Variants of the photosensitive ion channel protein chrmine and uses thereof in treating retinal neurodegenerative diseases

Abstract

Provided are sequence variants and fusion proteins of the photosensitive ion channel protein ChRmine and their use in treating retinal neurodegenerative diseases. These ChRmine variants and fusion proteins exhibit improved protein properties and enhanced photoresponsive characteristics compared with the wildtype ChRmine, therefore may provide effective optogenetic tools to improve the therapeutic treatment of the retinal neurodegenerative diseases.

Description

Variants of the Photosensitive Ion Channel Protein ChRmine and Uses Thereof in Treating Retinal Neurodegenerative Diseases

[0001] CROSS-REFERENCE TO RELATED APPLICATION

[0002] The present application claims priority to Chinese Patent Application No. 202410957683.3 filed on July 17, 2024, the content of which is hereby incorporated into the present application by reference in its entirety.

[0003] REFERENCE TO SEQUENCE LISTING SUBMITTED ELECTRONICALLY

[0004] The content of the electronically submitted sequence listing, file name "FPCH25160280P-seql. xml" , size 98, 910 bytes, and date of creation July 16, 2025, filed herewith, is incorporated herein by reference in its entirety.TECHNICAL FIELD

[0005] This application relates generally to the field of therapeutic treatment for eye diseases, and more specifically, relates to variants of the photosensitive ion channel protein ChRmine and their use in treating retinal neurodegenerative diseases.BACKGROUND

[0006] Retinal neurodegenerative diseases, including blindness-causing eye conditions such as retinitis pigmentosa (RP) and age-related macular degeneration (AMD) , typically result from the degeneration and death of critical retinal cells, such as photoreceptors, which frequently leads to the loss of visual functions, and sometimes even leads to blindness. The pathological progression of the retinal neurodegenerative diseases usually impairs patients' vision severely, and current treatments cannot prevent irreversible visual function loss. The pathogenesis of the retinal neurodegenerative diseases often involves apoptosis of photoreceptors, which may be caused by gene mutations occurring in these cells, and / or may be exacerbated by an imbalanced retinal microenvironment (e.g., neovascularization, death of retinal pigment epithelial cells, etc. ) . Based on these mechanisms, current treatment strategies primarily focus on: 1) overexpressing or editing mutated genes to delay photoreceptor degeneration; 2) inhibiting neovascularization to reduce damage to photoreceptors; and 3) expressing photosensitive proteins in other retinal neurons (e.g., bipolar cells or ganglion cells) to restore photosensitivity.

[0007] The international patent applications WO2007024391, WO2008022772, and WO2009127705 describe the use of genes encoding photosensitive ion channels and pumps (e.g., channelrhodopsin-2 [ChR2] ) from plants and microorganisms, which are engineered for expression in mammalian neurons and can be introduced into specific neurons via viral vectors at the genetic level. When exposed to lights of appropriate wavelengths, action potentials can be triggered in neurons expressing these photosensitive proteins, thereby rendering these cells photosensitive.

[0008] The international patent application WO2017187272A1 discloses a photosensitive ion channel protein, ChrimsonR, which enables patients to see objects on a table with the aid of special glasses after administration to these patients. Specifically, ChrimsonR fused with tdTomato (tdT) or green fluorescent protein (GFP) responds more effectively to light stimulation than ChrimsonR alone.

[0009] The Australian patent AU2017372351B2 discloses a photosensitive ion channel protein, MCO. After subretinal injection of an adeno-associated virus carrying MCO, the MCO reporter protein effectively and stably expressed in the mouse retina. It was also shown that MCO expression in the retina of a photoreceptor degeneration mouse model could behaviorally achieve vision recovery.

[0010] The ChRmine protein, which encodes a pump-like cation-conducting channelrhodopsin that is derived from marine microorganisms and was first identified in 2019, has demonstrated remarkable optostimulation properties, such as large photocurrents, high light-sensitivity, and red-shifted spectrum, etc. There have been efforts using ChRmine or its sequence variant as an optogenetic tool in the brain in recent years. The international patent applications WO2020150093A1 and WO2023141625A3, and US patent application US20230250143A1 have disclosed several substitution sites of ChRmine (i.e., H33, D92, D115, Y116, T119, D126, R136, S138, I146, E154, Y156, E158, G174, F178, T218, S220, D242, E246, and Y260, based on a full-length wildtype ChRmine amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 26) , and certain sequence variants of ChRmine on certain one or certain combination of these mutation sites have demonstrated improved photoresponsiveness compared with the wildtype ChRmine.

[0011] Despite these above successes in developing optogenetic tools for an effective and efficient therapy for retinal neurodegenerative diseases, issues and challenges still exist in the therapeutic applications of these existing optogenetic tools, such as low photoactivation efficiency, suboptimal spectral response, and poor protein stability. Therefore, there is a need for continuously improving these above photosensitive ion channel proteins.SUMMARY OF THE INVENTION

[0012] In a first aspect, the present disclosure provides a sequence variant of the photosensitive ion channel protein ChRmine ( "ChRmine variant" or "ChRmine sequence variant" hereinafter) .

[0013] The ChRmine variant comprises an amino acid sequence that is at least 80%identical to the sequence of a wildtype ChRmine whose amino acid sequence is set forth in SEQ ID NO: 26, and further comprises at least one amino acid substitution, each at a position corresponding to position A2, A4, V13, L21, L118, M122, L123, Y125, M221, L225, L228, I232, V251, R266, L292, L294, L298, L305, and L308 of SEQ ID NO: 26.

[0014] Herein according to some embodiments of the ChRmine variant, each of the at least one amino acid substitution as described above is selected from A2V, A4V, V13A, L21I, L118A, M122A, L123I, Y125G, M221A, L225A, L228A, I232A, V251A, R266K, R266A, L292I, L294I, L298I, L305I, or L308I.

[0015] In certain embodiments of the ChRmine variant disclosed herein, the at least one amino acid substitution further comprises a substitution at one or more of the positions corresponding to positions T119 and Y260 of SEQ ID NO: 26. Herein optionally, the substitution may include T119A and / or Y260F.

[0016] Further in certain embodiments of the ChRmine variant disclosed herein, an amino acid substitution at any of the positions corresponding to positions Q9, H33, D126, I146, L147, and Q290 of SEQ ID NO: 26 is absent.

[0017] Herein, there is no limit to the number of the at least one amino acid substitution in the ChRmine variant disclosed herein, which can be any integer above zero and below twenty, such as 1, 2, ..., or 19 (i.e. all of the 19 aforementioned positions contain substitutions) .

[0018] In some embodiments of the ChRmine variant disclosed herein, the number of the at least one amino acid substitution is one. According to some specific embodiments, the at least one amino acid substitution comprises one single substitution at a position corresponding to any one of positions L118 or Y125 of SEQ ID NO: 26. Herein optionally the one single substitution is L118A or Y125G, and further optionally, the ChRmine variant comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 49 or SEQ ID NO: 50.

[0019] In some other embodiments of the ChRmine variant disclosed herein, the number of the at least one amino acid substitution is at least two (e.g. 2, 3, ..., or 19) . According to some specific embodiments, the at least one amino acid substitution comprises two substitutions, respectively at two positions corresponding to positions L228 and I232 of SEQ ID NO: 26. Herein optionally the two substitutions consist of L228A and I232A, and further optionally, the ChRmine variant comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 48.

[0020] In some embodiments of the ChRmine variant disclosed herein, the number of the at least one amino acid substitution is at least four (e.g. 4, 5, 6, ..., or 19) . Herein according to some specific embodiments, the ChRmine variant comprises one of the following: L118A / L225A / V251A / L305I / L308I; A4V / L123I / L294I / L308I; A2V / Y260F / L294I / L305I; V13A / L21I / T119A / L292I / L298I; L118A / M221A / L225A / V251A; L118A / M221A / L225A / V251A / R266A; L118A / M221A / L225A / V251A / R266K; L118A / L123I / V251A / L294I / L308I; L21I / L118A / T119A / L225A / V251A; M221A / L225A / L228A / I232A / V251A / R266K; M221A / L225A / V251A / R266A; or M221A / L225A / V251A / R266K. Further optionally, the ChRmine variant disclosed herein comprises an amino acid sequence of any one of SEQ ID NOS: 52-55 and 58-65.

[0021] According to one preferred embodiment, the ChRmine variant disclosed herein comprises L118A, and optionally, the ChRmine variant comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 50.

[0022] According to another preferred embodiment, the ChRmine variant comprises L118A / L225A / V251A / L305I / L308I, and optionally the ChRmine variant comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 52.

[0023] According to yet another preferred embodiment, the ChRmine variant comprises A4V / L123I / L294I / L308I, and optionally the ChRmine variant comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 53.

[0024] According to some embodiments, the ChRmine variant and the wildtype ChRmine are respectively in a fusion protein and a reference fusion protein, in which the ChRmine variant and the wildtype ChRmine are respectively fused with an 8H87 segment (SEQ ID NO: 24) at the C-terminus thereof. When the fusion protein and the reference fusion protein are respectively expressed in HEK-293T cells, the fusion protein has at least one of the following characteristics:

[0025] (1) The fusion protein is capable, upon excitation by a 550 nm-light with a light intensity between 1.0×1014 and 1.0×1017 photons / cm2s, of providing at least 20%higher peak current than the reference fusion protein as measured by whole-cell patch-clamp at a membrane potential of -60 mV. Herein optionally, the sequence variant comprises one of the following combination of substitutions: L228A / I232A; Y125G; L118A; L118A / L225A / V251A / L305I / L308I; A4V / L123I / L294I / L308I; A2V / Y260F / L294I / L305I; V13A / L21I / T119A / L292I / L298I; L118A / M221A / L225A / V251A; L118A / M221A / L225A / V251A / R266A; L118A / M221A / L225A / V251A / R266K; L118A / L123I / V251A / L294I / L308I; L21I / L118A / T119A / L225A / V251A; M221A / L225A / L228A / I232A / V251A / R266K; M221A / L225A / V251A / R266A; or M221A / L225A / V251A / R266K. Further optionally the sequence variant comprises an amino acid sequence of any one of SEQ ID NOS: 48-50, 52-55, and 58-65;

[0026] (2) The fusion protein is capable, upon excitation by a 550 nm-light with a light intensity between 1.0 × 1014 and 1.0 × 1017 photons / cm2s, of providing at least 20%higher plateau current than the reference fusion protein as measured by whole-cell patch-clamp at a membrane potential of -60 mV; and

[0027] (3) The fusion protein is capable, upon illumination by a 550 nm-light with a pulse rate between 10 Hz and 20 Hz, of exhibiting at least 20%higher Return to Baseline percentage than the reference fusion protein as measured by whole-cell patch-clamp at a membrane potential of -60 mV.

[0028] In a second aspect, the present disclosure further provides an engineered ChRmine protein, which comprises the sequence variant of the photosensitive ion channel protein ChRmine according to any one of the embodiments as described above.

[0029] According to some embodiments, the engineered ChRmine protein further comprises an 8H87 segment having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 24 at a C-terminus of the sequence variant. Herein optionally, the engineered ChRmine protein comprises an amino acid sequence of any one of SEQ ID NOS: 3, 7, 11, 27-28, 33-34, and 37-44.

[0030] According to some embodiments, the engineered ChRmine protein further comprises at least one other segment, each selected from: an HA segment having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 19; a BRIL segment having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 20; a Kv2.1 segment having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 21; a Golgi segment having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 22; a 4BEY segment having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 23; or an 8HCQ segment having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 25.

[0031] Herein optionally, each of the HA segment, the BRIL segment, and the 8HCQ segment is over the N-terminus of the sequence variant; and each of the Kv2.1 segment, the Golgi segment, and the 4BEY segment is over the C-terminus of the 8H87 segment.

[0032] Further optionally, the engineered ChRmine protein comprises an amino acid sequence of any one of SEQ ID NOS: 5, 9, and 13.

[0033] In a third aspect, the present disclosure further provides an engineered ChRmine protein.

[0034] Differing from the engineered ChRmine protein as described above in the second aspect, the engineered ChRmine protein in here comprises a wildtype ChRmine whose amino acid sequence is set forth in SEQ ID NO: 26, or a functional variant thereof having an amino acid sequence that is at least 80%identical to the wildtype ChRmine. The engineered ChRmine protein in here further comprises an 8H87 segment having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 24 at a C-terminus of the wildtype ChRmine or the functional variant thereof. Herein the engineered ChRmine protein further comprises at least one other segment, each selected from: an HA segment having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 19; a BRIL segment having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 20; a Kv2.1 segment having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 21; a Golgi segment having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 22; a 4BEY segment having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 23; or an 8HCQ segment having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 25.

[0035] Herein optionally, each of the HA segment, the BRIL segment, and the 8HCQ segment is over the N-terminus of the sequence variant; and each of the Kv2.1 segment, the Golgi segment, and the 4BEY segment is over the C-terminus of the 8H87 segment.

[0036] According to some embodiments, the engineered ChRmine protein comprises an amino acid sequence of any one of SEQ ID NOS: 29-32.

[0037] According to some embodiments of the disclosure, when the engineered ChRmine protein is expressed in HEK-293T cells, the engineered ChRmine protein is capable of obtaining a significantly higher expression than a reference ChRmine protein having an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1.

[0038] In a fourth aspect, the present disclosure further provides an isolated nucleic acid, which comprises a nucleotide sequence encoding: a sequence variant of ChRmine according to any embodiment as described above in the first aspect, or an engineered ChRmine protein according to any embodiment as described above in the second and third aspects.

