Composition and method for cancer treatment using polypeptide conjugates

Abstract

Provided herein are recombinant polypeptides comprising: (a) an antibody; and (b) a multimerization domain, wherein the antibody is operably linked to the multimerization domain. Provided also relates to methods of administering the recombinant polypeptides during pre-targeted radioimmunotherapy totreat cancer in a subject in need thereof.

Description

COMPOSITION AND METHOD FOR CANCER TREATMENT USING POLYPEPTIDE CONJUGATESCROSS-REFERENCE TO RELATED APPLICATIONS

[0001] This application claims priority to International Application No. PCT / CN2024 / 129953, filed on November 5, 2024, the contents of which is incorporated by reference herein in its entirety for all purposes.INCORPORATION OF THE SEQUENCE LISTING

[0002] The contents of the electronic sequence listing (SUZS_001_00WO_SeqList_ST26. xml; Size: 109, 438 bytes; and Date of Creation: October 30, 2025) are herein incorporated by reference in its entirety.FIELD OF THE DISCLOSURE

[0003] The present disclosure relates generally to multi-specific polypeptide complexes that bind a target-specific antigen and a radionuclide. Additionally, disclosed herein are methods of utilizing the multi-specific polypeptide complexes in pre-targeted radioimmunotherapy to treat cancer.BACKGROUND

[0004] Pre-targeting technology can be used for radioactive imaging and treatments, and functions by generally employing a multi-specific polypeptide complex that binds a tumor-associated antigen and a radionuclide. A notable limitation of current methods is that while the target tumor of interest becomes highly enriched with the multiple-specific polypeptide complex, there is also off-target tissue toxicity. It would be desirable to generate novel multi-specific polypeptide complexes that not only enhance enrichment of the tumor but are also capable of reducing the radiotoxicity of non-target organs. The present disclosure provides compositions and methods related to a cancer treatment using such novel multi-specific polypeptides.BRIEF SUMMARY

[0005] In one aspect, the disclosure provides a composition comprising a recombinant polypeptide comprising: (a) an antibody; and (b) a multimerization domain, wherein the antibody is operably linked to the multimerization domain. In some embodiments, the multimerization domain is adapted to bind one or more molecules of the recombinant polypeptide to form a multimer of the recombinant polypeptide. In some embodiments, the multimerization domain is adapted to bind the multimerization domain of the one or more other molecules of the recombinant polypeptide. In some embodiments, the binding of the multimerization domain to the one or more other molecules is non-covalent binding.

[0006] In some embodiments, the multimerization domain comprises 7 consecutive amino acids, wherein at least 2 amino acids of the 7 consecutive amino acids are hydrophobic amino acids. In some embodiments, the 7 consecutive amino acids are X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7, wherein X2 and X5 are hydrophobic amino acids. In some embodiments, X1, X3, X4, X6, and X7 are hydrophobic or polar amino acids. In some embodiments, X1 is a polar amino acid. In some embodiments, X1, X3, X4, X6 are selected from the group consisting of alanine, glutamine, lysine, glutamic acid, histidine, aspartic acid, and arginine. In some embodiments, the hydrophobic amino acids are selected from the group consisting of alanine, isoleucine, leucine, methionine, phenylalanine, tryptophan, tyrosine, and valine. In some embodiments, the polar amino acids are selected from the group consisting of serine, threonine, asparagine, histidine, lysine, aspartic acid, glutamic acid and glutamine. In some embodiments, X2 and X5 are leucine or isoleucine. In some embodiments, X2 and X5 are both isoleucine (I) . In some embodiments, X3 and X4 are selected from the group consisting of alanine, arginine, histidine, lysine, aspartic acid, and glutamic acid. In some embodiments, X3 and X4 are polar charged amino acids having opposite charges. In some embodiments, X3 and X4 are histidine (H) and aspartic acid (D) , respectively. In some embodiments, X2 is leucine (L) and X5 is isoleucine (I) . In some embodiments, X3 and X4 are lysine (K) and glutamic acid (E) , respectively.

[0007] In some embodiments, X1 and X6 are selected from the group consisting of glutamine, arginine, histidine, lysine, aspartic acid, and glutamic acid. In some embodiments, both X1 and X6 are glutamine. In some embodiments, X1 is glutamic acid (E) and X6 is lysine (K) . In some embodiments, In some embodiments, X7 is glutamine, lysine, tryptophan or serine. In some embodiments, X7 is lysine. In some embodiments, X7 is glutamine.

[0008] In some embodiments, the multimerization domain comprises two or more copies of the 7 consecutive amino acids. In some embodiments, the multimerization domain comprises four or five of the segments of the 7 consecutive amino acids. In some embodiments, the segments are located consecutively in the multimerization domain, without any additional amino acid in between.

[0009] In some embodiments, the multimerization domain comprises an amino acid sequence that is at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 99%, or 100%identical to any one of SEQ ID NOs: 1-60. In some embodiments, the multimerization domain comprises any one of SEQ ID NOs: 1-60, or an amino acid sequence having at most 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10 mutations (insertions, deletions, and / or substitutions) thereto. In some embodiments, the multimerization domain comprises (a) SEQ ID NO: 54 or 60, or an amino acid sequence having at most 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10 mutations (insertions, deletions, and / or substitutions) thereto, or (b) SEQ ID NO: 2 or 10, or an amino acid sequence having at most 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10 mutations (insertions, deletions, and / or substitutions) thereto. In some embodiments, the multimerization domain comprises SEQ ID NO: 48, or an amino acid sequence having at most 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10 mutations (insertions, deletions, and / or substitutions) thereto.

[0010] In some embodiments, at least one of the segments has the amino acid sequence of any one of SEQ ID NO: 76-118. In some embodiments, the first segment, the second segment, the third segment, the fourth segment, and / or optionally the fifth segment, of the multimerization domain has the amino acid sequence of any one of SEQ ID NO: 76-118. In some embodiments, the multimerization domain comprises glutamine (Q) at one or more positions corresponding to amino acid positions 7, 14, 21, and 28 of SEQ ID NO: 48. In some embodiments, the amino acids corresponding to amino acid positions 24-25 of SEQ ID NO: 48 are polar charged amino acids having opposite charges. In some embodiments, the amino acids corresponding to amino acid positions 31-32 of SEQ ID NO: 48 are polar charged amino acids having opposite charges. In some embodiments, the polar charged amino acids having opposite charges are histidine (H) and aspartic acid (D) . In some embodiments, the recombinant polypeptide comprises lysine (K) at amino acid position 14 and tryptophan (W) at amino acid position 21, according to SEQ ID NO: 48.

[0011] In some embodiments, the multimerization domain comprises 3 or more alpha helices. In some embodiments, the multimerization domain comprises 3 to 7 alpha helices. In some embodiments, the multimerization domain forms a trimer, tetramer, pentamer or hexamer of the recombinant polypeptide. In some embodiments, the antibody is humanized. In some embodiments, the antibody is a single-domain antibody (sdAb) , a single chain variable fragment (scFv) , a bi-specific scFvs (bi-scFvs or di-scFvs) having the format (scFv) 2, or a diabody; optionally, the antibody is a scFv. In some embodiments, the antibody does not comprise a fragment crystallizable region (Fc region) . In some embodiments, the antibody does not comprise a constant domain.

[0012] In some embodiments, the antibody is a bi-specific antibody. In some embodiments, the bi-specific antibody comprises an antibody fragment selected from a Fab, F (ab′) 2, Fab′, scFv, single domain antibody (sdAb) , and affibody. In some embodiments, the antibody comprises a tumor-associated antigen binding domain. In some embodiments, the tumor-associated antigen binding domain comprises an anti-GD2, anti-GPA33, anti-HER2, anti-CAIX, anti-PSMA, anti-tag-72, anti-CD38, anti-B7H3, anti-CEA, anti-TROP2, anti-EGFR, anti-CDH17, anti-EPCAM, anti-STEAP1 binding domain, or any combination thereof. In some embodiments, the tumor-associated antigen binding domain comprises a GD2 binding domain. In some embodiments, the tumor-associated antigen binding domain comprises a HER2 binding domain. In some embodiments, the tumor-associated antigen binding domain comprises a CAIX binding domain.

[0013] In some embodiments, the bi-specific antibody comprises a second binding domain. In some embodiments, the second binding domain binds to a small molecule or small molecule hapten. In some embodiments, the small molecule comprises a DOTA (1, 4, 7, 10-tetraazacyclododecane-1, 4, 7, 10-tetraacetic acid) , DOTA-Bn (phenyl-1, 4, 7, 10-tetraazacyclododecane-1, 4, 7, 10-tetraacetic acid) , DTPA (Diethylenetriaminepentaacetic acid) , EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid) , NODAGA (1, 4, 7-triazacyclononane-1, 4-diacetic acid) , NETA (N, N, N', N'-tetraacetylated 1, 4, 7, 10-tetraazacyclododecane) , Cyclen (1, 4, 7, 10-tetraazacyclododecane) , Cyclam (1, 4, 8, 11-tetraazacyclotetradecane) , Bispidine (2, 2'-bispidine) , TACN (1, 4, 7-triazacyclononane) , ATSM (diacetyl-bis (N4-methylthiosemicarbazone) , SarAr (sarcosine-derived arylamine) , AmBaSar (aminobenzylsarcosine) , MAG3 (mercaptoacetyltriglycine) , MAG2 (mercaptoacetyltriglycine) , HYNIC (6-hydroxy-2, 2'-bipyridine) , DADT (diacetyl-di (N4-methylthiosemicarbazone) , EC (ethanolamine) , TRAP (3-aminopyridine-2-carboxaldehyde thiosemicarbazoneis) , NS3 (N-succinimidyl-3- (tri-n-butylstannyl) propionate) , H2dedpa (N, N'-diethyl-N, N'-di (2-pyridyl) ethylenediamine) , HBED (N, N'-bis (2-hydroxybenzyl) ethylenediamine-N, N'-diacetic acid) , DFO (deferoxamine) , PEPA (N-phenyl-N'- (2-ethoxyethyl) urea) , HEHA (N, N, N', N'-tetra (2-hydroxyethyl) ethylenediamine) , a derivative thereof, or any combination thereof. In some embodiments, the small molecule is selected from the group consisting or DTPA, EDT, NOTA, DOTA, DOTA-Bn, TRAP, TETA, NETA, CB-TE2A, Cyclen, Cyclam, Bispidine, TACN, ATSM, SarAr, AmBaSar, MAG3, MAG2, HYNIC, DADT, EC, NS3, H2dedpa, HBED, DFO, PEPA, HEHA, a derivative thereof, and any combination thereof.

[0014] In some embodiments, the small molecule hapten comprises a DOTA-hapten selected from the group consisting of DOTA, Proteus-DOTA, DOTA-Bn, DOTA-desferrioxamine, DOTA-Phe-Lys (histamine-succinyl-glycine (HSG) ) -D-Tyr-Lys (HSG) -NH2, Ac-Lys (HSG) D-Tyr-Lys (HSG) -Lys (Tscg-Cys) -NH2, DOTA-D-Asp-D-Lys (HSG) -D-Asp-D-Lys (HSG) -NH2, DOTA-D-Glu-D-Lys (HSG) -D-Glu-D-Lys (HSG) -NH2, DOTA-D-Tyr-D-Lys (HSG) -D-Glu-D-Lys (HSG) -NH2, DOTA-D-Ala-D-Lys (HSG) -D-Glu-D-Lys (HSG) -NH2, DOTA-D-Phe-D-Lys (HSG) -D-Tyr-D-Lys (HSG) -NH2, Ac-D-Phe-D-Lys (DOTA) -D-Tyr-D-Lys (DOTA) -NH2, Ac-D-Phe-D-Lys (DTPA) -D-Tyr-D-Lys (DTPA) -NH2, Ac-D-Phe-D-Lys (Bz-DTPA) -D-Tyr-D-Lys (Bz-DTPA) -NH2, Ac-D-Lys (HSG) -D-Tyr-D-Lys (HSG) -D-Lys (Tscg-Cys) -NH2, DOTA-D-Phe-D-Lys (HSG) -D-Tyr-D-Lys (HSG) -D-Lys (Tscg-Cys) -NH2, (Tscg-Cys) -D-Phe-D-Lys (HSG) -D-Tyr-D-Lys (HSG) -D-Lys (DOTA) -NH2, Tscg-D-Cys-D-Glu-D-Lys (HSG) -D-Glu-D-Lys (HSG) -NH2, (Tscg-Cys) -D-Glu-D-Lys (HSG) -D-Glu-D-Lys (HSG) -NH2, Ac-D-Cys-D-Lys (DOTA) -D-Tyr-D-Ala-D-Lys (DOTA) -D-Cys-NH2, Ac-D-Cys-D-Lys (DTPA) -D-Tyr-D-Lys (DTPA) -NH2, Ac-D-Lys (DTPA) -D-Tyr-D-Lys (DTPA) -D-Lys (Tscg-Cys) -NH2, and Ac-D-Lys (DOTA) -D-Tyr-D-Lys (DOTA) -D-Lys (Tscg-Cys) -NH2, and any combination thereof.

[0015] In some embodiments, the small molecule is phenyl-1, 4, 7, 10-tetraazacyclododecane-1, 4, 7, 10-tetraacetic acid ( [metal] -DOTA-Bn) . In some embodiments, the second binding domain is a single-domain antibody (sdAb) , a single chain variable fragment (scFv) , a bi-specific scFvs (bi-scFvs or di-scFvs) having the format (scFv) 2, or a diabody; optionally, the second binding domain is a scFv. In some embodiments, the multimerization domain is operably linked to the N-terminus of the heavy or light chain or the C-terminus of the heavy chain of the antibody, or the N-terminus or the C-terminus of the antibody. In some embodiments, the recombinant polypeptide comprises, from N-term to C-term, the tumor-associated antigen binding domain, the second binding domain, and the multimerization domain. In some embodiments, the recombinant polypeptide comprises, from N-term to C-term, the second binding domain, the tumor-associated antigen binding domain, and the multimerization domain. In some embodiments, the recombinant polypeptide comprises a linker between a first binding domain of the antibody (e.g., the tumor-associated antigen binding domain) , and the second binding domain. In some embodiments, the recombinant polypeptide comprises a linker between (i) the multimerization domain and (ii) a first binding domain of the antibody (e.g., the tumor-associated antigen binding domain) or the second binding domain.

[0016] In some embodiments, the small molecule (e.g., [metal] -DOTA-Bn) is radioactive or comprises a radioactive metal. In some embodiments, the radioactive metal (e.g., in [metal] -DOTA-Bn) is selected from the group consisting of gallium-68 (Ga-68) , yttrium-90 (Y-90) , yttrium-86 (Y-86) , indium-111 (In-111) , lutetium-177 (Lu-177) , technetium-99m (Tc-99m) , iodine-131 (I-131) , fluorine-18 (F-18) , copper-64 (Cu-64) , zirconium-89 (Zr-89) , lead-203 (Pb-203) , lead-212 (Pb-212) , strontium-89 (Sr-89) , actinium-225 (Ac-225) , bismuth-213 (Bi-213) , astatine-211 (At-211) , dysprosium-152 (Dy-152) , bismuth-212 (Bi-212) , radium-223 (Ra-223) , radon-219 (Rn-219) , polonium-215 (Po-215) , bismuth-211 (Bi-211) , francium-221 (Fr-221) , astatine-217 (At-217) , fermium-255 (Fm-255) , dysprosium-165 (Dy-165) , rhenium-186 (Re-186) , rhenium-188 (Re-188) , copper-67 (Cu-67) , and terbium-161 (Tb-161) .

[0017] In some embodiments, the recombinant polypeptide has increased affinity to a target antigen in comparison to a reference polypeptide, wherein the reference polypeptide has no multimerization domain and is otherwise identical to the recombinant polypeptide. In some embodiments, the recombinant polypeptide has reduced non-specific binding to a target antigen in comparison to a reference polypeptide, wherein the reference polypeptide has no multimerization domain and is otherwise identical to the recombinant polypeptide. In some embodiments, the recombinant polypeptide has increased renal clearance in a subject in comparison to a reference polypeptide, wherein the reference polypeptide has no multimerization domain and is otherwise identical to the recombinant polypeptide. In some embodiments, the recombinant polypeptide has higher tumor uptake in a subject in comparison to a reference polypeptide, wherein the reference polypeptide has no multimerization domain and is otherwise identical to the recombinant polypeptide. In some embodiments, the recombinant polypeptide has reduced blood half-life in a subject in comparison to a reference polypeptide, wherein the reference polypeptide. In some embodiments, the reference polypeptide has no multimerization domain and is otherwise identical to the recombinant polypeptide. In some embodiments, the multimerization domain is replaced by a sequence comprising SEQ ID NO: 119 or 120 in the reference polypeptide, and the reference polypeptide is otherwise identical to the recombinant polypeptide.

[0018] In another aspect, the disclosure provides a conjugate comprising: two or more molecules of the recombinant bind to form a multimer of the recombinant polypeptide. In some embodiments, the conjugate comprises a trimer, tetramer, pentamer or hexamer of the recombinant polypeptide. In some embodiments, the conjugate comprises a radioactive metal.

[0019] In another aspect, the disclosure provides an isolated nucleic acid encoding the recombinant polypeptide described herein.

[0020] In another aspect, the disclosure provides an expression vector comprising a nucleic acid segment encoding the recombinant polypeptide described herein.

[0021] In another aspect, the disclosure provides a recombinant host cell comprising the expression vector described herein, or the nucleic acid described herein.

[0022] In another aspect, the disclosure provides a method comprising administering to a subject in need thereof: the recombinant polypeptide, the conjugate, the isolated nucleic acid, the expression vector, or the recombinant host cell. In some embodiments, the method further comprises clearing unbounded recombinant polypeptide from the subject. In some embodiments, the method further comprises administering a small molecule after the recombinant polypeptide is administered to the subject. In some embodiments, the small molecule is administered about 1 hour to about 168 hours after the recombinant polypeptide is administered to the subject. In some embodiments, the small molecule is administered about 48 hours after the recombinant polypeptide is administered to the subject. In some embodiments, the small molecule is radioactive. In some embodiments, the radioactive small molecule comprises [metal] -DOTA-Bn. In some embodiments, the radioactive metal in [metal] -DOTA-Bn is selected from the group consisting of Ga-68, Y-90, Y-86, Cu-64, Pb-203, In-111, Lu-177, Tc-99m, I-131, F-18, Sr-89, Ra-223, Ac-225, Pb-212, Cu-67, and Tb-161. In some embodiments, the method is for treating cancer. In some embodiments, the cancer is selected from the group consisting of neuroblastoma, melanoma, brain tumor, osteosarcoma, breast cancer, liposarcoma, fibrosarcoma, malignant fibrous histiocytoma, leiomyosarcoma, spindle cell sarcoma, retinoblastoma, brain tumor, small cell lung cancer, glioma, soft tissue sarcoma, bladder cancer, colorectal cancer and prostate tumor.BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

[0023] The accompanying figures, which are incorporated herein and form a part of the specification, illustrate some, but not the only or exclusive, example embodiments and / or features. It is intended that the embodiments and figures disclosed herein are to be considered illustrative rather than limiting.

[0024] FIG. 1 shows a sequence alignment comparing the different components of a control conjugate hu3F8-C825-P53 (SEQ ID NO: 61) and a newly generated conjugate hu3F8-C825-Tet-HD-5 (SEQ ID NO: 62) .

[0025] FIGs. 2A-2B show SEC-MALS analyses of the hu3F8-C825-Tet-HD-5 (SEQ ID NO: 62) (FIG. 2A) and hu3F8-C825-P53 (SEQ ID NO: 61) (FIG. 2B) conjugates.

[0026] [Rectified under Rule 91, 22.01.2026]FIGs. 3A-3B show the binding affinity of the newly generated hu3F8-C825-MD conjugates with GD2 antigen. FIG. 3A shows a summary of a FACS cell-based activity assessment of the generated hu3F8-C825-MD conjugates compared to a control hu3F8-C825-P53 conjugate. The corresponding data lines of the samples are ordered top to bottom according to the sample name. FIG. 3B shows a IMR32 cell binding curve comparing the binding affinity of hu3F8-C825-Tet-HD-5 (SEQ ID NO: 62) to a control hu3F8-C825-P53 (SEQ ID NO: 61) conjugate.

[0027] FIG. 4 shows a blood pharmacokinetic profile of blood radio-uptake (%D / g) of hu3F8-C825-Tet-HD-5 (SEQ ID NO: 62) conjugate compared to hu3F8-C825-P53 (SEQ ID NO: 61) in tumor-free ICR mice.

[0028] FIG. 5 shows an ELISA-based pharmacokinetic profile of hu3F8-C825-Tet-HD-5 (SEQ ID NO: 62) compared to a control hu3F8-IgG construct in a rat model.

[0029] FIGs. 6A-6C show the effect of a pre-targeted dose of the hu3F8-C825-Tet-HD-5 (SEQ ID NO: 62) conjugate (FIG. 6A) , dosing intervals (FIG. 6B) , and different doses of nuclide (FIG. 6C) on the distribution of hu3F8-C825-Tet-HD-5 conjugate in vivo.

[0030] FIG. 7 shows a blood pharmacokinetic profile of pre-targeted hu3F8-C825-MD conjugates compared to a hu3F8-C825-P53 control conjugate in tumor-bearing mice.

[0031] [Rectified under Rule 91, 22.01.2026]FIGs. 8A-8H shows the biodistribution of select hu3F8-C825-MD conjugates enriched in various organs. For each group of columns in FIGs. 8A-8H, the columns from left to right are ordered according to the sample labels from top to bottom. The select hu3F8-C825-MD conjugates including hu3F8-C825-Tet-K21 (FIG. 8A) , hu3F8-C825-Tet-HD-5 (FIG. 8B) , hu3F8-C825-Tet-KE-5 (FIG. 8C) , hu3F8-C825-Tet-QQ-5 (FIG. 8D) , hu3F8-C825-Tet-3K (FIG. 8E) , hu3F8-C825-Tri-4K (FIG. 8F) , and hu3F8-C85-Tet-KHD-5 (FIG. 8G) were compared to a control hu3F8-C825-P53 (FIG. 8H) .

[0032] FIGs. 9A-9H shows representative images of in vivo biodistribution of select hu3F8-C825-MD conjugates. The select hu3F8-C825-MD conjugates including hu3F8-C825-Tet-K21 (FIG. 9A) , hu3F8-C825-Tet-HD-5 (FIG. 9B) , hu3F8-C825-Tet-KE-5 (FIG. 9C) , hu3F8-C825-Tet-QQ-5 (FIG. 9D) , hu3F8-C825-Tet-3K (FIG. 9E) , hu3F8-C825-Tri-4K (FIG. 9F) , and hu3F8-C85-Tet-KHD-5 (FIG. 9G) were compared to a control hu3F8-C825-P53 (FIG. 9H) .

[0033] FIG 10. shows the tumor uptake of select pre-targeted hu3F8-C825-MD conjugates in tumor-bearing mice.

[0034] [Rectified under Rule 91, 22.01.2026]FIG. 11 shows the ex-vivo biodistribution of pre-targeted hu3F8-C825-MD antibody in tumor-bearing mice across various organs. For each group of columns in FIG. 11, the columns from left to right are ordered according to the sample labels from top to bottom.

[0035] FIGs. 12A-12D shows the therapeutic efficacy of a hu3F8-C825-Tet-HD-5 (SEQ ID NO: 62) conjugate pre-targeted radioimmunotherapy (PRIT) regimen as demonstrated by tumor growth curves (FIG. 12A) , body weight (FIG. 12B) , tumor inhibition rates (FIG. 12C) , and survival curves (FIG. 12D) .

[0036] FIGs. 13A-13C show the individual tumor growth profiles in response to hu3F8-C825-MD antibody PRIT treatment for hu3F8-C825-Tet-HD-5 (SEQ ID NO: 62) (FIG. 13A) , 177Lu-DOTA-Bn Control (FIG. 13B) and NS Control (FIG. 13C) .

[0037] FIG. 14 shows the assessment of serum ADA levels in mice pre-and post-immunization with hu3F8-C825-Tet-HD-5 (SEQ ID NO: 62) .

[0038] [Rectified under Rule 91, 22.01.2026]FIG. 15 shows a summary of a FACS cell-based activity assessment of the generated HYE32-C825-MD conjugates compared to a control HYE32-C825-P53 conjugate. The corresponding data lines of the samples are ordered top to bottom according to the sample name.

[0039] [Rectified under Rule 91, 22.01.2026]FIGs. 16A-16B show the in vivo biodistribution of select HYE32-C825-MD conjugates. FIG. 16A shows representative images of in vivo biodistribution 1 hour post-dosing with select HYE32-C825-MD conjugates compared to a control HYE32-C825-P53 conjugate. FIG. 16B shows a quantified in vivo biodistribution 1 hour post-dosing with select HYE32-C825-MD conjugates compared to a control HYE32-C825-P53 conjugate. For each group of columns in FIG. 16B, the columns from left to right are ordered according to the sample labels from top to bottom.

[0040] [Rectified under Rule 91, 22.01.2026]FIG. 17 shows the uptake of HYE32-C825-Tet-HD-5 followed by 177Lu in various organs. For each group of columns in FIG. 17, the columns from left to right are ordered according to the sample labels from top to bottom.DETAILED DESCRIPTION

[0041] All publications, patents, and patent applications, including any drawings and appendices, are herein incorporated by reference to the same extent as if each individual publication or patent application was specifically and individually indicated to be incorporated by reference.

[0042] The following description includes information that may be useful in understanding the present disclosure. It is not an admission that any of the information provided herein is prior art or relevant to the presently claimed disclosures, or that any publication specifically or implicitly referenced is prior art.Definitions

[0043] The term “a” or “an” refers to one or more of that entity, i.e. can refer to plural referents. As such, the terms “a, ” “an, ” “one or more, ” and “at least one” are used interchangeably herein. In addition, reference to “an element” by the indefinite article “a” or “an” does not exclude the possibility that more than one of the elements is present, unless the context clearly requires that there is one and only one of the elements.

[0044] The term “about” refers to a value that includes the inherent variation of error for the device or the method being employed to determine the value, or the variation that exists among the samples being measured. Unless otherwise stated or otherwise evident from the context, the term “about” means within 10%above or below the reported numerical value (except where such number would exceed 100%of a possible value or go below 0%) . When used in conjunction with a range or series of values, the term “about” applies to the endpoints of the range or each of the values enumerated in the series, unless otherwise indicated. As used in this application, the terms “about” and “approximately” are used as equivalents.

[0045] The term “antibody” refers to a binding protein having at least one antigen binding domain. The antibodies of the present invention may be whole antibodies or any fragment thereof. Thus, the antibodies of the invention include monoclonal antibodies or fragments thereof, and antibody variants or fragments thereof, as well as immunoconjugates. Antigen binding fragments include Fab fragments, Fab' fragments, F (ab') 2 fragments, bispecific Fab dimers (Fab2) , trispecific Fab trimers (Fab3) , Fv, single chain Fv proteins ( “scFv” ) , bis-scFv, (scFv) 2, minibodies, diabodies, triabodies, tetrabodies, disulfide stabilized Fv proteins ( “dsFv” ) , single-domain antibodies (sdAb, nanobody) , heavy-chain only antibodies (e.g., camelid VHH, camelid nanobody, shark Ig NAR) , affibodies, and portions of full length antibodies responsible for antigen binding. An isolated antibody or antigen binding fragment thereof is one which has been identified and separated and / or recovered from a component of its natural environment.

[0046] In some embodiments, the antibodies are isolated antibodies. Thus, the present invention provides isolated antibodies, and nucleic acids encoding such antibodies, as well as compositions comprising such isolated antibodies and nucleic acids. The term “isolated” refers to a compound of interest (e.g., an antibody or nucleic acid) that has been separated from its natural environment. The present invention further provides pharmaceutical compositions comprising the isolated antibodies, or nucleic acids encoding such antibodies, and further comprising one or more pharmaceutically acceptable carrier. Pharmaceutically acceptable carriers include, for example, excipients, diluents, encapsulating materials, fillers, buffers, or other agents.

[0047] The term “derived” refers to a molecule or polypeptide relative to a reference antibody or other binding protein, means a molecule or polypeptide that is specific for, and capable of binding to, the same epitope as the reference antibody or other binding protein.

[0048] The term “epitope” refers to any determinant capable being bound by an antigen binding protein, such as an antibody. An epitope is a region of an antigen that is bound by an antigen binding protein that targets that antigen, and when the antigen is a protein, includes specific amino acids that directly contact the antigen binding protein. Most often, epitopes reside on proteins, but in some instances can reside on other kinds of molecules, such as nucleic acids. Epitope determinants can include chemically active surface groupings of molecules such as amino acids, sugar side chains, phosphoryl or sulfonyl groups, and can have specific three dimensional structural characteristics, and / or specific charge characteristics. Generally, antibodies specific for a particular target antigen will preferentially recognize an epitope on the target antigen in a complex mixture of proteins and / or macromolecules. Antibody epitopes may be linear or conformational. In embodiments, the epitope provided herein is a linear epitope.

[0049] The term “expression vector” refers to a nucleic acid molecule, linear or circular, comprising one or more expression units. In addition to one or more expression units, an expression vector can also include additional nucleic acid segments such as, for example, one or more origins of replication or one or more selectable markers. Expression vectors are generally derived from plasmid or viral DNA, or can contain elements of both.

[0050] The term “humanized” refers to a process of making an antibody or immunoglobulin binding proteins and polypeptides derived from a non-human species (e.g., mouse or rat) less immunogenic to humans, while still retaining antigen-binding properties of the original antibody, using genetic engineering techniques. In some embodiments, the binding domain (s) of an antibody or immunoglobulin binding proteins and polypeptides (e.g., light and heavy chain variable regions, Fab, scFv) are humanized. Knowledge about humanized antibodies in the art is applicable to the polypeptides according to the present disclosure.

[0051] The term “heavy chain” refers to a full-length heavy chain and fragments thereof having sufficient variable region sequence to confer binding specificity. A full-length heavy chain includes a variable region domain, three constant region domains, CH1, CH2, and CH3. The variable heavy domain is at the amino-terminus of the polypeptide, and the CH domains are at the carboxyl-terminus, with the CH3 being closest to the carboxy-terminus of the polypeptide. Heavy chains can be of any isotype, including IgG (including IgG1, IgG2, IgG3 and IgG4 subtypes) , IgA (including IgA1 and IgA2 subtypes) , IgM and IgE. The term “isotype” refers to the antibody class encoded by the heavy chain constant region genes.

[0052] The term “host cell” refers to a cell that has been transformed, or is capable of being transformed, with a nucleic acid sequence and thereby expresses a gene of interest. The term includes the progeny of the parent cell, whether or not the progeny is identical in morphology or in genetic make-up to the original parent cell, so long as the gene of interest is present.

[0053] The term “identity” refers to a relationship between the sequences of two or more polypeptide molecules or two or more nucleic acid molecules, as determined by aligning and comparing the sequences. “Percent identity, ” “percent homology, ” “sequence identity, ” or “sequence homology” and the like mean the percent of identical residues between the amino acids or nucleotides in the compared molecules and is calculated based on the size of the smallest of the molecules being compared. For these calculations, gaps in alignments (if any) are preferably addressed by a particular mathematical model or computer program (i.e., an “algorithm” ) . Methods that can be used to calculate the identity of the aligned nucleic acids or polypeptides include those described in Computational Molecular Biology, (Lesk, A.M., ed. ) , 1988, New York: Oxford University Press; Biocomputing Informatics and Genome Projects, (Smith, D.W., ed. ) , 1993, New York: Academic Press; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, (Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds. ) , 1994, New Jersey: Humana Press; von Heinje, G., 1987, Sequence Analysis in Molecular Biology, New York: Academic Press; Sequence Analysis Primer, (Gribskov, M. and Devereux, J., eds. ) , 1991, New York: M. Stockton Press; and Carillo et al., 1988, SIAM J. Applied Math. 48: 1073. In calculating percent identity, the sequences being compared are typically aligned in a way that gives the largest match between the sequences.

[0054] The term “light chain” refers to a full-length light chain and fragments thereof having sufficient variable region sequence to confer binding specificity. A full-length light chain includes a variable region domain and a constant region domain. The variable region domain of the light chain is at the amino-terminus of the polypeptide. Light chains include kappa chains and lambda chains.

[0055] The term “linker” generally refers to a short polypeptide sequence connecting two sub-domains of a polypeptide. Non-limiting examples of linkers include flexible linkers comprising glycine-serine repeats, and linkers derived from (a) an interdomain region of a transmembrane protein (e.g., a type I transmembrane protein) ; (b) a stalk region of a type II C-lectin; or (c) an immunoglobulin hinge. In some embodiments, a linker provides a spacer function compatible with interaction of the two sub-binding domains so that the resulting polypeptide retains a specific binding affinity to the same target molecule as an antibody that comprises the same light and heavy chain variable regions. In some embodiments, the linker connects two or more binding domains (e.g., the tumor-associated antigen domain and the small molecule domain) and is referred to herein as a “binding domain linker” . In some embodiments, the linker connects a VH region of an scFv and a VL region of an scFv and is referred to herein as a “scFv linker” . In some embodiments, the linker connects a VH region of an scFv and a VL region of an scFv and is referred to herein as a “scFv linker” .

