Method for detecting DNA methylation

Abstract

The present invention provides a method for detecting DNA methylation, comprising reacting a DNA of a gene with a metal cluster modified with a molecule having a function for binding DNA, amplifying signals of methylated bases in the DNA by surface-enhanced Raman scattering (SERS) spectroscopy, and detecting the DNA methylation based on the SERS spectrum.

Description

METHOD FOR DETECTING DNA METHYLATIONFIELD OF THE INVENTION

[0001] The present invention relates to a method for detecting DNA methylation characterized by using a metal cluster modified with a molecule having a function for binding DNA to label bases of a DNA of a gene, amplifying signals of methylated bases in the DNA by surface-enhanced Raman scattering (SERS) spectroscopy, and detecting the DNA methylation based on the SERS spectrum. DESCRIPTION OF PRIOR ART

[0002] Cancer is a disease caused by irreversible gene mutations that cannot be repaired by the body. In healthy people, gene mutations occur regularly because of physical, chemical, or biological damage, but such mutations can be rapidly fixed. For example, DNA methylation is an epigenetic mechanism used by cells to downregulate various types of gene expression. However, the irreversible hypermethylation of tumor suppressor genes (TSGs) at their CpG islands can suppress their expression; this process ultimately results in uncontrollable cancer cell growth, forming a solid tumor. Multiple types of cancer can result from nonfunctional TSGs, such as methylated RASSF1A, DAPK1, and p16INK4a. To identify this, various DNA methylome detection techniques can be used, such as real-time reverse transcription quantitative polymerase chain reaction, bisulfite sequencing, methylation quantitative trait locus, colon secure testing, methylation-specific enzyme-linked oligonucleotide assay, methylation-specific PCR, and whole-genome bisulfite sequencing. However, these methods are expensive because they are time-consuming, must be performed by professionals, and require complicated data analysis.

[0003] Surface-enhanced Raman scattering (SERS) is an innovative analytical approach with unparalleled sensitivity and precision for detecting and characterizing target molecules and obtaining their detailed molecular profiles. In SERS, a liquid analyte is typically deposited on a surface with a metallic nanopattern or nanocoating designed to enhance the Raman signal. This signal enhancement occurs through both chemical mechanisms (CMs) and electromagnetic mechanisms (EMs) . ACM comprises chemical interactions or charge transfer resonance between the electronic states of the analyte and the surface molecules or metals and can enhance signals by a factor of 10 to 100. Raman signal gain from the EM effect is much greater than the CM effect and is attributable to surface plasmon resonance (SPR) and localized SPR (LSPR) on the surface's metallic nanostructure. LSPR is most prominent for noble metal nanostructures (copper, silver, or gold) ; Raman signals can be greatly amplified by factors of 108 to 1014 on these surfaces. Current theory posits that the well-defined nanostructures of these metals provide a concentrated electric field, termed a “hotspot, ” between nanoparticles (NPs) . If an analyte is located on this hotspot, the EM effect between the molecules and metal surfaces can cause enhancements to soar as high as 1014, enabling detection at the single-molecule level. In previous reports, SERS techniques have been applied to detect DNA.

[0004] Developing novel ultrasensitive, rapid, easy, and cost-efficient approaches to evaluate the methylation status of TSGs could greatly improve early cancer detection, but such development remains challenging.DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

[0005] Rapid and noninvasive liquid biopsies can be used for early rumor diagnosis by identifying the methylation level of the tumor suppressor genes (TSGs) , a reliable index for cancer evaluation. However, identifying trace circulating genes from liquid specimens remains challenging. The present invention introduces a novel method that combines magnetic isolation and surface-enhanced Raman scattering (SERS) to concentrate and detect the methylated TSGs. A superparamagnetic iron oxide nanoparticle modified with streptavidin was prepared as a universal magnetic bead. Biotinterminated probe single-strand DNA (ssDNA) was immobilized on the magnetic beads through biotin-streptavidin bioconjugation. Artificial target ssDNA fragments with various methylation levels were applied as a gene model. Concentrated double-strand DNA (dsDNA) was produced by a hybridizing probe and target ssDNA on magnetic nanobeads, as well as an additional magnetic isolation process. The hybridization efficiency of probe and target ssDNA on magnetic nanobeads is 95.1%. The well-prepared DNA adduct, which consists of 3-nm cisplatin-modified Ag nanoclusters, could specifically bind with guanine-cytosine base pairs of dsDNA. Ag nanoparticle-induced SERS amplified signals of 5-methylcytosine (5-mC) from the TSGs in Raman spectra, enabling accurate methylation level measurement in mixtures of 0-1 μM methylated DNA, with a detection limit of 0.05 μM for the 5-mC signal. This method shows promise for enabling the methylation level evaluation of various TSGs in early cancer liquid biopsies.

[0006] As used herein, the term “a” or “an” are employed to describe elements and components of the present invention. This is done merely for convenience and to give a general sense of the present invention. This description should be read to include one or at least one and the singular also includes the plural unless it is obvious that it is meant otherwise.

[0007] The present invention provides a method for detecting DNA methylation, comprising: (1) providing a DNA of a gene from a sample ora subject; (2) reacting the DNA of the gene with a metal cluster modified with a molecule having a function for binding DNA to form a target analyte; (3) contacting the target analyte with a substrate having a surface with a nanostructured metal; and (4) irradiating the target analyte on the substrate with an exciting light and detecting an optical signal of the DNA of the gene to detect the DNA methylation based on the optical signal of the DNA.

[0008] As used herein, “DNA methylation” can refer to the presence of a methyl group of the cytosine at a CpG site (cytosine-phosphate-guanine site, i.e., a cytosine followed by a guanine in a 5' to 3' direction of the nucleic acid sequence) . Methylation can also occur at non CpG sites, for example, methylation can occur at a CpA, CpT, or CpC site. DNA methylation can change the activity of the methylated DNA region. For example, when DNA in a promoter region is methylated, transcription of the gene may be repressed. DNA methylation is critical for normal development and abnormality in methylation may disrupt epigenetic regulation. The disruption, e.g., repression, in epigenetic regulation may cause diseases, such as cancer. Promoter methylation in DNA may be indicative of cancer. Therefore, DNA methylation may be utilized for screening for diseases (e.g., cancer) , diagnosing diseases (e.g., cancer type) , monitoring the progression of a disease, and monitoring response to a treatment regimen.

[0009] In one embodiment, the subject is an animal, preferably a mammal, more preferably a human.