[0039] The isolated nucleic acid as disclosed herein may, in addition to the nucleotide sequence that encodes the ChRmine variant or the engineered ChRmine protein as described above, further comprise additional sequences, including, but not limited to, one or more signal sequences (e.g., enhancers, polyadenylation signals, additional restriction enzyme sites, multiple cloning sites) and / or promoter sequences, or other coding segments, or combinations thereof. The promoter may be an inducible or constitutive general or cell-specific promoter. An example of a cell-specific promoter is the bipolar cell-specific mGlu6 promoter or the ganglion cell-specific SNCG promoter. Some specific embodiments include any of the disclosed methods wherein the promoter is a constitutive promoter. Some specific embodiments include any of the disclosed methods wherein the constitutive promoter includes, but is not limited to, the CMV promoter or the CAG promoter (consisting of the cytomegalovirus (CMV) early enhancer and the chicken β-actin promoter) . Promoters, vectors, enhancers, and polyadenylation sites are conventional choices for those skilled in the art. These elements are well-described in the literature and commercially available.

[0040] In a fifth aspect, the present disclosure further provides a vector, which comprises an isolated nucleic acid as described above in the fourth aspect.

[0041] Herein optionally, the vector is based on a viral vector, and optionally, the viral vector is an adenoviral vector, an adeno-associated viral (AAV) vector, a lentiviral vector, or a retroviral vector. Further optionally, the viral vector is an AAV vector, having a serotype selected from AAV1, AAV2, AAV2-7m8, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAVrh74, or AAVdj.

[0042] In addition to AAV, the vector may alternatively be a Moloney murine leukemia viral (MoMLV) vector, MSCV, SFFV, MPSV, or SNV vector, a lentiviral vector (e.g., derived from human immunodeficiency virus (HIV) , simian immunodeficiency virus (SIV) , feline immunodeficiency virus (FIV) , bovine immunodeficiency virus (BIV) , or equine infectious anemia virus (EIAV) ) , an adenoviral (Ad) vector, an adeno-associated virus (AAV) vector, a simian virus 40 (SV-40) vector, a bovine papillomavirus vector, an Epstein-Barr virus vector, a herpes virus vector, a poxvirus vector, a Harvey murine sarcoma virus vector, a murine mammary tumor virus vector, or a Rous sarcoma virus vector.

[0043] Optionally, the vector is based on a non-viral vector, selected from a plasmid, a liposome, a polymer-based nanoparticle, or an mRNA vector.

[0044] In a sixth aspect, the present disclosure further provides a viral particle, which comprises, or is derived from, a vector as described above in the fifth aspect. Herein, in certain embodiments, the vector is an AAV vector, and the viral particle may further comprise an AAV-derived capsid.

[0045] In a seventh aspect, the present disclosure further provides a cell, which comprises one of the following: an isolated nucleic acid according to any embodiment as described above in the fourth aspect, a vector according to any embodiment as described above in the fifth aspect, or a viral particle according to any embodiment as described above in the sixth aspect, or may comprise or express the ChRmine variant or the engineered ChRmine protein according to any embodiment as described above in the first, second and third aspects.

[0046] Herein the cell may be transduced with, or may comprise, a vector comprising the isolated nucleic acid, or the cell may be gene-edited to express the ChRmine variant or the engineered ChRmine protein. In certain embodiments, the cell is a mammalian cell, such as a human cell. Depending on different embodiment, the cell may be a retinal cell, a bipolar cell, or a ganglion cell. The cell may be in vitro or in vivo.

[0047] In an eighth aspect, the present disclosure further provides a pharmaceutical composition, which comprises: an isolated nucleic acid according to any embodiment as described above in the fourth aspect, a vector according to any embodiment as described above in the fifth aspect, a viral particle according to any embodiment as described above in the sixth aspect, or a cell according to any embodiment as described above in the seventh aspect. The pharmaceutical composition disclosed herein further comprises a pharmaceutically acceptable excipient.

[0048] In a ninth aspect, the present disclosure further provides use of a therapeutical agent in preparation of a medicament for the treatment of an ocular disease. Herein the therapeutical agent comprises at least one of: an isolated nucleic acid according to any embodiment as described above in the fourth aspect, a vector according to any embodiment as described above in the fifth aspect, a viral particle according to any embodiment as described above in the sixth aspect, a cell according to any embodiment as described above in the seventh aspect, or a pharmaceutical composition according to any embodiment as described above in the eighth aspect. Herein optionally, the ocular disease is characterized as a retinal neurodegenerative disease.

[0049] Herein according to some embodiments, the isolated nucleic acid may comprise a nucleotide sequence encoding a sequence variant of ChRmine, which comprises an amino acid sequence of any one of SEQ ID NOS: 48-50, 52-55, and 58-65. Herein preferably, the sequence variant comprises an amino acid sequence of any one of SEQ ID NOS: 50, 52, and 53.

[0050] Herein according to some other embodiments, the isolated nucleic acid may comprise a nucleotide sequence encoding an engineered ChRmine protein, which comprises an amino acid sequence of any one of SEQ ID NOS: 29-32. Herein preferably the engineered ChRmine protein comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 32.

[0051] In a tenth aspect, the present disclosure further provides a method for treating an ocular disease in a subject in need thereof. The method comprises a step of introducing a therapeutical agent into eyes of the subject. Herein the therapeutical agent comprises at least one of: an isolated nucleic acid according to any embodiment as described above in the fourth aspect, a vector according to any embodiment as described above in the fifth aspect, a viral particle according to any embodiment as described above in the sixth aspect, a cell according to any embodiment as described above in the seventh aspect, or a pharmaceutical composition according to any embodiment as described above in the eighth aspect.

[0052] Herein according to some embodiments of the method, the isolated nucleic acid may comprise a nucleotide sequence encoding a sequence variant of ChRmine, which comprises an amino acid sequence of any one of SEQ ID NOS: 48-50, 52-55, and 58-65. Herein preferably, the sequence variant comprises an amino acid sequence of any one of SEQ ID NOS: 50, 52, and 53.

[0053] Herein according to some other embodiments of the method, the isolated nucleic acid may comprise a nucleotide sequence encoding an engineered ChRmine protein, which comprises an amino acid sequence of any one of SEQ ID NOS: 29-32. Herein preferably the engineered ChRmine protein comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 32.

[0054] Herein optionally, the ocular disease is characterized as a retinal neurodegenerative disease, which may be selected from retinitis pigmentosa (RP) , age-related macular degeneration (AMD) , Stargardt disease, Leber's hereditary optic neuropathy, cone-rod dystrophy, Leber congenital amaurosis, diabetic retinopathy, retinal detachment, Best disease, choroideremia, pattern dystrophy, hereditary optic neuropathy (e.g. Leber's hereditary optic neuropathy or dominant optic neuropathy) , compressive optic neuropathy (e.g. orbital pseudotumor, or thyroid eye disease) , autoimmune optic neuropathy (i.e. upus) , diabetic retinopathy, glaucomatous optic neuropathy (i.e. GOND) , glaucoma, arteritic ischemic optic neuropathy (i.e.giant cell arteritis) , non-arteritic ischemic optic neuropathy, infiltrative optic neuropathy (i.e. sarcoidosis) , infectious optic neuropathy (e.g. syphilis, Lyme disease, toxoplasmosis, or herpes zoster) , optic neuritis from demyelinating diseases, or radiation-induced optic neuropathy.

[0055] In certain embodiments, the therapeutical agent comprises a viral vector, which can be administered by injection, and preferably by subretinal injection. In certain embodiments, the ChRmine variant or the fusion protein is expressed in a long term. In certain embodiments, the ChRmine variant or the fusion protein may continue to be expressed for at least 2 months post-injection. In other embodiments, the ChRmine variant or fusion protein may continue to be expressed for at least 11 months post-injection.BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

[0056] FIG. 1 shows the photosensitivity of various ChRmine variants in HEK293T cells compared to ChRmine.

[0057] FIGS. 2A-2G show the pharmacodynamic results of the ChRmine variant M1, with FIG. 2A showing the retinal ganglion cell imaging, FIG. 2B showing the optic nerve imaging, FIG. 2C showing the efficiency of RGC infection, FIG. 2D showing the results of light stimulation at different wavelengths, FIG. 2E showing the photocurrent response results under different light intensities, FIG. 2F showing the relationship between light wavelengths and voltage responses; and FIG. 2G showing the relationship between light intensity and current response.

[0058] FIG. 3 shows the electroretinogram (ERG) signals (a-wave + b-wave) in normal C57 mice ( "C57" ) , blind C3H mice administered with control AAV ( "C3H+AAV (control) " ) , and blind C3H mice administered with AAV-M1 ( "C3H+AAV (M1) " ) .

[0059] FIG. 4 shows the ERG signals of blind C3H mice administered with ChRmine and various ChRmine variants as compared to normal C57 mice.

[0060] FIG. 5 shows the plots of whole-cell patch-clamp recorded peak currents induced by a low light intensity condition (2 × 1014 photons / cm2s, lighter bars) and a high light intensity condition (2 × 1015 photons / cm2s, darker bars) in cells transfected with wildtype ChRmine and various ChRmine variants.

[0061] FIG. 6 illustrates the structure of the AAV-based ChRmine construct for each of a wildtype ChRmine and three ChRmine variants (M3, CCR18 and PCC17) .

[0062] FIG. 7 shows the light-elicited peak current plots under multiple light wavelengths in cells transfected with different ChRmine constructs as measured by whole-cell patch-clamp recordings.

[0063] FIGS. 8A-8D respectively show the representative light-evoked current traces in voltage-clamp recordings (FIG. 8A) , light-elicited peak current plots (FIG. 8B) , plateau current plots (FIG. 8C) , and plateau-peak ratio plots (FIG. 8D) under multiple light intensities in cells transfected with different ChRmine constructs as measured by whole-cell patch-clamp recordings.

[0064] FIGS. 9A-9D respectively show the off-kinetics plot for the four ChRmine constructs (ChRmine, M3, PCC17, and CCR18) ; and FIG. 9E shows the comparison of the off rate plots for the four constructs.

[0065] FIG. 10A shows the photocurrent responses under multiple different pulsed optostimulations for the four ChRmine constructs; and FIG. 10B shows the return to baseline percentage vs. stimulation frequency plot for the four ChRmine constructs.

[0066] FIG. 11 shows the Western Blot results for cells transfected with constructs encoding different engineered ChRmine fusion proteins.DETAILED DESCRIPTION

[0067] In an effort to identify novel variants of the photosensitive ion channel protein ChRmine that exhibit improved photoresponsive characteristics, inventors of this present application have performed an extensive screening over a series of ChRmine variants (see Table 1) . With the exception of only several variants, most ChRmine sequence variants displayed increased photosensitivity compared with the wildtype ChRmine (see Examples 1-3 below) . These newly identified ChRmine variants therefore may serve as good candidates for improving the therapeutic effects in the optogenetic treatment of ocular diseases such as the retinal neurodegenerative diseases.

[0068] Table 1. ChRmine variants that have been experimentally studied in this present disclosure.

[0069] Note: The "AA" after each sequence ID NO indicates it is an amino acid sequence.

[0070] Before detailed description of the inventions provided in the disclosure, the following are to be noted.

[0071] Unless otherwise defined, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which this invention belongs. Although methods and materials similar or equivalent to those described herein can be used in the practice or testing of the present invention, suitable methods and materials are described below. In case of conflict, the present specification, including definitions, will control. The materials, methods, and examples are illustrative only and not intended to be limiting. The contents of all references that are cited in the disclosure, including patent publications, research articles, or conference abstracts, etc., are incorporated into the present disclosure by reference in their entirety. Unless otherwise specified, the use of singulars shall be interpreted to also include plurals. For example, the article "a" or "an" means "at least one" or "one or more" . The use of "or" means "and / or" . Additionally, the terms "comprising" , "including" , and "containing" or alike, shall be interpreted as open-ended terms without restriction. The term "about" , "approximately" , "around" or alike, as used herein, when used with a percentage or other quantity, refers to any value within a range of plus or minus 10%of that percentage or quantity. For example, "about 100" means any value within the range of 100 plus or minus 10, i.e., within the range from 90 to 110.

[0072] The present disclosure, in certain aspects, relates to the expression of photosensitive ion channel proteins in cells, which can be activated by contact with one or more light pulses, leading to strong depolarization of the cells. The photosensitive ion channel proteins of the present disclosure, also referred to as photosensitive ion channels, can be expressed in specific cells, tissues, and / or organisms and used to control cellular responses to light pulses of appropriate wavelengths in vivo, ex vivo, and in vitro. The photosensitive ion channel proteins of the present disclosure include, but are not limited to, the ChRmine variants and fusion proteins of the present invention. In the present invention, the term "ion channel" refers to a transmembrane polypeptide that forms a pore, which opens upon activation, allowing ion conductance through the pore across the membrane.

[0073] The photosensitive ion channel proteins of the present disclosure have been found to be suitable for expression and use in mammalian cells under normal cellular environmental conditions and ion concentrations, without the need for any chemical supplementation. The photosensitive ion channel proteins of the present disclosure have been found to be activated within a light wavelength range of 365 nm to 700 nm, with preferred activation wavelengths of 530 nm to 640 nm, and peak activation wavelengths at about 550 nm.

[0074] The photosensitive ion channel proteins of the present disclosure are strongly activated by contact with a red light, preferably a light with a wavelength between about 365 nm and about 700 nm, more preferably between about 530 nm and about 640 nm, and in some specific embodiments, peak activation occurs upon contact with a light at a wavelength of about 550 nm.

