Trispecific antibodies and uses thereof

Abstract

Disclosed herein are trispecific antibodies comprising a first antigen binding region that binds to PD1, a second antigen binding region that binds to CTLA4, and a third antigen binding region that binds to VEGFa. Also disclosed are nucleic acids encoding the trispecific antibodies, vectors comprising the nucleic acids, and host cells comprising the nucleic acids or the vectors, and medical uses of the trispecific antibodies.

Description

TRISPECIFIC ANTIBODIES AND USES THEREOF

[0001] The present application claims priority of PCT Application No. PCT / CN2024 / 122851 filed on September 30, 2024, and the PCT Application No. PCT / CN2025 / 119744 filed on September 8, 2025, the content of which is incorporated herein by reference in its entirety.FIELD OF THE INVENTION

[0002] The present invention relates to trispecific antibodies that bind to PD1, CTLA-4, and VEGF, and uses thereof.BACKGROUND OF THE INVENTION

[0003] Angiogenesis, the development of new blood vessels from pre-existing vessels, is essential for tumor growth and metastasis. Angiogenesis inhibition presents a potentially valuable strategy for treating diseases, such as cancer, in which progression (e.g., metastasis) is dependent on neovascularization. Two important angiogenesis pathways include the vascular endothelial growth factor (VEGF) pathway and the Tie2 pathway. The principal VEGF pathway is mediated by the transmembrane tyrosine kinase VEGF-R2. Various isoforms of VEGF, particularly VEGFa, bind to VEGF-R2, resulting in dimerization and activation through phosphorylation of various downstream tyrosine kinases.

[0004] In addition to the role of angiogenesis in cancer progression, the inability of the host to eliminate cancer cells is another major problem. Although the immune system is the principal mechanism of cancer prevention, cancer cells counteract immunosurveillance. The immune checkpoints PD1 and CTLA-4 exhibit distinct expression patterns on different immune cells, and their mediated signal interactions improve anti-tumor immunity. Therefore, simultaneous blockade of PD1 and CTLA-4 can promote anti-tumor immunity through multiple mechanisms. Bispecific antibodies targeting both PD1 and CTLA-4 induce endocytosis and degradation of PD1. On cells co-expressing PD1 and CTLA-4 (such as exhausted T cells in the tumor microenvironment) , enhanced blockade of CTLA-4 interaction with its ligand CD80 and other mechanisms can promote anti-tumor immunity, demonstrating efficacy on clinically non-responsive patients to immune checkpoint inhibitors. (Alexey Berezhnoy et al., Cell Rep Med. 2020 Dee 22; 1 (9) : 100163. Dovedi SJ et al., Cancer Discovery, 08 Jan 2021, 11 (5) : 1100-1117) .

[0005] Multispecific antibodies targeting multiple targets simultaneously hold great promise for clinical treatment of complex diseases. However, it is recognized in the field that simply linking two or more antibodies or proteins together often does not elicit synergistic effects and may even have adverse consequences. Trispecific antibodies that can effectively engage targets and inhibit the growth of tumors are highly desirable in this field.SUMMARY OF THE INVENTION

[0006] In an aspect, the present disclosure provides a trispecific antibody comprising a first antigen binding region that binds to PD1, a second antigen binding region that binds to CTLA4, and a third antigen binding region that binds to VEGFa.

[0007] In some embodiments, the first antigen binding region comprises a first heavy chain variable region (VH) and a first light chain variable region (VL) , and wherein: the first VH comprises HCDRs 1-3 comprising the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 7, 8, and 9, respectively, and the first VL comprises LCDRs 1-3 comprising the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 10, 11, and 12, respectively.

[0008] In some embodiments, the first VH comprises an amino acid sequence having at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity to SEQ ID NO: 13, and the first VL comprises an amino acid sequence having at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity to SEQ ID NO: 14.

[0009] In some embodiments, the second antigen binding region comprises a second VH and a second VL. In some embodiments, the third antigen binding region comprises a third VH and a third VL.

[0010] In some embodiments, the first, second, and third region are independently in a format of scfv, Fab, Fab, Fab’, F (ab') 2, scFab, Fv, dsFv, scFv, or di-scFv. In some embodiments, the first, second, and third region are independently in a format of scfv, or Fab. In some embodiments, the first antigen binding region and the second binding region are in a scFv format, the third antigen binding region is in a Fab format. In some embodiments, the first antigen binding region and the third binding region are in a scFv format, the second antigen binding region is in a Fab format. In some embodiments, the second antigen binding region and the third binding region are in a scFv format, the first antigen binding region is in a Fab format.

[0011] In some preferred embodiments, the first antigen binding region is in a scFv format. In some preferred embodiments, the second antigen binding region is in a scFv format. In some preferred embodiments, the third antigen binding region is in a Fab format.

[0012] In some embodiments, the first, second, and third region are independently monovalent or bivalent. In some embodiments, at least one of the first, second and third binding regions is monovalent. In some embodiments, at least one of the first, second and third binding regions is bivalent. In some embodiments, the first antigen binding region and the second antigen binding region are monovalent, the third antigen binding region is bivalent. In some embodiments, the first antigen binding region and the third antigen binding region are monovalent, the second antigen binding region is bivalent. In some embodiments, the second antigen binding region and the third antigen binding region are monovalent, the first antigen binding region is bivalent.

[0013] In some preferred embodiments, the first antigen binding region and the second antigen binding region are monovalent. In some embodiments, the third antigen binding region is bivalent.

[0014] In some embodiments, the trispecific antibody comprises two heavy chains and two light chains, wherein the two heavy chains comprise a heavy chain 1 comprising the first antigen binding region in a scFv format at C-terminal, and a heavy chain 2 comprising the second antigen binding region in a scFv format at C-terminal.

[0015] In some embodiments, each of the two heavy chains comprises a VH of the third antigen binding region at N-terminal, and each of the two light chains comprises a VL of the third antigen binding region at N-terminal.

[0016] In some embodiments, the trispecific antibody further comprises a CH3 constant region. In some preferred embodiments, the trispecific antibody further comprises Fc region.

[0017] In some embodiments, the Fc region is of an isotype selected from the group consisting of IgG, IgA, IgM, IgE, and IgD.

[0018] In some embodiments, the Fc region is of a subtype selected from the group consisting of IgG1, IgG2, IgG3, and IgG4.

[0019] In some embodiments, the CH3 constant region comprises a knob-into-hole mutation.

[0020] In some embodiments, the second antigen binding region comprises a second VH and a second VL, and wherein the second VH comprise HCDRs 1-3 comprising the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 15, 16, and 17, respectively, and the second VL comprises LCDRs 1-3 comprising the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 18, 19, and 20, respectively.

[0021] In some embodiments, the second VH comprises an amino acid sequence having at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity to SEQ ID NO: 21, and the second VL comprises an amino acid sequence having at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity to SEQ ID NO: 22.

[0022] In some embodiments, the third antigen binding region comprises a third VH and a third VL, and wherein the third VH comprise HCDRs 1-3 comprising the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 23, 24, and 25, respectively, and the third VL comprises LCDRs 1-3 comprising the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 26, 27, and 28, respectively.

[0023] In some embodiments, the third VH comprises an amino acid sequence having at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity to SEQ ID NO: 29, and the third VL comprises an amino acid sequence having at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity to SEQ ID NO: 30.

[0024] In some embodiments, from N-terminal to C-terminal, the heavy chain 1 comprises: a VH of the third antigen binding region, a CH1 region, a Fc region, and the first antigen binding region in a scFv format; the heavy chain 2 comprises: a VH of the third antigen binding region, a CH1 region, a Fc region, and the second antigen binding region in a scFv format; and each of the two light chains comprises: a VL of the third binding region and a light chain constant region.

[0025] In some embodiments, the heavy chain 1 comprises an amino acid sequence having at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity to SEQ ID NO: 32; the heavy chain 2 comprises an amino acid sequence having at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity to SEQ ID NO: 33; and each of the two light chains comprises an amino acid sequence having at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity to SEQ ID NO: 31.

[0026] In another aspect, the present disclosure provides a nucleic acid encoding the trispecifc antibody disclosed herein.

[0027] In another aspect, the present disclosure provides a vector comprising the nucleic acid disclosed herein.

[0028] In another aspect, the present disclosure provides a host cell comprising the nucleic acid disclosed herein.

[0029] In another aspect, the present disclosure provides a pharmaceutical composition comprising the trispecifc antibody disclosed herein, and optionally at least a pharmaceutically acceptable carrier or excipient.

[0030] In some embodiments, the composition further comprises a second therapeutic agent, optionally the second therapeutic agent is selected from the group consisting of an antibody, a chemotherapeutic agent, an siRNA, antisense oligonucleotide, a polypeptide, and a small molecule drug.

[0031] In another aspect, the present disclosure provides a method for treating a disease, comprising administering to a subject an effective amount of the trispecific antibody disclosed herein, or the pharmaceutical composition disclosed herein. In some embodiments, the disease is a cancer.

[0032] In some embodiments, the cancer is a PD-L1 expressing cancer. In some embodiments, the cancer is PD-L1 overexpressing. In some embodiments, the cancer is PD-L1 negative. In some preferred embodiments, the cancer is a solid tumor.

[0033] In some embodiments, the solid tumor includes, but is not limited to, colon cancer, adenocarcinoma of the rectum and colon, prostate cancer, breast cancer, lung cancer (including small cell lung cancer, non-small cell lung cancer) , liver cancer (including hepatocellular carcinoma) , gastric cancer, renal cancer, kidney cancer (including renal cell carcinoma) , cervical cancer; ovarian cancer; and endometrial cancer.

[0034] DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

[0035] An understanding of the features and advantages of the present invention will be obtained by reference to the following detailed description that sets forth illustrative embodiments, in which the principles of the invention are utilized, and the accompanying drawings of which:

[0036] FIG. 1 shows the structure of J30.

[0037] FIG. 2 shows the multi-targets engagement of J30 by Octet. The period of “TAs” represents the association of the test article for VEGFa.

[0038] FIG. 3 shows the binding and ligand blocking of J30 or CS1002+CS1003 combo on PD1 or CTLA4 single and double positive cells.

[0039] FIG. 4 shows the blockage effect of J30 on the binding of VEGFA to VEGFR2.

[0040] FIG. 5 shows that J30 inhibits VEGFa-induced proliferation of human umbilical vein endothelial cells.