[0010] The term “sample” is meant to include any tissue or material derived from the subject. The sample may be a cell-free sample, including a mixture of nucleic acid molecules from the subject. The sample generally comprises a nucleic acid (e.g., DNA or RNA) or a fragment thereof. The term “nucleic acid” may generally refer to DNA, RNA or any hybrid or fragment thereof. The nucleic acid in the sample may be a cell-free nucleic acid. The sample is a biological sample, and the sample may be a liquid sample or a solid sample (e.g., a cell or tissue sample) . The sample can be a bodily fluid, such as blood, plasma, serum, urine, vaginal fluid, fluid from a hydrocele, vaginal flushing fluids, pleural fluid, ascitic fluid, cerebrospinal fluid, saliva, sweat, tears, sputum, or aspiration fluid from different parts of the body, etc. In some embodiments, the DNA is a double-strand DNA.

[0011] In the present invention, the DNA of the gene is isolated from the sample. DNA may be isolated by any means standard in the art, including the use of commercially available kits. Briefly, wherein the DNA of interest is encapsulated in by a cellular membrane the sample must be disrupted and lysed by enzymatic, chemical or mechanical means. The DNA solution may then be cleared of proteins and other contaminants, e.g., by digestion with proteinase K. The genomic DNA is then recovered from the solution. This may be carried out by means of a variety of methods including salting out, organic extraction or binding of the DNA to a solid phase support. In the present invention, magnetic probes are used for binding to the DNA in the sample and magnetic beads are used for isolating the DNA with the magnetic probes.

[0012] Hypermethylation of CpG islands in various loci of DNA is associated with various cancers. It is believed that methylation inactivates the expression of genes, including tumor suppressor genes, cell cycle-related genes, DNA mismatch repair genes, hormone receptors and tissue or cell adhesion molecules. For example, tumor-specific deficiency of expression of the DNA repair genes MLH1 and MGMT and the tumor suppressors, p16, CDKN2 and MTS1, has been directly correlated to hypermethylation. Increased CpG island methylation is thought to result in the inactivation of these genes resulting in increased levels of genetic damage, predisposing cells to later genetic instability which then contributes to rumor progression. In some aspects, the gene comprises tumor suppressor genes. In one embodiment, the tumor suppressor genes comprise RASSF1A, DAPK1, and p16INK4a.

[0013] As used herein, the term “metal cluster” means a moiety containing one or more atoms or ions of one or more metals or metalloids. This definition embraces single atoms or ions and groups of atoms or ions that optionally include ligands or covalently bonded groups. In one embodiment, the metal cluster comprises Ag, Cu, Au, Al, Pd, Pt, Ru, Rh, Os, Ir, or combinations thereof. In the present invention, the metal cluster is a substance which produces a detectable Raman spectrum when illuminated with a radiation of the proper wavelength.

[0014] In the present invention, the molecule having the function for binding DNA is used for binding to bases in the DNA. The base comprises adenine (A) , cytosine (C) , guanine (G) , and thymine (T) . In some aspects, the molecule having the function for binding DNA is used for binding to guanine or cytosine of the DNA, especially guanine-cytosine base pairs of the DNA. In the present invention, the molecule comprises an anti-cancer drug having the function for binding DNA. In one embodiment, the molecule having the function for binding DNA comprises cisplatin, cyclophosphamide, ifosfamide, busulfan, carmustine, lomustine, temozolomide, chlorambucil, melphalan, carboplatin, oxaliplatin, doxorubicin, daunorubicin, epirubicin, mitoxantrone, hoechst 33258, DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindole) , or ethidium bromide.

[0015] The metal cluster modified with the molecule having the function for binding DNA is prepared by any means standard in the art. The purpose of the present invention is to make the molecules having the function for binding DNA connect to the surfaces of the metal clusters. Therefore, these modified metal clusters can provide the optical signal of the bases of the DNA.

[0016] In the present invention, the surface of the nanostructured metal is configured to enhance the optical signal of the DNA of the gene. In one embodiment, the nanostructured metal comprises Ag, Cu, Au, Al, Pd, Pt, Ru, Rh, Os, Ir, or combinations thereof. In a preferred embodiment, the nanostructured metal comprises Ag, Cu, Au, Al, Pt, or combinations thereof. In some aspects, the nanostructured metal comprises a plurality of metal particles. In another embodiment, the metal particles have an average particle size of from 5 nm to 1 μm. As used herein, the term “particles” is any substance which can be dispersed in a liquid and which will support the phenomenon of a surface-enhanced Raman scattering (SERS) or surface-enhanced resonance Raman scattering (SERRS) . Examples of metal particles include, but are not limited to: Colloids of Au or Ag, Pt, Cu, Ag / Au, Pt / Au, Cu / Au, coreshell or alloy particles; particles, hollow particles, or flakes of gold, silver, copper, or other substances displaying conductance band electrons. As the particle surface participates in the SERS and SERRS effect, flakes or particles of substances not displaying conductance band electrons, which have been coated with a substance which does, also become suitable particulates. In one embodiment, the particles include nanoparticles such as metallic nanoparticles.

[0017] In the present invention, any substrate can be used which allows observation of the detectable change. Suitable substrates include transparent solid surfaces (e.g., glass, quartz, plastics and other polymers) , opaque solid surface (e.g., white solid surfaces, such as thin-layer chromatography (TLC) silica plates, filter paper, glass fiber filters, cellulose nitrate membranes, nylon membranes, PDVF membranes) , and conducting solid surfaces (e.g., indium tin oxide (ITO) ) . The substrate can be any shape or thickness, but generally will be flat and thin. Preferred are transparent substrates such as glass (e.g., glass slides or glass beads) or plastics (e.g., wells of microtiter plates) . When a substrate is employed, the nanostructured metal or the metal particles may be attached to the substrate in an array for detecting the target analyte.

[0018] The Raman spectrum inspection is a method for inspecting and recognizing substances by detecting Raman spectrum produced by the Raman scattering effects of an object to be inspected by an exciting light. The metal cluster have the advantage of detecting higher Raman signals by being resonant with excitation laser wavelengths used for Raman analysis. In the present invention, the exciting light must be resonant with the metal cluster in the target analyte to generate a Raman exciting light. In one embodiment, the exciting light comprises a visible light. In a preferred embodiment, the wavelength of the exciting light ranges from 350 to 800 nm. In a more preferred embodiment, the wavelength of the exciting light ranges from 400 to 600 nm.

[0019] The nanostructured metal on the substrate can be used to produce or enhance a detectable change in any assay performed on a substrate, including the optical signal of the DNA. In one embodiment, the optical signal is a Raman signal, SERS signal or SERRS signal.

