Small molecule ice recrystallization inhibitors and methods of use thereof

Abstract

The present application provides ice recrystallization inhibitors, and methods of synthesis and use thereof. The ice recrystallization inhibitor (IRI) compounds have the structure of Formula (A) where B is an alkyl, or substituted or unsubstituted phenyl. The IRI compounds exhibit good IRI activity and are soluble in water and in buffers, such as those used in cryopreservation.

Description

SMALL MOLECULE ICE RECRYSTALLIZATION INHIBITORS AND   METHODS OF USE THEREOF  FIELD OF THE INVENTION

[0001] The present application pertains to the field of cryopreservation and sub‐zero  storage of biological material.  More particularly, the present application relates to small  molecule ice recrystallization inhibitors, and methods of manufacture and uses thereof in  cryopreservation and sub‐zero storage.  BACKGROUND

[0002] Cryopreservation remains the most common method for the long‐term storage of  cells and can also be used for long‐term storage of tissue. However, commonly during  cryopreservation a significant number of cells experience irreparable damage due to the  growth of ice, ultimately resulting in decreased post‐thaw recoveries or impaired function.  As cell‐based therapeutics continue to define new models of care, for example, in stem cell  therapy, regenerative medicine and transfusion, it is becoming increasingly important to  ensure the highest level of post‐thaw cell viability and functionality.

[0003] Currently, cryopreservation solutions include cryoprotective agents (CPAs), such as  glycerol, dimethyl sulfoxide (DMSO) and hydroxyethyl starch (HES), which are used to  mitigate cell damage during cyropreservation. However, cryopreservation solutions can  include these CPAs at concentrations that can be toxic and damage the cells that they are  meant to preserve.

[0004] Apart from the cytotoxicity of currently used CPAs, a significant short fall of most  current cryopreservation solutions and protocols is their failure to control ice  recrystallization. These CPAs do not protect against cell damage that ice crystals can cause  when samples are inappropriately stored or undergo unwanted transient warming during  handling, storage, and shipment. Much of the cellular damage that occurs during  cryopreservation results from uncontrolled growth of ice crystals during cooling and / or  during warming and thawing following storage. This process is known as ice recrystallization   1  LEGAL_1:87555556.1   and ultimately results in decreased post‐thaw viability and functional capacity of the cells  and tissues that have been cryopreserved. Ice recrystallization is a form of ice crystal re‐ modeling that occurs during freezing, maintenance at sub‐zero temperatures and during  warming from sub‐zero temperatures and which results in the growth of large ice crystals at  the expense of small ice crystals. Ice recrystallization is a significant factor contributing to  cell death from or during sub‐zero storage of cells, tissues and organs. This is evidenced by  the membrane damage observed following cryopreservation of cells.

[0005] Stem cell and regenerative therapy using cryopreserved cells has been hampered by  decreased cell function and viability after thawing. Consequently, improved  cryopreservation protocols that increase the yield of viable and functional cells are urgently  required. Improved cryopreservation compositions and methods have the potential to  revolutionize cell and gene therapies.

[0006] Freeze‐tolerant organisms have developed mechanisms to avoid the problems  associated with ice recrystallization by producing large quantities of biological antifreeze  proteins and glycoproteins that function, at least in part, as ice recrystallization inhibitors  (IRIs) in vivo. Unfortunately, biological antifreeze proteins and glycoproteins are typically not  suitable for use as cryoprotectants in cryopreservation solutions because of their ice binding  activity and / or dynamic ice shaping, which can exacerbate cellular damage. In addition, use  of biological antifreeze proteins and glycoproteins is limited due to their poor solubility and  the cost associated with isolation or manufacture.

[0007] Various polymers have been explored as an alternative to DMSO and glycerol, but  thus far have failed to provide the high cell viabilities observed with DMSO or glycerol.  Similarly, various sugars (mono‐ di‐ and oligosaccharides) have also been investigated as  cryoprotectants. However, the structure of the carbohydrate, the freezing protocol, cell  type and reported cell viabilities vary dramatically between studies making it difficult to  ascertain the true ability of these compounds to protect cells against cryo‐injury. More  recently studies have pursued other small molecules that can function as IRIs. Following  such studies, a particularly efficient ice recrystallization inhibitor, referred to as 2FA  (depicted below), was identified to be useful in formulations for cryopreservation in cell and  gene therapy applications.   2  LEGAL_1:87555556.1

[0008] However, a need remains for alternative small molecule IRIs, and for small molecule  IRIs that exhibit improved characteristics, for example improved solubility, while retaining  the ability to control and / or reduce ice recrystallization.

[0009] The above information is provided for the purpose of making known information  believed by the applicant to be of possible relevance to the present invention.  No  admission is necessarily intended, nor should be construed, that any of the preceding  information constitutes prior art against the present invention.  SUMMARY OF THE INVENTION

[0010] An object of the present application is to provides ice recrystallization inhibitors, and  methods of synthesis and use thereof.  In accordance with an aspect of the present  application, there is provided an ice recrystallization inhibitor (IRI) compound of Formula A     A  where:  B is phenyl; phenyl mono‐ or di‐substituted with C1‐C4‐alkyl, C1‐C4‐alkoxy, ‐NH2, ‐ NR5H, ‐N(R6)2 where each R6 is the same or different, ‐C(O)R7, ‐ COOH, ‐COOR8, ‐CHO  or halogen (e.g., Cl, Br, I or F); or an alkyl;  Ra is H when B is phenyl or substituted phenyl, and H or alkyl (e.g., a C1‐ C4 alkyl)  when B is alkyl;   3  LEGAL_1:87555556.1   R1, R2, R3 and each R4 are each independently H, ‐OH, ‐OR9, ‐NHR10, ‐[NH2R11]+, or ‐ [NH(R12)2]+ where each R12 is the same or different, wherein at least one of the R1,  R2, R3 and R4 substituents is not OH;   n is an integer from 1 to 7, wherein when n is greater than 1 each R4 is the same or  different; and   each R5 – R12 is independently H, alkyl or aryl.

[0011] In some embodiments, the IRI compound is a compound of Formula I   I  wherein:  each R is independently hydrogen, C1‐C4‐alkyl, C1‐C4‐alkoxy, ‐NH2, ‐NR5H, ‐N(R6)2  where each R6 is the same or different, ‐C(O)R7, ‐ COOH, ‐COOR8, ‐CHO or halogen  (e.g., Cl, Br, I or F);   R1, R2, R3 and each R4 are each independently H, ‐OH, ‐OR9, ‐NHR10, ‐[NH2R11]+, or ‐ [NH(R12)2]+ where each R12 is the same or different, wherein at least one of the R1,  R2, R3 and R4 substituents is not OH;  n is an integer from 1 to 7; and   each R5 – R12 is independently H, alkyl or aryl.

[0012] In some embodiments, the compound of Formula I has the structure of:   .

[0013] ,               I’                 I”      .     4  LEGAL_1:87555556.1   In some examples of this embodiment, R3 is H.

[0014] In accordance with other embodiments, the IRI compound is a compound of Formula  II   wherein:  Alk is a C3 – C9 linear or branched alkyl or a C3 – C10 mono‐ or poly‐cyclic alkyl.

[0015] In some examples of this embodiment, Alk is a straight chain C1 to C9 alkyl.  Alternatively, Alk is a C3 to C9 branched alkyl (e.g., t‐butyl) or a C3‐C10 cycloalkyl, which is  optionally a C3 to C8 monocyclic alkyl or adamantyl.

[0016] In accordance with some embodiments, the IRI compound is a compound of Formula  IIa     IIa  where:  R1, R2, R3 and each R4 are each independently H, ‐OH, ‐OR9, ‐NHR10, ‐[NH2R11]+, or ‐ [NH(R12)2]+ where each R12 is the same or different, wherein at least one of the R1,  R2, R3 and R4 substituents is not OH;  Ra is H or alkyl (e.g., a C1‐C4 alkyl);   n is an integer from 1 to 7;   p is an integer from 1 to 7, or from 5 to 7, or p is 6; and   each R9 – R12 is independently H, alkyl or aryl.

[0017] In accordance with another aspect of the present application, there is provided a  composition, for example, a cryopreservation composition, wherein the composition   5  LEGAL_1:87555556.1   comprises an IRI compound as described herein and a solvent (e.g., water) or a buffer.  Optionally, the composition further comprises a cryopreservation agent, such as, but not  limited to DMSO, lactobionate, glycerol, polyvinylalcohol, hydroxyethyl starch (HES),  ethylene glycol (EG), propylene glycol (PG), trehalose, mannitol, or a combination of two or  more thereof. In addition, or in the alternative, the composition further comprises, a  biological material. The biological material can be from, for example, a human, an animal, a  plant, a fungus or a microorganism. In some non‐limiting embodiments, the biological  material is an organ, a tissue, cells or platelets, or a combination thereof. The cells can  comprise, for example, stem cells, T cells (including, for example, CAR‐T cells), peripheral  blood mononuclear cells (PMBCs), neurons, progenitor cells, liver cells, red blood cells,  immune cells (including, for example, natural killer (NK) cells), endothelial cells, pancreatic  islet cells, dendritic cells, fibroblasts or cells from a cell line, preferably the cells comprise  stem cells, T cells (including, for example, CAR‐T cells), red blood cells, progenitor cells, or  liver cells. In some examples in which the composition is for use with cells or comprises  cells, the composition additionally comprises a cell culture medium (e.g., phosphate  buffered saline optionally comprising albumin, Eagle's minimum essential medium,  Dulbecco's modified Eagle's medium, RPMI, fetal bovine serum, fetal calf serum, Ham's F‐10,  Ham's F‐12, Medium 199, Hank's Buffered Salt Solution, Hank's Buffered Salt Solution and  dextrose, or a combination thereof).

[0018] In accordance with another aspect of the present application, there is provided a  method for cryopreserving a biological material (such as defined above) comprising:  a) combining (e.g., suspending, permeating, perfusing, immersing or infusing) the  biological material with a solution comprising at least one IRI compound as defined  herein;   b) cooling the combination formed in step a) to a storage temperature at or below the  freezing point of the solution; and  c) storing the combination at the storage temperature.

[0019] In some embodiments of the above method, cooling comprises performing a rate‐ controlled cooling of about 1°C per minute over about 16 hours.   6  LEGAL_1:87555556.1

[0020] In accordance with another aspect of the present application, there is provided a use  an IRI compound as defined herein to:   a. reduce toxicity during cryopreservation in comparison to cryopreservation in  the absence of the IRI compound as defined herein;  b. improve viability and / or functionality of biological material following  cryopreservation in comparison to cryopreservation in the absence of the IRI  compound as defined herein;   c. improve stability of biological material during temperature cycling in  cryopreservation in comparison to temperature cycling in cryopreservation in  the absence of the IRI compound as defined herein; and / or  d. facilitate cryopreservation at a warmer temperature in comparison to  cryopreservation in the absence of the IRI compound as defined herein.

[0021] In accordance with another aspect of the present application, there is provided a  method for synthesizing a compound of   XII  wherein:  B is phenyl; phenyl mono‐ or di‐substituted with C1‐C4‐alkyl, C1‐C4‐alkoxy, ‐NH2, ‐ NR5H, ‐N(R6)2 where each R6 is the same or different, ‐C(O)R7, ‐ COOH, ‐COOR8, ‐CHO  or halogen (e.g., Cl, Br, I or F); or an alkyl;  R1, R2, R3 and each R4 are each independently H, ‐OH, ‐OR9, ‐NHR10, ‐[NH2R11]+ or ‐ [NH(R12)2]+ where each R12 is the same or different, wherein the terminal R4 is OH;  m is an integer from 1 to 6; and   each R5 – R12 is independently H, alkyl or aryl,  said method comprising:   7  LEGAL_1:87555556.1   (a) providing a lactone of Formula VIII     [NH2R11]+,  ‐[NH(R12)2]+ where each R12 is the same or different, a protected alcohol, or a  protected amine, wherein the terminal R4a is OH;  (b) ring opening the compound of Formula VIII with an aryl or alkyl amine of  Formula VII   VII;   and  (c) optionally, deprotecting the product of step (b).

[0022] In accordance with some embodiments, there is provided a method for synthesizing  a compound of Formula IIIa     XIIa  wherein:  each R is independently hydrogen, C1‐C4‐alkyl, C1‐C4‐alkoxy, ‐NH2, ‐NR5H, ‐N(R6)2  where each R6 is the same or different, ‐C(O)R7, ‐ COOH, ‐COOR8, ‐CHO, haloalkyl or  halogen (e.g., Cl, Br, I or F);   R1, R2, R3 and each R4 are each independently H, ‐OH, ‐OR9, ‐NHR10, ‐[NH2R11]+ or ‐ [NH(R12)2]+ where each R12 is the same or different, wherein the terminal R4 is OH;  m is an integer from 1 to 6; and   each R5 – R12 is independently H, alkyl or aryl,   8  LEGAL_1:87555556.1   said method comprising:  (a) providing a lactone of Formula VIII       [NH2R11]+,  ‐[NH(R12)2]+ where each R12 is the same or different, a protected alcohol, or a  protected amine, wherein the terminal R4a is OH;  (b) ring opening the compound of Formula VIII with an aryl amine of Formula  VIIa          VIIa    ; and  (c) optionally, deprotecting the product of step (b).

[0023] In other embodiments, the synthetic method is for synthesizing a compound of  formula IIIb:   XIIb  wherein:  Alk is a C3 – C9 linear or branched alkyl or a C3 – C10 mono‐ or poly‐cyclic alkyl; and   wherein the compound Formula VII is an alkyl amine having the structure of Formula VIIb:    VIIb.

[0024] In some embodiments of the synthetic method, in which the compound of Formula  III includes R3 is H, prior to step (a), a compound of Formula VIII, in which R3a is H, is first  produced by steps comprising:   9  LEGAL_1:87555556.1   i. providing a protected O‐allyl pyranose of Formula IX      ; ii. derivative of Formula X      wherein Rb is H, CH3, SCH3, OCH3, phenyl (Ph), OPh or imidazolyl, preferably  imidazolyl;  iii. treating the thiocarbonyl derivative of Formula X with a radical reducing agent to  produce a C4‐deoxy pyranose derivative of Formula XI       iv. converting the C1 allyl group in the compound of Formula XI to a C1 hydroxyl  group; and  v. oxidizing the C1 hydroxyl group to form the lactone of Formula VIII.

[0025] In accordance with another aspect of the present application, there is provided a  method for manufacture of a compound of Formula I, I as defined above, wherein n is 2, R3  is H and R4 is OH, comprising the steps of:  (i) converting a protected D‐pyranose of Formula III to a benzylidene  acetal   10  LEGAL_1:87555556.1      where each R″ is independently H or OH and O‐R′′′ is a hydroxyl protecting  group, such as methoxy or silyl ether (e.g., a bulky silyl ether);  (ii) when one or both of the R″ groups are OH, protecting the OH group  or groups, and subsequently performing a selective ring opening of  the benzylidene acetal to form a C4 acceptor compound of Formula IV     wherein each R” is independently H or OPr1, where Pr1 is a hydroxyl  protecting group (such as, but not limited to, a benzyl group);  (iii) converting the C4 hydroxyl group of the compound of Formula IV into  a triflate and displacing the triflate to produce a C4 deoxy pyranose  derivative of Formula V     V      ;  (iv) deprotecting the anomeric protected group and oxidizing the  resultant hydroxyl to produce the lactone of Formula VI   11  LEGAL_1:87555556.1       ; and (v) ring opening the lactone of Formula VI with an aryl amine of Formula  VIIa   VIIa  wherein each R is independently hydrogen, C1‐C4‐alkyl, C1‐C4‐alkoxy, ‐NH2, ‐ NR5H, ‐N(R6)2 where each R6 is the same or different, ‐C(O)R7, ‐ COOH, ‐ COOR8, ‐CHO or halogen (e.g., Cl, Br, I or F), and removing the hydroxyl  protecting group(s) to form the compound of Formula I as defined above,  wherein n is 2, R3 is H and R4 is OH.  BRIEF DESCRIPTION OF TABLES AND FIGURES

[0026] For a better understanding of the application as described herein, as well as other  aspects and further features thereof, reference is made to the following description which is  to be used in conjunction with the accompanying drawings, where:

[0027] Figure 1 depicts dose response curves generated for the known IRI, 2FA, and for C4  Deoxy 2FA, an example of an IRI compound of the present application, after analysis of  crystal size using a splat cooling assay.  DETAILED DESCRIPTION

[0028] Definitions

[0029] Unless defined otherwise, all technical and scientific terms used herein have the  same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which this  invention belongs.    12  LEGAL_1:87555556.1

[0030] As used in the specification and claims, the singular forms “a”, “an” and “the”  include plural references unless the context clearly dictates otherwise.