[0041] FIG. 6 shows that J30 triggers the internalization of the targets on CHOS-PD1 / CTLA4 cells.

[0042] FIG. 7 shows that J30 inhibits the growth of MC38-PDL1 tumor cells in humanized PD1 / PDL1 / CTLA4 mice.

[0043] FIG. 8 shows the median of tumor volumes and Kaplan–Meier survival curve on CTLA4 / VEGFR2 mice with MC38-VEGFA tumor cells.

[0044] FIG. 9 shows the concurrent blockade effect of J30 alone and J30 co-incubated with human VEGFA on the binding of PD-L1 / PD-1 and CD80 / CTLA-4 in PD-1 / CTLA-4 dual-expression luciferase reporter gene assay.

[0045] FIG. 10 shows column chart of fold changes in IL-2 and IFN-γ secretion by human CD4+ T lymphocytes relative to the blank control.

[0046] FIG. 11 shows the expression of ICOS and Ki-67 on CD4 and CD8 T cells in the GLP Repeat-dose Toxicity Study.DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

[0047] The afore-mentioned features and advantages of the invention as well as additional features and advantages thereof will be more clearly understood hereafter with a detailed description of the following embodiments when taken in conjunction with the drawings.

[0048] The embodiments described herein with reference to drawings are explanatory, illustrative, and used to generally understand the present invention. The embodiments shall not be construed to limit the scope of the present invention. The same or similar elements and the elements having the same or similar functions are denoted by like reference numerals throughout the descriptions.

[0049] Unless indicated or defined otherwise, all terms used have their usual meaning in the art, which will be clear to the skilled person. Reference is for example made to the standard handbooks, such as Leuenberger, H. G. W, Nagel, B. and Klbl, H. eds., "Amultilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations) " , Helvetica Chimica Acta (1995) , CH-4010 Basel, Switzerland; Sambrook et al, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (2nd Ed. ) , Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) ; F. Ausubel et al, eds., "Current protocols in molecular biology" , Green Publishing and Wiley InterScience, New York (1987) ; Roitt et al., "Immunology (6th Ed. ) , Mosby / Elsevier, Edinburgh (2001) ; and Janeway et al., "Immunobiology" (6th Ed. ) , Garland Science Publishing / Churchill Livingstone, New York (2005) , as well as the general background art cited above.

[0050] As used herein, singular forms “a, ” “an, ” and “the” include plural referents unless the context clearly indicates otherwise. Thus, for example, reference to “an antibody” includes a plurality of antibodies.

[0051] Unless indicated or defined otherwise, the term "comprise, " and variations thereof such as "comprises" and "comprising" , should be understood to imply the inclusion of a stated element or step or a group of elements or steps but not the exclusion of any other element or step or a group of elements or steps. The term “comprising” encompasses “including” as well as “consisting” e.g., a composition “comprising” X may consist exclusively of X or may include something additional e.g., X + Y.

[0052] The term “about” in relation to a numerical value x is optional and means, for example, x+10%or x±5%.

[0053] As used herein, the term “antibody” refers to an immunoglobulin molecule which has ability to specifically bind to a specific antigen. An antibody often comprises a variable region and a constant region in each of a heavy chain and a light chain. The variable regions of the heavy and light chains of antibodies contain a binding domain that interacts with an antigen. The constant regions of antibodies may mediate the binding of the immunoglobulin to host tissues or factors, including various cells of the immune system (such as effector cells) and components of the complement system such as C1q, the first component in the classical pathway of complement activation. Most antibodies have a heavy chain variable region (VH) and a light chain variable region (VL) that together form the portion of the antibody that binds to the antigen.

[0054] A “light chain variable region” (VL) or “heavy chain variable region” (VH) consists of four “framework” regions interrupted by three “complementarity determining regions” or “CDRs” . The framework regions serve to align the CDRs for specific binding to an epitope of an antigen. The CDRs include the amino acid residues of an antibody that are primarily responsible for antigen binding. From amino-terminus to carboxyl-terminus, both VL and VH domains comprise the following framework (FR) and CDR regions: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, and FR4. CDRs 1, 2, and 3 of a VL domain are also referred to herein, respectively, as LCDR1, LCDR2, and LCDR3; CDRs 1, 2, and 3 of a VH domain are also referred to herein, respectively, as HCDR1, HCDR2, and HCDR3.

[0055] The assignment of amino acids to each VL and VH domain is in accordance with any conventional definition of CDRs. Conventional definitions include, the Kabat definition (Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1987 and 1991) , the Chothia definition (Chothia &Lesk, J. Mol. Biol. 196: 901-917, 1987; Chothia et al., Nature 342: 878-883, 1989) ; a composite of Chothia Kabat CDR (also named Chothia and Kabat Combined CDR) , in which each CDR is a composite of Chothia and Kabat CDR; the AbM definition used by Oxford Molecular’s antibody modelling software; and, the contact definition of Martin et al. (world wide web bioinfo. org. uk / abs) . Kabat provides a widely used numbering convention (Kabat numbering system) in which corresponding residues between different heavy chains or between different light chains are assigned the same number.

[0056] The present disclosure involves CDRs defined according to any of these numbering systems, although preferred embodiments involve Chothia and Kabat Combined defined CDRs.

[0057] Table 1. The definition methods for CDRs of an antibody (see http:  / / bioinf. org. uk / abs / )

[0058] In Table 1, Laa-Lbb may refers to the amino acid sequence from position aa (according to Chothia numbering system) to position bb (according to Chothia numbering system) starting from the N-terminus of the antibody light chain; and Haa-Hbb may refer to the amino acid sequence from position aa (according to Chothia numbering system) to position bb (according to Chothia numbering system) starting from the N-terminus of the antibody heavy chain. For example, L24-L34 can refer to the amino acid sequence from position 24 to position 34 (according to Chothia numbering system) starting from the N-terminus of the antibody light chain; and H26-H32 may refer to the amino acid sequence from position 26 to position 32 (according to Chothia numbering system) starting from the N-terminus of the antibody heavy chain.

[0059] As used herein, the term “antigen binding fragment” of an antibody refers to one or more fragments of an antibody that retain the ability to specifically bind to an antigen (e.g., PD1) . It has been shown that the antigen binding function of an antibody can be performed by fragments of a full-length antibody.

[0060] Examples of antigen binding fragment of an antibody include (i) a Fab fragment, a monovalent fragment consisting of the VL, VH, CL and CH1 domains; (ii) a F (ab') 2 fragment, a bivalent fragment comprising two Fab fragments linked by a disulfide bridge at the hinge region; (iii) a Fab'fragment, which is essentially an Fab with part of the hinge region (see, FUNDAMENTALIMMUNOLOGY (Paul ed., 3. sup. rd ed. 1993) ) ; (iv) a Fd fragment consisting of the VH and CH1 domains; (v) a Fd'fragment having VH and CH1 domains and one or more cysteine residues at the C-terminus of the CH1 domain; (vi) a Fv fragment consisting of the VL and VH domains of a single arm of an antibody, (vii) a dAb fragment (Ward et al., (1989) Nature 341: 544-546) , which consists of a VH domain; (viii) an isolated complementarity determining region (CDR) ; and (ix) a nanobody, a heavy chain variable region containing a single variable domain and two constant domains. Furthermore, although the two domains of the Fv fragment, VL and VH are coded by separate genes, they can be joined, using recombinant methods, by a synthetic linker that enables them to be made as a single protein chain in which the VL and VH regions pair to form monovalent molecules (known as single chain Fv (scFv) ; see e.g., Bird et al. (1988) Science 242: 423-426; and Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883) . Such single chain antibodies are also intended to be encompassed within the term "antigen binding fragment" of an antibody. Furthermore, the term also includes a "linear antibody" comprising a pair of tandem Fd segments (VH-CH1-VH-CH1) , which forms an antigen binding region together with a complementary light chain polypeptide, and a modified version of any of the foregoing fragments, which retains antigen binding activity.

[0061] These antigen binding fragments can be obtained using conventional techniques known to those with skills in the art, and the fragments are screened for utility in the same manner as are intact antibodies.

[0062] The term “valence” in reference to antibodies refers to the total number of antigen-binding sites within an antibody molecule, or the number of antigen-binding sites with identical antigen-binding specificity. For example, a monovalent antibody contains a total of one antigen-binding sites. In an embodiment, a monovalent binding region of a multi-specific antibody contains one VH region and one VL region.

[0063] As used herein, the term "binding" or "specifically binding" refers to a non-random binding reaction between two molecules, such as between an antibody and its target antigen. The binding specificity of an antibody can be determined based on affinity and / or avidity. The affinity, represented by the equilibrium constant for the dissociation of an antigen with an antibody (KD) , is a measure for the binding strength between an antigenic determinant (epitope) and an antigen-binding site on the antibody: the lesser the value of the KD, the stronger the binding strength between an antigenic determinant (epitope) and the antibody. Alternatively, the affinity can also be expressed as the affinity constant (KA) , which is 1 / KD.

[0064] Avidity is the measure of the strength of binding between an antibody and the pertinent antigen. Avidity is related to both the affinity between an antigenic determinant (epitope) and its antigen binding site on the antibody and the number of pertinent binding sites present on the antibody. Specifically binding of an antibody to an antigen or antigenic determinant can be determined in any suitable manner known per se, including, for example, Scatchard analysis and / or competitive binding assays, such as radioimmunoassays (RIA) , enzyme immunoassays (EIA) , bio-layer interferometry (BLI) assay and sandwich competition assays, and the different variants thereof known per se in the art.

[0065] The term “epitope” refers to a site on an antigen to which an antibody binds. An epitope can be formed from contiguous amino acids or noncontiguous amino acids juxtaposed by tertiary folding of one or more proteins. Epitopes formed from contiguous amino acids (also known as linear epitopes) are typically retained on exposure to denaturing solvents whereas epitopes formed by tertiary folding (also known as conformational epitopes) are typically lost on treatment with denaturing solvents. An epitope typically includes at least 3, and more usually, at least 5 or 8-10 amino acids in a unique spatial conformation. The epitope defines the smallest binding site of an antibody and therefore is the specific target of the antibody or antigen binding fragment thereof.

