An additive composition and a method for promoting differentiation into a10 precursors and / or a10 neurons

Abstract

Provided herein are an additive composition and a method for promoting differentiation into A10 precursors and / or A10 mDA neurons. The mDA progenitor cells are efficiently differentiated into A10 mDA neurons by Notch inhibitors, GDNF and AA. Furthermore, provided are deep insights into the subtype specification of mDA neurons and a new therapeutic strategy for major depression or psychiatric disorders related to A10 mDA neurons.

Description

AN ADDITIVE COMPOSITION AND A METHOD FOR PROMOTING DIFFERENTIATION INTO A10 PRECURSORS AND / OR A10 NEURONSTECHNICAL FIELD

[0001] The present disclosure relates to the field of stem cell biology. In particular, the disclosure relates to an additive composition and a method for promoting differentiation into A10 precursors and / or A10 neurons.BACKGROUND

[0002] Major depressive disorder (MDD) is among the world's greatest public health problems and has been projected as the third cause of the burden of disease worldwide in 2030. One of the two fundamental symptoms of MDD besides depressed mood, is anhedonia. The presence of anhedonic symptoms is suggested to predict and contribute to poor treatment response, which is also referred to as treatment resistant depression (TRD) and persist after mood symptoms have been resolved. A large body of evidence has shown that these symptoms are consistently associated with dysfunction in mesolimbic dopamine reward signaling, which is mainly composed of dopaminergic neurons in midbrain ventral tegmental area (VTA) innervate nucleus accumbens (NAc) in striatum (Admon and Pizzagalli, 2015; Der-Avakian and Markou, 2012; Eshel et al., 2016; Grace, 2016; Wise, 2004; 2008) . The NAc is central in the integration of afferents from multiple brain regions under the modulation of A10 mDA neurons (Sesack and Grace, 2010) . Indeed, hypodopaminergic state has been found in depressed patients with anhedonia compared with healthy subjects, evidenced by significantly lower DA transporter (DAT) binding (Meyer et al., 2001; Sarchiapone et al., 2006) and increased D2 receptor binding in striatum (D'Haenen H and Bossuyt, 1994) . Moreover, in stress based animal models of depression, the activity of VTA dopaminergic neurons decreased, especially those that preferentially projects to the reward-related NAc (Chang and Grace, 2014; Grace, 2016; Valenti et al., 2012) . To restore the VTA-NAc DA transmission is proposed to be a promising approach to treat depression especially TRD and has been evaluated in clinic (Hori and Kunugi, 2013; Papakostas, 2006) .

[0003] Human pluripotent stem cells (hPSCs) (both embryonic stem cells (ESCs) and induced pluripotent stem cells (iPSCs) ) have proven to be valuable tools in personalized regenerative medicine by providing an approach to generate large numbers of disorder-relevant cell types including several types of neurons, and enabling replace endogenous cells. Moreover, grafted hPSCs-derived neural cells build a similar cell-type-specific pre-and post-synaptic integration as endogenous neural networks, exhibiting the capacity of specific circuit repairing and functional restoration in the adult brain (Ji et al., 2023; Xiong et al., 2021) , an advantage over most pharmacotherapeutic agents which act non-specifically, broadly and cause many side effects (Ferguson, 2001; Salat and Tolosa, 2013) .

[0004] In the treatment of major depressive disorder (MDD) or other neural tissue dysfunctions, formation of appropriate linkage with proper cells (network formation) is necessary for restructuring brain function, therefore, not mature cells but progenitor cells that can differentiate into neurons in vivo are required to be transplanted. However, most current protocols are developed to generate mDA neurons, rather than specific subtypes, from hPSCs by sequential application of small molecule activators of sonic hedgehog (SHH) , canonical WNT signaling and FGF growth factors (Kriks et al., 2011; Xi et al., 2012) , none of currently available protocol can provide an essentially uniformed A10 precursor cell population which differentiates into A10 subtype enriched mDA neurons under the complicated in vivo environment. For example, CN114292814A disclosed a method for preparing A9 neurons, there are rare A10 mDA neurons are found in the period of differentiating A9 neurons while A9 having more than 85%and A10 mDA neurons only having 15%.

[0005] It has been known that the subtype of VTA (A10) DA neurons are anatomically and functionally distinctive from the other two mid-brain dopaminergic (mDA) neuronal subgroups, i.e., the retrorubral field (RRF, A8) and the substantia nigra pars compacta (SNc, A9) (Bjorklund and Dunnett, 2007; German and Manaye, 1993) . Single-cell transcriptome profiling reveals that both VTA and SNc subtype neurons emerge from a common progenitor pool during in vitro differentiation from hPSCs (La Manno et al., 2016; Xu et al., 2022) . During embryonic development, both VTA and SNc DA neurons are derived from midbrain floor-plate (FP) cells. The neurogenesis of SNc (A9) subset is around E10.5 and that of VTA (A10) subgroup reaches its peak at E11.5 instead (Bayer et al., 1995; Bye et al., 2012) . Some studies found that mDA progenitors are divided into two subsets in the medial and the lateral zones of the floor plate (FP) while medial progenitors give rise to SNc mDA neurons and lateral progenitors generate VTA mDA neurons, together with the specific spatiotemporal pattern of Shh expression (Blaess et al., 2011; Bodea et al., 2014) .

[0006] It is still largely not clear when and how different mDA subtype neurons will segregate during mDA neurogenesis, especially for VTA (Al 0) subtype neurons.SUMMARY

[0007] The invention provides an efficient differentiation paradigm for hPSCs to generate VTAA10 subtype enriched mDA neurons via induction of A10 precursor cells. We found that post-mitotic patterning by Notch inhibitor, GDNF and AA induced the specification of A10 subtype. Furthermore, these hPSC-derived mDA neurons exhibited important characteristics of A10 mDA neurons including expression profiles, electrophysiological properties in vitro and in vivo, and similar neural innervation like endogenous after transplantation. Importantly, with chemogenetical activation of the grafted A10-like mDA neurons, the anxiolytic phenotype was observed in transplanted normal mice, while the antidepressant-like phenotypes were observed in transplanted depression mice model. Our approach provides deep insights into the subtype specification of mDA neurons and provide a new strategy for major depression or psychiatric disorders related to A10 mDA neurons.

[0008] In a first aspect, provided herein is an additive composition for promoting differentiation of mDA progenitor cells into A10 precursor cells and / or A10 subtype neurons, consisting of Notch pathway inhibitor, AA (L-ascorbic acid) and GDNF (Glial cell line-derived neurotrophic factor) . In some embodiments, the Notch pathway inhibitor is selected from DAPT (N- [N- (3, 5-difluorophenacetyl) -L-alanyl] -S-phenylglycine t-butyl ester) , compound E, tarenflurbil and dibenzazepine. Optionally, the Notch pathway inhibitor is DAPT. In some embodiments, the molar ratio of DAPT, AA and GDNF is 10±1: 200±5: 0.00066±0.00010.

[0009] In another aspect, the disclosure provides another additive composition for promoting differentiating mDA progenitor cells into A10 precursor cells and / or A10 subtype neurons, consisting of Notch pathway inhibitor, AA, GDNF and at least one of BDNF (brain-derived neurotrophic factor) , cAMP (cyclic adenosine monophoshate) and TGFβ3 (Transforming growth factor beta 3) ; wherein the molar ratio of DAPT, AA and GDNF (molecular weight is 30.1kDa) is 10±1: 200±5: 0.00066±0.00010. Optionally, the Notch pathway inhibitor is selected from DAPT, compound E, tarenflurbil and dibenzazepine. Furthermore, in the additive composition of the present disclosure, the molar ratio of BDNF (molecular weight is 27kDa) and DAPT is 0.00074±0.00010: 10±1; the molar ratio of cAMP and DAPT is 0.5±0.2: 10±1; the molar ratio of TGFβ3 (molecular weight is 12.7kDa) and DAPT is 0.00008±0.00001: 10±1.

[0010] In another aspect, the disclosure provides the use of the additive composition of the present disclosure for manufacturing culture medium, or for facilitating the generation of A10 precursor cells or A10 subtype neurons.

[0011] In another aspect, the disclosure provides a culture medium comprising the additive composition for promoting differentiation of mDA progenitor cells into A10 precursor cells and / or A10 subtype neurons. In some embodiments, the medium further comprises DMEM / F-12 supplemented with 1 x NEAA and 1 x N2 supplements.

[0012] In another aspect, the disclosure provides a medium for differentiating A10 precursor cells, comprising 10±1 μM DAPT, 200±5 μM AA and 20±2 ng / ml GDNF. In some embodiments, the medium further comprises 20±2 ng / ml BDNF, 0.5±0.2 μM cAMP, and / or 1±0.2 ng / ml TGFβ3. In some embodiments, the medium further comprises DMEM / F-12 supplemented with 1 x NEAA and 1 x N2 supplements.

[0013] In another aspect, the disclosure provides an in vitro method for promoting differentiation of A10 precursor cells, comprising: exposing mDA progenitor cells to a medium comprising the additive composition of any one of described herein for induction of A10 precursor cells.

[0014] In some embodiments, the mDA progenitor cells are post-mitotic mDA progenitor cells, preferably early post-mitotic mDA progenitor cells, more preferably cells consist essentially of NURR1 positive cells.

[0015] In some embodiments, the mDA progenitor cells expose to the medium for a period of time between 4 days and 8 days. In this time duration, mDA progenitor cells are effective to induce mDA progenitor cells into A10 precursor cells.

[0016] In some embodiments, the mDA progenitor cells are differentiated from the pluripotent stem cells, preferably from the pluripotent stem cells selected from the group consisting of embryonic stem cells (ESCs) , induced pluripotent stem cells (iPSCs) , umbilical cord tissue-derived cells, amniotic fluid derived-cells and parthenotes, more preferably from hESC-H9, hESC-H1 or hiPSC WC-30 cells lines.

[0017] In some embodiments, the mDA progenitor cells are obtained by (a) culturing the pluripotent stem cells on feeder cells in a neural induction medium supplemented with 2±0.5 μM SB431542, 2 ±0.5 μM DMH-1, 0.4±0.2 μM CHIR99021, and 500±50 ng / ml SHH for 7±1 days; (o) culturing the cells on feeder cells of (a) in a neural induction medium supplemented with 1±0.5 μM SAG, 100±20 ng / ml SHH and 0.4±0.2 μM CHIR99021 for 6±1 days; (c) culturing the cells of (b) in a neural induction medium supplemented with 0.5±0.2 μM SAG, 20±5 ng / ml SHH and 100±20 ng / ml FGF8b for 7±1 days; and (d) culturing the cells of (c) in a neural induction medium supplemented with 0.1±0.02 μM SAG, 20±5 ng / ml SHH and 20±5ng / ml FGF8b for 0-15 days. Optionally, the culture time is 7±l days in step (d) .

[0018] In some embodiments, the method further comprising the step of maturing the A10 precursor cells into A10 subtype neurons in vitro.

[0019] In some embodiments, the A10 precursor cells are matured by culturing in a neural differentiation medium supplemented with 10±1 ng / ml BDNF, 10±1 ng / ml GDNF, 200±20 μM AA, 1±0.2 μM cAMP, 1±0.2 ng / ml TGFβ3 and 0.1±0.2 μM Compound E; and the neural differentiation medium comprises neurobasal medium with 1 x N2 supplement, 1 x B27 supplement and 1 x NEAA. In some embodiments, the A10 precursor cells are matured by culturing in DMEM / F-12 supplemented with 1 x NEAA, 1 x N2 supplement and 1 x B27 supplement with 10±1 ng / ml BDNF, 10±1 ng / ml GDNF, 200±20 μM AA, 1±0.2 μM cAMP, 1±0.2 ng / ml TGFβ3 and 0.1±0.2 μM Compound E.

[0020] In some embodiments, the A10 precursor cells are matured for a period of time for at least 10 days. For example, the A10 precursor cells are matured for 10, 11, 12, 13, 15, 18, 20, 22, 25 or 30 days.

[0021] In another aspect, the disclosure provides a cell population according to the method of the present disclosure.

[0022] In another aspect, the disclosure provides a cell population of the present disclosure for use as a medicament in a therapeutic or treatment or prevention method of psychiatric disorders related to A10 mDA neurons, especially major depressive disorder.

[0023] In another aspect, the disclosure provides a pharmaceutical composition comprising the cell population of the present disclosure and a pharmaceutically acceptable carder.

[0024] In another aspect, the disclosure provides the cell population of the present disclosure for use in a therapeutic or treatment or prevention method of psychiatric disorders related to A10 mDA neurons, especially major depressive disorder.

[0025] The invention provides the cell population of the present disclosure for use in a therapeutic or treatment or prevention method of psychiatric disorders related to A10 mDA neurons, especially major depressive disorder.

[0026] Given the strong evidence linking hypodopaminergic state in striatum of patients with depression, transplantation of A10 mDA neurons to innervate striatal neurons (mainly in the ventral part, the NAc) to reconstruct mesolimbic dopamine system may provide a potential treatment for depression and other reward related psychiatric disorders.

[0027] In another aspect, the disclosure provides a method of treating or preventing the psychiatric disorders related to A10 subtype neurons especially major depressive disorder, comprising: administering a therapeutically effective amount of the cell population of the present disclosure to the subject, preferably to the ventral striatum of the subject, especially the cell population is mDA progenitor cells exposing to the medium for 4 days. For example, the cell population used herein is mDA progenitor cells exposing to the medium with GAD or GADB or GBCATD for 4 days. Then, cell population were disassociated and about 100, 000 cells were resuspended and injected into the ventral striatum of a subject. Furthermore, the solution of resuspended is 1μl ACSF containing Rock inhibitor (0.5 μM) , 10%B27 without VA, 20ng / ml GDNF, 200 μM AA.

[0028] In conclusion, this disclosure developed a protocol for efficiently generating A10 subtype neurons from pluripotent stem cells, for example hESCs or hPSCs. Specifically, it was investigated whether and how Notch signaling is required for DA subtype specification, and found that not only Notch inhibition but AA and GDNF are critical for the specification of A10 subtype. We conducted characterization of the hPSC derived A10-like cells, on gene expression, electrophysiological properties, etc. Then we manipulate DA modulation on NAc neuron activity by transplanting A10-like precursor cells to target NAc, in vivo derived the A10-like neurons also projected into same target brain regions with endogenous A10 mDA neurons. To our knowledge, this is the first report of hPSC derived A10-like cells which closely resemble their endogenous counterparts when compared in such a comprehensive way.

[0029] The beneficial effects:

[0030] 1) The inventors discovered for the first time the essential role of Notch inhibitor, GDNF and AA in the induction of A10 subtype neuron differentiation, thereby providing an efficient and reliable approach to obtain A10 subtype enriched mDA neurons both in vitro and in vivo.

