Drug conjugates, their preparation methods and uses

Abstract

Provided are compounds of Formula (I), as well as drug conjugates prepared by using compounds of Formula (I) as linkers, and their preparation methods and uses. The linkers are expected to have good stability, be suitable for conjugation with drugs, and to construct antibody-drug conjugates.

Description

DRUG CONJUGATES, THEIR PREPARATION METHODS AND USESTECHNICAL FIELD

[0001] The present invention relates to linker-drug conjugates of Formula I or antibody-drug conjugates of Formula II. The present invention also relates to methods for preparing linker-drug conjugates of Formula I and antibody-drug conjugates of Formula II. The present invention further relates to uses of antibody-drug conjugates of Formula II for treating cancers. BACKGROUND

[0002] Antibody-drug conjugate (ADC) is a form of drug that comprises an antibody conjugated to a drug molecule through a linker, aiming to enhance drug tumor targeting and reduce toxic side effects on normal cells. In the development of ADC, the linker is a key component that tethers the antibody and the drug molecule. The linker design directly affects ADC stability, drug release and overall therapeutic efficacy.

[0003] An ideal linker has characteristics of being stable in blood circulation to prevent premature drug release before reaching tumor cells, being cleavable triggered by specific enzymes or in intra (extra) cellular environments to release the drug and having sufficient flexibility to ensure that the biological activity of ADC is not affected.

[0004] The chemical structure and physicochemical property of the linker determine its chemical stability and release kinetics in vivo. Currently, various types of linkers have been developed, including cleavable and non-cleavable ones. Cleavable linkers can be cleaved by specific enzymes in tumor microenvironment to release the drug, whereas non-cleavable linkers rely on antibody internalization, followed by degradation to release the drug. The choice of linker depends on nature of the drug, characteristics of the antibody, and therapeutic strategy.

[0005] Furthermore, the stability and release characteristics of the linker are also closely related to the efficacy and safety of ADC. An unstable linker may lead to premature drug release in non-target tissues causing toxic side effects, while a linker that releases the drug too slowly may reduce drug efficacy. Therefore, the design and optimization of the linker are one of the key technical challenges in the development of ADC.BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

[0006] Figure 1 shows the results of ELISA binding of B7-H3 hybridoma antibody to human B7-H3 protein.

[0007] Figure 2 shows the results of FACS binding of B7-H3 hybridoma antibody in CT26-B7H3 cells.

[0008] Figure 3 shows the results of FACS binding of B7-H3 hybridoma antibody in Calu-6 cells.

[0009] [Rectified under Rule 91, 12.06.2025]Figure 4 shows the results of binding kinetics between B7-H3 hybridoma antibody and B7-H3 antigen (Figure 4A is for Ref1; Figure 4B is for Hy58C11-2) .

[0010] Figure 5 shows the internalization results of B7-H3 hybridoma antibody in CT26-B7H3 cells.

[0011] Figure 6 shows the results of antigen-binding based on ELISA of humanized B7-H3 antibody.

[0012] Figure 7 shows the results of binding of humanized B7-H3 antibody in A172 cells by FACS.

[0013] Figure 8 shows the results of binding of humanized B7-H3 antibody in H1568 cells by FACS.

[0014] Figure 9 shows the results of ADCC of humanized B7-H3 antibody.

[0015] Figure 10 shows the results of CDC killing of humanized anti-B7-H3 antibody.

[0016] Figure 11 shows the results of internalization mediated by humanized B7-H3 antibody.

[0017] Figure 12 shows the results of non-specific binding of humanized B7-H3 antibody in Jurkat cells.

[0018] [Rectified under Rule 91, 12.06.2025]Figure 13 shows the results of binding kinetics between humanized B7-H3 antibody and B7-H3 antigen (Figure 13A is for Ref1; Figure 13B is for Hu58C11-1722; Figure 13C is for Hu58C11-1724; Figure 13D is for Hu58C11-1726) .

[0019] Figure 14 shows in vivo antitumor results (tumor volume change) in NCI-H1155 non-small cell lung cancer xenograft mouse model.

[0020] Figure 15 shows in vivo antitumor results (relative weight change) in NCI-H1155 non-small cell lung cancer xenograft mouse model.

[0021] Figure 16 shows in vivo antitumor results (tumor volume changes) in NCI-H1155 non-small cell lung cancer xenograft mouse model.

[0022] Figure 17 shows in vivo antitumor results (relative weight change) in NCI-H1155 non-small cell lung cancer xenograft mouse model.

[0023] Figure 18 shows in vivo antitumor results (tumor volume changes) in NCI-H1155 non-small cell lung cancer xenograft mouse model.

[0024] Figure 19 shows in vivo antitumor results (relative weight change) in NCI-H1155 non-small cell lung cancer xenograft mouse model.

[0025] Figure 20 shows in vivo antitumor efficacy results (tumor volume changes) in OVCAR-3 ovarian cancer xenograft mouse model.

[0026] Figure 21 shows in vivo antitumor efficacy results (relative weight change) in OVCAR-3 ovarian cancer xenograft mouse model.

[0027] Figure 22 shows in vivo antitumor efficacy results (tumor volume changes) in Calu-6 lung cancer xenograft mouse model.

[0028] Figure 23 shows in vivo antitumor efficacy results (relative weight change) in Calu-6 lung cancer xenograft mouse model.DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

[0029] Unless otherwise specified, the scientific and technical terms used herein have the meanings commonly understood by those skilled in the art. Additionally, the relevant terms and laboratory procedures used herein are widely used in the respective fields. Furthermore, to better understand the present invention, definitions and explanations of relevant terms are provided below.

[0030] “Some embodiments” , “some implementations” or “some schemes” describe subsets of all possible embodiments. However, it can be understood that “some embodiments” may refer to the same subset or different subsets of all possible embodiments and can be combined with each other without conflict.

[0031] “Comprise” , “include” , “have” , “contain” and their grammatical equivalents should generally be understood as open-ended and non-restrictive, for example, not excluding other unlisted elements or steps.

[0032] The numerical ranges include each value and subranges within the said range. For example, “C1-6 alkyl” includes C1, C2, C3, C4, C5, C6, C1-6, C1-5, C1-4, C1-3, C1-2, C2-6, C2-5, C2-4, C2-3, C3-6, C3-5, C3-4, C4-6, C4-5 and C5-6 alkyl.

[0033] “Substituted” refers to the replacement of one or more hydrogens on a specific atom with substituent (s) including deuterium, as long as the valence of the specific atom is chemically acceptable, and the substituted compound is stable. When the substituent is oxo (i.e., =O) , it means that two hydrogen atoms are replaced. “Optionally substituted” or “optionally substituted with” means that substitution may or may not occur, and unless otherwise specified, the type and number of substituents can be any that are chemically feasible.

[0034] When any variable (e.g., R) appears more than once in the composition or structure of a compound, they are independent to each other. For example, if a group is substituted with 0-2 R, the group can be optionally substituted with up to two Rs and each R has independent embodiment. Furthermore, combinations of substituents and / or their variants are only allowed if such combinations result in a stable compound.

[0035] In any implementation, any hydrogen in a compound or in a specific group of a compound can be replaced by deuterium or tritium. For example, when a group is described as ethyl, the ethyl can be C2H5 or C2H5 with x (1 to 5) number of hydrogens being replaced by deuteriums, such as C2DxH5-x. When a group is described as deuterated ethyl, the deuterated ethyl is C2DxH5-x (x = 1 to 5) . A deuterated derivative described in this disclosure is preferably a stable compound with any hydrogen atom being replaced by deuterium from 1 to the maximum number (e.g., 1 to 2, 1 to 3, 1 to 4, 1 to 5, 1 to 6, 1 to 7, etc. ) allowed.

[0036] This disclosure refers to a compound of Formula I, including its tautomers, stereoisomers, mixtures of stereoisomers, solvates, derivatives, etc.

[0037] This disclosure also includes “compounds” in the form of tautomers. Tautomeric forms arise from the exchange of a single bond with an adjacent double bond accompanied by the migration of a hydrogen. “Tautomer” or “tautomeric form” refers to different functional group isomers that are in equilibrium at room temperature and can quickly interconvert. It refers to one of two or more structural isomers in which equilibrium exists and can easily convert from one isomeric form to another. This transformation results in the formal migration of a hydrogen atom, accompanied by the conversion of adjacent conjugated double bonds. Tautomers exist as a mixture of tautomeric forms in solution. In solution where tautomerism can occur, chemical equilibrium of tautomers will be reached. The exact ratio of tautomers depends on several factors, including temperature, solvent and pH. The concept of tautomers that can interconvert through tautomerization is called tautomerism.

[0038] When a specification describes a compound that is prone to tautomerization, it should be understood that all tautomers are included as part of the described chemical meaning. It should be understood that when a compound has tautomeric forms, it is intended to include all tautomeric forms, and the naming of the compound does not exclude any tautomeric forms.

[0039] Common tautomeric forms are keto-enol, amide-nitrile, lactam-lactam, amide-imidic acid tautomerism in heterocycles, imine-enamine, and enamine-enamine.

[0040] “Isomers” refer to compounds that have the same molecular formula but different atomic arrangements and conformations. The compounds of this disclosure can exist in different stereoisomeric forms. These forms include geometric or optical isomers (enantiomers and / or diastereomers, including atropisomers) . Therefore, this disclosure includes enantiomers, diastereomers, and their mixtures. This disclosure further includes all mixtures of the aforementioned stereoisomers, regardless of the ratio, including racemates.

[0041] According to its structure, a compound disclosed herein can exist in various stable isotope forms. These forms include those in which one or more hydrogen atoms are replaced by deuterium atoms, or / and one or more nitrogen atoms are replaced by 15N atoms, or / and one or more carbon, fluorine, chlorine, bromine, sulfur or oxygen atoms are replaced by stable isotopes of the respective original atoms.

[0042] According to this disclosure, some compounds and salts may exist in different crystalline forms (polymorphs) .

[0043] refer to the absolute configuration of a stereocenter.  refer to chemical bond connections.

[0044] When appears in a ring, it indicates that the connection site is located on any atom on the ring, as long as the atomic valence is permitted.

[0045] The compounds of the present invention can be administered in form of prodrugs. “Prodrugs” refer to derivatives that are converted into biologically active compounds under the physiological condition in vivo, for example, by oxidation, reduction, and hydrolysis (each of which occurs with or without the participation of enzymes) . Examples of a prodrug are a compound of the present invention in which an amino is acylated, alkylated or phosphorylated, for example eicosanoyl amino, alanyl amino and pivaloyloxymethyl amino; a hydroxyl is acylated, alkylated or phosphorylated or converted into borate, for example acetoxy, palmitoyloxy, pivaloyloxy, succinyloxy, fumaroyloxy and alanyloxy; a carbonyl is esterified or amidated; and a thiol forms a disulfide bridge with a carrier molecule that selectively delivers the drug to the target and / or to the cytosol of cells, such as peptide. Prodrugs can be prepared from the compounds of the present invention according to well-known methods.

[0046] “Alkyl” refers to a saturated straight-chain or branched-chain hydrocarbyl substituent containing 1 to 20 carbon atoms, for example, 1 to 8 carbon atoms, 1 to 6 carbon atoms, or 1 to 4 carbon atoms. Unrestricted examples of alkyl include but are not limited to methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, isobutyl, tert-butyl, sec-butyl, n-pentyl, 1, 1-dimethylpropyl, 1, 2-dimethylpropyl, 2, 2-dimethylpropyl, 1-ethylpropyl, 2-methylbutyl, 3-methylbutyl, n-hexyl, 1-ethyl-2-methylpropyl, 1, 1, 2-trimethylpropyl, 1, 1-dimethylbutyl, 1, 2-dimethylbutyl, 2, 2-dimethylbutyl, 1, 3-dimethylbutyl and 2-ethylbutyl.

[0047] “Alkylene” refers to a saturated straight-chain or branched-chain hydrocarbyl divalent substituent containing 1 to 20 carbon atoms, for example, 1 to 6 carbon atoms or 1 to 4 carbon atoms. Unrestricted examples of alkylene include but are not limited to -CH2-, -CH (CH3) -, -CH2CH2-, -CH2CH2CH2-, - (CH3) C (CH3) -, -CH2CH2CH2CH2-and -CH2CH (CH3) CH2-.

[0048] “Heterocyclyl or heterocycle” refers to a saturated or partially unsaturated monocyclic or polycyclic group containing 3 to 20 annular atoms, for example, 3 to 14, 3 to 12, 3 to 10, 3 to 8, 3 to 6, or 5 to 6 annular atoms in which one or more of the annular atoms are selected from N, O and S (O) m (where m is an integer from 0 to 2) . Preferably, it can have 3 to 12 annular atoms, 3 to 10 annular atoms, 4 to 7 annular atoms, and 4 to 6 annular atoms, wherein 1 to 4 are heteroatoms, 1 to 3 are heteroatoms, or 1 to 2 are heteroatoms. Unrestricted examples of monocyclic heterocyclyl include but are not limited to pyrrolidinyl, oxetanyl, piperidyl, piperazinyl, tetrahydrofuranyl, tetrahydropyranyl, tetrahydrothiopyranyl, morpholinyl, thiomorpholinyl, homopiperazinyl and azetidinyl. Polycyclic heterocyclyl includes fused, bridged or spiro polycyclic heterocycle, such as octahydrocyclopenta [c] pyrrole, octahydropyrrole [1, 2-a] pyrazine, 3, 8-diazabicyclo [3.2.1] octane, 5-azaspiro [2.4] heptane and 2-oxa-7-azaspiro [3.5] nonane.

[0049] “Heteroatom” is selected from nitrogen, oxygen or sulfur. Among them, nitrogen can be optionally substituted, and sulfur can also be optionally substituted, such as with oxo to form S (O) t3 (where t3 is an integer from 0 to 2) .

[0050] “Aryl or aryl ring” refers to an aromatic monocyclic or fused polycyclic group containing 6 to 14 carbon atoms, preferably 6-to 10-membered, such as phenyl and naphthyl, most preferably phenyl. The aryl ring can be fused with a heteroaryl, heterocyclyl or cycloalkyl ring, and unrestricted examples include but are not limited to:

[0051] “Solvate” refers to a complex formed by a compound of the present disclosure and a solvent, prepared by precipitation or crystallization out of the solvent. For example, a complex formed with water is called a “hydrate” . Solvates of the compounds in the present disclosure are within the scope of this disclosure.

[0052] “Hydroxyl” refers to -OH.

[0053] “Cyano” refers to -CN.

[0054] “Nitro” refers to -NO2.

[0055] “Oxyl” or “oxo” refers to =O.

[0056] “Carboxyl” refers to -C (=O) OH.

[0057] “Acetyl or Ac” refers to -COCH3.

[0058] “Aldehyde” refers to -C (=O) H.

[0059] “Acetylene” refers to -CH≡C.

[0060] “Ethylene” refers to -CH=CH2.

[0061] “Allene” or refers to CH2=C=CH2.

[0062] “Azido” refers to -N3.

[0063] “Isocyanate” refers to -N=C=O.

[0064] “Hydrophilic” refers to a chemical group that can enhance solubility of a molecule in water. In the design of ADC, introduction of a hydrophilic group helps to improve the pharmacokinetic properties of the drug, such as increasing stability in blood circulation, reducing formation of aggregates, and enhancing the release efficiency in tumor tissues. The types of hydrophilic groups can be diverse, such as polyethylene glycol (PEG) chains, sugar chains, polylysine, etc. They improve the physicochemical properties and biological behavior of ADC by increasing hydrophilicity of the molecule. For example, hydrophilicity of a linker can be enhanced by attaching a PEG chain or a sugar chain, thereby improving the physicochemical properties of the drug.

[0065] “Polyhydroxy” is one type of hydrophilic groups, which includes monosaccharides, disaccharides, and polysaccharides, and their stereoisomers or mixtures of stereoisomers. Exemplary monosaccharides can be C5 or C6 sugars, and further can be glucose, ribose, galactose, mannose, arabinose, 2-deoxyglucose, glyceraldehyde, erythrose, threose, xylose, lyxose, allose, altrose, gulose, idose, deoxyribose, fructose, amino sugar, uronic acid, nucleotide sugar, dihydroxyacetone, ribulose, xylulose, allulose, sorbose, talose, gluconic acid, aldonic acid, uronic acid, fructonic acid, galactonic acid, mannuronic acid, arabic acid, ketoaldonic acid, glucosamine, N-acetylglucosamine, galactosamine, N-sulfated glucosamine, N-acetylmannosamine, fucosamine, rhamnosamine, fructosamine, N-acetylhexosamine, N-methylglucosamine, chitooligosaccharide, N-acetylgalactosamine, etc.

[0066] The disclosed amino acid sequence contains conventional single-letter or three-letter codes for naturally occurring amino acids, as well as universally recognized three-letter codes for other amino acids, such as Gly (α-aminoacetic acid) or G (glycine) . The three-letter and single-letter codes for amino acids used in this disclosure are as described in J. Biol. Chem, 243, p3558 (1968) .

[0067] “Amino acid” refers to a molecule that contains an amino group and a carboxyl group, where the amino and carboxyl groups are attached to the same carbon atom (α-carbon) . The α-carbon can additionally have 1-2 substituents. Amion acids include L and D isomers and racemic mixtures.

[0068] “Antibody-drug conjugate (ADC) ” refers to the connection of a biologically active small molecule drug to an antibody via a chemical linker, where the antibody serves as a carrier to deliver the small molecule drug to target cells.

[0069] “Antibody” described in the present disclosure refers to an immunoglobulin, which has a four-peptide chain structure composed of two identical heavy chains and two identical light chains connected by interchain disulfide bonds. The amino acid composition and sequence arrangement of the constant region of the heavy chain differ, resulting in different antigenic properties. Accordingly, immunoglobulins can be classified into five types, also known as immunoglobulin isotypes, namely IgM, IgD, IgG, IgA and IgE, according to their corresponding heavy chains being μ, δ, γ, α and ε chain, respectively. The same class of Ig can be further divided into different subclasses based on differences in the amino acid composition of the hinge region, and the number and position of heavy chain disulfide bonds. For example, IgG can be divided into IgG1, IgG2, IgG3 and IgG4. Light chains are classified into κ or λ chains based on differences in their constant regions. Among five classes of Ig, each can have either κ or λ chains.

[0070] In the present disclosure, the antibody light chain variable region may further comprise a light chain constant region, wherein the light chain constant region comprises human or murine κ or λ chains, or variants thereof.

[0071] In the present disclosure, the antibody heavy chain variable region may further comprise a heavy chain constant region, wherein the heavy chain constant region comprises human or murine IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, or variants thereof.

[0072] The sequence of approximately 110 amino acids near the N-terminus of the antibody heavy chain and light chain varies greatly, forming the variable region (V region) . The remaining amino acid sequence near the C-terminus is relatively conserved, forming the constant region (C region) . The variable region includes 3 hypervariable regions (HVR) and 4 relatively conserved framework regions (FR) . The 3 hypervariable regions determine the specificity of an antibody and are also known as complementarity-determining regions (CDR) . Each light chain variable region (VL) and heavy chain variable region (VH) are composed of 3 CDR regions and 4 FR regions, arranged sequentially from N-terminus to C-terminus as FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. The 3 CDR regions of the light chain are referred to as LCDR1, LCDR2 and LCDR3, while the 3 CDR regions of the heavy chain are referred to as HCDR1, HCDR2 and HCDR3. The CDR amino acid residues of the VL region and VH region of the antibody or antigen-binding fragment described in this disclosure conform in number and position to the known Kabat numbering rules, and the Kabat or ABM definition rules (http:  / / bioinf. org. uk / abs / ) .

[0073] “B7-H3” includes any variant or isoform of B7-H3 naturally expressed by cells. The antibody disclosed herein may cross-react with B7-H3 derived from non-human species. Alternatively, the antibody may be specific to human B7-H3 and may not exhibit cross-reactivity with other species. B7-H3 or any of its variants or isoforms can be isolated from cells or tissues that naturally express them or produced using recombinant techniques commonly known in the field and described herein. Preferably, the anti-B7-H3 antibody targets human-derived B7-H3 with a normal glycosylation pattern.

[0074] “Murine antibody” refers to a monoclonal antibody against human B7-H3 prepared according to those known in the field. During preparation, the B7-H3 antigen is injected into the test subject, and then hybridomas expressing antibodies with the desired sequence or functional characteristics are isolated. In a preferred embodiment of this disclosure, the murine B7-H3 antibody or its antigen-binding fragment may further comprise a light chain constant region of murine κ or λ chain, or its variant, or further comprise a heavy chain constant region of murine IgG1, IgG2, IgG3 or IgG4, or its variant.

[0075] “Human antibody” includes antibodies with variable and constant regions of human immunoglobulin sequences. The human antibodies disclosed herein may include amino acid residues not encoded by human immunoglobulin sequences (e.g., mutations introduced by in vitro random or site-specific mutagenesis or by in vivo somatic cell mutation) . However, the term “human antibody” does not include antibodies where CDR sequences derived from another mammalian species (such as mouse) are transplanted into the human framework sequence (i.e., “humanized antibody” ) .

[0076] “Humanized antibody” also known as CDR-grafted antibody, refers to an antibody produced by transplanting the CDR sequence of a mouse into the framework of a human antibody variable region. Humanized antibody can overcome the strong immune response induced by chimeric antibody due to carrying a large amount of mouse albumen components. To avoid decrease in activity while reducing immunogenicity, minimal back mutation is performed on the human antibody variable region.

[0077] “Antigen-binding fragment” refers to a fragment of an antibody as well as antibody-like molecule that binds to antigen which typically includes at least part of the antigen-binding region or variable region (e.g., one or more CDRs) of the parental antibody. Antibody fragment retains at least some binding specificities of the parental antibody. Typically, when activity is expressed on a molar basis, antibody fragment retains at least 10%of the parental binding activity. Preferably, antibody fragment retains at least 20%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100%or more of the parental antibody's binding affinity to the target. Examples of antigen-binding fragment include, but are not limited to Fab, Fab', F(ab') 2, Fv fragment, linear antibody, single-chain antibody, nanobody, domain antibody and multispecific antibody. Engineered antibody variants are reviewed in Holliger and Hudson, 2005, Nat. Biotechnol. 23: 1126-1136.

[0078] “Fab fragment” consists of a light chain, and the CH1 and variable region of a heavy chain. The heavy chain of a Fab molecule cannot form a disulfide bond with another heavy chain molecule.

[0079] The “Fc” region contains two heavy chain fragments that include the CH2 and CH3 domains of the antibody. The two heavy chain fragments are held together by two or more disulfide bonds and hydrophobic interactions through the CH3 domain.

[0080] “Fab'fragment” contains a light chain and part of a heavy chain that includes the VH domain and CH1 domain as well as the region between the CH1 and CH2 domains, thereby allowing formation of an interchain disulfide bond between two heavy chains of two Fab' fragments to form an F (ab') 2 molecule.

[0081] “F(ab') 2 fragment” contains two light and two heavy chains that include the constant region between the CH1 and CH2 domains, thereby forming interchain disulfide bonds between two heavy chains. Therefore, F (ab') 2 fragment consists of two Fab' fragments held together by disulfide bonds between two heavy chains.

[0082] “Fv region” contains the variable regions from both heavy and light chains but lacks the constant region.

[0083] “Binds to B7-H3” refers to the ability to interact with B7-H3.

[0084] Typically, the disclosed compound or its pharmaceutically acceptable salts, solvates, stereoisomers, prodrugs or antibody-drug conjugates can be formulated with one or more pharmaceutical carriers into suitable dosage forms for administration. These dosage forms are suitable for oral, rectal, topical, intraoral and other parenteral administration (e.g., subcutaneous, intramuscular, intravenous, etc. ) . For example, dosage forms suitable for oral administration include capsules, tablets, granules, syrups, and the like. The disclosed compound can be in the form of solid powders or granules, solutions or suspensions in aqueous or non-aqueous liquids, water-in-oil or oil-in-water emulsions, etc. The aforementioned dosage forms can be prepared by combining the active compound with one or more carriers or excipients using conventional pharmaceutical methods. The carriers thereof need to be compatible with the active compound or other excipients. For solid preparations, commonly used non-toxic carriers include, but are not limited to mannitol, lactose, starch, magnesium stearate, cellulose, glucose, sucrose, and others. Carriers used for liquid preparations include water, saline, glucose solution, ethylene glycol, polyethylene glycol, etc. The active compound can be in a solution or suspension with the aforementioned carriers.

[0085] The disclosed composition is formulated, dosed, and administered in a manner consistent with medical practice standards. The “therapeutically effective amount” of the compound administered is determined by factors such as the specific condition to be treated, the individual being treated, the cause of the condition, the drug's target, and the method of administration.

[0086] “Therapeutically effective amount” refers to an amount of the compound of the present disclosure that exhibits a biological or medical response in an individual, such as reducing or inhibiting enzyme or protein activity, improving symptoms, alleviating conditions, slowing or delaying disease progression, or preventing disease.

[0087] “Pharmaceutically acceptable carrier” refers to a non-toxic, inert, solid or semi-solid substance or liquid filler, diluent, encapsulating material, adjuvant or any type of excipient that is suitable for delivering the active agent to the target sites of patients without affecting the drug’s activity.

[0088] “Patient” or “subject” refers to an animal, preferably a mammal, and more preferably a human. The term “mammal” refers to a warm-blooded vertebrate mammal, including cat, dog, rabbit, bear, fox, wolf, monkey, deer, mouse, pig, and human.

[0089] “Disease” refers to the health condition of a subject in which the subject cannot maintain homeostasis, and if the disease is not improved, the subject’s health condition will deteriorate.

[0090] “Treatment” refers to alleviating, delaying progression, attenuating, preventing, or maintaining an existing disease or condition (e.g., cancer) . Treatment also includes curing one or more symptoms of the disease or condition, preventing its development, or alleviating it to some extents. As used herein, the term “treatment” or “treating” is defined as administering or applying a therapeutic agent to a patient, namely the compound disclosed herein (alone or in combination with another agent) , or administering or applying a therapeutic agent to isolated tissues or cells from a patient (e.g., for diagnostic or ex vivo applications) , where the patient has the disease or condition, signs or symptoms of the disease or condition, or has the potential to develop the disease or condition, for purposes of curing, recovering, alleviating, mitigating, altering, remedying, improving, enhancing, or affecting the disease or condition, the signs or symptoms of the disease or condition, or the likelihood of developing the disease or condition. Such treatments can be specifically tailored or modified based on knowledge in the field of pharmacogenomics. The term “treating” refers to reducing the frequency or severity of at least one sign or symptom of the disease or condition experienced by the subject.

[0091] “Cancer” refers to any type of tumor malignancies, most of which invade surrounding normal tissues, can metastasize to several sites, and may recur and cause patient death unless being adequately treated after surgical removal. Cancers include, but are not limited to squamous cell carcinoma, basal cell carcinoma, adenocarcinoma, hepatocellular carcinoma, and renal cell carcinoma, bladder cancer, intestinal cancer, breast cancer, cervix carcinoma, colon cancer, oesophageal carcinoma, head cancer, renal cancer, hepatic cancer, lung cancer, neck cancer, ovarian, pancreatic, prostate, and gastric; leukaemia, including non-acute and acute leukaemia, such as acute granulocytic leukaemia, acute lymphocytic leukaemia, acute promyelocytic leukaemia (APL) , acute T-cell lymphocytic leukaemia, T-lineage acute lymphocytic leukaemia (T-ALL) , adult T-cell leukaemia, basophilic leukaemia, eosinophilic leukaemia, granulocytic leukaemia, hairy cell leukaemia, leucopenic leukaemia, lymphatic leukaemia, lymphocytic leukaemia, lymphocytic leukaemia, megakaryocytic leukaemia, microgranular leukaemia, leukaemia monocytic, neutrophilic leukaemia, stem cell leukaemia, benign and malignant lymphomas (particularly burkitt's lymphoma and non-hodgkin's lymphoma) , benign and malignant melanomas, myeloproliferative diseases, sarcomas including Ewing’s sarcoma, angiosarcoma, kaposi's sarcoma, liposarcoma, myosarcoma, peripheral neuroectodermal tumor, synovial sarcoma, glioma, astrocytoma, oligodendroglioma, ependymoma, glioblastoma, neuroblastoma, ganglioneuroma, ganglioglioma, neuroepithelioma, pineocytoma, haemangioma, meningeal sarcoma, neurofibroma and neurosarcoma, intestinal cancer, breast cancer, prostate cancer, cervix carcinoma, uterine cancer, lung cancer, ovarian cancer, testis cancer, thyroid cancer, astrocytoma, oesophageal carcinoma, pancreatic carcinoma, gastric cancer, hepatic cancer, colon cancer, melanoma, carcinosarcoma, Hodgkin's disease, nephroblastoma, teratocarcinoma, etc.

[0092] If the severity of signs or symptoms of a disease or condition and / or the frequency of such signs or symptoms with which the patient experiences are reduced, the disease or condition is considered “alleviated” .

[0093] “Inhibition” refers to blockage or reduction of activity by at least ten percent relative to the control value. Preferably, the activity is inhibited or blocked by 50%compared to the control value, more preferably by 75%, even more preferably by 95%or more.

[0094] “Pharmaceutical composition” refers to a mixture of at least one compound of the present disclosure and a pharmaceutically acceptable carrier. The pharmaceutical composition facilitates the administration of the compound to a patient or subject. There are various techniques for administering compounds known in the field, including but not limited to intravenous, oral, aerosol, parenteral, ocular, pulmonary, and topical administration. The terms “pharmaceutical composition” , “therapeutic composition” , “therapeutic formulation” and “pharmaceutically acceptable formulation” refer to, but are not limited to compositions or formulations that allow for effective distribution of the compound of the present disclosure in a form suitable for administration by a way most appropriate for achieving its desired activity, such as systemic administration.

[0095] The first aspect of the present invention provides a linker that is useful for connecting an antibody or a polypeptide to a biologically active molecule or fragment thereof, having a structure as shown in Formula I:

[0096] wherein,

[0097] X is N or CRX;

[0098] Y is absent or NRY;

[0099] E1 and E2 are each independently bond or C1-8 alkylene;

[0100] A is -C (=O) -or -NRn-;

[0101] C is a group that can be conjugated to antibodies or peptides;

[0102] W is a hydrophilic group;

[0103] P is a peptide containing 1 to 8 amino acids;

[0104] R is a group that can be connected to a functional group on a biologically active molecule or its fragment, or a leaving group after coupling with a substituent of a biologically active molecule or its fragment;

[0105] M is absent or a self-immolative group;

[0106] Rn is hydrogen or C1-8 alkyl; and

[0107] RX and RY are each independently hydrogen or C1-8 alkyl.

[0108] In some embodiments, X is N, Y is absent, or X is CRX, Y is NRY, where RX and RY are each independently hydrogen or C1-8 alkyl.

[0109] In some embodiments, X is N, Y is absent, or X is CH, Y is NH or N (CH3) .

[0110] In some embodiments, X is N, Y is absent.

[0111] In some embodiments, X is CRX, Y is NRY, where RX and RY are each independently hydrogen or C1-8 alkyl.

[0112] In some embodiments, X is CH, Y is NH.

[0113] In some embodiments, X is CH, Y is N (CH3) .

[0114] In some embodiments, E1 and E2 are C1-6 alkylene.

[0115] In some embodiments, E1 is methylene or ethylene.

[0116] In some embodiments, E1 is methylene.

[0117] In some embodiments, E2 is methylene or ethylene.

[0118] In some embodiments, E2 is methylene.

[0119] In some embodiments, E1 and E2 are both methylene.

[0120] In some embodiments,  is (including ) ,

[0121] In some embodiments,  is

[0122] In some embodiments,  is

[0123] In some embodiments,  is

[0124] In some embodiments,  is

[0125] In some embodiments,  is

[0126] In some embodiments,  is

[0127] In some embodiments, a compound of Formula I has a structure as shown in Formula IA:

[0128] wherein, C, Y, X, W, E1, E2, P, M and R are as described in Formula I.

[0129] In some embodiments, W is or -NRW4RW5;

[0130] wherein, RW1 is hydrogen, C1-8 alkyl or a polyhydroxyl group, preferably hydrogen or methyl;

[0131] RW2 is hydrogen or C1-8 alkyl, preferably methyl;

[0132] RW3 is hydroxyl or -NRaRb;

[0133] RW4 and RW5 are each independently hydrogen, C1-8 alkyl or a polyhydroxyl group;

[0134] m3 and m4 are each independently an integer from 6 to 30;

[0135] Ra and Rb are each independently hydrogen or C1-8 alkyl, preferably hydrogen or methyl.

[0136] In some embodiments, W is where RW1 is hydrogen, C1-8 alkyl or a polyhydroxyl group; m3 is an integer of 6-30.