[0066] As used herein, the term “sequence identity” refers to the extent to which two sequences (amino acid) have the same residue at the same positions in an alignment. For example, “an amino acid sequence is X%identical to SEQ ID NO: Y” refers to %identity of the amino acid sequence to SEQ ID NO: Y and is elaborated as X%of residues in the amino acid sequence are identical to the residues of sequence disclosed in SEQ ID NO: Y. Generally, computer programs are employed for such calculations. Exemplary programs that compare and align pairs of sequences, include ALIGN (Myers and Miller, 1988) , FASTA (Pearson and Lipman, 1988; Pearson, 1990) and gapped BLAST (Altschul et al., 1997) , BLASTP, BLASTN, or GCG (Devereux et al., 1984) .

[0067] Also, in determining the degree of sequence identity between two amino acid sequences, the skilled person may take into account the so-called "conservative" amino acid substitutions, which can generally be described as amino acid substitutions in which an amino acid residue is replaced with another amino acid residue of similar chemical structure and which has little or essentially no influence on the function, activity or other biological properties of the polypeptide.

[0068] Such conservative substitutions preferably are substitutions in which one amino acid within the following groups (a) - (e) is substituted by another amino acid residue within the same group: (a) small aliphatic, nonpolar or slightly polar residues: Ala, Ser, Thr, Pro and Gly; (b) polar, negatively charged residues and their (uncharged) amides: Asp, Asn, Glu and Gln; (c) polar, positively charged residues: His, Arg and Lys; (d) large aliphatic, nonpolar residues: Met, Leu, Ile, Val and Cys; and (e) aromatic residues: Phe, Tyr and Trp.

[0069] Particularly preferred conservative substitutions are as follows: Ala into Gly or into Ser; Arg into Lys; Asn into Gln or into His; Asp into Glu; Cys into Ser; Gln into Asn; Glu into Asp; Gly into Ala or into Pro; His into Asn or into Gln; Ile into Leu or into Val; Leu into Ile or into Val; Lys into Arg, into Gln or into Glu; Met into Leu, into Tyr or into Ile; Phe into Met, into Leu or into Tyr; Ser into Thr; Thr into Ser; Trp into Tyr; Tyr into Trp; and / or Phe into Val, into Ile or into Leu.

[0070] As used herein, the term "monoclonal antibody" refers to an antibody obtained from a substantially homogeneous antibody population. That is, antibodies constituting the population are the same, except for possible naturally occurring mutations in small amount. Monoclonal antibodies are highly specific and are directed against a single antigen. The term "monoclonal antibody" herein is not limited to antibodies produced by hybridoma technology, and should not be interpreted as requiring production of antibodies by any specific method.

[0071] The term “trispecific antibody” is in the context of the present invention to be understood as an antibody having three different antigen-binding regions defined by different antibody sequences.

[0072] As used herein, the term "tumor associated antigen" refers to an antigen that is differentially expressed in cancer cells compared to normal cells, and therefore can be used to target cancer cells.

[0073] As used herein, the term "vector" is intended to refer to a nucleic acid molecule capable of transporting another nucleic acid to which it has been linked.

[0074] As used herein, the term "host cell" refers to a cell into which an expression vector has been introduced.

[0075] The term “pharmaceutically acceptable” means that the carrier or adjuvant is compatible with the other ingredients of the composition and not substantially deleterious to the recipient thereof and / or that such carrier or adjuvant is approved or approvable for inclusion in a pharmaceutical composition for parenteral administration to humans.

[0076] As used herein, the terms "treatment, " "treating, " and the like, refer to administering an agent, or carrying out a procedure, for the purposes of obtaining an effect. The effect may be prophylactic in terms of completely or partially preventing a disease or symptom thereof and / or may be therapeutic in terms of effecting a partial or complete cure for a disease and / or symptom of the disease. "Treatment, " as used herein, may include treatment of a disease or disorder (e.g. cancer) in a mammal, particularly in a human, and includes: (a) preventing the disease or a symptom of a disease from occurring in a subject which may be predisposed to the disease but has not yet been diagnosed as having it (e.g., including diseases that may be associated with or caused by a primary disease; (b) inhibiting the disease, i.e., arresting its development; and (c) relieving the disease, i.e., causing regression of the disease. Treating may refer to any indicia of success in the treatment or amelioration or prevention of a cancer, including any objective or subjective parameter such as abatement; remission; diminishing of symptoms or making the disease condition more tolerable to the patient; slowing in the rate of degeneration or decline; or making the final point of degeneration less debilitating. The treatment or amelioration of symptoms is based on one or more objective or subjective parameters; including the results of an examination by a physician. Accordingly, the term "treating" includes the administration of the antibodies or compositions or conjugates disclosed herein to prevent or delay, to alleviate, or to arrest or inhibit development of the symptoms or conditions associated with diseases (e.g., cancers) . The term "therapeutic effect" refers to the reduction, elimination, or prevention of the disease, symptoms of the disease, or side effects of the disease in the subject.

[0077] The term "effective amount" as used herein means the amount that, when administered to a subject for treating a disease, is sufficient to effect treatment for that disease.

[0078] The term “subject” , as used herein, refers to any mammalian subject for whom diagnosis, treatment, or therapy is desired. "Mammal" for purposes of treatment refers to any animal classified as a mammal, including humans, domestic and farm animals, and laboratory, zoo, sports, or pet animals, such as dogs, horses, cats, cows, sheep, goats, pigs, mice, rats, rabbits, guinea pigs, monkeys etc.

[0079] Trispecific antibodies

[0080] In an aspect , the present disclosure provides a trispecific antibody comprising a first antigen binding region that binds to PD1, a second antigen binding region that binds to CTLA4, and a third antigen binding region that binds to VEGFa, wherein the first antigen binding region comprises a first heavy chain variable region (VH) and a first light chain variable region (VL) , and wherein: the first VH comprises HCDRs 1-3 comprising the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 7, 8, and 9, respectively, and the first VL comprises LCDRs 1-3 comprising the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 10, 11, and 12, respectively.

[0081] In some embodiments, CDR sequences are defined according to Kabat numbering system.

[0082] When CDR sequences are defined according to Kabat numbering system, the first VH comprises an amino acid sequence having at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity to SEQ ID NO: 13, and the first VL comprises an amino acid sequence having at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity to SEQ ID NO: 14. In a preferred embodiment, the first VH comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 13, and the first VL comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 14.In some embodiments, the first antigen binding region is in a scFv format. In some embodiments, the second antigen binding region comprises a second VH and a second VL. In some embodiments, the second antigen binding region is in a scFv format.

[0083] In some embodiments, the third antigen binding region comprises a third VH and a third VL. In some embodiments, the third antigen binding region is in a Fab format.

[0084] In some embodiments, the first antigen binding region, and the second antigen binding region are monovalent. In some embodiments, the third antigen binding region is bivalent.

[0085] In some embodiments, the trispecific antibody comprises two heavy chains and two light chains, wherein the two heavy chains comprise a heavy chain 1 comprising the first antigen binding region in a scFv format at C-terminal, and a heavy chain 2 comprising the second antigen binding region in a scFv format at C-terminal.

[0086] In some embodiments, each of the two heavy chains comprises a VH of the third antigen binding region at N-terminal, and each of the two light chains comprises a VL of the third antigen binding region at N-terminal.

[0087] In some embodiments, the trispecific antibody further comprises a CH3 constant region. In some preferred embodiments, the trispecific antibody further comprises Fc region.

[0088] In some embodiments, the Fc region is of an isotype selected from the group consisting of IgG, IgA, IgM, IgE, and IgD.

[0089] In some embodiments, the Fc region is of a subtype selected from the group consisting of IgG1, IgG2, IgG3, and IgG4.

[0090] In a preferred embodiment, the Fc region is of a subtype of IgG1.

[0091] One of the challenges for efficiently producing bispecific and trispecific antibody preparations concerns mispairing of heavy and light chains when co-expressing chains of different binding specificities. Table 2 lists several amino acid substitution options for overcoming mispairing between heavy chains of different binding specificities, which "enforce" or preferentially promote correct association between desired heavy chains. Any approach to prevent or reduce mispairing between heavy chains may be used to make the trispecific antibodies according to the present disclosure.

[0092] Table 2

[0093] The "knobs-into-holes" (KiH) approach relies on modifications of the interface between the two CH3 domains where most interactions occur. Typically, a bulky residue is introduced into the CH3 domain of one antibody heavy chain and acts similarly to a key. In the other heavy chain, a "hole" is formed that is able to accommodate this bulky residue, mimicking a lock. The resulting heterodimeric Fc-part can be further stabilized by artificial disulfide bridges.

[0094] An alternative approach is based on charged residues with ionic interactions or steric complementarity. This includes altering the charge polarity in the CH3 interface so that co-expression of electrostatically matched Fc domains support favorable attractive interactions and heterodimer formation while retaining the hydrophobic core, whereas unfavorable repulsive charge interactions suppress homodimerization. See Table 2. The amino acid numbering in Table 2 follows the Kabat numbering scheme and can be applied to heavy chain amino acid sequences of the antibodies described herein.

[0095] In a further approach, leucine zipper (LZ) domains may be incorporated into a protein scaffold. A leucine zipper is a common three-dimensional structural motif in proteins, typically as part of a DNA-binding domain in various transcription factors. A single LZ typically contains 4-5 leucine residues at approximately 7-residue intervals, which forms an amphipathic alpha helix with a hydrophobic region running along one side. In an embodiment, a heterodimeric protein scaffold comprises a LZ from the c-jun transcription factor associated with a LZ from the c-fos transcription factor. Although c-jun is known to form jun-jun homodimers and c-fos does not form homodimers, the formation of jun-fos heterodimers is greatly favored over jun-jun homodimers.

[0096] A leucine zipper domain may be incorporated in place of CH2-CH3 sequences in the protein scaffold or it may be placed at the carboxy terminal end of the two heavy chains in the trispecific antibody. In the case of the latter, a furin cleavage site may be introduced between the carboxy terminal end of CH3 and the amino terminal end of the leucine zipper. This can facilitate furin-mediated cleavage of the leucine zipper following the heterdimerization step when co-expressing the heavy and light chains of the trispecific antibody in an appropriate mammalian cell expression system (see Wranik et al., J. Biol. Chem., 287 (5) : 43331-43339, 2012) .

[0097] In some embodiments, the CH3 constant region comprises a knob-into-hole mutation.

[0098] In some embodiments, the second antigen binding region comprises a second VH and a second VL, and wherein the second VH comprise HCDRs 1-3 comprising the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 15, 16, and 17, respectively, and the second VL comprises LCDRs 1-3 comprising the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 18, 19, and 20, respectively.

