55%, more than 60%, more than 65%, more than 70%, more than 75%, more than 80%, or more than 90%. The modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) may have a CAR positive rate of less than 5%, less than 10%, less than 15%,  less than 20%, less than 25%, less than 30%, less than 35%, less than 40%, less than 45%, less than 50%, less than 55%, less than 60%, less than 65%, less than 70%, less than 75%, less than 80%, or less than 90%. The modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) may have a CAR positive rate of 70%-80%, 70%-90%, 75%-85%, or 75%-90%.

[0133] The purity of the modified immune cells can be determined by flow cytometry (FACS) . The modified immune cells may have a purity of more than 5%, more than 10%, more than 15%, more than 20%, more than 25%, more than 30%, more than 35%, more than 40%, more than 45%, more than 50%, more than 55%, more than 60%, more than 65%, more than 70%, more than 75%, more than 80%, or more than 90%. The modified immune cells may have a purity of less than 5%, less than 10%, less than 15%, less than 20%, less than 25%, less than 30%, less than 35%, less than 40%, less than 45%, less than 50%, less than 55%, less than 60%, less than 65%, less than 70%, less than 75%, less than 80%, or less than 90%. The modified immune cells may have a purity of 90%-100%, 95%-100%, 98%-100%, or 98%-99%.

[0134] The modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) may not comprise any modification that renders the cells resistant to CNI (e.g., CsA or Tac) . The modification that renders the cells resistant to CNI may be gene-editing or knockout of FKBP12 or PPIA gene. The modification that renders the cells resistant to CNI may be overexpression of at least one miRNA of miR-17-92 cluster or paralogs thereof or inactivation of at least one miR-17-92 cluster target gene.

[0135] Allogeneic Cell or Allogeneic Cells

[0136] The modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) in the methods described herein may be allogeneic cells (or allogenic cells) , the terms “allogeneic cells” , “allogeneic immune cells” or “allogeneic engineered immune cells” are used interchangeably herein to refer to the cells are obtained from an allogeneic donor. The allogeneic cells may be NK cells or CAR-NK cells.

[0137] The allogeneic CAR-NK cells described herein may not have genetic modifications that affect its HLA complexes, including, for example, B2M mutation (e.g., knockout of B2M gene) , or mutations to the HLA alleles. Compared to allogeneic CAR-NK cells having MHC or B2M mutations (e.g., knockout) , the allogeneic CAR-NK cells described herein may have reduced recognition by host NK cells, for example, reduces proliferation or killing by host NK cells by about or at least 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%. Compared to the administration of allogeneic CAR-NK cells without the CNI, the  administration of the allogeneic CAR-NK cells with the CNI described herein may do not elicit killing by host T cells.

[0138] Methods of Treatment

[0139] In one aspect, the disclosure provides methods of treating a disease or disorder in a subject, the method comprising administering an effective amount of a calcineurin inhibitor (CNI) to the subject in need thereof, wherein the subject is or will be under the treatment of modified immune cells.

[0140] In one aspect, the disclosure provides methods of increasing the in vivo infiltration of a modified immune cell into a tissue in a subject, comprising administering an effective amount of a calcineurin inhibitor (CNI) to the subject.

[0141] The term “effective amount” as used herein means an amount effective, at dosages and for periods of time necessary to achieve the desired results.

[0142] The disease or disorder may be a cancer, an autoimmune disease, or an infection.

[0143] In another aspect, the present disclosure provides a method for treating cancer comprising administering an effective amount of modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) described herein and a calcineurin inhibitor (CNI) described herein to a subject in need thereof. Examples of cancer that can be treated include, but are not limited to, leukemias including chronic lymphocytic leukemia, chronic myelogenous leukemia, acute myelogenous leukemia, acute lymphoblastic leukemia, and T cell and B cell leukemias, lymphomas (Hodgkin's and non-Hodgkins) , lymphoproliferative disorders, plasmacytomas, histiocytomas, melanomas, adenomas, sarcomas, carcinomas of solid tissues, hypoxic tumors, squamous cell carcinomas, genitourinary cancers such as cervical and bladder cancer, hematopoietic cancers, head and neck cancers, and nervous system cancers.

[0144] The disclosure further includes the use of the modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) and CNI (e.g., CsA or Tac) described herein in the manufacture of a medicament or pharmaceutical composition to modulate an immune response or to treat disease or disorder as described hereinabove.

[0145] The disclosure further includes the use of the CNI (e.g., CsA or Tac) described herein in the manufacture of a medicament or pharmaceutical composition for use in (a) reducing immune clearance of modified immune cells in a subject; (b) increasing the in vivo infiltration of a modified  immune cell into a tissue in a subject; and / or (c) preventing and / or reversing modified immune cells in a subject exhaustion in a subject; wherein the subject is or will be under the treatment of modified immune cells described herein. The disclosure further includes the use of the CNI (e.g., CsA or Tac) described herein in the manufacture of a medicament or pharmaceutical composition for use in preventing or mitigating Host-versus-Graft (HvG) reactions resulting from the administration to a patient with cancer of modified immune cells described herein, wherein the modified immune cells are for treating said cancer or said autoimmune disease in said patients, wherein the HvG reactions are host T cell-mediated. The modified allogeneic cells may be isolated from a donor for being administered to a subject. The modified immune cells may be a modified natural killer (NK) cell. The modified NK cell may be a CAR-NK cell that expresses a chimeric antigen receptor (CAR) .

[0146] The CNI (e.g., CsA or Tac) described herein can increase the in vivo infiltration of the modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) into a tissue. The tissue may be a tumor tissue. One of the limitations of cell therapies is the low ability of the cells to infiltrate into tumor tissues. The CNI (e.g., CsA or Tac) described herein may increase the infiltration of the modified immune cells described herein (e.g., CAR-NK cells) into tumor tissues in vivo. The infiltration of the modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) into the tissue may be determined by the number of the modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) in the tumor tissue or the tumor area. The tissue may be organs or tissues affected by autoimmune diseases, such as the kidneys of patients with Lupus nephritis, which is a type of kidney disease caused by systemic lupus erythematosus link (SLE or lupus) . The CNI (e.g., CsA or Tac) described herein may increase the infiltration of the modified immune cells described herein (e.g., CAR-NK cells) into these organs or tissues in vivo. Compared to the modified immune cells without the administration of the CNI (e.g., CsA or Tac) , the tissue infiltration of the modified immune cells (e.g., the number of the modified immune cells in the tumor tissue or the tumor area) may be increased by about or at least 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, or 90%. The modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) described herein may have an increased tissue infiltration of about 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 or more folds, compared to the tissue infiltration of the modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) without the administration of the CNI (e.g., CsA or Tac) .

[0147] The increase tissue infiltration (e.g., tumor tissue infiltration, kidneys of patients with Lupus nephritis infiltration) ability of the modified immune cells described herein may be due to the increased expression of tumor infiltration marker CX3CR1 on the modified immune cells and the increased interactions between CX3CL1 and CX3CR1. The increase tissue infiltration (e.g., tumor tissue infiltration, kidneys of patients with Lupus nephritis infiltration) ability of the modified immune cells described herein may be via the interaction between CX3CR1 expressed on the modified immune cell and CX3CL1 expressed on the cells in the tissue (e.g., T cells, NK cells and macrophages in the tumor tissue, T cells, NK cells and macrophages in the kidneys of patients with Lupus nephritis infiltration) .