[0031] The term “comprising”, as used herein, will be understood to mean that the list  following is non‐exhaustive and may or may not include any other additional suitable items,  for example one or more further feature(s), component(s) and / or ingredient(s) as  appropriate.

[0032] Reference throughout this specification to “one embodiment,” “an embodiment,”  “another embodiment,” “a particular embodiment,” “a related embodiment,” “a certain  embodiment,” “an additional embodiment,” or “a further embodiment” or combinations  thereof means that a particular feature, structure or characteristic described in connection  with the embodiment is included in at least one embodiment. Thus, the appearances of the  foregoing phrases in various places throughout this specification are not necessarily all  referring to the same embodiment. Furthermore, the particular features, structures, or  characteristics may be combined in any suitable manner in one or more embodiments.

[0033] The term “and / or” as used in a phrase such as “A and / or B” herein is intended to  include “A and B”, “A or B”, “A”, and “B”.

[0034] The term “alkoxy”, as used herein, refers to straight‐chain or branched alkyl group  bonded to an oxygen. In some embodiments, the alkoxy group includes an alkyl having 1 to  about 10 carbons, or 1 to about 8 carbons, or 1 to 4 carbons. Examples include, but are not  limited to, methoxy, ethoxy, propoxy, butoxy, pentoxy, hexoxy, heptoxy and octoxy. By way  of example, the term “C1‐C4‐alkoxy” refers to an alkoxy having 1 to 4 carbon atoms, such as,  but not limited to, methoxy, ethoxy, n‐propoxy, 1‐methylethoxy, n‐butoxy, 1‐ methylpropoxy, 2‐methylpropoxy and 1,1‐dimethylethoxy. “Alkoxy” is intended to embrace  all structural isomeric forms of an alkoxy group. For example, as used herein, propoxy  encompasses both n‐propoxy and isopropoxy, etc.

[0035] The term “alkyl”, as used herein, refers to a saturated hydrocarbon chain of 1 to  about 12, or 1 to about 8, carbon atoms in length, such as, but not limited to, methyl, ethyl,  propyl and butyl. The alkyl group may be a straight‐chain, a branched‐chain or cyclic. By way  of example, the term “C1‐C4‐alkyl” as used herein refers to a saturated straight‐chain or   13  LEGAL_1:87555556.1   branched hydrocarbon having 1 to 4 carbon atoms. “Alkyl” is intended to embrace all  structural isomeric forms of an alkyl group. For example, as used herein, propyl  encompasses both n‐propyl and isopropyl; butyl encompasses n‐butyl, sec‐butyl, isobutyl  and tert‐butyl. Encompassed within cyclic alkyl (or “cycloalkyl) groups are mono‐ and poly‐ cyclic alkyl groups (e.g., spiro, fused or bridged), including, for example, cyclopropyl,  cyclobutyl, cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl, cyclooctyl, and adamantyl.

[0036] The term “alkylamine”, as used herein, refers to a group comprising one or two  straight‐chain or branched alkyl groups bonded to a nitrogen (‐NHR or ‐NR2, where R is an  alkyl and each R is the same or different). In some embodiments, the alkyl(s) in the  alkylamine includes 1 to about 10 carbons, or 1 to about 8 carbons, or 1 to 4 carbons.  Examples include, but are not limited to, amino groups comprising a single methyl, ethyl,  propyl or butyl and amino groups comprising two alkyl groups each independently selected  from methyl, ethyl, propyl or butyl. By way of example, the term “C1‐C4‐alkylamine” refers  to an alkylamine having 1 to 4 carbon atoms, such as, but not limited to, methylamine,  ethylamine, n‐propylamine, 1‐methylethylamine, n‐butylamine, methylpropylamine.  “Alkylamine” is intended to embrace all structural isomeric forms of an alkylaminegroup.  For example, as used herein, when alkyl(s) in the alkylamine is propyl, this encompasses  both n‐propoxy and isopropoxy, etc.

[0037] The term “aryl”, as used herein, refers to a monocyclic or polycyclic aromatic group,  such as, but not limited to, phenyl, naphthyl, thienyl and indolyl.

[0038] The term “arylamine”, as used herein, refers to a group comprising one or two aryl  groups bonded to a nitrogen (‐NHR or ‐NR2, where R is an aryl and each R is the same or  different). In some embodiments, the aryl is phenyl or a substituted phenyl.

[0039] The term “biological material”, as used herein, refers to any substance that can be or  has been removed from a plant, a fungus, a human or a non‐human animal that is suitable  for cryopreservation, such as, but not limited to, organs, tissues (including, for example,  organoids), cells, platelets, eggs, and, embryos. Alternatively, the biological material can be  cultured cells, tissues or organs. Examples of “cells” include, but are not limited to, stem  cells, T cells (including CAR‐T cells), oocytes, sperm, peripheral blood mononuclear cells   14  LEGAL_1:87555556.1   (PMBCs), neurons, progenitor cells, liver cells, red blood cells, immune cells (e.g., NK cells),  endothelial cells, fungal cells, pancreatic cells (e.g., pancreatic islet cells) dendritic cells,  fibroblasts or cells from a cell line. In another alternative, the “cells” can be unicellular  microorganisms, including, for example, bacterial or unicellular fungal (e.g., yeast) cells. The  cells can be in an isolated or a purified form, or they can be in a mixture with one or more  other cell types.

[0040] In some embodiments, the biological material is from a non‐human animal or human  source. In alternative embodiments, the biological material is from a plant source or a  fungal source. For example, the plant‐sourced biological material can be a plant cell, tissue  or organ or can be plant seed or fruit, or a part thereof.

[0041] In some embodiments, the biological material is food.

[0042] The terms “cell medium”, “cell culture medium”, and “growth medium”, are used  interchangeably herein to refer to a liquid or gel composition used to support cellular  growth of cells, tissues or organs in an artificial environment. Examples of cell culture media  include, but are not limited to, Eagle's Minimum Essential Medium (MEM), Dulbecco's  Modified Eagle's Medium (DMEM), Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI), Fetal  Bovine Serum (FBS), Fetal Calf Serum (FCS), Ham's F‐10, Ham's F‐12, Hank's buffered salt  solution (HBSS), HBSS and dextrose, and Medium 199.

[0043] The terms “cryopreservation agent”, “cyroprotecting agent” and “cyroprotectant”  are used interchangeably herein to refer to a compound that assists in the cryopreservation  of a biological material. Examples of suitable cryopreservation agents include, but are not  limited to, DMSO, lactobionate, glycerol, trehalose, mannitol, hydroxyethyl starch (HES),  ethylene glycol (EG), propylene glycol (PG), and other biopolymers useful in  cryopreservation. Examples of suitable biopolymers include, but are not limited to, polyvinyl  alcohols. As used herein, the term “cryopreservation agent” is not intended to include  water, RPMI, DMEM, or MEM, HBSS or dextrose.      15  LEGAL_1:87555556.1

[0044] The present inventors have previously found that the aryl‐glycosides, such as the ice  recrystallization inhibitor (IRI) 2FA, shown above, can be successfully used in  cryopreservation formulations, for example for use in cell and gene therapy applications.  However, the present inventors have now identified a subset of aldonamides with improved  solubility over the previously studied aryl‐glycosides, while retaining good ice  recrystallization inhibition activity. As used herein, “good” ice recrystallization inhibition is  intended to refer to an IC50 < about 45 mM, or preferably an IC50 < about 35 mM.

[0045] The present inventors have now identified a specific class of deoxy aldonamide  derivatives of 2FA, such as C4‐deoxy N‐aryl‐aldonamides and C4‐deoxy N‐alkyl‐aldonamides,  having similar ice recrystallization inhibition activity to 2FA, but with higher solubility in  aqueous buffers, in comparison to 2FA. The increased solubility of these compounds permits  the use of higher concentrations of the compounds in cryopreservation formulations. This is  of particular value since concentration is a function of temperature and cryopreservation  formulations are used at subzero temperatures, which means increased solubility is useful  for maximizing the amount of compound present in the formulations for cryopreservation.  In addition to the ice recrystallization inhibitory activity of the present IRIs, the inventors  have surprisingly found these compounds to have generally low cytotoxicity (e.g., in  comparison to CPAs currently in use). Thus, in some embodiments, the combination of  improved solubility and relatively low toxicity, further facilitates the use of these IRI  compounds at higher concentrations in cryopreservation formulations.

[0046] Accordingly, the present application provides IRI compounds of Formula A:   A  where:  B is phenyl; phenyl mono‐ or di‐substituted with C1‐C4‐alkyl, C1‐C4‐alkoxy, ‐NH2, ‐ NR5H, ‐N(R6)2 where each R6 is the same or different, ‐C(O)R7, ‐ COOH, ‐COOR8, ‐CHO  or halogen (e.g., Cl, Br, I or F); or an alkyl;   16  LEGAL_1:87555556.1   Ra is H when B is phenyl or substituted phenyl, and H or alkyl (e.g., a C1‐C4 alkyl)  when B is alkyl;  R1, R2 and R3 are each independently H, ‐OH, ‐OR9, ‐NHR10, ‐[NH2R11]+, or ‐[NH(R12)2]+  where each R12 is the same or different, wherein at least one of the R1, R2, R3 and R4  substituents is not H;   n is an integer from 1 to 7; and   each R5 – R12 is independently H, alkyl or aryl.

[0047] For greater certainty, as used throughout the present application to reference  selection of alternative substituents, use of the term “independently” indicates that each  substituent is selected individually from the recited alternatives, without connection to or  influence from the selection of other substituents.

[0048] In some embodiments of the present application the IRI compound of Formula A is a  compound of Formula I:   I  where:  each R is independently hydrogen, C1‐C4‐alkyl, C1‐C4‐alkoxy, ‐NH2, ‐NR5H, ‐N(R6)2  where each R6 is the same or different, ‐C(O)R7, ‐ COOH, ‐COOR8, ‐CHO or halogen  (e.g., Cl, Br, I or F);   R1, R2, R3 and each R4 are each independently H, ‐OH, ‐OR9, ‐NHR10, ‐[NH2R11]+, or ‐ [NH(R12)2]+ where each R12 is the same or different, wherein at least one of the R1,  R2, R3 and R4 substituents is not OH;   n is an integer from 1 to 7, wherein when n is greater than 1 each R4 is the same or  different; and   each R5 – R12 is independently H, alkyl or aryl.   17  LEGAL_1:87555556.1

[0049] In some embodiments, the compound of Formula I includes a mono‐substituted  phenyl and has the following structure:  .

[0050] In some embodiments, R1, R2 and R3 are each independently H, ‐OH, or ‐OR9 wherein  at least one of the R1, R2 and R3 substituents is not ‐OH or ‐OR9.

[0051] In some embodiments, R3 is H. The C4‐deoxy moiety has been found to contribute to  improved solubility in buffers, for example PBS, in comparison to the corresponding C4‐OH  compounds.

[0052] In certain embodiments, the IRI compound of Formula I has the stereochemistry as  shown in Formula I′   I′.

[0053] However, it should be recognized that the compound of Formula I can also occur as a  stereoisomer of the compound of Formula I′, or as a mixture of stereoisomers, which  optionally includes the stereoisomer of Formula I′. The compound of Formula I can be used  in cryopreservation formulations as described herein, in a single stereoisomeric form or as a  mixture of two or more stereoisomers.

[0054] In some embodiments, when n = 2, the IRI compound of Formula I of the present  application can be grouped into three sub‐families, as summarized in Scheme 1 below,  which illustrates the three sub‐families in relation to a specific C4‐deoxy‐derivative of 2FA,  referred to herein as “C4 Deoxy 2FA”. Sub‐family A includes three oxygen‐containing  substituents (e.g., three hydroxy or alkoxy substituents, or a combination thereof), in the  aldonamide chain. Sub‐family B includes one or two oxygen‐containing substituents (e.g.,  hydroxy and / or alkoxy substituents) in the aldonamide chain. In sub‐families A and B, when   18  LEGAL_1:87555556.1   the compound includes two or more alkoxy substituents, these substituents may be the  same or different from one another. Sub‐family C includes one, two or three alkylamine  substituents, where when there are two or three alkylamine substituents, they may be the  same or different from one another. In specific embodiments of these sub‐families, the  compounds are C‐4 deoxy aryl‐aldonamide derivatives.  (OR)30-21-3Sub-family C Scheme 1: Aryl aldonamide derivative ice recrystallization inhibitor Sub‐families

[0055] Although Scheme 1 depicts compounds including a mono‐substituted phenyl bound  to the nitrogen of the amide group, it should be understood that the analogous compounds  comprising a di‐substituted phenyl or an alkyl group at this position are also encompassed  by the present application, as detailed above.

[0056] In some embodiments, the compound of Formula I is not C4 Deoxy 2FA, as depicted  in Scheme 1.

[0057] In some embodiments of the present application the IRI compound of Formula A is a  compound of Formula II:   19  LEGAL_1:87555556.1    where:  R1, R2, R3 and R4 are each independently H, ‐OH, ‐OR9, ‐NHR10, ‐[NH2R11]+, or ‐ [NH(R12)2]+ where each R12 is the same or different, wherein at least one of the R1,  R2, R3 and R4 substituents is not OH;   Ra is H or alkyl (e.g., a C1‐C4 alkyl);  n is an integer from 1 to 7, wherein when n is greater than 1 each R4 is the same or  different;   Alk is a C3 – C9 linear or branched alkyl or a C3 – C10 mono‐ or poly‐cyclic alkyl.; and   each R9 – R12 is independently H, alkyl or aryl.

[0058] In some embodiments, the compound of Formula II is a compound of Formula IIa:   IIa  where:  p is an integer from 1 to 7, or from 5 to 7, or p is 6.

[0059] In some embodiments, R1, R2 and R3 are each independently H, ‐OH, or ‐OR9 wherein  at least one of the R1, R2 and R3 substituents is not ‐OH or ‐OR9.

[0060] In some embodiments, R3 is H. The C4‐deoxy moiety has been found to contribute to  improved solubility in buffers, for example PBS, in comparison to the corresponding C4‐OH  compounds.

[0061] Synthesis of C4 Deoxy aldonamide IRI Compounds   20  LEGAL_1:87555556.1

[0062] The IRI compounds of the present application can be manufactured using a range of  different synthetic routes using commercially available starting materials.

[0063] Provided below are non‐limiting, examples of synthetic methods for manufacturing  the compound of Formula I. However, the IRI compounds of the present application can be  synthesized using alternative methods, as would be well appreciated by the skilled person.

[0064] In accordance with one embodiment, there is provided a method for manufacture of  a compound of Formula I, I as defined above, wherein n is 2, R3 is H and R4 is OH, comprising  the steps of:  (i) converting a protected D‐pyranose of Formula III to a benzylidene  acetal     III  where each R″ is independently H or OH and O‐R′′′ is a hydroxyl protecting group, such  as methoxy or silyl ether (e.g., a bulky silyl ether);  (ii) when one or both of the R″ groups are OH, protecting the OH group  or groups, and subsequently performing a selective ring opening of  the benzylidene acetal, for example using sodium cyanoborohydride,  or a related bulky borohydride reducing agent or TES / TFA, to form a  C4 acceptor compound of Formula IV     IV   21  LEGAL_1:87555556.1   wherein each R” is independently H or OPr1, where Pr1 is a hydroxyl protecting group  (such as, but not limited to, a benzyl group);  (iii) converting the C4 hydroxyl group of the compound of Formula IV into  a triflate and displacing the triflate, for example using sodium  borohydride, to produce a C4 deoxy pyranose derivative of Formula V     V      ;  (iv) deprotecting the anomeric protected group and oxidizing the  resultant hydroxyl (e.g., via an Albright‐Goldman oxidation, Swern  oxidation, a Dess‐Martin or a PCC (pyridinium chlorochromate)  oxidation) to produce the lactone of Formula VI   (v) ring opening the lactone of Formula VI with an aryl amine of Formula  VIIa   VIIa  wherein R is hydrogen, C1‐C4‐alkyl, C1‐C4‐alkoxy, ‐NH2, ‐NR5H, ‐N(R6)2 where each R6  is the same or different, ‐C(O)R7, ‐ COOH, ‐COOR8, ‐CHO or halogen (e.g., Cl, Br, I or  F), and removing the hydroxyl protecting group(s) to form the compound of Formula  I as defined above, wherein n is 2, R3 is H and R4 is OH.   22  LEGAL_1:87555556.1

[0065] In some embodiments of the synthetic method for manufacture of a compound of  Formula I described above, the compound of Formula III employed in step (i) is a methoxy‐ D‐pyranoside, for example, methoxy‐D‐glucose.