[0099] In some embodiments, the second VH comprises an amino acid sequence having at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity to SEQ ID NO: 21, and the second VL comprises an amino acid sequence having at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity to SEQ ID NO: 22. In a preferred embodiment, the second VH comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 21, and the second VL comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 22.

[0100] In some embodiments, the third antigen binding region comprises a third VH and a third VL, and wherein the third VH comprise HCDRs 1-3 comprising the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 23, 24, and 25, respectively, and the third VL comprises LCDRs 1-3 comprising the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 26, 27, and 28, respectively.

[0101] In some embodiments, the third VH comprises an amino acid sequence having at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity to SEQ ID NO: 29, and the third VL comprises an amino acid sequence having at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity to SEQ ID NO: 30. In a preferred embodiment, the third VH comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 29, and the third VL comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 30.

[0102] In some embodiments, the heavy chain 1 comprises the following from N-terminal to C-terminal: a VH of the third antigen binding region, a CH1 region, a Fc region, and the first antigen binding region in a scFv format; the heavy chain 2 comprises the following from N-terminal to C-terminal: a VH of the third antigen binding region, a CH1 region, a Fc region, and the second antigen binding region in a scFv format; and each of the two light chains comprises the following from N-terminal to C-terminal: a VL of the third binding region and a light chain constant region.

[0103] The light chain of the antibody can be classified as a lambda (λ) chain or a kappa (κ) chain, based on the amino acid sequence of the light chain constant region.

[0104] In some embodiments, the heavy chain 1 comprises an amino acid sequence having at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity to SEQ ID NO: 32; the heavy chain 2 comprises an amino acid sequence having at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity to SEQ ID NO: 33; and each of the two light chains comprises an amino acid sequence having at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity to SEQ ID NO: 31.

[0105] In a preferred embodiment, the trispecific antibody comprises two heavy chains and two light chains, wherein a heavy chain 1 comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 32; a heavy chain 2 comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 33; and each of the two light chains comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 31.

[0106] Nucleic acids

[0107] The present disclosure provides a nucleic acid encoding the trispecifc antibody disclosed herein.

[0108] The term "nucleic acid" includes both single-stranded and double-stranded nucleotide polymers. The nucleic acid can be ribonucleotides or deoxyribonucleotides or a modified form of either type of nucleotide. Said modifications include base modifications such as bromouridine and inosine derivatives, ribose modifications such as 2', 3'-dideoxyribose, and internucleotide linkage modifications such as phosphorothioate, phosphorodithioate, phosphoroselenoate, phosphorodiselenoate, phosphoroanilothioate, phoshoraniladate and phosphoroamidate.

[0109] The invention provides nucleic acid molecules encoding the heavy chain sequence disclosed herein. For example, the invention provides nucleic acid molecules encoding a sequence that is at least 90%, at least 95%, at least 98%, or at least 99%identical to any one of the heavy chain sequences disclosed herein. In some embodiments, the nucleic acid encoding a sequence having at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity to SEQ ID NO: 32.

[0110] The invention provides nucleic acid molecules encoding the heavy chain sequence disclosed herein. For example, the invention provides nucleic acid molecules encoding a sequence that is at least 90%, at least 95%, at least 98%, or at least 99%identical to any one of the heavy chain sequences disclosed herein. In some embodiments, the nucleic acid encoding a sequence having at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity to SEQ ID NO: 33.

[0111] The invention provides nucleic acid molecules encoding the light chain sequence disclosed herein. For example, the invention provides nucleic acid molecules encoding a sequence that is at least 90%, at least 95%, at least 98%, or at least 99%identical to any one of the light chain sequences disclosed herein. In some embodiments, the nucleic acid encoding a sequence having at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity to SEQ ID NO: 32.

[0112] The invention also provides nucleic acid molecules encoding the heavy chain variable region sequence disclosed herein. For example, the invention provides nucleic acid molecules encoding a sequence that are at least 90%, at least 95%, at least 98%, or at least 99%identical to any one of the heavy chain variable region sequences disclosed herein.

[0113] In some embodiments, the nucleic acid encoding a sequence having at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity to SEQ ID NO: 13. In some embodiments, the nucleic acid encoding a sequence having at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity to SEQ ID NO: 21. In some embodiments, the nucleic acid encoding a sequence having at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity to SEQ ID NO: 29.

[0114] The invention also provides nucleic acid molecules encoding the light chain variable region sequence disclosed herein. For example, the invention provides nucleic acid molecules encoding a sequence that are at least 90%, at least 95%, at least 98%, or at least 99%identical to any one of the light chain variable region sequences disclosed herein.

[0115] In some embodiments, the nucleic acid encoding a sequence having at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity to SEQ ID NO: 14. In some embodiments, the nucleic acid encoding a sequence having at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity to SEQ ID NO: 22. In some embodiments, the nucleic acid encoding a sequence having at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity to SEQ ID NO: 30.

[0116] In some embodiments, the nucleic acid is ribonucleic acid (RNA) or deoxyribonucleic acid (DNA) . In some embodiments, the invention provides a ribonucleic acid (RNA) comprising a nucleotide sequence encoding the antibody disclosed herein. In some embodiments, the invention provides a deoxyribonucleic acid (DNA) comprising a deoxynucleotide sequence encoding the antibody disclosed herein.

[0117] In some embodiments, the deoxyribonucleic acid (DNA) may be introduced into the cells of a human body in vivo. In some embodiments, the deoxyribonucleic acid (DNA) of the invention is comprised in a vector or a delivering agent. In some embodiments, the deoxyribonucleic acid (DNA) of the invention is integrated into the genome of a cell.

[0118] In some embodiments, the ribonucleic acid (RNA) may be introduced into the cells of a human body in vivo. In some embodiments, the ribonucleic acid (RNA) of the invention is comprised in a vector or a delivering agent.

[0119] Vectors

[0120] The present disclosure provides a vector comprising the nucleic acid disclosed herein.

[0121] In some embodiments, the vector is an expression vector capable of expressing a polypeptide comprising a heavy or light chain variable region of the antibody. For example, the invention provides expression vectors comprising any of the nucleic acid molecules mentioned above.

[0122] Any vector may be suitable for the present disclosure. In some embodiments, the vector is a viral vector. In some embodiments, the vector is a retroviral vector, a DNA vector, a murine leukemia virus vector, an SFG vector, a plasmid, an RNA vector, an adenoviral vector, a baculoviral vector, an Epstein Barr viral vector, a papovaviral vector, a vaccinia viral vector, a herpes simplex viral vector, an adenovirus associated vector (AAV) , a lentiviral vector, or any combination thereof. Suitable exemplary vectors include e.g., pGAR, pBABE-puro, pBABE-neo largeTcDNA, pBABE-hygro-hTERT, pMKO. 1 GFP, MSCV-IRES-GFP, pMSCV PIG (Puro IRES GFP empty plasmid) , pMSCV-loxp-dsRed-loxp-eGFP-Puro-WPRE, MSCV IRES Luciferase, pMIG, MDH1-PGK-GFP_2.0, TtRMPVIR, pMSCV-IRES-mCherry FP, pRetroX GFP T2A Cre, pRXTN, pLncEXP, and pLXIN-Luc.

[0123] An expression vector may be any suitable recombinant expression vector. Suitable vectors comprise those designed for propagation and expansion or for expression or both, such as plasmids and viruses. For example, a vector may be selected from the pUC series (Fermentas Life Sciences, Glen Burnie, Md. ) , the pBluescript series (Stratagene, LaJolla, Calif. ) , the pET series (Novagen, Madison, Wis. ) , the pGEX series (Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden) , and the pEX series (Clontech, Palo Alto, Calif. ) . Bacteriophage vectors, such as λGT10, λGT11, λZapII (Stratagene) , λEMBL4, and λNM1149, also may be used. Examples of plant expression vectors useful in the context of the disclosure comprise pBI01, pBI101.2, pBI101.3, pBI121 and pBIN19 (Clontech) . Examples of animal expression vectors useful in the context of the disclosure comprise pcDNA, pEUK-Cl, pMAM, and pMAMneo (Clontech) .

[0124] Recombinant expression vectors may be prepared using standard recombinant DNA techniques described in, for example, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N. Y. 2001; and Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and John Wiley &Sons, NY, 1994. Constructs of expression vectors, which are circular or linear, may be prepared to contain a replication system functional in a prokaryotic or eukaryotic host cell. Replication systems may be derived, e.g., from ColEl, 2μ plasmid, λ, SV40, bovine papilloma virus, and the like.

[0125] For example, the vector may be an adenoviral vector comprising a nucleotide sequence encoding the antibody disclosed herein. The vector may be administered into the body of a subject, and then enter a cell of the subject in vivo, thereby the nucleotide sequence encoding the antibody disclosed herein is integrated into the genome of the cell, and subsequently the cell expresses the antibody disclosed herein.

[0126] Host Cells

[0127] The present disclosure provides a host cell comprising the nucleic acid disclosed herein or the vector disclosed herein.

[0128] Any cell may be used as a host cell for the nucleic acids or the vectors of the present disclosure. In some embodiments, the cell can be a prokaryotic cell, fungal cell, yeast cell, or higher eukaryotic cells such as a mammalian cell. Suitable prokaryotic cells include, without limitation, eubacteria, such as Gram-negative or Gram-positive organisms, for example, Enterobactehaceae such as Escherichia, e.g., E. coli; Enterobacter; Erwinia; Klebsiella; Proteus; Salmonella, e.g., Salmonella typhimurium; Serratia, e.g., Serratia marcescans, and Shigella; Bacilli such as B. subtilis and B. licheniformis; Pseudomonas such as P. aeruginosa; and Streptomyces. In some embodiments, the host cell is a mammalian cell. Examples of mammalian host cells may include, for example, human embryonic kidney cells (e.g., 293 or 293 cells subcloned for growth in suspension culture) , Expi293TM cells, CHO cells, baby hamster kidney cells (e.g., BHK, ATCC CCL 10) , mouse Sertoli cells (e.g., TM4 cells) , monkey kidney cells (e.g., CV1 ATCC CCL 70) , African green monkey kidney cells (e.g., VERO-76, ATCC CRL-1587) , human cervical carcinoma cells (e.g., HELA, ATCC CCL 2) , canine kidney cells (e.g., MDCK, ATCC CCL 34) , buffalo rat liver cells (e.g., BRL 3A, ATCC CRL 1442) , human lung cells (e.g., W138, ATCC CCL 75) , human liver cells (e.g., Hep G2, HB 8065) , mouse mammary tumor cells (e.g., MMT 060562, ATCC CCL51) , TRI cells, MRC 5 cells, FS4 cells, a human hepatoma line (e.g., Hep G2) , and myeloma cells (e.g., NS0 and Sp2 / 0 cells) ..

