Compositions and methods for relieving pain

Abstract

Provided are compositions and methods for relieving pain. Specifically, provided are effector modules for the development of controlled and / or regulated therapeutic systems.

Description

COMPOSITIONS AND METHODS FOR RELIEVING PAINFIELD OF THE INVENTION

[0001] The present application relates to effector modules for the development of controlled and / or regulated therapeutic systems, including polynucleotides comprising the effector module, polynucleotides encoding the same, vectors and cells containing the polypeptides and / or polynucleotides for use in preventing and / or relieving pain.BACKGROUND OF THE INVENTION

[0002] Pain afflicts more than 10%of the human population and causes more economic burden than cancer, cardiovascular diseases and diabetes together (Lampert et al. 2010; King and Vetter 2014) . In particular, treatment options for chronic pain unsatisfactory due to dose-limiting toxicities and the development of addiction (Goins et al. 2012; Dib-Hajj et al. 2013) . For example, non-steroidal anti-inflammatories have dose-limiting side effects, while morphine involves the risk of addiction or tolerance (King and Vetter 2014; Grosser et al. 2017) . Although the venom-derived ω-conotoxin peptide Ziconotide (SNX-111, Prialt) circumvents these issues and has been licensed for the treatment of severe chronic pain through inhibition of the voltage-gated calcium channel Cav2.2, the only effective administration route is intrathecal injection, which poses high risks (McGivern 2007; Adams et al. 2012) . Therefore, there is still an urgent need for safer and more effective pain treatment strategies.

[0003] Several novel therapies have been developed to relieve pain through cell or gene therapy. For example, engineered human cells (denoted AromaCell, referred to Wang et al. 2018) allowing an R-carvone-specific GPCR to mediate transcription of ssHwTx, a stabilized variant of a selective inhibitor of the voltage-gated sodium channel Nav1.7, via activation of intracellular cAMP signaling. In this manner, implantation of micro-encapsulated AromaCells into mice permitted the secretion of ssHwTx and initiation of pain relief upon stimulation with spearmint aroma. However, the slow dynamics of this said transcription-based system prohibit its clinical utility. In fact, similar to almost all transcription-based regulation systems, analgesia mediated by AromaCell can only occur at almost 24h after exposure to spearmint aroma, which is too slow for translation into a patient-compliant treatment regimen.

[0004] Therefore, to achieve the ultimate goal of a side effect-free, on-demand, and injection-free pain management in the long term, there is an urgent need for an improved human gene-and cell-based therapy-compatible gene regulation system allowing for instant secretion of therapeutic proteins (such as blockers of Nav1.7 or Cav2.2) within the timescales of minutes and at optimal bioavailability.SUMMARY OF THE INVENTION

[0005] In one aspect, the present application provides an effector module comprising a payload and at least one destabilizing domain operably linked thereto, wherein the payload comprises a peptide capable of preventing or relieving pain in a subject, and the destabilizing domain is responsive to one or more stimuli.

[0006] In some embodiments, the payload comprises a secretory peptide.

[0007] In some embodiments, the payload contains a secretory signal peptide.

[0008] In some embodiments, the payload comprises pain pathway inhibitors.

[0009] In some embodiments, the payload comprises ion channel blockers.

[0010] In some embodiments, the payload comprises a Sodium-channel blocker and / or a Calcium-channel blocker.

[0011] In some embodiments, the payload comprises a Nav1.7 blocker and / or a Cav2.2 blocker.

[0012] In some embodiments, the payload comprises a huwentoxin (HwTx) and / or a variant thereof, or a ω-conotoxin and / or a variant thereof.

[0013] In some embodiments, the payload comprises a huwentoxin-IV (HwTx-IV) and / or a variant thereof, or a CVIE and / or a variant thereof.

[0014] In some embodiments, the payload comprises a hIgG-Fc-stabilized Huwentoxin-IV variant (ssHwTx) or a hIgG-Fc-stabilized CVIE variant (ssCVIE) .

[0015] In some embodiments, the payload comprises the amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 28 or SEQ ID NO: 29.

[0016] In some embodiments, the destabilizing domain comprises a dihydrofolate reductase (DHFR) destabilization domain and / or a mutant thereof, and / or a FKBP destabilization domain and / or a mutant thereof.

[0017] In some embodiments, the destabilizing domain comprises a E. coli dihydrofolate reductase (ecDHFR) destabilization domain, a mouse dihydrofolate reductase (mDHFR) destabilization domain, a human dihydrofolate reductase (hDHFR) destabilization domain and / or a mutant thereof.

[0018] In some embodiments, the destabilizing domain comprises an ecDHFR destabilization domain comprising the amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 22 or an ecDHFR destabilization domain mutant with at least one mutation relative to the amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 22.

[0019] In some embodiments, the destabilizing domain comprises a FKBP12 destabilization domain and / or a mutant thereof.

[0020] In some embodiments, the destabilizing domain comprises a FKBP12 destabilization domain comprising the amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 21 or a FKBP12 destabilization domain mutant with at least one mutation relative to the amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 21.

[0021] In some embodiments, the destabilizing domain comprises a destabilization domain selected from the group consisting of: a) FKBP destabilization domain, comprising the amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 21; b) ecDHFR destabilization domain, comprising the amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 22; c) ecDHFR destabilization domain (H12Y, Y100I) , comprising the amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 23; d) ecDHFR destabilization domain (Y100I) , comprising the amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 24; e) ecDHFR destabilization domain (N18T, A19V) , comprising the amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 25; f) ecDHFR destabilization domain (I61F, T68S) , comprising the amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 26; or an g) ecDHFR destabilization domain (R98H, F103S) , comprising the amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 27.

[0022] In some embodiments, the stimulus comprises a small molecule.

[0023] In some embodiments, the stimulus comprises a ligand of the dihydrofolate reductase (DHFR) destabilization domain and / or a mutant thereof.

[0024] In some embodiments, the stimulus comprises Trimethoprim (TMP) and / or a derivative thereof, Methotrexate (MTX) and / or a derivative thereof, and / or Shield-1 and / or a derivative thereof.

[0025] In some embodiments, the destabilizing domain is linked to the N-terminus and / or the C-terminus of the payload.

[0026] In some embodiments, the effector module provided herein comprising from the N-terminus to the C-terminus: a) the payload and the destabilizing domain, b) the destabilizing domain and the payload, c) the payload, a cleavage site and the destabilizing domain, or d) the destabilizing domain, a cleavage site and the payload.

[0027] In some embodiments, the effector module further contains a signal peptide, a regulatory sequence, a linker, a label and / or a cleavage site.

[0028] In some embodiments, the effector module further contains a signal peptide, wherein the signal peptide is located at the N-terminus of the effector module.

[0029] In some embodiments, the effector module further contains a cleavage site, wherein the cleavage site is between the destabilizing domain and the payload.

[0030] In some embodiments, the effector module further contains a cleavage site, wherein the cleavage site comprises a furin cleavage site (FCS) .

[0031] In some embodiments, the effector module further contains a cleavage site, wherein the cleavage site comprises the amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 55.

[0032] In some embodiments, the effector module provided herein comprise the amino acid sequence as set forth in any one of SEQ ID NO: 30-32 and 57.

[0033] In another aspect, the present application provides a polypeptide comprising the effector module provided herein.

[0034] In another aspect, the present application provides a polynucleotide comprising a polynucleotide encoding the effector module provided herein and / or the polypeptide provided herein.

[0035] In another aspect, the present application provides a vector comprises the polynucleotide provided herein.

[0036] In some embodiments, the vector comprises a viral vector.

[0037] In some embodiments, the vector comprises a retroviral vector, a lentiviral vector, a gamma retroviral vector, a AAV vector, and / or an adenoviral vector.

[0038] In some embodiments, the vector comprises a recombinant AAV vector.

[0039] In some embodiments, wherein the vector comprises a AAV2 / 9n vector, a AAV2 / Myo vector and / or a AAV2 / 8 vector.

[0040] In another aspect, the present application provides a pharmaceutical composition comprising the effector module provided herein, the polypeptide provided herein, the polynucleotide provided herein, and / or the vector provided herein, and a pharmaceutically acceptable carrier.

[0041] In another aspect, the present application provides a pharmaceutical combination, comprising: a) the effector module provided herein, the polypeptide provided herein, the polynucleotide provided herein, the vector provided herein, and / or the pharmaceutical composition provided herein; and b) one or more stimuli.

[0042] In some embodiments, the stimulus comprises a small molecule.

[0043] In some embodiments, the stimulus comprises a dihydrofolate reductase (DHFR) destabilization domain ligand.

[0044] In some embodiments, the stimulus comprises Trimethoprim (TMP) and / or a derivative thereof, Methotrexate (MTX) and / or a derivative thereof, and / or Shield-1 and / or a derivative thereof.

[0045] In another aspect, the present application provides a use of the effector module provided herein, the polypeptide provided herein, the polynucleotide provided herein, and / or the vector provided herein in preparing a pharmaceutical composition and / or a pharmaceutical combination, wherein the pharmaceutical composition and / or a pharmaceutical combination is capable of preventing and / or relieving pain.

[0046] In some embodiments, the pain comprises chronic pain, acute pain, neuropathic pain, nociceptive pain, mixed pain syndrome, visceral pain, back pain, and pain associated with inflammation.

[0047] In some embodiments, the pain comprises chronic pain, wherein the chronic pain comprises chronic primary pain, chronic cancer related pain, chronic postsurgical or post traumatic pain, chronic secondary musculoskeletal pain, chronic secondary visceral pain, chronic neuropathic pain, and / or chronic inflammatory pain.

[0048] In some embodiments, the pain comprises peripheral neuropathic pain.

[0049] In another aspect, the present application provides the effector module provided herein, the polypeptide provided herein, the polynucleotide provided herein, the vector provided herein, the pharmaceutical composition provided herein, and / or the pharmaceutical combination provided herein for use in preventing and / or relieving pain.

[0050] In some embodiments, the pain comprises chronic pain, acute pain, neuropathic pain, nociceptive pain, mixed pain syndrome, visceral pain, back pain, and pain associated with inflammation.

[0051] In some embodiments, the pain comprises chronic pain, wherein the chronic pain comprises chronic primary pain, chronic cancer related pain, chronic postsurgical or post traumatic pain, chronic secondary musculoskeletal pain, chronic secondary visceral pain, chronic neuropathic pain, and / or chronic inflammatory pain.

[0052] In some embodiments, the pain comprises peripheral neuropathic pain.

[0053] In another aspect, the present application provides a method for preventing and / or relieving pain in a subject in need thereof, comprising: a) administering an effective amount of the effector module provided herein, the polypeptide provided herein, the polynucleotide provided herein, the vector provided herein and / or the pharmaceutical composition provided herein to a subject in need; and b) administering one or more stimuli to the subject, wherein the stimulus enables the production of the payload in a therapeutically effective amount.

[0054] In some embodiments, the stimulus comprises a small molecule.

[0055] In some embodiments, the stimulus comprises a dihydrofolate reductase (DHFR) destabilization domain ligand.

[0056] In some embodiments, the stimulus comprises Trimethoprim (TMP) and / or a derivative thereof, Methotrexate (MTX) and / or a derivative thereof, and / or Shield-1 and / or a derivative thereof.

[0057] In some embodiments, wherein the pain comprises chronic pain, acute pain, neuropathic pain, nociceptive pain, mixed pain syndrome, visceral pain, back pain, and pain associated with inflammation.

[0058] In some embodiments, wherein the pain comprises chronic pain, wherein the chronic pain comprises chronic primary pain, chronic cancer related pain, chronic postsurgical or post traumatic pain, chronic secondary musculoskeletal pain, chronic secondary visceral pain, chronic neuropathic pain, and / or chronic inflammatory pain.

[0059] In some embodiments, wherein the pain comprises peripheral neuropathic pain.

[0060] Additional aspects and advantages of the present application will become readily apparent to those skilled in this art from the following detailed description, wherein only illustrative embodiments of the present application are shown and described. As will be realized, the present application is capable of other and different embodiments, and its several details are capable of modifications in various obvious respects, all without departing from the application. Accordingly, the drawings and description are to be regarded as illustrative in nature, and not as restrictive. INCORPORATION BY REFERENCE

[0061] All publications, patents, and patent applications mentioned in this specification are herein incorporated by reference to the same extent as if each individual publication, patent, or patent application was specifically and individually indicated to be incorporated by reference. BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWING

[0062] The novel features of the invention are set forth with particularity in the appended claims. A better understanding of the features and advantages of the present invention will be obtained by reference to the following detailed description that sets forth illustrative embodiments, in which the principles of the invention are employed, and the accompanying drawings (also “figure” and “FIG. ” herein) , of which:

[0063] FIG. 1 illustrates the design principles of an ERAD-level gene switch of the present application. FIG. 1A illustrates the molecular mechanisms of ERAD-controlled protein secretion. FIG. 1B illustrates the comparative analysis of constitutive degradation efficiencies. FIG. 1C illustrates the stimulation of target protein secretion by various chemical inhibitors of protein degradation. FIG. 1D illustrates the kinetics of CP26-inducible NanoLuc secretion. FIG. 1E illustrates the CP26 concentration-dependent impact on gene expression and cytotoxicity in mammalian cells. FIG. 1F illustrates the optimization of Trimethoprim-inducible protein secretion.

[0064] FIG. 2 illustrates the results of control experiments for engineering ERAD-level gene switches. FIG. 2A illustrates the assessment of cytotoxicity by long-term CP26 exposure. FIG. 2B illustrates the drug-inducible protein secretion in mammalian cells. FIG. 2C illustrates the assessment of cytotoxicity by TMP exposure.

[0065] FIG. 3 illustrates the regulation performance of ERAD-level gene switches. FIG. 3A illustrates the TMP concentration-dependent NanoLuc expression. FIG. 3B illustrates the activation kinetics of TMP-inducible protein secretion. FIG. 3C illustrates the TMP-regulated protein secretion in different mammalian cell lines. FIG. 3D illustrates the reversibility of TMP-regulated protein secretion. FIG. 3E illustrates the applicability of the ERAD-level gene switch strategy to regulate ssHwTx.

[0066] FIG. 4 illustrates the activation kinetics of various trigger-inducible gene switches. FIG. 4A illustrates the Grazoprevir-inducible target gene transcription. FIG. 4B illustrates the gene expression by drug-inducible RNA splicing. FIG. 4C illustrates the Grazoprevir-inducible translational initiation. FIG. 4D illustrates the gene expression by inhibition of ER retention.

[0067] FIG. 5 illustrates the Trimethoprim (TMP) -dependent control of various secretory proteins of interest. FIG. 5A illustrates the comparative analysis of different ERAD-dependent SEAP secretion types. FIG. 5B illustrates the comparative analysis of different ERAD-dependent mTSLP secretion types.

[0068] FIG. 6 illustrates the ERAD-level gene switches for AAV-mediated gene therapy. FIG. 6A illustrates the application potential. ERAD-level gene switches can be installed onto single vector AAV systems, allowing delivery of POI cargos of close to 4 kb in size into various target tissues through flexible choice of suitable AAV serotypes. FIG. 6B illustrates the validation of Trimethoprim (TMP) -regulated protein secretion in vivo. FIG. 6C illustrates the activation kinetics of TMP-inducible protein secretion in mice. FIG. 6D illustrates the compatibility of the TMP-regulated ERAD gene switch with various therapeutically-relevant AAV serotypes. FIG. 6E illustrates the long-term control of TMP-stimulated protein secretion in mice. FIG. 6F illustrates the potential impact of ERAD-level gene switches on ER stress in target tissues in vivo.

[0069] FIG. 7 illustrates the validation of muscle-specific infection by AAV2 / Myo particles in vivo. Representative fluorescence images of DAPI-stained quadriceps, heart or liver tissues of mice profiled at 28 days after treatment with 2*1011 vg AAV2 / Myo-EGFP particles by single systemic injection. Scale bar: 100 μm.

[0070] FIG. 8 illustrates the validation of CNS-specific infection by AAV2 / 9n particles in vivo. Representative fluorescence images of DAPI-stained spinal cord of mice profiled at 14 days after treatment with 1*1011 vg AAV2 / 9n-EGFP particles by single intrathecal injection. Scale bar: 200 μm.