[0056] The term “multi-specific polypeptide complex” refers to a polypeptide comprising two or more binding domains each capable of specifically binding to a target antigen. For example, the polypeptides described herein may comprise 2, 3, 4, or more binding domains and may be able to bind 2, 3, 4, or more target antigens. In some embodiments, the multi-specific polypeptide complex is a bispecific polypeptide. Herein, a “bispecific polypeptide” comprises two binding domains each capable of binding to two distinct target antigens.

[0057] The term “sequence identity” refers to the extent to which two optimally aligned polynucleotides or polypeptide sequences are invariant throughout a window of alignment of residues, e.g. nucleotides or amino acids. An “identity fraction” for aligned segments of a test sequence and a reference sequence is the number of identical residues which are shared by the two aligned sequences divided by the total number of residues in the reference sequence segment, i.e. the entire reference sequence or a smaller defined part of the reference sequence. “Percent identity” is the identity fraction times 100. Comparison of sequences to determine percent identity can be accomplished by a number of well-known methods, including for example by using mathematical algorithms, such as, for example, those in the BLAST suite of sequence analysis programs. Unless noted otherwise, the term “sequence identity” in the claims refers to sequence identity as calculated by Clustal using default parameters.

[0058] The term “specific for” may mean that the antibody does not bind to the target due to only non-specific interactions, and this property can be determined by comparison to an isotype control or similar. Specific binding does not necessarily require, although it may include, exclusive binding to a single target.

[0059] The term “subject” refers to any subject, e.g., a human or a non-human mammal, for whom diagnosis, prognosis, or therapy is desired. The term “subject” may mean a human or non-human mammal affected, likely to be affected, or suspected to be affected with a disease. The terms “subject” and “patient” are used interchangeably herein. In some embodiments, a subject is a mammal. A mammal includes primates, such as humans, monkeys, chimpanzee, and apes, and non-primates such as domestic animals, including laboratory animals (such as rabbits and rodents, e.g., guinea pig, rat, or mouse) and household pets and farm animals (e.g., cats, dogs, swine, cattle, sheep, goats, horses, rabbits) , and non-domestic animals, such as wildlife, birds, reptile, fish, or the like.

[0060] The term “variant” of a polypeptide (e.g., an antigen binding protein, or an antibody) comprises an amino acid sequence wherein one or more amino acid residues are inserted into, deleted from and / or substituted into the amino acid sequence relative to another polypeptide sequence. Variants include antibodies that have a recited percent identity to an antibody or fragment provided herein or to an antibody or fragment having a recited DNA or amino acid sequence.

[0061] The term “variable region” or “variable domain” refers to a portion of the light and / or heavy chains of an antibody, typically including approximately the amino-terminal 120 to 130 amino acids in the heavy chain and about 100 to 110 amino terminal amino acids in the light chain. In certain embodiments, variable regions of different antibodies differ extensively in amino acid sequence even among antibodies of the same species. The variable region of an antibody typically determines specificity of a particular antibody for its target. The term “target, ” as used herein, refers to a molecule or a portion of a molecule capable of being bound by an antigen binding protein. In certain embodiments, a target can have one or more epitopes. In certain embodiments, a target is an antigen. The use of “antigen” in the phrase “antigen binding protein” simply denotes that the protein sequence that comprises the antigen can be bound by an antibody. In this context, it does not require that the protein be foreign or that it be capable of inducing an immune response.

[0062] All ranges disclosed herein include both end points as discrete values, as well as all values, integers, and fractions specified within the range. For example, a range of 0.1-2.0 includes 0.1, 0.17, 0.23, 0.5, and 2.0. If the end points are modified by the term "about, " the range specified is expanded by a variation of up to ±10%of any value within the range, including the end points.Overview

[0063] Metastatic disease remains a major obstacle to curing cancer. Although local disease can be controlled by surgery or radiation therapy, widespread, distant metastases require systemic therapy. However, many of these treatments have unplanned dose-limiting toxicity to vital organs due to a poor therapeutic index (TI, the ratio of cumulative tumor uptake to cumulative normal tissue uptake) . At present, more than 90%of clinical trials have failed to obtain FDA approval, of which a considerable number are due to dose-limiting kidney, liver or bone marrow toxicity. If a therapeutic agent is too small (<70 kDa) it is filtered through the glomerulus, while a larger dose or extended dosing regimen required to overcome the short serum half-life is associated with the disadvantages of excessively high costs, logistics and increased risk of organ toxicity. Conventional one-step delivery systems (e.g., radiolabeled immunoglobulin G (IgG) proteins) generally have TIs of less than 10: 1, and are associated with toxicity to the kidney, liver or bone marrow. The off-target effects of systemic cytotoxic therapy pose a major obstacle to cancer cure, especially in children whose genomic, physical and intellectual consequences may be severe and lasting.

[0064] Notably, antibodies with a smaller molecule weight can have strong tumor penetration and low immunogenicity. However, they can also have a shorter half-life, rapid metabolism, and relatively weak tumor retention ability, which may require the antibody to have a relatively high affinity or internalization ability. Whereas an antibody with a larger molecular weight can be better retained by tumors and has a slower metabolism. This can enable a larger antibody to continue destroying tumor cells but can also result in non-target organ uptake. Disclosed here are multimerization domains that can be conjugated to a multi-specific polypeptide complex, e.g., to enable controlled aggregation and dissociation, thus finding a balance between the characteristics of an antibody with a large or small molecular weight.

[0065] There are many ways for antibodies to form aggregates. A common method of forming aggregates is to use disulfide bonds, but these aggregates require a reducing agent to open the disulfide bonds before it can be depolymerized.

[0066] The present disclosure provides compositions and methods related to the use of a recombinant polypeptide comprising modified multimerization domains for treating disease, including cancer. In some embodiments, the multimerization domain comprises a modified sequence to enhance delivery of a multi-specific polypeptide complex as a therapeutic agent. Features of improved delivery include, but are not limited to, increased affinity / binding to target antigens, faster clearance, lower non-specific binding, faster renal clearance, and higher tumor uptake. In embodiments, the multi-specific antibody further binds a target-specific antigen and a small molecule, wherein the small molecule comprises a radionuclide (e.g., DOTA) . In some embodiments, the target-specific binding domain comprises a tumor-associated antigen (TAA) binding domain that enables the multi-specific polypeptide complex to bind tumor cells. In some embodiments, described herein is a recombinant polypeptide comprising: (a) an antibody; and (b) a multimerization domain, wherein the antibody is operably linked to the multimerization domain, and wherein the multimerization domain is adapted to bind one or more molecules of the recombinant polypeptide to form a multimer of the recombinant polypeptide.

[0067] The compositions described herein can be administered during pre-targeting radioimmunotherapy to a subject in need thereof in exemplary procedures including radioactive imaging and treatment. Once the compositions are enriched within a target tumor a radionuclide can then be administered. The radionuclide can bind the multi-specific polypeptide complex, causing it to dissociate and clear from the circulatory system at a faster rate. This can help reduce toxicity associated with non-specific organ uptake.I. Multimerization domains

[0068] Described herein are recombinant polypeptides comprising multimerization domains. In some embodiments, the multimerization domains can be designed to impart certain functional characteristics to the conjugate. For example, the multimerization domains can be designed to achieve changes in binding affinity and pharmacokinetic behavior. Moreover, the multimerization domain can be conjugated to a molecule to enable efficient delivery of a therapeutic payload to a target site while also minimizing the risk of off-target effects. In some embodiments, the multimerization domains can be conjugated to a molecule comprising an antibody, receptor, enzyme, transport protein, DNA-binding protein, small molecule ligand, polysaccharide, aptamer, chaperon protein and molecule scaffold. The molecule bound to a multimerization domain may have enhanced structural features, including, but not limited to, improved binding affinity to target antigens, faster clearance, lower non-specific binding, faster renal clearance, and higher uptake by a region of interest. In some embodiments, a region of interest comprises an organ or a tumor. In some embodiments, a molecule conjugated to a disclosed multimerization domain can have significantly reduced blood half-life compared to molecules including Fc regions.

[0069] Provided herein are recombinant polypeptides comprising (a) an antibody and (b) a multimerization domain, wherein the antibody is operably linked to the multimerization domain. In some embodiments, the multimerization domain is adapted to bind one or more other molecules of the recombinant polypeptide to form a multimer of the recombinant polypeptide. In some embodiments, the binding of the multimerization domain to the one or more other molecules is non-covalent binding. In some embodiments, the antibody and the multimerization domain are comprised in a continuous polypeptide.

[0070] In some embodiments, the recombinant polypeptides form a multimer under physiological conditions. In some embodiments, the recombinant polypeptides form a multimer under physiological conditions and at an effective concentration.

[0071] In some embodiments, the recombinant polypeptides comprise leucine zippers. In some embodiments, multimerization occurs spontaneously upon unfolding. In some embodiments, multimerization occurs at a higher concentration.

[0072] In some embodiments, the recombinant polypeptides multimerize at a concentration of about 1 nM to about 100 nM, about 10 nM to about 100 nM, about 20 nM to about 100 nM, about 30 nM to about 100 nM, about 40 nM to about 100 nM, about 50 nM to about 100 nM, about 60 nM to about 100 nM, about 70 nM to about 100 nM, about 80 nM to about 100 nM, about 90 nM to about 100 nM, about 1 nM to about 90 nM, about 10 nM to about 90 nM, about 20 nM to about 90 nM, about 30 nM to about 90 nM, about 40 nM to about 90 nM, about 50 nM to about 90 nM, about 60 nM to about 90 nM, about 70 nM to about 90 nM, about 80 nM to about 90 nM, about 1 nM to about 80 nM, about 10 nM to about 80 nM, about 20 nM to about 80 nM, about 30 nM to about 80 nM, about 40 nM to about 80 nM, about 50 nM to about 80 nM, about 60 nM to about 80 nM, about 70 nM to about 80 nM, about 1 nM to about 70 nM, about 10 nM to about 70 nM, about 20 nM to about 70 nM, about 30 nM to about 70 nM, about 40 nM to about 70 nM, about 50 nM to about 70 nM, about 60 nM to about 70 nM, about 1 nM to about 60 nM, about 10 nM to about 60 nM, about 20 nM to about 60 nM, about 30 nM to about 60 nM, about 40 nM to about 60 nM, about 50 nM to about 60 nM, about 1 nM to about 50 nM, about 10 nM to about 50 nM, about 20 nM to about 50 nM, about 30 nM to about 50 nM, about 40 nM to about 50 nM, about 1 nM to about 40 nM, about 10 nM to about 40 nM, about 20 nM to about 40 nM, about 30 nM to about 40 nM, about 1 nM to about 30 nM, about 10 nM to about 30 nM, about 20 nM to about 30 nM, about 1 nM to about 20 nM, about 10 nM to about 20 nM, or about 1 nM to about 10 nM, including any values or ranges therebetween. In some embodiments, the recombinant polypeptides multimerize at a concentration of about 1 nM to about 100 nM.

[0073] In some embodiments, the recombinant polypeptides multimerize at a concentration comprising about 0.1 μM to about 1 μM or about 100 μM to about 1,000 μM. In some embodiments, the recombinant polypeptides multimerize at a concentration comprising about 0.1 μM, about 0.2 μM, about 0.3 μM, about 0.4 μM, about 0.5 μM, about 0.6 μM, about 0.7 μM, 0.8 μM, 0.9 μM, or 1 μM, including any values or ranges therebetween. In some embodiments, the recombinant polypeptides multimerize at a concentration comprising about 0.1 μM to 1 μM. In some embodiments, the recombinant polypeptides multimerize at a concentration of about 1μM to about 100μM, about 10μM to about 100μM, about 20μM to about 100μM, about 30μM to about 100μM, about 40μM to about 100μM, about 50μM to about 100μM, about 60μM to about 100μM, about 70μM to about 100μM, about 80μM to about 100μM, about 90μM to about 100μM, about 1μM to about 90μM, about 10μM to about 90μM, about 20μM to about 90μM, about 30μM to about 90μM, about 40μM to about 90μM, about 50μM to about 90μM, about 60μM to about 90μM, about 70μM to about 90μM, about 80μM to about 90μM, about 1μM to about 80μM, about 10μM to about 80μM, about 20μM to about 80μM, about 30μM to about 80μM, about 40μM to about 80μM, about 50μM to about 80μM, about 60μM to about 80μM, about 70μM to about 80μM, about 1μM to about 70μM, about 10μM to about 70μM, about 20μM to about 70μM, about 30μM to about 70μM, about 40μM to about 70μM, about 50μM to about 70μM, about 60μM to about 70μM, about 1μM to about 60μM, about 10μM to about 60μM, about 20μM to about 60μM, about 30μM to about 60μM, about 40μM to about 60μM, about 50μM to about 60μM, about 1μM to about 50μM, about 10μM to about 50μM, about 20μM to about 50μM, about 30μM to about 50μM, about 40μM to about 50μM, about 1μM to about 40μM, about 10μM to about 40μM, about 20μM to about 40μM, about 30μM to about 40μM, about 1μM to about 30μM, about 10μM to about 30μM, about 20μM to about 30μM, about 1μM to about 20μM, about 10μM to about 20μM, or about 1μM to about 10μM, including any values or ranges therebetween. In some embodiments, the recombinant polypeptides multimerize at a concentration comprising about 1 μM to 100 μM.

[0074] In some embodiments, the recombinant polypeptides multimerize under physiological conditions comprising a pH, presence of metal ions, oxidizing environment, physiological temperature, physiological ionic strength, ligand or substrate binding, or post-translation modifications. In some embodiments, post-translational modifications comprises glycosylation or phosphorylation. In some embodiments, the recombinant polypeptides multimerize at a pH near neutral. In some embodiments, the pH comprises about 6 to about 8. In some embodiments, the pH comprises about 6, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8, including any values or ranges therebetween.

[0075] In some embodiments, the physiological conditions comprise moderate to high ionic salt. In some embodiments, the ionic salt comprises NaCl. In some embodiments, the ionic salt comprises a concentration of about 100 mM to about 200 mM. In some embodiments, the ionic salt comprises a concentration of about 100 mM to about 200 mM, about 125 mM to about 200 mM, about 150 mM to about 200 mM, about 175 mM to about 200 mM, about 100 mM to about 175 mM, about 125 mM to about 175 mM, about 150 mM to about 175 mM, about 100 mM to about 150 mM, about 125 mM to about 150 mM, or about 100 mM to about 125 mM, including any values or ranges.

[0076] In some embodiments, the physiologic conditions comprise a temperature comprising of about 20 ℃ to about 70 ℃, about 25 ℃ to about 70 ℃, about 30 ℃ to about 70 ℃, about 35 ℃ to about 70 ℃, about 40 ℃ to about 70 ℃, about 45 ℃ to about 70 ℃, about 50 ℃ to about 70 ℃, about 55 ℃ to about 70 ℃, 60 ℃ to about 70 ℃, about 65 ℃ to about 70 ℃, about 20 ℃ to about 60 ℃, about 25 ℃ to about 60 ℃, about 30 ℃ to about 60 ℃, about 35 ℃ to about 60 ℃, about 40 ℃ to about 60 ℃, about 45 ℃ to about 60 ℃, about 50 ℃ to about 60 ℃, about 55 ℃ to about 60 ℃, about 20 ℃ to about 50 ℃, about 25 ℃ to about 50 ℃, about 30 ℃ to about 50 ℃, about 35 ℃ to about 50 ℃, about 40 ℃ to about 50 ℃, about 45 ℃ to about 50 ℃, about 20 ℃ to about 40 ℃, about 25 ℃ to about 40 ℃, about 30 ℃ to about 40 ℃, about 35 ℃ to about 40 ℃, about 20 ℃ to about 30 ℃, or about 25 ℃ to about 30 ℃, including any values or ranges therebetween. In some embodiments, the physiologic conditions comprise a temperature comprising of about 20 ℃, 21 ℃, 22 ℃, 23 ℃, 24 ℃, 25 ℃, 26 ℃, 27 ℃, 28 ℃, 29 ℃, 30 ℃, 31 ℃, 32 ℃, 33 ℃, 34 ℃, 35 ℃, 36 ℃, or 37 ℃. In some embodiments, the temperature comprises about 25 ℃ or 37 ℃. In some embodiments, the initial concentration of the recombinant polypeptide in a sample is about 0.5 mg / mL to about 3 mg / mL. In some embodiments, the concentration of a recombinant polypeptide of a recombinant polypeptide following storage at 25 ℃ is about 0.5 mg / mL to about 3 mg / mL.

[0077] In some embodiments, the physiological conditions comprise oxidizing environments. In some embodiments, the physiological conditions comprise those of Tris-based buffers, HEPES (4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic acid) buffer, MES (2- (N-morpholino) ethanesulfonic acid) buffer, PIPES (Piperazine-N, N′-bis (2-ethanesulfonic acid) ) buffer, MOPS (3- (N-morpholino) propanesulfonic acid) , or Acetate or Citrate buffers In some embodiments, the physiological conditions comprise those of phosphate-buffered saline (PBS) .

[0078] In some embodiments, the multimer dissociates under physiological conditions and at an effective concentration. In some embodiments, the recombinant polypeptides multimerize under physiological conditions comprising a pH, presence of metal ions, oxidizing environment, physiological temperature, physiological ionic strength, ligand or substrate binding, or post-translation modifications.

[0079] In some embodiments, the multimerized recombinant polypeptides dissociate under physiological conditions comprising low salt or high salt. In some embodiments, a low salt condition comprises about 10 mM, about 11 mM, about 12 mM, about 13 mM, about 14 mM, about 15 mM, about 16 mM, about 17 mM, about 18 mM, about 19 mM, or about 20 mM, including any values or ranges therebetween. In some embodiments, a high salt condition comprises at least about 500 mM, at least about 600 mM, at least about 700 mM, at least about 800 mM, or at least about 900 mM, including any values or ranges therebetween.

[0080] In some embodiments, the multimerized recombinant polypeptides dissociate under physiological conditions comprising an acid or basic pH. In some embodiments, the multimerized recombinant polypeptides dissociate below a pH of 6. In some embodiments, the multimerized recombinant polypeptides dissociate above a pH of 8. In some embodiments, the multimerized recombinant polypeptides dissociate under physiological conditions comprising high temperatures. In some embodiments, the multimerized recombinant polypeptides dissociate under physiological conditions comprising a temperature comprising at least about 50 ℃, at least about 60 ℃, at least about 70 ℃, at least about 80 ℃, or at least about 90 ℃, including any values or ranges therebetween. In some embodiments, the multimerized recombinant polypeptides dissociate in the presence of denaturants or chemical stress. In some embodiments, the denaturants comprise urea, guanidinium hydrochloride, or a combination thereof. In some embodiments, the multimerized recombinant polypeptides dissociate in the presence of detergents or organic solvents. In some embodiments, the detergents or organic solvents comprise SDS (sodium dodecyl sulfate) , Triton X-100, Tween-20, CHAPS, urea, guanidinium hydrochloride, small organic solvents, or a combination thereof. In some embodiments, small organic solvents comprise ethanol or acetonitrile

[0081] In some embodiments, the recombinant polypeptides dissociate at lower concentrations. In some embodiments, the lower concentration is correlated to the strength of the multimerization. In some embodiments, the lower concentration is correlated to the strength of the leucine zipper. In some embodiments, the recombinant polypeptides dissociate at a concentration of less than about 10 nM, less than about 50 nM, or less than about 0.5 μM.

[0082] In some embodiments, recombinant polypeptides comprising the multimerization domains can self-assemble and disassemble. In some embodiments, the multimerization domain comprises a first multimer state or a high-order multimer state. In some embodiments, the first-multimer state comprises a monomer or dimer. In some embodiments, the high-order multimer state comprises a tetramer or a pentamer. In embodiments, the multimerization domain having a structure comprising a high-order multimer is stable in solution above a multimerization threshold. In some embodiments, the multimerization domain having a structure comprising a high-multimer state dissociates into a smaller state below a multimerization threshold. In some embodiments, the smaller state comprises a dimer or monomer. Provided herein are multimerization domains designed for adjustable in vivo delivery of a conjugate.

[0083] In some embodiments, the multimerization domain has a structure comprising a homodimer, trimer, tetramer, and heterodimer. An exemplary heterodimerizing domain used to generate the multimerization peptides described herein can be an alpha helix (e.g., a right-handed alpha helix) that can form a multimerization domain upon association with a second alpha helix containing oppositely charged residues. To generate homogeneous or nearly homogeneous populations of heterodimeric molecules, the heterodimerization domain may have a strong preference for forming heterodimers over homodimers.

[0084] In some embodiments, the multimerization domains are about 5-100 residues in length and / or can assemble reversibly and form stable structures at micromolar to nanomolar concentrations. In some embodiments, the multimerization domains are about 7-50 residues. In some embodiments, the multimerization domains are about 30 residues. In some embodiments, the multimerization domains are about 7, 14, 21, 28, 35, 42, or 49 residues. In some embodiments, multimerization domains comprise alpha-helical multimerization peptides. In some embodiments, the alpha-helical multimerization peptides comprise parallel dimeric, trimeric and tetrameric states. The multimerization domain can comprise a heptad copy of hydrophobic (H) and polar (P) residues, for example, HPPHPPP. In some embodiments, multimerization domains comprise four or more heptad copies. In some embodiments, the multimerization domains comprise one or more, two or more, three or more, four or more, five or more, or six or more heptad copies.

[0085] The multimerization domain can assemble to bury the hydrophobic surface formed by hydrophobic residues. The slight mismatch between the periodicity of these hydrophobic residues and the alpha-helix, about 3.5 residues versus about 3.6 residues, respectively, leads to a left-handed supercoiling of the helices around each other and to characteristic and intimate knobs-into-holes side-chain packing between the helices. Although this binding is primarily hydrophobic, the charged amino acids flank the hydrophobic core and present possibilities for interhelix salt-bridging interactions. In some embodiments, the multimerization domains comprise 1 or more, 2 or more, 3 or more, 4 or more, 5 or more, or 6 or more, or 7 or more alpha-helices. In some embodiments, the multimerization domains comprise 2 to 4 alpha-helices. The helices can be arranged in parallel, antiparallel, or mixed topologies in both homo-and heterotypic assemblies. For example, the alpha helices can be wrapped around each other in a rope-like structure. The formation of the alpha-helices can be determined by the heptad copies within the protein sequence that exhibit a propensity to form alpha-helical structures. For example, in a X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7 heptad, residues at the X1, X2, X5, and X6 sites of the heptad copies often define the helix-helix interfaces during multimerization assemblies.

[0086] To form aggregates into bundles through hydrophobic forces like a "leucine zipper" , a hydrophobic residue h and a polar residue p can be incorporated in the seven amino acids, such as HPPHPPP, HPPHHPP, HHPHHPP, PHHHHPP, PHHHHPH, or PHPPHPP.

[0087] When assessing the X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7 heptad sequence, the specific amino acid at each position can have a particular role or function within the multimerization peptide. In some embodiments, a multimerization domain comprises 7 consecutive amino acids. In some embodiments, the 7 consecutive amino acids are X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7. In some embodiments, a multimerization domain comprises 7 consecutive amino acids, wherein at least 2, at least 3, at least 4, or at least 5 amino acids of the 7 consecutive amino acids are hydrophobic amino acids. In some embodiments, the multimerization domain comprises 7 consecutive amino acids, wherein at least 2 amino acids of the 7 consecutive amino acids are hydrophobic amino acids. In some embodiments, the multimerization domain comprises 7 consecutive amino acids, wherein at least 3 amino acids of the 7 consecutive amino acids are hydrophobic amino acids. In some embodiments, the multimerization domain comprises 7 consecutive amino acids, wherein at least 2, at least 3, at least 4 or at least 5 amino acids of the 7 consecutive amino acids are polar amino acids. In some embodiments, the multimerization domain comprises 7 consecutive amino acids, wherein at least 3 amino acids of the 7 consecutive amino acids are polar amino acids.

[0088] In some embodiments, the multimerization domain comprises two or more, three or more, four or more, five or more or six or more segments of the 7 consecutive amino acids. In some embodiments, the multimerization domain comprises two or more segments of the 7 consecutive amino acids. In some embodiments, the segments are located consecutively in the multimerization domain, without any additional amino acid in between. The terms “segments of 7 consecutive amino acids” and “heptad” are used interchangeably throughout.

[0089] In some embodiments, the 7 consecutive amino acids are X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7, wherein X2 and X5 are hydrophobic amino acids. In some embodiments, the 7 consecutive amino acids are X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7, wherein X2 and X5 are hydrophobic amino acids, in at least one, at least two, or at least three of the segments. In some embodiments, wherein the 7 consecutive amino acids are X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7, wherein X2 and X5 are hydrophobic amino acids, in all the segments. In some embodiments, X1, X3, X4, X6, and X7 are hydrophobic or polar amino acids.

[0090] In some embodiments, the 7 consecutive amino acids are X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7, wherein X2 and X5 are hydrophobic amino acids and X1 is a polar amino acid. In some embodiments, X7 is any amino acid. In some embodiments, X1, X3, X4, X6, and X7 are hydrophobic or polar amino acids. In some embodiments, X1, X3, X4, X6 and X7 are selected from the group consisting of alanine, glutamine, lysine, glutamic acid, histidine, aspartic acid, and arginine. In some embodiments, X1, X3, X4, and X6 are selected from the group consisting of alanine, glutamine, lysine, glutamic acid, histidine, aspartic acid, and arginine.

[0091] In some embodiments, X2 and X5 are isoleucine and / or leucine. In some embodiments, X2 and X5 are both isoleucine (I) . In some embodiments, X2 is leucine (L) and X5 is isoleucine (I) . In some embodiments, X3 and X4 are alanine. In some embodiments, X3 and X4 are charged amino acids pairs. In some embodiments, X3 and X4 are selected from the group consisting of alanine, arginine, histidine, lysine, aspartic acid, and glutamic acid. In some embodiments, X3 and X4 are polar charged amino acids having opposite charges. In some embodiments, both X3 and X4 are alanine. In some embodiments, X3 and X4 are histidine (H) and aspartic acid (D) , respectively. In some embodiments, X3 and X4 are glutamic acid (E) and lysine (K) , respectively. In some embodiments, X3 and X4 are lysine (K) and glutamic acid (E) , respectively.

[0092] In some embodiments, X1 and X6 are glutamine. In some embodiments, X1 and X6 are charged amino acid pairs. In some embodiments, X1 and X6 are selected from the group consisting of glutamine, arginine, histidine, lysine, aspartic acid, and glutamic acid. In some embodiments, both X1 and X6 are glutamine. In some embodiments, X1 and X6 are both polar charged amino acids. In some embodiments, X1 is glutamic acid (E) and X6 is lysine (K) . In some embodiments, X1 is glutamic acid € and X6 is lysine (K) . In some embodiments, X7 is glutamine, lysine, tryptophan or serine. In some embodiments, X7 is lysine. In some embodiments, X7 is glutamine.

[0093] In some embodiments, the multimerization domain comprises two or more of the segments of the 7 consecutive amino acids. In some embodiments, the multimerization domain comprises four or five of the segments of the 7 consecutive amino acids. In some embodiments, the segments are located consecutively in the multimerization domain, without any additional amino acid in between.

[0094] In some embodiments, the hydrophobic amino acids are selected from the group consisting of alanine, isoleucine, leucine, methionine, phenylalanine, tryptophan, tyrosine, and valine. In some embodiments, the polar amino acids are selected from the group consisting of serine, threonine, asparagine, and glutamine.

[0095] In some embodiments, the multimerization domain comprise alpha-helices with interacting surfaces. In some embodiments, the interacting surfaces comprise hydrophobic amino acids. In some embodiments, the hydrophobic amino acids comprise leucine (s) . In some embodiments, the leucine (s) form a leucine zipper due to their arrangement on interacting surfaces. Exemplary amino acids that can be included at each position of the heptad are provided in Table 1 below.Table 1. Categorization of amino acids

[0096] In some embodiments, the hydrophobic residues in the heptad sequences can be chosen from alanine, valine, leucine, isoleucine, tryptophan, phenylalanine, tyrosine and methionine. Proline, while hydrophobic, can limit the ability of the multimerization peptide to form an alpha helical structure. Glycine residue can have conformational flexibility, and therefore may not readily adopt the constrained alpha helical structure. Charged residues that may be included in a multimerization domain comprise lysine, arginine, histidine, aspartic acid, and glutamic acid, where lysine, arginine, and histidine are basic residues, and aspartic acid and glutamic acid are acidic residues.

[0097] Notably, the amino acids at each position are not fixed, and can be optimized through sequence design. For example, the amino acid residues can be systematically varied at specific positions within the heptad sequence. In some embodiments, the heptad sequences can be optimized for certain functional properties of the multimerization domain. In some embodiments, the functional properties comprise helix formation, stability and solubility. In some embodiments, sequence design comprises altering the peptide length, solubility, charge and polarity-related amino acids.

[0098] As used herein, the term “hydrophobic amino acids” refers to amino acids having side chains that are nonpolar and that exhibit a tendency to minimize contact with aqueous environments. Such amino acids generally lack strongly electronegative atoms or charged functional groups in their side chains and preferentially associate with other nonpolar residues or lipid environments. Hydrophobic amino acids include, but are not limited to, valine, leucine, isoleucine, methionine, phenylalanine, and tryptophan.

[0099] As used herein, the term “polar amino acids” refers to amino acids having side chains that contain electronegative atoms or functional groups capable of forming hydrogen bonds with water or other polar molecules. Polar amino acids can exhibit hydrophilic character and tend to be solvent-exposed in aqueous environments. Polar amino acids may be classified as either polar uncharged or polar charged, as described below.

[0100] The term “polar uncharged amino acids” refers to amino acids that contain polar functional groups but are not ionized at physiological pH. Such amino acids typically participate in hydrogen bonding without carrying a formal charge. Examples include, but are not limited to, serine, threonine, asparagine, glutamine, cysteine, and histidine (in its neutral form) .

[0101] The term “polar charged amino acids” refers to amino acids that possess side chains that are ionized at physiological pH and thus carry a positive or negative charge. Positively charged (basic) amino acids include, but are not limited to, lysine, arginine, and histidine (in its protonated form) . Negatively charged (acidic) amino acids include, but are not limited to, aspartic acid and glutamic acid.

[0102] Exemplary heptad amino acid sequences for trimeric and tetrameric multimerization peptides are provided in Table 2 below.Table 2. Exemplary multimerization peptide amino acid sequences

[0103] In some embodiments, the multimerization peptides comprise an amino acid sequence that is at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 99%or 100%identical to any one of SEQ ID NOs: 1-60. In some embodiments, the multimerization peptides comprise an amino acid sequence that is at least 85%identical to any one of SEQ ID NOs: 1-60. In some embodiments, the multimerization peptides comprise an amino acid sequence that is about 100%identical to any one of SEQ ID NOs: 1-60. In some embodiments, the multimerization peptides comprise the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 1-60. In some embodiments, the multimerization peptides comprise an amino acid sequence that is at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 99%or 100%identical to SEQ ID NO: 48.In some embodiments, the multimerization peptides comprise an amino acid sequence that is at least 85%identical to SEQ ID NO: 48. In some embodiments, the multimerization peptides comprise an amino acid sequence that is about 100%identical to SEQ ID NO: 48. In some embodiments, the multimerization peptides comprise the amino acid sequence of SEQ ID NO: 48.

[0104] In some embodiments, the multimerization domain comprises any one of SEQ ID NOs: 1-60, or an amino acid sequence having at most 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10 mutations (insertions, deletions, and / or substitutions) thereto. In some embodiments, the multimerization domain comprises SEQ ID NO: 54 or 60, or an amino acid sequence having at most 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10 mutations (insertions, deletions, and / or substitutions) thereto. In some embodiments, the multimerization domain comprises SEQ ID NO: 2 or 10, or an amino acid sequence having at most 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10 mutations (insertions, deletions, and / or substitutions) thereto. In some embodiments, the multimerization domain comprises SEQ ID NO: 48, or an amino acid sequence having at most 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10 mutations (insertions, deletions, and / or substitutions) thereto.

[0105] Exemplary segment sequences of 7 amino acids are shown below in Table 3.Table 3. Exemplary Segment Sequences

[0106] In some embodiments, at least one of the segments comprises an amino acid sequence that is at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 99%or 100%identical to any one of SEQ ID NOs: 76-118. In some embodiments, at least one of the segments has the amino acid sequence of any one of SEQ ID NO: 76-118. In some embodiments, the first segment, the second segment, the third segment, the fourth segment, and / or optionally the fifth segment, of the multimerization domain has the amino acid sequence of any one of SEQ ID NO: 76-118.