[0031] 2) The inventors also discovered for the first time that mDA neural progenitors could respond well to the treatment of A10-inducing agents, which may facilitate the quality control of manufacturing A10 subtype neurons.

[0032] 3) The additive, the medium and the method may contribute to achieve an industrialized scale production of A10 progenitor cells or A10 subtype neurons.

[0033] 4) The cell population produced by the method of the present disclosure present target specific projections after transplantation into mice brain, and show the potential for restorative cell therapy to depression (especially major depressive disorder) and other psychiatric disorders caused by hypofunction of A10 mDA neurons.BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

[0034] The drawings forming a part of the disclosure are adopted to provide further understanding of the disclosure. The drawings together with the examples of the present invention are adopted to explain the present invention and not intended to form improper limits to the present invention. In the drawings:

[0035] Figure 1 shows generation of A10-like mDA neurons from hESCs. (A) Diagram of the experimental design of the time course with small-molecule cocktail treatment during the differentiation of hESC line into mDA neurons. G, GDNF; B, BDNF; C, cAMP; A, AA; T, TGFβ3; D, DAPT. (B) Representative immunostaining results show the neuron generation after maturation following GBCATD or control treatment during the stage V. Ho, Hoechst. Scale bar, 20μm. (C-D) Quantification of the percentage of TH-tdTomato / CALB1-+EGFP+ A10-like mDA neurons among TH-tdTomato+ mDA neurons (C) or among total cells (D) . Data are represented as mean ± SEM. Student's t test, ***p ＜ 0.001; comparison between GBCATD and control group in each stage. One-way ANOVA followed by Holm-Sidak post hoc test. *p ＜ 0.05, **p ＜ 0.01, ***p ＜ 0.001; comparison of GBCATD group during the stage V. (E) Immunocytochemistry for tdTomato and EGFP of mature neurons upon treatment with combination of GBCATD or subtracting them one by one during the stage V. Scale bar, 20μm. (F-G) Quantification of cellular differentiation presented in (E) . Data are represented as mean ± SEM. One-way ANOVA followed by Holm-Sidak post hoc test. **p ＜ 0.01, ***p ＜ 0.001; comparison of GBCATD group. (H-J) Immunocytochemistry and quantification of tdTomato and EGFP in mature neurons with AA, GDNF, DAPT or random of the three small molecules treatment during the stage V. Data are represented as mean ± SEM. One-way ANOVA followed by Holm-Sidak post hoc test. *p ＜ 0.05, **p ＜ 0.01, ***p ＜ 0.001; comparison of control group. #p ＜ 0.05, ##p ＜ 0.01, ###p ＜ 0.001; comparison of GBCATD treatment group. Scale bar, 20μm. (K-L) Immunocytochemistry and quantification of day 48 cultures derived from H9 hESCs following the GAD protocol show characteristic markers for mDA neurons, such as OTX2, EN1 and FOXA2.

[0036] Figure 2 Construction of TH-tdTomato / CALB1-EGFP reporter hESC line and analysis of A9-like mDA neurons generation and the differentiation of hPSC lines. Also related to Figure 1. (A) The strategy for generation of the TH-tdTomato / CALB1-EGFP dual-locus knockin hESC line. (B, C) Immunostaining of day 48 cultures derived from the reporter hESC line following the previous reported mDA differentiation protocol show co-expression of tdTomato and TH (B) or EGFP and CALB1 (C) . Boxed areas are magnified on the right. (D, E) Quantification of reporter gene expression to indicate that almost all the tdTomato+ cells are TH positive (D) and EGFP+ cells co-express CALB1 (E) . (F) Immunocytochemistry for tdTomato and EGFP after maturation following GBCATD or control treatment during stage III, IV, VI. Scale bar, 20μm. (G-I) Quantification of the percentage of TH-tdTomato+ mDA neurons among the total cells in the time course test (G) , subtracting factors test (H) and random combination test (I) . (J) Schematic showing A10-like mDA neurons differentiation paradigm. NIM: neural induction medium; NDM: neural differentiation medium; NB: Neurobasal Medium. (K, M) Immunostaining of day 48 cultures derived from TH-tdTomato / CALB1-EGFP reporter line show the markers for A9 mDA neurons-PITX3, GIRK2. White arrows indicate co-localization of tdTomato, EGFP and GIRK2 (K) or PITX3 (M) . White arrowheads indicate tdTomato+EGFP- neurons co-express GRIK2 (K) or PITX3 (L) . (L, N) Quantification of cell identity presented in (K) and (M) . (O) Immunostaining of day 48 cultures derived from several hPSC lines following the GAD protocol show markers for A10 mDA neurons. (P-R) Quantification of cellular differentiation presented in (O) .

[0037] Figure 3 Bulk RNA-seq analysis of the cells after GAD treatment and post-mitotic patterning of A10 subtype specification. (A) The heatmap depicts the differentially expressed genes (Y axis) , among the cells after GAD treatment and control group (X axis) . (B) Dot plots of KEGG pathway enrichment analysis of control and GAD treatment group enriched genes. The abscissa is the KEGG pathway name. The count of DEGs is represented by bubble size and P-value by color. (C) Dot plots of GO enrichment analysis of control and GAD treatment group enriched genes. The ordinate is the GO term name. The count of DEGs is represented by bubble size and P-value by color. (D) Schematic of experimental design for NURR1+ cells sorting and differentiation. (E) Immunohistochemistry analysis of day 46 cultures derived from the sorted cells with GA, GAD or control (G: GDNF; A: AA; D: DAPT) treatment shows co-labeling of TH and CALB1. Scale bar, 20 μm. (F) Quantification of the percentage of TH+CALB1+A10 subset among all the TH+ mDA neurons. Data are represented as mean ± SEM. Student's t test; ***p ＜ 0.001.

[0038] Figure 4 Proliferation of induced mDA neurons. (A) Illustration of A10-like mDA neuron differentiation protocol and time course of EdU treatment. EdU was added to the cultures for one week at various time points of differentiation. After maturation, cells were fixed at day 46 for immunostaining. (B) Representative images show colabeling of EdU and tdTomato and EGFP at day 46 of A10-like mDA neuron differentiation. Scale bar, 20 μm. (C, D) Quantification of the percentage of tdTomato+EdU+ cells among the tdTomato+ and EDU+ cells (C) and tdTomato+EGFP+EdU+ cells among the tdTomato+EGFP+ and EdU+ cells (D) . Data are represented as mean ± SEM. One-way ANOVA followed by Holm-Sidak post hoc test. ***p ＜ 0.001.

[0039] Figure 5 scRNA-seq analysis of mDA neurons derived from TH-tdTomato reporter hESC line. (A) Schematic overview of differentiation of TH-tdTomato reporter hESC line for scRNA-seq. (B) Clustering of individual cells from different protocols visualized by t-SNE. (C) Annotation of cell clusters on the basis of gene expression. The schema on the right illustrates the distribution of cells obtained from individual dissections of protocols for A10-like or A9-like mDA neurons. (D) Selected gene expression visualized by t-SNE. Each dot represents an individual cell colored according to the expression level (red, high; gray, low) . (E) Volcano plot showed distribution of DEGs between A10-like mDA neuron cluster and A9-like mDA neuron cluster. (F-G) Plots of the KEGG pathways enrichment analysis for A10 (F) and A9-like neuron cluster (G) . The color and size of each bubble represent enrichment significance and the number of mRNAs enriched in a pathway, respectively. (H) The ratio of each cell types among all the analyzed cells from the two different protocols visualized by histogram.

[0040] Figure 6 Establishment and characterization of TH-tdTomato and t-SNE plots of selected gene expression. (related to Figure 5) (A) Schematic diagram showing generation of the TH-tdTomato hESC line. (B, C) Immunostaining and quantification of the expression of tdTomato in TH+ neurons. (D) t-SNE plots show the expression of markers in each cluster.

[0041] Figure 7 The derived A10-like mDA neurons co-release glutamate. (A) Representative images showing the expression of VGLUT2 mRNA in tdTomato+EGFP+ neurons. (Right) Close-ups of the box area in (left) . Scale bar, 20μm (left) ; 10μm (right) . (B) Quantification of the percentage of VGLUT2+tdTomato+EGFP+ among the tdTomato+EGFP+ A10-like mDA neurons and VGLUT2+tdTomato+EGFP- among the tdTomato+EGFP- mDA neurons. Data are represented as mean ± SEM. Student's t test; ***p ＜ 0.001. (C) Schematic of experimental design for whole-cell patch-clamp recording after selective optical activation of A10 or A9-like neurons. (D) Typical whole-cell patch-clamp recordings of light induced excitatory and inhibitory postsynaptic currents (iEPSC, iIPSC) after activating A10-like mDA neurons. the induced EPSC (iEPSC) were blocked by the glutamate receptor antagonists CNQX (6-cyano-7-nitroquinoxaline-2, 3-dione, AMPA / kainate glutamate receptor antagonist, 20 μM) . (E) Non light-induced EPSC or IPSC after activation of A9-like neurons. (F) Quantification of amplitude of light-induced EPSC. Data are represented as mean ± SEM. Student's t test; ***p ＜ 0.001. (G) Schematics for electrophysiological recording in tool hESC line derived grafts. (H) Typical trace of light-induced EPSC and blocked by 20 μM CNQX. (I) Quantification of amplitude of light-induced EPSC.

[0042] Figure 8 Establishment and characterization of TH-vCre / CALB1-vloxp-stop-vloxp-iCre / AAVS1-DIO-CHR2-EYFP hESC lines. (A) Schematic depiction of the strategy for generation of TH-vCre / CALB1-vloxp-stop-vloxp-iCre / AAVS1-DIO-CHR2-EYFP hESC line. (B) Immunostaining of day48 cultures derived from H-vCre / CALB1-vloxp-stop-vloxp-iCre / AAVS1 -DIO-CHR2-EYFP hESC line. (C, D) Quantification of cellular differentiation presented in (B) . (E) Typical whole-cell path-clamp recording of blue light-induced current ofA10-like mDA neurons derived from TH-vCre / CALB1-vloxp-stop-vloxp-iCre / AAVS1-DIO-CHR2-EYFP hESC line shows the activation of A10-like mDA neurons by the blue light. (F) Quantification of the amplitude of induced current in (E) . Ho, Hoechst. Scale bar, 20μm. Data are represented as mean ± SEM.

[0043] Figure 9 Functional properties of grafted A10-like mDA neurons and comparison between A10 and A9 subgroups. (A) Immunostaining images show that the expression of tdTomato and EGFP in the human nuclei (hN) positive grafted neurons at 6 months after striatal transplantation of human mDA neuron progenitors with or without GAD small-molecule cocktail treatment. Scale bar, 100μm. (B-D) Quantification of the percentage of tdTomato+ cells among total hN+ cells (B) and tdTomato+EGFP+ cells among tdTomato+ neurons (C) or among total hN+ cells (D) , data from (A) . (E) Schematics for electrophysiological recording of mDA neurons subtypes by markers in reporter cell line derived grafts. (F-G) Cell Membrane capacitance (Cm) (F) , Resistance (Rm) (G) were different between the two subtypes whether the grafted neurons in SCID mice or endogenous neurons in mDA neuron reporter mice (DAT-Cre / Ai9) . (H-J) Typical traces of voltage sag measurements from endogenous A9 or A10 mDA neurons in mDA neuron reporter mice or grafted human A9 or A10-like mDA neurons 6 months after transplantation. (H) The sag amplitude and rebound delay times are plotted in (I) and (J) . Total 12 cells of endogenous A9 neurons were recorded sag component and 9 out of 12 were recorded rebound delay while among total 17 endogenous A10 mDA neurons, 6 cells were recorded sag component and 10 were recorded rebound delay. Total 20 cells of grafted A9-like neurons were recorded sag component and 15 ont of 20 cells were recorded rebound delay while of 23 grafted A10-like mDA neurons, 21 cells were recorded sag component and 20 cells were recorded rebound delay. (K-M) Example recording traces of the mDA neurons response to the step current injection (K) . Average spike numbers curves of each mDA neuron groups are plotted in (L) and (M) . (N) Typical whole-cell patch-clamp recording of sEPSCs and sIPSCs in grafted-A10 and A9-like neurons. (O-R) The frequency and amplitude of sEPSCs and sIPSCs of the grafted-A10 and A9-like neurons are plotted. Data are represented as mean ± SEM. Student t test (B-D, F-J, O-R) , Tow way ANOVA followed by Holm-Sidak post hoc test (L, M) . *p ＜ 0.05, **p ＜ 0.01, ***p ＜ 0.001.

[0044] Figure 10 Electrophysiological properties of the grafted mDA subsets. Also related to Figure 9. (A) Typical traces of the single action potential (AP) of the four groups induced by the injected current. (B-E) Tau (B) , The rest membrane potential (RMP) (C) , threshold (D) and peak amplitude (E) of AP of grafted-A10-like and A9-like neurons or endogenous A10 and A9 neurons from mDA neuron reporter mice (DAT-Cre / Ai9) are plotted. (F) Typical traces of spontaneous action potentials (sAPs) in the four groups. (G-I) The threshold (G) , frequency (H) and amplitude (I) of spontaneous action potential are plotted. (J) Typical traces of mDA neurons response after discharging at maximal frequencies. (K) Mean maximal firing rates of mDA neuron groups induced by ramp depolarizations. Data are represented as mean ± SEM. Student's t test. *p ＜ 0.05, ***p ＜ 0.001.

[0045] Figure 11 Subtype specific axonal projections of the orthotopically transplanted mDA neurons. (A) Schematic coronal views of the specific innervation of A9 and A10 mDA neurons. (B) Immunostaining images show that the expression of tdTomato and EGFP in the human nuclei (hN) positive grafted neurons at 6 months after orthotopic transplantation of human mDA neuron progenitors with 4 days GAD small-molecule cocktail treatment. Boxed areas are magnified on the bottom. (C, D) Quantification of the percentage of tdTomato+ cells among total hN+ cells (C) and tdTomato+EGFP+ cells among tdTomato+ neurons (D) . (E, F) Co-labeling of tdTomato and EGFP in coronal section of striatum to show grafted mDA subsets innervation patterns in striatum and OT. Boxed areas in (E) are magnified in (F) . CPu: caudate putamen, dorsal striatum; NAc: nucleus accumbens, ventral striatum; OT: olfactory tubercle. (G-I) Quantification of the extent of tdTomato+EGFP+ innervation by optical density (G) , the distribution of tdTomato+EGFP+ fibers in the three brain region (H) and the percentage of A10-like fibers (tdTomato+EGFP+) among all the mDA fibers (I) . (J, K) Immunostaining of tdTomato and EGFP indicate graft-derived mDA subsets innervation patterns in CPu, amygadala and LH. Boxed areas in (J) are magnified in (K) . BLA: basolateral amygdala; CeA: central amygdala; AMY: amygdala; LH: lateral hypothalamic area. (L-N) Quantification of the extent of tdTomato+EGFP+ innervation by optical density (L) and the distribution of tdTomato+EGFP+ fibers in the three brain region (M) and the percentage of A10-like fibers (tdTomato+EGFP+) among all the mDA fibers (N) . Scale bars: 100 μm (B, E, J) , 10 μm (B, bottom) , 50 μm (F) , 20 μm (K) . Data are represented as mean ± SEM. One-way ANOVA followed by Holm-Sidak post hoc test. *p ＜ 0.05, **p ＜ 0.01, ***p ＜ 0.001.