[0020] Several methods are available for detecting the optical signal of the DNA, such as spectrometers. The spectrometers can generate Raman spectra, SERS spectra or SERRS spectra based on the optical signal. In the present invention, it is determined whether the occurrence of the methylation in the DNA by obtaining and analyzing a SERS spectrum When the SERS spectrum and SERS signal intensity of the DNA are measured, the methylation in the DNA can be determined by comparison of the measured SERS spectrum to a SERS spectrum of an unmethylated DNA. In one embodiment, the step of detecting the DNA methylation comprises comparing the optical signal of the DNA with an optical signal of a unmethylated DNA to determine the DNA methylation. The unmethylated DNA is the DNA without methylation. When the DNA is methylated, it is observed that the intensity of the characteristic peak of the methylated base / position (such as 5-methylcytosine, 6-O-methylguanine, and 7-methylguanine) of the DNA in a Raman spectrum increases. Therefore, the intensity of the characteristic peak of the methylated base in the methylated DNA is higher than that of the unmethylated DNA. In some aspects, the optical signal, SERS spectrum or SERS signal intensity of the unmethylated DNA can be obtained from a reference database, and the reference database stores SERS spectra of unmethylated DNA of all genes.

[0021] The DNA methylation occurrence can be observed in the optical signal or SERS spectrum of the DNA obtained by the method of the present invention. In the present invention, the metal cluster modified with the molecule having the function for binding DNA specifically binds with guanine-cytosine base pairs of the DNA. When the DNA is methylated, the metal cluster can amplify the SERS signals of methylated bases in the DNA of the gene in the Raman spectrum. The characteristic peak of the methylated base (such as 5-methylcytosine) is detected in the SERS spectrum. Methylated positions in different nucleic acid bases have different characteristic peaks in Raman spectroscopy, such as the wavenumber of the characteristic peak of 6-O-methylguanine ranges from 1300 to 1345 cm-1 (especially at 1323 cm-1) , the wavenumber of the characteristic peak of 7-methylguanine (7-MG) ranges from 1530 to 1575 cm-1 (especially at 1554 cm-1) , and the wavenumber of the characteristic peak of 5-methylcytosine (5-mC) ranges from 765 to 805 cm-1 (especially at 785 cm-1) . In some aspects, the methylation status of the DNA is determined by detecting characteristic peaks of methylated bases / positions of the DNA in a Raman spectrum. In one embodiment, the step of detecting the DNA methylation further comprises detecting an intensity change of a characteristic peak of a methylated base in the optical signal of the DNA. In a preferred embodiment, the DNA methylation is determined when the intensity of the characteristic peak of the methylated base increases in a Raman spectrum obtained from the optical signal of the DNA. The Raman spectrum can be obtained based on the optical signal of the DNA. In another embodiment, a methylated base in the DNA has a characteristic peak ranging from 765 to 805 cm-1, 1300 to 1345 cm-1, or 1530 to 1575 cm-1 in a Raman spectrum obtained from the optical signal of the DNA.

[0022] In addition, the method of the present invention is further used for measuring the methylation level of the DNA. When the methylated DNA is confirmed, the intensity of the signal of the methylated bases and the concentration of the methylated DNA represent a linear relationship. However, a methylation level of a gene does not change with a concentration of a DNA. Therefore, the present invention can divide the intensity of the optical signal (SERS intensity) of the methylated base by the intensity of an optical signal of an unmethylated guanine from the SERS spectrum of the same DNA sample to obtain a degree of methylation (Dm) of this DNA sample. In some aspects, the wavenumber of the characteristic peak of the unmethylated guanine in the Raman spectrum ranges from 645 to 685 cm-1 (especially at 665 cm-1) . For example, in the SERS spectrum of the DNA sample, the SERS intensity of 5-mC (characteristic peak at 785 cm-1) is 2 x 103, and the SERS intensity of unmethylated guanine (G) (characteristic peak at 665 cm-1) is 1 x 103. The Dm value of this DNA sample is 2 (2 x 103 / 1 x 103=2) .

[0023] Furthermore, the present invention can establish a database for storing Dm values of methylated and unmethylated DNA of all gene obtained by the method of the present invention. The Dm values of the unmethylated DNA can be used as standard DNA. For example, a DNA sample is obtained from a subject to be tested, and the Dm value of the DNA sample is calculated by the method of the present invention. When the Dm value of the DNA sample is significantly higher a Dm value of a corresponding standard DNA, it indicates that the subject to be tested with hypermethylation of the DNA.

[0024] In the present invention, the optical signal of the DNA in the step (4) can be used for determining whether the DNA is methylated and calculating the methylation state of the DNA. The term “methylation state” is taken to mean the degree of methylation present in a nucleic acid of interest, this may be expressed in absolute or relative terms i.e. as a percentage or other numerical value or by comparison to another tissue and therein described as hypermethylated, hypomethylated or as having significantly similar or identical methylation status. If the DNA is methylated, the present invention will calculate the methylation level of the DNA. In one embodiment, the method further comprises a step (5) which is performed after the step (4) , comprising calculating a degree of the DNA methylation, wherein the degree of the DNA methylation is determined by dividing an intensity of an optical signal of a methylated base in the DNA by an intensity of an optical signal of an unmethylated guanine in the DNA.

[0025] Cancer DNA is frequently hypermethylated at CpG-rich regions. As used herein, “hypermethylation” refers to high level of methylation, hydroxymethylation, formylcytosine or carboxylcytosine of CpG in a gene sequence. The hypermethylation can be determined based on the statistical difference of the methylation status value as compared with the control sample. When the hypermethylation of the DNA is detected, it indicates that the subject is at a high risk of cancer.

[0026] This present invention successfully developed a novel technique combining magnetic separation and the SERS effect to enrich TSGs and detect 5-mC signals for early cancer diagnosis. Universal streptavidin (SA) -modified nanobeads were applied to conjugate probe ssDNA, thereby enabling hybridization with target ssDNA from the specimen sample and enriching the gene concentration through magnetic attraction. The probe exhibited a hybridization efficiency of 95.1%with respect to the target ssDNA on the magnetic nanobead. In addition, cisplatin-modified Ag clusters capable of adducting guanine bases were applied to conjugate with concentrated dsDNA, thereby providing localized electromagnetic hotspots surrounding the 5-mC group. Cluster-grafted dsDNA on an Ag nanoparticles-coated ITO substrate with a synergistic SERS effect was then analyzed, and a considerable amplification of the 5-mC signal was observed. Furthermore, the methylation level of artificial gene samples was evaluated, and a strong correlation between Dm and the presence of methylated genes was observed. The present invention demonstrates the feasibility of using the SERS spectrum to precisely determine the methylation level of TSGs. These results indicated the significant potential of this technique for early tumor detection.BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