[0066] In another embodiment, there is provided an alternative method for manufacture of  a compound of Formula I having the structure of Formula XII     wherein:  B is phenyl; phenyl mono‐ or di‐substituted with C1‐C4‐alkyl, C1‐C4‐alkoxy, ‐NH2, ‐ NR5H, ‐N(R6)2 where each R6 is the same or different, ‐C(O)R7, ‐ COOH, ‐COOR8, ‐CHO  or halogen (e.g., Cl, Br, I or F); or an alkyl;   R1, R2, R3 and each R4 are each independently H, ‐OH, ‐OR9, ‐NHR10, ‐[NH2R11]+ or ‐ [NH(R12)2]+ where each R12 is the same or different, wherein the terminal R4 is OH;  m is an integer from 1 to 6; and   each R5 – R12 is independently H, alkyl or aryl,  said method comprising:  (a) providing a lactone of Formula VIII         wherein R1a, R2a, R3a and each R4a are independently H, ‐OH, ‐OR9, ‐NHR10, ‐[NH2R11]+,  ‐[NH(R12)2]+ where each R12 is the same or different, a protected alcohol, or a  protected amine, wherein the terminal R4a is OH;  (b) ring opening the compound of Formula VIII with an aryl amine of Formula  VII            VII    ; and   23  LEGAL_1:87555556.1   (c) optionally, deprotecting the product of step (b).    b) In one example of the above embodiment, the method is for manufacture of a  compound of Formula XII has the structure of Formula XIIa:   wherein:  each R is independently hydrogen, C1‐C4‐alkyl, C1‐C4‐alkoxy, ‐NH2, ‐NR5H, ‐N(R6)2  where each R6 is the same or different, ‐C(O)R7, ‐ COOH, ‐COOR8, ‐CHO, haloalkyl or  halogen (e.g., Cl, Br, I or F), and   each R8 – R12 is independently H, alkyl or aryl; and  wherein the compound of Formula VII is an aryl amine having the structure of  Formula VIIa:   VIIa.

[0067] In another example of this embodiment, the method is for manufacture of a  compound of Formula XII has the structure of Formula XIIb:   XIIb  wherein:  Alk is a C3 – C9 linear or branched alkyl or a C3 – C10 mono‐ or poly‐cyclic alkyl; and   wherein the compound Formula VII is an alkyl amine having the structure of Formula  VIIb:    VIIb.   24  LEGAL_1:87555556.1

[0068] In one example of the above embodiments, the method for manufacture of a  compound of Formula I,  wherein R3 is H and wherein prior to step (a), a compound of  Formula VIII, in which R3a is H, is first produced by the steps:  (i) providing a protected O‐allyl pyranose of Formula IX   (ii) converting the protected O‐allyl pyranose of Formula IX to a thiocarbonyl  derivative of Formula X   wherein Rb is H, CH3, SCH3, OCH3, phenyl (Ph), OPh or imidazolyl (preferably imidazolyl);  (iii) treating the thiocarbonyl derivative of Formula X with a radical reducing agent to  produce a C4 deoxy pyranose derivative of Formula XI   XI    ;  (iv) converting the C1 allyl group of the derivative of Formula XI to a C1 hydroxyl  group;  (v)  oxidizing the C1 hydroxyl group to form a lactone of Formula VII.   25  LEGAL_1:87555556.1

[0069] In some embodiments of the synthetic method for manufacture of a compound of  Formula I described above, the protected O‐allyl pyranose of Formula IX is a protected O‐ allyl galactose.

[0070] In other embodiments, the N‐alkyl or N‐aryl aldonamide IRI compounds of Formula I  can be synthesized by an amidation of an alkyl or aryl amine of Formula VII (as defined  above) with a protected aldonic acid or deoxyaldonic acid. For example, the aldonic acid or  deoxyaldonic acid can include a terminal 1,3‐dioxolane as a protecting group, alone or in  combination with other hydroxyl or amine protecting groups, depending on the substituents  on the aldonic acid. The resultant protected amide is then deprotected to produce an IRI  compound of Formula I. In other examples, the 1,3‐dioxolane protecting group is used to  protect a hydroxyl group adjacent to the carboxylic acid moiety of the aldonic acid or  deoxyaldonic acid.

[0071] As would be readily appreciated by the skilled person, the reagents and conditions  used in the steps of the synthetic processes summarized above can be varied by  incorporating standard alternatives.

[0072] Compositions for Preserving Biological Material

[0073] Also provided herein are compositions for preserving biological material comprising  one or more IRI compounds of Formula I, optionally in combination with one or more  cryoprotecting agents, as defined herein. The preservation compositions of the present  application are suitable for use in cryopreservation, in which the compositions comprising  the biological material are frozen, or for subzero preservation without freezing. In both  instances, the presence of one or more IRI compounds of the present application aids in  inhibiting ice recrystallization formation during cooling and during warming following  cryopreservation. The preservation compositions of the present application can also be used  in non‐cyropreservation storage methods, such as, for example, hypothermic / vitrification  storage methods and normalthermic storage methods.

[0074] In a particular embodiment, the at least one IRI compound is present in the  composition at a concentration of less than about 400 mM, preferably less than about 200  mM, more preferably less than about 100 mM, even more preferably less than about 10   26  LEGAL_1:87555556.1   mM, still more preferably less than about 1 mM, and most preferably less than about 0.5  mM. In another embodiment, the IRI compound can be present in the composition at a  concentration of about 0.5 mM to (and including) about 400 mM, or about 55 mM to (and  including) about 220 mM.

[0075] As would be readily understood by the skilled person, the amount of IRI compound  employed in a cyropreservation composition of the present application, will be determined,  in part, based on the ratio between the toxicity of the IRI compound its IRI activity. This is  analogous to a therapeutic index as employed in determining appropriate dosing of a drug.  In the present application, the concentration of the IRI compound used in the  cryopreservation composition will be determined, in part, based on the ratio of the LD50 and  the IC50 of the IRI compound, with a higher ratio indicative of the ability to use a higher  concentration of the IRI compound while minimizing or avoiding cytotoxicity during  cryopreservation.

[0076] In a particular embodiment, compositions for cryopreserving a biological material  are provided herein, wherein the composition additionally comprises at least one, at least  two, or at least three, cryopreservation agents selected from the group consisting of DMSO,  lactobionate, glycerol, trehalose, mannitol, hydroxyethyl starch (HES), ethylene glycol (EG),  propylene glycol (PG), polyvinyl alcohol and other biopolymers useful in cryopreservation.  The at least one cryopreservation agent is present in the composition in a concentration of  about 0.1wt% to (and including) about 30wt%, preferably about 0.1wt% to (and including)  about 20wt%, preferably about 5wt% to (and including) about 30wt%, and preferably about  5wt% to (and including) about 20wt% .

[0077] In a particular embodiment, compositions for cryopreserving a biological material  are provided herein which further comprise a biological material. The biological material can  be, for example, organs, tissues (e.g., organoids), food, cells, platelets, eggs, and embryos.  Alternatively, the biological material can be cultured cells, tissues or organs. Examples of  “cells” include, but are not limited to, stem cells, T cells (e.g., CAR‐T cells), oocytes, sperm,  peripheral blood mononuclear cells (PMBCs), neurons, progenitor cells, liver cells, red blood  cells, immune cells (e.g., NK cells), endothelial cells, pancreatic cells (e.g., pancreatic islet   27  LEGAL_1:87555556.1   cells), dendritic cells, fibroblasts or cells from a cell line. The cells can be in an isolated or a  purified form, or they can be in a mixture with one or more other cell types.

[0078] In some embodiments, the biological material is from a non‐human animal or human  source. For example, the biological material from a non‐human animal or human source can  be a cell, tissue or organ. In alternative embodiments, the biological material is from a plant  source. For example, the plant‐sourced biological material can be a plant cell, tissue or  organ or can be plant seed or fruit, or a part thereof. In other embodiments, the biological  material is from a fungal source. In yet other embodiments, the biological material  comprises microorganisms of one or more types or species.

[0079] In a particular embodiment, compositions for cryopreserving a biological material  are provided herein further comprising a cell culture or growth medium. Examples of  suitable cell culture media include, but are not limited to, Eagle's Minimum Essential  Medium (MEM), Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), Roswell Park Memorial  Institute medium (RPMI), Fetal Bovine Serum (FBS), Fetal Calf Serum (FCS), Ham's F‐10,  Ham's F‐12, Hank's buffered salt solution (HBSS), HBSS and dextrose, Medium 199 and  combinations thereof.

[0080] In another embodiment, the compositions for cryopreservation can contain both  biological material and cell medium as provided above.

[0081] Kits for Preserving Biological Material

[0082] Kits for cryopreserving a biological material are provided herein comprising an IRI  compound of Formula I, or composition comprising one or more IRI compound of Formula I,  for cryopreserving a biological material as reported herein. The IRI compound and a further  cryopreservation agent, if present, can be in the same composition or in separation  compositions. Additionally, they can be co‐packaged for common presentation or packaged  individually. Instructions can also be provided in the kit for cryopreservation of various types  of biological material. The kits provided herein can further comprise a cell culture or growth  medium.    28  LEGAL_1:87555556.1

[0083] Methods for Cryopreserving Biological Material

[0084] Methods for cryopreserving a biological material are provided herein in which the  biological material is combined with in a solution of at least one IRI compound of Formula I  and the resulting combination is frozen or cooled to a sub‐zero storage temperature. As  would be readily understood by the skilled person, the technique by which the biological  material is combined with a solution of the at least one IRI compound of Formula I will be  dependent on the nature of the biological material. For example, cells may be suspended in  the solution prior to storage, or an organ may be perfused with the solution using the  existing vasculature of the organ, or a tissue may be perfused with or immersed in the  solution. Selection of the appropriate technique for combining the biomaterial with the  solution is a matter of routine for the skilled person having knowledge of cryopreservation.

[0085] Accordingly, in some embodiments, methods for cryopreserving a biological  material, in which the biological material is cells, are provided herein which comprise  suspending the biological material in a solution of at least one IRI compound of Formula I to  form a suspension and freezing the suspension or cooling the suspension to a sub‐zero  storage temperature.

[0086] In some embodiments, the method comprises adding a biological material to a  solution comprising at least one IRI compound of Formula I, and then cryopreserving the  biological material in cryogenic vials or other suitable container. The vials can be frozen  under rate controlled freezing conditions, such as freezing at 1°C per minute over 16 hours.  The vials can be stored using standard cryopreservation techniques, and then they can be  thawed when required by removing the vials from the cold storage, and thawing using  standard protocols. Examples of standard cryopreservation techniques include freezing in  liquid nitrogen to about ‐196 °C and freezing in dry ice to about ‐80 °C.  Examples of  standard thawing protocols include, but are not limited to, ambient thaw or rapid thaw in a  water bath at a temperature that is at or between room temperature and 37°C.  Alternatively, a controlled, slow thaw protocol can be used.

[0087] The present inventors have surprisingly found that use of the IRI compounds of  Formula I in cryopreservation allows the use of storage temperatures that are warmer than   29  LEGAL_1:87555556.1   typically employed during cryopreservation in the absence of such IRI compounds. For  example, cryopreservation can be performed using one or more IRI compounds of Formula I  at sub‐zero temperatures that are higher than ‐196 °C. In some embodiments, the  cryopreservation temperature is ‐100°C or higher, or ‐80°C or higher, or ‐40°C or higher, or ‐ 15°C or higher or ‐10°C or higher.

[0088] In some embodiments, temperatures of about ‐80°C have been found to be useful  for cryopreservation of organoids or spinal cord tissue using a solution comprising one or  more IRI compounds of Formula I.

[0089] In some embodiments, temperatures of about ‐40°C have been found to be useful  for cryopreservation of platelets using a solution comprising one or more IRI compounds of  Formula I.

[0090] In some embodiments, temperatures of from about ‐15°C to about ‐10°C have been  found to be useful for high sub‐zero cyropreservation of biological material using a solution  comprising one or more IRI compounds of Formula I.

[0091] In a particular embodiment, there is further provided methods for cryopreserving a  biological material by suspending biological material in a solution of at least one IRI  compound of Formula I to form a suspension, which is contained in a vial or other suitable  container, wherein the vial is frozen directly in a storage unit without a rate controlled  freezing protocol.

[0092] Also provided herein is a method for inhibiting ice recrystallization during  cryopreservation or sub‐zero storage of a biological material, which method comprises  combining, such as, by suspending, a biological material in a solution of at least one IRI  compound of Formula I reported herein to form a combination (e.g., a suspension) and  cryopreserving the resultant suspension or cooling the resultant suspension to a sub‐zero  storage temperature.      30  LEGAL_1:87555556.1

[0093] To gain a better understanding of the invention described herein, the following  examples are set forth.  It should be understood that these examples are for illustrative  purposes only. Therefore, they should not limit the scope of this invention in any way.  EXAMPLES

[0094] EXAMPLE 1: Synthesis of IRI Compounds from Methyl‐α‐D‐glucopyranoside

[0095] The IRI compounds used in the following Examples were synthesized according to  the synthetic route summarized in this Example. However, it should be understood that this  synthetic method is not limited to the specific starting material used in this Example; other  pyranose compounds can be substituted for the methyl‐α‐D‐glucopyranoside starting  material in order to obtain other compounds according to Formula I, as defined herein.

[0096] Benzilidene acetal 1

[0097] To a flame dried flask placed under an atmosphere of argon, methyl α‐d‐ glucopyranoside (7.5120 g) was suspended in anhydrous N,N‐dimethylformamide (DMF) (77  mL). Benzaldehyde dimethyl acetal (6.6 mL) and p‐TSA (0.6700 g) were added. The resulting  solution was stirred at room temperature under an atmosphere of argon for 6 hours after  which the reaction mixture was diluted with ethyl acetate (EtOAc), and extracted with  EtOAc  /  Brine. The organic phase was dried with Na2SO4 and concentrated under reduced  pressure. The crude product was recrystallized with dichloromethane (DCM)  /  Hexanes to  afford the benzylidene acetal 1 as a white solid.   31  LEGAL_1:87555556.1

[0098] 1H NMR (400 MHz, DMSO‐d6): δ 7.45‐7.39 (m, 2H), 7.36‐7.31 (m, 3H), 5.53 (s, 1H),  5.16 (d, J = 5.1 Hz, 1H), 4.99 (d, J = 6.7 Hz, 1H), 4.59 (d, J = 3.7 Hz, 1H),  4.13 (dd, J = 9.8, 4.7  Hz, 1H), 3.66 (t, J = 10.1 Hz), 1H), 3.58‐3.50 (m, 2H), 3.36‐3.31 (m, 1H), 3.28 (s, 3H).

[0099] 13C NMR (100 MHz, DMSO‐d6): δ 138.29, 129.31, 128.49 (2x CH), 126.86 (2x CH),  101.32, 101.01, 81.81, 72.88, 70.35, 68.64, 62.85, 55.22.

[0100] LRMS (ESI): m / z calcd. for C9H14O5Na [M + Na]+ 305.2, found 305.2.