[0107] In some embodiments, the multimerization domain comprises lysine (K) at one or more positions corresponding to amino acid positions 7, 14, 21, and 28 of SEQ ID NO: 48. In some embodiments, the multimerization domain comprises glutamine (Q) at one or more positions corresponding to amino acid positions 7, 14, 21, and 28 of SEQ ID NO: 48. In some embodiments, the amino acids corresponding to amino acid positions 24-25 of SEQ ID NO: 48 are polar charged amino acids having opposite charges. In some embodiments, the amino acids corresponding to amino acid positions 31-32 of SEQ ID NO: 48 are polar charged amino acids having opposite charges. In some embodiments, the polar charged amino acids having opposite charges are histidine (H) and aspartic acid (D) . In some embodiments, lysine (K) at amino acid position 14 and tryptophan (W) at amino acid position 21, according to SEQ ID NO: 48.

[0108] In some embodiments, the multimerization domains in the multimer of the recombinant polypeptide comprises 3 or more alpha helices. In some embodiments, the multimerization domains in the multimer of the recombinant polypeptide comprises 3, 4, 5, 6, or 7 alpha helices.

[0109] In some embodiments, the multimerization peptide is linked to a molecule comprising a multi-specific polypeptide complex to form a conjugate comprising a multimerization domain. In some embodiments, the multimerization domain is linked to a bi-specific antibody. The linkage may be a direct linkage by a peptide bond or may be through a linker sequence. A linker can be a peptide bonded to the C-terminal end of one amino acid sequence (e.g., the constant region) and to the N-terminal end of the other amino acid sequence (e.g., the multimerization domain) . In some embodiments, the linker binds the C-terminal of the bi-specific antibody. In some embodiments, the linker comprises 2 to 100 amino acids in length. In some embodiments, the linker is between 2 and 50 amino acids in length, for example, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, or 50 amino acids in length. In some embodiments, the linker can comprise neutral polar or nonpolar amino acids. In some embodiments, the linkers comprise single amino acids, peptides, polypeptides, non-proteinaceous polymers such as polyethylene glycol (PEG) , polypropylene glycol, polyoxyalkylenes, or copolymers of polyethylene glycol and polypropylene glycol, and chemical linkers. In some embodiments, the peptide linker can predominantly include the following amino acid residues: glycine, serine, alanine, proline, or threonine. Exemplary linkers include, but are not limited to, glycine-serine linkers, glycine-alanine linkers, proline-threonine, and alanine-serine linkers.

[0110] The linker peptide can have a length that is adequate to link the multimerization domain and a molecule in such a way that they assume the correct conformation relative to one another so that they retain the desired activity. In some embodiments, the molecule comprises a multi-specific antibody. In some embodiments, the linker is between about 5 amino acids to about 10 amino acids in length. In some embodiments, the linker is between about 5 amino acids to about 15 amino acids in length. In some embodiments, the linker is between about 5 amino acids to about 20 amino acids in length. In some embodiments, the linker is between about 5 amino acids to about 30 amino acids in length. In some embodiments, the linker is between about 10 amino acids to about 15 amino acids in length. In some embodiments, the linker is between about 10 amino acids to about 20 amino acids in length. In some embodiments, the linker is between about 10 amino acids to about 30 amino acids in length. In some embodiments, the linker is between about 15 amino acids to about 30 amino acids in length. In some embodiments, the linker is between about 15 amino acids to about 45 amino acids in length. In some embodiments, the linker is 5 amino acids in length. In some embodiments, the linker is 10 amino acids in length. In some embodiments, the linker is 15 amino acids in length. In some embodiments, the linker is 20 amino acids in length. In some embodiments, the linker is 25 amino acids in length. In some embodiments, the linker is 30 amino acids in length. In some embodiments, the linker is 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, or 50 amino acids in length.

[0111] In some embodiments, the linker is (G) n, n = 1-30. In some embodiments, the linker is (GxS) n, x = 1-5, n = 15. In some embodiments, the linker is (SxG) n, x = 1-5, n = 15. In some embodiments, the linker is (GSGGS) n, n = 1-5. In some embodiments, the linker is (GGGS) n, n = 1-5. In some embodiments, the linker is (GGGGS) n, n = 1-5. Exemplary linkers comprise (GGGS) n or (GGGGS) n, wherein n is 2 to 4. Exemplary linkers are provided in Table 4 below.Table 4. Exemplary linkers amino acid sequences II. Tumor-associated antigen (TAA) binding domain

[0112] Disclosed herein are conjugates comprising a multimerization domain conjugated to a multi-specific polypeptide complex. In some embodiments, the multi-specific polypeptide complex further comprises a target-specific binding domain. In some embodiments, the target-specific binding domain comprises a TAA binding domain. In some embodiments, the TAA binding domain binds to a tumor target comprising a TAA. In some embodiments, the multi-specific polypeptide complex binds a TAA comprising BCMA, CD33, HER2, CD38, CD48, CD79b, PCAD, CD74, CD138, SLAMF7, CD123, CLL1, FLT3, CD7, CKIT, CD56, SEZ6, DLL3, DLK1, B7-H3, EGFR, CD71, EphA2, EPCAM, FOLR1, ENPP3, MET, AXL, SLC34A2, Nectin4, TROP2, LIV1, CD46, MSLN, F3, MUC16, SLC39A6, TFRC, TACSTD2, GPNMB, EGFR, CD7, HER2, EPCAM, FOLR1, ENPP3, MET, AXL, SLC34A2, Nectin4, MSLN, F3, MUC16, SLC39A6, TFRC, TACSTD2, GPNMB, CD48, CD74, EphA2, PCAD, TROP2, B7-H3, 5T4, HER2, or any combination thereof. In some embodiments, the multi-specific polypeptide complex comprises a TAA binding domain that binds GD2.

[0113] In some embodiments, the antibody of the disclosure (e.g., a multi-specific antibody or bi-specific antibody) comprises a tumor-associated antigen binding domain. In some embodiments, the multi-specific polypeptide complex binds a TAA comprising CD19, CD20, CD22, BCMA, mesothelin, EGFRvIII, GD2, Tn antigen, sTn antigen, Tn-O-Glycopeptides, sTn-O-Glycopeptides, PSMA, CD97, TAG72, CD44v6, CEA, EPCAM, KIT, IL-13Ra2, leguman, GD3, CD171, IL-11Ra, PSCA, MAD-CT-1, MAD-CT-2, VEGFR2, LewisY, CD24, PDGFR-beta, SSEA-4, folate receptor alpha, ERBBs (for example, ERBB2) , Her2 / neu, MUC1, EGFR, NCAM, Ephrin B2, CAIX, LMP2, sLe, HMWMAA, o-acetyl-GD2, folate receptor beta, TEM1 / CD248, TEM7R, FAP, Legumain, HPV E6 or E7, ML-IAP, CLDN6, TSHR, GPRC5D, ALK, Polysialic acid, Fos-related antigen, neutrophil elastase, TRP-2, CYP1B1, sperm protein 17, beta human chorionic gonadotropin, AFP, thyroglobulin, PLAC1, globoH, RAGE1, MN-CA IX, human telomerase reverse transcriptase, intestinal carboxyl esterase, mut hsp 70-2, NA-17, NY-BR-1, UPK2, HAVCR1, ADRB3, PANX3, NY-ESO-1, GPR20, Ly6k, OR51E2, TARP, GFRα4, or any combination thereof. In some embodiments, the TAA comprises peptides of any of the above antigens presented on MHC.

[0114] In some embodiments, the multi-specific polypeptide complex binds a TAA comprising CD19, BCMA, TSHR, CD171, CS-1, CLL-1, GD3, Tn Ag, FLT3, CD38, CD44v6, B7H3, KIT, IL-13Ra2, IL-11Ra, PSCA, PRSS21, VEGFR2, LewisY, CD24, PDGFR-beta, SSEA-4, MUC1, EGFR, NCAM, CAIX, LMP2, EphA2, fucosyl GM1, sLe, GM3, TGS5, HMWMAA, o-acetyl-GD2, GD2, folate receptor alpha, folate receptor beta, TEM1 / CD248, TEM7R, CLDN6, GPRC5D, CXORF61, CD97, CD179a, ALK, polysialic acid, PLAC1, GloboH, NY-BR-1, UPK2, HAVCR1, ADRB3, PANX3, GPR20, LY6K, OR51E2, TAARP, WT1, ETV6-AML, sperm protein 17, XAGE1, Tie 2, MAD-CT-1, MAD-CT-2, Fos-related antigen 1, p53 mutant, hTERT, sarcoma translocation breakpoints, ML-IAP, ERG (TMPRSS2 ETS fusion gene) , NA17, PAX3, Androgen receptor, Cyclin B1, MYCN, RhoC, CYP1B1, BORIS, SART3, PAX5, OY-TES1, LCK, AKAP-4, SSX2, CD79a, CD79b, CD72, LAIR1, FCAR, LILRA2, CD300LF, CLEC12A, BST2, EMR2, LY75, GPC3, FCRL5, IGLL1, CD20, CD30, ERBB2, ROR1, FLT3, TAAG72, CD22, CD33, GD2, gp100Tn, FAP, tyrosinase, EPCAM, CEA, Igf-I receptor, EphB2, mesothelin, Cadherin17, CD32b, EGFRvIII, GPNMB, GPR64, HER3, LRP6, LYPD8, NKG2D, SLC34A2, SLC39A6, SLITRK6, TACSTD2, or any combination thereof.

[0115] In some embodiments, the TAA binding domain comprises an anti-GD2, anti-Globo H, anti-GPA33, anti-PSMA, anti-polysialic acid, anti-Lewy, anti-L1CAM, anti-HER2, anti-CAIX, anti-tag-72, anti-CD38, anti-CEA, anti-TROP2, anti-EGFR, anti-CDH17, anti-HSG, anti-EPCAM, anti-STEAP1, anti-B7H3, anti-CD33, anti-peptide / MHC, anti-glypican3, or anti-GD3 binding domain. In some embodiments, the TAA binding domain is selected from a group consisting of anti-GD2, anti-GPA33, anti-PSMA, anti-HER2, anti-CAIX, anti-tag-72, anti-CD38, anti-CEA, anti-TROP2, anti-EGFR, anti-CDH17, anti-EPCAM, anti-STEAP1, anti-B7H3 binding domain, or any combination thereof. As used herein, an anti- [antigen] binding domain means a domain that binds that antigen.

[0116] In some embodiments, the TAA binding domain comprises an anti-GD2 antibody. In some embodiments, the TAA binding domain comprises an hu3F8 antibody. In some embodiments, the TAA binding domain binds a disialoganglioside 2 (GD2) antigen. GD2 is a type of ganglioside, a lipid component found on cells surfaces, that serves as a carbohydrate marker on cell surfaces and transmits signals within certain cells, particularly tumor cells. GD2 is typically expressed at low levels in normal tissues and is overexpressed in certain tumors including, but not limited to, neuroblastoma, melanoma, osteosarcoma, and other solid tumors. Given the limited expression of GD2 in normal tissues, targeting GD2 can help minimize damage to healthy cells while directing immune responses against tumor cells. An hu3F8 antibody can bind GD2 and mediate tumor cell destruction through a variety of pathways. Exemplary pathways include but are not limited to antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC) . In some embodiments, “GD2” includes proteins comprising mutations, e.g., point mutations, fragments, insertions, deletions and splice variants of full length wild-type protein.

[0117] In some embodiments, the TAA binding domain comprises an anti-CAIX antibody. In some embodiments, the TAA binding domain comprises an HYE-32 antibody. In some embodiments, the TAA binding domains binds a CAIX antigen. CAIX, also known as Carbonic anhydrase IX or CA9, is a hypoxia-regulated, transmembrane protein associated with neoplastic growth in a large spectrum of human tumors. CAIX can be expressed in most clear cell renal tumors, and expression is associated with neoplastic growth and prognosis in cancers of the brain, lung, breast, cervix, kidney, gastrointestinal track, and head and neck. However, CAIX is not typically expressed in kidneys or other healthy tissue. In some embodiments, “CAIX” includes proteins comprising mutations, e.g., point mutations, fragments, insertions, deletions and splice variants of full length wild-type protein.

[0118] In some embodiments, the TAA binding domain comprises an anti-HER2 antibody. In some embodiments, the TAA binding domain comprises a H1 antibody. In some embodiments, the TAA binding domain binds a HER2 antigen. HER2, also known as human epidermal growth factor receptor 2, is a receptor tyrosine kinase that can be expressed in various cancers including breast, gastric and other solid tumors. Overexpression of HER2 can activate downstream pathways that lead to cellular proliferation and tumorigenesis. In some embodiments, “HER2” includes proteins comprising mutations, e.g., point mutations, fragments, insertions, deletions and splice variants of full length wild-type protein.

[0119] In some embodiments, the TAA binding domain binds a PSMA antigen. PSMA is also known as prostate-specific membrane antigen or folate hydrolase 1 (FOLH1) . PSMA is an integral, non-shed membrane glycoprotein that is highly expressed in prostate epithelial cells and is a cell-surface marker for prostate cancer. In some embodiments, “PSMA” includes proteins comprising mutations, e.g., point mutations, fragments, insertions, deletions and splice variants of full length wild-type protein.

[0120] In some embodiments, the TAA binding domain binds a HER2 / Neu antigen. HER2 / neu is a 185 kDa receptor protein that was originally identified as the product of the ERBB2 transforming gene from neuroblastomas of chemically treated rats. HER2 / neu comprises four domains: an extracellular domain to which ligand binds; a lipophilic transmembrane domain; a conserved intracellular tyrosine kinase domain; and a carboxyl-terminal signaling domain harboring several tyrosine residues that can be phosphorylated. HER2 / neu can function as a growth factor receptor and is often expressed by cancer cells of breast cancer, ovarian cancer or lung cancer. HER2 / neu is overexpressed in 25-30%of human breast and ovarian cancers, and its overexpression is associated with aggressive clinical progression and poor prognosis in affected. In some embodiments, “Her2 / Neu” includes proteins comprising mutations, e.g., point mutations, fragments, insertions, deletions and splice variants of full length wild-type protein.

[0121] In some embodiments, the TAA binding domain binds a BCMA. The term “BCMA” refers to B-cell maturation antigen. BCMA (also known as TNFRSF17, BCM or CD269) is a member of the tumor necrosis receptor (TNFR) family and is predominantly expressed on terminally differentiated B cells, e.g., memory B cells, and plasma cells. Its ligand is called B-cell activator of the TNF family (BAFF) and a proliferation inducing ligand (APRIL) . BCMA is involved in mediating the survival of plasma cells for maintaining long-term humoral immunity. In some embodiments, BCMA is expressed on the cell surface of malignant B-cells of a subject. In some embodiments, “BCMA” includes proteins comprising mutations, e.g., point mutations, fragments, insertions, deletions and splice variants of full length wild-type protein.

[0122] In some embodiments, the TAA binding domains binds an EGFR antigen. EGFR, also known as human epidermal growth factor receptor, HER-1 or ErbB1, is a 170 kDa transmembrane receptor encoded by the c-erbB proto-oncogene, and exhibits intrinsic tyrosine kinase activity. EGFR can bind ligands including α) , epidermal growth factor (EGF) , transforming growth factor-α (TGf-amphiregulin, heparin-binding EGF (hb-EGF) , betacellulin, and epiregulin. EGFR can regulate numerous cellular processes via tyrosine-kinase mediated signal transduction pathways, including, but not limited to, activation of signal transduction pathways that control cell proliferation, differentiation, cell survival, apoptosis, angiogenesis, mitogenesis, and metastasis. In some embodiments, “EGFR” includes proteins comprising mutations, e.g., point mutations, fragments, insertions, deletions and splice variants of full length wild-type protein.

[0123] In some embodiments, the TAA binding domain binds a CD33 (Cluster of Differentiation 33) . CD33 is an antigenic determinant detectable on leukemia cells as well on normal precursor cells of the myeloid lineage. In some embodiments, the CD33 protein is expressed on a cancer cell. Certain hematological malignancies are characterized by the expression of CD33 on the surface of the malignant cells. CD33-positive hematological malignancies include, but are not limited to, acute myeloid leukemia (AML) , chronic myeloid leukemia (CML) , chronic myelomonocytic leukemia, thrombolytic leukemia, a myelodysplastic syndrome, a myeloproliferative disorder, refractory anemia, a preleukemia syndrome, a lymphoid leukemia, or an undifferentiated leukemia. In some embodiments, “CD33” includes proteins comprising mutations, e.g., point mutations, fragments, insertions, deletions and splice variants of full length wild-type protein.

[0124] In some embodiments, the TAA binding domain binds a EphA2 (Ephrin receptor A2) . EphA2 is found to be either overexpressed, mutated or amplified in various cancers. In some embodiments, “EphA2” includes proteins comprising mutations, e.g., point mutations, fragments, insertions, deletions and splice variants of full length wild-type protein.

[0125] In some embodiments, the TAA binds a B7-H3 (also known as CD276) . It is a member of the B7 family of immune cell modulating molecules having a single-pass transmembrane. In humans the B7-H3 protein is expressed in two forms: Variant 1 contains a V-like or C-like Ig domain at two sites, respectively, and Variant 2 contains a V-like or C-like Ig domain at one site, respectively. The C-terminal intracellular domain of B7-H3 contains 45 amino acids. It is expressed on the surface of a wide variety of tumor cells and tumor vasculature including neuroblastoma, melanoma, renal cell cancer, prostate cancer, colorectal cancer, pancreatic cancer, gastric cancer, breast cancer, ovarian cancer and small cell lung cancer. B7-H3 expression has been correlated with poor prognosis in ovarian, RCC, NSCLC, pancreatic cancer, prostate cancer and colon cancer, with a potential role for inhibition of cytotoxic lymphocyte activity. In some embodiments, “B7-H3” includes proteins comprising mutations, e.g., point mutations, fragments, insertions, deletions and splice variants of full length wild-type protein.

[0126] In some embodiments, the TAA binds a CD79b. CD79b is an antigenic determinant known to be detectable on some malignant hematological cancer cells, e.g., leukemia cells. In some embodiments, the CD79b protein is expressed on a cancer cell. In some embodiments, “CD79b” includes proteins comprising mutations, e.g., point mutations, fragments, insertions, deletions and splice variants of full length wild-type protein.III. Small molecule binding domain

[0127] Also disclosed herein are conjugates comprising a multimerization domain conjugated to a multi-specific polypeptide complex. In some embodiments, the multi-specific polypeptide complex comprises a small molecule binding domain. In some embodiments, the small molecule binding domain comprises a C825 antibody. In some embodiments, the small molecule binding domain comprises an anti-DOTA antibody. In some embodiments, the small molecule binding domain comprises an anti-DOTA-Bn antibody. In some embodiments, the small molecule binding domain comprises an anti-DOTA-hapten antibody.

[0128] In some embodiments, the small molecule binding domain binds a target small molecule or small molecule hapten. In some embodiments, the small molecule binding domain binds a small molecule comprising pharmaceuticals, radionuclides, metabolites, hormones, plant alkaloids, terpenoids, ligands, pesticides, pollutants, preservatives, enzyme inhibitors, kinase inhibitors, and chelators. In some embodiments, the small molecule is radioactive. In some embodiments, the small molecule comprises a chelator. In some embodiments, the chelator comprises an acyclic chelator, cyclic chelator, bicyclic chelator, polyamine chelator, polyamine chelator, and siderophores. In some embodiments, the target small molecules comprise radionuclides. In some embodiments, the target small molecules comprise DOTA (1, 4, 7, 10-tetraazacyclododecane-1, 4, 7, 10-tetraacetic acid) , DOTA-Bn (phenyl-1, 4, 7, 10-tetraazacyclododecane-1, 4, 7, 10-tetraacetic acid) , DOTA-hapten, DTPA (Diethylenetriaminepentaacetic acid) , EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid) , NODAGA (1, 4, 7-triazacyclononane-1, 4-diacetic acid) , NETA (N, N, N', N'-tetraacetylated 1, 4, 7, 10-tetraazacyclododecane) , Cyclen (1, 4, 7, 10-tetraazacyclododecane) , Cyclam (1, 4, 8, 11-tetraazacyclotetradecane) , Bispidine (2, 2'-bispidine) , TACN (1, 4, 7-triazacyclononane) , ATSM (diacetyl-bis (N4-methylthiosemicarbazone) , SarAr (sarcosine-derived arylamine) , AmBaSar (aminobenzylsarcosine) , MAG3 (mercaptoacetyltriglycine) , MAG2 (mercaptoacetyltriglycine) , HYNIC (6-hydroxy-2, 2'-bipyridine) , DADT (diacetyl-di (N4-methylthiosemicarbazone) , EC (ethanolamine) , TRAP, NS3 (N-succinimidyl-3- (tri-n-butylstannyl) propionate) , H2dedpa (N, N'-diethyl-N, N'-di (2-pyridyl) ethylenediamine) , HBED (N, N'-bis (2-hydroxybenzyl) ethylenediamine-N, N'-diacetic acid) , DFO (deferoxamine) , PEPA (N-phenyl-N'- (2-ethoxyethyl) urea) , HEHA (N, N, N', N'-tetra (2-hydroxyethyl) ethylenediamine) , or their derivatives, or a combination thereof.

[0129] In some embodiments, the DOTA hapten is selected from the group consisting of DOTA, Proteus-DOTA, DOTA-Bn, DOTA-desferrioxamine, DOTA-Phe-Lys (histamine-succinyl-glycine (HSG) ) -D-Tyr-Lys (HSG) -NH2, Ac-Lys (HSG) D-Tyr-Lys (HSG) -Lys (Tscg-Cys) -NH2, DOTA-D-Asp-D-Lys (HSG) -D-Asp-D-Lys (HSG) -NH2; DOTA-D-Glu-D-Lys(HSG) -D-Glu-D-Lys (HSG) -NH2, DOTA-D-Tyr-D-Lys (HSG) -D-Glu-D-Lys (HSG) -NH2, DOTA-D-Ala-D-Lys (HSG) -D-Glu-D-Lys (HSG) -NH2, DOTA-D-Phe-D-Lys (HSG) -D-Tyr-D-Lys (HSG) -NH2, Ac-D-Phe-D-Lys (DOTA) -D-Tyr-D-Lys (DOTA) -NH2, Ac-D-Phe-D-Lys (DTPA) -D-Tyr-D-Lys (DTPA) -NH2, Ac-D-Phe-D-Lys (Bz-DTPA) -D-Tyr-D-Lys (Bz-DTPA) -NH2, Ac-D-Lys (HSG) -D-Tyr-D-Lys (HSG) -D-Lys (Tscg-Cys) -NH2, DOTA-D-Phe-D-Lys (HSG) -D-Tyr-D-Lys (HSG) -D-Lys (Tscg-Cys) -NH2, (Tscg-Cys) -D-Phe-D-Lys (HSG) -D-Tyr-D-Lys (HSG) -D-Lys (DOTA) -NH2, Tscg-D-Cys-D-Glu-D-Lys (HSG) -D-Glu-D-Lys (HSG) -NH2, (Tscg-Cys) -D-Glu-D-Lys (HSG) -D-Glu-D-Lys (HSG) -NH2, Ac-D-Cys-D-Lys (DOTA) -D-Tyr-D-Ala-D-Lys (DOTA) -D-Cys-NH2, Ac-D-Cys-D-Lys (DTPA) -D-Tyr-D-Lys (DTPA) -NH2, Ac-D-Lys (DTPA) -D-Tyr-D-Lys (DTPA) -D-Lys (Tscg-Cys) -NH2, and Ac-D-Lys (DOTA) -D-Tyr-D-Lys (DOTA) -D-Lys (Tscg-Cys) -NH) , NOTA (1, 4, 7-triazacyclononane-1, 4, 7-triacetic acid) , CB-TE2A (N, N'-bis (2-hydroxyethyl) ethylenediamine-N, N'-diacetic acid) , TETA (triethylenetetramine-N, N, N', N'-tetraacetic acid) , PCTA (2- (4- (1, 4, 7, 10-tetraazacyclododecan-1-yl) butyric acid) acetic acid, and a combination thereof.

[0130] In some embodiments, the target small molecules comprise DTPA, EDT, NOTA, DOTA, DOTA-Bn, DOTA-hapten, TRAP, TETA, NETA, CB-TE2A, Cyclen, Cyclam, Bispidine, TACN, ATSM, SarAr, AmBaSar, MAG3, MAG2, HYNIC, DADT, EC, NS3, H2dedpa, HBED, DFO, PEPA, HEHA, or their derivatives. In some embodiments, one or more target small molecules are selected from the group consisting of DTPA, EDT, NOTA, DOTA DOTA-Bn, DOTA-hapten, TRAP, TETA, NETA, CB-TE2A, Cyclen, Cyclam, Bispidine, TACN, ATSM, SarAr, AmBaSar, MAG3, MAG2, HYNIC, DADT, EC, NS3, H2dedpa, HBED, DFO, PEPA, HEHA, and their derivatives. In some embodiments, the small molecule binding domain binds a DOTA, DOTA-Bn or DOTA-hapten. In some embodiments, the small molecule binding domain binds a radionuclide comprising a DOTA, DOTA-Bn, DOTA-hapten or a combination thereof.

[0131] DOTA is an organic compound, also referred to as “tetraxetan” , with the chemical formula (CH2CH2NCH2CO2H) 4. DOTA is a chelating agent that can form stable complexes with radio metals, given it has a high affinity to radioactive metal isotopes. DOTA-Bn is a derivative of DOTA with a benzyl group attached that can also be used to chelate metal ions. The addition of the benzyl group can enhance stability of the resulting metal complex. DOTA or DOTA-Bn can be further conjugated to a hapten to form a DOTA-hapten or DOTA-Bn-hapten which comprises a small molecule that can elicit an immune response. These properties enable DOTA, DOTA-Bn and DOTA haptens to be used in various medical applications, including, but not limited to, radiopharmaceuticals, targeted imaging and targeted radionuclide therapies.

[0132] As used herein, the term “DOTA derivative” refers to any compound that is based on DOTA and retains the tetraazacyclododecane macrocyclic core. Such derivatives include compounds in which one or more of the carboxylic acid groups or nitrogen atoms are chemically modified, substituted, protected, or conjugated to other functional groups or molecules, provided that the resulting compound retains the ability to chelate metal ions or serve as a scaffold for coordination chemistry.

[0133] Exemplary modifications include, but are not limited to, alkylation, acylation, amidation, esterification, or conjugation to biomolecules such as peptides, proteins, antibodies, or polymers. A DOTA derivative may be optionally functionalized to improve solubility, stability, targeting, or other properties while preserving the chelating function of the macrocycle.

[0134] In the context of the present specification, the term “DOTA derivative” encompasses both known and novel compounds that satisfy the structural and functional criteria described herein.

[0135] In some embodiments, the small molecules described herein bind a metal ion. In some embodiments, DOTA, DOTA-Bn or DOTA-hapten bind a metal ion. In some embodiments, DOTA, Bn-DTA, and DOTA-hapten bind a metal ion comprising gallium-68 (Ga-68) , yttrium-90 (Y-90) , yttrium-86 (Y-86) , indium-111 (In-111) , lutetium-177 (Lu-177) , technetium-99m (Tc-99m) , iodine-131 (I-131) , fluorine-18 (F-18) , cobalt-60 (Co-60) , coppert-64 (Cu-64) , indium-111 (In-111) , zirconium-89 (Zr-89) , lead-203 (Pb-203) , lead-212 (Pb-212) , strontium-89 (Sr-89) , actinium-225 (Ac-225) or radium-223 (Ra-223) . In some embodiments, the metal ions are a radioactive isotope. In some embodiments, the small molecules or small molecule haptens bind a radioactive isotope that emits alpha particles during decay. In some embodiments, the small molecules or small molecule haptens bind a radioactive isotope comprising bismuth-213 (Bi-213) , astatine-211 (At-211) , actinium-22 (Ac-225) , dysprosium-152 (Dy-152) , bismuth-212 (Bi-212) , radium-223 (Ra-223) , radon-219 (Rn-219) , polonium-215 (Po-215) , bismuth-211 (Bi-211) , francium-221 (Fr-221) , astatine-217 (At-217) , or fermium-255 (Fm-255) . In some embodiments, the small molecules bind a radioactive isotope that emits beta particles during decay. In some embodiments, the small molecules bind a radioactive isotope comprising Y-86, Y-90, Sr-89, dysprosium-165 (Dy-165) , rhenium-186 (Re-186) , rhenium-188 (Re-188) , Lu-177, copper-67 (Cu-67) , or terbium-161 (Tb-161) . In some embodiments, the small molecule binds any other alpha, beta, gamma or positron emitters.

[0136] In some embodiments, the small molecules bind a metal ion selected from the group consisting of Ga-68, Cu-64, In-111, and Pb-203. In some embodiments, the small molecules bind a metal selected from the group consisting of Ra-223, Ac-225, Pb-212, Y-90, Lu-177, Cu-67, and Tb-161.

[0137] In some embodiments, the small molecule binding domain binds a target metal chelator phenyl-1, 4, 7, 10-tetraazacyclododecane-1, 4, 7, 10-tetraacetic acid ( [metal] -DOTA-Bn) . In some embodiments, the small molecule binding domain binds a [metal] -DOTA-Bn complexed with metal ions. In some embodiments, the small molecule binding domain binds a [metal] -DOTA complexed with metal ions. In some embodiments, the small molecule binding domain binds a [metal] -DOTA hapten complexed with metal ions.

[0138] In some embodiments, the small molecule is complexed with metal ions comprising Ga-68, Ac-225, Lu-177, Y-86, Y-90, Ac-225, Pb-212 or In-111. In some embodiments, the [metal] -DOTA-Bn is complexed with metal ions comprising Ga-68, Ac-225, Lu-177, Y-86, Y-90, Ac-225, Pb-212 or In-111. In some embodiments, the [metal] -DOTA-Bn is complexed with metal ions comprising Ga-68, Ac-225, Lu-177, Y-90, Ac-225 or Pb-212. In some embodiments, the small molecule binding domain binds a [metal] -DOTA-Bn complexed with Lu-177.IV. Multi-specific Polypeptide Complex

[0139] Also disclosed herein are compositions comprising a multimerization peptide conjugated to a multi-specific polypeptide complex. A multi-specific polypeptide complex refers to a molecule that has two or more antigen-binding domains, for example two (bispecific) or three (tri-specific) or four (tetra-specific) binding domains. In some embodiments, the multi-specific polypeptide complex is a construct having more than one specificity (e.g., two, three, four, five, six or more) . In some embodiments, the multi-specific polypeptide complex comprises a first binding domain and a second binding domain. In some embodiments, the multi-specific polypeptide complex further comprises a linker that connects the first domain to the second domain. In some embodiments, the multi-specific polypeptide complex is a bispecific antibody. In some embodiments, the multi-specific polypeptide complex is conjugated to a multimerization peptide having a sequence comprising any one of SEQ ID NOs: 1-60. In some embodiments, the multi-specific polypeptide complex is conjugated to a multimerization peptide having a sequence comprising SEQ ID NO: 48.

[0140] Multi-specific polypeptide complexes of the present disclosure may be constructed from various antibody fragments known in the art. For example, a diabody is a bi-specific antibody molecule composed of a non-covalent dimer of ScFv fragments, while a F (ab′) 2 is a bispecific antibody molecule composed of 2 Fab fragments linked by a hinge region. The skilled person will therefore be aware that different antibody fragments can be arranged in various combinations in order to produce bi-or multi-specific antibody molecules.