[0027] Figure 1 shows the characterization of the universal magnetic nanobeads. Figure 1a shows the synthesis processes of the universal magnetic nanobeads. Figure 1b shows the TEM image of the Fe3O4@OA nanoparticles (NPs) . Figure 1c shows the XRD-measured analyses of Fe3O4@OA, Fe3O4@DA, Fe3O4@DA-BT, and Fe3O4@DA-BT-SA NPs. Figure 1d shows the high-resolution TEM image of Fe3O4@DA-BT-SA NPs. The frame indicates the amplified area for observation of the lattice planes. Figure 1e shows the DLS-measured particle size analyses of Fe3O4@OA, Fe3O4@DA, Fe3O4@DA-BT, and Fe3O4@DA-BT-SA NPs. Figure 1f shows the DLS-measured zeta potential analyses of Fe3O4@OA, Fe3O4@DA, Fe3O4@DA-BT, and Fe3O4@DA-BT-SA NPs. Figure 1g shows the FTIR spectroscopy analyses of Fe3O4@OA, Fe3O4@DA, Fe3O4@DA-BT, and Fe3O4@DA-BT-SA NPs. Figure 1h shows the SQUID measurement of Fe3O4@DA. The inset images are photographs of a nanobead colloidal solution with and without magnet attraction and an enlarged hysteresis curve for a smaller magnetic field region. Figure 1i shows the elemental mapping analysis of Fe3O4@DA-BT-SA NPs (scale bar = 100 nm) .

[0028] Figure 2 shows the quantification of probe ssDNA and target ssDNA upon enrichment by nanobeads. Figure 2a shows the emission spectra of FITC-labeled probe after magnetic enrichment and elution processes. Figure 2b shows the emission spectra of FITC-labeled target ssDNA after magnetic enrichment and elution processes. No emission peak was obtained from nanobeads alone. CPS: count per second.

[0029] Figure 3 shows the characterizations of Ag nanoadducts. Figure 3a shows the TEM image of Ag@LA clusters. Insert: Photograph of a colloid of Ag@LA clusters. Figure 3b shows the ultraviolet-visible spectra ofAg@LA, Ag@LA-CP, and eluted dsDNA with Ag@LA-CP clusters. Figure 3c shows the photoluminescence spectra of Ag@LA, Ag@LA-CP, and eluted dsDNA with Ag@LA-CP clusters. Figure 3d shows the TEM image of Ag@LA-CP clusters. Insert: Photograph of a colloid of Ag@LA-CP clusters. Figure 3e shows the zeta potential profile of Ag@LA and Ag@LA-CP clusters. Figure 3f shows the XPS profiles of Ag@LA and Ag@LA-CP clusters. Figure 3g shows the TEM image of a dsDNA-conjugated nanobead with grafted Ag@LA-CP clusters. The dashed frames indicate the nanobead in the TEM image and its graphical representation. Figure 3h shows the TEM image of the eluted dsDNA with grafted Ag@LACP clusters.

[0030] Figure 4 shows the SERS-based methylation detection. Figure 4a shows dsDNA elution from magnetic nanobeads and sampling for SERS measurement. Figure 4b shows the SERS spectra of magnetically enriched dsDNA with and without methylation, Ag@LA-CP clusters, and the Ag NP-coated substrate. Figure 4c shows the principal component analysis results for SERS methylation evaluations of eluted dsDNA under a Ag@LA-CP cluster adducted with the Ag NP-coated substrate. PC1: Principal Component 1. PC2: Principal Component 2. Figure 4d shows SERS spectra for methylated dsDNA at multiple concentrations (i.e., 0, 0.125, 0.25, 0.5, and 1 μM) . Figure 4e shows the corresponding calibration curwe for methylated dsDNA at multiple concentrations. RSD: relative standard deviation. Figure 4f shows the SERS spectra of gene mixtures containing unmethylated and methylated dsDNA at multiple ratios (e.g., 10: 0, 8: 2, 6: 4, 4: 6, 2: 8, and 0: 10, corresponding to methylation levels of 0%, 20%, 40%, 60%, 80%, and 100%, respectively) . Figure 4g shows the degree of methylation (Dm) of artificial gene mixtures. All measurements were repeated in triplicate. EXAMPLES

[0031] The present invention may be implemented in many different forms and should not be construed as limited to the examples set forth herein. The described examples are not limited to the scope of the present invention as described in the claims.

[0032] 1. MATERIALS AND METHODS

[0033] Preparation of Hydrophobic Magnetic Nanobead (Fe3O4@OA NPs)

[0034] Truncated octahedral Fe3O4 nanoparticles (NPs) were synthesized using the thermal decomposition method detailed in a previous report. Briefly, 0.5 g of Iron (III) acetylacetonate (Fe (acac) 3) , 520 μL of oleic acid (OA) , and 20 mL of Tri-n-octyl amine (TOA) were mixed in a round-bottomed flask and heated at 150℃ for 30 min to remove the moisture within the solution. The round-bottomed flask was then connected to a vacuum pump so that a degassing process could be performed at 120℃ for 30 min. The reactor was then filled with inert argon gas and heated to 305℃ at a rate of 1.7℃ / min; the reactor was then maintained at this temperature for 30 min to react and form hydrophobic Fe3O4@OA NPs. After the thermal decomposition reaction, the NPs were collected by centrifugation at 4200 rpm for 10 min; this process was followed by redispersion in fresh n-hexane. Centrifugation and washing were performed thrice to obtain purified Fe3O4@OA NPs. The resulting NPs were stored in n-hexane for use in subsequent experiments.

[0035] Preparation of Hydrophilic Magnetic Nanobeads (Fe3O4@DA NPs)

[0036] The phase transfer of hydrophobic Fe3O4@OA NPs from the oil phase to the aqueous phase was achieved by replacing the OA with hydrophilic 3-hydroxytyramine hydrochloride (DA) through a ligand exchange method. Briefly, 20 mg of DA was added to an aqueous solution containing 10 mL of acetone and 4 mL of deionized water in a 20 mL glass vial, and 1000 ppm of Fe3O4@OA NPs dispersed in 0.1 mL of chloroform were added dropwise to the aforementioned water phase solution under sonication. The ligand exchange reaction was continued for 30 min, and the resulting Fe3O4@DA NPs were then purified by centrifugation at 8000 rpm for 10 min and resuspension in deionized water at fewest three times. The resulting NPs were stored in water for use in subsequent experiments.