[0101] Protected Benzilidene acetal 2      1           2

[0102] To a flame dried flask placed under an atmosphere of argon in a water  /  ice  bath, benzylidene acetal 1  (1.1317 g) and anhydrous DMF (40 mL) were added. 60 % NaH  suspension in mineral oil (0.4918 g), was added to the reaction portion‐wise over 5 minutes,  and the reaction was allowed to stir until homogeneous. Benzyl bromide (BnBr; 1.5 mL) was  added dropwise to the solution and the water  /  ice bath was removed. The reaction was  allowed to proceed at room temperature under argon atmosphere overnight. The resulting  mixture was diluted with DCM and extracted with DCM  /  H2O, the resulting organic phase  was dried with Na2SO4 and concentrated under reduced pressure. The crude product was  subjected to flash column chromatography with a gradient of 5 – 30 % EtOAc  /  Hexanes  used as eluent to afford the benzyl‐protected benzylidene acetal 2 as a clear oil.

[0103] 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 7.51‐7.46 (m, 2H), 7.41‐7.26 (m, 3H), 5.54 (s,  1H), 4.93‐4.81 (m, 3H), 4.69 (d, J = 12.2 Hz, 1H), 4.59 (d, J = 3.7 Hz, 1H), 4.26 (dd, J = 10.1, 4.7  Hz, 1H), 4.04 (t, J= 9.3 Hz, 1H), 3.86‐3.79 (m, 1H), 3.70 (t, J = 10.2 Hz, 1H), 3.63‐3.53 (m, 2H),  3.39 (s, 3H).   32  LEGAL_1:87555556.1

[0104] 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 138.74, 138.17, 137.42, 128.93, 128.48 (2x CH),  128.34 (2x CH), 128.25 (2x CH), 128.16 (2x CH), 128.06 (2x CH), 127.95, 127.62, 126.05 (2x  CH), 101.28, 99.26, 82.15, 79.18, 18.63, 75.38, 73.83, 69.08, 62.34, 55.38.

[0105] C4‐Hydroxy Glycosyl Acceptor 3        2               3

[0106] A flame dried flask placed under an atmosphere of argon was charged with  benzyl‐protected benzylidene acetal 2 (1.4633 g), 4Å molecular sieves, and anhydrous  MeCN (7.5 mL). Sodium cyanoborohydride (1.0106 g) was added and allowed to stir 10  minutes. The reaction flask was placed into a water  /  ice bath and allowed to cool for 15  minutes. Iodide chips (3.0316 g) were added to the reaction flask portion‐wise over 5  minutes, the resulting mixture was allowed to stir for 10 minutes after which the reaction  mixture was filtered through a Celite™ bed, diluted with DCM and extracted with DCM  /   brine. The resulting organic phase was dried with Na2SO4 and concentrated under reduced  pressure. The resulting crude oil was subjected to flash column chromatography with 30 %  EtOAc  /  Hexanes used as the eluent to afford the C4‐hydroxy glycosyl acceptor compound 3  as a clear oil.

[0107] 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 7.37‐7.24 (m, 15H), 4.99 (d, J = 11.4 Hz, 1H), 4.74  (dd, J = 15.9, 3.8 Hz, 2H), 4.68‐4.60 (m, 2H), 4.55 (q, J = 11.2 Hz, 2H), 3.77 (t, J = 9.2 Hz, 1H),  3.71‐3.64 (m, 3H), 3.59 (t, J = 9.1 Hz, 1H), 3.52 (dd, J = 9.5, 3.6 Hz, 1H), 3.37 (S, 3H).

[0108] 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 138.81, 138.06, 138.01, 128.61 (2x CH), 128.49  (2x CH), 128.38 (2x CH), 128.15, 128.02, 127.98, 127.87, 127.66, 127.64, 98.21, 81.47, 79.59,  75.45, 73.59, 73.18, 70.72, 69.88, 69.47, 55.27.

[0109] LRMS (ESI): m / z calcd. for C9H14O5Na [M + Na]+ 487.2, found 487.2.   33  LEGAL_1:87555556.1

[0110] Protected C4‐Deoxy Pyranose Derivative 5

[0111] To a flame dried flask placed under an atmosphere of argon, C4‐hydroxy  glycosyl acceptor compound 3 (1.39 g) was dissolved in anhydrous DCM (10 mL). Pyridine  (0.7 mL) was added and the reaction flask was placed into a water  /  ice bath. Tf2O (0.5 mL)  was added slowly and the resulting mixture was allowed to stir for 20 minutes. The reaction  mixture was diluted with DCM and extracted with DCM  /  brine. The resulting organic  solution was dried with Na2SO4 and concentrated under reduced pressure to afford a crude  triflate intermediate (1.9 g) as a thick oil which was dried under high vacuum and placed  under an atmosphere of argon. Anhydrous MeCN (160 mL), and NaBH4 (1.0021 g) were  added and allowed to stir overnight. The resulting mixture was diluted with EtOAc and  extracted with EtOAc  /  H2O. The organic phase was dried with Na2SO4 and concentrated  under reduced pressure. The crude C4‐deoxy pyranose derivative 5 was subjected to flash  column chromatography with 10 % EtOAc  /  Hexanes used as the eluent, to afford the pure  C4‐deoxy pyranose derivative 5 as a clear oil.

[0112] 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 7.39‐7.24 (m, 15H), 4.83 (d, J = 12.2 Hz, 1H), 4.74  (d, J = 11.7 Hz, 1H), 4.70‐4.64 (m, 3H), 4.54 (S, 2H), 3.96‐3.87 (m, 2H), 3.49‐3.44 (m, 3H), 3.37  (s, 3H), 2.05 (ddd, J = 12.8, 7.4, 2.9 Hz, 1H), 1.50 (q, J = 12.1 Hz, 1H).

[0113] 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 138.91, 138.56, 138.12, 128.38 (6x CH), 128.06  (2x CH), 127.74, 127.65 (3x CH), 127.62 (2x CH), 127.51, 99.07, 80.47, 75.32, 73.42, 73.33,  72.52, 72.42, 66.74, 55.19, 33.96.

[0114] LRMS (ESI): m / z calcd. for C9H14O5Na [M + Na]+ 471.3, found 471.3.   34  LEGAL_1:87555556.1

[0115] Protected C4 Deoxy‐N‐(2‐Fluorophenyl)‐D‐gluconamide 6

[0116] The C4‐deoxy pyranose derivative 5 (1.08 g) was dissolved in AcOH (17 mL)  and 3 M H2SO4 (2 mL). The reaction flask was equipped with a condenser and brought to 80  °C. The reaction was allowed to stir at heat for 100 minutes after which the flask was  removed from heat and allowed to cool to room temperature. The reaction mixture was  diluted with DCM and extracted with DCM  /  H2O. The organic phase was dried with Na2SO4  and concentrated under reduced pressure to afford the crude C1 deprotected C4‐deoxy  pyranose intermediate (0.9572 g) as a light brown oil which was dried under high vacuum  and placed under an argon atmosphere. Anhydrous DMSO (6 mL) and Ac2O (3.6 mL) were  added, and the reaction mixture was allowed to stir at room temperature overnight. The  reaction was quenched with H2O (10 mL) and allowed to stir for 10 minutes. The solution  was diluted with DCM and extracted with DCM  /  brine. The resulting organic phase was  dried with Na2SO4, and concentrated under reduced pressure to afford crude C4‐deoxy  lactone (0.8685 g) as a clear oil. A portion of crude C4‐deoxy lactone (0.6721 g) was  dissolved in AcOH (5 mL) and 2‐fluoroaniline (0.2 mL) was added. The reaction flask was  equipped with a condenser and the reaction was brought to 100 °C. The reaction was  allowed to stir at heat for 1 hour, after which time the flask was removed from heat and  allowed to cool to room temperature. The crude mixture was concentrated under reduced  pressure, and subjected to flask column chromatography using a gradient of 10 – 50 %  EtOAc  /  Hexanes as the eluent. The protected C4 Deoxy‐N‐(2‐Fluorophenyl)‐D‐gluconamide  6 was isolated as a white solid.   35  LEGAL_1:87555556.1

[0117] 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 8.77 (Br, 1NH), 8.34 (dt, J = 8.0, 1.5 Hz, 1H), 7.34‐ 7.26 (m, 10H), 7.18 (s, 5H), 7.15‐7.02 (m, 3H), 4.73 (d, J = 11.4 Hz, 1H), 4.59 (d, J = 11.4 Hz,  1H), 4.56 (s, 2H), 4.52 (s, 2H), 4.23‐4.17 (m,1H), 4.03 (d, J = 3.1 Hz, 1H), 4.00‐3.93 (m, 1H),  3.46 (dd, J = 9.4, 3.2Hz, 1H), 3.29 (dd, J = 9.4, 7.6Hz, 1H), 2.29 (Br, 1OH), 1.82‐1.74 (m, 1H),  1.65‐1.55 (m, 1H).

[0118] C‐4 Deoxy N‐(2‐Fluorophenyl)‐D‐Gluconamide (C4 Deoxy 2FA)                  C4 Deoxy 2FA

[0119] Protected C4 Deoxy‐N‐(2‐Fluorophenyl)‐D‐gluconamide 6 (0.1083 g) was  dissolved in EtOAc (2 mL) and MeOH (2 mL). 10 % Pd / C (0.022 g) is added, and the  hydrogenation flask was placed under an atmosphere of hydrogen. The reaction was  allowed to stir until deemed complete by TLC (80 % EtOAc  /  Hexanes) and the hydrogen  atmosphere was purged  /  cycled every 30 minutes. Once complete the reaction mixture was  diluted with MeOH (10 mL) and filtered through a bed of Celite™. The resulting solution was  concentrated under reduced pressure to afford the title compound C4 Deoxy 2FA as a white  solid.

[0120] 1H NMR (400 MHz, D2O): δ 7.45 (dt, J = 7.9, 1.5 Hz, 1H), 7.23‐7.17 (m, 1H),  7.15‐7.08 (m, 2H), 4.17‐4.10 (m, 2H), 3.82‐3.74 (m, 1H), 3.50 (dd, J = 11.7, 3.9 Hz, 1H), 3.38  (dd, J = 11.5, 6.8 Hz, 1H), 1.72‐1.63 (m, 1H), 1.53‐1.44 (m, 1H).

[0121] 13C NMR (100 MHz, D2O): δ 174.17, 128.21 (d, J = 7.9 Hz),126.29, 124.61 (d, J  = 3.8 Hz), 115.96 (d, J = 19.5 Hz), 74.85, 68.59, 68.38, 65.95, 35.95.     36  LEGAL_1:87555556.1

[0122] EXAMPLE 2: Synthesis of IRI Compounds from O‐Allyl Pyranose

[0123] An alternative synthetic route was used to produce the IRI compounds  described herein, which is more amenable to scale‐up synthesis.  In this example, the  synthesis, was performed using commercially available O‐allyl galactose as the starting  material. It should be understood that this synthetic method is not limited to the specific  starting material used in this Example; other O‐allyl pyranose compounds can be substituted  for the O‐allyl galactose starting material in order to obtain other compounds according to  Formula I, as defined above.

[0124] Details of the synthetic steps are provided below.

[0125] Step 1: Benzoyl protection of the C2, C3 and C6 hydroxyl groups of allyl α‐D‐ galactopyranoside

[0126] Allyl‐α‐D‐galactopyranoside (10.0 g) was dissolved in dry pyridine (120 mL,  0.28 M) in a flame dried flask under argon and the mixture is cooled to 0 °C using an ice‐ water bath. After 15 minutes of cooling, benzoyl chloride (15.9 mL, 3.05 equiv) was added  dropwise, and the mixture was stirred for 20 min. After the addition of benzoyl chloride, the  ice bath was removed, and the mixture is left to gradually warm to room temperature for an  additional 16 hours of stirring. The reaction was quenched by the slow addition an ice‐cold  saturated aq. NaHCO3 solution while stirring. The solution is extracted three times with  EtOAc, and the combined organic phase was washed 3 times with 1M HCl, ensuring that  enough HCl was added to acidify the entire quantity of pyridine. The organic phase was then  washed with saturated aq. NaCl solution and dried with Na2SO4. The organic phase was  evaporated under reduced pressure to obtain a light‐yellow solid. The crude product was  dissolved in DCM (2 mL / g) at room temperature while mixing and hexanes (5 mL / g) was  added after solubilization. The solution was placed in a freezer to recrystallize overnight,  followed by filtration to give the purified product as an off‐white solid. The recrystallization   37  LEGAL_1:87555556.1   mother liquor was collected, and the solvent was removed under reduced pressure. The  recrystallization procedure was repeated with DCM (2 mL / g) hexanes (4 mL or 5 mL / g) to  give additional pure product.

[0127] 1H NMR (500 MHz, CDCl3): δ 8.08 – 8.04 (m, 2H), 8.02‐7.97 (m, 4H), 7.61 –  7.56 (m, 1H), 7.55 – 7.49 (m, 2H), 7.46 (t, J = 7.8 Hz, 2H), 7.41 – 7.35 (m, 4H), 5.85 (ddd, J  =22.6, 10.8, 5.7 Hz, 1H), 5.78 (dd, J = 10.6, 3.1 Hz, 1H), 5.71 (dd, J = 10.7, 3.7 Hz, 1H), 5.35 (d,  J = 3.7 Hz, 1H), 5.27 (dq, J = 17.3, 1.7 Hz, 1H), 5.12 (dq, J = 10.4, 1.4 Hz, 1H), 4.68 (dd, J =  11.4, 6.1 Hz, 1H), 4.55 (dd, J = 11.4, 6.8 Hz, 1H), 4.44 – 4.39 (m, 2H), 4.25 (ddt, J = 13.1, 5.2,  1.5 Hz, 1H), 4.07 (ddt, J = 13.1, 6.0, 1.4 Hz, 1H)

[0128] 13C NMR (126 MHz, CDCl3): δ 166.6, 166.2, 165.9, 133.6, 133.5, 133.4, 133.4,  130.0, 129.9, 129.9, 129.8, 129.5, 129.4, 128.6, 128.6, 128.5, 117.8, 95.9, 71.1, 68.9, 68.9,  68.3, 68.1, 63.5

[0129] Step 2: Thioacylation of C4‐hydroxyl group for the subsequent Barton‐ McCombie deoxygenation

[0130] 4a (23.91 g) was dissolved in dry THF (224 mL, 0.2 M) in a flame dried flask  under argon. 1,1’‐thiocarbonyldiimidazole (16.00 g) was added to the solution and the  mixture was stirred at 65 °C with a reflux condenser for 3.5h. The solvent iwas evaporated  under reduced pressure and the resulting crude was dissolved in DCM and washed in  triplicate with 5% HCl. The organic phase was washed again with saturated aq. NaCl  solution, dried with Na2SO4 and evaporated under reduced pressure to yield the pure  product, a light green‐white solid.

[0131] 1H NMR (500 MHz, CDCl3): δ 8.50 (s, 1H), 7.99 (ddd, J = 9.4, 8.3, 1.3 Hz, 4H),  7.77 (dd, J = 8.3, 1.2 Hz, 2H), 7.72 (s, 1H), 7.57 (tt, J = 7.4, 1.3 Hz, 1H), 7.53 (tt, J = 7.4, 1.2 Hz,   38  LEGAL_1:87555556.1   1H), 7.48 (tt, J = 7.4, 1.3 Hz, 1H), 7.43 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 7.39 (t, J = 8.2 Hz, 1H), 7.33 – 7.28  (m, 2H), 7.17 (s, 1H), 6.63 (dd, J = 3.4, 1.2 Hz, 1H), 6.06 (dd, J = 10.8, 3.4 Hz, 1H), 5.87 (dddd,  J = 17.2, 10.4, 6.0, 5.3 Hz, 1H), 5.62 (dd, J = 10.8, 3.7 Hz, 1H), 5.47 (d, J = 3.6 Hz, 1H), 5.31  (dq, J = 17.2, 1.6 Hz, 1H), 5.18 (dq, J = 10.4, 1.3 Hz, 1H), 4.77 – 4.71 (m, 1H), 4.57 (dd, J =  11.5, 6.4 Hz, 1H), 4.39 (dd, J = 11.5, 6.7 Hz, 1H), 4.30 (ddt, J = 13.0, 5.3, 1.4 Hz, 1H), 4.13  (ddt, J = 13.0, 6.1, 1.4 Hz, 1H)

[0132] 13C NMR (101 MHz, CDCl3): δ 183.7, 166.0, 166.0, 165.7, 137.6, 133.7, 133.7,  133.5, 133.1, 131.6, 130.0, 129.9, 129.8, 129.4, 129.1, 128.8, 128.6, 128.6, 118.5, 117.9,  95.9, 77.7, 69.4, 69.1, 68.3, 66.9, 62.0

[0133] Step 3: Barton‐McCombie deoxygenation reaction with  tris(trimethylsilyl)silane

[0134] 4b (12.30 g) was dissolved in dry toluene (260 mL, 74.6 mM) in a flame dried  flask under argon. Tris(trimethylsilyl)silane (8.81 mL) was added to the solution followed by  AIBN (0.629 g). The reaction was stirred at 70 °C with a reflux condenser for 6h. The solvent  was evaporated under reduced pressure to give the crude product. The crude product was  purified by flash column chromatography using a gradient of 10‐ 25% EtOAc / Hexanes as  eluent to isolate the product as an off‐white solid.