[0046] Figure 12 Outgrowth of fibers from the human grafts in ventral striatum and serial coronal sections of fiber distribution from orthotopicly transplanted graft. Also related to Figure 11. (A-C) Immunostaining images show the fibers from the TH-tdtomato / CALB1-EGFP-hESC-line-derived grafts 6 months after transplantation into ventral striatum growth into some typical projection target of the mDA neurons such as medial prefrontal cortex (mPFC) (A) , ventral and dorsal striatum (CPu) (B) , basolateral (BLA) and central amygdala (CeA) (C) . Dotted white arrows in (A) indicate ascending fibers from the ventral striatum to mPFC. Boxed areas are amplified at right. (D) Serial coronal sections of distribution of fibers from orthotopicly transplanted graft immunostained for tdTomato and EGFP. Scale bars: 100 μm (A-C left figure, D) , 20μm (A-C right figure) .

[0047] Figure 13 Anxiolytic and antidepressant-like behaviors in the transplanted mice. (A) The experimental process of establishment of tool hESC cell, differentiation, transplantation, animal model and behavior analysis. (B-C) Elevated plus maze shows the entries (B) and duration (C) in the open-arm of the transplanted or ACSF-injected mice upon treatment with CNO or saline. (ACSF, n=6 in each group; control-grafted, n=6 in each group; hM3Dq-grafted, n=6 in saline group, n=9 in CNO group) . (D-F) Behavior effects of specific activation of A10-like mDA neurons in the sucrose preference test (SPT) , tail suspension test (TST) and forced swim test (FST) . (Control-grafted, n=10 in each group; hM3Dq-grafted, n=10-11 in each group) . (G) HPLC analysis of dopamine (DA) concentration in dialysate with microdialysis of grafted depression mice model pre and post CNO treatment. Data are represented as mean ± SEM. Student's t test (B-C) . One-way ANOVA followed by Holm-Sidak post hoc test (B-C, D-F) . Paired Student's t test (G) . *p ＜ 0.05, **p ＜ 0.01, ***p ＜ 0.001.

[0048] Figure 14 Establishment and characterization ofTH-iCre / CALB1-LSL-vCre / AAVS1-vloxp-stop-vloxp-loxp-EGFP-loxp-hM3Dq-mcherry-hESC-line and open field test analysis of grafted mice. Also related to Figure 13. (A) The strategy for generation of a TH-iCre / CALB1-LSL-vCre / AAVSl-vloxp-stop-vloxp-loxp-EGFP-loxp-hM3Dq-mcherry knockin hESC line. (B, C) Immunostaining and quantification of the expression of mcherry in TH and CALB1 double positive neurons. (D) Whole-cell patch clamping of differentiated A10-like mDA neurons shows representative changes in membrane potential on 10-week-old cultures upon treatment with and wash of CNO (40 μM) . (E) The statistical analysis of changes in membrane potential of spontaneous action potentials upon treatment with and wash of CNO (40 mM) . (F) Immunostaining images show the grafted neurons matured and expressed mcherry 6 months after transplantation into NAc. (G, H) In the open field test, each group show no significant difference of total movement distance and velocity. (I-L) The control-grafted and HM3Dq-grafted mice show no significant difference of total movement distance (I) and velocity (J) in the open field test suggest the same locomotor ability between each group mice. Also there is no significant difference of entries (K) and duration (L) in the center zone between each group of mice. (M) HPLC analysis of glutamate concentration in dialysate with microdialysis of grafted depression mice model pre and post CNO treatment. Data are represented as mean ± SEM. Student's t test (F, G, M) . One-way ANOVA followed by Holm-Sidak post hoc test (I-L) . *p ＜ 0.001.DETAILED DESCRIPTION

[0049] DEFINITION

[0050] As used in the present specification, the following words and phrases are generally intended to have the meanings as set forth below, except to the extent that the context in which they are used indicates otherwise.

[0051] As used herein, the term “a” , “an” , “the” , and “said” and similar terms used in the context of the present disclosure (especially in the context of the claims) are to be construed to cover both the singular and plural unless otherwise indicated herein or clearly contradicted by the context. In addition, it should be noted that the plural form does not necessarily mean that it is plural, and it needs to be understood according to the context in the article.

[0052] The term “optionally” means that the subsequent described event, circumstance or substituent may or may not occur, and that the description includes instances where the event or circumstance occurs and instances where it does not.

[0053] The recitation of numerical ranges by endpoints includes all numbers and fractions subsumed within the respective ranges, as well as the recited endpoints.

[0054] As used herein, the term "about" in reference to a numerical value means that variations of 10%above or below the numerical value are within the range ascribed to the specified value.

[0055] As used herein, the term “comprise” or "comprising" means including, but not limited to, whatever follows the word "comprising" . Thus, use of the term “comprise” or "comprising" indicates that the listed elements are required or mandatory, but that other elements are optional and may or may not be present.

[0056] As used herein, the phrase “consist of” or “consisting of” means including, and limited to, whatever follows the phrase. Thus, use of the phrase “consist of” or “consisting of” indicates that the listed elements are required or mandatory, and that no other elements may be present.

[0057] As used herein, the phrase “consist essentially of” or “consisting essentially of” means including any elements listed after the phrase, and limited to other elements that do not interfere with or contribute to the activity or action specified in the disclosure for the listed elements. Thus, use of the phrase “consisting essentially of” indicates that the listed elements are required or mandatory, but that other elements are optional and may or may not be present depending upon whether or not they affect the activity or action of the listed elements. For example, a cell population consists essentially of a specified cell type means that the proportion of the specified cell type in total cell population may reach at least 20%or more, e.g., 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%or more.

[0058] As used herein, a “sample” may contain whole cells and / or live cells and / or cell debris.

[0059] As used herein, the “cells” comprises “apopulation of cells” and also comprises “cell cultures” .

[0060] As used herein, the term “treatment” or “treat” here comprises preventive (e.g., prophylactic) , curative, or palliative treatment of a mammal, especially human; and comprises (1) preventing, treating, or alleviating a disease in an individual, wherein the individual is at high risk of developing the disease, or has the disease but has not yet been diagnosed; (2) inhibiting a disease (e.g., inhibiting its occurrence) ; or (3) alleviating a disease (e.g., alleviating symptoms associated with the disease) .

[0061] As used herein, the term “mature” or “maturation” refers to the differentiation from precursor cells into neurons, for example, the A10 precursor ceils or A9 precursor cells differentiate into A10 neuron or A9 neuron respectively.

[0062] The abbreviation GBCATD stands for GDNF, BDNF, cAMP, AA, TGFβ3 and DAPT. The abbreviation GAD stands for GDNF, AA and DAPT. And so on with the other abbreviations.

[0063] As used herein, the terms “pluripotent stem cells” refers to the cells are able to self-renew and to differentiate into various cell types. During normal neurogenesis, pluripotent stem cells differentiate into progenitor cells which are intended for a specific developmental series (referred to as “committed” ) . In the present disclosure, the pluripotent stem cells include but not limit to embryonic stem cells (ESCs) , induced pluripotent stem cells (iPSCs) , umbilical cord tissue-derived cells, amniotic fluid derived-cells and parthenotes.

[0064] As used herein, the terms “mid-brain dopaminergic (mDA) progenitors” and “mDA progenitor cells” may be used interchangeably, and refer to the cells differentiated from the pluripotent stem cells and maintained at least the potential for differentiating into dopaminergic neurons (e.g., A8 mDA subtype neurons, A9 mDA subtype neurons and A10 mDA subtype neurons) . In general, the mDA progenitor cells are first produced by differentiating hPSCs in a cellular differentiation medium, preferably a neural induction medium containing differentiation-favoring components disclosed in known in the art for a period of time (e.g., about 18-39 days, about 20-35 days, about 28±2 days) such that the cells become human dopaminergic progenitor cells (or a mixture of dopaminergic progenitor cells, neural progenitor cells and / or dopaminergic neuron cells) as determined by expression of one or more biomarkers of dopaminergic progenitor cell, e.g., tyro sine hydroxylase (TH) . The methods for generating mDA progenitor cells from pluripotent stem cells or neural progenitor cells are known in the art, other biomarkers (e.g., EN1, FOXA2, OTX2) for mDA progenitor cell are also known in the art. See for example the PCT international patent publication WO2011156331A9 and US patent application No. US20050196864A1, the relevant portions of which are incorporated by reference herein.

[0065] As used herein, the terms “post-mitotic mDA progenitor cells” refers to the mDA progenitor cell with mitotic exit, indicating that the cells may be at the molecular transition from specificity to monopotency. The post-mitotic biomarkers are known in the prior art, e.g., Nurr1, En1, En2, Pitx3, and TH, see for example CN patent application No. CN101292031A, Riessland et al., 2019, Cell Stem Cell 25, 514-530 e518, the relevant portions of which are incorporated by reference herein.

[0066] The mDA progenitor cells can be obtained from any of the method of the present disclosure. Specifically, in some embodiments, the pluripotent stem cells are cultured on feeder cells in a first medium for 7±1 days, the first medium is DMEM / F-12 with 1 x NEAA, 1 x N2 supplement supplemented with 2±0.5 μM SB431542, 2 ±0.5 μM DMH-1, 0.4±0.2 μM CHIR99021, and 500±50 ng / ml SHH; then the first medium is replaced with a second medium for culturing on feeder cells 6±1 days, and the second medium is DMEM / F-12 with 1 x NEAA, 1 x N2 supplement supplemented with 1±0.5 μM SAG, 100±20 ng / ml SHH and 0.4±0.2 μM CHIR99021 ; then the cells were cultured in a third medium for 7±1 days, and the third medium is DMEM / F-12 with 1 x NEAA, 1 x N2 supplement supplemented with 0.5±0.2 μM SAG, 20±5 ng / ml SHH and 100±20 ng / ml FGF8b; then the cells were cultured in a forth medium for 0-15 days and changed the forth medium 7±1 days, the forth medium is DMEM / F-12 with 1 x NEAA, 1 x N2 supplement supplemented 0.1±0.02 μM SAG, 20±5 ng / ml SHH and 20±5ng / ml FGF8b.

[0067] In some other embodiments, the pluripotent stem cells are cultured on feeder cells in a first medium for 8 days, the first medium is DMEM / F-12 with 1 x NEAA, 1 x N2 supplement supplemented with 2 μM SB431542, 2 μM DMH-1, 0.4 μM CHIR99021, and 500ng / ml SHH; then the first medium is replaced with a second medium for culturing on feeder cells 6 days, and the second medium is DMEM / F-12 with 1 x NEAA, 1 x N2 supplement supplemented with 1 μM SAG, 100ng / ml SHH and 0.4 μM CHIR99021; then the cells were cultured in a third medium for 7 days, and the third medium is DMEM / F-12 with 1 x NEAA, 1 x N2 supplement supplemented with 0.5 μM SAG, 20ng / ml SHH and 100ng / ml FGF8b; then the cells were cultured in a forth medium for 0-14 days and changed the forth medium per week, the forth medium is DMEM / F-12 with 1 x NEAA, 1 x N2 supplement supplemented 0.1 μM SAG, 20ng / ml SHH and 20ng / ml FGF8b.

[0068] In some embodiments, the mDA progenitor cells are from the pluripotent stem cells differentiating culturing for 28 days; the pluripotent stem cells are cultured on feeder cells in a first medium for 8 days, the first medium is DMEM / F-12 with 1 x NEAA, 1 x N2 supplement supplemented with 2 μM SB431542, 2 μM DMH-1, 0.4 μM CHIR99021, and 500ng / ml SHH; then the first medium is replaced with a second medium for culturing on feeder cells 6 days, and the second medium is DMEM / F-12 with 1 x NEAA, 1 x N2 supplement supplemented with 1 μM SAG, 100ng / ml SHH and 0.4 μM CHIR99021; then the cells were cultured in a third medium for 7 days, and the third medium is DMEM / F-12 with 1 x NEAA, 1 x N2 supplement supplemented with 0.5μM SAG, 20ng / ml SHH and 100ng / ml FGF8b; then the cells were cultured in a forth medium for 7 days, the forth medium is DMEM / F-12 with 1 x NEAA, 1 x N2 supplement supplemented 0.1μM SAG, 20ng / ml SHH and 20ng / ml FGF8b.

[0069] In some embodiments, the mDA progenitor cells are from the pluripotent stem cells differentiating culturing for 35 days; the pluripotent stem cells are cultured on feeder cells in a first medium for 7 days, the first medium is DMEM / F-12 with 1 x NEAA, 1 x N2 supplement supplemented with 2 μM SB431542, 2 μM DMH-1, 0.4 μM CHIR99021, and 500ng / ml SHH; then the first medium is replaced with a second medium for culturing on feeder cells 6 days, and the second medium is DMEM / F-12 with 1 x NEAA, 1 x N2 supplement supplemented with 1 tM SAG, 100ng / ml SHH and 0.4 μM CHIR99021; then the cells were cultured in a third medium for 7 days, and the third medium is DMEM / F-12 with 1 x NEAA, 1 x N2 supplement supplemented with 0.5μM SAG, 20ng / ml SHH and 100ng / ml FGF8b; then the cells were cultured in a forth medium for 14 days and changed the medium per week, the forth medium is DMEM / F-12 with 1 x NEAA, 1 x N2 supplement supplemented 0.1 μM SAG, 20ng / ml SHH and 20ng / ml FGF8b.

[0070] As used herein, the terms “A10-like mDA precursors” , “A10-like precursors” and “A10 precursors” may be used interchangeably, and refer to the cells having transformed into monopotent cells, which have been treated with the medium adding the additive composition provided by this disclosure but have not been cultured in mature.

[0071] As used herein, the “A10 mDA neurons” , “A10 subtype” , “A10-like mDA neurons” , and the like may be used interchangeably based on the context of the present disclosure. Specifically, A10 mDA neurons refers to terminally differentiated cells.

[0072] The terms “subject” , “individual” and “patient” are used interchangeably herein to refer to a vertebrate, preferably a mammal, more preferably a human. Mammals include, but are not limited to murines, simians, humans, farm animals, sport animals, and pets. Tissues, cells and their progeny of a biological entity obtained in vivo or cultured in vitro are also encompassed.