[0071] FIG. 9 illustrates the in vivo performance of transcription-based gene switches. FIG. 9A illustrates the activation kinetics of grazoprevir-inducible transcriptional regulation in mice. FIG. 9B illustrates the long-term control of grazoprevir-stimulated gene transcription in mice.

[0072] FIG. 10 illustrates the quantification of potential liver abnormalities following long-term AAV2 / 8-mediated gene therapy.

[0073] FIG. 11 illustrates the potential impact of constitutive expression and ERAD-level gene switches on ER stress.

[0074] FIG. 12 illustrates the regulated gene therapy approach for chronic pain treatment. FIG. 12A illustrates the on-demand analgesia by AAV2 / 9n-mediated Trimethoprim (TMP) -inducible painkiller release in vivo. FIG. 12B illustrates the TMP concentration-dependent ssHwTx expression. FIG. 12C illustrates the activation kinetics of TMP-stimulated ssHwTx production in mammalian cells. FIG. 12D, FIG. 12E and FIG. 12F illustrate the analgesic efficacy of TMP-inducible gene switches regulating ssHwTx secretion in mice. FIG. 12G illustrates the activation kinetics of TMP-inducible ssHwTx secretion in mice. FIG. 12H, FIG. 12I and FIG. 12J illustrate the rapid analgesia by TMP-stimulated ssHwTx secretion in mice. FIG. 12K, FIG. 12L, FIG. 12M, and FIG. 12N illustrate the Long-term pain management by a AAV2 / 9n-delivered Type-N TMP-inducible gene switch regulating ssHwTx secretion.

[0075] FIG. 13 illustrates the estimation of an efficacy window for ssHwTx-mediated analgesia.DETAILED DESCRIPTION

[0076] While various embodiments of the invention have been shown and described herein, it will be obvious to those skilled in the art that such embodiments are provided by way of example only. Numerous variations, changes, and substitutions may occur to those skilled in the art without departing from the invention. It should be understood that various alternatives to the embodiments of the invention described herein may be employed.

[0077] Definitions

[0078] Unless otherwise defined herein, scientific and technical terms used in the present application shall have the meanings that are commonly understood by those of ordinary skill in the art. Further, unless otherwise required by context, singular terms shall include pluralities and plural terms shall include the singular. Generally, nomenclatures used in connection with, and techniques of, cell and tissue culture, molecular biology, immunology, microbiology, genetics and protein and nucleic acid chemistry and hybridization described herein are those well-known and commonly used in the art.

[0079] As used herein, the term “effector module” generally refers to a functional unit within a therapeutic or biological system that comprises a payload and one or more regulatory elements, such as destabilizing domains, which modulate the activity, stability, or expression of the payload. The payload typically comprises a biologically active molecule, such as a peptide, protein, RNA, or small molecule, capable of inducing a desired therapeutic or biological effect. The regulatory elements within the effector module, including destabilizing domains, can respond to internal or external stimuli, thereby controlling the release, degradation, or activity of the payload. In the present application, the effector module can refer to a fusion product comprising the destabilizing domain and the payload.

[0080] As used herein, the term “destabilizing domain” or “degron” generally refers to a protein domain or motif, when fused to a target peptide, facilitates its degradation or reduces its stability under certain conditions. The destabilizing domain is designed to interact with cellular degradation pathways, such as the ER-associated degradation (ERAD) pathway, the ubiquitin-proteasome system and / or lysosomal degradation mechanisms. By incorporating a destabilizing domain, the half-life of a target peptide can be controlled. The destabilizing domain can function in a regulated manner. For example, the addition or removal of specific molecules can influence the stability of the fused peptide. For example, upon fused to a target peptide, the destabilizing domain may propagate its own destabilized or unstable nature onto the entire peptide unit so that the target protein also becomes unstable and eventually degraded. The conditional nature of the destabilizing domain allows rapid, non-perturbing and even dose-dependent switching between a stable and unstable conformation of any target protein that is fused to or interacts with said destabilizing domain. Depending on the degree of binding and / or interaction the altered function of the payload may vary, hence providing a “tuning” of the payload function.

[0081] As used herein, the term “stimulus” or “stimuli” generally refers to external or internal factors capable of regulating the activity of the destabilizing domain. Such stimuli influence the degradation or stability of the peptide containing at least one destabilizing domain by modulating the interaction of the destabilizing domain with cellular degradation pathways, thereby allowing control over the half-life of the payload. The stimuli may comprise, but are not limited to, physical stimuli such as temperature changes, light, or mechanical forces, and chemical stimuli such as pH shifts, the presence or absence of specific small molecules, peptides, polypeptides, proteins, or enzymatic activity. The stimuli of the present application comprise ligands of the destabilizing domain. In some embodiments, the stimuli alone do not have the effect of preventing or relieving pain.

[0082] As used herein, the term “ligand” generally refers to a substance that forms a complex with a biomolecule (for example, a receptor) to serve a biological purpose. The ligand typically exhibits specificity in the interaction with the receptor, the interaction between the ligand and its receptor is selective. The ligand of the destabilizing domain in the present application generally refers to a substance that can interact with the destabilizing domain. In some embodiments, the ligand of the destabilizing domain can bind to the destabilizing domain. Preferably the ligand of the destabilizing domain is a small molecule. In some embodiments, the ligand comprises small molecules that can cross the blood-brain barrier.

[0083] As used herein, the term “operably link” or “operably linked” generally refers to the functional association between two or more molecular entities, such as a destabilizing domain and a payload, wherein the linkage ensures that the entities work together in a coordinated manner to achieve a specific biological effect. For example, “operably link” or “operably linked” means that the destabilizing domain and the payload are connected in such a way that the functional activity of one entity (e.g., the regulatory effect of the destabilizing domain) directly influences or modulates the activity of the other entity (e.g., the therapeutic effect of the payload) . The linkage can be through direct covalent bonding, genetic fusion, or other means that maintain the functional integrity of the components.

[0084] As used herein, the term “peptide” , “polypeptide” and “protein” generally refer to polymers of amino acid residues. These terms also apply to amino acid polymers in which one or more amino acid residues are analogs or mimetics of the corresponding naturally occurring amino acids, as well as naturally occurring amino acid polymers. These terms may also include amino acid polymers that have been modified, for example, by adding glycosyl groups to form glycoproteins or by phosphorylation. As used herein, peptides may comprise polypeptides and proteins. The term “polypeptide” may refer to a peptide consisting of approximately 10 to 50 amino acids. The term “protein” may refer to a peptide consisting of more than approximately 50 amino acids. The peptide described in this application also include subunits or domains of polypeptides or proteins.

[0085] As used herein, the term “secretion” generally refers to the movement of a substance from within a cell to the extracellular environment. As used herein, the term “secretory peptide” generally refers to a peptide that after being synthesized within a cell, can be secreted to the extracellular environment to exert its function. The secretory peptide described in this application comprises naturally secreted peptides that can be secreted without modification and peptides that can be secreted after engineering, which have been artificially modified to enable secretion. Methods for enabling the secretion of a peptide that is not otherwise secreted can be known in the art, for example, operably linking a secretory signal peptide to the N-terminus or C-terminus of the peptide.

[0086] As used herein, the term “signal peptide” generally refers to a peptide sequence that directs the transport of a peptide to a specific location within or outside the cell. The signal peptides comprise signal peptides that guide peptides to the endoplasmic reticulum, the mitochondria, or the extracellular space, facilitating their proper localization. The signal peptide can be located at the N-terminus or the C-terminus of the peptide they guided. The signal peptide can be cleaved from the mature peptide by peptidase. Therefore, the mature secretory peptide may not contain the signal peptide. The signal peptides described in the present application may comprise signal peptides with known functions and sequences in the art. The signal peptides described in the present application may comprise functional active fragments, truncations, and / or mutants of wild-type signal peptides. The signal peptides described in the present application comprise secretory signal peptide.

[0087] As used herein, the term “secretory signal peptide” generally refers to a peptide sequence that can transport a peptide from within the cell to the extracellular environment. The secretory signal peptides described in this application can be derived from the domains responsible for secretion in various secretory peptides, or their mutants or variants, and can also be artificially designed sequences.

[0088] As used herein, the term “pain pathway inhibitor” generally refers to a molecule that can interfere with or block the signaling pathways involved in the pain sensation. The pain pathway inhibitors described in this application comprise inhibitors of peptide, polypeptide, and / or protein. For example, the pain pathway inhibitor can be naturally or engineered to be secreted extracellularly. The pain pathway inhibitor may comprise inhibitors of pathways involved in different stages of pain generation and transmission, including molecules that can regulate the generation of pain signals, the transmission of pain signals, the processing and perception of pain signals, and the regulation and sensitization of pain signals. The pain pathway inhibitors may comprise molecules that inhibit the activity of pain receptors, neurotransmitters, or signaling pathways that contribute to the perception and transmission of pain signals (Goodwin et al, 2021; Cao et al, 2024) . For example, the pain pathways inhibitor can comprise ion channel blockers, for example, pain-related ion channel blockers.

[0089] As used herein, the term “ion channel blockers” generally refers to a molecule that inhibit the activity of an ion channel. The ion channel blockers may comprise pain-related ion channel blockers, for example, sodium-channel blocker and / or a calcium-channel blocker.

[0090] Sodium channels, specifically voltage-gated sodium channels (Nav) , are integral to the initiation and propagation of action potentials in neurons. In the context of pain, certain sodium channels, such as Nav1.7, Nav1.8, and Nav1.9, are particularly important for transmitting nociceptive (pain-related) signals from peripheral sensory neurons to the central nervous system. These channels allow sodium ions to flow into the neuron, depolarizing the membrane and triggering the action potentials that carry pain signals. Sodium-channel blockers can be used to reduce the excitability of pain-transmitting neurons and alleviate pain. The sodium-channel blocker may comprise a Nav1.7 blocker, a Nav1.8 blocker, and / or a Nav1.9 blocker.

[0091] Calcium channels, particularly voltage-gated calcium channels (Cav) , are essential for the regulation of neurotransmitter release and neuronal excitability. In the context of pain transmission, specific subtypes of calcium channels, such as Cav2.2 (N-type) and Cav3.2 (T-type) , are involved in the release of neurotransmitters from sensory neurons in the dorsal horn of the spinal cord, which is critical for the communication of pain signals from peripheral nerves to the central nervous system. Calcium-channel blockers can be used to reduce calcium influx, decrease neurotransmitter release, and dampen the transmission of pain signals. The calcium-channel blocker may comprise a Cav2.2 blocker and / or a Cav3.2 blocker.

[0092] As used herein, the term “huwentoxin (HwTx) ” generally refers to a class of neurotoxic peptides derived from the venom of the Chinese bird spider Haplopelma schmidti (the species was formerly known as Haplopelma huwenum, Ornithoctonus huwena and Selenocosmia huwena) . The huwentoxin (HwTx) described in this application comprises huwentoxin and / or huwentoxin variants that are capable of preventing or alleviating pain. For example, the huwentoxin (HwTx) comprises huwentoxin-IV (HwTx-IV) and / or a variant thereof. HwTx-IV is also known as mutheraphotoxin-Hh2a. The amino acid sequence of the wild type HwTx-IV is available under Uniprot accession number P83303. HwTx-IV is a selective inhibitor of the voltage-gated sodium channel Nav1.7, which is the prime molecular target for treatment of pain (Dib-Hajj et al. 2013; SHEN et al. 2019) . For example, the optimized variant of HwTx-IV can inhibit human Nav1.7 with high specificity (IC50 ～ 0.4 nM) (Revell et al. 2013) , while showing low affinity for other sodium channel isoforms hNav1.4 (IC50 ～ 3.9 μM) and hNav1.5 (IC50 ～ 25 μM) (Revell et al. 2013) . The HwTx variants of the present application comprise those whose amino acid sequences differ from the wild-type sequence but still retain some of its functions. For example, the HwTx variant may still able to selectively inhibit Nav1.7, but its other properties may differ from the wild-type HwTx, for example, it may be more stable than wild-type HwTx in the bloodstream. For example, the huwentoxin (HwTx) variant comprises a hIgG-Fc-stabilized Huwentoxin-IV variant (ssHwTx-IV) (Wang et al. 2018) . The amino acid sequence of ssHwTx-IV can comprise the amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 28.

[0093] As used herein, the term “ω-conotoxin” generally refers to a class of neurotoxic peptides derived from the venom of cone snails, specifically from the Conus catus, which can inhibit Cav2.2 voltage-gated calcium channel. The ω-conotoxin described in this application comprises ω-conotoxin and / or ω-conotoxin variants that are capable of preventing or alleviating pain. The ω-conotoxins include but are not limited to GVIA, MVIIA, CVIE, and CVIF, which primarily differ in their source species of cone snails and amino acid sequences. For example, the ω-conotoxin comprises CVIE and / or a variant thereof. CVIE can selectively and voltage-dependently block recombinant and native N-Type calcium channels (Berecki et al, 2010) . The amino acid sequence of the wild type CVIE is available under Uniprot accession number P69751. The CVIE variants can be referenced in the article: "Effects of arginine 10 to lysine substitution on ω-conotoxin CVIE and CVIF block of Cav2.2 channels (Berecki et al, 2014) " . The ω-conotoxin variants of the present application comprise those whose amino acid sequences differ from the wild-type sequence but still retain some of its functions. For example, the ω-conotoxin variant may still able to selectively inhibit Cav2.2, but its other properties may differ from the wild-type ω-conotoxin, for example, it may be more stable than wild-type ω-conotoxin in the bloodstream. For example, the CVIE variant comprises a hIgG-Fc-stabilized CVIE variant (ssCIVE) (Wang et al. 2018) . The amino acid sequence of ssCVIE can comprise the amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 29.

[0094] As used herein, the term “FKBP” or “FK506 binding protein” generally refers to a family of proteins that have prolyl isomerase activity and are related to the cyclophilins in function. For example, the FKBP comprises FKBP12. The FKBP of the present application may comprise FKBP from different species, such as human FKBP. The amino acid sequence of human FKBP12 is available under Uniprot accession number Q3V793.

[0095] As used herein, the term “FKBP destabilization domain” generally refers to a protein domain derived from FKBP that can induce the degradation of a target protein fused to it. In the absence of a ligand, the FKBP destabilization domain is unstable, leading to the degradation of the fusion protein. However, when a ligand (such as Shield-1) binds, the stability of FKBP destabilization domain is enhanced, preventing the degradation of the target protein and thereby controlling its expression and function. The FKBP destabilization domain comprises FKBP protein and / or a mutant thereof. For example, the FKBP destabilization domain comprises FKBP12 and / or a mutant thereof. For example, the FKBP destabilization domain comprises the L106P FKBP mutant (Chu BW et al, 2008) .

[0096] The FKBP destabilization domain and its corresponding ligand described in this application may be those known in the prior art. Methods for identifying the FKBP destabilization domain are known in the prior art. In some embodiments, the FKBP destabilization domain can be referred as “DD” .

[0097] As used herein, the term “dihydrofolate reductase (DHFR) ” generally refers to an enzyme that can catalyze the reduction of dihydrofolate to tetrahydrofolate using NADPH as a cofactor. The DHFR of the present application may comprise DHFR from different species, such as Escherichia coli DHFR, human DHFR, and / or mouse DHFR. The DHFR of the present application may comprise wild-type DHFR and DHFR variants. The amino acid sequence of Escherichia coli DHFR is available under Uniprot accession number P0ABQ. The amino acid sequence of human DHFR is available under Uniprot accession number P00374. The amino acid sequence of mouse DHFR is available under Uniprot accession number P00375.

[0098] As used herein, the term “dihydrofolate reductase (DHFR) destabilization domain” generally refers to the destabilization domain of dihydrofolate reductase (DHFR) and / or a mutant thereof. The dihydrofolate reductase (DHFR) destabilization domain can be operably linked to a peptide and affect the peptide's stability, leading to its degradation in the absence of a ligand. The ligands of different dihydrofolate reductase (DHFR) destabilization domain may be identical or different. The dihydrofolate reductase (DHFR) destabilization domain and its corresponding ligand described in this application may be those known in the prior art. Methods for identifying the DHFR destabilization domain are known in the prior art.

