Multispecific antigen binding proteins and uses thereof

Abstract

Provided are multispecific antigen binding proteins (MSAPs), such as trispecific antigen binding proteins (TSAPs or trispecific T cell engagers), that specifically bind to CD20, CD19, and CD3. Also provided are TSAPs or bispecific antigen binding proteins (BSAPs), that specifically bind to CD3 and CD20. Compositions (e.g., pharmaceutical compositions), kits, methods of use (e.g., treating cancer), and methods of making thereof are also provided.

Description

MULTISPECIFIC ANTIGEN BINDING PROTEINS AND USES THEREOFCROSS-REFERENCE TO RELATED APPLICATIONS

[0001] This application claims the priority benefit of Chinese Patent Application No. CN202410266795.4, filed March 8, 2024, the content of which is incorporated herein by reference in its entirety. REFERENCE TO AN ELECTRONIC SEQUENCE LISTING

[0002] The contents of the electronic sequence listing (221992000841SEQLIST. xml; Size: 183, 815 bytes; and Date of Creation: March 7, 2025) is herein incorporated by reference in its entirety.FIELD OF THE INVENTION

[0003] The present invention relates to the field of biomedicine. Specifically, the present invention relates to multispecific antigen binding proteins (MSAPs, e.g., trispecific antigen binding proteins (TSAPs) such as trispecific T cell engagers) that specifically bind to CD3, CD19, and CD20, and their applications. The present invention also provides MSAPs (e.g., TSAPs, or bispecific antigen binding proteins (BSAPs) ) that specifically bind to CD3 and CD20. Further provided herein are pharmaceutical compositions comprising any of the MSAPs (e.g., TSAPs or BSAPs) , methods of treating CD19-and / or CD20-related diseases (e.g., CD19-positive and / or CD20-positive cancer, or autoimmune diseases) using thereof, methods of producing thereof, and kits comprising thereof.BACKGROUND OF THE INVENTION

[0004] Many abnormal cells and tissues as well as many diseases display unique antigens that can be leveraged for immune cell-mediated clearance. Exemplary diseases include, but are not limited to, cancers (e.g., solid tumors or liquid cancers) , autoimmune disorders, bacterial diseases, viral diseases, or fungal diseases that can each display one or more different target antigens or one or more different epitopes of the same target antigen. For example, some antigens are over-expressed, mutagenized, or selectively mutagenized in tumor tissues. Therefore, antibodies targeting specific antigens on the surface of cancer cells can be used as cancer therapeutics.

[0005] Tumor immunotherapy is a method for treating tumors by activating and improving the anti-tumor killing effect of the immune system. In tumor immunotherapy, tumor-associated antigens (TAAs) or tumor-specific antigens (TSAs) exist on the surface of tumor cells, usually as proteins or other biomacromolecules (such as carbohydrates, etc. ) . Antibodies produced by the immune system can bind pathogens. Modified immunotherapy antibodies designed to target tumor antigens can be used to enable the immune system to recognize tumor cells and activate the immune system to inhibit or kill tumor cells.

[0006] Compared with traditional chemotherapy, each of CAR-T therapies, anti-CD3 bispecific antibodies (such as BiTEs) , and immune checkpoint inhibitors have been proven to benefit tumor patients clinically by activating T cells. However, these treatment regimens have failed to benefit many tumor patients, especially those with advanced cancer or relapsed / refractory cancer. In addition, safety issues related to treatment regimens also limit their development and widespread clinical application.

[0007] Bispecific T cell engagers (BiTEs) , such as those developed and marketed by Amgen / Micromet AG, are a class of artificially synthesized bispecific antibodies used for anti-tumor therapy. BiTEs kill tumor cells by mediating the cytotoxic effect of T cells in the host immune system.

[0008] A BiTE is a protein construct formed by the fusion of single-chain variable fragments (scFvs) of two different antibodies, with a molecular weight of approximately 55 kDa. One arm can bind to the CD3 receptor on T cells, and the other arm can bind to a specific tumor cell surface antigen. Unlike traditional monoclonal antibodies, BiTEs and other anti-CD3 bispecific antibodies (such as teclistameb and mosunetuzumab) can form synapses between T cells and tumor cells, activate T cells and prompt the secretion of perforin and granzymes into tumor cells, exert cytotoxic effects to cause tumor cell lysis and death, and act independently of MHC-I and co-stimulatory factors. Blinatumomab (trade name  ) is the first BiTE immunotherapy to be approved in 2014, which binds to CD19 expressed on the surface of B cells and CD3 expressed on the surface of T cells, activates endogenous T cells, and leads to the directional lysis of CD19-positive acute lymphocytic leukemia (ALL) tumor cells, thereby achieving the purpose of treating ALL.

[0009] Currently, multiple therapeutic strategies based on targeting CD19 or CD20 are being evaluated in clinical trials at different stages. These include monoclonal antibodies, antibody-drug complexes (ADCs) , bispecific antibodies (e.g., BiTEs) , and CAR-T cell therapy. Despite the progress of these targeted therapies in the clinic, the emergence of drug resistance remains a major challenge. Tumor cells may develop resistance to treatment through a variety of mechanisms, including reduced target expression levels, changes in the tumor microenvironment, or activation of other signaling pathways.

[0010] In addition to cancer treatment, autoimmune diseases are a complex group of diseases, including rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus, and multiple sclerosis, etc., whose common feature is that the immune system mistakenly attacks and destroys host tissues.

[0011] B cells are an important part of the immune system. They are responsible for producing antibodies to fight pathogens. However, in autoimmune diseases, B cells may be abnormally activated, produce self-reactive antibodies, or otherwise promote pathological immune responses. Therefore, B cells play a key role in these diseases because they not only produce antibodies, but also promote immune responses through other mechanisms.

[0012] In recent years, therapies that eliminate B cells have shown effectiveness in treating certain autoimmune diseases. Such therapies usually involve the use of biologics, such as monoclonal antibodies and CAR-T cell therapy, which can specifically bind to molecules on the surface of B cells, induce B cell death, and / or prevent B cell proliferation and function. The purpose of this treatment method is to reduce abnormally active B cells, thereby alleviating the symptoms and progression of autoimmune diseases.

[0013] The B cell-specific membrane protein Cluster of Differentiation-19 (CD19) is a B cell surface antigen, and an important membrane antigen related to B cell proliferation, differentiation, activation, and antibody production. CD19 is distributed on all B cells, hairy cells, leukemia cells and other malignant B cells, and follicular dendritic cells.

[0014] The B cell-specific membrane protein Cluster of Differentiation-20 (CD20) is also known as B-lymphocyte surface antigen B1. CD20 is a cell transmembrane protein that is expressed in the precursor B cell to activated B cell stage during B cell development, and is not expressed on hematopoietic stem cells, post-B cells, and normal plasma cells. CD20 plays a role in the regulation of cellular calcium influx that is necessary for the development, differentiation, and activation of B-lymphocytes. CD20 is expressed in a majority of B-cell malignancies and thus can be used as a biomarker for cancer development, a prognostic indicator, and an immunotherapeutic target for CD20+ cancers.

[0015] CD3, comprising three different polypeptide chains (ε, δ, and γ chains) , is an antigen expressed by T cells. The three CD3 polypeptide chains associate with the T-cell receptor (TCR) and the ζ-chain to form the TCR complex, which has the function of activating signaling cascades in T cells. Currently, many therapeutic strategies target the TCR signal transduction to treat diseases using anti-human CD3 monoclonal antibodies. The CD3 specific antibody OKT3 is the first monoclonal antibody approved for human therapeutic use and is clinically used as an immunomodulator for the treatment of allogenic transplant rejections.

[0016] Although bispecific antibodies have been shown to have potential in effectively killing cancer cells, severe adverse effects, including systemic immune activation, immunogenicity (anti-drug antibody effect) , and the generally poor manufacturability of these molecules, have limited the widespread application of this type of drugs. For example, mosunetuzumab (trade name LUNSUMIOTM) , an anti-CD3 / anti-CD20 bispecific antibody, has been tested in phase I / Ib clinical trials as a monotherapy or combination immunotherapy (e.g. NCT02500407) or in combination with chemotherapy (e.g. NCT03677154) . However, mosunetuzumab was found to induce ≥ grade 3 adverse events in 63%of enrolled patients (see, e.g., Schuster et al. Blood 134 (supplement 1) : 6 (2019) ) . BRIEF SUMMARY OF THE INVENTION

[0017] The present invention provides multispecific antigen binding proteins ( “MSAPs” , such as trispecific antigen binding proteins, “TSAPs” ) that specifically bind to CD3, CD19, and CD20 (hereinafter also referred to as “CD20×CD19×CD3 MSAPs” or trispecific T-cell engager, “TriTE” ) , and MSAPs (e.g., TSAPs or BSAPs) that specifically bind to CD3 and CD20 (hereinafter also referred to as “CD20×CD3 MSAPs” ) , pharmaceutical compositions comprising any of the MSAPs, and methods of treating diseases using there, and methods of making thereof.

[0018] In one aspect of the present invention, there is provided a multispecific antigen binding protein comprising three moieties (CD20×CD19×CD3 MSAP) , comprising: i) an anti-CD3 moiety that specifically binds to CD3; ii) an anti-CD19 moiety that specifically binds to CD19; and iii) an anti-CD20 moiety that specifically binds to CD20; wherein a first moiety of the three moieties is a Fab fragment, wherein the Fab fragment comprises a first polypeptide comprising a heavy chain variable region (VH) and a heavy chain constant region (CH1) , and a second polypeptide comprising a light chain variable region (VL) and a light chain constant region (CL) ; wherein a second moiety of the three moieties is a first antigen binding fragment; wherein a third moiety of the three moieties is a second antigen binding fragment; and wherein: (a) the first antigen binding fragment is fused to the N-terminus of the VH of the Fab fragment or to the C-terminus of the CH1 of the Fab fragment, and the second antigen binding fragment is fused to the N-terminus of the VL of the Fab fragment or to the C-terminus of the CL of the Fab fragment; or (b) the first antigen binding fragment is fused to the N-terminus of the VH or the VL of the Fab fragment, and the second antigen binding fragment is fused to the C-terminus of the CH1 or the CL of the Fab fragment.

[0019] In some embodiments according to any of the CD20×CD19×CD3 MSAPs described above, the anti-CD3 moiety is the Fab fragment ( “anti-CD3 Fab fragment” ) . In some embodiments, the anti-CD19 moiety is the first antigen binding fragment ( “anti-CD19 first antigen binding fragment” ) , and the anti-CD20 moiety is the second antigen binding fragment (“anti-CD20 second antigen binding fragment” ) . In some embodiments, the anti-CD20 moiety is the first antigen binding fragment ( “anti-CD20 first antigen binding fragment” ) , and the anti-CD19 moiety is the second antigen binding fragment ( “anti-CD19 second antigen binding fragment” ) .

[0020] In some embodiments according to any of the CD20×CD19×CD3 MSAPs described above, the anti-CD19 moiety is the Fab fragment ( “anti-CD19 Fab fragment” ) . In some embodiments, the anti-CD3 moiety is the first antigen binding fragment ( “anti-CD3 first antigen binding fragment” ) , and the anti-CD20 moiety is the second antigen binding fragment. In some embodiments, the anti-CD20 moiety is the first antigen binding fragment, and the anti-CD3 moiety is the second antigen binding fragment ( “anti-CD3 second antigen binding fragment” ) .

[0021] In some embodiments according to any of the CD20×CD19×CD3 MSAPs described above, the anti-CD20 moiety is the Fab fragment ( “anti-CD20 Fab fragment” ) . In some embodiments, the anti-CD3 moiety is the first antigen binding fragment, and the anti-CD19 moiety is the second antigen binding fragment. In some embodiments, the anti-CD19 moiety is the first antigen binding fragment, and the anti-CD3 moiety is the second antigen binding fragment.

[0022] In some embodiments according to any of the CD20×CD19×CD3 MSAPs described above, the first antigen binding fragment and the second antigen binding fragment are independently selected from the group consisting of Fab, Fab’, Fab’-SH, F (ab’) 2, Fv, sdAb, scFv, and any combination thereof. In some embodiments, the first antigen binding fragment and the second antigen binding fragment are both scFv.

[0023] In some embodiments according to any of the CD20×CD19×CD3 MSAPs described above, the anti-CD19 moiety comprises: a heavy chain hypervariable region-1 (HVR-H1) comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, an HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, an HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, a light chain hypervariable region-1 (HVR-L1) comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20, an HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21, and an HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 99 or 22. In some embodiments, the anti-CD19 moiety comprises a VH comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 34, and a VL comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 35 or 100. In some embodiments, the anti-CD19 moiety is an anti-CD19 scFv, wherein the anti-CD19 scFv comprises an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 101-104. In some embodiments, the anti-CD19 moiety is an anti-CD19 Fab fragment, wherein the anti-CD19 Fab fragment comprises a first polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 105, and a second polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 59 and 106-108.

[0024] In some embodiments according to any of the CD20×CD19×CD3 MSAPs described above, the anti-CD3 moiety comprises: (a) an HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, an HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, an HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, an HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17, an HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18, and an HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19; (b) an HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, an HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 85, an HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 86, an HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17, an HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18, and an HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19; or (c) an HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, an HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 87, an HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, an HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17, an HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18, and an HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19. In some embodiments, the anti-CD3 moiety comprises a VH comprising the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 32, 88, and 89, and a VL comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 33. In some embodiments, the anti-CD3 moiety is an anti-CD3 scFv, wherein the anti-CD3 scFv comprises the amino acid sequence of any of SEQ ID NOs: 90-95. In some embodiments, the anti-CD3 moiety is an anti-CD3 Fab fragment, wherein the anti-CD3 Fab fragment comprises a first polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 60, 96, and 97, and a second polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 61 or 98.

[0025] In some embodiments according to any of the CD20×CD19×CD3 MSAPs described above, the anti-CD20 moiety comprises: (a) an HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, an HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8, an HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9, an HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 23, an HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 24, and an HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 25; (b) an HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10, an HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11, an HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12, an HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26, an HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 27, and an HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 28; (c) an HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13, an HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14, an HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15, an HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 29, an HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 30, and an HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 31; (d) an HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10, an HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16, an HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12, an HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26, an HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 27, and an HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 28; or (e) an HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, an HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8, an HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 109, an HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 110, an HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 111, and an HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 112. In some embodiments, the anti-CD20 moiety comprises: (a) a VH comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 36, and a VL comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 37; (b) a VH comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 38, and a VL comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 39; (c) a VH comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 40, and a VL comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 41; (d) a VH comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 42, and a VL comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 39; (e) a VH comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 113, and a VL comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 115; or (f) a VH comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 114, and a VL comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 116. In some embodiments, the anti-CD20 moiety is an anti-CD20 scFv, wherein the anti-CD20 scFv comprises an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 117-128. In some embodiments, the anti-CD20 moiety is an anti-CD20 Fab fragment, wherein the anti-CD20 Fab fragment comprises: (a) a first polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 139, and a second polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 129 or 130; (b) a first polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 140, and a second polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 131 or 132; (c) a first polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 141, and a second polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 133 or 134; (d) a first polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 142, and a second polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 131 or 132; (e) a first polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 143, and a second polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 135 or 136; or (f) a first polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 144, and a second polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 137 or 138.

[0026] In some embodiments according to any of the CD20×CD19×CD3 MSAPs described above, the MSAP comprises: (i) an anti-CD3 Fab fragment, an anti-CD19 first scFv, and an anti-CD20 second scFv; or (ii) an anti-CD3 Fab fragment, an anti-CD20 first scFv, and an anti-CD19 second scFv. In some embodiments, the MSAP comprises: (i) a first fusion polypeptide comprising the anti-CD19 first scFv fused to the N-terminus of the VH of the anti-CD3 Fab fragment via an optional first linker; and (ii) a second fusion polypeptide comprising the anti-CD20 second scFv fused to the N-terminus of the VL of the anti-CD3 Fab fragment via an optional second linker. In some embodiments, (a) the first fusion polypeptide comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 44, and the second fusion polypeptide comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 45; (b) the first fusion polypeptide comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 44, and the second fusion polypeptide comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 51; (c) the first fusion polypeptide comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 44, and the second fusion polypeptide comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 52; (d) the first fusion polypeptide comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 44, and the second fusion polypeptide comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 53; or (e) the first fusion polypeptide comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 44, and the second fusion polypeptide comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 55. In some embodiments, the MSAP comprises: (i) a first fusion polypeptide comprising the anti-CD20 first scFv fused to the N-terminus of the VH of the anti-CD3 Fab fragment via an optional first linker; and (ii) a second fusion polypeptide comprising the anti-CD19 second scFv fused to the N-terminus of the VL of the anti-CD3 Fab fragment via an optional second linker. In some embodiments, the first fusion polypeptide comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 48, and the second fusion polypeptide comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 43. In some embodiments, the MSAP comprises: (i) a first fusion polypeptide comprising the anti-CD19 first scFv fused to the C-terminus of the CH1 of the anti-CD3 Fab fragment via an optional first linker; and (ii) a second fusion polypeptide comprising the anti-CD20 second scFv fused to the N-terminus of the VL of the anti-CD3 Fab fragment via an optional second linker. In some embodiments, the first fusion polypeptide comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 54, and the second fusion polypeptide comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 52.

[0027] In some embodiments according to any of the CD20×CD19×CD3 MSAPs described above, the MSAP comprises: i) an anti-CD20 Fab fragment, an anti-CD19 first scFv, and an anti-CD3 second scFv; or ii) an anti-CD20 Fab fragment, an anti-CD3 first scFv, and an anti-CD19 second scFv. In some embodiments, the MSAP comprises: (i) a first fusion polypeptide comprising the anti-CD3 first scFv fused to the N-terminus of the VH of the anti-CD20 Fab fragment via an optional first linker; and (ii) a second fusion polypeptide comprising the anti-CD19 second scFv fused to the N-terminus of the VL of the anti-CD20 Fab fragment via an optional second linker. In some embodiments, the first fusion polypeptide comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 46, and the second fusion polypeptide comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 47.

[0028] In some embodiments according to any of the CD20×CD19×CD3 MSAPs described above, the MSAP comprises: i) an anti-CD19 Fab fragment, an anti-CD3 first scFv, and an anti-CD20 second scFv; or ii) an anti-CD19 Fab fragment, an anti-CD20 first scFv, and an anti-CD3 second scFv. In some embodiments, the MSAP comprises: (i) a first fusion polypeptide comprising the anti-CD3 first scFv fused to the N-terminus of the VH of the anti-CD19 Fab fragment via an optional first linker; and (ii) a second fusion polypeptide comprising the anti-CD20 second scFv fused to the N-terminus of the VL of the anti-CD19 Fab fragment via an optional second linker. In some embodiments, the first fusion polypeptide comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 49, and the second fusion polypeptide comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 50.

[0029] Also provided herein are pharmaceutical compositions comprising any of the CD20×CD19×CD3 MSAPs described above and optionally a pharmaceutically acceptable carrier.

[0030] Also provided herein are methods of treating a disease associated with CD19 and / or CD20 in an individual, comprising administering to the individual an effective amount of any of the CD20×CD19×CD3 MSAPs described above or any of the pharmaceutical compositions described above. In some embodiments, the disease associated with CD19 and / or CD20 is a CD19-positive and / or CD20-positive cancer. In some embodiments, the CD19-positive and / or CD20-positive cancer is selected from the group consisting of acute myeloid leukemia (AML) , chronic myelogenous leukemia (CML) , myelodysplastic syndrome (MDS) , acute B lymphoblastic leukemia (B-ALL) , diffuse large B cell lymphoma (DLBCL) , mantle cell lymphoma (MCL) , follicular lymphoma, chronic lymphocytic leukemia (CLL) , hairy cell leukemia (HCL) , blastic plasmacytoid dendritic cell neoplasm (BPDCN) , non-Hodgkin’s lymphomas (NHL) , Hodgkin’s lymphoma, systemic mastocytosis, Burkitt’s lymphoma, and T-cell lymphoma (TCL) . In some embodiments, the CD19-positive and / or CD20-positive cancer is Burkitt’s lymphoma. In some embodiments, the disease associated with CD19 and / or CD20 is an autoimmune disease, such as an autoimmune disease selected from the group consisting of multiple sclerosis, myelin-oligodendrocyte glycoprotein spectrum disorder, neuromuscular spectrum disorder, systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, N-methyl-D-aspartate receptor encephalitis, myasthenia gravis, and a combination thereof. In some embodiments, the MSAP or the pharmaceutical composition is administered subcutaneously or intravenously. In some embodiments, the individual is a human.

[0031] The present invention in another aspect provides a multispecific antigen binding protein (CD20×CD3 MSAP) comprising: (i) an anti-CD3 Fab fragment that specifically binds to CD3, wherein the anti-CD3 Fab fragment comprises: (a) a VH and a CH1; and (b) a VL and a CL; and (ii) an anti-CD20 antigen binding fragment that specifically binds to CD20.

[0032] In some embodiments according to any of the CD20×CD3 MSAPs described above, the anti-CD20 antigen binding fragment is fused to the N-terminus of the VH or the VL of the anti-CD3 Fab fragment via an optional linker. In some embodiments, the MSAP comprises a first anti-CD20 antigen binding fragment and a second anti-CD20 antigen binding fragment, wherein the first anti-CD20 antigen binding fragment is fused to the N-terminus of the VH of the anti-CD3 Fab fragment via an optional first linker, and wherein the second anti-CD20 antigen binding fragment is fused to the N-terminus of the VL of the anti-CD3 Fab fragment via an optional second linker.

[0033] In some embodiments according to any of the CD20×CD3 MSAPs described above, the anti-CD3 Fab fragment comprises: (a) an HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, an HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, an HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, an HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17, an HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18, and an HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19; (b) an HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, an HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 85, an HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 86, an HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17, an HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18, and an HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19; or (c) an HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, an HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 87, an HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, an HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17, an HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18, and an HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19. In some embodiments, the VH of the anti-CD3 Fab fragment comprises an amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 32, 88, and 89, and the VL of the anti-CD3 Fab fragment comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 33.

[0034] In some embodiments according to any of the CD20×CD3 MSAPs described above, the CH1 and the CL of the anti-CD3 Fab fragment are connected by a disulfide bond. In some embodiments, the CH1 and the CL of the anti-CD3 Fab fragment are connected by 1 to 5 disulfide bonds, such as 2 disulfide bonds.

[0035] In some embodiments according to any of the CD20×CD3 MSAPs described above, the anti-CD3 Fab fragment comprises a first polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 60, 96, and 97, and a second polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 61 or 98. In some embodiments, the first polypeptide and the second polypeptide of the anti-CD3 Fab fragment each further comprises a hinge or portion thereof at the C-terminus of the first polypeptide and the second polypeptide. In some embodiments, the hinge or portion thereof comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 81 or 82.

[0036] In some embodiments according to any of the CD20×CD3 MSAPs described above, the anti-CD20 antigen binding fragment, the first anti-CD20 antigen binding fragment, and / or the second anti-CD20 antigen binding fragment, each independently comprises: (a) an HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, an HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8, an HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9, an HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 23, an HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 24, and an HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 25; (b) an HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10, an HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11, an HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12, an HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26, an HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 27, and an HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 28; (c) an HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13, an HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14, an HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15, an HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 29, an HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 30, and an HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 31; (d) an HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10, an HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11, an HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12, an HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26, an HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 27, and an HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 28; or (e) an HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, an HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8, an HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 109, an HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 110, an HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 111, and an HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 112. In some embodiments, the anti-CD20 antigen binding fragment, the first anti-CD20 antigen binding fragment, and / or the second anti-CD20 antigen binding fragment, each independently comprises: (a) a VH comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 36, and a VL comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 37; (b) a VH comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 38, and a VL comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 39; (c) a VH comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 40, and a VL comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 41; (d) a VH comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 42, and a VL comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 39; (e) a VH comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 113, and a VL comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 115; or (f) a VH comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 114, and a VL comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 116.

[0037] In some embodiments according to any of the CD20×CD3 MSAPs described above, (i) the anti-CD20 antigen binding fragment is an anti-CD20 scFv; or (ii) the first anti-CD20 antigen binding fragment and the second anti-CD20 antigen binding fragment are each an anti-CD20 scFv. In some embodiments, the VH and the VL of the anti-CD20 scFv, the first anti-CD20 scFv, and / or the second anti-CD20 scFv, independently, are connected by an optional linker peptide, such as a linker peptide each independently comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 66 or 68. In some embodiments, the anti-CD20 scFv, the first anti-CD20 scFv, and / or the second anti-CD20 scFv each independently comprises an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 117-128.

[0038] In some embodiments according to any of the CD20×CD3 MSAPs described above, the multispecific antigen binding protein comprises a first anti-CD20 scFv and a second anti-CD20 scFv. In some embodiments, the first anti-CD20 scFv and the second anti-CD20 scFv have the same amino acid sequence.

[0039] In some embodiments according to any of the CD20×CD3 MSAPs described above, : (i) the MSAP comprises a first fusion polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 146, and a second fusion polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 45; (ii) the MSAP comprises a first fusion polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 147, and a second fusion polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 51; (iii) the MSAP comprises a first fusion polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 148, and a second fusion polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 52; (iv) the MSAP comprises a first fusion polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 149, and a second fusion polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 53; (v) the MSAP comprises a first fusion polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 150, and a second fusion polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 151; (vi) the MSAP comprises a first fusion polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 152, and a second fusion polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 153; (vii) the MSAP comprises a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 60, and a fusion polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 51; (viii) the MSAP comprises a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 60, and a fusion polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 52; (ix) the MSAP comprises a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 60, and a fusion polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 53; or (x) the MSAP comprises a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 60, and a fusion polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 153.

[0040] Also provided herein are pharmaceutical compositions comprising any of the CD20×CD3 MSAPs described above, and optionally a pharmaceutically acceptable carrier.

[0041] Also provided herein are methods of treating a disease associated with CD20 in an individual, comprising administering to the individual an effective amount of any of the CD20×CD3 MSAPs described above or any of the pharmaceutical compositions described above. In some embodiments, the disease associated with CD20 is a CD20-positive cancer. In some embodiments, the CD20-positive cancer is selected from the group consisting of acute myeloid leukemia (AML) , chronic myelogenous leukemia (CML) , myelodysplastic syndrome (MDS) , acute B lymphoblastic leukemia (B-ALL) , diffuse large B cell lymphoma (DLBCL) , mantle cell lymphoma (MCL) , follicular lymphoma, chronic lymphocytic leukemia (CLL) , hairy cell leukemia (HCL) , blastic plasmacytoid dendritic cell neoplasm (BPDCN) , non-Hodgkin’s lymphomas (NHL) , Hodgkin’s lymphoma, systemic mastocytosis, Burkitt’s lymphoma, and T-cell lymphoma (TCL) . In some embodiments, the CD20-positive cancer is Burkitt’s lymphoma. In some embodiments, the disease associated with CD20 is an autoimmune disease, such as an autoimmune disease selected from the group consisting of multiple sclerosis, myelin-oligodendrocyte glycoprotein spectrum disorder, neuromuscular spectrum disorder, systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, N-methyl-D-aspartate receptor encephalitis, myasthenia gravis, and a combination thereof. In some embodiments, the MSAP or the pharmaceutical composition is administered subcutaneously or intravenously. In some embodiments, the individual is a human.

[0042] Also provided herein are isolated nucleic acids encoding any of the CD20×CD19×CD3 MSAPs or CD20×CD3 MSAPs described above, vectors (e.g., viral vector) comprising such isolated nucleic acids, and host cells comprising any of the isolated nucleic acids or vectors.

[0043] Also provided are methods of making any of the CD20×CD19×CD3 MSAPs or CD20×CD3 MSAPs described above, comprising: i) culturing a host cell comprising any of the isolated nucleic acids or the vectors described above, or any of the host cells described above, under a condition suitable for the expression of the MSAP; and ii) obtaining the expressed MSAP from said host cell.

[0044] These and other aspects and advantages of the present invention will become apparent from the subsequent detailed description and the appended claims. It is to be understood that one, some, or all of the properties of the various embodiments described herein may be combined to form other embodiments of the present invention.

[0045] The disclosures of all publications, patents, patent applications and published patent applications referred to herein are hereby incorporated herein by reference in their entirety.BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

[0046] FIGs. 1A-1D provide exemplary multispecific (e.g., trispecific) antigen binding protein (MSAP, e.g., TSAP) structures. FIG. 1A depicts the structures of tested exemplary CD19×CD20×CD3 TSAP constructs as well as some control constructs described in the Examples. Each of FIG. 1B, FIG. 1C, and FIG. 1D provide additional exemplary CD19×CD20×CD3 TSAP construct structures.

[0047] FIG. 2 shows a schematic diagram of the CD19×CD20×CD3 MSAP heavy chain (e.g., fusion) polypeptide transient expression vector and the light chain (e.g., fusion) polypeptide transient expression vector.

[0048] FIGs. 3A-3D depict the binding curves of exemplary CD19×CD20×CD3 TSAP constructs (i.e., IMP-2023-025, IMP-2023-026, IMP-2023-027, and IMP-2023-028) to T cells and CD19+ and / or CD20+ target cells. FIG. 3A depicts the binding curves of IMP-2023-025, IMP-2023-026, IMP-2023-027, and IMP-2023-028 to CD3+ T cells. FIG. 3B depicts the binding curves of IMP-2023-025, IMP-2023-026, IMP-2023-027, and IMP-2023-028 to CD19+ / CD20+ Raji target cells. FIG. 3C depicts the binding curves of IMP-2023-025, IMP-2023-026, IMP-2023-027, and IMP-2023-028 to CD19-knockout / CD20+ Raji cells. FIG. 3D depicts the binding curves of IMP-2023-025, IMP-2023-026, IMP-2023-027, and IMP-2023-028 to CD19+ / CD20-RS4; 11 target cells. Conc., concentration.

[0049] FIG. 4 shows the expression levels of each of CD19 and CD20 on various cell lines. The black solid box in the figure represents CD19, and the white box represents CD20. The left vertical axis is the mean fluorescence intensity (MFI) of CD19, and the right vertical axis is the MFI of CD20.

[0050] FIGs. 5A-5E show the target cell killing curve of exemplary CD19×CD20×CD3 TSAP constructs (i.e., IMP-2023-025, IMP-2023-026, IMP-2023-027, and IMP-2023-028) and a CD19×CD3 bispecific antibody control (IMC-021; see structure in FIG. 1A) , wherein effector T cells were co-cultured with one of three target cell lines (i.e., Raji, Raji CD19-KO, or RS4; 11 cells) at an E: T ratio of 4: 1, over an incubation time of 24 hours. FIG. 5A shows T cell-mediated Raji cell killing curve of IMP-2023-025, IMP-2023-026, and IMP-2023-027, compared to the CD19×CD3 bispecific antibody control, IMC-021. FIG. 5B shows T cell-mediated Raji cell killing curve of IMP-2023-028, compared to CD19×CD3 bispecific control IMC-021. FIG. 5C shows T cell-mediated Raji CD19-KO cell killing curve of IMP-2023-025, IMP-2023-026, and IMP-2023-027. FIG. 5D shows T cell-mediated Raji CD19-KO cell killing curve of IMP-2023-028. FIG. 5E shows T cell-mediated RS4; 11 cell killing curve of IMP-2023-025, IMP-2023-026, IMP-2023-027, and IMP-2023-028, compared to CD19×CD3 bispecific control IMC-021.

[0051] FIGs. 6A-6J show the target cell killing curve of the exemplary CD19×CD20×CD3 TSAP construct, IMP-2023-026, wherein effector T cells were co-cultured with one of ten target cell lines (i.e., Raji, Daudi, Su-DHL-4, Jeko-1, K562-CD19, REH, RS4; 11, K562-CD20, Raji CD19KO, or K562-BCMA cells) at an E: T ratio of 4: 1, over an incubation time of 24 hours. FIG. 6A provides the CD19+ / CD20+ Raji cell killing curve of IMP-2023-026. FIG. 6B provides the CD19+ / CD20+ Daudi cell killing curve of IMP-2023-026, compared to the EpCAM×CD3 bispecific antibody control, IMC-023 (see structure in FIG. 1A) . FIG. 6C provides the CD19+ / CD20+ Su-DHL-4 cell killing curve of IMP-2023-026, compared to the EpCAM×CD3 bispecific control IMC-023. FIG. 6D provides the CD19+ / CD20+ Jeko-1 cell killing curve of IMP-2023-026, compared to the EpCAM×CD3 bispecific control IMC-023. FIG. 6E provides the CD19+ / CD20-K562-CD19 cell killing curve of IMP-2023-026, compared to the CD20×CD3 bispecific antibody control, IMC-022 (see structure in FIG. 1A) . FIG. 6F provides the CD19+ / CD20-REH cell killing curve of IMP-2023-026, compared to CD20×CD3 bispecific control IMC-022. FIG. 6G provides the CD19+ / CD20-RS4; 11 cell killing curve of IMP-2023-026, compared to CD20×CD3 bispecific control IMC-022. FIG. 6H provides the CD19- / CD20+K562-CD20 cell killing curve of IMP-2023-026, compared to the CD19×CD3 bispecific antibody control, IMC-021 (see structure in FIG. 1A) . FIG. 6I provides the Raji CD19-KO cell (CD19- / CD20+) killing curve of IMP-2023-026, compared to CD19×CD3 bispecific control IMC-021. FIG. 6J provides the CD19- / CD20- / BCMA+ K562-BCMA cell killing curve of IMP-2023-026, compared to the control CD19×BCMA×CD3 TSAP construct, IMP-2023-031 (see structure in FIG. 1A) .