[0137] In some embodiments, W is where RW1 is hydrogen, C1-8 alkyl or a polyhydroxyl group; m3 is an integer of 8-24.

[0138] In some embodiments, W is where RW1 is hydrogen, C1-8 alkyl or a polyhydroxyl group; m3 is 8, 12 or 24.

[0139] In some embodiments, W is where RW1 is hydrogen; m3 is an integer of 6-30.

[0140] In some embodiments, W is where RW1 is hydrogen; m3 is an integer of 8-24.

[0141] In some embodiments, W is where RW1 is hydrogen; m3 is 8, 12 or 24.

[0142] In some embodiments, W is where RW2 is hydrogen or C1-8 alkyl; RW3 is hydroxyl or -NRaRb; m4 is an integer from 6 to 30.

[0143] In some embodiments, W is where RW2 is hydrogen or C1-8 alkyl; RW3 is hydroxyl or -NRaRb; m4 is 12 or 24.

[0144] In some embodiments, W is where RW2 is hydrogen or C1-8 alkyl; RW3 is hydroxyl or -NRaRb; m4 is 12.

[0145] In some embodiments, W is where RW2 is hydrogen or C1-8 alkyl; m4 is an integer from 6 to 30.

[0146] In some embodiments, W is where RW2 is hydrogen or C1-8 alkyl; m4 is 12 or 24.

[0147] In some embodiments, W is where RW2 is hydrogen or C1-8 alkyl; m4 is an integer from 6 to 30.

[0148] In some embodiments, W is where RW2 is hydrogen or C1-8 alkyl; m4 is 12 or 24.

[0149] In some embodiments, W is where RW2 is hydrogen or C1-8 alkyl; m4 is 12.

[0150] In some embodiments, W is where RW1 is hydrogen, C1-8 alkyl or a polyhydroxyl group; RW4 is a polyhydroxyl group; m3 is an integer from 6 to 30.

[0151] In some embodiments, W is where RW1 is hydrogen, C1-8 alkyl or a polyhydroxyl group; RW4 is a polyhydroxyl group; m3 is 8 or 12.

[0152] In some embodiments, W is where RW1 is hydrogen, C1-8 alkyl or a polyhydroxyl group; RW4 is a polyhydroxyl group; m3 is 12.

[0153] In some embodiments, W is where RW4 is a polyhydroxyl group; m3 is 8 or 12.

[0154] In some embodiments, W is where RW4 is a polyhydroxyl group; m3 is 12.

[0155] In some embodiments, W is where RW1 is hydrogen, C1-8 alkyl or a polyhydroxyl group; RW4 is a polyhydroxyl group; m3 is an integer from 6 to 30.

[0156] In some embodiments, W is where RW1 is hydrogen, C1-8 alkyl or a polyhydroxyl group; RW4 is a polyhydroxyl group; m3 is 8, 12, or 24.

[0157] In some embodiments, W is where RW1 is hydrogen, C1-8 alkyl or a polyhydroxyl group; RW4 is a polyhydroxyl group; m3 is 8.

[0158] In some embodiments, W is where RW1 is hydrogen, C1-8 alkyl or a polyhydroxyl group; RW4 is a polyhydroxyl group; m3 is 12.

[0159] In some embodiments, W is where RW1 is hydrogen, C1-8 alkyl or a polyhydroxyl group; RW4 is a polyhydroxyl group; m3 is 24.

[0160] In some embodiments, W is where RW4 is a polyhydroxyl group; m3 is an integer from 6 to 30.

[0161] In some embodiments, W is where RW4 is a polyhydroxyl group; m3 is 8, 12 or 24.

[0162] In some embodiments, W is where RW4 is a polyhydroxyl group; m3 is 8.

[0163] In some embodiments, W is where RW4 is a polyhydroxyl group; m3 is 12.

[0164] In some embodiments, W is where RW4 is a polyhydroxyl group; m3 is 24.

[0165] In some embodiments, W is where RW4 is a polyhydroxyl group; m3 is an integer from 6 to 30.

[0166] In some embodiments, W is where RW4 is a polyhydroxyl group; m3 is 8, 12 or 24.

[0167] In some embodiments, W is where RW4 is a polyhydroxyl group; m3 is 8.

[0168] In some embodiments, W is where RW4 is a polyhydroxyl group; m3 is 12.

[0169] In some embodiments, W is where RW4 is a polyhydroxyl group; m3 is 24.

[0170] In some embodiments, W is where RW1 is hydrogen, C1-8 alkyl or a polyhydroxyl group; RW4 and RW5 are polyhydroxyl groups; m3 is an integer from 6 to 30.

[0171] In some embodiments, W is where RW1 is hydrogen, C1-8 alkyl or a polyhydroxyl group; RW4 and RW5 are polyhydroxyl groups; m3 is 8, 12 or 24.

[0172] In some embodiments, W is where RW1 is hydrogen, C1-8 alkyl or a polyhydroxyl group; RW4 and RW5 are polyhydroxyl groups; m3 is 8.

[0173] In some embodiments, W is where RW1 is hydrogen, C1-8 alkyl or a polyhydroxyl group; RW4 and RW5 are polyhydroxyl groups; m3 is 12.

[0174] In some embodiments, W is where RW4 and RW5 are polyhydroxyl groups; m3 is an integer from 6 to 30.

[0175] In some embodiments, W is where RW4 and RW5 are polyhydroxyl groups; m3 is 8, 12 or 24.

[0176] In some embodiments, W is where RW4 and RW5 are polyhydroxyl groups; m3 is 8.

[0177] In some embodiments, W is where RW4 and RW5 are polyhydroxyl groups; m3 is 12.

[0178] In some embodiments, W is where RW4 and RW5 are polyhydroxyl groups; m3 is an integer from 6 to 30.

[0179] In some embodiments, W is where RW4 and RW5 are polyhydroxyl groups; m3 is 8, 12 or 24.

[0180] In some embodiments, W is where RW4 and RW5 are polyhydroxyl groups; m3 is 8.

[0181] In some embodiments, W is where RW4 and RW5 are polyhydroxyl groups; m3 is 12

[0182] In some embodiments, W is

[0183] In some embodiments, W is

[0184] In some embodiments, W is

[0185] In some embodiments, W is

[0186] In some embodiments, W is

[0187] In some embodiments, W is

[0188] In some embodiments, W is

[0189] In some embodiments, W is

[0190] In some embodiments, W is

[0191] In some embodiments, A is -NRn-; W is Rn is hydrogen or C1-8 alkyl; m3 is an integer from 6 to 30; RW4 and RW5 are each independently hydrogen, C1-8 alkyl or a polyhydroxyl group.

[0192] In some embodiments, Rn is hydrogen.

[0193] In some embodiments, Rn is C1-8 alkyl.

[0194] In some embodiments, Rn is C1-6 alkyl.

[0195] In some embodiments, Rn is methyl, ethyl, propyl or isopropyl.

[0196] In some embodiments, W is where m3 is an integer from 6 to 30.

[0197] In some embodiments, W is where m3 is an integer from 8 to 24.

[0198] In some embodiments, W is where m3 is 8, 12 or 24.

[0199] In some embodiments, W is where m3 is an integer from 6 to 30; RW4 and RW5 are each independently hydrogen, C1-8 alkyl or a polyhydroxyl group.

[0200] In some embodiments, W is where m3 is an integer from 8 to 24; RW4 and RW5 are each independently hydrogen, C1-8 alkyl or a polyhydroxyl group.

[0201] In some embodiments, W is where m3 is 8, 12 or 24; RW4 and RW5 are each independently hydrogen, C1-8 alkyl or a polyhydroxyl group.

[0202] In some embodiments, W is

[0203] In some embodiments, a polyhydroxyl group is where nw is an integer from 0 to 8 (e.g., 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 or 8) . The specification of the polyhydroxyl group herein is merely as exemplary and does not intend to limit to specific stereochemistry. The disclosed structural fragment can carry a larger number of hydroxyl groups, helping to improve hydrophilicity and / or stability of the compounds disclosed herein.

[0204] In some embodiments, C is where G is halogen, formyl, acetylenyl, ethylenyl, allenyl, azido, isocyanato, -C1-8 alkyl-RG3, -O-NH2,

[0205] Ar is aryl (e.g., phenyl or naphthyl) ;

[0206] indicates single or double bond;

[0207] RG1 is hydrogen or nitro;

[0208] RG2 is hydrogen or C1-8 alkyl;

[0209] RG3 is halogen;

[0210] RG41 and RG42 are each independently selected from hydrogen, halogen, or -S-phenyl group, where the phenyl is optionally substituted with one or more substituents selected from cyano, halogen, C1-8 alkyl, C1-8 alkoxy, ester or amide; and RG41 and RG42 can not be hydrogen at the same time;

[0211] RG51, RG52 and RG53 are each independently selected from hydrogen, halogen, nitro, cyano, thiocyanato, C1-8 alkyl, C2-8 alkenyl, C2-8 alkynyl, C6-10 aryl, 4-to 10-membered heteroaryl, C3-9 cycloalkyl, 3-to 9-membered heterocyclyl, - (OCH2CH2) pOCH3, -ORG54, -SRG54, -N (RG54) 2, -C (=O) RG54, -C (=O) ORG54, -C (=O) N (RG54) 2, -C (=S) ORG54, -C (=S) N (RG54) 2, -C (=S) SRG54, -NRG54 (C=O) RG54, -NRG54 (C=S) N (RG54) 2, -O (C=O) N (RG54) 2, -S (=O) 2RG54 or -S (=O) 2ORG54;

[0212] Each RG54 is independently selected from hydrogen, C1-8 alkyl, C2-8 alkenyl or C2-8 alkynyl;

[0213] p is an integer from 1 to 6;

[0214] LG is Q1, LG1 or -LG2-Q2-LG3-;

[0215] Q1 and Q2 are each independently selected from NRG6, O, S, (CH2) m, (CHRG6) m, (CH2CH2O) m, C (O) NRG6, NRG6C (O) , C6-10 aryl, 4-to 10-membered heteroaryl, C3-9 cycloalkyl or 3-to 9-membered heterocyclyl;

[0216] LG1, LG2 and LG3 are each independently selected from absent, - (CH2) m-, - (CHRG6) m-, -(CH2CH2O) m-, - (CH2CH2O) m- (CH2) m-or - (CH2) m (CH2CH2O) m-;

[0217] RG6 is hydrogen, C1-8 alkyl, C3-9 cycloalkyl, C6-10 aryl or 4-to 10-membered heteroaryl;

[0218] Each m is independently 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10;

[0219] Preferably, LG is -O- (CH2) m-, C6-10 aryl, - (CH2) m-C6-10 aryl-, -C6-10 aryl- (CH2) m-, C3-9 cycloalkyl, - (CH2) m- (C3-9 cycloalkyl) -, - (C3-9 cycloalkyl) - (CH2) m-, - (CH2) m- (3-to 9-membered heterocyclyl) -, - (3-to 9-membered heterocyclyl) - (CH2) m-, - (CH2) mC (O) NRG6 (CH2) m-, - (CH2CH2O) m-, - (CH2CH2O) m-CH2-, - (CH2CH2O) m-CH2CH2-, - (CH2) mC (O) NRG6 (CH2CH2O) m-, - (CH2) mC (O) NRG6 (CH2CH2O) m-CH2-, - (CH2) mC (O) NRG6 (CH2CH2O) m-CH2CH2-, - (CH2CH2O) mC (O) NRG6 (CH2CH2O) m-, - (CH2CH2O) mC (O) NRG6 (CH2CH2O) m-CH2-, - (CH2CH2O) mC (O) NRG6 (CH2CH2O) m-CH2CH2-or - (CH2CH2O) mC (O) NRG6 (CH2) m-.

[0220] In some embodiments, G is C1-8 alkyl-RG3, where RG3 is halogen.

[0221] In some embodiments, G is

[0222] In some embodiments, G is where RG1 is hydrogen or nitro.

[0223] In some embodiments, G is where RG3 is halogen.

[0224] In some embodiments, G is where RG2 is hydrogen or C1-8 alkyl.

[0225] In some embodiments, G is where RG2 is hydrogen or methyl.

[0226] In some embodiments, G is where RG41 and RG42 are each independently selected from hydrogen, halogen or -S-phenyl, where the phenyl is optionally substituted with one or more substituents selected from cyano, halogen, C1-8 alkyl, C1-8 alkoxy, ester or amide; and RG41 and RG42 can not be hydrogen at the same time.

[0227] In some embodiments, G is where RG3 is halogen.

[0228] In some embodiments, G is where RG3 is halogen.

[0229] In some embodiments, C is

[0230] where RC1 is hydrogen or C1-8 alkyl; RC2 is halogen; n1, n2, n3, n4 and n5 are each independently 0, 1, 2, 3, 4 or 5.

[0231] In some embodiments, C is where n1 is 1, 2, 3, 4 or 5.

[0232] In some embodiments, C is where RC1 is hydrogen or methyl; n2 is 1, 2, 3, 4 or 5.

[0233] In some embodiments, C is where RC1 is hydrogen or methyl; n3 is 1, 2, 3, 4 or 5; n4 is 0, 1, 2, 3, 4 or 5.

[0234] In some embodiments, C is where n3 is 1, 2, 3, 4 or 5; n4 is 0, 1, 2, 3, 4 or 5.

[0235] In some embodiments, C is where RC2 is halogen; n5 is 0, 1, 2, 3, 4 or 5.

[0236] In some embodiments, C is

[0237] In some embodiments, M is *L1-LM1-LM2-LM3-LM4-LM5-**L1, where LM1, LM2, LM3, LM4 and LM5 are each independently selected from absent, -NH-, methylene, phenylene, -O-or acyl; *L1 indicates connection to P and **L1 indicates connection to R.

[0238] In some embodiments, M is absent,  where *L1 indicates connection to P and **L1 indicates connection to R.

[0239] In some embodiments, the amino acid is selected from alanine (Phe) , glycine (Gly) , valine (Val) , alanine (Ala) , leucine (Leu) , lysine (Lys) , citrulline (Cit) , arginine (Arg) or asparagine (Asn) , and the side chains of the amino acids are optionally substituted with alkyl or a hydrophilic group.

[0240] In some embodiments, P is peptide containing 2 amino acids, tripeptide containing 3 amino acids or tetrapeptide containing 4 amino acids.

[0241] In some embodiments, P is dipeptide selected from *L2-Phe-Lys-**L2, *L2-Val-Ala-**L2, *L2-Val-Lys-**L2, *L2-Ala-Lys-**L2, *L2-Val-Cit-**L2, *L2-Phe-Cit-**L2, *L2-Leu-Cit-**L2, *L2-Phe-Arg-**L2 or *L2-Gly-Val-**L2, where *L2 indicates connection to and **L2 indicates connection to M.

[0242] In some embodiments, P is tripeptide selected from *L2-Glu-Val-Ala-**L2, *L2-Glu-Val-Cit-**L2, *L2-Ala-Ala-Ala-**L2, *L2-Ala-Ala-Asn-**L2 or where *L2 indicates connection to and **L2 indicates connection to M.

[0243] In some embodiments, P is tetrapeptide selected from *L2-Gly-Gly-Phe-Gly-**L2, *L2-Gly-Gly-Val-Ala-**L2 or *L2-Gly-Phe-Gly-Gly-**L2, preferably *L2-Gly-Gly-Phe-Gly-**L2, where *L2 indicates connection to and **L2 indicates connection to M

[0244] In some embodiments, P is where *L2 indicates connection to and **L2 indicates connection to M.

[0245] In some embodiments, R is a group that can be conjugated to amino, hydroxyl or carboxyl, or a leaving group after coupling with amino, hydroxy or carboxy, such as hydrogen, hydroxy, carboxy, ester or halogen.

[0246] In some embodiments, R is halogen, hydroxy, acetoxy or

[0247] In some embodiments, the compounds of Formula I are the following compounds:

[0248] wherein R is a group that can be connected to a functional group of a biologically active molecule or its fragment, or a leaving group after coupling with a substituent on a biologically active molecule or its fragment.

[0249] In some embodiments, R is a group that can be conjugated to amino, hydroxyl or carboxyl, or a leaving group after conjugating to amino, hydroxy or carboxy; preferably, R is halogen, hydroxy, acetoxy or

[0250] The second aspect of the present disclosure provides the use of the compounds described in the first aspect of the present disclosure for the preparation of linker-drug conjugates, polypeptide-drug conjugates or antibody-drug conjugates.

[0251] The third aspect of the present disclosure provides linker-drug conjugates which comprise a biologically active molecule or a fragment thereof and a linker, wherein the linker is a compound described in the first aspect of the present disclosure.

[0252] The fourth aspect of the present disclosure provides antibody-drug conjugates which comprise a biologically active molecule or a fragment thereof, a linker and an antibody or an antigen-binding fragment thereof, wherein the linker is a compound described in the first aspect of the present disclosure.

[0253] The fourth aspect of the present disclosure provides antibody-drug conjugates as shown in Formula II:

[0254] wherein,

[0255] X, Y, W, P, M, E1, E2 and A are as described in Formula I;

[0256] C′ is a linker for conjugating to an antibody or its antigen-binding fragment;

[0257] Ab is an antibody or its antigen-binding fragment;

[0258] nLD = 1-8 and is an average number of linker-drug conjugates per antibody (DAR) ;

[0259] D is a biologically active molecule or its fragment.

[0260] In some embodiments, C′is

[0261] where indicates connection to an antibody or its antigen-binding fragment and indicateds connection to Y.

[0262] In some embodiments, D is a topoisomerase I inhibitor or microtubule inhibitor.

[0263] In some embodiments, the topoisomerase I inhibitor is a camptothecin derivative.

[0264] In some embodiments, the microtubule inhibitor is MMAE or its derivative.

[0265] In some embodiments, D has a structure as shown in Formula IIA:

[0266] wherein,

[0267] YD1 is NRD1, O, S or (CH2) nD1;

[0268] RD1 is hydrogen or C1-8 alkyl;

[0269] nD1 is 0, 1 or 2;

[0270] XD1 and XD2 are each independently hydrogen, halogen, cyano, hydroxy, nitro, -NRe1Re2, C1-8 alkyl or -O-C1-8 alkyl; or XD1, XD2 and the ring atoms to which they are attached to form C4-9 cycloalkyl or 4-to 9-membered heterocyclyl;

[0271] LD3 is -NRf-M, -C1-8 alkylene-O-M or -NRf-C (O) -C1-8 alkylene-O-M, where the alkylene is optionally substituted with alkyl, cycloalkyl or fluorinated alkyl; -M indicates connection to M of an antibody-drug conjugate as shown in Formula II;

[0272] Re1, Re2 and Rf are each independently hydrogen or C1-8 alkyl.

[0273] In some embodiments, LD3 is -NH-M or -NH-C (O) -CH2-O-M.

[0274] In some embodiments, D has a structure as shown in Formula IIB:

[0275] wherein,

[0276] YD1 is NRD1, O, S or (CH2) nD1;

[0277] RD1 is hydrogen or C1-8 alkyl;

[0278] nD1 is 0, 1 or 2;

[0279] LD4 is -NRh-M, -C1-6 alkylene- (OC2-6 alkylene) nD2-YD2-M, - (OC2-6 alkylene) nD2-YD2-M or -NRc-C (O) -C1-8 alkylene-O-M, where YD2 is O or NRc; nD2 is an integer from 0 to 8; -M indicates connection to M of an antibody-drug conjugate as shown in Formula II;

[0280] XD4 is hydrogen, halogen, cyano, hydroxyl, nitro, -NRg1Rg2, C1-8 alkyl or -O-C1-8 alkyl;

[0281] RD3 is hydrogen or optionally substituted C1-8 alkyl;

[0282] Rg1, Rg2 and Rh are each independently hydrogen or C1-8 alkyl.

[0283] In some embodiments, LD4 is -NH-M or -CH2-O-M.

[0284] In some embodiments, D is

[0285] The fourth aspect of this disclosure provides the following antibody-drug conjugates:

[0286] wherein Ab is an antibody or its antigen-binding fragment.

[0287] In some embodiments, the antibody or its antigen-binding fragment is an anti-B7-H3 antibody or its antigen-binding fragment, or an anti-Her2 antibody or its antigen-binding fragment.

[0288] In some embodiments, the anti-B7-H3 antibody or its antigen-binding fragment comprises a heavy chain variable region and a light chain variable region, where the heavy chain variable region comprises HCDR1 shown as SEQ ID NO 1, HCDR2 shown as SEQ ID NO 2 or HCDR3 shown as SEQ ID NO 3; the light chain variable region comprises LCDR1 shown as SEQ ID NO 4, LCDR2 shown as SEQ ID NO 5 or LCDR3 shown as SEQ ID NO 6.

[0289] In some embodiments, the heavy chain variable region comprises HCDR1 as shown in SEQ ID NO 1, HCDR2 as shown in SEQ ID NO 2 or HCDR3 as shown in SEQ ID NO 3; the light chain variable region comprises LCDR1 as shown in SEQ ID N 4, LCDR2 as shown in SEQ ID NO 5 or LCDR3 as shown in SEQ ID NO 6.

[0290] In some embodiments, the anti-B7-H3 antibody or its antigen-binding fragment comprises a heavy chain and a light chain, where the heavy chain is selected from SEQ ID NO 7, SEQ ID NO 9, SEQ ID NO 11, SEQ ID NO 13, or a heavy chain with at least 80%, 85%, 90%, 95%or 99%sequence similarity; the light chain is selected from SEQ ID NO 8, SEQ ID NO 10, SEQ ID NO 12, SEQ ID NO 14, or a light chain with at least 80%, 85%, 90%, 95%or 99%sequence similarity.

[0291] In some embodiments, the anti-B7-H3 antibody or its antigen-binding fragment comprises:

[0292] (1) A heavy chain as shown in SEQ ID NO 7 and a light chain as shown in SEQ ID NO 8;

[0293] (2) A heavy chain as shown in SEQ ID NO 9 and a light chain as shown in SEQ ID NO 10;

[0294] (3) A heavy chain as shown in SEQ ID NO 11 and a light chain as shown in SEQ ID NO 12; or

[0295] (4) A heavy chain as shown in SEQ ID NO 13 and a light chain as shown in SEQ ID NO 14.

[0296] In some embodiments, the antibody or its antigen-binding fragment is selected from murine antibody or its antigen-binding fragment, chimeric antibody or its antigen-binding fragment, human antibody or its antigen-binding fragment, or humanized antibody or its antigen-binding fragment.

[0297] The fifth aspect of the present disclosure provides the use of the antibody-drug conjugates described in the fourth aspect for the preparation of medicines for treating cancer.

[0298] In some embodiments, the linker-drug conjugates described in the third aspect of this disclosure have a structure as shown in Formula III:

[0299] wherein,

[0300] C, Y, X, A, W, P, M, E1 and E2 are as described in Formula I;

[0301] D is a biologically active molecule or its fragment;

[0302] In some embodiments, D is a topoisomerase I inhibitor or microtubule inhibitor.

[0303] In some embodiments, the topoisomerase I inhibitor is a camptothecin derivative.

[0304] In some embodiments, the microtubule inhibitor is MMAE or its derivative.

[0305] In some embodiments, D is a compound represented by Formula IIA or Formula IIB, where the compound of Formula IIA or Formula IIB is connected to M of the compound of Formula III through LD3 or LD4.

[0306] In some embodiments, the linker-drug conjugate is selected from any of LD-1 to LD-32.

[0307] The sixth aspect of this disclosure provides the following compounds:

[0308] The seventh aspect of the present disclosure provides a pharmaceutical composition comprising the compounds of the first aspect of the present disclosure, the linker-drug conjugates of the third aspect of the present disclosure, the antibody-drug conjugates of the fourth aspect of the present disclosure, or the compounds of the sixth aspect of the present disclosure, and optionally a pharmaceutically acceptable carrier.

[0309] The eighth aspect of the present disclosure provides an anti-B7-H3 antibody or its antigen-binding fragment, comprising a heavy chain variable region and a light chain variable region, where the heavy chain variable region comprises HCDR1 having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO 1 or any variant thereof, HCDR2 having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO 2 or any variant thereof, or HCDR3 having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO 3 or any variant thereof; the light chain variable region comprises: LCDR1 having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO 4 or any variant thereof, LCDR2 having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO 5 or any variant thereof, or LCDR3 having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO 6 or any variant thereof.

[0310] In some embodiments, the heavy chain variable region comprises HCDR1 as shown in SEQ ID NO 1, HCDR2 as shown in SEQ ID NO 2, or HCDR3 as shown in SEQ ID NO 3; the light chain variable region comprises LCDR1 as shown in SEQ ID NO 4, LCDR2 as shown in SEQ ID NO 5, or LCDR3 as shown in SEQ ID NO 6.

[0311] In some embodiments, the anti-B7-H3 antibody or its antigen-binding fragment comprises a heavy chain and a light chain, where the heavy chain is selected from SEQ ID NO 7, SEQ ID NO 9, SEQ ID NO 11, SEQ ID NO 13, or a heavy chain with at least 80%, 85%, 90%, 95%or 99%sequence similarity; the light chain is selected from SEQ ID NO 8, SEQ ID NO 10, SEQ ID NO 12, SEQ ID NO 14, or a light chain with at least 80%, 85%, 90%, 95%or 99%sequence similarity.

[0312] In some embodiments, the anti-B7-H3 antibody or its antigen-binding fragment comprises:

[0313] (1) A heavy chain as shown in SEQ ID NO 7 and a light chain as shown in SEQ ID NO 8;

[0314] (2) A heavy chain as shown in SEQ ID NO 9 and a light chain as shown in SEQ ID NO 10;

[0315] (3) A heavy chain as shown in SEQ ID NO 11 and a light chain as shown in SEQ ID NO 12; or

[0316] (4) A heavy chain as shown in SEQ ID NO 13 and a light chain as shown in SEQ ID NO 14.

[0317] In some embodiments, the antibody or its antigen-binding fragment is selected from murine antibody or its antigen-binding fragment, chimeric antibody or its antigen-binding fragment, human antibody or its antigen-binding fragment, or humanized antibody or its antigen-binding fragment.

[0318] This disclosure includes variants of B7-H3 antigen-binding fragments, including functionally equivalent polypeptides that do not significantly affect the characteristics of the molecules, as well as variants with enhanced or reduced activity. Modifications of polypeptides are commonly known in the field. Examples of modified polypeptides include those with conservative substitutions of amino acid residues, one or more deletions or additions of amino acids that do not significantly or detrimentally alter functional activity, or the use of chemical analogs. Conservatively substitutable amino acid residues include but are not limited to glycine / alanine, serine / threonine, valine / isoleucine / leucine, asparagine / glutamine, aspartic acid / glutamic acid, lysine / arginine, and alanine / tyrosine. The polypeptides also include glycosylated and non-glycosylated ones, as well as polypeptides with other post-translational modifications, for example, glycosylation with different sugars, acetylation and other modifications. Preferably, amino acid substitutions should be conservative, meaning that the substituted amino acid has chemical properties similar to the original amino acid. Such conservative substitutions are known in the field. Amino acid modifications can range from altering or modifying one or more amino acids to completely redesigning regions such as variable domains. Changes in the variable domain can alter binding affinity and / or specificity. Other methods of modification include the use of conjugation techniques known in the field, including but not limited to enzymatic means, oxidative substitution and chelation. Modifications can be used, for example, to attach tags for immunoassays, such as attaching a radioactive moiety for radioimmunoassay. Modified polypeptides are prepared using methods known in the field and can be screened using standard assays known in the field.

[0319] The ninth aspect of the present disclosure provides a polynucleotide encoding the anti-B7-H3 antibody or its antigen-binding fragment described in the eighth aspect of the present disclosure.

[0320] The tenth aspect of the present disclosure provides an antibody-drug conjugate, which comprises an antibody or its antigen-binding fragment according to the eighth aspect of the present disclosure covalently attached to a biologically active molecule or a fragment thereof.

[0321] The eleventh aspect of the present disclosure provides a pharmaceutical composition comprising the anti-B7-H3 antibody or its antigen-binding fragment as described in the eighth aspect of the present disclosure, and a pharmaceutically acceptable carrier.

[0322] In the twelfth aspect of the present disclosure, a method for treating a disease is provided, which includes administration to a patient in need the linker-drug conjugate described in the third aspect, the compound described in the sixth aspect, the pharmaceutical composition described in the seventh aspect, the antibody or antigen-binding fragment thereof described in the eighth aspect, the polynucleotide described in the ninth aspect, the antibody-drug conjugate described in the fourth or tenth aspect, or the pharmaceutical composition described in the seventh or eleventh aspect of the present disclosure, wherein the disease is cancer, a B7-H3 mediated disease, or a Her2 mediated disease.

[0323] EXAMPLES

[0324] The starting materials disclosed herein were synthesized using methods known in the art or purchased from chemical companies such as Shaoyuan Chemical Technology (Accela ChemBio Inc. ) , Beijing Coupling, Bide Pharmatech, Zesheng Technology, and Shanghai Haohong Biopharma.

[0325] The structures of the disclosed compounds were determined by nuclear magnetic resonance (NMR) and / or mass spectrometry (MS) . The NMR measurements used a Bruker ASCEND-400 nuclear magnetic instrument with solvents such as deuterated dimethyl sulfoxide (DMSO-d6) , deuterated chloroform (CDC13) or deuterated methanol (CD3OD) , and an internal standard of tetramethylsilane (TMS) . The chemical shift was given in units of 10-6 (ppm) . The MS measurements used an Agilent SQD (ESI) mass spectrometer (Agilent 6120) .

[0326] HPLC used Agilent 1260 DAD high-pressure liquid chromatograph (Poroshell 120 EC-C18, 50×3.0 mm, 2.7 μm column) or Waters ARC high-pressure liquid chromatograph (Sunfire C18, 150×4.6 mm, 5 μm column) .

[0327] Unless otherwise specified, the reaction temperature was room temperature (20℃～30℃) .

[0328] Unless otherwise specified, the reaction was carried out under an argon or a nitrogen atmosphere. An argon or a nitrogen atmosphere refers to that a reaction flask is connected to an approximately 1 L argon or nitrogen balloon. A hydrogen atmosphere refers to that a hydrogen balloon with a volume of approximately 1 L is attached to a reaction flask after being vacuumed and refilled with hydrogen gas repeatedly (about 3 times) .

[0329] The reaction was monitored using an Agilent's LC-MS (1260 / 6120) or thin-layer chromatography (TLC) with the thickness of the silica gel plate being 0.15～0.2 mm (Qingdao Marine gf254) .

[0330] Purification of the compound was carried out using column chromatography or thin-layer chromatography. Column chromatography used 200～300 mesh silica gel from Qingdao Haiyang, while thin-layer chromatography used GF254 silica gel plates with a thickness of 0.4～0.5 mm from Qingdao Haiyang.

[0331] Column chromatography or thin-layer chromatography eluting solvent systems typically were dichloromethane and methanol mixture, petroleum ether and ethyl acetate mixture, or as shown in the examples. The volume ratio of solvents was adjusted according to the polarity of the compound. A small amount of triethylamine or other acidic or basic reagents was added for further adjustment when needed.

[0332] Purification of the compound also used Waters' mass spectrometry-guided automated preparation system (mass spectrometer: SQD2) equipped with a reverse-phase high-pressure column (XBridge-C18, 19×150 mm, 5 μm) , and eluted with an appropriate acetonitrile / water (containing 0.1%TFA or formic acid, or 0.05%ammonia in water) gradient based on the polarity of the compound at a flow rate of 20 mL / min.

[0333] The abbreviation DMF refers to N, N-dimethylformamide.

[0334] The abbreviation DMSO refers to dimethyl sulfoxide.

[0335] The abbreviation NMP refers to N-methylpyrrolidone.

[0336] The abbreviation TFA refers to trifluoroacetic acid.

[0337] The abbreviation DIPEA refers to N, N-diisopropylethylamine.

[0338] The abbreviation DMAP refers to 4-dimethylaminopyridine.

[0339] The abbreviation HOBt refers to 1-hydroxybenzenebenzotriazole.

[0340] The abbreviation HATU refers to O- (7-azabenzotriazol-1-yl) -N, N, N', N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate.

[0341] The abbreviation HBTU refers to 2- (1H-benzotriazol-1-yl) -1, 1, 3, 3-tetramethyluronium hexafluorophosphate.

[0342] The abbreviation PyBOP refers to benzotriazol-1-yloxytris (pyrrolidino) phosphonium hexafluorophosphate.

[0343] The abbreviation EEDQ refers to 2-ethoxy-1-ethoxycarbonyl-1, 2-dihydroquinoline.

[0344] The abbreviation Pd (PPh3) 4 refers to tetrakis (triphenylphosphine) palladium.

[0345] The abbreviation X-phos refers to 2-dicyclohexylphosphino-2', 4', 6'-triisopropylbiphenyl.