[0099] As used herein, the term “variant” generally refers to a peptide or a polynucleotide that differs from a reference or parent peptide or polynucleotide. For example, the difference may comprise one or more substitutions, deletions, additions, or modifications. In addition, the term "variant" as described in this application may also include modifications that incorporate additional sequences or regions beyond the parent sequence. The variant may refer to a peptide or a polynucleotide that retains the same or similar functionality as the parent peptide or polynucleotide. In some cases, a variant may exhibit improved functionality in certain aspects compared to the parent sequence. The variants of the present application may comprise mutants.

[0100] As used herein, the term “mutant” generally refers to one or more alterations at the sequence level, for example, a protein, polypeptide or amino acid sequence in which a mutation has occurred. The mutation may refer to a difference compared to the wild type.

[0101] As used herein, the term “cleavage site” generally refers to a specific location within a polypeptide or protein sequence where enzymatic or chemical cleavage occurs, resulting in the separation of peptide bonds. The cleavage site may be recognized by proteases, nucleases, or other catalytic agents, and can be naturally occurring or engineered for controlled protein processing, degradation, or activation. The cleavage site described in the present application may comprise cleavage site may be recognized by proteases, for example, furin cleavage site (FCS) , Chymotrypsin-like Elastase Family C cleavage site, Caspase cleavage site, TEV protease cleavage site, 3C protease cleavage site, HIV-1 protease cleavage site and / or HRV 3C protease cleavage site.

[0102] As used herein, the term “regulatory sequence” generally refers to a sequence that can modulate the expression, stability, or function. At the peptide level, the regulatory sequence comprises amino acid sequences that can modulate the expression, stability, or function of a peptide. Regulatory sequences may comprise, but are not limited to small molecule binding sites, and / or epigenetic modification sites.

[0103] As used herein, the term “label” or “tag” generally refers to a molecule that can be used as a marker. “Label” and “tag” can be used interchangeably in the present application. For example, the label or tag may by a detectable marker.

[0104] As used herein, the term “polynucleotide” and “nucleic acid” generally refer to polymers of nucleotides of any length, including DNA and RNA. The polynucleotide may be a deoxyribonucleotide, a ribonucleotide, a modified nucleotide or base, and / or an analogue thereof, or may be any substrate that can be incorporated into a polymer by a DNA or RNA polymerase.

[0105] As used herein, the term “vector” generally refers to a vehicle that is used to carry genetic material (e.g., a polynucleotide sequence) , which can be introduced into a host cell, where it can be replicated and / or expressed. Vectors applicable for use include, for example, expression vectors, plasmids, phage vectors, viral vectors, episomes and artificial chromosomes, which can include selection sequences or markers operable for stable integration into a host cell’s chromosome. Additionally, the vectors can include one or more selectable marker genes and appropriate expression control sequences. Selectable marker genes that can be included, for example, provide resistance to antibiotics or toxins, complement auxotrophic deficiencies, or supply critical nutrients not in the culture media. Expression regulatory sequences can include constitutive and inducible promoters, transcription enhancers, transcription terminators, and the like which are well known in the art. The introduction of polynucleotides into a host cell can be confirmed using methods well known in the art. It is understood by those skilled in the art that the polynucleotides are expressed in a sufficient amount to produce a desired product, and it is further understood that expression levels can be optimized to obtain sufficient expression using methods well known in the art.

[0106] As used herein, the term “pharmaceutical composition” generally refers to a composition of one or more active pharmaceutical ingredients with one or more pharmaceutically acceptable carriers. Pharmaceutical compositions can include various forms such as tablets, capsules, injections, creams, or liquids, and may incorporate additional components to facilitate drug delivery, enhance stability, ensure proper dosing, and improve patient acceptability.

[0107] As used herein, the term “pharmaceutically acceptable carrier” or “pharmaceutically acceptable excipient” refers to a material that is suitable for drug administration to an individual along with an active agent without causing undesirable biological effects or interacting in a deleterious manner with any of the other components of the pharmaceutical composition.

[0108] As used herein, the term “pharmaceutical combination” generally refers to a formulation or therapeutic regimen that includes two or more pharmaceutical agents or active ingredients combined.

[0109] As used herein, the terms “effective amount” or “therapeutically effective amount” generally refers to the administration of an agent to a subject, either alone or as a part of a pharmaceutical composition and either in a single dose or as part of a series of doses, in an amount that is capable of having any detectable, positive effect on any symptom, aspect, or characteristics of a disease, disorder or condition when administered to the subject. The therapeutically effective amount can be ascertained by measuring relevant physiological effects. The exact amount required vary from subject to subject, depending on the age, weight, and general condition of the subject, the severity of the condition being treated, the judgment of the clinician, and the like. An appropriate “effective amount” in any individual case can be determined by one of ordinary skill in the art using routine experimentation.

[0110] As used herein, the term “pain” generally refers to an unpleasant sensory and emotional experience associated with actual or potential tissue damage. Pain can be acute or chronic and is typically characterized by discomfort, distress, or suffering. Pain is mediated through complex interactions between peripheral sensory neurons, central nervous system pathways, and brain regions involved in processing and interpreting nociceptive signals. Pain can arise from various sources, including injury, inflammation, or pathological conditions, and may be influenced by both physiological and psychological factors.

[0111] As used herein, the term “chronic pain” generally refers to pain that persists for an extended period. For example, chronic pain can be defined as lasting longer than about three to about six months, beyond the usual course of acute injury or illness. Chronic pain can be associated with various conditions, such as arthritis, neuropathy, or fibromyalgia, and may be characterized by persistent discomfort, disability, or suffering.

[0112] As used herein, the term “subject” as used herein refers to any animal (e.g., a mammal) , including, but not limited to, humans, non-human primates, canines, felines, rodents, and the like, which is to be the recipient of a particular treatment. A subject can be a human. A subject can have a particular disease or condition.

[0113] Compounds as used in the present application are intended to include all stereoisomers, geometric isomers, tautomers and isotopes of the structure depicted. Compounds as used in the present application are also intended to include pharmaceutically acceptable salts of the compounds. The term is also intended to refer to the compound of the present application, without considering its preparation method, such as synthesis, by biological process (such as metabolism or enzyme conversion) or its combination. All compounds and pharmaceutically acceptable salts thereof can be found with other substances, such as water and solvent together (such as hydrates and solvates) , or can be separated. When in solid state, compounds described in the present application and salts thereof can exist in various forms, and can be, for example, in solvate (including hydrate) form. The compound can be in any solid form, such as polymorph or solvate, therefore unless otherwise clearly indicated.

[0114] As used herein and unless otherwise indicated, the terms “a” and “an” are taken to mean “one” , “at least one” or “one or more” . Unless otherwise required by context, singular terms used herein shall include pluralities and plural terms shall include the singular.

[0115] The term “comprise” or “include” as used herein means including the elements, integers or steps described, but does not exclude any other elements, integers or steps. The term also covers the combination of the elements, integers or steps mentioned herein when the term "comprises" or "include" is used, unless otherwise specified. In some embodiments, the term can also mean “consisting of the elements, integers or steps described” .

[0116] The term “about” used in combination with a numerical value is intended to encompass the numerical values in a range from a lower limit less than the specified numerical value by 5%to an upper limit greater than the specified numerical value by 5%.

[0117] The term “and / or” as used herein, means any of the options or two or more of the options.

[0118] Mutations are sometimes referred to in the form XnY, wherein X is a wild-type amino acid, n is an amino acid position of X in a wildtype sequence, and Y is a replacement amino acid. If the mutation occurs in a sequence having a different number of amino acids than the wild-type sequence, it is present at the position in the sequence aligned with position n in the wildtype sequence when the respective sequences are maximally aligned.

[0119] Additionally, the words “herein” , “above” and “below” and words of similar import, when used in this application, shall refer to this application as a whole and not to any particular portions of this application.

[0120] The present application employs an Endoplasmic Reticulum-Associated Degradation (ERAD) -centered strategy to develop trigger-inducible gene switches tailor-designed for instantaneous protein secretion. By temporary attachment of conditional destabilizing domains to various therapeutic proteins of interest (POIs) , rapid, tunable and reversible control of native POI secretion into the bloodstream was achieved through oral administration of specific clinically-licensed small molecule drugs. This simple and generalizable design principle is highly compatible with gene delivery systems such as adeno-associated virus (AAV) -mediated gene delivery, enabling long-term and remote-controlled transgene expression in vivo. The present application provides an improved human gene-and cell-based therapy-compatible gene regulation system allowing for the instant secretion of therapeutic proteins within the timescales of minutes and at optimal bioavailability to achieve the ultimate goal of a side effect-free, on-demand, and injection-free pain management in the long term.

[0121] Effector module

[0122] In one aspect, the present application provides an effector module comprising a payload and at least one destabilizing domain operably linked thereto, wherein the destabilizing domain is responsive to one or more stimuli.

[0123] As used herein, the “responsive” nature of a destabilizing domain to one or more stimuli may be characterized by a covalent or non-covalent interaction, a direct or indirect association or a structural or chemical reaction to the stimulus. Further, the response of any destabilizing domain to a stimulus may be a matter of degree or kind. The response may be a partial response. The response may be a reversible response. The response may ultimately lead to a regulated signal or output. For example, the response may lead to the degradation or stabilization of the payload which the destabilizing domain is operably linked to.

[0124] In some embodiments, the stimuli comprise ligands of the destabilizing domains. For example, the presence, absence or an amount of a small molecule ligand that binds to or interacts with the destabilizing domains, can, upon such binding or interaction modulate the stability of the payload and consequently the function of the payload. For example, when the ligand is absent, the destabilizing domain causes the payload to be degraded, when the ligand is present, the payload remains stable due to the interaction between the ligand and the destabilizing domain. The regulation of the payload by the ligand of the destabilizing domain may be reversible and / or dose-dependent.

[0125] The destabilizing domain and its corresponding ligand described in the present application can be those known in the prior art. In some embodiments, the desired characteristics of the destabilizing domains may include, but are not limited to, low protein levels in the absence of a ligand of the destabilizing domain (i.e. low basal stability) , large dynamic range, robust and predictable dose-response behavior, and rapid kinetics of degradation. Candidate destabilizing domains that bind to a desired ligand but not endogenous molecules may be preferred. In some embodiments, the desired characteristics of the ligand may include, but are not limited to, non-toxic, non-addictive, commercially available, and having desirable pharmacological properties.

[0126] In some embodiments, the destabilizing domain comprises a dihydrofolate reductase (DHFR) destabilization domain and / or a mutant thereof. The destabilization domains of the present application may comprise destabilization domains derived from DHFR of different species, such as E. Coli, human, or mouse. The destabilization domains of the present application may comprise wild-type DHFR destabilization domains and / or DHFR destabilization domain mutants. The destabilization domains of the present application may comprise the destabilization domain of wild-type E. Coli DHFR and / or mutants thereof. For example, the destabilization domains of the present application may comprise an ecDHFR destabilization domain mutant with at least one mutation relative to SEQ ID NO: 22.

[0127] For example, the destabilizing domain may comprise a destabilization domain selected from the group consisting of: ecDHFR destabilization domain, comprising the amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 22; ecDHFR destabilization domain (H12Y, Y100I) , comprising the amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 23; ecDHFR destabilization domain (Y100I) , comprising the amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 24; ecDHFR destabilization domain (N18T, A19V) , comprising the amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 25; ecDHFR destabilization domain (I61F, T68S) , comprising the amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 26; ecDHFR destabilization domain (R98H, F103S) , comprising the amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 27. For example, the destabilizing domain may comprise a destabilization domain selected from a destabilizing domain having at least 85%, at least 86%, at least 87%, at least 88%, at least 89%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity sequence identity to the amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 22-27.

[0128] In some embodiments, the destabilizing domain comprises a FKBP destabilizing domain and / or a mutant thereof. In some embodiments, the destabilizing domain comprises a FKBP12 destabilizing domain and / or a mutant thereof. The destabilization domains of the present application may comprise destabilization domains derived from FKBP of different species, such as human. For example, the destabilizing domain comprises a FKBP destabilizing domain comprising the amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 21. For example, the destabilizing domain may comprise a destabilization domain selected from a destabilizing domain having at least 85%, at least 86%, at least 87%, at least 88%, at least 89%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21. For example, the destabilization domains of the present application may comprise FKBP destabilizing domain mutant with at least one mutation relative to SEQ ID NO: 21.

[0129] In some embodiments, the stimuli comprise a small molecule. In some embodiments, the stimuli may comprise the ligands of the destabilizing domains and / or a mutant thereof. In some embodiments, the ligands provided herein, when used alone, do not possess the function of preventing and / or alleviating pain.

[0130] In some embodiments, the stimuli comprise trimethoprim (TMP) and / or a derivative thereof, and / or Methotrexate (MTX) and / or a derivative thereof. In some embodiments, the stimuli comprise Shield-1 and / or a derivative thereof. The derivatives described in this application generally refer to molecules that have the similar biological activity as the compound. For example, a derivative of a ligand of the destabilizing domains has a function similar to that of the compound from which it is derived as a ligand of the destabilizing domains, and the destabilizing domains are also able to respond to the derivative. The derivative may have the same parent core as the compound from which it is derived, with one or more groups substituted at certain positions, without losing its biological activity. For example, a TMP or MTX derivative can have a function similar to TMP or MTX accordingly that is the ligand of a DHFR destabilizing domain and / or a mutant thereof. For example, a Shield-1 derivative can have a function similar to Shield-1 that is the ligand of a FKBP destabilizing domain and / or a mutant thereof.

[0131] In this application, different destabilizing domains may have different ligands, and such correspondence is known to those skilled in the art. For example, when the destabilizing domain of the module of the present application is a DHFR destabilizing domains and / or a mutant thereof, the stimuli can be a ligand of the DHFR destabilizing domains and / or a mutant thereof, such as trimethoprim (TMP) or a derivative thereof, and / or Methotrexate (MTX) and / or a derivative thereof. For example, when the destabilizing domain of the module of the present application is a FKBP and / or a mutant thereof, the stimuli can be a ligand of the FKBP (FK506 binding protein) and / or a mutant thereof, such as Shield-1. In some embodiments, the ligand selection is determined by the magnitude and duration of expression of the effector modules of the invention using the PK parameters of the ligands. The ligand selection may be determined by the magnitude and duration of expression of the effector modules of the application.

[0132] In this application, the payload may be any therapeutic peptide if it can be regulated by the destabilizing domain that operably linked to it. With the purpose of preventing and / or relieving pain, the payload of the effector module of the present application comprises a peptide capable of preventing or relieving pain in a subject. The stability of the payload capable of preventing and / or relieving pain in the effector module is regulated by the stimuli through the destabilizing domain.

[0133] In some embodiments, the payload comprises a secretory peptide which is capable of preventing or relieving pain as the destabilizing domain may regulate the stability of the payload through the secretory pathway. In some embodiments, the payload comprises wild-type secreted peptides that can be secreted without modification and peptides that can be secreted after engineering, which have been artificially modified to enable secretion. For example, the payload contains a secretory signal peptide which enables the secretion of the payload.

[0134] In some embodiments, the payload comprises pain pathway inhibitors which can interfere with or block the signaling pathways involved in the pain sensation. In some embodiments, the payload comprises peptide pain pathway inhibitors. In some embodiments, the payload comprises secretory peptide pain pathway inhibitors.

[0135] In some embodiments, the pain pathway inhibitors comprise ion channel blockers. The ion channel blockers of the present application may comprise pain ion channel blockers and / or selective ion channel blockers. In some embodiments, the pain pathway inhibitors comprise ion channel blockers. For example, the payload comprises pain-related ion channel blockers. In some embodiments, the payload comprises peptide, polypeptide and / or protein ion channel blockers. In some embodiments, the payload comprises secretory peptide, polypeptide and / or protein ion channel blockers.

[0136] Based on the role of sodium-channels and calcium-channels in the pain pathways, the payload may comprise sodium-channel blockers and / or calcium-channel blockers. The sodium-channel blockers of the present application may comprise pain sodium-channel blockers and / or selective sodium-channel blockers. The calcium-channel blockers of the present application may comprise pain calcium-channel blockers and / or selective calcium-channel blockers. In some embodiments, the payload may comprise a Nav1.7 blocker, a Nav1.8 blocker, and / or a Nav1.9 blocker.