[0135] 1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 8.11 – 8.05 (m, 2H), 8.05 – 7.99 (m, 2H), 7.99 –  7.93 (m, 2H), 7.62 – 7.55 (m, 1H), 7.55 – 7.43 (m, 4H), 7.43 – 7.33 (m, 4H), 5.95 – 5.74 (m,  2H), 5.38 – 5.24 (m, 3H), 5.13 (dq, J = 10.4, 1.4 Hz, 1H), 4.50 – 4.37 (m, 3H), 4.26 (ddt, J =  13.2, 5.1, 1.5 Hz, 1H), 4.06 (ddt, J = 13.2, 5.9, 1.4 Hz, 1H), 2.54 – 2.43 (m, 1H), 1.99 – 1.81 (m,  1H)   39  LEGAL_1:87555556.1

[0136] 13C NMR (101 MHz, CDCl3): δ 166.4, 166.2, 166.0, 133.7, 133.4, 133.3, 133.3,  130.0, 129.9, 129.8, 129.8, 129.8, 129.6, 128.6, 128.5, 128.5, 117.7, 96.2, 72.5, 68.7, 68.7,  66.2, 65.7, 33.3

[0137] Step 4: Allyl group removal from anomeric hydroxyl group

[0138] 4c (8.38 g) was dissolved in a mixture of MeOH:DCM (162 mL, 3:1) at a  concentration of 0.1 M. A 0.15 M solution of PdCl2 (0.432 g) in MeOH (16.2 mL) was added  dropwise to the reaction vessel. The mixture was stirred at 40 °C with a reflux condenser for  3h. The reaction was quenched by the dropwise addition of triethylamine (3.3 mL). The  solvent was evaporated under reduced pressure and the crude was purified by flash column  chromatography using a gradient of 20% EtOAc / Hexanes as the eluent to isolate the product  as a white solid.

[0139] 1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 8.15 – 8.05 (m, 2 aryl‐Hα + 2 aryl‐Hβ), 8.05 –  7.93 (m, 4 aryl‐Hα + 4 aryl‐Hβ), 7.64 – 7.55 (m, aryl‐Hα + aryl‐Hβ), 7.55 – 7.42 (m, 4 aryl‐Hα +  4 aryl‐Hβ), 7.42 – 7.33 (m, 4 aryl‐Hα + 4 aryl‐Hβ), 5.91 – 5.80 (m, H‐3α), 5.69 (t, J = 3.6 Hz, H‐ 1α), 5.58 – 5.47 (m, H‐3β), 5.32 (ddd, J = 10.2, 3.6, 1.3 Hz, H‐2α), 5.24 (dd, J = 9.8, 7.9 Hz, H‐ 2β), 4.91 (t, J = 8.2 Hz, H‐1β), 4.69 – 4.57 (m, H‐5α), 4.51 – 4.47 (m, 2H‐6β), 4.44 (d, J = 4.7  Hz, 2H‐6α), 4.16 – 4.06 (m, H‐5β), 3.76 (d, J = 8.5 Hz, OHβ), 3.04 (dd, J = 3.6, 1.3 Hz, OHα),  2.49 (ddd, J = 12.4, 5.2, 2.2 Hz, H‐4eqα), 2.54 – 2.41 (m, H‐4eqβ) 1.93 (q, J = 12.0 Hz, H‐ 4axα), 1.90 (q, J = 11.9 Hz, H‐4axβ)

[0140] 13C NMR (76 MHz, CDCl3): δ 166.5, 166.2, 166.1, 133.5, 133.4, 133.3, 130.0,  129.9, 129.8, 129.5, 128.6, 128.5, 91.5, 72.9, 68.2, 66.2, 65.8, 33.4   40  LEGAL_1:87555556.1

[0141] Step 5: Conversion to a lactone through Albright‐Goldman oxidation

[0142] 4d (5.66 g) was dissolved in dry DMSO (30 mL, 0.4 M) in a flame dried flask  under argon. Acetic anhydride (19.1 mL) was added to the solution, and the mixture was  stirred at 80 °C with a reflux condenser for 30 min. Water was added to the reaction mixture  (0.75x the solvent volume) and the solution obtained was extracted five times with DCM.  The organic layer was dried over Na2SO4, and the solvent was evaporated under reduced  pressure. The crude was purified by flash column chromatography using a gradient of 20%  EtOAc / Hexanes as the eluent to isolate the product as a white solid.

[0143] 1H NMR (500 MHz, CDCl3): δ 8.10 – 8.03 (m, 4H), 8.00 – 7.96 (m, 2H), 7.62 –  7.54 (m, 3H), 7.49 – 7.45 (m, 2H), 7.44 – 7.39 (m, 4H), 5.81 (ddd, J = 11.8, 9.6, 4.7 Hz, 1H),  5.65 (d, J = 9.7 Hz, 1H), 5.01 – 4.93 (m, 1H), 4.63 – 4.56 (m, 2H), 2.74 (ddd, J = 13.6, 4.7, 2.7  Hz, 1H), 2.28 (dt, J = 13.6, 11.9 Hz, 1H)

[0144] 13C NMR (126 MHz, CDCl3): δ 166.2, 166.1, 165.8, 165.6, 133.9, 133.8, 133.6,  130.2, 130.0, 129.9, 129.3, 129.0, 128.7, 128.7, 128.6, 128.6, 74.5, 71.8, 69.4, 65.1, 31.2

[0145] Steps. 6 and 7: Final deprotection and addition of 2‐fluoroaniline  OHUp to 70%

[0146] 4e (5.68 g) was dissolved in DCM (30 mL, 0.4 M) in a flame dried flask under  argon. DMAP (0.147 g) was added to the solution, followed by the dropwise addition of 2‐ fluoroaniline (3.5 mLand the mixture was stirred at room temperature for 5h. The solvent  was evaporated under reduced pressure. The crude was purified by flash column   41  LEGAL_1:87555556.1   chromatography using a gradient of 10 / 25% EtOAc in Hexanes as the eluent to isolate the  product as a white solid.

[0147] 4f (4.78 g) is dissolved in MeOH:H2O:Et3N (410 mL, 5:2:1:, 0.01 M) in a flask  and the mixture was stirred at room temperature  for 3h. The volatiles were evaporated  under reduced pressure. The crude was purified by flash column chromatography using a  gradient of 5% MeOH in DCM as the eluent to isolate the product as a white solid. Further  purification by overnight EtOH recrystallization, followed by filtration, Hexanes wash and  room temperature vacuum dried on the Büchner flask for 4h afforded over 99% purity of 2.

[0148] 1H NMR (600 MHz, D2O): δ 7.56 (t, J = 7.3 Hz, 1H), 7.29 (t, J = 7.1 Hz, 1H), 7.22  (q, J = 8.3 Hz, 2H), 4.24 (q, J = 4.2 Hz, 2H), 3.88 (q, J = 6.6 Hz, 1H), 3.60 (ddd, J = 11.7, 4.0, 1.7  Hz, 1H), 3.55 – 3.43 (m, 1H), 1.85 – 1.73 (m, 1H), 1.60 (ddd, J = 14.4, 9.8, 2.4 Hz, 1H)

[0149] 13C NMR (151 MHz, D2O): δ 174.2, 155.60 (d, J = 246.5 Hz), 128.20 (d, J = 7.9  Hz), 126.2, 124.65 (d, J = 3.8 Hz), 123.30 (d, J = 12.2 Hz), 116.00 (d, J = 19.5 Hz), 74.9, 68.6,  68.4, 65.9, 36.0.

[0150] EXAMPLE 3: Alternative C4 Deoxy 2FA Synthesis

[0151] Step 1 and 2: Synthesis of unsaturated ester 2

[0152] Dess‐Martin periodinane (2.18 g, 5.13 mmol, 1.5 equiv) was dissolved in DCM  (25 mL, 0.14 M) and (4S)‐4‐(2‐hydroxyethyl)‐2,2‐dimethyl‐1,3‐dioxolane (0.487 mL, 3.42  mmol, 1 equiv) dissolved in DCM (2.5 mL) was added dropwise to the stirring solution. After  2h at room temperature, the reaction was quenched by a 0.5M Na2S2O3 solution (25 mL)   42  LEGAL_1:87555556.1   then sat. NaHCO3 solution (50 mL) and stirred until clear. The mixture was diluted with DCM  (50 mL) and water (25 mL). The aqueous layer was further extracted with DCM, dried over  MgSO4 and the volatiles were carefully removed under reduced pressure (Caution, volatile  product: 40C bath, max 300 mbar pressure). Redissolve aldehyde oil in Hexanes, filter out  excess DMP byproduct, remove solvent under reduced pressure. The aldehyde was used  directly without further purification.

[0153] 1H NMR (600 MHz, CDCl3): δ 9.81 (t, J = 1.5 Hz, 1H), 4.53 (p, J = 6.3 Hz, 1H),  4.19 (dd, J = 8.3, 6.1 Hz, 1H), 3.59 (dd, J = 8.3, 6.7 Hz, 1H), 2.84 (ddd, J = 17.2, 6.6, 1.8 Hz,  1H), 2.65 (ddd, J = 17.2, 6.1, 1.3 Hz, 1H), 1.42 (s, 3H), 1.37 (s, 3H).

[0154] 13C NMR (151 MHz, CDCl3): δ 200.02, 109.10, 70.56, 68.99, 47.71, 26.69,  25.36.

[0155] Crude aldehyde (3.42 mmol, 1 equiv) is dissolved in THF (4.9 mL, 0.7 M) and  ethyl (triphenylphosphoranylidene)acetate (1.19g, 3.42 mmol, 1 equiv.) was added to the  stirring solution portion wise. The reaction was purged under inert atmosphere and the  solution was stirred at room temperature for 16 h. The volatiles were removed under  reduced pressure and the oily residue was purified by flash column chromatography (5%  EtOAc in Pet. Ether) via. Celite dry loading, affording unsaturated ester 2 (280 mg, 38% over  2 steps)

[0156] 1H NMR (600 MHz, CDCl3): δ 6.84 (dt, J = 15.7, 7.1 Hz, 1H), 5.82 (d, J = 15.7  Hz, 1H), 4.15 – 4.12 (m, 1H), 4.09 (q, J = 7.1 Hz, 2H), 3.97 (dd, J = 8.2, 6.0 Hz, 1H), 3.49 (dd, J  = 8.2, 6.7 Hz, 1H), 2.42 (dtd, J = 15.1, 6.8, 1.6 Hz, 1H), 2.35 (dddd, J = 14.8, 7.3, 5.8, 1.6 Hz,  1H), 1.33 (s, 3H), 1.26 (s, 3H), 1.19 (t, J = 7.2 Hz, 3H).

[0157] 13C NMR (151 MHz, CDCl3): δ 166.0, 143.7, 123.8, 109.2, 74.2, 68.8, 60.2,  36.4, 26.8, 25.5, 14.2.

[0158] Step 3: Synthesis of dihydroxylated product 3   43  LEGAL_1:87555556.1

[0159] AD‐mix‐α (1.82 g, 1.4g / mmol) and MeSO2NH2 (124 mg, 1.3 mmol, 1 equiv) is  dissolve in tBuOH:H2O (15.5 mL:15.5 mL, 0.082 M, 1:1) and stirred at 0°C for 5 mins. The  α,β‐unsaturated ester 2 (280 mg, 1.3 mmol, 1 equiv) was dissolved in minimal tBuOH and  added to the solution and stirred at 4°C for 20h. The reaction was quenched by the addition  of sodium sulfite (1.17 g) and stirred at room temperature for 30 mins. The mixture was  extracted with EtOAc (30 mL x 2), the combined organic fractions washed with 0.5M NaOH  (20 mL), brine (20 mL), dried over MgSO4 and the volatiles were removed under reduced  pressure. The residue was purified by flash column chromatography to afford  dihydroxylated product 3 (110 mg, 35%)

[0160] 1H NMR (600 MHz, CDCl3): δ 4.31 (dddd, J = 8.2, 7.3, 6.0, 4.1 Hz, 1H), 4.28 –  4.21 (m, 2H), 4.15 – 4.09 (m, 1H), 4.09 – 4.03 (m, 2H), 3.55 (dd, J = 8.1, 7.3 Hz, 1H), 3.39 (d, J  = 6.0 Hz, 1H), 2.74 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 1.88 (ddd, J = 14.0, 9.7, 4.1 Hz, 1H), 1.76 (ddd, J = 14.3,  8.3, 3.4 Hz, 1H), 1.38 (s, 3H), 1.32 (s, 3H), 1.28 (t, J = 7.2 Hz, 3H).

[0161] 13C NMR (151 MHz, CDCl3): δ 173.2, 109.0, 74.0, 73.3, 69.9, 69.6, 62.1, 37.5,  27.0, 25.7, 14.2.

[0162] Step 4 and 5: Synthesis of C4 Deoxy 2FA

[0163] Diol 3 (100 mg, 0.403 mmol, 1 equiv) was dissolved in acetonitrile (5 mL,  0.08M). H2O (0.20 mL) and TFA (0.70 mL) were added dropwise and the mixture was stirred  at room temperature for 2h. The volatiles were removed under air to afford a crude residue  which was used without purification.   44  LEGAL_1:87555556.1

[0164] The residue was dissolved in AcOH (0.768 mL, 0.56 M) and 2‐Fluoroaniline  (0.125 mL, 1.3 mmol, 3 equiv.) was added dropwise. The solution was heated to 120 °C for  2h. The solvent was removed under reduced pressure and the residue was purified by flash  column chromatography (5‐10% MeOH in DCM) to afford C4 Deoxy 2FA 1.

[0165] 1H NMR (600 MHz, D2O): δ 7.56 (t, J = 7.3 Hz, 1H), 7.29 (t, J = 7.1 Hz, 1H), 7.22  (q, J = 8.3 Hz, 2H), 4.24 (q, J = 4.2 Hz, 2H), 3.88 (q, J = 6.6 Hz, 1H), 3.60 (ddd, J = 11.7, 4.0, 1.7  Hz, 1H), 3.55 – 3.43 (m, 1H), 1.85 – 1.73 (m, 1H), 1.60 (ddd, J = 14.4, 9.8, 2.4 Hz, 1H).

[0166] EXAMPLE 4: Synthesis of C4,C5 Deoxy IRI Compound

[0167] Step 1 and 2: Synthesis of α,β‐unsaturated ester 2  4-  4‐Benzyloxy‐1‐butanol (1g, 5.55 mmol, 1 eq.) was added to a stirring solution of DCM (14  mL, 0.4 M), Celite™ (4.1 g) and pyridinium chlorochromate (1.20 g, 5.55 mmol, 1 eq.). The  solution was stirred at room temperature under inert atmosphere for 4h and the mixture  was passed through a short silica plug and the solution was directly added to a stirring  solution of ethyl (triphenylphosphoranylidene)acetate (1.9 g, 5.55 mmol, 1 eq.) in DCM (14  mL, 0.4 M). The mixture was stirred at room temperature overnight and the volatiles were  removed under reduced pressure. The residue was purified by flash column  chromatography (5% EtOAc in Hexanes), to of α,β‐unsaturated ester 2 (2.54 g, 46% over two  steps).   45  LEGAL_1:87555556.1  1H NMR (600 MHz, CDCl3): δ 7.36 – 7.30 (m, 4H), 7.26 (ddd, J = 5.6, 4.3, 2.8 Hz, 1H), 6.97 (dt,  J = 15.7, 6.9 Hz, 1H), 5.87 – 5.78 (m, 1H), 4.48 (d, J = 1.5 Hz, 2H), 4.17 (qd, J = 7.0, 0.8 Hz, 2H),  3.47 (t, J = 6.3 Hz, 2H), 2.29 (qd, J = 7.1, 1.6 Hz, 2H), 1.76 (dq, J = 7.7, 6.3 Hz, 2H), 1.27 (td, J =  7.1, 0.8 Hz, 3H).