[0141] Various multi-specific and / or bi-specific formats include recombinant IgG-like dual targeting molecules, wherein the two sides of the molecule each contain the Fab fragment or part of the Fab fragment of at least two different antibodies; IgG fusion molecules, wherein full length IgG antibodies are coupled to an extra Fab fragment or parts of Fab fragment; Fc fusion molecules, wherein single chain Fv molecules or stabilized diabodies are coupled to heavy-chain constant-domains, Fc-regions or parts thereof; Fab fusion molecules, wherein different Fab-fragments are coupled together; ScFv-and diabody-based and heavy chain antibodies (e.g., domain antibodies, nanobodies) wherein different single chain Fv molecules or different diabodies or different heavy-chain antibodies (e.g. domain antibodies, nanobodies) are coupled to each other or to another protein or carrier molecule, or multi-specific polypeptide complexes generated by arm exchange. Exemplary multi-specific and / or bispecific formats with dual targeting molecules include Dual Targeting (DT) -Ig (GSK / Domantis) , Two-in-one Antibody (Genentech) and mAb2 (F-Star) , Dual Variable Domain (DVD) -Ig (Abbott) , Ts2Ab (MedImmune / AZ) and BsAb (Zymogenetics) , HERCULES (Biogen Idec) and TvAb (Roche) , ScFv / Fc Fusions (Academic Institution) , SCORPION (Emergent BioSolutions / Trubion, Zymogenetics / BMS) and Dual Affinity Retargeting Technology (Fc-DART) (MacroGenics) , F (ab) 2 (Medarex / AMGEN) , Dual-Action or Bis-Fab (Genentech) , Dock-and-Lock (DNL) (ImmunoMedics) , Bivalent Bispecific (Biotecnol) and Fab-Fv (UCB-Celltech) , Bispecific T Cell Engager (BITE) (Micromet) , Tandem Diabody (Tandab) (Affimed) , Dual Affinity Retargeting Technology (DART) (MacroGenics) , Single-chain Diabody (Academic) , TCR-like Antibodies (AIT, ReceptorLogics) , Human Serum Albumin ScFv Fusion (Merrimack) and COMBODY (Epigen Biotech) , dual targeting nanobodies (Ablynx) , dual targeting heavy chain only domain antibodies. Various formats of bispecific antibodies have been described, for example in Chames and Baty (2009) Curr Opin Drug Disc Dev 12: 276 and in Nunez-Prado et al., (2015) Drug Discovery Today 20 (5) : 588-594. Examples of trispecific or tetraspecific antibody formats include but are not limited to Fab3, triabody, tetrabody, tribody, DVD-Ig, IgG-scFv, ScFv2-Fc, tandAbs and DNL-Fab3.I. Bi-specific antibody

[0142] In some embodiments, the multi-specific polypeptide complex comprises an antibody. In some embodiments, the antibody is humanized. In some embodiments, the antibody is a single-domain antibody (sdAb) , a single chain variable fragment (scFv) , a bi-specific scFvs (bi-scFvs or di-scFvs) having the format (scFv) 2, or a diabody; optionally, the antibody is a scFv. In some embodiments, the antibody does not comprise a fragment crystallizable region (Fc region) . In some embodiments, the antibody does not comprise a constant domain. In some embodiments, the antibody is a multi-specific antibody, optionally, a bi-specific antibody. In some embodiments, the multi-specific antibody or bi-specific antibody comprises an antibody fragment selected from a Fab, F (ab′) 2, Fab′, scFv, single domain antibody (sdAb) , and affibody. In some embodiments, the multi-specific antibody or bi-specific antibody comprises a DARPin. In some embodiments, the multi-specific antibody or bi-specific antibody comprises a tumor-associated antigen binding domain. In some embodiments, the antibody is a bispecific antibody. In some embodiments, the bi-specific antibody comprises a tumor-associated antigen binding domain.

[0143] Provided herein compositions comprising a multimerization peptide conjugated to a bi-specific antibody. Bi-specific antibody molecules described herein refer to a molecule with two antigen binding domains, which may bind different antigens. Examples of bispecific antibody formats include but are not limited to Bispecific T cell engager (BiTE) , F (ab′) 2, F (ab′) -ScFv2, di-scFv, diabody, minibody, scFv-Fc, DART, TandAb, ScDiabody, ScDiabody-CH3, Diabody-CH3, triple body, miniantibody, minibody, TriBi minibody, ScFv-CH3 KIH (knobs in holes) , Fab-ScFv, SCFv-CH-CL-scFv, scFv-KIH, Fab-scFv-Fc, Tetravalent HCAb, scDiabody-Fc, Diabody-Fc, intrabody, dock and lock antibodies, ImmTAC, HSAbody, ScDiabody-HAS, humabody and Tandem ScFv-toxic (see for example Christoph Spiess et al, Molecular Immunology 67 (2015) page 95-106) .

[0144] In some embodiments, the bi-specific antibody can be selected from any class of immunoglobulins. In some embodiments, the bi-specific antibody comprises IgM, IgG, IgD, IgA, or IgE. In some embodiments, the antibody can be any isotype. In some embodiments, the bi-specific antibody comprises IgG1, IgG2, IgG3, or IgG4 (e.g., variants of IgG4 and IgG4 nullbody) . In some embodiments, the bi-specific antibody comprises kappa light chain constant sequences. In some embodiments, the bi-specific antibody comprises lambda light chain constant sequences.

[0145] In some embodiments, the bi-specific antibody comprises an antibody fragment. Examples of antibody fragments include but are not limited to Fv, Fab, Fab’, Fab’-SH, F (ab’) 2; diabodies; single-chain antibody molecules (e.g., scFv) . In some embodiments, the bi-specific antibody comprises a single chain variable fragment (scFv) . In some embodiments, the bi-specific antibody comprises a Fab. In some embodiments, the bi-specific antibody comprises a Fab’ . In some embodiments, the bi-specific antibody comprises a F (ab’) 2. In some embodiments, the bi-specific antibody comprises an antibody fragment selected from a Fab, F (ab′) 2, Fab′, scFv, and single domain antibody (sdAb) . In some embodiments, the bi-specific antibody comprises a tandem scFv. In some embodiments, the bi-specific antibody comprises an affibody. In some embodiments, the bi-specific antibody comprises a DARPin.

[0146] In some embodiments, the bi-specific antibody comprises a scFv and the C-terminus of the VH region is linked to the N-terminus of the VL region. In some embodiments, the bi-specific antibody comprises a scFv and the C-terminus of the VL region is linked to the N-terminus of the VH region. In some embodiments, the VH region and the VL region are linked by a linker. Suitable linkers are generally those which allow both the VH region and the VL region to fold with a three-dimensional structure very similar to the VH region and the VL region produced individually without any linker or other component. Linkers include single amino acids, peptides, polypeptides, non-proteinaceous polymers such as polyethylene glycol (PEG) , polypropylene glycol, polyoxyalkylenes, or copolymers of polyethylene glycol and polypropylene glycol, and chemical linkers.

[0147] In some embodiments, the VH region and the VL region are linked by a peptide linker. In some embodiments, the peptide linker can predominantly include the following amino acid residues: glycine, serine, alanine, proline, or threonine. Exemplary linkers include, but are not limited to, glycine-serine linkers, glycine-alanine linkers, proline-threonine, and alanine-serine linkers.

[0148] In some embodiments, the multimerization domain is operably linked to the N-or C-terminus of the antibody. In some embodiments, the recombinant polypeptide comprises, from N-term to C-term, the first binding domain of the antibody (e.g., the tumor-associated antigen binding domain) , the second binding domain, and the multimerization domain. In some embodiments, the recombinant polypeptide comprises, from N-term to C-term, the second binding domain, the first binding domain of the antibody (e.g., the tumor-associated antigen binding domain) , and the multimerization domain. In some embodiments, the multimerization comprises a linker between the first binding domain of the antibody (e.g., the tumor-associated antigen binding domain) and the second binding domain. In some embodiments, the multimerization domain comprises a linker between (i) the multimerization domain and (ii) the first binding domain of the antibody (e.g., the tumor-associated antigen binding domain) or the second binding domain.

[0149] In some embodiments, the multimerization domain is operably linked to the C-terminus of the heavy chain. In some embodiments, the multimerization domain is operably linked to the N-terminus of the heavy or light chain.

[0150] The linker peptide should have a length that is adequate to link the VH region and the VL region in such a way that they assume the correct conformation relative to one another so that they retain the desired activity. In some embodiments, the linker is between about 5 amino acids to about 10 amino acids in length. In some embodiments, the linker is between about 5 amino acids to about 15 amino acids in length. In some embodiments, the linker is between about 5 amino acids to about 20 amino acids in length. In some embodiments, the linker is between about 5 amino acids to about 30 amino acids in length. In some embodiments, the linker is between about 10 amino acids to about 15 amino acids in length. In some embodiments, the linker is between about 10 amino acids to about 20 amino acids in length. In some embodiments, the linker is between about 10 amino acids to about 30 amino acids in length. In some embodiments, the linker is between about 15 amino acids to about 30 amino acids in length. In some embodiments, the linker is between about 15 amino acids to about 45 amino acids in length. In some embodiments, the linker is 5 amino acids in length. In some embodiments, the linker is 10 amino acids in length. In some embodiments, the linker is 15 amino acids in length. In some embodiments, the linker is 20 amino acids in length. In some embodiments, the linker is 25 amino acids in length. In some embodiments, the linker is 30 amino acids in length. In some embodiments, the linker is 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, or 50 amino acids in length.

[0151] In some embodiments, the linker is (G) n, n = 1-30. In some embodiments, the linker is (GxS) n, x = 1-5, n = 15. In some embodiments, the linker is (SxG) n, x = 1-5, n = 15. In some embodiments, the linker is (GSGGS) n, n = 1-5. In some embodiments, the linker is (GGGGS) n, n = 1-5. Exemplary linkers are provided in Table 4 above.

[0152] In some embodiments, the bi-specific antibody has two binding domains comprising a first binding domain and a second binding domain. In some embodiments, the two binding domains and the variable domains (VH / VL) of the bi-specific antibody may comprise peptide linkers (spacer peptides) . The term “peptide linker” comprises in accordance with the present disclosure an amino acid sequence by which the amino acid sequences of one (variable and / or binding) domain and another (variable and / or binding) domain of the antibody construct of the present disclosure are linked with each other. The peptide linkers can also be used to fuse the third domain to the other domains of the antibody construct of the present disclosure. An essential technical feature of such peptide linker is that it does not comprise any polymerization activity. Among the suitable peptide linkers are those described in U.S. Pat. Nos. 4,751,180 and 4,935,233 or WO 88 / 09344. The peptide linkers can also be used to attach other domains or modules or regions (such as half-life extending domains) to the antibody construct of the present disclosure. Illustrative bispecific single chain antibody constructs are described in WO 99 / 54440, Mack, J. Immunol. (1997) , 158, 3965-3970, Mack, PNAS, (1995) , 92, 7021-7025, Kufer, Cancer Immunol. Immunother., (1997) , 45, 193-197,  Blood, (2000) , 95, 6, 2098-2103, Brühl, Immunol., (2001) , 166, 2420-2426, Kipriyanov, J. Mol. Biol., (1999) , 293, 41-56.

[0153] Bivalent (also called divalent) or bi-specific single-chain variable fragments (bi-scFvs or di-scFvs having the format (scFv) 2 can be engineered by linking two scFv molecules (e.g. with linkers as described hereinbefore) . If these two scFv molecules have the same binding specificity, the resulting (scFv) 2 molecule will preferably be called bivalent (i.e. it has two valences for the same target epitope) . If the two scFv molecules have different binding specificities, the resulting (scFv) 2 molecule will preferably be called bispecific. The linking can be done by producing a single peptide chain with two VH regions and two VL regions, yielding tandem scFvs (see e.g. Kufer P. et al., (2004) Trends in Biotechnology 22 (5) : 238-244) . Another possibility is the creation of scFv molecules with linker peptides that are too short for the two variable regions to fold together (e.g., about five amino acids) , forcing the scFvs to dimerize. This type is known as diabodies (see e.g., Hollinger, Philipp et al., (July 1993) Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 90 (14) : 6444-8) .

[0154] In line with this disclosure either the first, the second or the first and the second domain may comprise a single domain antibody, respectively the variable domain or at least the CDRs of a single domain antibody. Single domain antibodies comprise merely one (monomeric) antibody variable domain which is able to bind selectively to a specific antigen, independently of other V regions or domains. The first single domain antibodies were engineered from heavy chain antibodies found in camelids, and these are called VHH fragments. Cartilaginous fishes also have heavy chain antibodies (IgNAR) from which single domain antibodies called VNAR fragments can be obtained. An alternative approach is to split the dimeric variable domains from common immunoglobulins e.g., from humans or rodents into monomers, hence obtaining VH or VL as a single domain Ab. Although most research into single domain antibodies is currently based on heavy chain variable domains, nanobodies derived from light chains have also been shown to bind specifically to target epitopes. Examples of single domain antibodies are called sdAb, nanobodies or single variable domain antibodies.

[0155] Whether or not an antibody construct competes for binding with another given antibody construct can be measured in a competition assay such as a competitive ELISA or a cell-based competition assay. Avidin-coupled microparticles (beads) can also be used. Similar to an avidin-coated ELISA plate, when reacted with a biotinylated protein, each of these beads can be used as a substrate on which an assay can be performed. Antigen is coated onto a bead and then precoated with the first antibody. The second antibody is added and any additional binding is determined. Possible means for the read-out includes flow cytometry.

[0156] In some embodiments, the multi-specific antibody as described herein is an IgG1, an IgG2, an IgG3 or an IgG4 isotype. In some embodiments, the multi-specific antibody is the IgG1 isotype. In some embodiments, the multi-specific antibody is the IgG2 isotype. In some embodiments, the multi-specific antibody is the IgG3 isotype. In some embodiments, the multi-specific antibody is the IgG4 isotype.

[0157] Provided herein is a bi-specific antibody comprising (i) a first domain comprising a binding molecule that binds a tumor-associated antigen (TAA) , and (ii) a second domain comprising a binding domain that binds a small molecule. In some embodiments, the first binding domain comprises an anti-tumor associated antibody. In some embodiments, the first binding domain is an anti-tumor associated antibody comprising an anti-GD2, anti-Globo H, anti-GPA33, anti-PSMA, anti-polysialic acid, anti-Lewy, anti-L1CAM, anti-HER2, anti-B7H3, anti-CD33, anti-peptide / MHC, anti-glypican3, or anti-GD3 binding domain. In some embodiments, the first binding domain binds a TAA comprising GD2, GPA33, Her2, CAIX, PSMA, tag-72, CD38, B7H3, CEA, trop2, EGFR, CDH17, EPCAM, or STEAP1. In some embodiments, the anti-tumor associated antibody comprises anti-GD2, anti-HER2 or anti-CAIX. In some embodiments, the anti-tumor associated antibody comprises hu3F8, H1 and HYE-32. In some embodiments, the first domain comprises a binding molecule that binds a GD2 antigen. In some embodiments, the TAA binding domain is an antibody fragment comprising sdAb and VHH.

[0158] In some embodiments, the second binding domain comprises an anti-DOTA antibody. In some embodiments, the second binding domain comprises an anti-DOTA-Bn antibody. In some embodiments, the second binding domain comprises an anti-DOTA hapten antibody. In some embodiments, the second binding domain comprises a C825 antibody. In some embodiments, the second binding domain binds a small molecule comprising DOTA, DOTA-Bn or DOTA-hapten.

[0159] In some embodiments, the first domain (i.e., the TAA-binding domain) comprises a VH region and a VL region. In some embodiments, the VH region comprises a HCDR1, a HCDR2, and a HCDR3. In some embodiments, the VL region comprises a LCDR1, a LCDR2, and a LCDR3. In some embodiments, the second domain (i.e., the TAA-binding domain) comprises a heavy chain or a binding fragment thereof. In some embodiments, the heavy chain or a binding fragment thereof is from an IgA, IgD, IgE, IgG, or IgM. In some embodiments, the heavy chain or a binding fragment thereof is a subclass of IgA, IgD, IgE, IgG, or IgM, such as, e.g., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, and IgA2.

[0160] In some embodiments, the first domain (i.e., the TAA-binding domain) comprises a light chain or a binding fragment thereof. In some embodiments, the light chain or binding fragment thereof is a kappa light chain. In some embodiments, the light chain or binding fragment thereof is a lambda light chain.

[0161] In some embodiments, the first domain (i.e., the TAA-binding domain) specifically binds to a TAA with high affinity. In some embodiments, the TAA binding domain has a dissociation constant of about 10-8 to about 10-12 moles per liter or molar (M) (e.g., 10-8, 10-9, 10-10, 10-11, or 10-12 M, including any values or ranges therebetween.

[0162] In some embodiments, the bi-specific antibody comprises (i) a first domain comprising a binding molecule that binds a TAA, and (ii) a second domain comprising a binding domain that binds a small molecule. In some embodiments, the bi-specific antibody comprises a binding domain that binds an immune cell antigen. In some embodiments, the first domain comprises an immune cell binding domain. In some embodiments, the second domain comprises an immune cell binding domain. In some embodiments, an immune cell antigen is derived from an immune cell receptor comprising a T cell, B cell, natural killer cell, macrophage activation, dendritic cell, and complement system receptor. Examples of T cell surface antigens include but are not limited to: CD3, CD2, VLA-1, CD8, CD4, CCR6, CXCR5, CD25, CD31, CD45RO, CD197, CD127, CD38, CD27, CD196, CD277 and CXCR3, particularly CD2, CD3, CD31 and CD277. In some embodiments, T cell receptors comprise CD28, CD3, CD4, CD8, CD25, TCR, CTLA-4, and PD-1. In some embodiments, B cell receptors comprise BCR, CD19, CD20 CD21, CD40, TLR, IL-4, and CD22. In some embodiments, immune cell receptors further comprise NKG2D, CD16, TLRs, CD40, and CD14.

[0163] In some embodiments, the bi-specific antibody comprises (i) a first domain comprising a binding molecule that binds a tumor-associated antigen, and (ii) a second domain comprising a binding domain that binds a [metal] -DOTA-Bn. In some embodiments, a multimerization peptide is conjugated to the bi-specific antibody to form a recombinant polypeptide. In some embodiments, the recombinant polypeptide comprises (i) a first domain comprising a binding molecule that binds a tumor-associated antigen, (ii) a second domain comprising a binding domain that binds a [metal] -DOTA-Bn, and (iii) a third domain comprising a multimerization domain having a sequence comprising any one of SEQ ID NOs: 1-60. In some embodiments, the recombinant polypeptide comprises (i) a first domain comprising a binding molecule that binds a tumor-associated antigen, (ii) a second domain comprising a binding domain that binds a [metal] -DOTA-Bn, and (iii) a third domain comprising a multimerization domain having a sequence comprising SEQ ID NO: 48. Exemplary recombinant polypeptide sequences are in Table 5 below.Table 5. Exemplary sequences for multi-specific recombinant polypeptide complexes

[0164] In some embodiments, the bi-specific antibody comprises (i) a first domain comprising a binding molecule that binds a GD2 antigen, and (ii) a second domain comprising a binding domain that binds a [metal] -DOTA-Bn. In some embodiments, the bi-specific antibody comprises an amino acid sequence that is at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, or at least 97%identical to SEQ ID NO: 73. In some embodiments, the bi-specific antibody comprises an amino acid sequence that is at least 90%identical to SEQ ID NO: 73. In some embodiments, the bi-specific antibody comprises an amino acid sequence that is about 100%identical to SEQ ID NO: 73.

[0165] In some embodiments, the bi-specific antibody comprises (i) a first domain comprising a binding molecule that binds a HER2 antigen, and (ii) a second domain comprising a binding domain that binds a [metal] -DOTA-Bn. In some embodiments, the bi-specific antibody comprises an amino acid sequence that is at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, or at least 97%identical to SEQ ID NO: 74. In some embodiments, the bi-specific antibody comprises an amino acid sequence that is at least 90%identical to SEQ ID NO: 74. In some embodiments, the bi-specific antibody sequence comprises an amino acid sequence that is about 100%identical to SEQ ID NO: 74.

[0166] In some embodiments, the bi-specific antibody comprises (i) a first domain comprising a binding molecule that binds a CAIX antigen, and (ii) a second domain comprising a binding domain that binds a [metal] -DOTA-Bn. In some embodiments, the bi-specific antibody comprises an amino acid sequence that is at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, or at least 97%identical to SEQ ID NO: 75. In some embodiments, the bi-specific antibody comprises an amino acid sequence that is at least 90%identical to SEQ ID NO: 75. In some embodiments, the bi-specific antibody comprises an amino acid sequence that is about 100%identical to SEQ ID NO: 75.

[0167] In some embodiments, the recombinant polypeptide comprises (i) a first domain comprising a binding molecule that binds a tumor-associated antigen, (ii) a second domain comprising a binding domain that binds a [metal] -DOTA-Bn, and (iii) a third domain comprising a multimerization domain having a sequence comprising SEQ ID NO: 62. In some embodiments, the recombinant polypeptide comprises comprise an amino acid sequence that is at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, or at least 97%identical to SEQ ID NO: 62. In some embodiments, the recombinant polypeptide comprises an amino acid sequence that is at least 90%identical to SEQ ID NO: 62. In some embodiments, the recombinant polypeptide comprises an amino acid sequence that is about 100%identical to SEQ ID NO: 62.A. Methods of Producing Multi-specific Recombinant Polypeptide Complexes

[0168] The present disclosure also provides recombinant nucleic acid molecules (e.g., DNA or RNA) encoding the multimerization domain, [metal] -DOTA-Bn binding domain, TAA-binding domain, multi-specific polypeptide complexes, or one or more polypeptide chain (s) of the multi-specific polypeptide complexes provided herein. The present disclosure also provides vectors comprising such recombinant nucleic acid molecules.

[0169] Recombinant nucleic acid molecules comprising a desired polynucleotide sequence can be propagated by placing the nucleic acid molecule encoding the binding molecules (e.g. TAA-binding domain, GD2 binding domain, [metal] -DOTA-Bn binding domain, etc. ) , the multi-specific polypeptide complexes, or one or more polypeptide chain (s) of the multi-specific polypeptide complexes in a vector. Viral and non-viral vectors are used, including plasmids. The choice of plasmid will depend on the type of cell in which propagation is desired and the purpose of propagation. Certain vectors are useful for amplifying and making large amounts of the desired DNA sequence. Other vectors are suitable for expression in cells in culture. Still other vectors are suitable for transfer and expression in cells in a whole animal or person. The choice of appropriate vector is well within the skill of the art. Many such vectors are available commercially. In an exemplary protocol, the partial or full-length polynucleotide is inserted into a vector typically by means of DNA ligase attachment to a cleaved restriction enzyme site in the vector. Alternatively, the desired nucleotide sequence can be inserted by homologous recombination in vivo. This can be accomplished by attaching regions of homology to the vector on the flanks of the desired nucleotide sequence. Regions of homology can be added by ligation of oligonucleotides, or by polymerase chain reaction using primers comprising both the region of homology and a portion of the desired nucleotide sequence, for example.

[0170] For expression, an expression cassette or system may be employed. To express a nucleic acid encoding a polypeptide disclosed herein, a nucleic acid molecule encoding the polypeptide, operably linked to regulatory sequences that control transcriptional expression in an expression vector, is introduced into a host cell. In addition to transcriptional regulatory sequences, such as promoters and enhancers, expression vectors can include translational regulatory sequences and a marker gene which is suitable for selection of cells that carry the expression vector. The gene product encoded by a polynucleotide of the disclosure is expressed in any convenient expression system, including, for example, bacterial, yeast, insect, amphibian and mammalian systems. In the expression vector, the polypeptide-encoding polynucleotide is linked to a regulatory sequence as appropriate to obtain the desired expression properties. These can include, but are not limited to, promoters, enhancers, terminators, operators, repressors, and inducers. The promoters can be regulated (e.g., the promoter from the steroid inducible pIND vector (Invitrogen) ) or constitutive (e.g., promoters from CMV, SV40, Elongation Factor, or LTR sequences) . These are linked to the desired nucleotide sequence using the techniques described above for linkage to vectors. Any techniques known in the art can be used. Accordingly, the expression vector will generally provide a transcriptional and translational initiation region, which can be inducible or constitutive, where the coding region is operably linked under the transcriptional control of the transcriptional initiation region, and a transcriptional and translational termination region.

[0171] An expression cassette ( “expression unit” ) can be introduced into a variety of vectors, e.g., plasmid, BAC, YAC, bacteriophage such as lambda, P1, M13, etc., plant or animal viral vectors (e.g., retroviral-based vectors, adenovirus vectors) , and the like, where the vectors are normally characterized by the ability to provide selection of cells comprising the expression vectors. The vectors can provide for extrachromosomal maintenance, particularly as plasmids or viruses, or for integration into the host chromosome. A wide variety of markers are available for selection, particularly those which protect against toxins and antibiotics. The particular marker that is chosen is selected in accordance with the nature of the host, where, in some cases, complementation can be employed with auxotrophic hosts. Introduction of the DNA construct can use any convenient method, including, e.g., conjugation, bacterial transformation, calcium-precipitated DNA, electroporation, fusion, transfection, infection with viral vectors, biolistics, and the like.

[0172] Vectors of the present disclosure include any suitable vectors derived from either a eukaryotic or prokaryotic sources. In some embodiments, vectors are obtained from bacteria (e.g., E. coli) , insects, yeast (e.g., Pichia pastoris) , algae, or mammalian sources.

[0173] Exemplary bacterial vectors include, but are not limited to, pACYC177, pASK75, pBAD vector series, pBADM vector series, pET vector series, pETM vector series, pGEX vector series, pHAT, pHAT2, pMal-c2, pMal-p2, pQE vector series, pRSET A, pRSET B, pRSET C, pTrcHis2 series, pZA31-Luc, pZE21-MCS-l, pFLAG ATS, pFLAG CTS, pFLAG MAC, pFLAG Shift-12c, pTAC-MAT-1, pFLAG CTC, or pTAC-MAT-2.

[0174] Exemplary insect vectors include, but are not limited to, pFastBacl, pFastBac DUAF, pFastBac ET, pFastBac HTa, pFastBac HTb, pFastBac HTc, pFastBac M30a, pFastBact M3 Ob, pFastBac, M30c, pVF1392, pVF1393, pVF1393 M10, pVF1393 Mi l, pVF1393 M12, FFAG vectors such as pPolh-FFAGl or pPolh-MAT 2, or MAT vectors such as pPolh-MAT 1, or pPolh-MAT2.

[0175] Exemplary yeast vectors include, but are not limited to,  pDESTTM 14 vector,  pDESTTM 15 vector,  pDESTTM 17 vector,  pDESTTM 24 vector,  pYES-DEST52 vector, pBAD-DEST49  destination vector, pA0815 Pichia vector, pFFDl Pichi pastoris vector, pGAPZA, B, &C Pichia pastoris vector, pPIC3.5K Pichia vector, pPIC6 A, B, &C Pichia vector, pPIC9K Pichia vector, pTEFl / Zeo, pYES2 yeast vector, pYES2 / CT yeast vector, pYES2 / NT A, B, and C yeast vector, or pYES3 / CT yeast vector.

[0176] Exemplary algae vectors include pChlamy-4 vector or MCS vector.

[0177] Exemplary mammalian vectors include, but are not limited to, transient expression vectors or stable expression vectors. Exemplary mammalian transient expression vectors include, but are not limited to, pCDNA4, pRK5, p3xFFAG-CMV 8, pFFAG-Myc-CMV 19, pFEAG-Myc-CMV 23, pFEAG-CMV 2, pFEAG-CMV 6 (a-c) , pFEAG-CMV 5.1, pFEAG-CMV 5 (a-c) , p3xFFAG-CMV 7.1, pFEAG-CMV 20, p3xFFAG-Myc-CMV 24, pCMV-FEAG-MAT 1, pCMV-FFAG-MAT2, pBICEP-CMV 3, or pBICEP-CMV 4. Mammalian stable expression vectors include, but are not limited to, pFFAG-CMV 3, p3xFFAG-CMV 9, p3xFFAG-CMV 13, pFFAG-Myc-CMV 21, p3xFFAG-Myc-CMV 25, pFEAG-CMV 4, p3xFFAG-CMV 10, p3xFFAG-CMV 14, pFFAG-Myc-CMV 22, p3xFFAG-Myc-CMV 26, pBICEP-CMV 1, or pBICEP-CMV 2.

[0178] In some embodiments, a cell-free system is a mixture of cytoplasmic and / or nuclear components from a cell and is used for in vitro nucleic acid synthesis. In some embodiments, a cell-free system utilizes either prokaryotic cell components or eukaryotic cell components. For example, a nucleic acid synthesis is obtained in a cell-free system based on Drosophila cells, Xenopus egg, or HeFa cells. Exemplary cell-free systems include, but are not limited to, E. coli S30 Extract system, E. coli T7 S30 system, or

[0179] Suitable host cells are those cell types that can be transformed or transfected with exogenous DNA and grown in culture, and include bacteria, fungal cells, and cultured higher eukaryotic cells (including cultured cells of multicellular organisms) , particularly cultured mammalian cells. Techniques for manipulating cloned DNA molecules and introducing exogenous DNA into a variety of host cells are disclosed by Sambrook and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001) , and Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology (4th ed., John Wiley &Sons, 1999) .

[0180] For example, for recombinant expression of a heterodimeric binding protein comprising different first and second polypeptide chains, the first and second polypeptide chains can be co-expressed from separate vectors in the host cell for expression of the entire heterodimeric protein. Alternatively, for the expression of heterodimeric binding proteins the first and second polypeptide chains are co-expressed from separate expression units in the same vector in the host cell for expression of the entire heterodimeric protein. The expression vector (s) are transferred to a host cell by conventional techniques, and the transfected cells are then cultured by conventional techniques to produce the encoded polypeptide (s) to produce the corresponding binding proteins (e.g., the multi-specific polypeptide complexes, or one or more polypeptide chain (s) of the multi-specific polypeptide complexes provided herein) .

[0181] To direct a recombinant protein into the secretory pathway of a host cell, a secretory signal sequence (also known as a leader sequence) is provided in the expression vector. The secretory signal sequence can be that of the native form of the recombinant protein, or can be derived from another secreted protein or synthesized de novo. The secretory signal sequence is operably linked to the polypeptide-encoding DNA sequence, i.e., the two sequences are joined in the correct reading frame and positioned to direct the newly synthesized polypeptide into the secretory pathway of the host cell. Secretory signal sequences are commonly positioned 5’ to the DNA sequence encoding the polypeptide of interest, although certain signal sequences can be positioned elsewhere in the DNA sequence of interest (see, e.g., U.S. Patent Nos. 5,037,743 and 5,143,830) .

[0182] Cultured mammalian cells can be suitable hosts for production of recombinant polypeptides and proteins of the present disclosure (e.g., the multi-specific polypeptide complexes, or one or more polypeptide chain (s) of the multi-specific polypeptide complexes provided herein) for use within the present disclosure. Methods for introducing exogenous DNA into mammalian host cells include calcium phosphate-mediated transfection (Wigler et al., Cell 14: 725, 1978; Corsaro and Pearson, Somatic Cell Genetics 7: 603, 1981: Graham and Van der Eb, Virology 52: 456, 1973) , electroporation (Neumann et al., EMBO J. 1: 841-845, 1982) , DEAE-dextran mediated transfection (Ausubel et al., supra) , and liposome-mediated transfection (Hawley-Nelson et al., Focus 15: 73, 1993; Ciccarone et al., Focus 15: 80, 1993) . The production of recombinant polypeptides in cultured mammalian cells is disclosed by, for example, U.S. Patent Nos. 4,713,339; 4,784,950; 4,579,821; and 4,656,134. Examples of suitable mammalian host cells include, but are not limited to, 293A cell line, 293FT cell line, 293F cells, 293 H cells, CHO DG44 cells, CHO-Scells, CHO-K1 cells, FUT8 KO CHOK1, Expi293FTM cells, Flp-InTM T-RExTM 293 cell line, Flp-InTM-293 cell line, Flp-InTM-3T3 cell line, Flp-InTM-BHK cell line, Flp-InTM-CHO cell line, Flp-InTM-CV-l cell line, Flp-InTM-Jurkat cell line, FreeStyleTM 293-F cells, FreeStyleTM CHO-Scells, GripTiteTM 293 MSR cell line, GS-CHO cell line, HepaRGTM cells, T-RExTM Jurkat cell line, Per. C6 cells, T-RExTM-293 cell line, T-RExTM-CHO cell line, and T-RExTM-HeLa cell line. Additional suitable cell lines are known in the art and available from public depositories such as the American Type Culture Collection, Manassas, Virginia. Strong transcription promoters can be used, such as promoters from SV-40 or cytomegalovirus. See, e.g., U.S. Patent No. 4,956,288. Other suitable promoters include those from metallothionein genes (U.S. Patents Nos. 4,579,821 and 4,601,978) and the adenovirus major late promoter.

[0183] Drug selection is generally used to select for cultured mammalian cells into which foreign DNA has been inserted. Such cells are commonly referred to as “transfectants. ” Cells that have been cultured in the presence of the selective agent and are able to pass the gene of interest to their progeny are referred to as “stable transfectants. ” Exemplary selectable markers include a gene encoding resistance to the antibiotic neomycin, which allows selection to be carried out in the presence of a neomycin-type drug, such as G-418 or the like; the gpt gene for xanthine-guanine phosphoribosyl transferase, which permits host cell growth in the presence of mycophenolic acid / xanthine; and markers that provide resistance to zeocin, bleomycin, blastocidin, and hygromycin (see, e.g., Gatignol et al., Mol. Gen. Genet. 207: 342, 1987; Drocourt et al., Nucl. Acids Res. 18: 4009, 1990) . Selection systems can also be used to increase the expression level of the gene of interest, a process referred to as “amplification. ” Amplification is carried out by culturing transfectants in the presence of a low level of the selective agent and then increasing the amount of selective agent to select for cells that produce high levels of the products of the introduced genes. An exemplary amplifiable selectable marker is dihydrofolate reductase, which confers resistance to methotrexate. Other drug resistance genes (e.g., hygromycin resistance, multi-drug resistance, puromycin acetyltransferase) can also be used.