[0137] In some embodiments, the payload comprises a huwentoxin (HwTx) and / or a variant thereof. In some embodiments, the payload comprises a secretory huwentoxin (HwTx) and / or a variant thereof.

[0138] In some embodiments, the payload comprises a huwentoxin-IV (HwTx-IV) or and / or a variant thereof. In some embodiments, the payload comprises a secretory huwentoxin-IV variant thereof. The HwTx-IV variants of the present application may retain the same or similar functionality as the wild-type, such as the selective inhibition of Nav1.7. For example, the IC50 of the HwTx-IV variant may less than 1 mM. In some embodiments, the HwTx-IV variants of the present application retain the same or similar functionality as the wild-type HwTx-IV but are secretory and stabilized.

[0139] In some embodiments, the payload comprises a hIgG-Fc-stabilized Huwentoxin-IV variant (ssHwTx-IV) , a stabilized HwTx-IV variant custom-designed for high-level production and secretion in human cells (Refers to Wang et al. 2018) . The amino acid sequence of ssHwTx-IV can be as set forth In SEQ ID NO: 28. For example, the payload may comprise a peptide selecting from a HwTx-IV variant having at least 85%, at least 86%, at least 87%, at least 88%, at least 89%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity sequence identity to the amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 28.

[0140] In Wang et al. 2018, the authors engineered human cells (denoted AromaCell) allowing an R-carvone-specific GPCR to mediate transcription of ssHwTx-IV via activation of intracellular cAMP signaling. In this manner, implantation of micro-encapsulated AromaCells into mice permitted the secretion of ssHwTx-IV and initiation of pain relief upon stimulation with spearmint aroma. However, the slow dynamics of this said transcription-based system prohibit its clinical utility. In fact, like almost all transcription-based regulation systems, analgesia mediated by AromaCell can only occur at almost 24h after exposure to spearmint aroma, which is too slow for translation into a patient-compliant treatment regimen. Compared to the AromaCell, the regulation method of the present application can achieve regulation of target polypeptide expression (e.g. ssHwTx-IV) within the timescales of minutes and at optimal bioavailability.

[0141] In some embodiments, the payload may comprise a Cav2.2 blocker and / or a Cav3.2 blocker. In some embodiments, the payload may comprise a Cav2.2 blocker. In some embodiments, the payload comprises a ω-conotoxin and / or a variant thereof. In some embodiments, the payload comprises a CVIE and / or a variant thereof. In some embodiments, the payload may comprise a secretory CVIE and / or a variant thereof. The CVIE variants of the present application may retain the same or similar functionality as the wild-type, such as the selective inhibition of Cav2.2. For example, the IC50 of the CVIE variant be less than 1 mM. In some embodiments, the CVIE variants of the present application retain the same or similar functionality as the wild-type CVIE but are secretory and stabilized.

[0142] In some embodiments, the payload comprises a hIgG-Fc-stabilized CVIE variant (ssCVIE) , a stabilized CVIE variant custom-designed for high-level production and secretion in human cells. The amino acid sequence of ssCVIE can be as set forth in SEQ ID NO: 29. For example, the payload may comprise a peptide selecting from a CVIE variant having at least 85%, at least 86%, at least 87%, at least 88%, at least 89%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity sequence identity to the amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 29.

[0143] In some embodiments, the effector module comprises one or more destabilizing domains operably linked to the payload. The number of the destabilizing domain may affect the regulation of the payload by the stimulus through the destabilizing domain. In some embodiments, an increase in the number of the destabilizing domains may enhance the regulation of the payload. For example, the effect module may comprise one, two, three, four, five or more destabilizing domains operably linked to the payload. In some embodiments, the effect module comprises two or more destabilizing domains which may be identical, partly identical, or different. In some embodiments, the effect module comprises two or more destabilizing domains, and the ligands of the destabilizing domains may be identical, partly identical, or different.

[0144] In some embodiments, the destabilizing domain is operably linked to the payload via covalent bonding. In some embodiments, the destabilizing domain is indirectly operably linked to the payload. For example, the destabilizing domain is operably linked to the payload via a linker. In some embodiments, the linker between the destabilizing domain and the payload may have a specific function.

[0145] In some embodiments, the destabilizing domain is operably linked to the N-terminus and / or the C-terminus of the payload. Whether the destabilizing domain is operably linked to the N-terminus or the C-terminus of the payload may depend on the selection of the destabilizing domain and the payload. In some embodiments, the destabilizing domain can be linked to the N-terminus or C-terminus of the payload with similar or identical effects. In some embodiments, when the destabilizing domain is operably linked to the N-terminus or C-terminus of the payload, the effects may be different.

[0146] In some embodiments, the effector module of the present application comprises form the N-terminus to the C-terminus: a) the payload and the destabilizing domain, b) the destabilizing domain and the payload, c) the payload, a cleavage site, and the destabilizing domain, or d) the destabilizing domain, a cleavage site and the payload.

[0147] In some embodiments, the effector module may contain other components besides the destabilizing domain and the payload. For example, the effector module may further contain a signal peptide, a regulatory sequence, a linker, a label and / or a cleavage site.

[0148] As mentioned above, since the destabilizing domain may regulate the degradation of the payload through the secretory pathway, the payload may be secretory, for example, the payload may contain a secretory signal peptide. Alternatively, in cases where the payload itself is not secretory, the effector module may possess secretory properties, for example, incorporating a secretory signal peptide located at either the N-terminus or C-terminus of the effector module.

[0149] In some embodiments, the effector module further containing a cleavage site. In some embodiments, the cleavage site is between the destabilizing domain and the payload and may allow for the release of the payload. In some embodiments, the cleavage site may cause the payload, upon release, to retain a portion of the cleavage site at its terminus.

[0150] Various cleavage sites can be used in the effector module of the present application. In some embodiments, the cleavage site may be recognized and cleaved by enzymes naturally present or ectopically expressed in the cells expressing the effector module. In some embodiments, the cleavage site comprises a furin cleavage site (FCS) . For example, the amino sequence of the furin cleavage site is as set forth in SEQ ID NO: 55.

[0151] In some embodiments, the effector module of the present application comprises a payload and at least one destabilizing domain operably linked thereto. In some embodiments, the effector module of the present application further comprises a signal peptide and / or a cleavage site.

[0152] In some embodiments, the effector module of the present application comprises the amino acid as set forth in any one of SEQ ID NO: 30-32 and 57. In some embodiments, the effector module of the present application comprises the amino acid sequence selecting from the amino acid sequence having at least 85%, at least 86%, at least 87%, at least 88%, at least 89%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity sequence identity to the amino acid sequence as set forth in any one of SEQ ID NO: 30-32 and 57.

[0153] Polypeptides, Polynucleotides and Vectors

[0154] Also provided herein are polypeptides comprising the effector module provided herein.

[0155] The present application also provides variants of the polypeptides described herein, wherein the variants comprise, for example, fragments, analogs, and / or derivatives of the effector module disclosed herein. In some embodiments, the present application provides a polypeptide comprising the amino acid sequence at least about 80%identical, at least about 85%identical, at least about 90%identical, at least about 95%identical, at least about 96%identical, at least about 97%identical, at least about 98%identical, or at least about 99%identical to a polypeptide sequence of an effector module described herein.

[0156] Also provided herein are polynucleotides comprising the polynucleotide encoding the effector module provided herein. Also provided herein are polynucleotides encoding the polypeptides comprising the effector module provided herein.

[0157] The polynucleotide provided herein encompasses a polynucleotide which includes only coding sequences for the effector module as well as a polynucleotide which includes additional coding and / or non-coding sequences. In some embodiments, the polynucleotides provided herein may include coding sequences for the effector module and expression regulatory element sequences. For example, the expression regulatory elements may comprise promoter, enhancer, terminator, poly (A) , 5'-untranslated region (5'-UTR) , 3'-UTR, or a combination thereof.

[0158] The present application also provides variants of the polynucleotides described herein, wherein the variants encode, for example, fragments, analogs, and / or derivatives of the effector module disclosed herein. In some embodiments, the present application provides a polynucleotide comprising a nucleotide sequence at least about 80%identical, at least about 85%identical, at least about 90%identical, at least about 95%identical, at least about 96%identical, at least about 97%identical, at least about 98%identical, or at least about 99%identical to a polynucleotide sequence encoding an effector module described herein.

[0159] The polynucleotides of the application may be in the form of RNA or in the form of DNA. DNA may be cDNA, genomic DNA, or synthetic DNA, and may be double-stranded or single-stranded. Single stranded DNA may be the coding strand or non-coding (anti-sense) strand. The polynucleotides of the application may be mRNA. Polynucleotides provided herein can be prepared, manipulated, and / or expressed using any of a variety of well-established techniques known and available in the art.

[0160] Vectors comprising the polynucleotides provided herein are also provided. In some embodiments, provided herein are vectors comprising a polynucleotide provided herein. In some embodiments, the vectors provided herein comprise a polynucleotide encoding an effector module described herein. In some embodiments, the vectors provided herein comprise a polynucleotide encoding a polypeptide that is part of an effector module described herein. In some embodiments, the vectors provided herein may be an isolated vector. The vector described in the present application may be an isolated vector. Methods for isolating vectors are known in the art.

[0161] In some embodiments, the vectors provided herein can be a vector suitable for gene therapy. In some embodiments, the vectors provided herein comprise viral vectors. For example, the vector provided herein comprise a DNA viral vector, an RNA vector and / or a retroviral vector. For example, the vector provided herein comprise an integrative viral vector and / or an episomal vector. For example, the vector provided herein comprise a retroviral vector, a lentiviral vector, a gamma retroviral vector, an adeno-associated virus (AAV) vector, and / or an adeno viral vector.

[0162] In some embodiments, the vectors provided herein comprise an adeno-associated virus (AAV) vector. The AAV vectors described herein comprise AAV vectors of various serotypes. The AAV vectors described herein can deliver the effector module to the target cell and / or organ of a subject for expression, and an appropriate AAV vector can be selected based on the target cell and / or organ to be delivered. In some embodiments, the vectors provided herein comprise a recombinant AAV vector. In some embodiments, the vectors provided herein comprises a AAV2 / 9n vector, a AAV2 / Myo vector and / or a AAV2 / 8 vector.

[0163] In some embodiments, the vector may be a polynucleotide vector, for example, a plasmid, a cosmid or a transposon.

[0164] In some embodiments, the vector provided herein comprise AAV vectors. For example, the vector provided herein may comprise the nucleotide sequence as set forth in any one of SEQ ID NO: 56.

[0165] Pharmaceutical compositions and pharmaceutical combinations

[0166] Also provided herein are pharmaceutical compositions comprising the effect or module provided herein, the polypeptide provided herein, the polynucleotide provided herein, and / or the vector provided herein, and a pharmaceutically acceptable carrier.

[0167] Pharmaceutically acceptable carriers that can be used in compositions or formulations provided herein include any and all solvents, dispersion media, coatings, antibacterial and antifungal agents, isotonic and absorption delaying agents, and the like that are physiologically compatible. In some embodiments, the carrier is suitable for intravenous, intramuscular, subcutaneous, parenteral, spinal or epidermal administration (e.g., by injection or infusion) . Depending on the route of administration, the active ingredient, i.e., the effector modules, polynucleotides or vectors, can be coated in a material to protect the active ingredient from the action of acids and other natural conditions that can inactivate the active ingredient.

[0168] The pharmaceutical compositions of the present application may be formulated in any manner suitable for delivery. The formulation may be, but is not limited to, nanoparticles, poly (lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microspheres, lipidoids, lipoplex, liposome, polymers, carbohydrates (including simple sugars) , cationic lipids and combinations thereof.

[0169] Also provided herein are pharmaceutical combinations comprising a) the effector module provided herein, the polypeptide provided herein, the polynucleotide provided herein, the vector provided herein, and / or the pharmaceutical compositions provided herein; and b) one or more stimuli.

[0170] The destabilizing domain can respond to one or more stimuli in the pharmaceutical combinations described in this application, thereby regulating the expression of the payload operably linked to it. In some embodiments, the stimulus in the pharmaceutical combinations comprises a small molecule. In some embodiments, the stimulus in the pharmaceutical combinations comprises a ligand of the destabilizing domain described in the present application. For example, the stimulus in the pharmaceutical combinations comprises a ligand of the dihydrofolate reductase (DHFR) destabilization domain and / or a mutant thereof. For example, the stimulus in the pharmaceutical combinations comprises a ligand of the FKBP destabilization domain and / or a mutant thereof. For example, the stimulus in the pharmaceutical combinations comprises Trimethoprim (TMP) and / or a derivative thereof, Methotrexate (MTX) and / or a derivative thereof, and / or Shield-1 and / or a derivative thereof.

[0171] The different components in the pharmaceutical combinations can be administered separately. For example, after administering the effector module, polypeptide, polynucleotide, vector, and / or pharmaceutical compositions provided herein, the one or more stimuli can be administered independently. The payload will only be properly expressed and exert its therapeutic effect after the one or more stimuli are administered. The one or more stimuli can be administered repeatedly, and their administration can be adjusted according to the needs of the subject.

[0172] Methods and Uses

[0173] Also provided herein are methods for preventing and / or relieving pain. The present application provided a method for preventing and / or relieving pain in a subject in need thereof, comprising: a) administering an effective amount of the effector module provided herein, the polypeptide provided herein, the polynucleotide provided herein, the vector provided herein, the pharmaceutical compositions provided herein and / or the pharmaceutical combinations provided herein to a subject; and b) administering one or more stimuli to the subject, wherein the stimulus enables the production of the payload in a therapeutically effective amount.

[0174] In some embodiments, the expression of the payload is regulated by the presence of the one or more stimuli in the subject, and the amount and / or duration of stimuli administration is sufficient to produce a therapeutically effective amount of the payload in the at least one cell in the population of cells.

[0175] In some embodiments, the step a) and the step b) of the method for preventing and / or relieving pain described herein can be performed with a time interval in between, and the time interval can be determined based on the subject's needs. In some embodiments, the step a) of the method for preventing and / or relieving pain described herein only needs to be performed once, while step b) can be performed repeatedly as based on the subject's needs.

[0176] Also provided herein are the effector module provided herein, the polypeptide provided herein, the polynucleotide provided herein, the vector provided herein, the pharmaceutical compositions provided herein and / or the pharmaceutical combinations provided herein for use in preventing and / or relieving pain.

[0177] Also provided herein are uses of the effector module provided herein, the polypeptide provided herein, the polynucleotide provided herein and / or the vector provided herein in preparing a pharmaceutical composition and / or a pharmaceutical combination, wherein the pharmaceutical composition and / or a pharmaceutical combination is capable of preventing and / or relieving pain.

[0178] The methods and uses of the present application may comprise treating an animal patient belonging to any classification. Examples of such animals include mammals such as humans, rodents, dogs, cats and farm animals.

[0179] The efficacy of preventing and / or relieving pain can be compared to a no treatment or placebo control. Additionally, or alternatively, efficacy can be evaluated in comparison to one or more known pain preventing or relieving medicaments. Animal models may be used to evaluate the efficacy of preventing and / or relieving pain.

[0180] The relieving of pain described in the present application can include complete or partial disappearance of the pain sensation, shortening of the duration of the pain, or reduction in the intensity of the pain. The prevention of pain described in this application can include reducing or eliminating the risk of future pain before it occurs.

[0181] Pain can be detected and assessed through various methods, including but not limited to self-reporting via pain scoring scales or pain questionnaires, monitoring physiological indicators such as heart rate, blood pressure, respiratory rate, and skin conductance, recording changes in neural signals using electrophysiological techniques, and observing behavioral changes in subjects during pain, such as posture, facial expressions, and activity limitations.

[0182] Various type of pain may be prevented and / or relived with the effector module provided herein, the polypeptide provided herein, the polynucleotide provided herein, the vector provided herein, the pharmaceutical compositions provided herein and / or the pharmaceutical combinations provided herein.

[0183] In some embodiments, the pain may be prevented and / or relived in the present application comprises chronic pain, acute pain, neuropathic pain, nociceptive pain, mixed pain syndrome, visceral pain, back pain, and pain associated with inflammation. In some embodiments, the pain may be prevented and / or relived in the present application comprises chronic pain, wherein the chronic pain may comprise chronic primary pain, chronic cancer related pain, chronic postsurgical or post traumatic pain, chronic secondary musculoskeletal pain, chronic secondary visceral pain, chronic neuropathic pain, and / or chronic inflammatory pain.