[0346] The abbreviation EDCI refers to 1- (3-dimethylaminopropyl) -3-ethylcarbodiimide hydrochloride.

[0347] The abbreviation PPTS refers topyridinium 4-toluenesulfonate.

[0348] The abbreviation TCFH refers to chloro-N, N, N', N'-tetramethylformamidinium hexafluorophosphate.

[0349] The abbreviation NMI refers to N-methylimidazole.

[0350] The abbreviation Fmoc-Ala-Ala-OH refers to (S) -2- ( (S) -2- ( ( ( (9H-fluoren-9-yl) methoxy) carbonyl) amino) propanoylamino) propionic acid.

[0351] The abbreviation DMTMM refers to 4- (4, 6-dimethoxy-1, 3, 5-triazin-2-yl) -4-methylmorpholin-4-ium tetrafluoroborate.

[0352] The abbreviation FmocCl refers to 9-fluorenylmethyl chloroformate

[0353] Example 1. Synthesis of Intermediates

[0354] Intermediate A. 3- (Buta-2, 3-dienamido) propionic acid

[0355] Step 1

[0356] tert-Butyl 3- (buta-2, 3-dienamido) propanoate (A-2)

[0357] A mixture of 3-butynoic acid (0.67 g, 7.93 mmol) , 2-chloro-1-methylpyridinium iodide (2.53 g, 9.91 mmol) and dichloromethane (10 mL) was stirred at room temperature for 1 hour, and then A-1 (hydrochloride salt, 1.2 g, 6.61 mmol) and DIPEA (2.56 g, 19.8 mmol) were added and stirring was continued for additional 10 minutes. The mixture was concentrated under reduced pressure, and the residue was purified by silica gel column chromatography (petroleum ether / ethyl acetate = 60 / 40) to give the target product A-2 (620 mg, 44%) .

[0358] MS m / z (ESI) : 156.3 [M+H+-56]

[0359] Step 2

[0360] 3- (Buta-2, 3-dienamido) propionic acid (A)

[0361] A-2 (300 mg, 1.42 mmol) and TFA (2 mL) were added to dichloromethane (2 mL) at 0℃, and the rsulting mixture was stirred at room temperature for 1 hour. The mixture was concentrated under reduced pressure, and the residue was purified by reverse-phase preparative high-performance liquid chromatography to give the target product A (190 mg, 86%) .

[0362] MS m / z (ESI) : 156.3 [M+H+]

[0363] Intermediate B. 6- (N-methylbuta-2, 3-dienamido) hexanoic acid

[0364] Step 1

[0365] tert-Butyl 6- (benzyl (methyl) amino) hexanoate (B-2)

[0366] B-1 (18.0 g, 71.7 mmol) , N-methyl-1-phenylmethanamine (5.8 g, 47.8 mmol) , potassium iodide (23.8 g, 143 mmol) , cesium carbonate (54.4 g, 143 mmol) and acetonitrile (360 mL) were stirred at 80℃ overnight. Water was added, and the resulting mixture was extracted with ethyl acetate. The organic phase was concentrated under reduced pressure. The residue was purified by reverse-phase preparative high-performance liquid chromatography to give the target product B-2 (13.6 g, 65%) .

[0367] MS m / z (ESI) : 292.2 [M+H+]

[0368] Step 2

[0369] tert-Butyl 6- (methylamino) hexanoate (B-3)

[0370] A mixture of B-2 (13.6 g, 46.7 mmol) , palladium on carbon (10%, containing 55%water, 32.0 g) and methanol (320 mL) was stirred under a hydrogen atmosphere at room temperature overnight. The mixture was filtered, and the filtrate was concentrated to dryness to give the target product B-3 (9.1 g, 97%) .

[0371] MS m / z (ESI) : 202.2 [M+H+]

[0372] Steps 3-4

[0373] 6- (N-Methylbuta-2, 3-dienamido) hexanoic acid (B)

[0374] B was synthesized according to the procedures of Steps 1-2 for A, but B-3 was used instead of A-1.

[0375] MS m / z (ESI) : 212.2 [M+H+]

[0376] Intermediate C. 6- (Buta-2, 3-dienamido) hexanoic acid

[0377] Step 1

[0378] Methyl 6- (buta-2, 3-dienamido) hexanoate (C-2)

[0379] C-2 was synthesized according to the procedure of Step 1 for A, but C-l was used instead of A-l.

[0380] MS m / z (ESI) : 212.3 [M+H+]

[0381] Step 2

[0382] 6- (Buta-2, 3-dienamido) hexanoic acid (C)

[0383] To a solution of C-2 (2.0 g, 9.5 mmol) in tetrahydrofuran (20 mL) at 0℃ was added an aqueous solution of lithium hydroxide (1.0 M, 19 mmol, 19 mL) and the resulting mixture was stirred for 4 hours. Diluted hydrochloric acid (1 N) was added to adjust the solution pH to 6-7. The mixture was concentrated under reduced pressure, and the residue was purified by reverse-phase preparative high-performance liquid chromatography to give the target product C (1.4 g, 75%) .

[0384] MS m / z (ESI) : 198.3 [M+H+]

[0385] Intermediate D. 29, 33-Dioxo-4, 7, 10, 13, 16, 19, 22, 25-octaoxa-28, 32-diazahexatriaconta-34, 35-dienoic acid (D)

[0386] Step 1

[0387] tert-Butyl 29, 33-dioxo-4, 7, 10, 13, 16, 19, 22, 25-octaoxa-28, 32-diazahexatriaconta-34, 35-dienoate (D-2)

[0388] D-1 (498 mg, 1.0 mmol) , A (78 mg, 0.50 mmol) , NMI (120 μL, 1.5 mmol) , TCFH (212 mg, 0.75 mmol) and DMF (2.5 mL) were stirred at room temperature for 1 hour. The mixture was concentrated under reduced pressure to give the target product D-2 (600 mg, crude product) .

[0389] MS m / z (ESI) : 635.3 [M+H+]

[0390] Step 2

[0391] 29, 33-Dioxo-4, 7, 10, 13, 16, 19, 22, 25-octaoxa-28, 32-diazahexatriaconta-34, 35-dienoic acid (D)

[0392] D was synthesized according to the procedure of Step 2 for A, but D-2 was used instead of A-2. MS m / z (ESI) : 579.3 [M+H+]

[0393] Intermediate E. 29-Oxo-4, 7, 10, 13, 16, 19, 22, 25-octaoxa-28-azadotriaconta-30, 31-dienoic acid

[0394] The intermediate E was synthesized according to the procedure for A, but D-1 was used instead of A-1.

[0395] Intermediate F. tert-Butyl 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23, 26, 29, 32, 35-undecamethyl-4, 7, 10, 13, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34-undecaoxo-2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23, 26, 29, 32, 35-dodecaazaheptatriacontan-37-oate

[0396] Step 1

[0397] tert-Butyl N- (N- ( ( (9H-fluoren-9-yl) methoxy) carbonyl) -N-methylglycyl) -N-methylglycinate (F-2)

[0398] To a mixture of F-1 (5.00 g, 16.1 mmol) , tert-butyl methylglycinate (hydrochloride salt, 3.50 g, 19.3 mmol) , DIPEA (13 mL, 80.3 mmol) and dichloromethane (50 mL) was added HATU (9.20 g, 24.1 mmol) , and the reaction mixture was stirred at room temperature for 1 hour. The mixtue was concentrated under reduced pressure, and the residue was purified by silica gel column chromatography (petroleum ether / ethyl acetate = 100 / 0 to 0 / 100) to give the target product F-2 (7.2 g, 100%) .

[0399] MS m / z (ESI) : 439.2 [M+H+]

[0400] Step 2

[0401] N- (N- ( ( (9H-fluoren-9-yl) methoxy) carbonyl) -N-methylglycyl) -N-methylglycine (F-3)

[0402] To a mixture of F-2 (1.00 g, 2.28 mmol) and dichloromethane (5 mL) was added TFA (5 mL) , and the reaction mixture was stirred at room temperature for 1 hour. The mixture was concentrated under reduced pressure to give the target product F-3 (1.00 g, crude product) . This product was used directly in the next step without further purification.

[0403] MS m / z (ESI) : 383.4 [M+H+]

[0404] Step 3

[0405] tert-Butyl 1- (9H-fluoren-9-yl) -4, 7, 10-trimethyl-3, 6, 9-trioxo-2-oxo-4, 7, 10-triazadodecane-12-oate (F-4)

[0406] To a mixture of F-3 (crude product, 1.00 g, 2.28 mmol) , tert-butyl methylglycinate (hydrochloride salt, 497 mg, 2.74 mmol) , DIPEA (1.1 mL, 6.84 mmol) and dichloromethane (10 mL) was added HBTU (1.3 g, 3.42 mmol) , and the reaction mixture was stirred at room temperature for 1 hour. The mixture was concentrated under reduced pressure, and the residue was purified by silica gel column chromatography (dichloromethane / methanol = 100 / 0 to 90 / 10) to give the target product F-4 (990 mg, 85%yield for two steps) .

[0407] MS m / z (ESI) : 510.6 [M+H+]

[0408] Step 4

[0409] 1- (9H-fluoren-9-yl) -4, 7, 10-trimethyl-3, 6, 9-trioxo-2-oxa-4, 7, 10-triazadodecane-12-acid (F-5)

[0410] F-5 was synthesized according to the procedure of Step 2, but F-4 was used instead of F-2.

[0411] MS m / z (ESI) : 454.5 [M+H+]

[0412] Step 5

[0413] tert-Butyl N-methyl-N- (N-methyl-N- (methylglycyl) glycyl) glycinate (F-6)

[0414] To a solution of F-4 (490 mg, 0.96 mmol) in DMF (5 mL) was added diethylamine (1 mL) , and the mixture was stirred at room temperature for 1 hour. The mixture was concentrated under reduced pressure to give the target product F-6 (490 mg, crude product) . This product was used directly in the next step without further purification.

[0415] MS m / z (ESI) : 288.3 [M+H+]

[0416] Steps 6-7

[0417] 1- (9H-Fluoren-9-yl) -4, 7, 10, 13, 16, 19-hexamethyl-3, 6, 9, 12, 15, 18-hexaoxo-2-oxa-4, 7, 10, 13, 19-hexaazahenicosane-21-acid (F-8)

[0418] F-8 was synthesized according to the procedures of Steps 3-4, but F-5 was used instead of F-3 and F-6 was used instead of tert-butyl methylglycinate.

[0419] MS m / z (ESI) : 667.2 [M+H+]

[0420] Step 8

[0421] tert-Butyl 5, 8, 11, 14, 17-pentamethyl-4, 7, 10, 13, 6-pentaoxo-2, 5, 8, 11, 14, 17-hexazanonadecane-19-oate (F-9)

[0422] F-9 was synthesized according to the procedure of Step 5, but F-7 was used instead of F-4.

[0423] MS m / z (ESI) : 501.6 [M+H+]

[0424] Step 9

[0425] tert-Butyl 1- (9H-fluoren-9-yl) -4, 7, 10, 13, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34, 37-dodecamethyl-3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36-dodecaoxo-2-oxa-4, 7, 10, 13, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34, 37-dodecaazanonatriacontan-39-oate (F-10)

[0426] F-10 was synthesized according to the procedure of Step 3, but F-8 was used instead of F-3 and F-9 was used instead of tert-butyl methylglycinate.

[0427] MS m / z (ESI) : 1171.3 [M+Na+]

[0428] Step 10

[0429] tert-Butyl 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23, 26, 29, 32, 35-undecamethyl-4, 7, 10, 13, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34-undecaoxo-2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23, 26, 29, 32, 35-dodecaazaheptatriacontan-37-oate (F)

[0430] F was synthesized according to the procedure of Step 5, but F-10 was used instead of F-4.

[0431] MS m / z (ESI) : 927.5 [M+H+]

[0432] Intermediate G. 1-Amino-N- ( (2S, 3R, 4R, 5R) -2, 3, 4, 5, 6-pentahydroxyhexyl) -3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36-dodecaoxanonatriacontan-39-amide

[0433] Step 1

[0434] (9H-fluoren-9-yl) methyl ( (42S, 43R, 44R, 45R) -42, 43, 44, 45, 46-pentahydroxy-39-oxo-3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36-dodecaoxa-40-azahexatetracontyl) carbamate (G-2)

[0435] To a mixture of G-1 (200 mg, 0.24 mmol) , (2R, 3R, 4R, 5S) -6-aminohexane-1, 2, 3, 4, 5-pentanol (52 mg, 0.29 mmol) , DIPEA (41 μL, 0.24 mmol) and DMF (4 mL) was added HATU (136 mg, 0.36 mmol) , and the reaction mixture was stirred at room temperature for 0.5 hour. The mixture was purified by reverse-phase preparative high-performance liquid chromatography to give the target product G-2 (210 mg, 88%) .

[0436] MS m / z (ESI) : 1003.5 [M+H+]

[0437] Step 2

[0438] 1-Amino-N- ( (2S, 3R, 4R, 5R) -2, 3, 4, 5, 6-pentahydroxyhexyl) -3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36-dodecaoxanonatriacontan-39-amide (G)

[0439] G was synthesized according to the procedure of Step 5 for F, but G-2 was used instead of F-4.

[0440] MS m / z (ESI) : 781.4 [M+H+]

[0441] Intermediate H. 4- ( (S) -2- ( (S) -2-Amino-3-methylbutanamido) -5-ureidopentanamido) benzyl ( (1S, 9S) -9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10, 13-dioxo-2, 3, 9, 10, 13, 15-hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinolin-1-yl) carbamate

[0442] Step 1

[0443] (9H-Fluoren-9-yl) methyl ( (S) -1- ( ( (S) -1- ( (4- ( ( ( ( (1S, 9S) -9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10, 13-dioxo-2, 3, 9, 10, 13, 15-hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinolin-1-yl) carbamoyl) oxy) methyl) phenyl) amino) -1-oxo-5-ureidopentan-2-yl) amino) -3-methyl-1-oxobutan-2-yl) carbamate (H-2)

[0444] A mixture of exatecan (mesylate, 695 mg, 1.31 mmol) , H-1 (1.0 g, 1.31 mmol) , DIPEA (506 mg, 3.92 mmol) , HOBt (212 mg, 1.57 mmol) and DMF (10 mL) was stirred at room temperature for 1 hour. Water was added, and the mixture was filtered. The solid was washed with dichloromethane and dried to give the target product H-2 (1.4 g, 100%) .

[0445] MS m / z (ESI) : 1063.3 [M+H+]

[0446] Step 2

[0447] 4- ( (S) -2- ( (S) -2-Amino-3-methylbutanamido) -5-ureidopentanamido) benzyl ( (1S, 9S) -9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10, 13-dioxo-2, 3, 9, 10, 13, 15-hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinolin-1-yl) carbamate (H)

[0448] H was synthesized according to the procedure of Step 5 for F, but H-2 was used instead of F-4.

[0449] MS m / z (ESI) : 841.3 [M+H+]

[0450] Intermediate I. (S) -2-amino-N- ( (S) -1- ( ( (S) -9-ethyl-9-hydroxy-10, 13-dioxo-2, 3, 9, 10, 13, 15-hexahydro) -1H, 12H-benzo [de] pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinolin-4-yl) amino) -1-oxopropan-2-yl) -3-methylbutanamide

[0451] Step 1

[0452] N- (5, 6, 7, 8-tetrahydro naphthalen-1-yl) acetamide (I-2)

[0453] To a solution of I-1 (25.0 g, 170 mmol) in ethanol (400 mL) at 0℃ was added acetic anhydride (31.9 mL, 340 mmol) , and the reaction mixture was stirred at room temperature for 15 minutes. Dichloromethane was added, and the resulting mixture was concentrated under reduced pressure to give the target product I-2 (40 g, crude) . This product was used directly in the next step without further purification.

[0454] MS m / z (ESI) : 190.2 [M+H+]

[0455] Step 2

[0456] N- (4-bromo-5, 6, 7, 8-tetrahydronaphthalen-1-yl) acetamide (I-3)

[0457] To a solution of I-2 (crude product, 40 g, 170 mmol) in TFA (257 mL) at 0℃ were added bromine (9.6 mL, 187 mmol) and acetic acid (40 mL) , and the reaction mixture was stirred at room temperature for 20 minutes. The mixture was added with water and filtered. The filter cake was washed with water to give the target product I-3 (43.4 g, 96%) .

[0458] MS m / z (ESI) : 268.0 [M+H+]

[0459] Step 3

[0460] N- (4-bromo-8-oxo-5, 6, 7, 8--tetrahydronaphthalen-1-yl) acetamide (I-4)

[0461] To a mixture of I-3 (43.4 g, 162 mmol) , anhydrous magnesium sulfate (25.3 g, 211 mmol) , acetonitrile (450 mL) and water (60 mL) at 0℃ was added potassium permanganate (76.8 g, 486 mmol) . The reactioin mixture was stirred at 0℃ for 2 hours and then concentrated under reduced pressure. The residue was dissolved in dichloromethane and washed with water. The organic phase was concentrated under reduced pressure, and the residue was purified by slurrying with ethyl acetate to give the target product I-4 (28.0 g, 62%) .

[0462] MS m / z (ESI) : 282.1 [M+H+]

[0463] Step 4

[0464] tert-Butyl (4-acetamido-5-oxo-5, 6, 7, 8-tetrahydronaphthalen-1-yl) carbamate (I-5)

[0465] To a solution of I-4 (27.0 g, 96.1 mmol) and tert-butyl carbamate (33.7 g, 288 mmol) in 1, 4-dioxane (540 ml) were added cesium carbonate (62.7 g, 192 mmol) , palladium acetate (4.3 g, 19.2 mmol) and X-phos (9.2 g, 19.2 mmol) , and the reaction mixture was stirred at 100℃ overnight. The mixture was cooled to room temperature and filtered. The filter cake was washed with ethyl acetate. The filtrate was concentrated under reduced pressure, and the residue was purified by silica gel column chromatography (petroleum ether / ethyl acetate = 75 / 35) to give the target product I-5 (19.2 g, 63%) .

[0466] MS m / z (ESI) : 319.1 [M+H+]

[0467] Step 5

[0468] 5,8-Diamino-3, 4-dihydronaphthalen-1 (2H) -one (I-6)

[0469] I-5 (19.2 g, 60.4 mmol) was dissolved in a hydrochloric acid solution (6 N, 400 mL) , and the mixture was stirred at 90℃ for 6 hours. The mixture was cooled to room temperature, quenched with saturated aqueous solution of ammonium bicarbonate, and extracted with ethyl acetate. The organic phase was concentrated under reduced pressure, and the residue was purified by slurrying with petroleum ether to give the target product I-6 (7.7 g, 73%) .

[0470] MS m / z (ESI) : 177.1 [M+H+]

[0471] Step 6

[0472] (9H-fluoren-9-yl) methyl (S) - (1- ( (4-amino-5-oxo-5, 6, 7, 8-tetrahydronaphthalen-1-yl) amino) -1-oxopropan-2-yl) carbamate (I-7)

[0473] To a solution of I-6 (2.2 g, 12.5 mmol) , ( ( (9H-fluoren-9-yl) methoxy) carbonyl) -L-alanine (4.67 g, 15.0 mmol) and triethylamine (2.27 g, 22.5 mmol) in tetrahydrofuran (25 mL) were added EDCI (2.88 g, 15.0 mmol) and HOBt (2.03 g, 15.0 mmol) . The reaction mixture was stirred at room temperature overnight. The mixture was concentrated under reduced pressure, and the residue was purified by silica gel column chromatography (dichloromethane / methanol = 24 / 1) to give the target product I-7 (3.72 g, 64%) .

[0474] MS m / z (ESI) : 470.2 [M+H+]

[0475] Step 7

[0476] (9H-fluoren-9-yl) methyl ( (S) -1- ( ( (S) -9-ethyl-9-hydroxy-10, 13-dioxo-2, 3, 9, 10, 13, 15-hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinolin-4-yl) amino) -1-oxopropan-2-yl) carbamate (I-9)

[0477] To a solution of I-7 (3.72 g, 7.93 mmol) and I-8 (2.29 g, 8.72 mmol) in toluene (45 mL) was added PPTS (1.00 g, 3.97 mmol) , and the reaction mixture was stirred at 130℃ overnight. The mixture was cooled to room temperature, concentrated under reduced pressure, and the residue was purified by silica gel column chromatography (dichloromethane / methanol = 97 / 3) to give the target product I-9 (2.82 g, 51%) .

[0478] MS m / z (ESI) : 697.2 [M+H+]

[0479] Step 8

[0480] (S) -2-amino-N- ( (S) -9-ethyl-9-hydroxy-10, 13-dioxo-2, 3, 9, 10, 13, 15-hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinolin-4-yl) propanamide (I-10)

[0481] I-10 was synthesized according to the procedure of Step 5 for F, but I-9 was used instead of F-4.

[0482] MS m / z (ESI) : 475.1 [M+H+]

[0483] Step 9

[0484] (9H-fluoren-9-yl) methyl ( (S) -1- ( ( (S) -1- ( ( (S) -9-ethyl-9-hydroxy-10, 13-dioxo-2, 3, 9, 10, 13, 15-hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinolin-4-yl) amino) -1-oxopropan-2-yl) amino) -3-methyl-1-oxobutan-2-yl) carbamate (I-11)

[0485] I-11 was synthesized according to the procedure of Step 1 for F, but I-10 was used instead of tert-butyl methylglycinate and ( ( (9H-fluoren-9-yl) methoxy) carbonyl) -L-valine was used instead of F-1.

[0486] MS m / z (ESI) : 796.4 [M+H+]

[0487] Step 10

[0488] (S) -2-Amino-N- ( (S) -1- ( ( (S) -9-ethyl-9-hydroxy-10, 13-dioxo-2, 3, 9, 10, 13, 15-hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinolin-4-yl) amino) -1-oxopropan-2-yl) -3-methylbutanamide (I)

[0489] I was synthesized according to the procedure of Step 5 for F, but I-11 was used instead of F-4.

[0490] MS m / z (ESI) : 574.3 [M+H+]

[0491] Intermediate J. (S) -2- (2- (2-Aminoacetamido) acetamido) -N- (2- ( ( (2- ( ( (1S, 9S) -9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10, 13-dioxo-2, 3, 9, 10, 13, 15-hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinolin-1-yl) amino) -2-oxoethoxy) methyl) amino) -2-oxoethyl) -3-phenylpropanamide

[0492] Step 1

[0493] tert-Butyl ( ( (9H-fluoren-9-yl) methoxy) carbonyl) glycylglycyl-L-phenylalaninate (J-2)

[0494] To a mixture of J-1 (20 g, 56.4 mmol) , tert-butyl L-phenylalaninate (hydrochloride salt, 14.6 g, 56.4 mmol) , DIPEA (21.8 g, 169 mmol) and DMF (100 mL) was added HATU (27.9 g, 73.4 mmol) , and the reaction mixture was stirred at room temperature for 2 hours. The mixture was poured into ice water, stirred, and filtered after the solid precipitated. The filter cake was washed with water, and dried to give the target product J-2 (23 g, 73%) .

[0495] MS m / z (ESI) : 558.3 [M+H+]

[0496] Step 2

[0497] ( ( (9H-Fluoren-9-yl) methoxy) carbonyl) glycylglycyl-L-phenylalanine (J-3)

[0498] J-3 was synthesized according to the procedure of Step 2 for F, but J-2 was used instead of F-2.

[0499] MS m / z (ESI) : 502.2 [M+H+]

[0500] Step 3

[0501] (2- ( ( ( (9H-Fluoren-9-yl) methoxy) carbonyl) amino) acetylamino) methyl acetate (J-4)

[0502] To a mixture of J-1 (20 g, 56.4 mmol) , pyridine (5.35 g, 67.7 mmol) and tetrahydrofuran (200 mL) was added lead tetraacetate (35 g, 79 mmol) , and the reaction mixture was stirred at 70℃ for 12 hours. The mixture was concentrated under reduced pressure, added with water, and extracted with ethyl acetate. The organic phase was washed with saturated brine, dried over anhydrous sodium sulfate, and concentrated under reduced pressure to give the target product J-4 (20 g, 96%) .

[0503] MS m / z (ESI) : 391.2 [M+Na+]

[0504] Step 4

[0505] Benzyl 1- (9H-fluoren-9-yl) -3, 6-dioxo-2, 9-dioxa-4, 7-diazaundecan-11-oate (J-5)

[0506] A mixture of J-4 (20 g, 54.3 mmol) , benzyl 2-hydroxyacetate (18.0 g, 109 mmol) , p-toluenesulfonic acid monohydrate (2 g, 10.9 mmol) and tetrahydrofuran (200 mL) was stirred at room temperature for 6 hours. The reaction mixture was quenched with saturated sodium bicarbonate solution and extracted with ethyl acetate. The organic phase was dried over anhydrous sodium sulfate and filtered. The filtrate was concentrated under reduced pressure, and the residue was purified by silica gel column chromatography (petroleum ether / ethyl acetate = 100 / 1 to 1 / 1) to give the target product J-5 (10 g, 39%) .

[0507] MS m / z (ESI) : 475.2 [M+H+]

[0508] Step 5

[0509] Benzyl (S) -11-benzyl-1- (9H-fluoren-9-yl) -3, 6, 9, 12, 15-pentaoxo-2, 18-dioxa-4, 7, 10, 13, 16-pentaazaicosan-20-oate (J-6)

[0510] To a solution of J-5 (10 g, 21.1 mmol) in DMF (40 mL) was added diethylamine (10 mL) , and the mixture was stirred at room temperature for 1 hour. The mixture was concentrated under reduced pressure to remove diethylamine, then added with DMF (50 mL) , J-3 (10.6 g, 21.1 mmol) , PyBOP (22 g, 42.1 mmol) and DIPEA (5.44 g, 42.1 mmol) . The reaction mixture was stirred at room temperature for 3 hours. The mixture was added with water and extracted with ethyl acetate. The organic phase was dried over anhydrous sodium sulfate and filtered. The filtrate was concentrated under reduced pressure, and the residue was purified by silica gel column chromatography (dichloromethane / methanol = 100 / 1 to 30 / 1) to give the target product J-6 (10 g, 64%) .

[0511] MS m / z (ESI) : 758.3 [M+Na+]

[0512] Step 6

[0513] (S) -11-Benzyl-1- (9H-fluoren-9-yl) -3, 6, 9, 12, 15-pentaoxo-2, 18-dioxa-4, 7, 10, 13, 16-pentaazaicosan-20-oic acid (J-7)

[0514] A mixture of J-6 (10 g, 13.6 mmol) , palladium on carbon (10%, containing 55%water, 1 g) , dichloromethane (5 mL) and methanol (10 mL) was stirred at room temperature under a hydrogen atmosphere for 6 hours. The mixture was filtered, and the filtrate was concentrated under reduced pressure. The residue was recrystallized from methanol to give the target product J-7 (6 g, 68%) .

[0515] MS m / z (ESI) : 644.2 [M-H+]

[0516] Steps 7 to 8

[0517] (S) -2- (2- (2-Aminoacetamido) acetamido) -N- (2- ( ( (2- ( ( (1S, 9S) -9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10, 13-dioxo-2, 3, 9, 10, 13, 15-hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinolin-1-yl) amino) -2-oxoethoxy) methyl) amino) -2-oxoethyl) -3-phenylpropanamide (J)

[0518] J was synthesized according to the procedures of Steps 1-2 for G, but J-7 was used instead of G-1, and exatecan mesylate was used instead of (2R, 3R, 4R, 5S) -6-aminohexane-1, 2, 3, 4, 5-pentanol.

[0519] MS m / z (ESI) : 841.3 [M+H+]

[0520] Intermediate K. N- (2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23, 26, 29-Decamethyl-3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30-decaoxo-2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23, 26, 29-decaazahentriacontan-31-yl) -N-methyl-2- (N-methyl-2- (methylamino) acetamido) acetamide

[0521] Step 1

[0522] 1- (9H-fluoren-9-yl) -4, 7, 10, 13, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34, 37-dodecamethyl-3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36-dodecaoxo-2-oxa-4, 7, 10, 13, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34, 37-dodecaazanonatriacontan-39-oic acid (K-1)

[0523] K-1 was synthesized according to the procedure of Step 2 for A, but F-10 was used instead of A-2.

[0524] MS m / z (ESI) : 1093.2 [M+Na+]

[0525] Step 2

[0526] (9H-fluoren-9-yl) methyl (2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23, 26, 29, 32, 35-dodecamethyl-3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36-dodecaoxo-2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23, 26, 29, 32, 35-dodecaazaheptatriacontan-37-yl) (methyl) carbamate (K-2)

[0527] To a solution of K-1 (50 mg, 0.046 mmol) in DMF (10 mL) were added dimethylamine hydrochloride (4.5 mg, 0.056 mmol) , DIPEA (18 mg, 0.14 mmol) and HATU (21 mg, 0.056 mmol) . The reaction mixture was stirred at room temperature for 1 hour, and purified by reverse-phase column chromatography (C-18, 20-40 μm) to give the target product K-2 (39 mg, 75%) .

[0528] MS m / z (ESI) : 1120.8 [M+H+]

[0529] Step 3

[0530] N- (2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23, 26, 29-decamethyl-3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30-decaoxo-2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23, 26, 29-decaazahentriacontan-31-yl) -N-methyl-2- (N-methyl-2-(methylamino) acetamido) acetamide (K)

[0531] K was synthesized according to the procedure of Step 5 for F, but K-2 was used instead of F-4.

[0532] MS m / z (ESI) : 898.5 [M+H+]

[0533] Intermediate L. N- ( ( (9H-fluoren-9-yl) methoxy) carbonyl) -N- (2- (tert-butoxy) -2-oxoethyl) glycine

[0534] Step 1

[0535] Benzyl (2- (tert-butoxy) -2-oxoethyl) glycinate (L-2)

[0536] To a solution of benzyl 2-bromoacetate (3.27 g, 19.5 mmol) in DMF (30 mL) at 0℃ was added DIPEA (6.30 g, 48.9 mmol) , and the mixture was stirred for 15 minutes. The reaction mixture was added with tert-butyl glycinate L-1 (4.05 g, 17.8 mmol) , and stirred at room temperature for additional 4 hours. The mixture was diluted with water and extracted with ethyl acetate. The organic phase was washed with 10%hydrochloric acid solution for three times. The aqueous phases were combined, adjusted to pH = 9 with sodium carbonate, and extracted with ethyl acetate. The organic phase was dried over anhydrous sodium sulfate, filtered, and the filtrate was concentrated under reduced pressure to give the target product L-2 (3.16 g, 64%) . This product was used directly in the next step without further purification.

[0537] MS m / z (ESI) : 280.2 [M+H+]

[0538] Step 2

[0539] Benzyl N- ( ( (9H-fluoren-9-yl) methoxy) carbonyl) -N- (2- (tert-butoxy) -2-oxoethyl) glycinate (L-3)

[0540] To a solution of L-2 (3.16 g, 11.3 mmol) in 1, 4-dioxane (15 mL) were added saturated aqueous solution of sodium bicarbonate (15 mL) and FmocCl (3.23 g, 12.5 mmol) sequentially, and the reaction mixture was stirred vigorously at room temperature overnight. The mixture was diluted with water and extracted with ethyl acetate. The organic phase was dried over anhydrous sodium sulfate and filtered. The filtrate was concentrated under reduced pressure, and the residue was purified by silica gel column chromatography (ethyl acetate / petroleum ether = 5 / 95 to 10 / 90) to give the target product L-3 (5.45 g, 96%) .

[0541] MS m / z (ESI) : 524.2 [M+Na+]

[0542] Step 3

[0543] N- ( ( (9H-fluoren-9-yl) methoxy) carbonyl) -N- (2- (tert-butoxy) -2-oxoethyl) glycine (L)

[0544] L was synthesized according to the procedure of Step 2 for B, but L-3 was used instead of B-2.

[0545] MS m / z (ESI) : 434.3 [M+Na+]

[0546] Intermediate M. N- ( ( (9H-fluoren-9-ylmethyl) oxy) carbonyl) -N- (39-oxy-38-aza-2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23, 26, 29, 32, 35-dodecaoxatetracontan-40-yl) glycine

[0547] Step 1

[0548] 2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23, 26, 29, 32, 35-Dodecaoxaheptatriacontan-37-yl 4-methylbenzenesulfonate (M-2)

[0549] To a solution of M-1 (25 g, 44.6 mmol) in dichloromethane (200 mL) were added p-toluenesulfonyl chloride (17.0 g, 89.3 mmol) , triethylamine (13.5 g, 134 mmol) and DMAP (1.1 g, 8.9 mmol) , and the reaction mixture was stirred at room temperature overnight. The mixture was concentrated under reduced pressure, and the residue was purified by silica gel column chromatography (methanol / dichloromethane = 1 / 99 to 5 / 95) to give the target product M-2 (31 g, 97%) .