[0184] Other higher eukaryotic cells can also be used as hosts, including insect cells, plant cells and avian cells. The use of Agrobacterium rhizogenes as a vector for expressing genes in plant cells has been reviewed by Sinkar et al., J. Biosci. (Bangalore) 11: 47-58, 1987. Transformation of insect cells and production of foreign polypeptides therein is disclosed in U.S. Patent No. 5,162,222 and PCT Publication No. WO 94 / 06463. Exemplary insect cells include, but are not limited to, Drosophila S2 cells, Sf9 cells, Sf21 cells, High FiveTM cells, and expresSF+  cells; and exemplary algae cells include, but are not limited to Chlamydomonas reinhardtii 137c.

[0185] Insect cells can be infected with recombinant baculovirus, commonly derived from Autographa californica nuclear polyhedrosis virus (AcNPV) . See King and Possee, The Baculovirus Expression System: A Laboratory Guide (Chapman &Hall, London) ; O’ Reilly et al., Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual (Oxford University Press., New York 1994) ; and Baculovirus Expression Protocols. Methods in Molecular Biology (Richardson ed., Humana Press, Totowa, NJ, 1995) . Recombinant baculovirus can also be produced through the use of a transposon-based system described by Luckow et al. (J. Virol. 67:4566-4579, 1993) . This system, which utilizes transfer vectors, is commercially available in kit form (BAC-TO-BAC kit; Life Technologies, Gaithersburg, MD) . The transfer vector (e.g., PFASTBAC1; Life Technologies) contains a Tn7 transposon to move the DNA encoding the protein of interest into a baculovirus genome maintained in E. coli as a large plasmid called a “bacmid. ” See Hill-Perkins and Possee, J. Gen. Virol. 71: 971-976, 1990; Bonning et al., J. Gen. Virol. 75: 1551-1556, 1994; and Chazenbalk and Rapoport, J. Biol. Chem. 270: 1543-1549, 1995. In addition, transfer vectors can include an in-frame fusion with DNA encoding a polypeptide extension or affinity tag as disclosed above. Using techniques known in the art, a transfer vector containing a protein-encoding DNA sequence is transformed into E. coli host cells, and the cells are screened for bacmids which contain an interrupted lacZ gene indicative of recombinant baculovirus. The bacmid DNA containing the recombinant baculovirus genome is isolated, using common techniques, and used to transfect Spodoptera frugiperda cells, such as Sf9 cells. Recombinant virus that expresses the protein or interest is subsequently produced. Recombinant viral stocks are made by methods commonly used in the art.

[0186] For protein production, the recombinant virus is used to infect host cells, typically a cell line derived from the fall armyworm, Spodoptera frugiperda (e.g., Sf9 or Sf21 cells) or Trichoplusia ni (e.g., HIGH FIVETM cells; Invitrogen, Carlsbad, CA) . See generally Glick and Pasternak, Molecular Biotechnology, Principles &Applications of Recombinant DNA (ASM Press, Washington, D.C., 1994) . See also U.S. Patent No. 5,300,435. Serum-free media are used to grow and maintain the cells. Suitable media formulations are known in the art and can be obtained from commercial suppliers. The cells are grown up from an inoculation density of approximately 2-5 x 105 cells to a density of 1-2 x 106 cells, at which time a recombinant viral stock is added at a multiplicity of infection (MOI) of 0.1 to 10, more typically near 3. Procedures used are generally described in available laboratory manuals (see, e.g., King and Possee, supra; O’ Reilly et al., supra; Richardson, supra) .

[0187] Fungal cells, including yeast cells, can also be used within the present disclosure to produce the polypeptides of the present disclosure (e.g., the multi-specific polypeptide complexes, or one or more polypeptide chain (s) of the multi-specific polypeptide complexes provided herein) . Exemplary yeast or filamentous fungi include, for example, the genus: Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Candida, Pichia, Hansenula, Kluyveromyces, Zygosaccharomyces, Yarrowia, Trichosporon, Rhodosporidi, Aspergillus, Fusarium, or Trichoderma. Yeast species of in this regard include, e.g., Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Candida utilis, Candida boidini, Candida albicans, Candida tropicalis, Candida stellatoidea, Candida glabrata, Candida krusei, Candida parapsilosis, Candida guilliermondii, Candida viswanathii, Candida lusitaniae, Rhodotorula mucilaginosa, Pichia metanolica, Pichia angusta, Pichia pastoris, Pichia anomala, Hansenula polymorpha, Kluyveromyces lactis, Zygosaccharomyces rouxii, Yarrowia lipolytica, Trichosporon pullulans, Rhodosporidium toru-Aspergillus niger, Aspergillus nidulans, Aspergillus awamori, Aspergillus oryzae, Trichoderma reesei, Yarrowia lipolytica, Brettanomyces bruxellensis, Candida stellata, Schizosaccharomyces pombe, Torulaspora delbrueckii, Zygosaccharomyces bailii, Cryptococcus neoformans, Cryptococcus gattii, or Saccharomyces boulardii. Exemplary Pichia pastoris strains include GS 115, KM71H, SMD1168, SMD1168H, and X-33; and the Saccharomyces cerevisiae strain INVScl.

[0188] Prokaryotic host cells, including strains of the bacteria Escherichia coli, Bacillus, and other genera are also useful host cells within the present disclosure to produce, for example, the multi-specific polypeptide complexes, or one or more polypeptide chain (s) of the recombinant polypeptides provided herein. Techniques for transforming these hosts and expressing foreign DNA sequences cloned therein are well-known in the art (see, e.g., Sambrook and Russell, supra) . When expressing a recombinant protein in bacteria such as E. coli, the protein can be retained in the cytoplasm, typically as insoluble granules, or can be directed to the periplasmic space by a bacterial secretion sequence. In the former case, the cells are lysed, and the granules are recovered and denatured using, for example, guanidine isothiocyanate or urea. The denatured protein can then be refolded and dimerized by diluting the denaturant, such as by dialysis against a solution of urea and a combination of reduced and oxidized glutathione, followed by dialysis against a buffered saline solution. In the alternative, the protein can be recovered from the cytoplasm in soluble form and isolated without the use of denaturants. The protein is recovered from the cell as an aqueous extract in, for example, phosphate buffered saline. To capture the protein of interest, the extract is applied directly to a chromatographic medium, such as an immobilized antibody or heparin-Sepharose column. Secreted proteins can be recovered from the periplasmic space in a soluble and functional form by disrupting the cells (by, for example, sonication or osmotic shock) to release the contents of the periplasmic space and recovering the protein, thereby obviating the need for denaturation and refolding. Antibodies, including single-chain antibodies, can be produced in bacterial host cells according to known methods. See, e.g., Bird et al., Science 242: 423-426, 1988; Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883, 1988; and Pantoliano et al., Biochem. 30: 10117-10125, 1991.

[0189] Transformed or transfected host cells to produce the polypeptides and proteins of the present disclosure (e.g., multimerization binding molecule, [metal] -DOTA-Bn binding molecule, TAA-binding molecule, multi-specific polypeptide complexes, or one or more polypeptide chain (s) of the multi-specific polypeptide complexes provided herein) are cultured according to conventional procedures in a culture medium containing nutrients and other components required for the growth of the chosen host cells. A variety of suitable media, including defined media and complex media, are known in the art and generally include a carbon source, a nitrogen source, essential amino acids, vitamins and minerals. Media can also contain such components as growth factors or serum, as required. The growth medium will generally select for cells containing the exogenously added DNA by, for example, drug selection or deficiency in an essential nutrient which is complemented by the selectable marker carried on the expression vector or co-transfected into the host cell.

[0190] The proteins and polypeptides of the present disclosure (e.g., multimerization binding molecule, [metal] -DOTA-Bn binding molecule, TAA-binding molecule, multi-specific polypeptide complexes, or one or more polypeptide chain (s) of the multi-specific polypeptide complexes provided herein) may be purified by conventional protein purification methods, typically by a combination of chromatographic techniques. See generally Affinity Chromatography: Principles &Methods (Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Sweden, 1988) ; Scopes, Protein Purification: Principles and Practice (Springer-Verlag, New York 1994) . Proteins comprising an immunoglobulin Fc region can be purified by affinity chromatography on immobilized protein A or protein G. In some embodiments, the proteins and polypeptides of the present disclosure are purified, for example, by chromatography (e.g., ion exchange, affinity, particularly by affinity for the specific antigen after Protein A, and sizing column chromatography) , centrifugation, differential solubility. Additional purification steps, such as gel filtration, can be used to obtain the desired level of purity or to provide for desalting, buffer exchange, and the like.

[0191] An exemplary protocol for producing the recombinant polypeptides is described below. The bi-specific antibody and multimerization peptide can be constructed into the mammalian expression vector pCDNA4. After 6-7 days of culture, the transient expression supernatant can be collected and purified using a suitable affinity resin (e.g., Protein L resin) .B. Methods of using pre-targeted radioimmunotherapy

[0192] Also provided herein are methods, technologies and devices that utilize the recombinant polypeptides described above. In some embodiments, the recombinant polypeptides described above are used in a cancer treatment method comprising pre-targeting radioimmunotherapy (PRIT) . PRIT can be used to target tumor cells in a subject. Pre-targeting technology is used in radioactive imaging and / or treatment, and typically employs a bi-specific antibody that binds a target-specific antigen and a small molecule, which is usually a radionuclide. During PRIT, a bispecific antibody can be first administered to a subject followed by a radionuclide that contacts the bispecific antibody. An exemplary PRIT procedure is described in more detail below.

[0193] An exemplary procedure for PRIT involves a two-step process. The first step can comprise administering a target agent (e.g. an antibody, ligand, etc. ) to a subject with a tumor. In some embodiments, the target agent targets the tumor. The agent can be conjugated with a low-immunogenicity linker or “tag” . In some embodiments, the first step further comprises clearing unbound target agent from the subject. In a second step a radiolabel and / or therapeutic can then be administered after a sufficient amount of time has passed for the target agent to bind to the tumor. Typically, this second agent comprises a complimentary component (e.g., biotin, hapten, etc. ) that can contact the first agent. In some embodiments, the second agent binds the target agent administered in the first step. In some embodiments, the second agent selectively accumulates at the tumor site due to the pre-bound targeting agent. In some embodiments, the second agent binds the target agent, causing the target agent to dissociate and clear from the circulatory system. This can help reduce toxicity associated with non-specific organ uptake. In some embodiments, the bound target agent clears from the circulatory system faster than an unbound target agent.

[0194] In some embodiments, a method described herein comprises administering a subject in need thereof: a recombinant polypeptide, a conjugate, an isolated nucleic acid, an expression vector or a recombinant host cell described herein. In some embodiments, the method further comprises clearing unbounded recombinant polypeptide from the subject. In some embodiments, the method further comprises administering a small molecule after the recombinant polypeptide is administered to the subject. In some embodiments, the method comprises administering a small molecule about 1 hour to about 168 hours after the recombinant polypeptide is administered to the subject (e.g., 1, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, or 168 hours, including any values or ranges therebetween) . In some embodiments, the method comprises administering a small molecule about 48 hours after the recombinant polypeptide is administered to the subject. In some embodiments, the small molecule is radioactive. In some embodiments, the radioactive small molecule comprises [metal] -DOTA-Bn. In some embodiments, the radioactive metal (e.g., in [metal] -DOTA-Bn) is selected from the group consisting of Ga-68, Y-90, Cu-64, In-111, Lu-177, Ra-223, Ac-225, Pb-212, Cu-67, and Tb-161. In some embodiments, the method comprises administering a small molecule hapten after the recombinant polypeptide is administered to the subject.

[0195] Provided are methods comprising administering the recombinant polypeptides described herein. In some embodiments, a method of targeting tumor cells comprises (i) a first step comprising administering a target agent to a subject, and (ii) a second step comprising administering a radiolabeled agent after a period of time. In some embodiments, the first step further comprises clearing unbounded target agent from the subject. In some embodiments, the first step comprises administering a recombinant polypeptide described herein to a subject. In some embodiments, the recombinant polypeptide comprises (i) a first domain comprising a binding molecule that binds a tumor-associated antigen (TAA) , (ii) a second domain comprising a binding domain that binds a [metal] -DOTA-Bn, and (iii) a third domain comprising a multimerization domain having a sequence comprising any one of SEQ ID NOs: 1-60. In some embodiments, the second step comprises administering a small molecule to a subject. In some embodiments, the second step comprises administering [metal] -DOTA-Bn or [metal] -DOTA. In some embodiments, the second step comprises administering a [metal] -DOTA-Bn-hapten or [metal] -DOTA-hapten. In some embodiments, the second step comprises administering 177Lu-DOTA-Bn. In some embodiments, the [metal] -DOTA-Bn binds the recombinant polypeptide administered to the subject. In some embodiments, the [metal] -DOTA-Bn bound recombinant polypeptide dissociates and clears from the circulatory system. In some embodiments, the time period between the first step and the second comprises about 1 hour to about 168 hours (e.g., 1, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, or 168 hours, including any values or ranges therebetween) . In some embodiments, the time period between the first step and the second step comprises about 48 hours.

[0196] Provided herein is a method of targeting tumor cells comprising (i) a first step comprising administering a recombinant polypeptide to a subject, and (ii) a second step comprising administering a radiolabeled agent about 48 hours later. In some embodiments, the first step further comprises clearing unbounded recombinant polypeptide from the subject. In some embodiments, the method of targeting tumor cells comprises (i) a first step comprising administering to a subject a recombinant polypeptide comprising (a) a first domain comprising a binding molecule that binds a tumor-associated antigen, (b) a second domain comprising a binding domain that binds a radionuclide, and (c) a third domain comprising a multimerization domain having a sequence comprising any one of SEQ ID NOs: 1-60, and (ii) a second step comprising administering a radiolabeled agent about 48 hours later. In some embodiments, the first step further comprises clearing unbounded recombinant polypeptide from the subject. In some embodiments, the method of targeting tumor cells comprising comprises (i) a first step comprising administering to a subject a recombinant polypeptide comprising (a) a first domain comprising a binding molecule that binds a tumor-associated antigen, (b) a second domain comprising a binding domain that binds a [metal] -DOTA-Bn, and (c) a third domain comprising a multimerization domain having a sequence comprising any one of SEQ ID NOs: 1-60, and (ii) a second step comprising administering a [metal] -DOTA-Bn about 48 hours later. In some embodiments, the first step further comprises clearing unbounded recombinant polypeptide from the subject.

[0197] In some embodiments, the recombinant polypeptide administered to a subject in step (i) comprises a multimerization domain comprising an amino acid sequence that is at least 80%or at least 85%identical to SEQ ID NOs: 1-60. In some embodiments, the multimerization domain comprises an amino acid sequence that is at least 85%identical to any one of SEQ ID NOs: 1-60. In some embodiments, the multimerization domain comprise an amino acid sequence that is about 100%identical to any one of SEQ ID NOs: 1-60. In some embodiments the multimerization domain comprises an amino acid sequence that is at least 80%or at least 85%identical to SEQ ID NO: 48. In some embodiments, the multimerization domain comprises an amino acid sequence that is at least 85%identical to SEQ ID NO: 48. In some embodiments, the multimerization domain comprised an amino acid sequence that is about 100%identical to SEQ ID NO: 48.

[0198] In some embodiments, the method of targeting tumor cells comprises (i) a first step comprising administering to a subject a recombinant polypeptide having a sequence comprising SEQ ID NO: 62, and (ii) a second step comprising administering a radiolabeled agent about 48 hours later. In some embodiments, the first step further comprises clearing unbounded recombinant polypeptide from the subject. In some embodiments, the method of targeting tumor cells comprises (i) a first step comprising administering to a subject a recombinant polypeptide having a sequence comprising SEQ ID NO: 62, and (ii) a second step comprising administering a [metal] -DOTA-Bn about 48 hours later. In some embodiments, the recombinant polypeptide comprises an amino acid sequence that is at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, or at least 97%identical to SEQ ID NO: 62. In some embodiments, the recombinant polypeptide comprises an amino acid sequence that is at least 90%identical to SEQ ID NO: 62. In some embodiments, the recombinant polypeptide comprises an amino acid sequence that is about 100%identical to SEQ ID NO: 62.

[0199] In some embodiments, the radionuclide contacts the recombinant polypeptides described herein, causing them to dissociate and clear from the circulatory system at a faster rate than a reference recombinant polypeptide without the multimerization domain. This can help enhance tumor uptake while also reduce toxicity associated with non-specific organ uptake. In some embodiments, the recombinant polypeptides comprising the multimerization domains described herein have increased affinity to a target antigen when compared to that of a reference recombinant polypeptide without a multimerization domain. In some embodiments, the recombinant polypeptides comprising the multimerization domains described herein have reduced non-specific binding to a target antigen when compared to that of a reference recombinant polypeptide with no multimerization domain. In some embodiments, the recombinant polypeptides comprising the multimerization domains described herein have increased renal clearance when compared to that of a recombinant polypeptide with no multimerization domain. In some embodiments, the recombinant polypeptides comprising the multimerization domains described herein have higher tumor update when compared to that of a recombinant polypeptide with no multimerization domain. In some embodiments, the recombinant polypeptides comprising the multimerization domains described herein have reduced blood half-life when compared to that of a reference recombinant polypeptide with no multimerization domain.

[0200] In some embodiments, the recombinant polypeptides comprising the multimerization domains described herein (SEQ ID NOs: 1-60) increase tumor uptake by 2-fold, 3-fold, 4-fold, 5-fold, 6-fold, 7-fold, or 8-fold in comparison to a reference recombinant polypeptide with no multimerization domain. In some embodiments, the recombinant polypeptides comprising the multimerization domains described herein (SEQ ID NOs: 1-60) reduce non-specific binding by 2-fold, 3-fold, 4-fold, 5-fold, 6-fold, 7-fold, or 8-fold in comparison to a reference recombinant polypeptide with no multimerization domain. In some embodiments, the recombinant polypeptides comprising the multimerization domains described herein (SEQ ID NOs; 1-60) increase tumor uptake by 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 90%or 100%in comparison to a reference recombinant polypeptides with no multimerization domain. In some embodiments, the recombinant polypeptides comprising the multimerization domains described herein (SEQ ID NOs: 1-60) reduce non-specific binding by 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 90%or 100%in comparison to a reference recombinant polypeptide with no multimerization domain.

[0201] In some embodiments, the recombinant polypeptide has increased affinity to a target antigen of the antibody in comparison to a reference polypeptide. In some embodiments, the recombinant polypeptide has reduced off-target effects in a subject in comparison to a reference polypeptide. In some embodiments, the recombinant polypeptide has increased renal clearance in a subject in comparison to a reference polypeptide. In some embodiment, the recombinant polypeptide has higher tumor uptake in a subject in comparison to a reference polypeptide. In some embodiments, the recombinant polypeptide has reduced blood half-life in a subject in comparison to a reference polypeptide.

[0202] In some embodiments, the reference polypeptide has no multimerization domain and is otherwise identical to the recombinant polypeptide. In some embodiments, the multimerization domain is replaced by an amino acid sequence comprising at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 99%or 100%identity to SEQ ID NO: 119 or 120 in the reference polypeptide, and the reference polypeptide is otherwise identical to the recombinant polypeptide. In some embodiments, the multimerization domain is replaced by an amino acid sequence comprising SEQ ID NO: 119 or 120 in the reference polypeptide, and the reference polypeptide is otherwise identical to the recombinant polypeptide.C. Treatments

[0203] Described herein are pharmaceutical compositions comprising the multimerization domains, the multi-specific polypeptide complex, the recombinant polypeptides, the recombinant nucleic acid molecule, or the vector provided herein. In some embodiments, the pharmaceutical composition further comprises a pharmaceutically acceptable carrier, diluent, or excipient. In some embodiments the pharmaceutical compositions prevent or treat a disease or disorder in a subject. In some embodiments, the pharmaceutical compositions provided herein treat cancer. In some embodiments, the pharmaceutical compositions provided herein prevent cancer.

[0204] The pharmaceutical compositions described herein are formulated according to known methods to prepare pharmaceutically useful compositions, whereby the multimerization domains, the multi-specific polypeptide complex, the recombinant polypeptides, the recombinant nucleic acid molecule, or the vector provided herein is combined in a mixture with a pharmaceutically acceptable carrier, diluent or excipient. In some embodiments, the precise nature of the carrier, diluent, or excipient depend on the route of administration.

[0205] In some embodiments, the composition is administered through parenteral injection. In some embodiments, the parenteral injection comprises intramuscular injections, subcutaneous injections, and intravenous (IV) injections. In some embodiments, the composition is for intramuscular administration. In some embodiments, the composition is administered to the subject intramuscularly. In some embodiments, the composition is a liquid formulated for intramuscular administration.

[0206] In some embodiments, the composition is administered through parenteral injection, wherein the composition is a liquid. In some embodiments, the liquid composition comprises one or more adjuvants.

[0207] In some embodiments, the composition is administered via mucosal surfaces. In some embodiments, mucosal delivery comprises administration via intranasal, oral or vaginal routes. In some embodiments, the composition is formulated as a mucoadhesive formulation.

[0208] In some embodiments, the pharmaceutical compositions described herein are administered to subjects by one or more administration routes. Possible administration routes further include, for example, intravenous, intramuscular, subcutaneous, intraperitoneal, oral, intranasal, intrasynovial, parenteral, intrapulmonary, transdermal, intrathecal, topical, and intralesional routes. In some embodiments, the administration route is selected from the group consisting of: intravenous administration, intramuscular administration, subcutaneous administration, intraperitoneal administration, and oral administration. In some embodiments, the pharmaceutical composition is administered intravenously to a subject. In some embodiments, the pharmaceutical composition is administered subcutaneously to a subject. In some embodiments, the pharmaceutical composition is administered orally to a subject.

[0209] In some embodiments, the pharmaceutical compositions described herein can be administered to a subject in a single bolus delivery, via continuous delivery (e.g., continuous transdermal delivery) over an extended time period, or in a repeated administration protocol (e.g., on an hourly, daily, weekly, monthly, or yearly basis) .

[0210] In some embodiments, the methods provided herein comprise administering a therapeutically effective dose of the pharmaceutical compositions described herein. As used herein, “therapeutically effective dose” means a dose sufficient to achieve the intended therapeutic purpose, such as, to alleviate a sign or symptom of a disease or disorder in a subject. A therapeutically effective dose, dosage, or amount, as defined above, refers to the amount of the pharmaceutical composition required to result in a particular physiological effect, e.g., prevention or amelioration of one or more symptoms of cancer.

[0211] In some embodiments, the pharmaceutical composition is used to treat a disease or disorder associated with overexpression and / or ectopic expression of GD2. In some embodiments, the pharmaceutical composition is used to treat a GD2-positive cancer in a subject.

[0212] In some embodiments, the pharmaceutical composition is used to treat a cancer in a subject. In some embodiments, the cancer is a solid tumor. In some embodiments, the cancer is metastatic. In some embodiments, the cancer is a hematologic cancer. In some embodiments, the cancer is bladder cancer, blood cancer, breast cancer, colon cancer, fallopian tube cancer, gastrointestinal cancer, gastric cancer, head and neck cancer, kidney cancer, liver cancer, lung cancer, leukemia, lymphoma, Merkel cell carcinoma, endometrial cancer, ovarian cancer, cervical cancer, prostate cancer, esophageal cancer, pancreatic cancer, skin cancer, thyroid cancer, chordoma, or urothelial cancer. In some embodiments, the cancer is breast cancer, and the breast cancer is HER2 positive breast cancer or triple negative breast cancer. In some embodiments, the cancer is colon cancer, and the colon cancer is colorectal cancer. In some embodiments, the cancer is head and neck cancer, and the head and neck cancer is squamous cell carcinoma of the head and neck. In some embodiments, the cancer is kidney cancer, and the kidney cancer is renal cell carcinoma. In some embodiments, the cancer is liver cancer, and the liver cancer is hepatocellular carcinoma. In some embodiments, the cancer is lung cancer, and the lung cancer is advanced lung non-small cell carcinoma (NSCC) , recurrent NSCC, small cell lung cancer, or non-small cell lung cancer. In some embodiments, the cancer is lymphoma, and the lymphoma is Hodgkin lymphoma, non-Hodgkin lymphoma, primary mediastinal large B-cell lymphoma, Burkitt’s lymphoma (BL) , T cell lymphoma, mantle cell lymphoma, follicular lymphoma, or diffuse large B-cell lymphoma. In some embodiments, the cancer is leukemia, and the leukemia is acute myeloid leukemia (AML) , treatment-related AML, secondary AML, B and T cell acute lymphoblastic leukemia (ALL) , chronic lymphocytic leukemia (CLL) , B chronic lymphocytic leukemia (B-CLL) , hairy cell leukemia (HCL) chronic lymphocytic leukemia, or chronic myelogenous leukemia (CML) . In some embodiments, the blood cancer is myelodysplastic syndrome (MDS) . In some embodiments, the blood cancer is myeloma, and the myeloma is multiple myeloma. In some embodiments, the cancer is ovarian cancer, and the ovarian cancer is epithelial ovarian cancer. In some embodiments, the cancer comprises melanoma, osteosarcoma, and small cell lung cancer (SCLC) . In some embodiments, the cancer is selected from the group consisting of neuroblastoma, melanoma, brain tumor, osteosarcoma, breast cancer, liposarcoma, fibrosarcoma, malignant fibrous histiocytoma, leiomyosarcoma, spindle cell sarcoma, retinoblastoma, brain tumor, small cell lung cancer, glioma, soft tissue sarcoma, bladder cancer, colorectal cancer and prostate tumor.

[0213] In some embodiments, the pharmaceutical composition reduces tumor burden in a subject with cancer. In some embodiments, the pharmaceutical composition reduces tumor growth in a subject with cancer. In some embodiments, the pharmaceutical composition reduces or prevents metastases in a subject with cancer. In some embodiments, the pharmaceutical composition increases survival of a subject with cancer.NUMBERED EMBODIMENTS

[0214] Notwithstanding the appended embodiments, the disclosure sets forth the following numbered embodiments:

[0215] Embodiment 1. A recombinant polypeptide comprising: (a) an antibody; and (b) a multimerization domain, wherein the antibody is operably linked to the multimerization domain, and wherein the multimerization domain is adapted to bind one or more molecules of the recombinant polypeptide to form a multimer of the recombinant polypeptide.

[0216] Embodiment 2. The recombinant polypeptide of embodiment 1, wherein the multimerization domain comprises 7 consecutive amino acids, wherein at least 2 amino acids of the 7 consecutive amino acids are hydrophobic amino acids.

[0217] Embodiment 3. The recombinant polypeptide of embodiment 2, wherein the 7 consecutive amino acids are X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7, wherein X2 and X5 are hydrophobic amino acids.

[0218] Embodiment 4. The recombinant polypeptide of embodiment 3, wherein X1, X3, X4, X6, and X7 are hydrophobic or polar amino acids.

[0219] Embodiment 5. The recombinant polypeptide of embodiment 4, wherein X1 is a polar amino acid.

[0220] Embodiment 6. The recombinant polypeptide of embodiment 3, wherein X1, X3, X4, and X6 are selected from the group consisting of alanine, glutamine, lysine, glutamic acid, histidine, aspartic acid, and arginine.

[0221] Embodiment 7. The recombinant polypeptide of any one of embodiments 2-6, wherein the hydrophobic amino acids are selected from the group consisting of alanine, isoleucine, leucine, methionine, phenylalanine, tryptophan, tyrosine, and valine.

[0222] Embodiment 8. The recombinant polypeptide of any one of embodiments 2-7, wherein the polar amino acids are selected from the group consisting of serine, threonine, asparagine, histidine, lysine, aspartic acid, glutamic acid, arginine, and glutamine.

[0223] Embodiment 9. The recombinant polypeptide of any one of embodiments 3-8, wherein X2 and X5 are leucine or isoleucine.

[0224] Embodiment 10. The recombinant polypeptide of any one of embodiments 3-9, wherein X3 and X4 are selected from the group consisting of alanine, arginine, histidine, lysine, aspartic acid, and glutamic acid.

[0225] Embodiment 11. The recombinant polypeptide of any one of embodiments 3-10, wherein X1 and X6 are selected from the group consisting of glutamine, arginine, histidine, lysine, aspartic acid, and glutamic acid.

[0226] Embodiment 12. The recombinant polypeptide of any one of embodiments 3-11, wherein X7 is glutamine, lysine, tryptophan, or serine.

[0227] Embodiment 13. The recombinant polypeptide of any one of embodiments 2-12, wherein the multimerization domain comprises two or more copies of the 7 consecutive amino acids.

[0228] Embodiment 14. The recombinant polypeptide of any one of embodiments 1-13, wherein the multimerization domain comprises an amino acid sequence that is at least 80%or at least 85%identical to any one of SEQ ID NOs: 1-60.

[0229] Embodiment 15. The recombinant polypeptide of any one of embodiments 1-14, wherein the multimerization domain comprises 3 or more alpha helices.

[0230] Embodiment 16. The recombinant polypeptide of embodiment 15, wherein the multimerization domain comprises 3 to 7 alpha helices.

[0231] Embodiment 17. The recombinant polypeptide of any one of embodiments 1-16, wherein the multimerization domain forms a trimer, tetramer, pentamer or hexamer of the recombinant polypeptide.

[0232] Embodiment 18. The recombinant polypeptide of any one of embodiments 1-17, wherein the antibody is humanized.

[0233] Embodiment 19. The recombinant polypeptide of any one of embodiments 1-18, wherein the antibody is a bi-specific antibody.

[0234] Embodiment 20. The recombinant polypeptide of embodiments 19, wherein the bi-specific antibody comprises an antibody fragment selected from a Fab, F (ab′) 2, Fab′, scFv, single domain antibody (sdAb) , affibody and DARPin.

[0235] Embodiment 21. The recombinant polypeptide of embodiment 19 or 20, wherein the bi-specific antibody comprises a tumor-associated binding domain.

[0236] Embodiment 22. The recombinant polypeptide of embodiment 21, wherein the tumor-associated binding domain comprises an anti-GD2, anti-GPA33, anti-HER2, anti-CAIX, anti-PSMA, anti-tag-72, anti-CD38, anti-B7H3, anti-CEA, anti-TROP2, anti-EGFR, anti-CDH17, anti-EPCAM, and anti-STEAP1 binding domain, or any combination thereof.

[0237] Embodiment 23. The recombinant polypeptide of any one of embodiments 19-22, wherein the tumor-associated binding domain comprises a GD2 binding domain.

[0238] Embodiment 24. The recombinant polypeptide of any one of embodiments 19-22, wherein the tumor-associated binding domain comprises a HER2 binding domain.

[0239] Embodiment 25. The recombinant polypeptide of any one of embodiments 19-22, wherein the tumor-associated binding domain comprises a CAIX binding domain.

[0240] Embodiment 26. The recombinant polypeptide of any one of embodiments 19-25, wherein the bi-specific antibody comprises a second binding domain.

[0241] Embodiment 27. The recombinant polypeptide of embodiment 26, wherein the second binding domain binds to a small molecule or small molecule hapten.

[0242] Embodiment 28. The recombinant polypeptide of embodiment 27, wherein the small molecule comprises a DOTA (1, 4, 7, 10-tetraazacyclododecane-1, 4, 7, 10-tetraacetic acid) , DOTA-Bn (phenyl-1, 4, 7, 10-tetraazacyclododecane-1, 4, 7, 10-tetraacetic acid) , DTPA (Diethylenetriaminepentaacetic acid) , EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid) , NODAGA (1, 4, 7-triazacyclononane-1, 4-diacetic acid) , NETA (N, N, N', N'-tetraacetylated 1, 4, 7, 10-tetraazacyclododecane) , Cyclen (1, 4, 7, 10-tetraazacyclododecane) , Cyclam (1, 4, 8, 11-tetraazacyclotetradecane) , Bispidine (2, 2'-bispidine) , TACN (1, 4, 7-triazacyclononane) , ATSM (diacetyl-bis (N4-methylthiosemicarbazone) , SarAr (sarcosine-derived arylamine) , AmBaSar (aminobenzylsarcosine) , MAG3 (mercaptoacetyltriglycine) , MAG2 (mercaptoacetyltriglycine) , HYNIC (6-hydroxy-2, 2'-bipyridine) , DADT (diacetyl-di (N4-methylthiosemicarbazone) , EC (ethanolamine) , TRAP (3-aminopyridine-2-carboxaldehyde thiosemicarbazoneis) , NS3 (N-succinimidyl-3- (tri-n-butylstannyl) propionate) , H2dedpa (N, N'-diethyl-N, N'-di (2-pyridyl) ethylenediamine) , HBED (N, N'-bis (2-hydroxybenzyl) ethylenediamine-N, N'-diacetic acid) , DFO (deferoxamine) , PEPA (N-phenyl-N'- (2-ethoxyethyl) urea) , HEHA (N, N, N', N'-tetra (2-hydroxyethyl) ethylenediamine) , or their derivatives, or any combination thereof.