[0148] CX3CL1 is a transmembrane protein from which a soluble form can be generated by proteolytic shedding. Membranal and soluble forms of CX3CL1 exhibit different functions, although both bind to the CX3CR1 chemokine receptor. The CX3CL1-CX3CR1 axis mediates the adhesion of leukocytes and is also involved in cell survival and recruitment of immune cell subpopulations. The function of CX3CL1 is finely tuned by cytokines and transcription factors regulating its expression and post-translational modifications. On homeostasis, the CX3CL1-CX3CR1 axis participates in the removal of damaged neurons and neurogenesis, and it is also involved on several pathological contexts. The CX3CL1-CX3CR1 axis induces several cellular responses relevant to cancer such as proliferation, migration, invasion and apoptosis resistance. The CX3CL1-CX3CR1 axis is also involved in a number of autoimmune diseases, including systemic lupus erythematosus (SLE) , kidney disease, and rheumatoid arthritis (RA) . CX3CL1 is also produced by renal tubular epithelium, CX3CR1 and its ligand are highly regulated in human kidney diseases such as IgA nephritis, systemic lupus erythematosus, and inflammatory conditions such as transplant rejection (von Vietinghoff S, Kurts C. Regulation and function of CX3CR1 and its ligand CX3CL1 in kidney disease. Cell Tissue Res. 2021 Aug; 385 (2) : 335-344) .

[0149] Compared to the modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) without the administration of the CNI (e.g., CsA or Tac) , the expression of CX3CR1 on the modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) may be increased by about or at least 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, or 90%. The expression of CX3CR1 on the modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) may be increased by about or at least 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 or more folds, compared to the expression of  CX3CR1 on the modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) without the administration of the CNI (e.g., CsA or Tac) .

[0150] The administration of the CNI (e.g., CsA or Tac) may promote the enrichment of the modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) in the bone marrow of the subject. The subject in the methods described herein may have a bone-marrow-related disease or disorder, or a hematological cancer, e.g., a lymphoma or a leukemia. The subject may have a disease or disorder selected from acute lymphoblastic leukemia, acute myeloid leukemia, chronic lymphocytic leukemia, chronic myelogenous leukemia, Hodgkin lymphoma, non-Hodgkin lymphoma, Waldenstrom macroglobulinemia, follicular lymphoma, B-cell lymphoma, cutaneous T-cell lymphoma, multiple myeloma, plasmacytoma, and amyloidosis. The subject may have a bone-marrow-related disease. The subject may have a bone-marrow-related autoimmune disease, e.g., a B-cell regulated autoimmune disease. The subject may have systemic lupus erythematosus (SLE) , rheumatoid arthritis, Wegener's disease, inflammatory bowel disease, ulcerative colitis, idiopathic thrombocytopenic purpura (ITP) , thrombotic throbocytopenic purpura (TTP) , autoimmune thrombocytopenia, multiple sclerosis (MS) , Systemic sclerosis / scleroderma (SSc) , Idiopathic inflammatory myopathy (IIM) , antiphospholipid syndrome (APS) , psoriasis, IgA nephropathy, IgM polyneuropathies, myasthenia gravis (MG) , ANCA (Anti-neutrophil cytoplastic antibodies) associated vasculitis, diabetes mellitus, Reynaud's syndrome, Sjorgen's syndrome, Neuromyelitis Optica (NMO) , and glomerulonephritis, myelin oligodendrocyte glycoprotein-IgG associated disorders (MOGAD) .

[0151] Compared to the modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) without the administration of the CNI (e.g., CsA or Tac) , the distribution of the modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) in the bone marrow (e.g., the number of the modified immune cells in the bone marrow of the subject) may be increased by about or at least 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, or 90%. The distribution of the modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) in the bone marrow (e.g., the number of the modified immune cells in the bone marrow of the subject) may be increased by about or at least 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 or more folds, compared to the distribution of the modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) in the bone marrow (e.g., the number of the modified immune cells in the bone marrow of the subject) without the administration of the CNI (e.g., CsA or Tac) .

[0152] The administration of the CNI (e.g., CsA or Tac) can promote the expansion of the modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) . The expansion of the modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) may be increased by more than 5%, more than 10%, more than 15%, more than 20%, more than 25%, more than 30%, more than 35%, more than 40%, more than 45%, more than 50%, more than 55%, more than 60%, more than 65%, more than 70%, more than 75%, more than 80%, or more than 90%compared to cells without the administration of the CNI (e.g., CsA or Tac) . The expansion of the modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) may be increased by about 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 or more folds compared to cells without the administration of the CNI (e.g., CsA or Tac) . Cell expansion or proliferation can be measured by an in vitro cell proliferation assay. Comparing to cells without the administration of the CNI (e.g., CsA or Tac) , the modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) described herein may have a cell number that is higher by more than 5%, more than 10%, more than 15%, more than 20%, more than 25%, more than 30%, more than 35%, more than 40%, more than 45%, more than 50%, more than 55%, more than 60%, more than 65%, more than 70%, more than 75%, more than 80%, or more than 90%. Comparing to a cells without the administration of the CNI (e.g., CsA or Tac) , the modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) described herein may have a cell number that is higher by less than 5%, less than 10%, less than 15%, less than 20%, less than 25%, less than 30%, less than 35%, less than 40%, less than 45%, less than 50%, less than 55%, less than 60%, less than 65%, less than 70%, less than 75%, less than 80%, or less than 90%.

[0153] The modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) can kill tumor cells. The cytotoxicity of the modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) against tumor cells can be determined by an in vitro long-term cytotoxicity assay. The effector cell: target cell (E: T) ratio can be about 1: 10, 1: 5, 1: 4.5, 1: 4, 1: 3.5, 1: 3, 1: 2.5, 1: 2, 1: 1, 2: 1, 2.5: 1, 3: 1, 3.5: 1, 4: 1, 4.5: 1, 5: 1, or 10: 1. The E: T ratio can be 1: 4. The modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) may have a cytotoxicity of more than 5%, more than 10%, more than 15%, more than 20%, more than 30%, more than 40%, more than 50%, more than 60%, more than 70%, more than 80%, or more than 90%, after 1 round, 2 rounds, 3 rounds, 4 rounds, or 5 rounds of stimulation in a re-challenge assay. The modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) may have a cytotoxicity of less than 5%, less than 10%, less than 15%, less than 20%, less than 30%, less than 40%, less than 50%, less than 60%, less than 70%, less than 80%, or less than 90%, after 1 round, 2 rounds, 3 rounds, 4 rounds, or 5 rounds of stimulation in a re-challenge assay. The modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) may have a  cytotoxicity of 10-100%, 10%-50%, 20-100%, 20-60%, 20-40%, 30-70%, 40-80%, 50-90%, 70-100%, 80-100%, or 90-100%, after 1 round, 2 rounds, 3 rounds, 4 rounds, or 5 rounds of stimulation in a re-challenge assay. Comparing to the cytotoxicity of the modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) without the administration of the CNI (e.g., CsA or Tac) , the cytotoxicity of the modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) may increase by more than 5%, more than 10%, more than 15%, more than 20%, more than 30%, more than 40%, more than 50%, more than 60%, more than 70%, more than 80%, more than 90%, more than 100%, more than 150%, more than 200%, more than 250%, more than 300%, more than 400%, more than 500%, more than 600%, more than 700%, more than 800%, more than 900%, or more than 10, 00%, after 1 round, 2 rounds, 3 rounds, 4 rounds, or 5 rounds of stimulation in a re-challenge assay.

[0154] In one aspect, the disclosure provides methods of reducing immune clearance of modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) in a subject, comprising administering an effective amount of the modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) and a calcineurin inhibitor (CNI (e.g., CsA or Tac) ) to the subject.