[0168] 13C NMR (101 MHz, CDCl3): δ 166.4, 148.4, 138.3, 128.2, 127.5, 127.4, 121.6,  72.8, 69.1, 60.0, 28.8, 28.1, 14.2.

[0169] Step 3: Synthesis of diol 3

[0170] AD‐mix‐α (3.6 g, 1.4g / mmol starting material) and MeSO2NH2 (244 mg, 1 eq.)  was dissolved in tBuOH:H2O (15 mL:15 mL, 1:1, 0.082 M) and stirred at 0°C for 5 mins. The  α,β‐unsaturated ester 2 (630 mg, 2.57 mmol, 1 eq.) was dissolved in minimal tBuOH and  added to the solution and stirred for 20h at 4°C. The reaction was quenched by the addition  of sodium sulfite (1.17 g) and stirred at room temperature for 30 mins. The mixture was  extracted with EtOAc (30 mL x 2), the combined organic fractions washed with 0.5 M NaOH  (20 mL), brine (20 mL), dried over MgSO4 and the volatiles were removed under reduced  pressure. The residue was purified by flash column chromatography (20‐40% EtOAc in  Hexanes) to afford diol 3 (420 mg, 58%).

[0171] 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 7.36 – 7.23 (m, 5H), 4.50 (s, 2H), 4.24 (qd, J =  7.2, 1.3 Hz, 2H), 4.05 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 3.90 (td, J = 6.4, 2.2 Hz, 1H), 3.54 – 3.47 (m, 2H),  1.85 – 1.66 (m, 4H), 1.27 (t, J = 7.1 Hz, 3H).

[0172] 13C NMR (101 MHz, CDCl3): δ 173.5, 138.2, 128.4, 127.7, 127.6, 73.6, 73.0,  72.4, 70.2, 61.8, 30.8, 26.2, 14.2.

[0173] Step 4: Synthesis of acetonide 4   46  LEGAL_1:87555556.1

[0174] Diol 3 (510 mg, 1.83 mmol, 1 equiv) was dissolved in acetone (9.1 mL, 0.2 M).  2,2‐Dimethoxypropane (0.448 mL, 3.66 mmol, 2 equiv) was added dropwise followed by the  addition of p‐Toluenesulfonic acid (32 mg, 0.183 mmol, 0.1 equiv). The solution was stirred  at room temperature for 3h and the volatiles were removed under reduced pressure. The  residue was purified by flash column chromatography (5% EtOAc in Hexanes) to afford  acetonide 4 as a white powder (430 mg, 73%).

[0175] 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 7.37 – 7.21 (m, 5H), 4.48 (s, 2H), 4.20 (qd, J =  7.1, 4.7 Hz, 2H), 4.15 – 4.07 (m, 2H), 3.50 (tt, J = 5.8, 3.1 Hz, 2H), 2.00 – 1.64 (m, 3H), 1.44 (s,  3H), 1.41 (s, 3H), 1.25 (dd, J = 7.5, 6.6 Hz, 3H).

[0176] 13C NMR (101 MHz, CDCl3): δ 170.9, 138.6, 128.4, 127.6, 127.6, 110.8, 79.1,  79.0, 72.9, 69.9, 61.3, 30.3, 27.2, 25.9, 25.7, 14.2.

[0177] Step 5:  Synthesis of carboxylic acid 5

[0178] Acetonide 4 (430 mg, 1.34 mmol, 1 equiv) was dissolved in ethanol:H2O (3.4  mL:3.4 mL, 0.2 M, 1:1) followed by the addition of LiOH.H2O (112 mg, 2.68 mmol, 2 equiv).  The solution was stirred at room temperature for 1.5 h. The solution was quenched with 1M  HCl until the solution turned cloudy and the mixture extracted with EtOAc (3 x 50 mL). The  combined organic fractions were washed with brine, dried over MgSO4 and the volatiles  were removed under reduced pressure to afford carboxylic acid 5, used without further  purification.   47  LEGAL_1:87555556.1

[0179] 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 10.99 (s, 1H), 7.37 – 7.24 (m, 5H), 4.52 (s, 2H),  4.20 – 4.12 (m, 2H), 3.52 (dp, J = 6.3, 3.0 Hz, 2H), 2.01 – 1.70 (m, 4H), 1.47 (s, 3H), 1.43 (s,  3H).

[0180] 13C NMR (101 MHz, CDCl3): δ 175.4, 138.3, 128.5, 127.8, 127.7, 111.3, 79.0,  78.6, 72.9, 69.8, 30.3, 27.2, 25.8, 25.7.

[0181] Step 6: Synthesis of amide 6

[0182] Carboxylic acid 5 (284 mg, 0.966 mmol, 1 equiv) was dissolved in DCM (2.4  mL, 0.4 M) where EDC.HCl (277 mg, 1.44 mmol, 1.5 equiv) and DMAP (12 mg, 0.0966 mmol,  0.1 equiv) were added to the stirring solution. The solution was stirred at room temperature  for 5 mins, followed by the dropwise addition of 2‐Fluoroaniline (0.094 mL, 0.966 mmol, 1  equiv). The solution was stirred at room temperature overnight and quenched with 1M HCl  solution (10 mL). The mixture was extracted with DCM (3 x 20 mL) and the combined  organic fractions were washed with brine solution (25 mL). The organic fraction was dried  over MgSO4 and removed under reduced pressure. The residue was purified by dry loaded  flash column chromatography (5‐25% EtOAc in Hexanes), affording protected amide 6 (480  mg, 78%).

[0183] 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 8.70 (s, 1H), 8.34 (td, J = 8.0, 1.7 Hz, 1H), 7.39 –  7.24 (m, 5H), 7.19 – 7.03 (m, 3H), 4.51 (s, 2H), 4.15 (d, J = 2.1 Hz, 2H), 3.54 (t, J = 6.0 Hz, 1H),  2.12 – 1.98 (m, 1H), 1.94 – 1.76 (m, 3H), 1.51 (s, 3H), 1.48 (s, 3H).

[0184] Step 7 and 8: Synthesis of C4,C5 Deoxy 1   48  LEGAL_1:87555556.1

[0185] Protected amide 6 (82 mg, 0.21 mmol, 1 equiv) was dissolved in MeOH (1.7  mL, 0.127 M) and heated to 65°C while stirring. NH4HCO2 (66 mg, 1.05 mmol, 5 equiv) and  10% Pd / C (105 mg, 0.5 mg / mmol starting material) were added and the suspension was  stirred at 65°C for 4h, with the addition of 5 more equivalents of NH4HCO2 at the halfway  point. The mixture was cooled to room temperature, filtered over celite with MeOH  washing and the solvent was removed under reduced pressure. The residue was used  without further purification.

[0186] To the residue was added DCM (0.525 mL, 0.4 M) followed by the dropwise  addition of TFA (0.525 mL, 0.4 M). The mixture was equipped with a balloon and stirred at  room temperature for 1h. The volatiles were removed with air and the residue was purified  by dry loaded flash column chromatography (50‐100% EtOAc in DCM) to afford C4,C5 Deoxy  compound 1 (25 mg, 46% over 2 steps).

[0187] 1H NMR (400 MHz, D2O): δ 7.43 (td, J = 7.8, 1.6 Hz, 1H), 7.23 – 7.13 (m, 1H),  7.13 – 7.05 (m, 2H), 4.13 (d, J = 2.5 Hz, 1H), 3.89 (td, J = 6.4, 3.0 Hz, 1H), 3.54 – 3.44 (m, 2H),  1.63 – 1.42 (m, 4H).

[0188] 13C NMR (151 MHz, D2O): δ 174.44, 155.61 (d, J = 246.5 Hz), 128.20 (d, J = 7.9  Hz), 126.24, 124.65 (d, J = 3.7 Hz), 123.31 (d, J = 12.2 Hz), 116.00 (d, J = 19.6 Hz), 74.08,  71.91, 61.52, 28.91, 27.84.

[0189] EXAMPLE 5: Ice Recrystallization Studies

[0190] A splat cooling assay was performed to demonstrate the inhibitory activity of  one of the IRI compounds of the present application, C4‐Deoxy‐2FA as defined above,  against ice recrystallization. To perform the assay it was necessary to first confirm solubility  of C4‐Deoxy‐2FA in a buffer, which, in this study was phosphate buffered saline (PBS).   49  LEGAL_1:87555556.1

[0191] Solubility

[0192] C4 Deoxy 2FA was solubilized at its maximum concentration in a PBS solution  during a splat cooling assay to determine its inhibitory activity against ice recrystallization.  For comparison, the previously known IRI, 2FA, was also solubilized at its maximum  concentration when performing the same assay.

[0193] Methodology:

[0194] In order to dissolve C4 Deoxy 2FA in PBS solution, a stock solution was  prepared by adding a sufficient amount of the compound in PBS buffer to obtain a mixture  having a concentration of 500 mM, and the solution was vortexed to achieve  supersaturation. This stock mixture was used to prepare mixtures having lower  concentrations through serial dilution, with each solution being further vortexed until a  visual inspection indicated that the compound was fully solubilized at its maximal  concentration. This procedure was repeated for 2FA.

[0195] Results:

[0196] C4‐Deoxy‐2FA was solubilized in PBS buffer solution at a concentration of 50  mM for the splat cooling assay, which corresponds with the maximum solubility of C4 Deoxy  2FA in PBS. The maximum solubility obtainable for 2FA in PBS was about 5 times lower than  that obtainable for C4‐Deoxy‐2FA.

[0197] Conclusion:

[0198] C4‐Deoxy‐2FA was fully solubilized in PBS at a concentration of 50 mM, which  is significantly higher than the solubility of 2FA in the same PBS solution, which had a  maximum concentration of 12 mM. This means that a higher concentration of C4‐Deoxy‐2FA  will remain in solution, as the temperature of the solution is lowered, than in solutions of  2FA.

[0199] Ice Recrystallization Inhibitory Activity

[0200] This study was performed to demonstrate the ice recrystallization inhibitory  activity of C4‐Deoxy‐2FA, as an example of the IRI compounds of the present application.   50  LEGAL_1:87555556.1   The studies provide an evaluation of the concentration‐dependence of the IC50 in the  presence of the IRI using dose‐response curves. The corresponding IC50 value of the IRI was  then extrapolated from the dose‐response curves using a four‐parameter logistic regression.

[0201] Methodology:

[0202] A splat cooling assay was the initial step in the study to provide the ice  recrystallization activity of C4‐Deoxy‐2FA. The details of the assay used in this study have  been previously published (Abraham S.; Keillor, K.; Capicciotti, C. J.; Perley‐Robertson, G. E.;  Keillor, J. W.; Ben, R. N. Quantitative Analysis of the Efficacy and Potency of Novel Small  Molecule Ice Recrystallization Inhibitors. Cryst. Growth Des. 2015, 15, 5034‐5039) and  shown to be appropriate for providing accurate ice recrystallization activity data.

[0203] Six solutions were initially prepared with a range of concentrations of C4‐ Deoxy‐2FA (1, 5, 7.5, 10, 25, 50 mM) solubilized in PBS. The upper plateau of the curve was  defined at 100 by the control sample, and the lower plateau at 0 by the maximum inhibitor  concentration. The IC50 value and Hill slope for C4‐Deoxy‐2FA were then determined by  nonlinear regression using a 4‐parameter sigmoidal dose‐response fitting equation. The  lower bound was defined with the assay development in terms of what is considered rate =  0; the bottom plateau was not redefined to maximal inhibitor potency. The IC50 value in this  case represents the concentration when 50% of the maximal ice recrystallization inhibition  was achieved.

[0204] Results:

[0205] The IC50 value obtained using this method for C4‐Deoxy‐2FA was about 9.4  mM, which is very similar to the value obtained for 2FA (IC50 = 3.0 mM). Thus, the present  study confirms that C4‐Deoxy‐2FA acts as a potent inhibitor of ice recrystallization (where a  “potent” or “good” inhibitor of ice recrystallization is one that has an IC50 < about 45 mM, or  an IC50 < about 35 mM). The 95% confidence interval for this obtained IC50 value of C4 Deoxy  2FA was 8.8 mM to 10.1 mM.

[0206] The dose response curves for both 2FA and C4 Deoxy 2FA are shown in Figure  1. C4 Deoxy 2FA has an ice recrystallization inhibitory activity that is approximately   51  LEGAL_1:87555556.1   equivalent to that of 2FA. This, in combination with the high solubility in aqueous solutions,  is indicative of the value of the C4 deoxy derivatives of 2FA as improved IRIs.

[0207] EXAMPLE 6: Adsorption, Distribution, Metabolism and Excretion (ADME)  Testing and Pharmacokinetic Studies

[0208] Adsorption, Distribution, Metabolism and Excretion (ADME) testing and  pharmacokinetic studies were performed to assess the characteristics of the IRI compounds  of the present application, as exemplified by C4 Deoxy 2FA. The studies illustrated that C4  Deoxy 2FA is a hydrophilic, low permeability compound, that is not a substrate for efflux  transporters. Metabolite identification studies in mouse and human liver microsomes  revealed that there were 2 metabolites in mouse liver samples and 1 metabolite in human  liver samples. Moreover, upon IV and PO administration of C4 Deoxy 2FA to mice to identify  the half‐life, no changes in clinical signs or behaviour was observed. These results illustrate  that the IRI compounds of the present application, as exemplified by C4 Deoxy 2FA, are  suitable to use for clinical purposes.

[0209] Log D Determination

[0210] This study was performed to confirm the hydrophilic nature of the IRI  compounds of the present application. LogD is a distribution coefficient used to measure  the lipophilicity of ionizable compounds, where the partition is a function of the pH.

[0211] Experimental Procedure

[0212] Aliquots (10 µL) of 1 mM working solutions, in DMSO, of each of C4 Deoxy  2FA and S‐V1 (comparison compound) and a control compound, nicardipine, were placed  into a 96‐well deep well plate (Log D plate). Aliquots (500 µL) of phosphate buffer, pH 7.4,  saturated with octanol, and 500 µL octanol, saturated with phosphate buffer, pH 7.4, were  then added to each of the wells containing the working solutions and shaken at 2,000 rpm,  25°C, for 2 hours using the Eppendorf Thermomixer Comfort™ plate shaker. The samples  were centrifuged to separate the layers of phosphate buffer and octanol. The layers were  then analyzed by UPLC‐MS / MS. All incubations were performed in duplicate.   52  LEGAL_1:87555556.1

[0213] Bioanalytical Method

[0214] UPLC‐MS / MS was employed for analysis of the separated layers using the  following conditions.

[0215] LC conditions:    Instrument:  Shimadzu LC‐30 AD  Column:  Waters XSelect™ HSS T3, 2.5 μm (2.1 × 50 mm)  Column temperature: 40°C  Injection volume: 3 μL for C4 Deoxy 2FA and 0.5 µL for S‐V1   Mobile phase:   A: 0.1% formic acid in water         B: 0.1% formic acid in acetonitrile  Elution gradient:  Time (min)  A (%)  B (%)  Elution rate (mL / min)  0  95  5  0.6  0.6  0  100  0.6  0.9  0  100  0.6  1.0  95  5  0.6  1.4  95  5  0.6

[0216] Mass conditions:  Instrument:   Triple Quad 5500 (AB Sciex)  Ion source:  Turbo spray  Ionization model: ESI  Scan type: MRM  Ionisation mode: Positive

[0217] Mass Conditions:  Test article  Q1 (m / z)  Q3 (m / z)  DP (v)  EP (v)  CE (v)  CXP (v)  C4 Deoxy 2FA  274.169  112.061  60  10  25  19  S‐V1  300.217  105.094  70  10  25  19   53  LEGAL_1:87555556.1   Tolbutamide (IS)  271.2  155.1  80  10  15  19

[0218] Data Analysis

[0219] All calculations were carried out using Microsoft Excel. Peak areas were  determined from extracted ion chromatograms.