[0550] MS m / z (ESI) : 715.4 [M+H+]

[0551] Step 2

[0552] Di- (tert-butoxycarbonyl) -2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23, 26, 29, 32, 35-dodecaoxaheptatriacontan-37-amine (M-3)

[0553] To a solution of M-2 (31 g, 43.4 mmol) in acetonitrile (250 mL) were added bis (tert-butyloxycarbonyl) amine (19 g, 86.8 mmol) and cesium carbonate (42 g, 130 mmol) , and the reaction mixture was stirred at 50℃ for 8 hours. The mixture was filtered. The filtrate was added water and extracted with ethyl acetate. The organic phase was washed with saturated saline and dried over anhydrous sodium sulfate. After filtration, the filtrate was concentrated under reduced pressure to give the target product M-3 (32.2 g, 98%) .

[0554] MS m / z (ESI) : 782.5 [M+Na+]

[0555] Step 3

[0556] 2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23, 26, 29, 32, 35-Dodecaoxaheptatriacontan-37-amine (M-4)

[0557] A mixture of M-3 (32.2 g, 42.4 mmol) and a solution of hydrogen chloride in 1, 4-dioxane (4 M, 80 mL) was stirred at room temperature for 3 hours. The mixture was concentrated under reduced pressure, and the residue was added with water and washed with ethyl acetate. The aqueous phase was concentrated under reduced pressure to give the target product M-4 (hydrochloride, 22 g, 88%) .

[0558] MS m / z (ESI) : 560.5 [M+H+]

[0559] 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.06 (brs, 3H) , 3.63 (t, J = 5.3 Hz, 2H) , 3.60 –3.46 (m, 42H) , 3.44 –3.42 (m, 2H) , 3.24 (s, 3H) , 2.94 (t, J = 5.3 Hz, 2H) .

[0560] Step 4

[0561] tert-Butyl 41- ( ( (9H-fluoren-9-yl) methoxy) carbonyl) -39-oxo-2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23, 26, 29, 32, 35-dodecaoxa-38, 41-diazatritetracontan-43-oate (M-5)

[0562] To a mixture of M-4 (2 g, 3.4 mmol) , L (1.52 g, 3.7 mmol) and DMF (20 mL) were added DIPEA (1.8 mL, 10.1 mmol) and HATU (1.53 mg, 4.03 mmol) , and the mixture was stirred at room temperature for 10 minutes. The mixture was concentrated under reduced pressure, and the residue was purified by silica gel column chromatography (dichloromethane / methanol = 99 / 1 to 33 / 1) to give the target product M-5 (3.18 g, 99%) .

[0563] MS m / z (ESI) : 953.6 [M+H+]

[0564] Step 5

[0565] N- ( ( (9H-fluoren-9-ylmethyl) oxy) carbonyl) -N- (39-oxy-38-aza-2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23, 26, 29, 32, 35-dodecaoxatetracontan-40-yl) glycine (M)

[0566] M was synthesized according to the procedure of Step 2 for F, but M-5 was used instead of F-2.

[0567] MS m / z (ESI) : 897.5 [M+H+]

[0568] Intermediate N. (S) -2- (2- (2-aminoacetamide) acetamido) -N- (2- ( ( ( ( (S) -9-ethyl-9-hydroxy-10, 13-dioxo-2, 3, 9, 10, 13, 15-hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinolin-4-yl) methoxy) methyl) amino) -2-oxoethyl) -3-phenylpropanamide

[0569] Step 1

[0570] 8-amino-5-bromo-3, 4-dihydronaphthalen-1 (2H) -one (N-1)

[0571] A mixture of I-4 (1 g, 3.6 mmol) and hydrochloric acid solution (6 N, 20 mL) was stirred at 90℃for 10 hours. The pH of the solution was adjusted to 7-8 by adding aqueous sodium hydroxide solution (5 N) , and the resulting mixture was extracted with ethyl acetate. The organic phase was washed with saturated brine, dried over anhydrous sodium sulfate, and filtered. The filtrate was concentrated under reduced pressure, and the residue was purified by silica gel column chromatography (petroleum ether / ethyl acetate = 10 / 1 to 6 / 1) to give the target product N-1 (793 mg, 93%) .

[0572] MS m / z (ESI) : 240.0 [M+H+]

[0573] Step 2

[0574] (S) -4-bromo-9-ethyl-9-hydroxy-1, 2, 3, 9, 12, 15-hexahydro-10H, 13H-benzo [de] pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinoline-10, 13-dione (N-2)

[0575] To a mixture of N-1 (793 mg, 3.31 mmol) , I-8 (1.40 g, 5.41 mmol) and toluene (20 mL) was added PPTS (340 mg, 1.36 mmol) , and the reaction mixture was heated to reflux for 36 hours. The mixture was concentrated under reduced pressure, and the residue was purified by silica gel column chromatography (dichloromethane / methanol = 25 / 1 to 10 / 1) to give the target product N-2 (1.48 g, 95%) .

[0576] MS m / z (ESI) : 467.0 [M+H+]

[0577] Step 3

[0578] (S) -9-Ethyl-9-hydroxy-4- (hydroxymethyl) -1, 2, 3, 9, 12, 15-hexahydro-10H, 13H-benzo [de] pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinoline-10, 13-dione (N-3)

[0579] A reaction mixture of N-2 (1.48 g, 3.18 mmol) , (tributyltin) methanol (1.63 g, 5.06 mmol) , Pd (PPh3) 4 (0.29 g, 0.25 mmol) and 1, 4-dioxane (20 mL) was stirred at 100℃ for 42 hours. The mixture was concentrated under reduced pressure, and the residue was purified by silica gel column chromatography (dichloromethane / methanol = 30 / 1 to 15 / 1) to give the target product N-3 (734 mg, 55%) .

[0580] MS m / z (ESI) : 419.2 [M+H+]

[0581] 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.98 (d, J = 8.7 Hz, 1H) , 7.89 (d, J = 8.8 Hz, 1H) , 7.31 (s, 1H) , 6.49 (s, 1H) , 5.43 (s, 2H) , 5.31 (t, J = 5.4 Hz, 1H) , 5.25 (s, 2H) , 4.72 (d, J = 5.2 Hz, 2H) , 3.16 (t, J =5.8 Hz, 2H) , 3.08 (t, J = 6.0 Hz, 2H) , 2.12 –2.02 (m, 2H) , 1.95 –1.81 (m, 2H) , 0.88 (t, J = 7.3 Hz, 3H) . Step 4

[0582] (9H-fluoren-9-yl) methyl (S) - (2- ( ( ( (9-ethyl-9-hydroxy-10, 13-dioxo-2, 3, 9, 10, 13, 15-hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinolin-4-yl) methoxy) methyl) amino) -2-oxoethyl) carbamate (N-4)

[0583] N-4 was synthesized according to the procedure of Step 4 for J, but N-3 was used instead of benzyl 2-hydroxyacetate.

[0584] Step 5

[0585] (S) -2-amino-N- ( ( (9-ethyl-9-hydroxy-10, 13-dioxo-2, 3, 9, 10, 13, 15-hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinolin-4-yl) methoxy) methyl) acetamide (N-5)

[0586] N-5 was synthesized according to the procedure of Step 5 for F, but N-4 was used instead of F-4.

[0587] MS m / z (ESI) : 505.3 [M+H+]

[0588] Step 6

[0589] (9H-fluoren-9-yl) methyl ( (S) -9-benzyl-1- ( (S) -9-ethyl-9-hydroxy-10, 13-dioxo-2, 3, 9, 10, 13, 15-hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinolin-4-yl) -5, 8, 11, 14-tetraoxo-2-oxa-4, 7, 10, 13-tetraazapentadecan-15-yl) carbamate (N-6)

[0590] N-6 was synthesized according to the procedure of Step 1 for F, but N-5 was used instead of tert-butyl methylglycinate and J-3 was used instead of F-l.

[0591] MS m / z (ESI) : 988.4 [M+H+]

[0592] Step 7

[0593] (S) -2- (2- (2-aminoacetamido) acetamido) -N- (2- ( ( ( ( (S) -9-ethyl-9-hydroxy-10, 13-dioxo-2, 3, 9, 10, 13, 15-hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinolin-4-yl) methoxy) methyl) amino) -2-oxoethyl) -3-phenylpropanamide (N)

[0594] N was synthesized according to the procedure of Step 5 for F, but N-6 was used instead of F-4.

[0595] MS m / z (ESI) : 766.4 [M+H+]

[0596] Intermediate O. 4- ( (S) -4-amino-2- ( (S) -2- ( (S) -2-aminopropanamido) propanamido) -4-oxobutanamido) benzyl ( (1S, 9S) -9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10, 13-dioxo-2, 3, 9, 10, 13, 15-hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinolin-1-yl) carbamate

[0597] Step 1

[0598] (9H-Fluoren-9-yl) methyl (S) - (4-amino-1- ( (4- (hydroxymethyl) phenyl) amino) -1, 4-dioxobutan-2-yl) carbamate (O-2)

[0599] A mixture of O-1 (1.5 g, 4.23 mmol) , p-aminobenzyl alcohol (626 mg, 5.08 mmol) , EEDQ (1.3 g, 5.08 mmol) , methanol (1 mL) and dichloromethane (15 mL) was stirred at 40℃ for 2 hours. The mixture was filtered, and the filter cake was washed with dichloromethane to give the target product O-2 (1.2 g, 62%) .

[0600] MS m / z (ESI) : 460.2 [M+H+]

[0601] Step 2

[0602] (S) -2-amino-N1- (4- (hydroxymethyl) phenyl) succinamide (O-3)

[0603] O-3 was synthesized according to the procedure of Step 5 for F, but O-2 was used instead of F-4.

[0604] MS m / z (ESI) : 238.2 [M+H+]

[0605] Step 3

[0606] (9H-fluoren-9-yl) methyl ( (S) -1- ( ( (S) -1- ( ( (S) -4-amino-1- ( (4- (hydroxymethyl) phenyl) amino) -1, 4-dioxobutan-2-yl) amino) -1-oxopropan-2-yl) amino) -1-oxopropan-2-yl) carbamate (O-4)

[0607] A mixture of O-3 (crude product, 860 mg, 2.03 mmol) , Fmoc-Ala-Ala-OH (600 mg, 1.69 mmol) , triethylamine (308 mg, 3.05 mmol) , DMTMM (599 mg, 2.03 mmol) and DMF (5 mL) was stirred at room temperature for 1 hour. The mixture was concentrated under reduced pressure, and the residue was purified by reverse-phase preparative high-performance liquid chromatography to give O-4 (500 mg, 41%) .

[0608] MS m / z (ESI) : 602.3 [M+H+]

[0609] Step 4

[0610] (9H-fluoren-9-yl) methyl ( (S) -1- ( ( (S) -1- ( ( (S) -4-amino-1- ( (4- ( ( ( (4-nitrophenoxy) carbonyl) ) oxy) methyl) phenyl) amino) -1, 4-dioxobutan-2-yl) amino) -1-oxopropan-2-yl) amino) -1-oxopropan-2-yl) carbamate (O-5)

[0611] A mixture of O-4 (500 mg, 0.83 mmol) , 4-nitrophenyl carbonochloridate (201 mg, 1.00 mmol) , pyridine (99 mg, 1.25 mmol) , DMAP (102 mg, 0.83 mmol) and tetrahydrofuran (15 mL) was stirred at room temperature for 3 hours. The mixture was concentrated under reduced pressure. The residue was dissolved in dichloromethane, stirred for 10 minutes and filtered. The filter cake was washed with dichloromethane, and dried under vacuum to give O-5 (330 mg, 52%) .

[0612] MS m / z (ESI) : 767.3 [M+H+]

[0613] Steps 5-6

[0614] 4- ( (S) -4-amino-2- ( (S) -2- ( (S) -2-aminopropanamido) propanamido) -4-oxobutanamido) benzyl ( (1S, 9S) -9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10, 13-dioxo-2, 3, 9, 10, 13, 15-hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinolin-1-yl) carbamate (O)

[0615] O was synthesized according to the procedures of Steps 1-2 for H, but O-5 was used instead of H-l.

[0616] MS m / z (ESI) : 841.3 [M+H+]

[0617] Intermediate P. (29S, 30R, 31R, 32R) -1-amino-27- ( (2S, 3R, 4R, 5R) -2, 3, 4, 5, 6-pentahydroxyhexyl) -3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24-octaoxa-27-azatritriacontane-29, 30, 31, 32, 33-pentol

[0618] Step 1

[0619] (29S, 30R, 31R, 32R) -1-Azido-27- ( (2S, 3R, 4R, 5R) -2, 3, 4, 5, 6-pentahydroxyhexyl) -3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24-octaoxa-27-azatritriacontane-29, 30, 31, 32, 33-pentaol (P-2)

[0620] To a solution of P-1 (0.72 g, 1.64 mmol) in methanol (35 mL) were added D-glucose (2.96 g,

[0621] 16.4 mmol) and acetic acid (0.19 mL, 3.3 mmol) , and the reaction mixture was stirred at 50℃ for 30 minutes. Sodium cyanoborohydride (1.0 g, 16.4 mmol) was added, and the reaction mixture was stirred at 50℃ overnight. The mixture was concentrated under reduced pressure, and the residue was purified by reverse-phase preparative high-performance liquid chromatography to give the target product P-2 (1.0 g, 81%) .

[0622] MS m / z (ESI) : 767.4 [M+H+]

[0623] Step 2

[0624] (29S, 30R, 31R, 32R) -1-amino-27- ( (2S, 3R, 4R, 5R) -2, 3, 4, 5, 6-pentahydroxyhexyl) -3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24-octaoxa-27-azatritriacontane-29, 30, 31, 32, 33-pentol (P)

[0625] To a solution of P-2 (300 mg, 0.39 mmol) in methanol (5 mL) was added palladium on carbon (10%, containing 55%water, 10 mg) , and the reaction mixture was stirred at room temperature under a hydrogen atmosphere for 1 hour. The mixture was filtered, and the filtrate was concentrated under reduced pressure to give the target product P (275 mg, 95%) .

[0626] MS m / z (ESI) : 741.4 [M+H+]

[0627] Intermediate Q. (S) -41- ( ( (9H-fluoren-9-yl) methoxy) carbonyl) -42-methyl-39-oxo-2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23, 26, 29, 32, 35-dodecaoxa-38, 41-diazatetratriacontane-43-acid

[0628] Step 1

[0629] tert-Butyl (2- (benzyloxy) -2-oxoethyl) -L-alaninate (Q-2)

[0630] To a mixture of Q-1 (hydrochloride salt, 2.0 g, 11 mmol) , benzyl 2-bromoacetate (2.5 g, 11 mmol) and acetonitrile (30 mL) was added DIPEA (10 mL, 55 mmol) , and the reaction mixture was stirred at room temperature for 16 hours. The mixture was concentrated under reduced pressure, and the residue was purified by preparative reverse-phase high-performance liquid chromatography to give the target product Q-2 (2.5 g, 77%) .

[0631] MS m / z (ESI) : 294.2 [M+H+]

[0632] Step 2

[0633] tert-Butyl N- ( ( (9H-fluoren-9-yl) methoxy) carbonyl) -N- (2- (benzyloxy) -2-oxoethyl) -L-alaninate (Q-3)

[0634] To a mixture of Q-2 (2.5 g, 8.5 mmol) , saturated aqueous solution of sodium bicarbonate (40 mL) , and tetrahydrofuran (40 mL) at 0℃ was added FmocCl (2.4 g, 9.4 mmol) , and the reaction mixture was stirred at 0℃ for 0.5 hour. After quenched with saturated ammonium chloride solution, the mixture was extracted with dichloromethane. The organic phase was concentrated under reduced pressure, and the residue was purified by silica gel column chromatography (petroleum ether / ethyl acetate = 100 / 0 to 0 / 100) to give the target product Q-3 (2.6 g, 95%) .

[0635] MS m / z (ESI) : 538.3 [M+Na+]

[0636] Step 3

[0637] (S) -N- ( ( (9H-fluoren-9-yl) methoxy) carbonyl) -N- (1- (tert-butoxy) -1-oxopropan-2-yl) glycine (Q-4)

[0638] To a mixture of Q-3 (2.6 g, 5.0 mmol) and methanol (30 mL) was added palladium on carbon (10%, containing 55%water, 1.3 g) , and the reaction mixture was stirred at room temperature under a hydrogen atmosphere for 1 hour. The mixture was filtered, and the filter cake was washed with methanol. The filtrate was concentrated under reduced pressure to give the target product Q-4 (2 g, crude product, 93%) . This product was used directly in the next step without further purification.

[0639] MS m / z (ESI) : 448.2 [M+Na+]

[0640] Step 4

[0641] tert-butyl (S) -41- ( ( (9H-fluoren-9-yl) methoxy) carbonyl) -42-methyl-39-oxo-2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23, 26, 29, 32, 35-dodecaoxa-38, 41-diazatritetracontan-43-oate (Q-5)

[0642] Q-5 was synthesized according to the procedure of Step 4 for M, but Q-4 was used instead of L. MS m / z (ESI) : 967.5 [M+H+]

[0643] Step 5

[0644] (S) -41- ( ( (9H-fluoren-9-yl) methoxy) carbonyl) -42-methyl-39-oxo-2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23, 26, 29, 32, 35-dodecaoxa-38, 41-diazatetratriacontane-43-acid (Q)

[0645] A reaction mixture of Q-5 (160 mg, 0.16 mmol) and a 1, 4-dioxane solution of hydrogen chloride (4.0 M, 2 mL) was stirred at 40℃ for 1 hour. The mixture was concentrated under reduced pressure to give the target product Q (160 mg, crude product) . This product was used directly in the next step without further purification.

[0646] MS m / z (ESI) : 911.5 [M+H+]

[0647] Intermediate R. (S) -41- ( ( ( (9H-fluoren-9-yl) methoxy) carbonyl) (methyl) amino) -39-oxo-2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23, 26, 29, 32, 35-dodecaoxa-38-azatetratriacontane-43-acid

[0648] Step 1

[0649] 1-Benzyl 5- (tert-butyl) (R) -3- ( ( ( (9H-fluoren-9-yl) methoxy) carbonyl) amino) pentanedioate (R-2)

[0650] To a mixture of R-1 (425 mg, 1.0 mmol) , potassium carbonate (207 mg, 1.5 mmol) and DMF (3 mL) was added benzyl bromide (555 mg, 3.0 mmol) , and the reaction mixture was stirred at room temperature for 2 hours. After quenched with saturated ammonium chloride solution, the mixture was extracted with dichloromethane. The organic phase was concentrated under reduced pressure, and the residue was purified by silica gel column chromatography (petroleum ether / ethyl acetate = 100 / 0 to 0 / 100) to give the target product R-2 (500 mg, 97%) .

[0651] MS m / z (ESI) : 460.1 [M+H+-56]

[0652] Step 2

[0653] (S) -3- ( ( ( (9H-fluoren-9-yl) methoxy) carbonyl) (methyl) amino) -5- (benzyloxy) -5-oxo-pentanoic acid (R-3)

[0654] To a mixture of R-2 (450 mg, 0.87 mmol) and dichloromethane (3 mL) was added TFA (3 mL) , and the reaction mixture was stirred at room temperature for 1 hour. The mixture was added with a formaldehyde aqueous solution (0.85 mL, 10.5 mmol) , and stirred at room temperature for 1 hour. Triethylsilane (1.7 mL, 10.5 mmol) was added, and the mixture was stirred at room temperature for 2 hours. After diluted with water, the mixture was extracted with dichloromethane. The organic phase was concentrated under reduced pressure, and the residue was purified by reverse-phase preparative high-performance liquid chromatography to give the target product R-3 (50 mg, 12%) .

[0655] MS m / z (ESI) : 474.2 [M+H+]

[0656] Step 3

[0657] Benzyl (S) -41- ( ( ( (9H-fluoren-9-yl) methoxy) carbonyl) (methyl) amino) -39-oxo-2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23, 26, 29, 32, 35-dodecaoxa-38-azatetratriacontane-43-oate (R-4)

[0658] R-4 was synthesized according to the procedure of Step 4 for M, but R-3 was used instead of L.

[0659] MS m / z (ESI) : 1015.5 [M+H+]

[0660] Step 4

[0661] (S) -41- ( ( ( (9H-fluoren-9-yl) methoxy) carbonyl) (methyl) amino) -39-oxo-2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23, 26, 29, 32, 35-dodecaoxa-38-azatetratriacontane-43-acid (R)

[0662] To a mixture of R-4 (65 mg, 0.06 mmol) and methanol (5 mL) was added palladium on carbon (10%, containing 55%water, 30 mg) , and the reaction mixture was stirred at room temperature under a hydrogen atmosphere for 0.5 hour. The mixture was filtered, and the filter cake was washed with methanol. The filtrate was concentrated under reduced pressure to give the target product R (56 mg, crude, 95%) . This product was used directly in the next step without further purification.

[0663] MS m / z (ESI) : 925.4 [M+H+]

[0664] Intermediate S. 4- ( (S) -2- ( (S) -2-amino-3-methylbutanamido) -5-ureidopentanamido) benzyl ( (S) -1- ( ( (S) -1- ( ( (3R, 4S, 5S) -1- ( (S) -2- ( (1R, 2R) -3- ( ( (1S, 2R) -1-hydroxy-1-phenylpropan-2-yl) amino) -1-methoxy-2-methyl-3-oxopropyl) pyrrolidin-1-yl) -3-methoxy-5-methyl-1-oxoheptan-4-yl) (methyl) amino) -3-methyl-1-oxobutan-2-yl) amino) -3-methyl-1-oxobutan-2-yl) (methyl) carbamate

[0665] The intermediate S was synthesized according to the procedure for H, but MMAE was used instead of exatecan.

[0666] Intermediate T. (S) -2- ( (S) -2-amino-3-methylbutanamido) -6- (dipropylamino) -N- (2- ( ( ( ( (S) -9-ethyl-9-hydroxy-10, 13) -dioxo-2, 3, 9, 10, 13, 15-hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinolin-4-yl) methoxy) methyl) amino) -2-oxoethyl) hexanamide

[0667] Step 1

[0668] N2- ( ( ( (9H-fluoren-9-yl) methoxy) carbonyl) -L-valyl) -N6- (tert-butoxycarbonyl) -L-lysine (T-3)

[0669] To a mixture of T-1 (1.0 g, 4.1 mmol) , T-2 (1.8 g, 4.5 mmol) and dichloromethane (20 mL) was added triethylamine (2.8 mL, 20 mmol) , and the reaction mixture was stirred at room temperature overnight. The mixture was adjusted to pH = 5 with hydrochloric acid (1 N) , and extracted with dichloromethane. The organic phase was concentrated under reduced pressure to give the target product T-3 (1.8 g, crude product) . This product was used directly in the next step without further purification.

[0670] MS m / z (ESI) : 468.3 [M+H+-100]

[0671] Step 2

[0672] ( ( (9H-fluoren-9-yl) methoxy) carbonyl) -L-valyl-L-lysine (T-4)

[0673] A mixture of T-3 (crude product, 1.8 g, 3.2 mmol) and a 1, 4-dioxane solution of hydrogen chloride (4 M, 20 mL) was stirred at room temperature for 1 hour. The mixture was concentrated under reduced pressure to yield the target product T-4 (1.8 g, crude product) . This product was used directly in the next step without further purification.

[0674] MS m / z (ESI) : 468.4 [M+H+]

[0675] Step 3

[0676] N2- ( ( ( (9H-fluoren-9-yl) methoxy) carbonyl) -L-valyl) -N6, N6-dipropyl-L-lysine (T-5)

[0677] To a mixture of T-4 (crude product, 1.8 g, 3.2 mmol) , acetic acid (0.4 mL) and methanol (20 mL) at 0℃ was added propanal (1.4 mL, 19 mmol) . The reaction mixture was stirred at room temperature for 0.5 hour. Sodium cyanoborohydride (1.2 g, 19 mmol) was added at 0℃, and the mixture was stirred at room temperature for 0.5 hour. The mixture was quenched with water and concentrated under reduced pressure. The residue was purified by reverse-phase preparative high-performance liquid chromatography to give the target product T-5 (750 mg, 43%) .

[0678] MS m / z (ESI) : 552.4 [M+H+]

[0679] Step 4

[0680] (9H-fluoren-9-yl) methyl ( (9S, 12S) -9- (4- (dipropylamino) butyl) -1- ( (S) -9-ethyl-9-hydroxy-10, 13-dioxo-2, 3, 9, 10, 13, 15-hexahydro-1H, 12H-Benzenepyrrolo [de] pyran [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinolin-4-yl) -13-methyl-5, 8, 11-trioxo-2-oxa-4, 7, 10-triazadecane-12-yl) carbamate (T-6)

[0681] To a mixture of N-5 (crude product, 80 mg, 0.11 mmol) , T-5 (73 mg, 0.13 mmol) , triethylamine (80 μL, 0.55 mmol) and DMF (1 mL) was added DMTMM (72 mg, 0.22 mmol) , and the reaction mixture was stirred at room temperature for 0.5 hour. The mixture was purified by reverse-phase preparative high-performance liquid chromatography to give the target product T-6 (17 mg, 15%) .

[0682] MS m / z (ESI) : 1038.5 [M+H+]

[0683] Step 5

[0684] (S) -2- ( (S) -2-amino-3-methylbutanamido) -6- (dipropylamino) -N- (2- ( ( ( ( (S) -9-ethyl-9-hydroxy-10, 13) -dioxo-2, 3, 9, 10, 13, 15-hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinolin-4-yl) methoxy) methyl) amino) -2-oxoethyl) hexanamide (T)

[0685] To a mixture of T-6 (17 mg, 0.02 mmol) and DMF (2 mL) was added diethylamine (0.4 mL) , and the reaction mixture was stirred at room temperature for 0.5 hour. The mixture was concentrated under reduced pressure to give the target product T (17 mg, crude product) . This product was used directly in the next step without further purification.

[0686] MS m / z (ESI) : 816.4 [M+H+]

[0687] Intermediate U. (S) -9-ethyl-9-hydroxy-4- (hydroxymethyl) -1, 9, 12, 15-tetrahydro-13H-pyrano [4, 3, 2-de] pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinoline-10, 13 (2H) -dione

[0688] Step 1

[0689] 3- (2-bromo-5-nitrophenoxy) propionic acid (U-2)

[0690] A mixture of U-1 (4.0 g, 18 mmol) , potassium hydroxide (2.6 g, 46 mmol) and water (160 mL) was stirred at room temperature for 30 minutes, then 3-bromopropionic acid (3.1 g, 20 mmol) was added, and the reaction mixture was stirred at 100℃ overnight. Hydrochloric acid (12 N) was added to adjust the solution pH to 2, and the resulting mixture was extracted with ethyl acetate. The organic phase was concentrated under reduced pressure to give the target product U-2 (4.7 g, 89%) .

[0691] Step 2

[0692] 3- (5-Amino-2-bromophenoxy) propionic acid (U-3)

[0693] A mixture of U-2 (4.7 g, 16 mmol) , saturated aqueous solution of ammonium chloride (32 mL) and ethanol (98 mL) was stirred at 80℃ for 10 minutes. Iron powder (7.2 g, 130 mmol) was added, and the reaction mixture was stirred at 80℃ for 2 hours. The mixture was filtered, and the filter cake was washed with ethanol. The filtrate was concentrated under reduced pressure, and the residue was purified by silica gel column chromatography (dichloromethane / methanol = 94 / 6) to give the target product U-3 (380 mg, 9%) .

[0694] MS m / z (ESI) : 260.1 [M+H+]

[0695] Step 3

[0696] N- (8-bromo-4-oxochroman-5-yl) -2, 2, 2-trifluoroacetamide (U-4)

[0697] A mixture of U-3 (380 mg, 1.46 mmol) , TFA (15 mL) and trifluoroacetic anhydride (15 mL) was stirred at room temperature for 72 hours. The mixture was concentrated under reduced pressure to give the target product U-4 (498 mg, crude product) .

[0698] MS m / z (ESI) : 338.1 [M+H+]

[0699] Step 4

[0700] 5-Amino-8-bromochroman-4-one (U-5)

[0701] A mixture of U-4 (crude product, 498 mg, 1.46 mmol) , potassium carbonate (2.0 g, 14.6 mmol) and methanol (20 mL) was stirred at room temperature for 3 hours. Water was added and the resulting mixture was extracted with dichloromethane. The organic phase was concentrated under reduced pressure, and the residue was purified by silica gel column chromatography (petroleum ether / ethyl acetate = 100 / 0 to 70 / 30) to give the target product U-5 (251 mg, 71%) .

[0702] MS m / z (ESI) : 242.1 [M+H+]

[0703] Step 5

[0704] (S) -4-bromo-9-ethyl-9-hydroxy-1, 9, 12, 15-tetrahydro-13H-pyrano [4, 3, 2-de] pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinoline-10, 13 (2H) -dione (U-6)

[0705] A mixture of U-5 (241 mg, 1.0 mmol) , I-8 (263 mg, 1.1 mmol) , PPTS (251 mg, 0.52 mmol) and toluene (5.2 mL) was stirred at 120℃ overnight. The mixture was concentrated under reduced pressure, and the residue was purified by reverse-phase preparative high-performance liquid chromatography to give the target product U-6 (41 mg, 8%) .

[0706] MS m / z (ESI) : 469.1 [M+H+]

[0707] Step 6

[0708] (S) -9-ethyl-9-hydroxy-4- (hydroxymethyl) -1, 9, 12, 15--tetrahydro-13H-pyrano [4, 3, 2-de] pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinoline-10, 13 (2H) -dione (U)

[0709] A mixture of U-6 (37 mg, 0.078 mmol) , (tributyltin) methanol (50 mg, 0.16 mmol) , Pd (PPh3) 4 (9 mg, 0.0078 mmol) and 1, 4-dioxane (2 mL) was stirred at 100℃ for 2 hours. The mixture was concentrated under reduced pressure, and the residue was purified by reverse-phase preparative high-performance liquid chromatography column to give the target product compound U (5.9 mg, 18%) .

[0710] MS m / z (ESI) : 421.1 [M+H+]

[0711] 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.87 (d, J = 8.7 Hz, 1H) , 7.74 (d, J = 8.7 Hz, 1H) , 7.32 (s, 1H) , 6.51 (s, 1H) , 5.43 (s, 2H) , 5.28 –5.22 (m, 3H) , 4.69 (d, J = 5.6 Hz, 2H) , 4.50 (t, J = 5.8 Hz, 2H) , 3.40 –3.36 (m, 2H) , 1.93 –1.82 (m, 2H) , 0.92 –0.86 (m, 3H) .

[0712] Intermediate V. (S) -9-ethyl-9-hydroxy-4- (3- (2-hydroxyethoxy) propyl) -1, 2, 3, 9, 12, 15-hexahydro-10H, 13H-benzo [de] pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinoline-10, 13-dione

[0713] Step 1

[0714] N- (8-oxo-5, 6, 7, 8-tetrahydronaphthalen-1-yl) acetamide (V-1)

[0715] V-1 was synthesized according to the procedure of Step 3 for I, but I-2 was used instead of I-3.

[0716] MS m / z (ESI) : 204.2 [M+H+]

[0717] Step 2

[0718] 8-amino-3, 4-dihydronaphthalen-1 (2H) -one (V-2)

[0719] V-2 was synthesized according to the procedure of Step 5 for I, but V-1 was used instead of I-5.

[0720] MS m / z (ESI) : 162.2 [M+H+]

[0721] Step 3

[0722] 8-amino-5-iodo-3, 4-dihydronaphthalen-1 (2H) -one (V-3)

[0723] To a solution of V-2 (1.5 g, 9.4 mmol) in acetic acid (30 mL) was added iodine chloride (1.5 g, 9.4 mmol) . The reaction mixture was stirred at 30℃ for 3 hours. The mixture was added with water and extracted with ethyl acetate. The organic phase was concentrated under reduced pressure, and the residue was purified by silica gel column chromatography (petroleum ether / ethyl acetate = 85 / 15 to 70 / 30) to give the target product V-3 (1.9 g, 68%) .

[0724] Step 4

[0725] 8-amino-5- (3- (2-hydroxyethoxy) prop-1-yn-1-yl) -3, 4-dihydronaphthalen-1 (2H) -one (V-4)

[0726] To a solution of V-3 (400 mg, 1.4 mmol) , 2- (prop-2-yn-1-yloxy) ethanol (209 mg, 2.1 mmol) , Pd (PPh3) 2Cl2 (98 mg, 0.14 mmol) and triethylamine (421 mg, 4.2 mmol) in tetrahydrofuran (10 mL) was added copper iodide (26 mg, 0.14 mmol) . The reaction mixture was stirred at room temperature for 3 hours. The mixture was concentrated under reduced pressure, and the residue was purified by silica gel column chromatography (petroleum ether / ethyl acetate = 3 / 1) to give the target product V-4 (300 mg, 83%) .