[0073] The term “exemplary” is used herein to mean serving as an example, instance, or illustration. Any aspect or design described herein as “exemplary” is not necessarily to be construed as preferred or advantageous over other aspects, embodiments, or designs.

[0074] The term “Notch pathway inhibitor” refers to a compound or molecule (e.g., small molecules, antibodies, peptides, peptidomimetic, natural compounds, siRNA, anti-sense nucleic acids, or aptamers) that interferes with (e.g., antagonizes, reduces, decreases, suppresses, eliminates, or blocks) the function of the target molecule of Notch pathway. An inhibitor can be any compound or molecule that changes the activity of Notch pathway. For example, the Notch pathway inhibitor can be N- [N- (3, 5-difluorophenacetyl) -L-alanyl] -S-phenylglycine t-butyl ester (DAPT) , compound E, tarenflurbil or dibenzazepine.

[0075] The “additive composition” of the present invention can achieve promoting differentiation of mDA progenitor cells into A10 precursor cells and / or A10 subtype neurons when added to a cell medium, particularly a neural induction medium. That is, the use of the additive composition of the is specifically exemplified by any or any combination of the following: promoting A10-like cells proliferation, promoting A10-like cells differentiation, promoting A10 precursor proliferation, promoting A10 precursor differentiation, promoting A10 neuron proliferation, and promoting A10 neuron differentiation. In general, the additive composition may siginificantly increase the proportion of A10 precursor cells when added to a medium for culturing mDA progenitor cells. According to the results of the neurons obtained, the proportion of A10 mDA neurons in mDA neurons may range from about 30%to about 80%. Compared to the control without addition of the additive composition, the proportion of A10 mDA neurons in mDA neurons shows an increase of about 20%to about 60%.

[0076] In some embodiments, the use of the additive composition of the present disclosure may give rise to a cell population with more than about 20%A10 precursor cells or A10 subtype neurons in the total cells, in case of no preceding step of isolating the mDA progenitor cells. In some other embodiments, the use of the additive composition of the present disclosure may give rise to a cell population with more than about 60% (e.g. about 65%, 70%, 75%, 80%) A10 precursor cells or A10 subtype neurons in the total cells, especially in the case that the mDA progenitor cells at early post-mitotic are isolated preceding.

[0077] The additive composition of the present invention may be used in the preparation of a culture medium in conjunction with one or more medium component. Such component is not particularly limited as long as the desired effect of the present invention is obtained, and includes, for example, DMEM / F-12, DMEM / F-12 with 1 x NEAA, DMEM / F-12 with 1 x N2 supplement, DMEM / F-12 with 1 x NEAA and 1 x N2 supplement, NeurobasalTM Plus medium, NeurobasalTM medium, Essential 8TM medium, TeSRTM-E8TM, Essential 6 and so on.

[0078] The additive composition of the present invention can have any shape during provision or preservation. The additive composition may be in the form of a formulated solid mixture such as tablet, pill, capsule, granule, or a liquid such as a solution obtained by dissolving in an appropriate solvent using a solubilizer or a suspension. In some embodiments, the ingredients of the additive composition are presented in a mixture. In some embodiments, the ingredients of the additive composition are in the form of a single or two or more but not all the ingredients mixture, and they are mixed before use or in use process.

[0079] In some embodiments, the concentration of additive composition in culture medium is 10±1 μM DAPT, 20±2 ng / ml GDNF and 200±5 μM AA. Furthermore, the culture medium contains at least one of BDNF, cAMP and TGFβ3. For example, in some embodiments, the medium contains BDNF, cAMP or TGFβ3; in some embodiments, the medium contains any two of BDNF, cAMP and TGFβ3, e.g. BDNF and cAMP; cAMP and TGFβ3; or BDNF and TGFβ3. In some embodiments, the medium contains BDNF, cAMP and TGFβ3.

[0080] In some embodiments, in the culture medium: BDNF has the concentration of 20±2 ng / ml; cAMP has the concentration of 0.5±0.2 μM; and / or, TGFβ3 has the concentration of 1±0.2 ng / ml.

[0081] In a special embodiment, the medium contains the additive consisting of 10 μM DAPT, 20 ng / ml GDNF, 200 μM AA, 20 ng / ml BDNF. In a special embodiment, the medium contains the additive consisting of 10 μM DAPT, 20 ng / ml GDNF, 200 μM AA, 0.5 μM cAMP. In a special embodiment, the medium contains the additive consisting of 10 μM DAPT, 20 ng / ml GDNF, 200 μM AA, 1 ng / ml TGFβ3. In a special embodiment, the medium contains the additive consisting of 10 μM DAPT, 20 ng / ml GDNF, 200 μM AA, 20 ng / ml BDNF, 0.5 μM cAMP. In a special embodiment, the medium contains the additive consisting of 10 μM DAPT, 20 ng / ml GDNF, 200 μM AA, 20 ng / ml BDNF, 1 ng / ml TGFβ3. In a special embodiment, the medium contains the additive consisting of 10 μM DAPT, 20 ng / ml GDNF, 200 μM AA, 0.5 μM cAMP, 1 ng / ml TGFβ3. In a special embodiment, the medium contains the additive consisting of 10 μM DAPT, 20 ng / ml GDNF, 200 μM AA, 20 ng / ml BDNF, 0.5 μM cAMP, 1 ng / ml TGFβ3.

[0082] The term “neural induction medium” refers to the medium for the neural induction of pluripotent stem cells. This medium enables efficient generation of neural progenitor cell using either embryoid body-or monolayer culture-based protocols. Specifically, the neural induction medium is consisted of neurobasal medium and the neurogenic additives. For example, the neural induction medium is commercially available product, STEMdiffTM Neural Induction Medium,  PSC Neural Induction Medium and so on. In some embodiments, the neural induction medium is DMEM / F-12 with 1 x NEAA, 1 x N2 supplement.

[0083] In some embodiments, the medium provided in this invention for differentiating A10 precursor cells, comprising neural induction medium and the additive, the neural induction medium is DMEM / F-12 with 1 x NEAA, 1 x N2 supplement; the additive consisting of 10 μM DAPT, 20 ng / ml GDNF and 200 μM AA.

[0084] In some embodiments, the medium comprises neural induction medium and the additive, the neural induction medium is DMEM / F-12 with 1 x NEAA, 1 x N2 supplement; the additive consisting of 10 μM DAPT, 20 ng / ml GDNF, 200 μM AA, 20 ng / ml BDNF, 0.5 μM cAMP and 1 ng / ml TGFβ3.

[0085] The term “neurobasal medium” refers to the basal medium designed for long-term maintenance of the normal phenotype and growth of neuronal cells. For example, the neurobasal medium may be DMEM / F-12, NeurobasalTM Plus medium, NeurobasalTM medium, Essential 8TM medium, TeSRTM-E8TM, Essential 6 and so on.

[0086] The term “exposure” or “exposing” mDA progenitor cells to a medium comprising the additive composition refers to providing the mDA progenitor cells in a medium that permits the cell or cells access to the additive composition. The “exposure” or “exposing” may be accomplished using any suitable method. For example, “exposure” or “exposing” can be accomplished by adding the additive composition to a cell or population of cells, for example in the context of a cell culture, to achieve the desired concentration. “Exposure” or “exposing” can be accomplished by including the additive composition as a component of a formulated culture medium. The medium can be the basic medium suitable for the growth of neuronal progenitor cells, especially mDA progenitor cells. For example, in some embodiments, the medium is the neural induction medium mentioned above.

[0087] As used herein, “effective amount” refers to the amount of agents (cells or cell preparations of the present disclosure) that are sufficient to obtain desired curative effects. Effective amounts also comprise instances where the therapeutically beneficial effects of the agents outweigh toxic or detrimental effects thereof. Effective amount of agents does not necessarily cure diseases or disorders, but can delay, hinder or prevent the occurrence of the diseases or disorders, or alleviate the symptoms associated with the diseases or disorders. A therapeutically effective amount may be divided into one, two or more doses and administered once, two or more times in an appropriate dosage form within a given period.

[0088] The effective amount of cells population of the present disclosure may vary with the form of administration, the severity of the disease to be treated, and the like. Selection of preferred effective amount can be determined by those skilled in the art based on various factors (e.g. through clinical trials) . Such factors comprise but are not limited to: pharmacokinetic parameters, such as bioavailability, metabolism, half-life, the severity of the disease to be treated, weight, immune status of patients, the form of administration, and so on.

[0089] The term “pharmaceutically acceptable carder” refers to a carrier for the administration of a therapeutic agent, comprising various excipients and diluents. The term refers to a pharmaceutical carder that is, by itself, not essential active ingredients and is not unduly toxic after administration. Suitable carriers are well known to those skilled in the art. Pharmaceutically acceptable carders in compositions may comprise liquids such as water, saline, buffers. In addition, auxiliary substances such as fillers, lubricants, glidants, wetting or emulsifying agents, pH buffering substances and the like may also be present in these carders. The carrier may also comprise cell transfection reagents.

[0090] Various embodiments are described herein. It should be noted that the specific embodiments are not intended as an exhaustive description or as a limitation to the broader aspects discussed herein. One aspect described in conjunction with a particular embodiment is not necessarily limited to that embodiment and can be practiced with any other embodiment (s) . Reference throughout this specification to “in a specific embodiment” , “in some embodiment” , “in certain embodiment” means that a particular feature, structure or characteristic described in connection with the embodiment is included in at least one embodiment of the present disclosure. Thus, appearances of the phrases “aspecific embodiment” , “in one embodiment” or “in certain embodiment” in various places throughout this specification are not necessarily all referring to the same embodiment, but may. Furthermore, a particular feature, structures or characteristics may be combined in any suitable manner, as would be apparent to a person skilled in the art from this disclosure, in one or more embodiments. Furthermore, while some embodiments described herein include some but not other features included in other embodiments, combinations of features of different embodiments are meant to be within the scope of the disclosure. For example, in the appended claims, any one of the claimed embodiments can be used in any combination.

[0091] All publications, publish patent documents, and patent applications cited herein are hereby incorporated by reference to the same extent as though each individual publication, published patent document, or patent application was specifically and individually indicated as being incorporated by reference.

[0092] Experimental Materials

[0093] Cell culture

[0094] H9 hESCs, H1 hESCs, WC-30 hPSCs and reporter H9 hESCs were cultured on a feeder of irradiated mouse embryonic fibroblasts (MEFs) in the ESC medium consisting of Dulbecco's Modified Eagle's medium / Nutrient Mixture F-12 (DMEM / F-12) , lx Non-Essential Amino Acids (NEAA) , 0.5 x Glutamax, 0.1 mM 2-Mercaptoethanol, and 4 ng / ml FGF-2. Cells were fed daily with ESC medium and passaged weekly by Dispase II. The cell lines tested negative for mycoplasma contamination.

[0095] Construction of donor plasmid and generation of hESC line

[0096] Donor plasmids were designed as following structure: 5'homology arm includes about last 1000 bp sequence of the last exon of selected genes before the stop codon; in-frame P2A and fluorescent protein or other expression cassettes were inserted before the stop codon of the last exon of selected genes; human GH polyA, mouse PGK promoter, puromycin or neomycin resistance gene and polyA sequence were inserted following in-frame P2A and expression cassettes; 3'homology arm includes stop codon and following about 1000 bp sequence.

[0097] Maturation of A10-like and A9-like midbrain dopaminergic neurons

[0098] For in vitro analysis, the neurospheres were dissociated by Accutase at 37℃ for 5 minutes and plating onto Matrigel-coated glass coverslips. And for further maturation, cells were cultured in the Neural differentiation medium (Neurobasal Medium with 1 x N2 supplement, 1 x B27 supplement, 1 x NEAA) supplemented with 10ng / ml BDNF, 10ng / ml GDNF, 200 μM AA, 1 μM cAMP, 1 ng / ml TGFβ3 and 0.1 μM Compound E for at least 10 days (for example, for 8, 11, 15, 22, 25 or 29 days) . Generation of forebrain glutamate neurons

[0099] Induction of forebrain glutamate neurons from hESCs was described before (Zhang et al., 2001) . Briefly, H9 hESC colonies were detached from the feeder layer and grown in the ES medium for 4 days to help form cell aggregates. For neural induction, cell aggregates were cultured in flasks fed with NIM supplemented with 2μM SB431542 and 2μM DMH-1 for 3 days. The ESC aggregates were then adhered to 6-well plates in the presence of NIM till formation of neural tube-like rosettes at around day 16. The rosettes were gently blown off by a 1 mL pipette and suspended in the same medium for another 10 days. Then, neuron spheres were digested into small spheres with Accutase for 4 min at day 26. After an additional 1 day culture in flask with NIM, small spheres were collected and matured in NDM supplemented with 10 ng / ml BDNF, 10 ng / ml GDNF, 200 mM AA, 1 mM cAMP, 10 ng / ml IGF1 on glass coverslips.

[0100] Animal surgery and cell transplantation

[0101] All the animal experiments were performed according to a protocol approved by the animal care and use committee at the Institute of Neuroscience, CAS Center for Excellence in Brain Science and Intelligence Technology, Chinese Academy of Science. Adult SCID mice (7-8 weeks) were anesthetized with 2%isoflurane mixed in oxygen. For the functional properties test, hESC-cell-line-induced progenitors were disassociated with Accutase on day 32 and 100,000 cells were resuspended in 1μl ACSF containing Rock inhibitor (0.5 μM) , 10%B27 without VA, 20ng / ml GDNF, 200 μM AA and injected into the Nucleus Accumbens (anterior-posterior [AP] = + 0.9 mm, medial-lateral [ML] = ± 1.6 mm, vertical [V] = -4.5 mm) or Ventral Tegmental Area (AP = -3.3 mm, ML = -0.5 mm, V = -4.2 mm) . To illustrate the axonal projection of grafted neurons, 1 μl 6-OHDA (3 mg / ml, in saline with 1%ascorbic acid, Sigma) was directly injected into the left Ventral Tegmental Area (AP = -3.3 mm, ML = -0.5 mm, V = -4.2 mm) and cells were injected into the same location 4 weeks after 6-OHDA-lesion surgery.

[0102] Tissue preparation and immunocytochemistry

[0103] Cells on the coverslips were fixed with 4%paraformaldehyde (PFA) for 20 min, washed with DPBS, permeabilized with 0.2%Triton X-100 for 10 minutes and blocked using 10%donkey serum for 1 hour at room temperature (RT) . Then the cells were incubated with the primary antibodies diluted in the buffer with 5%donkey serum and 0.1%Triton X-100 for overnight at 4℃. Secondary antibody staining was performed the same as on cells. The coverslips were mounted by Fluoromount-GTM (Southern Biotech) .