[0129] The host cell of the invention is prepared by introducing the vector disclosed herein or the nucleic acid disclosed herein in vitro or ex vivo. The host cell of the invention may be administered into the body of a subject, and the host cell expresses the antibody disclosed herein in vivo.

[0130] The invention provides host cells into which any of the vectors mentioned above have been introduced. The invention further provides a method of preparing the antibody of the invention, wherein the method comprises a) culturing the host cell disclosed herewith under a condition suitable for the production of the antibody; and b) obtaining the antibody from the culture.

[0131] Compositions

[0132] The present disclosure provides a pharmaceutical composition comprising the trispecifc antibody disclosed herein, and optionally at least a pharmaceutically acceptable carrier or excipient.

[0133] The antibodies or agents of the invention (also referred to herein as “active compounds” ) , and derivatives, fragments, analogs and homologs thereof, can be incorporated into pharmaceutical compositions suitable for administration. Such compositions typically comprise the antibody or agent and a pharmaceutically acceptable carrier. The term “pharmaceutically acceptable carrier” includes any and all solvents, buffers, dispersion media, coatings, antibacterial and antifungal agents, isotonic and absorption delaying agents, and the like that are physiologically compatible. Preferably, the carrier is suitable for intravenous, intramuscular, subcutaneous, parenteral, spinal or epidermal administration (e.g. by injection or infusion) . For example, in some embodiments, a composition for intravenous administration typically is a solution in sterile isotonic aqueous buffer.

[0134] In some embodiments, the composition further comprises a second therapeutic agent, optionally the second therapeutic agent is selected from the group consisting of an antibody, a chemotherapeutic agent, an siRNA, antisense oligonucleotide, a polypeptide, and a small molecule drug.

[0135] Medical uses

[0136] In another aspect, the present disclosure provides a method for treating a disease, comprising administering to a subject an effective amount of the trispecific antibody disclosed herein, or the pharmaceutical composition disclosed herein. In some embodiments, the disease is a cancer.

[0137] The present disclosure provides a use of the trispecific antibody disclosed herein, or the pharmaceutical composition disclosed herein for the manufacture of a medicament for treating a disease. In some embodiments, the disease is a cancer.

[0138] The present disclosure also provides the trispecific antibody disclosed herein, or the pharmaceutical composition disclosed herein for use in treating a disease. In some embodiments, the disease is a cancer.

[0139] A therapeutically effective amount of a composition is administered to a subject in an amount that is sufficient to inhibit growth, replication or metastasis of cancer cells, or to inhibit a sign or a symptom of the cancer.

[0140] In some embodiments, the cancer is a CTLA4-related cancer. In some embodiments, the cancer is a VEGFa-related cancer. In some embodiments, the cancer is a PD-L1 expressing cancer. Suitable subjects may include those diagnosed with a cancer that expresses PD-L1. In some embodiments, the cancer is PD-L1 overexpressing. In some embodiments, the cancer is PD-L1 negative. In some preferred embodiments, the cancer is a solid tumor.

[0141] In some embodiments, the solid tumor includes, but is not limited to, colon cancer, adenocarcinoma of the rectum and colon, prostate cancer, breast cancer, lung cancer (including small cell lung cancer, non-small cell lung cancer) , liver cancer (including hepatocellular carcinoma) , gastric cancer, renal cancer, kidney cancer (including renal cell carcinoma) , cervical cancer; ovarian cancer; and endometrial cancer.

[0142] The precise therapeutically effective amount for a human subject will depend upon the severity of the disease state, the general health of the subject, the age, weight and gender of the subject, diet, time and frequency of administration, drug combination (s) , reaction sensitivities and tolerance / response to therapy. This amount can be determined by routine experimentation and is within the judgment of the clinician. Generally, a therapeutically effective amount will be from 0.01 mg / kg to 50 mg / kg, for example 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, and 45 mg / kg. Pharmaceutical compositions may be conveniently presented in unit dose forms containing a predetermined amount of an active agent of the invention.

[0143] The dose at which the antibody molecule of the present disclosure is administered depends on the nature of the condition to be treated, the extent of the inflammation present and on whether the antibody molecule is being used prophylactically or to treat an existing condition.

[0144] The frequency of dose will depend on the half-life of the antibody molecule and the duration of its effect. If the antibody molecule has a short half-life (e.g. 2 to 10 hours) it may be necessary to give one or more doses per day. Alternatively, if the antibody molecule has a long half-life (e.g. 2 to 15 days) it may only be necessary to give a dosage once per day, once per week or even once every 1 or 2 months. In some embodiments, the trispecific antibody is administered once every week. In some embodiments, the trispecific antibody is administered once every two weeks. In some embodiments, the trispecific antibody is administered once every three weeks.

[0145] EXAMPLES

[0146] The present invention is further illustrated by the following examples, which are not intended to limit the present invention. Experimental procedures without specified conditions in the following examples are performed in accordance with conventional procedures and conditions, or in accordance with instructions.

[0147] Example 1: Construction, expression and purification of anti-PD1 / CTLA-4 / VEGF trispecific antibody J30

[0148] 1-1 Sequence and structure of J30

[0149] The present invention constructs a trispecific antibody J30 that can recognize PD1, CTLA-4 and VEGFA, derived from anti-PD1 antibody CS1003, anti-CTLA-4 antibody CS1002 and anti-VEGFA antibody I10. The structure of the constructed J30 is shown in FIG. 1. The constant region sequence of human hIgG1 is used to construct the trispecific antibody of the present invention. The corresponding sequences are shown in the Table 12.

[0150] 1-2 Expression and production

[0151] A polynucleotide of the corresponding sequence of the trispecific antibody J30 was synthesized and inserted into the expression vector pCDNA3.4, and then expressed as human IgG1 in Chinese hamster ovary (CHO) cells, and subsequently purified by protein A magnetic beads, according to the manufacturer’s instructions. The concentration of the purified antibodies was determined by measuring absorbance at 280 nm. The control antibodies used in the present Examples were constructed as follows and expressed and purified according to the above method. The following antibodies were used as the positive controls in the Examples: AK112 (Ivonescimab, a PD1 / VEGF bispecific antibody) , AK104 (Cadonilimab, a PD1 / CTLA4 bispecific antibody) , MEDI5752 (Volrustomig, a PD1 / CTLA4 bispecific antibody) , Pembrolizumab (an anti-PD1 antibody) , and Bevacizumab (an anti-VEGF antibody) .

[0152] Example 2: Detection of J30 binding affinity to PD1, CTLA4 or VEGFA proteins by Octet

[0153] J30 as well as Isotype human IgG1 were tested by Bio-Layer Interferometry (BLI) with ForteBio Octet RED96e with HIS1K Biosensors (Sartorius #18-5120) . The assay was performed at 30℃ with 1000 rpm mixing. All samples were diluted in 1x Kinetics Buffer prepared with 10x Kinetics Buffer (Sartorius #18-1105) and PBS. Sensors were loaded with 5 μg / mL PD1 protein (SinoBiological #10377-H08H) or CTLA4 protein (SinoBiological #11159-H08H) for 240 seconds followed by a baseline with 1x Kinetics Buffer for 180 seconds. Association of J30 and isotype Ab were performed at 200 nM, 20 nM, 2 nM and 0 nM for 300 seconds followed by a dissociation with 1x Kinetics Buffer for 300 seconds. The data was analyzed with ForteBio Data Analysis software HT12.0.

[0154] J30 as well as Isotype were also tested by BLI with ForteBio Octet RED96e with Anti-hIgG Fc Capture (AHC) Biosensors (Sartorius #18-5060) . The assay was performed at 30℃ with 1000 rpm mixing. All samples were diluted in 1x Kinetics Buffer prepared with 10x Kinetics Buffer (Sartorius #18-1105) and PBS. Sensors were loaded with 10 μg / mL J30, or isotype Ab for 120 seconds followed by a baseline with 1x Kinetics Buffer for 120 seconds. Association of recombinant VEGF121 Protein (SinoBiological #10008-HNAH) was performed at 100 nM, 33 nM, 11 nM and 0 nM for 120 seconds followed by a dissociation with 1x Kinetics Buffer for 300 seconds. The data was analyzed with ForteBio Data Analysis software HT12.0.

[0155] The OCTET binding results were shown in Table 3. J30 demonstrated double digit nanomolar affinities to PD1 and CTLA4.

[0156] Table 3 Summary of J30 binding affinity on PD1, CTLA4 and VEGFA

[0157] Example 3: Detection of multi-target engagement of J30 to PD1, CTLA4 and VEGFA proteins by Octet

[0158] The simultaneous triple binding to PD1, CTLA4 and VEGFA was also determined by BLI. J30, I10, as well as Isotype human IgG1 were tested with ForteBio Octet RED96e with SA Biosensors (Sartorius #18-5019) . The assay was performed at 30℃with 1000 rpm mixing. All samples were diluted in 1x Kinetics Buffer prepared with 10x Kinetics Buffer (Sartorius #18-1105) and PBS. Sensors were loaded with 5 μg / mL VEGF165 Protein (SinoBiological #11066-H27H-B) for 120 seconds followed by a baseline with 1x Kinetics Buffer for 120 seconds. Association of J30, I10 and Isotype human IgG1 were performed at 200 nM for 240 seconds followed by a dissociation with 1x Kinetics Buffer for 30 seconds. Then, association of PD1-mFc protein (ACRO #PD1-H5255) was performed at 5 μg / mL for 240 seconds followed by a dissociation with 1x Kinetics Buffer for 30 seconds. Finally, association of CTLA4 protein (SinoBiological #11159-H08H) was performed at 5 μg / mL for 240 seconds followed by a dissociation with 1x Kinetics Buffer for 30 seconds. The data was analyzed with ForteBio Data Analysis software HT12.0. The OCTET binding results were shown in FIG. 2. J30 demonstrated the concurrent binding to PD1, CTLA4 and VEGFA.