[0155] The administration of the CNI (e.g., CsA or Tac) may protect the modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) described herein from immune clearance (e.g., host T cell-mediated cytotoxicity or host immune cell-mediated cytotoxicity) . The T cell-or immune cell-mediated killing of the modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) may be decreased by more than 5%, more than 10%, more than 15%, more than 20%, more than 25%, more than 30%, more than 35%, more than 40%, more than 45%, more than 50%, more than 55%, more than 60%, more than 65%, more than 70%, more than 75%, more than 80%, or more than 90%compared to the cytotoxicity without the administration of the CNI (e.g., CsA or Tac) . The T cell-or immune cell-mediated killing of the modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) may be decreased by about 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 or more folds compared to cells without the administration of the CNI (e.g., CsA or Tac) .

[0156] The modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) and / or the CNI (e.g., CsA or Tac) can also be used in experimental models, for example, to further study and elucidate the function of the cells.

[0157] The modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) and / or the CNI (e.g., CsA or Tac) can be administered via any suitable method. One or more of the modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) and / or the CNI (e.g., CsA or Tac) described herein can be administered to a subject  in a single, unified form, such as an intravenous injection, or in multiple forms, for example, as multiple intravenous infusions or injections, or subcutaneous injections. The modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) and / or the CNI (e.g., CsA or Tac) can be administered via different methods. The modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) can be administered via one or more injections and the CNI (e.g., CsA or Tac) can be administered via separate injections or orally, or a combination thereof (e.g., the CNI (e.g., CsA or Tac) is injected during the time the subject is hospitalized and administered orally after the subject is discharged from the hospital) .

[0158] In some cases, the modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) can expand within a subject's body, in vivo, after administration to a subject. In some cases, the modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) have been expanded in vitro before administered to the subject. The modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) can be frozen to provide cells for multiple treatments with the same cell preparation. The modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) of the disclosure, and pharmaceutical compositions comprising the same and any additional therapeutic agent (e.g., the CNI (e.g., CsA or Tac) ) , can be packaged as a kit. A kit can include instructions (e.g., written instructions) on the use of the modified cells and the CNI (e.g., CsA or Tac) , and compositions comprising the same.

[0159] In one aspect, the present disclosure provides a method of treatment that comprises administering to a subject a therapeutically-effective amount of the modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) described herein and the CNI (e.g., CsA or Tac) described herein. The therapeutically-effective amount of the modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) may be administered for a single time. The therapeutically-effective amount of the modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) may be administered for multiple times (such as any of 2, 3, 4, 5, 6, or more times) . The CNI (e.g., CsA or Tac) may be administered for at least 1 week, 2 weeks, 3 weeks, 1 month, 2 months, 3 months, 4 months, 5 months, 6 months, or 1 year. The optimal dosage and treatment regime for a particular patient can readily be determined by one skilled in the art of medicine by monitoring the patient for signs of disease and adjusting the treatment accordingly.

[0160] The CNI (e.g., CsA or Tac) may be administered prior to, during, and / or after the administration of the modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) in the methods described herein. For example, the CNI (e.g., CsA or Tac) can be administered prior to the administration of the modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) to provide an immunosuppressed environment in the subject for the enhanced efficacy of the modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) . During the  administration of the modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) , the CNI (e.g., CsA or Tac) can continue to be injected throughout the course of administration of the modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) . After the administration of the modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) , the CNI (e.g., CsA or Tac) can continued to be administered for the maintenance of the immunosuppressed condition in the subject to reduce, e.g., HvG reactions. The frequency and dosages of the CNI (e.g., CsA or Tac) may vary depending on attributes particular to the disease or disorder and / or patient and / or other treatments. For example, the CNI (e.g., CsA or Tac) may be administered every day, every two days, every three days, every four days, every five days, every six days, every week, every two weeks or more.

[0161] The CNI (e.g., CsA or Tac) may be administered prior to the administration of the modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) in the methods described herein. The CNI (e.g., CsA or Tac) may be administered at least 1 day, 2 days, 3 days, 4 days, 5 days, 6 days, 7 days, 8 days, 9 days, 10 days, 11 days, 12 days, 13 days, 14 days, 15 days, 16 days, 17 days, 18 days, 19 days, 20 days, 21 days, 22 days, 23 days, 24 days, 25 days, 26 days, 27 days, 28 days, 29 days, 30 days or more prior to the administration of the modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) . The CNI may be administered 7 days prior to the administration of the modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) .

[0162] The CNI (e.g., CsA or Tac) may be administered during and throughout the administration of the modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) . The CNI (e.g., CsA or Tac) may be administered concurrently with the modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) in the methods described herein.

[0163] The CNI (e.g., CsA or Tac) may be administered after the administration of the modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) . The CNI (e.g., CsA or Tac) may be administered about 1 day, 2 days, 3 days, 4 days, 5 days, 6 days, 7 days, 8 days, 9 days, 10 days, 11 days, 12 days, 13 days, 14 days, 15 days or more after the administration of the modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) .

[0164] The CNI (e.g., CsA or Tac) may be administered for about or at least 1 day, 2 days, 3 days, 4 days, 5 days, 6 days, 7 days, 8 days, 9 days, 10 days, 11 days, 12 days, 13 days, 14 days, 15 days, 20 days, 1 month, or 2 months after the administration of the modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) . The CNI (e.g., CsA or Tac) may be administered for about at least 15 days, at least 20 days, at least 1 month, 2 months or 3 months after the administration of the modified  immune cells (e.g., CAR-NK cells) . The CNI (e.g., CsA or Tac) may be administered for about 20 days after the administration of the modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) .

[0165] The CNI (e.g., CsA or Tac) may be administered for about or at least 1 day, 2 days, 3 days, 4 days, 5 days, 6 days, 7 days, 8 days, 9 days, 10 days, 11 days, 12 days, 13 days, 14 days, 15 days, 16 days, 17 days, 18 days, 19 days, 20 days, 21 days, 22 days, 23 days, 24 days, 25 days, 26 days, 27 days, 28 days, 29 days, 30 days, 1 month, 2 months, or 3 months. The CNI (e.g., CsA or Tac) may be administered for 27 days.

[0166] In the methods described herein, a lymphodepletion may have been performed in the subject prior to the administration of CNI (e.g., CsA or Tac) . In the methods described herein, a lymphodepletion may be performed in the subject after the administration of CNI (e.g., CsA or Tac) .

[0167] In the methods described herein, a lymphodepletion may have been performed in the subject prior to the administration of the modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) . The lymphodepletion may have been performed in the subject at least 1 day, 2 days, 3 days, 4 days, 5 days, 6 days, 7 days, 8 days, 9 days, 10 days, 11 days, 12 days, 13 days, 14 days, 15 days, 16 days, 17 days, 18 days, 19 days, 20 days, 21 days, 22 days, 23 days, 24 days, 25 days, 26 days, 27 days, 28 days, 29 days, 30 days or more prior to the administration of the modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) . The lymphodepletion may have been performed in the subject about 3 or 4 days prior to the administration of the modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) . The lymphodepletion may be performed for multiple times (such as any of 2, 3, 4, 5, 6, or more times) . The lymphodepletion may be performed for 3 times.

[0168] The lymphodepletion may have been performed in the subject after the administration of the modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) . The lymphodepletion may have been performed in the subject about or at least 1 day, 2 days, 3 days, 4 days, 5 days, 6 days, 7 days, 8 days, 9 days, or 10 days after the administration of the modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) .

[0169] The CNI may be administered 7 days prior to the administration of the modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) . The CNI (e.g., CsA or Tac) may be administered for 27 days. The lymphodepletion may have been performed in the subject about 3 or 4 days prior to the administration of the modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) . The lymphodepletion may be performed for 3 times.

[0170] In the methods described herein, the CNI (e.g., CsA or Tac) may be administered by oral administration after the subject is discharged from the hospital.

[0171] In the methods described herein, the blood concentration of the CNI (e.g., CsA or Tac) may be monitored throughout the course of the treatment.