[0052] FIGs. 7A-7B show the comparison of the target cell specific cytolysis induced by the exemplary CD19×CD20×CD3 TSAP construct, IMP-2023-029, compared to the CD20×CD3 bispecific antibody control, IMP-024 or the CD19×CD3 bispecific antibody control, IMP-025 (see structures in FIG. 1A) . FIG. 7A shows the specific cytolysis of K562-CD20 cells resulting from co-culture with T cells and various concentrations of IMP-2023-029, compared to the CD20×CD3 bispecific control IMP-024 (see structure in FIG. 1A) . FIG. 7B shows the specific cytolysis of K562-CD19 cells resulting from co-culture with T cells and various concentrations of IMP-2023-029, compared to the CD19×CD3 bispecific control IMP-025.

[0053] FIG. 8 shows the results of the CD4+ T cell and CD8+ T cell activation experiment, wherein human peripheral blood mononuclear cells (hPBMCs) were co-cultured with Raji cells and various concentrations of the exemplary CD19×CD20×CD3 TSAP construct, IMP-2023-026.

[0054] FIGs. 9A-9B show results of the T cell proliferation experiment at various concentrations of the exemplary CD19×CD20×CD3 TSAP construct, IMP-2023-026, compared to the EpCAM×CD3 bispecific antibody control, IMC-023 (see structure in FIG. 1A) . FIG. 9A provides the CD4+ T cell proliferation results. FIG. 9B provides the CD8+ T cell proliferation results.

[0055] FIG. 10 shows the results of the in vivo tumor killing experiment, wherein NSG mice first were administered 5×106 hPBMCs by intraperitoneal injection (i. p. ) on Day -2, then were subcutaneously injected (s. c. ) with 3×106 Raji tumor cells on Day 0. The tumor-bearing mice were then injected with either PBS vehicle or the IMP-2023-026 TSAP at one of 30 μg / kg, 100 μg / kg, or 500 μg / kg on Day 9 and every-other day thereafter for a total of 3 weeks and the tumor sizes measured until Day 28.

[0056] FIG. 11 provides a schematic overview outlining the expression of CD19, CD20, and BCMA on developing and mature B cells.

[0057] FIGs. 12A-12B provide schematic outlines of exemplary CD20×CD3 MSAP (e.g., BSAP) structures. FIG. 12A depicts the structure of an exemplary CD20×CD3 MSAP (e.g., IM-320-C15) comprising 2 anti-CD20 scFvs. FIG. 12B depicts the structure of an exemplary CD20×CD3 MSAP (e.g., IM-320-C21) comprising 1 anti-CD20 scFv.

[0058] FIGs. 13A-13F provide the T cell-mediated specific cytotoxicity of target Raji cells induced upon culture in the presence of exemplary CD20×CD3 MSAP constructs IM-320-C15 through IM-320-C18 and IM-320-C20 through IM-320-C24. FIG. 13A depicts the percent of specific cytotoxicity for IM-320-C16, IM-320-C17, and IM-320-C18 against Raji cells. FIG. 13B depicts the percent of specific cytotoxicity for exemplary CD20×CD3 MSAP constructs IM-320-C15 through IM-320-C18 against Raji CD19KO cells. FIG. 13C depicts the percent of specific cytotoxicity for IM-320-C20 and IM-320-C24 against Raji cells. FIG. 13D depicts the percent of specific cytotoxicity for IM-320-C20 and IM-320-C24 against Raji CD19KO cells. FIG. 13E depicts the percent of specific cytotoxicity for IM-320-C21, IM-320-C22, and IM-320-C23 against Raji CD19KO cells. FIG. 13F depicts the percent of specific cytotoxicity for IM-320-C21, IM-320-C22, and IM-320-C23 against Raji cells. CFSE-positive (CFSE+) cells are Raji cells, 7-AAD-negative (7-AAD-) cells are viable cells, 7-AAD+ cells are dead cells, and CFSE+ / 7-AAD+ cells are dead Raji cells. Cells were analyzed using ACCURI C6 (BD Bioscience) . MSAP, multispecific antigen binding proteins; CD19KO, CD19 knockout.DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

[0059] Despite of the various multispecific antibodies available, there remains great challenges for their widespread clinical application (e.g., in treating cancer) with good efficacy, safety, and durability. Patients, such as those receiving single-target therapy, can also develop drug resistance. Also, different target antigens may be expressed at different disease stages and / or tissues. For example, during different development stages of B cells (e.g., see FIG. 11) , especially in different disease types, the expression spectrum and expression level of CD19 and CD20 is different. The expression spectrum of CD19 on B cells seems wider than that of CD20.

[0060] The present invention in one aspect provides an MSAP (e.g., TSAP; hereinafter also referred to as CD20×CD19×CD3 MSAPs or TSAPs) comprising three moieties, comprising: i) an anti-CD3 moiety that specifically binds to CD3; ii) an anti-CD19 moiety that specifically binds to CD19; and iii) an anti-CD20 moiety that specifically binds to CD20; wherein a first moiety of the three moieties is a Fab fragment, wherein a second moiety of the three moieties is a first antigen binding fragment (e.g., scFv) ; and wherein a third moiety of the three moieties is a second antigen binding fragment (e.g., scFv) . In some embodiments, the first antigen binding fragment is fused to the N-terminus of the VH of the Fab fragment or to the C-terminus of the CH1 of the Fab fragment, and the second antigen binding fragment is fused to the N-terminus of the VL of the Fab fragment or to the C-terminus of the CL of the Fab fragment. In some embodiments, the first antigen binding fragment is fused to the N-terminus of the VH or the VL of the Fab fragment, and the second antigen binding fragment is fused to the C-terminus of the CH1 or the CL of the Fab fragment. In some embodiments, the first antigen binding fragment and the second antigen binding fragment are both scFvs. Exemplary MSAPs are shown in FIGs. 1A-1D (e.g., exemplary TSAPs or TriTEs) .

[0061] After extensive investigation, inventors of the present application discovered that the CD20×CD19×CD3 MSAPs (such as TSAP) described herein have several unexpected advantages compared to other multispecific proteins. First, the CD20×CD19×CD3 MSAPs described herein have enhanced cytotoxic activities against target (e.g., cancer) cells, either a single target-expressing cell (e.g., CD19+) or a double target-expressing cell (e.g., CD19+ and CD20+) , such as compared to a BSAP targeting a single B-cell target antigen (e.g., CD19×CD3 BSAP) . The multi-targeting (CD19 and CD20) design of the MSAPs can redirect specific polyclonal immune cells (e.g., T cells or NK cells) to target (e.g., cancer) cells to enhance immune cell-mediated target cell killing. This multimodal (or multi-targeting) design allows the CD20×CD19×CD3 MSAPs to capture a wider spectrum of disease types associated with the expression of CD20 and / or CD19, such as a disease with CD20 and CD19 expression at different levels and / or during different disease stages, compared to bispecific antibodies targeting a single non-CD3 target. For patients (e.g., cancer patient) that co-express CD20 and CD19, CD20×CD19×CD3 MSAPs described herein may also improve the efficacy and reduce or avoid drug resistance developed against a single non-CD3 target like for bispecific antibodies. CD20×CD19×CD3 MSAPs described herein can also avoid antigen escape from a single non-CD3 target and provide patients with a more comprehensive treatment plan. CD19 or CD20 targets may be lost during disease treatment. When this happens, the CD20×CD19×CD3 MSAPs can still exert their effects through another target, while bispecific molecules are likely to fail. The CD20×CD19×CD3 MSAPs can offer the advantage of killing target cells that express CD19 or CD20 alone, while bispecific molecules can only be effective against one and not the other. Second, without being bound by theory, when one or both antigen binding fragments are fused to the N-terminus of the Fab fragment, the CD20×CD19×CD3 MSAPs described herein may display hindered Fab binding in the absence of its binding to target antigen (s) recognized by the N’antigen binding fragment (s) , which can reduce off-target immune cell-mediated toxicity by limiting T-cell activation to CD20+ and / or CD19+ tissues, i.e. CD20+ and / or CD19+ cancers. For example, when the Fab fragment specifically recognizes CD20 or CD19, the hindered Fab binding may add an extra safety layer to preferentially target high CD20-or CD19-expressing cells (e.g., tumor cells) vs. low CD20-or CD19-expressing cells (e.g., normal B cells) . Third, the CD20×CD19×CD3 MSAPs, by employing a Fab fragment, may have extended half-life (e.g., compared to a BiTE format) that enables lower dosing frequency and shorter infusion time, providing more convenience to the patients. Fourth, the CD20×CD19×CD3 MSAPs demonstrated concentration-dependent T cell activation and target-antigen directed binding and killing (e.g., not killing cells without CD20 and CD19 expression) , demonstrating high specificity and superior safety profile. Fifth, the CD20×CD19×CD3 MSAPs significantly increased T cell proliferation, including proliferation of both CD4+ and CD8+ T cells in both a target protein-specific and concentration-dependent manner relative to controls that did not target these antigens. Sixth, the CD20×CD19×CD3 MSAPs described herein have cross-reactivity to both human and cynomolgus monkey CD3, which can facilitate extrapolation of toxicity and efficacy study results from cynomolgus monkeys to human clinical studies. Seventh, the CD20×CD19×CD3 MSAPs described herein showed excellent and dose-dependent in vivo clearance of target cells (e.g., CD19+ / CD20+ Raji cancer cells) in mice. These surprising effects were demonstrated for CD20×CD19×CD3 MSAPs of various structures and sequences. Taken together, these findings demonstrate the unique pharmacokinetic and pharmacodynamic properties of the CD20×CD19×CD3 MSAPs and their improved therapeutic efficacy compared to multispecific or bispecific antibodies targeting a single non-CD3 target antigen (e.g., CD19 or CD20 only) . Such MSAPs may be very promising in anti-tumor therapies and treatment of autoimmune diseases.

[0062] The present invention in another aspect provides an MSAP (e.g., TSAP or BSAP; hereinafter also referred to as CD20×CD3 MSAPs, TSAPs, or BSAPs) comprising: (i) an anti-CD3 Fab fragment that specifically binds to CD3, wherein the anti-CD3 Fab fragment comprises: (a) a VH and a CH1; and (b) a VL and a CL; and (ii) an anti-CD20 antigen binding fragment (e.g., scFv) that specifically binds to CD20. In some embodiments, the anti-CD20 antigen binding fragment is fused to the N-terminus of the VH or the VL of the anti-CD3 Fab fragment via an optional linker. In some embodiments, the MSAP comprises a first anti-CD20 antigen binding fragment (e.g., scFv) and a second anti-CD20 antigen binding fragment (e.g., scFv) , wherein the first anti-CD20 antigen binding fragment is fused to the N-terminus of the VH of the anti-CD3 Fab fragment via an optional first linker, and wherein the second anti-CD20 antigen binding fragment is fused to the N-terminus of the VL of the anti-CD3 Fab fragment via an optional second linker. In some embodiments, the first anti-CD20 antigen binding fragment and the second anti-CD20 antigen binding fragment are each an anti-CD20 scFv. Exemplary CD20×CD3 MSAPs are shown in FIGs. 12A-12B.

[0063] Inventors of the present application also discovered several unexpected advantages of CD20×CD3 MSAPs (e.g., TSAP or BSAP) described herein. First, the CD3×CD20 MSAPs described herein exhibit excellent cytotoxic activities against cancer cells, particularly against CD20-positive Burkitt’s lymphoma (Raji) cells. Second, the CD3×CD20 MSAPs may have extended half-life that enables lower dosing frequency and shorter infusion time (e.g., compared to a BiTE format) , providing more convenience to the patients. Third, without being bound by theory, the CD3×CD20 MSAPs may display hindered anti-CD3 Fab binding to CD3 in the absence of CD3×CD20 MSAP binding to CD20 antigen, which can reduce off-target immune cell-mediated toxicity by limiting T-cell activation to CD20+ tissues, i.e. CD20+ cancers. Fourth, the CD3×CD20 MSAPs have cross-reactivity to both human and cynomolgus monkey CD3, which can facilitate extrapolation of toxicity and efficacy study results from cynomolgus monkeys to human clinical studies.

[0064] Also provided are isolated nucleic acids, vectors, and host cells encoding any of the CD3×CD20×CD19 MSAPs and CD3×CD20 MSAPs described herein.

[0065] Further provided are pharmaceutical compositions and kits comprising any of the CD20×CD19×CD3 MSAPs (such as TSAPs) or CD20×CD3 MSAPs (such as TSAPs or BSAPs) described herein, or isolated nucleic acids, vectors, or host cells encoding thereof. Further provided are methods of use any of the CD20×CD19×CD3 MSAPs, CD20×CD3 MSAPs, or pharmaceutical compositions thereof, such as for treating a disease associated with CD19 and / or CD20, such as cancers such as hematological malignancies, e.g., CD19-positive, CD20-positive, or CD19-positive / CD20-positive cancers, or autoimmune diseases.Brief Summary of Exemplary Invention

[0066] In some embodiments, the present invention provides a T cell engager that targets CD19 and CD20 antigens on the surface of target cells (e.g., B cells) .

[0067] In the first aspect of the present invention, a multispecific antibody is provided, the multispecific antibody comprising: 1) a CD3 targeting binding domain, which comprises one or more antigen binding fragments that specifically bind to CD3 protein (anti-CD3 antigen binding fragment) ; 2) a CD19 targeting binding domain, which comprises one or more antigen binding fragments that specifically bind to CD19 protein (anti-CD19 antigen binding fragment) ; and 3) a CD20 targeting binding domain, which comprises one or more antigen binding fragments that specifically bind to CD20 protein (anti-CD20 antigen binding fragment) . In some embodiments, the multispecific antibody is a trispecific antibody (herein also referred to as trispecific T-cell engager or “TriTE” ) .

[0068] In some embodiments, the antigen binding fragment that specifically binds to the CD3 protein comprises a heavy chain variable region (VH) and a light chain variable region (VL) , wherein the VH comprises the following CDRs: a VH-CDR1 as shown in SEQ ID NO: 1, a VH-CDR2 as shown in SEQ ID NO: 2, and a VH-CDR3 as shown in SEQ ID NO: 3; and the VL has the following CDRs: a VL-CDR1 as shown in SEQ ID NO: 17, a VL-CDR2 as shown in SEQ ID NO: 18, and a VL-CDR3 as shown in SEQ ID NO: 19.

[0069] In some embodiments, the VH of the anti-CD3 antigen binding fragment comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 32 or has at least 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%sequence homology thereto, and / or the VL of the anti-CD3 antigen binding fragment comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 33 or has at least 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%sequence homology thereto.

[0070] In some embodiments, the antigen-binding fragment that specifically binds to the CD19 protein comprises a VH and a VL, wherein the VH comprises the following CDRs: a VH-CDR1 as shown in SEQ ID NO: 4, a VH-CDR2 as shown in SEQ ID NO: 5, and a VH-CDR3 as shown in SEQ ID NO: 6; and the VL comprises the following CDRs: a VL-CDR1 as shown in SEQ ID NO: 20, a VL-CDR2 as shown in SEQ ID NO: 21, and a VL-CDR3 as shown in SEQ ID NO: 22.

[0071] In some embodiments, the VH of the anti-CD19 antigen binding fragment comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 34 or has at least 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%sequence homology thereto, and / or the VL of the anti-CD19 antigen binding fragment comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 35 or has at least 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%sequence homology thereto.

[0072] In some embodiments, the antigen binding fragment specifically binding to the CD20 protein comprises a VH and a VL, wherein the VH and the VL have the following CDRs: (i) a VH-CDR1 as shown in SEQ ID NO: 13, a VH-CDR2 as shown in SEQ ID NO: 14, a VH-CDR3 as shown in SEQ ID NO: 15, a VL-CDR1 as shown in SEQ ID NO: 29, a VL-CDR2 as shown in SEQ ID NO: 30, and a VL-CDR3 as shown in SEQ ID NO: 31; or (ii) a VH-CDR1 as shown in SEQ ID NO: 10, a VH-CDR2 as shown in SEQ ID NO: 11, a VH-CDR3 as shown in SEQ ID NO: 12, a VL-CDR1 as shown in SEQ ID NO: 26, a VL-CDR2 as shown in SEQ ID NO: 27, and a VL-CDR3 as shown in SEQ ID NO: 28; or (iii) a VH-CDR1 as shown in SEQ ID NO: 10, a VH-CDR2 as shown in SEQ ID NO: 16, a VH-CDR3 as shown in SEQ ID NO: 12, a VL-CDR1 as shown in SEQ ID NO: 26, a VL-CDR2 as shown in SEQ ID NO: 27, and a VL-CDR3 as shown in SEQ ID NO: 28; or (iv) a VH-CDR1 as shown in SEQ ID NO: 7, a VH-CDR2 as shown in SEQ ID NO: 8, a VH-CDR3 as shown in SEQ ID NO: 9, a VL-CDR1 as shown in SEQ ID NO: 23, a VL-CDR2 as shown in SEQ ID NO: 24, and a VL-CDR3 as shown in SEQ ID NO: 25.

[0073] In some embodiments, the VH of the anti-CD20 antigen binding fragment comprises the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 40, 38, 42, and 36, or has at least 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%sequence homology thereto. In some embodiments, the VL of the anti-CD20 antigen binding fragment comprises an amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 41, 39, and 37, or has at least 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%sequence homology thereto. In some embodiments, the VH of the anti-CD20 antigen binding fragment comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 40, and the VL of the anti-CD20 antigen binding fragment comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 41. In some embodiments, the VH of the anti-CD20 antigen binding fragment comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 38 or 42, and the VL of the anti-CD20 antigen binding fragment comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 39. In some embodiments, the VH of the anti-CD20 antigen binding fragment comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 36, and the VL of the anti-CD20 antigen binding fragment comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 37.

[0074] In some embodiments, the antigen binding fragment is selected from the group consisting of Fab, (Fab') 2, scFv, and any combination thereof. In some embodiments, the antigen binding fragment is an scFv.

[0075] In some embodiments, the antigen binding fragment that binds to CD3 is an anti-CD3 Fab, and the antigen binding fragment that binds to CD19 and the antigen binding fragment that binds to CD20 are anti-CD19 scFv and anti-CD20 scFv, respectively.

[0076] In some embodiments, the antigen binding fragment that binds to CD19 is an anti-CD19 Fab, and the antigen binding fragment that binds to CD19 and the antigen binding fragment that binds to CD3 are anti-CD19 scFv and anti-CD3 scFv, respectively.

[0077] In some embodiments, the antigen binding fragment that binds to CD20 is an anti-CD20 Fab, and the antigen binding fragment that binds to CD19 and the antigen binding fragment that binds to CD3 are anti-CD19 scFv and anti-CD3 scFv, respectively.

[0078] In some embodiments, the anti-CD3 scFv, anti-CD20 scFv, and / or anti-CD19 scFv has a structure shown in the following formula Ia or Ib from N-terminus to C-terminus: VL-L1-VH    (Ia) ;  VH-L1-VL    (Ib) ; in the formula, "-" is independently a bond; VL is the light chain variable region of the  antigen binding fragment; VH is the heavy chain variable region of the antigen binding fragment; and L1 is a connecting peptide.

[0079] In some embodiments, L1 is a flexible connecting peptide. In some embodiments, L1 comprises an amino acid sequence as shown in (GGGGS) n (SEQ ID NO: 175) , wherein “n” is an integer of 1-6, such as 2, 3, or 4. In some embodiments, L1 comprises an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 68.

[0080] In some embodiments, the anti-CD3 Fab, anti-CD20 Fab, and / or anti-CD19 Fab comprises a light chain constant region and / or a heavy chain constant region. In some embodiments, the Fab fragment comprises a light chain constant region CL and a heavy chain constant region CH1. In some embodiments, the constant region is a human constant region or a mouse constant region. In some embodiments, the light chain constant region CL comprises an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 63. In some embodiments, the heavy chain constant region CH1 comprises an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 64.

[0081] In some embodiments, the multispecific (e.g., trispecific) antibody has a structure as shown in any of the following formula IIIa, IIIb, IIIc, IIId or IIIe: in each formula, "-" is independently a bond or a connecting peptide; ScFvCD19, ScFvCD20  and ScFvCD3 are the anti-CD19 scFv, anti-CD20 scFv, and anti-CD3 scFv, respectively; VHCD3 and VLCD3 are the VH and VL of the anti-CD3 antigen binding fragment, respectively; VHCD20 and VLCD20 are the VH and VL of the anti-CD20 antigen binding fragment, respectively; VHCD19 and VLCD19 are the VH and VL of the anti-CD19 antigen binding fragment, respectively; CH1 is the heavy chain constant region 1; CL is the light chain constant region; L2 and L3 are independently connecting peptides; and is a disulfide bond or a  covalent bond.

[0082] In some embodiments, L2 and L3 are flexible connecting peptides. In some embodiments, L2 and L3 each independently comprise an amino acid sequence as shown in (GGGGS) n (SEQ ID NO: 176) , wherein “n” is an integer of 1-6, such as 1, 2, or 3. In some embodiments, L2 comprises an amino acid sequence as shown in any one of SEQ ID NOs: 65-67. In some embodiments, L3 comprises an amino acid sequence as shown in any one of SEQ ID NOs: 65-67.

[0083] In some embodiments, the heavy chain (e.g., heavy chain fusion polypeptide) of the multispecific (e.g., trispecific) antibody comprises an amino acid sequence as shown in any one of SEQ ID NOs: 44, 46, 48, 49, and 54, or has at least 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%sequence homology thereto. In some embodiments, the light chain (e.g., light chain fusion polypeptide) of the multispecific (e.g., trispecific) antibody comprises an amino acid sequence of any one of SEQ ID NO: 43, 45, 47, 50, 51, 52, 53, and 55, or has at least 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%sequence homology thereto. In some embodiments, the heavy chain (e.g., heavy chain fusion polypeptide) of the multispecific (e.g., trispecific) antibody comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 44 or 54, and the light chain (e.g., light chain fusion polypeptide) of the multispecific (e.g., trispecific) antibody comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 52.

[0084] In some embodiments, the EC50 of the multispecific (e.g., trispecific) antibody binding to target cells expressing CD19 and CD20 is ≤1×10-8 M, such as ≤1×10-9 M, or ≤5×10-10 M.

[0085] In a second aspect of the present invention, a recombinant protein is provided, the recombinant protein comprises: (i) the multispecific (e.g., trispecific) antibody as described in the first aspect of the  present invention; and (ii) a tag sequence that assists expression and / or purification.

[0086] In some embodiments, the tag sequence comprises a “6×His” tag, a “GGGS” (SEQ ID NO: 73) sequence, or a “FLAG” tag. In some embodiments, the recombinant protein is a fusion protein. In some embodiments, the recombinant protein is a monomer, a dimer, a multimer, or a polymer.

[0087] In a third aspect of the present invention, a polynucleotide is provided, which encodes a multispecific (e.g., trispecific) antibody as described in the first aspect of the present invention or a recombinant protein as described in the second aspect of the present invention.

[0088] In a fourth aspect of the present invention, a vector is provided, which comprises a polynucleotide as described in the third aspect of the present invention.

[0089] In some embodiments, the vector is an expression vector. In some embodiments, the expression vector is selected from the group consisting of a DNA vector, an RNA vector, a viral vector, a plasmid, a transposon, other gene transfer systems, and any combination thereof. In some embodiments, the expression vector is a viral vector, such as a lentivirus vector, an adenovirus vector, an AAV vector, a retrovirus vector, or any combination thereof.

[0090] In a fifth aspect of the present invention, a genetically engineered host cell is provided, which comprises a vector as described in the fourth aspect of the present invention, or a polynucleotide as described in the third aspect of the present invention, such as integrated into the genome of the host cell.

[0091] In some embodiments, the host cell is a prokaryotic cell or a eukaryotic cell. In some embodiments, the host cell is selected from the group consisting of Escherichia coli cells, yeast cells, and mammalian cells.

[0092] In a sixth aspect of the present invention, an antibody conjugate is provided, the antibody conjugate comprises: (a) an antibody portion, the antibody portion being a multispecific (e.g., trispecific)  antibody as described in the first aspect of the present invention; and (b) a conjugated portion conjugated to the antibody portion, the conjugated portion being a detectable marker, a drug, or any combination thereof.

[0093] In some embodiments, the detectable marker comprises a radionuclide. In some embodiments, the drug comprises a toxin, a cytokine, or an enzyme.

[0094] In some embodiments, the conjugate is selected from the group consisting of fluorescent or luminescent markers, radioactive markers, MRI (magnetic resonance imaging) or CT (computer tomography) contrast agents, or enzymes capable of producing detectable products, radionuclides, biotoxins, cytokines (such as IL-2, etc. ) , antibodies, Fc fragments, scFvs, gold nanoparticles / nanorods, viral particles, liposomes, nanomagnetic particles, prodrug activating enzymes (e.g., DT-diaphorase (DTD) or biphenyl hydrolase-like protein (BPHL) ) , chemotherapeutic agents (for example, cisplatin) , and any form of nanoparticles.

[0095] In some embodiments, the antibody portion is coupled to the conjugated portion through a chemical bond or a linker.

[0096] In a seventh aspect of the present invention, there is provided a use of an active ingredient in the preparation of a medicament for preventing and / or treating a disease associated with expression (e.g., high expression) of CD19 and / or CD20, wherein the active ingredient is selected from the group consisting of a multispecific (e.g., trispecific) antibody as described in the first aspect of the present invention, a recombinant protein as described in the second aspect of the present invention, an antibody conjugate as described in the sixth aspect of the present invention, and any combination thereof.

[0097] In some embodiments, the disease is a cancer, a tumor, or an autoimmune disease.

[0098] In some embodiments, the disease is a cancer or a tumor. In some embodiments, the cancer or tumor is a solid tumor or a hematological tumor. In some embodiments, the cancer or tumor is selected from the group consisting of acute lymphocytic leukemia (ALL) , chronic lymphocytic leukemia (CLL) , B-cell lymphoma (BCL) , and any combination thereof.

[0099] In some embodiments, the disease is an autoimmune disease. In some embodiments, the autoimmune disease is selected from the group consisting of multiple sclerosis, myelin-oligodendrocyte glycoprotein spectrum disorder, optic nerve spinal cord spectrum disorder, systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, N-methyl-D-aspartate receptor encephalitis, myasthenia gravis, and any combination thereof.

[0100] In an eighth aspect of the present invention, a pharmaceutical composition is provided, the pharmaceutical composition comprises: (i) an active ingredient, the active ingredient being selected from the group consisting of  the multispecific (e.g., trispecific) antibody as described in the first aspect of the present invention, the recombinant protein as described in the second aspect of the present invention, the antibody conjugate as described in the sixth aspect of the present invention, and any combination thereof; and (ii) a pharmaceutically acceptable carrier.

[0101] In some embodiments, the pharmaceutical composition is a liquid preparation. In some embodiments, the pharmaceutical composition is an injection solution. In some embodiments, the pharmaceutical composition comprises 0.01%to 99.99%of the active ingredient and 0.01%to 99.99%of the pharmaceutical carrier, the percentage being the mass percentage of the pharmaceutical composition.

[0102] In some embodiments, the pharmaceutical composition is for use to prevent and / or treat diseases associated with expression (e.g., high expression) of CD19 and / or CD20.

[0103] Ina ninth aspect of the present invention, a method for treating diseases associated with expression (e.g., high expression) of CD19 and / or CD20 is provided, wherein an effective amount of the multispecific (e.g., trispecific) antibody as described in the first aspect of the present invention, the recombinant protein as described in the second aspect of the present invention, the antibody conjugate as described in the sixth aspect of the present invention, the pharmaceutical composition as described in the eighth aspect of the present invention, or any combination thereof, is administered to a subject in need.

[0104] In some embodiments, the disease is a cancer, a tumor, or autoimmune disease.

[0105] In some embodiments, the disease is a cancer or a tumor. In some embodiments, the cancer or tumor is a solid tumor or a hematological tumor. In some embodiments, the cancer or tumor is selected from the group consisting of ALL, CLL, BCL, and any combination thereof.

[0106] In some embodiments, the disease is an autoimmune disease. In some embodiments, the autoimmune disease is selected from the group consisting of multiple sclerosis, myelin-oligodendrocyte glycoprotein spectrum disorder, optic nerve spinal cord spectrum disorder, systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, N-methyl-D-aspartate receptor encephalitis, myasthenia gravis, and any combination thereof.

[0107] It should be understood that within the scope of the present invention, the above-mentioned technical features of the present invention and the technical features specifically described below (such as the embodiments) can be combined with each other to form a new or preferred technical solution. Due to space limitations, they will not be described one by one here. I. Definitions

[0108] In order to make the present invention more easily understood, certain technical and scientific terms are specifically defined below. Unless otherwise explicitly defined herein, all other technical and scientific terms used herein have the meanings commonly understood by those of ordinary skill in the art to which the present invention belongs. Before describing the present invention, it should be understood that the present invention is not limited to the specific methods and experimental conditions described, because such methods and conditions may vary. It should also be understood that the terms used herein are intended only to describe specific embodiments and are not intended to be limiting.

[0109] The practice of the present invention will employ, unless indicated specifically to the contrary, conventional methods of virology, immunology, microbiology, molecular biology, and recombinant DNA techniques within the skill of the art, many of which are described below for the purpose of illustration. Such techniques are explained fully in the literature. See, e.g., Current Protocols in Molecular Biology or Current Protocols in Immunology, John Wiley &Sons, New York, N.Y. (2009) ; Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, 3rd ed., John Wiley &Sons, 1995; Sambrook and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd Edition, 2001) ; Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982) ; DNA Cloning: A Practical Approach, vol. I&II (D. Glover, ed. ) ; Oligonucleotide Synthesis (N. Gait, ed., 1984) ; Nucleic Acid Hybridization (B. Hames &S. Higgins, eds., 1985) ; Transcription and Translation (B. Hames &S. Higgins, eds., 1984) ; Animal Cell Culture (R. Freshney, ed., 1986) ; Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984) and other like references.

[0110] As used herein, the term "treatment" refers to administering an internal or external therapeutic agent, including an antibody of the present invention or a composition thereof, to a patient who has one or more symptoms of a disease for which the therapeutic agent is known to have a therapeutic effect. Typically, the patient is administered an amount of the therapeutic agent that is effective in alleviating one or more symptoms of the disease (therapeutically effective amount) . In some embodiments, the treatment alters the natural course of the individual or cell being treated during the course of clinical pathology. Desirable effects of treatment include decreasing the rate of disease progression, ameliorating or palliating the disease state, and remission or improved prognosis. For example, an individual is successfully “treated” if one or more symptoms associated with cancer are mitigated or eliminated, including, but not limited to, reducing the proliferation of (or destroying) cancerous cells, decreasing symptoms resulting from the disease, increasing the quality of life of those suffering from the disease, decreasing the dose of other medications required to treat the disease, and / or prolonging survival of individuals.

[0111] As used herein, the term "optionally" means that the event or situation described subsequently may occur but does not necessarily occur (in other words, may or may not occur) . For example, "optionally comprising 1-3 antibody heavy chain variable regions" means that the specific sequence may have, but do not necessarily have, 1, 2 or 3 antibody heavy chain variable regions.

[0112] As used herein, an “effective amount” refers to an amount of an agent or drug effective to treat a disease or disorder in a subject. In the case of cancer, the effective amount of the agent may reduce the number of cancer cells; reduce the tumor size; inhibit (i.e., slow to some extent and preferably stop) cancer cell infiltration into peripheral organs; inhibit (i.e., slow to some extent and preferably stop) tumor metastasis; inhibit, to some extent, tumor growth; and / or relieve to some extent one or more of the symptoms associated with the cancer. As is understood in the clinical context, an effective amount of a drug, compound, or pharmaceutical composition may or may not be achieved in conjunction with another drug, compound, or pharmaceutical composition. Thus, an “effective amount” may be considered in the context of administering one or more therapeutic agents, and a single agent may be considered to be given in an effective amount if, in conjunction with one or more other agents, a desirable result may be or is achieved.

[0113] As used herein, an “individual” or a “subject” refers to a mammal, including, but not limited to, human, bovine, horse, feline, canine, rodent, or primate. In some embodiments, the individual is a human.

[0114] The term “antibody” , “antibody construct” , or “antigen binding protein” is used in the broadest sense and can cover monoclonal antibodies (including full length monoclonal antibodies) , multispecific antibodies (e.g., bispecific antibodies) , and antibody fragments so long as they exhibit the desired biological activity or function. In some embodiments, the term "antibody" or "immunoglobulin" refers to heterotetrameric glycoproteins of about 150,000 Daltons, composed of two identical light (L) chains and two identical heavy (H) chains.