[0220] Log D values of the control compound and the test compounds were  calculated using the following equation:  ^^ ^^ ^^ ^^ ^^ ^^ ^^ ^^ ^^ ^^where DF is the dilution factor, and AREA Ratio is peak area of sample  /  peak area of  internal standard.

[0221] Acceptance Criteria for Control Compounds

[0222] The acceptance criteria of Log D values for control compound nicardipine was  within 4.18 – 4.88.

[0223] Results

[0224] The Log D value for control compound nicardipine in 1‐octanol / PBS at pH 7.4  was 4.59. The result was within the historical range. Therefore, the acceptance criteria were  met, and the assay results for C4 Deoxy 2FA and S‐V1 were acceptable.

[0225] The Log D values of C4 Deoxy 2FA and S‐V1 in 1‐octanol / PBS at pH 7.4 are  summarised in Table 1.  Table 1: LogD Values for Control and Test Compounds in 1‐octanol / PBS at pH 7.4  Compounds  Replicate  Log D    Replicate 1  4.59  Nicardipine (control)  Replicate 2  4.59    Mean  4.59    Replicate 1  ‐0.451  C4 Deoxy 2FA  Replicate 2  ‐0.449    Mean  ‐0.450   54  LEGAL_1:87555556.1     Replicate 1  ‐0.460  S‐V1  Replicate 2  ‐0.509    Mean  ‐0.485

[0226] Conclusions

[0227] The Log D value for C4 Deoxy 2FA in 1‐octanol / PBS at pH 7.4 was ‐0.450 and  the Log D value for S‐VI in 1‐octanol / PBS at pH 7.4 was ‐0.485. The results indicated that C4  Deoxy 2FA and S‐V1 were hydrophilic compounds.

[0228] Intestinal Mucosal Permeability

[0229] The objective of this study was to evaluate the bidirectional permeability and  absorption mechanism of C4 Deoxy 2FA and S‐V1 using Caco‐2 cell monolayers.

[0230] Materials

[0231] The Caco‐2 cells (passage 49) used in this study were obtained from American  Type Culture Collection (ATCC® Number HTB‐37).

[0232] All the reagents in this study were of at least the standard of analytical  laboratory reagent grade and are listed below:  Item  Source  Lot No.  Acetonitrile  Fisher Chemical  197285  Alprazolam  Cerilliant  FE06102008  Caffeine  ChromaDex.Inc  00003027‐300  Cimetidine  Tianjin Yifang Technology Co., Ltd.  100158  DMEM  Corning  20319014  DMSO  Solarbio  1209M031  Erythromycin  Tianjin Yifang Technology Co., Ltd.  R2004  FBS  Corning  35081003  Formic acid  DIKMA  4633515  H2O  Prepared by Water purification system  ‐  HBSS  Gibco  2085528  HEPES  Solarbio  625V023   55  LEGAL_1:87555556.1   Item  Source  Lot No.  Lucifer yellow  Sigma  MKCD2184  Metoprolol  Tianjin Yifang Technology Co., Ltd.  ‐  NaHCO3  Shanghai Lianshi Chemical Reagent Co., Ltd.  180302  Non‐essential amino  Gibco  2163626  acids  Penicillin /   Solarbio  20190617  Streptomycin  Tolbutamide  Sigma  SLBV1577  Trypsin / EDTA  Gibco  20191226

[0233] Experimental Procedure

[0234] Incubations with Caco‐2 cell monolayers were performed in duplicate.  Transport buffer solution (HBSS, 25 mM HEPES, pH 7.4) containing either a test compound,  C4 Deoxy 2FA (10 µM) and S‐V1 (10 µM), or a control compound, metoprolol (10 μM),  erythromycin (10 μM) or cimetidine (10 μM), was added to appropriate donor wells of the  apical or basolateral plate. The transport buffer with DMSO was added to appropriate wells  of receiver wells. Following incubation at 37°C for 2 hours, the cell plates were removed and  8 μL samples were transferred from both apical and basolateral sides into new 96‐well  plates with 72 μL transport buffer. Subsequently, 240 μL of acetonitrile containing internal  standard (100 nM alprazolam, 200 nM caffeine and 100 nM tolbutamide) was added to all  samples to precipitate protein prior to analysis by UPLC‐MS / MS to determine the peak area  of C4 Deoxy 2FA, S‐V1 and control compounds. The peak area ratio was used to calculate  the apparent permeability (Papp) from apical to basolateral direction and basolateral to  apical direction of the cell monolayers and the efflux ratio. Lucifer yellow was used as a  marker to confirm the integrity of the cell monolayers after 2 hours incubation.

[0235] Bioanalytical Method

[0236] UPLC‐MS / MS was used for sample analysis.

[0237] LC conditions:     56  LEGAL_1:87555556.1   Instrument:  Shimadzu Nexera Series Pump LC‐40D XS  Column:  Waters XSelect™ HSS T3, 2.5 μm (2.1 × 50 mm)  Column temperature: 40°C  Injection volume: 10 μL   Mobile phase:   A: 0.1% formic acid in water         B: 0.1% formic acid in acetonitrile  Elution gradient:  Time (min)  A (%)  B (%)  Elution rate (mL / min)  0  95  5  0.65  0.6  0  100  0.65  0.9  0  100  0.65  1.0  95  5  0.65  1.4  95  5  0.65

[0238] Mass conditions:  Instrument:   Triple Quad 4500   Ion source:  Turbo spray  Ionization model: ESI  Scan type: MRM  Ionisation mode: Positive

[0239] Mass conditions:  Test article  Q1 (m / z)  Q3 (m / z)  DP (v)  EP (v)  CE (v)  CXP (v)  C4 Deoxy 2FA  274.17  112.06  60  10  25  6  S‐V1  300.22  105.094  70  10  25  6  Caffeine   (Internal Standard) 195.2  138.1  80  12  27  12    57  LEGAL_1:87555556.1

[0240] Data Analysis

[0241] All calculations were carried out using Microsoft Excel™. Peak areas were  determined from extracted ion chromatograms.

[0242] Apparent permeability (Papp, cm / s × 10‐6) was calculated for drug transport  assays using the following equation:  ^^ ^ ^^ ^^ ^^^^ ^ ^^^^^^^^௩^^where:   − VA is the volume (in mL) in the receiver well (0.3 mL for A^B flux and 0.1  mL for B^A flux)  − Area is the surface area of the membrane (0.143 cm2 for HTS Transwell‐ 96 Well Permeable Supports)  − Time is the total transport time (in seconds)

[0243] Efflux ratio was determined using the following equation:  ^^ ^^ ^^ ^^ ^^ ^^ ^^ ^^ ^^ ^^ ^^ ൌ^^^^^ ^^→^^^^  ^^^ ^^→^^  where:  − Papp (B^A) indicates the apparent permeability coefficient in basolateral to  apical direction  − Papp (A^B) indicates the apparent permeability coefficient in apical to  basolateral direction

[0244] Mass balance (percentage recovery) was determined using the following  equation:  ^^ൌ^ ^^ ^^ ^^ ^^^ ൈ^^^௧^^^,ௗ^^^^ ൈ ^^^  58  LEGAL_1:87555556.1   where:  − VA is the volume (in mL) in the receiver well  − VD is the volume (in mL) in the donor well

[0245] Percentage Lucifer yellow (LY) leakage of monolayer was calculated using the  following equation:  ^^ ^^ ^^ ^^ ^^ ^^ ^^ ^^ ^^ ^^ ^^ ^^ ^^ ^^ ^^ ^^ ^^ ^^ ^^ ^%^ ൌ ^^൬ ^^^^^௩^^ ൈ 0.3^^^^^^^௩^^ ൈ 0.3 ^ ^^ௗ^^^^ ൈ 0.1^ ൈ 100 where:  − Ireceiver is the fluorescence intensity in the receiver well (0.3 mL)  − Idonor is the fluorescence intensity in the donor well (0.1 mL)

[0246] Percentage Lucifer yellow leakage should be less thank 1.5%.

[0247] Criteria for permeability assignment:  − if the Papp(A^B) is less than 1 cm / s × 10‐6, the compound will be considered as low  permeability;  − if the Papp(A^B) is greater than 10 cm / s ×10‐6, the compound will be considered as  high permeability;  − if the Papp(A^B) is greater than 1 cm / s ×10‐6 and less than 10 cm / s ×10‐6, the  compound will be considered as moderately permeability; and  − if the efflux ratio of test article is greater than or equal to 2, the test article will be  considered as substrate of efflux transporter.

[0248] Acceptance Criteria for Control Compounds

[0249] The historical ranges of the control compounds, metoprolol, erythromycin  and cimetidine are listed below.   59  LEGAL_1:87555556.1   Control compound  Papp (A^B) (cm / s × 10‐6)  Metoprolol  18.6 – 29.5  Erythromycin  0.0603 – 0.397  Cimetidine  0.467 – 1.78

[0250] Results

[0251] The Papp(A^B) values for cimetidine, erythromycin and metoprolol incubated  with Caco‐2 cell monolayers were 1.14, 0.100 and 21.6, respectively. These results were  within the respective historical range. Therefore, the acceptance criteria were met, and the  assay results for C4 Deoxy 2FA and S‐V1 were acceptable. The results are shown in Table 2.

[0252] Papp(A^B) values for C4 Deoxy 2FA and S‐V1 at a concentration of 10 µM were  0.770 and 0.253 cm / s × 10‐6 with efflux ratios of 1.05 and 1.36, respectively. Permeability  results for C4 Deoxy 2FA and S‐V1 in Caco‐2 cell monolayers are shown in Table 2.  Table 2: Permeability results for test and control compounds in Caco=2 cell monolayers  (n=2)      Papp (cm / s × 10‐6)  Percentage  Efflux  Compound and Conc.  Replicate  recovery (%)  ratio      A^B  B^A  A^B  B^A    Replicate 1  0.831  0.864  96.5  97.1  1.04  C4 Deoxy 2FA‐10 μM  Replicate 2  0.708  0.754  100  102  1.06    Mean  0.770  0.809  98.3  99.7  1.05    Replicate 1  0.252  0.332  97.6  104  1.32  S‐V1‐10 μM  Replicate 2  0.255  0.358  108  109  1.41    Mean  0.253  0.345  103  106  1.36    Replicate 1  22.3  20.0  105  103  0.898  Metoprolol‐10 μM  Replicate 2  20.9  19.8  99.3  98.8  0.951    Mean  21.6  19.9  102  101  0.924    Replicate 1  0.0950  6.34  90.5  96.4  66.7  Erythromycin‐10 μM  Replicate 2  0.105  6.54  92.2  88.9  62.2    Mean  0.100  6.44  91.4  92.6  64.5    Replicate 1  1.16  5.38  105  97.9  4.65  Cimetidine‐10 μM  Replicate 2  1.13  5.54  103  103  4.91   60  LEGAL_1:87555556.1       Papp (cm / s × 10‐6)  Percentage  Efflux  Compound and Conc.  Replicate  recovery (%)  ratio      A^B  B^A  A^B  B^A    Mean  1.14  5.46  104  101  4.78

[0253] The Lucifer yellow leakage values for C4 Deoxy 2FA and S‐V1 and control  compounds are shown in Table 3.  Table 3: Lucifer yellow leakage values for test compounds and control compounds (n=2)  Compound  Percentage LY leakage (%)  A^B  B^A  C4 Deoxy 2FA (10 μM)  0.102  0.139  0.107  0.120  S‐V1 (10 μM)  0.115  0.125  0.102  0.118  Metoprolol (10 μM)  0.129  0.135  0.104  0.106  Erythromycin (5 μM)  0.162  0.185  0.104  0.109  Cimetidine (10 μM)  0.131  0.156  0.101  0.0971

[0254] Conclusions

[0255] The results of this study demonstrated that C4 Deoxy 2FA and S‐V1 were low  permeability compounds and were not substrates of efflux transporters.

[0256] Metabolite Identification in Mouse and Human Liver Microsomes

[0257] The objective of this study was to identify the potential metabolites of C4  Deoxy 2FA and to predict its possible metabolic pathways in mouse and human liver  microsomes.

[0258] Experiment Procedure

[0259] C4 Deoxy 2FA was incubated in singlicate in mouse or human liver  microsomes (1 mg / mL) suspended in 0.2 M phosphate buffer at pH 7.4. These incubations  were carried out at a final test concentration of 10 µM over a total incubation period of 60  minutes. The concentration of NADPH was 2 mM. Samples were taken at 0, 30 and 60 min  and the reaction was terminated by addition of 400 µL of acetonitrile. The supernatants   61  LEGAL_1:87555556.1   were transferred and placed in the evaporator under steady stream of nitrogen at room  temperature until dry. The dried residues were reconstituted with diluents. The control  compound verapamil was included in the experiment under the same incubation conditions  with the time points taken at 0 min and 60 min. The percentage of verapamil remaining at  60 minutes was used to monitor the metabolic activity of liver microsomes. The samples  were analyzed by UPLC‐MS / MS.

[0260] Bioanalytical Method

[0261] UPLC‐MS / MS was used for sample analysis.

[0262] Study Results

[0263] The percentage remaining for positive control verapamil in mouse and  human liver microsomes at 60 min were 8.86% and 10.33%, respectively, which were all  within the historical range. Therefore, the acceptance criteria were met and assay results for  the C4 Deoxy 2FA were acceptable. The percentage remaining for verapamil in mouse and  human liver microsomes at 60 min is shown in Table 4.  Table 4: Percentage remaining   of   verapamil   in   mouse   and    human   liver microsomes  at 60 min  Species  Percentage remaining (%)  Mouse  8.86  Human  10.33

[0264] The percentage remaining for C4 Deoxy 2FA in mouse and human liver  microsomes at 60 min is shown in Table 5.  Table 5: Percentage remaining of M‐03055 in mouse and human liver microsomes at 60 min  Species  Percentage remaining (%)  Mouse  99.79  Human  95.91

[0265] The metabolite information of C4‐Deoxy‐2FA is shown in Table 6.   62  LEGAL_1:87555556.1        63  LEGAL_1:87555556.1

[0266] Conclusions

[0267] Under the experimental conditions described herein, a total of two  metabolites of C4‐Deoxy‐2FA were detected in mouse and human liver microsomes  samples; both of which were detected in mouse liver microsomes samples and only one of  which was detected in human liver microsomes samples.

[0268] The peak area percentages of parent drug and each metabolite were  determined     by semi‐quantitative estimation using the extracted ion chromatogram peak  areas of all detected drug‐related material in the sample. Metabolites with percentage of  peak area ≥10% are proposed as major metabolites of C4‐Deoxy‐2FA. All metabolites  observed were less than 10% of the drug‐related material in the mouse and human liver  microsomes samples.

[0269] EXAMPLE 7: Structural Attributes of Compounds Affecting IRI Activity

[0270] In this study a modified splat cooling assay was employed to assess IRI  activity of compounds of the present application. Ice crystal images were used together with  IC50 values as a measure of IRI activity.

[0271] N‐(2‐Fluorophenyl)‐d‐gluconamide (2FA) was discovered in 2015 and has  been used successful in cryopreservation of numerous cell types in conjunction with DMSO.  This compound has become a standard for modern IRI development, and has an IC50 of 3  mM.

[0272] N‐(octyl)‐d‐gluconamide (NOG) was discovered in 2012 and is known to be  one of the most potent small molecule carbohydrate IRIs identified, having an IC50 of 0.8  mM. However, cellular applications are severely limited due to extreme solubility limits.

[0273] In considering the present compounds of Formula A, which are IRI  compounds that incorporate features of one or both of 2FA and NOG. This study provides  insight into the structural components are required or beneficial for IRI activity.