[0075] Contacting excitable cells that express the photosensitive ion channel proteins of the present disclosure with a light within the activation wavelength range will strongly depolarize the cells. Exemplary light wavelengths that can be used to depolarize the cells expressing the photosensitive ion channel proteins of the present disclosure include wavelengths of at least about 365 nm, 385 nm, 405 nm, 425 nm, 445 nm, 465 nm, 485 nm, 505 nm, 525 nm, 545 nm, 565 nm, 585 nm, 590 nm, 605 nm, 625 nm, 645 nm, 665 nm, 685 nm, and 700 nm, including all wavelengths between these values. In some specific embodiments, the photosensitive ion channel proteins of the present disclosure have peak wavelength sensitivity.

[0076] The photosensitive ion channel proteins of the present disclosure can be used to depolarize excitable cells expressing these proteins. In some specific embodiments, the photosensitive ion channel proteins of the present disclosure can be expressed in a subset of cells within a cell population, which also includes one or more additional cell subsets expressing photosensitive ion channel proteins activated by light wavelengths that do not activate the photosensitive ion channel proteins of the present invention.

[0077] An "effective amount" of the photosensitive ion channel proteins or their nucleic acid expression vectors is referred to as an amount that elevates the level of photosensitive ion channel proteins in cells, tissues, or subjects to a level beneficial to the subject. An effective amount can also be determined by assessing the physiological effects of administration on cells or subjects, such as a reduction in symptoms post-administration. Other assays are known to those skilled in the art and can be used to determine the level of response to treatment. The amount of treatment can vary, for example, by increasing or decreasing the amount of photosensitive ion channel protein or nucleic acid expression vector administered, altering the therapeutic composition containing the administered photosensitive ion channel protein or nucleic acid expression vector, changing the route of administration, or altering the timing of administration. The effective amount may vary depending on the specific condition being treated, the age and physical condition of the subject being treated, the severity of the condition, the duration of treatment, the nature of concurrent therapies (if any) , the specific route of administration, and similar factors within the knowledge and expertise of a physician. These factors are well-known to those skilled in the art and can be addressed through routine experimentation. Those skilled in the art will understand that, for medical, psychological, or virtually any other reason, a subject may insist on using a lower dose or tolerate a lower dose.

[0078] The photosensitive ion channel proteins or their nucleic acid expression vectors of the present disclosure can be administered using methods known in the art. In some specific embodiments, a nucleic acid encoding a photosensitive ion channel protein of the present disclosure is administered to a subject. In some specific embodiments, a photosensitive ion channel protein is administered to a subject. The mode and dosage of administration can be individually adjusted by a physician, particularly in the presence of any complications. The absolute amount administered will depend on various factors, including the material selected for administration, whether single or multiple doses are administered, and the subject's individual parameters, including age, weight, physical condition, and disease stage. These factors are well-known to those skilled in the art and can be addressed through routine experimentation.

[0079] Pharmaceutical compositions comprising the photosensitive ion channel proteins or their nucleic acid expression vectors of the present disclosure can be administered alone or in combination with other pharmacological therapies or treatment regimens administered to the subject. Various administration modes are known to those skilled in the art. Suitable administration modes may include topical administration, intravenous administration, oral administration, intracavitary administration, intrathecal administration, intrasynovial administration, buccal administration, sublingual administration, intranasal administration, transdermal administration, subretinal administration, subcutaneous administration, intramuscular administration, and intradermal administration. The present disclosure is not limited by the specific administration modes disclosed herein.

[0080] The present disclosure, in certain aspects, includes preparing nucleic acids containing nucleotide sequences; expressing polypeptides encoded by the prepared nucleic acids and nucleotide sequences in cells and / or membranes; irradiating the cells and / or membranes with appropriate light and verifying rapid depolarization and / or changes in transmembrane conductance in response to light, as well as rapid recovery from depolarization after light cessation. The ability to controllably alter transmembrane voltage and cell depolarization through light has been validated. The present disclosure enables light-controlled manipulation of cell functions in vivo, ex vivo, and in vitro, and the photosensitive ion channel proteins of the present disclosure have broad applications in drug screening, therapeutic, and research applications, some of which are described herein.

[0081] Although the peptide amino acid sequences described in the present disclosure can be chemically synthesized, large polypeptide sequences are preferably generated using recombinant DNA techniques employing well-known methods for expressing nucleic acids containing nucleotide sequences encoding the desired peptides. Such methods can be used to construct expression vectors containing nucleotide sequences encoding peptides along with appropriate transcriptional and translational control signals. These methods include, for example, in vitro recombinant DNA techniques, synthetic techniques, and in vivo genetic recombination, which are well-known in the art.

[0082] The terms as used and the technologies as employed throughout the disclosure are provided as follows.

[0083] In general terms, a “subject” as used herein means a mammal such as a primate including a human and a chimpanzee, a pet animal including a dog and a cat, a livestock animal including cattle, a horse, sheep, and a goat, and a rodent including a mouse and a rat. It is to be noted that the whole disclosure concerns more specifically human subjects, but can optionally be applied to other non-human mammals as well. Within the scope of the present disclosure, a "subject in need" may include mammals suffering from or susceptible to ocular diseases.

[0084] Unless indicated or defined otherwise, the terms or abbreviations such as "gene" , “nucleic acid” , “nucleotide” , “polynucleotide” , “DNA” , “RNA” , and “miRNA” abide by common use in the art.

[0085] As used herein, the term “nucleic acid” is interchangeable with “polynucleotide” and refers to a polymer of nucleotides of any length, which may be ribonucleotides or deoxyribonucleotides. Thus, the term includes, but is not limited to, single-, double-, or multi-stranded DNA or RNA, genomic DNA, cDNA, DNA-RNA hybrids, or polymers containing purine and pyrimidine bases or other natural, chemically, or biochemically modified, non-natural, or derivatized nucleotide bases. The backbone of the polynucleotide may comprise sugars and phosphate groups (as typically found in RNA or DNA) or modified or substituted sugar or phosphate groups. Alternatively, the polynucleotide backbone may comprise synthetic subunits, such as phosphoramidates, and thus may be an oligodeoxynucleoside phosphoramidate (P-NH2) or a mixed phosphoramidate-phosphodiester oligomer. The nucleic acids of the present disclosure can be prepared by any technique known to those skilled in the art, including chemical synthesis, recombination, and mutagenesis. In a preferred embodiment, the nucleic acid of the present disclosure is a DNA molecule, preferably synthesized by recombinant methods well-known to those skilled in the art.

[0086] The term "isolated nucleic acid" as used herein refers to a nucleic acid molecule that has been identified and separated and / or recovered from components of its natural environment. Specifically, the term refers to a nucleic acid molecule separated from other nucleic acid molecules present in its natural source. For example, for genomic DNA, the term "isolated" includes nucleic acid molecules separated from the chromosome with which the genomic DNA is naturally associated. Preferably, an "isolated" nucleic acid molecule is free of sequences naturally flanking the nucleic acid molecule in the genomic DNA of the organism from which it is derived.

[0087] The terms "polypeptide" and "protein" are used interchangeably herein to refer to a polymer of amino acid residues and are not limited to a minimum length. These polymers of amino acid residues may contain natural or non-natural amino acid residues and include, but are not limited to, peptides, oligopeptides, dimers, trimers, and multimers of amino acid residues. Both full-length proteins and their fragments are encompassed by this definition. The term also includes post-translational modifications of polypeptides, such as glycosylation, sialylation, acetylation, phosphorylation, etc. Furthermore, for the purposes of the present invention, a "polypeptide" may refer to a protein that includes modifications such as deletions, additions, and substitutions to the parent sequence, as long as the protein retains the desired activity. These modifications may be deliberately engineered through site-directed mutagenesis or may be incidental, such as through mutations in the host producing the protein or errors caused by PCR amplification.

[0088] As used in the present invention, unless otherwise stated, the terms "treatment" and "therapy" refer to an action taken when a subject is suffering from a disease (e.g., a retinal neurodegenerative disease) that reduces the severity of one or more symptoms or the impact of the disease. As used in the present invention, unless otherwise stated, the term "prevention" refers to an action taken before a subject begins to suffer from a disease (e.g., a retinal neurodegenerative disease) , which delays the onset of the disease and / or inhibits or reduces the severity of the disease. It should be understood that treatment may be prophylactic or implemented after a disease or condition is diagnosed. The treatment of the present disclosure may reduce or eliminate the symptoms or characteristics of a disorder, disease, or condition, or may eliminate the disorder, disease, or condition itself. It should be understood that the treatment methods of the present disclosure may slow or eliminate the progression of a disease or condition and, in some cases, may lead to regression of the disease, disorder, or condition. In some specific embodiments of the present invention, the ChRmine variants may be expressed in a population of cells and used to treat retinal neurodegenerative diseases.

[0089] As used herein, the term "ChRmine variant" refers to a protein formed by the addition, deletion, or substitution of one or more amino acids relative to the parent ChRmine protein. In the context of the present disclosure, the ChRmine variant exhibits improvement in at least one property, activity, or function compared to the parent ChRmine protein. Such properties, activities, or functions include, but are not limited to, photoactivation properties, stability, expression efficiency, and therapeutic efficacy. It should be understood that this definition does not imply that the ChRmine variant is superior to the parent ChRmine protein in all aspects. For example, compared to the parent ChRmine protein, the ChRmine variant may be improved in one or more aspects but remain unchanged or less effective in one or more other aspects.

[0090] A ChRmine variant may also include conservative amino acid substitutions. As used in the present invention, the term "conservative substitution" generally refers to an amino acid substitution that maintains the structural and functional characteristics of a protein or polypeptide. Such functionally equivalent (conservative substitution) peptide amino acid sequences include, but are not limited to, additions or substitutions of amino acid residues in an amino acid sequence encoded by a nucleotide sequence that results in a silent change, thereby producing a functionally equivalent gene product. Conservative amino acid substitutions may be based on the similarity of polarity, charge, solubility, hydrophobicity, hydrophilicity, and / or amphipathic properties of the relevant residues. For example: non-polar (hydrophobic) amino acids include alanine (A) , leucine (L) , isoleucine (I) , valine (V) , proline (P) , phenylalanine (F) , tryptophan (W) , and methionine (M) ; polar neutral amino acids include glycine (G) , serine (S) , threonine (T) , cysteine (C) , tyrosine (Y) , asparagine (N) , and glutamine (Q) ; positively charged (basic) amino acids include arginine (R) , lysine (K) , and histidine (H) ; and negatively charged (acidic) amino acids include aspartic acid (D) and glutamic acid (E) .

[0091] Conservative amino acid substitutions may also be based on the hydrophilicity index. Each amino acid is assigned a hydrophilicity index based on its hydrophobicity and charge characteristics: isoleucine (+4.5) ; valine (+4.2) ; leucine (+3.8) ; phenylalanine (+2.8) ; cysteine / cystine (+2.5) ; methionine (+1.9) ; alanine (+1.8) ; glycine (-0.4) ; threonine (-0.7) ; serine (-0.8) ; tryptophan (-0.9) ; tyrosine (-1.3) ; proline (-1.6) ; histidine (-3.2) ; glutamate (-3.5) ; glutamine (-3.5) ; aspartate (-3.5) ; asparagine (-3.5) ; lysine (-3.9) ; and arginine (-4.5) . The hydrophilicity index is known in the art to confer biological functions to proteins (Kyte and Doolittle, J. Mol. Biol., 157: 105-132, 1982) . It is known that certain amino acids can be substituted with others having a similar hydrophilicity index or score while retaining similar biological activity. In some specific embodiments, substitutions include amino acids with a hydrophilicity index within ±2; in other specific embodiments, within ±1; and in yet other specific embodiments, within ±0.5.

[0092] Conservative amino acid substitutions may also be based on hydrophilicity, particularly in embodiments where the resulting biologically functional protein or peptide involves immunology. In some specific embodiments, the maximum local average hydrophilicity of a protein (determined by the hydrophilicity of its adjacent amino acids) correlates with its immunogenicity and antigenicity, i.e., its biological properties. The following hydrophilicity values are assigned to amino acid residues: arginine (+3.0) ; lysine (+3.0) ; aspartate (+3.0 ± 1) ; glutamate (+3.0 ± 1) ; serine (+0.3) ; asparagine (+0.2) ; glutamine (+0.2) ; glycine (0) ; threonine (-0.4) ; proline (-0.5 ± 1) ; alanine (-0.5) ; histidine (-0.5) ; cysteine (-1.0) ; methionine (-1.3) ; valine (-1.5) ; leucine (-1.8) ; isoleucine (-1.8) ; tyrosine (-2.3) ; phenylalanine (-2.5) ; and tryptophan (-3.4) . In some specific embodiments, substitutions include amino acids with hydrophilicity values within ±2; in other specific embodiments, within ±1; and in yet other specific embodiments, within ±0.5.

[0093] Amino acid changes are achieved by altering the codons of the corresponding nucleic acid sequence. It is known that such protein variants can be obtained by replacing certain amino acids in the protein structure with others to modify or improve biological activity. For example, amino acid substitutions can confer small conformational changes to a protein that result in increased activity. Alternatively, amino acid substitutions in certain proteins can provide residues that can then be conjugated to other molecules to produce peptide-molecule conjugates that retain sufficient characteristics of the original polypeptide for other purposes.

[0094] In the context of two or more nucleic acid or polypeptide sequences, the term "percent identity" refers to the percentage of identical residues or nucleotides in two or more sequences or subsequences when compared and aligned for maximum correspondence, as measured using one of the sequence comparison algorithms described below or by visual inspection.