[0184] In some embodiments, the pain may be prevented and / or relived in the present application comprises peripheral neuropathic pain (pNP) . The peripheral neuropathic pain may arise from a damage or disease affecting the peripheral nervous system, including neuropathic pain associated with peripheral neuropathy. In some embodiments, the peripheral neuropathic pain comprises chronic peripheral neuropathic pain. The peripheral neuropathic pain may be selected from the group consisting of brachialgia paraesthetica, carpal tunnel syndrome, erythromelalgia, facial neuralgia, postherpetic neuralgia, postoperative neuralgia, posttraumatic neuralgia, causalgia, mononeuropathy, nerve entrapment syndromes, nerve injuries, neuritis pain, occipital neuralgia, trigeminal neuropathy, allodynia and hyperalgesia, sulcus ulnaris syndrome, tarsal tunnel syndrome, polyneuropathy, posttraumatic neuropathy, postamputation pain, stump pain and notalgia paraesthetica.

[0185] In some embodiments, the nociceptive pain may be selected from the group consisting of ischemic pain; Raynaud syndrome related pain; degenerative joint pain such as osteoarthritis pain or arthritic pain; rheumatic pain; tendinitis associated pain, such as epicondylitis, achillodynia, fasciitis pain, keel spur pain; frozen shoulder; arthritis; degenerative vertebral pain; degenerative cervical pain; myofascial pain syndrome; muscular trigger points and myalgia.

[0186] In some embodiments, the mixed pain syndrome may be selected from the group consisting of cervical syndrome, cancer pain, low back pain, abdominal pain, complex regional pain syndrome (CRPS, also referred to as algodystrophy, reflex dystrophy, Sudeck's atrophy) , postamputation pain, disc herniation and degeneration, degenerative spinal pain, failed back surgery syndrome (FBS) and and chronic postsurgical pain (CPSP) .

[0187] Examples

[0188] The following examples are set forth so as to provide those of ordinary skill in the art with a complete disclosure and description of how to make and use the present invention, and are not intended to limit the scope of what the inventors regard as their invention nor are they intended to represent that the experiments below are all or the only experiments performed. Efforts have been made to ensure accuracy with respect to numbers used (e.g. amounts, temperature, etc. ) but some experimental errors and deviations should be accounted for. Unless indicated otherwise, parts are parts by weight, molecular weight is weight average molecular weight, temperature is in degrees Celsius, and pressure is at or near atmospheric. Standard abbreviations may be used, e.g., bp, base pair (s) ; kb, kilobase (s) ; pl, picoliter (s) ; s or sec, second (s) ; min, minute (s) ; h or hr, hour (s) ; aa, amino acid (s) ; nt, nucleotide (s) ; i. m., intramuscular (ly) ; i. p., intraperitoneal (ly) ; s. c., subcutaneous (ly) ; and the like.

[0189] Methods and Materials

[0190] Vector design. Construction and references details for all expression vectors are provided in Table 1. Some expression vectors were constructed by in-fusion cloning using the Seamless Cloning Kit (Beyotime Biotechnology, Shanghai, China; cat. no. D7010M) . PCR-amplification reactions were performed using KOD One PCR Master Mix (Toyobo Inc., Osaka, Japan; cat. no. KMM-201) . Ligation reactions were performed using T4 DNA ligase (New England Biolabs, Beverly, MA; cat. no. M0202L) . Restriction endonucleases were purchased from New England Biolabs. The primer synthesis and gene synthesis were completed by Suzhou Genewiz Biotech Co., Ltd. Plasmid DNA was extracted using the TIANprep Mini Plasmid Kit (TIANGEN Biotech, Beijing, China; cat. no. GDP103-03) . DNA sequencing service was provided by Tsingke Biotechnology (Beijing, China) .

[0191] Table 1. Plasmids designed and used in this study

[0192] Cell culture and transfection. Human embryonic kidney cells (HEK-293T, ATCC: CRL-3216) , murine hepatoma cells (Hepa1-6, ATCC: CRL-1830) , KRASG12D-positive pancreatic ductal adenocarcinoma cells (KPC, Shanghai Model Organisms Center: NM-YD04) , murine neuroblasts (N2A, ATCC: CRL-131) , malignant human glioma cells (U-87 MG, ATCC: HTB-14) , human glioblastoma astrocytoma cells (U251, Shanghai Model Organisms Center: NM-N03) were cultivated in Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA; cat. no. 12100046) supplemented with 10% (v / v) fetal bovine serum (Gibco FBS, Australia; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA; cat. no. 10099141, lot no. 2177370) and 1% (v / v) penicillin / streptomycin solution (PenStrep; Beyotime Biotechnology, Shanghai, China; cat. no. ST488) . ElectroBeta18 were cultivated in Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium (RPMI medium; VivaCell Biosciences, Shanghai, China; cat. no. C3010) supplemented with 10%FBS and with 1%PenStrep. For passaging, cells of pre-confluent cultures were detached by incubation in 0.05%trypsin-EDTA (Sangon Biotech, Shanghai, China; cat no. A610629-0050; lot no. F319BA0030) for 3 min at 37℃, collected in 10 ml of cell culture medium, centrifuged for 2 min at 1000 rpm, and resuspended in fresh culture medium at 1.5 x 105 cells / mL, and then seeded into new tissue culture plates (Wuxi NEST Biotechnology, Wuxi, China) . All cells were cultured at 37℃ in a humidified atmosphere of 5%CO2 in air. Cell number and viability were quantified using an Invitrogen Countess II AMQAX1000 Cell Counter (Thermo Fisher Scientific) .

[0193] AAV production. AAV2 / 9n-ssHwTx (TMP) , AAV2 / 9n-ssCVIE (TMP) , AAV2 / 9n-SEAP (TMP) , AAV2 / Myo-SEAP (TMP) , AV2 / 8-SEAP (TMP) and AAV2 / 8-SEAP (Grazoprevir) were produced by PackGene Biotech (Guangzhou, China) using the transfer plasmids pSL1047, pSL660 or pSL552, respectively. AAV2 / 9n-EGFP and AAV2 / Myo-EGFP were kindly gifted by PackGene Biotech (Guangzhou, China) .

[0194] Fluorescence Imaging. Tissues from mice injected with AAV2 / Myo-EGFP (intravenous) or AAV2 / 9n-EGFP (intrathecal) were harvested and fixed with 4%PFA solution (4℃, overnight) and immersed in 30%sucrose until submersion. After embedded in  O. C. T. Compound (Sakura Finetek Inc., Torrance, CA; cat. no. cat. no. 4583) , the tissues were cut into 15μm slices and stained with DAPI Staining Solution (Beyotime Biotechnology; cat. no. C1006) . Images were visualized under a Nikon ECLIPSE Ts2 Fluorescence Microscope with respective excitation and emission filter sets (EGFP: 488 / 509 nm) . Images were acquired by OPLENIC software (version x64, 10.1.14643.20190511) .

[0195] Reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) . Total RNA was extracted from the liver of mice using a Trizol-based RNA extraction method. First-strand cDNA was synthesized using the HiScript II Q RT SuperMix for qPCR (Vazyme Biotech, Nanjing, China; cat. no. R223-01) . For quantitative analysis, PCR reaction was carried out with an initial step of 95℃ for 30 s followed by 40 cycles of 95℃ for 10 s and 60℃ for 30 s on the Applied Biosystems QuantStudio 1 Real-Time PCR System (ThermoFisher Scientific) using the ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix (Vazyme Biotech; cat. no. Q711-02) and the primers listed in Table 2. The relative cycle threshold (CT) was determined and normalized against the expression level of endogenous human (ACTB) or mouse actin beta (ActB) genes.

[0196] Table 2. qRT-PCR Primers

[0197] Quantification of target gene expression. Expression levels of human placental secreted alkaline phosphatase (SEAP) in culture supernatants were quantified based on p-nitrophenyl phosphate-derived light absorbance at 415 nm. In brief, 80 μL of heat-inactivated supernatants (30 min at 65℃) were transferred to a 96-well plate containing 100 μL of 2x SEAP assay buffer [20 mM L-homoarginine, 1 mM MgCl2, 21% (v / v) diethanolamine, pH 9.8] per well. Immediately after addition of 20 μL pNPP solution [120mM stock solution in 2x SEAP assay buffer] per well, time-dependent increase of light absorbance at 405 nm was followed over 30 min using a Multiskan SkyHigh Microplate Spectrophotometer (ThermoFisher Scientific) set at 37 ℃. SEAP levels in mouse serum were profiled using a SEAP chemiluminescence assay kit (Abcam, Cambridge, UK; cat no. AB133077) . NanoLuc levels were profiled using the Luciferase Assay System (Promega, Madison, WI; cat. no. N1120) . ssHwTx level in culture supernatants and animal serum were quantified with a human IgG Fc ELISA kit (Immunology Consultants Laboratory Inc., Portland, OR; cat. no. E-80G) . Quantification of murine ALT, AST, TBIL, ALB, ALP and TBA levels in animal serum was performed by Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd. (Wuhan, China) .

[0198] Animal experiments. Animal experiments were performed according to the protocol (Protocol ID: 24-088-XMQ) approved by the Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) of Westlake University and in accordance with the Animal Care Guidelines of the Ministry of Science and Technology of the People's Republic of China. 8-week-old male C57BL / 6J and NSG mice were ordered through the Laboratory Animal Resources Center (LARC) of Westlake University. All mice were housed in Laboratory Animal Resources Center of Westlake University at a constant temperature and humidity and exposed to 12 h cycles of alternating light and dark, with ad libitum access to standard rodent food and water. Hydrodynamic tail vein injection. Endotoxin-free plasmids were diluted in Ringer’s solution (consisting of 147 mM NaCl, 4 mM KCl, 1.13 mM CaCl2) to achieve a final injection volume of 100 μL per gram body weight and injected into tail veins of > 6-week-old mice using 5 mL syringes. Drug administration. TMP (0-4 mg / kg dissolved in saline) was administered by oral gavage. Grazoprevir (3 mg / kg dissolved in saline) was administered by intraperitoneal (i. p. ) injection or oral gavage. Blood sampling. Blood was obtained from the submandibular vein of mice and allowed to clot by incubating at 4℃for 2 hours. Following this, the serum was separated from the clotted blood by centrifuging at 8000g for 8 minutes. Thermal pain assay. 3 days after acclimatization of mice to the testing room, animals were gently held by the experimenter wearing a cotton glove and blinded to group assignments, allowing one-third of the protruding mouse tail to immerse into a water bath set to 52℃. The latency of the tail flick response was immediately recorded using a conventional stopwatch by setting a maximum time limit of 10 seconds. Mechanical pain assay. The mechanical sensitivity threshold of mice was measured by using a BIO-EVF4 electronic von Frey instrument (BIOSEB Inc., Vitrolles, France) . In brief, mice were acclimatized to the testing room for 2-3 days before a punctuate stimulus was delivered to the mid-plantar area of each anterior paw from the mesh floor through a plastic tip, and the withdrawal threshold was automatically recorded. The final value was obtained by averaging 5 repeated measurements.

[0199] Data analysis. Two-tailed unpaired Student’s t-tests or one-way ANOVA were used to evaluate the statistical significance of differences between two groups or more than three groups, respectively. P values less than 0.05 were considered statistically significant. Statistical parameters and corresponding P values are declared in each figure caption. All analyses were performed using GraphPad Prism 10 (Graph Pad Software, San Diego, CA, USA) .

[0200] Example 1 Design and validation of ERAD-level gene switches in mammalian cells.

[0201] To gain control over constitutive protein secretion, the mammalian ER-associated degradation (ERAD) pathway may be an attractive accession point. When proteins enter the secretory pathway, ERAD identifies and targets misfolded proteins for immediate removal from the endoplasmic reticulum (ER) and initiation of proteasomal degradation. Thus, manipulation of the ERAD machinery could be decisive to rapidly control whether constitutively expressed proteins shall eventually complete the secretory pathway (ON) , or be effectively discarded from the cells at this stage (OFF) (FIG. 1A) . In the basal state (OFF) , misfolded target proteins are removed by the Endoplasmic Reticulum-Associated Degradation (ERAD) pathway in mammalian cells, thus preventing protein of interest (POI) secretion. POI secretion can be restored either by administration of ERAD inhibitors or trigger signals that prevent protein misfolding (ON) . Conditional control over protein misfolding can be achieved by attachment of specific degron signals to the POI. Gene switches designed to operate at the ERAD-stage of protein secretion are expected to operate at timescales of minutes.

[0202] To test this hypothesis, we fused a broad selection of well-established degron signals to the N-or C-terminus of the target protein NanoLuc, expecting that the degron motif may propagate its misfolded conformation onto the entire fusion protein and therefore activate ERAD-mediated NanoLuc removal (FIG. 1B) . For FIG 1B, HEK-293 were transfected with constitutive expression vectors for different degron-tagged NanoLuc constructs (none, pMH455; UbR, pDG147; UbAV, pDG208; UbH, pDG205; UbP, pDG211; UbVR, pDG210; UbW, pDG207; UbVV, pDG209; UbI, pDG206; NS3 / NS4A, pDG198; hPEST, pDG196; DD, pLYL205; LID, pDG212; ecDHFR, pIU140; ecDHFRH12Y, Y100I, pLYL202; ecDHFRY100I, pLYL204; ecDHFRN18T, A19V, pGT69; ecDHFRI61F, T68S, pIU142; ecDHFRR98H, F103S, pIU143; before NanoLuc levels in culture supernatants were measured after 36h. Data presented are mean ± SD, n = 3 individual experiments. The amino acid sequences of different degron signals tagged NanoLuc are set forth in SEQ ID NOs: 2-20.

[0203] Among all candidates tested, such as ubiquitin tags, hPEST signals, a self-excising Hepatitis C virus derived NS3 / NS4A complex, or mutants of E. coli-derived or murine dihydrofolate reductase (DHFR) , ecDHFRN18T, A19V showed strongest constitutive degradation efficiency (FIG. 1B) . ERAD-involvement was confirmed when exposing the transfected cells to different chemical inhibitors of eukaryotic protein degradation, with only the ERAD-specific inhibitor CP26 accounting for significant upregulation of ecDHFRN18T, A19V-tagged NanoLuc expression (FIG. 1C) . For FIG. 1C, HEK-293 cells were transfected with a constitutive expression vector for ecDHFRN18T, A19V-tagged NanoLuc (pGT69) , before the cultivation medium was supplemented with DMSO (vehicle control) or the ERAD inhibitors Eeyarestatin I (40μM) or CP26 (20μM) , the ubiquitin activating enzyme inhibitor TAK-243 (1μM) , or the proteasome inhibitor MG132 (20μM) at 24h post transfection. NanoLuc levels in culture supernatants were measured at 3h after exposure to chemicals. Data are shown as the mean ± SD of n = 3 independent experiments, and circles show individual results. Ns, not significant; ****, p<0.0001.

[0204] As anticipated, ERAD-dependent protein secretion was indeed operating at very fast timescales, with stimulation of NanoLuc secretion being recorded within 30min of CP26-exposure (FIG. 1D) . For FIG. 1D. HEK-293 cells were transfected with a constitutive expression vector for ecDHFRN18T, A19V-tagged NanoLuc (pGT69) . At 24h post transfection, NanoLuc levels in culture supernatants were monitored over 4h after exposing the cells to 20μM CP26. Data are shown as the mean ± SD of n = 3 independent experiments, and circles show individual results. ns, not significant; **, p<0.01; ****, p<0.0001.

[0205] There was also a correlation between absolute NanoLuc secretion levels and the administered CP26-dose (FIG. 1E and FIG. 2A) . For FIG. 1E, HEK-293 cells were transfected with a constitutive expression vector for either ecDHFRN18T, A19V-tagged NanoLuc (pGT69) or native untagged secreted alkaline phosphatase SEAP (pSEAP2-Control) , before the cultivation medium was supplemented with different concentrations of CP26 at 24h post transfection. NanoLuc and SEAP levels in culture supernatants were measured at 3h after CP26 exposure. Data are shown as the mean ± SD of n = 3 independent experiments, and circles show individual results. *, p<0.05; ***, p<0.001; ****, p<0.0001. For FIG. 2A, HEK-293 cells were transfected with a constitutive SEAP expression vector and cultivated in cell culture medium containing different concentrations of CP26. SEAP levels in culture supernatants were quantified at 24h after transfection. Data are shown as the mean ± SD of n = 3 independent experiments, and circles show individual results. ****, p<0.0001.