[0243] Embodiment 29. The recombinant polypeptide of embodiments 27 or 28, wherein the small molecule is selected from the group consisting or DTPA, EDT, NOTA, DOTA, DOTA-Bn, TRAP, TETA, NETA, CB-TE2A, Cyclen, Cyclam, Bispidine, TACN, ATSM, SarAr, AmBaSar, MAG3, MAG2, HYNIC, DADT, EC, NS3, H2dedpa, HBED, DFO, PEPA, HEHA, and their derivatives, and any combination thereof.

[0244] Embodiment 30. The recombinant polypeptide of embodiment 27, wherein the small molecule hapten comprises a DOTA-hapten selected from the group consisting of DOTA, Proteus-DOTA, DOTA-Bn, DOTA-desferrioxamine, DOTA-Phe-Lys (histamine-succinyl-glycine (HSG) ) -D-Tyr-Lys (HSG) -NH2, Ac-Lys (HSG) D-Tyr-Lys (HSG) -Lys (Tscg-Cys) -NH2, DOTA-D-Asp-D-Lys (HSG) -D-Asp-D-Lys (HSG) -NH2, DOTA-D-Glu-D-Lys (HSG) -D-Glu-D-Lys (HSG) -NH2, DOTA-D-Tyr-D-Lys (HSG) -D-Glu-D-Lys (HSG) -NH2, DOTA-D-Ala-D-Lys (HSG) -D-Glu-D-Lys (HSG) -NH2, DOTA-D-Phe-D-Lys (HSG) -D-Tyr-D-Lys (HSG) -NH2, Ac-D-Phe-D-Lys (DOTA) -D-Tyr-D-Lys (DOTA) -NH2, Ac-D-Phe-D-Lys (DTPA) -D-Tyr-D-Lys (DTPA) -NH2, Ac-D-Phe-D-Lys (Bz-DTPA) -D-Tyr-D-Lys (Bz-DTPA) -NH2, Ac-D-Lys (HSG) -D-Tyr-D-Lys (HSG) -D-Lys (Tscg-Cys) -NH2, DOTA-D-Phe-D-Lys (HSG) -D-Tyr-D-Lys (HSG) -D-Lys (Tscg-Cys) -NH2, (Tscg-Cys) -D-Phe-D-Lys (HSG) -D-Tyr-D-Lys (HSG) -D-Lys (DOTA) -NH2, Tscg-D-Cys-D-Glu-D-Lys (HSG) -D-Glu-D-Lys (HSG) -NH2, (Tscg-Cys) -D-Glu-D-Lys (HSG) -D-Glu-D-Lys (HSG) -NH2, Ac-D-Cys-D-Lys (DOTA) -D-Tyr-D-Ala-D-Lys (DOTA) -D-Cys-NH2, Ac-D-Cys-D-Lys (DTPA) -D-Tyr-D-Lys (DTPA) -NH2, Ac-D-Lys (DTPA) -D-Tyr-D-Lys (DTPA) -D-Lys (Tscg-Cys) -NH2, and Ac-D-Lys (DOTA) -D-Tyr-D-Lys (DOTA) -D-Lys (Tscg-Cys) -NH2, and any combination thereof.

[0245] Embodiment 31. The recombinant polypeptide of any one of embodiments 27-29, wherein the small molecule is phenyl-1, 4, 7, 10-tetraazacyclododecane-1, 4, 7, 10-tetraacetic acid ( [metal] -DOTA-Bn) .

[0246] Embodiment 32. The recombinant polypeptide of any one of embodiments 1-31, wherein the multimerization domain is operably linked to the N-or C-terminus of the antibody.

[0247] Embodiment 33. The recombinant polypeptide of embodiment 31, wherein [metal] -DOTA-Bn is radioactive.

[0248] Embodiment 34. The recombinant polypeptide of embodiment 33, wherein the radioactive metal in [metal] -DOTA-Bn is selected from the group consisting of gallium-68 (Ga-68) , yttrium-90 (Y-90) , yttrium-86 (Y-86) , indium-111 (In-111) , lutetium-177 (Lu-177) , technetium-99m (Tc-99m) , iodine-131 (I-131) , fluorine-18 (F-18) , copper-64 (Cu-64) , zirconium-89 (Zr-89) , lead-203 (Pb-203) , lead-212 (Pb-212) , strontium-89 (Sr-89) , actinium-225 (Ac-225) , bismuth-213 (Bi-213) , astatine-211 (At-211) , dysprosium-152 (Dy-152) , bismuth-212 (Bi-212) , radium-223 (Ra-223) , radon-219 (Rn-219) , polonium-215 (Po-215) , bismuth-211 (Bi-211) , francium-221 (Fr-221) , astatine-217 (At-217) , fermium-255 (Fm-255) , dysprosium-165 (Dy-165) , rhenium-186 (Re-186) , rhenium-188 (Re-188) , copper-67 (Cu-67) , and terbium-161 (Tb-161) .

[0249] Embodiment 35. The recombinant polypeptide of any one of embodiments 1-34, wherein the recombinant polypeptide has increased affinity to a target antigen in comparison to a reference polypeptide, wherein the reference polypeptide has no multimerization domain and is otherwise identical to the recombinant polypeptide.

[0250] Embodiment 36. The recombinant polypeptide of any one of embodiments 1-35, wherein the recombinant polypeptide has reduced non-specific binding to a target antigen in comparison to a reference polypeptide, wherein the reference polypeptide has no multimerization domain and is otherwise identical to the recombinant polypeptide.

[0251] Embodiment 37. The recombinant polypeptide of any one of embodiments 1-36, wherein the recombinant polypeptide has increased renal clearance in comparison to a reference polypeptide, wherein the reference polypeptide has no multimerization domain and is otherwise identical to the recombinant polypeptide.

[0252] Embodiment 38. The recombinant polypeptide of any one of embodiments 1-37, wherein the recombinant polypeptide has higher tumor uptake in comparison to a reference polypeptide, wherein the reference polypeptide has no multimerization domain and is otherwise identical to the recombinant polypeptide.

[0253] Embodiment 39. The recombinant polypeptide of any one of embodiments 1-38, wherein the recombinant polypeptide has reduced blood half-life in comparison to a reference polypeptide, wherein the reference polypeptide has no multimerization domain and is otherwise identical to the recombinant polypeptide.

[0254] Embodiment 40. A conjugate comprising: two or more molecules of the recombinant polypeptide of any one of embodiments 1-39, bind to form a multimer of the recombinant polypeptide.

[0255] Embodiment 41. The conjugate of embodiment 40, comprising a trimer, tetramer, pentamer or hexamer of the recombinant polypeptide.

[0256] Embodiment 42. An isolated nucleic acid encoding the recombinant polypeptide of any one of embodiments 1-39.

[0257] Embodiment 43. An expression vector comprising a nucleic acid segment encoding the recombinant polypeptide of any one of embodiments 1-39 or 42.

[0258] Embodiment 44. A recombinant host cell comprising the expression vector of embodiment 43.

[0259] Embodiment 45. A method comprising administering to a subject in need thereof: the recombinant polypeptide of any one of embodiments 1-39, the conjugate of embodiment 40 or 41, the isolated nucleic acid of embodiment 42, the expression vector of embodiment 43, or the recombinant host cell of embodiment 44.

[0260] Embodiment 46. The method of embodiment 45, further comprising clearing unbounded recombinant polypeptide from the subject.

[0261] Embodiment 47. The method of embodiment 45 or 46, further comprising administering a small molecule after the recombinant polypeptide is administered to the subject.

[0262] Embodiment 48. The method of embodiment 47, wherein the small molecule is administered about 1 hour to about 168 hours after the recombinant polypeptide is administered to the subject.

[0263] Embodiment 49. The method of embodiment 47 or 48, wherein the small molecule is administered about 48 hours after the recombinant polypeptide is administered to the subject. ]

[0264] Embodiment 50. The method of any one of embodiments 47-49, wherein the small molecule is radioactive.

[0265] Embodiment 51. The method of embodiment 50, wherein the radioactive small molecule comprises [metal] -DOTA-Bn.

[0266] Embodiment 52. The method of embodiment 51, wherein the radioactive metal in [metal] -DOTA-Bn is selected from the group consisting of Ga-68, Y-90, Y-86, Cu-64, Pb-203, In-111, Lu-177, Tc-99m, I-131, F-18, Sr-89, Ra-223, Ac-225, Pb-212, Cu-67, and Tb-161.

[0267] Embodiment 53. The method of any one of embodiments 45-52, wherein the method is for treating cancer.

[0268] Embodiment 54. The method of embodiment 53, wherein the cancer is selected from the group consisting of neuroblastoma, melanoma, brain tumor, osteosarcoma, breast cancer, liposarcoma, fibrosarcoma, malignant fibrous histiocytoma, leiomyosarcoma, spindle cell sarcoma, retinoblastoma, brain tumor, small cell lung cancer, glioma, soft tissue sarcoma, bladder cancer, colorectal cancer and prostate tumor.FURTHER EMBODIMENTS A

[0269] Notwithstanding the appended embodiments, the disclosure sets forth the following further embodiments:

[0270] Embodiment A1. A recombinant polypeptide comprising: (a) an antibody; and (b) a multimerization domain, wherein the antibody is operably linked to the multimerization domain.

[0271] Embodiment A2. The recombinant polypeptide of embodiment A1, wherein the multimerization domain is adapted to bind one or more other molecules of the recombinant polypeptide to form a multimer of the recombinant polypeptide.

[0272] Embodiment A3. The recombinant polypeptide of embodiment A2, wherein the multimerization domain is adapted to bind the multimerization domain of the one or more other molecules of the recombinant polypeptide.

[0273] Embodiment A4. The recombinant polypeptide of any one of embodiments A2-A3, wherein the binding of the multimerization domain to the one or more other molecules is non-covalent binding.

[0274] Embodiment A5. The recombinant polypeptide of any one of embodiments A1-A4, wherein the antibody and the multimerization domain are comprised in a continuous polypeptide.

[0275] Embodiment A6. The recombinant polypeptide of any one of embodiments A1-A5, wherein the multimerization domain comprises one or more segments of 7 consecutive amino acids, wherein at least 2 amino acids of each of the 7 consecutive amino acids segment are hydrophobic amino acids.

[0276] Embodiment A7. The recombinant polypeptide of embodiment A6, wherein the 7 consecutive amino acids are X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7, wherein X2 and X5 are hydrophobic amino acids, in at least one, at least two, or at least three of the segments.

[0277] Embodiment A8. The recombinant polypeptide of embodiment A7, wherein the 7 consecutive amino acids are X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7, wherein X2 and X5 are hydrophobic amino acids, in all the segments.

[0278] Embodiment A9. The recombinant polypeptide of embodiment A7 or A8, wherein X1, X3, X4, X6, and X7 are hydrophobic or polar amino acids.

[0279] Embodiment A10. The recombinant polypeptide of any one of embodiments A7-A9, wherein X1 is a polar amino acid.

[0280] Embodiment A11. The recombinant polypeptide of any one of embodiments A7-A10, wherein X1, X3, X4, and X6 are selected from the group consisting of alanine, glutamine, lysine, glutamic acid, histidine, aspartic acid, and arginine.

[0281] Embodiment A12. The recombinant polypeptide of any one of embodiments A6-A11, wherein the hydrophobic amino acids are selected from the group consisting of alanine, isoleucine, leucine, methionine, phenylalanine, tryptophan, tyrosine, and valine.

[0282] Embodiment A13. The recombinant polypeptide of any one of embodiments A9-A12, wherein the polar amino acids are selected from the group consisting of serine, threonine, asparagine, histidine, lysine, aspartic acid, glutamic acid, arginine, and glutamine.

[0283] Embodiment A14. The recombinant polypeptide of any one of embodiments A7-A13, wherein X2 and X5 are leucine or isoleucine.

[0284] Embodiment A15. The recombinant polypeptide of embodiment A14, wherein X2 and X5 are both isoleucine (I) .

[0285] Embodiment A16. The recombinant polypeptide of embodiment A14, wherein X2 is leucine (L) and X5 is isoleucine (I) .

[0286] Embodiment A17. The recombinant polypeptide of any one of embodiments A7-A16, wherein X3 and X4 are selected from the group consisting of alanine, arginine, histidine, lysine, aspartic acid, and glutamic acid.

[0287] Embodiment A18. The recombinant polypeptide of embodiment A17, wherein X3 and X4 are polar charged amino acids having opposite charges.

[0288] Embodiment A19. The recombinant polypeptide of embodiment A17, wherein both X3 and X4 are alanine.

[0289] Embodiment A20. The recombinant polypeptide of embodiment A17, wherein X3 and X4 are histidine (H) and aspartic acid (D) , respectively.

[0290] Embodiment A21. The recombinant polypeptide of embodiment A17, wherein X3 and X4 are lysine (K) and glutamic acid (E) , respectively.

[0291] Embodiment A22. The recombinant polypeptide of any one of embodiments A7-A21, wherein X1 and X6 are selected from the group consisting of glutamine, arginine, histidine, lysine, aspartic acid, and glutamic acid.

[0292] Embodiment A23. The recombinant polypeptide of embodiment A22, wherein both X1 and X6 are glutamine.

[0293] Embodiment A24. The recombinant polypeptide of embodiment A22, wherein X1 and X6 are both polar charged amino acids.

[0294] Embodiment A25. The recombinant polypeptide of embodiment A22, wherein X1 is glutamic acid (E) and X6 is lysine (K) .

[0295] Embodiment A26. The recombinant polypeptide of any one of embodiments A7-A25, wherein X7 is glutamine, lysine, tryptophan, or serine.

[0296] Embodiment A27. The recombinant polypeptide of embodiment A26, wherein X7 is lysine.

[0297] Embodiment A28. The recombinant polypeptide of embodiment A26, wherein X7 is glutamine.

[0298] Embodiment A29. The recombinant polypeptide of any one of embodiments A6-A28, wherein the multimerization domain comprises two or more of the segments of the 7 consecutive amino acids.

[0299] Embodiment A30. The recombinant polypeptide of embodiment A29, wherein the multimerization domain comprises four or five of the segments of the 7 consecutive amino acids.

[0300] Embodiment A31. The recombinant polypeptide of embodiment A29 or A30, wherein the segments are located consecutively in the multimerization domain, without any additional amino acid in between.

[0301] Embodiment A32. The recombinant polypeptide of any one of embodiments A1-A31, wherein the multimerization domain comprises an amino acid sequence that is at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 99%or 100%identical to any one of SEQ ID NOs: 1-60.

[0302] Embodiment A33. The recombinant polypeptide of embodiment A32, wherein the multimerization domain comprises any one of SEQ ID NOs: 1-60, or an amino acid sequence having at most 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10 mutations (insertions, deletions, and / or substitutions) thereto.

[0303] Embodiment A34. The recombinant polypeptide of embodiment A32 or A33, wherein the multimerization domain comprises:(a) SEQ ID NO: 54 or 60, or an amino acid sequence having at most 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10 mutations (insertions, deletions, and / or substitutions) thereto, or(b) SEQ ID NO: 2 or 10, or an amino acid sequence having at most 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10 mutations (insertions, deletions, and / or substitutions) thereto.

[0304] Embodiment A35. The recombinant polypeptide of embodiment A32 or A33, wherein the multimerization domain comprises SEQ ID NO: 48, or an amino acid sequence having at most 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10 mutations (insertions, deletions, and / or substitutions) thereto.

[0305] Embodiment A36. The recombinant polypeptide of any one of embodiments A32-A35, wherein at least one of the segments has the amino acid sequence of any one of SEQ ID NO: 76-118.

[0306] Embodiment A37. The recombinant polypeptide of any one of embodiments A32-A36, wherein the first segment, the second segment, the third segment, the fourth segment, and / or optionally the fifth segment, of the multimerization domain has the amino acid sequence of any one of SEQ ID NO: 76-118.

[0307] Embodiment A38. The recombinant polypeptide of any one of embodiments A32-A37, wherein the multimerization domain comprises glutamine (Q) at one or more positions corresponding to amino acid positions 7, 14, 21, and 28 of SEQ ID NO: 48.

[0308] Embodiment A39. The recombinant polypeptide of any one of embodiments A32-A38, wherein the amino acids corresponding to amino acid positions 24-25 of SEQ ID NO: 48 are polar charged amino acids having opposite charges.

[0309] Embodiment A40. The recombinant polypeptide of any one of embodiments A32-A39, wherein the amino acids corresponding to amino acid positions 31-32 of SEQ ID NO: 48 are polar charged amino acids having opposite charges.

[0310] Embodiment A41. The recombinant polypeptide of embodiment A39 or A40, wherein the polar charged amino acids having opposite charges are histidine (H) and aspartic acid (D) .

[0311] Embodiment A42. The recombinant polypeptide of any one of embodiments A32-A41, comprising lysine (K) at amino acid position 14 and tryptophan (W) at amino acid position 21, according to SEQ ID NO: 48.

[0312] Embodiment A43. The recombinant polypeptide of any one of embodiments A1-A42, wherein the multimerization domains in the multimer of the recombinant polypeptide comprises 3 or more alpha helices.

[0313] Embodiment A44. The recombinant polypeptide of embodiment A43, wherein the multimerization domains in the multimer of the recombinant polypeptide comprises 3, 4, 5, 6, or 7 alpha helices.

[0314] Embodiment A45. The recombinant polypeptide of any one of embodiments A1-A44, wherein the multimerization domain is capable of mediating the formation of a trimer, tetramer, pentamer or hexamer of the recombinant polypeptide.

[0315] Embodiment A46. The recombinant polypeptide of any one of embodiments A1-A45, wherein the antibody is humanized.

[0316] Embodiment A47. The recombinant polypeptide of any one of embodiments A1-A46, wherein the antibody is a single-domain antibody (sdAb) , a single chain variable fragment (scFv) , a bi-specific scFvs (bi-scFvs or di-scFvs) having the format (scFv) 2, or a diabody; optionally, the antibody is a scFv.

[0317] Embodiment A48. The recombinant polypeptide of any one of embodiments A1-A46, wherein the antibody does not comprise a fragment crystallizable region (Fc region) .

[0318] Embodiment A49. The recombinant polypeptide of any one of embodiments A1-A46, wherein the antibody does not comprise a constant domain.

[0319] Embodiment A50. The recombinant polypeptide of any one of embodiments A1-A49, wherein the antibody is a multi-specific antibody, optionally, a bi-specific antibody.

[0320] Embodiment A51. The recombinant polypeptide of embodiments A50, wherein the multi-specific antibody or bi-specific antibody comprises an antibody fragment selected from a Fab, F (ab′) 2, Fab′, scFv, single domain antibody (sdAb) , and affibody.

[0321] Embodiment A52. The recombinant polypeptide of any one of embodiments A1-A51, wherein the antibody comprises a tumor-associated antigen binding domain.

[0322] Embodiment A53. The recombinant polypeptide of embodiment A52, wherein the tumor-associated antigen binding domain comprises an anti-GD2, anti-GPA33, anti-HER2, anti-CAIX, anti-PSMA, anti-tag-72, anti-CD38, anti-B7H3, anti-CEA, anti-TROP2, anti-EGFR, anti-CDH17, anti-EPCAM, anti-STEAP1 binding domain, or any combination thereof.

[0323] Embodiment A54. The recombinant polypeptide of any one of embodiments A52-A53, wherein the tumor-associated antigen binding domain comprises an anti-GD2 binding domain.

[0324] Embodiment A55. The recombinant polypeptide of any one of embodiments A52-A53, wherein the tumor-associated antigen binding domain comprises an anti-HER2 binding domain.

[0325] Embodiment A56. The recombinant polypeptide of any one of embodiments A52-A53, wherein the tumor-associated antigen binding domain comprises an anti-CAIX binding domain.

[0326] Embodiment A57. The recombinant polypeptide of any one of embodiments A50-A56, wherein the multi-specific antibody or bi-specific antibody comprises a second binding domain.

[0327] Embodiment A58. The recombinant polypeptide of embodiment A57, wherein the second binding domain binds to a small molecule or small molecule hapten.

[0328] Embodiment A59. The recombinant polypeptide of embodiment A58, wherein the small molecule comprises a DOTA (1, 4, 7, 10-tetraazacyclododecane-1, 4, 7, 10-tetraacetic acid) , DOTA-Bn (phenyl-1, 4, 7, 10-tetraazacyclododecane-1, 4, 7, 10-tetraacetic acid) , DTPA (Diethylenetriaminepentaacetic acid) , EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid) , NODAGA (1, 4, 7-triazacyclononane-1, 4-diacetic acid) , NETA (N, N, N', N'-tetraacetylated 1, 4, 7, 10-tetraazacyclododecane) , Cyclen (1, 4, 7, 10-tetraazacyclododecane) , Cyclam (1, 4, 8, 11-tetraazacyclotetradecane) , Bispidine (2, 2'-bispidine) , TACN (1, 4, 7-triazacyclononane) , ATSM (diacetyl-bis (N4-methylthiosemicarbazone) , SarAr (sarcosine-derived arylamine) , AmBaSar (aminobenzylsarcosine) , MAG3 (mercaptoacetyltriglycine) , MAG2 (mercaptoacetyltriglycine) , HYNIC (6-hydroxy-2, 2'-bipyridine) , DADT (diacetyl-di (N4-methylthiosemicarbazone) , EC (ethanolamine) , TRAP (3-aminopyridine-2-carboxaldehyde thiosemicarbazoneis) , NS3 (N-succinimidyl-3- (tri-n-butylstannyl) propionate) , H2dedpa (N, N'-diethyl-N, N'-di (2-pyridyl) ethylenediamine) , HBED (N, N'-bis (2-hydroxybenzyl) ethylenediamine-N, N'-diacetic acid) , DFO (deferoxamine) , PEPA (N-phenyl-N'- (2-ethoxyethyl) urea) , HEHA (N, N, N', N'-tetra (2-hydroxyethyl) ethylenediamine) , a derivative thereof, or any combination thereof.

[0329] Embodiment A60. The recombinant polypeptide of embodiments A58 or A59, wherein the small molecule is selected from the group consisting or DTPA, EDT, NOTA, DOTA, DOTA-Bn, TRAP, TETA, NETA, CB-TE2A, Cyclen, Cyclam, Bispidine, TACN, ATSM, SarAr, AmBaSar, MAG3, MAG2, HYNIC, DADT, EC, NS3, H2dedpa, HBED, DFO, PEPA, HEHA, a derivative thereof, and any combination thereof.

[0330] Embodiment A61. The recombinant polypeptide of embodiment A58, wherein the small molecule hapten comprises a DOTA-hapten selected from the group consisting of DOTA, Proteus-DOTA, DOTA-Bn, DOTA-desferrioxamine, DOTA-Phe-Lys (histamine-succinyl-glycine (HSG) ) -D-Tyr-Lys (HSG) -NH2, Ac-Lys (HSG) D-Tyr-Lys (HSG) -Lys (Tscg-Cys) -NH2, DOTA-D-Asp-D-Lys (HSG) -D-Asp-D-Lys (HSG) -NH2, DOTA-D-Glu-D-Lys (HSG) -D-Glu-D-Lys (HSG) -NH2, DOTA-D-Tyr-D-Lys (HSG) -D-Glu-D-Lys (HSG) -NH2, DOTA-D-Ala-D-Lys (HSG) -D-Glu-D-Lys (HSG) -NH2, DOTA-D-Phe-D-Lys (HSG) -D-Tyr-D-Lys (HSG) -NH2, Ac-D-Phe-D-Lys (DOTA) -D-Tyr-D-Lys (DOTA) -NH2, Ac-D-Phe-D-Lys (DTPA) -D-Tyr-D-Lys (DTPA) -NH2, Ac-D-Phe-D-Lys (Bz-DTPA) -D-Tyr-D-Lys (Bz-DTPA) -NH2, Ac-D-Lys (HSG) -D-Tyr-D-Lys (HSG) -D-Lys (Tscg-Cys) -NH2, DOTA-D-Phe-D-Lys (HSG) -D-Tyr-D-Lys (HSG) -D-Lys (Tscg-Cys) -NH2, (Tscg-Cys) -D-Phe-D-Lys (HSG) -D-Tyr-D-Lys (HSG) -D-Lys (DOTA) -NH2, Tscg-D-Cys-D-Glu-D-Lys (HSG) -D-Glu-D-Lys (HSG) -NH2, (Tscg-Cys) -D-Glu-D-Lys (HSG) -D-Glu-D-Lys (HSG) -NH2, Ac-D-Cys-D-Lys (DOTA) -D-Tyr-D-Ala-D-Lys (DOTA) -D-Cys-NH2, Ac-D-Cys-D-Lys (DTPA) -D-Tyr-D-Lys (DTPA) -NH2, Ac-D-Lys (DTPA) -D-Tyr-D-Lys (DTPA) -D-Lys (Tscg-Cys) -NH2, and Ac-D-Lys (DOTA) -D-Tyr-D-Lys (DOTA) -D-Lys (Tscg-Cys) -NH2, and any combination thereof.

[0331] Embodiment A62. The recombinant polypeptide of any one of embodiments A58-A60, wherein the small molecule is phenyl-1, 4, 7, 10-tetraazacyclododecane-1, 4, 7, 10-tetraacetic acid ( [metal] -DOTA-Bn) .

[0332] Embodiment A63. The recombinant polypeptide of any one of embodiments A57-A62, wherein the second binding domain is a single-domain antibody (sdAb) , a single chain variable fragment (scFv) , a bi-specific scFvs (bi-scFvs or di-scFvs) having the format (scFv) 2, or a diabody; optionally, the second binding domain is a scFv.

[0333] Embodiment A64. The recombinant polypeptide of any one of embodiments A1-A63, wherein the multimerization domain is operably linked to the N-terminus of the heavy or light chain or the C-terminus of the heavy chain of the antibody, or the N-terminus or the C-terminus of the antibody.

[0334] Embodiment A64.1 The recombinant polypeptide of embodiment A64, wherein the multimerization domain is operably linked to the C-terminus of the antibody.

[0335] Embodiment A65. The recombinant polypeptide of embodiment A64 or A64.1, wherein the recombinant polypeptide comprises, from N-term to C-term, the tumor-associated antigen binding domain, the second binding domain, and the multimerization domain.

[0336] Embodiment A66. The recombinant polypeptide of embodiment A64 or A64.1, wherein the recombinant polypeptide comprises, from N-term to C-term, the second binding domain, the tumor-associated antigen binding domain, and the multimerization domain.

[0337] Embodiment A67. The recombinant polypeptide of any one of embodiments A57-A66, comprising a linker between a first binding domain of the antibody (e.g., the tumor-associated antigen binding domain) , and the second binding domain.

[0338] Embodiment A68. The recombinant polypeptide of any one of embodiments A57-A67, comprising a linker between (i) the multimerization domain and (ii) a first binding domain of the antibody (e.g., the tumor-associated antigen binding domain) or the second binding domain.

[0339] Embodiment A69. The recombinant polypeptide of any one of embodiments A58-A68, wherein the small molecule (e.g., [metal] -DOTA-Bn) is radioactive or comprises a radioactive metal.

[0340] Embodiment A70. The recombinant polypeptide of embodiment A69, wherein the radioactive metal is selected from the group consisting of gallium-68 (Ga-68) , yttrium-90 (Y-90) , yttrium-86 (Y-86) , indium-111 (In-111) , lutetium-177 (Lu-177) , technetium-99m (Tc-99m) , iodine-131 (I-131) , fluorine-18 (F-18) , copper-64 (Cu-64) , zirconium-89 (Zr-89) , lead-203 (Pb-203) , lead-212 (Pb-212) , strontium-89 (Sr-89) , actinium-225 (Ac-225) , bismuth-213 (Bi-213) , astatine-211 (At-211) , dysprosium-152 (Dy-152) , bismuth-212 (Bi-212) , radium-223 (Ra-223) , radon-219 (Rn-219) , polonium-215 (Po-215) , bismuth-211 (Bi-211) , francium-221 (Fr-221) , astatine-217 (At-217) , fermium-255 (Fm-255) , dysprosium-165 (Dy-165) , rhenium-186 (Re-186) , rhenium-188 (Re-188) , copper-67 (Cu-67) , and terbium-161 (Tb-161) .

[0341] Embodiment A71. The recombinant polypeptide of any one of embodiments A1-A70, wherein the recombinant polypeptide has increased affinity to a target antigen of the antibody in comparison to a reference polypeptide.

[0342] Embodiment A72. The recombinant polypeptide of any one of embodiments A1-A71, wherein the recombinant polypeptide has reduced off-target effects in a subject in comparison to a reference polypeptide.

[0343] Embodiment A73. The recombinant polypeptide of any one of embodiments A1-A72, wherein the recombinant polypeptide has increased renal clearance in a subject in comparison to a reference polypeptide.

[0344] Embodiment A74. The recombinant polypeptide of any one of embodiments A1-A73, wherein the recombinant polypeptide has higher tumor uptake in a subject in comparison to a reference polypeptide.

[0345] Embodiment A75. The recombinant polypeptide of any one of embodiments A1-A74, wherein the recombinant polypeptide has reduced blood half-life in a subject in comparison to a reference polypeptide.

[0346] Embodiment A76. The recombinant polypeptide of any one of embodiments A71-A75, wherein the reference polypeptide has no multimerization domain and is otherwise identical to the recombinant polypeptide.

[0347] Embodiment A77. The recombinant polypeptide of any one of embodiments A71-A75, wherein the multimerization domain is replaced by an amino acid sequence comprising SEQ ID NO: 119 or 120 in the reference polypeptide, and the reference polypeptide is otherwise identical to the recombinant polypeptide.

[0348] Embodiment A78. A conjugate comprising: two or more molecules of the recombinant polypeptide of any one of embodiments A1-A77, bind to form a multimer of the recombinant polypeptide.

[0349] Embodiment A79. The conjugate of embodiment A78, comprising a trimer, tetramer, pentamer or hexamer of the recombinant polypeptide.

[0350] Embodiment A80. The conjugate of embodiment A78 or A79, wherein the conjugate comprises a radioactive metal.

[0351] Embodiment A81. An isolated nucleic acid encoding the recombinant polypeptide of any one of embodiments A1-A77.

[0352] Embodiment A82. An expression vector comprising a nucleic acid segment encoding the recombinant polypeptide of any one of embodiments A1-A77.

[0353] Embodiment A83. A recombinant host cell comprising the expression vector of embodiment A82 or the nucleic acid of embodiment A81.

[0354] Embodiment A84. A method comprising administering to a subject in need thereof: the recombinant polypeptide of any one of embodiments A1-A77, the conjugate of any one of embodiments A78-A80, the isolated nucleic acid of embodiment A81, the expression vector of embodiment A82, or the recombinant host cell of embodiment A83.

[0355] Embodiment A85. The method of embodiment A84, further comprising clearing unbounded recombinant polypeptide from the subject.

[0356] Embodiment A86. The method of embodiment A84 or A85, further comprising administering a small molecule that binds to the recombinant polypeptide, after the recombinant polypeptide is administered to the subject; optionally, wherein the small molecule binds to the second binding domain of the recombinant polypeptide.

[0357] Embodiment A87. The method of embodiment A86, wherein the small molecule is administered about 1 hour to about 168 hours after the recombinant polypeptide is administered to the subject.

[0358] Embodiment A88. The method of embodiment A86 or A87, wherein the small molecule is administered about 48 hours after the recombinant polypeptide is administered to the subject.

[0359] Embodiment A89. The method of any one of embodiments A86-A88, wherein the small molecule is radioactive.

[0360] Embodiment A90. The method of embodiment A89, wherein the radioactive small molecule comprises [metal] -DOTA-Bn.

[0361] Embodiment A91. The method of embodiment A90, wherein the radioactive metal in [metal] -DOTA-Bn is selected from the group consisting of Ga-68, Y-90, Y-86, Cu-64, Pb-203, In-111, Lu-177, Tc-99m, I-131, F-18, Sr-89, Ra-223, Ac-225, Pb-212, Cu-67, and Tb-161.

[0362] Embodiment A92. The method of any one of embodiments A84-A91, wherein the method is for treating cancer.

[0363] Embodiment A93. The method of embodiment A92, wherein the cancer is selected from the group consisting of neuroblastoma, melanoma, brain tumor, osteosarcoma, breast cancer, liposarcoma, fibrosarcoma, malignant fibrous histiocytoma, leiomyosarcoma, spindle cell sarcoma, retinoblastoma, brain tumor, small cell lung cancer, glioma, soft tissue sarcoma, bladder cancer, colorectal cancer and prostate tumor.EXAMPLESExample 1: De novo design and generation of multimerization peptides.

[0364] Purpose: This study sought to generate multimerization peptides by systematically manipulating heptad repeats within the multimerization peptide sequences that exhibit a propensity to from alpha-helical structures.