[0172] The trough blood concentration of CsA may be about 10-500 ng / ml, 10-400 ng / ml, 10-300 ng / ml, 10-200 ng / ml, 10-100 ng / ml, 10-50 ng  / ml, 100-500 ng / ml, 100-400 ng / ml, 100-300 ng / ml, 100-200 ng / ml, 200-500 ng / ml, 200-400 ng / ml, 200-300 ng / ml. The trough blood concentration of CsA at the beginning of the treatment (e.g., prior, during or immediately after the administration of the modified immune cells) may be about 100-300 ng / ml. The trough blood concentration of CsA at a later time point of the treatment treatment (e.g., at least 1, 2, 3, or 4 week (s) after the administration of the modified immune cells) may be about less than 300ng / ml, less than 200 ng / ml, less than 100 ng / ml, less than 50 ng / ml or less than 10 ng / ml.

[0173] The trough blood concentration of Tac may be about 1-50 ng / ml, 1-40 ng / ml, 1-30 ng / ml, 1-20 ng / ml, 1-10 ng / ml, 1-5 ng  / ml, 5-50 ng / ml, 5-40 ng / ml, 5-30 ng / ml, 5-20 ng / ml, or 5-10 ng / ml. The trough blood concentration of CsA at the beginning of the treatment (e.g., prior, during or immediately after the administration of the modified immune cells) may be about 5-15 ng / ml. The trough blood concentration of CsA at a later time point of the treatment treatment (e.g., at least 1, 2, 3, or 4 week (s) after the administration of the modified immune cells) may be about less than 30ng / ml, less than 20 ng / ml, less than 10 ng / ml, less than 5 ng / ml or less than 1 ng / ml.

[0174] Also provided herein are methods of enhancing degranulation of a modified immune cell (e.g., CAR-NK cells) in a subject, the method comprising administering an effective amount of a calcineurin inhibitor (CNI) to the subject, wherein the subject is or will be under the treatment of modified immune cells.

[0175] NK cells kill by a mechanism involving the release of small cytolytic granules containing granzyme B and perforin that induce cell death in the target cell. Although NK cell numbers can be enumerated by immunophenotyping on the flow cytometer, an important limitation in the study of NK cells is the lack of availability of high throughput assays for the detection of the functional activity of NK cells.

[0176] During degranulation, cytolytic granules in NK cells are released and the lysosome-associated membrane protein-1 (LAMP-1, CD107a) which is present on cytolytic granules surface is transported to the cell surface and becomes accessible for antibody binding. This  allows identification of activated NK cells, making it an attractive biomarker for assessing the integrity of the granule exocytosis mechanism.

[0177] The administration of the CNI may enhance the degranulation of the modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) in the methods described herein. The degranulation may be enhanced by about or at least 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, or about or at least 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 folds.

[0178] The administration of the CNI may increase the expression of CD107a on the modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) in the methods described herein. The expression of CD107a on the modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) may be increased by about or at least 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, or about or at least 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 folds.

[0179] The modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) and / or the CNI (e.g., CsA or Tac) described herein can be administered before, during, or after the occurrence of a disease or condition, and the timing of administering the modified cells can vary. For example, the modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) and / or the CNI (e.g., CsA or Tac) can be used as a prophylactic and can be administered continuously to subjects with a propensity to conditions or diseases in order to lessen a likelihood of the occurrence of the disease or condition. The modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) and / or the CNI (e.g., CsA or Tac) can be administered to a subject during or as soon as possible after the onset of the symptoms. The administration of the modified cells can be initiated immediately within the onset of symptoms, within the first 3 hours of the onset of the symptoms, within the first 6 hours of the onset of the symptoms, within the first 24 hours of the onset of the symptoms, within 48 hours of the onset of the symptoms, or within any period of time from the onset of symptoms. The initial administration can be via any route practical (e.g., intravenous infusions or injections) , such as by any route described herein using any formulation described herein. The administration of the modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) and / or the CNI (e.g., CsA or Tac) of the disclosure can be an intravenous administration. One or multiple dosages of the modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) and / or the CNI (e.g., CsA or Tac) can be administered as soon as is practicable after the onset of a cancer or an infectious disease, and for a length of time necessary for the treatment of the disease, such as, for example, from about 24 hours to about 48 hours, from about 48 hours to about 1 week, from about 1 week to about 2 weeks, from about 2 weeks to about 1 month, from about 1 month to about 3 months.  For the treatment of cancer, one or multiple dosages of the modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) and / or the CNI (e.g., CsA or Tac) can be administered years after onset of the cancer and before or after other treatments. The modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) and / or the CNI (e.g., CsA or Tac) can be administered for at least about 10 minutes, 30 minutes, 1 hour, 2 hours, 3 hours, 4 hours, 5 hours, 6 hours, 12 hours, 24 hours, at least 48 hours, at least 72 hours, at least 96 hours, at least 1 week, at least 2 weeks, at least 3 weeks, at least 4 weeks, at least 1 month, at least 2 months, at least 3 months, at least 4 months, at least 5 months, at least 6 months, at least 7 months, at least 8 months, at least 9 months, at least 10 months, at least 11 months, at least 12 months, at least 1 year, at least 2 years at least 3 years, at least 4 years, or at least 5 years. The length of treatment can vary for each subject.

[0180] Methods for administration of modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) and / or the CNI (e.g., CsA or Tac) for adoptive cell therapy are known and can be used in connection with the provided methods and compositions. For example, adoptive T cell or NK cell therapy methods are described, e.g., in US Patent Application Publication No. 2003 / 0170238 to Gruenberg et al; US Patent No. 4,690,915 to Rosenberg; Rosenberg (2011) Nat Rev Clin Oncol. 8 (10) : 577-85) . See, e.g., Themeli et al. (2013) Nat Biotechnol. 31 (10) : 928-933; Tsukahara et al. (2013) Biochem Biophys Res Commun 438 (1) : 84-9; Davila et al. (2013) PLoS ONE 8 (4) : e61338.

[0181] The cell therapy (e.g., adoptive NK cell therapy) may be carried out by allogeneic transfer, in which the cells are isolated and / or otherwise prepared from a subject other than a subject who is to receive or who ultimately receives the cell therapy, e.g., a first subject. The cells may then be administered to a different subject, e.g., a second subject, of the same species. The first and second subjects may be genetically identical. The first and second subjects may be genetically similar. The second subject may express the same HLA class or supertype as the first subject.

[0182] The subject may have been treated with a therapeutic agent targeting the disease or condition, e.g., the tumor, prior to administration of the cells or composition containing the cells and / or the CNI (e.g., CsA or Tac) . In some aspects, the subject is refractory or non-responsive to the other therapeutic agent. The subject may have persistent or relapsed disease, e.g., following treatment with another therapeutic intervention, including chemotherapy, radiation, and / or hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) , e.g., allogeneic HSCT. The administration may effectively treat the subject despite the subject having become resistant to another therapy.

[0183] The subject may be responsive to the other therapeutic agent, and treatment with the therapeutic agent reduces disease burden. In some aspects, the subject is initially responsive to the therapeutic agent, but exhibits a relapse of the disease or condition over time. The subject may not have relapsed. The subject may be determined to be at risk for relapse, such as at a high risk of relapse, and thus the cells are administered prophylactically, e.g., to reduce the likelihood of or prevent relapse. In some aspects, the subject has not received prior treatment with another therapeutic agent.

[0184] The subject may have persistent or relapsed disease, e.g., following treatment with another therapeutic intervention, including chemotherapy, radiation, and / or hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) , e.g., allogeneic HSCT. The administration may effectively treat the subject despite the subject having become resistant to another therapy.