[0206] Therefore, to engineer ERAD-centered gene switches of real clinical utility, the use of non-toxic and patient-compliant trigger compounds (other than CP26) must be preferred (FIG. 1A) .

[0207] Example 2 Trimethoprim (TMP) -inducible protein secretion in mammalian cells.

[0208] ecDHFRN18T, A19V, like most E. coli-derived dihydrofolate reductase (ecDHFR) mutants, are known to respond to the FDA-approved drugs Trimethoprim (TMP) and Methotrexate (MTX) as chemical control compounds protecting ecDHFR from proteasomal degradation. Therefore, based on our results showing that ecDHFRN18T, A19V could effectively activate the ERAD pathway and enable trigger-inducible protein secretion (FIGs. 1C and 1E) , we sought to use ecDHFRN18T, A19V as the degron module within the frame of an ERAD-centered gene switch tailor-designed for therapeutic usage (FIG. 1A) . Hence, in the basal state, ecDHFRN18T, A19V-tagged target proteins of interest (POIs) may be spontaneously degraded by the cell’s endogenous ERAD pathway, until the presence of TMP or MTX promotes POI secretion by rapidly protecting ecDHFRN18T, A19V from ERAD-mediated degradation (FIG. 2B) . For FIG. 2B, HEK-293 cells were transfected with a constitutive expression vector for ecDHFRN18T, A19V- (pGT69) or DD-tagged NanoLuc (pLYL205) . At 36h post transfection, NanoLuc levels in culture supernatants were monitored at 4h after exposing the cells to TMP (40μM) , MTX (40μM) or Shield-1 (1μM) . Data are shown as the mean ± SD of n = 3 independent experiments, and circles show individual results. Numbers above bars are fold change. ns, not significant.

[0209] In fact, when we constitutively expressed ecDHFRN18T, A19V-tagged NanoLuc in mammalian cells, regulation performances of over 1000-fold in TMP-stimulated NanoLuc expression were achieved, with basal secretion levels remaining constantly low even when increasing the plasmid levels of the expression vector (FIG. 1F) . For FIG. 1F, HEK-293 cells were transfected with different plasmid amounts of a constitutive expression vector for ecDHFRN18T, A19V-tagged NanoLuc (pGT69) , cultivated for 48h in cell culture medium containing 0 or 40μM Trimethoprim (TMP) , before NanoLuc levels in culture supernatants were scored. Data are shown as the mean ± SD of n = 3 independent experiments, and circles show individual results. Numbers above bars indicate fold changes of NanoLuc expression between TMP-treated cells and cells treated in DMSO (vehicle control) .

[0210] Notably, in contrast to CP26 (FIGs. 1E and 2A) , TMP showed almost no signs of cytotoxicity either in the short or longer term (FIG. 2C) , and was therefore selected as a clinically compatible trigger signal for dose-dependent regulation of transgene expression (FIG. 3A) . For FIG. 2C, HEK-293 cells were transfected with a constitutive SEAP expression vector and cultivated in cell culture medium containing different concentrations of TMP. SEAP levels in culture supernatants were quantified at 3h and 24h post transfection. Data are shown as the mean ± SD of n = 3 independent experiments, and circles show individual results. ns, not significant. For FIG. 3A, HEK-293 cells were transfected with a constitutive expression vector for ecDHFRN18T, A19V-tagged NanoLuc (pGT69) and cultivated in cell culture medium containing different Trimethoprim (TMP) -concentrations. NanoLuc levels in culture supernatants were measured at 48h post transfection. Data are shown as the mean ± SD of n = 3 independent experiments, and circles show individual results. Numbers above bars are fold changes of TMP-inducible NanoLuc production compared to NanoLuc levels from cells treated with DMSO (0μM TMP) .

[0211] From a gene therapy perspective, an ideal gene switch should permit high fold-changes, rapid and reversible activation kinetics, multi-organ functionality, regulation of different types of therapeutic proteins, and compatibility with various viral and non-viral gene delivery strategies. Indeed, with 15min being sufficient to reveal a two-fold stimulation of target protein secretion (FIG. 3B) . For FIG. 3B, HEK-293 cells were transfected with a constitutive expression vector for ecDHFRN18T, A19V-tagged NanoLuc (pGT69) . At 36h post transfection, NanoLuc levels in culture supernatants were monitored over 4h after exposing the cells to 40μM TMP. Data are shown as the mean ± SD of n = 3 independent experiments, and circles show individual results. Numbers above bars indicate fold change of time-dependent NanoLuc production relative to time zero. ns, not significant.

[0212] The Trimethoprim (TMP) -regulated ERAD-level gene switch performed at significantly faster timescales when directly compared to conventional gene switches acting at the levels of transcription (FIG. 4A; inspired by Zhou, Y. et al. A small and highly sensitive red / far-red optogenetic switch for applications in mammals. Nat. Biotechnol. 40, 262–272 (2022) . ) , RNA-splicing (FIG. 4B; inspired by Monteys, A. M. et al. Regulated control of gene therapies by drug-induced splicing. Nature 596, 291–295 (2021) ) or translation (FIG. 4C; according to Shao, J. et al. Engineered poly (A) -surrogates for translational regulation and therapeutic biocomputation in mammalian cells. Cell Res. 34, 31–46 (2024) ) , while showing a comparable kinetic profile to regulation strategies based on TEV-repressible ER-retention (FIG. 4D; inspired by Wang, X. et al. A programmable protease-based protein secretion platform for therapeutic applications. Nat. Chem. Biol. 20, 432–442 (2024) ) .

[0213] For FIG. 4A, a grazoprevir-inducible transcription-level gene switch comprises a synthetic transcription factor TetR-NS3a (encoded by pLZ88) , a grazoprevir-dependent mammalian trans-activator (GNCR) 3-VP64 (encoded by pLZ85) and a NanoLuc expression vector containing a TetR-specific minimal promoter (encoded by pSL873) , allowing grazoprevir-mediated association between NS3a and GNCR1 to activate transcription. For experimental validation, HEK-293 cells were transfected with 100 ng of pSL873, 200 ng of pLZ85 and 200 ng of pLZ88. At 36h post transfection, NanoLuc levels in culture supernatants were monitored over 4h after exposing the cells to 0.5μM Grazoprevir. Data are shown as the mean ± SD of n = 3 independent experiments, and circles show individual results. ns, not significant; ****, p<0.0001. For FIG. 4B, in the absence of a small molecule drug LMI070, a translationally inactive transcript lacking a start codon (AUG) is produced. The presence of LMI070 inhibits AUG excision and enables POI expression. For experimental validation, HEK-293 cells were transfected with 300 ng of such LMI070-inducible NanoLuc expression vector (pSL1517) . At 36h post transfection, NanoLuc levels in culture supernatants were monitored over 4h after exposing the cells to 0.1μM LMI070. Data are shown as the mean ± SD of n = 3 independent experiments, and circles show individual results. ns, not significant; ****, p<0.0001. For FIG. 4C, a grazoprevir-inducible translation-level gene switch comprises the synthetic translation initiation factors (STIFs) MCP- (NS3a) 3 (encoded by pSL548) and (GNCR) 3-NSP3 (encoded by pLZ74) , allowing grazoprevir-mediated association between NS3a and GNCR1 to mediate circularization and translation of MCP-specific NanoLuc-mRNA (encoded by pSL683) . For experimental validation, HEK-293 cells were transfected with 50ng of pSL683 and 200ng of pSL548 and pLZ74. At 36h post transfection, NanoLuc levels in culture supernatants were monitored over 4h after exposing the cells to 0.5μM Grazoprevir. Data are shown as the mean ± SD of n = 3 independent experiments, and circles show individual results. ns, not significant; **, p<0.01. For FIG. 4D, in the basal state (OFF) , the protein of interest (POI) is sequestered to the ER lumen through a C-terminal retrieval signal (KKRN) , allowing POI secretion to only initiate upon abscisic acid (ABA) -mediated reconstitution of an ectopically expressed TEV protease with concomitant removal of the retrieval signal at a site-specific cleavage site (TEVcs) . Secretion of mature POI occurs upon furin endoprotease processing at its encoded cleavage site (FCS) within the secretory pathway (ON) . For experimental validation, HEK-293 cells were transfected with 50 ng of a constitutive expression vector for ER-sequestered NanoLuc-preprotein containing an FCS, TEVcs and a human CD4-derived transmembrane domain (TMD) (pKL131) and constitutive expression vectors for an ABA-dependent TEV protease (175ng of pKL65 and pKL68; expressing PYL1-cTEVP and ABI-nTEVP) . At 36h post transfection, NanoLuc levels in culture supernatants were monitored over 4h after exposing the cells to 100μM abscisic acid. Data are shown as the mean ± SD of n = 3 independent experiments, and circles show individual results. ns, not significant; **, p<0.01; ***, p<0.001; ****, p<0.0001.

[0214] Though, in contrast to ER retention strategies, ERAD-level gene switches are markedly simpler in design, do not rely on exogenous proteases and may therefore be favorable for gene therapy settings (FIGs. 3B and 4D) . Furthermore, the ERAD-level gene switch was functional in a variety of mammalian cell lines, consistently showing negligible basal secretion levels when cultivating different cells in TMP-free medium (FIG. 3C) . For FIG. 3C, U251, KPC, U-87 MG, N2A and Hepa1-6 were transfected with a constitutive expression vector for ecDHFRN18T, A19V-tagged NanoLuc (pGT69) and cultivated in cell culture medium containing 0 or 40μM TMP. NanoLuc levels in culture supernatants were profiled at 48h post transfection. Data are shown as the mean ± SD of n = 3 independent experiments, and circles show individual results. Numbers above bars indicate fold changes of NanoLuc expression between TMP-treated cells and cells treated in DMSO (vehicle control) .

[0215] In addition, the gene switch not only showed rapid activation kinetics (FIG. 3B) , but also fast inactivation profiles upon TMP withdrawal (FIG. 3D) , indicating potential utility for on-demand transgene regulation. For FIG. 3D, HEK-293 cells were transfected with a constitutive expression vector for ecDHFRN18T, A19V-tagged NanoLuc (pGT69) and cultivated in cell culture medium containing 40μM TMP for 2h, before the medium was exchanged into fresh TMP-free medium every 2h. After repeating the medium exchange step for three times, TMP-containing medium was re-administered to the cells. NanoLuc levels in culture supernatants were profiled every 30min. Data are shown as the mean ± SD of n = 3 independent experiments.

[0216] Lastly, we inserted a furin cleavage site (FCS) into the linker domain used to connect the target protein and the degron signal, allowing furin-mediated proteolysis to mediate spontaneous degron removal within the Golgi-apparatus (FIG. 3E) . For FIG. 3E, in a Type-C ERAD-level gene switch, the degron motifs are placed at the C-terminus of the protein of interest (POI) through a furin-cleavable linker, whereas Type-N ERAD-level switches have the degron motif inserted between a synthetic signal peptide (SP) and the furin cleavage site (FCS) at the N-terminus of the POI. While C-terminal FCS-derived residues remain at the POI following Type-C secretion, Type-N switches enable POI secretion in its native format. To test various therapeutic outputs for potential Type-C secretion, HEK-293 cells were transfected with a constitutive expression vector for FCS-ecDHFRN18T, A19V-linked ssHwTx (pLYL110) , and cultivated in cell culture medium containing 0 or 40μM TMP. Expression levels of each therapeutic protein secreted into culture supernatants were measured by corresponding enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) kits at 48h post transfection. Data are shown as the mean ± SD of n = 3 independent experiments, and circles show individual results. Numbers above bars indicate fold changes of output protein expression between TMP-treated cells and cells treated in DMSO (vehicle control) .

[0217] In theory, while proteins engineered with C-terminal furin-cleavable linkers (denoted ERAD-level gene switch with Type-C inducible secretion; FIG. 3E) may still contain amino acid residues originating from the furin cleavage site, target proteins where the furin-cleavable linker was placed after the N-terminal signal peptide may no longer contain any additional residues (denoted Type-N secretion; FIG. 3E) .

[0218] In practice, our experimental findings suggest that (i) both Type-C and Type-N secretion may compromise absolute expression levels to some extent (FIG. 5A) , that (ii) Type-N secretion may produce native therapeutic proteins but Type-C secretion allows for higher ERAD-efficiencies (FIG. 5B) . Therefore, when developing ERAD-centered gene switches for biomedical applications, the furin-independent strategy may be sufficient when high fold-changes are the prime engineering goal and if the output protein may tolerate the presence of a C-terminal appendix (such as in the case of reporter proteins; FIG. 5A) . In contrast, when therapeutic applications in vivo are the ultimate aim (FIG. 3E) , N-type secretion may be favored in order to reduce safety concerns arising from the potentially modified therapeutic protein (FIG. 5B) .

[0219] For FIG. 5A, HEK-293 cells were transfected with constitutive expression vectors for either ecDHFRN18T, A19V-tagged SEAP (pGT68) or Type-C TMP-inducible SEAP secretion (pGT103) . SEAP levels in culture supernatants were scored at 48h after cultivation in cell culture medium containing 0 or 40μM TMP. Data are shown as the mean ± SD of n = 3 independent experiments, and circles show individual results. Numbers above bars indicate fold changes of SEAP expression between TMP-treated cells and cells treated in DMSO (vehicle control) . For FIG. 5B, HEK-293 cells were transfected with constitutive expression vectors for either Type-C (pSL1198) or Type-N TMP-inducible mTSLP secretion (pSL1197) . mTSLP levels in culture supernatants were scored at 48h after cultivation in cell culture medium containing 0 or 40μM TMP. Data are shown as the mean ± SD of n = 4 independent experiments, and circles show individual results. Numbers above bars indicate fold changes of mTSLP expression between TMP-treated cells and cells treated in DMSO (vehicle control) .

[0220] Example 3 Compatibility of ERAD-level gene switches with AAV-mediated gene delivery.

[0221] Next, we sought to transfer the ERAD-level gene switch into various AAV vectors and test its regulation performance in various gene therapy settings. Because the engineering of ERAD-level gene switches only requires attachment of a <200 amino acids peptide motif to the protein of interest (FIG. 1A) , AAV-based delivery of therapeutic cargos of close to 4kb in size may be achieved in this manner (FIG. 6A) . In particular, after confirming that dose-dependent (FIG. 6B) and rapid stimulation of target gene expression was also achieved in mice (FIG. 6C) , we created AAV2 / 8, AAV2 / Myo and AAV2 / 9n particles that were previously shown to mediate efficient gene delivery into the liver, muscle and central nervous system (CNS) , respectively. Indeed, 14 days after intravenous (for AAV2 / 8) , intramuscular (for AAV2 / Myo) or intrathecal injection (for AAV2 / 9n) of 3*1011 vg AAV particles expressing ecDHFRN18T, A19V-tagged SEAP into mice, a strict TMP-dependent SEAP production profile was observed in the animals’ bloodstream (FIG. 6D) . For FIG. 6B, 30 μg of plasmid DNA encoding for ecDHFRN18T, A19V-tagged SEAP (pGT68) were hydrodynamically injected into the tail vein of C57BL / 6 mice. At 6h post injection, mice were fed with different doses of TMP 3 times per day. SEAP levels in the bloodstream of mice were measured at 24h after the first TMP administration. Data are presented as the mean ± SEM; n = 7 mice per group, and circles show individual results. Numbers above bars are fold changes of TMP-inducible SEAP production compared to SEAP levels measured in mice not receiving TMP (PBS as vehicle control) . For FIG. 6C, 24h after hydrodynamic injection of 30 μg pGT68 plasmid DNA into the tail vein of C57BL / 6 mice, the animals received a single oral dose of TMP solution (4mg / kg dissolved in saline) before SEAP levels in the bloodstream were tracked for 2h. Data are presented as the mean ± SEM; n = 7 mice per group, and circles show individual results. Numbers above bars are fold changes of TMP-inducible SEAP production compared to SEAP levels measured in mice not receiving TMP (PBS as vehicle control) . For FIG. 6D, a constitutive expression unit for ecDHFRN18T, A19V-tagged SEAP (from pGT68) was transferred into AAV2 particles with preferred tropisms for the liver (AAV2 / 8 serotype) , muscle (AAV2 / Myo serotype) or central nervous system CNS (AAV2 / 9n serotype) , respectively. 14 days after intravenous (for AAV2 / 8) , intramuscular (for AAV2 / Myo) or intrathecal injection (for AAV2 / 9n) of 3*1011 vg AAV particles into C57BL / 6 mice, SEAP levels in the bloodstream or cerebral fluid of mice receiving or not receiving TMP (12mg / kg / day) were measured. Data are presented as the mean ±SEM; n > 6 mice per group, and circles show individual results. Numbers above bars are fold changes of TMP-inducible SEAP production compared to SEAP levels measured in mice not receiving TMP (PBS as vehicle control) .