[0037] Preparation of Biotinylated Magnetic Nanobeads (Fe3O4@DA-BT NPs)

[0038] The surface biotinylation of hydrophilic nanobeads can be achieved through amide bond formation between the carboxylic acid groups of biotins and the amine groups of Fe3O4@DA NPs. First, 30 mg of biotin (BT) , 10 mg of 1-Ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) , and 20 mg of n-hydroxysuccinimide (NHS) were sequentially added to a 50%dimethyl sulfoxide (DMSO) aqueous solution followed by stirring for 30 min. Subsequently, 2 mL of Fe3O4@DA NPs at an Fe concentration of 200 ppm were introduced into the aforementioned solution, and the conjugation reaction was performed for 4 h to form Fe3O4@DA-BT NPs. Finally, the resulting NPs were concentrated by centrifugation at 8000 rpm for 10 min and subsequently resuspended in deionized water. The centrifugation and washing process was performed thrice to purify the biotinylated magnetic nanobeads, which were stored in water for use in subsequent experiments.

[0039] Preparation of Universal Magnetic Nanobeads (Fe3O4@DA-BT-SANPs)

[0040] Biotin-SA bioconjugation was applied to prepare Fe3O4@DA-BT-SA NPs. Briefly, 0.05 mg of streptavidin (SA) was dissolved in 1000 mL of deionized water. Then, 1 mL of Fe3O4@DA-BT NPs at an Fe concentration of 1000 ppm was added to this solution, which was then stirred for 4 h to complete the conjugation between biotin and SA. The NPs were collected by centrifugation at 8000 rpm for 10 min, and the supernatant was removed for indirect quantification of the SA attached to the NPs. The Fe3O4@DA-BT-SA NPs were washed with deionized water at fewest two times and then stored in water at 4℃ for use in subsequent experiments.

[0041] Quantification of SA Conjugated on Nanobeads

[0042] Indirect quantification of the SA on the NPs was performed through a protein assay of the residual SA in a supernatant. First, 100 μL of the supematant solution obtained from the centrifugation and washing process of Fe3O4@DA-BT-SA NPs was mixed with 100 μL of commercial protein assay reagent (Bio-Rad) . The protein-bound reagent, which was measured on a 96-well plate by using an enzyme-linked immunosorbent assay reader (800 TS, BioTek) , had increased absorbance at 495 nm. Standard SA solutions of 0.025, 0.0125, 0.00625, 0.003125, and 0.0015625 mg / mL were employed to identify a calibration curve that was then used to determine the residual SA concentration in the supernatant. The curve was used to infer the amount of SA conjugated on the NPs.

[0043] Conjugation of Biotinylated DNA Probe on Universal Magnetic Nanobeads

[0044] An artificial RASSF1A gene with a well-considered sequence and length served as a model DNA probe. Specifically, 5' biotinylated RASSF1A ssDNA primer was directly conjugated with Fe3O4@DA-BT-SA NPs through biotin-SA bioconjugation. A total of 10 μL of a 10-μM sample of probe ssDNA was added to 1 mL of Fe3O4@DA-BT-SA NPs at an Fe element concentration of 1000 ppm in phosphate-buffered saline (PBS) solution (pH = 7.4) ; the reaction continued under shaking at room temperature for 30 min. After the reaction, the product was centrifugated at 8000 rpm for 10 min and subsequently washed with PBS at fewest two times. The purified probe ssDNA-modified nanobeads were stored at 4℃ for use in subsequent experiments.

[0045] Quantification of Probe ssDNA Conjugated on Nanobeads

[0046] To quantify the amount of probe ssDNA conjugated on nanobeads, biotinylated RASSF lA primer with 3'-terminal fluorescein i sothiocyanate (FITC) was used. The aforementioned bioconjugation reaction was used to form probe ssDNA-modified nanobeads with grafted FITC. The FITC-labeled biotinylated probe ssDNA was eluted from the nanobeads under heating at 95℃ for 5 min. The universal magnetic nanobeads were recycled through a magnetic attraction process, and the supematant containing FITC-labeled ssDNA was further analyzed using fluorescence spectroscopy to detect the emission intensity of FITC at 525 nm. Finally, the concentration of probe ssDNA on the nanobeads was determined by comparing this emission intensity with a standard calibration curve.

[0047] Hybridization Between Targeted ssDNA and Probe ssDNA-Modified Nanobeads

[0048] Targeted ssDNAwith a complementary sequence to the probe ssDNA can be hybridized and captured by the probe ssDNA-modified nanobead. For this purpose, 10 μL of an artificial targeted ssDNA sample with multiple methylation levels (i.e., 0%, 20%, 40%, 60%, 80%, and 100%) and multiple gene concentrations (i.e., 0, 0.125, 0.25, 0.5, and 1.0 μM) was mixed with 1 mL of probe ssDNA-modified nanobeads in PBS media with 1000 ppm of Fe element under a vortex for 30 min; an attractive magnetic field was then applied to collect the double-strand DNA (dsDNA) -conjugated nanobeads.

[0049] Quantification of Targeted ssDNA Captured by Nanobeads

[0050] The quantity of targeted ssDNA captured by probe ssDNA-modified nanobeads was determined by replacing the unlabeled targeted ssDNA with FITC-labeled targeted ssDNA. The same capture process then followed, but the concentration of the targeted ssDNA was 0.1, 1, or 10 μM. The FITC-labeled dsDNA was then eluted from the nanobead and dehybridized into targeted ssDNA and probe ssDNA under heating at 95℃ for 5 min. The universal magnetic nanobead could be recycled by magnetic attraction, and the supernatant containing FITC-labeled targeted ssDNA was further analyzed using fluorescence spectroscopy to detect the emission intensity of FITC at 525 nm. Finally, the concentration of the targeted ssDNA on nanobeads was determined by comparing this emission intensity with that on a standard calibration curve.

[0051] Preparation of Ag Clusters

[0052] The 3-nm Ag@LA clusters were synthesized by a one-pot reaction followed by further modification. Briefly, 19 mg of lipoic acid (LA) and 7 mg of NaBH4 were dissolved in 14 mL of deionized water and stirred for 15 min at room temperature. Then, 2 mL of 132.12 mM NaBH4 (aq) and 0.7 mL of 25-mM AgNO3 (aq) were sequentially added to the aforementioned solution. Initially, the color of the solution was black; however, after 5 h, it had turned b right orange. This change in color was attributed to the formation of the Ag@LA clusters. After the reaction, the solution containing Ag@LA clusters were extracted by adding n-butanol to remove the residual reagents. This extraction process was then repeated at least five times. Finally, the Ag@LA clusters that remained in the water phase were collected by centrifugation at 15000 rpm for 1 min. The stock Ag@LA clusters were stored at 4℃ for use in subsequent experiments.