[0727] MS m / z (ESI) : 260.1 [M+H+]

[0728] Step 5

[0729] 8-amino-5- (3- (2-hydroxyethoxy) propyl) -3, 4-dihydronaphthalen-1 (2H) -one (V-5)

[0730] To a solution of V-4 (50 mg, 0.19 mol) in methanol (5 mL) was added palladium on carbon (10%, containing 55%water, 20 mg) , and the reaction mixture was stirred at room temperature under a hydrogen atmosphere for 2 hours. The mixture was filtered, and the filtrate was concentrated under reduced pressure to give the target product V-5 (40 mg, 79%) .

[0731] MS m / z (ESI) : 264.2 [M+H+]

[0732] Step 6

[0733] (S) -9-ethyl-9-hydroxy-4- (3- (2-hydroxyethoxy) propyl) -1, 2, 3, 9, 12, 15-hexahydro-10H, 13H-benzo [de] pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinoline-10, 13-dione (V)

[0734] To a solution of V-5 (40 mg, 0.15 mmol) and I-8 (40 mg, 0.15 mmol) in toluene (5 mL) was added PPTS (19 mg, 0.075 mmol) , and the reaction mixture was stirred at 130℃ for 3 hours. After cooled to room temperature, the mixture was concentrated under reduced pressure, and the residue was purified by reverse-phase preparative high-performance liquid chromatography to give the target product V (24 mg, 32%) .

[0735] MS m / z (ESI) : 491.3 [M+H+]

[0736] 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.91 (d, J = 8.7 Hz, 1H) , 7.66 (d, J = 8.7 Hz, 1H) , 7.30 (s, 1H) , 6.49 (s, 1H) , 5.43 (s, 2H) , 5.24 (s, 2H) , 4.58 (t, J = 5.5 Hz, 1H) , 3.54 –3.50 (m, 2H) , 3.46 –3.38 (m, 4H) , 3.20 –3.07 (m, 4H) , 2.90 –2.82 (m, 2H) , 2.12 –2.03 (m, 2H) , 1.91 –1.82 (m, 4H) , 0.88 (t, J =7.3 Hz, 3H) .

[0737] Example 2. Preparations of LD-1, LD-2 and LD-18

[0738] 4- ( (33S, 36S) -29- (6- (2, 5-dioxo-2, 5-dihydro-1H-pyrrol-1-yl) hexanoyl) -33-isopropyl-27, 31, 34-trioxo-36- (3-ureidopropyl) -2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23-octaoxa-26, 29, 32, 35-tetraazaheptatriacontan -37-amido) benzyl ( (1S, 9S) -9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10, 13-dioxo-2, 3, 9, 10, 13, 15-hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinolin-1-yl) carbamate (Compound LD-1)

[0739] Step 1

[0740] tert-Butyl 29- ( ( (9H-fluoren-9-yl) methoxy) carbonyl) -27-oxo-2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23-octaoxa-26, 29-diazahentriacontan-31-oate (LD-1b)

[0741] To a solution of L (1.65 g, 4.01 mmol) in DMF (25 mL) were added DIPEA (1.04 g, 8.03 mmol) and HATU (1.83 g, 4.82 mmol) , and the reaction mixture was stirred at room temperature for 5 minutes. Then the mixture was added with LD-1a (1.54 g, 4.01 mmol) , and stirred at room temperature for additional 30 minutes. After diluted with water, the mixture was extracted with ethyl acetate. The organic phase was washed with saturated brine, dried over anhydrous sodium sulfate, and filtered. The filtrate was concentrated under reduced pressure, and the residue was purified by silica gel column chromatography (methanol / dichloromethane = 1 / 99 to 5 / 95) to give the target product LD-1b (3.01 g, 96%) .

[0742] MS m / z (ESI) : 777.4 [M+H+]

[0743] Step 2

[0744] 29- ( ( (9H-fluoren-9-yl) methoxy) carbonyl) -27-oxo-2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23-octaoxa-26, 29-diazahentriacontan-31-acid (LD-1c)

[0745] A mixture of LD-1b (61 mg, 0.065 mmol) and a 1, 4-dioxane solution of hydrogen chloride (4 M, 4 mL) was stirred at 30℃ for 3 hours. The mixture was concentrated under reduced pressure to yield the target product LD-1c (55 mg, 99%) . The product was used directly in the next step without further purification.

[0746] MS m / z (ESI) : 721.4 [M+H+]

[0747] Step 3

[0748] (9H-fluoren-9-yl) methyl (2- ( ( (S) -1- ( ( (S) -1- ( (4- ( ( ( ( (1S, 9S) -9-ethyl-5-fluoro) -9-hydroxy-4-methyl-10, 13-dioxo-2, 3, 9, 10, 13, 15-hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinolin-1-yl) carbamoyl) oxy) methyl) phenyl) amino) -1-oxo-5-ureidopentane-2-yl) amino) -3-methyl-1-oxobutane-2-yl) amino) -2-oxoethyl) (27-oxo-2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23-octaoxa-26-azaoctacosan-28-yl) carbamate (LD-1d)

[0749] To a mixture of LD-1c (55 mg, 0.077 mmol) , H (56 mg, 0.065 mmol) and DMF (4 mL) were added DIPEA (34 mg, 0.26 mmol) and HATU (37 mg, 0.098 mmol) sequentially. The reaction mixture was stirred at room temperature for 30 minutes and purified by reverse-phase preparative high-performance liquid chromatography to give the target product LD-1d (24 mg, 24%) .

[0750] MS m / z (ESI) : 772.3 [M / 2+H+]

[0751] Step 4

[0752] 4- ( (33S, 36S) -33-Isopropyl-27, 31, 34-trioxo-36- (3-ureidopropyl) -2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23-octaoxa-26, 29, 32, 35-tetraazaheptatriacontane-37-amido) benzyl ( (1S, 9S) -9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10, 13-dioxo-2, 3, 9, 10, 13, 15-hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinolin-1-yl) carbamate (LD-1e)

[0753] To a solution of LD-1d (8 mg, 0.0052 mol) in DMF (3 mL) was added diethylamine (4 mg, 0.052 mmol) , and the reaction mixture was stirred at room temperature for 3 hours. The mixture was concentrated under reduced pressure to give the target product LD-1e (crude product) . This product was used directly in the next step without further purification.

[0754] MS m / z (ESI) : 1321.5 [M+H+]

[0755] Step 5

[0756] 4- ( (33S, 36S) -29- (6- (2, 5-dioxo-2, 5-dihydro-1H-pyrrol-1-yl) hexanoyl) -33-isopropyl-27, 31, 34-trioxo-36- (3-ureidopropyl) -2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23-octaoxa-26, 29, 32, 35-tetraaza heptatriacontan -37-amido) benzyl ( (1S, 9S) -9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10, 13-dioxo-2, 3, 9, 10, 13, 15-hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinolin-1-yl) carbamate (LD-1)

[0757] LD-1 was synthesized according to the procedure of Step 3, but LD-1e was used instead of H and 6- (2, 5-dioxo-2, 5-dihydro-1H-pyrrol-1-yl) hexanoic acid was used instead of LD-1c.

[0758] MS m / z (ESI) : 1514.5 [M+H+]

[0759] 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9.96 (s, 0.5H) , 9.73 (s, 0.5H) , 8.71 –8.63 (m, 1H) , 8.49 (d, J =7.9 Hz, 0.5H) , 8.27 –8.22 (m, 0.5H) , 8.13 (d, J = 7.7 Hz, 0.5H) , 8.04 (d, J = 8.4 Hz, 1H) , 7.95 (d, J =7.7 Hz, 0.5H) , 7.79 (s, 0.5H) , 7.76 (s, 0.5H) , 7.64 (d, J = 8.5 Hz, 1H) , 7.60 (d, J = 8.7 Hz, 1H) , 7.36 (d, J = 7.8 Hz, 2H) , 7.31 (s, 1H) , 7.01 –6.97 (m, 2H) , 5.97 (brs, 1H) , 5.45 (s, 2H) , 5.37 –5.23 (m, 3H) , 5.08 (s, 2H) , 4.42 –4.31 (m, 1H) , 4.24 (dd, J = 7.8, 7.1 Hz, 0.5H) , 4.20 –4.16 (m, 0.5H) , 4.15 –4.13 (m, 1H) , 4.07 –4.02 (m, 0.5H) , 4.12 –4.06 (m, 1H) , 4.06 –4.02 (m, 0.5H) , 3.98 (d, J = 5.9 Hz, 0.5H) , 3.89 (d, J = 7.2 Hz, 0.5H) , 3.57 –3.45 (m, 26H) , 3.44 –3.32 (m, 7H) , 3.31 –3.18 (m, 5H) , 3.17 –3.07 (m, 2H) , 3.07 –2.98 (m, 1H) , 2.97 –2.90 (m, 1H) , 2.38 (s, 3H) , 2.24 –2.11 (m, 4H) , 2.10 –1.95 (m, 3H) , 1.94 –1.82 (m, 2H) , 1.80 –1.65 (m, 1H) , 1.65 –1.56 (m, 1H) , 1.54 –1.35 (m, 6H) , 1.21 –1.13 (m, 2H) , 0.95 –0.79 (m, 9H) .

[0760] Compound LD-2 was synthesized according to the procedure for LD-1, but (R) -3- ( ( ( (9H-fluoren-9-yl) methoxy) carbonyl) amino) -5- (tert-butoxy) -5-oxopentanoic acid was used instead of L.

[0761] The NMR data of LD-2 are as follows:

[0762] Compound LD-18 was synthesized according to the procedure for LD-1, but I was used instead of H.

[0763] The NMR data for LD-18 are as follows:

[0764] Example 3. Preparations of LD-3, LD-7, LD-8 and LD-28

[0765] 4- ( (33S, 36S) -33-Isopropyl-29- (6- (N-methylbuta-2, 3-dienamido) hexanoyl) -27, 31, 34-trioxo-36- (3-ureidopropyl) -2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23-octaoxa-26, 29, 32, 35-tetraazaheptatriacontane-37-amido) benzyl ( (1S, 9S) -9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10, 13-dioxo-2, 3, 9, 10, 13, 15-hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinolin-1-yl) carbamate (Compound LD-3)

[0766] Step 1

[0767] tert-Butyl N- ( ( (9H-fluoren-9-yl) methoxy) carbonyl) -N- (2- ( ( (S) -1- ( ( (S) -1- ( (4- ( ( ( ( (1S, 9S) -9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10, 13-dioxo-2, 3, 9, 10, 13, 15-hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinolin-1-yl) carbamoyl) oxy) methyl) phenyl) amino) -1-oxo-5-ureidopentane-2-yl) amino) -3-methyl-1-oxobutan-2-yl) amino) -2-oxoethyl) glycinate (LD-3a)

[0768] To a solution of H (330 mg, 0.39 mmol) , L (200 mg, 0.47 mmol) and NMI (160 μL, 1.95 mmol) in NMP (3 mL) was added TCFH (170 mg, 0.58 mmol) . The reaction mixture was stirred at room temperature for 10 minutes. The mixture was added with water and extracted with a mixed solvent of dichloromethane and methanol (v / v = 5 / 1) . The organic phase was concentrated under reduced pressure to give the target product LD-3a (400 mg, 82%) .

[0769] MS m / z (ESI) : 1234.3 [M+H+]

[0770] Step 2

[0771] tert-Butyl (2- ( ( (S) -1- ( ( (S) -1- ( (4- ( ( ( ( (1S, 9S) -9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10, 13-dioxo-2, 3, 9, 10, 13, 15-hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinolin-1-yl) carbamoyl) oxy) methyl) phenyl) amino) -1-oxo-5-ureidopentane-2-yl) amino) -3-methyl-1-oxobutan-2-yl) amino) -2-oxoethyl) glycinate (LD-3b)

[0772] LD-3b was synthesized according to the procedure of Step 4 in Example 2, but LD-3a was used instead of LD-1d.

[0773] MS m / z (ESI) : 1012.4 [M+H+]

[0774] Step 3

[0775] tert-Butyl N- (2- ( ( (S) -1- ( ( (S) -1- ( (4- ( ( ( ( (1S, 9S) -9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10, 13-dioxo-2, 3, 9, 10, 13, 15-hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinolin-1-yl) carbamoyl) oxy) methyl) phenyl) amino) -1-oxo-5-ureidopentane-2-yl) amino) -3-methyl-1-oxobutan-2-yl) amino) -2-oxoethyl) -N- (6- (N-methylbuta-2, 3-dienamido) hexanoyl) glycinate (LD-3c)

[0776] A mixture of LD-3b (crude product, 210 mg, 0.15 mmol) , B (crude product, 65 mg, 0.30 mmol) , NMI (37 mg, 0.45 mmol) , TCFH (63 mg, 0.22 mmol) and DMF (2 mL) was stirred at room temperature for 1 hour, and then purified by reverse-phase preparative high-performance liquid chromatography to give the target product LD-3c (92 mg, 51%) .

[0777] MS m / z (ESI) : 1205.4 [M+H+]

[0778] Step 4

[0779] N- (2- ( ( (S) -1- ( ( (S) -1- ( (4- ( ( ( ( (1S, 9S) -9-ethyl-5-fluorine-9-hydroxy-4-methyl) -10, 13-dioxo-2, 3, 9, 10, 13, 15-hexahydro-1H, 12H-Benzenebenzo [de] pyran [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinolin-1-yl) carbamoyloxy) methyl) Benzeneyl) amino) -1-oxo-5-ureidoPentane-2-yl) amino) -3-methyl-1-oxobut-2-yl) amino) -2-oxoethyl) -N- (6- (N-methylbut-2, 3-dienamide) hexanoyl) glycine (LD-3d)

[0780] A mixture of LD-3c (58 mg, 0.048 mmol) , TFA (2 mL) , and dichloromethane (2 mL) was stirred at room temperature for 1 hour. The mixture was concentrated under reduced pressure to yield the target product LD-3d (65 mg, crude) . This product was used directly in the next step without further purification.

[0781] MS m / z (ESI) : 1149.3 [M+H+]

[0782] Step 5

[0783] 4- ( (33S, 36S) -33-Isopropyl-29- (6- (N-methylbuta-2, 3-dienamido) hexanoyl) -27, 31, 34-trioxo-36- (3-ureidopropyl) -2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23-octaoxa-26, 29, 32, 35-tetraazaheptatriacontan-37-amido) benzyl ( (1S, 9S) -9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10, 13-dioxo-2, 3, 9, 10, 13, 15-hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinolin-1-yl) carbamate (LD-3)

[0784] LD-3 was synthesized according to the procedure of Step 3, but LD-3d was used instead of B and LD-1a was used instead of LD-3b.

[0785] MS m / z (ESI) : 1514.6 [M+H+]

[0786] 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9.96 (s, 0.5H) , 9.71 (s, 0.5H) , 8.73 –8.63 (m, 1H) , 8.54 –8.46 (m, 0.5H) , 8.24 (t, J = 5.7 Hz, 0.5H) , 8.16 –7.92 (m, 2H) , 7.77 (d, J = 10.9 Hz, 1H) , 7.70 –7.59 (m, 2H) , 7.41 –7.28 (m, 3H) , 6.25 –6.16 (m, 1H) , 6.01 –5.92 (m, 1H) , 5.50 –5.37 (m, 2H) , 5.32 –5.26 (m, 2H) , 5.23 (d, J = 6.6 Hz, 2H) , 5.08 (s, 2H) , 4.44 –4.31 (m, 1H) , 4.27 –3.85 (m, 6H) , 3.56 –3.37 (m, 30H) , 3.30 –3.18 (m, 9H, overlapping with water peak) , 3.17 –3.07 (m, 2H) , 3.06 –2.90 (m, 4H) , 2.81 (d, J = 3.4 Hz, 1H) , 2.38 (s, 3H) , 2.24 –2.14 (m, 3H) , 2.10 –2.01 (m, 2H) , 1.93 –1.81 (m, 2H) , 1.79 –1.54 (m, 2H) , 1.53 –1.31 (m, 6H) , 1.27 –1.12 (m, 3H) , 0.94 –0.81 (m, 9H) .

[0787] Compounds LD-7 and LD-8 were synthesized according to the procedure for LD-3, but different compounds were used instead of LD-1a.

[0788] The NMR data for LD-7 and LD-8 are as follows:

[0789] Compound LD-28 was synthesized according to the procedure for LD-3, but a different compound was used instead of L.

[0790] The NMR data of LD-28 are as follows:

[0791] Example 4. Preparation of LD-4

[0792] 4- ( (81S, 84S) -77- (6- (2, 5-dioxo-2, 5-dihydro-1H-pyrrol-1-yl) hexanoyl) -81-isopropyl-75, 79, 82-trioxo-84- (3-ureidopropyl) -2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23, 26, 29, 32, 35, 38, 41, 44, 47, 50, 53, 56, 59, 62, 65, 68, 71-tetracosaoxa-74, 77, 80, 83-tetraazapentaoctacontane-85-amido) benzyl ( (1S, 9S) -9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10, 13-dioxo-2, 3, 9, 10, 13, 15-hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinolin-1-yl) carbamate (Compound LD-4)

[0793] Step 1

[0794] N- ( ( (9H-fluoren-9-yl) methoxy) carbonyl) -N- (2- ( ( (S) -1- ( ( (S) -1- ( (4- ( ( ( (1S, 9S) -9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10, 13-dioxo-2, 3, 9, 10, 13, 15-hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinolin-1-yl) carbamoyl) oxy) methyl) phenyl) amino) -1-oxo-5-ureidopentane-2-yl) amino) -3-methyl-1-oxobutan-2-yl) amino) -2-oxoethyl) glycine (LD-4a)

[0795] LD-4a was synthesized according to the procedure of Step 4 in Example 3, but LD-3a was used instead of LD-3c.

[0796] MS m / z (ESI) : 1178.2 [M+H+]

[0797] Step 2

[0798] (9H-Fluoren-9-yl) methyl (2- ( ( (S) -1- ( ( (S) -1- ( (4- ( ( ( ( (1S, 9S) -9-ethyl-5-fluoro) -9-hydroxy-4-methyl-10, 13-dioxo-2, 3, 9, 10, 13, 15-hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinolin-1-yl) carbamoyl) oxy) methyl) phenyl) amino) -1-oxo-5-ureidopentane-2-yl) amino) -3-methyl-1-oxobutane-2-yl) amino) -2-oxoethyl) (75-oxo-2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23, 26, 29, 32, 35, 38, 41, 44, 47, 50, 53, 56, 59, 62, 65, 68, 71-tetracosaoxa-74-azahexaheptacontane-76-yl) carbamate (LD-4b)

[0799] LD-4b was synthesized according to the procedure of Step 3 in Example 2, but LD-4a was used instead of LD-1c and 2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23, 26, 29, 32, 35, 38, 41, 44, 47, 50, 53, 56, 59, 62, 65, 68, 71-tetracosaoxatriheptacontan-73-amine was used instead of H.

[0800] MS m / z (ESI) : 1124.4 [M / 2+H+]

[0801] Steps 3-4

[0802] 4- ( (81S, 84S) -77- (6- (2, 5-dioxo-2, 5-dihydro-1H-pyrrol-1-yl) hexanoyl) -81-isopropyl-75, 79, 82-trioxo-84- (3-ureidopropyl) -2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23, 26, 29, 32, 35, 38, 41, 44, 47, 50, 53, 56, 59, 62, 65, 68, 71-tetracosaoxa-74, 77, 80, 83-tetraazapentaoctacontane-85-amido) benzyl ( (1S, 9S) -9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10, 13-dioxo-2, 3, 9, 10, 13, 15-hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinolin-1-yl) carbamate (LD-4)

[0803] LD-4 was synthesized according to the procedures of Steps 4-5 in Example 2, but LD-4b was used instead of LD-1d.

[0804] MS m / z (ESI) : 1110.8 [M / 2+H+]

[0805] 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9.95 (s, 0.5H) , 9.73 (s, 0.5H) , 8.67 (q, J = 8.0, 6.8 Hz, 1H) , 8.49 (d, J = 7.8 Hz, 0.5H) , 8.24 (t, J = 5.6 Hz, 0.5H) , 8.15 –7.90 (m, 2H) , 7.77 (d, J = 10.9 Hz, 1H) , 7.68 –7.55 (m, 2H) , 7.40 –7.27 (m, 3H) , 6.98 (s, 2H) , 6.50 (s, 1H) , 6.00 –5.90 (m, 1H) , 5.51 –5.36 (m, 4H) , 5.36 –5.22 (m, 2H) , 5.08 (s, 2H) , 4.45 –4.29 (m, 1H) , 4.27 –3.84 (m, 4H) , 3.60 –3.37 (m, 94H) , 3.27 –3.17 (m, 7H, overlapping with water peak) , 3.16 –2.91 (m, 4H) , 2.37 (s, 3H) , 2.26 –2.10 (m, 4H) , 2.10-1.95 (m, 2H) , 1.93 –1.81 (m, 2H) , 1.80 –1.55 (m, 2H) , 1.50 –1.35 (m, 6H) , 1.27 –1.10 (m, 3H) , 0.93 –0.80 (m, 9H) .

[0806] Example 5. Preparation of LD-5

[0807] (6S, 9S) -1-amino-13- (6- (2, 5-dioxo-2, 5-dihydro-1H-pyrrol-1-yl) hexanoyl) -6- ( (4- ( ( ( ( (1S, 9S) -9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10, 13-dioxo-2, 3, 9, 10, 13, 15-hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinolin-1-yl) carbamoyl) oxy) methyl) phenyl) carbamoyloxy) -9-isopropyl-16, 19, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49-dodecamethyl-1, 8, 11, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36, 39, 42, 45, 48-pentadecaoxo-2, 7, 10, 13, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49-hexadecaazahenpentacontane-51-acid (Compound LD-5)

[0808] Step 1

[0809] tert-Butyl N- (6- (2, 5-dioxo-2, 5-dihydro-1H-pyrrol-1-yl) hexanoyl) -N- (2- ( ( (S) -1- ( ( (S) ) -1- ( (4- ( ( ( ( (1S, 9S) -9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10, 13-dioxo-2, 3, 9, 10, 13, 15-hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinolin-1-yl) carbamoyl) oxy) methyl) phenyl) amino) -1-oxo-5-ureidopentane-2-yl) amino) -3-methyl-1-oxobutan-2-yl) amino) -2-oxoethyl) glycinate (LD-5a)

[0810] LD-5a was synthesized according to the procedure of Step 3 in Example 2, but LD-3b was used instead of H and 6- (2, 5-dioxo-2, 5-dihydro-1H-pyrrol-1-yl) hexanoic acid was used instead of LD-1c.

[0811] MS m / z (ESI) : 1205.4 [M+H+]

[0812] Step 2

[0813] N- (6- (2, 5-dioxo-2, 5-dihydro-1H-pyrrol-1-yl) hexanoyl) -N- (2- ( ( (S) -1- ( ( (S) ) -1- ( (4- ( ( ( ( (1S, 9S) -9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10, 13-dioxo-2, 3, 9, 10, 13, 15-hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinolin-1-yl) carbamoyl) oxy) methyl) phenyl) amino) -1-oxo-5-ureidopentane-2-yl) amino) -3-methyl-1-oxobutan-2-yl) amino) -2-oxoethyl) glycine (LD-5b)

[0814] LD-5b was synthesized according to the procedure of Step 4 in Example 3, but LD-5a was used instead of LD-3c.

[0815] MS m / z (ESI) : 1149.2 [M+H+]

[0816] Steps 3-4

[0817] (6S, 9S) -1-amino-13- (6- (2, 5-dioxo-2, 5-dihydro-1H-pyrrol-1-yl) hexanoyl) -6- ( (4- ( ( ( ( (1S, 9S) -9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10, 13-dioxo-2, 3, 9, 10, 13, 15-hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinolin-1-yl) carbamoyl) oxy) methyl) phenyl) carbamoyl) -9-isopropyl-16, 19, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49-dodecamethyl-1, 8, 11, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36, 39, 42, 45, 48-pentadecaoxo-2, 7, 10, 13, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49-hexadecaazahenpentacontane-51-acid (LD-5)

[0818] LD-5 was synthesized according to the procedures of Steps 1-2 in this example, but LD-5b was used instead of 6- (2, 5-dioxo-2, 5-dihydro-1H-pyrrol-1-yl) hexanoic acid and F was used instead of LD-3b.

[0819] MS m / z (ESI) : 1001.2 [M / 2+H+]

[0820] 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9.92 (s, 0.5H) , 9.56 (s, 0.5H) , 8.16 –8.10 (m, 1H) , 8.05 (d, J =8.6 Hz, 1H) , 7.84 (s, 1H) , 7.78 (d, J = 10.9 Hz, 1H) , 7.67 (d, J = 8.1 Hz, 1H) , 7.61 (d, J = 8.2 Hz, 1H) , 7.39 –7.33 (m, 2H) , 7.31 (s, 1H) , 7.01 –6.93 (m, 2H) , 6.55 –6.45 (m, 1H) , 6.00 –5.90 (m, 1H) , 5.45 (s, 2H) , 5.40 –5.35 (m, 1H) 5.35 –5.25 (m, 4H) , 5.07 (s, 2H) , 4.59 –4.52 (m, 1H) , 4.45 –3.81 (m, 28H) , 3.08 –2.68 (m, 40H) , 2.38 (s, 3H) , 2.25 –2.05 (m, 6H) , 2.04 –1.80 (m, 6H) , 1.50 –1.35 (m, 6H) , 1.20 –1.12 (m, 3H) , 0.95 –0.80 (m, 9H) .

[0821] Example 6. Preparations of LD-6, LD-9, LD-10, LD-14, LD-16, LD-17 and LD-19

[0822] 4- ( (45S, 48S) -45-Isopropyl-41- (6- (N-methylbuta-2, 3-dienamido) hexanoyl) -39, 43, 46-trioxo-48- (3-ureidopropyl) -2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23, 26, 29, 32, 35-dodecaoxa-38, 41, 44, 47-tetraazanonatetracontane-49-amido) benzyl ( (1S, 9S) -9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10, 13-dioxo-2, 3, 9, 10, 13, 15-hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinolin-1-yl) carbamate (Compound LD-6)

[0823] Steps 1-2

[0824] 4- ( (45S, 48S) -45-isopropyl-39, 43, 46-trioxo-48- (3-ureidopropyl) -2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23, 26, 29, 32, 35-dodecaoxa-38, 41, 44, 47-tetraazanonatetracontane-49-amido) benzyl ( (1S, 9S) -9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10, 13-dioxo-2, 3, 9, 10, 13, 15-hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinolin-1-yl) carbamate (LD-6b)

[0825] LD-6b was synthesized according to the procedures of Steps 3-4 in Example 2, but M was used instead of LD-1c.

[0826] MS m / z (ESI) : 1497.6 [M+H+]

[0827] Step 3

[0828] 4- ( (45S, 48S) -45-isopropyl-41- (6- (N-methylbuta-2, 3-dienamido) hexanoyl) -39, 43, 46-trioxo-48- (3-ureidopropyl) -2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23, 26, 29, 32, 35-dodecaoxa-38, 41, 44, 47-tetraazanonatetracontane-49-amido) benzyl ( (1S, 9S) -9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10, 13-dioxo-2, 3, 9, 10, 13, 15-hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinolin-1-yl) carbamate (LD-6)

[0829] LD-6 was synthesized according to the procedure of Step 3 in Example 3, but LD-6b was used instead of LD-3b.

[0830] MS m / z (ESI) : 1690.6 [M+H+]

[0831] 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9.96 (s, 0.5H) , 9.71 (s, 0.5H) , 8.73 –8.63 (m, 1H) , 8.54 –8.46 (m, 0.5H) , 8.24 (t, J = 5.7 Hz, 0.5H) , 8.16 –7.92 (m, 2H) , 7.77 (d, J = 10.9 Hz, 1H) , 7.70 –7.59 (m, 2H) , 7.41 –7.28 (m, 3H) , 6.25 –6.16 (m, 1H) , 6.01 –5.92 (m, 1H) , 5.50 –5.37 (m, 2H) , 5.32 –5.26 (m, 2H) , 5.23 (d, J = 6.6 Hz, 2H) , 5.08 (s, 2H) , 4.44 –4.31 (m, 1H) , 4.27 –3.85 (m, 6H) , 3.56 –3.37 (m, 46H) , 3.30 –3.18 (m, 9H, overlapping with water peak) , 3.17 –3.07 (m, 2H) , 3.06 –2.90 (m, 4H) , 2.81 (d, J = 3.4 Hz, 1H) , 2.38 (s, 3H) , 2.24 –2.14 (m, 3H) , 2.10 –2.01 (m, 2H) , 1.93 –1.81 (m, 2H) , 1.79 –1.54 (m, 2H) , 1.53 –1.31 (m, 6H) , 1.27 –1.12 (m, 3H) , 0.94 –0.81 (m, 9H) .

[0832] Compounds LD-9, LD-10, LD-16 and LD-17 were synthesized according to the procedure for LD-6, but different compounds were used instead of B.

[0833] The NMR data of LD-9, LD-10, LD-16 and LD-17 are as follows:

[0834] Compound LD-14 was synthesized according to the procedure for LD-6, but a different compound was used instead of H.

[0835] The NMR data for LD-14 are as follows:

[0836] Compound LD-19 was synthesized according to the procedure for LD-6, but different compounds were used instead of H and M.

[0837] The NMR data for LD-19 are as follows:

[0838] Example 7. Preparation of LD-11

[0839] 4- ( (45S, 48S) -41- (3- (1- (3- (Buta-2, 3-dienamino) propyl) -1H-1, 2, 3-triazol-4-yl) propionyl) -45-isopropyl-39, 43, 46-trioxo-48- (3-ureidopropyl) -2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23, 26, 29, 32, 35-dodecaoxa-38, 41, 44, 47-tetraazanonatetracontane-49-amido) benzyl ( (1S, 9S) -9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10, 13-dioxo-2, 3, 9, 10, 13, 15-hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinolin-1-yl) carbamate (Compound LD-11)

[0840] Step 1

[0841] N- (3-Azidopropyl) buta-2, 3-dienamide (LD-11b)

[0842] A mixture of 3-Butynoic acid (315 mg, 3.75 mmol) , 2-chloro-1-methylpyridinium iodide (957 mg, 3.75 mmol) and dichloromethane (25 mL) was stirred at room temperature for 2 hours, then LD-11a (250 mg, 2.5 mmol) and DIPEA (968 mg, 7.5 mmol) were added, and the mixture was stirred at room temperature for additional 30 minutes. The mixture was concentrated under reduced pressure, and the residue was dissolved in acetone (25 mL) , followed by the addition of potassium carbonate (1.7 g, 12.5 mmol) . The reaction mixture was stirred at room temperature overnight. The mixture was filtered, and the filtrate was concentrated under reduced pressure. The residue was purified by silica gel column chromatography (petroleum ether / ethyl acetate = 60 / 40) to give the target product LD-11b (303 mg, 73%) .

[0843] MS m / z (ESI) : 167.3 [M+H+]

[0844] Step 2

[0845] 4- ( (45S, 48S) -45-Isopropyl-39, 43, 46-trioxo-41- (pent-4-ynoyl) -48- (3-ureidopropyl) -2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23, 26, 29, 32, 35-dodecaoxa-38, 41, 44, 47-tetraazanonatetracontane-49-amido) benzyl ( (1S, 9S) -9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10, 13-dioxo-2, 3, 9, 10, 13, 15-hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinolin-1-yl) carbamate (LD-11c)

[0846] A mixture of LD-6b (crude product, 65 mg, 0.040 mmol) , 4-pentynoic acid (8 mg, 0.079 mmol) , NMI (10 mg, 0.12 mmol) , TCFH (17 mg, 0.059 mmol) and DMF (4 mL) was stirred at room temperature for 30 minutes. Diluted hydrochloric acid (1 N) was added, and the mixture was extracted with dichloromethane. The organic phase was concentrated under reduced pressure to dryness to yield the target product LD-11c (80 mg, crude product) .

[0847] MS m / z (ESI) : 1577.6 [M+H+]

[0848] Step 3

[0849] 4- ( (45S, 48S) -41- (3- (1- (3- (buta-2, 3-dienamido) propyl) -1H-1, 2, 3-triazol-4-yl) propionyl) -45-isopropyl-39, 43, 46-trioxo-48- (3-ureidopropyl) -2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23, 26, 29, 32, 35-dodecaoxa-38, 41, 44, 47-tetraazanonatetracontane-49-amido) benzyl ( (1S, 9S) -9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10, 13-dioxo-2, 3, 9, 10, 13, 15-hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinolin-1-yl) carbamate (LD-11)

[0850] A mixture of LD-11c (crude product, 80 mg, 0.040 mmol) , LD-11b (7.2 mg, 0.044 mmol) , copper (II) sulfate pentahydrate (20 mg, 0.079 mmol) , L-sodium ascorbate (78 mg, 0.40 mmol) , DMSO (200 μL) and water (200 μL) was stirred at room temperature for 30 minutes. The mixture was filtered. The filtrate was acidified with formic acid, and purified by reverse-phase preparative high-performance liquid chromatography to give the target product LD-11 (15.5 mg, 23%yield for two steps) .