[0115] The terms “native antibody, ” “full length antibody, ” “intact antibody, ” and “whole antibody” are used herein interchangeably to refer to an antibody in its substantially intact form, not antibody fragments as defined below. The terms particularly refer to an antibody with heavy chains that contain an Fc region. Native antibodies are usually heterotetrameric glycoproteins of about 150,000 Daltons, composed of two identical light (L) chains and two identical heavy (H) chains. Each light chain is linked to a heavy chain by one covalent disulfide bond, while the number of disulfide linkages varies among the heavy chains of different immunoglobulin isotypes. Each heavy and light chain also has regularly spaced intrachain disulfide bridges. Each heavy chain has at one end a variable domain (VH) followed by a number of constant domains. Each light chain has a variable domain at one end (VL) and a constant domain at its other end; the constant domain of the light chain is aligned with the first constant domain of the heavy chain, and the light chain variable domain is aligned with the variable domain of the heavy chain. Particular amino acid residues are believed to form an interface between the light chain and heavy chain variable domains.

[0116] The term “constant domain” refers to the portion of an immunoglobulin molecule having a more conserved amino acid sequence relative to the other portion of the immunoglobulin, the variable domain, which contains the antigen binding site. The constant domain contains the CH1, CH2 and CH3 domains (collectively, CH) of the heavy chain and the CHL (or CL) domain of the light chain. As used herein, the term "heavy chain constant region” or “CH” includes an amino acid sequence derived from an immunoglobulin heavy chain. In some embodiments, a polypeptide that comprises a CH domain comprises at least one of the following: a CH1 domain, a hinge region (e.g., an upper, middle and / or lower hinge region) , a CH2 domain, a CH3 domain, or a variant or fragment thereof. In some embodiments, a polypeptide that comprises a CH domain can comprise at least one of the following: a CH1 domain, a CH2 domain, a CH3 domain, or a variant or fragment thereof. A "light chain constant region" includes an amino acid sequence derived from an antibody light chain (e.g., from the more conserved amino acid sequence region) . For example, a light chain constant region can include at least one of a constant kappa domain or a constant lambda domain.

[0117] The “variable region” or “variable domain” of an antibody refers to the amino-terminal domains of the heavy or light chain of the antibody. The variable domain of the heavy chain may be referred to as “VH. ” The variable domain of the light chain may be referred to as “VL. ” These domains are generally the most variable parts of an antibody and contain the antigen-binding sites.

[0118] As used herein, the term “variable” means that certain portions of the variable domains differ in sequence among antibodies and are used in the binding and specificity of each particular antibody for its particular antigen. However, the variability is not evenly distributed throughout the variable domains of antibodies. It is concentrated in three segments called hypervariable regions (HVRs) or complementarity determining regions (CDRs) both in the light-chain and the heavy-chain variable domains. The more highly conserved portions of variable domains are called the framework regions (FR) . The variable domains of native heavy and light chains each comprise four FR regions, largely adopting a β-sheet configuration, connected by three CDRs, which form loops connecting, and in some cases forming part of, the β-sheet structure. The CDRs in each chain are held together in close proximity by the FR regions and, with the CDRs from the other chain, contribute to the formation of the antigen-binding site of antibodies (see Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, National Institute of Health, Bethesda, Md. (1991) ) . The constant domains are not involved directly in the binding of an antibody to an antigen, but exhibit various effector functions, such as participation of the antibody in antibody-dependent cellular toxicity.

[0119] Generally, the antigen binding properties of antibodies can be described by three specific regions located in the variable regions of the heavy and light chains, namely CDRs, which divide each variable region into four FRs. The amino acid sequences of the four FRs are relatively conservative and do not directly participate in the binding reaction. The amino acid sequences of antibodies of the same type can be compared to determine which amino acids constitute the FR or CDR region.

[0120] The light chains of antibodies (immunoglobulins) from any mammalian species can be assigned to one of two clearly distinct types, called kappa ( “κ” ) and lambda ( “λ” ) , based on the amino acid sequences of their constant domains.

[0121] The term IgG “isotype” or “subclass” as used herein is meant any of the subclasses of immunoglobulins defined by the chemical and antigenic characteristics of their constant regions.

[0122] Depending on the amino acid sequences of the constant domains of their heavy chains, antibodies (immunoglobulins) can be assigned to different classes. There are five major classes of immunoglobulins: IgA, IgD, IgE, IgG, and IgM, and several of these may be further divided into subclasses (isotypes) , e.g., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, and IgA2. The heavy chain constant domains that correspond to the different classes of immunoglobulins are called α, δ, ε, γ, and μ, respectively. The subunit structures and three-dimensional configurations of different classes of immunoglobulins are well known and described generally in, for example, Abbas et al. Cellular and Mol. Immunology, 4th ed. (W. B. Saunders, Co., 2000) . An antibody may be part of a larger fusion molecule, formed by covalent or non-covalent association of the antibody with one or more other proteins or peptides.

[0123] “Antibody fragments” comprise a portion of an intact antibody, preferably comprising the antigen binding region thereof. In some embodiments, the antibody fragment described herein is an antigen binding fragment. An antigen binding fragment normally retains certain ability to specifically bind to an antigen. Examples of antibody fragments or antigen binding fragments include Fab, Fab’, F (ab’) 2, and Fv fragments (such as single-chain variable fragment, scFv) ; diabodies; linear antibodies; single-chain antibody molecules; and multispecific antibodies formed from antibody fragments. In some embodiments, an antibody moiety or an antigen binding fragment can also be an sdAb. An antigen binding fragment can also be a Fd fragment comprising VH and CH1 domains. Antibody heavy chains and antibody light chains are also captured by the present invention.

[0124] Papain digestion of antibodies produces two identical antigen-binding fragments, called “Fab” fragments, each with a single antigen-binding site, and a residual “Fc” fragment, whose name reflects its ability to crystallize readily. Pepsin treatment yields an F (ab’) 2 fragment that has two antigen-combining sites and is still capable of cross-linking antigen.

[0125] “Fv” is the minimum antibody fragment which contains a complete antigen-binding site. Generally, an Fv does not have constant regions. An Fv can contain a polypeptide linker between the VH and VL domains and is capable of forming the structure required for antigen binding. In one embodiment, a two-chain Fv species consists of a dimer of one heavy-and one light-chain variable domain in tight, non-covalent association. In a single-chain Fv (scFv) species, one heavy-and one light-chain variable domain can be covalently linked by a flexible peptide linker such that the light and heavy chains can associate in a “dimeric” structure analogous to that in a two-chain Fv species. It is in this configuration that the three HVRs of each variable domain interact to define an antigen-binding site on the surface of the VH-VL dimer. Collectively, the six HVRs confer antigen-binding specificity to the antibody. However, even a single variable domain (or half of an Fv comprising only three HVRs specific for an antigen) has the ability to recognize and bind antigen, although at a lower affinity than the entire binding site.

[0126] The Fab fragment has two polypeptide chains, containing the heavy-and light-chain variable domains (VH, VL) , and also containing the constant domain of the light chain (CL) and the first constant domain (CH1) of the heavy chain. In some embodiments, the heavy chain polypeptide portion of a Fab fragment is referred to as “Fd” , which comprises the VH and CH1 domains. The VL, VH, CL, and CH1 domains of a Fab fragment may form a dimer through a disulfide bond between the CL and the CH1 domain. Fab’ fragments differ from Fab fragments by the addition of a few residues at the carboxy terminus of the heavy chain CH1 domain including one or more cysteines from the antibody hinge region. Fab’-SH is the designation herein for Fab’ in which the cysteine residue (s) of the constant domains bear a free thiol group. F (ab’) 2 antibody fragments originally were produced as pairs of Fab’ fragments which have hinge cysteines between them (e.g., connected by a disulfide bridge) . F (ab’) 2 can be bivalent. Other chemical couplings of antibody fragments are also known.

[0127] “Single-chain Fv” or “scFv” antibody fragments comprise the VH and VL domains of antibody, wherein these domains are present in a single polypeptide chain. The VH and VL domains can be in a VL-VH or a VH-VL configuration. Generally, the scFv polypeptide further comprises a polypeptide linker between the VH and VL domains which enables the scFv to form the desired structure for antigen binding. For a review of scFv, see, e.g., Pluckthün, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies. Springer Berlin Heidelberg, 1994.269-315.

[0128] The “Fc” fragment comprises the carboxy-terminal portions of both heavy chains held together by di-sulfides. The effector functions of antibodies are determined by sequences in the Fc region, which region is also the part recognized by Fc receptors (FcR) found on certain types of cells.

[0129] The term "epitope" or "antigenic determinant" refers to a site on an antigen to which an immunoglobulin or antibody specifically binds. An epitope typically includes at least 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 or 15 consecutive or non-continuous amino acids in a unique spatial conformation. An epitope can be a discontinuous three-dimensional spatial site on an antigen that is recognized by an antibody or antigen-binding fragment.

[0130] The term “monoclonal antibody” as used herein refers to an antibody obtained from a population of substantially homogeneous antibodies, e.g., the individual antibodies comprising the population are identical except for possible mutations, e.g., naturally occurring mutations, that may be present in minor amounts. Thus, the modifier “monoclonal” indicates the character of the antibody as not being a mixture of discrete antibodies. In some embodiments, such a monoclonal antibody typically includes an antibody comprising a polypeptide sequence that binds a target, wherein the target-binding polypeptide sequence was obtained by a process that includes the selection of a single target binding polypeptide sequence from a plurality of polypeptide sequences. For example, the selection process can be the selection of a unique clone from a plurality of clones, such as a pool of hybridoma clones, phage clones, or recombinant DNA clones. It should be understood that a selected target binding sequence can be further altered, for example, to improve affinity for the target, to humanize the target binding sequence, to improve its production in cell culture, to reduce its immunogenicity in vivo, to create a multispecific antibody, etc., and that an antibody comprising the altered target binding sequence is also a monoclonal antibody of this invention. In contrast to polyclonal antibody preparations, which typically include different antibodies directed against different determinants (epitopes) , each monoclonal antibody of a monoclonal antibody preparation is directed against a single determinant on an antigen. In addition to their specificity, monoclonal antibody preparations are advantageous in that they are typically uncontaminated by other immunoglobulins.

[0131] The modifier “monoclonal” indicates the character of the antibody as being obtained from a substantially homogeneous population of antibodies, and is not to be construed as requiring production of the antibody by any particular method. For example, the monoclonal antibodies to be used in accordance with the invention may be made by a variety of techniques, including, for example, the hybridoma method (e.g., Kohler and Milstein, Nature 256: 495-97 (1975) ; Hongo et al., Hybridoma 14 (3) : 253-260 (1995) , Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988) ; Hammerling et al., Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981) ) , recombinant DNA methods (see, e.g., U.S. Pat. No. 4,816,567) , phage-display technologies (see, e.g., Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991) ; Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992) ; Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338 (2) : 299-310 (2004) ; Lee et al., J. Mol. Biol. 340 (5) : 1073-1093 (2004) ; Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101 (34) : 12467-12472 (2004) ; and Lee et al., J. Immunol. Methods 284 (1-2) : 119-132 (2004) ) , and technologies for producing human or human-like antibodies in animals that have parts or all of the human immunoglobulin loci or genes encoding human immunoglobulin sequences (see, e.g., WO 1998 / 24893; WO 1996 / 34096; WO 1996 / 33735; WO 1991 / 10741; Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2551 (1993) ; Jakobovits et al., Nature 362: 255-258 (1993) ; Bruggemann et al., Year in Immunol. 7: 33 (1993) ; U.S. Pat. Nos. 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; and 5,661,016; Marks et al., Bio / Technology 10: 779-783 (1992) ; Lonberg et al., Nature 368: 856-859 (1994) ; Morrison, Nature 368: 812-813 (1994) ; Fishwild et al., Nature Biotechnol. 14: 845-851 (1996) ; Neuberger, Nature Biotechnol. 14: 826 (1996) ; and Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93 (1995) ) .

[0132] The monoclonal antibodies herein specifically include “chimeric” antibodies in which a portion of the heavy and / or light chain is identical with or homologous to corresponding sequences in antibodies derived from a particular species or belonging to a particular antibody class or subclass, while the remainder of the chain (s) is identical with or homologous to corresponding sequences in antibodies derived from another species or belonging to another antibody class or subclass, as well as fragments of such antibodies, so long as they exhibit the desired biological activity (see, e.g., U.S. Pat. No. 4,816,567; and Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855 (1984) ) . For example, a chimeric antibody can have different parts derived from different animal species. Chimeric antibodies include antibodies wherein the antigen-binding region of the antibody is derived from an antibody produced by, e.g., immunizing macaque monkeys with the antigen of interest. In some embodiments, a chimeric antibody can comprise a variable region derived from a mouse monoclonal antibody, and a constant region derived from a human immunoglobulin (see, for example, U.S. Pat. No. 4,816,567 and U.S. Pat. No. 4,816,397, the contents of each of which are incorporated herein by reference in their entireties) .

[0133] “Humanized” forms of non-human (e.g., murine) antibodies are chimeric antibodies that contain minimal sequence derived from non-human immunoglobulin. In one embodiment, a humanized antibody is a human immunoglobulin (recipient antibody) in which residues from an HVR of the recipient are replaced by residues from an HVR of a non-human species (donor antibody) such as mouse, rat, rabbit, or nonhuman primate having the desired specificity, affinity, and / or capacity. In some instances, FR residues of the human immunoglobulin are replaced by corresponding non-human residues. Furthermore, humanized antibodies may comprise residues that are not found in the recipient antibody or in the donor antibody. These modifications may be made to further refine antibody performance. In general, a humanized antibody will comprise substantially all of at least one, and typically two, variable domains, in which all or substantially all of the hypervariable loops correspond to those of a non-human immunoglobulin, and all or substantially all of the FRs are those of a human immunoglobulin sequence. The humanized antibody optionally will also comprise at least a portion of an immunoglobulin constant region (Fc) , typically that of a human immunoglobulin. For further details, see, e.g., Jones et al., Nature 321: 522-525 (1986) ; Riechmann et al., Nature 332: 323-329 (1988) ; and Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-596 (1992) . See also, e.g., Vaswani and Hamilton, Ann. Allergy, Asthma &Immunol. 1: 105-115 (1998) ; Harris, Biochem. Soc. Transactions 23: 1035-1038 (1995) ; Hurle and Gross, Curr. Op. Biotech. 5: 428-433 (1994) ; and U.S. Pat. Nos. 6,982,321 and 7,087,409. A “humanized” antibody may be an antibody molecule derived from a non-human species (e.g., murine) , having one or more CDRs derived from a non-human species and a framework region derived from a human immunoglobulin molecule (see U.S. Pat. No. 5,585,089, which is hereby incorporated by reference in its entirety) .

[0134] Chimeric and humanized monoclonal antibodies can be prepared using DNA recombinant technology well known in the art.

[0135] A “human antibody” is one which possesses an amino acid sequence which corresponds to that of an antibody produced by a human and / or has been made using any of the techniques for making human antibodies as disclosed herein. This definition of a human antibody specifically excludes a humanized antibody comprising non-human antigen-binding residues. Human antibodies can be produced using various techniques known in the art, including phage-display libraries. Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol. 227: 381 (1991) ; Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581 (1991) . Also available for the preparation of human monoclonal antibodies are methods described in Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, 77 (1985) ; Boerner et al., J. Immunol. 147 (1) : 86-95 (1991) . See also van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001) . Human antibodies can be prepared by administering the antigen to a transgenic animal that has been modified to produce such antibodies in response to antigenic challenge, but whose endogenous loci have been disabled, e.g., immunized xenomice (see, e.g., U.S. Pat. Nos. 6,075,181 and 6,150,584 regarding XENOMOUSETM technology) . See also, for example, Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103: 3557-3562 (2006) regarding human antibodies generated via a human B-cell hybridoma technology.

[0136] The term “hypervariable region, ” “HVR, ” or “HV, ” when used herein refers to the regions of an antibody variable domain which are hypervariable in sequence and / or form structurally defined loops. Generally, antibodies comprise six HVRs; three in the VH (H1, H2, H3) , and three in the VL (L1, L2, L3) . In native antibodies, H3 and L3 display the most diversity of the six HVRs, and H3 in particular is believed to play a unique role in conferring fine specificity to antibodies. See, e.g., Xu et al., Immunity 13: 37-45 (2000) ; Johnson and Wu, in Methods in Molecular Biology 248: 1-25 (Lo, ed., Human Press, Totowa, N.J., 2003) . Naturally occurring camelid antibodies consisting of a heavy chain only are functional and stable in the absence of light chain. See, e.g., Hamers-Casterman et al., Nature 363: 446-448 (1993) ; Sheriff et al., Nature Struct. Biol. 3: 733-736 (1996) . HVR is also referred to as “CDR” or “complementarity determining region” . CDRs primarily contribute to antigen binding. One of the most commonly used definitions of the six CDRs is provided by Kabat E.A et al. (1991) Sequences of proteins of immunological interest. NIH Publication 91-3242) . Unless otherwise indicated, the CDRs in the present application is according to Kabat numbering.

[0137] The structures and locations of immunoglobulin variable regions may be determined by reference to Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest. 4th Edition. US Department of Health and Human Services. 1987, and updates thereof, now available on the Internet (immuno. bme. nwu. edu) .

[0138] “Framework” or “FR” residues are those variable domain residues other than the HVR (or CDR) residues as herein defined.

[0139] The term “covalently linked” as used herein, refers to a direct linkage through one or more chemical bonds or an indirect linkage through one or more linkers. Any suitable chemical bond can be used to create a direct linkage, including but not limited to, a covalent bond such as a peptide bond and a disulfide bond, or a non-covalent bond such as a hydrogen bond, a hydrophobic bond, an ionic bond, or a van der Waals bond.

[0140] “Covalent bond” as used herein refers to a stable bond between two atoms sharing one or more electrons. Examples of covalent bonds include, but are not limited to, peptide bonds and disulfide bonds. As used herein, “peptide bond” refers to a covalent bond formed between a carboxyl group of an amino acid and an amine group of an adjacent amino acid. A “disulfide bond” as used herein refers to a covalent bond formed between two sulfur atoms, such as a combination of a heavy chain fragment CH1 and a light chain fragment CL by one or more disulfide bonds. One or more disulfide bonds may be formed between the two fragments by linking the thiol groups in the two fragments. In some embodiments, one or more disulfide bonds can be formed between one or more cysteines of the heavy chain fragment and the light chain fragment, respectively. Disulfide bonds can be formed by oxidation of two thiol groups. In some embodiments, the covalent linkage is directly linked by a covalent bond. In some embodiments, the covalent linkage is directly linked by a peptide bond or a disulfide bond.

[0141] As used herein, the term “binds, ” “specifically binds to, ” “selectively binds” , or is “specific for” refers to measurable and reproducible interactions such as binding between a target (e.g., predetermined epitope on an antigen) and an antibody or antigen-binding protein, which is determinative of the presence of the target in the presence of a heterogeneous population of molecules including biological molecules. For example, an antibody or antigen-binding protein that binds to or specifically binds to a target (which can be an epitope) is an antibody or antigen-binding protein that binds this target with greater affinity, avidity, more readily, and / or with greater duration than it binds to other targets. In one embodiment, the extent of binding of an antibody or antigen-binding protein to an unrelated target is less than about 10%of the binding of the antibody or antigen-binding protein to the target as measured, e.g., by a radioimmunoassay (RIA) . In some embodiments, an antibody or antigen-binding protein that specifically binds to a target has a dissociation constant (Kd) of ≤ 1μM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0.1 nM, or less. In some embodiments, an antibody or antigen-binding protein specifically binds to an epitope on a protein that is conserved among the protein from different species. In another embodiment, specific binding can include, but does not require exclusive binding.

[0142] The "sequence identity" described in the present invention refers to the degree of identity between two nucleic acid or two amino acid sequences when aligned (e.g., optimally aligned) and compared with appropriate mutations such as substitutions, insertions or deletions. The sequence identity between the sequence described in the present invention and the sequence having the same identity may be at least 85%, 90%, or 95%, preferably at least 95%. Non-limiting examples include a sequence identity of at least 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or can be 100%identical.

[0143] As used herein, “Percent (%) amino acid sequence identity” and “homology” with respect to a peptide, polypeptide or antibody sequence are defined as the percentage of amino acid residues in a candidate sequence that are identical with the amino acid residues in the specific peptide or polypeptide sequence, after aligning the sequences and introducing gaps, if necessary, to achieve the maximum percent sequence identity, and not considering any conservative substitutions as part of the sequence identity. Alignment for purposes of determining percent amino acid sequence identity can be achieved in various ways that are within the skill in the art, for instance, using publicly available computer software such as BLAST, BLAST-2, ALIGN or MEGALIGNTM (DNASTAR) software. Those skilled in the art can determine appropriate parameters for measuring alignment, including any algorithms needed to achieve maximal alignment over the full length of the sequences being compared.

[0144] The three-letter and single-letter codes for amino acids used in the present invention are as described in J. biol. chem, 243, p3558 (1968) .

[0145] An amino acid substitution may include but is not limited to the replacement of one amino acid in a polypeptide with another amino acid. Exemplary substitutions are shown in Table A. Amino acid substitutions may be introduced into an antibody of interest and the products screened for a desired activity, e.g., retained / improved antigen binding, decreased immunogenicity, or improved ADCC or CDC. TABLE A

[0146] Amino acids may be grouped according to common side-chain properties: (1) hydrophobic: Norleucine, Met, Ala, Val, Leu, Ile; (2) neutral hydrophilic: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; (3) acidic: Asp, Glu; (4) basic: His, Lys, Arg; (5) residues that influence chain orientation: Gly, Pro; (6) aromatic: Trp, Tyr, Phe. Non-conservative substitutions will entail exchanging a member of one of these classes for another class.

[0147] As used herein, a “multispecific antibody" or “multispecific antigen binding protein” (MSAP) refers to a molecule that can bind to (e.g., simultaneously) multiple different epitopes, which can be located on the same target cell or different target cells. In some embodiments, the MSAP comprises a Fab fragment covalently linked to one or more antigen binding fragments that have different characteristics compared to the Fab fragment. The characteristics may be biological characteristics, such as in vitro or in vivo activity. The characteristics may also be simple chemical or physical properties, such as binding to a target molecule, catalytic reactions, and the like. The Fab fragment and the one or more antigen binding fragments may be directly connected by a single peptide bond, or connected via a peptide linker, but to each other in an in-frame manner. The terms “multispecific antigen binding protein” and “MSAP” are used herein interchangeably to refer to an antigen binding protein that has polyepitopic specificity.

[0148] The term “multispecific” as used in conjunction with an antibody or antigen binding protein (such as a multispecific antigen binding protein, MSAP) refers to an antibody or antigen binding protein having polyepitopic specificity (i.e., is capable of specifically binding to two, three, or more, different epitopes on one biological molecule or is capable of specifically binding to epitopes on two, three, or more, different biological molecules) . The term “bispecific” as used in conjunction with an antibody or antigen binding protein (such as a bispecific antigen binding protein, BSAP) refers to an antibody or antigen binding protein capable of specifically binding to two different epitopes on one biological molecule, or capable of specifically binding to epitopes on two different biological molecules. The term “trispecific” as used in conjunction with an antibody or antigen binding protein (such as a TSAP) refers to an antibody or antigen binding protein capable of specifically binding to 3 different epitopes (can be on 1, 2, or 3 different biological molecules) . Unless otherwise indicated, the order in which the antigens bound by a multispecific antibody or MSAP are listed in a multispecific antibody or MSAP name is arbitrary. That is, the terms “anti-CD3 / CD20, ” “anti-CD20 / CD3, ” “CD20×CD3” and “CD3×CD20” may be used interchangeably to refer to multispecific antibodies (such as MSAP) that specifically bind to both CD3 and CD20 (e.g., different CD20 epitopes) . In some embodiments, an MSAP is a BSAP. BSAP can be bivalent or multivalent (e.g., trivalent) . In some embodiments, an MSAP is a TSAP. TSAP can be trivalent or multivalent.

[0149] As used herein, the “C terminus” of a polypeptide refers to the last amino acid residue of the polypeptide which donates its amine group to form a peptide bond with the carboxyl group of its adjacent amino acid residue. “N terminus” of a polypeptide as used herein refers to the first amino acid of the polypeptide which donates its carboxyl group to form a peptide bond with the amine group of its adjacent amino acid residue.

[0150] The term “vector, ” as used herein, refers to a nucleic acid molecule capable of propagating another nucleic acid to which it is linked. The term includes the vector as a self-replicating nucleic acid structure as well as the vector incorporated into the genome of a host cell into which it has been introduced. Certain vectors are capable of directing the expression of nucleic acids to which they are operatively linked. Such vectors are referred to herein as “expression vectors. ”

[0151] The term “cell” includes the primary subject cell and its progeny.

[0152] The term “cytokine storm, ” also known as a “cytokine cascade” or “hypercytokinemia, ” is a potentially fatal immune reaction typically consisting of a positive feedback loop between cytokines and immune cells, with highly elevated levels of various cytokines (e.g. INF-γ, IL-10, IL-6, CCL2, etc. ) .

[0153] It will be understood by one of ordinary skill in the art that uracil and thymine can both be represented by ‘t’, instead of ‘u’ for uracil and ‘t’ for thymine; in the context of a ribonucleic acid, it will be understood that ‘t’ is used to represent uracil unless otherwise indicated.

[0154] It is understood that embodiments of the invention described herein include “consisting” and / or “consisting essentially of” embodiments.

[0155] Reference to “about” a value or parameter herein includes (and describes) variations that are directed to that value or parameter per se. For example, description referring to “about X” includes description of “X” . When used in reference to a specific listed numerical value, the term "about" means that the value may vary by no more than 1%from the listed value. For example, as used herein, the expression "about 100" includes all values between 99 and 101 (e.g., 99.1, 99.2, 99.3, 99.4, etc. ) .

[0156] As used herein, reference to “not” a value or parameter generally means and describes “other than” a value or parameter. For example, the method is not used to treat cancer of type X means the method is used to treat cancer of types other than X.

[0157] The term “about X-Y” used herein has the same meaning as “about X to about Y. ”

[0158] As used herein and in the appended claims, the singular forms “a, ” “or, ” and “the” include plural referents unless the context clearly dictates otherwise. II. MSAPs specifically recognizing CD3, CD20, and CD19

[0159] In one aspect, there is provided a CD3×CD19×CD20 multispecific antigen binding protein (MSAP; e.g., TSAP) comprising an anti-CD3 moiety that specifically binds to CD3, an anti-CD19 moiety that specifically binds to CD19, and an anti-CD20 moiety that specifically binds to CD20, wherein at least one of the 3 moieties comprises (or consist of, or consist essentially of) a Fab fragment. Each of the 3 moieties can comprise (or consist of, or consist essentially of) one or more antigen binding fragments (e.g., Fab or scFv) . In some embodiments, a first moiety of the three moieties comprises a Fab fragment, a second moiety of the three moieties comprises a first antigen binding fragment (e.g., scFv) , and a third moiety of the three moieties comprises a second antigen binding fragment (e.g., scFv) . In some embodiments, the MSAP comprises two or more first antigen binding fragments (e.g., scFv) , and / or two or more second antigen binding fragments (e.g., scFv) . In some embodiments, the two or more first antigen binding fragments (e.g., scFv) are fused with each other in tandem, then fused to the Fab fragment (e.g., N’ of VH, N’ of VL, C’ of CH1, and / or C’ of CL) . In some embodiments, the two or more second antigen binding fragments (e.g., scFv) are fused with each other in tandem, then fused to the Fab fragment (e.g., N’ of VH, N’ of VL, C’ of CH1, and / or C’ of CL) . In some embodiments, the two or more first antigen binding fragments (e.g., scFv) are fused to the N-terminus of the Fab fragment (e.g., one at N’ of VH, and / or another one at N’ of VL) . In some embodiments, the two or more second antigen binding fragments (e.g., scFv) are fused to the C-terminus of the Fab fragment (e.g., one at C’ of CH1, and / or another one at C’ of CL) . In some embodiments, the two or more second antigen binding fragments (e.g., scFv) are fused to the N-terminus of the Fab fragment (e.g., one at N’ of VH, and / or another one at N’ of VL) . In some embodiments, the two or more first antigen binding fragments (e.g., scFv) are fused to the C-terminus of the Fab fragment (e.g., one at C’ of CH1, and / or another one at C’ of CL) . The two or more first antigen binding fragments (e.g., scFv) can be fused to the same polypeptide chain of the Fab fragment (e.g., one at N’ of VH and another one at C’ of CH1) , or fused to different polypeptide chains of the Fab fragment (e.g., one at N’ of VH or C’ of CH1, and another one at N’ of VL or C’ of CL) . The two or more second antigen binding fragments (e.g., scFv) can be fused to the same polypeptide chain of the Fab fragment (e.g., one at N’ of VL and another one at C’ of CL) , or fused to different polypeptide chains of the Fab fragment (e.g., one at N’ of VH or C’ of CH1, and another one at N’ of VL or C’ of CL) .