[0104] For mouse brain slice staining, animals were deeply anesthetized and transcardially perfused with 0.9%saline solution followed by ice-cold 4%PFA. The brains were removed and post-fixed for 4 hours in 4%PFA, followed by 20%, 30%sucrose until sunk. Coronal sections were collected on a cryostat (Leica) at a thickness of 30 μm and stored in cryo-preservative solution at -20℃. The sections were blocked with 10%donkey serum, 0.3%Triton X-100 for 1 hour at RT and incubated with primary antibodies diluted in 5%donkey serum, 0.2%Triton X-100 2 hours at RT, and then transferred to 4℃ ovemight. Sections were incubated with appropriate Alexa flour dyes conjugated secondary antibodies and mounted with Fluoromount-GTM.

[0105] RNA FISH experiment was performed using RNA-Scope reagents and protocols (ACD Bioscience, CA) following the manufacturer's instructions for coverslip fixed with 4%paraformaldehyde (PFA) for 20 min. For Figure 5D, immunohistochemistry was performed following RNA FISH.

[0106] Imaging and quantification

[0107] All the Fluorescence images were taken on a Nikon TIE inverted microscope (60x and 20x magnification) . For cultured neurons, the number of each markers positive cells were counted from the images obtained at 60x magnification and at least six fields of each coverslip were chosen randomly, and three coverslips in each group were counted with ImageJ software. For garfts, the number of tdTomato+, tdTomato+EGFP+, Ho+ cells were counted from the images obtained at 20x magnification and at least six mice with typical images of grafts were counted with ImageJ software. For measuring the subtype specific fiber density in the brain slice of grafted mice, one typical section per animal of each target brain area were chosen to stain with tdTomato and EGFP, at least six animals were measured. The images were obtained at 20x magnification and data were shown as optical density in different areas analyzed by ImageJ software.

[0108] Post-mitotic cell sorting

[0109] NURRl-driven tdTomato expressing mDAprogenitorss at day 28 of differentiation from hESC line were sorted by MA900 Multi-Application Cell Sorter. The tdTomato positive cells were equally divided into two bottles which were cultured in the NIM for 1 week, one supplemented with 10 μM DAPT, 20ng / ml GDNF and 200 μM AA and the other supplemented with 20ng / ml SHH, 0.1μM SAG and 20ng / ml FGF8b. Until D35, the cells were plated onto Matrigel-coated glass coverslips for further maturation.

[0110] scRNA-seq using the 10x genomics chromium platform

[0111] For in vitro differentiated samples, the attached mature neurons were digested using TrypLE Express Enzyme for 12 minutes at 37℃ and washed twice with neural induction medium. Cells were collected and gently pipetted, then passed through a 35-μm cell sieve (BD) to obtain a single-cell suspension and sorted with MA900 Multi-Application Cell Sorter (Sony, Japan) . Chromium Single Cell 3'Reagent Kits (v3) were used for library preparation (10X Genomics) . Libraries were sequenced on an Illumina Hiseq PE150.

[0112] Processing of scRNA-seq data

[0113] Data processing were performed as previously reported (Xu et al., 2022) . In brief, scRNA-seq data were aligned with the human reference genome, GRCh38-3.0.0, and demultiplexed using the default parameters of Cellranger software (10x Genomics, v4.0.0) . The filtered count matrix was analyzed and processed using Seurat (v3.1.4) and Scanpy (v3.0.46) , including data filtering, normalization, highly variable genes selection, scaling, dimension reduction, and clustering. First, scRNA-seq data was created as Seurat object. Genes with less than 3 counts were removed and cells with less than 200 genes detected were removed. Highly variable genes were calculated using “FindVariableFeatures” function in Seurat and 2000 highly variable genes were used to calculate principal components in the “RunPCA” function in Seurat. 100 principal components (PCs) were obtained and stored in Seurat object for computing neighborhood graph and umap in Scanpy. Second, Seurat object was converted into a loom file and imported into Scanpy for clustering. A neighborhood graph of observations was computed by the “scanpy. pp. neighbors” function in Scanpy and the leiden algorithm was used to cluster cells by “scanpy. tl. leiden” function in Scanpy.

[0114] Bulk RNA-seq sequencing and data analysis

[0115] For transcriptional analysis of control or GAD treatment cells, cells were prepared to differentiate into mDA progenitors on day 35. Cells were digested as described above for scRNA-seq and double-positive cells of each reporter cell line were sorted by MA900 Multi-Application Cell Sorter. The sorted cells, hESC-derived forebrain glutamate neurons and hESC were lysed in the TRIZOL and then RNA of these cells were extracted for sequencing. Sequencing libraries were generated using NEBNext UltraTM RNA Library Prep Kit for Illumina (NEB, USA) and sequenced on an Illumina Hiseq PE150. Raw sequencing reads were processed by quality control and adaptor trimming. Data processing were performed as previously reported (Xu et al., 2022) . In brief, clean sequencing reads were mapped to the UCSC human GRCh38 genome with HISAT2 software (v2.1.0) . Bam files were generated using Samtools (v1.7) and reads were counted by the ‘summarizeOverlaps’ function in the GenomicFeatures R package (v1.38.2) . Differential expression analysis was performed using the ‘glmTreat’ function in edgeR R package (v3.28.1) . DEGs were chosen with an absolute fold change of ＞1 (|Log2FC| ＞ 1) and sorted by Benjamini-Hochberg adjusted p-value. DEGs volcano plot was plotted using the EnhancedVolcano R package (v1.4.0) , the chosen cutoff for statistical significance was 0.01, and chosen cutoff for absolute log2 fold-change was 5. Gene Ontology (GO) enrichment analysis was performed using ‘enrichGO’ function in ‘clusterProfiler’ R package (v3.14.3) with top 200 DEGs (control or GADgroup) , Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) enrichment analysis was performed using ‘enrichKEGG’ function in ‘clusterProfiler’ R package (v3.14.3) with top 200 DEGs (control or GAD group) , enrichment analysis based on DisGeNET was performed using ‘enrichDGN’ function in ‘DOSE’ R (v3.12.0) package with top 200 DEGs (control or GADgroup) .

[0116] Whole-cell patch-clamp recording of coverslip and brain slice

[0117] For coverslip cultured neurons, the coverslips were transferred to a recording chamber and perfused continuously at 2-4ml / minutes oxygenated ACSF at 28 ℃. For light induced excitatory and inhibitory postsynaptic currents (iEPSC, iIPSC) recording, optogenetic stimulation of channelrhodopsin 2 (ChR2) -expressing inputs was achieved with wide-field illumination using a blue LED (470 nm, 2 ms, 1.5 mW / mm2) in cultured mDA neurons. For iEPSC or iIPSC recording, cells were voltage clamped at -60 mV or 10 mV, respectively. Chemically genetically induced action potentials changed with the absence or presence of CNO (40 mM) in cultured mDA neurons.

[0118] Coronal brain slices (300 μm thick) at the level of the forehrain were prepared from grafted mice after 6 months of cell transplantation using a vibratome (Leica VT1200S) in an ice-cold cutting solution (100 mM glucose, 75 mM NaCl, 26 mM NaHCO3, 2.5 mM KCl, 2 mM MgCl2-6H20, 1.25 mM NaH2PO4-6H20, and 0.7 mM CaCl2) . The slices were transferred to the recording artificial cerebrospinal fluid (ACSF, 124 mM NaCl, 4.4 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgSO4, 25 mM NaHCO3, 1 mM NaH2PO4, and 10 mM glucose) saturated with 95%O2 and 5%CO2 at 32℃ for 12 minutes, and then transferred into ACSF at room temperature for recovery. After 60 minutes of recovery, slices were transferred to a recording chamber and peffused continuously at 2-4 ml / minutes with oxygenated ACSF at 28 ℃. Transplanted A10-like mDA precursors were identified by tdTomato and EGFP fluorescence co-expressing in the graft while A9-like by only tdTomato expressing.

[0119] The initial access resistance was monitored throughout the experiment, ranging from 15-30 MΩ. Cells with the access resistance changed ＞ 15%were discarded. Data were filtered at 1 kHz and digitized at 10 kHz. Voltage and current signals were recorded by Axon 700B amplifier (Axon) . The recording electrodes (3-5 MΩ) were filled with internal solution (120 mM K+-Glucose, 5 mM NaCl, 0.2 mM EGTA, 10 mM HEPES, 2 mM MgATP, 0.1 mM Na3 GTP and 10 mM Phosphocreatine, adjusted to PH 7.2 with HCl) for action potential recording. Action potentials (APs) in response to the depolarizing currents (0-180 pA, step 20 pA, duration 600 ms) were recorded in the current-clamp mood. Ramp current inj ecfions (100-300 pA, duration 2000 ms) were used to record the maximal discharging frequencies of mDA neurons. Voltage sag measurement was conducted under current-clamp mode by injecting current (-120 pA, duration 2000 ms) into the grafted mDA neurons.

[0120] The recording electrodes (3-5 MΩ) were filled with internal solution (112 mM Cs-Gluconate, 5 mM TEA-Cl, 3.7 mM NaCl, 0.2 mM EGTA, 10 mM HEPES, 2 mM MgATP, 0.3 mM Na3GTP and 5 mM QX-314, adjusted to PH 7.2 with CsOH) for spontaneous excitatory post-synaptic current (sEPSC) and spontaneous inhibitory post-synaptic current (sIPSC) recording. For sEPSC or sIPSC recording, ceils were voltage clamped at -60 mV or 10 mV, respectively.

[0121] Depression model and Behavior test

[0122] To activate the grafted A10-like mDA neurons, the behaviors were recorded after 10 min with intraperitoneal CNO (1.2mg / kg) injection.

[0123] Open field test (OPT) . The mice were placed in the center of arena (40cm x 40cm x 40cm) in a room for 30 min. A video camera positioned directly above the arena was used to track the movement of the mice. The video data was analyzed by Noduls EthoVision XT software which the total distance and the velocity of movement, the frequency and duration of entering the center of arena were measured.

[0124] Elevated plus maze (EPM) test. Mice were place in the center of the elevated plus maze which consists of four arms (two open without walls and two enclosed by 15.5cm high walls) 40cm long and 5cm wide and freely moved for 5 min. A video camera positioned directly above the arena was used to track the movement of the mice. The video data was analyzed by Noduls EthoVision XT software and the duration and frequency of entering in the open arms were measured.

[0125] Chronic restraint stress (CRS) depression model. Mice were subjected to chronic-restraint stress by placement in 50-ml conical tubes with holes for air flow for 2-3 h per day for 14 consecutive days.

[0126] Sucrose preference test (SPT) . Mice were single housed and habituated with two bottles of water for 2 days, followed by two bottles of 2%sucrose for 2 days. Mice were then water deprived for 24 h and then exposed to one bottle of 2%sucrose and one bottle of water for 2 h in the dark phase. Bottle positions were switched after 1 h (for 2 h test) . Total consumption of each fluid was measured and sucrose preference was defined as the average sucrose consumption ratio during the two hours. Sucrose consumption ratio was calculated by dividing the total consumption of sucrose by the total consumption of both water and sucrose.

[0127] Tail suspension test (TST) . Mice were gently suspended by adhesive tape to secure their tail to a horizontal bar far away from the floor. The mice could not climb up their tails during the test. Video camera was positioned from the front side of the mice to track the behavior of the mice. The immobile time during the total 6-min test were counted offiine by blind manual scoring.

[0128] Forced swim test (FST) . Mice were individually placed in a cylinder (12 cm diameter, 25 cm height) of water (23-25 ℃) and swam for 6 min under normal light. Water depth was set to prevent animals from touching the bottom with their tails or hind limbs. Video camera was positioned from the side of the cylinder to track the behavior of mice. The immobile time during the last 4-min test was counted offline by an observer blinded to animal treatment. Immobile time was defined as time when animals remained floating or motionless with only movements necessary for keeping balance in the water.

[0129] In vivo mierodialysis with awake depression model mice

[0130] Before microdialysis, a cannula was inserted above NAc with the following co-ordinates: AP +0.9 mm, ML 1.6 mm, DV -3.0 mm into depression model mice. Mice were single housed and received gel nutritional supplements for recovery after surgery. One week after implant surgery, the mice were fixed onto heat holder instrument. Then remove the core from the cannula with replacement of microdialysis probe. Proceeding microdialysis with artificial cerebrospinal fluid by microinjection pump in perfusion rate of 0.2 μl / min for 1 h to equilibrium. Then the perfusion rate was tuned to 1 μl / min for collection. The dialysate was collected every 45 min with collection vial contained 15 μl 10-7M ascorbic acid as an antioxidant. Next, analyzed dopamine and their metabolites or glutamate concentration in dialysate with HPLC (Thermo UltiMate 3000-dopamine, H-Class Plus UPLC-glutamate) . Furthermore, the dialysate was collected after 10 min with intraperitoneal CNO (1.2mg / kg) injection.

[0131] The reagent or resource in the present invention are shown in table 1 and the oligonucleotides are shown in table 2.

[0132] Table 1 The reagent or resource

[0133] Table 2 The Oligonucleotides

[0134] Note: Two sgRNAs are used simultaneously in the contruction of the cell line.

[0135] Example 1

[0136] There are reports about anatomical and functional distinctions among the three major subgroups of mid-brain dopaminergic (mDA) neurons, i.e., the retrorubral field (RRF, A8) , the substantia nigra pars compacta (SNc, A9) , and the ventral tegmental area (VTA, A10) . It has been known that A10 subtype located in VTA predominantly express CALBINDIN (CALB1) while A9 subtype is marked by KCNJ6 (also known as GIRK2) (Thompson et al., 2005) . To identify the subtypes of mDA neurons obtained in the following examples, we constructed a reporter hESC line as illustrated in Figure 2A. In the engineered cell line called TH-tdTomato / CALB1-EGFP hESCs, tdTomato expression cassette and EGFP expression cassette are respectively knocked into TH (tyrosine hydroxylase, rate-limiting enzyme for dopamine synthesis) locus and CALB1 locus. Accordingly, after differentiation using this cell line, it will be observed that dopaminergic neurons (including A9 neurons and A10 neurons) emit red fluorescence, while A10 neurons (including their precursors) emit green fluorescence in addition to red fluorescence (Figure 2B-2E) .

[0137] Example 2

[0138] The example describes two exemplified methods for induction of the midbrain dopaminergic A10 neurons in vitro, and the comparative methods as control.