[0053] Modification of Ag clusters with cisplatin

[0054] The modification of the Ag@LA clusters with cisplatin (CP) was achieved through amide bonding formation between the CP's amine group and the LA's carboxylic acid. First, 2.5 mL of Ag@LA clusters in 100 ppm of Ag element, 100 μL of NHS (1 mg / mL) , and 100 μL of EDC (1 mg / mL) were mixed and stirred in darkness for 15 min. Subsequently, 100 μL of CP (1 mg / mL) was added to this solution, which was then stirred for 1 h to conjugate the clusters and CP.The resulting Ag@LA-CP clusters were then washed using n-butanol before being stored at 4℃ for use in subsequent experiments.

[0055] Preparation of Ag NP-Deposited ITO Substrate

[0056] For the synthesis of Ag NPs, 30 mL of deionized water in a round-bottomed flask was heated to 100℃. Then, 30 μL of L-ascorbic acid (AA) (0.1 M) and 180 μL of trisodium citrate dihydrate (TSC) (0.1 M) were rapidly added to the flask. A mixture containing 59.50 μL of AgNO3 (aq) (0.1 M) and 1.5 μL of Fe (NO3) 3 (aq) (0.01 M) was then added dropwise to this solution, which was allowed to react for 1 h. After 1 h, the solution had turned yellow, indicating the successful formation of Ag NPs, which were collected by centrifugation at 8000 rpm for 10 min and then washed with deionized water. The washing process was repeated at least three times. A square indium tin oxide (ITO) glass sheet with a length of 1.5 cm was carefully cleaned using aqua regia and deionized water and then dried in an oven. The dried ITO glass was carefully placed into a solution of 3-aminopropyl triethoxysilane (APTES) in ethanol and slowly stirred at 70℃ for 24 h for the silanization of ITO with APTES; the glass was then washed with EtOH. The APTES-modified ITO substrate was then immersed in an Ag colloidal solution with 1000 ppm of Ag element and subjected to gentle shaking for 12 h to coat the surface of the ITO with Ag NPs through Ag-N bond formation; the substrate was then washed with deionized water and dried under a vacuum at room temperature in darkness before being used in further experiments.

[0057] SERS Measurement

[0058] After the enrichment of dsDNA by magnetic nanobead capturing, the dsDNA was then collected by elution under heating with an elufion buffer at 65℃ for 5 min; magnetic recycling of the nanobeads was then performed. A 100 μL dsDNA sample was mixed with 100 μL of Ag@LA-CP clusters in a 50 ppm Ag solution to induce a gene adducfion reaction at room temperature for 30 min. A 100 μL sample of this solution was then dropped onto the surface of the Ag NP-coated ITO substrate and dried in a vacuum at room temperature in darkness; this step was performed twice. A consistent standard sampling process was employed for the comparison groups with the exception of the mentioned differences (i.e., the use of gene adducting and the Ag NP-coated ITO substrate) . All Raman spectra were recorded using a micro-Raman spectroscope (PTT-1532S, ProTrusTech) . The spectra were measured at an excitation laser wavelength of 532 nm with 128 mW. The incident laser beam spot had a diameter of 2 μm. SERS signals were collected with a charge coupled device (CCD) and analyzed using OriginPro 2023b software. All measurements were performed at fewest three times independently.

[0059] 2. RESULTS

[0060] Characterization of Universal Magnetic Nanobeads

[0061] Streptavidin (SA) -modified Fe3O4 NPs were prepared as universal magnetic nanobeads through multiple surface modification processes (Figure 1a) . First, hydrophobic Fe3O4 NPs with oleic acid capping (Fe3O4@OA NPs) were synthesized using a thermal decomposition method. Observations of transmission electron microscopy (TEM) images revealed monodispersed Fe3O4@OA NPs with an average particle size of 16.0 ± 2.2 nm (Figure 1b) . In an X-ray diffractometry (XRD) analysis, diffraction peaks corresponding to the lattice planes of (220) , (311) , (222) , (400) , (422) , (511) , and (440) were detected for Fe3O4@OA NPs, thereby directly confirming the presence and composition of the Fe3O4 (Figure 1c) . In addition, a lattice fingerprint of (222) with a d-spacing of 0.24 nm was observed in a high-resolution TEM image of a truncated octahedral Fe3O4@OA NP (Figure 1 d) . A dynamic light scattering (DLS) analysis revealed that the zeta potential and hydrodynamic diameter of each Fe3O4@OA NP were -29.14 mV and 265.1 nm, respectively, implying that the surface of the NPs capped with oleic acid contained both carboxylic acid groups and linear carbon chains (Figures 1e and 1f) . Moreover, Fourier-transform infrared (FTIR) spectroscopy of Fe3O4@OA NPs (Figure 1g) revealed Fe-O, C=O, and C-H stretching vibrations at 560, 1628, and 2920-2930 cm-1, respectively, indicating the presence of Fe3O4 and oleic acid.

[0062] The hydrophobic Fe3O4@OA NPs in an oil-phase solvent were then converted into hydrophilic NPs capable of dispersing in the aqueous phase through a ligand exchange method. The hydrophilic molecule dopamine (DA) was applied to replace the surface oleic acid; two hydroxyl functional groups of DA can co-coordinate at an exposed Fe site of NP to form a stable five-member ring chelation. This process resulted in the formation of Fe3O4@DA NPs dispersed in water. TEM images of the Fe3O4@DA NPs indicated no morphological or size changes after the ligand exchange and phase transfer. DLS analysis revealed a positive surface charge of 8.85 mV for the Fe3O4@DA NPs, suggesting that the functional DA amine group was exposed on the NP surface (Figure 1f) . In addition, the hydrodynamic diameter of the NPs was reduced following the ligand exchange process, implying that a long oleic acid chain was replaced with a small DA molecule (Figure 1e) . Moreover, FTIR spectroscopy detected a newly added aromatic ring stretching vibration at 1450 cm-1 and standard amine vibration at 1615 cm-1; these vibrations were attributed to the presence of DA (Figure 1g) . The magnetic properties of the Fe3O4@DA NPs were evaluated through superconducting quantum interference device (SQUID) analysis, which indicated superior magnetization at 80 emu / g and excellent controllable enrichment toward the magnet (Figure 1h) . The superparamagnetic features of the Fe3O4@DA NPs were evaluated in relation to these NPs'retentivity and coercivity, which were 2.17 emu / g and 32 Oe, respectively.