[0160] In some embodiments, there is provided a multispecific antigen binding protein (MSAP) comprising: (i) an anti-CD3 moiety that specifically binds to CD3; (ii) an anti-CD19 moiety that specifically binds to CD19; and (iii) an anti-CD20 moiety that specifically binds to CD20; wherein a first moiety of the three moieties is a Fab fragment, wherein the Fab fragment comprises a first polypeptide comprising a VH and a CH1, and a second polypeptide comprising a VL and a CL; wherein a second moiety of the three moieties is a first antigen binding fragment (e.g., scFv) ; and wherein a third moiety of the three moieties is a second antigen binding fragment (e.g., scFv) . In some embodiments, the first antigen binding fragment is fused to the N-terminus of the VH of the Fab fragment or to the C-terminus of the CH1 of the Fab fragment via an optional first linker, and the second antigen binding fragment is fused to the N-terminus of the VL of the Fab fragment or to the C-terminus of the CL of the Fab fragment via an optional second linker. In some embodiments, the first antigen binding fragment is fused to the N-terminus of the VH or the VL of the Fab fragment via an optional first linker, and the second antigen binding fragment is fused to the C-terminus of the CH1 or the CL of the Fab fragment via an optional second linker. In some embodiments, the first antigen binding fragment is fused to the N-terminus of the VH of the Fab fragment, and the second antigen binding fragment is fused to the N-terminus of the VL of the Fab fragment. In some embodiments, the first antigen binding fragment is fused to the N-terminus of the VL of the Fab fragment, and the second antigen binding fragment is fused to the N-terminus of the VH of the Fab fragment. In some embodiments, the first antigen binding fragment is fused to the C-terminus of the CH1 of the Fab fragment, and the second antigen binding fragment is fused to the C-terminus of the CL of the Fab fragment. In some embodiments, the first antigen binding fragment is fused to the C-terminus of the CL of the Fab fragment, and the second antigen binding fragment is fused to the C-terminus of the CH1 of the Fab fragment. In some embodiments, the first antigen binding fragment is fused to the N-terminus of the VH of the Fab fragment, and the second antigen binding fragment is fused to the C-terminus of the CL of the Fab fragment. In some embodiments, the first antigen binding fragment is fused to the C-terminus of the CL of the Fab fragment, and the second antigen binding fragment is fused to the N-terminus of the VH of the Fab fragment. In some embodiments, the first antigen binding fragment is fused to the C-terminus of the CH1 of the Fab fragment, and the second antigen binding fragment is fused to the N-terminus of the VL of the Fab fragment. In some embodiments, the first antigen binding fragment is fused to the N-terminus of the VL of the Fab fragment, and the second antigen binding fragment is fused to the C-terminus of the CH1 of the Fab fragment. In some embodiments, the first antigen binding fragment is fused to the N-terminus of the VH of the Fab fragment, and the second antigen binding fragment is fused to the C-terminus of the CH1 of the Fab fragment. In some embodiments, the first antigen binding fragment is fused to the C-terminus of the CH1 of the Fab fragment, and the second antigen binding fragment is fused to the N-terminus of the VH of the Fab fragment. In some embodiments, the first antigen binding fragment is fused to the N-terminus of the VL of the Fab fragment, and the second antigen binding fragment is fused to the C-terminus of the CL of the Fab fragment. In some embodiments, the first antigen binding fragment is fused to the C-terminus of the CL of the Fab fragment, and the second antigen binding fragment is fused to the N-terminus of the VL of the Fab fragment. In some embodiments, (a) the anti-CD3 moiety is the Fab fragment ( “anti-CD3 Fab fragment” ) , the anti-CD19 moiety is the first antigen binding fragment ( “anti-CD19 first antigen binding fragment” ) , and the anti-CD20 moiety is the second antigen binding fragment ( “anti-CD20 second antigen binding fragment” ) ; (b) the anti-CD3 moiety is the Fab fragment, the anti-CD20 moiety is the first antigen binding fragment ( “anti-CD20 first antigen binding fragment” ) , and the anti-CD19 moiety is the second antigen binding fragment ( “anti-CD19 second antigen binding fragment” ) ; (c) the anti-CD19 moiety is the Fab fragment ( “anti-CD19 Fab fragment” ) , the anti-CD3 moiety is the first antigen binding fragment ( “anti-CD3 first antigen binding fragment” ) , and the anti-CD20 moiety is the second antigen binding fragment; (d) the anti-CD19 moiety is the Fab fragment, the anti-CD20 moiety is the first antigen binding fragment, and the anti-CD3 moiety is the second antigen binding fragment ( “anti-CD3 second antigen binding fragment” ) ; (e) the anti-CD20 moiety is the Fab fragment ( “anti-CD20 Fab fragment” ) , the anti-CD3 moiety is the first antigen binding fragment, and the anti-CD19 moiety is the second antigen binding fragment; or (f) the anti-CD20 moiety is the Fab fragment, the anti-CD19 moiety is the first antigen binding fragment, and the anti-CD3 moiety is the second antigen binding fragment. In some embodiments, the first antigen binding fragment and the second antigen binding fragment are independently selected from the group consisting of Fab, Fab’, Fab’-SH, F (ab’) 2, Fv, sdAb, scFv, and any combination thereof. In some embodiments, the first antigen binding fragment and the second antigen binding fragment are both scFv. The scFv can be from N’ to C’ : VH -optional linker -VL or VL -optional linker -VH. The linker within scFv (s) , the first linker, and the second linker can be independently present or absent, and can be independently identical or different. In some embodiments, the CH1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 64, and the CL comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 63 or 145. In some embodiments, the first antigen binding fragment is fused to the Fab fragment via an optional first linker, and / or the second antigen binding fragment is fused to the Fab fragment via an optional second linker. In some embodiments, the linker within an scFv, the first linker, and / or the second linker comprises an amino acid sequence independently selected from the group consisting of GG, GS, and SEQ ID NOs: 65-80 and 172-176 (e.g., any of GG and SEQ ID NO: 65-68 and 74) . In some embodiments, the MSAP has a structure of any of the formula IIIa, IIIb, IIIc, IIId, and IIIe. In some embodiments, the anti-CD20 moiety comprises: (a) an HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, an HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8, an HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9, an HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 23, an HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 24, and an HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 25; (b) an HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10, an HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11, an HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12, an HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26, an HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 27, and an HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 28; (c) an HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13, an HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14, an HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15, an HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 29, an HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 30, and an HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 31; (d) an HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10, an HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11, an HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12, an HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26, an HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 27, and an HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 28; or (e) an HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, an HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8, an HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 109, an HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 110, an HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 111, and an HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 112. In some embodiments, the anti-CD20 moiety comprises: (a) a VH comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 36, and a VL comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 37; (b) a VH comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 38, and a VL comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 39; (c) a VH comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 40, and a VL comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 41; (d) a VH comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 42, and a VL comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 39; (e) a VH comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 113, and a VL comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 115; or (f) a VH comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 114, and a VL comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 116. In some embodiments, the anti-CD20 moiety is an anti-CD20 scFv, such as comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 117-128. In some embodiments, the anti-CD20 moiety is an anti-CD20 Fab fragment, wherein the anti-CD20 Fab fragment comprises: (a) a first polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 139, and a second polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 129 or 130; (b) a first polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 140, and a second polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 131 or 132; (c) a first polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 141, and a second polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 133 or 134; (d) a first polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 142, and a second polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 131 or 132; (e) a first polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 143, and a second polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 135 or 136; or (f) a first polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 144, and a second polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 137 or 138. In some embodiments, the anti-CD3 moiety comprises: (a) an HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, an HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, an HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, an HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17, an HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18, and an HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19; (b) an HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, an HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 85, an HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 86, an HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17, an HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18, and an HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19; or (c) an HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, an HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 87, an HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, an HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17, an HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18, and an HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19. In some embodiments, the anti-CD3 moiety comprises a VH comprising the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 32, 88, and 89, and a VL comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 33. In some embodiments, the anti-CD3 moiety is an anti-CD3 scFv, such as comprising the amino acid sequence of any of SEQ ID NOs: 90-95. In some embodiments, the anti-CD3 moiety is an anti-CD3 Fab fragment, wherein the anti-CD3 Fab fragment comprises a first polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 60, 96, and 97, and a second polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 61 or 98. In some embodiments, the anti-CD19 moiety comprises: an HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, an HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, an HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, an HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20, an HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21, and an HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 99 or 22. In some embodiments, the anti-CD19 moiety comprises a VH comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 34, and a VL comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 35 or 100. In some embodiments, the anti-CD19 moiety is an anti-CD19 scFv, such as comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 101-104. In some embodiments, the anti-CD19 moiety is an anti-CD19 Fab fragment, wherein the anti-CD19 Fab fragment comprises a first polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 105, and a second polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 59 and 106-108. In some embodiments, the MSAP is trivalent and trispecific, hereinafter also referred to as “TSAP” “CD3×CD19×CD20 TSAP” . Exemplary CD3×CD19×CD20 MSAPs (e.g., TSAPs) are shown in FIGs. 1A-1D and Examples.

[0161] In some embodiments, there is provided an MSAP (e.g., TSAP) comprising: (i) an anti-CD3 Fab fragment, (ii) an anti-CD19 first antigen binding fragment (e.g., scFv) , and (iii) an anti-CD20 second antigen binding fragment (e.g., scFv) ; wherein the anti-CD3 Fab fragment comprises a first polypeptide comprising a VH and a CH1, and a second polypeptide comprising a VL and a CL; wherein the anti-CD19 first antigen binding fragment is fused to the N-terminus of the VH of the anti-CD3 Fab fragment via an optional first linker; and wherein the anti-CD20 second antigen binding fragment is fused to the N-terminus of the VL of the anti-CD3 Fab fragment via an optional second linker. In some embodiments, the anti-CD19 first antigen binding fragment and the anti-CD20 second antigen binding fragment are both scFv.

[0162] In some embodiments, there is provided an MSAP (e.g., TSAP) comprising: (i) an anti-CD3 Fab fragment, (ii) an anti-CD20 first antigen binding fragment (e.g., scFv) , and (iii) an anti-CD19 second antigen binding fragment (e.g., scFv) ; wherein the anti-CD3 Fab fragment comprises a first polypeptide comprising a VH and a CH1, and a second polypeptide comprising a VL and a CL; wherein the anti-CD20 first antigen binding fragment is fused to the N-terminus of the VH of the anti-CD3 Fab fragment via an optional first linker; and wherein the anti-CD19 second antigen binding fragment is fused to the N-terminus of the VL of the anti-CD3 Fab fragment via an optional second linker. In some embodiments, the anti-CD20 first antigen binding fragment and the anti-CD19 second antigen binding fragment are both scFv.

[0163] In some embodiments, there is provided an MSAP (e.g., TSAP) comprising: (i) an anti-CD19 Fab fragment, (ii) an anti-CD3 first antigen binding fragment (e.g., scFv) , and (iii) an anti-CD20 second antigen binding fragment (e.g., scFv) ; wherein the anti-CD19 Fab fragment comprises a first polypeptide comprising a VH and a CH1, and a second polypeptide comprising a VL and a CL; wherein the anti-CD3 first antigen binding fragment is fused to the N-terminus of the VH of the anti-CD19 Fab fragment via an optional first linker; and wherein the anti-CD20 second antigen binding fragment is fused to the N-terminus of the VL of the anti-CD19 Fab fragment via an optional second linker. In some embodiments, the anti-CD3 first antigen binding fragment and the anti-CD20 second antigen binding fragment are both scFv.

[0164] In some embodiments, there is provided an MSAP (e.g., TSAP) comprising: (i) an anti-CD19 Fab fragment, (ii) an anti-CD20 first antigen binding fragment (e.g., scFv) , and (iii) an anti-CD3 second antigen binding fragment (e.g., scFv) ; wherein the anti-CD19 Fab fragment comprises a first polypeptide comprising a VH and a CH1, and a second polypeptide comprising a VL and a CL; wherein the anti-CD20 first antigen binding fragment is fused to the N-terminus of the VH of the anti-CD19 Fab fragment via an optional first linker; and wherein the anti-CD3 second antigen binding fragment is fused to the N-terminus of the VL of the anti-CD19 Fab fragment via an optional second linker. In some embodiments, the anti-CD20 first antigen binding fragment and the anti-CD3 second antigen binding fragment are both scFv.

[0165] In some embodiments, there is provided an MSAP (e.g., TSAP) comprising: (i) an anti-CD20 Fab fragment, (ii) an anti-CD3 first antigen binding fragment (e.g., scFv) , and (iii) an anti-CD19 second antigen binding fragment (e.g., scFv) ; wherein the anti-CD20 Fab fragment comprises a first polypeptide comprising a VH and a CH1, and a second polypeptide comprising a VL and a CL; wherein the anti-CD3 first antigen binding fragment is fused to the N-terminus of the VH of the anti-CD20 Fab fragment via an optional first linker; and wherein the anti-CD19 second antigen binding fragment is fused to the N-terminus of the VL of the anti-CD20 Fab fragment via an optional second linker. In some embodiments, the anti-CD3 first antigen binding fragment and the anti-CD19 second antigen binding fragment are both scFv.

[0166] In some embodiments, there is provided an MSAP (e.g., TSAP) comprising: (i) an anti-CD20 Fab fragment, (ii) an anti-CD19 first antigen binding fragment (e.g., scFv) , and (iii) an anti-CD3 second antigen binding fragment (e.g., scFv) ; wherein the anti-CD20 Fab fragment comprises a first polypeptide comprising a VH and a CH1, and a second polypeptide comprising a VL and a CL; wherein the anti-CD19 first antigen binding fragment is fused to the N-terminus of the VH of the anti-CD20 Fab fragment via an optional first linker; and wherein the anti-CD3 second antigen binding fragment is fused to the N-terminus of the VL of the anti-CD20 Fab fragment via an optional second linker. In some embodiments, the anti-CD19 first antigen binding fragment and the anti-CD3 second antigen binding fragment are both scFv.

[0167] In some embodiments, there is provided an MSAP (e.g., TSAP) comprising: (i) an anti-CD20 Fab fragment, (ii) an anti-CD3 first antigen binding fragment (e.g., scFv) , and (iii) an anti-CD19 second antigen binding fragment (e.g., scFv) ; wherein the anti-CD20 Fab fragment comprises a first polypeptide comprising a VH and a CH1, and a second polypeptide comprising a VL and a CL; wherein the anti-CD3 first antigen binding fragment is fused to the C-terminus of the CH1 of the anti-CD20 Fab fragment via an optional first linker; and wherein the anti-CD19 second antigen binding fragment is fused to the N-terminus of the VL of the anti-CD20 Fab fragment via an optional second linker. In some embodiments, the anti-CD3 first antigen binding fragment and the anti-CD19 second antigen binding fragment are both scFv.

[0168] In some embodiments, there is provided an MSAP (e.g., TSAP) comprising: (i) an anti-CD20 Fab fragment, (ii) an anti-CD19 first antigen binding fragment (e.g., scFv) , and (iii) an anti-CD3 second antigen binding fragment (e.g., scFv) ; wherein the anti-CD20 Fab fragment comprises a first polypeptide comprising a VH and a CH1, and a second polypeptide comprising a VL and a CL; wherein the anti-CD19 first antigen binding fragment is fused to the C-terminus of the CH1 of the anti-CD20 Fab fragment via an optional first linker; and wherein the anti-CD3 second antigen binding fragment is fused to the N-terminus of the VL of the anti-CD20 Fab fragment via an optional second linker. In some embodiments, the anti-CD19 first antigen binding fragment and the anti-CD3 second antigen binding fragment are both scFv.

[0169] In some embodiments, there is provided an MSAP (e.g., TSAP) comprising: (i) an anti-CD3 Fab fragment; (ii) an anti-CD19 first antigen binding fragment (e.g., scFv) ; and (iii) an anti-CD20 second antigen binding fragment (e.g., scFv) ; wherein the anti-CD3 Fab fragment comprises a first polypeptide comprising a VH and a CH1, and a second polypeptide comprising a VL and a CL; wherein the anti-CD19 first antigen binding fragment is fused to the C-terminus of the CH1 of the anti-CD3 Fab fragment via an optional first linker; and wherein the anti-CD20 second antigen binding fragment is fused to the N-terminus of the VL of the anti-CD3 Fab fragment via an optional second linker. In some embodiments, the anti-CD19 first antigen binding fragment and the anti-CD20 second antigen binding fragment are both scFv.

[0170] In some embodiments, there is provided an MSAP (e.g., TSAP) comprising: (i) an anti-CD3 Fab fragment; (ii) an anti-CD20 first antigen binding fragment (e.g., scFv) ; and (iii) an anti-CD19 second antigen binding fragment (e.g., scFv) ; wherein the anti-CD3 Fab fragment comprises a first polypeptide comprising a VH and a CH1, and a second polypeptide comprising a VL and a CL; wherein the anti-CD20 first antigen binding fragment is fused to the C-terminus of the CH1 of the anti-CD3 Fab fragment via an optional first linker; and wherein the anti-CD19 second antigen binding fragment is fused to the N-terminus of the VL of the anti-CD3 Fab fragment via an optional second linker. In some embodiments, the anti-CD20 first antigen binding fragment and the anti-CD19 second antigen binding fragment are both scFv.

[0171] In some embodiments, there is provided an MSAP (e.g., TSAP) comprising: (i) an anti-CD19 Fab fragment, (ii) an anti-CD3 first antigen binding fragment (e.g., scFv) , and (iii) an anti-CD20 second antigen binding fragment (e.g., scFv) ; wherein the anti-CD19 Fab fragment comprises a first polypeptide comprising a VH and a CH1, and a second polypeptide comprising a VL and a CL; wherein the anti-CD3 first antigen binding fragment is fused to the C-terminus of the CH1 of the anti-CD19 Fab fragment via an optional first linker; and wherein the anti-CD20 second antigen binding fragment is fused to the N-terminus of the VL of the anti-CD19 Fab fragment via an optional second linker. In some embodiments, the anti-CD3 first antigen binding fragment and the anti-CD20 second antigen binding fragment are both scFv.

[0172] In some embodiments, there is provided an MSAP (e.g., TSAP) comprising: (i) an anti-CD19 Fab fragment, (ii) an anti-CD20 first antigen binding fragment (e.g., scFv) , and (iii) an anti-CD3 second antigen binding fragment (e.g., scFv) ; wherein the anti-CD19 Fab fragment comprises a first polypeptide comprising a VH and a CH1, and a second polypeptide comprising a VL and a CL; wherein the anti-CD20 first antigen binding fragment is fused to the C-terminus of the CH1 of the anti-CD19 Fab fragment via an optional first linker; and wherein the anti-CD3 second antigen binding fragment is fused to the N-terminus of the VL of the anti-CD19 Fab fragment via an optional second linker. In some embodiments, the anti-CD3 second antigen binding fragment and the anti-CD20 first antigen binding fragment are both scFv.

[0173] In some embodiments, there is provided an MSAP (e.g., TSAP) comprising: (i) an anti-CD20 Fab fragment, (ii) an anti-CD3 first antigen binding fragment (e.g., scFv) , and (iii) an anti-CD19 second antigen binding fragment (e.g., scFv) ; wherein the anti-CD20 Fab fragment comprises a first polypeptide comprising a VH and a CH1, and a second polypeptide comprising a VL and a CL; wherein the anti-CD3 first antigen binding fragment is fused to the N-terminus of the VH of the anti-CD20 Fab fragment via an optional first linker; and wherein the anti-CD19 second antigen binding fragment is fused to the C-terminus of the CL of the anti-CD20 Fab fragment via an optional second linker. In some embodiments, the anti-CD3 first antigen binding fragment and the anti-CD19 second antigen binding fragment are both scFv.

[0174] In some embodiments, there is provided an MSAP (e.g., TSAP) comprising: (i) an anti-CD20 Fab fragment, (ii) an anti-CD19 first antigen binding fragment (e.g., scFv) , and (iii) an anti-CD3 second antigen binding fragment (e.g., scFv) ; wherein the anti-CD20 Fab fragment comprises a first polypeptide comprising a VH and a CH1, and a second polypeptide comprising a VL and a CL; wherein the anti-CD19 first antigen binding fragment is fused to the N-terminus of the VH of the anti-CD20 Fab fragment via an optional first linker; and wherein the anti-CD3 second antigen binding fragment is fused to the C-terminus of the CL of the anti-CD20 Fab fragment via an optional second linker. In some embodiments, the anti-CD19 first antigen binding fragment and the anti-CD3 second antigen binding fragment are both scFv.

[0175] In some embodiments, there is provided an MSAP (e.g., TSAP) comprising: (i) an anti-CD3 Fab fragment; (ii) an anti-CD19 first antigen binding fragment (e.g., scFv) ; and (iii) an anti-CD20 second antigen binding fragment (e.g., scFv) ; wherein the anti-CD3 Fab fragment comprises a first polypeptide comprising a VH and a CH1, and a second polypeptide comprising a VL and a CL; wherein the anti-CD19 first antigen binding fragment is fused to the N-terminus of the VH of the anti-CD3 Fab fragment via an optional first linker; and wherein the anti-CD20 second antigen binding fragment is fused to the C-terminus of the CL of the anti-CD3 Fab fragment via an optional second linker. In some embodiments, the anti-CD19 first antigen binding fragment and the anti-CD20 second antigen binding fragment are both scFv.

[0176] In some embodiments, there is provided an MSAP (e.g., TSAP) comprising: (i) an anti-CD3 Fab fragment; (ii) an anti-CD20 first antigen binding fragment (e.g., scFv) ; and (iii) an anti-CD19 second antigen binding fragment (e.g., scFv) ; wherein the anti-CD3 Fab fragment comprises a first polypeptide comprising a VH and a CH1, and a second polypeptide comprising a VL and a CL; wherein the anti-CD20 first antigen binding fragment is fused to the N-terminus of the VH of the anti-CD3 Fab fragment via an optional first linker; and wherein the anti-CD19 second antigen binding fragment is fused to the C-terminus of the CL of the anti-CD3 Fab fragment via an optional second linker. In some embodiments, the anti-CD19 second antigen binding fragment and the anti-CD20 first antigen binding fragment are both scFv.

[0177] In some embodiments, there is provided an MSAP (e.g., TSAP) comprising: (i) an anti-CD19 Fab fragment, (ii) an anti-CD3 first antigen binding fragment (e.g., scFv) , and (iii) an anti-CD20 second antigen binding fragment (e.g., scFv) ; wherein the anti-CD19 Fab fragment comprises a first polypeptide comprising a VH and a CH1, and a second polypeptide comprising a VL and a CL; wherein the anti-CD3 first antigen binding fragment is fused to the N-terminus of the VH of the anti-CD19 Fab fragment via an optional first linker; and wherein the anti-CD20 second antigen binding fragment is fused to the C-terminus of the CL of the anti-CD19 Fab fragment via an optional second linker. In some embodiments, the anti-CD3 first antigen binding fragment and the anti-CD20 second antigen binding fragment are both scFv.

[0178] In some embodiments, there is provided an MSAP (e.g., TSAP) comprising: (i) an anti-CD19 Fab fragment, (ii) an anti-CD20 first antigen binding fragment (e.g., scFv) , and (iii) an anti-CD3 second antigen binding fragment (e.g., scFv) ; wherein the anti-CD19 Fab fragment comprises a first polypeptide comprising a VH and a CH1, and a second polypeptide comprising a VL and a CL; wherein the anti-CD20 first antigen binding fragment is fused to the N-terminus of the VH of the anti-CD19 Fab fragment via an optional first linker; and wherein the anti-CD3 second antigen binding fragment is fused to the C-terminus of the CL of the anti-CD19 Fab fragment via an optional second linker. In some embodiments, the anti-CD3 second antigen binding fragment and the anti-CD20 first antigen binding fragment are both scFv.

[0179] In some embodiments, there is provided an MSAP (e.g., TSAP) comprising: (i) an anti-CD20 Fab fragment, (ii) an anti-CD3 first antigen binding fragment (e.g., scFv) , and (iii) an anti-CD19 second antigen binding fragment (e.g., scFv) ; wherein the anti-CD20 Fab fragment comprises a first polypeptide comprising a VH and a CH1, and a second polypeptide comprising a VL and a CL; wherein the anti-CD3 first antigen binding fragment is fused to the N-terminus of the VH of the anti-CD20 Fab fragment via an optional first linker; and wherein the anti-CD19 second antigen binding fragment is fused to the C-terminus of the CH1 of the anti-CD20 Fab fragment via an optional second linker. In some embodiments, the anti-CD3 first antigen binding fragment and the anti-CD19 second antigen binding fragment are both scFv.

[0180] In some embodiments, there is provided an MSAP (e.g., TSAP) comprising: (i) an anti-CD20 Fab fragment, (ii) an anti-CD19 first antigen binding fragment (e.g., scFv) , and (iii) an anti-CD3 second antigen binding fragment (e.g., scFv) ; wherein the anti-CD20 Fab fragment comprises a first polypeptide comprising a VH and a CH1, and a second polypeptide comprising a VL and a CL; wherein the anti-CD19 first antigen binding fragment is fused to the N-terminus of the VH of the anti-CD20 Fab fragment via an optional first linker; and wherein the anti-CD3 second antigen binding fragment is fused to the C-terminus of the CH1 of the anti-CD20 Fab fragment via an optional second linker. In some embodiments, the anti-CD19 first antigen binding fragment and the anti-CD3 second antigen binding fragment are both scFv.

[0181] In some embodiments, there is provided an MSAP (e.g., TSAP) comprising: (i) an anti-CD3 Fab fragment, (ii) an anti-CD19 first antigen binding fragment (e.g., scFv) , and (iii) an anti-CD20 second antigen binding fragment (e.g., scFv) ; wherein the anti-CD3 Fab fragment comprises a first polypeptide comprising a VH and a CH1, and a second polypeptide comprising a VL and a CL; wherein the anti-CD19 first antigen binding fragment is fused to the N-terminus of the VH of the anti-CD3 Fab fragment via an optional first linker; and wherein the anti-CD20 second antigen binding fragment is fused to the C-terminus of the CH1 of the anti-CD3 Fab fragment via an optional second linker. In some embodiments, the anti-CD19 first antigen binding fragment and the anti-CD20 second antigen binding fragment are both scFv.

[0182] In some embodiments, there is provided an MSAP (e.g., TSAP) comprising: (i) an anti-CD3 Fab fragment; (ii) an anti-CD20 first antigen binding fragment (e.g., scFv) ; and (iii) an anti-CD19 second antigen binding fragment (e.g., scFv) ; wherein the anti-CD3 Fab fragment comprises a first polypeptide comprising a VH and a CH1, and a second polypeptide comprising a VL and a CL; wherein the anti-CD20 first antigen binding fragment is fused to the N-terminus of the VH of the anti-CD3 Fab fragment via an optional first linker; and wherein the anti-CD19 second antigen binding fragment is fused to the C-terminus of the CH1 of the anti-CD3 Fab fragment via an optional second linker. In some embodiments, the anti-CD19 second antigen binding fragment and the anti-CD20 first antigen binding fragment are both scFv.

[0183] In some embodiments, there is provided an MSAP (e.g., TSAP) comprising: (i) an anti-CD19 Fab fragment, (ii) an anti-CD3 first antigen binding fragment (e.g., scFv) , and (iii) an anti-CD20 second antigen binding fragment (e.g., scFv) ; wherein the anti-CD19 Fab fragment comprises a first polypeptide comprising a VH and a CH1, and a second polypeptide comprising a VL and a CL; wherein the anti-CD3 first antigen binding fragment is fused to the N-terminus of the VH of the anti-CD19 Fab fragment via an optional first linker; and wherein the anti-CD20 second antigen binding fragment is fused to the C-terminus of the CH1 of the anti-CD19 Fab fragment via an optional second linker. In some embodiments, the anti-CD3 first antigen binding fragment and the anti-CD20 second antigen binding fragment are both scFv.

[0184] In some embodiments, there is provided an MSAP (e.g., TSAP) comprising: (i) an anti-CD19 Fab fragment, (ii) an anti-CD20 first antigen binding fragment (e.g., scFv) , and (iii) an anti-CD3 second antigen binding fragment (e.g., scFv) ; wherein the anti-CD19 Fab fragment comprises a first polypeptide comprising a VH and a CH1, and a second polypeptide comprising a VL and a CL; wherein the anti-CD20 first antigen binding fragment is fused to the N-terminus of the VH of the anti-CD19 Fab fragment via an optional first linker; and wherein the anti-CD3 second antigen binding fragment is fused to the C-terminus of the CH1 of the anti-CD19 Fab fragment via an optional second linker. In some embodiments, the anti-CD3 second antigen binding fragment and the anti-CD20 first antigen binding fragment are both scFv.

[0185] In some embodiments, there is provided an MSAP (e.g., TSAP) comprising: (i) an anti-CD20 Fab fragment, (ii) an anti-CD3 first antigen binding fragment (e.g., scFv) , and (iii) an anti-CD19 second antigen binding fragment (e.g., scFv) ; wherein the anti-CD20 Fab fragment comprises a first polypeptide comprising a VH and a CH1, and a second polypeptide comprising a VL and a CL; wherein the anti-CD3 first antigen binding fragment is fused to the N-terminus of the VL of the anti-CD20 Fab fragment via an optional first linker; and wherein the anti-CD19 second antigen binding fragment is fused to the C-terminus of the CL of the anti-CD20 Fab fragment via an optional second linker. In some embodiments, the anti-CD3 first antigen binding fragment and the anti-CD19 second antigen binding fragment are both scFv.

[0186] In some embodiments, there is provided an MSAP (e.g., TSAP) comprising: (i) an anti-CD20 Fab fragment, (ii) an anti-CD19 first antigen binding fragment (e.g., scFv) , and (iii) an anti-CD3 second antigen binding fragment (e.g., scFv) ; wherein the anti-CD20 Fab fragment comprises a first polypeptide comprising a VH and a CH1, and a second polypeptide comprising a VL and a CL; wherein the anti-CD19 first antigen binding fragment is fused to the N-terminus of the VL of the anti-CD20 Fab fragment via an optional first linker, and the anti-CD3 second antigen binding fragment is fused to the C-terminus of the CL of the anti-CD20 Fab fragment via an optional second linker. In some embodiments, the anti-CD19 first antigen binding fragment and the anti-CD3 second antigen binding fragment are both scFv.

[0187] In some embodiments, there is provided an MSAP (e.g., TSAP) comprising: (i) an anti-CD3 Fab fragment; (ii) an anti-CD19 first antigen binding fragment (e.g., scFv) ; and (iii) an anti-CD20 second antigen binding fragment (e.g., scFv) ; wherein the anti-CD3 Fab fragment comprises a first polypeptide comprising a VH and a CH1, and a second polypeptide comprising a VL and a CL; wherein the anti-CD19 first antigen binding fragment is fused to the N-terminus of the VL of the anti-CD3 Fab fragment via an optional first linker; and wherein the anti-CD20 second antigen binding fragment is fused to the C-terminus of the CL of the anti-CD3 Fab fragment via an optional second linker. In some embodiments, the anti-CD19 first antigen binding fragment and the anti-CD20 second antigen binding fragment are both scFv.

[0188] In some embodiments, there is provided an MSAP (e.g., TSAP) comprising: (i) an anti-CD3 Fab fragment; (ii) an anti-CD20 first antigen binding fragment (e.g., scFv) ; and (iii) an anti-CD19 second antigen binding fragment (e.g., scFv) ; wherein the anti-CD3 Fab fragment comprises a first polypeptide comprising a VH and a CH1, and a second polypeptide comprising a VL and a CL; wherein the anti-CD20 first antigen binding fragment is fused to the N-terminus of the VL of the anti-CD3 Fab fragment via an optional first linker; and wherein the anti-CD19 second antigen binding fragment is fused to the C-terminus of the CL of the anti-CD3 Fab fragment via an optional second linker. In some embodiments, the anti-CD19 second antigen binding fragment and the anti-CD20 first antigen binding fragment are both scFv.

[0189] In some embodiments, there is provided an MSAP (e.g., TSAP) comprising: (i) an anti-CD19 Fab fragment, (ii) an anti-CD3 first antigen binding fragment (e.g., scFv) , and (iii) an anti-CD20 second antigen binding fragment (e.g., scFv) ; wherein the anti-CD19 Fab fragment comprises a first polypeptide comprising a VH and a CH1, and a second polypeptide comprising a VL and a CL; wherein the anti-CD3 first antigen binding fragment is fused to the N-terminus of the VL of the anti-CD19 Fab fragment via an optional first linker; and wherein the anti-CD20 second antigen binding fragment is fused to the C-terminus of the CL of the anti-CD19 Fab fragment via an optional second linker. In some embodiments, the anti-CD3 first antigen binding fragment and the anti-CD20 second antigen binding fragment are both scFv.

[0190] In some embodiments, there is provided an MSAP (e.g., TSAP) comprising: (i) an anti-CD19 Fab fragment, (ii) an anti-CD20 first antigen binding fragment (e.g., scFv) , and (iii) an anti-CD3 second antigen binding fragment (e.g., scFv) ; wherein the anti-CD19 Fab fragment comprises a first polypeptide comprising a VH and a CH1, and a second polypeptide comprising a VL and a CL; wherein the anti-CD20 first antigen binding fragment is fused to the N-terminus of the VL of the anti-CD19 Fab fragment via an optional first linker; and wherein the anti-CD3 second antigen binding fragment is fused to the C-terminus of the CL of the anti-CD19 Fab fragment via an optional second linker. In some embodiments, the anti-CD3 second antigen binding fragment and the anti-CD20 first antigen binding fragment are both scFv.