[0139] Comparative Example 1:

[0140] A9 protocol: Human PSCs were cultured on mouse embryonic fibroblast feeder in the neural induction medium (NIM) (DMEM / F-12, 1 x NEAA, 1 x N2 supplement) supplemented with 2 μM SB431542, 2 μM DMH-1, 0.4 μM CHIR99021 and 500ng / ml SHH (C25II) for 7 days (Stage I) . On day 8, individual colonies of neuroepithelial cells were gently blown off with a pipette and replated on mouse embryonic fibroblast feeder in the NIM containing 1 μM SAG, 100ng / ml SHH and 0.4 μM CHIR99021 for additional 6 days (Stage II) . On day 14, the colonies were gently blown off again and keep in suspension in the NIM with CHIR99021 removed, SHH reduced to 20ng / ml, SAG reduced to 0.5 μM and 100ng / ml FGF8b till day 21 (Stage III) . Then, the precursor s were kept in the NIM containing 20ng / ml SHH, 0.1 μM SAG and 20ng / ml FGF8b and changed the medium per week until to transplantation at day 32 or until to maturation at day 35.

[0141] Preparation example 1:

[0142] A10 protocol 1: Briefly, the TH-tdTomato / CALB1-EGFP hESC cells were cultured in the neural induction medium (NIM) (DMEM / F-12 supplemented with 1 x NEAA, 1 x N2 supplement) by sequential application of small molecule activators as below.

[0143] Stage I: The initial cells were cultured on mouse embryonic fibroblast feeder in the NIM supplemented with 2 μM SB431542, 2 μM DMH-1, 0.4 μM CHIR99021 and 500ng / ml SHH (C25II) for 7 days.

[0144] Stage II: On Day 8, individual colonies of neuroepithelial cells were gently blown off with a pipette and then re-seeded on mouse embryonic fibroblast feeder in the NIM containing 1 μM SAG, 100ng / ml SHH and 0.4 μM CHIR99021 for from Day 8 to Day 13.

[0145] Stage III: On Day 14, the colonies were gently blown off again and then maintained in suspension in the NIM with 0.5 μM SAG, 20ng / ml SHH and 100ng / ml FGF8b from Day 14 to Day 20.

[0146] Stage IV: On Day 21 to Day 27, the cells were maintained in the NIM containing 0.1 μM SAG, 20ng / ml SHH and 20ng / ml FGF8b.

[0147] Stage V: On Day 28, the medium was changed to NIM containing 10 μM DAPT, 20ng / ml GDNF and 200 μM AA, and the cells were cultured in the medium for 7 days, then to maturation.

[0148] This A10 scheme was also referred to as the GAD protocol, which was illustrated in Figure 2J.

[0149] Preparation example 2:

[0150] The example describes another exemplified method for induction of the A10 mDA neurons in vitro.

[0151] A10 protocol 2: The culture scheme is the same with GAD protocol, except for the medium used in Stage V was NIM supplemented with 10 μM DAPT, 20 ng / ml GDNF, 200 μM AA, 20 ng / ml BDNF, 0.5 μM cAMP and 1 ng / ml TGFβ3.

[0152] This A10 scheme was also referred to as the GBCATD protocol, which was illustrated in Figure 1A.

[0153] According to Figure 1B and 1H, the dual reporter (tdTomato and EGFP) expression was validated in cells derived from GAD and GBCATD schemes, indicating the hESC lines in both schemes has had undergone in vitro A10 mDA neuron differentiation and given rise to A10 mDA neurons co-expressing TH and CALB1. In comparison, in our multiple-stage protocol for DA neuron differentiation (A9 protocol; Figure 1A) , a cell population composed mainly of A9 DA neurons (around 80%) has been observed, which contains merely a small amount of A10 subtype (around 15%) .

[0154] Figures 1K, 1L, 2K-2N show the immunostaining results of the cells obtained from Comparative Example and GAD protocol (with an additional maturation stage of 13 days) . Most of the TH+-CALB1+ A10 subtype neurons co-expressed OTX2 (71.4±3.4%) , EN1 (91.3±2.0%) and FOXA2 (98.3±1.0%) , which are transcription factors specific to midbrain dopaminergic neurons (Figures 1K, 1L) . Some of tdTomato+-EGFP+ A10 mDA neurons were co-stained with GIRK2 but few co-labelled with PITX3 (Figure 2K-N) which is found more specifically to dorsal SNc A9 subtype. Furthermore, less of 15%TH-tdTomato+ mDA neurons were EGFP negative and expressed GIRK2 or PITX3 which were considered as A9 subtype neurons, indicating the few generations of A9 mDA neurons.

[0155] Example 3

[0156] The A9 and A10 subtypes share a lot of key events during their development, especially in the earlier stages. Therefore, we keep the early part of the A9 protocol and set out to modify culture conditions from stage III (Figure 1A) . Notch has been demonstrated to play important roles in subtype specification of a variety of neuronal types, such as motor neurons, spinal cord intemeurons, retinal cells, etc. Also, Notch signaling blockage has been shown to promote neuronal differentiation from neural stem cells in vitro.

[0157] In this example, we tested whether Notch inhibition played a central role in altering DA neuron subtype outcome by using the γ-secretase inhibitor N- [N- (3, 5-difluorophenacetyl) -L-alanyl] -S-phenylglycine t-butyl ester (DAPT) to block Notch signaling. Further, we also tested what effect did the combination of Notch inhibition with other neurotrophic or growth factors related to mDA neurons differentiation and neurogenesis have on the induction efficiency of the midbrain dopaminergic A10 neurons, including BDNF (brain-derived neurotrophic factor) , GDNF (Glial cell line-derived neurotrophic factor) , AA (L-ascorbic acid) , cAMP (cyclic adenosine monophoshate) and TGFβ3 (Transforming growth factor beta 3) (GBCATD) as the candidate cocktail of regulation factors.

[0158] All the groups used the same scheme of Preparation example 1, except for the Cocktails supplemented in medium of Stage V was the ones listed in the following Table 3.

[0159] Table 3 Promoting effect of different additive components on A10 neurons

[0160] *Note: G: 20 ng / ml GDNF; B: 20 ng / ml BDNF; C: 0.5 μM cAMP; A: 200 μM AA; D: 10 μM DAPT; T: 1 ng / ml TGFβ3.

[0161] The outcome of withdrawal individual factor from GBCATD during stage V were shown in Figures 1F, 1G, 1I, 1J. Notably, in the absence of Notch inhibitor-DAPT, GDNF or AA, both the ratio of A10 subtype (tdTomato+-EGFP+) to total mDA neurons (tdTomato+) and the ratio of A10 subtype to total cells were significantly decreased (Figure 1E-G, Figure 2H) . The number of A10 subtype to total dopaminergic neurons or total neurons did not change without BDNF, cAMP or TGFβ3. These data strongly indicated that GDNF, AA and DAPT are critical for generation of A10 subpopulation from hESCs. To further test the sufficiency of each of the GAD (GDNF+AA+DAPT) for A10 subtype neuron generation, we treated mDA neural progenitors with single or different combination of two molecules from GAD in stage V. Firstly, comprised with GBCATD treatment, GAD treatment displayed similar level of A10 subtype neurons in total TH neurons or in total cells (Figure 1H-J, Figure 2I) . In contrast to control condition, GDNF or DAPT alone or the combinations of GDNF+AA, DAPT+AA or DAPT+GDNF did not increase the percentage of A10 subpopulation to total TH-tdTomato+, while the combinations of DAPT+GDNF but not GDNF+AA or DAPT+AA, significantly increased the ratio of A10 subtype to total cells (Figure 1J) . Taken together, the results indicated both the necessity and sufficiency of the combination of GAD in promotion of A10 subtype neuron generation during mDA differentiation in vitro.

[0162] Example 4

[0163] We further tested whether the cocktail comprising Notch signaling inhibitor could induce more hPSC lines to A10-like induction.

[0164] We applied the same induction scheme as the Preparation Example 1, except for using other hPSC lines (e.g., hESC-H9, hESC-H1 and hiPSC WC-30) as the starting cell line. In case of all three cell lines, high efficiency of A10 subtype neuron induction were observed in GAD protocol (Figure 2O-2R) , confirming the GAD protocol can effectively induce A10 subtype neuron from various hPSC lines.

[0165] Example 5

[0166] The in vivo development of mDA occurs according to a strict neurogenetic timetable. Birth dating studies show that A10 mDA neurons succeed the birth of A9 neurons (Bayer et al., 1995; Bye et al., 2012) . To find out the critical time point of the A10 subtype generation in vitro, we tested the A10-like induction efficiency by treating the cells at different stages (III, IV, V and VI) of the above-mentioned A9 protocol with GBCATD cocktail (Figure 1A) .

[0167] Stage III added GBCATD:

[0168] GBCATD Group (III) : After the first two Stages of A9 protocol, the cells are cultured in the NIM with GBCATD cocktail (10 μtM DAPT, 20 ng / ml GDNF, 200 μM AA, 20 ng / ml BDNF, 0.5 μM cAMP and 1 ng / ml TGFβ3) from Day 14 to Day 20. After the GBCATD treatment, the cells are subject to maturation.

[0169] Control group (III) : The cells are culture according to the same protocol as GBCATD Group (III) , except that the culture medium used from Day 14 to Day 20 is the NIM with 0.5 μM SAG, 20ng / ml SHH and 100ng / ml FGF8b.

[0170] Stage IV added GBCATD:

[0171] GBCATD Group (IV) : After the first three Stages of A9 protocol, the cells are cultured in the NIM with GBCATD cocktail (10 μM DAPT, 20 ng / ml GDNF, 200 μM AA, 20 ng / ml BDNF, 0.5 μM cAMP and 1 ng / ml TGFβ3) from Day 21 to Day 27. After the GBCATD treatment, the cells are subject to maturation.

[0172] Control group (IV) : The cells are culture according to the same protocol as GBCATD Group (IV) , except that the culture medium used from Day 21 to Day 27 is the NIM with 0.1 μM SAG, 20ng / ml SHH and 20ng / ml FGF8b.

[0173] Stage V added GBCATD:

[0174] GBCATD Group (V) : After the first four Stages of A9 protocol, the cells are cultured in the NIM with GBCATD cocktail (10 μM DAPT, 20 ng / ml GDNF, 200 μM AA, 20 ng / ml BDNF, 0.5 μM cAMP and 1 ng / ml TGFβ3) from Day 28 to Day 34. After the GBCATD treatment, the cells are subject to maturation.

[0175] Control group (V) : The cells are culture according to the same protocol as GBCATD Group (V) , except that the culture medium used from Day 28 to Day 34 is the NlM with 0.1 μM SAG, 20ng / ml SHH and 20ng / ml FGF8b.

[0176] Stage VI added GBCATD:

[0177] GBCATD Group (VI) : After the first five Stages of A9 protocol, the cells are cultured in the NIM with GBCATD cocktail (10 μM DAPT, 20 ng / ml GDNF, 200 μM AA, 20 ng / ml BDNF, 0.5 μM cAMP and 1 ng / ml TGFβ3) from Day 35 to Day 41. After the GBCATD treatment, the cells are subject to maturation.

[0178] Control group (VI) : The cells are culture according to the same protocol as GBCATD Group (VI) , except that the culture medium used from Day 35 to Day 41 is the NIM with 0.1 μM SAG, 20ng / ml SHH and 20ng / ml FGF8b.

[0179] Figures 1B, 1C, 2F, and 2G show the fluorescent confocal microscopy images of the cells obtained from Example 5. According to the above-mentioned figures, GBCATD treatment at stages IV, V and VI all significantly increased the ratio of tdTomato+-EGFP+ / tdTomato+, compared with non-treated control, indicating GBCATD treatment may promote the generation of A10 subtype neuron from mDA progenitor. Besides, the ratio of A10 mDA neurons to total cells (tdTomato+-EGFP+ / Hochest) also dramatically increased by GBCATD cocktail treatment at all stages (III, IV, V and VI) during neural differentiation (Figure 1 B, D) . Of note, the percentage of A10 subtype to total dopaminergic neurons or total cells both peak after GBCATD cocktail-treatment in stage V (Figure 1B-D) , indicating a critical period for A10 subtype neuron specification during mDA neural differentiation in vitro.

[0180] Taken together, we established a protocol to generate A10 mDA neurons efficiently by GAD or GBCATD treatment at certain stages during mDA differentiation in vitro (Figure 2J) . In search for factors may be involved in DA neuron subtype specification, we took the advantage of knowledge obtained in studies on neural development. We found that more mDA neurons were produced upon Notch inhibition specially in early stage, with no difference between A9 and A10. In later stages, Notch inhibition promote generation of A10 subtype neurons over A9, peaking at stage V, which suggests Notch may play a role in subtype specification as it does in developing spinal cord. These results offer a new insight into subtype specification of mDA neurons and suggest that regulation of subtype specification by NOTCH signaling may be conserved across the nervous system.

[0181] Example 6

[0182] To explore the underlying molecular mechanism of GAD in A10 mDA neuron generation, bulk RNA-seq analysis was performed on the precursors obtained by Preparation Example 2 or Comparative Example 1 (maintaining SHH, SAG and FGF8b) on day 35. The results were shown in Figures 2A to 2C.

[0183] In Figure 3A, differentially expressed genes (DEGs) analysis showed that genes related to cell cycle exit and neurogenesis such as CEND1, MYT1L, MAST1 and ITGA3 (Gaitanou et al., 2019; Jing et al., 2020; Loulier et al., 2009; Mall et al., 2017) were up-regulated in GAD treatment group, while Notch signaling related genes, NOTCH1, NOTCH3, HES5 and HEY1 (Maier and Gessler, 2000; Ohtsuka et al., 1999) were highly expressed in the control group. According to Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) pathway enrichment analysis, we found that addiction related pathways and MAPK signaling pathway were up-regulated in the GAD group while cell cycle and Notch signaling pathway were enriched in the control group (Figure 3B) . Also Gene Ontology (GO) enrichment analysis showed that the top significant enriched biological process terms in GAD treatment progenitors was activity related to channel and neurotransmitter, while cyclin-dependent protein serine was enriched in control group (Figure 3C) . These data indicate the strong influence of Notch signaling in regulation of A10 subtype generation.

[0184] Notch signaling inhibition causes cell cycle exit which is found coupled with subsequent neurogenesis (Imayoshi et al., 2013; Rao et al., 2009) . To verify the DAPT (with G, A) treatment caused cell cycle exit of mDA progenitors, we exposed cells with 5-Ethynyl-2-deoxyuridine (EdU) at different timepoints (Figure 4A) . Only 30%of the outcome DA neurons (tdTomato+) or A10-like mDA neurons (tdTomato+EGFP+) were from proliferating progenitors under GAD treatment at stage V and no DA or A10-like mDA neurons were from proliferating progenitors after GAD treatment at stage VI, while the majority (60%) of DA and A10-like mDA neurons were from progenitors before GAD treatment (Figure 4B-4D) . These results show that GAD treatment indeed drove proliferating progenitors to exit cell cycle.