[0222] Fluorescence imaging of muscle (FIG. 7) and spinal cord tissues (FIG. 8) of mice receiving isogenic EGFP-expressing AAV particles confirm that the gene switches were indeed delivered into the respective body parts (FIG. 6A) . Notably, delivery of an ERAD-level gene switch into wild-type mice using AAV2 / 8 particles resulted in a long-lasting profile of TMP-dependent transgene expression for over one year (FIG. 6E) . For FIG. 6E, Trimethoprim (TMP) -stimulated SEAP production of C57BL / 6 mice treated with 3*1011 vg AAV2 / 8-particles (single i. v. injection) was monitored for 1 year by recurrent feeding of TMP (12mg / kg / day) at different timepoints. Data are presented as the mean ± SEM; n > 5 mice per group, and circles show individual results. Numbers above bars are fold changes of TMP-inducible SEAP production compared to SEAP levels measured in mice not receiving TMP (PBS as vehicle control) .

[0223] In contrast, hepatic expression of a state-of-the art transcription-level gene switch using the same AAV2 / 8 serotype failed to reveal trigger-inducible transgene expression in the longer term (FIG. 9B) , even though this gene switch was also regulated by a clinically licensed drug (i.e. grazoprevir) and showed excellent performances both in vitro (FIG. 4A) and in mice following hydrodynamic injection (FIG. 9A) . Grazoprevir-inducible gene switch characteristics were restored when applying the same AAV2 / 8 particles to immunodeficient NSG mice (FIG. 9B) , suggesting the involvement of immune-related factors of transgene silencing. For FIG. 9A, 24h after hydrodynamic injection of an expression vector for a grazoprevir-inducible transcription-level gene switch (100 μg of pSL552; see also FIG. 4A) into the tail vein of C57BL / 6 mice, the animals received a single oral dose of grazoprevir solution (3mg / kg dissolved in saline) before SEAP levels in the bloodstream were tracked for 24h. Data are presented as the mean ± SEM; n =5 mice per group, and circles show individual results. For FIG. 9B, Grazoprevir-stimulated SEAP production in (left) C57BL / 6 mice and (right) NSG mice treated with 3*1011 vg AAV2 / 8-particles (single i. v. injection) was monitored for 57 days by recurrent feeding of 9mg / kg / day grazoprevir at different timepoints. Data are presented as the mean ± SEM; n = 5 mice per group, and circles show individual results. Numbers above bars are fold changes of grazoprevir-inducible SEAP production compared to SEAP levels measured in mice not receiving grazoprevir (PBS as vehicle control) .

[0224] In any case, such issues were not observed with the simpler designed ERAD-level gene switch comprising markedly reduced xenogenic payloads (FIG. 6E) . No signs of hepatic side effects were observed either when analyzing the overall liver physiology of mice treated with the AAV2 / 8 particles for over one year, compared to non-treated mice of equal ages indicative for “normal” aging (FIG. 10) . For FIG. 10, one year after a single intravenous injection of 3*1011 vg AAV2 / 8-particles as described in FIG. 6E, alanine transaminase (ALT) , aspartate aminotransferase (AST) , total Bilirubin (TBIL) , albumin (ALB) , alkaline phosphatase (ALP) and total bile acids (TBA) levels in the bloodstream of 60-weeks old C57BL / 6 mice receiving or not receiving TMP administration were quantified by routine diagnostic tests of liver failure. C57BL / 6 mice of equal ages and not receiving AAV treatments were used as controls. Data are shown as the mean ± SEM of n = 5 mice, and circles show individual results. ns, not significant.

[0225] Furthermore, we show that ERAD-level gene switches appeared to not significantly induce ER stress when compared to conventional constitutive gene expression strategies both at a cellular level (FIG. 11) and in mice (FIG. 6F) . For FIG. 11, HEK-293 cells were transfected with a constitutive SEAP expression vector (pSL517) or a constitutive expression vector for ecDHFRN18T, A19V-tagged SEAP (pGT68) , and cultivated for 48h in cell culture medium containing 0 or 40μM Trimethoprim (TMP) . Relative expression levels of human DnaJ heat shock protein family member C3 (DNAJC3; panel A) , ER degradation enhancing alpha-mannosidase like protein 1 (EDEM1; panel B) , protein disulfide isomerase family A member 4 (ERP72; panel C) , homocysteine inducible ER protein with ubiquitin like domain 1 (HERPUD1; panel D) , heat shock protein family A member 5 (HSPA5; panel E) and tryptophanyl-tRNA synthetase 1 (WARS1; panel F) were profiled by qRT-PCR using primers listed in Table 2 and normalized to the gene encoding human beta-actin (ACTB) . HEK-293 cells treated for 18h with Tunicamycin (TM; 0.5 μg / ml) were used as a positive control of ER stress activation. Non-transfected HEK-293 cells without any chemical treatment were used as negative control (NC) . Data are shown as the mean ± SD of n = 3 independent experiments. ns, not significant. For FIG. 6F, one year after a single intravenous injection of 3*1011 vg AAV2 / 8-particles as described in FIG. 6E, total RNA was extracted and relative mRNA expression levels of murine protein disulfide isomerase family A member 4 (Pdia4) , tryptophanyl-tRNA synthetase 1 (Wars1) , heat shock protein family A member 5 (Hspa5) , homocysteine inducible ER protein with ubiquitin like domain 1 (Herpud1) and DnaJ heat shock protein family member C3 (Dnajc3) were profiled by qRT-PCR using primers listed in Table S1 and normalized to the gene encoding murine beta-actin (ActB) . C57BL / 6 mice of equal ages and not receiving AAV treatments were used as controls. Data are shown as the mean ± SEM of n > 5 mice, and circles show individual results. ns, not significant.

[0226] These factors may form promising basis to develop gene therapy products with reliable safety and efficacy profiles of on-demand transgene expression.

[0227] Example 4 Instant control of TMP-stimulated painkiller release in the CNS providing on-demand analgesia.

[0228] Apart from being compatible with regulation of protein secretion in the context of ERAD-level gene switches, another key advantage of Trimethoprim (TMP) as a clinically-established trigger molecule is the ability of TMP to cross the blood-brain barrier and manipulate gene activities within the central nervous system (CNS) . To this end, chronic pain may be a disorder that may highly benefit from a CNS-specific gene therapy providing on-demand and remote-controlled drug actions. At present, morphine injection remains the first-line option of chronic pain management in the clinics, though a few promising gene-and cell-based therapy approaches were reported in recent years. For example, human cells engineered with a transcription-based expression system enabling spearmint-dependent secretion of a hIgG-Fc-stabilized Huwentoxin-IV variant (ssHwTx) can theoretically provide trigger-inducible painkiller release upon cell implantation, but the slow activation kinetics of the ssHwTx production system would prohibit instant drug actions in real practice. Likewise, an AAV-based gene therapy approach was described for CRISPR-mediated silencing of a pain-related voltage-gated sodium channel Nav1.7 within the CNS, but whether and how such permanent gene silencing strategy may cause safety concerns is not sufficiently characterized. Thus, to provide a gene therapy approach capable of providing on-demand analgesia in its strictest sense, we sought to create an ERAD-level gene switch for TMP-simulated ssHwTx secretion, followed by AAV2 / 9n-mediated delivery into the dorsal root ganglia (DRG) at the subarachnoid space, ultimately allowing oral TMP administration to mediate spontaneous painkiller release right at the main body site of pain signal transmission (FIG. 12A) . For FIG. 12A, an ERAD-level gene switch for Type-N TMP-inducible secretion of an optimized and stabilized Huwentoxin-IV variant (ssHwTx) was transferred into AAV2 / 9n particles with enhanced central nervous system (CNS) tropism. Upon single intrathecal injection of such AAV2 / 9n-ssHwTx (TMP-N) particles into the dorsal root ganglia (DRG) at the subarachnoid space, instant pain relief can be achieved in the long-term by oral trimethoprim (TMP) -stimulated ssHwTx secretion.

[0229] Effective TMP-inducible ssHwTx production was achieved with either Type-C or Type-N secretion strategies (FIGs. 12B and 12C) . For FIG. 12B, HEK-293 cells were transfected with equal amounts of a constitutive expression vector for either Type-C (pLYL110) or Type-N TMP-inducible ssHwTx secretion (pLYL225) , and cultivated in cell culture medium containing different TMP-concentrations. ssHwTx levels in culture supernatants were measured at 48h post transfection. Data are shown as the mean ± SD of n = 3 independent experiments, and circles show individual results. **, p<0.01; ****, p<0.0001. For FIG. 12C, HEK-293 cells were transfected with equal amounts of a constitutive expression vector for either Type-C (pLYL110) or Type-N TMP-inducible ssHwTx secretion (pLYL225) . At 36h post transfection, ssHwTx levels in culture supernatants were monitored over 4h after exposing the cells to 40μM TMP. Data are shown as the mean ± SD of n = 3 independent experiments. ns, not significant; ****, p<0.0001.

[0230] ssHwTx produced from Type-N TMP-inducible secretion could account for the analgesic effects produced in mice as soon as ssHwTx-secretion levels reached a typical efficacy window of >100ng / mL in the bloodstream (FIGs. 12D-12F and FIG. 13) . For FIG. 12D-F, 6h after hydrodynamic injection of 60 μg pLYL225 (Type-N) into the tail vein of C57BL / 6 mice, the animals were fed with 12mg / kg / day TMP (dissolved in saline) over 24h, before analgesic scores against (D) thermal or (E) mechanical pain were profiled. For FIG 12F, ssHwTx-levels in the bloodstream of mice were profiled after completion of all behavioral assays of (D, E) . Data are presented as the mean ± SEM; n > 6 mice per group, and circles show individual results. ns, not significant; **, p<0.01. For FIG. 13, 24h after hydrodynamic injection of different plasmid amounts of a constitutive expression vector for Type-N TMP-inducible ssHwTx secretion (pLYL225; 0-150μg) into the tail vein of C57BL / 6 mice, the animals received a single oral dose of 4mg / kg TMP solution before analgesia against thermal pain was profiled using a tail flick latency assay at 1h after TMP administration. Corresponding ssHwTx-levels in the bloodstream of mice were measured after the behavioral test. Data are presented as the mean ± SEM; n = 6 mice per group, and circles show individual results. ns, not significant; **, p<0.01; ***, p<0.001; ****, p<0.0001.

[0231] Thus, after confirming that improvement of pain sensation was achieved within one hour after oral administration of a single TMP dose (FIGs. 12G-12J) , we transferred the Type-N TMP-inducible gene switch for ssHwTx secretion into CNS-selective AAV2 / 9n vectors (FIGs. 12A and FIG. 8) . For FIG. 12G, 24h after hydrodynamic injection of 150 μg pLYL225 plasmid DNA into the tail vein of C57BL / 6 mice, the animals received a single oral dose of TMP solution (4mg / kg dissolved in saline) before ssHwTx levels in the bloodstream were tracked for 2h. Data are presented as the mean ± SEM; n = 7 mice per group, and circles show individual results. ns, not significant; *, p<0.05; **, p<0.01. For FIG. 12H-12J, 24h after hydrodynamic injection of 150 μg plasmid DNA encoding for Type-N TMP-inducible ssHwTx secretion (pLYL225) into the tail vein of C57BL / 6 mice, the animals received a single oral dose of 4mg / kg TMP solution before analgesic scores against (H) thermal or (I) mechanical pain were profiled. (J) ssHwTx-levels in the bloodstream of mice were profiled after completion of all behavioral assays of (H, I) . Data are presented as the mean ± SEM; n > 7 mice per group, and circles show individual results. ns, not significant; **, p<0.01; ***, p<0.001; ****, p<0.0001.

[0232] As expected, suppression of thermal (FIG. 12K) or mechanical pain (FIG. 12L) was mediated upon oral TMP-intake over prolonged timespans, thus offering the perspective of achieving patient-compliant, side effect free, on-demand and injection-free pain management in the long term. We also showed that ssHwTx-secretion triggered by one single TMP stimulation event could account for pain suppression of at least 3 days in duration (FIGs. 12M and 12N) , which may facilitate precise dosing of the therapeutic regimen. In the future, gene therapies enabling instant pain suppression upon stimulation using a patient-compliant and CNS-compatible trigger signal such as Trimethoprim may pave the way to effective pain treatment strategies in humans. For FIG. 12K-12N, C57BL / 6 mice received a single intrathecal injection of 5*1011 vg AAV2 / 9n-ssHwTx (TMP-N) particles before analgesia scores against (K) thermal or (L) mechanical pain were profiled over several weeks. Before each behavioral test, native (control group) or AAV2 / 9n-treated mice (AAV group) were fed with 12mg / kg / day TMP or saline (vehicle control) over 24h. (M, N) In the sixth week, analgesia scores of mice receiving one single TMP dose (4mg / kg) were followed for 5 days to assess the efficacy time window of each TMP-stimulated ssHwTx release. Data are presented as the mean ± SEM; n > 5 mice per group, and circles show individual results. ns, not significant; *, p<0.05; **, p<0.01; ***, p<0.001.

[0233] Example 5 Compatibility of the effector module with other ligand responsive destabilizing domains.

[0234] In vitro production and concentration of ssCVIE. ssCVIE was secreted by pGT172-transgenic HEK-293 cells grown in DMEM / F-12 (Thermo Fisher Scientific, cat. no. 11320033) supplied with 10% (v / v) Panexin basic (Pan Biotech, cat. no. P04-96900) and 1% (v / v) penicillin / streptomycin solution. The ss CVIE-containing culture supernatant was purified using a Filtropur S 0.2μm syringe filter (Sarstedt, cat. no. 83.1826.001) before concentration and buffer-exchange into phosphate-buffered saline (PBS) using a 10K PierceTM Protein Concentrator according to the manufacturer’s protocol (ThermoFisher Scientific, cat. no. 88527) . ss CVIE levels were determined with the human IgG ELISA kit and supplied with 0.1%bovine serum albumin (BSA; New England Biolabs, cat. no. B9000S) for storage at -20 ℃.

[0235] Patch-Clamp electrophysiology. Heterologous hCaV2.2 was transient transfected in HEK-293 cells. In this study, HEK293T cells were co-transfected with 500 ng hCaV2.2, 500 ng PMX251, and 50 ng GFP per well of a 24-well plate, and the culture medium was replaced 4 h after transfection. Cells were maintained in DMEM supplemented with 10%fetal bovine serum (the same medium supplied by the client in the shipped culture flask) and cultured at 37 ℃ with 5%CO2 for 24 h before recording. One hour before electrophysiological recording, the transiently transfected cells were enzymatically dissociated to obtain a single-cell suspension and transferred onto glass coverslips placed in 24-well plates for 1 h of attachment, ensuring that most cells were well separated for patch-clamp measurements. Whole-cell hCaV2.2 channel currents were recorded with a MultiClamp700B amplifier connected to an AXON 1550B interface and controlled by the Clampex10.5 software (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) . Membrane currents were filtered at 1 or 2 kHz, digitized at 5 kHz and stored on a computer hard drive. The perfusion rate of the extracellular solution was approximately 1 mL / min. The extracellular solution contained 100 mM NaCl, 40 mM NMDG, 4 mM KCl, 5 mM CaCl2, 5 mM sorbitol, 1 mM MgCl2, 5 mM glucose, and 10 mM HEPES, adjusted to pH 7.4 with NaOH with an osmolarity of ～305 mOsm. The intracellular (pipette) solution contained 108 mM Cs-methanesulfonate, 1 mM CaCl2, 4.5 mM MgCl2, 24 mM HEPES, 10 mM EGTA, 5 mM creatine, 5 mM pyruvate, 5 mM oxaloacetate, 5 mM phosphocreatine-Na2, and 4 mM Na-ATP, adjusted to pH 7.25 with KOH with an osmolarity of ～300 mOsm.