[0851] MS m / z (ESI) : 872.0 [M / 2+H+]

[0852] 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9.95 (s, 0.5H) , 9.79 (s, 0.5H) , 8.71 –8.63 (m, 1H) , 8.46 (d, J =7.9 Hz, 0.5H) , 8.27 –8.22 (m, 0.5H) , 8.19 –7.93 (m, 4H) , 7.83 –7.75 (m, 2H) , 7.67 –7.57 (m, 2H) , 7.39 –7.33 (m, 2H) , 7.31 (s, 1H) , 6.50 (s, 1H) , 6.00 –5.94 (m, 1H) , 5.71 (t, J = 6.6 Hz, 1H) , 5.46 –5.37 (m, 3H) , 5.33 –5.24 (m, 4H) , 5.07 (s, 2H) , 4.40 –4.32 (m, 1H) , 4.32 –4.08 (m, 5H) , 4.02 –3.89 (m, 2H) , 3.56 –3.38 (m, 46H) , 3.27 –3.17 (m, 7H) , 3.15 –3.05 (m, 3H) , 3.03 –2.88 (m, 2H) , 2.84 –2.74 (m, 2H) , 2.38 (s, 3H) , 2.26 –2.11 (m, 2H) , 2.08 –1.98 (m, 1H) , 1.97 –1.81 (m, 4H) , 1.78 –1.30 (m, 6H) , 0.95 –0.79 (m, 9H) .

[0853] Example 8. Preparation of LD-12

[0854] 4- ( (45S, 48S) -41- (4- ( (2-chloroallyl) sulfonyl) benzoyl) -45-isopropyl-39, 43, 46-trioxo-48- (3-ureidopropyl) -2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23, 26, 29, 35-dodecaoxa-38, 41, 41, 44, 47-tetraazanonatetracontane-49-amido) benzyl ( (1S, 9S) -9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10, 13-dioxo-2, 3, 9, 10, 13, 15-hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinolin-1-yl) carbamate (Compound LD-12)

[0855] Step 1

[0856] 4- (Methoxycarbonyl) benzenesulfinic acid (LD-12b)

[0857] To a mixture of LD-12a (1.0 g, 4.26 mmol) , sodium sulfite (0.59 g, 4.69 mmol) and water (20 mL) was added sodium bicarbonate (0.72 g, 8.52 mmol) . The reaction mixture was stirred at 80℃ for 4 hours. The mixture was concentrated under reduced pressure, added with ethanol, and stirred at 80℃for 0.5 hour. The mixture was filtered, and the filter cake was washed with ethanol. The filtrate was concentrated under reduced pressure to give the target product LD-12b (980 mg, crude product) . This product was used directly in the next step without further purification.

[0858] MS m / z (ESI) : 201.1 [M+H+]

[0859] Step 2

[0860] Methyl 4- ( (2-chloroallyl) sulfonyl) benzoate (LD-12c)

[0861] To a solution of LD-12b (crude product, 200 mg, 1.00 mmol) in DMF (5 mL) was added 1, 3-dichloropropene (2 mL) , and the reaction mixture was stirred at room temperature for 16 hours. The mixture was concentrated under reduced pressure, and the residue was purified by silica gel column chromatography (petroleum ether / ethyl acetate = 100 / 0 to 0 / 100) to give the target product LD-12c (80 mg, 33%yield for two steps) .

[0862] MS m / z (ESI) : 297.1 [M+Na+]

[0863] Step 3

[0864] 4- ( (2-chloroallyl) sulfonyl) benzoic acid (LD-12d)

[0865] To a mixture of LD-12c (70 mg, 0.25 mmol) and acetic acid (3 mL) was added concentrated hydrochloric acid (1 mL) , and the reaction mixture was stirred at 100℃ for 1 hour. The mixture was concentrated under reduced pressure to give the target product LD-12d (70 mg, crude product) . This product was used directly in the next step without further purification.

[0866] MS m / z (ESI) : 283.0 [M+H+]

[0867] Step 4

[0868] 4- ( (45S, 48S) -41- (4- ( (2-chloroallyl) sulfonyl) benzoyl) -45-isopropyl-39, 43, 46-trioxo-48- (3-ureidopropyl) -2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23, 26, 29, 35-dodecaoxa-38, 41, 41, 44, 47-tetraazanonatetracontane-49-amido) benzyl ( (1S, 9S) -9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10, 13-dioxo-2, 3, 9, 10, 13, 15-hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinolin-1-yl) carbamate (LD-12)

[0869] LD-12 was synthesized according to the procedure of Step 3 in Example 3, but LD-12d was used instead of B and LD-6b was used instead of LD-3b.

[0870] MS m / z (ESI) : 870.1 [M / 2+H+]

[0871] 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.00 (s, 0.5H) , 9.91 (s, 0.5H) , 8.56 –8.50 (m, 0.5H) , 8.50 –8.44 (m, 1H) , 8.39 –8.28 (m, 1H) , 8.21 (d, J = 7.4 Hz, 0.5H) , 8.14 –8.01 (m, 1H) , 7.98 –7.89 (m, 2H) , 7.81 –7.75 (m, 1H) , 7.68 –7.57 (m, 5H) , 7.40 –7.34 (m, 2H) , 7.31 (s, 1H) , 6.03 –5.92 (m, 1H) , 5.57 –5.50 (m, 1H) , 5.49 –5.40 (m, 2H) , 5.36 –5.22 (m, 2H) , 5.08 (s, 2H) , 4.62 –4.55 (m, 2H) , 4.44 –4.35 (m, 1H) , 4.32 –3.85 (m, 5H) , 3.55 –3.39 (m, 46H) , 3.26 –3.18 (m, 9H) , 3.17 –2.89 (m, 5H) , 2.38 (s, 3H) , 2.26 –2.10 (m, 2H) , 2.08 –1.81 (m, 4H) , 1.49 –1.34 (m, 2H) , 0.96 –0.74 (m, 9H) .

[0872] Example 9. Preparation of LD-13

[0873] 4- ( (45S, 48S) -45-isopropyl-41- (6- (N-methylbuta-2, 3-dienamido) hexanoyl) -39, 43, 46-trioxo-48- (3-ureidopropyl) -2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23, 26, 29, 32, 35-dodecaoxa-38, 41, 44, 47-tetraazanonatetracontane-49-amido) benzyl ( (S) -9-ethyl-9-hydroxy-10, 13-dioxo-2, 3, 9, 10, 13, 15-hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinolin-4-yl) carbamate (Compound LD-13)

[0874] Step 1

[0875] (9H-fluoren-9-yl) methyl ( (S) -1- ( ( (S) -1- ( (4- ( ( ( (4-amino-5-oxo-5, 6, 7, 8-tetrahydronaphthalen) -1-yl) carbamoyl) oxy) methyl) phenyl) amino) -1-oxo-5-ureidopentane-2-yl) amino) -3-methyl-1-oxobutan-2-yl) carbamate (LD-13a)

[0876] A mixture of H-1 (510 mg, 0.67 mmol) , I-6 (353 mg, 2.00 mmol) , HOBt (90 mg, 0.67 mmol) , DIPEA (700 μL, 4.00 mmol) and DMF (7 mL) was stirred at room temperature for 1 hour. The mixture was concentrated under reduced pressure, and the residue was purified by reverse-phase preparative high-performance liquid chromatography to give the target product LD-13a (321 mg, 60%) .

[0877] MS m / z (ESI) : 804.3 [M+H+]

[0878] Step 2

[0879] (9H-Fluoren-9-yl) methyl ( (S) -1- ( ( (S) -1- ( (4- ( ( ( ( (S) -9-ethyl-9-hydroxy-10, 13-dioxo) -2, 3, 9, 10, 13, 15-hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinoline-4-yl) carbamoyl) oxy) methyl) phenyl) amino) -1-oxo-5-ureidopentane-2-yl) amino) -3-methyl-1-oxobutan-2-yl) carbamate (LD-13b)

[0880] A mixture of LD-13a (270 mg, 0.34 mmol) , I-8 (355 mg, 1.34 mmol) , PPTS (84 mg, 0.34 mmol) , toluene (3 mL) and methanol (340 μL) was stirred at 120℃ for 72 hours. The mixture was concentrated under reduced pressure, and the residue was purified by reverse-phase preparative high-performance liquid chromatography to give the target product LD-13b (60 mg, 11%) .

[0881] MS m / z (ESI) : 1031.4 [M+H+]

[0882] Step 3

[0883] 4- ( (S) -2- ( (S) -2-amino-3-methylbutanamido) -5-ureidopentanamido) benzyl ( (S) -9-ethyl-9-hydroxy-10, 13-dioxo-2, 3, 9, 10, 13, 15-hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinolin-4-yl) carbamate (LD-13c)

[0884] LD-13c was synthesized according to the procedure of Step 4 in Example 2, but LD-13b was used instead of LD-1d.

[0885] MS m / z (ESI) : 809.4 [M+H+]

[0886] Steps 4-6

[0887] 4- ( (45S, 48S) -45-isopropyl-41- (6- (N-methylbuta-2, 3-dienamido) hexanoyl) -39, 43, 46-trioxo-48- (3-ureidopropyl) -2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23, 26, 29, 32, 35-dodecaoxa-38, 41, 44, 47-tetraazanonatetracontane-49-amido) benzyl ( (S) -9-ethyl-9-hydroxy-10, 13-dioxo-2, 3, 9, 10, 13, 15-hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinolin-4-yl) carbamate (LD-13)

[0888] LD-13 was synthesized according to the procedures of Steps 1-3 in Example 3, but LD-13c was used instead of H.

[0889] MS m / z (ESI) : 1658.6 [M+H+]

[0890] 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9.99 (s, 0.5H) , 9.74 (s, 0.5H) , 9.43 (s, 1H) , 8.73 –8.63 (m, 1H) , 8.56 –8.46 (m, 1H) , 8.30 –8.09 (m, 1H) , 7.99 –7.93 (m, 1H) , 7.90 –7.83 (m, 1H) , 7.73 –7.60 (m, 2H) , 7.43 –7.36 (m, 2H) , 7.30 (s, 1H) , 6.21 (t, J = 6.2 Hz, 1H) , 6.02 –5.92 (m, 1H) , 5.43 (s, 2H) , 5.30 –5.18 (m, 4H) , 5.13 (s, 2H) , 4.44 –4.31 (m, 1H) , 4.28 –3.83 (m, 6H) , 3.61 –3.37 (m, 46H) , 3.28 –3.10 (m, 9H) , 3.07 –2.89 (m, 5H) , 2.81 (d, J = 4.1 Hz, 1H) , 2.26 –2.15 (m, 2H) , 2.10 –1.95 (m, 3H) , 1.94 –1.80 (m, 3H) , 1.80 –1.57 (m, 3H) , 1.53 –1.34 (m, 6H) , 1.28 –1.11 (m, 3H) , 0.95 –0.81 (m, 9H) .

[0891] Example 10. Preparation of LD-15

[0892] (S) -N1- ( (S) -10-benzyl-1- ( ( (1S, 9S) -9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10, 13-dioxo-2, 3, 9, 10, 13, 15-hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinoline-1-yl) amino) -1, 6, 9, 12, 15-pentaoxo-3-oxa-5, 8, 11, 14-tetraazahexadecane-16-yl) -3- (6- (2, 5-dioxo-2, 5-dihydro-1H-pyrrole) -1-yl) hexanamino) -N5, N5-bis ( (2S, 3R, 4R, 5R) -2, 3, 4, 5, 6-pentahydroxyhexyl) glutaramide (Compound LD-15)

[0893] Step 1

[0894] (2R, 2'R, 3R, 3'R, 4R, 4'R, 5S, 5'S ) -6, 6'- (benzylazanediyl) bis (hexane-1, 2, 3, 4, 5-pentaol) (LD-15b)

[0895] A mixture of LD-15a (33.6 g, 187 mmol) , benzylamine (2.0 g, 18.7 mmol) , sodium cyanoborohydride (11.7 g, 187 mmol) and methanol (200 mL) was stirred at 80℃ overnight. After cooled to room temperature, the reaction was quenched with water. The resulting mixture was concentrated under reduced pressure, and the residue was purified by reverse-phase column chromatography (acetonitrile / water = 5 / 95) to give the target product LD-15b (6.2 g, 76%) .

[0896] MS m / z (ESI) : 436.3 [M+H+]

[0897] Step 2

[0898] (2R, 2'R, 3R, 3'R, 4R, 4'R, 5S, 5'S ) -6, 6'-azanediylbis (hexane-1, 2, 3, 4, 5-pentaol) (LD-15c)

[0899] A mixture of LD-15b (2.5 g, 5.7 mmol) , palladium on carbon (10%, containing 55%water, 5.0 g) , methanol (250 mL) and water (25 mL) was stirred at room temperature under a hydrogen atmosphere for 72 hours. Water was added, the mixture was filtered, and the filtrate was concentrated under reduced pressure. The residue was dissolved in tetrahydrofuran (16 mL) , added with FmocCl (1.8 g, 6.9 mmol) and aqueous solution of sodium bicarbonate (16 mL) , and the reaction mixture was stirred at room temperature for 1 hour. The mixture was concentrated under reduced pressure, and the residue was purified by reverse-phase column chromatography (methanol / water=38 / 62) . The obtained product was dissolved in DMF (10 mL) , diethylamine (3.5 g, 48.0 mmol) was added, and the mixture was stirred at room temperature for 1 hour. The mixture was concentrated under reduced pressure to give the target product LD-15c (828 mg, 42%) .

[0900] MS m / z (ESI) : 346.3 [M+H+]

[0901] Step 3

[0902] tert-butyl (R) -3- ( ( ( (9H-fluoren-9-yl) methoxy) carbonyl) amino) -5- (bis ( (2S, 3R, 4R, 5R) -2, 3, 4, 5, 6-pentahydroxyhexyl) amino) -5-oxopentanoate (LD-15d)

[0903] LD-15d was synthesized according to the procedure of Step 3 in Example 2, but LD-15c was used instead of H and (R) -3- ( ( ( (9H-fluoren-9-yl) methoxy) carbonyl) amino) -5- (tert-butoxy) -5-oxopentanoic acid was used instead of LD-1c.

[0904] MS m / z (ESI) : 753.3 [M+H+]

[0905] Step 4

[0906] (R) -3- ( ( ( (9H-fluoren-9-yl) methoxy) carbonyl) amino) -5- (bis ( (2S, 3R, 4R, 5R) -2, 3, 4, 5, 6-pentahydroxyhexyl) amino) -5-oxo-pentanoic acid (LD-15e)

[0907] A mixture of LD-15d (110 mg, 0.15 mmol) , TFA (5 mL) and dichloromethane (5 mL) was stirred at 0℃ for 1 hour. The mixture was concentrated under reduced pressure to yield the target product LD-15e (112 mg, crude product) .

[0908] MS m / z (ESI) : 697.3 [M+H+]

[0909] Steps 5-7

[0910] (S) -N1- ( (S) -10-benzyl-1- ( ( (1S, 9S) -9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10, 13-dioxo-2, 3, 9, 10, 13, 15-hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinolin-1-yl) amino) -1, 6, 9, 12, 15-pentaoxo-3-oxa-5, 8, 11, 14-tetraazahexadecane-16-yl) -3- (6- (2, 5-dioxo-2, 5-dihydro-1H-pyrrol) -1-yl) hexanamido) -N5, N5-bis ( (2S, 3R, 4R, 5R) -2, 3, 4, 5, 6-pentahydroxyhexyl) glutaramide (LD-15)

[0911] LD-15 was synthesized according to the procedures of Steps 3-5 in Example 2, but LD-15e was used instead of LD-1c and J was used instead of H.

[0912] MS m / z (ESI) : 1490.3 [M+H+]

[0913] 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.62 (t, J = 6.6 Hz, 1H) , 8.49 (d, J = 8.8 Hz, 1H) , 8.32 –8.26 (m, 1H) , 8.09 (d, J = 7.8 Hz, 1H) , 8.06 –7.97 (m, 2H) , 7.78 (d, J = 10.9 Hz, 1H) , 7.61 (d, J = 8.1 Hz, 1H) , 7.31 (s, 1H) , 7.27 –7.14 (m, 5H) , 6.98 (s, 2H) , 5.60 (s, 1H) , 5.42 (s, 2H) , 5.21 (s, 2H) , 4.64 (d, J = 6.6 Hz, 2H) , 4.52 –4.32 (m, 2H) , 4.02 (s, 2H) , 3.88 –3.54 (m, 37H, overlapping with water peak) , 2.43 –2.31 (m, 4H) , 2.25 –2.10 (m, 3H) , 1.97 (t, J = 7.6 Hz, 2H) , 1.85 (q, J = 7.3 Hz, 2H) , 1.50 –1.38 (m, 5H) , 1.30 –1.10 (m, 5H) , 0.87 (t, J = 7.3 Hz, 3H) .

[0914] Example 11. Preparations of LD-20, LD-21 and LD-22

[0915] 6- (2, 5-Dioxo-2, 5-dihydro-1H-pyrrol-1-yl) -N- (2- ( ( (S) -1- ( ( (S) -1- ( ( (S) ) -9-ethyl-9-hydroxy-10, 13-dioxo-2, 3, 9, 10, 13, 15-hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinolin-4-yl) amino) -1-oxopropane-2-yl) amino) -3-methyl-1-oxobutan-2-yl) amino) -2-oxoethyl) -N- ( (32S, 33R, 34R, 35R) -32, 33, 34, 35, 36-pentahydroxy-2-oxo-30- ( (2S, 3R, 4R, 5R) -2, 3, 4, 5, 6-pentahydroxyhexyl) -6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27-octaoxa-3, 30-diazahexatriacontyl) hexanamide (Compound LD-20)

[0916] Steps 1-3

[0917] tert-Butyl N- (6- (2, 5-dioxo-2, 5-dihydro-1H-pyrrol-1-yl) hexanoyl) -N- (2- ( ( (S) -1- ( ( (S) -1- ( ( (S) -9-ethyl-9-hydroxy-10, 13-dioxo-2, 3, 9, 10, 13, 15-hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinolin-4-yl) amino) -1-oxopropane-2-yl) amino) -3-methyl-1-oxobutan-2-yl) amino) -2-oxoethyl) glycinate (LD-20c)

[0918] LD-20c was synthesized according to the procedures of Steps 3-5 in Example 2, but I was used instead of H and L was used instead of LD-1c.

[0919] MS m / z (ESI) : 938.4 [M+H+]

[0920] Step 4

[0921] N- (6- (2, 5-Dioxo-2, 5-dihydro-1H-pyrrol-1-yl) hexanoyl) -N- (2- ( ( (S) -1- ( ( (S) -1- ( ( (S) -9-ethyl-9-hydroxy-10, 13-dioxo-2, 3, 9, 10, 13, 15-hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinolin-4-yl) amino) -1-oxopropane-2-yl) amino) -3-methyl-1-oxobutan-2-yl) amino) -2-oxoethyl) glycine (LD-20d)

[0922] LD-20d was synthesized according to the procedure of Step 4 in Example 3, but LD-20c was used instead of LD-3c.

[0923] MS m / z (ESI) : 882.4 [M+H+]

[0924] Step 5

[0925] 6- (2, 5-Dioxo-2, 5-dihydro-1H-pyrrol-1-yl) -N- (2- ( ( (S) -1- ( ( (S) -1- ( ( (S) ) -9-ethyl-9-hydroxy-10, 13-dioxo-2, 3, 9, 10, 13, 15-hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinolin-4-yl) amino) -1-oxopropane-2-yl) amino) -3-methyl-1-oxobutan-2-yl) amino) -2-oxoethyl) -N- ( (32S, 33R, 34R, 35R) -32, 33, 34, 35, 36-pentahydroxy-2-oxo-30- ( (2S, 3R, 4R, 5R) -2, 3, 4, 5, 6-pentahydroxyhexyl) -6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27-octaoxa-3, 30-diazahexatriacontyl) hexanamide (LD-20)

[0926] LD-20 was synthesized according to the procedure of Step 3 in Example 2, but LD-20d was used instead of LD-1c and P was used instead of H.

[0927] MS m / z (ESI) : 1604.6 [M+H+]

[0928] 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9.75 (s, 0.5H) , 9.55 (s, 0.5H) , 8.78 –8.65 (m, 2H) , 8.52 (d, J=7.9 Hz, 0.5H) , 8.30 –8.23 (m, 1H) , 8.18 –8.06 (m, 1.5H) , 7.97 (s, 0.5H) , 7.95 (s, 0.5H) , 7.83 (d, J=4.3 Hz, 0.5H) , 7.80 (d, J= 4.3 Hz, 0.5H) , 7.31 (s, 1H) , 6.99, 6.98 (s, total 2H) , 6.50 (brs, 1H) , 5.43 (s, 2H) , 5.26 (s, 2H) , 4.62 –4.47 (m, 2H) , 4.29 –4.24 (m, 1H) , 4.23 –4.18 (m, 1H) , 4.16 –4.06 (m, 3H) , 4.04 –3.94 (m, 4H) , 3.89 (s, 1H) , 3.83 –3.75 (m, 3H) , 3.73 –3.65 (m, 3H) , 3.63 –3.54 (m, 7H) , 3.54 –3.46 (m, 26H) , 3.45 –3.38 (m, 8H) , 3.37 –3.32 (m, 5H) , 3.30 –3.19 (m, 4H) , 3.18 –3.13 (m, 2H) , 3.01 –2.93 (m, 2H) , 2.21 –2.15 (m, 2H) , 2.12 –1.98 (m, 3H) , 1.92 –1.82 (m, 2H) , 1.50 –1.35 (m, 7H) , 1.22 –1.13 (m, 2H) , 0.95 –0.82 (m, 9H) .

[0929] Compound LD-21 was synthesized according to the procedure of LD-20, but different compounds were used instead of L and P.

[0930] The NMR data of LD-21 are as follows:

[0931] Compound LD-22 was synthesized following the procedure of LD-20, but a different compound was used instead of P.

[0932] The NMR data of LD-22 are as follows:

[0933] Example 12. Preparations of LD-23 and LD-26

[0934] N- (2- ( ( (S) -1- ( ( (S) -1- ( ( (S) -9-ethyl-9-hydroxy-10, 13-dioxo-2, 3, 9, 10, 13, 15-hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinolin-4-yl) amino) -1-oxopropane-2-yl) amino) -3-methyl-1-oxobutan-2-yl) amino) -2-oxoethyl) -6- (N-methylbuta-2, 3-dienamido) -N- (39-oxo-2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23, 26, 29, 32, 35-dodecaoxa-38-azatetracontan-40-yl) hexanamide (Compound LD-23)

[0935] Steps 1-3

[0936] N- (2- ( ( (S) -1- ( ( (S) -1- ( ( (S) -9-ethyl-9-hydroxy-10, 13-dioxo-2, 3, 9, 10, 13, 15-hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinolin-4-yl) amino) -1-oxo-propane-2-yl) amino) -3-methyl-1-oxobutan-2-yl) amino) -2-oxoethyl) -6- (N-methylbuta-2, 3-dienamido) -N- (39-oxo-2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23, 26, 29, 32, 35-dodecaoxa-38-azatetracontan-40-yl) hexanamide (LD-23) LD-23 was synthesized according to the procedures of Steps 3-5 in Example 3, but LD-20b was used instead of LD-3b and M-4 was used instead of LD-1a.

[0937] MS m / z (ESI) : 1423.6 [M+H+]

[0938] 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9.75 (s, 0.5H) , 9.56 (s, 0.5H) , 8.71 (d, J = 7.9 Hz, 1H) , 8.57 –8.48 (m, 0.5H) , 8.26 (t, J = 5.4 Hz, 1H) , 8.10 (d, J = 7.0 Hz, 0.5H) , 7.98 –7.93 (m, 1H) , 7.85 –7.79 (m, 1H) , 7.31 (s, 1H) , 6.26 –6.15 (m, 1H) , 5.43 (s, 2H) , 5.30 –5.20 (m, 4H) , 4.58 –4.48 (m, 1H) , 4.30 –4.18 (m, 1H) , 4.16 –4.08 (m, 2H) , 4.06 –3.86 (m, 3H) , 3.54 –3.46 (m, 42H) , 3.45 –3.37 (m, 4H) , 3.35 –3.14 (m, 9H) , 3.02 –2.94 (m, 3H) , 2.81 (s, 1H) , 2.26 –2.15 (m, 2H) , 2.14 –1.96 (m, 3H) , 1.94 –1.82 (m, 2H) , 1.54 –1.36 (m, 8H) , 1.26 –1.13 (m, 2H) , 0.96 –0.84 (m, 9H) .

[0939] Compound LD-26 was synthesized according to the procedure of LD-23, but different compounds were used instead of B and M-4.

[0940] The NMR data of LD-26 are as follows:

[0941] Example 13. Preparation of LD-24

[0942] 6- (Buta-2, 3-dienamido) -N- (2- ( ( (S) -1- ( ( (S) -1- ( ( (S) -9-ethyl-9-hydroxy-10, 13) -dioxo-2, 3, 9, 10, 13, 15-hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinolin-4-yl) amino) -1-oxopropane-2-yl) amino) -3-methyl-1-oxobutan-2-yl) amino) -2-oxoethyl) -N- (39-oxo-2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23, 26, 29, 32, 35-dodecaoxa-38-azatetracontan-40-yl) hexanamide (Compound LD-24)

[0943] Steps 1-4

[0944] (S) -N- ( (S) -1- ( ( (S) -9-ethyl-9-hydroxy-10, 13-dioxo-2, 3, 9, 10, 13, 15-hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinolin-4-yl) amino) -1-oxopropane-2-yl) -3-methyl-2- (39-oxo-2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23, 26, 29, 32, 35-dodecaoxa-38, 41-diazatritetracontane-43-amido) butanamide (LD-24d)

[0945] LD-24d was synthesized according to the procedures of Steps 1-4 in Example 2, but M was used instead of L, tert-butyl L-valinate was used instead of LD-1a and I-10 was used instead of H.

[0946] MS m / z (ESI) : 1230.5 [M+H+]

[0947] Step 5

[0948] 6- (Buta-2, 3-dienamido) -N- (2- ( ( (S) -1- ( ( (S) -1- ( ( (S) -9-ethyl-9-hydroxy-10, 13) -dioxo-2, 3, 9, 10, 13, 15-hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinolin-4-yl) amino) -1-oxopropane-2-yl) amino) -3-methyl-1-oxobutan-2-yl) amino) -2-oxoethyl) -N- (39-oxo-2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23, 26, 29, 32, 35-dodecaoxa-38-azatetracontan-40-yl) hexanamide (LD-24)

[0949] LD-24 was synthesized according to the procedure of Step 3 in Example 3, but LD-24d was used instead of LD-3b and C was used instead of B.

[0950] MS m / z (ESI) : 1409.8 [M+H+]

[0951] 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9.75 (s, 0.5H) , 9.56 (s, 0.5H) , 8.75 –8.68 (m, 1H) , 8.53 (d, J=6.9 Hz, 0.5H) , 8.30 –8.22 (m, 1H) , 8.10 (d, J= 6.9 Hz, 0.5H) , 7.97 (s, 0.5H) , 7.95 (s, 0.5H) , 7.87 –7.78 (m, 2H) , 7.31 (s, 1H) , 6.64 (brs, 1H) , 5.73 –5.67 (m, 1H) , 5.43 (s, 2H) , 5.35 –5.30 (m, 1H) , 5.30 –5.22 (m, 3H) , 4.65 –4.18 (m, 14H) , 4.17 –4.05 (m, 4H) , 4.02 –3.94 (m, 2H) , 3.94 –3.84 (m, 2H) , 3.58 –3.45 (m, 28H) , 3.45 –3.35 (m, 4H) , 3.23 (s, 3H) , 3.19 –3.13 (m, 2H) , 3.08 –3.01 (m, 2H) , 3.01 –2.94 (m, 2H) , 2.24 –2.15 (m, 2H) , 2.10 –1.94 (m, 5H) , 1.92 –1.81 (m, 2H) , 1.53 –1.33 (m, 7H) , 0.98 –0.75 (m, 9H) .

[0952] Example 14. Preparation of LD-25

[0953] N- ( (S) -9-Benzyl-1- ( (S) -9-ethyl-9-hydroxy-10, 13-dioxo-2, 3, 9, 10, 13, 15-hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinolin-4-yl) -5, 8, 11, 14, 17-pentaoxo-2-oxa-4, 7, 10, 13, 16-pentaazaoctadecan-18-yl) -6- (2, 5-dioxo-2, 5-dihydro-1H-pyrrol-1-yl) -N- (39-oxo-2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23, 26, 29, 32, 35-dodecaoxa-38-azatetracontan-40-yl) hexanamide (Compound LD-25)

[0954] Steps 1-3

[0955] N- ( (S) -9-benzyl-1- ( (S) -9-ethyl-9-hydroxy-10, 13-dioxo-2, 3, 9, 10, 13, 15-hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinolin-4-yl) -5, 8, 11, 14, 17-pentaoxo-2-oxa-4, 7, 10, 13, 16-pentaazaoctadecan-18-yl) -6- (2, 5-dioxo-2, 5-dihydro-1H-pyrrol-1-yl) -N- (39-oxo-2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23, 26, 29, 32, 35-dodecaoxa-38-azatetracontan-40-yl) hexanamide (LD-25)

[0956] LD-25 was synthesized according to the procedures of Steps 3-5 in Example 2, but N was used instead of H and M was used instead of LD-1c.

[0957] MS m / z (ESI) : 808.5 [M / 2+H+]

[0958] 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.85 (t, J = 5.6 Hz, 0.5H) , 8.68 –8.62 (m, 1H) , 8.57 (t, J = 5.4 Hz, 0.5H) , 8.48 (t, J = 5.8 Hz, 0.5H) , 8.36 –8.32 (m, 1H) , 8.17 –8.05 (m, 2H) , 8.04 –7.99 (m, 0.5H) , 7.98, 7.96 (s, 1H) , 7.82, 7.80 (s, 1H) , 7.31 (s, 1H) , 7.29 –7.13 (m, 5H) , 6.98, 6.97 (s, 2H) , 6.49 (s, 1H) , 5.43 (s, 2H) , 5.25 (s, 2H) , 4.78 –4.62 (m, 4H) , 4.57 – 4.48 (m, 1H) , 4.06, 4.02 (s, 2H) , 3.93, 3.88 (s, 2H) , 3.84 –3.68 (m, 6H) , 3.63 -3.56 (m, 2H) , 3.55 –3.43 (m, 38H) , 3.43 –3.32 (m, 8H) , 3.23 (s, 3H) , 3.20 –3.15 (m, 2H) , 3.11 –3.05 (m, 2H) , 2.86 –2.76 (m, 2H) , 2.57 –2.53 (m, 2H) , 2.24 –2.14 (m, 2H) , 2.11 –2.03 (m, 2H) , 1.92 –1.81 (m, 2H) , 1.48 –1.37 (m, 4H) , 1.22 –1.12 (m, 2H) , 0.88 (t, J =7.3 Hz, 3H) .

[0959] Example 15. Preparation of LD-27

[0960] N- ( (S) -9-Benzyl-1- ( (S) -9-ethyl-9-hydroxy-10, 13-dioxo-2, 3, 9, 10, 13, 15-hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinolin-4-yl) -5, 8, 11, 14, 17-pentaoxo-2-oxa-4, 7, 10, 13, 16-pentaazaoctadecan-18-yl) -6- (buta-2, 3-dienamido) -N- (39-oxo-2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23, 26, 29, 32, 35-dodecaoxa-38-azatetracontan-40-yl) hexanamide (Compound LD-27)

[0961] LD-27 was synthesized according to the procedure of Step 3 in Example 3, but LD-25b was used instead of LD-3b and C was used instead of B.