[0365] Methods: The heptad repeats within the multimerization peptide sequences typically follow the pattern X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7. Within these heptads the hydrophobic side chains are in close proximity, averaging approximately every 3.5 residues in a typical heptad repeat, which leads to the formation of amphipathic helices. The interacting surfaces of the helices often contain hydrophobic amino acids, such as leucine, which can result in the formation of a 'leucine zipper'due to the arrangement of leucine residues on the interacting surfaces.

[0366] This study comprised optimizing multimerization peptides through sequence design to achieve more desirable structural and biological properties such as helix formation, stability, and solubility. The procedure for optimization involved systematically varying the amino acid residues at specific positions within the heptad repeats to fine-tune the overall function of the multimerization peptide. A standard heptad sequence comprises the sequence X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7 where the (1) positions X2 and X5 are typically occupied by hydrophobic amino acids, (2) positions X3 and X4 are typically occupied by amino acids with relatively small side chains, such as alanine, which favors helix formation, (3) position X7 is often occupied by glutamine or lysine, which can improve helix stability or solubility, and (4) position X1 and X6 usually accommodate charged amino acids to enhance stability. The amino acids at these designated positions can be altered to improve various structural properties such as helix formation and stability.

[0367] In particular this study focused on optimizing the design of trimeric and tetrameric multimerization peptides, and included systematically altering the peptide length, solubility, and charge, as well as polarity-related amino acids. The multimerization peptides designed and generated in this study have amino acid sequences comprising SEQ ID NOs: 1-60 (Table 2) . These include predominantly "Tri" and "Tet" multimerization peptides that represent the basic trimeric and tetrameric peptide formations with four heptad repeats, while the remaining polypeptides were modifications based on these forms. The modifications labeled “-5” were extended to five heptad repeats.

[0368] To demonstrate the versatility of the designed multimerization peptides, the above constructs were next incorporated into various antibody formats with different targeting domains to validate their feasibility and various structural properties. A series of in vitro and in vivo validations were conducted as described in further detail below to prove the universality and manufacturability of the designed multimerization peptides comprising alpha-helices.Example 2: Design and generation of conjugates comprising a hu3F8-C825 bi-specific antibody and the multimerization peptides of Example 1.

[0369] Purpose: To verify the formation of the multimerization peptides, the multimerization peptides were conjugated to a hu3F8-C825 bi-specific antibody to form various hu3F8-C825-MD (MD, “multimerization domain” ) conjugates. This approach allows for the assessment of both the formation of oligomers by the multimerization peptides and the affinity of the bi-specific antibodies in vitro and in vivo when conjugated with the multimerization peptides.

[0370] Methods: In subsequent constructions where the multimerization peptides were conjugated to the bi-specific antibodies, a pre-targeting strategy was employed. The target antibody, hu3F8, an anti-GD2 antibody, was first conjugated with an anti-small molecule antibody C825, an anti-DOTA, to generate a bi-specific antibody. The multimerization peptide was then conjugated to the bi-specific antibody. This approach allowed for the evaluation of multimerization peptide oligomerization and disassociation. The hu3F8-C825-MD conjugates comprise three primary components: (1) a first scFv binding domain that binds to a payload (e.g., a therapeutic agent) ; (2) a second scFv binding domain that targets a specific cell target (e.g., a cell surface marker) ; and (3) a multimerization domain (MD) . The two different scFv domains are connected by a linker and then fused to a MD. Commonly used linkers include (GGGS) n or (GGGGS) n, where different linker lengths may also impact oligomer formation, including in most cases n = 2 to 4.

[0371] A library of 24 molecular constructs was created, each varying in the MD. All constructs incorporated a first scFv targeting tumor cells (humanized anti-GD2 scFv, hu3F8) and a second scFv targeting the metal chelator phenyl-1, 4, 7, 10-tetraazacyclododecane-1, 4, 7, 10-tetraacetic acid ( [metal] -DOTA-Bn) (C825) . The second scFv recognizes [metal] -DOTA-Bn when complexed with metal ions such as Lu-177, Y-86, Y-90, and In-111. The MD was positioned at either the N-or C-terminus of the antibody, with the C-terminus being the preferred site.

[0372] The hu3F8-C825 bi-specific antibody, together with the multimerization peptide, was constructed into the expression vector pCDNA4 and transfected into HEK293 cells for antibody expression. After 6-7 days of culture, the transient expression supernatant was collected and purified using a suitable affinity resin (e.g., Protein L resin) . An hu3F8-C825-P53 antibody was also constructed and purified as a control. The hu3F8-C825-P53 is a SADA platform antibody that is known to form tetramers. The P53 peptide is derived from a sequence of the cellular tumor protein p53 and is a natural human sequence. Under the influence of the P53 peptide, a self-assembling and disassembling (SADA) platform can self-dissociate or reassemble, displaying a dynamic equilibrium between the monomer and tetramer forms. Given these features, the SADA platform antibody was selected as a control.

[0373] A comparison of the amino acid sequences for the control conjugate hu3F8-C825-P53 (SEQ ID NO: 61) and newly generated conjugate hu3F8-C825-Tet-HD-5 (SEQ ID NO: 62) is shown in FIG. 1.

[0374] The oligomeric state of the antibodies was further verified by assessing the molecular weight of the conjugates. SEC-HPLC and SEC-MALS analyses were conducted on the purified antibodies. Results of the SEC-MALS analyses comparing hu3F8-C825-Tet-HD-5 and hu3F8-C825-P53 conjugates are provided in Tables 6-8 below and Figs. 2A-2B.Table 6. SEC-MALS analysis of hu3F8-C825-Tet-HD-5 conjugate Table 7. SEC-MALS analysis of hu3F8-C825-P53 conjugate Table 8. Theoretical and measured molecular weight of hu3F8-C825-Tet-HD-5 and hu3F8-C825-P53 conjugates

[0375] As shown in Table 9 below, the SEC-MALS results correlate well with those of SEC-HPLC, indicating that the oligomeric state of the antibody can be inferred from the elution time. These findings demonstrate the oligomeric forms and purity of the antibodies can be determined based on the retention time and the area percentage of the main peak. These detectable constructs were further evaluated for various biological and mechanical properties.Table 9. Summary of Purity and Oligomerization Analysis of hu3F8-C825-MD Conjugates Example 3: Optimization of multimerization domain containing bi-specific antibody conjugates for enhanced therapeutic and structural properties.

[0376] Purpose: To verify the formation and function of the multimerization peptides from Example 1, the multimerization peptides were conjugated to various bi-specific antibodies as described in Example 2 to form conjugates with enhanced therapeutic and structural properties. Based on additional detection assays, these conjugates were optimized to further enhance properties related to therapeutic use. Moreover, the approach of conjugating the multimerization peptides to the bi-specific antibody also allows for the assessment of both the formation of oligomers by the multimerization peptide helices and the binding affinity of the antibodies in vitro and in vivo when conjugated with the multimerization peptide.

[0377] Methods: To evaluate multimerization peptide formation, bi-specific antibodies were co-expressed and purified as in Example 2. However, for this study either a H1 antibody targeting HER2 or hu3F8 antibody targeting GD2 was linked to the C825 antibody targeting small molecule DOTA. The multimerization peptides were then conjugated to the hu3F8-C825 and H1-C285 bi-specific antibodies to form the constructs hu3F8-C825-MD and H1-C825-MD. These conjugates were then characterized by analyzing protein purity, conformation, and expression levels with the assays described in Example 2. Based on these findings the fusion proteins were optimized for properties including solubility, stability, orthogonality, and helix regulation of the helices. Additional analyses were conducted to assess the effect of extending multimerization heptad repeats from four to five repeats.Solubility

[0378] First, the bi-specific antibody constructs were engineered to optimize solubility. Solubility is primarily determined by the charge and polarity of amino acids and their ability to interact with surrounding water molecules. In the X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7 heptad repeat of the multimerization peptides, the X7 position is often occupied by amino acids related to solubility, such as the hydrophilic amino acids lysine (K) , glutamine (Q) , or serine (S) . Given, antibody solubility is critical throughout the drug development process, antibodies with good solubility generally exhibit better stability. Therefore, a series of multimerization peptides were designed to specifically modify solubility. Specifically, SEQ ID NOs: 2, 14, 21-23, 45-47, and 54 [Tri-QQ / Tri-Q21 / Tet-Q21 / Tet-QQ / Tri-K21 / Tet-K21 / Tet-3K / Tri-KK / Tri-4K] , involved the substitution of all or part of the amino acids at position X7 with hydrophilic glutamine (Q) to enhance solubility. The characterization assay results for these purified constructs are shown in Table 10 below. In Tri-QSS (SEQ ID NO: 19) , all or part of the X7 position amino acids have been replaced with serine (S) , an even more soluble modification (shown in Table 9) . These findings demonstrated that mutating the amino acid at position X7 significantly improved the purity and stability of the mutant antibodies compared to the original polypeptides “Tri” and “Tet” constructs. Additionally, the expression levels of some mutant antibodies were also enhanced, suggesting that altering position X7 improved solubility.Table 10. Expression of hu3F8-C825-MD conjugates optimized for solubility. Stability

[0379] Next, constructs were optimized to assess stability. Stability is a critical feature for achieving positive pharmacokinetic responses to antibody drugs. Positions X2 and X5 within the heptad repeats comprise hydrophobic amino acids, such as leucine and isoleucine. These hydrophobic residues are crucial for establishing tight knob-into-hole packing and controlling the oligomeric state of the helix. The multimerization platform used herein enables regulation of the ability of antibodies to dissociate, thereby allowing one to adjust the half-life. The stability engineering performed considered both increases and decreases in stability, as both may be of interest depending on the therapeutic program. Bi-specific antibodies conjugated to multimerization peptides (SEQ ID NOs: 4-6, 12, 26, and 59 [Tri-NL / Tri-Q / Tri-K / Tri-IN / Tri-LL / Tet-N5] ) were constructed to enhance their stability and prolong the drug metabolic half-life. These primarily involve replacing the leucine or isoleucine at the X2 or X5 position with polar amino acids such as asparagine (N) . The hydrophobic interaction between the amino acids at the X2 and X5 positions (similar to a leucine zipper) promotes the formation of a helical structure in the polypeptide sequence. Replacing one of these amino acids with a polar amino acid disrupts the original hydrophobic interactions and may lead to the instability of the helix core, thus possibly reducing the stability of the construct and making it prone to dissociation. The characterizations of these constructs after purification are shown in Table 11 below. Mutations at position X2 and X5 appeared to weaken hydrophobic interactions, leading to decreased stability, reduced purity, and increased turbidity of the mutant antibodies. These findings suggest that targeting positions X2 or X5 could be a strategy to modulate antibody half-life and stability.Table 11. Expression of H1-C825-MD and hu3F8-C825-MD constructs optimized for stability.

[0380] The solubility and stability modifications above can be combined to further enhance the constructs of interest. Examples of such optimizations to the multimerization peptides include SEQ ID NOs: 3, 7, 24-25, 27-29, 55, and 58 [Tri-N27 / Tri-N5 / Tri-NN / Tri-NQQN / Tri-LQ / Tri-KN / Tri-KIN / Tet-N27 / Tet-NQQ] . Building upon the stability engineering described above, further modifications were introduced to improve solubility. The characterization of these constructs after purification is shown in Table 12 below. The results show that the purity of certain polypeptides, such as Tri-LQ (SEQ ID NO: 3) and Tet-N27 (SEQ ID NO: 55) , was enhanced after the introduction of solubility-enhancing amino acids compared to those with mutations only at positions X2 and X5. However, when the number of mutations at positions X2 and X5 within the seven-amino acid multimerization peptide increased, even with the addition of solubility-enhancing amino acids, the stability and purity of the polypeptides remained low, as exemplified by Tri-NQQN (SEQ ID NO: 29) .Table 12. Expression of H1-C825-MD and hu3F8-C825-MD constructs optimized for solubility and stability. Orthogonality

[0381] To ensure the orthogonality of the multimerization peptide helix, charged amino acids are generally placed at the X1 and X6 positions of the heptad repeat, resulting in peptide pairs with unique electrostatic motifs that promote helix formation through electrostatic interactions. Altering the original charged amino acid at the X1 and X6 position to increase or decrease the electrostatic force can also lead to a more stable and easily formed helix or a less stable and more easily dissociated helix, respectively. Additionally, as described previously, mutations can also be made in conjunction with amino acids related to solubility to either promote or inhibit helix formation. Mutations such as in the multimerization peptides having SEQ ID NOs: 13, 17-18, and 30-31 [Tri-S23 / Tri-SS / Tri-KE / Tri-KQQ / Tri-RD] employ this approach. The characterization of these constructs is shown below in Table 13. These findings demonstrate that mutating the X1 and X6 position to an uncharged amino acid destabilizes the helix and promotes dissociation. Therefore, to maintain the orthogonality of the helix, it is preferable to place a charged amino acid at the X1 and X6 position. Another effective approach could be to incorporate glutamine at both the X1 and X6 positions.Table 13. Expression of H1-C825-MD and hu3F8-C825-MD constructs optimized for orthogonality Helix Regulation

[0382] Next, constructs were optimized based on the X3 and X4 position of the multimerization peptide, which primarily function to regulate helix formation of the multimerization peptide helix. During construct optimization, alanine was selected for positions X3 and X4 for its smaller side chain, to prevent unexpected effects caused by side chain interactions and promote a high propensity for helix formation. It was hypothesized that introducing two amino acids with opposite charges would increase both the electrostatic interaction and the van der Waals forces, thereby enhancing stability. However, introducing two amino acids with the same charge may result in additional spatial repulsion, causing the helix to stretch and thereby affect helix stability. By enhancing amino acids at the X3 and X4 position related to helix formation in combination with enhancing amino acids related to solubility, oligomer formation, and helix orthogonality, the multimerization peptide may be more dynamic and the conjugated antibody may have a more suitable half-life for drug development. Alternatively, all mutations could introduce glutamine, an amino acid related to solubility. Multimerization peptide sequences such as SEQ ID NOs: 15-16, 20, 36, 41, 43-44, 52, and 53 [Tri-EQE / Tri-KQK / Tri-VS / Tri-HD / Tet-HD / Tet-HDN / Tet-EK / Tet-EQK / Tri-KHDN] were modified for these purposes. Further characterization of these purified constructs is shown below in Table 14.

[0383] When the amino acids at positions X3 and X4 were substituted with amino acids carrying the same charge, the resulting electrostatic repulsion caused a decrease in helix curvature, as exemplified by Tri-KQK (SEQ ID NO: 16) . In contrast, mutations to oppositely charged amino acids led to increased helix curvature due to electrostatic attraction, as observed in Tri-HD (SEQ ID NO: 36) , Tri-KHDN (SEQ ID NO: 41) , and Tet-EK (SEQ ID NO: 43) , as well as Tet-HD (SEQ ID NO: 53) . However, further mutations at positions X2 and X5 reduced the stability of these constructs, as seen in Tet-HDN (SEQ ID NO: 52) . These findings indicate that to enhance helix curvature and stability, it is advantageous to substitute the amino acids at positions X3 and X4 with oppositely charged residues.Table 14. Expression of hu3F8-C825-MD constructs optimized to regulate helix curvature. Elongated heptad repeats

[0384] The original trimeric and tetrameric multimerization peptides ( “Tri” and “Tet” ) referenced above consist of four heptad repeats. The peptide sequences were extended to five heptad repeats to increase the helicity between the peptides, thereby enhancing their stability. Both H1-C825-MD and hu3F8-C825-MD constructs were modified with the extended multimerization peptides (SEQ ID NOs: 8-11, 32-35, 37-40, 48-51, 56-57, and 60 [Tri-5, Tri-QN-5, Tri-QQ-5, Tri-EHD-5, Tri-N27-5, Tri-SN-5, Tri-NSN-5, Tri-QQ-N-5, Tri-HD-5, Tri-QHD-5, Tri-KHD-5, Tri-KHDN-5, Tet-QHD-5, Tet-HD-5, Tet-KHD-5, Tet-3KHD-5, Tet-5, Tet-KE-5, and Tet-QQ-5] ) . Characterization of the constructs is described below in Table 15.

[0385] In some instances, when the polypeptide helix was extended from four to five turns, the recombinant polypeptides showed improvement compared to the control constructs in one of the measured parameters, such as antibody purity, expression level, or protein stability. These findings indicate extending the polypeptide length can be an effective strategy for enhancing stability or solubility.Table 15. Expression of H1-C825-MD and hu3F8-C825-MD constructs with elongated multimerization peptides comprising 5 heptad repeats

[0386] Based on the validation results of the above studies, all fusion proteins with a main peak purity exceeding 90%were considered candidates for further development and testing.Example 4. Evaluation of binding affinity between hu3F8-C825-MD antibody conjugates with GD2 antigen using ELISA

[0387] Purpose: This study sought to assess the binding affinity of the hu3F8-C825-MD conjugates with GD2 antigen measured by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) .

[0388] Methods: Microtiter plates were coated with GD2 antigen at a concentration of 0.5 μg / mL (20 μL / well) and incubated overnight at 4℃. After blocking with 3%bovine serum albumin (BSA) , serial dilutions of the novel test antibody constructs (primary antibody) were prepared starting at a concentration of 200 μg / mL. Following incubation at 37℃, 175Lu-DOTA-Bn-C37-cHis antibody (0.5 μg / mL) and His-HRP secondary antibody were added sequentially. The plate was then read on a microplate reader and the overall binding activity was detected. The hu3F8-C825-P53 was used as a control antibody. A summary of the ELISA assays is presented in Table 16.Table 16. Summary of ELISA-based activity assessment of hu3F8-C825-MD conjugates

[0389] Results: The ELISA results revealed that the binding affinity of many of the mutated constructs was higher than that of the control hu3F8-C825-P53 construct. In sum, the activity results indicate that the MD containing bi-specific antibody constructs binds well to both GD2 and DOTA-Bn.Example 5. Evaluation of binding affinity between hu3F8-C825-MD antibody conjugates with GD2 antigen using FACS

[0390] Purpose: This study sought to assess the binding affinity of the novel hu3F8-C825-MD conjugates with GD2 antigen by fluorescence-activated cell sorting (FACS) .

[0391] Methods: Human Melanoma Cells (M14 cells, 1x105 cells per well) were incubated with hu3F8-C825-MD antibodies at 37℃ for 1h. 175Lu-DOTA-Bn-C37-cHis antibody (0.5 μg / mL) and Anti-His-PE (2 μL per well) secondary antibody were added sequentially. The plate was then detected by flow cytometry. hu3F8-C825-P53 was used as a control antibody at a saturating concentration of 30 μg / mL, while the modified hu3F8-C825-MD antibodies were added at equimolar amounts. Moreover, a representative IMR32 (Neuroblastoma) binding curve was conducted using the hu3F8-C825-Tet-HD-5 (SEQ ID NO: 62) conjugate in comparison to the control hu3F8-C825-P53 conjugate.

[0392] Results: A summary of the FACS results are presented in FIGs. 3A-3B. FIG. 3A showed that many of the hu3F8-C825-MD antibody constructs exhibited robust binding to GD2 (+) tumor lines, M14 (Melanoma) . FIG. 3B showed that hu3F8-C825-Tet-HD-5, selected as a representative hu3F8-C825-MD conjugate, has similar IMR32 cell binding ability hu3F8-C825-P53. As shown in FIGs. 3A-3B, a FACS analysis using a second antibody 175Lu-DOTA-Bn-C37-cHis conjugate demonstrated that the hu3F8-C825-Tet-HD-5 antibody construct can bind GD2 on the cell surface in two different tumor cell lines while also simultaneously binding a second antigen (DOTA-Bn) , which is critical for pre-targeted radioimmunotherapy (PRIT) .Example 6. Stability testing of the generated hu3F8-C825-MD antibody conjugates.

[0393] Purpose: Due to the unique properties of the hu3F8-C825-MD antibody conjugates, aggregates are not formed by disulfide bonds or other covalent interactions, but rather by hydrophobic interactions. Therefore, the hu3F8-C825-MD antibody conjugates can transition between oligomeric and monomeric states, and any conditions that affect hydrophobic interactions may impact the stability of the antibodies. This study sought to assess the stability of the hu3F8-C825-MD antibody conjugates when stored at 25℃ for two weeks.

[0394] Methods: The hu3F8-C825-MD antibodies were placed in a 25℃ incubator, and their protein concentration and purity were measured at Day 0 (D0) , Day 7 (D7) , and Day 14 (D14) .

[0395] Results: The results are shown in Tables 17 and 18 below. Results demonstrated that the protein concentration of the modified hu3F8-C825-MD antibodies remained relatively stable after storage at 25℃ for two weeks. While a small portion of the antibody exhibited changes in purity, indicating potentially some instability of the oligomeric form under these conditions, a larger portion maintained a stable oligomeric state and high purity after two weeks of storage at 25℃.Table 17. Summary of protein concentration measurements for hu3F8-C825-MD conjugates after Storage at 25℃ Table 18. Summary of purity assessment for hu3F8-C825-MD conjugates following storage at 25℃ Example 7. Pre-mixed pharmacokinetics of hu3F8-C825-MD antibody conjugates in non-tumor-bearing ICR mice

[0396] Purpose: This study sought to assess the speed of in vivo clearance of the MD domain-containing hu3F8-C825-MD antibody conjugates with tetrameric structures.

[0397] Methods: In a pre-mixed pharmacokinetics study in ICR mice, a representative radiolabeled pharmacokinetic study was conducted using one of the newly generated hu3F8-C825-MD antibody constructs, hu3F8-C825-Tet-HD-5 (SEQ ID NO: 62) . The hu3F8-C825-Tet-HD-5 antibody and the control hu3F8-C825-P53 (SEQ ID NO: 61) antibody were premixed with 177Lu-DOTA-Bn and intravenously administered to ICR mice at a dose of 100 μCi per animal. After dosing, blood samples were collected at 0.083, 0.25, 0.5, 1, 2, 4, 6, 24, 48, 72, 96, and 120 hours, and then weighed, and counted for gamma emissions. Data were decay-corrected to calculate blood percentage of injected dose per gram (%ID / g) , to provide a measurement of the amount radiotracer in the mouse’s blood.

[0398] Results: As shown in FIG. 4, the in vivo clearance of the modified hu3F8-C825-Tet-HD-5 antibody was faster than that of the control antibody hu3F8-C825-P53. Specifically, the blood %ID / g values for the hu3F8-C825-MD antibody and the control antibody were 0.59%and 1.40%, respectively, at 24 hours, and approximately 0.12%and 0.23%, respectively, at 48 hours. Values decreased further after 72 hours. In sum, these findings demonstrated that the modified MD containing bi-specific antibody conjugates generated herein had a surprisingly faster clearance than a previously developed antibody, even without the use of clearance agents.Example 8. Cold protein pharmacokinetics of hu3F8-C825-MD antibody conjugates in rats

[0399] Purpose: To assess the in vivo clearance of the generated MD-containing bi-specific antibody conjugates using a cold protein pharmacokinetic analysis in rats.

[0400] Methods: A representative cold protein ELISA pharmacokinetic study was conducted using one of the hu3F8-C825-MD conjugates, specifically hu3F8-C825-Tet-HD-5 (SEQ ID NO: 62) . Female and male Sprague-Dawley (SD) rats (n=6 / group) were intravenously administered a single dose of 0.6 mg per animal. Blood samples were collected at 0.083, 0.25, 0.5, 1, 2, 4, 6, 24, and 48 hours post-dose. Serum antibody concentrations were determined by ELISA using GD2 antigen as the coating antigen. The plates were blocked with 3%BSA and incubated with the test samples. After incubation with 175Lu-DOTA-Bn-C37-cHis antibody, His-HRP secondary antibody was added, and the plates were read. In addition, hu3F8-IgG was used as a control antibody. The associated pk detection reagent applied was the corresponding secondary antibody, Hu IgG HRP.

[0401] Results: As shown in FIG. 5, approximately 2%of the initial hu3F8-C825-Tet-HD-5 (SEQ ID NO: 62) antibody concentration remained in the blood at 24 hours post-dose, decreasing to less than 1.5%at 48 hours. In contrast, approximately 37%of the initial hu3F8-IgG concentration was still detectable in the blood at 48 hours post-dose. Moreover, the elimination half-life (t1 / 2) was 7.0 ± 4.2 hours versus 31.8 ± 12.3 hours for hu3F8-C825-tet-HD-5 and hu3F8-IgG, respectively. These results indicate that the hu3F8-C825-Tet-HD-5 antibody was almost completely cleared from the blood within 48 hours post-dose without the use of clearance agents. Moreover, the clearance of the hu3F8-C825-Tet-HD-5 antibody significantly faster than the clearance rate of the conventional hu3F8-IgG antibody.Example 9. Effects of different administration intervals, nuclide doses and hu3F8-C825-MD conjugate doses on distribution in vivo

[0402] Purpose: The purpose of this study was to evaluate the effects of different administration intervals, nuclide (177Lu-DOTA-Bn) dosages, and hu3F8-C825-MD conjugate doses on distribution of the hu3F8-C825-MD antibody conjugates in vivo using a mouse model.

[0403] Methods: A representative study of different influences on distribution in vivo was conducted using one of the hu3F8-C825-MD conjugates, hu3F8-C825-Tet-HD-5 (SEQ ID NO: 62) . IMR32 tumor-bearing mice were pre-targeted with hu3F8-C825-Tet-HD-5 conjugate, and then given the nuclide 177Lu-DOTA-Bn 48 hours later. Next, IMR32 tumor-bearing mice were pre-targeted with hu3F8-C825-Tet-HD-5, and then given 177Lu-DOTA-Bn after 24, 48 and 72 hours, respectively. All animals underwent SPECT CT scans at 1 hour, 4 hours, 24 hours, 48 hours, 72 hours, and 96 hours after 177Lu-DOTA-Bn administration to assess distribution of the antibody conjugate in regions of interest, including uptake by the tumor and important organs, by measuring radioactivity in those regions.

[0404] Results: Results are in FIGs. 6A-6C. Subsequent increases in the antibody conjugate did does not increase tumor uptake, but instead resulted in increased radioactive activity in other non-target organs, including the heart and kidney, due to greater accumulation of the bi-specific antibody in those organs (FIG. 6A) . Interestingly, FIG. 6B shows that a longer interval of administration results in a lower uptake of the antibody conjugate by tumors and non-target organs. After comprehensive evaluation, 48 hours was determined to be the most reasonable interval of administration. Moreover, FIG. 6C shows that after a certain amount of antibody conjugate is pre-targeted the tumor uptake is proportional to the dose of nuclide administered at first, but subsequent increases in the nuclide did not further increase tumor uptake. However, the growth rate of the therapeutic index is slower than that of the tumor, and the increase of the amount of nuclide administered increased the radioactive activity of other organs.Example 10. Pharmacokinetics of hu3F8-C825-MD conjugates in a tumor-bearing IMR32 mouse model

[0405] Purpose: To assess the pharmacokinetics of select hu3F8-C825-MD conjugates administered in a tumor-bearing IMR32 mouse model.

[0406] Methods: IMR32 tumor-bearing mice were administered 1.25 nmol of select hu3F8-C825-MD bispecific antibody conjugates, followed by approximately 1 millicurie (mCi) per animal of 177Lu-DOTA-Bn 48 hours later. The hu3F8-C825-MD conjugates assessed included:a. hu3F8-C825-Tet-K21b. hu3F8-C825-Tet-HD-5c. hu3F8-C825-Tet-KE-5d. hu3F8-C825-Tet-QQ-5e. hu3F8-C825-Tet-3Kf. hu3F8-C825-Tri-4kg. hu3F8-C825-Tet-KHD5.

[0407] The hu3F8-C825-P53 antibody was used as a control. Blood samples were collected at 0.083, 0.5, 1, 2, 4, 24, 48, 72, and 96 hours post-177Lu administration, and then weighed, and subjected to gamma-counting. Decay correction was applied to obtain blood %ID / g in order to measure radioactivity.

[0408] Results: As shown in FIG. 7, in tumor-bearing mice administered a hu3F8-C825-MD conjugate the blood retention of DOTA-Bn was significantly lower compared to the control hu3F8-C825-P53 antibody. While the hu3F8-C825-Tet-K21 and hu3F8-C825-Tet-KHD5 group exhibited slower 177Lu metabolism in the blood at 24 hours post-administration of hu3F8-C825-MD antibody, approximately 0.58%and 0.31%remaining, respectively, all other hu3F8-C825-MD groups demonstrated slightly faster 177Lu metabolism compared to the control antibody, approximately 0.1%vs 0.25%at 24 hours, respectively.

[0409] In sum, these findings reflect the in vivo metabolism of select hu3F8-C825-MD conjugates 48 hours post-injection, indicating that only minimal amounts of the hu3F8-C825-MD conjugates remained in the blood 48 hours after pre-targeting, which is a highly advantageous pharmacokinetic property for PRIT. Upon administration of single-dose of 177Lu-DOTA-Bn, the mice that were administered the select hu3F8-C825-MD conjugates showed almost complete clearance of DOTA-Bn, which highlights the unexpected finding that nearly all the administered hu3F8-C825-MD conjugate present in vivo self-cleared within this interval.Example 11. Assessment of in vivo biodistribution of the hu3F8-C825-MD antibody conjugates in a tumor-bearing IMR32 mouse model

[0410] Purpose: To evaluate the in vivo distribution and accumulation of select hu3F8-C825-MD conjugates in comparison to a hu3F8-C825-P53 antibody in tumor-bearing IMR-32 mice.

[0411] Methods: IMR32 cells (GD2-positive cells) were subcutaneously inoculated into mice. Approximately 20 days post-tumor inoculation, 1.25 nmol of the hu3F8-C825-MD conjugates was administered via pre-targeting, followed by approximately 1 mCi of 177Lu-DOTA-Bn 48 hours later. The hu3F8-C825-MD conjugates evaluated included:a. hu3F8-C825-Tet-K21b. huF38-C825-Tet-HD-5c. hu3F8-C825-Tet-KE-5d. hu3F8-C825-Tet-QQ-5e. hu3F8-C825-Tet-3Kf. hu3F8-C825-Tri-4Kg. hu3F8-C825-Tet-KHD-5.

[0412] The hu3F8-C825-P53 antibody was used as a control. Volumes of interest (VOIs) were drawn on the acquired images at 1, 4, 24, 48, 72, and 96 hours post-injection to calculate the uptake values in various organs including heart, lung, liver, spleen, kidney, small intestine, stomach, bone, and the tumor itself.

[0413] Results: As shown in FIGs. 8A-8H and 9A-9H, the hu3F8-C825-MD antibody demonstrated significant tumor-specific uptake with relatively low uptake in non-target organs. Notably, the issue of high renal uptake associated with small antibodies and high hepatic uptake associated with large antibodies was not found to be an issue with these new conjugates. The MD containing bi-specific antibody conjugates evaluated herein achieved high tumor uptake while maintaining a low off-target effect, indicating that conjugating the multimerization peptide to the bi-specific antibody hu3F8-C825 not only preserved the long tumor retention time of large antibodies but also benefited from the rapid metabolism of small antibodies, resulting in low off-target effects. Moreover, these results indirectly support a hypothesis that the multimerization peptide dissociates from its polymeric form into monomers during systemic circulation and is subsequently metabolized and excreted from the body.

[0414] In addition, despite the rapid clearance of the select hu3F8-C825-MD conjugates from the serum as previously described, the total tumor uptake was unaffected. As shown in FIG. 10 tested conjugates were stably retained at the target site, even after 96 hours. This prolonged retention at the target site, in contrast to the rapid clearance from all non-target tissues (such as blood) , demonstrates the excellent in vivo activity of the MD containing bi-specific antibody conjugates.

[0415] In sum, these data demonstrate the superior in vivo metabolic profile of the MD containing conjugates in comparison to the p53 control antibody, along with other advantageous properties including rapid clearance from the blood and stable binding to tumor sites. Specifically, the metabolic profiles of the new conjugates were modulated by the density of the target antigen, and in the presence of the target cognate antigen, the new conjugates’ self-assembled polymeric state exhibited high affinity leading to stable retention at the tumor site. Conversely, in the absence of antigen (i.e., at off-target sites) , the polymer dissociated into monomeric units, followed by rapid clearance.Example 12. Ex vivo biodistribution and dosimetry of a hu3F8-C825-MD conjugate in tumor-bearing mice

[0416] Purpose: To assess the ex vivo distribution and dosimetry of a generated hu3F8-C825-MD conjugate, hu3F8-C825-Tet-HD-5 (SEQ ID NO: 62) , in tumor-bearing IMR32 mice.