[0191] In some embodiments, there is provided an MSAP (e.g., TSAP) comprising: (a) an anti-CD3 Fab fragment, (b) an anti-CD19 antigen binding fragment (e.g., scFv) , and (c) an anti-CD20 antigen binding fragment (e.g., scFv) ; wherein the anti-CD3 Fab fragment comprises a first polypeptide comprising a VH and a CH1, and a second polypeptide comprising a VL and a CL;and wherein: (i) the anti-CD19 antigen binding fragment is fused to the N-terminus of the VH of the anti-CD3 Fab fragment via an optional first linker, and the anti-CD20 antigen binding fragment is fused to the N-terminus of the VL of the anti-CD3 Fab fragment via an optional second linker; (ii) the anti-CD20 antigen binding fragment is fused to the N-terminus of the VH of the anti-CD3 Fab fragment via an optional first linker, and the anti-CD19 antigen binding fragment is fused to the N-terminus of the VL of the anti-CD3 Fab fragment via an optional second linker; (iii) the anti-CD19 antigen binding fragment is fused to the N-terminus of the VH of the anti-CD3 Fab fragment via an optional first linker, and the anti-CD20 antigen binding fragment is fused to the C-terminus of the CL of the anti-CD3 Fab fragment via an optional second linker; (iv) the anti-CD20 antigen binding fragment is fused to the N-terminus of the VH of the anti-CD3 Fab fragment via an optional first linker, and the anti-CD19 antigen binding fragment is fused to the C-terminus of the CL of the anti-CD3 Fab fragment via an optional second linker; (v) the anti-CD19 antigen binding fragment is fused to the N-terminus of the VH of the anti-CD3 Fab fragment via an optional first linker, and the anti-CD20 antigen binding fragment is fused to the C-terminus of the CH1 of the anti-CD3 Fab fragment via an optional second linker; (vi) the anti-CD20 antigen binding fragment is fused to the N-terminus of the VH of the anti-CD3 Fab fragment via an optional first linker, and the anti-CD19 antigen binding fragment is fused to the C-terminus of the CH1 of the anti-CD3 Fab fragment via an optional second linker; (vii) the anti-CD19 antigen binding fragment is fused to the N-terminus of the VL of the anti-CD3 Fab fragment via an optional first linker, and the anti-CD20 antigen binding fragment is fused to the C-terminus of the CL of the anti-CD3 Fab fragment via an optional second linker; (viii) the anti-CD20 antigen binding fragment is fused to the N-terminus of the VL of the anti-CD3 Fab fragment via an optional first linker, and the anti-CD19 antigen binding fragment is fused to the C-terminus of the CL of the anti-CD3 Fab fragment via an optional second linker; (ix) the anti-CD19 antigen binding fragment is fused to the N-terminus of the VL of the anti-CD3 Fab fragment via an optional first linker, and the anti-CD20 antigen binding fragment is fused to the C-terminus of the CH1 of the anti-CD3 Fab fragment via an optional second linker; (x) the anti-CD20 antigen binding fragment is fused to the N-terminus of the VL of the anti-CD3 Fab fragment via an optional first linker, and the anti-CD19 antigen binding fragment is fused to the C-terminus of the CH1 of the anti-CD3 Fab fragment via an optional second linker; (xi) the anti-CD19 antigen binding fragment is fused to the C-terminus of the CH1 of the anti-CD3 Fab fragment via an optional first linker, and the anti-CD20 antigen binding fragment is fused to the C-terminus of the CL of the anti-CD3 Fab fragment via an optional second linker; or (xii) the anti-CD20 antigen binding fragment is fused to the C-terminus of the CH1 of the anti-CD3 Fab fragment via an optional first linker, and the anti-CD19 antigen binding fragment is fused to the C-terminus of the CL of the anti-CD3 Fab fragment via an optional second linker. In some embodiments, both the anti-CD19 antigen binding fragment and the anti-CD20 antigen binding fragment are scFvs. Hence in some embodiments, there is provided an MSAP (e.g., TSAP) comprising: (a) an anti-CD3 Fab fragment, (b) an anti-CD19 scFv, and (c) an anti-CD20 scFv; wherein the anti-CD3 Fab fragment comprises a first polypeptide comprising a VH and a CH1, and a second polypeptide comprising a VL and a CL; and wherein: (i) the anti-CD19 scFv is fused to the N-terminus of the VH of the anti-CD3 Fab fragment via an optional first linker, and the anti-CD20 scFv is fused to the N-terminus of the VL of the anti-CD3 Fab fragment via an optional second linker; (ii) the anti-CD20 scFv is fused to the N-terminus of the VH of the anti-CD3 Fab fragment via an optional first linker, and the anti-CD19 scFv is fused to the N-terminus of the VL of the anti-CD3 Fab fragment via an optional second linker; or (iii) the anti-CD19 scFv is fused to the C-terminus of the CH1 of the anti-CD3 Fab fragment via an optional first linker, and the anti-CD20 scFv is fused to the N-terminus of the VL of the anti-CD3 Fab fragment via an optional second linker. In some embodiments, the anti-CD19 antigen binding fragment comprises: an HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, an HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, an HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, an HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20, an HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21, and an HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 99 or 22. In some embodiments, the anti-CD19 antigen binding fragment comprises a VH comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 34, and a VL comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 35 or 100. In some embodiments, the anti-CD19 antigen binding fragment is an anti-CD19 scFv. In some embodiments, the anti-CD19 scFv comprises an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 101-104. In some embodiments, the anti-CD3 Fab fragment comprises: (a) an HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, an HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, an HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, an HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17, an HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18, and an HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19; (b) an HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, an HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 85, an HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 86, an HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17, an HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18, and an HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19; or (c) an HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, an HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 87, an HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, an HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17, an HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18, and an HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19. In some embodiments, the anti-CD3 Fab fragment comprises a VH comprising the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 32, 88, and 89, and a VL comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 33. In some embodiments, the anti-CD3 Fab fragment comprises a first polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 60, 96, and 97, and a second polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 61 or 98. In some embodiments, the anti-CD20 antigen binding fragment comprises: (a) an HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, an HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8, an HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9, an HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 23, an HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 24, and an HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 25; (b) an HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10, an HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11, an HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12, an HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26, an HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 27, and an HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 28; (c) an HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13, an HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14, an HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15, an HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 29, an HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 30, and an HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 31; (d) an HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10, an HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11, an HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12, an HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26, an HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 27, and an HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 28; or (e) an HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, an HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8, an HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 109, an HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 110, an HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 111, and an HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 112. In some embodiments, the anti-CD20 antigen binding fragment comprises: (a) a VH comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 36, and a VL comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 37; (b) a VH comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 38, and a VL comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 39; (c) a VH comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 40, and a VL comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 41; (d) a VH comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 42, and a VL comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 39; (e) a VH comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 113, and a VL comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 115; or (f) a VH comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 114, and a VL comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 116. In some embodiments, the anti-CD20 antigen binding fragment is an anti-CD20 scFv. In some embodiments, the anti-CD20 scFv comprises an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 117-128. In some embodiments, the first linker and / or the second linker comprises an amino acid sequence independently selected from the group consisting of GG, GS, and SEQ ID NOs: 65-80 and 172-176 (e.g., any of GG and SEQ ID NO: 65-68 and 74) .

[0192] In some embodiments, there is provided an MSAP (e.g., TSAP) , wherein the MSAP comprises: (i) a first fusion polypeptide comprising an anti-CD19 first scFv fused to the N-terminus of the VH of an anti-CD3 Fab fragment via an optional first linker, and (ii) a second fusion polypeptide comprising an anti-CD20 second scFv fused to the N-terminus of the VL of the anti-CD3 Fab fragment via an optional second linker. In some embodiments, the first fusion polypeptide comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 44 (or an amino acid sequence having at least about 85%sequence identity to the sequence of SEQ ID NO: 44) , and the second fusion polypeptide comprises the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 45, 51-53, and 55 (or an amino acid sequence having at least about 85%sequence identity to the sequence of any one of SEQ ID NOs: 45, 51-53, and 55. In some embodiments, (a) the first fusion polypeptide comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 44, and the second fusion polypeptide comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 45 (herein also referred to as “IMP-2023-021 MSAP” ) ; (b) the first fusion polypeptide comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 44, and the second fusion polypeptide comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 51 (herein also referred to as “IMP-2023-025 MSAP” ) ; (c) the first fusion polypeptide comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 44, and the second fusion polypeptide comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 52 (herein also referred to as “IMP-2023-026 MSAP” ) ; (d) the first fusion polypeptide comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 44, and the second fusion polypeptide comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 53 (herein also referred to as “IMP-2023-027 MSAP” ) ; or (e) the first fusion polypeptide comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 44, and the second fusion polypeptide comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 55 (herein also referred to as “IMP-2023-029 MSAP” ) .

[0193] In some embodiments, there is provided an MSAP (e.g., TSAP) , wherein the MSAP comprises: (i) a first fusion polypeptide comprising an anti-CD20 first scFv fused to the N-terminus of the VH of an anti-CD3 Fab fragment via an optional first linker, and (ii) a second fusion polypeptide comprising an anti-CD19 second scFv fused to the N-terminus of the VL of the anti-CD3 Fab fragment via an optional second linker. In some embodiments, the first fusion polypeptide comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 48 (or an amino acid sequence having at least about 85%sequence identity to the sequence of SEQ ID NO: 48) , and the second fusion polypeptide comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 43 (or an amino acid sequence having at least about 85%sequence identity to the sequence of SEQ ID NO: 43) . In some embodiments, the first fusion polypeptide comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 48, and the second fusion polypeptide comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 43 (herein also referred to as “IMP-2023-022 MSAP” ) .

[0194] In some embodiments, there is provided an MSAP (e.g., TSAP) , wherein the MSAP comprises: (i) a first fusion polypeptide comprising the anti-CD19 first scFv fused to the C-terminus of the CH1 of an anti-CD3 Fab fragment via an optional first linker, and (ii) a second fusion polypeptide comprising the anti-CD20 second scFv fused to the N-terminus of the VL of the anti-CD3 Fab fragment via an optional second linker. In some embodiments, the first fusion polypeptide comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 54 (or an amino acid sequence having at least about 85%sequence identity to the sequence of SEQ ID NO: 54) , and the second fusion polypeptide comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 52 (or an amino acid sequence having at least about 85%sequence identity to the sequence of SEQ ID NO: 52) . In some embodiments, the first fusion polypeptide comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 54, and the second fusion polypeptide comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 52 (herein also referred to as “IMP-2023-028 MSAP” ) .

[0195] In some embodiments, there is provided an MSAP (e.g., TSAP) comprising: (a) an anti-CD19 Fab fragment, (b) an anti-CD3 antigen binding fragment (e.g., scFv) , and (c) an anti-CD20 antigen binding fragment (e.g., scFv) ; wherein the anti-CD19 Fab fragment comprises a first polypeptide comprising a VH and a CH1, and a second polypeptide comprising a VL and a CL;and wherein: (i) the anti-CD3 antigen binding fragment is fused to the N-terminus of the VH of the anti-CD19 Fab fragment via an optional first linker, and the anti-CD20 antigen binding fragment is fused to the N-terminus of the VL of the anti-CD19 Fab fragment via an optional second linker; (ii) the anti-CD20 antigen binding fragment is fused to the N-terminus of the VH of the anti-CD19 Fab fragment via an optional first linker, and the anti-CD3 antigen binding fragment is fused to the N-terminus of the VL of the anti-CD19 Fab fragment via an optional second linker; (iii) the anti-CD3 antigen binding fragment is fused to the N-terminus of the VH of the anti-CD19 Fab fragment via an optional first linker, and the anti-CD20 antigen binding fragment is fused to the C-terminus of the CL of the anti-CD19 Fab fragment via an optional second linker; (iv) the anti-CD20 antigen binding fragment is fused to the N-terminus of the VH of the anti-CD19 Fab fragment via an optional first linker, and the anti-CD3 antigen binding fragment is fused to the C-terminus of the CL of the anti-CD19 Fab fragment via an optional second linker; (v) the anti-CD3 antigen binding fragment is fused to the N-terminus of the VH of the anti-CD19 Fab fragment via an optional first linker, and the anti-CD20 antigen binding fragment is fused to the C-terminus of the CH1 of the anti-CD19 Fab fragment via an optional second linker; (vi) the anti-CD20 antigen binding fragment is fused to the N-terminus of the VH of the anti-CD19 Fab fragment via an optional first linker, and the anti-CD3 antigen binding fragment is fused to the C-terminus of the CH1 of the anti-CD19 Fab fragment via an optional second linker; (vii) the anti-CD3 antigen binding fragment is fused to the N-terminus of the VL of the anti-CD19 Fab fragment via an optional first linker, and the anti-CD20 antigen binding fragment is fused to the C-terminus of the CL of the anti-CD19 Fab fragment via an optional second linker; (viii) the anti-CD20 antigen binding fragment is fused to the N-terminus of the VL of the anti-CD19 Fab fragment via an optional first linker, and the anti-CD3 antigen binding fragment is fused to the C-terminus of the CL of the anti-CD19 Fab fragment via an optional second linker; (ix) the anti-CD3 antigen binding fragment is fused to the N-terminus of the VL of the anti-CD19 Fab fragment via an optional first linker, and the anti-CD20 antigen binding fragment is fused to the C-terminus of the CH1 of the anti-CD19 Fab fragment via an optional second linker; (x) the anti-CD20 antigen binding fragment is fused to the N-terminus of the VL of the anti-CD19 Fab fragment via an optional first linker, and the anti-CD3 antigen binding fragment is fused to the C-terminus of the CH1 of the anti-CD19 Fab fragment via an optional second linker; (xi) the anti-CD3 antigen binding fragment is fused to the C-terminus of the CH1 of the anti-CD19 Fab fragment via an optional first linker, and the anti-CD20 antigen binding fragment is fused to the C-terminus of the CL of the anti-CD19 Fab fragment via an optional second linker; or (xii) the anti-CD20 antigen binding fragment is fused to the C-terminus of the CH1 of the anti-CD19 Fab fragment via an optional first linker, and the anti-CD3 antigen binding fragment is fused to the C-terminus of the CL of the anti-CD19 Fab fragment via an optional second linker. In some embodiments, both the anti-CD3 antigen binding fragment and the anti-CD20 antigen binding fragment are scFvs. Hence in some embodiments, there is provided an MSAP (e.g., TSAP) comprising: (a) an anti-CD19 Fab fragment, (b) an anti-CD3 scFv, and (c) an anti-CD20 scFv; wherein the anti-CD19 Fab fragment comprises a first polypeptide comprising a VH and a CH1, and a second polypeptide comprising a VL and a CL; and wherein the anti-CD3 scFv is fused to the N-terminus of the VH of the anti-CD19 Fab fragment via an optional first linker, and the anti-CD20 scFv is fused to the N-terminus of the VL of the anti-CD3 Fab fragment via an optional second linker. In some embodiments, the anti-CD19 Fab fragment comprises: an HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, an HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, an HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, an HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20, an HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21, and an HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 99 or 22. In some embodiments, the anti-CD19 Fab fragment comprises a VH comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 34, and a VL comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 35 or 100. In some embodiments, the anti-CD19 Fab fragment comprises a first polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 105, and a second polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 59 and 106-108. In some embodiments, the anti-CD3 antigen binding fragment comprises: (a) an HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, an HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, an HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, an HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17, an HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18, and an HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19; (b) an HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, an HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 85, an HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 86, an HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17, an HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18, and an HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19; or (c) an HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, an HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 87, an HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, an HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17, an HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18, and an HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19. In some embodiments, In some embodiments, the anti-CD3 antigen binding fragment comprises a VH comprising the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 32, 88, and 89, and a VL comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 33. In some embodiments, the anti-CD3 antigen binding fragment is an anti-CD3 scFv. In some embodiments, the anti-CD3 scFv comprises the amino acid sequence of any of SEQ ID NOs: 90-95. In some embodiments, the anti-CD20 antigen binding fragment comprises: (a) an HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, an HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8, an HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9, an HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 23, an HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 24, and an HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 25; (b) an HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10, an HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11, an HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12, an HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26, an HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 27, and an HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 28; (c) an HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13, an HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14, an HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15, an HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 29, an HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 30, and an HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 31; (d) an HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10, an HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11, an HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12, an HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26, an HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 27, and an HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 28; or (e) an HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, an HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8, an HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 109, an HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 110, an HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 111, and an HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 112. In some embodiments, the anti-CD20 antigen binding fragment comprises: (a) a VH comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 36, and a VL comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 37; (b) a VH comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 38, and a VL comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 39; (c) a VH comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 40, and a VL comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 41; (d) a VH comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 42, and a VL comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 39; (e) a VH comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 113, and a VL comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 115; or (f) a VH comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 114, and a VL comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 116. In some embodiments, the anti-CD20 antigen binding fragment is an anti-CD20 scFv. In some embodiments, the anti-CD20 scFv comprises an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 117-128. In some embodiments, the optional first linker and / or the optional second linker comprises an amino acid sequence independently selected from the group consisting of GG, GS, and SEQ ID NOs: 65-80 and 172-176 (e.g., any of GG and SEQ ID NO: 65-68 and 74) .

[0196] In some embodiments, there is provided an MSAP (e.g., TSAP) , wherein the MSAP comprises: (i) a first fusion polypeptide comprising an anti-CD3 first scFv fused to the N-terminus of the VH of an anti-CD19 Fab fragment via an optional first linker, and (ii) a second fusion polypeptide comprising an anti-CD20 second scFv fused to the N-terminus of the VL of the anti-CD19 Fab fragment via an optional second linker. In some embodiments, the first fusion polypeptide comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 49 (or an amino acid sequence having at least about 85%sequence identity to the sequence of SEQ ID NO: 49) , and the second fusion polypeptide comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 50 (or an amino acid sequence having at least about 85%sequence identity to the sequence of SEQ ID NO: 50) . In some embodiments, the first fusion polypeptide comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 49, and the second fusion polypeptide comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 50 (herein also referred to as “IMP-2023-024 MSAP” ) .

[0197] In some embodiments, there is provided an MSAP (e.g., TSAP) comprising: (a) an anti-CD20 Fab fragment, (b) an anti-CD3 antigen binding fragment (e.g., scFv) , and (c) an anti-CD19 antigen binding fragment (e.g., scFv) ; wherein the anti-CD20 Fab fragment comprises a first polypeptide comprising a VH and a CH1, and a second polypeptide comprising a VL and a CL; and wherein: (i) the anti-CD3 antigen binding fragment is fused to the N-terminus of the VH of the anti-CD20 Fab fragment via an optional first linker; and the anti-CD19 antigen binding fragment is fused to the N-terminus of the VL of the anti-CD20 Fab fragment via an optional second linker; (ii) the anti-CD19 antigen binding fragment is fused to the N-terminus of the VH of the anti-CD20 Fab fragment via an optional first linker; and the anti-CD3 antigen binding fragment is fused to the N-terminus of the VL of the anti-CD20 Fab fragment via an optional second linker; (iii) the anti-CD3 antigen binding fragment is fused to the N-terminus of the VH of the anti-CD20 Fab fragment via an optional first linker, and the anti-CD19 antigen binding fragment is fused to the C-terminus of the CL of the anti-CD20 Fab fragment via an optional second linker; (iv) the anti-CD19 antigen binding fragment is fused to the N-terminus of the VH of the anti-CD20 Fab fragment via an optional first linker, and the anti-CD3 antigen binding fragment is fused to the C-terminus of the CL of the anti-CD20 Fab fragment via an optional second linker; (v) the anti-CD3 antigen binding fragment is fused to the N-terminus of the VH of the anti-CD20 Fab fragment via an optional first linker, and the anti-CD19 antigen binding fragment is fused to the C-terminus of the CH1 of the anti-CD20 Fab fragment via an optional second linker; (vi) the anti-CD19 antigen binding fragment is fused to the N-terminus of the VH of the anti-CD20 Fab fragment via an optional first linker, and the anti-CD3 antigen binding fragment is fused to the C-terminus of the CH1 of the anti-CD20 Fab fragment via an optional second linker; (vii) the anti-CD3 antigen binding fragment is fused to the N-terminus of the VL of the anti-CD20 Fab fragment via an optional first linker, and the anti-CD19 antigen binding fragment is fused to the C-terminus of the CL of the anti-CD20 Fab fragment via an optional second linker; (viii) the anti-CD19 antigen binding fragment is fused to the N-terminus of the VL of the anti-CD20 Fab fragment via an optional first linker, and the anti-CD3 antigen binding fragment is fused to the C-terminus of the CL of the anti-CD20 Fab fragment via an optional second linker; (ix) the anti-CD3 antigen binding fragment is fused to the N-terminus of the VL of the anti-CD20 Fab fragment via an optional first linker, and the anti-CD19 antigen binding fragment is fused to the C-terminus of the CH1 of the anti-CD20 Fab fragment via an optional second linker; (x) the anti-CD19 antigen binding fragment is fused to the N-terminus of the VL of the anti-CD20 Fab fragment via an optional first linker, and the anti-CD3 antigen binding fragment is fused to the C-terminus of the CH1 of the anti-CD20 Fab fragment via an optional second linker; (xi) the anti-CD3 antigen binding fragment is fused to the C-terminus of the CH1 of the anti-CD20 Fab fragment via an optional first linker, and the anti-CD19 antigen binding fragment is fused to the C-terminus of the CL of the anti-CD20 Fab fragment via an optional second linker; or (xii) the anti-CD19 antigen binding fragment is fused to the C-terminus of the CH1 of the anti-CD20 Fab fragment via an optional first linker, and the anti-CD3 antigen binding fragment is fused to the C-terminus of the CL of the anti-CD20 Fab fragment via an optional second linker. In some embodiments, both the anti-CD19 antigen binding fragment and the anti-CD3 antigen binding fragment are scFvs. Hence in some embodiments, there is provided an MSAP (e.g., TSAP) comprising: (a) an anti-CD20 Fab fragment, (b) an anti-CD3 scFv, and (c) an anti-CD19 scFv; wherein the anti-CD20 Fab fragment comprises a first polypeptide comprising a VH and a CH1, and a second polypeptide comprising a VL and a CL; and wherein the anti-CD3 scFv is fused to the N-terminus of the VH of the anti-CD20 Fab fragment via an optional first linker, and the anti-CD19 scFv is fused to the N-terminus of the VL of the anti-CD20 Fab fragment via an optional second linker. In some embodiments, the anti-CD19 antigen binding fragment comprises: an HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, an HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, an HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, an HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20, an HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21, and an HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 99 or 22. In some embodiments, the anti-CD19 antigen binding fragment comprises a VH comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 34, and a VL comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 35 or 100. In some embodiments, the anti-CD19 antigen binding fragment is an anti-CD19 scFv. In some embodiments, the anti-CD19 scFv comprises an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 101-104. In some embodiments, the anti-CD3 antigen binding fragment comprises: (a) an HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, an HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, an HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, an HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17, an HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18, and an HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19; (b) an HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, an HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 85, an HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 86, an HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17, an HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18, and an HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19; or (c) an HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, an HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 87, an HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, an HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17, an HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18, and an HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19. In some embodiments, the anti-CD3 antigen binding fragment comprises a VH comprising the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 32, 88, and 89, and a VL comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 33. In some embodiments, the anti-CD3 antigen binding fragment is an anti-CD3 scFv. In some embodiments, the anti-CD3 scFv comprises the amino acid sequence of any of SEQ ID NOs: 90-95. In some embodiments, the anti-CD20 Fab fragment comprises: (a) an HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, an HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8, an HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9, an HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 23, an HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 24, and an HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 25; (b) an HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10, an HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11, an HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12, an HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26, an HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 27, and an HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 28; (c) an HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13, an HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14, an HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15, an HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 29, an HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 30, and an HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 31; (d) an HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10, an HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11, an HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12, an HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26, an HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 27, and an HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 28; or (e) an HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, an HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8, an HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 109, an HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 110, an HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 111, and an HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 112. In some embodiments, the anti-CD20 Fab fragment comprises: (a) a VH comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 36, and a VL comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 37; (b) a VH comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 38, and a VL comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 39; (c) a VH comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 40, and a VL comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 41; (d) a VH comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 42, and a VL comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 39; (e) a VH comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 113, and a VL comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 115; or (f) a VH comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 114, and a VL comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 116. In some embodiments, the anti-CD20 Fab fragment comprises: (a) a first polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 139, and a second polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 129 or 130; (b) a first polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 140, and a second polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 131 or 132; (c) a first polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 141, and a second polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 133 or 134; (d) a first polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 142, and a second polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 131 or 132; (e) a first polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 143, and a second polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 135 or 136; or (f) a first polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 144, and a second polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 137 or 138. In some embodiments, the optional first linker and / or the optional second linker comprises an amino acid sequence independently selected from the group consisting of GG, GS, and SEQ ID NOs: 65-80 and 172-176 (e.g., any of GG and SEQ ID NO: 65-68 and 74) .

[0198] In some embodiments, there is provided an MSAP (e.g., TSAP) , wherein the MSAP comprises: (i) a first fusion polypeptide comprising an anti-CD3 first scFv fused to the N-terminus of the VH of an anti-CD20 Fab fragment via an optional first linker, and (ii) a second fusion polypeptide comprising an anti-CD19 second scFv fused to the N-terminus of the VL of the anti-CD20 Fab fragment via an optional second linker. In some embodiments, the first fusion polypeptide comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 46 (or an amino acid sequence having at least about 85%sequence identity to the sequence of SEQ ID NO: 46) , and the second fusion polypeptide comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 47 (or an amino acid sequence having at least about 85%sequence identity to the sequence of SEQ ID NO: 47) . In some embodiments, the first fusion polypeptide comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 46, and the second fusion polypeptide comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 47 (herein also referred to as “IMP-2023-023 MSAP” ) .

[0199] In some embodiments, there is provided an MSAP (e.g., TSAP) comprising a first fusion polypeptide and a second fusion polypeptide, (i) wherein the first fusion polypeptide comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 44, or an amino acid sequence having at least about 85% (such as at least about any of 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or more) sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 44; and wherein the second fusion polypeptide comprises an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 45, 51-53, and 55, or an amino acid sequence having at least about 85% (such as at least about any of 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or more) sequence identity to the amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 45, 51-53, and 55; (ii) wherein the first fusion polypeptide comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 48, or an amino acid sequence having at least about 85% (such as at least about any of 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or more) sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 48; and wherein the second fusion polypeptide comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 43, or an amino acid sequence having at least about 85% (such as at least about any of 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or more) sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NOs: 43; or (iii) wherein the first fusion polypeptide comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 54, or an amino acid sequence having at least about 85% (such as at least about any of 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or more) sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 54; and wherein the second fusion polypeptide comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 52, or an amino acid sequence having at least about 85% (such as at least about any of 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or more) sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 52. In some embodiments, there is provided an MSAP (e.g., TSAP) comprising a first fusion polypeptide and a second fusion polypeptide, wherein the first fusion polypeptide comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 49, or an amino acid sequence having at least about 85% (such as at least about any of 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or more) sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 49; and wherein the second fusion polypeptide comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 50, or an amino acid sequence having at least about 85% (such as at least about any of 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or more) sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 50. In some embodiments, there is provided an MSAP (e.g., TSAP) comprising a first fusion polypeptide and a second fusion polypeptide, wherein the first fusion polypeptide comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 46, or an amino acid sequence having at least about 85% (such as at least about any of 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or more) sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 46; and wherein the second fusion polypeptide comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 47, or an amino acid sequence having at least about 85% (such as at least about any of 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or more) sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 47.

[0200] In some embodiments, the C-terminus of the first and / or the second polypeptide of the Fab fragment of the MSAP (such as TSAP) comprises a covalent binding region CPPC (SEQ ID NO: 82) or CPPCS (SEQ ID NO: 81) capable of forming an intermolecular disulfide bond. In some embodiments, the CPPCS at the C-terminus of the first and / or the second polypeptide of the Fab fragment of any of the MSAPs described herein can be replaced with CPPC, or any other covalent binding region capable of forming an intermolecular disulfide bond. In some embodiments, the covalent binding region capable of forming an intermolecular disulfide bond is located at the C-terminus of CH1 and CL of the Fab fragment. In some embodiments, the C-terminus of the Fab fragment (e.g., C’ of CH1 and / or C’ of CL) of the MSAP does not comprise a covalent binding region CPPC or CPPCS.

[0201] In some embodiments, the N-terminus and / or C-terminus of the first and / or the second polypeptide (e.g., fusion polypeptide) of the MSAP (e.g., TSAP) further comprises a purification tag (e.g., a histidine tag, HIS-tag, an HA tag, a PHE-tag, a Myc tag, a V5 tag, a FLAG tag, a  a GST tag, a HiBiT tag, a calmodulin binding peptide, a maltose-binding protein, a Strep-tag, a biotin tag) for protein purification.

[0202] In some embodiments, the N-terminus of the first and / or the second polypeptide (e.g., fusion polypeptide) of the MSAP (such as TSAP) further comprises a signal peptide (e.g., for better expression) . In some embodiments, the signal peptide comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 84. In some embodiments, the signal peptide is cleaved in the mature MSAPs (e.g., secreted MSAPs from host cells) .

[0203] The present invention further provides fusion proteins or recombinant proteins comprising any of the CD3×CD19×CD20 MSAPs (such as TSAPs) described herein and other sequence (s) , such as a recombinant protein (or fusion protein) comprising any of the CD3×CD19×CD20 MSAPs described herein and a tag sequence that can assist expression and / or purification. In some embodiments, the tag sequence comprises a “6×His” tag, a “GGGS” (SEQ ID NO: 73) sequence, or a “FLAG” tag.

[0204] The present invention also provides antibody conjugates comprising any of the MSAPs described herein and a conjugate portion conjugated to the MSAP. In some embodiments, the conjugate portion is a detectable marker (e.g., radionuclide) , a drug (e.g., a toxin, a cytokine, or an enzyme) , or any combination thereof. The MSAP conjugate can be a small molecule drug conjugate or a detection tag conjugate. The conjugate portion can be selected from the group consisting of fluorescent or luminescent markers, radioactive markers, MRI (magnetic resonance imaging) or CT (computer tomography) contrast agents, enzymes capable of producing detectable products, radionuclides, biotoxins, cytokines (such as IL-2, etc. ) , gold nanoparticles / nanorods, nanomagnetic particles, prodrug activating enzymes (e.g., DT-diaphorase (DTD) or biphenyl hydrolase-like protein (BPHL) ) , chemotherapeutic agents (e.g., cisplatin) , and any form of nanoparticles. The conjugation can be via chemical bond or a linker.

[0205] Also provided are isolated nucleic acid (s) encoding any of the MSAPs (e.g., TSAPs) described herein (or the MSAP portion of an MSAP conjugate) , vector (s) (e.g., viral vector, such as lentiviral vector or AAV) comprising such isolated nucleic acid (s) , and host cells (prokaryotic or eukaryotic) comprising such isolated nucleic acid (s) or vector (s) or expressing any of the MSAPs described herein. Antigen-binding moieties

[0206] MSAPs of the present invention comprise antigen-binding moieties that specifically bind to CD3, CD19, and CD20. The anti-CD3 moieties, anti-CD19 moieties, and / or anti-CD20 moieties described herein can be of any format and derived from any suitable antibodies or antigen-binding fragments thereof. Derivatives and analogs of antibodies or antigen-binding fragments thereof can also be used as an antigen-binding moiety. For example, the anti-CD3 moieties, the anti-CD19 moieties, and / or the anti-CD20 moieties can be independently selected from the group consisting of a full-length antibody, an scFv, a VH, a VL, an scFv-scFv, an Fv, a Fab, a Fab’, a (Fab’) 2, a minibody, a diabody, a domain antibody variant (dAb) , a single domain antibody (sdAb) , a camelid antibody (VHH) , a fibronectin 3 domain variant, an ankyrin repeat variant, and other antigen-specific binding domains derived from other protein scaffolds. In some embodiments, the anti-CD3 moiety, the anti-CD19 moiety, and / or the anti-CD20 moiety is independently a Fab fragment (also referred herein as “anti-CD3 Fab fragment” , “anti-CD19 Fab fragment” , and “anti-CD20 Fab fragment” , respectively) . In some embodiments, the anti-CD3 moiety, the anti-CD19 moiety, and / or the anti-CD20 moiety is independently an scFv (also referred herein as “anti-CD3 scFv” , “anti-CD19 scFv” , and “anti-CD20 scFv” ) . Such antigen-binding moieties can be generated by a variety of methods known in the art (see, e.g., U.S. Pat. Nos. 6,291,161; 6,291,158) . Sources of anti-CD3 moieties, anti-CD19 moieties, and / or anti-CD20 moieties include monoclonal antibody or antigen-binding fragments thereof from various species, including human, camelid (from camels, dromedaries, or llamas; Hamers-Casterman et al. (1993) Nature, 363: 446 and Nguyen et al. (1998) J. Mol. Biol., 275: 413) , shark (Roux et al. (1998) Proc. Nat'l. Acad. Sci. (USA) 95: 11804) , fish (Nguyen et al. (2002) Immunogenetics, 54: 39) , rodent, avian, or ovine. The anti-CD3 moiety, the anti-CD19 moiety, and / or the anti-CD20 moiety can be independently derived from a human antibody, a humanized antibody, a chimeric antibody, or a non-human (e.g., murine) antibody. In some embodiments, the anti-CD3 moiety, the anti-CD19 moiety, and / or the anti-CD20 moiety is independently derived from a fully human antibody, for example, developed using phage-display, yeast-display, or transgenic mice bearing human Ig genes. In some embodiments, the anti-CD3 moiety, the anti-CD19 moiety, and / or the anti-CD20 moiety is independently murine. An antigen-binding moiety can comprise one or more antigen-binding fragments (e.g., two anti-CD3 scFvs connected in tandem) . In some embodiments, an antigen-binding moiety comprises (e.g., consists of, or consists essentially of) one antigen-binding fragment (e.g., Fab or scFv) . In some embodiments, the anti-CD3 moiety, the anti-CD19 moiety, and / or the anti-CD20 moiety is independently a monospecific antibody, a multispecific antibody, a monoclonal antibody, a multivalent (e.g., bivalent) antibody, or a chimeric antibody. Any anti-CD3 moieties, anti-CD19 moieties, and / or anti-CD20 moieties available in the field can be used herein.

[0207] In some embodiments, the anti-CD3 moiety, the anti-CD19 moiety, and / or the anti-CD20 moiety is independently a monoclonal antibody or a full-length antibody. Suitable monoclonal antibodies may be of any type, including IgA, IgM, IgD, IgG, IgE and subtypes thereof, such as IgG1, IgG2, IgG3, and IgG4. The light chain domains may be derived from the kappa or lambda chain. The anti-CD3 moiety, the anti-CD19 moiety, and / or the anti-CD20 moiety can be independently designed recombinantly.

[0208] In some embodiments, the anti-CD3 moiety, the anti-CD19 moiety, and / or the anti-CD20 moiety is independently an scFv. In some embodiments, the anti-CD3 scFv, the anti-CD19 scFv, and / or the anti-CD20 scFv independently comprises from N-terminus to C-terminus: VH-optional linker-VL, or VL-optional linker-VH. Any linker in the “Linkers” subsection below can be used for linking VH and VL in an scFv.

[0209] In some embodiments, the anti-CD3 moiety, the anti-CD19 moiety, and / or the anti-CD20 moiety is independently a Fab fragment, comprising a first polypeptide comprising VH-CH1, and a second polypeptide comprising VL-CL. In some embodiments, the configuration of the variable and constant regions within the Fab fragment may be different from what is found in a native Fab fragment. In some embodiments, the Fab fragment comprises a first polypeptide comprising VH-CL, and a second polypeptide comprising VL-CH1 (see, for example, Shaefer et al. (2011) , PNAS, 108: 111870-92, the content of which is incorporated herein by reference in its entirety) .

[0210] In some embodiments, the anti-CD3 moiety, the anti-CD19 moiety, and / or the anti-CD20 moiety is independently a Fab fragment comprising a VH, a CH1, a VL, and a CL. In some embodiments, the CH1 and VH heterodimerize with the VL and CL, and are covalently linked by a disulfide bond between the heavy and light chain constant regions. In some embodiments, the Fab fragment has the basic structure NH2-VL-CL-S-S-CH1-VH-NH2. In some embodiments, the CH1 and the CL of the Fab fragment are connected by one or more disulfide bonds. In some embodiments, the number of disulfide bonds between CH1 and CL of the Fab fragment is at least one, such as 2, 3, 4, 5, or more. In some embodiments, cysteine residues are engineered in the Fab fragment (such as in the CH1 and CL regions) to introduce disulfide bonds.