[0962] MS m / z (ESI) : 1601.6 [M+H+]

[0963] 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.86 (t, J = 5.8 Hz, 0.5H) , 8.69 –8.63 (m, 1H) , 8.58 (t, J = 5.5 Hz, 0.5H) , 8.49 (t, J = 5.7 Hz, 0.5H) , 8.39 –8.30 (m, 1H) , 8.18 –8.06 (m, 2H) , 8.01 (t, J = 5.6 Hz, 0.5H) , 7.98, 7.95 (s, 1H) , 7.83 –7.78 (m, 2H) , 7.31 (s, 1H) , 7.29 –7.13 (m, 5H) , 6.49 (s, 1H) , 5.70 (t, J = 6.6 Hz, 1H) , 5.43 (s, 2H) , 5.28 –5.22 (m, 4H) , 4.75 –4.63 (m, 4H) , 4.57 –4.47 (m, 1H) , 4.07, 4.04 (s, 2H) , 3.94, 3.89 (s, 2H) , 3.85 –3.66 (m, 6H) , 3.65 –3.45 (m, 44H) , 3.44 –3.37 (m, 4H) , 3.25 –2.99 (m, 10H) , 2.86 –2.77 (m, 1H) , 2.25 –2.16 (m, 2H) , 2.12 –2.00 (m, 2H) , 1.93 –1.79 (m, 2H) , 1.52 –1.33 (m, 4H) , 1.25 –1.16 (m, 2H) , 0.88 (t, J = 7.3 Hz, 3H) .

[0964] Example 16. Preparations of LD-29 and LD-30

[0965] 4- ( (42S, 45S, 48S) -41- (6- (buta-2, 3-dienamido) hexanoyl) -45-isopropyl-42-methyl-39, 43, 46-trioxo-48- (3-ureidopropyl) -2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23, 26, 29, 32, 35-dodecaoxa-38, 41, 4, 44, 47-tetraazanonatetracontane-49-amido) benzyl ( (1S, 9S) -9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10, 13-dioxo-2, 3, 9, 10, 13, 15-hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinolin-1-yl) carbamate (Compound LD-29)

[0966] Step 1

[0967] (9H-Fluoren-9-yl) methyl ( (S) -1- ( ( (S) -1- ( ( (S) -1- ( (4- ( ( ( ( (1S, 9S) -9-ethyl) -5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10, 13-dioxo-2, 3, 9, 10, 13, 15-hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinolin-1-yl) carbamoyl) oxy) methyl) phenyl) amino) -1-oxo-5-ureidopentane-2-yl) amino) -3-methyl-1-oxobutane-2-yl) amino) -1-oxopropane-2-yl) (39-oxo-2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23, 26, 29, 32, 35-dodecaoxa-38-azatetracontan-40-yl) carbamate (LD-29a)

[0968] To a mixture of Q (160 mg, 0.16 mmol) , H (200 mg, 0.24 mmol) , NMI (65 μL, 0.80 mmol) and NMP (5 mL) was added TCFH (0.14 g, 0.48 mmol) , and then the reaction mixture was stirred at room temperature for 0.5 hour. The mixture was purified by reverse-phase preparative high-performance liquid chromatography to give LD-29a (20 mg, 7%) .

[0969] MS m / z (ESI) : 867.5 [M / 2+H+]

[0970] Step 2

[0971] 4- ( (42S, 45S, 48S) -45-isopropyl-42-methyl-39, 43, 46-trioxo-48- (3-ureidopropyl) -2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23, 26, 29, 32, 35-dodecaoxa-38, 41, 44, 47-tetraazanonatetracontane-49-amido) benzyl ( (1S, 9S) -9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10, 13-dioxo-2, 3, 9, 10, 13, 15-hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinolin-1-yl) carbamate (LD-29b)

[0972] To a mixture of LD-29a (0.02 g, 0.01 mmol) , tetrahydrofuran (2 mL) and methanol (2 mL) was added diethylamine (2 mL) , and then the reaction mixture was stirred at room temperature for 0.5 hour. The mixture was concentrated under reduced pressure to give the target product LD-29b (20 mg, crude product) . This product was used directly in the next step without further purification.

[0973] MS m / z (ESI) : 756.5 [M / 2+H+]

[0974] Step 3

[0975] 4- ( (42S, 45S, 48S) -41- (6- (buta-2, 3-dienamido) hexanoyl) -45-isopropyl-42-methyl-39, 43, 46-trioxo-48- (3-ureidopropyl) -2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23, 26, 29, 32, 35-dodecaoxa-38, 41, 44, 47-tetraazanonatetracontane-49-amido) benzyl ( (1S, 9S) -9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10, 13-dioxo-2, 3, 9, 10, 13, 15-hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinolin-1-yl) carbamate (LD-29)

[0976] LD-29 was synthesized according to the procedure of Step 1 in this example, but LD-29b was used instead of H and C was used instead of Q.

[0977] MS m / z (ESI) : 845.8 [M / 2+H+]

[0978] 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.02 (s, 0.5H) , 9.83 (s, 0.5H) , 8.54 (s, 0.5H) , 8.46 –8.35 (m, 0.5H) , 8.16 –8.02 (m, 2H) , 7.92 –7.82 (m, 2H) , 7.81 –7.74 (m, 1H) , 7.64 –7.56 (m, 2H) , 7.41 –7.27 (m, 3H) , 6.07 –5.97 (m, 1H) , 5.71 (t, J = 6.5 Hz, 1H) , 5.45 (s, 2H) , 5.36 –5.21 (m, 4H) , 5.08 (s, 2H) , 4.45 –3.98 (m, 7H) , 3.93 –3.76 (m, 46H) , 3.47 –3.18 (m, 9H) , 3.17 –2.87 (m, 9H) , 2.38 (s, 3H) , 2.30 –2.09 (m, 3H) , 2.06 –1.95 (m, 2H) , 1.93 –1.81 (m, 1H) , 1.67 (d, J = 6.9 Hz, 3H) , 1.53 –1.33 (m, 4H) , 1.24 –1.13 (m, 2H) , 0.93 –0.79 (m, 9H) .

[0979] Compound LD-30 was synthesized following the procedure of LD-29, but a different compound was used instead of Q.

[0980] The NMR data of LD-30 are as follows:

[0981] Example 17. Preparation of LD-31

[0982] 4- ( (45S, 48S) -41- (6- (buta-2, 3-dienamido) hexanoyl) -45-isopropyl-39, 43, 46-trioxo-48- (3-ureidopropyl) -2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23, 26, 29, 32, 35-dodecaoxa-38, 41, 44, 47-tetraazanonatetracontan-49-amido) benzyl ( (S) -1- ( ( (S) -1- ( ( (3R, 4S, 5S) -1- ( (S) -2- ( (1R, 2R) -3- ( ( (1S, 2R) -1-hydroxy-1-phenylpropan-2-yl) amino) -1-methoxy-2-methyl-3-oxopropyl) pyrrolidin-1-yl) -3-methoxy-5-methyl-1-oxoheptan-4-yl) (methyl) amino) -3-methyl-1-oxobutan-2-yl) amino) -3-methyl-1-oxobutan-2-yl) (methyl) carbamate (Compound LD-31)

[0983] Step 1

[0984] 4- ( (45S, 48S) -41- ( ( (9H-fluoren-9-yl) methoxy) carbonyl) -45-isopropyl-39, 43, 46-trioxo-48- (3-ureidopropyl) -2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23, 26, 29, 32, 35-dodecaoxa-38, 41, 44, 47-tetraazanonatetracontane-49-amido) benzyl ( (S) -1- ( ( (S) -1- ( ( (3R, 4S, 5S) -1- ( (S) -2- ( (1R, 2R) -3- ( ( (1S, 2R) -1-hydroxy-1-phenylpropan-2-yl) ) amino) -1-methoxy-2-methyl-3-oxopropyl) pyrrolidin-1-yl) -3-methoxy-5-methyl-1-oxoheptane-4-yl) (methyl) amino) -3-methyl-1-oxobutane-2-yl) amino) -3-methyl-1-oxobutane-2-yl) (methyl) carbamate (LD-31a)

[0985] A mixture of S (crude product, 80 mg, 0.05 mmol) , M (90 mg, 0.1 mmol) , NMI (12 mg, 0.15 mmol) , TCFH (28 mg, 0.1 mmol) and DMF (2 mL) was stirred at room temperature for 1 hour. The mixture was concentrated under reduced pressure, and the residue was purified by C18 reverse-phase column (acetonitrile / water = 1 / 1) to give the target product LD-31a (40 mg, 40%) .

[0986] MS m / z (ESI) : 1001.5 [M / 2+H+]

[0987] Step 2

[0988] 4- ( (45S, 48S) -45-Isopropyl-39, 43, 46-trioxo-48- (3-ureidopropyl) -2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23, 26, 29, 32, 35-dodecaoxa-38, 41, 44, 47-tetraazanonatetracontane-49-amido) benzyl ( (S) -1- ( ( (S) -1- ( ( (3R, 4S, 5S) -1- ( (S) -2- ( (1R, 2R) -3- ( ( (1S, 2R) -1-hydroxy-1-phenylpropan-2-yl) amino) -1-methoxy-2-methyl-3-oxopropyl) pyrrolidin-1-yl) -3-methoxy-5-methyl-1-oxoheptan-4-yl) (methyl) amino) -3-methyl-1-oxobutan-2-yl) amino) -3-methyl-1-oxobutan-2-yl) (methyl) carbamate (LD-31b)

[0989] A mixture of LD-31a (40 mg, 0.02 mmol) , diethylamine (29 mg, 0.4 mmol) and methanol (2 mL) was stirred at room temperature for 1 hour. The mixture was concentrated under reduced pressure to yield the target product LD-31b (60 mg, crude) . This product was used directly in the next step without further purification.

[0990] MS m / z (ESI) : 890.5 [M / 2+H+]

[0991] Step 3

[0992] 4- ( (45S, 48S) -41- (6- (buta-2, 3-dienamido) hexanoyl) -45-isopropyl-39, 43, 46-trioxo-48- (3-ureidopropyl) -2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23, 26, 29, 32, 35-dodecaoxa-38, 41, 44, 47-tetraazanonatetracontane-49-amido) benzyl ( (S) -1- ( ( (S) -1- ( ( (3R, 4S, 5S) -1- ( (S) -2- ( (1R, 2R) -3- ( ( (1S, 2R) -1-hydroxy-1-phenylpropan-2-yl) amino) -1-methoxy-2-methyl-3-oxopropyl) pyrrolidin-1-yl) -3-methoxy-5-methyl-1-oxoheptan-4-yl) (methyl) amino) -3-methyl-1-oxobutan-2-yl) amino) -3-methyl-1-oxobutan-2-yl) (methyl) carbamate (LD-31)

[0993] LD-31 was synthesized according to the procedure of Step 3 in Example 3, but LD-31b was used instead of LD-3b and C was used instead of B.

[0994] MS m / z (ESI) : 980.6 [M / 2+H+]

[0995] 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.04 –9.94 (m, 1H) , 9.72 (s, 1H) , 9.04 (s, 0.5H) , 8.73 –8.63 (m, 1H) , 8.54 –8.48 (m, 0.5H) , 8.32 –7.93 (m, 3H) , 7.91 –7.80 (m, 2H) , 7.71 –7.65 (m, 1H) , 7.65 –7.52 (m, 4H) , 7.36 –7.22 (m, 4H) , 7.21 –7.11 (m, 1H) , 5.75 –5.67 (m, 1H) , 5.36 –5.30 (m, 1H) , 5.26 (d, J = 6.6 Hz, 2H) , 5.15 –4.90 (m, 3H) , 4.80 –4.58 (m, 3H) , 4.54 –4.37 (m, 3H) , 4.33 –4.21 (m, 2H) , 4.20 –4.06 (m, 2H) , 4.06 –3.88 (m, 3H) , 3.86 (s, 1H) , 3.80 –3.76 (m, 1H) , 3.70 –3.62 (m, 1H) , 3.61 –3.47 (m, 46H) , 3.27 –3.17 (m, 9H) , 3.13 –2.94 (m, 5H) , 2.90 –2.82 (m, 3H) , 2.71 –2.65 (m, 1H) , 2.45 –2.37 (m, 1H) , 2.34 –2.23 (m, 1H) , 2.21 –1.87 (m, 7H) , 1.85 –1.66 (m, 1H) , 1.64 –1.32 (m, 4H) , 1.06 –0.96 (m, 7H) , 0.95 –0.71 (m, 36H) .

[0996] Example 18. Preparation of LD-32

[0997] 6- (Buta-2, 3-dienamido) -N- ( (9S, 12S) -9- (4- (dipropylamino) butyl) -1- ( (S) -9-ethyl-9-hydroxy-10, 13-dioxo-2, 3, 9, 10, 13, 15-hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinolin-4-yl) -12-isopropyl-5, 8, 11, 14-tetraoxo-2-oxa-4, 7, 10, 13-tetraazapentadecan) -N- (39-oxo-2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23, 26, 29, 32, 35-dodecaoxa-38-azatetracontan-40-yl) -hexanamide (Compound LD-32)

[0998] Step 1

[0999] tert-Butyl 41- (6- (buta-2, 3-dienamido) hexanoyl) -39-oxo-2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23, 26, 29, 32, 35-dodecaoxa-38, 41-diazatritetracontan-43-oate (LD-32a)

[1000] A mixture of M-5 (4.5 g, 4.7 mmol) , diethylamine (1.7 g, 24 mmol) and DMF (15 mL) was stirred at room temperature for 30 minutes. The mixture was concentrated under reduced pressure. The residue was dissolved in DMF (45 mL) , added with C (930 mg, 4.7 mmol) , TCFH (2.7 g, 9.5 mmol) and NMI (1.2 g, 14 mmol) , and the reaction mixture was stirred at room temperature for 15 minutes. The mixture was purified by reverse-phase preparative high-performance liquid chromatography to give the target product LD-32a (2.9 g, 67%) .

[1001] MS m / z (ESI) : 910.6 [M+H+]

[1002] Step 2

[1003] 41- (6- (buta-2, 3-dienamido) hexanoyl) -39-oxo-2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23, 26, 29, 32, 35-dodecaoxa-38, 41-diazatritetraacontane-43-acid (LD-32b)

[1004] To a solution of LD-32a (250 mg, 0.027 mmol) in dichloromethane (4 mL) was added TFA (1 mL) , and the reaction mixture was stirred at room temperature for 2 hours. The mixture was concentrated under reduced pressure to give the target product LD-32b (200 mg, 85%) . This product was used directly in the next step without further purification.

[1005] MS m / z (ESI) : 854.5 [M+H+]

[1006] Step 3

[1007] 6- (Buta-2, 3-dienamido) -N- ( (9S, 12S) -9- (4- (dipropylamino) butyl) -1- ( (S) -9-ethyl-9-hydroxy-10, 13-dioxo-2, 3, 9, 10, 13, 15-hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinolin-4-yl) -12-isopropyl-5, 8, 11, 14-tetraoxo-2-oxa-4, 7, 10, 13-tetraazapentadecan-15-yl) -N- (39-oxo-2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23, 26, 29, 32, 35-dodecaoxa-38-azatetracontan-40-yl) hexanamide (LD-32) To a mixture of T (17.0 mg, 0.02 mmol) , LD-32b (20 mg, 0.02 mmol) , triethylamine (15 μL, 0.1 mmol) and DMF (1 mL) was added DMTMM (15.0 mg, 0.04 mmol) , and the reaction mixture was stirred at room temperature for 0.5 hour. The mixture was purified by reverse-phase preparative high-performance liquid chromatography to give the target product LD-32 (1.5 mg, 5%) .

[1008] MS m / z (ESI) : 826.6 [M / 2+H+]

[1009] 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.84 –8.80 (m, 0.5H) , 8.78 –8.70 (m, 1H) , 8.66 –8.62 (m, 0.5H) , 8.44 (d, J = 7.9 Hz, 0.5H) , 8.32 (d, J = 7.6 Hz, 0.5H) , 8.25 –8.18 (m, 0.5H) , 8.04 (d, J = 7.4 Hz, 0.5H) , 7.97 (d, J = 8.7 Hz, 1H) , 7.84 –7.78 (m, 2H) , 7.31 (s, 1H) , 6.50 (s, 1H) , 5.73 –5.66 (m, 1H) , 5.43 (s, 2H) , 5.29 –5.24 (m, 4H) , 4.75 –4.64 (m, 4H) , 4.30 –4.03 (m, 3H) , 3.96 –3.72 (m, 4H) , 3.58 –3.46 (m, 46H) , 3.45 –3.40 (m, 9H) , 3.25 –3.22 (m, 4H) , 3.20 –3.08 (m, 2H) , 3.06 –2.92 (m, 7H) , 2.21 –2.14 (m, 2H) , 2.03 –1.95 (m, 3H) , 1.92 –1.83 (m, 1H) , 1.66 –1.53 (m, 7H) , 1.50 –1.30 (m, 2H) , 0.91 –0.85 (m, 20H) .

[1010] Example 19. Preparation of mouse immunization and hybridoma

[1011] Blood samples were collected from mice 7 days before immunization and left to stand overnight in a 4℃ refrigerator. After centrifugation at 12000 rpm, the supernatant was stored at -80℃ as a negative serum control.

[1012] The antigen preparation followed the principle of "prepare-as-you-use" . Accordingly, 25 μL of antigen albumin was taken from each mouse, diluted to 50 μL with the same solvent (PBS) , and then mixted homogeously with adjuvant (Quickbody, catalog number KX0210041) before injection to mice. Six mice were immunized three times at the abdominal cavity, muscle and subcutaneous tissues.

[1013] Starting from the second immunization, blood samples were collected from mice's orbital cavities 10-14 days after each immunization. The blood samples were left to stand overnight in a 4℃refrigerator and the supernatants were collected by centrifugation the next day for titer determination. Based on the titers, the mice with the highest titer were selected for boosting. Fusion was performed three days after boosting.

[1014] Myeloma cells SP2 / 0 were resuscitated one week before titer testing and cultured at 37℃, 5%CO2. Two days before fusion, when the cell confluence rate reached 90%, a 1: 2 subculturing was performed for three days with fresh culture medium each time. Electrofusion was performed when the cells were in the optimal condition. Spleen cells and myeloma cells were mixed at a 2: 1 ratio, centrifuged at 1500 rpm for 5 minutes, resuspended in 8 mL of electrofusion buffer, and centrifuged at 1500 rpm (700×g) for 5 minutes. The supernatants were discarded, and the centrifugation-resuspension cycle was repeated once. Cells were then resuspended in an appropriate amount of electrofusion buffer and fusioned in an electrofusion chamber. The cell suspension was added with a complete culture medium, dispensed into a 96-well plate with 25,000 cells in 150 μL per well, and cultured in a 37℃, 5%CO2 incubator. After 7-10 days of culturing, HAT medium was exchanged to HT medium, and culturing was continued for 3-4 more days before the supernatant from each well was taken for ELISA testing. After fusion, the cells were plated and screened. The supernatants from the parental clones were taken for ELISA and flow cytometry screening, and cross-reactivity screening against monkey-derived and mouse-derived antigens as well. Cell subcloning was performed using the diagonal method and the parental clones were cryopreserved.

[1015] Through immunisation of BALB / C strain mice, after the antibody titer in the serum of the immunised mice reached 72,000, spleen cells from the mice were fused with myeloma cells SP2 / 0 to prepare hybridoma cells. After selective culture of the hybridoma cells, the hybridoma cells were screened using ELISA and FACS 10 days after fusion. The positive clones obtained from screening were further subcloned to isolate monoclonal cells capable of expressing the target antibody. A total of 6 mice were immunized in a batch and fused once, resulting in a monoclonal strain that specifically recognized the B7-H3 antigen and was named Hy58C11-2 with the sequences of heavy and light chains shown as SEQ ID NO 7 and SEQ ID NO 8, respectively. The sequences were analyzed according to IMGT principles, with the CDR antigen-binding regions of the heavy and light chains being SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5 and SEQ ID NO 6, respectively. SEQ ID NO 15 and SEQ ID NO 16 are the corresponding nucleotide sequences of the heavy and light chains of Hy58C11-2, respectively.

[1016] Example 20. Hybridoma antibody and human B7-H3 albumin ELISA binding assay

[1017] The internally prepared B7-H3 protein was coated at 50 ng per well and incubated overnight at 4℃. The coated plates were equilibrated to room temperature, washed three times with PBS, added with 200 μL of blocking buffer (1×PBS containing 2%BSA) per well, and incubated at 37℃ for 2 hours. The plates were washed five times with PBST (1×PBS / 0.05%Tween-20) and blotted dry. B7-H3 hybridoma antibody and control were prepared with PBS containing 0.1%BSA to a final concentration of 20 μg / mL, followed by a 3.16-fold series dilution to 10 concentrations. The plates were added with 50 μL of antibody per well, incubated at 37℃ for 1 hour, and washed five times with PBST. 100 μL of 1: 10000 diluted anti-mouse IgG (Fc specific) –peroxidase antibody (SIGMA, A9309) was added to each sample well, and 100 μL of PBS was added to each blank well. After incubated at 37℃ for 40 minutes and washed five times with PBST, the plates were added with 100 μL of color developing solution per well and incubated at 37℃ for 15-30 minutes. 50 μL of stop solution was added to each well. The absorbance of each well was measured at a single wavelength of 450 nm.

[1018] The results are shown in Figure 1 and Table 1. Both of the B7-H3 hybridoma antibody Hy58C11-2 and the control antibody Ref1 (enoblituzumab, US9150656) can bind to the B7-H3 protein with similar affinity. The amino acid sequences of the heavy and light chains of the enoblituzumab antibody are SEQ ID NO 23 and SEQ ID NO 24, respectively.

[1019] Table 1

[1020] Example 21. Hybridoma antibody and human B7-H3 albumin flow (FACS) binding

[1021] CT26-B7H3 and Calu-6 cells were revived and resuspended in FACS buffer (containing 2%FBS) to approximately 2.0×105 / mL. 50 μL of cell suspension was added to each well of a U-bottom 96-well plate. Antibodies were prepared at an initial concentration of 40 μg / mL, diluted in a 3.16-fold series dilution to 9 concentrations, and added with 50 μL to each well. Cells were mixed thoroughly, incubated at 4℃ for 1 hour, and washed with 400 μL of FACS buffer three times. The cells were added with secondary antibody PE anti-human IgG Fc (Biolegend, 410708) at a 1: 100 ratio, incubated at 4℃for 1 hour, washed with 400 μL of FACS buffer three times, and resuspended in 200 μL of FACS buffer. 2000 cells per sample were collected for flow cytometry. Flowjo was used to analyze the maximum relative fluorescence signal of the PE signal of the target cell population and GraphPad Prism software was used to plot concentration vs. maximum fluorescence signal of each antibody in different cell types.

[1022] In CT26-B7H3 overexpressing cells, EC50 of the hybridoma antibody Hy58C11-2 was 0.1 μg / mL, with a maximum relative fluorescence signal of 34020, whereas the control antibody Ref1 (enoblituzuma) did not show significant binding, with a maximum relative fluorescence signal of 240. Therefore, the hybridoma antibody Hy58C11-2 has superior affinity (results shown in Figure 2 and Table 2) . In the human lung cancer cell line Calu-6, EC50 of the hybridoma antibody Hy58C11-2 was 0.05 μg / mL, with a maximum relative fluorescence signal of 3235, whereas EC50 of the control antibody Ref1 was 0.7 μg / mL, with a maximum relative fluorescence signal of 1526. Therefore, the affinity of Hy58C11-2 was about 14 times stronger than that of Ref1 (results shown in Figure 3 and Table 3) . hIgG1 is a human IgG1 isotype control antibody used as a B7-H3 negative control (Kyinno Bio KA-2001, batch number 20220527) .

[1023] Table 2

[1024] Table 3

[1025] Example 22. Kinetics of B7-H3 hybridoma antibody binding to B7-H3 antigen

[1026] Bio-layer Interferometry (BLI) utilizes visible light focused onto the surface of a detection probe's thin film and reflected twice at the upper and lower interfaces of the film layer, resulting in so called interference phenomena. Molecular binding or dissociation causes changes in the thickness of the film layer and a spectrometer is used to detect the intensities at different wavelengths of light after interference. The shift value of the interference spectrum represents the change in film layer thickness. This method can measure the binding constant and dissociation constant of antibody, as well as the affinity constant (kon / kdis, i.e., 1 / Kd) . The smaller the Kd value, the greater the antibody's affinity to its target.

[1027] The sample buffer 1×PBS (0.01 M, pH 7.2～7.4) + 0.04%Tween20 + 1 mg / mL BSA was prepared. The antibody was coated as 250 μL per well with an antibody working concentration of 10 μg / mL. An antigen working solution was prepared with a maximum concentration of 200 nM, followed by 2-fold series dilution to 7 concentrations, and added as 250 μL per well. The prepared samples were transferred to a black-bottom 96-well plate. Machine detection and data analysis were performed. The results are shown in Figure 4 and Table 4. The dissociation constant of Hy58C11-2 is comparable to that of the control antibody Ref1, being 2.9×10-4 and 2.3×10-4, respectively. The association constant of Hy58C11-2 is faster than that of the control antibody Ref1, being 4.3×105 and 1.8×105, respectively. The kinetic constant of Hy58C11-2 is about 2 times better than that of the control antibody Ref1, indicating that Hy58C11-2 exhibits stronger binding kinetics due to its stronger binding ability.

[1028] Table 4

[1029] Example 23. Internalization of B7-H3 hybridoma antibody

[1030] A 2× concentrated antibody working solution, i.e., 20 μg / mL, was prepared for analysis. CT26-CD276 cells were digested using EDTA digestion solution without trypsin, collected and counted. The cells were centrifuged and resuspended in FACS buffer with the density adjusted to ～1×106 / mL and added with 50 μL per well. 50 μL of each antibody was added, mixed with cells, incubated at 4℃ for 1 hour, and then washed 3 times with pre-cooled FACS buffer. 100 μL of secondary antibody PE anti-mouse IgG Fc (Biolegend, 405307) was added to the secondary antibody control wells and sample wells, and 100 μL of FACS buffer was added to the blank control wells. The wells were incubated at 4℃ for 40 minutes and washed 3 times with pre-cooled FACS buffer. The non-endocytosed controls were resuspended with 200 μL FACS buffer and placed at 4℃ for testing. For the endocytosis experiment group, the cells were resuspended with 100 μL complete culture medium, incubated in a 37℃ incubator for 0, 0.5, 1 and 2 hours, respectively, and centrifuged. The cells were resuspended with 200 μL Stripping buffer (0.05 M glycine, 0.1 M NaCl, pH 3.0) , incubated at room temperature for 7 minutes, added with 200 μL neutralizing buffer (0.15 M Tris, pH 7.4) to neutralize, and centrifuged at 4℃ for 5 minutes. The cells were resuspended with 200 μL FACS buffer and detected by flow cytometry. 2000 cells per well were collected.

[1031] As shown in Figure 5 and Table 5, the internalization rate of the hybridoma antibody Hy58C11-2 reached 18%at 0.5 hour and 20%at 1 hour, which were significantly faster than that of the control antibody, indicating that Hy58C11-2 has a higher internalization efficiency.

[1032] Table 5

[1033] Example 24. Humanization of B7-H3 hybridoma antibody

[1034] For the mouse antibody anti-Hy58C11-2, the following human germline sequences of the heavy chain and light chain were selected as templates, IGHV1-69 and IGKV1-39, respectively. Homology modeling was performed on the mouse antibody anti-Hy58C11-2 to simulate the structure of the Fab region. After homology modeling calculations, the predicted Fab structure of the 58C11-2 antibody was obtained. Through back-mutation of the humanized antibody, a total of three humanized antibodies were obtained, namely Hu58C11-1722, Hu58C11-1724 and Hu58C11-1726.

[1035] The heavy and light chain sequences of Hu58C11-1722 are SEQ ID NO 9 and SEQ ID NO 10, respectively. The heavy and light chain sequences of Hu58C11-1724 are SEQ ID NO 11 and SEQ ID NO 12, respectively. The heavy and light chain sequences of Hu58C11-1726 are SEQ ID NO 13 and SEQ ID NO 14, respectively.

[1036] The corresponding nucleotides of the heavy and light chains of Hu58C11-1722 are SEQ ID NO 17 and SEQ ID NO 18, respectively. The corresponding nucleotides of the heavy and light chains of Hu58C11-1724 are SEQ ID NO 19 and SEQ ID NO 20, respectively. The corresponding nucleotides of the heavy and light chains of Hu58C11-1726 are SEQ ID NO 21 and SEQ ID NO 22, respectively.

[1037] Example 25. B7-H3 humanized antibody antigen binding assay based on ELISA

[1038] The hybridoma antibody Hy58C11-2 and the humanized antibodies Hu58C11-1722, Hu58C11-1724 and Hu58C11-1726 were evaluated according to the procedure described in Example 20. The results are shown in Figure 6 and Table 6. The humanized antibodies Hu58C11-1722, Hu58C11-1724 and Hu58C11-1726 have comparable affinity as the hybridoma antibody Hy58C11-2, ranging between 0.2～0.3 μg / mL.

[1039] Table 6

[1040] Example 26. B7-H3 humanized antibody binding by FACS

[1041] The hybridoma antibody Hy58C11-2 and humanized antibodies Hu58C11-1722, Hu58C11-1724 and Hu58C11-1726 were evaluated using human glioma cells A172 and human non-small cell lung cancer cells H1568 according to the procedure described in Example 21. The results are shown in Figure 7, Table 7, Figure 8 and Table 8. The affinities of the hybridoma antibody Hy58C11-2 and the control antibody Ref1 were comparable against A172 cells, while the affinities of the humanized antibodies Hu58C11-1722, Hu58C11-1724 and Hu58C11-1726 were 4-5 times higher than that of the control antibody Hy58C11-2. The affinity of the hybridoma antibody Hy58C11-2 was 10 times higher than that of the control antibody Ref1 against H1568 cells, and the affinities of the humanized antibodies Hu58C11-1722, Hu58C11-1724 and Hu58C11-1726 were 20 times higher than that of the control antibody Ref1.

[1042] Table 7

[1043] Table 8

[1044] Example 27. B7-H3 humanized antibody ADCC reporting assay

[1045] NCI-H661, A-172, Jurkat-NFAT-CD16-V158 cells were cultured and centrifuged at 400 g for 5 minutes. The supernatants were removed and the cells were resuspended with 1640 complete culture medium. The hybridoma antibody against B7-H3 and 3 humanized antibodies, as well as positive control antibody Ref1 and negative control hIgG1 were pepared with an initial concentration of 50 μg / mL, followed by 5-fold series dilutions to a total of 9 concentrations. Approximately 4×106 NCI-H661 or A-172 and 4×106 Jurkat-NFAT-CD16a-V158 cells were mixed and resuspended. 80 μL of cells and 20 μL of antibody were added to each well of a white 96-well plate, with two replicates, mixed well, and incubated in an incubator for 6 hours. The fluorescence signals were detected. Data was collected and GraphPad Prism software was used to plot the curve and calculate EC50. The results are shown in Figure 9 and Table 9. Compared to the control antibody Ref1, the hybridoma antibody Hy58C11-2 and the humanized antibodies Hu58C11-1722, Hu58C11-1724 and Hu58C11-1726 have significant ADCC functions, with ADCC signal intensity approximately 10-30 times than that of the control antibody.

[1046] Table 9

[1047] Example 28. B7-H3 humanized antibody CDC assay

[1048] 293T-B7H3 cells were resuscitated, cultured, and resuspended with DMEM medium with cell density adjusted to 5.0×105 / mL. 80 μL of cell suspension was added to each well of a U-bottom 96-well plate. The antibody working solution was prepared at an initial concentration of 200 μg / mL, followed by a 3.16-fold series dilution to 10 concentrations. 10 μL of each antibody solution was added to each well and the wells were incubated for 30 minutes. 10 μL of human AB serum was added to each well, mixed well, and cultured overnight in an incubator. The cells were transferred on ice and centrifuged at low temperature to remove the supernatants. The cells were resuspended with 100 μL of FACS buffer (PBS containing 2%FBS) , added with 2 μL of 7-AAD per well, incubated at room temperature for 10 minutes, and then added with another 100 μL of FACS buffer per well. Flow cytometry was performed and 5000 cells per sample were collected. Flowjo was used to analyze the 7-AAD+ proportion of the target cell population. GraphPad Prism software was used to plot the curve and calculate EC50. The results are shown in Figure 10 and Table 10. Compared to the control antibody Ref2 (ifinatamab, with heavy and light chain amino acid sequences as SEQ ID NO 25 and SEQ ID NO 26, respectively) , the maximum cell death rate of the humanized antibody Hu58C11-1722 is approximately 60%, with EC50 of 0.2 μg / mL, whereas EC50 of the control antibody Ref2 is 0.4 μg / mL. The CDC capability of Hu58C11-1722 is about twice of that of the control antibody.

[1049] Table 10

[1050] Example 29. B7-H3 humanized antibody internalization assay

[1051] The assay was carried out according to the procedure described in Example 23 and the results are as shown in Figure 11 and Table 11. The humanized antibody Hu58C11-1722 has internalization rates of 17%at 0.5 hour, 20%at 1 hour and 19%at 2 hours. These rates are higher than those of the control antibody Ref2 (antibody of DS-7300) with 8%, 14%, and 12%at corresponding times, indicating that the humanized antibody Hu58C11-1722 has higher internalization efficiency.