[0185] Example 7

[0186] Notch signaling pathway not only regulates neurogenesis and but also has been demonstrated to have a direct effect on specifying subtype identity of motor neuron, spinal cord intemeuron and etc. (Butts et al., 2017; Del Barrio et al., 2007; Mizeracka et al., 2013; Tan et al., 2016) . Based on the results of Examples 5 and 6, we hypothesized that the subtype selection effect of the combination of small molecules of the present disclosure, especially of Notch inhibitor, may partially take place post-mitotically. As shown in Figure 3D, to test this hypothesis and explore regulation of Notch signaling in A10 generation, we constructed a NURRl-driven (NURR1 is a post-mitotic marker for mDA neurons) (Saucedo-Cardenas et al., 1998) , tdTomato-expressing hESC line (NURRl-tdTomato cells) by CRISPR / Cas9 based knock-in approach to mark spontaneous post-mitotic cells.

[0187] We then used fluorescence-activated cell sorting (FACS) -based isolation of early post-mitotic NURR1+ cells on Day 28 of A10 protocol. We randomly divided the sorted NURR1+ cells into three groups which were treated with GA (GDNF+AA) or GAD or control (SHH, SAG and FGF8b) during the stage V and then maturated into neurons. The immunostaining results showed that both GA and GAD treatment increase the generation of A10-like mDA neurons. compared with control. Surprisingly, the mDA neurons generated by GAD treatment are mainly composed of A10 subtypes (above 80%) . Therefore, it is suggested that the mDAprogenitors at post-mitotic period are highly responsive to the A10-like induction of the present disclosure and GAD treatment is far more effective to induce the mDA progenitor cells to differentiate into A10 subtype compared with GA and control group (Figure 3E-F) . Taken together, the inhibition of Notch signaling pathway not only drives progenitors to exit cell cycle but also regulates subtype specification of A10 mDA subtype post-mitotically.

[0188] Example 8

[0189] The mDA neuron cells prepared by the same method of Preparation Example 1 and matured for another 11 days were used to further verify the molecular characteristics of the derived mDA neurons. We used single-cell RNA-sequencing (scRNA-seq) analysis to perform the molecular census on the 46-days-old differentiating TH+ mDA neurons which were isolated from the differentiated TH-driven-tdTomato-expressing (TH-tdTomato) reporter hESC line by FACS (Figure 5A and 6A-6C) . We also performed clustering analysis for sorted cells from two different protocols, the current protocol for A10-like mDA neuron enrichment (i.e., the A10 protocol according to Preparation Example 1) and the protocol for A9-like mDA neuron (i.e., the A9 protocol according to Comparative Example 1) .

[0190] Most of the cells highly expressed FP and midbrain markers such as NR4A2, FOXA2, EN1 and LMX1A, suggesting the mDA neural fate. Furthermore, we found that the main cluster (cluster 0) in cells from A10 protocol was identified as A10-like mDA neurons by expression of specific markers CALB1, CALB2 while the main one (cluster 1) in cells from the A9 protocol was identified as A9-like mDA neuron by the expression of PITX3 and KCNJ6 (Figure 5B-5E) . Consistent with the histological inspection above (Figure 2I-2L) , a small amount of CALB1+ A10-like mDA neurons expressed KCNJ6 and PITX3 (Figure 5D) . We also found that some cells in A9-like mDA neuron cluster expressed SOX6 the other markers of A9 mDA neurons (Figure 6D) . Moreover, no cells express POU4F1 (also known as BRN3A) which is an important marker for red nucleus, indicating the absence of A8-mDA-like cells (Figure 6D) . We then performed KEGG pathway enrichment analysis based on the top 200 differentially expressed genes (DEGs) to show the different biological functions of these DEGs. We found that some pathways which were reported related to A10 mDA neurons such as oxytocin signaling pathway, amphetamine addiction and cocaine addiction (Morales and Pickel, 2012; Xiao et al., 2017) were enriched in the derived A10-like mDA neurons while pathways of Parkinson disease, Huntington disease and other related neurodegeneration diseases (Chen et al., 2013; Dauer and Przedborski, 2003) were enriched in the derived A9-like mDA neurons (Figure 5F, 5G) . The different functions between the hPSCs-derived A10 and A9-like mDA neurons were consistent with reported endogenous functions. Moreover, consistent with the histology results in Figure 1, we observed that 62%of the cells from A10 protocol were identified as A10-like mDA neurons while only 16%percent of cells were in A9-like mDA neuron cluster (Figure 5H) , further confirming that following our protocol enabled to achieve enrichment of A10 subset.

[0191] With the highly expressed genes and canonical markers, we also identified some other small neuronal clusters including glutamatergic neuroblasts (cluster 2, SLC17A6 also known as VGLUT2, ASCL1) , glutamatergic neurons (cluser3, VGLUT2, ADCYAP1) , GABAergic neurons (cluster 6, SLC32A1, GAD1, GAD2) , serotonergic neurons (cluster 7, FEV, TPH2) , motor neurons (cluster 8, SLC18A3, PHOX2A, PHOX2B) , vascular leptomeningeal cells (VLMC) (cluster 6, COL1A1, LUM) and two small unidentified clusters with cells expressing CRABP1 and NKX2.2 (cluster 4 and 5) (Figure 6D) . These cells without mDA neural fate might have had expressed TH during the differentiation and were sorted before quencher of red fluorescent.

[0192] Example 9

[0193] Interestingly, we observed that cells of A10-like mDA neuron cluster highly expressed VGLUT2 while only a few cells in A9-like mDA neuron cluster did so (Figure 5D, 5E) . These results was consistent with the previous reports that Vglut2 mRNA is expressed in TH-expressing subpopulations ofVTA dopamine neurons, whereas those in the SNc show barely detectable levels of Vglut2 mRNA (E1 Mestikawy et al., 2011; Kawano et al., 2006) . Meanwhile, some studies have proved that TH and VGLUT2-co-expressing dopaminergic neurons found in VTA but not SNc of both non-human primates and humans are able to co-release glutamate (Hnasko et al., 2010; Root et al., 2016) , suggesting that the derived-A10-like mDA neurons may be able to release glutamate.

[0194] To confirm their ability to co-release glutamate, we firstly examined the expression of SLC17A6 mRNA in the A10-like mDA neurons derived from TH-tdTomato / CALB1-EGFP hESC line by  combined with immunohistochemistry. We observed that SLC17A6 mRNA located in the soma of the neurons. Quantitative analyses revealed that SLC17A6 mRNA was expressed in 79.0 ± 2.6%TH and CALB1 double positive neurons while in only 22.4 ± 4.1%of TH positive and CALB1 negative neurons (Figure 7A, 7B) .

[0195] Secondly, to verifiy the co-release of glutamate from presynaptic A10-like mDA neurons, we examined the induced currents on postsynaptic membrane in response to released neurotransmitters. We then established a TH-vCre / CALB1-vloxp-stop-vloxp-iCre / AAVS1-DIO -CHR2-EYFP hESC line by inserting vCre recombinase expression cassette into TH locus and vloxp-stop-vloxp-iCre expression cassette into CALB1 locus by CRISPR and knocking the DIO-CHR2-EYFP expression cassette into AAVS1 locus by TALEN, in which CHR2 were only expressed in the TH and CALB1 double positive cells after differentiation (Figure 7C and 8A) . The specificity of this system was evidenced by exclusive EYFP expression in the TH+and CALB1+ A10-like mDA neurons (Figure 8B-8D) . By this tool hESC line, we were able to selectively activate A10 mDA neurons by optogenetics (Figure 8E-8F) . To confirm this co-release is subtype specific to A10 mDA neurons, we also examined derived A9-like neurons as control. We chose TH and PITX3 as A9 neuron marker. We created the TH-vCre / PITX3-vloxp-stop-vloxp-iCre hESC line and infected them with the lentiviral DIO-CHR2-EYFP after differentiation into A9-like neurons following the published protocol (Chen et al., 2016) to achieve specifically activation in A9-like neurons (Figure 7F) . After optical activation, we recorded light-induced excitatory and inhibitory postsynaptic currents (iEPSCs and iIPSCs) from visually identified non-A10-like or non-A9-like neurons on the coverslips. As shown in Figure 7D, Whole-cell voltage-clamp recordings revealed that optical stimulation of A10-like mDA neurons resulted in iEPSCs in 17 / 32 neurons with no iIPSC found and the light-evoked EPSCs were blocked by CNQX (a competitive antagonist of AMPA / Kainate glutamate receptors) . Nevertheless, there no iEPSCs and iIPSCs were found after optical stimulation of A9-like neurons (Figure 7E, 7F) , suggesting the specific ability of the induced-A10-like dopamine neurons to release glutamate.

[0196] Next, we wondered whether the ability of this functional ability to co-release glutamate still remains after transplantation in vivo. We transplanted the Day 32 A10-like mDA precursors derived from TH-vCre / CALB1-vloxp-stop-vloxp-iCre / AAVS1-DIO-CHR2-EYFP hESC line, which have had been treated with GAD for 4 days, into mouse brain. Since NAc is the main innervation target of A10 mDA neurons related to regulation of reward, motivation and many other important functions and can be a potential therapeutic target of cell transplantation therapy (Mohebi et al., 2019; Roitman et al., 2008) , we chose ventral striatum for transplantation. Six months after transplantation, we used whole-cell voltage-clamp recordings on grafted brain slice to record iEPSCs from the non-A10-like mDA neurons (Figure 7G) . iEPSCs were recorded in six of eighteen cells after the optical activation and the light-evoked EPSCs were also blocked by AMPAR antagonist CNQX (Figure 7H, 7I) , indicating that the grafted A10-like mDA neurons are also capable to co-release glutamate as those endogeneous dopaminergic neurons found in VTA.

[0197] Example 10

[0198] To determine the ability of derived cells to survive, differentiate and mature in vivo, we transplanted the A10-reporter-hESC-line-derived precursors into NAc of SCID mice, at day 32, after 4 days treatment with the GAD small molecules compound. Control group was transplanted with precursors derived from SHH, SAG and FGF8b treatment instead of GAD. Grafts were present in all transplanted animals and tdtomato+, EGFP+ cells were detected in all grafts six months post-transplantation (MPT) , indicating that the precursors finally differentiated into A10-like mDA neurons and retained the fluorescent reporter expression in vivo. Furthermore, consistent with the observation in vitro, we found that the majority (60.4±2.0%) of tdtomato+ (TH+) neurons co-expressed EGFP (CALB1) , which are considered as A10-like mDA neurons in the GAD grafts. Whereas, in control group, most of TH-tdtomto+ mDA neurons didn't express CALB1-EGFP (Figure 9A-9D) . These results confirmed that our approach was able to efficiently generate A10 mDA neurons either in differentiation in-vitro or after transplantation in vivo.

[0199] We then assessed the functional properties of derived-A10-like (tdTomato+EGFP+) mDA neurons in vivo in comparison to A9-like subgroup (tdTomato+EGFP-) using whole-cell patch-clamp recordings in acute ex vivo striatum slices at 6 MPT (Figure 9E) . For comparison and verification, we also recorded the properties of endogenous medial VTA (Al 0) and lateral SNc (A9) dopamine neurons from mDA neuron reporter mice (DAT-Cre / Ai9) midbrain slice. The whole-cell patch-clamp recording revealed that the grafted-A10-like mDA neurons had higher membrane resistance (Rm) and lower capacitance values (Cm) than A9-like, similar to the endogenous A10 and A9 mDA neurons in the midbrain of DAT-Cre / Ai9 mouse (Figure 9F-9G) . Then, we tested the neuronal excitability of the grafted neurons, found that almost all the recorded cells were able to fire action potential (AP) trains during somatic current injection and exhibited sodium spikes at depolarized potentials, suggesting the maturation of the grafted mDA neurons. The resting membrane potential (RMP) , AP threshold, AP peak amplitude were not significantly different between grafted-A10-like and A9-like neurons or between mouse A10 and A9 mDA neurons (Figure 10A-10E) . These results indicate that the physiological features of grafted human mDA-like neurons are consistent with characteristics of endogenous mDA neurons.

[0200] Upon injection of hyperpolarizing currents of increasing amplitudes, DA neurons develop the typical and prominent HCN-channel-mediated sag component in the sub-threshold range, which is the typical characteristic feature of mDA neurons (Lammel et al., 2008; Neuhoff et al., 2002) . We found that all of the grafted-A9-like and endogenous SNc mDA neurons displayed a typical sag component in the subthreshold range. However, only 6 in 17 endogenous VTA mDA neurons and 21 in 23 grafted-A10-like mDA neurons showed a sag component, whose amplitude were much smaller than endogenous and grafted A9 subtype (Figure 9H, 5I) . In addition, both the grafted-A9-like and mouse A9 mDA neurons showed obviously shorter rebound delay, while grafted-A10-like and mouse A10 mDA neurons need more rebound time (Figure 9H, 5J) . The derived-A10-like mDA neurons showed faster firing frequency and more spikes than A9-like neurons in response to a step current injection, similar to the different response between mouse endogenous A10 and A9 mDA neurons (Figure 9K-9M) . The max firing rate of the endognous A10 or A10-like DA neurons were much higher than endogenous A9 or A9-like DA neurons, respectively (Figure 10J-1 0K) . These results were consistent with the previous reports (Evans et al., 2017; Lammel et al., 2008; Neuhoff et al., 2002) , which further confirms that the grafted human mDA neuron subtypes possess functional characteristics of endogenous ones. Meanwhile, spontaneous action potential (sAP) were recorded in both transplanted precursors and mouse neurons. Mouse A9 mDA neurons showed higher amplitude and lower frequency of sAP than mouse A10 mDA neurons whereas there was no significant difference between grafted-A10-like and A9-like neurons (Figure 1 0F-10I) , which may result from the ectopic transplantation and different microenvironment between grafted and endogenous neurons. In sum, these results indicate that the transplanted precursors robustly differentiate and mature into A10-like mDA neurons and recaptulate functional properties of endogenous A10 mDA neurons.

[0201] Furthermore, spontaneous excitatory postsynaptic currents (sEPSC) and spontaneous inhibitory postsynaptic currents (sIPSC) were examined both in A10-like and A9-like neurons and no significant difference in the sEPSC and sIPSC frequency and amplitude was found between the two subsets (Figure 9N-9R) . These data provide evidence that the transplanted neurons can integrate into local neural circuits and receive functional excitatory and inhibitory inputs from surrounding neurons.

[0202] Example 11

[0203] Reporter hESCs were transplanted and finally differentiated into mature mDA neurons in ventral striatum. Both tdTomato+ and EGFP+ fibers were detected in various brain areas. Most of tdTomato+EGFP+ fibers from grafted A10-like mDA neurons were found in the NAc, the main target region of A10 subtype whereas a few found in the dorsal striatum (caudate putamen, CPu) which were entirely full of tdTomato+EGFP-fibers (Figure 12B) . In other areas away from the grafts, most of tdTomato+EGFP+ fibers were in the medial prefrontal cortex (mPFC) and amygdala (Amy: including BLA and CeA) which are target regions of A10 mDA neurons (Figure 12A, 12C) . Furthermore, we found that the tdTomato+EGFP+ fibers ascended into the mPFC along the boundary between the cortex and striatum (Figure 12A) . These data indicate that most of the axonal outgrowth from grafted mDA neurons follow the endogenous pathways instead of aimless growth and incorrect innervation.