[0185] The modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) and / or the CNI (e.g., CsA or Tac) described herein can be administered to an animal, preferably a mammal, even more preferably a human, to treat a cancer. In addition, the modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) and / or the CNI (e.g., CsA or Tac) can be used for the treatment of any condition related to a cancer, especially a cell-mediated immune response against a tumor cell (s) , where it is desirable to treat or alleviate the disease. The types of cancers to be treated with the modified cells or pharmaceutical compositions include, carcinoma, blastoma, and sarcoma, and certain leukemia or lymphoid malignancies, benign and malignant tumors, and malignancies e.g., sarcomas, carcinomas, and melanomas. Other exemplary cancers include but are not limited breast cancer, prostate cancer, ovarian cancer, cervical cancer, skin cancer, pancreatic cancer, colorectal cancer, renal cancer, liver cancer, brain cancer, lymphoma, leukemia, lung cancer, thyroid cancer, and the like. The cancers can be non-solid tumors (such as hematological tumors) or solid tumors. Adult tumors / cancers and pediatric tumors / cancers are also included. The cancer can be a solid tumor or a hematological tumor. The cancer can be a carcinoma. The cancer can be a sarcoma. The cancer can be a leukemia. The cancer can be a solid tumor.

[0186] Solid tumors are abnormal masses of tissue that usually do not contain cysts or liquid areas. Solid tumors can be benign or malignant. Different types of solid tumors are named for the type of cells that form them (such as sarcomas, carcinomas, and lymphomas) . Examples of solid tumors, such as sarcomas and carcinomas, include fibrosarcoma, myxosarcoma, liposarcoma, chondrosarcoma, osteosarcoma, and other sarcomas, synovioma, mesothelioma, Ewing's tumor,  leiomyosarcoma, rhabdomyosarcoma, colon carcinoma, lymphoid malignancy, pancreatic cancer, breast cancer, lung cancers, ovarian cancer, prostate cancer, hepatocellular carcinoma, squamous cell carcinoma, basal cell carcinoma, adenocarcinoma, sweat gland carcinoma, medullary thyroid carcinoma, papillary thyroid carcinoma, pheochromocytomas sebaceous gland carcinoma, papillary carcinoma, papillary adenocarcinomas, medullary carcinoma, bronchogenic carcinoma, renal cell carcinoma, hepatoma, bile duct carcinoma, choriocarcinoma, Wilms' tumor, cervical cancer, testicular tumor, seminoma, bladder carcinoma, melanoma, and CNS tumors (such as a glioma (such as brainstem glioma and mixed gliomas) , glioblastoma (also known as glioblastoma multiforme) astrocytoma, CNS lymphoma, germinoma, medulloblastoma, Schwannoma craniopharyogioma, ependymoma, pinealoma, hemangioblastoma, acoustic neuroma, oligodendroglioma, menangioma, neuroblastoma, retinoblastoma and brain metastases) .

[0187] Carcinomas that can be amenable to therapy by a method disclosed herein include, but are not limited to, esophageal carcinoma, hepatocellular carcinoma, basal cell carcinoma (aform of skin cancer) , squamous cell carcinoma (various tissues) , bladder carcinoma, including transitional cell carcinoma (amalignant neoplasm of the bladder) , bronchogenic carcinoma, colon carcinoma, colorectal carcinoma, gastric carcinoma, lung carcinoma, including small cell carcinoma and non-small cell carcinoma of the lung, adrenocortical carcinoma, thyroid carcinoma, pancreatic carcinoma, breast carcinoma, ovarian carcinoma, prostate carcinoma, adenocarcinoma, sweat gland carcinoma, sebaceous gland carcinoma, papillary carcinoma, papillary adenocarcinoma, cystadenocarcinoma, medullary carcinoma, renal cell carcinoma, ductal carcinoma in situ or bile duct carcinoma, choriocarcinoma, seminoma, embryonal carcinoma, Wilm's tumor, cervical carcinoma, uterine carcinoma, testicular carcinoma, osteogenic carcinoma, epithelial carcinoma, and nasopharyngeal carcinoma.

[0188] Sarcomas that can be amenable to therapy by a method disclosed herein include, but are not limited to, fibrosarcoma, myxosarcoma, liposarcoma, chondrosarcoma, chordoma, osteogenic sarcoma, osteosarcoma, angiosarcoma, endotheliosarcoma, lymphangiosarcoma, lymphangioendotheliosarcoma, synovioma, mesothelioma, Ewing's sarcoma, leiomyosarcoma, rhabdomyosarcoma, and other soft tissue sarcomas.

[0189] The modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) and / or the CNI (e.g., CsA or Tac) described herein can be administered to an animal, preferably a mammal, even more preferably a human, to treat a bone-marrow-related autoimmune disease. In addition, the modified immune  cells (e.g., CAR-NK cells) and / or the CNI (e.g., CsA or Tac) can be used for the treatment of any condition related to a bone-marrow-related autoimmune disease. A bone-marrow-related autoimmune disease is a group of diseases that affect the bone marrow. Some pathogenic cells of these diseases can be located in the bone marrow, develop in the bone marrow, and / or invade the bone marrow, thereby affecting the function of the bone marrow. The bone-marrow-related autoimmune disease includes a B-cell regulated autoimmune disease. The B-cell regulated autoimmune disease is an autoimmune disorder that involves misregulation of B-cells. The B-cell regulated autoimmune disease can be an autoimmune disorder associated with autoreactive plasma cells and / or autoreactive memory B cells.

[0190] Examples of bone-marrow-related autoimmune disease, such as systemic lupus erythematosus (SLE) , rheumatoid arthritis, Wegener's disease, inflammatory bowel disease, ulcerative colitis, idiopathic thrombocytopenic purpura (ITP) , thrombotic throbocytopenic purpura (TTP) , autoimmune thrombocytopenia, multiple sclerosis (MS) , Systemic sclerosis / scleroderma (SSc) , Idiopathic inflammatory myopathy (IIM) , antiphospholipid syndrome (APS) , psoriasis, IgA nephropathy, IgM polyneuropathies, myasthenia gravis (MG) , ANCA (Anti-neutrophil cytoplastic antibodies) associated vasculitis, diabetes mellitus, Reynaud's syndrome, Sjorgen's syndrome, Neuromyelitis Optica (NMO) , glomerulonephritis, and myelin oligodendrocyte glycoprotein-IgG associated disorders (MOGAD) .