[0095] For sequence alignment, one sequence is typically used as a reference sequence, and test sequences are compared to it. When using a sequence comparison algorithm, test and reference sequences are input into a computer, subsequence coordinates are specified (if necessary) , and sequence algorithm program parameters are designated. The sequence comparison algorithm then calculates the percent sequence identity for the test sequence relative to the reference sequence based on the specified program parameters.

[0096] Optimal sequence alignments for comparison can be conducted, for example, using the local homology algorithm of Smith &Waterman (Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981) ) , the homology alignment algorithm of Needleman &Wunsch (J. Mol. Biol., 48: 443 (1970) ) , the similarity search method of Pearson &Lipman (Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85: 2444 (1988) ) , computerized implementations of these algorithms (GAP, BESTFIT, FASTA, and TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI) , or by visual inspection (see generally, Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., eds., Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley &Sons, Inc. (1995 Supplement) (Ausubel) ) .

[0097] Examples of algorithms suitable for determining percent sequence identity include the BLAST and BLAST 2.0 algorithms, described in Altschul et al., (1990) J. Mol. Biol., 215: 403-410 and Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402, respectively. Software for performing BLAST analyses is publicly available through the National Center for Biotechnology Information. The algorithm involves first identifying high-scoring sequence pairs (HSPs) by identifying short words of length W in the query sequence that either match or satisfy some positive-valued threshold score T when aligned with a word of the same length in a database sequence. T is referred to as the neighborhood word score threshold (Altschul et al., supra) . These initial neighborhood word hits act as seeds for initiating searches to find longer HSPs containing them. The word hits are then extended in both directions along each sequence as long as the cumulative alignment score can be increased.

[0098] For nucleotide sequences, the cumulative score is calculated using parameters M (reward score for a pair of matching residues; always > 0) and N (penalty score for mismatching residues; always < 0) . For amino acid sequences, a scoring matrix is used to calculate the cumulative score. Extension of the word hits in each direction stops when: the cumulative alignment score falls off by the quantity X from its maximum achieved value; the cumulative score becomes zero or less due to the accumulation of one or more negative-scoring residue alignments; or the end of either sequence is reached. The BLAST algorithm parameters W, T, and X determine the sensitivity and speed of the alignment. The BLASTN program (for nucleotide sequences) uses a word length (W) of 11, an expectation (E) of 10, M=5, N=-4, and comparison of both strands by default. For amino acid sequences, the BLASTP program uses a word length (W) of 3, an expectation (E) of 10, and the BLOSUM62 scoring matrix (see Henikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915 (1989) ) by default.

[0099] Another indication that two nucleic acid or polypeptide sequences are substantially identical is that the polypeptide encoded by the first nucleic acid immunologically cross-reacts with the polypeptide encoded by the second nucleic acid. Thus, a first polypeptide is typically substantially identical to a second polypeptide if, for example, the two peptides differ only by conservative substitutions. Another indication that two nucleic acid sequences are substantially identical is that the two molecules hybridize to each other under stringent conditions.

[0100] In the present invention, the term "vector" refers to a nucleic acid molecule capable of transporting another nucleic acid between different genetic environments, wherein the nucleic acid is operably linked to the other nucleic acid.

[0101] When a nucleic acid is in a functional relationship with another nucleic acid sequence, it is "operably linked. " Generally, "operably linked" means that the linked DNA sequences are contiguous. However, enhancers do not need to be contiguous. Linking is achieved by ligation at conventional restriction sites. If such sites are not present, synthetic oligonucleotide adaptors or linkers are used according to conventional practice.

[0102] The term "vector" also refers to a virus or organism capable of transporting a nucleic acid molecule. One type of vector is an episome, i.e., a nucleic acid molecule capable of extra-chromosomal replication. Some useful vectors are those capable of autonomous replication and / or expression of nucleic acids to which they are linked. Vectors capable of directing the expression of genes to which they are operably linked are referred to herein as "expression vectors. " Expression vectors and their methods of use are well-known in the art. The present disclosure provides non-limiting examples of suitable expression vectors and their methods of use. In preferred specific embodiments, the vector is suitable for gene therapy, particularly for viral-mediated gene transfer. Viral vectors suitable for gene therapy include retroviruses, adenoviruses, adeno-associated viruses (AAV) , lentiviruses, poxviruses (e.g., MVA) , alphaviruses, herpesviruses, etc. Examples of AAV can be found in Davidson et al., PNAS (2000) 97: 3428-3432. AAV and lentiviruses can confer sustained expression, while adenoviruses can provide transient expression.

[0103] However, gene therapy also includes non-viral methods, such as the use of naked DNA or nucleic acids combined with liposomes. Vectors suitable for some methods of the present disclosure can genetically insert photosensitive ion channel protein genes into dividing and non-dividing cells and can insert photosensitive ion channel proteins into cells in vivo, ex vivo, or in vitro.

[0104] In some preferred specific embodiments, nucleic acid expression vectors containing genes encoding the photosensitive ion channel proteins of the present disclosure are selected from AAV viral vectors. The term "serotype" refers to an AAV distinguished from other AAVs by a defining antiserum and based on the reactivity of its capsid proteins with the defining antiserum. For example, numerous known serotypes exist for primate AAVs (e.g., AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV-Rh74, and AAVRh10, as well as modified capsids of these serotypes) . An "AAV virus" or "AAV viral particle" refers to a viral particle composed of at least one AAV capsid protein (preferably all capsid proteins of a wild-type AAV) and an encapsidated polynucleotide. According to preferred specific embodiments, the AAV viral vectors used in the present disclosure are of serotype AAV-2, AAV-5, AAV2-7m8, AAV-9, and AAV-8, more preferably AAV-2 or AAV2-7m8.

[0105] As used herein, the term “pharmaceutically acceptable” means approved by a regulatory agency or recognized pharmacopeia such as European Pharmacopeia, for use in animals and / or humans. The term “excipient” refers to a diluent, adjuvant, carrier, or vehicle with which the therapeutic agent is administered. As is well known in the art, "pharmaceutically acceptable excipients" are relatively inert substances that facilitate administration of a pharmacologically effective substance and can be supplied as liquid solutions or suspensions, as emulsions, or as solid forms suitable for dissolution or suspension in liquid prior to use. For example, an excipient can give form or consistency, or act as a diluent. Suitable excipients include but are not limited to stabilizing agents, wetting and emulsifying agents, salts for varying osmolality, encapsulating agents, pH buffering substances, and buffers. Such excipients include any pharmaceutical agent suitable for direct delivery to the eye which may be administered without undue toxicity. Pharmaceutically acceptable excipients include, but are not limited to, sorbitol, any of the various tween compounds, and liquids such as water, saline, glycerol and ethanol. Pharmaceutically acceptable salts can be included therein, for example, mineral acid salts such as hydrochlorides, hydrobromides, phosphates, sulfates, and the like; and the salts of organic acids such as acetates, propionates, malonates, benzoates, and the like. Preferably, the composition is formulated to be administered to the eye, in particular by intraocular injection, e.g., by subretinal and / or intravitreal administration. Accordingly, the composition can be combined with pharmaceutically acceptable excipient such as saline, Ringer's balanced salt solution (pH 7.4) , and the like. The pharmaceutical compositions described herein can be packaged in single unit dosages or in multi dosage forms.

[0106] In an embodiment, the pharmaceutical composition comprises a vector or viral particle of the invention, more preferably an AAV vector or particle. In another embodiment, the pharmaceutical composition comprises host cells of the invention, preferably human host cell of the invention, i.e. transformed or transfected with an expression cassette, vector or viral particle of the invention, preferably with an AAV particle. Optionally, the composition comprising host cells may be frozen for storage at any temperature appropriate for storage of the cells. For example, the cells may be frozen at about -20℃--80℃ or any other appropriate temperature. Cryogenically frozen cells may be stored in appropriate containers and prepared for storage to reduce risk of cell damage and maximize the likelihood that the cells will survive thawing. Alternatively, the cells may also be maintained at room temperature of refrigerated, e.g. at about 4℃.

[0107] The amount of pharmaceutical composition to be administered may be determined by standard procedure well known by those of ordinary skill in the art. Physiological data of the patient (e.g. age, size, and weight) and type and severity of the disease being treated have to be taken into account to determine the appropriate dosage. The pharmaceutical composition of the invention may be administered as a single dose or in multiple doses. In a particular embodiment, the composition comprises viral particles of the invention and each unit dosage comprises from 108 to 1013 viral particles, preferably from 109 to 1012 particles.

[0108] In light of the photosensitivity characterization results of the Examples 1-3, in one aspect of the present disclosure, a ChRmine variant is provided.

[0109] The ChRmine variant comprises an amino acid sequence that is at least 80%identical to the sequence of a wildtype ChRmine (SEQ ID NO: 26) , and further comprises at least one amino acid substitution, each at a position corresponding to one of the following 19 positions (i.e. position A2, A4, V13, L21, L118, M122, L123, Y125, M221, L225, L228, I232, V251, R266, L292, L294, L298, L305, and L308) of the wildtype ChRmine. Herein according to some embodiments of the ChRmine variant, each of the at least one amino acid substitution as described above is selected from A2V, A4V, V13A, L21I, L118A, M122A, L123I, Y125G, M221A, L225A, L228A, I232A, V251A, R266K, R266A, L292I, L294I, L298I, L305I, or L308I.

[0110] In certain embodiments of the ChRmine variant disclosed herein, the at least one amino acid substitution further comprises a substitution at one or more of the positions corresponding to positions T119 and Y260 of SEQ ID NO: 26. Herein optionally, the substitution may include T119A and / or Y260F.

[0111] It is to be noted that in the ChRmine variant disclosed herein, these above substitutions only serve as specific embodiments of the substitutions at these above positions, and within the scope of the present disclosure, any amino acid substitutions at one or more of these above positions are substantially included and covered. In one example, at position A2, the amino acid substitution may include any of the 19 possible substitutions (i.e. A2G, A2V, A2C, A2P, A2L, A2I, A2M, A2W, A2F, A2S, A2T, A2Y, A2N, A2Q, A2K, A2R, A2H, A2D, and A2E) . In another example, the amino acid substitution at position L118 may include, in addition to L118A as mentioned above, any of the other 18 possible substitutions (i.e. L118G, L118V, L118C, L118P, L118I, L118M, L118W, L118F, L118S, L118T, L118Y, L118N, L118Q, L118K, L118R, L118H, L118D, and L118E) .

[0112] It is to be further noted that the ChRmine variant as disclosed herein does not have to exhibit superior protein or functional properties. Certain preferred embodiments of the ChRmine variant that include one or a combination of substitutions at these above positions may exhibit superior protein or functional properties over the wildtype ChRmine in a screening or functional characterizations, such as relatively elevated protein expression levels, stronger light-elicited photocurrents, higher desensitization characteristics, enhanced post-light stimulation off-kinetics, and / or increased capability of distinguishing pulsed light stimulation, etc. Yet it is to be noted that the embodiments of the ChRmine variant that show one or more inferior properties than the wildtype ChRmine are also included within the scope of this present disclosure.

[0113] It is to be also noted that there is no limit to the number of the at least one amino acid substitution in the ChRmine variant disclosed herein, which can be any integer above zero and below twenty, such as 1, 2, ..., 18, or 19.

[0114] In some specific embodiments of the ChRmine variant disclosed herein, the at least one amino acid substitution comprises one single substitution at a position corresponding to any one of positions L118 or Y125 of SEQ ID NO: 26. Herein optionally the one single substitution is L118A or Y125G, and further optionally, the ChRmine variant comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 49 or SEQ ID NO: 50.

[0115] In some specific embodiments of the ChRmine variant disclosed herein, the at least one amino acid substitution comprises two substitutions, respectively at two positions corresponding to positions L228 and I232 of SEQ ID NO: 26. Herein optionally the two substitutions consist of L228A and I232A, and further optionally, the ChRmine variant comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 48.

[0116] In some specific embodiments of the ChRmine variant disclosed herein, the number of the at least one amino acid substitution is at least four. Herein optionally, the ChRmine variant may comprise one of the following: L118A / L225A / V251A / L305I / L308I; A4V / L123I / L294I / L308I; A2V / Y260F / L294I / L305I; V13A / L21I / T119A / L292I / L298I; L118A / M221A / L225A / V251A; L118A / M221A / L225A / V251A / R266A; L118A / M221A / L225A / V251A / R266K; L118A / L123I / V251A / L294I / L308I; L21I / L118A / T119A / L225A / V251A; M221A / L225A / L228A / I232A / V251A / R266K; M221A / L225A / V251A / R266A; and M221A / L225A / V251A / R266K. Further preferably, the ChRmine variant disclosed herein comprises an amino acid sequence of any one of SEQ ID NOS: 52-55 and 58-65.

[0117] In light of the screening and characterization results (see Examples 1-3) , three preferred embodiments of the ChRmine variant that showed certain superior photocurrent responses over the wildtype ChRmine (Examples 1-3) are provided, which include the three substitution (s) : L118A, L118A / L225A / V251A / L305I / L308I, and A4V / L123I / L294I / L308I, respectively. Herein more preferably, the ChRmine variant disclosed herein comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, or SEQ ID NO: 53.