[0211] In some embodiments, the Fab fragment (e.g., anti-CD3 Fab fragment, anti-CD19 Fab fragment, and / or anti-CD20 Fab fragment) does not comprise a disulfide bond at the C-terminus. For example, the heavy and light chains of the Fab fragment may be engineered in such a way so as to stably interact without the need for disulfide bonds. In some embodiments, the heavy chain or light chain can be engineered to remove a cysteine residue at the C-terminus, and the heavy and light chains still stably interact and function as a Fab. In some embodiments, mutations are made to facilitate stable interactions between the heavy and light chains of the Fab fragment. For example, a “knobs into holes” engineering strategy can be used to facilitate dimerization between the heavy and light chains of a Fab (see e.g., 1996 Protein Engineering, 9:617-621) . Also contemplated for use herein are variant Fab fragments designed for a particular purpose, for example, amino acid changes in the constant domains of CH1 and / or CL, and removal of a disulfide bond or addition of tags for purification, etc.

[0212] In some embodiments, the CH1 and the CL of the Fab fragment (e.g., anti-CD3 Fab fragment, anti-CD19 Fab fragment, and / or anti-CD20 Fab fragment) are connected by about 1 to about 5 (such as 1, 2, 3, 4, or 5) disulfide bonds, such as about 2 disulfide bonds. In some embodiments, the Fab fragment comprises a human immunoglobulin CH1, e.g., comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 64. In some embodiments, the Fab fragment comprises a human lambda light chain constant region, e.g., comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 63. In some embodiments, the Fab fragment comprises a human kappa light chain constant region, e.g., comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 145. In some embodiments, the C-terminus of the CH1 and / or the CL of the Fab fragment comprises a covalent binding sequence of CPPC (SEQ ID NO: 82) or CPPCS (SEQ ID NO: 81) capable of forming an intermolecular disulfide bond. In some embodiments, the C-terminus of the CH1 and / or the CL of the Fab fragment does not comprise a covalent binding sequence of SEQ ID NO: 81 or 82, or any covalent binding sequence capable of forming an intermolecular disulfide bond.

[0213] The anti-CD3 moiety, the anti-CD19 moiety, and / or the anti-CD20 moiety (e.g., scFv, sdAb, or Fab) can comprises a particular sequence or certain variants of these sequences. In some embodiments, the amino acid variations (e.g., substitutions) in the variant sequences do not substantially reduce (e.g., reducing at most about any of 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5%, 1%, or less) the ability of the antigen-binding moiety to bind to its corresponding antigen (e.g., CD3, CD19, CD20) . Also contemplated are modifications that substantially improve (e.g., improving at least about any of 1.2, 1.5, 2, 5, 10, 20, 50-fold, or more) the binding affinity of the antigen-binding moiety to its corresponding antigen or other properties, such as specificity, immunogenicity, and / or cross-reactivity with variants of corresponding antigen.

[0214] In some embodiments, a specific VH and / or VL of an anti-CD3 moiety, anti-CD19 moiety, and / or anti-CD20 moiety may be used to screen a library of the complementary variable region to identify VH / VL with desirable properties, such as increased affinity for CD3, CD19, and / or a CD20, respectively. Such methods are described, for example, in Portolano et al., J. Immunol. (1993) 150: 880-887; Clarkson et al., Nature (1991) 352: 624-628; and Klimka et al., British Journal of Cancer (2000) 83: 252-260; Beiboer et al., J. Mol. Biol. (2000) 296: 833-849; and Rader et al., PNAS (1998) 95: 8910-8915; the contents of each of which are incorporated herein by reference in their entirety.

[0215] In some embodiments, the anti-CD3 moiety, anti-CD19 moiety, and / or anti-CD20 moiety independently comprises one or more post-translational modifications.

[0216] Functional epitopes can be mapped by combinatorial alanine scanning. In this process, a combinatorial alanine-scanning strategy can be used to identify amino acids in the antigen protein (e.g., CD3, CD19, or CD20) that are necessary for interaction with the antigen-binding moiety (e.g., anti-CD3 moiety, anti-CD19 moiety, or CD20 moiety, respectively) . In some embodiments, the epitope is conformational, and crystal structure of the antigen-binding moiety bound to its antigen may be employed to identify the epitopes.

[0217] Any anti-CD3 antibody or antigen binding fragment thereof (or anti-CD3 moiety) which competes with any one of the anti-CD3 antibodies or antigen-binding fragments thereof described herein for binding to CD3 (e.g., same CD3 epitope, overlapping CD3 epitope) can also be used herein. Any anti-CD19 antibody or antigen binding fragment thereof (or anti-CD19 moiety) which competes with any one of the anti-CD19 antibodies or antigen-binding fragments thereof described herein for binding to CD19 (e.g., same CD19 epitope, overlapping CD19 epitope) can also be used herein. Any anti-CD20 antibody or antigen binding fragment thereof (or anti-CD20 moiety) which competes with any one of the anti-CD20 antibodies or antigen-binding fragments thereof described herein for binding to CD20 (e.g., same CD20 epitope, overlapping CD20 epitope) can also be used herein.

[0218] Competition assays may be used to identify an antibody or antigen binding fragment thereof that competes with any of the antibodies or antigen-binding fragments thereof described herein (e.g., anti-CD3 antibody or antigen-binding fragment thereof, anti-CD19 antibody or antigen-binding fragment thereof, or anti-CD20 antibody or antigen-binding fragment thereof) for binding to its target (e.g., CD3, CD19, or CD20, respectively) . Competition assays can be used to determine whether two antibodies or antigen binding fragments thereof bind the same epitope by recognizing identical or sterically overlapping epitopes, or one antibody (or antigen binding fragment thereof) competitively inhibits binding of another antibody (or antigen binding fragment thereof) to the antigen. In certain embodiments, such a competing antibody (or antigen binding fragment thereof) binds to the same epitope that is bound by any of the antibodies or antigen-binding fragments thereof described herein. Exemplary competition assays include, but are not limited to, routine assays such as those provided in Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch. 14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. ) . Detailed exemplary methods for mapping an epitope to which an antibody (or antigen binding fragment thereof) binds are provided in Morris (1996) "Epitope Mapping Protocols, " in Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, N.J. ) . In some embodiments, two antibodies (or antigen binding fragments thereof) are said to bind to the same epitope if each blocks binding of the other by about 50%or more (e.g., at least about any of 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, or more) . In some embodiments, the antibody (or antigen binding fragments thereof) that competes with any of the antibodies or antigen-binding fragments thereof described herein is a humanized antibody, a human antibody, a multispecific antibody, a monoclonal antibody, a multivalent antibody, a conjugated antibody, or a chimeric antibody. In some embodiments, the competing antibody or antigen-binding fragment thereof is a full-length antibody, a Fab, a Fab’, a Fab’-SH, a F (ab’) 2, an Fv, an scFv, an sdAb, or any combinations thereof.

[0219] In some embodiments, the MSAPs (such as TSAPs) described herein have an increased (e.g., increasing at least about any of 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, or more times) in vivo half-life compared to: the anti-CD3 moiety (e.g., Fab, scFv) alone, the anti-CD19 moiety (e.g., Fab, scFv) alone, and / or the anti-CD20 moiety (e.g., Fab, scFv) alone. Anti-CD3 moiety

[0220] Any of the anti-CD3 antibodies or antigen binding fragments thereof described herein can be used as an anti-CD3 moiety in any of the MSAPs (such as TSAPs or BSAPs) described herein. An anti-CD3 moiety can comprise one or more anti-CD3 antigen binding fragments, such as two or more anti-CD3 antigen binding fragments connected in tandem. In some embodiments, the anti-CD3 moiety comprises (e.g., consists of, or consists essentially of) an (e.g., one) anti-CD3 antigen binding fragment (e.g., Fab or scFv) . In some embodiments, “anti-CD3 antigen binding fragment” and “anti-CD3 moiety” are used interchangeably.

[0221] CD3 is a multi-protein complex of six chains (see, Abbas and Lichtman, 2003; Janeway et al., p172 and 178, 1999) . In mammals, the T cell receptor (TCR) complex comprises a CD3γ chain, a CD3δ chain, two CD3ε chains, and a homodimer of CD3ζ chains. The CD3γ, CD3δ, and CD3ε chains are highly related cell surface proteins of the immunoglobulin superfamily containing a single immunoglobulin domain. The transmembrane regions of the CD3γ, CD3δ, and CD3ε chains are negatively charged, which is a characteristic that allows these chains to associate with the positively charged TCR chains. The intracellular tails of the CD3γ, CD3δ, and CD3ε chains each contain a single conserved motif known as an immunoreceptor tyrosine-based activation motif or ITAM, whereas each CD3ζ chain has three. Without being bound by theory, it is believed the ITAMs are important for the signaling capacity of a TCR complex. CD3 may be from various animal species, including human, primate, mouse, rat, rabbit, or other mammals. In some embodiments, the anti-CD3 moiety specifically recognizes a human CD3. In some embodiments, the anti-CD3 moiety specifically recognizes a cynomolgus monkey CD3. In some embodiments, the anti-CD3 moiety specifically recognizes both human and cynomolgus monkey CD3. CD3 can be wild-type or mutant (e.g., has insertion, deletion, and / or amino acid substitution compared to wild-type) . In some embodiments, the anti-CD3 moiety specifically binds to the extracellular domain of one or more of CD3ε, CD3γ, and CD3δ. In some embodiments, the anti-CD3 moiety specifically binds to the extracellular domain of CD3ε. In some embodiments, the anti-CD3 moiety specifically binds to N’ of CD3ε, such as an epitope within amino acids 1-27 of CD3ε.

[0222] In some embodiments, the anti-CD3 moiety (e.g., scFv or Fab) binds to CD3 with an equilibrium binding constant (Kd) ≤1 μM, such as ≤100 nM, preferably ≤10 nM, more preferably ≤1 nM. For example, the Kd value of the anti-CD3 moiety in binding to CD3 is between about 1 nM and about 1 pM. In some embodiments, the anti-CD3 moiety binds to human CD3 and / or monkey (e.g., cynomolgus) CD3 with a Kd of from about 1×10-12 M to about 1×10-7 M (e.g., from about 1×10-12 M to about 1×10-10 M, from about 1×10-10 M to about 1×10-9 M, from about 1×10-10 M to about 1×10-8 M, from about 1×10-10 M to about 1×10-7 M, from about 1×10-9 M to about 1×10-7 M, from about 1×10-9 M to about 1×10-8 M, from about 1×10-11 M to about 1×10-7 M, or from about 1×10-8 M to about 1×10-7 M) .

[0223] In some embodiments, the anti-CD3 moiety (e.g., scFv or Fab) specifically binds to an individual CD3 chain, such as CD3γ chain, CD3δ chain, or CD3ε chain. In some embodiments, the anti-CD3 moiety specifically binds to a complex formed from two or more individual CD3 chains (e.g., a complex of more than one CD3ε chains, a complex of a CD3γ and CD3ε chain, or a complex of a CD3δ and CD3ε chain) .

[0224] In some embodiments, the anti-CD3 moiety (e.g., scFv or Fab) specifically binds to both human and non-human primates (such as cynomolgus monkey) CD3. Exemplary anti-human CD3 antibodies and antigen binding fragments thereof with cross reactivity to human and monkey CD3 include, but are not limited to, SP34 mouse monoclonal antibody (see, for example, Pressano, S. The EMBO J. 4: 337-344, 1985; Alarcon, B. EMBO J. 10: 903-912, 1991; Salmeron A. et al., J. Immunol. 147: 3047-52, 1991; Yoshino N. et al., Exp. Anim 49: 97-110, 2000; Conrad M L. et al., Cytometry 71A: 925-33, 2007; Yang et al., J. Immunol. 137: 1097-1100: 1986; US 8,846,042; US 11,013,800; and US 10,870,701) . MSAPs (such as TSAPs, BSAPs) employing such anti-CD3 moieties with cross-reactivity to monkey CD3 may facilitate toxicity studies in non-human primates, which can provide more relevant safety assessments for human clinical trial candidates, without having to perform toxicity studies in chimpanzees or using surrogate molecules.

[0225] In some embodiments, the anti-CD3 moiety (e.g., scFv or Fab) is derived from an anti-CD3 antibody or antigen binding fragment thereof that does not have cross-reactivity to non-human primates. Such exemplary anti-CD3 moieties include the Cris-7 monoclonal antibody (Reinherz, E. L. et al. (eds. ) , Leukocyte typing II, Springer Verlag, New York, (1986) ) , BC3 monoclonal antibody (Anasetti et al. (1990) J. Exp. Med. 172: 1691) , OKT3 (Ortho multicenter Transplant Study Group (1985) N. Engl. J. Med. 313: 337) and derivatives thereof such as OKT3 ala-ala (Herold et al. (2003) J. Clin. Invest. 11: 409) , visilizumab (Carpenter et al. (2002) Blood 99: 2712) , and 145-2C11 monoclonal antibody (Hirsch et al. (1988) J. Immunol. 140: 3766) .

[0226] Further anti-CD3 antibodies or antigen binding fragments that can be used herein include UCHT-1 (Beverley, P C and Callard, R. E. (1981) Eur. J. Immunol. 11: 329-334) and CD3 binding molecules described in US8784821; US11987633; US20100150918; US8236308; WO2024188355, US8846042, US10870701, US20210301018, and US20220064295, the contents of each of which are incorporated herein by reference in their entirety.

[0227] In some embodiments, the anti-CD3 moiety or antigen binding fragment (e.g., Fab or scFv) comprises a VH comprising one, two, or three HVRs (or CDRs) from a reference VH comprising the sequence of any of SEQ ID NOs: 32, 88, and 89, and / or a VL comprising one, two, or three HVRs (or CDRs) from a reference VL comprising the sequence of SEQ ID NO: 33. In some embodiments, the anti-CD3 moiety or antigen binding fragment comprises a VH comprising three HVRs from a reference VH comprising the sequence of any of SEQ ID NOs: 32, 88, and 89, and / or a VL comprising three HVRs from a reference VL comprising the sequence of SEQ ID NO: 33.

[0228] In some embodiments, anti-CD3 moiety or antigen binding fragment (e.g., Fab or scFv) comprises: an HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, or a variant thereof comprising up to 5 (e.g., 1, 2, 3, 4, or 5) amino acid variations (e.g., insertion (s) , deletion (s) , and / or substitution (s) , such as conservative substitution (s) ) ; an HVR-H2 comprising the amino acid sequence of any of SEQ ID NOs: 2, 85, and 87, or a variant thereof comprising up to 5 (e.g., 1, 2, 3, 4, or 5) amino acid variations (e.g., insertion (s) , deletion (s) , and / or substitution (s) , such as conservative substitution (s) ) ; an HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 or 86, or a variant thereof comprising up to 5 (e.g., 1, 2, 3, 4, or 5) amino acid variations (e.g., insertion (s) , deletion (s) , and / or substitution (s) , such as conservative substitution (s) ) ; an HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17, or a variant thereof comprising up to 5 (e.g., 1, 2, 3, 4, or 5) amino acid variations (e.g., insertion (s) , deletion (s) , and / or substitution (s) , such as conservative substitution (s) ) ; an HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18, or a variant thereof comprising up to 5 (e.g., 1, 2, 3, 4, or 5) amino acid variations (e.g., insertion (s) , deletion (s) , and / or substitution (s) , such as conservative substitution (s) ) ; and an HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19, or a variant thereof comprising up to 5 (e.g., 1, 2, 3, 4, or 5) amino acid variations (e.g., insertion (s) , deletion (s) , and / or substitution (s) , such as conservative substitution (s) ) .

[0229] In some embodiments, the anti-CD3 moiety or antigen binding fragment (e.g., Fab or scFv) comprises: (a) an HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, an HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, an HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, an HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17, an HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18, and an HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19; (b) an HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, an HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 85, an HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 86, an HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17, an HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18, and an HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19; or (c) an HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, an HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 87, an HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, an HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17, an HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18, and an HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19. In some embodiments, the anti-CD3 moiety or antigen binding fragment comprises a VH comprising an amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 32, 88, and 89, or a variant thereof (e.g., comprising insertion (s) , deletion (s) , and / or substitution (s) , such as conservative substitution (s) ) having at least about 80% (such as at least about any of 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or more) sequence identity to the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 32, 88, and 89; and / or a VL comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 33, or a variant thereof (e.g., comprising insertion (s) , deletion (s) , and / or substitution (s) , such as conservative substitution (s) ) having at least about 80% (such as at least about any of 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or more) sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 33. In some embodiments, the one or more variations reside in one or more of the HVRs. In some embodiments, the one or more variations reside in the framework regions. In some embodiments, the anti-CD3 moiety or antigen binding fragment comprises a VH comprising the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 32, 88, and 89, and a VL comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 33.

[0230] In some embodiments, the anti-CD3 moiety or antigen binding fragment is an anti-CD3 scFv. In some embodiments, the anti-CD3 scFv comprises the amino acid sequence of any of SEQ ID NOs: 90-95, or a variant thereof (e.g., comprising insertion (s) , deletion (s) , and / or substitution (s) , such as conservative substitution (s) ) having at least about 80% (such as at least about any one of 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or more) sequence identity to the amino acid sequence of any of SEQ ID NOs: 90-95. In some embodiments, the anti-CD3 scFv comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 90-95.

[0231] In some embodiments, the anti-CD3 moiety or antigen binding fragment is an anti-CD3 Fab fragment. In some embodiments, the anti-CD3 Fab fragment comprises (a) a first polypeptide comprising the amino acid sequence of any of SEQ ID NOs: 60, 96, and 97, or a variant thereof (e.g., comprising insertion (s) , deletion (s) , and / or substitution (s) , such as conservative substitution (s) ) having at least about 80% (such as at least about any one of 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or more) sequence identity to the amino acid sequence of any of SEQ ID NOs: 60, 96, and 97; and / or (b) a second polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 61 or 98, or a variant thereof (e.g., comprising insertion (s) , deletion (s) , and / or substitution (s) , such as conservative substitution (s) ) having at least about 80% (such as at least about any one of 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or more) sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 61 or 98. In some embodiments, the anti-CD3 Fab fragment comprises a first polypeptide comprising the amino acid sequence of any of SEQ ID NOs: 60, 96, and 97, and a second polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 61 or 98. In some embodiments, the first polypeptide and / or the second polypeptide of the anti-CD3 Fab fragment do not comprise a hinge or portion thereof (e.g., SEQ ID NO: 81 or 82) at the C-terminus of the first polypeptide and / or the second polypeptide. Anti-CD19 moiety

[0232] Any of the anti-CD19 antibodies or antigen binding fragments thereof described herein can be used as an anti-CD19 moiety in any of the MSAPs (e.g., TSAPs) described herein. An anti-CD19 moiety can comprise one or more anti-CD19 antigen binding fragments, such as two or more anti-CD19 antigen binding fragments connected in tandem. In some embodiments, the anti-CD19 moiety comprises (e.g., consists of, or consists essentially of) an (e.g., one) anti-CD19 antigen binding fragment (e.g., Fab or scFv) . In some embodiments, “anti-CD19 antigen binding fragment” and “anti-CD19 moiety” are used interchangeably.

[0233] The B-lymphocyte antigen CD19 is also known as CD19 molecule (cluster of differentiation 19) , B-lymphocyte surface antigen B4, T-cell surface antigen Leu-12 and CVID3. In humans, CD19 is expressed in all B lineage cells, except for plasma cells, and in follicular dendritic cells. CD19 has two major roles: 1) acting as an adaptor protein to recruit cytoplasmic signaling proteins to the membrane; and 2) functioning within the CD19 / CD21 complex to decrease the threshold for B cell receptor signaling pathways. CD19 is expressed in both normal B lymphocytes and malignant B lymphocytes, and is considered a B-cell tumor-associated antigen. For example, CD19 can serve as a biomarker for B lymphocyte development, a cancer diagnosis marker, or a target for immunotherapy, such as for B cell lymphomas, mantle cell lymphoma (MCL) , acute lymphoblastic leukemia (ALL) , and chronic lymphocytic leukemia (CLL) . Because CD19 is present in all B cells, it can serve as a biomarker for B lymphocyte development or lymphoma diagnosis, and can serve as a target for leukemia immunotherapy.

[0234] CD19 may be from various animal species, including human, primate, mouse, rat, rabbit, or other mammals. CD19 can be wild-type or mutant (e.g., has insertion, deletion, and / or amino acid substitution compared to wild-type) .

[0235] In some embodiments, the anti-CD19 moiety specifically binds to CD19 present on the surface of a cell. In some embodiments, the cell is an immune cell, such as B cell. In some embodiments, the cell is a cancer cell, such as malignant B lymphocyte. In some embodiments, the cancer cell is in a solid tumor. In some embodiments, the cancer cell is a metastatic cancer cell, such as hematological cancers, e.g., ALL, CLL, MCL, B cell lymphoma, etc.

[0236] In some embodiments, the anti-CD19 moiety (e.g., scFv or Fab) binds to CD19 with an equilibrium binding constant (Kd) ≤1 μM, such as ≤100 nM, preferably ≤10 nM, more preferably ≤1 nM. For example, the Kd value of the anti-CD19 moiety in binding to CD19 is between about 1 nM and about 1 pM. In some embodiments, the anti-CD19 moiety binds to human CD19 and / or monkey (e.g., cynomolgus) CD19 with a Kd of from about 1×10-12 M to about 1×10-7 M (e.g., from about 1×10-12 M to about 1×10-10 M, from about 1×10-10 M to about 1×10-9 M, from about 1×10-10 M to about 1×10-8 M, from about 1×10-10 M to about 1×10-7 M, from about 1×10-9 M to about 1×10-7 M, from about 1×10-9 M to about 1×10-8 M, from about 1×10-11 M to about 1×10-7 M, or from about 1×10-8 M to about 1×10-7 M) .

[0237] The anti-CD19 moieties antigen binding fragments described herein can be of any format and derived from any suitable anti-CD19 antibodies, including but not limited to, B43, MEDI-551, CLB-CD19, 4G7, SJ25-CILT19, Leu-12, HD37, or other known anti-human CD19 monoclonal antibodies. In some embodiments, the anti-CD19 moiety is a Fab. In some embodiments, the anti-CD19 moiety is an scFv. The anti-CD19 moiety can be human, humanized, or chimeric. In some embodiments, the anti-CD19 moiety is derived from a monoclonal antibody of mouse, rat, monkey, or rabbit. Anti-CD19 antigen binding fragments described in US20220064295 or US20210301018 can also be used herein, the contents of each of which are incorporated herein by reference in their entirety.

[0238] In some embodiments, the anti-CD19 moiety (e.g., scFv or Fab) specifically binds to both human and non-human primates (such as cynomolgus monkey) CD19. MSAPs (such as TSAPs or BSAPs) having anti-CD19 moiety with cross-reactivity to monkey CD19 may facilitate toxicity studies in non-human primates, which can provide more relevant safety assessments for human clinical trial candidates, without having to perform toxicity studies in chimpanzees or using surrogate molecules. In some embodiments, the anti-CD19 moiety only binds to human CD19. In some embodiments, the anti-CD19 moiety binds to human CD19 stronger (such as about any of 2, 5, 10, 20, 50, 100, 500, 1000-fold, or more) than non-human (e.g., cynomolgus monkey) CD19.

[0239] The anti-CD19 moiety or anti-CD19 antigen binding fragment (e.g., scFv or Fab) may fully or partially modulate, block, inhibit, reduce, antagonize, neutralize or interfere with the functional activity of CD19. When the functional activity of CD19 is reduced by at least about 95% (such as at least about any of 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%) in the presence of an anti-CD19 moiety compared to not bound by an anti-CD19 moiety, the anti-CD19 moiety is considered capable of fully modulating, blocking, inhibiting, reducing, antagonizing, neutralizing or interfering with the functional activity of CD19. When the functional activity of CD19 is reduced by at least about 50% (such as at least about any of 55%, 60%, 75%, 80%, 85%, or 90%) in the presence of an anti-CD19 moiety compared to not bound by an anti-CD19 moiety, the anti-CD19 moiety is considered capable of significantly modulating, blocking, inhibiting, reducing, antagonizing, neutralizing or interfering with the functional activity of CD19. When the functional activity of CD19 is reduced by less than about 50% (such as reduced by less than about any of 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, or 50%) in the presence of an anti-CD19 moiety compared to not bound by an anti-CD19 moiety, the anti-CD19 moiety is considered capable of partially modulating, blocking, inhibiting, reducing, antagonizing, neutralizing or interfering with the functional activity of CD19.

[0240] In some embodiments, the anti-CD19 moiety or antigen binding fragment (e.g., Fab or scFv) comprises a VH comprising one, two, or three HVRs (or CDRs) from a reference VH comprising the sequence of SEQ ID NO: 34, and / or a VL comprising one, two, or three HVRs (or CDRs) from a reference VL comprising the sequence of SEQ ID NO: 35 or 100. In some embodiments, the anti-CD19 moiety or antigen binding fragment comprises a VH comprising three HVRs from a reference VH comprising the sequence of SEQ ID NO: 34, and / or a VL comprising three HVRs from a reference VL comprising the sequence of SEQ ID NO: 35 or 100.

[0241] In some embodiments, the anti-CD19 moiety or antigen binding fragment (e.g., scFv or Fab) comprises: an HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, or a variant thereof comprising up to 5 (e.g., 1, 2, 3, 4, or 5) amino acid variations (e.g., insertion (s) , deletion (s) , and / or substitution (s) , such as conservative substitution (s) ) ; an HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, or a variant thereof comprising up to 5 (e.g., 1, 2, 3, 4, or 5) amino acid variations (e.g., insertion (s) , deletion (s) , and / or substitution (s) , such as conservative substitution (s) ) ; an HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, or a variant thereof comprising up to 5 (e.g., 1, 2, 3, 4, or 5) amino acid variations (e.g., insertion (s) , deletion (s) , and / or substitution (s) , such as conservative substitution (s) ) ; an HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20, or a variant thereof comprising up to 5 (e.g., 1, 2, 3, 4, or 5) amino acid variations (e.g., insertion (s) , deletion (s) , and / or substitution (s) , such as conservative substitution (s) ) ; an HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21, or a variant thereof comprising up to 5 (e.g., 1, 2, 3, 4, or 5) amino acid variations (e.g., insertion (s) , deletion (s) , and / or substitution (s) , such as conservative substitution (s) ) ; and an HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22 or 99, or a variant thereof comprising up to about 5 (e.g., 1, 2, 3, 4, or 5) amino acid variations (e.g., insertion (s) , deletion (s) , and / or substitution (s) , such as conservative substitution (s) ) .

[0242] In some embodiments, the anti-CD19 moiety or antigen binding fragment (e.g., scFv or Fab) comprises: an HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, an HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, an HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, an HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20, an HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21, and an HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 99 or 22. In some embodiments, the anti-CD19 moiety or antigen binding fragment comprises a VH comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 34, or a variant thereof (e.g., comprising insertion (s) , deletion (s) , and / or substitution (s) , such as conservative substitution (s) ) having at least about 80% (such as at least about any of 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or more) sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 34; and / or a VL comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 35 or 100, or a variant thereof (e.g., comprising insertion (s) , deletion (s) , and / or substitution (s) , such as conservative substitution (s) ) having at least about 80% (such as at least about any of 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or more) sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 35 or 100. In some embodiments, the one or more variations reside in one or more of the HVRs. In some embodiments, the one or more variations reside in framework regions. In some embodiments, the anti-CD19 moiety or antigen binding fragment thereof comprises a VH comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 34, and a VL comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 35 or 100.

[0243] In some embodiments, the anti-CD19 moiety or antigen binding fragment is an anti-CD19 scFv. In some embodiments, the anti-CD19 scFv comprises the amino acid sequence of any of SEQ ID NOs: 101-104, or a variant thereof (e.g., comprising insertion (s) , deletion (s) , and / or substitution (s) , such as conservative substitution (s) ) having at least about 80% (such as at least about any one of 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or more) sequence identity to the amino acid sequence of any of SEQ ID NOs: 101-104. In some embodiments, the anti-CD19 scFv comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 101-104.

[0244] In some embodiments, the anti-CD19 moiety or antigen binding fragment is an anti-CD19 Fab fragment. In some embodiments, the anti-CD19 Fab fragment comprises: (a) a first polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 105, or a variant thereof (e.g., comprising insertion (s) , deletion (s) , and / or substitution (s) , such as conservative substitution (s) ) having at least about 80% (such as at least about any one of 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or more) sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 105; and / or (b) a second polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 59 and 106-108, or a variant thereof (e.g., comprising insertion (s) , deletion (s) , and / or substitution (s) , such as conservative substitution (s) ) having at least about 80% (such as at least about any one of 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or more) sequence identity to an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 59 and 106-108. In some embodiments, the anti-CD19 Fab fragment comprises: a first polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 105, and a second polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 59 and 106-108. In some embodiments, the first polypeptide and / or the second polypeptide of the anti-CD19 Fab fragment do not comprise a hinge or portion thereof (e.g., SEQ ID NO: 81 or 82) at the C-terminus of the first polypeptide and / or the second polypeptide. Anti-CD20 moiety

[0245] Any of the anti-CD20 antibodies or antigen binding fragments thereof described herein can be used as an anti-CD20 moiety in any of the MSAPs (e.g., TSAPs or BSAPs) described herein. An anti-CD20 moiety can comprise one or more anti-CD20 antigen binding fragments, such as two or more anti-CD20 antigen binding fragments connected in tandem. In some embodiments, the anti-CD20 moiety comprises (e.g., consists of, or consists essentially of) an (e.g., one) anti-CD20 antigen binding fragment (e.g., Fab or scFv) . In some embodiments, “anti-CD20 antigen binding fragment” and “anti-CD20 moiety” are used interchangeably.

[0246] The B cell-specific membrane protein Cluster of Differentiation-20 (CD20) is also known as B-lymphocyte surface antigen B1, Bp35, Leukocyte surface antigen Leu-16, Membrane-spanning 4-domains subfamily A member 1 (MS4A1) . CD20 is expressed primarily on B cells and plays a role in the regulation of cellular calcium influx that is necessary for the development, differentiation, and activation of B-lymphocytes. CD20 is expressed in a majority of B-cell malignancies and is considered a prognostic marker for, e.g., hematological cancers; its role in a variety of adult and pediatric malignancies and metastasis is being assessed. CD20 is expressed in cancers associated with B-cell deterioration, such as chronic lymphocytic leukemia, diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL) , mantle cell lymphoma (MCL) , and follicular lymphoma. For example, CD20 can serve as a biomarker for Burkitt’s lymphoma development, a cancer diagnosis marker, or a target for immunotherapy, such as for hematological cancers.

[0247] CD20 may be from various animal species, including human, primate, mouse, rat, rabbit, or other mammals. CD20 can be wild-type or mutant (e.g., has insertion, deletion, and / or amino acid substitution compared to wild-type) .

[0248] In some embodiments, the anti-CD20 moiety can specifically bind to CD20 on a cell surface. In some embodiments, the cell is an immune cell, such as B cell. In some embodiments, the cell is a cancer cell, such as malignant B lymphocyte. In some embodiments, the cancer cell is a solid cancer. In some embodiments, the cancer cell is a liquid cancer. In some embodiments, the cancer cell is a hematological malignancy, e.g., Burkitt’s lymphoma, and the like.

[0249] In some embodiments, the anti-CD20 moiety (e.g., scFv or Fab) of the MSAP (such as TSAP or BSAP) binds to CD20 with a Kd ≤ 1 μM, such as ≤100 nM, preferably ≤10 nM, more preferably ≤1 nM. For example, the Kd value of the anti-CD20 moiety is between about 1 nM and about 1 pM. In some embodiments, the anti-CD20 moiety binds to human CD20 and / or monkey (e.g., cynomolgus) CD20 with a Kd of from about 1×10-12 M to about 1×10-7 M (e.g., from about 1×10-12 M to about 1×10-10 M, from about 1×10-11 M to about 1×10-10 M, from about 1×10-11 M to about 1×10-9 M, from about 1×10-11 M to about 1×10-8 M, from about 1×10-10 M to about 1×10-9 M, from about 1×10-10 M to about 1×10-8 M, from about 1×10-10 M to about 1×10-7 M, from about 1×10-9 M to about 1×10-7 M, from about 1×10-9 M to about 1×10-8 M, from about 1×10-11 M to about 1×10-7 M, or from about 1×10-8 M to about 1×10-7 M) .