[0063] SA-biotin (BT) bioconjugation was applied in the present invention to prepare a universal magnetic nanobead; such bioconjugation is a common strategy for extending the applicability of the nanobeads through their conjugation with biotin-terminated probe ssDNA. Accordingly, in the present invention, the Fe3O4@DA NPs were modified with biotin by forming covalent amide bonds between the amine group of the surface-exposed DA and the carboxylic acid group of the biotins, thereby producing biotinylated nanobeads (Fe3O4@DA-BT NPs) . SA, a tetramer protein known to strongly interact with biotin, was grafted onto the surface of the Fe3O4@DA-BT NPs to form SA-modified nanobeads (Fe3O4@DA-BT-SA NPs) . No changes in NP morphology were observed in TEM images taken after the BT and SA modifications; however, the zeta potentials of the NPs changed to -4.43 and 1.73 mV after the BT and SA modifications, respectively (Figure 1e) . In addition, the hydrodynamic diameter increased after both BT and SA grafting (Figure 1 f) . The composition and crystalline structure of the Fe3O4 NPs did not change at either stage in the XRD analysis, indicating the high stability and robust magnetic properties of the nanobeads (Figure 1c) . For the Fe3O4@DA-BT NPs, the intensity of the amine vibration at 1615 cm-1 decreased, and a new C=O vibration at 1639 cm-1 was observed, implying that amine depletion and amide bond formation occurred during the BT modification (Figure 1g) . The presence of sulfur atoms indicated by an X-ray photoelectron spectroscopy (XPS) analysis served as additional direct evidence for successful biotinylation of the NPs. Both FTIR spectroscopy and a protein assay confirmed the successful conjugation of SA. The featured vibration peaks of SA at 1639, 1539, and 1084 cm-1 were detected in the Fe3O4@DA-BT-SA NPs, suggesting the presence of SA (Figure 1g) . Moreover, an elemental mapping analysis of Fe3O4@DA-BT-SA NPs from a TEM image revealed an Fe distribution in the area of the NPs and diffuse O, N, and S distributions surrounding the NPs, implying that the NP magnetic core was fully coated by those surfactants (Figure 1i) . Furthermore, SA content was quantified by a protein assay, which indicated that the SA-biotin bioconjugation efficiency on the nanobeads was 60.61%.

[0064] Equipping Probe ssDNA on the Nanobeads and Capturing Target ssDNA

[0065] Equipping Probe ssDNA on the Nanobeads and Capturing Target ssDNA. The 3'end-biotinterminated probe ssDNA with an as-designed RASSF1A sequence was applied to the SA-exposed universal magnetic nanobead by another SA-BT bioconjugation, forming the probe ssDNA-modified nanobead. The previous findings reveal that epigenetic suppression of the RASSF1A gene strongly correlates with carcinogenesis and cancer risk, making it a promising biomarker for diagnosis. The sequence of probe ssDNA was determined by observing the results of treating crude RASSF1A with HaeIII restriction enzymes, which is a necessary pretreatment process for generating the gene segment of interest for real DNA specimens. In the proposed strategy, the probe ssDNA can be easily modified according to the detection target. For the further quantitative analysis of probe ssDNA on the NPs, fluorescein isothiocyanate (FITC) -labeled biotinylated probe ssDNA was conjugated with the nanobeads. A distinctive emission of FITC at 525 nm was detected from the FITC-labeled probe ssDNA-modified nanobead; no such emission peak was obtained before the conjugation, indicating the success of the conjugation of the nanobead with the probe ssDNA (Figure 2a) . The concentration of probe ssDNA on the nanobeads was further calculated to be 3.162 μM. Probe ssDNA-modified nanobeads without the FITC label were used for subsequent experiments.

[0066] In the next step, the synthesized target ssDNA with a complementary sequence of RASSF1A capable of hybridizing with probe ssDNA was used as the model gene analyte. Target ssDNA with this specific sequence can be produced from crude RASSF1A DNA after pretreatment with a restriction enzyme and heat-induced dehybridization. Innate hybridization between the probe and target ssDNA of RASSF1A enables the probe ssDNA-modified nanobead to be applied to capture suspended target ssDNA in a medium; it can then be collected by magnetic attraction. FITC-labeled target ssDNA was used to evaluate the capturing efficiency of the mentioned magnetic separation method. A strong fluorescence signal of FITC at 525 nm was detected from nanobeads that had captured the target ssDNA, whereas no such emission was observed for the nanobeads alone, confirming the integration of the target ssDNA with probe ssDNA-modified nanobeads to form dsDNA-conjugated nanobeads (Figure 2b) . The capturing efficiencies for 0.1, 1, and 10 μM of the target ssDNA were calculated to be 51.9%, 43.2%, and 30.4%, respectively. The highest quantity of target ssDNA on a nanobead was further determined to be 3.004 μM, suggesting that 95.1%of probe ssDNA on the nanobeads hybridized with complementary target ssDNA. The dsDNA was then isolated from NPs through an additional elution process to prevent nanobead interference in the subsequent Raman analysis.

[0067] Synthesis and Characterization of 3 nm Nano Ag Adduct. To achieve the SERS effect in the Raman analysis, plasmon metal NPs must be combined with dsDNA. Accordingly, in this study, a lipoic-acid-modified Ag (Ag@LA) cluster was prepared; this cluster had excellent dispersibility and an average particle size of 3.0 ± 1.2 nm (Figure 3a) . Representative absorbance features of the Ag cluster at 430 and 500 nm were observed and corresponded to SPR and ligand-to-metal charge transfer, respectively (Figure 3b) . Moreover, photoluminescence of the Ag@LA cluster at 672 nm was observed (Figure 3c) . Lipoic acid (LA) was used to modify the surface of the Ag clusters through Ag-Sbonding, thereby producing Ag@LA clusters with exposed carboxylic acid groups. The FTIR spectrum of the Ag@LA cluster featured vibrations at 523, 1334, and 1690 cm-1 that were linked to Ag-S, C-O, and C=O, respectively.