[0118] In light of the photosensitivity screening and characterization results (see Examples 1-3) , the following embodiments of the ChRmine variant are provided. Each such embodiment of the ChRmine variant and the wildtype ChRmine are respectively fused with an 8H87 segment (SEQ ID NO: 24) at C-terminus thereof to thereby respectively form a fusion protein and a reference fusion protein. When the fusion protein and the reference fusion protein are respectively expressed in HEK-293T cells, the fusion protein exhibits at least one of the following three characteristics:

[0119] (1) The fusion protein is capable, upon excitation by a 550 nm-light with a light intensity between 1.0×1014 and 1.0×1017 photons / cm2s, of providing at least 20%higher peak current than the reference fusion protein as measured by whole-cell patch-clamp at a membrane potential of -60 mV. Herein, the ChRmine variant may comprise one of the following substitutions: L228A / I232A; Y125G; L118A; L118A / L225A / V251A / L305I / L308I; A4V / L123I / L294I / L308I; A2V / Y260F / L294I / L305I; V13A / L21I / T119A / L292I / L298I; L118A / M221A / L225A / V251A; L118A / M221A / L225A / V251A / R266A; L118A / M221A / L225A / V251A / R266K; L118A / L123I / V251A / L294I / L308I; L21I / L118A / T119A / L225A / V251A; M221A / L225A / L228A / I232A / V251A / R266K; M221A / L225A / V251A / R266A; or M221A / L225A / V251A / R266K. Further preferably the ChRmine variant comprises an amino acid sequence of any one of SEQ ID NOS: 48-50, 52-55, and 58-65 52 (see Examples 1 and 2 below) .

[0120] (2) The fusion protein is capable, upon excitation by a 550 nm-light with a light intensity between 1.0 × 1014 and 1.0 × 1017 photons / cm2s, of providing at least 20%higher plateau current than the reference fusion protein as measured by whole-cell patch-clamp at a membrane potential of -60 mV. Herein, the ChRmine variant may comprise one of the following two substitutions: L118A or L118A / L225A / V251A / L305I / L308I, and further preferably, may comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 50 or SEQ ID NO: 52 (see Example 3 below) .

[0121] (3) The fusion protein is capable, upon illumination by a 550 nm-light with a pulse rate between 10 Hz and 20 Hz, of exhibiting at least 20%higher Return to Baseline percentage than the reference fusion protein as measured by whole-cell patch-clamp at a membrane potential of -60 mV. Herein, the ChRmine variant may comprise substitution: A4V / L123I / L294I / L308I, and further preferably, may comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 53 (see Example 3 below) .

[0122] It is to be noted that these above preferred embodiments of the ChRmine variant shall not be interpreted to impose any limitation to the scope of the present disclosure, and other embodiments are also possible and included in this present disclosure, as long as these embodiments display the respective capabilities as described above.

[0123] As used herein, the term "peak current" refers to the maximum current that can be recorded from a cell under the conditions of a recording technology, such as the whole-cell patch-clamp technology, which is typically measured at a constant membrane voltage achieved usually by applying a voltage clamp. The peak current is a critical measure in understanding the activity of ion channels (e.g. ChRmine) , as it provides insight into the conductance of the channel and its response to various stimuli.

[0124] As used herein, the term "plateau current" refers to the average current amplitude during the last 100 ms of light stimulation, which can be used to evaluate the desensitization characteristics of ion channels (e.g. ChRmine) under sustained light stimulation. A sustained current typically indicates no desensitization, whereas an inability to maintain the current typically indicates desensitization, i.e. the ion channel cannot sustain a response to continuous light stimulation.

[0125] As used herein, the term "Return to Baseline percentage" or "Return to Baseline (%) " refers to the ratio of current amplitude to peak current, which is used to characterize the response sensitivity of ion channels (e.g. ChRmine) to light stimulation under specific frequency pulsed light. A higher Return to Baseline (%) typically indicates that the ion channel is more sensitive to light responses and can distinguish pulsed light stimulation.

[0126] In yet another effort to identify novel engineered ChRmine fusion proteins that exhibit enhanced protein properties, inventors of this present application have also performed screening and characterization studies over several ChRmine fusion proteins (see Table 3) , where the wildtype ChRmine or a ChRmine variant is fused with one or more functional segments (see Table 2) over the N-terminus and / or C-terminus thereof (see Examples 1 and 4) .

[0127] Table 2. Functional Segments used in the engineered ChRmine fusion protein.

[0128] Table 3. Engineered ChRmine fusion proteins.

[0129] Note: In each engineered ChRmine fusion protein, the segments are connected by "-" ; and from left to right, the various different segments are in a N-terminal to C-terminal direction.

[0130] In light of these screening and characterization results (see Examples 1 and 4) , in another aspect of the present disclosure, an engineered ChRmine fusion protein is provided.

[0131] In the engineered ChRmine fusion protein, one or more functional segments may be linked to the ChRmine variant or the wildtype ChRmine to improve certain biological activities thereof. Such functional segments may be directly linked to the ChRmine variant, indirectly linked via a linker, or both. In some embodiments, the linker is a flexible linker. In some embodiments, the linker consists of glycine or glycine and serine. The linker in the fusion protein of the present disclosure may have various lengths, such as 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, or 20 amino acids long. In some embodiments, the linker comprises an amino acid sequence selected from GG, GGG, GGGG, GGGGG, GGGGGG, (GGS) 2, (GGS) 3, (GGS) 4, and (GGS) 5, or any combination of these sequences.

[0132] In certain embodiments, the engineered ChRmine fusion protein comprises a wildtype ChRmine (SEQ ID NO: 26) and an 8H87 segment (SEQ ID NO: 24) at a C-terminus thereof, and further comprises at least one other segment, each selected from: an HA segment (SEQ ID NO: 19) , a BRIL segment (SEQ ID NO: 20) , a Kv2.1 segment (SEQ ID NO: 21) , a Golgi segment (SEQ ID NO: 22) , a 4BEY segment (SEQ ID NO: 23) , or an 8HCQ segment (SEQ ID NO: 25) . Optionally in some embodiments, each of the HA segment, the BRIL segment, and the 8HCQ segment is over the N-terminus of the ChRmine variant, and each of the Kv2.1 segment, the Golgi segment, and the 4BEY segment is over the C-terminus of the 8H87 segment. According to some specific embodiments, the engineered ChRmine fusion protein comprises an amino acid sequence of any one of SEQ ID NOS: 29-32.

[0133] According to some embodiments, when expressed in HEK-293T cells, the engineered ChRmine fusion protein is capable of obtaining a significantly higher expression than a reference ChRmine fusion protein (SEQ ID NO: 1) which comprises only the wildtype ChRmine and the 8H87 segment but comprises no other functional segment (s) .

[0134] In certain embodiments, the engineered ChRmine fusion protein comprises a ChRmine variant and an 8H87 segment (SEQ ID NO: 24) at a C-terminus thereof. Herein depending on the different substitutions of the ChRmine variant, the engineered ChRmine fusion protein may comprise an amino acid sequence of any one of SEQ ID NOS: 3, 7, 11, 27-28, 33-34, and 37-44.

[0135] According to some embodiments, the engineered ChRmine fusion protein may further comprise at least one other segment, selected from: an HA segment (SEQ ID NO: 19) , a BRIL segment (SEQ ID NO: 20) , a Kv2.1 segment (SEQ ID NO: 21) , a Golgi segment (SEQ ID NO: 22) , a 4BEY segment (SEQ ID NO: 23) , or an 8HCQ segment (SEQ ID NO: 25) . Herein optionally, each of the HA segment, the BRIL segment, and the 8HCQ segment is over the N-terminus of the ChRmine variant; and each of the Kv2.1 segment, the Golgi segment, and the 4BEY segment is over the C-terminus of the 8H87 segment. Further according to some specific embodiments, the engineered ChRmine fusion protein comprises an amino acid sequence of any one of SEQ ID NOS: 5, 9, and 13.

[0136] In some other aspects, the present disclosure further provides an isolated nucleic acid, a vector, a viral particle, a cell, and a pharmaceutical composition.

[0137] The isolated nucleic acid as described herein comprises a nucleotide sequence that encodes the ChRmine variant or the engineered ChRmine fusion proteins as described above.

[0138] The vector as disclosed herein comprises the isolated nucleic acid, which may be based on a viral vector, such as an adenoviral vector, an adeno-associated viral (AAV) vector (e.g. AAV1, AAV2, AAV2-7m8, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAVrh74, or AAVdj) , a lentiviral vector, or a retroviral vector, etc., or may be based on a non-viral vector (e.g. plasmid, liposome, polymer-based nanoparticle, or mRNA vector, etc. ) .

[0139] The cell as disclosed herein may comprise the isolated nucleic acid, the vector, or the viral particle as described above, or may express the ChRmine variant or the engineered ChRmine fusion proteins as described above.

[0140] The pharmaceutical composition may comprise the isolated nucleic acid, the vector, the viral particle, or the cell as described above, and may further comprise a pharmaceutically acceptable excipient.

[0141] In yet some other aspects, the present disclosure further provides use of a therapeutical agent in preparation of a medicament, and a method of using the therapeutical agent, for the treatment of an ocular disease, such as a retinal neurodegenerative disease. Herein the treatment method comprises a step of introducing a therapeutical agent into eyes of the subject, and the therapeutical agent may comprise the isolated nucleic acid, the vector, the viral particle, the cell, and / or the pharmaceutical composition as described above.

[0142] Herein according to some embodiments, the isolated nucleic acid may comprise a nucleotide sequence encoding a sequence variant of ChRmine, which comprises an amino acid sequence of any one of SEQ ID NOS: 48-50, 52-55, and 58-65. Herein preferably, the sequence variant comprises an amino acid sequence of any one of SEQ ID NOS: 50, 52, and 53.Herein according to some other embodiments, the isolated nucleic acid may comprise a nucleotide sequence encoding an engineered ChRmine fusion protein, which comprises an amino acid sequence of any one of SEQ ID NOS: 29-32. Herein preferably the engineered ChRmine fusion protein comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 32.

[0143] The following Examples 1-4 provide further details on certain specific embodiments of the inventions disclosed in this present application. Yet it is to be noted that these examples are for illustrative purposes only and do not limit the scope of the present disclosure.

[0144] Example 1

[0145] This example intends to identify novel ChRmine variants that exhibit improved photocurrent responses compared with the wildtype (” ChRmine” ) , which bears the potential for future clinical application in the treatment of retinal neurodegenerative diseases. The following summarizes the detailed experimental process and the observed results.

[0146] 1.1) Construction of ChRmine Variants

[0147] Based on a wild-type ChRmine fusion protein (SEQ ID NO: 1) , mutation sites were introduced through primer design, followed by PCR amplification of the mutated gene fragments, which were then cloned into expression vectors. The mutation sites were then verified by DNA sequencing. Through preliminary screening of the photoactivation properties, stability, and expression efficiency of the proteins, the inventors obtained ChRmine variants M1 (L228A / I232A) , M2 (Y125G) , M3 (L118A) , and M4 (M122A) , and constructed their respective fusion proteins M1-A, M2-A, M3-A, and M4-A (see Table 4 for the various ChRmine variants and their related sequences) .

[0148] Table 4. Engineered ChRmine variants and sequences.

[0149] It is to be noted that the wild-type ChRmine fusion protein (SEQ ID NO: 1) is substantially a fusion protein in which a full-length wildtype ChRmine polypeptide (SEQ ID NO: 26) is fused with an 8H87 sequence (SEQ ID NO: 24) at a C-terminus thereof. The reason for using this ChRmine fusion polypeptide for obtaining the ChRmine variants rather than using a wildtype ChRmine is that we found that the wildtype ChRmine has a relatively low expression in target cells while the ChRmine fusion polypeptide shows a much improved expression than the wildtype ChRmine when they are expressed in these target cells.

[0150] 1.2) In Vitro Light Stimulation Recording of ChRmine Variant Photosensitivity

[0151] Genes encoding the photosensitive ion channel proteins of the ChRmine variants were transiently transfected into HEK293T cells to ensure effective expression. These cells expressing photosensitive ion channel proteins were then placed in an electrophysiological recording system. In current-clamp or voltage-clamp mode, light pulses of different wavelengths and intensities were used to stimulate the cells to activate the photosensitive ion channel proteins. By recording changes in cell membrane potential or current responses, the protein's response to light stimulation was evaluated. By adjusting light parameters (e.g., wavelength and intensity) and applying specific ion channel inhibitors, the functional characteristics of the photosensitive ion channel proteins were further analyzed and validated. Statistical analysis revealed that the photosensitivity of variants M3 and M3-A was significantly stronger (～1.8-fold and 2.0-fold, respectively) than that of ChRmine itself, with other variants also slightly superior (～1.2-1.6 fold for each of M1, M1-A, M2, M2-A, and M4-A, except for M4) , as shown in FIG. 1. More specific steps in the experimental processes are provided as follows:

[0152] 1.2.1) Cell Culture and Transfection:

[0153] Cell Culture: HEK293T cells were cultured in DMEM medium (containing 10%FBS) at 37℃ in a 5%CO2 environment until reaching 70-80%confluence.

[0154] Plasmid Transfection: Plasmid DNAs encoding the photosensitive proteins were transfected into HEK293T cells using the Lipofectamine 3000 transfection reagent. Transfection was performed according to the reagent instructions, and the medium was replaced with fresh medium 6-8 hours post-transfection.

[0155] 1.2.2) Protein Expression and Cell Preparation

[0156] Expression Induction: No special induction was required, and protein expression peaked 24-48 hours post-transfection.

[0157] Cell Processing: Before recording, cells were washed with PBS and switched to a recording buffer, such as HBSS.

[0158] 1.2.3) Light Stimulation Experiment

[0159] Microscope Preparation: A fluorescence microscope or confocal microscope was used, equipped with a specific wavelength light source (e.g., LED or laser) to stimulate photosensitive proteins.