[0204] To examine the capability of long-distance projection and ability to reconstruct mesolimbic and mesocortical pathways of the grafted neurons (Figure 11A) , we transplanted the TH-tdTomato / CALB1-EGFP-hESC-reporter-cell-line-derived precursors orthotopically into the VTA of adult SCID mice which had been lesioned by unilateral injection of 6-hydroxydopamine (6-OHDA) in the VTA. Six months following transplantation, grafts and neurons with fluorescent reporter expressing were detected in all grafted mice. Consistent with the observation of ectopic transplantation into NAc, majority of TH-tdTomato+ mDA neurons expressed the CALB1-EGFP, characteristic of A10-like mDA neuron (Figure liB-liD) , indicating that the precursors were efficiently induced into A10-like mDA neurons regardless of orthotopic or ectopic transplantation. Then we assessed the distribution of the fluorescent fibers to elucidate the specific axonal innervation of grafted mDA neuron subtypes. On coronal sections of grafted brain, we found that NAc and olfactory tubercle (OT) , the innervation target regions of endogenous A10 mDA neurons, received most tdTomato+EGFP+ projection fibers while CPu, the main target region of endogenous A9 subtype, were only occupied by tdTomato+EGFP- fibers (Figure llE-6I) . Figure 12D shows serial coronal sections of distribution of fibers from orthotopicly transplanted graft immunostained for tdTomato and EGFP. Figure 12D and Figure 11E are slices at the same time point from different mice which verifies that the typical slices selected in Figure 11E are plausible, while indicating that the fiber distribution is similar between different mice.

[0205] The tdTomato+EGFP+ fiber intensity in the NAc and OT were significantly higher than in the CPu (Figure 11G) . Quantification of tdTomato+EGFP+ fiber density on the representative coronal planes showed that 50.29±8.49%of total tdTomato+EGFP+ fibers were distributed in the NAc while fewer tdTomato+EGFP+ fibers were detected in the CPu (32.78±5.97%) although the area of NAc was much smaller than CPu (Figure 11H) . Nevertheless, we found that NAc and OT received more innervation from A10 subtype of mDA neuron innervation than CPu (Figure 11 I) . We also examined the distribution of the fluorescent fibers in the posterior sections. Consistent with the endogenous neural circuits, both basolateral (BLA) and central (CEA) which belonged to amygdala (AMY) , the other two target regions of endogenous A10 subtype, received more tdTomato+EGFP+ projection fibers than CPu (Figure 11J-11N) . Furthermore, the intensity of tdTomato+EGFP+ fibers in the AMY and lateral hypothalamic (LH) were significantly higher than in the CPu (Figure l lL) . The distribution of tdTomato+EGFP+ projection fibers didn't show significant difference among the three regions because of the small areas of AMY and LH (Figure 11M) . Aslo, AMY received more the innervation from A10 subtype of mDA neurons than the CPu and LH (Figure llN) . It was also found that a few tdTomato+EGFP+ fibers distributed in the mPFC (data not show) . The distribution pattern of tdTomato+EGFP+ and total tdTomato+ fibers are similar to that of endogenous A10 and A9 mDA neuron innervation in normal animals. These results suggest that the grafted mDA neurons are capable of long distance projection by extending axons into the regions far away from the grafts. Moreover, our results indicate that the axonal innervation of grafted neurons show subtype specific characteristics and that the target regions follow the endogenous neural circuits, which depend on the identity (subtype) of the transplanted neurons other than the location of transplantation.

[0206] Example 12

[0207] The integration of grafted neurons in the host brain circuits can modulate host brain's function. To test whether the grafted-A10-like mDA neurons can regulate brain functions, we assessed behavioral phenotypes of recipient mice by chemogenetically manipulating the activity of grafted cells. We established a TH-iCre / CALB1-LSL-vCre / AAVS 1-vloxp-stop-vloxp-loxp-EGFP-loxp-hM3Dq-mcherry-hESC-line by inserting iCre recombinase expression cassette into TH locus and loxp-stop-loxp-vCre expression cassette into CALB1 locus by CRISPR and knocking the vloxp-stop-vloxp-loxp-EGFP-loxp-hM3Dq-mcherry expression cassette into AAVS1 locus by TALEN (Figure 14A) .

[0208] When these engineered cells are differentiated, only TH and CALB1 double positive cells are able to expressed hM3Dq, i.e. only A10-like mDA neurons are able to be activated by clozapine-N-oxide (CNO) . We validated that the expression of mcherry reporter is mainly confined in TH+CALB1 + cells by immunostaining (Figure 14B-14C) . By patch-clamping analysis on 65-days-old cultures (following the GAD protocol and then maturation for 30 days) , we found that CNO treatment induced depolarization of the resting membrane potential and elicited action potentials in the hM3Dq-expressing A10-like mDA neurons, suggesting the ability of activation of A10-like mDA neurons by CNO (Figure 14D, 14E) . The cells derived from TH-vCre / CALBl-vloxp-stop-vloxp-iCre / AAVS1-DIO-CHR2-EYFP as grafted-cell control for the following experiments.

[0209] Example 13

[0210] A10-NAc circuit were known to play a critical role in regulation emotion, motivation and reward related to anxiety and depression (Admon and Pizzagalli, 2015; Bewernick et al., 2010; Tye et al., 2013; Zweifel et al., 2011) . We first tested the phenotypes of transplanted mice in the elevated plus maze (an anxiety assay) with or without grafted-A10 mDA neuron activiation. We transplanted chemogenectically engineered A10-like-mDA precursors obtained in Example 12 into mouse NAc, with hM3Dq expression in A10-like (TH+CALB1+) cells. The mice transplanted with A10-like precursors without hM3Dq expression served as control. Six months after transplantation, A10-like cells have matured and integrated into host neural circuits (Figure 11 and Figure 12, Figure 14F) . We treated mice with CNO to activate hM3Dq expressing neurons. With CNO treatment, the entry frequency and duration in the open arm significantly increased in mice grafted with hM3Dq-expressing A10-like cells, without alteration in general motor function of the mice (Figure 13A-13 C, Figure 14G-14H) , suggesting that the specific activation of grafted-A10-like mDA neurons could exert an anxiolytic-like phenotype in the transplanted mice.

[0211] We next assessed the role of grafted-A10-like mDA neurons in regulation of depression-like behaviors in a depression mouse model by chronic restraint stress (CRS) . We also transplanted the two cell lines induced A10-like mDA precursors into mouse NAc, one with A10-dirven hM3Dq expressing and the other without hM3Dq expressing. The transplanted mice were randomly divided into three groups, non-CRS with saline treatment and exposed to CRS with saline or CNO treatment six months after transplantation. No significant difference of the locomotor ability was found among groups (Figure 14I-14L) . Furthermore, CNO treatment significantly increased the sucrose preference and decreased the immobile time in the tail suspension test (TST) and force swimming test (FST) of mice grafted with the A10-driven-hM3Dq-expressing cells but not of mice grafted with control cells (Figure 13D-13F) . These results suggest that activation of grafted-A10-like mDA neurons by CNO treatment efficiently relieve the depression-like behaviors, for example anhedonia which was indicated by sucrose preference test (SPT) and behavioral despair which was indicated by immobile time in the TST and FST.

[0212] To verify that CNO treatment indeed altered neurotransmitter levels in mouse brain with grafted A10-like cells, we measured dopamine and glutamate levels in NAc, the graft site, using in vivo microdialysis followed by in vitro HPLC analysis. We found that the concentration of dopamine in NAc was significantly increased in A10-driven-hM3Dq-expressing-grafted-mice but not in the control-grafted mice, between before and after CNO treatment (Figure 13G) . Although these A10-like cells co-release glutamate in host brain as proved by electrophysiological approaches (Figure 7G-H) , however, the concentration of glutamate in NAc kept unchanged after CNO treatment in either control-grafted mice model or A10-driven-hM3Dq-expressing-grafted-mice model (Figure 14M) . This could be due to already a high level of glutamate in NAc, which may come from glutamatergic irmervation from cortex.

[0213] We adopted a different strategy to manipulate DA modulation on NAc neuron activity by transplanting A10-like mDA precursors to target NAc (more like a cell therapy) . When we chemogenetically activated the grafted A10-like mDA neurons innervating NAc, the depression model mice showed antidepressant phenotypes with elevated level of DA in striatum. Although to make an engineered cell to fire phasic burst is no applicable for chemogenetics, after chemogentic activation, the cells did fire a high-frequency spikes, at least in vitro. Together with the positive outcome of anti-depressant phenotypes, we propose that the high-frequent firing promotes massive DA release in NAc, which allow the intrasynaptic DA released by endogenous / host stimuli-evoked burst firing (the level of which otherwise is subthreshold in such depression condition) to reach a certain level enough to trigger some downstream effects on NAc neurons. Interestingly, without chemogenetical activation of grafted-A10-mDA-neurons, the transplanted mice showed higher, though not significant, open arm duration and frequency than ACSF control mice, suggesting that the grafted A10 mDA neurons are involved in regulation of host behaviors with no need of activation. Taken together, this study provides a strong proof of concept for the A10-mDA-neuron-based therapy in clinical treatment of major depression and, moreover, extends potential applications of cell-based therapy for psychiatry disorders.

[0214] Together, these results indicate the critical functional effect of the grafted-A10-like mDA neuron activity on preventing anxiety and meliorating diverse depression-related behaviors, suggesting a credibly potential application of these cells in cell therapy of the neurological diseases related to dysfunction of A10 mDA neurons.

[0215] References as mentioned herein are all incorporated herein by reference. It will be understood that many variations and modifications may be made to the embodiments of the present invention without departing from the spirit and scope of the present disclosure.

Claims

1.An additive composition for promoting differentiation of mDA progenitor cells into A10 precursor cells and / or A10 subtype neurons, consisting of Notch pathway inhibitor, L-ascorbic acid (AA) and Glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) ,optionally, the Notch pathway inhibitor is selected from N- [N- (3, 5-difluorophenacetyl) -L-alanyl] -S-phenylglycine t-butyl ester (DAPT) , compound E, tarenflurbil and dibenzazepine;optionally, the Notch pathway inhibitor is DAPT.2.The additive composition according to claim 1, wherein the molar ratio of DAPT, AA and GDNF is 10±1: 200±5: 0.00066±0.00010.3.An additive composition for promoting differentiation of mDA progenitor cells into A10 precursor cells and / or A10 subtype neurons, consisting of Notch pathway inhibitor, AA, GDNF and at least one of BDNF, cAMP and TGFβ3;the molar ratio of DAPT, AA and GDNF is 10±1: 200±5: 0.00066±0.00010;optionally, the Notch pathway inhibitor is selected from DAPT, compound E, tarenflurbil and dibenzazepine,optionally, the molar ratio of BDNF and DAPT is 0.00074±0.00010: 10±1;the molar ratio of cAMP and DAPT is 0.5±0.2: 10±1;the molar ratio of TGFβ3 and DAPT is 0.00008±0.00001: 10±1.4.The use of the additive composition of any one of claims 1-3 for manufacturing culture medium for promoting differentiation of mDA progenitor cells into A10 precursor cells and / or A10 subtype neurons, or for facilitating the generation of A10 precursor cells or A10 subtype neurons.5.A medium for differentiating A10 precursor cells, comprising 10±1 μM DAPT, 200±5 μM AA and 20±2 ng / ml GDNF,optionally, the medium further comprises 20±2 ng / ml BDNF, 0.5±0.2 μM cAMP, and / or 1±0.2 ng / ml TGFβ3,optionally, the medium further comprises DMEM / F-12 supplemented with 1 x NEAA and 1 x N2 supplements.6.An in vitro method for promoting differentiation of A10 precursor cells, comprising:exposing mDA progenitor cells to a medium comprising the additive composition of any one of claims 1-3 or the medium of claim 5 for induction of A10 precursor cells.7.The method according to claim 6, wherein the mDA progenitor cells are post-mitotic mDA progenitor cells, preferably early post-mitotic mDA progenitor cells, more preferably cells consist essentially of NURR1 positive cells,optionally, the mDA progenitor cells are differentiated from the pluripotent stem cells, preferably from the pluripotent stem cells selected from the group consisting of embryonic stem cells (ESCs) , induced pluripotent stem cells (iPSCs) , umbilical cord tissue-derived cells, amniotic fluid derived-cells and parthenotes, more preferably from hESC-H9, hESC-H1 or hiPSC WC-30 cells lines.8.The method according to claim 6, wherein the mDA progenitor cells are obtained by (a) culturing the pluripotent stem cells on feeder cells in a neural induction medium supplemented with 2±0.5 μM SB431542, 2 ±0.5 μM DMH-1, 0.4±0.2 μM CHIR99021, and 500±50 ng / ml SHH for 7±1 days; (b) culturing the cells on feeder cells of (a) in a neural induction medium supplemented with 1±0.5 μM SAG, 100±20 ng / ml SHH and 0.4±0.2 μM CHIR99021 for 6±1 days; (c) culturing the cells of (b) in a neural induction medium supplemented with 0.5±0.2 μM SAG, 20±5 ng / ml SHH and 100±20 ng / ml FGF8b for 7±1 days; and (d) culturing the cells of (c) in a neural induction medium supplemented with 0.1±0.02 μM SAG, 20±5 ng / ml SHH and 20±5ng / ml FGF8b for 0-15 days; optionally, the culture time is 7±1 days in step (d) .9.The method according to claim 6, wherein the mDA progenitor cells are exposed to the medium for a period of time between 4 days and 8 days.10.The method according to claim 6, further comprising the step of maturing the A10 precursor cells into A10 subtype neurons in vitro.11.The method according to claim 10, wherein the A10 precursor cells are matured by culturing in a neural differentiation medium supplemented with 10±1 ng / ml BDNF, 10±1 ng / ml GDNF, 200±20 μM AA, 1±0.2 μM cAMP, 1±0.2 ng / ml TGFβ3 and 0.1±0.2 μM Compound E; and the neural differentiation medium comprises neurobasal medium with 1 x N2 supplement, 1 x B27 supplement and 1 x NEAA.12.The method according to claim 10, wherein the A10 precursor cells are matured for a period of time for at least 10 days.13.A cell population according to the method of any one of claims 6-12.14.A pharmaceutical composition comprising the cell population of claim 13 and a pharmaceutically acceptable carrier.15.A method of treating or preventing the psychiatric disorders related to A10 subtype neurons in a subject in need thereof, comprising:administering a therapeutically effective amount of the cell population of claim 13 to the subject, preferably to the ventral striatum of the subject.

Images