[0191] Bone-marrow-related autoimmune disease that can be amenable to therapy by a method disclosed herein include, but are not limited to, systemic lupus erythematosus (SLE) , Wegener's disease, inflammatory bowel disease, ulcerative colitis, Sjogren's syndrome, graft-versus-host disease, multiple sclerosis, Systemic sclerosis / scleroderma (SSc) , systemic sclerosis, myasthenia gravis, rheumatoid arthritis, juvenile rheumatoid arthritis, Idiopathic inflammatory myopathy (IIM) , antiphospholipid syndrome (APS) , psoriasis, ANCA associated vasculitis, diabetes mellitus, Neuromyelitis Optica (NMO) , osteoarthritis, psoriatic arthritis, dermatitis, atopic dermatitis, chronic autoimmune urticaria, polymyositis / dermatomyositis, toxic epidermal necrolysis, systemic scleroderma and sclerosis, respiratory distress syndrome, adult respiratory distress syndrome (ARDS) , meningitis, allergic rhinitis, encephalitis, uveitis, colitis, glomerulonephritis, myelin oligodendrocyte glycoprotein-IgG associated disorders (MOGAD) , allergic conditions, eczema, asthma, atherosclerosis, autoimmune myocarditis, leukocyte adhesion deficiency, lupus (nephritis, non-renal, discoid, alopecia) , allergic encephalomyelitis,  tuberculosis, sarcoidosis, granulomatosis, Wegener's granulomatosis, agranulocytosis, vasculitis, aplastic anemia, Coombs positive anemia, Diamond Blackfan anemia, immune hemolytic anemia, hemolytic anemia (AIHA) , pernicious anemia, pure red cell aplasia (PRCA) , Factor VIII deficiency, hemophilia A, autoimmune neutropenia, pancytopenia, leukopenia, diseases involving leukocyte diapedesis, multiple organ injury syndrome, anti-glomerular basement membrane disease, anti-phospholipid antibody syndrome, allergic neuritis, Bechet disease, Castleman's syndrome, Goodpasture's Syndrome, Lambert-Eaton Myasthenic Syndrome, Reynaud's syndrome, Sjorgen's syndrome, Stevens-Johnson syndrome, solid organ transplant rejection, graft versus host disease (GVHD) , pemphigoid bullous, pemphigus, vulgaris, foliaceus, autoimmune polyendocrinopathies, Reiter's disease, stiff-man syndrome, giant cell arteritis, immune complex nephritis, IgA nephropathy, IgM polyneuropathies, IgM mediated neuropathy, idiopathic thrombocytopenic purpura (ITP) , thrombotic throbocytopenic purpura (TTP) , autoimmune thrombocytopenia, autoimmune orchitis, autoimmune oophoritis, primary hypothyroidism; autoimmune endocrine diseases, autoimmune thyroiditis, chronic thyroiditis (Hashimoto's Thyroiditis) , subacute thyroiditis, idiopathic hypothyroidism, Addison's disease, Grave's disease, polyglandular endocrinopathy syndromes, Sheehan's syndrome, autoimmune hepatitis, Lymphoid interstitial pneumonitis (HIV) , non-transplant bronchiolitis obliterans, Guillain-Barre' Syndrome, Large Vessel Vasculitis, Polymyalgia Rheumatica, Giant Cell (Takayasu's) Arteritis, Medium Vessel Vasculitis, Kawasaki's Disease, Polyarteritis Nodosa, ankylosing spondylitis, Berger's Disease, Rapidly Progressive Glomerulonephritis, Primary biliary cirrhosis, Celiac sprue, Cryoglobulinemia, ALS, and coronary artery disease.

[0192] Since the CNI (e.g., CsA or Tac) can promote the infiltration of the modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) into the bone marrow, the method described herein is helpful for the treatment of the bone-marrow-related autoimmune disease.

[0193] The modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) and / or CNI (e.g., CsA or Tac) described herein can be included in a composition for immunotherapy. The composition can include a pharmaceutical composition and further include a pharmaceutically acceptable carrier. A therapeutically effective amount of the pharmaceutical composition comprising the modified cells can be administered.

[0194] The modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) and / or the CNI (e.g., CsA or Tac) can be immediately used in the above therapeutic, experimental or commercial applications or the  cells can be cryopreserved for use at a later date. The pharmaceutical compositions can be included in a container, pack, or dispenser together with instructions for administration.

[0195] The modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) and / or the CNI (e.g., CsA or Tac) disclosed herein can be formulated in unit dosage forms suitable for single administration of precise dosages. In some cases, the unit dosage forms comprise additional lymphocytes. In unit dosage form, the formulation is divided into unit doses containing appropriate quantities of one or more compounds. The unit dosage can be in the form of a package containing discrete quantities of the formulation. Non-limiting examples are packaged tablets or capsules, and powders in vials or ampoules. Aqueous suspension compositions can be packaged in single-dose non-reclosable containers. Multiple-dose reclosable containers can be used, for example, in combination with a preservative or without a preservative. In some examples, the pharmaceutical composition does not comprise a preservative. Formulations for parenteral injection can be presented in unit dosage form, for example, in ampoules, or in multi-dose containers with a preservative.

[0196] EXAMPLES

[0197] The disclosure is further described in the following examples, which do not limit the scope of the disclosure described in the claims.

[0198] Example 1. Calcineurin Inhibitors Inhibit the Tumor Killing Effect of CAR-T Cells

[0199] To study the effect of CNIs at plasma concentration on the killing of target cells by CAR-T cells, PBMCs were isolated from human peripheral blood. CAR-T cells that specifically target BCMA were prepared, the CAR used in this experiment was 32M CAR described in PCT Application No. PCT / CN2023 / 096342.

[0200] The CAR-T cells were incubated with target H929 cells at a ratio of 1: 4. Target cells were supplemented at the same ratio every 24 hours to establish a repeated stimulation system to assess the killing effects by the CAR-T cells in a serial killing assay. Various concentrations of calcineurin inhibitor Tac (MJedChemExpress) or CsA (Selleck) were added as shown in FIG. 2. After 72 hours, the percentage of live H929 cells were detected by flow cytometry. In FIG. 2, Ctrl is a control group without the addition of any calcineurin inhibitor, BCMA shows the residual tumor marker level and sdAb shows the level of the CAR-T cells. As shown in FIG. 2, calcineurin  inhibitors Tacrolimus (Tac) and cyclosporine A (CsA) inhibited the killing of target cells by CAR-T cells at clinically relevant concentrations.

[0201] Example 2: Calcineurin Inhibitors Enhance the Tumor Killing Effect of CAR-NK Cells

[0202] The CAR-NK cells used in this experiment were 32M CAR-NK described in PCT Application No. PCT / CN2023 / 096342. The CAR-NK cells were incubated with target H929 cells at a ratio of 1: 4. Target cells were supplemented at the same ratio every 24 hours to establish a repeated stimulation system to assess the killing effects by the CAR-NK cells in a serial killing assay. Various concentrations of calcineurin inhibitor Tac (MJedChemExpress) or CsA (Selleck) were added as shown in FIG. 3A. After 72 hours, the percentage of live H929 cells were detected by flow cytometry.

[0203] Different from the results for CAR-T cells, calcineurin inhibitors Tacrolimus (Tac) and cyclosporine A (CsA) did not inhibit the killing of target cells by CAR-NK cells at clinically relevant concentrations. Instead, the calcineurin inhibitors Tacrolimus (Tac) and cyclosporine A (CsA) enhanced the killing of target cells by CAR-NK cells (see, FIG. 3A) .

[0204] In addition, calcineurin inhibitor such as cyclosporine A (CsA) enhanced the CD107a expression of CAR-NK cells. The CAR-NK cells were incubated with target NCI-H929 cells at a ratio of 1: 1 for 2 hours, with or without titrated CsA. Cells were then collected, and the degranulation maker CD107a (LAMP-1) was stained and analyzed by flow cytometry. As shown in FIGs. 3B-C, the expression of CD107a on CAR-NK in the groups treated with CsA was higher than the group without the addition of CsA.

[0205] Example 3: Calcineurin Inhibitors Enhance the Tumor Killing Effect of CAR-NK Cells in Animal Models

[0206] To further investigate the effect of CsA on the functions of CAR-NK cells in animal models, we constructed an NCG tumor mouse model and performed CAR-NK cell transfusion. Specifically, luciferase-labeled H929 cells were inoculated in NCG mice through tail veil injection. 12 days post injection, the tumor-bearing mice were randomly distributed into the CsA-treated group (CsA) or control group (Ctrl) and were inoculated with the same number of CAR-NK cells. The mice were given either CsA or plain buffer after 3 days of CAR-NK transfusion. Total flux were recorded twice a week after the CsA or buffer treatment. As shown in FIG. 4A, 50 mg / kg  CsA (Selleck) -treated mice had significantly lower flux level than the control group after 10 days of CAR-NK transfusion. More importantly, this effect on tumor progression was not due to the direct killing of the tumor cells by CsA. As shown in FIG. 4B, CsA alone (without CAR-NK cells) did not have inhibiting effect on the growth of the tumor cells.

[0207] These data demonstrate that CsA enhanced the tumor killing effect of CAR-NK cells in animal models.