[0417] Methods: IMR32 cells (GD2-positive cells) were subcutaneously inoculated into mice. Approximately 20 days post-tumor inoculation, 1 nmol of a hu3F8-C825-Tet-HD-5 conjugate was administered via pre-targeting, followed by the administration of approximately 1 mCi of 177Lu-DOTA-Bn 48 hours later. A tissue autopsy was performed at about 2, 24, 48, 72 and 120 hours post-dose to collect and weigh blood, heart, lung, liver, spleen, kidney, stomach, intestine, femur, muscle, bone marrow, brain, tumor and other organs. The radioactivity count was measured with a gamma counter to calculate the percentage of radioactive injected dose uptake (%ID, corrected for decay as described above) per gram of tissue (%ID / g) in each organ.

[0418] Results: Ex vivo biodistribution data is in FIG. 11. As shown, tumor specific uptake was both high and stably retained after 96 hours, while non-target organ uptake was relatively low, which is indicative of rapid clearance. These findings further demonstrate excellent in vivo activity of the novel conjugates generated herein.

[0419] In addition, dosimetry estimates for two-step MD-PRIT were generated through the above biodistribution data (Table 19) . On the basis of these findings, the hu3F8-C825-Tet-HD-5 conjugate was estimated to safely deliver an absorbed organ dose of 5, 985 cGy to the tumor using a 15 MBq dose of DOTA [177Lu] payload, with the kidneys and blood receiving only196.5 cGy and 10.5 cGy, respectively.Table 19. Multimerization domain PRIT Dosimetry aClin Cancer Res (2021) 27 (2) : 532–541Example 13. Evaluation of antitumor activity of the generated hu3F8-C825-MD conjugates in an IMR32 mouse xenograft model

[0420] Purpose: To evaluate the anti-tumor activity of a newly generated hu3F8-C825-MD conjugate, hu3F8-C825-Tet-HD-5 (SEQ ID NO: 62) in an IMR32 mouse xenograft model.

[0421] Methods: IMR32 cells (GD2-positive cells) were subcutaneously inoculated into mice. Once tumors reached a volume of 500 mm3 or greater, mice were randomized into groups (n=6 per group) and administered 0.2 nmol of the hu3F8-C825-Tet-HD-5 conjugate (SEQ ID NO: 62) . 48 hours later, approximately 0.5 mCi per animal of 177Lu-DOTA-Bn was administered. This treatment regimen was repeated once a week for a total of two administrations. Mice were monitored for overall health status, and tumor volume and body weight were measured three times per week.

[0422] Results: As shown in FIGs. 12A-12D and FIGs. 13A-13C, the two-step PRIT regimen using the hu3F8-C825-Tet-HD-5 conjugate significantly reduced the tumor burden in mice and even resulted in complete tumor eradication, without causing any apparent adverse effects on body weight. Notably, the tumor burden in this experiment was substantial, with the average tumor volume in each group exceeding 750 mm3. However, despite this large tumor burden, the two-step PRIT treatment with the novel hu3F8-C825-MD conjugate was able to completely eradicate tumors in all treated mice, suggesting that the conjugates generated herein are highly effective and potentially provide a curative therapeutic approach for tumors.

[0423] Furthermore, despite two administrations of the hu3F8-C825-MD conjugate and a total dose of 1 mCi of 177Lu-DOTA-Bn, no clinical or histopathological toxicities were observed (data not shown) . Moreover, there were no off-target toxicities detected in any treated mice. In sum, this study demonstrates the efficacy of the two-step PRIT approach using the newly generated MD domain containing bi-specific antibody conjugates in reducing tumor burden in vivo.Example 14. Evaluation of immunogenicity of the generated hu3F8-C825-MD conjugates in a mouse model

[0424] Purpose: This study sought to assess the immunogenicity of the generated hu3F8-C825-Tet-HD-5 (SEQ ID NO: 62) conjugate compared to the hu3F8-C825-P53 (SEQ ID NO: 61) conjugate in immunocompetent C57BL / 6J mice.

[0425] Methods: To assess the immunogenicity of the MD containing bi-specific antibodies, immunocompetent C57BL / 6J mice were immunized with 0.5 nmol of a hu3F8-C825-Tet-HD-5 conjugate on days 0 and 28. Blood samples were collected prior to dosing, and on days 14, 27, 42, and 55 to measure anti-drug antibody (ADA) titers in plasma.

[0426] Results: Results are in FIG. 14. As shown, there were no significant changes in serum ADA levels in mice immunized with the novel hu3F8-C825-Tet-HD-5 conjugate at any time point compared to pre-dose levels, suggesting that the hu3F8-C825-Tet-HD-5 conjugate may result in a lower immunogenicity. However, the occurrence of clinical ADAs may be related to higher clinical dosing.Example 15. Interaction and characterization of conjugates comprising the multimerization peptides of Example 1 and a HYE32-C825 bi-specific antibody

[0427] Purpose: This study sought to assess aggregation propensity and purity evaluation of novel MD containing bi-specific antibody conjugates targeting CAIX, referred to as HYE32-C825-MD conjugates.

[0428] Methods: The construction, expression, and purification of the bi-specific antibody HYE32-C825 conjugated to the multimerization peptides of Example 1 were performed as described in Examples 2 and 3. Additionally, the bispecific antibody HYE32-C825-P53 was constructed and purified as a control. The purified antibody conjugates underwent SEC-HPLC analysis to determine their aggregation state and purity based on the retention time and peak area ratio.

[0429] Results: The results are presented in Table 20 below. Almost all of the generated HYE32-C825-MD conjugates demonstrated higher purity and aggregation than the control HYE32-C825-P53 conjugate.Table 20. Characterization of purity and aggregation of HYE32-C825-MD conjugates Example 16. In vitro activity assay of HYE32-C825-MD conjugates using ELISA

[0430] Purpose: This study sought to assess the binding affinity of the HYE32-C825-MD conjugates with CAIX-Fc antigen using ELISA.

[0431] Methods: The activity of the HYE32-C825-MD conjugates was assessed by ELISA using CAIX-Fc antigen (1 μg / mL) coated overnight at 4℃. After blocking with 3%BSA, the primary antibody (HYE32-C825-MD) was serially diluted starting at 10 μg / mL with 5-fold dilutions. Following incubation at 37℃, 175Lu-DOTA-Bn-C37-cHis antibody (0.5 μg / mL) was added, followed by His-HRP secondary antibody. Detection was performed using a plate reader. As a control, the HYE32-C825-P53 antibody was also tested.

[0432] Results: The affinity of the HYE32-C825-MD antibody conjugates is shown in Table 21. ELISA results demonstrated that the majority of the generated conjugates exhibited higher binding affinity compared to the control antibody.Table 21. Summary of ELISA-based activity analysis for HYE32-C825-MD conjugates Example 17. In vitro activity assay of HYE32-C825-MD conjugates using FACS

[0433] Purpose: This study sought to assess the binding affinity of the HYE32-C825-MD conjugates with OS-RC-2 cell using FACS.

[0434] Methods: Human renal cell carcinoma cells (OS-RC-2 cell, 2x105 cells per well) were incubated with HYE32-C825-MD conjugates at room temperature for 1 hour. 175Lu-DOTA-Bn-C37-cHis antibody (0.5 μg / mL) and Anti-His-PE (2μL per well) secondary antibody were added sequentially. The plate was then detected by flow cytometry. HYE32-C825-P53 was used as a control antibody at a saturating concentration of 30 μg / mL, while other antibodies were added at equimolar amounts.

[0435] Results: The results are presented in FIG. 15. Preparations of the various HYE32-C825-MD conjugates exhibited robust binding to CAIX (+) tumor lines. The FACS analysis used a second antibody, 175Lu-DOTA-Bn conjugate, thus also demonstrating that each of the novel HYE32-C825-MD conjugates can bind to the CAIX on the cell surface and simultaneously bind a second antigen (DOTA-Bn) , which is critical for PRIT.Example 18. Evaluation of the stability of the HYE32-C825-MD conjugates stored at 25℃ overtime

[0436] Purpose: This study sought to assess the stability of HYE32-C825-MD conjugates compared to a control HYE32-C825-P53 conjugate when stored at 25℃ for two weeks.

[0437] Methods: To evaluate the stability of the HYE32-C825-MD conjugates, samples were stored at 25℃. A HYE32-C825-P53 antibody was used as the control. Antibody concentration and purity were measured at Day 0 (D0) , Day 7 (D7) and Day 14 (D14) .

[0438] Results: The stability data are presented in Tables 22 and Table 23. Many of the novel conjugates demonstrated improved protein yields compared to the control after long-term storage. These findings indicate the novel HYE32-C825-MD conjugates have improved stability properties.Table 22. Results of protein concentration analysis for HYE32-C825-MD conjugates after storage at 25℃. Table 23. Results of purity assessment for HYE32-C825-MD conjugates following storage at 25℃ Example 19. In vivo biodistribution of 177Lu pre-target evaluated by in vivo imaging

[0439] Purpose: To further validate the in vivo biodistribution of the novel HYE32-C825-MD conjugates in comparison to HYE32-C825-P53 in OS-RC-2 tumor-bearing mice.

[0440] Methods: OS-RC-2 cells (CAIX-positive cells) were subcutaneously inoculated into mice. Approximately 12 days post-tumor inoculation, 1.0 nmol of select HYE32-C825-MD conjugates were administered via pre-targeting, followed by approximately 0.5 mCi of 177Lu-DOTA-Bn 48 hours later. The select HYE32-C825-MD conjugates tested included:a. HYE32-C825-Tetb. HYE32-C825-Tric. HYE32-C825-Tet-KE-5d. HYE32-C825-Tet-HD-5e. HYE32-C825-Tet-KHD-5f. HYR32-C825-Tet-QHD-5g. HYR32-C825-Tet-QQ-5h. HYE32-C825-Tet-K21.i. HYE32-C825-Tri-4K.

[0441] The HYE32-C825-P53 conjugate was included as a control. Volume of interests (VOIs) were drawn on acquired images at 1-hour post-injection to calculate the uptake values in various organs including heart, lung, liver, spleen, kidney, small intestine, stomach, bone, and the tumor itself.

[0442] Results: Results are in FIGs. 16A-16B. Specifically, FIG. 16A presents representative images of the biodistribution of the novel conjugates compared to the control, and FIG. 16B shows the uptake of the generated conjugates compared to the control in various organs. These findings demonstrated that the HYE32-C825-MD conjugates had significant tumor-specific uptake with relatively low uptake in non-target organs. This study further shows that conjugating the modified MD peptides to the bi-specific antibody not only preserves the long tumor retention time of large antibodies but also exhibits the rapid metabolism of small antibodies, resulting in lower off-target effects. Moreover, these results indirectly support the hypothesis that the MD peptide dissociates from its polymeric form into monomers during systemic circulation and is subsequently metabolized and excreted from the body.Example 20. In vivo biodistribution of 177Lu-pre-target evaluated by imaging

[0443] Purpose: To further validate in vivo biodistribution of HYE32-C825-Tet-HD-5 at different timepoints in OS-RC-2 tumor-bearing mice.

[0444] Methods: OS-RC-2 cells (CAIX-positive cells) were inoculated into mice. Approximately 12 days post-tumor inoculation, 1.0 nmol of HYE32-C825-Tet-HD-5 were administered via pre-targeting, followed by approximately 0.5 mCi of 177Lu 48 hours later.

[0445] Volume of interest (VOIs) were drawn on acquired images at 1, 4, 24, 48, 72, and 96 hours post-injection to calculate the uptake values in various organs, including heart, lung, liver, muscle, kidney, small intestine, stomach, bone, and the tumor itself.

[0446] Results: The uptake of HYE32-C825-Tet-HD-5 followed by 177Lu in various organs is shown in FIG. 17. These findings demonstrated that the HYE32-C825-Tet-HD-5 conjugates had significant tumor-specific uptake with relatively low uptake in non-target organs. This study further verifies that conjugating the modified MD peptides to the bi-specific antibody not only preserves the long tumor retention time of large antibodies but also exhibits the rapid metabolism of small antibodies, resulting in lower off-target effects.

[0447] In sum, the MD peptides were successfully conjugated to various bi-specific antibodies with different targets in a series of in vitro and in vivo validations. These findings demonstrate that regardless of the antibody type, the MD peptides were capable of inducing the formation of corresponding multimers, exhibiting excellent performance both in vitro and in vivo. Particularly in in vivo animal experiments, the newly generated conjugates not only retained the high tumor retention characteristics of large antibodies but also exhibited the rapid metabolism of small antibodies. Furthermore, the non-specific uptake was extremely low, indicating the potential for safe use of these conjugates as radiopharmaceuticals.INCORPORATION BY REFERENCE

[0448] All references, articles, publications, patents, patent publications, and patent applications cited herein are incorporated by reference in their entireties for all purposes. However, mention of any reference, article, publication, patent, patent publication, and patent application cited herein is not, and should not be taken as an acknowledgment or any form of suggestion that they constitute valid prior art or form part of the common general knowledge in any country in the world.

Claims

1.A recombinant polypeptide comprising: (a) an antibody; and (b) a multimerization domain, wherein the antibody is operably linked to the multimerization domain.2.The recombinant polypeptide of claim 1, wherein the multimerization domain is adapted to bind one or more other molecules of the recombinant polypeptide to form a multimer of the recombinant polypeptide.3.The recombinant polypeptide of claim 2, wherein the multimerization domain is adapted to bind the multimerization domain of the one or more other molecules of the recombinant polypeptide.4.The recombinant polypeptide of any one of claims 2-3, wherein the binding of the multimerization domain to the one or more other molecules is non-covalent binding.5.The recombinant polypeptide of any one of claims 1-4, wherein the antibody and the multimerization domain are comprised in a continuous polypeptide.6.The recombinant polypeptide of any one of claims 1-5, wherein the multimerization domain comprises one or more segments of 7 consecutive amino acids, wherein at least 2 amino acids of each of the 7 consecutive amino acids segment are hydrophobic amino acids.7.The recombinant polypeptide of claim 6, wherein the 7 consecutive amino acids are X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7, wherein X2 and X5 are hydrophobic amino acids, in at least one, at least two, or at least three of the segments.8.The recombinant polypeptide of claim 7, wherein the 7 consecutive amino acids are X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7, wherein X2 and X5 are hydrophobic amino acids, in all the segments.9.The recombinant polypeptide of claim 7 or 8, wherein X1, X3, X4, X6, and X7 are hydrophobic or polar amino acids.10.The recombinant polypeptide of any one of claims 7-9, wherein X1 is a polar amino acid.11.The recombinant polypeptide of any one of claims 7-10, wherein X1, X3, X4, and X6 are selected from the group consisting of alanine, glutamine, lysine, glutamic acid, histidine, aspartic acid, and arginine.12.The recombinant polypeptide of any one of claims 6-11, wherein the hydrophobic amino acids are selected from the group consisting of alanine, isoleucine, leucine, methionine, phenylalanine, tryptophan, tyrosine, and valine.13.The recombinant polypeptide of any one of claims 9-12, wherein the polar amino acids are selected from the group consisting of serine, threonine, asparagine, histidine, lysine, aspartic acid, glutamic acid, arginine, and glutamine.14.The recombinant polypeptide of any one of claims 7-13, wherein X2 and X5 are leucine or isoleucine.15.The recombinant polypeptide of claim 14, wherein X2 and X5 are both isoleucine (I) .16.The recombinant polypeptide of claim 14, wherein X2 is leucine (L) and X5 is isoleucine (I) .17.The recombinant polypeptide of any one of claims 7-16, wherein X3 and X4 are selected from the group consisting of alanine, arginine, histidine, lysine, aspartic acid, and glutamic acid.18.The recombinant polypeptide of claim 17, wherein X3 and X4 are polar charged amino acids having opposite charges.19.The recombinant polypeptide of claim 17, wherein both X3 and X4 are alanine.20.The recombinant polypeptide of claim 17, wherein X3 and X4 are histidine (H) and aspartic acid (D) , respectively.21.The recombinant polypeptide of claim 17, wherein X3 and X4 are lysine (K) and glutamic acid (E) , respectively.22.The recombinant polypeptide of any one of claims 7-21, wherein X1 and X6 are selected from the group consisting of glutamine, arginine, histidine, lysine, aspartic acid, and glutamic acid.23.The recombinant polypeptide of claim 22, wherein both X1 and X6 are glutamine.24.The recombinant polypeptide of claim 22, wherein X1 and X6 are both polar charged amino acids.25.The recombinant polypeptide of claim 22, wherein X1 is glutamic acid (E) and X6 is lysine (K) .26.The recombinant polypeptide of any one of claims 7-25, wherein X7 is glutamine, lysine, tryptophan, or serine.27.The recombinant polypeptide of claim 26, wherein X7 is lysine.28.The recombinant polypeptide of claim 26, wherein X7 is glutamine.29.The recombinant polypeptide of any one of claims 6-28, wherein the multimerization domain comprises two or more of the segments of the 7 consecutive amino acids.30.The recombinant polypeptide of claim 29, wherein the multimerization domain comprises four or five of the segments of the 7 consecutive amino acids.31.The recombinant polypeptide of claim 29 or 30, wherein the segments are located consecutively in the multimerization domain, without any additional amino acid in between.32.The recombinant polypeptide of any one of claims 1-31, wherein the multimerization domain comprises an amino acid sequence that is at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 99%or 100%identical to any one of SEQ ID NOs: 1-60.33.The recombinant polypeptide of claim 32, wherein the multimerization domain comprises any one of SEQ ID NOs: 1-60, or an amino acid sequence having at most 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10 mutations (insertions, deletions, and / or substitutions) thereto.34.The recombinant polypeptide of claim 32 or 33, wherein the multimerization domain comprises:(a) SEQ ID NO: 54 or 60, or an amino acid sequence having at most 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10 mutations (insertions, deletions, and / or substitutions) thereto, or(b) SEQ ID NO: 2 or 10, or an amino acid sequence having at most 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10 mutations (insertions, deletions, and / or substitutions) thereto.35.The recombinant polypeptide of claim 32 or 33, wherein the multimerization domain comprises SEQ ID NO: 48, or an amino acid sequence having at most 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10 mutations (insertions, deletions, and / or substitutions) thereto.36.The recombinant polypeptide of any one of claims 32-35, wherein at least one of the segments has the amino acid sequence of any one of SEQ ID NO: 76-118.37.The recombinant polypeptide of any one of claims 32-36, wherein the first segment, the second segment, the third segment, the fourth segment, and / or optionally the fifth segment, of the multimerization domain has the amino acid sequence of any one of SEQ ID NO: 76-118.38.The recombinant polypeptide of any one of claims 32-37, wherein the multimerization domain comprises glutamine (Q) at one or more positions corresponding to amino acid positions 7, 14, 21, and 28 of SEQ ID NO: 48.39.The recombinant polypeptide of any one of claims 32-38, wherein the amino acids corresponding to amino acid positions 24-25 of SEQ ID NO: 48 are polar charged amino acids having opposite charges.40.The recombinant polypeptide of any one of claims 32-39, wherein the amino acids corresponding to amino acid positions 31-32 of SEQ ID NO: 48 are polar charged amino acids having opposite charges.41.The recombinant polypeptide of claim 39 or 40, wherein the polar charged amino acids having opposite charges are histidine (H) and aspartic acid (D) .42.The recombinant polypeptide of any one of claims 32-41, comprising lysine (K) at amino acid position 14 and tryptophan (W) at amino acid position 21, according to SEQ ID NO: 48.43.The recombinant polypeptide of any one of claims 1-42, wherein the multimerization domains in the multimer of the recombinant polypeptide comprises 3 or more alpha helices.44.The recombinant polypeptide of claim 43, wherein the multimerization domains in the multimer of the recombinant polypeptide comprises 3, 4, 5, 6, or 7 alpha helices.45.The recombinant polypeptide of any one of claims 1-44, wherein the multimerization domain is capable of mediating the formation of a trimer, tetramer, pentamer or hexamer of the recombinant polypeptide.46.The recombinant polypeptide of any one of claims 1-45, wherein the antibody is humanized.47.The recombinant polypeptide of any one of claims 1-46, wherein the antibody is a single-domain antibody (sdAb) , a single chain variable fragment (scFv) , a bi-specific scFvs (bi-scFvs or di-scFvs) having the format (scFv) 2, or a diabody; optionally, the antibody is a scFv.48.The recombinant polypeptide of any one of claims 1-46, wherein the antibody does not comprise a fragment crystallizable region (Fc region) .49.The recombinant polypeptide of any one of claims 1-46, wherein the antibody does not comprise a constant domain.50.The recombinant polypeptide of any one of claims 1-49, wherein the antibody is a multi-specific antibody, optionally, a bi-specific antibody.51.The recombinant polypeptide of claims 50, wherein the multi-specific antibody or bi-specific antibody comprises an antibody fragment selected from a Fab, F (ab′) 2, Fab′, scFv, single domain antibody (sdAb) , and affibody.52.The recombinant polypeptide of any one of claims 1-51, wherein the antibody comprises a tumor-associated antigen binding domain.53.The recombinant polypeptide of claim 52, wherein the tumor-associated antigen binding domain comprises an anti-GD2, anti-GPA33, anti-HER2, anti-CAIX, anti-PSMA, anti-tag-72, anti-CD38, anti-B7H3, anti-CEA, anti-TROP2, anti-EGFR, anti-CDH17, anti-EPCAM, anti-STEAP1 binding domain, or any combination thereof.54.The recombinant polypeptide of any one of claims 52-53, wherein the tumor-associated antigen binding domain comprises an anti-GD2 binding domain.55.The recombinant polypeptide of any one of claims 52-53, wherein the tumor-associated antigen binding domain comprises an anti-HER2 binding domain.56.The recombinant polypeptide of any one of claims 52-53, wherein the tumor-associated antigen binding domain comprises an anti-CAIX binding domain.57.The recombinant polypeptide of any one of claims 50-56, wherein the multi-specific antibody or bi-specific antibody comprises a second binding domain.58.The recombinant polypeptide of claim 57, wherein the second binding domain binds to a small molecule or small molecule hapten.59.The recombinant polypeptide of claim 58, wherein the small molecule comprises a DOTA (1,4, 7, 10-tetraazacyclododecane-1, 4, 7, 10-tetraacetic acid) , DOTA-Bn (phenyl-1, 4, 7, 10-tetraazacyclododecane-1, 4, 7, 10-tetraacetic acid) , DTPA (Diethylenetriaminepentaacetic acid) , EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid) , NODAGA (1, 4, 7-triazacyclononane-1, 4-diacetic acid) , NETA (N, N, N', N'-tetraacetylated 1, 4, 7, 10-tetraazacyclododecane) , Cyclen (1, 4, 7, 10-tetraazacyclododecane) , Cyclam (1, 4, 8, 11-tetraazacyclotetradecane) , Bispidine (2, 2'-bispidine) , TACN (1, 4, 7-triazacyclononane) , ATSM (diacetyl-bis (N4-methylthiosemicarbazone) , SarAr (sarcosine-derived arylamine) , AmBaSar (aminobenzylsarcosine) , MAG3 (mercaptoacetyltriglycine) , MAG2 (mercaptoacetyltriglycine) , HYNIC (6-hydroxy-2, 2'-bipyridine) , DADT (diacetyl-di (N4-methylthiosemicarbazone) , EC (ethanolamine) , TRAP (3-aminopyridine-2-carboxaldehyde thiosemicarbazoneis) , NS3 (N-succinimidyl-3- (tri-n-butylstannyl) propionate) , H2dedpa (N, N'-diethyl-N, N'-di (2-pyridyl) ethylenediamine) , HBED (N, N'-bis (2-hydroxybenzyl) ethylenediamine-N, N'-diacetic acid) , DFO (deferoxamine) , PEPA (N-phenyl-N'- (2-ethoxyethyl) urea) , HEHA (N, N, N', N'-tetra (2-hydroxyethyl) ethylenediamine) , a derivative thereof, or any combination thereof.60.The recombinant polypeptide of claims 58 or 59, wherein the small molecule is selected from the group consisting or DTPA, EDT, NOTA, DOTA, DOTA-Bn, TRAP, TETA, NETA, CB-TE2A, Cyclen, Cyclam, Bispidine, TACN, ATSM, SarAr, AmBaSar, MAG3, MAG2, HYNIC, DADT, EC, NS3, H2dedpa, HBED, DFO, PEPA, HEHA, a derivative thereof, and any combination thereof.61.The recombinant polypeptide of claim 58, wherein the small molecule hapten comprises a DOTA-hapten selected from the group consisting of DOTA, Proteus-DOTA, DOTA-Bn, DOTA-desferrioxamine, DOTA-Phe-Lys (histamine-succinyl-glycine (HSG) ) -D-Tyr-Lys(HSG) -NH2, Ac-Lys (HSG) D-Tyr-Lys (HSG) -Lys (Tscg-Cys) -NH2, DOTA-D-Asp-D-Lys(HSG) -D-Asp-D-Lys (HSG) -NH2, DOTA-D-Glu-D-Lys (HSG) -D-Glu-D-Lys (HSG) -NH2, DOTA-D-Tyr-D-Lys (HSG) -D-Glu-D-Lys (HSG) -NH2, DOTA-D-Ala-D-Lys (HSG) -D-Glu-D-Lys (HSG) -NH2, DOTA-D-Phe-D-Lys (HSG) -D-Tyr-D-Lys (HSG) -NH2, Ac-D-Phe-D-Lys(DOTA) -D-Tyr-D-Lys (DOTA) -NH2, Ac-D-Phe-D-Lys (DTPA) -D-Tyr-D-Lys (DTPA) -NH2, Ac-D-Phe-D-Lys (Bz-DTPA) -D-Tyr-D-Lys (Bz-DTPA) -NH2, Ac-D-Lys (HSG) -D-Tyr-D-Lys (HSG) -D-Lys (Tscg-Cys) -NH2, DOTA-D-Phe-D-Lys (HSG) -D-Tyr-D-Lys (HSG) -D-Lys(Tscg-Cys) -NH2, (Tscg-Cys) -D-Phe-D-Lys (HSG) -D-Tyr-D-Lys (HSG) -D-Lys (DOTA) -NH2, Tscg-D-Cys-D-Glu-D-Lys (HSG) -D-Glu-D-Lys (HSG) -NH2, (Tscg-Cys) -D-Glu-D-Lys(HSG) -D-Glu-D-Lys (HSG) -NH2, Ac-D-Cys-D-Lys (DOTA) -D-Tyr-D-Ala-D-Lys(DOTA) -D-Cys-NH2, Ac-D-Cys-D-Lys (DTPA) -D-Tyr-D-Lys (DTPA) -NH2, Ac-D-Lys(DTPA) -D-Tyr-D-Lys (DTPA) -D-Lys (Tscg-Cys) -NH2, and Ac-D-Lys (DOTA) -D-Tyr-D-Lys(DOTA) -D-Lys (Tscg-Cys) -NH2, and any combination thereof.62.The recombinant polypeptide of any one of claims 58-60, wherein the small molecule is phenyl-1, 4, 7, 10-tetraazacyclododecane-1, 4, 7, 10-tetraacetic acid ( [metal] -DOTA-Bn) .63.The recombinant polypeptide of any one of claims 57-62, wherein the second binding domain is a single-domain antibody (sdAb) , a single chain variable fragment (scFv) , a bi-specific scFvs (bi-scFvs or di-scFvs) having the format (scFv) 2, or a diabody; optionally, the second binding domain is a scFv.64.The recombinant polypeptide of any one of claims 1-63, wherein the multimerization domain is operably linked to the N-terminus of the heavy or light chain or the C-terminus of the heavy chain of the antibody, or the N-terminus or the C-terminus of the antibody.65.The recombinant polypeptide of claim 64, wherein the recombinant polypeptide comprises, from N-term to C-term, the tumor-associated antigen binding domain, the second binding domain, and the multimerization domain.66.The recombinant polypeptide of claim 64, wherein the recombinant polypeptide comprises, from N-term to C-term, the second binding domain, the tumor-associated antigen binding domain, and the multimerization domain.67.The recombinant polypeptide of any one of claims 57-66, comprising a linker between a first binding domain of the antibody (e.g., the tumor-associated antigen binding domain) , and the second binding domain.68.The recombinant polypeptide of any one of claims 57-67, comprising a linker between (i) the multimerization domain and (ii) a first binding domain of the antibody (e.g., the tumor-associated antigen binding domain) or the second binding domain.69.The recombinant polypeptide of any one of claims 58-68, wherein the small molecule (e.g., [metal] -DOTA-Bn) is radioactive or comprises a radioactive metal.70.The recombinant polypeptide of claim 69, wherein the radioactive metal is selected from the group consisting of gallium-68 (Ga-68) , yttrium-90 (Y-90) , yttrium-86 (Y-86) , indium-111 (In-111) , lutetium-177 (Lu-177) , technetium-99m (Tc-99m) , iodine-131 (I-131) , fluorine-18 (F-18) , copper-64 (Cu-64) , zirconium-89 (Zr-89) , lead-203 (Pb-203) , lead-212 (Pb-212) , strontium-89 (Sr-89) , actinium-225 (Ac-225) , bismuth-213 (Bi-213) , astatine-211 (At-211) , dysprosium-152 (Dy-152) , bismuth-212 (Bi-212) , radium-223 (Ra-223) , radon-219 (Rn-219) , polonium-215 (Po-215) , bismuth-211 (Bi-211) , francium-221 (Fr-221) , astatine-217 (At-217) , fermium-255 (Fm-255) , dysprosium-165 (Dy-165) , rhenium-186 (Re-186) , rhenium-188 (Re-188) , copper-67 (Cu-67) , and terbium-161 (Tb-161) .71.The recombinant polypeptide of any one of claims 1-70, wherein the recombinant polypeptide has increased affinity to a target antigen of the antibody in comparison to a reference polypeptide.72.The recombinant polypeptide of any one of claims 1-71, wherein the recombinant polypeptide has reduced off-target effects in a subject in comparison to a reference polypeptide.73.The recombinant polypeptide of any one of claims 1-72, wherein the recombinant polypeptide has increased renal clearance in a subject in comparison to a reference polypeptide.74.The recombinant polypeptide of any one of claims 1-73, wherein the recombinant polypeptide has higher tumor uptake in a subject in comparison to a reference polypeptide.75.The recombinant polypeptide of any one of claims 1-74, wherein the recombinant polypeptide has reduced blood half-life in a subject in comparison to a reference polypeptide.76.The recombinant polypeptide of any one of claims 71-75, wherein the reference polypeptide has no multimerization domain and is otherwise identical to the recombinant polypeptide.77.The recombinant polypeptide of any one of claims 71-75, wherein the multimerization domain is replaced by an amino acid sequence comprising SEQ ID NO: 119 or 120 in the reference polypeptide, and the reference polypeptide is otherwise identical to the recombinant polypeptide.78.A conjugate comprising: two or more molecules of the recombinant polypeptide of any one of claims 1-77, bind to form a multimer of the recombinant polypeptide.79.The conjugate of claim 78, comprising a trimer, tetramer, pentamer or hexamer of the recombinant polypeptide.80.The conjugate of claim 78 or 79, wherein the conjugate comprises a radioactive metal.81.An isolated nucleic acid encoding the recombinant polypeptide of any one of claims 1-77.82.An expression vector comprising a nucleic acid segment encoding the recombinant polypeptide of any one of claims 1-77.83.A recombinant host cell comprising the expression vector of claim 82 or the nucleic acid of claim 81.84.A method comprising administering to a subject in need thereof: the recombinant polypeptide of any one of claims 1-77, the conjugate of any one of claims 78-80, the isolated nucleic acid of claim 81, the expression vector of claim 82, or the recombinant host cell of claim 83.85.The method of claim 84, further comprising clearing unbounded recombinant polypeptide from the subject.86.The method of claim 84 or 85, further comprising administering a small molecule that binds to the recombinant polypeptide, after the recombinant polypeptide is administered to the subject; optionally, wherein the small molecule binds to the second binding domain of the recombinant polypeptide.87.The method of claim 86, wherein the small molecule is administered about 1 hour to about 168 hours after the recombinant polypeptide is administered to the subject.88.The method of claim 86 or 87, wherein the small molecule is administered about 48 hours after the recombinant polypeptide is administered to the subject.89.The method of any one of claims 86-88, wherein the small molecule is radioactive.90.The method of claim 89, wherein the radioactive small molecule comprises [metal] -DOTA-Bn.91.The method of claim 90, wherein the radioactive metal in [metal] -DOTA-Bn is selected from the group consisting of Ga-68, Y-90, Y-86, Cu-64, Pb-203, In-111, Lu-177, Tc-99m, I-131, F-18, Sr-89, Ra-223, Ac-225, Pb-212, Cu-67, and Tb-161.92.The method of any one of claims 84-91, wherein the method is for treating cancer.93.The method of claim 92, wherein the cancer is selected from the group consisting of neuroblastoma, melanoma, brain tumor, osteosarcoma, breast cancer, liposarcoma, fibrosarcoma, malignant fibrous histiocytoma, leiomyosarcoma, spindle cell sarcoma, retinoblastoma, brain tumor, small cell lung cancer, glioma, soft tissue sarcoma, bladder cancer, colorectal cancer and prostate tumor.

Images