[0160] Light Stimulation: Different light intensities and durations were set according to the experimental design. Recording equipment (e.g., electrophysiological recorder or fluorescence imaging system) was calibrated and prepared for signal recording.

[0161] 1.2.4) Data Recording and Analysis

[0162] Signal Recording: Responses of photosensitive proteins were recorded using the appropriate recording equipment.

[0163] Data Analysis: Recorded data were analyzed, response curves were plotted, and photosensitive protein characteristics, such as response speed, sensitivity, and dynamic range, were evaluated.

[0164] 1.3) In Vivo Pharmacodynamic Validation of ChRmine Variants

[0165] The AAV2 / 7m8 serotype used in this study was produced by Shanghai Genechem Co., Ltd. Photoreceptor-degenerated C3H mice (12 weeks old, male) were selected for intravitreal injection, with a dose of 1.5×109 VG (vector genomes)  / eye (1.5 μl, 1×1012 VG / ml) .

[0166] The steps are briefly described as follows: Mice were anesthetized by intraperitoneal injection of 1%sodium pentobarbital (10 μl / g) , whiskers were trimmed, and one drop of 2.5%phenylephrine hydrochloride eye drops was applied to the mouse eye. The mice were placed on a heating pad, and after pupil dilation, they were positioned under a stereomicroscope. The mouse head was elevated to the level of the corneal limbus, and one drop of 0.5%proparacaine hydrochloride eye drops was applied for brief surface anesthesia. A 31-gauge needle was used to puncture the cornea to release some aqueous humor to reduce intraocular pressure. A 5 μl Hamilton microsyringe connected to a 33-gauge needle was used to inject 1.5 μl of AAV viral particles 1 mm posterior to the corneal limbus (avoiding large blood vessels) vertically, then tilted at 45° to insert the needle. The microsyringe was slowly pushed to inject the viral particles into the vitreous body (approximately 1 minute) . After injection, the needle was left in place for 1 minute and then slowly withdrawn to complete the intravitreal injection.

[0167] Retinal Flat-Mount Imaging: After perfusion with saline (0.9%NaCl) and 4%PFA, mouse eyes were harvested, fixed in 4%PFA solution at 4℃ overnight, and washed with PBS three times for 5 minutes each. Under a microscope, the cornea was removed along the corneal limbus using ophthalmic surgical scissors, and the lens was removed. The eyes were dehydrated in 5%sucrose solution for 5 minutes, 15%sucrose solution for 1 hour, and 30%sucrose solution for 2 hours. In 30%sucrose solution, under a microscope, the sclera was gently removed using forceps, and the translucent retinal tissue was extracted. With the optic disc as the center, the retina was radially cut into four segments. On a glass slide, a square well (50 mm × 50 mm) was constructed using stretched sealing film. The retina was placed in the center of the well, ganglion cell layer facing up, and residual sucrose solution was removed using a pipette and absorbent paper, allowing the retina to flatten in a petal-like shape on the slide. A drop of mounting medium was added, a coverslip was quickly placed, and the slide was sealed with nail polish. Imaging was performed using a Zeiss LSM880 confocal microscope or a Nikon spinning disk (CSU W1 Sora) confocal microscope.

[0168] Optic Nerve Flat-Mount Imaging: After perfusion with saline (0.9%NaCl) , mice were euthanized by cervical dislocation. Surrounding eye muscles were removed with surgical scissors, and the orbit was cut to expose the eyeball. The eyeball, along with the optic nerve, was extracted using curved forceps, fixed in 4%PFA solution at room temperature for 1 hour, and washed with PBS three times for 5 minutes each. Under a microscope, the optic nerve was cut at the end of the optic disc. On a glass slide, a square well (50 mm × 50 mm) was constructed using stretched sealing film. The optic nerve was placed in the center of the well, straightened as much as possible, and a drop of mounting medium was added. A coverslip was quickly placed, and the slide was sealed with nail polish. Imaging was performed using a Zeiss LSM880 confocal microscope or a Nikon spinning disk (CSU W1 Sora) confocal microscope.

[0169] Retinal flat-mount and optic nerve imaging of C3H mice 7 weeks post-administration revealed that variant M1 was efficiently expressed in retinal ganglion cells, with axons converging at the optic disc (FIG. 2A) and into optic nerve (FIG. 2B) , and approximately 20%RGC infection efficiency (FIG. 2C) .

[0170] The processed retina was prepared as a whole-mount and placed in an electrophysiological recording system. In whole-cell current-clamp mode, light pulses of different wavelengths were used to stimulate retinal cells expressing photosensitive proteins. As shown in FIG. 2D, the M1 variant responded to light stimulation at wavelengths ranging from 305 nm to 635 nm. In voltage-clamp mode, the membrane potential of the cells was precisely controlled, and the current responses of M1 under different light intensities were recorded (FIG. 2E) . Figure 2F shows the relationship between light wavelength and voltage response. Figure 2G shows the relationship between light intensity and current response. Using a light intensity of 0.1 cd*s / m^2 for ERG data collection (a-wave + b-wave) , it was found that, compared to control AAV administration, C3H mice expressing AAV-M1 exhibited detectable ERG signals, indicating partial vision restoration in blind mice (FIG. 3) .

[0171] 1.4) Summary of ERG Pharmacodynamics of ChRmine Variants

[0172] Electroretinogram (ERG) recording: Before the recording of ERG, the mice to be tested were adapted to a completely dark environment (0 Lux) for 12h in advance. Place a dim red LED light indoors to provide minimal lighting for the field of view. Be careful not to shine the animals directly. Mice were anesthetized by intramuscular injection of Zoletil (50mg / kg) and Xylazine (5mg / kg) . The degree of anesthesia was determined by the weak toes squeeze withdrawal reflex. The experimental mice were transferred to a fixed device with a constant temperature heating pad, and the body temperature of the animals was maintained at 37.0℃ by rectal probe. Tropicamide (Runzheng, China) was administered by infusion for 10 minutes to dilate the pupil. The corneal positive electrode was fixed on the eye of the mouse, the negative electrode was placed under the skin of the cheek of the mouse, and the ground electrode was placed under the skin near the tail of the mouse. The mice were moved into the visual stimulator and adapted for 5 minutes before the start of ERG recording to obtain the best effect of pupil dilation and adaptation. The software (AVES8000, Chongqing Kanghuariming Technology Co., LTD. ) was started, and the stimulus intensity of 0.1cd*s / m2 and 2.0cd*s / m2 were selected under the dark adaptation ERG mode to record the retinal electrograph waveform. The stimulation was repeated 5 times at a frequency of 0.2 Hz and the average value was obtained. The B wave amplitude of the ipsilateral and contralateral eyes of the same mouse was analyzed to evaluate the function of the retina (intermediate layer cells, such as bipolar cells) .

[0173] It was found that, compared to controls, the experimental group expressing ChRmine exhibited detectable ERG signals at both light intensities, with stronger signals at higher light intensities, consistent with normal physiological phenomena. As shown in FIG. 4, most of tested variants outperformed ChRmine: M1 (～1.5 fold compared with ChRmine) , M1-A (～1.3 fold) , M2 (～1.5 fold) , M2-A (～1.6 fold) , M3 (～1.8 fold) , M3-A (～2.0 fold) , and M4-A (～1.2 fold) , with M4 as the only exception (～1.0 fold) .

[0174] Example 2

[0175] In this example, in order to screen for novel ChRmine variants that exhibit improved photocurrent responses compared with the wildtype (” ChRmine” ) or with the M3 variant that has been identified in Example 1, a variety of ChRmine variants were engineered, and their photocurrent responses were examined in comparison with the wildtype ChRmine and the M3 variant.

[0176] 2.1) Construction of ChRmine variants:

[0177] Briefly, all of the ChRmine variants are generated by site-directed mutagenesis based on a nucleotide sequence (SEQ ID NO: 2) encoding a ChRmine fusion protein (SEQ ID NO: 1) , in which a wildtype ChRmine polypeptide (SEQ ID NO: 26) is fused with an 8H87 sequence (SEQ ID NO: 24) at a C-terminus thereof (see Example 1) . For the convenience of functional characterization, each ChRmine variant, including the wildtype ChRmine is inserted into an expression vector (e.g. an AAV expression vector) . All ChRmine variants, as well as the ChRmine fusion polypeptide based on which these variants are generated, are listed in the table below.

[0178] Table 5. Engineered ChRmine sequence variants in Example 2.

[0179] 2.2) Photocurrent response characterization:

[0180] Briefly, the expression vectors that respectively encode these above ChRmine variants (including wildtype ChRmine) are transfected into HEK-293T cells, and the transfected cells were then examined for their respective light responsiveness under two light intensity conditions (2 × 1014 and 2 × 1015 photons / cm2s) by whole-cell patch-clamp recordings at a membrane potential of -60 mV. The light-elicited peak currents were measured and plotted for each ChRmine variant (see FIG. 5) .

[0181] As shown in FIG. 5, with the exception of CCR21, CCR22 and PCC20, all other engineered variants (CCR18, CCF19, CCR20, PCC11, PCC12, PCC13, PCC14, PCC15, PCC16, PCC17, PCC18, and PCC19) exhibited at least 20%higher peak currents than the wildtype ChRmine upon excitation by a light with a lower light intensity (2 × 1014 photons / cm2s) or by a light with a higher light intensity (2 × 1015 photons / cm2s) , indicating improved photoresponsive characteristics for these variants compared with the wildtype ChRmine. Each of the above lower-intensity light excitation and higher-intensity light excitation was performed at a wavelength of 550nm and at a 1 s-pulse. Notably, two variants, CCR18 and PCC17, displayed even higher photoexcitabory characteristics than the M3 variant, with the variant PCC17 notably generating photocurrents almost two times those for the M3 variant when the cells expressing these variants were evoked by either the low-or high-intensity lights. Therefore, these ChRmine variants (i.e. CCR18, CCF19, CCR20, PCC11, PCC12, PCC13, PCC14, PCC15, PCC16, PCC17, PCC18, and PCC19) may potentially be used as highly effective excitatory tools for future clinical applications.

[0182] The two good performers, the CCR18 variant (SEQ ID NO: 28) and the PCC17 variant (SEQ ID NO: 27) , further underwent functional characterization in the following Example 3.

[0183] Example 3

[0184] In this example, detailed functional characterizations for the two ChRmine variants that have been identified in the screening in Example 2, i.e. the PCC17 variant SEQ ID NO: 27) and the CCR18 variant (SEQ ID NO: 28) were carried out in terms of the photocurrent responses in comparison with the wildtype ChRmine (i.e. "ChRmine" , or "ChRmine (wt) " , SEQ ID NO: 1) and the M3 variant (SEQ ID NO: 11) .

[0185] 3.1) Constructs and experiments:

[0186] Specifically, each of the four ChRmine variants (ChRmine, M3, PCC17 and CCR18) was inserted into an AAV expression vector that can simultaneously express each ChRmine variant and the EGFP fluorescence protein, thereby obtaining four constructs: ChRmine-GFP, M3-GFP, PCC17-GFP, and CCR18-GFP. The structure of these constructs is illustrated in FIG. 6, where each ChRmine variant-encoding polynucleotide is linked to an EGFP (SEQ ID NO: 47) -encoding polynucleotide by means of a T2A (SEQ ID NO: 46) -encoding sequence. These constructs were respectively used to transfect HEK-293T cells, which further underwent optostimulation at different conditions. EGFP was used for locating ChRmine-expressing cells under microscope, and the whole-cell patch-clamp recordings were then carried out for the characterizations.

[0187] 3.2) Characterizations:

[0188] Firstly, photocurrent responses under multiple wavelengths were examined. Briefly, HEK-293T cells transfected with ChRmine-GFP (n=4) , M3-GFP (n=5) , PCC17-GFP (n=5) and CCR18-GFP (n=6) were examined for their respective light responsiveness by whole-cell patch-clamp recordings at a membrane potential of -60 mV. The results are shown in FIG. 7, where peak currents with a 1 s light pulse at intensity of 2 × 1016 photons / cm2s at different wavelength each of 435 nm, 470 nm, 500 nm, 550 nm, 580 nm and 635 nm respectively are compared among different ChRmine variants. As shown in the figure, compared with cells transfected with wildtype ChRmine, cells transfected with each of the three ChRmine variants exhibited generally larger peak currents upon the light stimulation across the visible spectrum (i.e. tested wavelengths from 435 nm to 635 nm) , indicating an improved photoexcitatory characteristics (i.e. light responsiveness) for all of these three variants compared with the wildtype ChRmine. Furthermore, among the three variants, the CCR18 variant showed generally the highest level of light responsiveness, followed by the PCC17 variant, which both performed better than the M3 variant. In particular, at wavelength of 550 nm (yellow-green) , which is approximately the wavelength of light the human eyes are most sensitive to under photopic (daylight) conditions, the CCR18 variant, the PCC17 variant, and the M3 variant showed a light-elicited current amplitude approximately 1.81-, 1.57-, 1.17-fold that generated by the wildtype ChRmine. Therefore, these three ChRmine variants demonstrate great potentials for future clinical applications.

[0189] Secondly, photocurrent responses under multiple light intensities were then examined. Briefly, HEK-293T cells transfected with ChRmine-GFP (n=7) , M3-GFP (n=6) , PCC17-GFP (n=7) and CCR18-GFP (n=7) were stimulated with 550 nm lights at different light intensities (6.0 × 1013, 2.0 × 1014, 6.0 × 1014, 6.0 × 1015, 6.0 × 1016, and 2.0 × 1017 photons / cm2s , as illustrated in FIG. 8A) with a 1 s light pulse. Whole-cell patch-clamp recordings were carried out at a membrane potential of -60 mV. The peak currents, plateau currents (the mean current of the last 100 ms) and plateau / peak ratios at 550 nm for different ChRmine variants were plotted in FIGS. 8B, 8C, and 8D respectively.