[1052] Table 11

[1053] Example 30. Non-specific binding of B7-H3 humanized antibody on non-target cells

[1054] Jurkat cells were revived, cultured, passaged twice and collected. The cells were resuspended in FACS buffer (containing 2%FBS) and cell density was adjusted to approximately 2.0×105 / mL. 50 μL of cell suspension was added to each well of a U-bottom 96-well plate. The antibody solution was prepared with an initial concentration at 200 μg / mL, followed by a 10-fold series dilution to 4 concentrations. 50 μL of the antibody solution was added to each well of the plate. The cells were mixed thoroughly and incubated at 4℃ for 1 hour. The cells were washed with 400 μL FACS buffer three times, added with secondary antibody PE anti-human IgG Fc at a 1: 100 ratio, and incubated at 4℃ for 1 hour. The cells were washed with 400 μL FACS buffer three times and resuspended in 200 μL FACS buffer. Flow cytometry was performed, 2000 cells per well were collected, and the intensity of the PE signal was analyzed. The results are shown in Figure 12. The humanized antibodies Hu58C11-1722, Hu58C11-1724 and Hu58C11-1726 have no binding on non-target cells, even at a high concentration of 100 μg / mL, with a maximum fluorescence intensity of less than 20, comparable to the non-targeting antibody binding, indicating that three humanized antibodies have low non-specific binding capacity.

[1055] Example 31. B7-H3 humanized antibody binding kinetics assay

[1056] The assay was carried out according to the procedure described in Example 22. The results are shown in Figure 13 and Table 12. kons of the humanized antibodies Hu58C11-1722, Hu58C11-1724 and Hu58C11-1726 are equivalent, approximately 2 times faster than that of the control antibody Ref1. The dissociation constants of the humanized antibodies and the control antibody are <1.0×10-7, <1.0×10-7, 1.4×10-4 and 3.5×10-4 1 / s, respectively, indicating that the humanized antibodies Hu58C11-1722 and Hu58C11-1724 are slower to dissociate compared to the control antibody. Therefore, the humanized antibodies Hu58C11-1722 and Hu58C11-1724 exhibit stronger binding affinity, with binding constants below 1.0×10-12 M, superior to the control antibody Ref1.

[1057] Table 12

[1058] Example 32. Preparation of antibody-drug conjugates

[1059] Method 1

[1060] 2 mg of antibody was diluted with pH 7.4 PBS buffer to 4 mg / mL to a total volume of 500 μL, to which were added 5 μL of 500 mM EDTA (to a final concentration of EDTA as 5 mM) and an appropriate amount of 10 mM TCEP solution as indicated in Table 13. The mixture was incubated at 37℃ for 1 hour while shaking. An appropriate amount of 20 mM DMSO solution of a linker-payload compound as shown in Table 13 was added to the above solution, and the mixture was incubated at 25℃ for a period of time as shown in Table 13 while shaking. The mixture was replaced with pH 7.4 PBS buffer using an ultra centrifugal filter unit with 50 kDa molecular weight cutoff and sterilized by filtration through a 0.22-μm membrane filter to afford the target ADC.

[1061] Method 2

[1062] The antibody was replaced with pH 8.0 PBS buffer using a 50-KDa ultra centrifugal filter unit. 2 mg of antibody was diluted with pH 8.0 PBS buffer to 4 mg / mL to a total volume of 500 μL, to which were added 5 μL of 500 mM EDTA (to a final EDTA concentration as 5 mM) and an appropriate amount of 10 mM TCEP solution as indicated in Table 13. The mixture was incubated at 37℃ for 1 hour while shaking. An appropriate amount of 20 mM DMSO solution of a linker-payload compound was added to the above solution as shown in Table 13 and the reaction mixture was incubated at 25℃for a period of time as shown in Table 13 while shaking. The mixture was replaced with pH 7.4 PBS buffer using a 50-KDa ultra centrifugal filter unit and sterilized by filtration through a 0.22-μm membrane filter to afford the target ADC.

[1063] Method 3

[1064] The antibody was replaced with pH 8.0 PBS buffer using a 50-KDa ultra centrifugal filter unit. 2 mg of antibody was diluted with pH 8.0 PBS buffer to 4 mg / mL to a total volume of 500 μL, to which were added 100 μL of 1 M ammonium citrate at pH 8.0 (to a final concentration of ammonium citrate as 0.2 M) , 5 μL of 500 mM EDTA (to a final concentration of EDTA as 5 mM) and an appropriate amount of 10 mM TCEP solution as shown in Table 13. The mixture was incubated at 37℃ for 1 hour while shaking. An appropriate amount of 20 mM DMSO solution of a linker-payload compound was added to the above solution as shown in Table 13 and the reaction mixture was incubated at 25℃ for a period of time as shown in Table 13 while shaking. The mixture was replaced with pH 7.4 PBS buffer using a 50-KDa ultra centrifugal filter unit and sterilized by filtration through a 0.22-μm membrane filter to afford the target ADC.

[1065] According to the methods described above, the following ADCs were prepared as shown in Table A. The average DAR values were determined by mass spectrometry and the purities were determined by SEC-HPLC. The results are shown in Tables A and 13.

[1066] Table A

[1067] Table 13

[1068] *Referring to US10195288 for the synthetic procedure.

[1069] Size exclusion chromatography (SEC-HPLC) for ADC purity determination

[1070] Instrument: Agilent 1290 Infinity Ⅱ UPLC

[1071] Chromatography column: MabPacTM SEC-1, 5 μm, 4 × 150 mm (Thermo Scientific)

[1072] Detector: UV detection at the wavelength of 280 nm

[1073] Mobile phase: 50 mM Na2HPO4, 300 mM NaCl, pH 6.8

[1074] Elution: isocratic elution for 16 min at a flow rate of 0.2 mL / min

[1075] Sample loading: 20 μg

[1076] Mass spectrometry for DAR determination

[1077] Sample preparation: to a 20 μg of ADC sample were added DTT to a final concentration of 5 mM and 0.5 μg of PNGase F. The mixture was incubated at 37℃ for 1 hour for deglycosylation.

[1078] The molecular weight and DAR value of ADC were analysized by LC-MS as follows:

[1079] Instrument: Vanquish LC systems (Thermo Scientific)

[1080] Chromatographic column: 2.1 × 50 mm MABPac RP column with 4 μm particles (Thermo Scientific)

[1081] Mobile phase A: 0.1%formic acid aqueous solution

[1082] Mobile phase B: acetonitrile containing 0.1%formic acid

[1083] Column temperature: 80℃

[1084] Elution gradient: from 90%to 10%of mobile phase A in 16 min at a flow rate of 0.3 mL / min

[1085] Mass spectrometer: Q Exactive Plus Orbitrap Mass Spectrometers (Thermo Scientific)

[1086] Mass spectrometry parameters: Sheath gas flow rate: 30 units, Aux gas flow rate: 15 units, Spray voltage: 3.80 kV, Capillary temp: 320℃, Aux gas heater temp: 200℃, Mass range: 600-2600 m / z

[1087] The drug-antibody ratio (DAR value) of ADC was calculated based on the number of payloads conjugated to the light and heavy chains of the antibody and the proportion of each component.

[1088] Biological experiment

[1089] Example 33. Determination of cell proliferation inhibitory activity

[1090] NCI-H1155 (human non-small cell lung cancer cell line) , OVCAR-3 (human ovarian cancer cell line) , Calu-6 (human lung cancer cell line) , NCI-N87 (human gastric cancer cell line) or SK-BR-3 (human breast cancer cell line) cells, which were cultured for about a week, were plated in flat-bottom 96-well plates, with 2000 cells per well in a total volume of 90 μL, and cultured overnight at 37℃ in a 5%CO2 incubator. After the cells adhered, the compound was diluted in a 5-fold series dilution with the complete culture medium to a total of 10 concentrations (the starting concentration of ADC and small molecule toxin were 1000 nM each) . 10 μL of the compound was added to the above 96-well plates (two replicates per concentration) and incubated at 37℃ in a 5%CO2 incubator for 144 hours. 50 μL of CTG ( Luminescent Cell Viability Assay Kit) was added to each well which was then shaken at room temperature for 10 minutes, The luminescence signals (X) were detected using a microplate reader (Envision, PerkinElmer) . The wells without compound had the highest signal (High) and the wells added with 10 mL of 1000 nM exatecan had the lowest signal (Low) . The percentage of inhibiton on cell proliferation of the compound was calculated as

[1091] The IC50 value for the compound was obtained by 4-parameter nonlinear fitting analysis (XLfit, IDBS) .

[1092] The sources of tumor cells and culture media are shown in Table 14.

[1093] The IC50 values of the compounds are shown in Tables 15 and 16.

[1094] Table 14

[1095] Table 15

[1096] Note: “ / ” means “not tested” .

[1097] Table 16

[1098] In vivo efficacy studies

[1099] Example 34. In vivo antitumor efficacy study using NCI-H1155 non-small cell lung cancer xenograft mouse model

[1100] 6–8-week-old female BALB / c nude mice were purchased from Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. NCI-H1155 cells (purchased from Nanjing Cobioer Biosciences Co., Ltd. ) were cultured in ATCC modified 1640 medium (ATCC, catalog number A10491-01) supplemented with 10%FBS (ExCell Bio, catalog number FSP500) at 37℃ in a 5%CO2 incubator. When the cells were harvested, they were washed twice in pre-cooled PBS and subjected to cell counting. The cell pellet was then resuspended on ice in pre-cooled PBS mixed with an equal volume of Matrigel (Corning, catalog number 354234) to a final concentration to 2.5×107 cells / mL.

[1101] Tumors were induced by inoculating 200 μL of cell suspension (containing 5×106 NCI-H1155 cells) into the subcutaneous tissue on the right anterior back of female BALB / c nude mice. DS-7300 was diluted with PBS to 0.3 mg / mL, and ADC1, ADC3 and ADC17 were diluted with PBS to 0.15 mg / mL. When the average tumor volume reached 100～200 mm3, the animals in good health were randomly grouped based on tumor volume and weight (8 per group) and were injected via tail vein with 3 mg / kg DS-7300, vehicle (PBS) , and 1.5 mg / kg of each ADC1, ADC3 and ADC17, respectively. At the end of the study, the effects on tumor growth were evaluated by calculating the tumor growth inhibition rates (TGI) . Drug tolerances were assessed through clinical symptoms, such as body weight loss, mortality rate, and treatment-related side effects. One-way ANOVA and Dunnett’s test were used to analyze the differences between the vehicle control group and all treatment groups. P < 0.05 was considered to be significantly different.

[1102] The results showed that 3 mg / kg of DS-7300 did not significantly inhibit tumor growth, whereas 1.5 mg / kg of ADC1, ADC3 and ADC17 significantly inhibited tumor growth with TGI values of 51%, 88%, and 60%, respectively (compared to the vehicle control group, P values were < 0.05, < 0.001, and < 0.05, respectively) . Additionally, the mice in each dosing group exhibited good tolerance with no significant body weight loss during the study period (Figures 14 and 15) .

[1103] Example 35

[1104] In vivo antitumor efficacies of ADC3, ADC6, ADC17 and ADC20 in the NCI-H1155 non-small cell lung cancer xenograft mouse model were evaluated according to the method of Example 34. ADC3, ADC6, ADC17 and ADC20 were diluted with PBS to 0.15 mg / mL. The vehicle (PBS) , 1.5 mg / kg of each ADC3, ADC6, ADC17 and ADC20 were injected via the tail vein. The results showed that ADC3, ADC6, ADC17 and ADC20 significantly inhibited tumor growth, with TGI values of 68%, 63%, 69%, and 65%, respectively (compared with the vehicle control group, P values were < 0.01, < 0.001, <0.001, and < 0.001, respectively) . The mice in each dosing group exhibited good tolerance with no significant body weight loss during the study period (Figures 16-17) .

[1105] Example 36

[1106] In vivo antitumor efficacies of ADC7, ADC9, ADC22 and ADC24 in the NCI-H1155 non-small cell lung cancer xenograft mouse model were evaluated according to the method of Example 34. ADC7, ADC9, ADC22 and ADC24 were diluted with PBS to 0.1 mg / mL. The vehicle (PBS) , 1 mg / kg of each ADC7, ADC9, ADC22 and ADC24 were injected via the tail vein. The results showed that ADC7, ADC9, ADC22 and ADC24 significantly inhibited tumor growth, with TGI values of 51%, 69%, 93%, and 100%, respectively (compared to the vehicle control group, P values were < 0.05, < 0.01, < 0.0001, and < 0.0001, respectively) . The mice in each dosing group showed good tolerance with no significant body weight loss during the study (Figures 18 and 19) .

[1107] Example 37

[1108] 6–8-week-old female B-NDG nude mice were purchased from Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. OVCAR3 cells (purchased from Procell) were cultured in RPMI1640 medium (Gibco, catalog number 11875093) supplemented with 10%FBS (ExCell Bio, catalog number FSP500) and 1%insulin (Gibco, catalog number 41400045) at 37℃ in a 5%CO2 incubator. When cells were harvested, they were washed twice in pre-cooled PBS and counted. The cell pellet was then resuspended on ice in pre-cooled PBS with an equal volume of Matrigel (Corning, catalog number 354234) to a final concentration to 5×107 cells / mL.

[1109] Tumors were induced by inoculating 200 μL of cell suspension (containing 1×107 OVCAR3 cells) into the subcutaneous tissue on the right anterior back of female B-NDG nude mice. DS-7300 was diluted with PBS to 0.3 mg / mL, and ADC1, ADC3 and ADC17 were diluted with PBS to 0.15 mg / mL. When the average tumor volume reached 100～200 mm3, the animals in good health were randomly grouped based on tumor volume and weight (8 per group) and were administered via tail vein injection with vehicle (PBS) , 3 mg / kg DS-7300, 1 mg / kg of each ADC1, ADC3 and ADC17, respectively. At the end of the study, the effects on tumor growth were evaluated by calculating the tumor growth inhibition rates (TGI) . Drug tolerances were assessed through clinical symptoms, such as body weight loss, mortality rate, and treatment-related side effects. One-way ANOVA and Dunnett’s test were used to analyze the differences between the vehicle control group and all treatment groups. P < 0.05 was considered to be significantly different.

[1110] The results showed that a single tail vein injection of 3 mg / kg of DS-7300 showed no significant inhibitory effect on tumor growth, with a TGI of 13%. A single tail vein injections of 1.5 mg / kg of each ADC1, ADC3 and ADC17 significantly inhibited tumor growth, with TGI values of 38%, 56%, and 46%, respectively (compared to the vehicle control group, P values were < 0.05, < 0.01, and <0.01, respectively) . Moreover, mice in all dosing groups exhibited good tolerance with no significant body weight loss during the study period (Figures 20 and 21) .

[1111] Example 38

[1112] 6–8-week-old female BALB / c nude mice were purchased from Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. Calu-6 tumor cells (purchased from Nanjing Cobioer Biosciences Co., Ltd. ) were cultured in MEM medium (Gibco, catalog number 12492013) supplemented with 10%FBS (ExCell Bio, catalog number FSP500) at 37℃ in a 5%CO2 incubator. When cells were harvested, they were washed twice in pre-cooled PBS and counted. The cell pellet was then resuspended on ice in pre-cooled PBS with an equal volume of Matrigel (Corning, catalog number 354234) to a final concentration to 2.5 × 107 cells / mL.

[1113] Tumors were induced by inoculating 200 μL of cell suspension (containing 5×106 Calu-6 cells) into the subcutaneous tissue on the right anterior back of female BALB / c nude mice. ADC1, ADC4, ADC16 and ADC17 were diluted with PBS to 0.15 mg / mL. When the average tumor volume reached 100～200 mm3, the animals in good health were randomly grouped based on tumor volume and weight (8 per group) . The vehicle (PBS) and 1.5 mg / kg of each ADC1, ADC4, ADC16 and ADC17 were injected into the tail vein biweekly for a total of two doses. At the end of the study, the effects on tumor growth were evaluated by calculating the tumor growth inhibition rates (TGI) . Drug tolerances were assessed through clinical symptoms, such as body weight loss, mortality rate, and treatment-related side effects. One-way ANOVA and Dunnett’s test were used to analyze the differences between the vehicle control group and all treatment groups. P < 0.05 was considered to be a significant difference.

[1114] The results showed that tail vein injection of 1.5 mg / kg of each ADC1, ADC4, ADC16 and ADC17 administered biweekly for a total of two doses effectively inhibited tumor growth, with TGI values of 42%, 52%, 29%, and 60%, respectively (compared to the vehicle control group, P values were < 0.05, < 0.01, n. s., and < 0.01, respectively) . Except for ADC16, the other three ADCs significantly inhibited tumor growth. All dosing groups of mice exhibited good tolerance with no significant body weight loss during the study period (Figures 22 and 23) .

[1115] Sequence information used in this application

[1116] The foregoing description of specific exemplary embodiments of the present invention is for purposes of illustration and exemplification. These descriptions are not intended to limit the invention to the precise forms disclosed, and it is evident that many modifications and variations can be made in light of the above teachings. The purpose of selecting and describing exemplary embodiments is to explain the specific principles of the invention and its practical applications, thereby enabling those skilled in the art to implement and utilize various exemplary embodiments of the invention as well as various choices and modifications. The scope of the invention is intended to be defined by the claims and their equivalents.

Claims

A compound of Formula I:wherein,X is N or CRX;Y is absent or NRY;E1 and E2 are each independently bond or C1-8 alkylene;A is -C (=O) -or -NRn-;C is a group that can be conjugated with an antibody or peptide;W is a hydrophilic group;P is a peptide containing 1 to 8 amino acids;R is a group that can be connected to a functional group of a biologically active molecule or its fragment, or a leaving group after coupling to a substituent of a biologically active molecule or its fragment;M is absent or a self-immolative group;Rn is hydrogen or C1-8 alkyl; andRX and RY are each independently hydrogen or C1-8 alkyl.A compound according to Claim 1, wherein X is N, Y is absent, or X is CRX, Y is NRY; RX and RY are each independently hydrogen or C1-8 alkyl; preferably X is N, Y is absent, or X is CH, Y is NH or N (CH3) .A compound according to Claim 1 or 2, wherein E1 and E2 are C1-6 alkylene, preferably methylene optionally substituted with methyl.A compound according to any one of Claims 1-3, whereinispreferablyPreferably, a compound of Formula I has a structure as shown in Formula IA:wherein C, Y, X, W, E1, E2, P, M and R are as described in Formula I.A compound according to any one of Claims 1-4, wherein when A is -C (=O) -, W isor -NRW4RW5 ; when A is -NRn-, W isRW1 is hydrogen, C1-8 alkyl or a polyhydroxyl group, preferably hydrogen or methyl;RW2 is hydrogen or C1-8 alkyl, preferably methyl;RW3 is hydroxyl or -NRaRb;RW4 and RW5 are each independently hydrogen, C1-8 alkyl or a polyhydroxyl group;m3 and m4 are each independently an integer from 6 to 30;Ra and Rb are each independently hydrogen or C1-8 alkyl, preferably hydrogen or methyl.A compound according to Claim 5, wherein the polyhydroxyl group isnw is an integer from 0 to 8.A compound according to Claim 5, wherein when A is -C (=O) -, W iswhen A is -NRn-, W isA compound according to any one of Claims 1-7, wherein C isG is halogen, formyl, acetylenyl, ethylenyl, allenyl, azido, isocyanato, -C1-8 alkyl-RG3, -O-NH2, Ar is aryl;indicates single or double bond;RG1 is hydrogen or nitro;RG2 is hydrogen or C1-8 alkyl;RG3 is halogen;RG41 and RG42 are each independently selected from hydrogen, halogen or -S-phenyl, where the phenyl is optionally substituted with one or more substituents selected from cyano, halogen, C1-8 alkyl, C1-8 alkoxyl, ester or amide; and RG41 and RG42 can not be hydrogen at the same time;RG51, RG52 and RG53 are each independently selected from hydrogen, halogen, nitro, cyano, thiocyano, C1-8 alkyl, C2-8 alkenyl, C2-8 alkynyl, C6-10 aryl, 4-to 10-membered heteroaryl, C3-9 cycloalkyl, 3-to 9-membered heterocyclyl, - (OCH2CH2) pOCH3, -ORG54, -SRG54, -N (RG54) 2, -C (=O) RG54, -C (=O) ORG54, -C (=O) N (RG54) 2, -C (=S) ORG54, -C (=S) N (RG54) 2, -C (=S) SRG54, -NRG54 (C=O) RG54, -NRG54 (C=S) N (RG54) 2, -O (C=O) N (RG54) 2, -S (=O) 2RG54 or -S (=O) 2ORG54;Each RG54 is independently selected from hydrogen, C1-8 alkyl, C2-8 alkenyl or C2-8 alkynyl;p is an integer from 1 to 6;LG is Q1, LG1 or -LG2-Q2-LG3-;Q1 and Q2 are each independently selected from NRG6, O, S, (CH2) m, (CHRG6) m, (CH2CH2O) m, C (O) NRG6, NRG6C (O) , C6-10 aryl, 4-to 10-membered heteroaryl, C3-9 cycloalkyl or 3-to 9-membered heterocyclyl;LG1, LG2 and LG3 are each independently selected from absent, - (CH2) m-, - (CHRG6) m-, - (CH2CH2O) m-, - (CH2CH2O) m- (CH2) m-or - (CH2) m (CH2CH2O) m-;RG6 is hydrogen, C1-8 alkyl, C3-9 cycloalkyl, C6-10 aryl or 4-to 10-membered heteroaryl;Each m is independently 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10;Preferably, LG is -O- (CH2) m-, C6-10 aryl, - (CH2) m-C6-10 aryl-, -C6-10 aryl- (CH2) m-, C3-9 cycloalkyl, - (CH2) m- (C3-9 cycloalkyl) -, - (C3-9 cycloalkyl) - (CH2) m-, - (CH2) m- (3-to 9-membered heterocyclyl) -, - (3-to 9-membered heterocyclyl) - (CH2) m-, - (CH2) mC (O) NRG6 (CH2) m-, - (CH2CH2O) m-, - (CH2CH2O) m-CH2-, - (CH2CH2O) m-CH2CH2-, - (CH2) mC (O) NRG6 (CH2CH2O) m-, - (CH2) mC (O) NRG6 (CH2CH2O) m-CH2-, - (CH2) mC (O) NRG6 (CH2CH2O) m-CH2CH2-, - (CH2CH2O) mC (O) NRG6 (CH2CH2O) m-, - (CH2CH2O) mC (O) NRG6 (CH2CH2O) m-CH2-, - (CH2CH2O) mC (O) NRG6 (CH2CH2O) m-CH2CH2-or - (CH2CH2O) mC (O) NRG6 (CH2) m-.A compound according to Claim 8, wherein C isRC1 is hydrogen or C1-8 alkyl; RC2 is halogen; n1, n2, n3, n4 and n5 are each independently 0, 1, 2, 3, 4 or 5;Preferably, C isA compound according to any one of Claims 1-9, wherein M is *L1-LM1-LM2-LM3-LM4-LM5-**L1; LM1, LM2, LM3, LM4 and LM5 are each independently selected from absent, -NH-, methylene, phenylene, -O-or acyl; *L1 indicates connection to P and **L1 indicates connection to R;Preferably, M is absent, wherein *L1 indicates connection to P and **L1 indicates connection to R.A compound according to any one of Claims 1-10, wherein the amino acid is selected from phenylalanine (Phe) , glycine (Gly) , valine (Val) , alanine (Ala) , leucine (Leu) , lysine (Lys) , citrulline (Cit) , arginine (Arg) or asparagine (Asn) , and the side chains of the amino acids are optionally substituted with alkyl or a hydrophilic group;Preferably, P is dipeptide, tripeptide or tetrapeptide;Preferably, P is dipeptide selected from *L2-Phe-Lys-**L2, *L2-Val-Ala-**L2, *L2-Val-Lys-**L2, *L2-Ala-Lys-**L2, *L2-Val-Cit-**L2, *L2-Phe-Cit-**L2, *L2-Leu-Cit-**L2, *L2-Phe-Arg-**L2 or *L2-Gly-Val-**L2;Preferably, P is tripeptide selected from *L2-Glu-Val-Ala-**L2, *L2-Glu-Val-Cit-**L2, *L2-Ala-Ala-Ala-**L2, *L2-Ala-Ala-Asn-**L2 orPreferably, P is tetrapeptide selected from *L2-Gly-Gly-Phe-Gly-**L2, *L2-Gly-Gly-Val-Ala-**L2 or *L2-Gly-Phe-Gly-Gly-**L2, more preferably *L2-Gly-Gly-Phe-Gly-**L2;where *L2 indicates connection toand **L2 indicates connection to M;Preferably, P iswhere *L2 indicates connection toand **L2 indicates connection to M.A compound according to any one of Claims 1-11, wherein R is a group that can be conjugated to amino, hydroxyl or carboxyl, or a leaving group after coupling with amino, hydroxyl or carboxyl;Preferably, R is halogen, hydroxy, acetoxy orA compound according to Claim 1, wherein the compound is selected from the followings:wherein R is a group that can be connected to a functional group of a biologically active molecule or its fragment, or a leaving group after coupling with a substituent of a biologically active molecule or its fragment; preferably R is a group that can be conjugated to amino, hydroxyl or carboxyl, or a leaving group after conjugating to amino, hydroxyl or carboxyl; preferably R is halogen, hydroxy, acetoxy orThe use of compounds according to any one of Claims 1-13 for the preparation of linker-drug conjugates, polypeptide-drug conjugates or antibody-drug conjugates.Linker-drug conjugate comprising a biologically active molecule or its fragment and a linker, wherein the linker is a compound according to any one of Claims 1-13.Antibody-drug conjugate comprising a biologically active molecule or its fragment, a linker and an antibody or its antigen-binding fragment, wherein the linker is a compound according to any one of Claims 1-13;Preferably, an antibody-drug conjugate thereof has a structure as shown in Formula II:wherein,X, Y, W, P, M, E1, E2 and A are as described in any one of Claims 1-13;C′ is a linker for conjugating to an antibody or its antigen-binding fragment;Ab is an antibody or its antigen-binding fragment;nLD = 1-8 and is an average number of linker-drug conjugates per antibody (DAR) ;D is a biologically active molecule or its fragment;Preferably, C′ iswhereindicates connection to an antibody or its antigen-binding fragment andindicateds connection to Y.An antibody-drug conjugate according to Claim 16, wherein D is a topoisomerase I inhibitor or microtubule inhibitor;Preferably, the topoisomerase I inhibitor is a camptothecin derivative;Preferably, the microtubule inhibitor is MMAE or its derivative.An antibody-drug conjugate according to Claim 16, wherein D has a structure as shown in Formula IIA:wherein,YD1 is NRD1, O, S or (CH2) nD1;RD1 is hydrogen or C1-8 alkyl;nD1 is 0, 1 or 2;XD1 and XD2 are each independently hydrogen, halogen, cyano, hydroxy, nitro, -NRe1Re2, C1-8 alkyl or -O-C1-8 alkyl; or XD1, XD2 and the ring atoms to which they are attached to form C4-9 cycloalkyl or 4-to 9-membered heterocyclyl;LD3 is -NRf_M, -C1-8 alkylene-O-M or -NRf-C (O) -C1-8 alkylene-O-M, where the alkylene is optionally substituted with alkyl, cycloalkyl or fluorinated alkyl, where -M indicates connection to M of antibody-drug conjugate as shown in Formula II;Re1, Re2 and Rf are each independently hydrogen or C1-8 alkyl;Preferably, LD3 is -NH-M or -NH-C (O) -CH2-O-M.An antibody-drug conjugate according to Claim 16, wherein D has a structure as shown in Formula IIB:wherein,YD1 is NRD1, O, S or (CH2) nD1;RD1 is hydrogen or C1-8 alkyl;nD1 is 0, 1 or 2;LD4 is -NRh_M, -C1-6 alkylene- (OC2-6 alkylene) nD2-YD2_M, - (OC2-6 alkylene) nD2-YD2_M or -NRc-C (O) -C1-8 alkylene-O-M, where YD2 is O or NRc, nD2 is an integer from 0 to 8; -M indicates connection to M of an antibody-drug conjugate as shown in Formula II;XD4 is hydrogen, halogen, cyano, hydroxyl, nitro, -NRg1Rg2, C1-8 alkyl or -O-C1-8 alkyl;RD3 is hydrogen or optionally substituted C1-8 alkyl;Rg1, Rg2 and Rh are each independently hydrogen or C1-8 alkyl;Preferably, LD4 is -NH-M or -CH2-O-M.An antibody-drug conjugates according to Claim 16, wherein D isThe following antibody-drug conjugates:wherein Ab is an antibody or its antigen-binding fragment; preferably, the antibody or its antigen-binding fragment is an anti-B7-H3 antibody or its antigen-binding fragment, or an anti-Her2 antibody or its antigen-binding fragment; preferably, the anti-B7-H3 antibody or its antigen-binding fragment comprises a heavy chain variable region and a light chain variable region, where the heavy chain variable region contains HCDR1 as shown in SEQ ID NO 1, HCDR2 as shown in SEQ ID NO 2 or HCDR3 as shown in SEQ ID NO 3; the light chain variable region contains LCDR1 as shown in SEQ ID NO 4, LCDR2 as shown in SEQ ID NO 5, or LCDR3 as shown in SEQ ID NO 6.The use of an antibody-drug conjugate according to any one of Claims 16-21 for the preparation of medicines for treating cancer.A linker-drug conjugate according to Claim 15, having a structure as shown in Formula III:wherein,C, Y, X, A, W, P, M, E1 and E2 are as described in any one of Claims 1-13;D is a biologically active molecule or its fragment; preferably, D is as described in any one of Claims 17-20; preferably, a linker-drug conjugate is selected from followings:The following compounds:A pharmaceutical composition, comprising a compound according to any one of Claims 1-13, a linker-drug conjugate according to Claim 15, an antibody-drug conjugate according to any one of Claims 16-21, or a compound according to Claim 24, and optionally a pharmaceutically acceptable carrier.An anti-B7-H3 antibody or its antigen-binding fragment, comprising a heavy chain variable region and a light chain variable region, where the heavy chain variable region comprises HCDR1 having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO 1 or any variant thereof, HCDR2 having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO 2 or any variant thereof, or HCDR3 having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO 3 or any variant thereof; the light chain variable region comprises LCDR1 having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO 4 or any variant thereof, LCDR2 having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO 5 or any variant thereof, or LCDR3 having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO 6 or any variant thereof.An anti-B7-H3 antibody or its antigen-binding fragment according to Claim 26, comprising a heavy chain variable region and a light chain variable region, where the heavy chain variable region comprises HCDR1 as shown in SEQ ID NO 1, HCDR2 as shown in SEQ ID NO 2 or HCDR3 as shown in SEQ ID NO 3; the light chain variable region comprises LCDR1 as shown in SEQ ID NO 4, LCDR2 as shown in SEQ ID NO 5 or LCDR3 as shown in SEQ ID NO 6.An anti-B7-H3 antibody or its antigen-binding fragment according to Claim 26, comprising a heavy chain and a light chain, where the heavy chain is selected from SEQ ID NO 7, SEQ ID NO 9, SEQ ID NO 11, SEQ ID NO 13, or a heavy chain with at least 80%, 85%, 90%, 95%or 99%sequence similarity; the light chain is selected from SEQ ID NO 8, SEQ ID NO 10, SEQ ID NO 12, SEQ ID NO 14, or a light chain with at least 80%, 85%, 90%, 95%or 99%sequence similarity.An anti-B7-H3 antibody or its antigen-binding fragment according to Claim 26, comprising(1) A heavy chain as shown in SEQ ID NO 7 and a light chain as shown in SEQ ID NO 8;(2) A heavy chain as shown in SEQ ID NO 9 and a light chain as shown in SEQ ID NO 10;(3) A heavy chain as shown in SEQ ID NO 11 and a light chain as shown in SEQ ID NO 12; or(4) A heavy chain as shown in SEQ ID NO 13 and a light chain as shown in SEQ ID NO 14.An antibody or its antigen-binding fragment according to any one of Claims 26-29, is selected from a murine antibody or its antigen-binding fragment, a chimeric antibody or its antigen-binding fragment, a human antibody or its antigen-binding fragment, or a humanized antibody or its antigen-binding fragment.A polynucleotide encoding anti-B7-H3 antibody or its antigen-binding fragment according to any one of Claims 26-30.A pharmaceutical composition comprises an anti-B7-H3 antibody or its antigen-binding fragment according to any one of Claims 26-30, and a pharmaceutically acceptable carrier.

Images