[0068] Cisplatin, which is a guanine-specific DNA adduct, was applied to conjugate with the Ag@LA cluster through amide bond formation between the amine terminal of cisplatin and the carboxylic acid group of the cluster, thereby producing the cisplatin-modified Ag cluster adduct (Ag@LA-CP) . No morphology or size changes in the cluster were observed after cisplatin modification (Figure 3d) . The absorbance peaks at 430 and 500 nm also remained unchanged, indicating the high stability of the cluster (Figure 3b) . The decrease in the photoluminescence emission intensity for the Ag@LA-CP cluster could perhaps be attributed to the cisplatin-induced quenching effect (Figure 3c) . The zeta potential decreased considerably from -32.45 to -11.46 mV after functionalization with cisplatin, implying that positively charged amine groups on the surface increased in quantity (Figure 3e) . This process substantially increased the binding energies of Ag 3d5 / 2 and Ag 3d3 / 2, which increased from 372.32 and 366.33 eV for the Ag@LA cluster to 372.53 and 366.53 eV for the Ag@LA-CP cluster. This outcome indirectly indicates the successful surface modification of cisplatin on the Ag@LA clusters. New Pt and N signals in the XPS spectrum of the Ag@LA-CP cluster were observed, indicating the successful conjugation of cisplatin on the cluster (Figure 3f) . Finally, signature peaks of Pt-N and Ag-S stretching were observed at 509 and 523 cm-1, respectively, in the FTIR spectrum of Ag@LA-CP.

[0069] The Ag@LA-CP cluster was further mixed with the dsDNA-conjugated nanobead to evaluate its ability to adduct to genes. A nanobead surrounded by a few linearly arranged clusters was observed, enabling the visual observation of dsDNA chains on the surface of the NPs and indicating the successful conjugation of cisplatin with guanine bases (Figure 3g) . The Ag@LACP cluster can also bind with free dsDNA; linearly arranged clusters were observable for the gene fragments in the TEM image presented in Figure 3h. The absorbance and photoluminescent features of the Ag@LA-CP clusters were not significantly different after binding with dsDNA (Figures 3b and 3c) .

[0070] SERS Measurements of Ag-Cluster-Labeled dsDNA for Methylation Evaluation

[0071] Ag NPs were also synthesized for deposition on the ITO slide, which was applied as a substrate for enhancement in SERS. In the concept of the present invention, the dsDNA with guanine-base-conjugated Ag clusters is deposited on the Ag NP-processed ITO substrate for Raman measurements; these elements can synergistically promote the SERS effect, enabling the efficient detection of 5-mC, which appears at the guanine base's complementary position (Figure 4a) . An excitation laser at 532 nm (128 mW) was applied because the Ag@LA-CP clusters and Ag-NP-coated ITO substrate had absorbance features at this region. To validate this concept, methylated and unmethylated target DNA were isolated and enriched by the aforementioned magnetic separation and elution processes, and Raman measurements of the methylated and unmethylated target DNA were then performed together with Ag clusters conjugation on ITO and with and without Ag clusters conjugation on the Ag NP-coated ITO substrate. For dsDNA-Ag clusters on Ag NP-processed ITO, a clear 5-mC signal was observed for the methylated dsDNA but not the unmethylated dsDNA (Figure 4b) . No detectable 5-mC signal for either type of dsDNA was obtained without Ag clusters conjugation or on the bare ITO substrate, suggesting that the synergistic SERS effect of both the Ag clusters and NPs is crucial for 5-mC sensing. Moreover, no detectable 5-mC signal was observed if the nanobeads and dsDNA were not separated through the elution process, indicating that nanobead interference may have inhibited the scattering signals. The optimal SERS enhancement factor of the 5-mC signal from 1 μM dsDNA was calculated as 33.8; both the Ag@LA-CP clusters and Ag NPs were thus indispensable for attaining high gain. Moreover, several measurements of methylated and unmethylated dsDNA were performed, and a correlation analysis was performed for the intensities of the 5-mC signal. The two types of dsDNA were independent and highly correlated to their respective gene types (Figure 4c) .

[0072] Notably, the intensity of the 5-mC signal increased with the concentration of methylated RASSF1A, indicating a strong linear relationship (Figures 4d and 4e) . The methylation level (Dm) of a gene was calculated as the intensity ratio of the 5-mC and guanine signals. The value of Dm did not change with the dsDNA concentration, suggesting that a normalized comparison of the methylation level can be obtained regardless of the gene concentration (Figure 4e) . Artificial gene samples with multiple methylation levels (i.e., 0%, 20%, 40%, 60%, 80%, and 100%) were prepared by mixing the methylated and unmethylated RASSF1A DNA at various ratios, and the value of Dm increased with the methylation level (Figures 4f and 4g) . This result indicates the high potential and feasibility of the proposed method for TSG isolation and methylation level evaluation.

[0073] Those skilled in the art recognize the foregoing outline as a description of the method for communicating hosted application information. The skilled artisan will recognize that these are illustrative only and that many equivalents are possible.

Claims

1.A method for detecting DNA methylation, comprising: (1) providing a DNA of a gene from a sample of a subject; (2) reacting the DNA of the gene with a metal cluster modified with a molecule having a function for binding DNA to form a target analyte; (3) contacting the target analyte with a substrate having a surface with a nanostructured metal; and (4) irradiating the target analyte on the substrate with an exciting light and detecting an optical signal of the DNA of the gene to detect the DNA methylation based on the optical signal of the DNA.2.The method of claim 1, wherein the metal cluster comprises Ag, Cu, Au, Al, Pd, Pt, Ru, Rh, Os, Ir, or combinations thereof.3.The method of claim 1, wherein the molecule having the function for binding DNA comprises the molecule having the function for binding to guanine or cytosine of the DNA.4.The method of claim 1, wherein the molecule having the function for binding DNA comprises cisplatin, cyclophosphamide, ifosfamide, busulfan, carmustine, lomustine, temozolomide, chlorambucil, melphalan, carboplatin, oxaliplatin, doxorubicin, daunorubicin, epirubicin, mitoxantrone, hoechst 33258, DAPI, or ethidium bromide.5.The method of claim 1, wherein the nanostructured metal comprises Ag, Cu, Au, Al, Pd, Pt, Ru, Rh, Os, Ir, or combinations thereof.6.The method of claim 1, wherein the wavelength of the exciting light ranges from 350 to 800 nm.7.The method of claim 1, wherein the optical signal is a Raman signal, a surface-enhanced Raman scattering signal or a surface-enhanced resonance Raman scattering signal.8.The method of claim 1, wherein the step of detecting the DNA methylation comprises comparing the optical signal of the DNA with an optical signal of a unmethylated DNA to determine the DNA methylation.9.The method of claim 8, wherein a methylated base in the DNA has a characteristic peak ranging from 765 to 805 cm-1, 1300 to 1345 cm-1, or 1530 to 1575 cm-1 in a Raman spectrum obtained from the optical signal of the DNA.10.The method of claim 1, which further comprises a step (5) which is performed after the step (4) , comprising calculating a degree of the DNA methylation, wherein the degree of the DNA methylation is determined by dividing an intensity of an optical signal of a methylated base in the DNA by an intensity of an optical signal of an unmethylated guanine in the DNA.

Images