[0159] Example 4: Binding and blocking activities of J30 on PD1, CTLA4 single-and double-positive cells by FACS

[0160] The PD1 single positive cell NK92-PD1-GFP (Celetrix) , the CTLA4 single positive cell CHO-K1-CTLA4 (Kyinno Bio) and the PD1 / CTLA4 double positive cell CHO-S-PD1-CTLA4 (Sanyou Bio) were used. CHO-S-PD1-CTLA4 cell line was screened out with a ratio of PD1 / CTLA4≈40: 1, which was similar to the ratio on tumor infiltrating lymphocytes (TILs) . These three cell lines were used to detect the binding and ligand-blocking of J30 compared to CS1003 and CS1002 combo.

[0161] The culture medium was RPMI-1640 medium with 10%fetal bovine serum for CHO-K1-CTLA4 and CHO-S-PD1-CTLA4, NK92 culture medium for NK92-PD1-GFP. All cells were cultured at 37℃ with 5%CO2. Cells were collected during exponential growth phase. Cell density was detected by CounterStar and adjusted to 2x106 cells / mL with culture medium. 2x105 cells per well were seeded into 96-well U-Bottom plates. Cells were washed twice with stain buffer (BD #554656) and pelleted at 300x g and 2-8℃ for 3 minutes. Cells were resuspended and incubated with 100 μL / well of cold diluted antibody in stain buffer as first antibody solution at 2-8℃ away from light for 30 minutes. The concentrations of tested antibodies started from 200 nM with 7 serial dilutions at a 5-fold dilution factor. After incubation for 30 minutes at 2-8℃, cells were washed and fixed with 37℃ pre-warmed fresh PhosflowTM Lyse / Fix Buffer (1x) (BD #558049) at 37℃ for 10 minutes. After two washes, cells were resuspended and incubated with 100 μL / well of cold ligand, which was 100 nM Human PD-L1-mFc (Acro #PD1-H52A3) or 100 nM Human B7-1-mFc (Acro #B71-H52A4) , at 2-8℃ away from light for 30 minutes. Unbound PD1 receptor was detected with PD1 ligand PD-L1-mFc, whereas unbound CTLA4 receptor was detected using CTLA4 ligand B7-1-mFc. After two washes, cells were resuspended and incubated with 100 μL / well of mixture of Goat anti-mouse IgG AF647 (1: 1000) (Jackson #115-605-062) and anti-human IgG PE secondary antibodies (1: 100) (Invitrogen #12-4998-82) as second antibodies and incubated at 2-8℃ away from light for 30 minutes. After two washes with stain buffer, the cells were resuspended with 100 μL / well of stain buffer and analyzed by a Beckman CytoFlex flow cytometer. A nonlinear regression analysis with four adjustable parameters was conducted using GraphPad Prism 9.2 software.

[0162] The related results were shown in FIG. 3. Panel a-b show results on PD1 / CTLA4 double positive cell CHO-S-PD1-CTLA4; panel c-d show results on CTLA4 single positive cell CHO-K1-CTLA4; and panel e-f show results on PD1 single positive cell NK92-PD1-GFP. J30 blocked B7 / CTLA4 interaction with higher potency than the combo group on CHO-S-PD1-CTLA4 cells. Whilst, the monovalent anti-PD1 arm of J30 was still functional. The monovalent anti-CTLA4 arm of J30 cannot block B7 / CTLA4 interaction on CHO-hCTLA4 cells. Of these, J30 will be able to re-invigorate PD1 / CTLA4 double positive tumor infiltrating T cells, but without over-activating peripheral CTLA4 single positive T cells, thus avoiding immune-related adverse events (irAEs) .

[0163] Example 5: Detection of the blocking effect of J30 on the binding of VEGFA to VEGFR2 by VEGFR2-NFAT reporter assay

[0164] The HEK293 / VEGFR2 / NFAT-Luciferase cell line (Genscript #M00891) was used to detect the blocking ability of J30 on the binding of human VEGFA to human VEGFR2. The HEK293 / VEGFR2 / NFAT-Luciferase cell line is a luciferase reporter gene cell line constructed based on the NFAT signaling pathway. When VEGFA binds to VEGFR2, it triggers NFAT signaling pathway, thereby induces the expression of luciferase.

[0165] The culture medium was DMEM medium containing 10%FBS, 1 μg / ml puromycin and 200 μg / ml hygromycin B for HEK293 / VEGFR2 / NFAT-Luciferase reporter cells. HEK293 / VEGFR2 / NFAT-Luciferase cells were digested by accutase and resuspended in basic medium (DMEM+1%Heat-inactive FBS) . The cell density was detected by CounterStar and adjusted to 1x106 cells / mL, and 40 μL of cell cultures were seeded into 96-well plates, which was 4x104 cells per well. 80 μL of 40 ng / mL hVEGF165-His (Genscript #Z03073-10) was mixed with 80 μL of the antibody solution and then incubated at room temperature for 30min. The concentrations of tested antibodies started from 400 nM with 8 serial dilutions at a 4-fold dilution factor. Add 40 μL mixture to each well of the 96-well plate and incubate at 37℃ for 6 hours. Thus, the final concentration of hVEGF165-his was 10 ng / mL and the final starting concentration of each antibody was 100 nM, respectively. After incubation, add 80 μL / well luciferase buffer (Beyotime #RG051M) and detect the luminescence signal with the following condition: Gain (200) and Measurement interval time (1 s) .

[0166] The results are shown in FIG. 4 and Table 4. J30 blocked the interaction between human VEGFA and human VEGFR2 on the cell surface, as effectively as I10 and AK112 did, thus inhibit VEGFR2 downstream signaling.

[0167] Table 4 Summary of blocking activities on HEK293 / VEGFR2 / NFAT-Luciferase cell line

[0168] Example 6: The function of J30 in inhibiting VEGFA-driven proliferation of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC)

[0169] Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) express VEGF receptors and are therefore induced to proliferate by VEGF, and can be used to evaluate the angiogenic effect of anti-VEGF antibodies. HUVEC (ATCC, CRL-1730) was used to detect the inhibition of VEGF function by trispecific antibodies.

[0170] HUVEC cells were seeded to a 96-well transparent bottom plate and adjusted to 3x103 cells / well. The concentrations of tested antibodies started from 10 nM with 8 serial dilutions at a 2-fold dilution factor. The gradient dilution of antibodies and VEGFA (Sino Biological, #11066-HNAH-100ug) with final concentration of 20 ng / mL were mixed and incubated for 30 min at room temperature. 50 μl of the mixture were added to each well of the 96-well plate and incubated at 37℃ for 72 hours. After 72-hour incubation, 20 μL / well MTS was added into the plate and incubated at 37℃ for 4 hours. Read the fluorescence signal at OD492. The IC50 value of the antibody inhibitory activity was calculated using a four-parameter model. The results were shown in FIG. 5 and Table 5, J30 effectively blocked VEGFA-driven HUVEC cell proliferation, with IC50 as 1.012 nM.

[0171] Table 5. Summary of inhibition activities on the growth of HUVEC cells

[0172] Example 7: Internalization of J30 on PD1 and CTLA4

[0173] To evaluate the internalization rate of PD1 and CTLA4 on cell surface, J30, AK104, AK112, MEDI5752, as well as isotype human IgG1 were tested using CHO-S-PD1-CTLA4 cells (Sanyou Bio) .

[0174] CHO-S-PD1-CTLA4 cells were tested with 200 nM antibody solutions at 0 min, 15 min, 30 min and 60 min using indirect method of internalization (FACS surface binding) . For internalization 0 min group, which as the initial value, the FACS procedure was same as mentioned in Example 4. For internalization 15 min, 30 min and 60 min groups, after the incubation with first antibody solution, cells were washed twice with 200 μL / well cold culture medium, resuspended with 100 μL / well culture medium and culture for designated timepoints at 37℃. The second antibody staining was conducted with collected cells after washed twice with stain buffer. The following FACS procedure was similar to Example 4. The internalization ratios of 15 min, 30 min and 60 min were calculated as 100%- (MFI of designated timepoint / MFI of 0 min) %.

[0175] The results of indirect method were shown in FIG. 6. All the tested antibodies triggered internalization on CHO-S-PD1-CTLA4 cells. The internalization of targets reduces the available targets on the cell surface, thereby decrease the inhibitory signals. J30 performed superior performance to the other tested antibodies on this study.

[0176] Example 8: In vivo efficacy of J30 in inhibiting the growth of MC-38-PDL1 in humanized PD1 / PDL1 / CTLA4 mice

[0177] For the in vivo efficacy evaluation of J30, 5x105 B-hPD-L1 MC38 plus cells (Biocytogen) were injected subcutaneously into female B-hPD1 / hPD-L1 / hCTLA4 humanized (C57BL / 6) mice (Biocytogen) . Mice were randomized into study groups and dosed with test articles via intraperitoneal injection once the tumors reached approximately 99 mm3. Tumor volume was calculated with the formula: volume = 1 / 2 x length x width x width. The tumor growth inhibition (TGI) of tumor volume were calculated by the following equation: TGI%= [1- (Ti-T0)  /  (Ci-C0) ] × 100%. (Ti: the mean tumor volume of the treated group at Day i following treatment; T0: the mean tumor volume of the treated group at Day 0; Ci: the mean tumor volume of the control group at Day i following treatment; C0: the mean tumor volume of the control group at Day 0) . All animal procedures were performed under a protocol approved by the Institutional Animal Care and Use Committee of the animal facility. Efficacy study grouping information was listed in Table 6.

[0178] On Day 29 post treatment, 2.4 mg / kg J30 induced 60%TGI while the equimolar dosage groups for MEDI5752, AK112 and AK104 resulted in 33.3%, 28.2%and 8.4%TGI, respectively. Combination groups (Pembrolizumab / CS1002 Fc null combo group and CS1003 / CS1002 Fc null combo group) resulted in 37.5%and 27.6%TGI, respectively. No weight loss or treatment-related toxicities were observed during the study.

[0179] Generally, J30 demonstrated superior tumor growth inhibition in B-hPD1 / hPD-L1 / hCTLA4 humanized mice over MEDI5752, AK112, AK104, the pembrolizumab / CS1002 combo group, and the CS1003 / CS1002 combo group.