[0208] Example 4: Calcineurin Inhibitors Upregulate the Expression of CX3CR1 on CAR-NK Cells

[0209] Interestingly, through phenotypical analysis of the CAR-NK cells treated with CsA or Tac, we found that CsA or Tac-treated CAR-NK cells had upregulated expression of a tissue infiltration marker, CX3CR1 (FIGs. 5A-5B) .

[0210] One of the limitations of cell therapy products is the low tumor infiltration ability. Furthermore, the CX3CL1-CX3CR1 axis plays an important role in the chemotaxis of immune cells to tumor microenvironment. Therefore, the upregulated expression of CX3CR1 on the CAR-NK cells indicates that the CAR-NK cells have enhanced ability of tissue / tumor infiltration in vivo.

[0211] Example 5: Calcineurin Inhibitors Promote the Infiltration of CAR-NK Cells in the Bone Marrow

[0212] We further investigated the effect of CNI on the distribution of CAR-NK cells in bone marrow and peripheral blood in tumor mouse models. The NCG H929 tumor mouse model was constructed and CAR-NK cells were transfused into the mice as described in Example 3.50 mg / kg CsA (CsA group) or plain buffer (Ctrl) were given to the mice for three days. The bone marrow and peripheral blood sample were obtained from the mice, and the number of CAR-NK cells were analyzed using flow cytometry (FIGs. 6A and 6B) . As shown in FIG. 6A, the treatment with CsA increased the distribution and number of CAR-NK cells in the bone marrow, indicating that CsA promoted the infiltration of CAR-NK cells in the bone marrow.

[0213] In addition, CX3CR1 expression on CAR-NK isolated from bone marrow was also evaluated. In consistent with that observed in vitro, 21-day CsA treatment also increased CX3CR1 expression in bone marrow isolated CAR-NK (FIG. 6C) .

[0214] Example 6: Calcineurin Inhibitors Suppress the Host Immune System and Promote the Expansion of CAR-NK Cells

[0215] To investigate whether CNI could suppress the host immune system and promote the expansion of CAR-NK cells, we established a Mixed Lymphocyte Reactions (MLR) system. Using CsA and Tac as examples, in an allogeneic 3-way MLR of CsA experimental system, the ratio of PBMC : allo-CAR-NK : Tumor cell = 50: 1: 4 was used for co-culture. 200 ng / ml CsA was added in the CsA group at the same time. As shown in FIG. 7A, the addition of CsA significantly promoted the expansion of CAR-NK cells, eliminating the rejection mediated by allogeneic PBMCs. Similarly, in an allogeneic 3-way MLR of Tac experimental group, the ratio of PBMC : allo-CAR-NK : Tumor cell = 50: 1: 4 was used for co-culture. 10 ng / ml Tac was added in the Tac group at the same time. As shown in FIG. 7B, the addition of Tac significantly promoted the expansion of CAR-NK cells, eliminating the rejection mediated by allogeneic PBMCs.

[0216] Example 7: Calcineurin Inhibitors Enhance the Tumor Killing Effect of CAR-NK Cells in Animal Models

[0217] To further investigate the effect of CsA or Tac on the functions of CAR-NK cells in animal models, we constructed an NCG tumor mouse model and performed CAR-NK cell transfusion. Specifically, luciferase-labeled H929 cells were inoculated in NCG mice through tail veil injection. 12 days post injection, the tumor-bearing mice were randomly distributed into the CsA-treated group (CAR-NK, CsA) , Tac-treated group (CAR-NK, Tac) or control group (CAR-NK, vehicle) and were inoculated with the same number of CAR-NK cells. The mice were given CsA, Tac or plain buffer 1 day before CAR-NK transfusion. Total flux were recorded twice a week after the CsA, Tac or buffer treatment. As shown in FIG. 8A, 50 mg / kg CsA or 5 mg / kg Tac treated mice were more effective in control tumor progression. More importantly, the expansion of peripheral CAR-NK was not affected, as shown in FIG. 8B.

[0218] We also performed RNA sequencing to further characterize the gene expression profiles of CAR-NK isolated from experiment as mentioned in FIG. 8A and 8B. KEGG gene enrichment analysis suggested that a variety of genes that positively controls NK cell activities were upregulated.

[0219] Together, these data support that Calcineurin inhibitors including CsA and Tac did not suppress but positively regulated CAR-NK activities.

[0220] Example 8: CsA prevents CAR-NK rejection in vivo in PBMC based HvG model

[0221] To further investigate whether CsA treatment suppresses host immune rejections and thus promotes the persistence of graft CAR-NK, we established a human PBMC based HvG model. To this end, CsA at a dose of 50 mg / kg (once a day) or 25 mg / kg (twice a day) or vehicle were used to treat NCG mice. 5 days later, 20 × 106 PBMC were inoculated to reconstitute human immune systems. Then 3 days later, 1.5 × 106 HLA-A / B / C-mismatched allogenic CAR-NK were infused, and peripheral CAR-NK counts were monitored by FACS (FIG. 9A) . As shown in FIG. 9B, CsA treatment prolonged CAR-NK persistence, and increased Cmax, supporting that CsA suppressed host immune rejections to allogenic CAR-NK, and therefore favored CAR-NK expansion in this HvG model.

[0222] We also evaluated the T cell counts and T cell phenotypes of PBMC origin. Consistently, CsA treatment suppressed T cell reconstitution (FIG. 9C) and downregulated the expression of T cell activation makers, including CD38 and CD71 (FIG. 9D -9E) . In addition, we investigated the impact of CsA withdrawal on T cells recovery. To this end, we stopped CsA treatment 18 days post CAR-NK infusion as indicated by the dashed line. T cell expansion and activation markers were substantially recovered after CsA withdrawal (FIG. 9D -9E) .

[0223] Example 9: CsA prevents CAR-NK from rejection in vivo in a dose dependent manner

[0224] In clinical settings, clinicians may adjust the dose of CsA to control the degree of rejection. To further investigate the impact of different CsA dosage on CAR-NK rejection, we established a similar HvG model as mentioned in Example 8, and in this case, we treated the mice with titrated CsA. As shown in FIG. 10, 20 mg / kg / day –50 mg / kg / day CsA were all effective in protecting CAR-NK from clearance and promoting CAR-NK expansion. Increased CsA dosage were associated with better CAR-NK persistence, as revealed by increased Cmax and prolonged expansion. Again, we stopped CsA treatment at day 13 (dashed line) in 50 mg / kg / day treatment group to investigate the impact of CsA withdrawal on CAR-NK clearance. Preliminary data suggested that CsA withdrawal tended to accelerate CAR-NK rejections.

[0225] These data suggested that CsA prolonged CAR-NK persistence in a dose dependent manner.

[0226] Example 10: CsA treatment durations determine CAR-NK persistence

[0227] In clinical settings, clinicians may adjust CsA treatment durations to control the degree of rejection. To investigate the impact of CsA treatment durations on CAR-NK persistence, we established the similar HvG model as mentioned in Example 8. Here, CsA treatment was set up to be 4 days, 7 days or 22 days post CAR-NK infusion. As shown in FIG. 11A, longer CsA treatment durations were associated with better CAR-NK persistence, as revealed by prolonged CAR-NK expansion and higher Cmax. Consistently, CsA treatment suppressed T cell expansion and CsA withdrawal led to obvious T cell recovery (FIG. 11B) .

[0228] These data suggest that CsA prolonged CAR-NK persistence in a treatment duration dependent manner.

[0229] Example 11: CsA treatment improved CAR-NK efficacy in tumor bearing HvG model

[0230] To investigate whether CsA treatment suppressed immune rejection and therefore improved CAR-NK tumoricidal efficacy, we established the tumor bearing HvG model, wherein myeloma H929 tumor cells were additionally inoculated, before the establishment of HvG model as mentioned in Example 8. As shown in FIG. 12A, CsA treatment promoted the tumoricidal effects of CAR-NK as compared to vehicle treated groups. Coordinately, CAR-NK expansion was also evaluated upon CsA treatment, as shown in FIG. 12B.