[0190] As shown in FIG. 8B, each of the M3, PCC17 and CCR18 variants exhibited stronger light-elicited peak currents, thereby higher photosensitivity, than the wildtype ChRmine at substantially all of the multiple light intensities, with the photosensitivity ranking of CCR18≥PCC17> M3>ChRmine at each light intensity, which is consistent with the above preliminary characterization results shown in FIG. 7. The differences are observed to be bigger at higher light intensities.

[0191] The "plateau current" is the average current amplitude during the last 100 ms of light stimulation, which can be used to evaluate the desensitization characteristics of ion channels under sustained light stimulation. A sustained current typically indicates no desensitization, whereas an inability to maintain the current typically indicates desensitization, i.e. the ion channel cannot sustain a response to continuous light stimulation. As shown in FIG. 8C, compared with the wildtype ChRmine, the CCR18 variant exhibited similar plateau currents at high light intensities (> 6.0 × 1015 photons / cm2s) and slightly higher plateau currents at low light intensities (<6.0 × 1015 photons / cm2s) , whereas both the M3 and PCC17 variants showed stronger plateau currents, with PCC17 notably displaying approximately 2-3 fold plateau currents than wildtype ChRmine across all tested light intensities. This result indicated that both M3 and PCC17 variants show improved desensitization characteristics compared with the wildtype ChRmine. As further shown in FIG. 8D, at the plateau current, the PCC17 and M3 variants are capable of maintaining the peak current amplitude to a greater extent, a result similarly also indicating a better desensitization characteristics of these two variants compared to the wildtype ChRmine.

[0192] Thirdly, the off-kinetics of the various ChRmine variants are examined. Briefly, HEK-293T cells transfected with ChRmine-GFP (n=6) , M3-GFP (n=5) , PCC17-GFP (n=6) and CCR18-GFP (n=6) were investigated by whole-cell patch-clamp recordings at a membrane potential of -60 mV. Upon illumination with a 10 ms light pulse of a wavelength of 550 nm at intensity of 6.0 × 1016 photons / cm2s, the peak currents and off rate values (as determined by the time frame for photocurrent to subside to 50%peak value) for each ChRmine variant were measured, and the relationship between the peak current and the off rate of each ion channel after light stimulation was recorded. Data from multiple light stimulations were used to obtain a fitted curve, where the slope k of the curve is used to characterize the kinetic features of the ion channel's light response. A larger k value typically indicates that the ion channel can rapidly respond to changes in light stimulation. As shown in FIG. 9E, compared to the wild type, all three ChRmine variants (M3, PCC17 and CCR18) exhibited a decreased off rate after light stimulation, with the decrease ranking of PCC17>CCR18>M3.

[0193] Fourthly, photocurrent responses under multiple optostimulations were examined. Briefly, HEK-293T cells transfected with ChRmine-GFP (n=5) , M3-GFP (n=4) , PCC17-GFP (n=6) and CCR18-GFP (n=6) were investigated by whole-cell patch-clamp recordings at a membrane potential of -60 mV. The variations of the return to baseline percentage at 6.0 ×1016 photons / cm2s at wavelength of 550 nm, under ten light pulses at different frequencies each of, 100 ms, 50 ms, 33 ms and 25 ms at 5 Hz, 10 Hz, 15 Hz and 20 Hz, respectively (illustrated in FIG. 10A) , were measured and plotted. Herein, the ratio of current amplitude to peak current is defined as "Return to Baseline percentage" or "Return to Baseline (%) " , which is used to characterize the response sensitivity of ion channels to light stimulation under specific frequency pulsed light. A higher Return to Baseline (%) indicates that the ion channel is more sensitive to light responses and can distinguish pulsed light stimulation. As shown in FIG. 10B, compared to wildtype ChRmine, the CCR18 variant exhibited better pulsed light response characteristics, whereas the M3 and PCC17 variants performed worse. This result indicates that the CCR18 variant displays an improved sensitivity to light responses and is capable of distinguishing pulsed light stimulation better than wildtype ChRmine.

[0194] Example 4

[0195] In this example, a series of fusion proteins were engineered such that the wildtype ChRmine (SEQ ID NO: 26) is fused with various functional segments (see Table 3) intended to improve the various characteristics of an engineered ChRmine, such as expression, protein stability, intracellular transport, trafficking, protein folding, membrane localization, etc., when such engineered ChRmine is introduced into target cells.

[0196] A total of four engineered ChRmine fusion proteins were generated, and their basic structures and sequences are listed below (see Table 6) . Each engineered ChRmine fusion protein, along with the wildtype ChRmine ( "WT" ) , is inserted into an expression vector in frame with C-terminal eGFP coding sequences and the resulting plasmid is used to transfect HEK-293T cells, and the Western blot was then performed to compare the expression levels among these different constructs.

[0197] Table 6. Engineered ChRmine fusion proteins.

[0198] Note: In each engineered ChRmine fusion protein, the segments are connected by "-" ; and from left to right, the various different segments are in a N-terminal to C-terminal direction.

[0199] As shown in FIG. 11, whereas the wildtype ChRmine showed no detectable expression in this expression system, all other engineered ChRmine fusion proteins showed expression, with M10 showing the highest expression level, followed by M8, M9, and M7. This result indicates that the engineered ChRmine fusion proteins M10, and M7-M9 as well, exhibits higher expression or protein stability than the wildtype ChRmine in vitro.

[0200] References:

[0201] Altschul SF, et al., Nucleic Acids Res. 1997 Sep 1; 25 (17) : 3389-402.

[0202] Altschul SF, et al., FEBS J. 2005 Oct; 272 (20) : 5101-9.

[0203] Basic Local Alignment Search Tool (https:  / / blast. ncbi. nlm. nih. gov)

[0204] Chen M, et al. Aging Cell. 2015 Aug; 14 (4) : 635-43.

[0205] Conway, J E et al., (1997) Virology 71 (11) : 8780-8789

[0206] Needleman SB and Wunsch CD, J Mol Biol. 1970 Mar; 48 (3) : 443-53.

[0207] Smith TF and Waterman MS, J Mol Biol. 1981 Mar 25; 147 (1) : 195-7.

[0208] Xu D, et al. Neural Regeneration Research 18 (5) : p1124-1131, May 2023.

[0209] SEQUENCE LISTING

[0210] ChRmine (wt) -8H87, Amino Acid Sequence, SEQ ID NO: 1

[0211] ChRmine (wt) -8H87, Nucleotide Sequence, SEQ ID NO: 2

[0212] ChRmine (L228A / I232A) -8H87 ( "M1" ) , Amino Acid Sequence, SEQ ID NO: 3

[0213] ChRmine (L228A / I232A) -8H87 ( "M1" ) , Nucleotide Sequence, SEQ ID NO: 4

[0214] HA-ChRmine (L228A / I232A) -8H87 ( "M1-A" ) , Amino Acid Sequence, SEQ ID NO: 5

[0215] HA-ChRmine (L228A / I232A) -8H87 ( "M1-A" ) , Nucleotide Sequence, SEQ ID NO: 6

[0216] ChRmine (Y125G) -8H87 ( "M2" ) , Amino Acid Sequence, SEQ ID NO: 7

[0217] ChRmine (Y125G) -8H87 ( "M2" ) , Nucleotide Sequence, SEQ ID NO: 8

[0218] HA-BRIL-ChRmine (Y125G) -8H87-Kv2.1-Golgi-4BEY ( "M2-A" ) , Amino Acid Sequence, SEQ ID NO: 9

[0219] HA-BRIL-ChRmine (Y125G) -8H87-Kv2.1-Golgi-4BEY ( "M2-A" ) , Nucleotide Sequence, SEQ ID NO: 10

[0220] ChRmine (L118A) -8H87 ( "M3" ) , Amino Acid Sequence, SEQ ID NO: 11

[0221] ChRmine (L118A) -8H87 ( "M3" ) , Nucleotide Sequence, SEQ ID NO: 12

[0222] HA-BRIL-ChRmine (L118A) -8H87-Kv2.1-Golgi-4BEY ( "M3-A" ) , Amino Acid Sequence, SEQ ID NO: 13

[0223] HA-BRIL-ChRmine (L118A) -8H87-Kv2.1-Golgi-4BEY ( "M3-A" ) , Nucleotide Sequence, SEQ ID NO: 14

[0224] ChRmine (M122A) -8H87 ( "M4" ) , Amino Acid Sequence, SEQ ID NO: 15

[0225] ChRmine (M122A) -8H87 ( "M4" ) , Nucleotide Sequence, SEQ ID NO: 16

[0226] HA-ChRmine (M122A) -8H87 ( "M4-A" ) , Amino Acid Sequence, SEQ ID NO: 17

[0227] HA-ChRmine (M122A) -8H87 ( "M4-A" ) , Nucleotide Sequence, SEQ ID NO: 18

[0228] hemagglutinin signal sequence ( "HA" ) , Amino Acid Sequence, SEQ ID NO: 19

[0229] bacterial rhodopsin-like insertion loop ( "BRIL" ) , Amino Acid Sequence, SEQ ID NO: 20

[0230] Kv2.1 channel protein localization sequence ( "Kv2.1" ) , Amino Acid Sequence, SEQ ID NO: 21

[0231] Golgi export signal ( "Golgi" ) , Amino Acid Sequence, SEQ ID NO: 22

[0232] rhodopsin trafficking sequence ( "4BEY" ) , Amino Acid Sequence, SEQ ID NO: 23

[0233] potassium-selective channelrhodopsin HcKCR2 localization sequence ( "8H87" ) , Amino Acid Sequence, SEQ ID NO: 24

[0234] Chain R, Endothelin-1 receptor, Oplophorus-luciferin 2-mono-oxygenase catalytic subunit chimera sequence ( "8HCQ" ) , Amino Acid Sequence, SEQ ID NO: 25

[0235] ChRmine (wildtype) , Amino Acid Sequence, SEQ ID NO: 26

[0236] ChRmine (L118A / L225A / V251A / L305I / L308I) -8H87 ( "PCC17" ) , Amino Acid Sequence, SEQ ID NO: 27

[0237] ChRmine (A4V / L123I / L294I / L308I) -8H87 ( "CCR18" ) , Amino Acid Sequence, SEQ ID NO: 28

[0238] 8HCQ-ChRmine (wt) -8H87 ( "M7" ) , Amino Acid Sequence, SEQ ID NO: 29

[0239] 8HCQ-ChRmine (wt) -8H87-Kv2.1-Golgi-4BEY ( "M8" ) , Amino Acid Sequence, SEQ ID NO: 30

[0240] HA-BRIL-ChRmine (wt) -8H87 ( "M9" ) , Amino Acid Sequence, SEQ ID NO: 31

[0241] HA-BRIL-ChRmine (wt) -8H87-Kv2.1-Golgi-4BEY ( "M10" ) , Amino Acid Sequence, SEQ ID NO:32

[0242] ChRmine (A2V / Y260F / L294I / L305I) -8H87 ( "CCR19" ) , Amino Acid Sequence, SEQ ID NO: 33

[0243] ChRmine (V13A / L21I / T119A / L292I / L298I) -8H87 ( "CCR20" ) , Amino Acid Sequence, SEQ ID NO:34

[0244] ChRmine (A4V / H33R / L123I / L147I / L308I) -8H87 ( "CCR21" ) , Amino Acid Sequence, SEQ ID NO:35

[0245] ChRmine (Q9N / D126N / I146M / Q290N / L298I) -8H87 ( "CCR22" ) , Amino Acid Sequence, SEQ ID NO: 36

[0246] ChRmine (L118A / M221A / L225A / V251A) -8H87 ( "PCC11" ) , Amino Acid Sequence, SEQ ID NO:37

[0247] ChRmine (L118A / M221A / L225A / V251A / R266A) -8H87 ( "PCC12" ) , Amino Acid Sequence, SEQ ID NO: 38

[0248] ChRmine (L118A / M221A / L225A / V251A / R266K) -8H87 ( "PCC13" ) , Amino Acid Sequence, SEQ ID NO: 39

[0249] ChRmine (L118A / L123I / V251A / L294I / L308I) -8H87 ( "PCC14" ) , Amino Acid Sequence, SEQ ID NO: 40

[0250] ChRmine (L21I / L118A / T119A / L225A / V251A) -8H87 ( "PCC15" ) , Amino Acid Sequence, SEQ ID NO: 41

[0251] ChRmine (M221A / L225A / L228A / I232A / V251A / R266K) -8H87 ( "PCC16" ) , Amino Acid Sequence, SEQ ID NO: 42

[0252] ChRmine (M221A / L225A / V251A / R266A) -8H87 ( "PCC18" ) , Amino Acid Sequence, SEQ ID NO:43

[0253] ChRmine (M221A / L225A / V251A / R266K) -8H87 ( "PCC19" ) , Amino Acid Sequence, SEQ ID NO:44

[0254] ChRmine (L118A / D126N / L147I / L225A / V251A / R266K) -8H87 ( "PCC20" ) , Amino Acid Sequence, SEQ ID NO: 45