[0180] Table 6. The list of efficacy study groups in MC-38-PDL1 of humanized PD1 / PDL1 / CTLA4 transgenic mouse model

[0181] Example 9: In vivo efficacy of J30 in inhibiting the growth of MC38-hVEGFA in humanized CTLA4 / VEGFR2 mice

[0182] J30 has binding activity to the mouse PD1. The in vivo antitumor efficacy of J30 was also evaluated in the subcutaneous B-hVEGFA MC38 (V2) mouse colon carcinoma (human VEGFA transduced MC38 cells) of B-hCTLA4 / VEGFR2 transgenic (C57BL / 6) mouse model (Biocytogen) . Mice were randomly divided into the study groups and dosed with test articles via intraperitoneal injection once the tumors reached approximately 99 mm3. Tumor volume was calculated with the formula (volume = 1 / 2 x length x width x width) . No weight loss or treatment-related toxicities were observed during the study. All animal procedures were performed under a protocol approved by the Institutional Animal Care and Use Committee of the animal facility. The grouping information is listed in Table 7.

[0183] On Day 28 post treatment, the median tumor volume of 3 mg / kg J30 group was 527 mm3. In the equimolar dosage group for AK112 and the combination group of CS1002 Fc null, CS1003 and bevacizumab, the median tumor volumes were 730 mm3 and 640 mm3, respectively. In the 12 mg / kg or equimolar dosage group, the median tumor volumes for J30, AK112 and the combination group of CS1002 Fc null, CS1003 and bevacizumab were 354 mm3, 565 mm3 and 459 mm3, respectively. Compared with the vehicle control group, J30 demonstrated significant inhibition on tumor growth in a dose-dependent manner under the tested doses. Comparing to the other groups dosed with equimolar drugs, the anti-tumor effect of J30 was superior to that of AK112 and the combination group of CS1002 Fc null, CS1003 and bevacizumab (FIG. 8a and 8b) .

[0184] On Day 35 (i.e. 11 days after the final dose) , all drug-treated animals survived, except that one animal deceased from the combination group of 2.25 mg / kg CS1002 Fc null, 2.25 mg / kg CS1003 and 2.25 mg / kg Bevacizumab. J30 exhibited effects on survival of the tumor-bearing mice.. The Kaplan–Meier survival curve for all groups is presented in FIG. 8c and 8d.

[0185] In conclusion, J30 demonstrated significant inhibitory effects on the growth of subcutaneous B-hVEGFA MC38 (V2) murine colon carcinoma at the tested doses in a dose-dependent manner. Comparing to the other treated groups dosed with the equimolar drugs, the anti-tumor effect of J30 was comparable to that of AK112 and the combination group of CS1002 Fc null, CS1003 and bevacizumab, with a trend towards slight superiority. In addition, all test articles demonstrated potent anti-tumor efficacy without apparent adverse effects, indicating good tolerability.

[0186] Table 7 The list of efficacy study groups in MC38-hVEGFA of B-hCTLA4 / VEGFR2 transgenic mouse model

[0187] Example 10: The crosslinking between J30 and VEGFA dimers enhances the blockade of both PD-1 and CTLA-4 mediated checkpoint signaling assessed by PD-1 / CTLA-4 dual reporter assay

[0188] VEGFA is secreted as a functional dimer in which the two monomers are linked together by two inter-subunit disulfide bridges. To determine whether VEGFA can enhance the blockade activities of J30, we evaluated the ability of J30 alone and J30 co-incubated with human VEGFA dimer (J30+VEGFA) to interrupt the engagement of PD-L1 / PD-1 and CD80 / CTLA-4. The H_CTLA4 PD-1 Reporter Cells (Genomeditech #HC142) with H_CD80 PDL1 aAPC CHO-K1 Cells (Genomeditech #MC080) as antigen-presenting cells (APCs) were used to detect the blockade effects of J30 or J30+VEGFA on the interactions between PD-L1 / PD-1 and CD80 / CTLA-4. H_CD80 PDL1 aAPC CHO-K1 Cell Line is a clonal stable cell line that constitutively expresses OKT3, human PDL1 and human CD80 gene. The cell line is co-cultured with the H_CTLA4 PD-1 Reporter Cell Line (GM-C26486) . The binding of OKT3 to TCR and CD80 to CD28 jointly activates T cell signaling. PD-L1 binds to PD-1, or CTLA-4 competes with CD28 for CD80, thereby blocking the expression of luciferase. Blockade antibodies can block this inhibitory signal transmission and restore the activation of T cells. The luciferase activity measurement indicates the activation level of the signaling pathway and can thus be used to evaluate the in vitro effects of drugs related to CTLA4 and PD1.

[0189] H_CD80 PDL1 aAPC CHO-K1 cells were resuspended to 1.5x105 cells / mL with culture medium (F12K containing 10%FBS, 1%PS, 4 μg / mL puromycin, 4 μg / mL blasticidin and 100 μg / mL hygromycin B) and followed by adding 100 μL of the cells into each well on a 96-well microplate (Corning 3903) . After overnight incubation at 37℃ with 5%CO2, the culture medium was discarded from 96-well microplate and 50 μL of gradient-diluted antibody samples were added into each well. For J30+VEGFA preparation, J30 was mixed with human VEGF165 protein and incubated at room temperature for 30 minutes. 105 of H_CTLA4 PD-1 Reporter Cells in 50 μL were then added to each well. Further, the 96-well plates with the two cells were incubated at 37℃ and 5%CO2 for 7 h. After the incubation, 100 μL / well of luciferase substrate was added to all wells. The LUM (luminescence) signal was read with gain at 200 and measurement interval time of 1 second by Microplate Reader (BioTek, Synergy 2) . The LUM scatter plot was drawn with GraphPad 10.3.1 software, and the EC50 was calculated.

[0190] Both J30 and J30+VEGFA were able to concurrently block the binding of PD-L1 / PD-1 and CD80 / CTLA-4, thereby releasing the activity of TCR signals to trigger the expression of luciferase, with EC50 of 73.96 nM and 4.41 nM, respectively (Table 8, FIG. 9) . In summary, the function of J30 as an immune checkpoint inhibitor (CPI) achieved 16.8-fold increase by crosslinking with VEGFA dimers.

[0191] Table 8. The EC50 values of J30 alone and J30+VEGFA in the PD-1 / CTLA-4 dual-expression luciferase reporter gene assay

[0192] Example 11: The crosslinking between J30 and VEGFA dimers enhances blockade of both PD-1 / PD-L1 and CTLA4 / CD80 signaling assessed by MLR assay

[0193] The activation of CD4+ T lymphocytes by J30 alone or J30+VEGFA was also assessed with allogeneic mixed lymphocyte reaction (MLR) assay. The density of the CD4+ T cells and myeloid dendritic cells (mDCs) isolated from human was adjusted with RPMI-1640 containing 10%FBS to 1.2 x 106 cells / mL and 4 x 105 cells / mL, respectively. Then, 100 μL / well of CD4+ T cells were added into a 96-well plate followed by adding 50 μL of gradient-diluted antibody samples into each well. For J30+VEGFA, the antibody was mixed with human VEGF165 protein and incubated at room temperature for 30 minutes. 100 μL / well of mDCs were then added to each well, resulting in a final volume of 250 μL per well. After incubation for 3 days at 37℃ and 5%CO2, 120 μL of supernatant was collected for IL-2 detection. After incubation for 2 more days at 37℃ and 5%CO2, 80 μL of supernatant was collected for IFN-γ detection. The fold changes of the secretion levels of IL-2 and IFN-γ in the supernatant samples relative to the blank controls were calculated and plotted as column charts using GraphPad 10.3.1 software.

[0194] In the allogeneic MLR, J30 alone and J30+VEGFA showed the potential to promote the proliferation and activation of CD4+ T lymphocytes in a dose-dependent manner. At all concentrations tested, J30+VEGFA exhibited a stronger ability to enhance IL-2 secretion compared to J30 alone (FIG. 10a) . For IFN-γ secretion, J30+VEGFA showed a greater enhancement than J30 at 1 nM (FIG. 10b) . These results indicated that co-incubation of J30 with human VEGFA dimers enhanced J30’s ability to activate T lymphocytes.

[0195] Example 12: Single dose pharmacokinetic (PK) and repeat dose toxicokinetic (TK) of J30 in cynomolgus monkeys

[0196] As cynomolgus monkey was identified as the pharmacologically relevant species according to the in vitro cross-species binding affinity data, nonclinical PK evaluations of J30 were conducted in this species. IV infusion, which is the intended clinical route of administration, was selected as the dosing route. Full PK was evaluated in a stand-alone single-dose study with a clinical-relevant dose range. The multiple dose cynomolgus monkey toxicokinetic (TK) studies were conducted concurrently with the repeat-dose toxicity studies.

[0197] The PK profile of J30 was investigated after a single 5, 15, or 50 mg / kg (n=6 / dose level) IV infusion. The serum concentrations were monitored for 4 weeks, and parameters were estimated by noncompartmental analysis (NCA) . The mean terminal half-life (T1 / 2) across dose levels ranged from 47.69 to 78.61 hr, while the mean clearance (CL) and mean volume of distribution at steady state (Vd, ss) ranged from 0.435 to 0.699 mL / h / kg and 44.3 to 79.0 mL / kg, respectively, which are all within the ranges of marketed therapeutic antibodies. The mean area under the concentration-time curves from the time of dosing to the time of the last measurable concentration (AUClast) was 6.81, 24.9, and 114 h*mg / mL in the 5, 15, or 50 mg / kg IV dose group, respectively. No marked gender difference in J30 exposure was observed, while the maximal concentration (Cmax) and AUClast were slightly over-proportional to dose. PK parameters were summarized in Table 9. Therefore, J30 has an mAb-like PK profile.

[0198] Table 9 Mean PK Parameters Following a Single J30 IV Infusion in Cynomolgus Monkeys

[0199] Note: All means are geometric. GSD stands for geometric standard deviation factor.

[0200] A concomitant TK study of J30 was incorporated in the GLP-compliant repeat-dose toxicity study (25, 50, and 100 mg / kg, n=10 / dose level, once weekly for 4 weeks with 5 doses in total) . Intensive sampling was conducted for 1 week after the 1st and the 4th dosing, respectively. The Cmax and AUClast were slightly over-proportional to dose. No gender difference in Cmax or AUClast was detected. After the first dose of 25, 50, and 100 mg / kg J30, the average AUClast were 21.6, 54.8, and 126 h*mg / mL, respectively. TK parameters were summarized in Table 10.

[0201] Table 10. J30 TK Parameters Summary *: Arithmetic mean ± SD

[0202] Example 13: Toxicity of J30 in cynomolgus monkeys

[0203] The purpose of this GLP-compliant study was to evaluate the potential toxicity of J30 in cynomolgus monkeys administered once weekly for 4 consecutive weeks (total 5 doses) intravenously, and to investigate the reversibility, progression, and / or potential delayed effects during a 4-week recovery period.