[0231] These data supported that CsA suppressed PBMC mediated rejections of allogenic CAR-NK and promoted their anti-tumor efficacy. In addition, these data also supported that clinicians may adjust CsA treatment dosage or durations to achieve a desired CAR-NK persistency.

[0232] OTHER EMBODIMENTS

[0233] It is to be understood that while the disclosure has been described in conjunction with the detailed description thereof, the foregoing description is intended to illustrate and not limit the scope of the disclosure, which is defined by the scope of the appended claims. Other aspects, advantages, and modifications are within the scope of the following claims.

Claims

1.A method of treating a disease or disorder in a subject, the method comprising administering an effective amount of a calcineurin inhibitor (CNI) to the subject in need thereof, wherein the subject is or will be under the treatment of modified immune cells.2.The method of claim 1, wherein the disease or disorder is a cancer, an autoimmune disease, or an infection.3.A method of reducing immune clearance of modified immune cells in a subject, comprising administering an effective amount of a calcineurin inhibitor (CNI) to the subject, wherein the subject is or will be under the treatment of modified immune cells.4.The method of claim 3, wherein the modified immune cells are allogeneic cells isolated from a donor for being administered to a subject.5.The method of claim 3 or 4, wherein the immune clearance of the modified immune cells is through host immune cell-mediated cytotoxicity.6.The method of any one of claims 3-5, wherein the immune clearance of the modified immune cells is through host T cell-mediated cytotoxicity.7.The method of any one of claims 3-6, wherein the administration of the CNI increases the expansion of the modified immune cells.8.A method of increasing the in vivo infiltration of a modified immune cell into a tissue in a subject, comprising administering an effective amount of a calcineurin inhibitor (CNI) to the subject.9.The method of claim 8, wherein the tissue is a tumor tissue.10.The method of claim 8 or 9, wherein the modified immune cell has an increased expression of CX3CR1.11.The method of claim 10, wherein the increased in vivo infiltration of the modified immune cell into the tissue is via the interaction between CX3CR1 expressed on the modified immune cell and CX3CL1 expressed on the cells in the tissue.12.The method of any one of claims 1-11, wherein the modified immune cell is a modified natural killer (NK) cell.13.The method of claim 12, wherein the modified NK cell is a CAR-NK cell that expresses a chimeric antigen receptor (CAR) .14.The method of any one of claims 1-13, wherein the CNI is Cyclosporine A (CsA) .15.The method of claim 14, wherein the CsA is administered at a dosage of about 1 to about 25 mg / kg / day or about 0.5 to about 12.5 / mg / kg / twice a day.16.The method of any one of claims 1-13, wherein the CNI is tacrolimus.17.The method of claim 16, wherein the tacrolimus is administered at a concentration of about 0.01 to 1 mg / kg / day.18.The method of claim 13, wherein the CAR receptor specifically binds to a target antigen.19.The method of claim 18, wherein the target antigen is selected from the group consisting of BCMA, CLL1, CD4, GPC3, GPRC5D, GU2CYC, CD19, MUC16, MUC1, CAIX, CEA, CD8, CD7, CD10, CD20, CD22, CD30, CD33, CD34, CD38, CD41, CD44, CD49f, CD56, CD74, CD133, CD138, EGP-2, EGP-40, EpCAM, ERBB2, ERBB3, ERBB4, FBP, fetal acetylcholine receptor, folate receptor-α, GD2, GD3, HER-2, hTERT, IL-13R-α2, κ-light chain, KDR, LeY, L1  cell adhesion molecule, MAGE-A1, mesothelin, MAGEA3, p53, MART1, GP100, proteinase-3 (PR3) , tyrosinase, survivin, hTERT, EphA2, NY-ESO-1, h5T4, PSCA, PSMA, ROR1, TAG-72, VEGF-R2, WT-1, CD123, CD44V6, NKCS1, IGF1R, EGFR, EGFR-VIII, Claudin 18.2, Claudin 6, NKG2D, Delta-like 3 (DLL3) , CD70, CS-1, c-Met, Glycolipid F77, PD-L1, and PD-L2.20.The method of any one of claims 1-19, wherein the modified immune cells are not modified by gene-editing or knockout of FKBP12 or PPIA gene, which renders the cells resistant to CNI.21.The method of any one of claims 1-19, wherein the modified immune cells are not modified by overexpression of at least one miRNA of miR-17-92 cluster or paralogs thereof or inactivation of at least one miR-17-92 cluster target gene, which renders the cells resistant to CNI.22.The method of any one of claims 1-19, wherein the modified immune cells do not comprise any modification that renders the cells resistant to CNI.23.The method of any one of claims 1-22, wherein the modified immune cells are enriched in the bone marrow of the subject.24.The method of any one of claims 1-23, wherein the subject has a bone-marrow-related disease or disorder, or a hematological cancer, e.g., a lymphoma or a leukemia.25.The method of claim 24, wherein the subject has acute lymphoblastic leukemia, acute myeloid leukemia, chronic lymphocytic leukemia, chronic myelogenous leukemia, Hodgkin lymphoma, non-Hodgkin lymphoma, Waldenstrom macroglobulinemia, follicular lymphoma, B-cell lymphoma, cutaneous T-cell lymphoma, multiple myeloma, plasmacytoma, or amyloidosis.26.The method of any one of claims 1-23, wherein the subject has a bone-marrow-related disease.27.The method of claim 26, wherein the subject has a bone-marrow-related autoimmune disease, e.g., a B-cell regulated autoimmune disease.28.The method of claim 27, wherein the subject has systemic lupus erythematosus (SLE) , rheumatoid arthritis, Wegener's disease, inflammatory bowel disease, ulcerative colitis, idiopathic thrombocytopenic purpura (ITP) , thrombotic throbocytopenic purpura (TTP) , autoimmune thrombocytopenia, multiple sclerosis (MS) , Systemic sclerosis / scleroderma (SSc) , Idiopathic inflammatory myopathy (IIM) , antiphospholipid syndrome (APS) , psoriasis, IgA nephropathy, IgM polyneuropathies, myasthenia gravis (MG) , ANCA (Anti-neutrophil cytoplastic antibodies) associated vasculitis, diabetes mellitus, Reynaud's syndrome, Sjorgen's syndrome, Neuromyelitis Optica (NMO) , glomerulonephritis, and myelin oligodendrocyte glycoprotein-IgG associated disorders (MOGAD) .29.The method of any one of claims 1-28, wherein the CNI is administered prior to, during, and / or after the administration of the modified immune cells.30.The method of any one of claims 1-29, wherein the CNI is administered at least 1 day, at least 2 days, at least 3 days, at least 4 days, at least 5 days, at least 6 days, or at least 7 days prior to the administration of the modified immune cells.31.The method of any one of claims 1-30, wherein the CNI is administered throughout the administration of the modified immune cells.32.The method of any one of claims 1-31, wherein the CNI is administered after the administration of the modified immune cells for at least 15 days, at least 20 days, at least 1 month, 2 months or 3 months.33.The method of any one of claims 1-32, wherein a lymphodepletion is performed in the subject prior to or after the administration of the CNI and prior to the administration of the modified immune cells.34.The method of any one of claims 1-33, wherein the CNI is administered by intravenous injection and / or oral administration.35.The method of claim 34, wherein the CNI is administered by oral administration after the subject is discharged from the hospital.36.The method of any one of claims 1-35, wherein the modified immune cells have been expanded in vitro before administered to the subject.37.The method of any one of claims 1-36, wherein the degranulation of the modified immune cells is enhanced by the administration of the CNI.38.The method of any one of claims 1-37, wherein the expression of CD107a on the modified immune cells is increased by the administration of the CNI.

Images