[0236] Membrane currents were elicited by 200 ms step depolarizations to 0 mV from a holding potential (HP) of –80 mV, applied every 10 s. The acquisition rate was set to 20 kHz and signals were filtered at 5 kHz. Whole-cell patch-clamp experiments were performed at room temperature (～25 ℃) unless otherwise indicated. After stable CaV2.2 currents were obtained under continuous extracellular perfusion, the perfusion was switched to solutions containing CVIE until a steady-state effect, defined as three consecutive overlapping current traces, was reached. Each cell could be used to test one or multiple concentrations of the same compound or different compounds.

[0237] The pain-inhibiting function of ssCVIE by targeting Cav2.2 was confirmed by patch clamp electrophysiology experiment. Patch clamp experiments showing the effects of ssCVIE on inward current kinetics and dose-dependent hCav2.2 inhibition. IBa traces were evoked by 200 ms, 0.1 Hz step depolarizations to 0 mV from a HP of -80 mV (insets) . Dotted lines indicate zero current level. Vertical bars represent 0.5 μA; horizontal bars represent 100 ms (C, control) . ssCVIE dose-dependent inhibition of hCav2.2 stably expressed in HEK293 cells.

[0238] Instant control of TMP-stimulated ssCVIE release in the CNS providing on-demand analgesia. Similarly, TMP-regulated ERAD-level gene switches can also provide on-demand analgesia carrying by AAV-mediated gene delivery system. The system suppressed thermal or mechanical pain was mediated upon oral TMP-intake over prolonged timespans, thus offering the perspective of achieving patient-compliant, side effect free, on-demand and injection-free pain management in the long term. C57BL / 6 mice received a single intrathecal injection of 5*1011 vg AAV2 / 9n-ssCVIE (TMP-N) particles before analgesia scores against thermal or mechanical pain were profiled over several weeks. Before each behavioral test, native (control group) or AAV2 / 9n-treated mice (AAV group) were fed with 12mg / kg / day TMP or saline (vehicle control) over 24h.

[0239] While preferred embodiments of the present invention have been shown and described herein, it will be obvious to those skilled in the art that such embodiments are provided by way of example only. It is not intended that the invention be limited by the specific examples provided within the specification. While the invention has been described with reference to the aforementioned specification, the descriptions and illustrations of the embodiments herein are not meant to be construed in a limiting sense. Numerous variations, changes, and substitutions will now occur to those skilled in the art without departing from the invention. Furthermore, it shall be understood that all aspects of the invention are not limited to the specific depictions, configurations or relative proportions set forth herein which depend upon a variety of conditions and variables. It should be understood that various alternatives to the embodiments of the invention described herein may be employed in practicing the invention. It is therefore contemplated that the invention shall also cover any such alternatives, modifications, variations or equivalents. It is intended that the following claims define the scope of the invention and that methods and structures within the scope of these claims and their equivalents be covered thereby.

[0240] References of the present application: 1) Goodwin G, McMahon SB (2021) . The physiological function of different voltage-gated sodium channels in pain. Nat Rev Neurosci. 22: 263-274. 2) Cao, B., Xu, Q., Shi, Y. et al (2024) . Pathology of pain and its implications for therapeutic interventions. Sig Transduct Target Ther 9, 155. 3) Lampert A, O’ Reilly AO, Reeh P, Leffler A (2010) Sodium channelopathies and pain. Pflügers Arch -Eur J Physiol 460: 249–263. 4) King GF, Vetter I (2014) No Gain, No Pain: Nav1.7 as an Analgesic Target. ACS Chem Neurosci 5: 749–751. 5) Goins WF, Cohen JB, Glorioso JC (2012) Gene therapy for the treatment of chronic peripheral nervous system pain. Neurobiol Dis 48: 255–270. 6) Dib-Hajj SD, Yang Y, Black JA, Waxman SG (2013) The Nav1.7 sodium channel: from molecule to man. Nat Rev Neurosci 14: 49–62. 7) Grosser T, Woolf CJ, FitzGerald GA (2017) Time for nonaddictive relief of pain. Science 355: 1026–1027. 8) McGivern JG (2007) Ziconotide: a review of its pharmacology and use in the treatment of pain. Neuropsychiatr Dis Treat 3: 69–85. 9) Adams DJ, Callaghan B, Berecki G (2012) Analgesic conotoxins: block and G protein‐coupled receptor modulation of N‐type (CaV2.2) calcium channels. Br J Pharmacol 166: 486–500. 10) Wang H, Xie M, Hamri GC-E, et al (2018) Treatment of chronic pain by designer cells controlled by spearmint aromatherapy. Nat Biomed Eng 2: 114–123. 11) Wang, X. et al. A programmable protease-based protein secretion platform for therapeutic applications. Nat. Chem. Biol. 20, 432–442 (2024) . 12) Shao J, Li S, Qiu X, et al (2024) Engineered poly (A) -surrogates for translational regulation and therapeutic biocomputation in mammalian cells. Cell Res 34: 31–46. 13) Monteys, A. M. et al. Regulated control of gene therapies by drug-induced splicing. Nature 596, 291–295 (2021) . 14) Shen H, et al. Structures of human Nav1.7 channel in complex with auxiliary subunits and animal toxins. Science 363, 1303-1308 (2019) . 15) Berecki G, Daly NL, Huang YH, Vink S, Craik DJ, Alewood PF, Adams DJ. Effects of arginine 10 to lysine substitution on ω-conotoxin CVIE and CVIF block of Cav2.2 channels. Br J Pharmacol. 2014 Jul; 171 (13) : 3313-27. 16) Berecki G, Motin L, Haythornthwaite A, Vink S, Bansal P, Drinkwater R, Wang CI, Moretta M, Lewis RJ, Alewood PF, Christie MJ, Adams DJ. Analgesic ω-Conotoxins CVIE and CVIF Selectively and Voltage-Dependently Block Recombinant and Native N-Type Calcium Channels. Mol Pharmacol. 2010, Feb; 77 (2) 139-148. 17) Chu BW, Banaszynski LA, Chen LC, Wandless TJ. Recent progress with FKBP-derived destabilizing domains.Bioorg Med Chem Lett.2008;18(22):5941-5944.

Claims

1.An effector module comprising a payload and at least one destabilizing domain operably linked thereto, wherein the payload comprises a peptide capable of preventing or relieving pain in a subject, and the destabilizing domain is responsive to one or more stimuli.2.The effector module of claim 1, wherein the payload comprises a secretory peptide.3.The effector module of any one of claims 1-2, wherein the payload contains a secretory signal peptide.4.The effector module of any one of claims 1-3, wherein the payload comprises pain pathway inhibitors.5.The effector module of any one of claims 1-4, wherein the payload comprises ion channel blockers.6.The effector module of any one of claims 1-5, wherein the payload comprises a Sodium-channel blocker and / or a Calcium-channel blocker.7.The effector module of any one of claims 1-6, wherein the payload comprises a Nav1.7 blocker and / or a Cav2.2 blocker.8.The effector module of any one of claims 1-7, wherein the payload comprises a huwentoxin (HwTx) and / or a variant thereof, or a ω-conotoxin and / or a variant thereof.9.The effector module of any one of claims 1-8, wherein the payload comprises a huwentoxin-IV (HwTx-IV) and / or a variant thereof, or a CVIE and / or a variant thereof.10.The effector module of any one of claims 1-9, wherein the payload comprises a hIgG-Fc-stabilized Huwentoxin-IV variant (ssHwTx-IV) or a hIgG-Fc-stabilized CVIE variant (ssCVIE) .11.The effector module of any one of claims 1-10, wherein the payload comprises the amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 28 or SEQ ID NO: 29.12.The effector module of any one of claims 1-11, wherein the destabilizing domain comprises a dihydrofolate reductase (DHFR) destabilization domain and / or a mutant thereof, and / or a FKBP destabilization domain and / or a mutant thereof.13.The effector module of any one of claims 1-12, wherein the destabilizing domain comprises an E. coli dihydrofolate reductase (ecDHFR) destabilization domain, a mouse dihydrofolate reductase (mDHFR) destabilization domain, a human dihydrofolate reductase (hDHFR) destabilization domain and / or a mutant thereof.14.The effector module of any one of claims 1-13, wherein the destabilizing domain comprises an ecDHFR destabilization domain comprising the amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 22 or an ecDHFR destabilization domain mutant with at least one mutation relative to the amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 22.15.The effector module of any one of claims 1-12, wherein the destabilizing domain comprises a FKBP12 destabilization domain and / or a mutant thereof.16.The effector module of any one of claims 1-15, wherein the destabilizing domain comprises a FKBP12 destabilization domain comprising the amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 21 or a FKBP12 destabilization domain mutant with at least one mutation relative to the amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 21.17.The effector module of any one of claims 1-16, wherein the destabilizing domain comprises a destabilization domain selected from the group consisting of:a) FKBP destabilization domain, comprising the amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO:21;b) ecDHFR destabilization domain, comprising the amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 22;c) ecDHFR destabilization domain (H12Y, Y100I) , comprising the amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 23;d) ecDHFR destabilization domain (Y100I) , comprising the amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 24;e) ecDHFR destabilization domain (N18T, A19V) , comprising the amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 25;f) ecDHFR destabilization domain (I61F, T68S) , comprising the amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 26; andg) ecDHFR destabilization domain (R98H, F103S) , comprising the amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 27.18.The effector module of any one of claims 1-17, wherein the stimulus comprises a small molecule.19.The effector module of any one of claims 1-18, wherein the stimulus comprises a ligand of the dihydrofolate reductase (DHFR) destabilization domain and / or a mutant thereof.20.The effector module of any one of claims 1-19, wherein the stimulus comprises Trimethoprim (TMP) and / or a derivative thereof, Methotrexate (MTX) and / or a derivative thereof, and / or Shield-1 and / or a derivative thereof.21.The effector module of any one of claims 1-20, wherein the destabilizing domain is linked to the N-terminus and / or the C-terminus of the payload.22.The effector module of any one of claims 1-21, comprising from the N-terminus to the C-terminus:a) the payload and the destabilizing domain,b) the destabilizing domain and the payload,c) the payload, a cleavage site and the destabilizing domain, ord) the destabilizing domain, a cleavage site and the payload.23.The effector module of any one of claims 1-22, further containing a signal peptide, a regulatory sequence, a linker, a label and / or a cleavage site.24.The effector module of any one of claims 1-23, further containing a signal peptide, wherein the signal peptide is located at the N-terminus of the effector module.25.The effector module of any one of claims 1-24, further containing a cleavage site, wherein the cleavage site is between the destabilizing domain and the payload.26.The effector module of any one of claims 1-25, further containing a cleavage site, wherein the cleavage site comprises a furin cleavage site (FCS) .27.The effector module of any one of claims 1-26, further containing a cleavage site, wherein the cleavage site comprises the amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 55.28.The effector module of any one of claims 1-27, comprising the amino acid sequence as set forth in any one of SEQ ID NO: 30-32 and 57.29.A polypeptide comprising the effector module of any one of claims 1-28.30.A polynucleotide comprising a polynucleotide encoding the effector module of any one of claims 1-28 and / or the polypeptide of claim 29.31.A vector comprises the polynucleotide of claim 30.32.The vector of claim 31, wherein the vector comprises a viral vector.33.The vector of any one of claims 31-32, wherein the vector comprises a retroviral vector, a lentiviral vector, a gamma retroviral vector, a AAV vector, and / or an adeno viral vector.34.The vector of any one of claims 31-33, wherein the vector comprises a recombinant AAV vector.35.The vector of any one of claims 31-34, wherein the vector comprises a AAV2 / 9n vector, a AAV2 / Myo vector and / or a AAV2 / 8 vector.36.A pharmaceutical composition comprising the effector module of any one of claims 1-28, the polypeptide of claim 29, the polynucleotide of claim 30, and / or the vector of any one of claims 31-35, and a pharmaceutically acceptable carrier.37.A pharmaceutical combination, comprising:a) the effector module of any one of claims 1-28, the polypeptide of claim 29, the polynucleotide of claim 30, the vector of any one of claims 31-35, and / or the pharmaceutical composition of claim 36; andb) one or more stimuli.38.The pharmaceutical combination of claim 37, wherein the stimulus comprises a small molecule.39.The pharmaceutical combination of any one of claims 37-38, wherein the stimulus comprises a dihydrofolate reductase (DHFR) destabilization domain ligand.40.The pharmaceutical combination of any one of claims 37-39, wherein the stimulus comprises Trimethoprim (TMP) and / or a derivative thereof, Methotrexate (MTX) and / or a derivative thereof, and / or Shield-1 and / or a derivative thereof.41.A use of the effector module of any one of claims 1-28, the polypeptide of claim 29, the polynucleotide of claim 30, and / or the vector of any one of claims 31-35 in preparing a pharmaceutical composition and / or a pharmaceutical combination, wherein the pharmaceutical composition and / or a pharmaceutical combination is capable of preventing and / or relieving pain.42.The use of claim 41, wherein the pain comprises chronic pain, acute pain, neuropathic pain, nociceptive pain, mixed pain syndrome, visceral pain, back pain, and pain associated with inflammation.43.The use of any one of claims 41-42, wherein the pain comprises chronic pain, wherein the chronic pain comprises chronic primary pain, chronic cancer related pain, chronic postsurgical or post traumatic pain, chronic secondary musculoskeletal pain, chronic secondary visceral pain, chronic neuropathic pain, and / or chronic inflammatory pain.44.The use of any one of claims 41-43, wherein the pain comprises peripheral neuropathic pain.45.The effector module of any one of claims 1-28, the polypeptide of claim 29, the polynucleotide of claim 30, the vector of any one of claims 31-35, the pharmaceutical composition of claim 36, and / or the pharmaceutical combination of any one of claims 37-40 for use in preventing and / or relieving pain.46.The use of claim 45, wherein the pain comprises chronic pain, acute pain, neuropathic pain, nociceptive pain, mixed pain syndrome, visceral pain, back pain, and pain associated with inflammation.47.The use of any one of claims 45-46, wherein the pain comprises chronic pain, wherein the chronic pain comprises chronic primary pain, chronic cancer related pain, chronic postsurgical or post traumatic pain, chronic secondary musculoskeletal pain, chronic secondary visceral pain, chronic neuropathic pain, and / or chronic inflammatory pain.48.The use of any one of claims 45-47, wherein the pain comprises peripheral neuropathic pain.49.A method for preventing and / or relieving pain in a subject in need thereof, comprising:a) administering an effective amount of the effector module of any one of claims 1-28, the polypeptide of claim 29, the polynucleotide of claim 30, the vector of any one of claims 31-35 and / or the pharmaceutical composition of claim 36 to a subject in need; andb) administering one or more stimuli to the subject, wherein the stimulus enables the production of the payload in a therapeutically effective amount.50.The method of claim 49, wherein the stimulus comprises a small molecule.51.The method of any one of claims 49-50, wherein the stimulus comprises a dihydrofolate reductase (DHFR) destabilization domain ligand.52.The method of any one of claims 49-51, wherein the stimulus comprises Trimethoprim (TMP) and / or a derivative thereof, Methotrexate (MTX) and / or a derivative thereof, and / or Shield-1 and / or a derivative thereof.53.The method of any one of claims 49-52, wherein the pain comprises chronic pain, acute pain, neuropathic pain, nociceptive pain, mixed pain syndrome, visceral pain, back pain, and pain associated with inflammation.54.The method of any one of claims 49-53, wherein the pain comprises chronic pain, wherein the chronic pain comprises chronic primary pain, chronic cancer related pain, chronic postsurgical or post traumatic pain, chronic secondary musculoskeletal pain, chronic secondary visceral pain, chronic neuropathic pain, and / or chronic inflammatory pain.55.The method of any one of claims 49-54, wherein the pain comprises peripheral neuropathic pain.

Images