[0250] The anti-CD20 moieties or antigen binding fragments described herein can be of any format and derived from any suitable anti-CD20 antibodies. In some embodiments, the anti-CD20 antigen binding fragment is a Fab. In some embodiments, the anti-CD20 moiety is an scFv. The anti-CD20 moiety can be human, humanized, or chimeric. In some embodiments, the anti-CD20 moiety is derived from a monoclonal antibody of mouse, rat, monkey or rabbit. In some embodiments, the anti-CD20 moiety is derived from any anti-CD20 monoclonal antibodies, including but not limited to, 1412, 2H7, C20Mab-60, QA18A73, QA20A02, S18015E, SA271G2, SA275A11, SP32, LT20, L26, HI47, AISB12, B9E9, QCH6A7, OTI4B4, UMAB37, MEM-97, 3E9D3C1G3, QCH6A7, B-Ly1, FMC7, 4A7G3, UMAB58, OTI11F7, 743AB35, OTI1H4, OTI3C4, OTI2D3, OTI10A5, OTI2C11, 743X69, 743X78, 743AB30, 743Y4, 743X56, 743X65, 743AB71, UMAB38, 13.6E12, ZY492, 5C11, 4F11, OTI4A4, 743X45, OIT1C12, C273, ZY459, UMAB39, DFA-7, ICO-180, NKI-B20, ZM86, SY12-01, ARC0331, RM272, IGEL / 7015R, IGEL / 1497r, rIGEL / 773, etc.

[0251] In some embodiments, the anti-CD20 moiety or anti-CD20 antigen binding fragment (e.g., scFv or Fab) specifically binds to both human and non-human primates (such as cynomolgus monkey) CD20. MSAPs (such as TSAPs or BSAPs) having an anti-CD20 moiety with cross-reactivity to monkey CD20 may facilitate toxicity studies in non-human primates, which can provide more relevant safety assessments for human clinical trial candidates, without having to perform toxicity studies in chimpanzees or using surrogate molecules. In some embodiments, the anti-CD20 moiety only binds to human CD20. In some embodiments, the anti-CD20 moiety binds to human CD20 stronger (such as about any of 2, 5, 10, 20, 50, 100, 500, 1000-fold, or more) than non-human (e.g., cynomolgus monkey) CD20.

[0252] The anti-CD20 moiety or anti-CD20 antigen binding fragment (e.g., scFv or Fab) may fully or partially modulate, block, inhibit, reduce, antagonize, neutralize or interfere with the functional activity of CD20. When the functional activity of CD20 is reduced by at least about 95%(such as at least about any of 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%) in the presence of an anti-CD20 moiety compared to not bound by an anti-CD20 moiety, the anti-CD20 moiety is considered capable of fully modulating, blocking, inhibiting, reducing, antagonizing, neutralizing or interfering with the functional activity of CD20. When the functional activity of CD20 is reduced by at least about 50% (such as at least about any of 55%, 60%, 75%, 80%, 85%, or 90%) in the presence of an anti-CD20 moiety compared to not bound by an anti-CD20 moiety, the anti-CD20 moiety is considered capable of significantly modulating, blocking, inhibiting, reducing, antagonizing, neutralizing or interfering with the functional activity of CD20. When the functional activity of CD20 is reduced by less than about 50% (such as reduced by less than about any of 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, or 50%) in the presence of an anti-CD20 moiety compared to not bound by an anti-CD20 moiety, the anti-CD20 moiety is considered capable of partially modulating, blocking, inhibiting, reducing, antagonizing, neutralizing or interfering with the functional activity of CD20.

[0253] In some embodiments, the anti-CD20 moiety or antigen binding fragment (e.g., scFv, Fab fragment) comprises a VH comprising one, two or three HVRs (or CDRs) from a reference VH comprising the amino acid sequence of any of SEQ ID NOs: 36, 38, 40, 42, 113, and 114, and / or a VL comprising one, two or three HVRs (or CDRs) from a reference VL comprising the amino acid sequence of any of SEQ ID NOs: 37, 39, 41, 115, and 116. In some embodiments, the anti-CD20 moiety or antigen binding fragment comprises a VH comprising three HVRs from a reference VH comprising the amino acid sequence of any of SEQ ID NOs: 36, 38, 40, 42, 113, and 114, and / or a VL comprising three HVRs from a reference VL comprising the amino acid sequence of any of SEQ ID NOs: 37, 39, 41, 115, and 116.

[0254] In some embodiments, the anti-CD20 moiety or antigen binding fragment (e.g., scFv or Fab) comprises: an HVR-H1 comprising the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 7, 10, and 13, or a variant thereof comprising up to 5 (e.g., 1, 2, 3, 4, or 5) amino acid variations (e.g., insertion (s) , deletion (s) , and / or substitution (s) , such as conservative substitution (s) ) ; an HVR-H2 comprising the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 8, 11, 14, and 16, or a variant thereof comprising up to 5 (e.g., 1, 2, 3, 4, or 5) amino acid variations (e.g., insertion (s) , deletion (s) , and / or substitution (s) , such as conservative substitution (s) ) ; an HVR-H3 comprising the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 9, 12, 15, and 109, or a variant thereof comprising up to 5 (e.g., 1, 2, 3, 4, or 5) amino acid variations (e.g., insertion (s) , deletion (s) , and / or substitution (s) , such as conservative substitution (s) ) ; an HVR-L1 comprising the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 23, 26, 29, and 110, or a variant thereof comprising up to 5 (e.g., 1, 2, 3, 4, or 5) amino acid variations (e.g., insertion (s) , deletion (s) , and / or substitution (s) , such as conservative substitution (s) ) ; an HVR-L2 comprising the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 24, 27, 30, and 111, or a variant thereof comprising up to 5 (e.g., 1, 2, 3, 4, or 5) amino acid variations (e.g., insertion (s) , deletion (s) , and / or substitution (s) , such as conservative substitution (s) ) ; and an HVR-L3 comprising the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 25, 28, 31, and 112, or a variant thereof comprising up to about 5 (e.g., 1, 2, 3, 4, or 5) amino acid variations (e.g., insertion (s) , deletion (s) , and / or substitution (s) , such as conservative substitution (s) ) .

[0255] In some embodiments, the anti-CD20 moiety or antigen binding fragment (e.g., scFv or Fab) comprises: (a) an HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, an HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8, an HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9, an HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 23, an HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 24, and an HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 25; (b) an HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10, an HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11, an HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12, an HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26, an HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 27, and an HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 28; (c) an HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13, an HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14, an HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15, an HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 29, an HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 30, and an HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 31; (d) an HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10, an HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16, an HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12, an HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26, an HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 27, and an HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 28; or (e) an HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, an HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8, an HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 109, an HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 110, an HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 111, and an HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 112. In some embodiments, the anti-CD20 moiety or antigen binding fragment comprises: (i) a VH comprising an amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 36, 38, 40, 42, 113, and 114, or a variant thereof (e.g., comprising insertion (s) , deletion (s) , and / or substitution (s) , such as conservative substitution (s) ) having at least about 80% (such as at least about any of 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or more) sequence identity to the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 36, 38, 40, 42, 113, and 114, and / or (ii) a VL comprising an amino acid sequence of any of SEQ ID NOs: 36, 38, 40, 42, 113, and 114, or a variant thereof (e.g., comprising insertion (s) , deletion (s) , and / or substitution (s) , such as conservative substitution (s) ) having at least about 80% (such as at least about any of 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or more) sequence identity to the amino acid sequence of any of SEQ ID NOs: 37, 39, 41, 115, and 116. In some embodiments, the anti-CD20 moiety or antigen binding fragment comprises a VH comprising the amino acid sequence of any of SEQ ID NOs: 36, 38, 40, 42, 113, and 114, and / or a VL comprising the amino acid sequence of any of SEQ ID NOs: 37, 39, 41, 115, and 116. In some embodiments, the anti-CD20 moiety or antigen binding fragment comprises: (a) a VH comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 36, and a VL comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 37; (b) a VH comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 38, and a VL comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 39; (c) a VH comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 40, and a VL comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 41; (d) a VH comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 42, and a VL comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 39; (e) a VH comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 113, and a VL comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 115; or (f) a VH comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 114, and a VL comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 116.

[0256] In some embodiments, the anti-CD20 moiety or antigen binding fragment (is an anti-CD20 scFv. In some embodiments, the anti-CD20 scFv comprises the amino acid sequence of any of SEQ ID NOs: 117-128, or a variant thereof (e.g., comprising insertion (s) , deletion (s) , and / or substitution (s) , such as conservative substitution (s) ) having at least about 80% (such as at least about any one of 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or more) sequence identity to the amino acid sequence of any of SEQ ID NOs: 117-128. In some embodiments, the anti-CD20 scFv comprising the amino acid sequence of any of SEQ ID NOs: 117-128.

[0257] In some embodiments, the anti-CD20 moiety or antigen binding fragment is an anti-CD20 Fab fragment. In some embodiments, the anti-CD20 Fab fragment comprises: (i) a first polypeptide comprising the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 139-144, or a variant thereof (e.g., comprising insertion (s) , deletion (s) , and / or substitution (s) , such as conservative substitution (s) ) having at least about 80% (such as at least about any one of 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or more) sequence identity to the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 139-144, and (ii) a second polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 129-138, or a variant thereof (e.g., comprising insertion (s) , deletion (s) , and / or substitution (s) , such as conservative substitution (s) ) having at least about 80% (such as at least about any one of 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or more) sequence identity to the amino acid sequence of any of SEQ ID NOs: 129-138. In some embodiments, the anti-CD20 Fab fragment comprises: (a) a first polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 139, and a second polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 129 or 130; (b) a first polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 140, and a second polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 131 or 132; (c) a first polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 141, and a second polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 133 or 134; (d) a first polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 142, and a second polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 131 or 132; (e) a first polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 143, and a second polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 135 or 136; or (f) a first polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 144, and a second polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 137 or 138. In some embodiments, the first polypeptide and / or the second polypeptide of the anti-CD20 Fab fragment do not comprise a hinge or portion thereof (e.g., SEQ ID NO: 81 or 82) at the C-terminus of the first polypeptide and / or the second polypeptide. Linkers

[0258] The MSAPs (such as TSAPs or BSAPs) described herein may comprise a linker (such as a peptide linker) connecting the Fab fragment (e.g., N’ of VH, N’ of VL, C’ of CH1, and / or C’ of CL) and the first antigen binding fragment (e.g., scFv) , and / or connecting the Fab fragment (e.g., N’ of VH, N’ of VL, C’ of CH1, and / or C’ of CL) and the second antigen binding fragment (e.g., scFv) . In some embodiments, the first antigen binding fragment and / or the second antigen binding fragment is an scFv. In some embodiments, the scFv comprises a linker (e.g., peptide linker; sometimes referred to as “linker peptide” herein) connecting the VH and the VL. In some embodiments, the first antigen binding fragment is directly fused to the Fab fragment, and / or the second antigen binding fragment is directly fused to the Fab fragment. In some embodiments, the first antigen binding fragment is fused to the Fab fragment via a first linker, and / or the second antigen binding fragment is fused to the Fab fragment via a second linker. The first linker and the second linker can be the same or different. In some embodiments, the linker (such as peptide linker) connecting the VH and the VL of an scFv may be the same or different from one or both of the linkers between the Fab fragment and the first scFv and / or the second scFv. The linker within an scFv, the linker between the Fab fragment and the first scFv and / or the second scFv can be independently present or absent.

[0259] In some embodiments, the linker is not a peptide linker. In some embodiments, the linker is a peptide linker.

[0260] The linker can be a peptide linker of any length. In some embodiments, the peptide linker is from about 1 to about 10 amino acids (aa) long, from about 2 to about 15 aa long, from about 3 to about 12 aa long, from about 4 to about 10 aa long, from about 5 to about 9 aa long, from about 1 to about 20 aa long, from about 21 to about 30 aa long, from about 1 to about 30 aa long, from about 10 to about 30 aa long, from about 2 to about 19 aa long, from about 2 to about 18 aa long, from about 2 to about 17 aa long, from about 2 to about 16 aa long, from about 2 to about 10 aa long, from about 2 to about 14 aa long, from about 2 to about 13 aa long, from about 2 to about 12 aa long, from about 2 to about 11 aa long, from about 2 to about 9 aa long, from about 2 to about 8 aa long, from about 2 to about 7 aa long, from about 2 to about 6 aa long, or from about 2 to about 5 aa long. In some embodiments, the peptide linker is any of 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, or 20 aa long. In some embodiments, the peptide linker is any of 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, or 30 aa long. In some embodiments, the peptide linker is about 2 to about 30 aa long, such as about 2 to about 15 amino acids long, about 15 amino acids long, about 6 amino acids long, about 2 aa long, or about 5 aa long.

[0261] A peptide linker can have a naturally occurring sequence or a non-naturally occurring sequence. For example, a sequence derived from the hinge region of a heavy chain only antibody can be used as a linker. See, for example, WO1996 / 34103. In some embodiments, the peptide linker is derived from a human IgG1 or IgG4 hinge. In some embodiments, the linker is a flexible linker. Exemplary flexible linkers include glycine polymers (G) n, glycine-serine polymers (including, for example, (GS) n (SEQ ID NO: 177) , (GSGGS) n (SEQ ID NO: 172) , (GGGS) n (SEQ ID NO: 173) , or (GGGGS) n (SEQ ID NO: 174) , where n is an integer of at least one) , glycine-alanine polymers, alanine-serine polymers, and other flexible linkers known in the art. Glycine and glycine-serine polymers are relatively unstructured, and therefore may be able to serve as a neutral tether between components. Glycine accesses significantly more phi-psi space than even alanine and is much less restricted than residues with longer side chains (see Scheraga, Rev. Computational Chem. 11 173-142 (1992) ) . In some embodiments, the linker comprises amino acid residues selected form the group consisting of glycine, serine, arginine, and alanine. Exemplary flexible linkers include, but are not limited to GG, GGSG (SEQ ID NO: 75) , GGSGG (SEQ ID NO: 76) , GSGSG (SEQ ID NO: 77) , GSGGG (SEQ ID NO: 78) GGGSG (SEQ ID NO: 79) , GSSSG (SEQ ID NO: 80) , GSGGS (SEQ ID NO: 72) , GGGS (SEQ ID NO: 73) , GGGGS (SEQ ID NO: 74) , GGSGGS (SEQ ID NO: 69) , SGGGGS (SEQ ID NO: 66) , GRAGGGGAGGGG (SEQ ID NO: 70) , GRAGGG (SEQ ID NO: 71) , GGGGSGGGGSGS (SEQ ID NO: 67) , GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 68) , GGGGS (SEQ ID NO: 65) , and the like. In some embodiments, the linker between the Fab fragment and the antigen binding fragment (e.g., first antigen binding fragment or second antigen binding fragment, such as scFv) comprises the amino acid sequence of any of GG and SEQ ID NOs: 65-68 and 74. In some embodiments, the linker connecting the VH and the VL of the scFv, the first scFv, and / or the second scFv comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 66 or 68. The ordinarily skilled artisan will recognize that design of a MSAP (such as TSAP or BSAP) can include linkers that are all or partially flexible, such that the linker can include a flexible linker portion as well as one or more portions that confer less flexible structure to provide a desired MSAP structure.

[0262] In some embodiments, the linker between the Fab fragment and the first or second antigen binding fragment (e.g., scFv) is a stable linker (not cleavable by protease, especially MMPs) .

[0263] In some embodiments, the linker is a cleavable linker. In some embodiments, the linker between the Fab fragment and the first or second antigen binding fragment (e.g., scFv) comprises a protease substrate cleavage sequence, for example, an MMP substrate cleavage sequence. Substrate sequences that can be cleaved by MMPs have been extensively studied. For example, the sequence of PLGLAG (SEQ ID NO: 83) can be cleaved by most MMPs. In some embodiments, the protease cleavage site is recognized by MMP-2, MMP-9, or a combination thereof.

[0264] In some embodiments, a linker (e.g., optional linker) is denoted as L, or as L1, L2, L3, L4 and so on when there are 1, 2, 3, 4, or more linkers (e.g., optional linkers) . The linker L1, L2, L3 in Formula Ia, Ib, IIIa, IIIb, IIIc, IIId, and IIIe can be independently present or absent, and can be independently selected from the group consisting of GG, GS, and SEQ ID NOs: 65-80 and 172-176 (e.g., any of GG and SEQ ID NO: 65-68 and 74) . III. MSAPs specifically recognizing CD3 and CD20

[0265] The present invention in another aspect provides multispecific antigen binding proteins (MSAPs) , such as TSAPs or BSAPs, that specifically bind CD3 and CD20. In some embodiments, there is provided a CD3×CD20 MSAP (e.g., CD3×CD20 BSAP) comprising: (i) an anti-CD3 Fab fragment that specifically binds to CD3, and (ii) an anti-CD20 antigen binding fragment (e.g., scFv) that specifically binds to CD20. In some embodiments, the anti-CD20 antigen binding fragment is fused to the N-terminus of the VH or the VL of the anti-CD3 Fab fragment via an optional linker. In some embodiments, the anti-CD20 antigen binding fragment is an anti-CD20 scFv. The scFv may comprise a linker (e.g., linker peptide) between its VH and VL. Any of the anti-CD3 moieties, antibodies or antigen binding fragments thereof described herein, any of the anti-CD20 moieties, antibodies or antigen binding fragments thereof described herein, and any of the linkers described herein, such as those described under Section II above, can be used as the anti-CD3 Fab fragment, the anti-CD20 antigen binding fragment, and / or linker (s) in any of the CD3×CD20 MSAPs (such as BSAPs) described herein.

[0266] In some embodiments, the CD3×CD20 MSAP comprises two anti-CD20 antigen binding fragments (e.g., scFvs) . In some embodiments, the CD3×CD20 MSAP comprising two anti-CD20 antigen binding fragments (e.g., scFvs) is trivalent and trispecific (also referred to as “CD3×CD20 TSAP” ) , i.e., the two anti-CD20 antigen binding fragments specifically bind to different epitopes of CD20. In some embodiments, the CD3×CD20 MSAP comprising two anti-CD20 antigen binding fragments (e.g., scFvs) is trivalent and bispecific (also referred to as “CD3×CD20 BSAP” ) , i.e., the two anti-CD20 antigen binding fragments specifically bind to the same CD20 epitope. In some embodiments, the CD3×CD20 MSAP is bivalent and bispecific (also referred to as “CD3×CD20 BSAP” ) . In some embodiments, the CD3×CD20 MSAP (such as BSAP) comprises two anti-CD20 scFvs having the same amino acid sequence. In some embodiments, the CD3×CD20 MSAP comprises two anti-CD20 scFvs having different amino acid sequences. Exemplary CD3×CD20 MSAPs are shown in FIGs. 12A-12B.

[0267] In some embodiments, there is provided a an MSAP comprising: (i) an anti-CD3 Fab fragment that specifically binds to CD3, wherein the anti-CD3 Fab fragment comprises: (a) a VH and a CH1; and (b) a VL and a CL; and (ii) an anti-CD20 antigen binding fragment (e.g., scFv) that specifically binds to CD20. In some embodiments, the anti-CD20 antigen binding fragment is fused to the N-terminus of the VH of the anti-CD3 Fab fragment via an optional linker. In some embodiments, the anti-CD20 antigen binding fragment is fused to the N-terminus of the VL of the anti-CD3 Fab fragment via an optional linker. In some embodiments, the anti-CD20 antigen binding fragment is an anti-CD20 scFv. In some embodiments, the MSAP comprises a first anti-CD20 antigen binding fragment (e.g., scFv) and a second anti-CD20 antigen binding fragment (e.g., scFv) . Hence in some embodiments, there is provided a an MSAP comprising: (i) an anti-CD3 Fab fragment that specifically binds to CD3, wherein the anti-CD3 Fab fragment comprises: (a) a VH and a CH1; and (b) a VL and a CL; (ii) a first anti-CD20 antigen binding fragment (e.g., scFv) that specifically binds to CD20; and (iii) a second anti-CD20 antigen binding fragment (e.g., scFv) that specifically binds to CD20. In some embodiments, the first anti-CD20 antigen binding fragment is fused to the N-terminus of the VH of the anti-CD3 Fab fragment via an optional first linker, and the second anti-CD20 antigen binding fragment is fused to the N-terminus of the VL of the anti-CD3 Fab fragment via an optional second linker. The first linker and the second linker can be the same or different, and can be independently present or absent. In some embodiments, the first anti-CD20 antigen binding fragment and the second anti-CD20 antigen binding fragment are each an anti-CD20 scFv. In some embodiments, the first anti-CD20 scFv and the second anti-CD20 scFv have the same amino acid sequence. In some embodiments, the VH and the VL of the anti-CD20 scFv, the first anti-CD20 scFv, and / or the second anti-CD20 scFv, independently, are connected by an optional linker peptide. The linker peptide within an anti-CD20 scFv can be the same or different from the linker connecting an anti-CD20 scFv and the anti-CD3 Fab fragment, and can be independently present or absent. In some embodiments, the optional linker, the optional first linker, the optional second linker, and / or the optional linker peptide each independently comprises about 2 to about 30 amino acid residues selected from the group consisting of glycine, serine, arginine, and alanine. In some embodiments, the optional linker, the optional first linker, the optional second linker, and / or the optional linker peptide each independently comprises an amino acid sequence selected from the group consisting of GG, GS, and SEQ ID NOs: 65-80 and 172-176 (e.g., any of GG and SEQ ID NO: 65-68 and 74) . In some embodiments, the CH1 and the CL of the anti-CD3 Fab fragment are connected by a disulfide bond (e.g., 1, 2, 3, 4, 5, or more disulfide bonds) , such as about 1 to about 5 disulfide bonds, for example 2 disulfide bonds. In some embodiments, the CH1 of the anti-CD3 Fab fragment comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 64, and / or the CL of the anti-CD3 Fab fragment comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 63 or 145. In some embodiments, the first polypeptide and / or the second polypeptide of the anti-CD3 Fab fragment each comprises a hinge or portion thereof at the C-terminus of the first polypeptide and / or the second polypeptide. In some embodiments, the first polypeptide and / or the second polypeptide of the anti-CD3 Fab fragment does not comprise a hinge or portion thereof at the C-terminus of the first polypeptide and / or the second polypeptide. In some embodiments, the hinge or portion thereof comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 81 or 82. In some embodiments, the anti-CD3 Fab fragment comprises: (a) an HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, an HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, an HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, an HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17, an HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18, and an HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19; (b) an HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, an HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 85, an HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 86, an HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17, an HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18, and an HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19; or (c) an HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, an HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 87, an HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, an HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17, an HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18, and an HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19. In some embodiments, the VH of the anti-CD3 Fab fragment comprises an amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 32, 88, and 89, and the VL of the anti-CD3 Fab fragment comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 33. In some embodiments, the anti-CD3 Fab fragment comprises a first polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 60, 96, and 97, and a second polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 61 or 98. In some embodiments, the anti-CD20 antigen binding fragment, the first anti-CD20 antigen binding fragment, and / or the second anti-CD20 antigen binding fragment, each independently comprises: (a) an HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, an HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8, an HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9, an HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 23, an HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 24, and an HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 25; (b) an HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10, an HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11, an HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12, an HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26, an HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 27, and an HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 28; (c) an HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13, an HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14, an HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15, an HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 29, an HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 30, and an HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 31; (d) an HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10, an HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11, an HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12, an HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26, an HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 27, and an HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 28; or (e) an HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, an HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8, an HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 109, an HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 110, an HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 111, and an HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 112. In some embodiments, the anti-CD20 antigen binding fragment, the first anti-CD20 antigen binding fragment, and / or the second anti-CD20 antigen binding fragment, each independently comprises: (a) a VH comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 36, and a VL comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 37; (b) a VH comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 38, and a VL comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 39; (c) a VH comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 40, and a VL comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 41; (d) a VH comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 42, and a VL comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 39; (e) a VH comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 113, and a VL comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 115; or (f) a VH comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 114, and a VL comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 116. In some embodiments, the anti-CD20 antigen binding fragment, the first anti-CD20 antigen binding fragment, and / or the second anti-CD20 antigen binding fragment is independently an scFv. In some embodiments, the anti-CD20 scFv, the first anti-CD20 scFv, and / or the second anti-CD20 scFv each independently comprises an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 117-128.

[0268] In some embodiments, there is provided an MSAP (e.g., TSAP or BSAP) comprising: (i) an anti-CD3 Fab fragment that specifically binds to CD3, wherein the anti-CD3 Fab fragment comprises: (a) a VH and a CH1; and (b) a VL and a CL; and (ii) an anti-CD20 scFv that specifically binds to CD20; wherein the anti-CD20 scFv is fused to the N-terminus of the VH or the VL of the anti-CD3 Fab fragment via an optional linker. In some embodiments, the anti-CD3 Fab fragment comprises: (a) an HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, an HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, an HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, an HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17, an HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18, and an HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19; (b) an HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, an HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 85, an HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 86, an HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17, an HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18, and an HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19; or (c) an HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, an HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 87, an HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, an HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17, an HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18, and an HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19. In some embodiments, the VH of the anti-CD3 Fab fragment comprises an amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 32, 88, and 89, and the VL of the anti-CD3 Fab fragment comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 33. In some embodiments, the anti-CD3 Fab fragment comprises a first polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 60, 96, and 97, and a second polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 61 or 98. In some embodiments, the anti-CD20 scFv comprises: (a) an HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, an HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8, an HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9, an HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 23, an HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 24, and an HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 25; (b) an HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10, an HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11, an HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12, an HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26, an HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 27, and an HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 28; (c) an HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13, an HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14, an HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15, an HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 29, an HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 30, and an HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 31; (d) an HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10, an HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11, an HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12, an HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26, an HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 27, and an HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 28; or (e) an HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, an HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8, an HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 109, an HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 110, an HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 111, and an HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 112. In some embodiments, the anti-CD20 scFv comprises: (a) a VH comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 36, and a VL comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 37; (b) a VH comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 38, and a VL comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 39; (c) a VH comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 40, and a VL comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 41; (d) a VH comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 42, and a VL comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 39; (e) a VH comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 113, and a VL comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 115; or (f) a VH comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 114, and a VL comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 116. In some embodiments, the anti-CD20 scFv comprises an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 117-128. In some embodiments, the linker comprises an amino acid sequence of any of GG and SEQ ID NO: 65-68 and 74.

[0269] In some embodiments, there is provided a an MSAP comprising: (i) an anti-CD3 Fab fragment that specifically binds to CD3, wherein the anti-CD3 Fab fragment comprises: (a) a VH and a CH1; and (b) a VL and a CL; (ii) a first anti-CD20 scFv that specifically binds to CD20; and (iii) a second anti-CD20 scFv that specifically binds to CD20; wherein the first anti-CD20 scFv is fused to the N-terminus of the VH of the anti-CD3 Fab fragment via an optional first linker, and the second anti-CD20 scFv is fused to the N-terminus of the VL of the anti-CD3 Fab fragment via an optional second linker. The first anti-CD20 scFv and the second anti-CD20 scFv can have the same or different amino acid sequences. In some embodiments, the optional first linker and the optional second linker each independently comprises an amino acid sequence selected from the group consisting of GG and SEQ ID NO: 65-68 and 74. In some embodiments, the anti-CD3 Fab fragment comprises: (a) an HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, an HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, an HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, an HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17, an HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18, and an HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19; (b) an HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, an HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 85, an HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 86, an HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17, an HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18, and an HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19; or (c) an HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, an HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 87, an HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, an HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17, an HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18, and an HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19. In some embodiments, the VH of the anti-CD3 Fab fragment comprises an amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 32, 88, and 89, and the VL of the anti-CD3 Fab fragment comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 33. In some embodiments, the anti-CD3 Fab fragment comprises a first polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 60, 96, and 97, and a second polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 61 or 98. In some embodiments, the first anti-CD20 scFv and the second anti-CD20 scFv each independently comprises: (a) an HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, an HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8, an HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9, an HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 23, an HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 24, and an HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 25; (b) an HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10, an HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11, an HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12, an HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26, an HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 27, and an HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 28; (c) an HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13, an HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14, an HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15, an HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 29, an HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 30, and an HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 31; (d) an HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10, an HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11, an HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12, an HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26, an HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 27, and an HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 28; or (e) an HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, an HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8, an HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 109, an HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 110, an HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 111, and an HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 112. In some embodiments, the first anti-CD20 scFv and the second anti-CD20 scFv each independently comprises: (a) a VH comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 36, and a VL comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 37; (b) a VH comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 38, and a VL comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 39; (c) a VH comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 40, and a VL comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 41; (d) a VH comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 42, and a VL comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 39; (e) a VH comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 113, and a VL comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 115; or (f) a VH comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 114, and a VL comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 116. In some embodiments, the first anti-CD20 scFv and the second anti-CD20 scFv each comprises an amino acid sequence independently selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 117-128.

[0270] In some embodiments, there is provided an CD3×CD20 MSAP (e.g., BSAP) comprising a polypeptide and a fusion polypeptide, wherein the polypeptide comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 60, or an amino acid sequence having at least about 85% (such as at least about any of 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or more) sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 60, and wherein the fusion polypeptide comprises the amino acid sequence of any of SEQ ID NOs: 45, 51-53, 151, and 153, or an amino acid sequence having at least about 85% (such as at least about any of 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or more) sequence identity to the amino acid sequence of any of SEQ ID NOs: 45, 51-53, 151, and 153. In some embodiments, the MSAP comprises a polypeptide and a fusion polypeptide, wherein: (i) the polypeptide comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 60, and the fusion polypeptide comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 51 (herein also referred to as “IM-320-C21 MSAP” ) ; (ii) the polypeptide comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 60, and the fusion polypeptide comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 52 (herein also referred to as “IM-320-C22 MSAP” ) ; (iii) the polypeptide comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 60, and the fusion polypeptide comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 53 (herein also referred to as “IM-320-C23 MSAP” ) ; or (iv) the polypeptide comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 60, and the fusion polypeptide comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 153 (herein also referred to as “IM-320-C24 MSAP” ) . The hinge or portion thereof (e.g., SEQ ID NO: 81) at the C-terminus of the polypeptide and / or the fusion polypeptide can be replaced with another hinge or portion thereof (e.g., SEQ ID NO: 82) capable of forming an intermolecular disulfide bond, or can be absent.

[0271] In some embodiments, there is provided an CD3×CD20 MSAP (e.g., TSAP or BSAP) comprising a first fusion polypeptide and a second fusion polypeptide, wherein the first fusion polypeptide comprises the amino acid sequence of any of SEQ ID NOs: 146-150 and 152, or an amino acid sequence having at least about 85% (such as at least about any of 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or more) sequence identity to the amino acid sequence of any of SEQ ID NOs: 146-150 and 152, and wherein the second fusion polypeptide comprises the amino acid sequence of any of SEQ ID NOs: 45, 51-53, 151, and 153, or an amino acid sequence having at least about 85% (such as at least about any of 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or more) sequence identity to the amino acid sequence of any of SEQ ID NOs: 45, 51-53, 151, and 153. In some embodiments, the MSAP comprises a first fusion polypeptide and a second fusion polypeptide, wherein: (i) the first fusion polypeptide comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 146, and the second fusion polypeptide comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 45 (herein also referred to as “IM-320-C15 MSAP” ) ; (ii) the first fusion polypeptide comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 147, and the second fusion polypeptide comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 51 (herein also referred to as “IM-320-C16 MSAP” ) ; (iii) the first fusion polypeptide comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 148, and the second fusion polypeptide comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 52 (herein also referred to as “IM-320-C17 MSAP” ) ; (iv) the first fusion polypeptide comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 149, and the second fusion polypeptide comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 53 (herein also referred to as “IM-320-C18 MSAP” ) ; (v) the first fusion polypeptide comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 150, and the second fusion polypeptide comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 151 (herein also referred to as “IM-320-C19 MSAP” ) ; or (vi) the first fusion polypeptide comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 152, and the second fusion polypeptide comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 153 (herein also referred to as “IM-320-C20 MSAP” ) . The hinge or portion thereof (e.g., SEQ ID NO: 81) at the C-terminus of the first fusion polypeptide and / or the second fusion polypeptide can be replaced with another hinge or portion thereof (e.g., SEQ ID NO: 82) capable of forming an intermolecular disulfide bond, or can be absent.

[0272] In some embodiments, the N-terminus and / or C-terminus of the first and / or the second polypeptide (e.g., fusion polypeptide) of the CD3×CD20 MSAP further comprises a purification tag (e.g., a histidine tag, HIS-tag, an HA tag, a PHE-tag, a Myc tag, a V5 tag, a FLAG tag, a  aGST tag, a HiBiT tag, a calmodulin binding peptide, a maltose-binding protein, a Strep-tag, a biotin tag) for protein purification.

[0273] In some embodiments, the N-terminus of the first and / or the second polypeptide (e.g., fusion polypeptide) of the CD3×CD20 MSAP further comprises a signal peptide (e.g., for better expression) . In some embodiments, the signal peptide comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 84. In some embodiments, the signal peptide is cleaved in the mature MSAPs (e.g., secreted MSAPs from host cells) .

[0274] The present invention further provides fusion proteins or recombinant proteins comprising any of the CD3×CD20 MSAPs (such as BSAPs) described herein and other sequence (s) , such as a recombinant protein (or fusion protein) comprising any of the CD3×CD20 MSAPs described herein and a tag sequence that can assist expression and / or purification. In some embodiments, the tag sequence comprises a “6×His” tag, a “GGGS” (SEQ ID NO: 73) sequence, or a “FLAG” tag.