[0204] A total of 20 female and 20 male animals were assigned into 4 groups (5 animals / gender / group) . J30 at different dose levels (0, 25, 50 or 100 mg / kg / dose) was administered via IV infusion (30 min) at a dose volume of 10 mL / kg once weekly for 4 weeks. The study design can be found in Table 11.

[0205] Table 11 Design of the 4-week GLP Repeat-Dose Toxicity Study in Cynomolgus Monkeys a Scheduled for terminal-sacrifice (TS) on Day 30; b scheduled for recovery-sacrifice (RS) on Day 58.

[0206] Dosing route: intravenous infusion (30 min)

[0207] Vehicle control: 20 mM of histidine / histidine hydrochloride, 80 mg / mL of sucrose, and 0.2 mg / mL Polysorbate 80 in water for injection (WFI) , pH 5.5

[0208] M: male; F: female.

[0209] J30 was well tolerated when infused intravenously at 25, 50 or 100 mg / kg once weekly for 4 weeks with 5 doses in total. No J30-related abnormal changes in body weight, body weight gain, food consumption, body temperature, ECG, blood pressure, respiratory function, FOB, clinical observations, ophthalmoscopy examination, clinical chemistry, hematology, coagulation, urinalysis, cytokine levels, immunophenotyping, or organ weight were noted during the dosing phase and the recovery period. Moreover, no increase in circulating immune complex (CIC) was observed.

[0210] On the terminal sacrifice, dark red discoloration in the mucosa of the rectum or stomach fundus was noted in 3 males given ≥50 mg / kg, correlated microscopically with minimal or mild hemorrhage in mucosal lamina propria. These hemorrhage-related findings could be related to exaggerated pharmacology of J30’s VEGFA antagonist function arm. As they were observed in a small portion of animals with low severities (minimal or mild) and without relevant abnormal clinical observation, thus were considered as non-adverse changes. J30-related histopathology findings were also observed in the heart, lung, gallbladder, stomach, pancreas, duodenum, ileum, cecum, colon, rectum, kidney, urinary bladder, ovary, epididymis, brain, sciatic nerve, tongue, cervix, uterus, vagina, or sternum bone, mainly characterized as minimal or mild mixed cell / mononuclear cell infiltration / inflammation or periarteritis. Minimal fibroplasia was found in the spleen and skin from one male dosed at 100 mg / kg.

[0211] On the recovery sacrifice, no J30-related macroscopic observations were noted, whilst microscopic observations including minimal mixed cell / mononuclear cell infiltration in the colon, brain and sciatic nerve, and minimal fibroplasia in the lung, liver, spleen and cervix were noted. J30-related hemorrhage and periarteritis were completely reversed after the recovery period. J30-related mixed cell / mononuclear cell infiltration / inflammation and fibroplasia were still noted in the recovery sacrifices, while the mixed cell / mononuclear cell infiltration / inflammation were considered as partially reversed due to lower incidences and less severe than the findings on terminal sacrifices. None of the aforementioned microscopic findings were considered as adverse changes.

[0212] Therefore, J30’s highest non-severely toxic dose (HNSTD)  / no-observed-adverse-effect level (NOAEL) were determined as more than 100 mg / kg.

[0213] Example 14: Pharmacodynamic (PD) activities of J30 in cynomolgus monkeys

[0214] In the GLP-compliant repeat-dose toxicity study of J30 in cynomolgus monkeys described in Example 13, the expression of activation (ICOS) and proliferation (Ki-67) biomarkers on CD4 and CD8 T cells were measured using flow cytometry (FCM) to evaluate T cell activation by J30.

[0215] On day 15, except for Ki-67+ CD8 T cells, an increase of ICOS+ CD4 / CD8 T cells and Ki-67+ CD4 T cells was observed in a dose-dependent manner. As shown in FIG. 11, the median %increase of ICOS+ CD8 T cells was 161.89%in 25 mg / kg group, 225.64%in 50 mg / kg group and 279.02%in 100 mg / kg group on day 15. The median %increase of ICOS+ CD4 T cells was 110.66%in 25 mg / kg group, 113.45%in 50 mg / kg group, and 138.92%in 100 mg / kg group on day 15. The median %increase of Ki-67+ CD4 T cells was 148.09%in 25 mg / kg group, 132.26%in 50 mg / kg group, and 229.60%in 100 mg / kg group on day 15. The increase of Ki-67+ CD8 T cells did not show a dose-dependent trend, possibly because it has already reached the plateau at 25 mg / kg. In conclusion, J30 dose-dependently induced T cell activation in cynomolgus monkeys.

[0216] TABLE 12. SEQUENCE INFORMATION

Claims

1.A trispecific antibody comprising a first antigen binding region that binds to PD1, a second antigen binding region that binds to CTLA4, and a third antigen binding region that binds to VEGFa, wherein the first antigen binding region comprises a first heavy chain variable region (VH) and a first light chain variable region (VL) , and wherein: the first VH comprises HCDRs 1-3 comprising the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 7, 8, and 9, respectively, and the first VL comprises LCDRs 1-3 comprising the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 10, 11, and 12, respectively.2.The trispecific antibody according to claim 1, wherein the first VH comprises an amino acid sequence having at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity to SEQ ID NO: 13, and the first VL comprises an amino acid sequence having at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity to SEQ ID NO: 14.3.The trispecific antibody according to claim 1 or 2, wherein the first antigen binding region is in a scFv format.4.The trispecific antibody according to any one of claims 1-3, wherein the second antigen binding region comprises a second VH and a second VL and is in a scFv format.5.The trispecific antibody according to any one of claims 1-4, wherein the third antigen binding region comprises a third VH and a third VL and is in a Fab format.6.The trispecific antibody according to any one of claims 1-5, wherein the first antigen binding region, the second antigen binding region are monovalent, and the third antigen binding region is bivalent.7.The trispecifc antibody according to any one of claims 1-6, wherein the trispecific antibody comprises two heavy chains and two light chains, wherein the two heavy chains comprise a heavy chain 1 and a heavy chain 2, the heavy chain 1 comprises the first antigen binding region in a scFv format at C-terminal, and the heavy chain 2 comprises the second antigen binding region in a scFv format at C-terminal.8.The trispecifc antibody according to claim 7, wherein each of the two heavy chains comprises a VH of the third antigen binding region at N-terminal, and each of the two light chains comprises a VL of the third antigen binding region at N-terminal.9.The trispecific antibody according to any one of claims 1-8, wherein the trispecific antibody further comprises a constant region comprising a CH3 region, preferably comprising a Fc region.10.The trispecific antibody according to claim 9, wherein the Fc region is of an isotype selected from the group consisting of IgG, IgA, IgM, IgE, and IgD.11.The trispecifc antibody according to claim 10, wherein the Fc region is of a subtype selected from the group consisting of IgG1, IgG2, IgG3, and IgG4.12.The trispecific antibody according to any one of claims 9-11, wherein the CH3 region comprises a knob-into-hole mutation.13.The trispecifc antibody according to any one of claims 1-12, wherein the second antigen binding region comprises a second VH and a second VL, and wherein the second VH comprise HCDRs 1-3 comprising the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 15, 16, and 17, respectively, and the second VL comprises LCDRs 1-3 comprising the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 18, 19, and 20, respectively.14.The trispecific antibody according to claim 13, wherein the second VH comprises an amino acid sequence having at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity to SEQ ID NO: 21, and the second VL comprises an amino acid sequence having at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity to SEQ ID NO: 22.15.The trispecifc antibody according to any one of claims 1-14, wherein the third antigen binding region comprises a third VH and a third VL, and wherein the third VH comprise HCDRs 1-3 comprising the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 23, 24, and 25, respectively, and the third VL comprises LCDRs 1-3 comprising the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 26, 27, and 28, respectively.16.The trispecific antibody according to claim 15, wherein the third VH comprises an amino acid sequence having at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity to SEQ ID NO: 29, and the third VL comprises an amino acid sequence having at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity to SEQ ID NO: 30.17.The trispecific antibody according to any one of claims 1-16, wherein the trispecific antibody comprises two heavy chains and two light chains, wherein a heavy chain 1 comprises the following from N-terminal to C-terminal: a VH of the third antigen binding region, a CH1 region, a Fc region, and the first antigen binding region in a scFv format; a heavy chain 2 comprises the following from N-terminal to C-terminal: a VH of the third antigen binding region, a CH1 region, a Fc region, and the second antigen binding region in a scFv format; and each of the two light chains comprises the following from N-terminal to C-terminal: a VL of the third binding region and a light chain constant region.18.The trispecific antibody according to any one of claims 1-17, wherein the trispecific antibody comprises two heavy chains and two light chains, wherein a heavy chain 1 comprises an amino acid sequence having at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity to SEQ ID NO: 32; a heavy chain 2 comprises an amino acid sequence having at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity to SEQ ID NO: 33; and each of the two light chains comprises an amino acid sequence having at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity to SEQ ID NO: 31.19.A nucleic acid encoding the trispecifc antibody according to any one of claims 1-18.20.A vector comprising the nucleic acid according to claim 19.21.A host cell comprising the nucleic acid according to claim 19 or the vector according to claim 20.22.A pharmaceutical composition comprising the trispecifc antibody according to any one of claims 1-18, and optionally at least a pharmaceutically acceptable carrier or excipient.23.The pharmaceutical composition according to claim 22, wherein the pharmaceutical composition further comprises a second therapeutic agent, optionally the second therapeutic agent is selected from the group consisting of an antibody, a chemotherapeutic agent, an siRNA, an antisense oligonucleotide, a polypeptide, and a small molecule drug.24.A method of treating a disease comprising administering to a subject an effective amount of the trispecific antibody according to any one of claims 1-18, or the pharmaceutical composition according to claims 22 or 23.25.The method according to claim 24, wherein the disease is a cancer, preferably a solid tumor.26.The method according to claim 24 or 25, wherein the solid tumor is selected from the group consisting of colon cancer, carcinoma of the rectum and colon, prostate cancer, breast cancer, lung cancer, small cell lung cancer, non-small cell lung cancer, liver cancer, hepatocellular carcinoma, gastric cancer, renal cancer, kidney cancer, renal cell carcinoma, cervical cancer;ovarian cancer;and endometrial cancer.

Images