[0255] T2A amino acid sequence, SEQ ID NO: 46

[0256] eGFP amino acid sequence, SEQ ID NO: 47

[0257] ChRmine (L228A / I232A) , Amino Acid Sequence, SEQ ID NO: 48

[0258] ChRmine (Y125G) , Amino Acid Sequence, SEQ ID NO: 49

[0259] ChRmine (L118A) , Amino Acid Sequence, SEQ ID NO: 50

[0260] ChRmine (M122A) , Amino Acid Sequence, SEQ ID NO: 51

[0261] ChRmine (L118A / L225A / V251A / L305I / L308I) , Amino Acid Sequence, SEQ ID NO: 52

[0262] ChRmine (A4V / L123I / L294I / L308I) , Amino Acid Sequence, SEQ ID NO: 53

[0263] ChRmine (A2V / Y260F / L294I / L305I) , Amino Acid Sequence, SEQ ID NO: 54

[0264] ChRmine (V13A / L21I / T119A / L292I / L298I) , Amino Acid Sequence, SEQ ID NO: 55

[0265] ChRmine (A4V / H33R / L123I / L147I / L308I) , Amino Acid Sequence, SEQ ID NO: 56

[0266] ChRmine (Q9N / D126N / I146M / Q290N / L298I) , Amino Acid Sequence, SEQ ID NO: 57

[0267] ChRmine (L118A / M221A / L225A / V251A) , Amino Acid Sequence, SEQ ID NO: 58

[0268] ChRmine (L118A / M221A / L225A / V251A / R266A) , Amino Acid Sequence, SEQ ID NO: 59

[0269] ChRmine (L118A / M221A / L225A / V251A / R266K) , Amino Acid Sequence, SEQ ID NO: 60

[0270] ChRmine (L118A / L123I / V251A / L294I / L308I) , Amino Acid Sequence, SEQ ID NO: 61

[0271] ChRmine (L21I / L118A / T119A / L225A / V251A) , Amino Acid Sequence, SEQ ID NO: 62

[0272] ChRmine (M221A / L225A / L228A / I232A / V251A / R266K) , Amino Acid Sequence, SEQ ID NO: 63

[0273] ChRmine (M221A / L225A / V251A / R266A) , Amino Acid Sequence, SEQ ID NO: 64

[0274] ChRmine (M221A / L225A / V251A / R266K) , Amino Acid Sequence, SEQ ID NO: 65

[0275] ChRmine (L118A / D126N / L147I / L225A / V251A / R266K) , Amino Acid Sequence, SEQ ID NO: 66

Claims

1.A sequence variant of the photosensitive ion channel protein ChRmine, comprising an amino acid sequence that is at least 80%identical to the sequence of a wildtype ChRmine whose amino acid sequence is set forth in SEQ ID NO: 26, and further comprising at least one amino acid substitution, each at a position corresponding to position A2, A4, V13, L21, L118, M122, L123, Y125, M221, L225, L228, I232, V251, R266, L292, L294, L298, L305, or L308 of SEQ ID NO: 26, wherein optionally, each of the at least one amino acid substitution is selected from A2V, A4V, V13A, L21I, L118A, M122A, L123I, Y125G, M221A, L225A, L228A, I232A, V251A, R266K, R266A, L292I, L294I, L298I, L305I, or L308I.2.The sequence variant of claim 1, wherein the at least one amino acid substitution further comprises a substitution at one or more of the positions corresponding to positions T119 and Y260 of SEQ ID NO: 26.3.The sequence variant of claim 1, wherein an amino acid substitution at any of the positions corresponding to positions Q9, H33, D126, I146, L147, and Q290 of SEQ ID NO: 26 is absent.4.The sequence variant of claim 1 or claim 2, wherein the at least one amino acid substitution comprises a substitution at a position corresponding to any one of positions L118 or Y125 of SEQ ID NO: 26, wherein optionally the substitution is L118A or Y125G, wherein further optionally, the sequence variant comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 49 or SEQ ID NO: 50.5.The sequence variant of claim 1 or claim 2, wherein the at least one amino acid substitution comprises two substitutions, respectively at two positions corresponding to positions L228 and I232 of SEQ ID NO: 26, wherein optionally the two substitutions consist of L228A and I232A, wherein further optionally, the sequence variant comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 48.6.The sequence variant of claim 1 or claim 2, wherein the number of the at least one amino acid substitution is at least two.7.The sequence variant of claim 6, wherein the number of the at least one amino acid substitution is at least four, wherein optionally, the sequence variant comprises one of the following combination of substitutions: L118A / L225A / V251A / L305I / L308I; A4V / L123I / L294I / L308I; A2V / Y260F / L294I / L305I; V13A / L21I / T119A / L292I / L298I; L118A / M221A / L225A / V251A; L118A / M221A / L225A / V251A / R266A; L118A / M221A / L225A / V251A / R266K; L118A / L123I / V251A / L294I / L308I; L21I / L118A / T119A / L225A / V251A; M221A / L225A / L228A / I232A / V251A / R266K; M221A / L225A / V251A / R266A; or M221A / L225A / V251A / R266K; wherein further optionally the sequence variant comprises an amino acid sequence of any one of SEQ ID NOS: 52-55 and 58-65.8.The sequence variant of claim 1, wherein the sequence variant comprises L118A, wherein optionally the sequence variant comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 50.9.The sequence variant of claim 1, wherein the sequence variant comprises L118A / L225A / V251A / L305I / L308I, wherein optionally the sequence variant comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 52.10.The sequence variant of claim 1, wherein the sequence variant comprises A4V / L123I / L294I / L308I, wherein optionally the sequence variant comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 53.11.The sequence variant of claim 1 or 2, wherein when a fusion protein that comprises the sequence variant fused with an 8H87 segment having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 24 at a C-terminus thereof and a reference fusion protein that comprises the wildtype ChRmine fused also with the 8H87 segment at a C-terminus thereof are respectively expressed in HEK-293T cells, the fusion protein is capable, upon excitation by a 550 nm-light with a light intensity between 1.0×1014 and 1.0×1017 photons / cm2s, of providing at least 20%higher peak current than the reference fusion protein as measured by whole-cell patch-clamp at a membrane potential of -60 mV, wherein optionally the sequence variant comprises one of the following combination of substitutions: L228A / I232A; Y125G; L118A; L118A / L225A / V251A / L305I / L308I; A4V / L123I / L294I / L308I; A2V / Y260F / L294I / L305I; V13A / L21I / T119A / L292I / L298I; L118A / M221A / L225A / V251A; L118A / M221A / L225A / V251A / R266A; L118A / M221A / L225A / V251A / R266K; L118A / L123I / V251A / L294I / L308I; L21I / L118A / T119A / L225A / V251A; M221A / L225A / L228A / I232A / V251A / R266K; M221A / L225A / V251A / R266A; or M221A / L225A / V251A / R266K; wherein further optionally the sequence variant comprises an amino acid sequence of any one of SEQ ID NOS: 48-50, 52-55, and 58-65.12.The sequence variant of claim 1 or 2, wherein when a fusion protein that comprises the sequence variant fused with an 8H87 segment having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 24 at a C-terminus thereof and a reference fusion protein that comprises the wildtype ChRmine fused also with the 8H87 segment at a C-terminus thereof are respectively expressed in HEK-293T cells, the fusion protein is capable, upon excitation by a 550 nm-light with a light intensity between 1.0 × 1014 and 1.0 × 1017 photons / cm2s, of providing at least 20%higher plateau current than the reference fusion protein as measured by whole-cell patch-clamp at a membrane potential of -60 mV.13.The sequence variant of claim 1 or 2, wherein when a fusion protein that comprises the sequence variant fused with an 8H87 segment having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 24 at a C-terminus thereof and a reference fusion protein that comprises the wildtype ChRmine fused also with the 8H87 segment at a C-terminus thereof are respectively expressed in HEK-293T cells, the fusion protein is capable, upon illumination by a 550 nm-light with a pulse rate between 10 Hz and 20 Hz, of exhibiting at least 20%higher Return to Baseline percentage than the reference fusion protein as measured by whole-cell patch-clamp at a membrane potential of -60 mV.14.An engineered ChRmine protein, comprising the sequence variant of the photosensitive ion channel protein ChRmine according to any one of claims 1-13.15.The engineered ChRmine protein of claim 14, further comprising an 8H87 segment having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 24 at a C-terminus of the sequence variant, wherein optionally, the engineered ChRmine protein comprises an amino acid sequence of any one of SEQ ID NOS: 3, 7, 11, 27-28, 33-34, and 37-44.16.The engineered ChRmine protein of claim 15, further comprising at least one other segment, each selected from:an HA segment having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 19;a BRIL segment having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 20;a Kv2.1 segment having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 21;a Golgi segment having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 22;a 4BEY segment having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 23; oran 8HCQ segment having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 25.17.The engineered ChRmine protein of claim 16, wherein:each of the HA segment, the BRIL segment, and the 8HCQ segment is over the N-terminus of the sequence variant; andeach of the Kv2.1 segment, the Golgi segment, and the 4BEY segment is over the C-terminus of the 8H87 segment.18.The engineered ChRmine protein of claim 17, wherein the engineered ChRmine protein comprises an amino acid sequence of any one of SEQ ID NOS: 5, 9, and 13.19.An engineered ChRmine protein, comprising a wildtype ChRmine whose amino acid sequence is set forth in SEQ ID NO: 26, or a functional variant thereof having an amino acid sequence that is at least 80%identical to the wildtype ChRmine, and further comprising an 8H87 segment having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 24 at a C-terminus of the wildtype ChRmine or the functional variant thereof, wherein the engineered ChRmine protein further comprises at least one other segment, each selected from:an HA segment having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 19;a BRIL segment having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 20;a Kv2.1 segment having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 21;a Golgi segment having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 22;a 4BEY segment having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 23; oran 8HCQ segment having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 25.20.The engineered ChRmine protein of claim 19, wherein:each of the HA segment, the BRIL segment, and the 8HCQ segment is over the N-terminus of the sequence variant; andeach of the Kv2.1 segment, the Golgi segment, and the 4BEY segment is over the C-terminus of the 8H87 segment.21.The engineered ChRmine protein of claim 19, wherein the engineered ChRmine protein comprises an amino acid sequence of any one of SEQ ID NOS: 29-32.22.The engineered ChRmine protein of claim 19, wherein when expressed in HEK-293T cells, the engineered ChRmine protein is capable of obtaining a significantly higher expression than a reference ChRmine protein having an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1.23.An isolated nucleic acid, comprising a nucleotide sequence that encodes:a sequence variant of ChRmine according to any one of claims 1-13; oran engineered ChRmine protein according to any one of claims 14-22.24.A vector, comprising an isolated nucleic acid according to claim 23.25.The vector of claim 24, wherein the vector is based on a viral vector, wherein optionally, the viral vector is an adenoviral vector, an adeno-associated viral (AAV) vector, a lentiviral vector, or a retroviral vector.26.The vector of claim 25, wherein the viral vector is an AAV vector, having a serotype selected from AAV1, AAV2, AAV2-7m8, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAVrh74, or AAVdj.27.The vector of claim 24, wherein the vector is based on a non-viral vector, selected from a plasmid, a liposome, a polymer-based nanoparticle, or an mRNA vector.28.A viral particle, comprising or derived from a vector according to any one of claims 24-26.29.A cell, comprising an isolated nucleic acid according to claim 23, a vector according to any one of claims 24-27, or a viral particle according to claim 28.30.A pharmaceutical composition, comprising:an isolated nucleic acid according to claim 23, a vector according to any one of claims 24-27, a viral particle according to claim 28, or a cell according to claim 29; anda pharmaceutically acceptable excipient.31.Use of a therapeutic agent in preparation of a medicament for the treatment of an ocular disease, wherein the therapeutic agent comprises at least one of: an isolated nucleic acid according to claim 23, a vector according to any one of claims 24-27, a viral particle according to claim 28, a cell according to claim 29, or a pharmaceutical composition according to claim 30.32.The use of claim 31, wherein the ocular disease is characterized as a retinal neurodegenerative disease.33.The use of claim 31, wherein the isolated nucleic acid comprises a nucleotide sequence encoding a sequence variant of ChRmine, wherein the sequence variant comprises an amino acid sequence of any one of SEQ ID NOS: 48-50, 52-55, and 58-65, and wherein preferably the sequence variant comprises an amino acid sequence of any one of SEQ ID NOS: 50, 52, and 53.34.The use of claim 31, wherein the isolated nucleic acid comprises a nucleotide sequence encoding an engineered ChRmine protein, wherein the engineered ChRmine protein comprises an amino acid sequence of any one of SEQ ID NOS: 29-32, and wherein preferably the engineered ChRmine protein comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 32.35.A method for treating an ocular disease in a subject in need thereof, comprising a step of:introducing a therapeutic agent into eyes of the subject, wherein the therapeutic agent comprises at least one of: an isolated nucleic acid according to claim 23, a vector according to any one of claims 24-27, a viral particle according to claim 28, a cell according to claim 29, or a pharmaceutical composition according to claim 30.36.The method of claim 35, wherein the isolated nucleic acid comprises a nucleotide sequence encoding a sequence variant of ChRmine, wherein the sequence variant comprises an amino acid sequence of any one of SEQ ID NOS: 48-50, 52-55, and 58-65, and wherein preferably the sequence variant comprises an amino acid sequence of any one of SEQ ID NOS: 50, 52, and 53.37.The method of claim 35, wherein the isolated nucleic acid comprises a nucleotide sequence encoding an engineered ChRmine protein, wherein the engineered ChRmine protein comprises an amino acid sequence of any one of SEQ ID NOS: 29-32, and wherein preferably the engineered ChRmine protein comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO:32.

Images