[0275] The present invention also provides antibody conjugates comprising any of the CD3×CD20 MSAPs described herein and a conjugate portion conjugated to the MSAP. In some embodiments, the conjugate portion is a detectable marker (e.g., radionuclide) , a drug (e.g., a toxin, a cytokine, or an enzyme) , or any combination thereof. The MSAP conjugate can be a small molecule drug conjugate or a detection tag conjugate. The conjugate portion can be selected from the group consisting of fluorescent or luminescent markers, radioactive markers, MRI (magnetic resonance imaging) or CT (computer tomography) contrast agents, enzymes capable of producing detectable products, radionuclides, biotoxins, cytokines (such as IL-2, etc. ) , gold nanoparticles / nanorods, nanomagnetic particles, prodrug activating enzymes (e.g., DT-diaphorase (DTD) or biphenyl hydrolase-like protein (BPHL) ) , chemotherapeutic agents (e.g., cisplatin) , and any form of nanoparticles. The conjugation can be via chemical bond or a linker.

[0276] Also provided are isolated nucleic acid (s) encoding any of the CD3×CD20 MSAPs (e.g., CD3×CD20 BSAPs) described herein (or the MSAP portion of an MSAP conjugate) , vector (s) (e.g., viral vector, such as lentiviral vector or AAV) comprising such isolated nucleic acid (s) , and host cells (prokaryotic or eukaryotic) comprising such isolated nucleic acid (s) or vector (s) expressing any of the MSAPs described herein. IV. Antibody-drug conjugates

[0277] The present invention also provides antibody-drug conjugate (ADC) comprising any of the CD3×CD20×CD19 or CD3×CD20 MSAPs of the present invention and an effector molecule.

[0278] Typically, an ADC comprises an antibody portion and an effector molecule, wherein the antibody portion is coupled to the effector molecule, and preferably chemically coupled. The effector molecule can be a drug with therapeutic activity. In some embodiments, the effector molecule is one or more of a toxic protein, a chemotherapeutic drug, a small molecule drug, or a radionuclide.

[0279] The MSAPs of the present invention and an effector molecule may be coupled via a coupling agent. Examples of the coupling agent may be any one or more of a non-selective coupling agent, a coupling agent using a carboxyl group, a peptide chain, and a coupling agent using a disulfide bond. A non-selective coupling agent can be a compound that forms a covalent bond between the effector molecule and the MSAP, such as glutaraldehyde. A coupling agent using a carboxyl group may be any one or more of a cis-aconitic anhydride coupling agent (such as cis-aconitic anhydride) and an acylhydrazone coupling agent (the coupling site is an acylhydrazone) .

[0280] Certain residues on antibodies or antigen-binding proteins (such as Cys or Lys, etc. ) can be used to attach a variety of functional groups, including imaging agents (e.g., chromophores and fluorophores) , diagnostic agents (e.g., MRI contrast agents and radioisotopes) , stabilizers (e.g., glycol polymers) and therapeutic agents. Antibodies or antigen-binding proteins can be conjugated (e.g., covalently linked) to functional agents (e.g., drugs, detection agents, stabilizers) to form antibody-functional agent conjugates. Functional agents can be directly or indirectly linked to antibodies or antigen-binding proteins through linkers.

[0281] ADCs can contain linkers between the effector molecule (e.g., drug) and the antibody portion (or antigen-binding protein) . Linkers can be degradable or non-degradable linkers. Degradable linkers are typically easily degraded in the intracellular environment, such as degradation of the linker at the target site, thereby releasing the drug from the antibody portion. Suitable degradable linkers include, for example, enzyme-degradable linkers, including linkers containing peptidyl groups that can be degraded by intracellular proteases (e.g., lysosomal proteases or endosomal proteases) , or sugar linkers, such as glucuronide-containing linkers that can be degraded by glucuronidase. Peptidyl linkers can include, for example, dipeptides such as valine-citrulline, phenylalanine-lysine, or valine-alanine. Other suitable degradable linkers include, for example, pH-sensitive linkers (e.g., linkers that hydrolyze at pH less than 5.5, such as hydrazone linkers) and linkers that degrade under reducing conditions (e.g., disulfide linkers) . Non-degradable linkers typically release the drug under conditions where the antibody (or antigen-binding protein) is hydrolyzed by proteases.

[0282] Prior to being attached to the antibody (or antigen-binding protein) , the linker has an active reactive group that can react with certain amino acid residues, and the connection is achieved through the active reactive group. Thiol-specific reactive groups are preferred and include, for example, maleimides, halogenated amides (e.g., iodinated, brominated, or chlorinated) ; halogenated esters (e.g., iodinated, brominated, or chlorinated) ; halogenated methyl ketones (e.g., iodinated, brominated, or chlorinated) , benzyl halides (e.g., iodinated, brominated, or chlorinated) ; vinyl sulfones, pyridyl disulfides; mercury derivatives such as 3, 6-di- (mercurymethyl) dioxane, where the counter ion is acetate, chloride, or nitrate; and polymethylene dimethyl sulfide thiosulfonate. The linker may include, for example, a maleimide linked to the antibody via thiosuccinimide.

[0283] The drug may be any cytotoxic, cytostatic, or immunosuppressive drug. In embodiments, a linker links the antibody (or antigen-binding protein) and the drug, and the drug has a functional group that can form a bond with the linker. For example, the drug may have an amino, carboxyl, thiol, hydroxyl, or keto group that can form a bond with the linker. In the case where the drug is directly linked to the linker, the drug has a reactive group that reacts prior to being linked to the antibody.

[0284] Useful drug classes include, for example, anti-tubulin drugs, DNA minor groove binding agents, DNA replication inhibitors, alkylating agents, antibiotics, folate antagonists, antimetabolites, chemosensitizers, topoisomerase inhibitors, vinca alkaloids, and the like. Examples of particularly useful cytotoxic drugs include, for example, DNA minor groove binding agents, DNA alkylating agents, and tubulin inhibitors. Typical cytotoxic drugs include, for example, auristatins, camptothecins, duocarmycins, etoposides, maytansines and maytansinoids (e.g., DM1 and DM4) , taxanes, benzodiazepines or benzodiazepine containing drugs (e.g., pyrrolo [1, 4] benzodiazepines (PBDs) , indolinobenzodiazepines, and oxazolidinobenzodiazepines) , and vinca alkaloids.

[0285] In some embodiments, , drug-linkers can be used to form ADCs in one simple step. In other embodiments, bifunctional linker compounds can be used to form ADCs in a two-step or multi-step process. For example, a cysteine residue in the antibody (or antigen-binding protein) is reacted with a reactive moiety of a linker in a first step, and in a subsequent step, a functional group on the linker is reacted with a drug to form an ADC.

[0286] Typically, a functional group on the linker is selected to facilitate specific reaction with a suitable reactive group on the drug moiety. As a non-limiting example, an azide-based moiety can be used to specifically react with a reactive alkynyl group on a drug moiety. The drug can be covalently bound to the linker by a 1, 3-dipolar cycloaddition between the azide and the alkynyl group. Other useful functional groups include, for example, ketones and aldehydes (suitable for reaction with hydrazides and alkoxyamines) , phosphines (suitable for reaction with azides) ; isocyanates and isothiocyanates (suitable for reaction with amines and alcohols) ; and activated esters, such as N-hydroxysuccinimide esters (suitable for reaction with amines and alcohols) . These and other linking strategies, such as those described in Bioconjugation Technology, 2nd Edition (Elsevier) , are well known to those skilled in the art. Those skilled in the art will appreciate that for the selective reaction of the drug moiety and the linker, when a reactive functional group of a complementary pair is selected, each member of the complementary pair can be used for both the linker and the drug.

[0287] In some embodiments, the present invention also provides a method for preparing an ADC (or MSAP-drug conjugate) , which may include: combining an MSAP (such as any of the MSAPs described herein) with a drug-linker compound under conditions sufficient to form an ADC. In certain embodiments, the method comprises: combining an MSAP with a bifunctional linker compound under conditions sufficient to form an antibody-linker conjugate. In some embodiments, the method further comprises: combining the MSAP-linker conjugate with the drug moiety under conditions sufficient to covalently link the drug moiety to the MSAP via the linker. V. Methods of preparation of MSAPs

[0288] Also provided are methods of making any of the CD3×CD20×CD19 MSAPs (e.g., TSAPs) and CD3×CD20 MSAPs (e.g., BSAPs or TSAPs) described herein. See Examples 1 and 4 for exemplary methods.

[0289] The MSAPs described herein may be prepared by any of the known protein expression and purification methods in the art. DNA sequence encoding the MSAPs can be fully synthesized. After obtaining such sequence, it is cloned into a suitable expression vector, then transfected into a suitable host cell. The transfected host cells are cultured, and the supernatant is harvested and purified to obtain the MSAPs described herein. MSAPs can also be produced by chemical cross-linking or hybridoma technology. Alternatively, MSAPs can be produced by recombinant technology, for example, by connecting one or more scFv molecules to a Fab fragment through a connecting peptide. The length of the connecting peptide can be between 4 and 15 amino acids. The connecting peptide can be composed of multiple amino acids, such as a repeating unit of GGGGS (SEQ ID NO: 65) .

[0290] The present application also provides isolated nucleic acids encoding one or more of the polypeptides of any one of the CD3×CD20×CD19 MSAPs and CD3×CD20 MSAPs described herein, or fragments thereof. In some embodiments, the isolated nucleic acid at its 5’ end further comprises a nucleic acid encoding a signal peptide sequence, such as nucleic acid encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 84. The isolated nucleic acids may be DNA or RNA. DNA forms can include cDNA, genomic DNA or artificially synthesized DNA. DNA may be single-stranded or double-stranded. DNA may be a coding strand or a non-coding strand. The coding region sequence encoding the mature polypeptide may be the same as the coding region sequence of the MSAPs of the present invention or may be a degenerate variant. For example, a degenerate variant of a nucleic acid sequence can be a nucleic acid sequence encoding an amino acid sequence identical to the polypeptide of the MSAPs of the present invention but having a different coding region sequence.

[0291] A polynucleotide encoding the mature polypeptide of the MSAP can be: a coding sequence encoding only a mature polypeptide; a coding sequence of a mature polypeptide and various additional coding sequences; a coding sequence of a mature polypeptide (and optional additional coding sequences) and non-coding sequences. A polynucleotide encoding a polypeptide may comprise a polynucleotide sequence encoding the polypeptide or may comprise additional coding and / or non-coding sequences.

[0292] The present invention also provides polynucleotides that hybridize with any of the above-mentioned nucleic acid sequences and have at least 50%, preferably at least 70%, and more preferably at least 80%sequence identity between the two sequences. In some embodiments, the present invention provides polynucleotides that can hybridize with a polynucleotide encoding any of the MSAPs of the present invention under stringent conditions. A stringent condition can be: (1) hybridization and elution at relatively low ionic strength and relatively high temperature, such as 0.2×SSC, 0.1%SDS, 60℃; or (2) the addition of a denaturant during hybridization, such as 50% (v / v) formamide, 0.1%calf serum / 0.1%Ficoll, 42℃, etc.; or (3) hybridization occurs only when the identity between the two sequences is at least 90%, preferably at least 95%. In some embodiments, the polypeptide encoded by the hybridizable polynucleotide has the same biological function and activity as the mature polypeptide of the MSAPs of the present invention.

[0293] The nucleotide sequence of the MSAPs described herein or its fragments can usually be obtained by PCR amplification, recombination or artificial synthesis. One feasible method is to synthesize the relevant sequence by artificial synthesis, especially when the fragment length is relatively short. Generally, a fragment with a very long sequence can be obtained by synthesizing multiple small fragments first and then connecting them. In some embodiments, , the coding sequence of a polypeptide chain and an expression tag (such as 6×His) can be fused together to form a sequence encoding a fusion protein.

[0294] The sequence of the DNA molecule encoding MSAPs or its fragment of the present invention can be obtained by conventional techniques, such as PCR amplification or genomic library screening. Once the relevant sequence is obtained, the relevant sequence can be obtained in large quantities by recombinant methods. This is usually cloned into a vector, then transferred into a cell, and then the relevant sequence is isolated from the host cell after proliferation by conventional methods.

[0295] A DNA sequence encoding the MSAPs (or its fragment, or its derivative) described herein can be obtained completely by chemical synthesis. The DNA sequence can then be introduced into various existing DNA molecules (or such as vectors) and cells known in the art. Mutations can be introduced into the DNA sequences of the present invention by chemical synthesis.

[0296] In some embodiments, the isolated nucleic acid or polynucleotide is inserted into a vector, such as an expression vector, a viral vector, or a cloning vector. Hence also provided are vectors comprising any of the isolated nucleic acids or polynucleotides described herein.

[0297] For expression of the nucleic acids or polynucleotides, the v...

Claims

1.A multispecific antigen binding protein comprising three moieties, comprising:i) an anti-CD3 moiety that specifically binds to CD3;ii) an anti-CD19 moiety that specifically binds to CD19; andiii) an anti-CD20 moiety that specifically binds to CD20;wherein a first moiety of the three moieties is a Fab fragment, wherein the Fab fragment comprises a first polypeptide comprising a heavy chain variable region (VH) and a heavy chain constant region (CH1) , and a second polypeptide comprising a light chain variable region (VL) and a light chain constant region (CL) ;wherein a second moiety of the three moieties is a first antigen binding fragment;wherein a third moiety of the three moieties is a second antigen binding fragment; and wherein:(a) the first antigen binding fragment is fused to the N-terminus of the VH of the Fab fragment or to the C-terminus of the CH1 of the Fab fragment, and the second antigen binding fragment is fused to the N-terminus of the VL of the Fab fragment or to the C-terminus of the CL of the Fab fragment; or(b) the first antigen binding fragment is fused to the N-terminus of the VH or the VL of the Fab fragment, and the second antigen binding fragment is fused to the C-terminus of the CH1 or the CL of the Fab fragment.2.The multispecific antigen binding protein of claim 1, wherein the anti-CD3 moiety is the Fab fragment ( “anti-CD3 Fab fragment” ) .3.The multispecific antigen binding protein of claim 2, wherein the anti-CD19 moiety is the first antigen binding fragment ( “anti-CD19 first antigen binding fragment” ) , and the anti-CD20 moiety is the second antigen binding fragment ( “anti-CD20 second antigen binding fragment” ) .4.The multispecific antigen binding protein of claim 2, wherein the anti-CD20 moiety is the first antigen binding fragment ( “anti-CD20 first antigen binding fragment” ) , and the anti-CD19 moiety is the second antigen binding fragment ( “anti-CD19 second antigen binding fragment” ) .5.The multispecific antigen binding protein of claim 1, wherein the anti-CD19 moiety is the Fab fragment ( “anti-CD19 Fab fragment” ) .6.The multispecific antigen binding protein of claim 5, wherein the anti-CD3 moiety is the first antigen binding fragment ( “anti-CD3 first antigen binding fragment” ) , and the anti-CD20 moiety is the second antigen binding fragment.7.The multispecific antigen binding protein of claim 5, wherein the anti-CD20 moiety is the first antigen binding fragment, and the anti-CD3 moiety is the second antigen binding fragment ( “anti-CD3 second antigen binding fragment” ) .8.The multispecific antigen binding protein of claim 1, wherein the anti-CD20 moiety is the Fab fragment ( “anti-CD20 Fab fragment” ) .9.The multispecific antigen binding protein of claim 8, wherein the anti-CD3 moiety is the first antigen binding fragment, and the anti-CD19 moiety is the second antigen binding fragment.10.The multispecific antigen binding protein of claim 8, wherein the anti-CD19 moiety is the first antigen binding fragment, and the anti-CD3 moiety is the second antigen binding fragment.11.The multispecific antigen binding protein of any one of claims 1-10, wherein the first antigen binding fragment and the second antigen binding fragment are independently selected from the group consisting of Fab, Fab’, Fab’-SH, F (ab’) 2, Fv, sdAb, scFv, and any combination thereof.12.The multispecific antigen binding protein of claim 11, wherein the first antigen binding fragment and the second antigen binding fragment are both scFv.13.The multispecific antigen binding protein of any one of claims 1-12, wherein the anti-CD19 moiety comprises: a heavy chain hypervariable region-1 (HVR-H1) comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, an HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, an HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, a light chain hypervariable region-1 (HVR-L1) comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20, an HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21, and an HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 99 or 22.14.The multispecific antigen binding protein of claim 13, wherein the anti-CD19 moiety comprises a VH comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 34, and a VL comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 35 or 100.15.The multispecific antigen binding protein of claim 13 or 14, wherein the anti-CD19 moiety is an anti-CD19 scFv, and wherein the anti-CD19 scFv comprises an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 101-104.16.The multispecific antigen binding protein of claim 13 or 14, wherein the anti-CD19 moiety is an anti-CD19 Fab fragment, and wherein the anti-CD19 Fab fragment comprises a first polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 105, and a second polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 59 and 106-108.17.The multispecific antigen binding protein of any one of claims 1-16, wherein the anti-CD3 moiety comprises:(a) an HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, an HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, an HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, an HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17, an HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18, and an HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19;(b) an HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, an HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 85, an HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 86, an HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17, an HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18, and an HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19; or(c) an HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, an HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 87, an HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, an HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17, an HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18, and an HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19.18.The multispecific antigen binding protein of claim 17, wherein the anti-CD3 moiety comprises a VH comprising the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 32, 88, and 89, and a VL comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 33.19.The multispecific antigen binding protein of claim 17 or 18, wherein the anti-CD3 moiety is an anti-CD3 scFv, and wherein the anti-CD3 scFv comprises the amino acid sequence of any of SEQ ID NOs: 90-95.20.The multispecific antigen binding protein of claim 17 or 18, wherein the anti-CD3 moiety is an anti-CD3 Fab fragment, and wherein the anti-CD3 Fab fragment comprises a first polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 60, 96, and 97, and a second polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 61 or 98.21.The multispecific antigen binding protein of any one of claims 1-20, wherein the anti-CD20 moiety comprises:(a) an HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, an HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8, an HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9, an HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 23, an HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 24, and an HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 25;(b) an HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10, an HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11, an HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12, an HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26, an HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 27, and an HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 28;(c) an HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13, an HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14, an HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15, an HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 29, an HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 30, and an HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 31;(d) an HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10, an HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16, an HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12, an HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26, an HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 27, and an HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 28; or(e) an HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, an HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8, an HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 109, an HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 110, an HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 111, and an HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 112.22.The multispecific antigen binding protein of claim 21, wherein the anti-CD20 moiety comprises:(a) a VH comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 36, and a VL comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 37;(b) a VH comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 38, and a VL comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 39;(c) a VH comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 40, and a VL comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 41;(d) a VH comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 42, and a VL comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 39;(e) a VH comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 113, and a VL comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 115; or(f) a VH comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 114, and a VL comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 116.23.The multispecific antigen binding protein of claim 21 or 22, wherein the anti-CD20 moiety is an anti-CD20 scFv, and wherein the anti-CD20 scFv comprises an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 117-128.24.The multispecific antigen binding protein of claim 21 or 22, wherein the anti-CD20 moiety is an anti-CD20 Fab fragment, and wherein the anti-CD20 Fab fragment comprises:(a) a first polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 139, and a second polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 129 or 130;(b) a first polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 140, and a second polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 131 or 132;(c) a first polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 141, and a second polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 133 or 134;(d) a first polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 142, and a second polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 131 or 132;(e) a first polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 143, and a second polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 135 or 136; or(f) a first polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 144, and a second polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 137 or 138.25.The multispecific antigen binding protein of any one of claims 1-4, 11-15, 17, 18, and 20-23, wherein the multispecific antigen binding protein comprises:(i) an anti-CD3 Fab fragment, an anti-CD19 first scFv, and an anti-CD20 second scFv; or(ii) an anti-CD3 Fab fragment, an anti-CD20 first scFv, and an anti-CD19 second scFv.26.The multispecific antigen binding protein of claim 25, wherein the multispecific antigen binding protein comprises:(i) a first fusion polypeptide comprising the anti-CD19 first scFv fused to the N-terminus of the VH of the anti-CD3 Fab fragment via an optional first linker; and(ii) a second fusion polypeptide comprising the anti-CD20 second scFv fused to the N-terminus of the VL of the anti-CD3 Fab fragment via an optional second linker.27.The multispecific antigen binding protein of claim 26, wherein:(a) the first fusion polypeptide comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 44, and the second fusion polypeptide comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 45;(b) the first fusion polypeptide comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 44, and the second fusion polypeptide comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 51;(c) the first fusion polypeptide comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 44, and the second fusion polypeptide comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 52;(d) the first fusion polypeptide comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 44, and the second fusion polypeptide comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 53; or(e) the first fusion polypeptide comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 44, and the second fusion polypeptide comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 55.28.The multispecific antigen binding protein of claim 25, wherein the multispecific antigen binding protein comprises:(i) a first fusion polypeptide comprising the anti-CD20 first scFv fused to the N-terminus of the VH of the anti-CD3 Fab fragment via an optional first linker; and(ii) a second fusion polypeptide comprising the anti-CD19 second scFv fused to the N-terminus of the VL of the anti-CD3 Fab fragment via an optional second linker.29.The multispecific antigen binding protein of claim 28, wherein the first fusion polypeptide comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 48, and the second fusion polypeptide comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 43.30.The multispecific antigen binding protein of claim 25, wherein the multispecific antigen binding protein comprises:(i) a first fusion polypeptide comprising the anti-CD19 first scFv fused to the C-terminus of the CH1 of the anti-CD3 Fab fragment via an optional first linker; and(ii) a second fusion polypeptide comprising the anti-CD20 second scFv fused to the N-terminus of the VL of the anti-CD3 Fab fragment via an optional second linker.31.The multispecific antigen binding protein of claim 30, wherein: the first fusion polypeptide comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 54, and the second fusion polypeptide comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 52.32.The multispecific antigen binding protein of any one of claims 1, 8-15, 17-19, 21, 22, and 24, wherein the multispecific antigen binding protein comprises:i) an anti-CD20 Fab fragment, an anti-CD19 first scFv, and an anti-CD3 second scFv; orii) an anti-CD20 Fab fragment, an anti-CD3 first scFv, and an anti-CD19 second scFv.33.The multispecific antigen binding protein of claim 32, wherein the multispecific antigen binding protein comprises:(i) a first fusion polypeptide comprising the anti-CD3 first scFv fused to the N-terminus of the VH of the anti-CD20 Fab fragment via an optional first linker; and(ii) a second fusion polypeptide comprising the anti-CD19 second scFv fused to the N-terminus of the VL of the anti-CD20 Fab fragment via an optional second linker.34.The multispecific antigen binding protein of claim 33, wherein the first fusion polypeptide comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 46, and the second fusion polypeptide comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 47.35.The multispecific antigen binding protein of any one of claims 1, 5-7, 11-14, 16-19, and 21-23, wherein the multispecific antigen binding protein comprises:i) an anti-CD19 Fab fragment, an anti-CD3 first scFv, and an anti-CD20 second scFv; orii) an anti-CD19 Fab fragment, an anti-CD20 first scFv, and an anti-CD3 second scFv.36.The multispecific antigen binding protein of claim 35, wherein the multispecific antigen binding protein comprises:(i) a first fusion polypeptide comprising the anti-CD3 first scFv fused to the N-terminus of the VH of the anti-CD19 Fab fragment via an optional first linker; and(ii) a second fusion polypeptide comprising the anti-CD20 second scFv fused to the N-terminus of the VL of the anti-CD19 Fab fragment via an optional second linker.37.The multispecific antigen binding protein of claim 36, wherein the first fusion polypeptide comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 49, and the second fusion polypeptide comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 50.38.A pharmaceutical composition comprising the multispecific antigen binding protein of any one of claims 1-37, and optionally a pharmaceutically acceptable carrier.39.A method of treating a disease associated with CD19 and / or CD20 in an individual, comprising administering to the individual an effective amount of the multispecific antigen binding protein of any one of claims 1-37 or the pharmaceutical composition of claim 38.40.The method of claim 39, wherein the disease associated with CD19 and / or CD20 is a CD19-positive and / or CD20-positive cancer.41.The method of claim 40, wherein the CD19-positive and / or CD20-positive cancer is selected from the group consisting of acute myeloid leukemia (AML) , chronic myelogenous leukemia (CML) , myelodysplastic syndrome (MDS) , acute B lymphoblastic leukemia (B-ALL) , diffuse large B cell lymphoma (DLBCL) , mantle cell lymphoma (MCL) , follicular lymphoma, chronic lymphocytic leukemia (CLL) , hairy cell leukemia (HCL) , blastic plasmacytoid dendritic cell neoplasm (BPDCN) , non-Hodgkin’s lymphomas (NHL) , Hodgkin’s lymphoma, systemic mastocytosis, Burkitt’s lymphoma, and T-cell lymphoma (TCL) .42.The method of claim 41, wherein the CD19-positive and / or CD20-positive cancer is Burkitt’s lymphoma.43.The method of any one of claims 39-42, wherein the multispecific antigen binding protein or the pharmaceutical composition is administered subcutaneously or intravenously.44.The method of any one of claims 39-43, wherein the individual is a human.45.A multispecific antigen binding protein comprising:(i) an anti-CD3 Fab fragment that specifically binds to CD3, wherein the anti-CD3 Fab fragment comprises:(a) a VH and a CH1; and(b) a VL and a CL; and(ii) an anti-CD20 antigen binding fragment that specifically binds to CD20.46.The multispecific antigen binding protein of claim 45, wherein the anti-CD20 antigen binding fragment is fused to the N-terminus of the VH or the VL of the anti-CD3 Fab fragment via an optional linker.47.The multispecific antigen binding protein of claim 45, wherein the multispecific antigen binding protein comprises a first anti-CD20 antigen binding fragment and a second anti-CD20 antigen binding fragment, wherein the first anti-CD20 antigen binding fragment is fused to the N-terminus of the VH of the anti-CD3 Fab fragment via an optional first linker, and wherein the second anti-CD20 antigen binding fragment is fused to the N-terminus of the VL of the anti-CD3 Fab fragment via an optional second linker.48.The multispecific antigen binding protein of any one of claims 45-47, wherein the anti-CD3 Fab fragment comprises:(a) an HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, an HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, an HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, an HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17, an HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18, and an HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19;(b) an HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, an HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 85, an HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 86, an HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17, an HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18, and an HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19; or(c) an HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, an HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 87, an HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, an HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17, an HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18, and an HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19.49.The multispecific antigen binding protein of claim 48, wherein the VH of the anti-CD3 Fab fragment comprises an amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 32, 88, and 89, and the VL of the anti-CD3 Fab fragment comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 33.50.The multispecific antigen binding protein of any one of claims 45-49, wherein the CH1 and the CL of the anti-CD3 Fab fragment are connected by a disulfide bond.51.The multispecific antigen binding protein of claim 50, wherein the CH1 and the CL of the anti-CD3 Fab fragment are connected by 1 to 5 disulfide bonds.52.The multispecific antigen binding protein of claim 51, wherein the CH1 and the CL of the anti-CD3 Fab fragment are connected by 2 disulfide bonds.53.The multispecific antigen binding protein of any one of claims 45-52, wherein the anti-CD3 Fab fragment comprises a first polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 60, 96, and 97, and a second polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 61 or 98.54.The multispecific antigen binding protein of claim 53, wherein the first polypeptide and the second polypeptide of the anti-CD3 Fab fragment each further comprises a hinge or portion thereof at the C-terminus of the first polypeptide and the second polypeptide.55.The multispecific antigen binding protein of claim 54, wherein the hinge or portion thereof comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 81 or 82.56.The multispecific antigen binding protein of any one of claims 45-55, wherein the anti-CD20 antigen binding fragment, the first anti-CD20 antigen binding fragment, and / or the second anti-CD20 antigen binding fragment, each independently comprises:(a) an HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, an HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8, an HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9, an HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 23, an HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 24, and an HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 25;(b) an HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10, an HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11, an HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12, an HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26, an HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 27, and an HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 28;(c) an HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13, an HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14, an HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15, an HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 29, an HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 30, and an HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 31;(d) an HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10, an HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11, an HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12, an HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26, an HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 27, and an HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 28; or(e) an HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, an HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8, an HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 109, an HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 110, an HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 111, and an HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 112.57.The multispecific antigen binding protein of claim 56, wherein the anti-CD20 antigen binding fragment, the first anti-CD20 antigen binding fragment, and / or the second anti-CD20 antigen binding fragment, each independently comprises:(a) a VH comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 36, and a VL comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 37;(b) a VH comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 38, and a VL comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 39;(c) a VH comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 40, and a VL comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 41;(d) a VH comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 42, and a VL comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 39;(e) a VH comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 113, and a VL comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 115; or(f) a VH comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 114, and a VL comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 116.58.The multispecific antigen binding protein of any one of claims 45-57, wherein:(i) the anti-CD20 antigen binding fragment is an anti-CD20 scFv; or(ii) the first anti-CD20 antigen binding fragment and the second anti-CD20 antigen binding fragment are each an anti-CD20 scFv.59.The multispecific antigen binding protein of claim 56, wherein the VH and the VL of the anti-CD20 scFv, the first anti-CD20 scFv, and / or the second anti-CD20 scFv, independently, are connected by an optional linker peptide.60.The multispecific antigen binding protein of claim 59, wherein the optional linker, the optional first linker, the optional second linker, and / or the optional linker peptide each independently comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 66 or 68.61.The multispecific antigen binding protein of claim 59 or 60, wherein the anti-CD20 scFv, the first anti-CD20 scFv, and / or the second anti-CD20 scFv each independently comprises an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 117-128.62.The multispecific antigen binding protein of any one of claims 58-61, wherein the multispecific antigen binding protein comprises a first anti-CD20 scFv and a second anti-CD20 scFv.63.The multispecific antigen binding protein of claim 62, wherein the first anti-CD20 scFv and the second anti-CD20 scFv have the same amino acid sequence.64.The multispecific antigen binding protein of any one of claims 45-63, wherein:(i) the multispecific antigen binding protein comprises a first fusion polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 146, and a second fusion polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 45;(ii) the multispecific antigen binding protein comprises a first fusion polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 147, and a second fusion polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 51;(iii) the multispecific antigen binding protein comprises a first fusion polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 148, and a second fusion polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 52;(iv) the multispecific antigen binding protein comprises a first fusion polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 149, and a second fusion polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 53;(v) the multispecific antigen binding protein comprises a first fusion polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 150, and a second fusion polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 151;(vi) the multispecific antigen binding protein comprises a first fusion polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 152, and a second fusion polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 153;(vii) the multispecific antigen binding protein comprises a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 60, and a fusion polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 51;(viii) the multispecific antigen binding protein comprises a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 60, and a fusion polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 52;(ix) the multispecific antigen binding protein comprises a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 60, and a fusion polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 53; or(x) the multispecific antigen binding protein comprises a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 60, and a fusion polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 153.65.A pharmaceutical composition comprising the multispecific antigen binding protein of any one of claims 45-64, and optionally a pharmaceutically acceptable carrier.66.A method of treating a disease associated with CD20 in an individual, comprising administering to the individual an effective amount of the multispecific antigen binding protein of any one of claims 45-64 or the pharmaceutical composition of claim 65.67.The method of claim 66, wherein the disease associated with CD20 is a CD20-positive cancer.68.The method of claim 67, wherein the CD20-positive cancer is selected from the group consisting of acute myeloid leukemia (AML) , chronic myelogenous leukemia (CML) , myelodysplastic syndrome (MDS) , acute B lymphoblastic leukemia (B-ALL) , diffuse large B cell lymphoma (DLBCL) , mantle cell lymphoma (MCL) , follicular lymphoma, chronic lymphocytic leukemia (CLL) , hairy cell leukemia (HCL) , blastic plasmacytoid dendritic cell neoplasm (BPDCN) , non-Hodgkin’s lymphomas (NHL) , Hodgkin’s lymphoma, systemic mastocytosis, Burkitt’s lymphoma, and T-cell lymphoma (TCL) .69.The method of claim 68, wherein the CD20-positive cancer is Burkitt’s lymphoma.70.The method of any one of claims 66-69, wherein the multispecific antigen binding protein or the pharmaceutical composition is administered subcutaneously or intravenously.71.The method of any one of claims 66-70, wherein the individual is a human.72.An isolated nucleic acid encoding the multispecific antigen binding protein of any one of claims 1-37 and 45-64.73.A vector comprising the isolated nucleic acid of claim 72.74.A host cell comprising the isolated nucleic acid of claim 72 or the vector of claim 73.75.A method of making a multispecific antigen binding protein, comprising:(i) culturing a host cell comprising the isolated nucleic acid of claim 72 or the vector of claim 73, or the host cell of claim 74, under a condition suitable for the expression of the multispecific antigen binding protein; and(ii) obtaining the expressed multispecific antigen binding protein from said host cell.

Images