[0274] Aryl‐D‐gluconamide was used as a starting point for compounds having a  truncated gluconamide portion. The results are summarized below:   64  LEGAL_1:87555556.1   Compound structure  IC50 (mM) 3    2FA  27    OH OH H N 43  O OH F   47    >60    >60

[0275] The above results demonstrate that the first three derivatives of 2FA have  good IRI activity. However, there is a loss in IRI activity as the gluconamide portion of the  compound is truncated. To further demonstrate whether this decrease in activity is resulting  from the chain length or the loss of hydroxyl groups, deoxy‐derivatives of 2FA were  synthesized and evaluated. The results are summarized below:  Compound structure  IC50 (mM) 3    2FA   65  LEGAL_1:87555556.1   Compound structure  IC50 (mM) 8    C4‐Deoxy‐2FA  27    27    23    25    27    83    >65    N / A    >30     66  LEGAL_1:87555556.1   Compound structure  IC50 (mM) 4    8    11    >10        N / A = not active as an IRI

[0276] The above results suggest that an ‐OH group at the C6 position contributes  significantly to IRI activity. However, the presence of the C6‐OH group is not the sole source  of activity and removal of hydroxyls can provide an order of magnitude increase in solubility,  which is beneficial for use in cryopreservation compositions.

[0277] Further, in considering the lack of IRI activity observed with the last two  compounds in the above table, it appears that both the position of the C6‐OH in space and  also the H‐bond donor functionality is beneficial for IRI activity.

[0278] As noted above, NOG is known to be one of the most potent small molecule  carbohydrate IRIs identified, but it suffers from solubility issues. In view of the finding that  removing hydroxyls from the gluconamide portion of 2FA can improve solubility,  compounds including an n‐octyl with similarly modified gluconamide chains were studied.  The results are summarized below:  Compound structure  IC50 (mM)  OH OH H N OH O OH OH 3  F   2FA   67  LEGAL_1:87555556.1   Compound structure  IC50 (mM)  0.8    NOG  10.2    5.5    12.4    0.76  (LD50 = 1.1 mM)    1.2    3.2    Similar to above  compound

[0279] As illustrated by the data above, removal of all but the terminal OH from the  gluconamide portion of NOG did not have any effect on IRI activity. However, there was an  observed order of magnitude increase in solubility in buffer. The above results further  demonstrate that replacement of the terminal OH group with an alkoxy group can be  tolerated; with good IRI activity being retained.

[0280] The toxicity of the C2, C3, C4, C5‐tetradeoxy NOG derivative was tested in  HepG2 cells using the Resazurin viability assay with 24 hour incubation. This derivative was  found to have low toxicity, with an LD50 of 1.1 mM.   68  LEGAL_1:87555556.1

[0281] Based on the above data showing that NOG derivatives retain IRI activity  while having improved solubility characteristics, compounds comprising alternative N‐alkyl  substituents were studied. The results are summarized below:  Compound structure  IC50 (mM)  LD50 (mM)  3.2  6.1    1.7  4.7    >80      68.5      27.2      13.5      >65      24.8      17.2      >10           69  LEGAL_1:87555556.1   >10

[0282] As illustrated above, inclusion of cyclic and bulky alkyl groups in place of the  n‐octyl group of NOG, allows retention of IRI activity in these compounds.

[0283] In summary, the results of this study demonstrate that a range of derivatives  of 2FA and NOG retain IRI activity. The presence of a C6‐OH group is beneficial to IRI activity  in both the aryl‐gluconamide derivatives and the alkyl‐gluconamide derivatives. However,  selective dihydroxylation is useful to improve solubility in both types of N‐functionalized  gluconamides.

[0284] All publications, patents and patent applications mentioned in this  Specification are indicative of the level of skill of those skilled in the art to which this  invention pertains and are herein incorporated by reference to the same extent as if each  individual publication, patent, or patent applications was specifically and individually  indicated to be incorporated by reference.

[0285] The invention being thus described, it will be obvious that the same may be  varied in many ways. Such variations are not to be regarded as a departure from the spirit  and scope of the invention, and all such modifications as would be obvious to one skilled in  the art are intended to be included within the scope of the following claims.  70  LEGAL_1:87555556.1

Claims

We Claim:

1. A compound of Formula A   where:  B is phenyl; phenyl mono‐ or di‐substituted with C1‐C4‐alkyl, C1‐C4‐alkoxy, ‐NH2, ‐ NR5H, ‐N(R6)2 where each R6 is the same or different, ‐C(O)R7, ‐ COOH, ‐COOR8, ‐CHO  or halogen (e.g., Cl, Br, I or F); or an alkyl;  Ra is H when B is phenyl or substituted phenyl, and H or alkyl (e.g., a C1‐C4 alkyl)  when B is alkyl;  R1, R2, R3 and each R4 are each independently H, ‐OH, ‐OR9, ‐NHR10, ‐[NH2R11]+, or ‐ [NH(R12)2]+ where each R12 is the same or different, wherein at least one of the R1,  R2, R3 and R4 substituents is not OH;   n is an integer from 1 to 7, wherein when n is greater than 1 each R4 is the same or  different; and   each R5 – R12 is independently H, alkyl or aryl.

2. The compound of claim 1, which is compound of Formula I   I  wherein:  each R is independently hydrogen, C1‐C4‐alkyl, C1‐C4‐alkoxy, ‐NH2, ‐NR5H, ‐N(R6)2  where each R6 is the same or different, ‐C(O)R7, ‐ COOH, ‐COOR8, ‐CHO or halogen  (e.g., Cl, Br, I or F).     71  LEGAL_1:87555556.1   3. The compound of claim 2, wherein the compound has the structure of Formula I’        .

4. The compound of claim 1, which is a compound of Formula II  R1R3 II  wherein:  Alk is a C3 – C9 linear or branched alkyl or a C3 – C10 mono‐ or poly‐cyclic alkyl.

5. The compound of claim 4, which is a compound of Formula IIa   where:  p is an integer from 1 to 7, or from 5 to 7, or p is 6.

6. The compound of claim 4, wherein Alk is a C3‐C8 straight alkyl, a C3‐C8 branched alkyl  (e.g., t‐butyl), a C3‐C8 cycloalkyl, or adamantyl.

7. The compound of any one of claims 1 to 6, wherein R1, R2, R3 and each R4 are  independently H, ‐OH, ‐OR9.

8. The compound of any one of claims 1 to 6, wherein at least one of R1, R2, R3 and each  R4 is H and / or at least one of R1, R2, R3 and each R4 is OH.

9. The compound of any one of claims 1 to 8, wherein R3 is H.   72  LEGAL_1:87555556.1     10. The compound of any one of claims 1 to 9, wherein at least one of R1, R2, R3 and each  R4 are OH.

11. The compound of any one of claims 1 to 10, wherein n is 1, 2 or 3.

12. The compound of claim 11, wherein the compound has the structure of Formula Ia       .

13. The compound of claim 11 or 12, wherein each of R1 and R2 are OH, and optionally  wherein one R is H and one R is F.

14. The compound of claim 1, having the structure of:  ,    ,     ,   ,    ,    73  LEGAL_1:87555556.1   ,   15. The compound of claim 1, having the structure of:  , , or  .

16. The compound of any one of claims 1 to 3, wherein at least one of R1, R2, R3 and the  R4 groups is ‐NHR10, ‐[NH2R11]+, or ‐[NH(R12)2]+.     74  LEGAL_1:87555556.1   17. The compound of claim 16, wherein at least two of R1, R2, R3 and R4 groups are  independently ‐NHR10, ‐[NH2R11]+, or ‐[NH(R12)2]+.

18. A composition comprising the compound of any one of claims 1 – 17 and a solvent  (e.g., water) or a buffer.

19. The composition of claim 18, further comprising a cryopreservation agent.

20. The composition of claim 19, wherein the cryopreservation agent comprises DMSO,  lactobionate, glycerol, polyvinylalcohol, hydroxyethyl starch (HES), ethylene glycol  (EG), propylene glycol (PG), trehalose, mannitol, or a combination of two or more  thereof.

21. The composition of any one of claims 18 to 20, further comprising a biological  material from a human, an animal, a plant, a fungus or a microorganism.

22. The composition of claim 21, wherein the biological material is an organ, a tissue,  cells or platelets.

23. The composition of claim 22, wherein the cells comprise stem cells, T cells (including  CAR‐T cells), peripheral blood mononuclear cells (PMBCs), neurons, progenitor cells,  liver cells, red blood cells, immune cells (including natural killer (NK) cells),  endothelial cells, pancreatic cells (e.g., pancreatic islet cells), dendritic cells,  fibroblasts or cells from a cell line, preferably the cells comprise stem cells, T cells,  red blood cells, progenitor cells, or liver cells.

24. The composition of any one of claims 18 to 23, further comprising a cell culture  medium.

25. The composition of claim 24, wherein the cell culture medium is phosphate buffered  saline optionally comprising albumin, Eagle's minimum essential medium, Dulbecco's  modified Eagle's medium, RPMI, fetal bovine serum, fetal calf serum, Ham's F‐10,   75  LEGAL_1:87555556.1   Ham's F‐12, Medium 199, Hank's Buffered Salt Solution, Hank's Buffered Salt  Solution and dextrose, or a combination thereof.

26. A method for cryopreserving a biological material comprising:  a) combining the biological material with a solution comprising at least one compound  according to any one of claims 1 to 17 t;   b) cooling the combination from step a) to a storage temperature at or below the  freezing point of the solution; and  c) storing the cooled combination at the storage temperature.

27. The method of claim 26, wherein the biological material is from a human, an animal,  a plant, a fungus or a microorganism and / or the biological material is food.

28. The method of claim 27, wherein the biological material is an organ, a tissue, cells or  platelets.

29. The method of claim 28, wherein the cells comprise stem cells, T cells (including CAR‐ T cells), peripheral blood mononuclear cells (PMBCs), neurons, progenitor cells, liver  cells, red blood cells, immune cells (including natural killer (NK) cells), endothelial  cells, pancreatic cells (e.g., pancreatic islet cells), dendritic cells, fibroblasts or cells  from a cell line, preferably the cells comprise stem cells, T cells, red blood cells,  progenitor cells, or liver cells.

30. The method of any one of claims 26 to 29, wherein the cooling comprises performing  a rate‐controlled cooling of about 1°C per minute over about 16 hours.

31. The method of any one of claims 26 to 30, wherein the biological material is cells and  the combining step comprises suspending the cells in the solution and the  combination is a suspension of the cells in the solution.

32. Use of the compound of any one of claims 1 to 17 to:   76  LEGAL_1:87555556.1   a) reduce toxicity during cryopreservation in comparison to cryopreservation in the  absence of the compound of any one of claims 1 to 17;  b) improve viability and / or functionality of biological material following  cryopreservation in comparison to cryopreservation in the absence of the compound  of any one of claims 1 to 17;   c) improve stability of biological material during temperature cycling in  cryopreservation in comparison to temperature cycling in cryopreservation in the  absence of the compound of any one of claims 1 to 17; and / or  d) facilitate cryopreservation at a warmer temperature than possible in the absence of  the compound of any one of claims 1 to 17.

33. A method for synthesizing a compound of Formula XII     wherein:  B is phenyl; phenyl mono‐ or di‐substituted with C1‐C4‐alkyl, C1‐C4‐alkoxy, ‐NH2, ‐ NR5H, ‐N(R6)2 where each R6 is the same or different, ‐C(O)R7, ‐ COOH, ‐COOR8, ‐CHO  or halogen (e.g., Cl, Br, I or F); or an alkyl;  R1, R2, R3 and each R4 are each independently H, ‐OH, ‐OR9, ‐NHR10, ‐[NH2R11]+ or ‐ [NH(R12)2]+ where each R12 is the same or different, wherein the terminal R4 is OH;  m is an integer from 1 to 6; and   each R5 – R12 is independently H, alkyl or aryl,  said method comprising:  (a)      VIII       77  LEGAL_1:87555556.1   wherein R1a, R2a, R3a and each R4a are independently H, ‐OH, ‐OR9, ‐NHR10, ‐[NH2R11]+,  ‐[NH(R12)2]+ where each R12 is the same or different, a protected alcohol, or a  protected amine, wherein the terminal R4a is OH;  (b) ring opening the compound of Formula VIII with an aryl or alkyl amine of  Formula VII         ; and  (c) optionally, deprotecting the product of step (b).

34. The method according to claim 33, wherein:  a) the compound of Formula XII has the structure of Formula XIIa:   XIIa  wherein:  each R is independently hydrogen, C1‐C4‐alkyl, C1‐C4‐alkoxy, ‐NH2, ‐NR5H, ‐N(R6)2  where each R6 is the same or different, ‐C(O)R7, ‐ COOH, ‐COOR8, ‐CHO, haloalkyl or  halogen (e.g., Cl, Br, I or F), and   each R8 – R12 is independently H, alkyl or aryl; and  wherein the compound of Formula VII is an aryl amine having the structure of  Formula VIIa:   VIIa;   or  b)  XIIb  wherein:  Alk is a C3 – C9 linear or branched alkyl or a C3 – C10 mono‐ or poly‐cyclic alkyl; and    78  LEGAL_1:87555556.1   wherein the compound Formula VII is an alkyl amine having the structure of Formula  VIIb:    VIIb.

35. The method synthesizing a compound of Formula III according to claim 33 or 34,  wherein R3 is H, and wherein prior to step (a), a compound of Formula VIII, in which  R3a is H, is first produced by steps comprising:  (i) providing a protected O‐allyl pyranose of Formula IX        IX      ;  (ii) converting the protected O‐allyl pyranose of Formula IX to a  thiocarbonyl derivative of Formula X           wherein Rb is H, CH3, SCH3, OCH3, phenyl (Ph), OPh or imidazolyl, preferably  imidazolyl;  (iii) treating the thiocarbonyl derivative of Formula X with a radical  reducing agent to produce a C4‐deoxy pyranose derivative of Formula  XI         XI      ;  (iv) converting the C1 allyl group in the compound of Formula XI to a C1  hydroxyl group; and   79  LEGAL_1:87555556.1   (v) oxidizing the C1 hydroxyl group to form the lactone of Formula VIII.

36. The method of any one of claims 33 to 35, wherein R1a, R2a, R3a and each R4a are  independently H or a protected alcohol and / or wherein m is 1.

37. A method for synthesizing a compound of Formula I, I as defined in claim 2, wherein  n is 2, R3 is H and R4 is OH, comprising the steps of:  (i) converting a protected D‐pyranose of Formula III to a benzylidene  acetal     where each R″ is independently H or OH and O‐R′′′ is a hydroxyl protecting  group, such as methoxy or silyl ether (e.g., a bulky silyl ether);  (ii) when one or both of the R″ groups are OH, protecting the OH group  or groups, and subsequently performing a selective ring opening of  the benzylidene acetal to form a C4 acceptor compound of Formula IV     IV  wherein each R” is independently H or OPr1, where Pr1 is a hydroxyl  protecting group (such as, but not limited to, a benzyl group);  (iii) converting the C4 hydroxyl group of the compound of Formula IV into  a triflate and displacing the triflate to produce a C4 deoxy pyranose  derivative of Formula V   80  LEGAL_1:87555556.1         ; (iv) deprotecting the anomeric protected group and oxidizing the  resultant hydroxyl to produce the lactone of Formula VI     ; and  (v) ring opening the lactone of Formula VI with an aryl amine of Formula  VIIa     VIIa  wherein each R is independently hydrogen, C1‐C4‐alkyl, C1‐C4‐alkoxy, ‐NH2, ‐ NR5H, ‐N(R6)2 where each R6 is the same or different, ‐C(O)R7, ‐ COOH, ‐ COOR8, ‐CHO or halogen (e.g., Cl, Br, I or F), and removing the hydroxyl  protecting group(s) to form the compound of Formula I as defined above,  wherein n is 2, R3 is H and R4 is OH.

38. A method of synthesizing a compound of Formula I, as defined in claim 1, wherein R1  and R2 are both OH, R3 and R4 are H and Ra is H , said method comprising the steps  of:  (a) providing a carboxylic acid of Formula XX   81  LEGAL_1:87555556.1         ;  (b) coupling the carboxylic acid of Formula XX with an alkyl or aryl amine of  Formula VII    in the presence of a coupling agent (e.g., EDC) to form a protected amide of  Formula XXI          XXI   ; and  (c) deprotecting of the protected amide to form the compound of Formula I in  which R1 and R2 are both OH, R3 and R4 are H and Ra is H.     82  LEGAL_1:87555556.1

Images