Multiplexing adaptive optics system and method for rapid high-resolution imaging in deep tissue

Abstract

A multiplexing adaptive optics method for deep-tissue imaging is provided, comprising: providing a first optical beam and a group of second optical beams, each with lower intensity and distinct modulation frequencies; combining the beams with temporal overlap to form a composite excitation beam; focusing the composite beam into a sample such that the second optical beams are laterally separated in the focal plane; detecting a signal excited by the composite beam; demodulating the signal with reference frequencies to compute phase and amplitude data at each modulation frequency and obtain a second signal; performing spatial measurements of the first beam relative to the second beams to derive down-sampled electric-field point spread functions; and merging the functions to reconstruct a full-sampled point spread function for identifying and correcting optical aberrations within the sample.

Description

MULTIPLEXING ADAPTIVE OPTICS SYSTEM AND METHOD FOR RAPID HIGH-RESOLUTION IMAGING IN DEEP TISSUEInventors: Zhentao SHE; Zhongya QIN; and Jianan QUTechnical Field:

[0001] The present invention provides a method and system for identifying and correcting optical aberrations within a sample at fast under optical microscopy. More specifically, a non-invasive method and system arrangement are provided to accurately measure an aberrated electric-field (E-field) PSF of an excitation laser within a sample in milliseconds time, leading to a near diffraction-limited resolution imaging.Background:

[0002] Optical microscopy has for a long time been an essential tool for biological and biomedical research. Taking use of various fluorescent proteins and indicators, multiphoton microscopy allows for direct visualization of subcellular structures and continuous monitoring of dynamic biological activities at spatiotemporal scales spanning orders of magnitude in living animals. However, when imaging deep into samples, the microscope performance is severely affected by the optical aberrations of the specimens due to the refractive index variations of biological tissues. These aberrations prevent the formation of diffraction-limited focus inside specimens and ultimately degrade the resolution and contrast of microscope images. To overcome these limitations, adaptive optics (AO) , an optical technique originally developed for astronomical telescope, has been introduced to microscopy to compensate for the wavefront distortion. If the wavefront distortion is known, a wavefront corrector such as deformable mirror (DM) or spatial light modulator (SLM) can be employed to generate a compensatory wavefront to the excitation and / or emission light to cancel all the aberrations and recover the optimal imaging resolution.

[0003] Previous efforts for implementing AO in optical microscopy mainly differ in how the aberration is measured and can be classified to either direct or indirect wavefront sensing.

[0004] In direct wavefront measurement, aberrations are determined directly from the received wavefront of a “guide star” with a wavefront sensor, similar to that in astronomical AO. This information is then used to generate the compensate wavefront and drive the shape of a deformable mirror to minimize the total aberrations. Direct wavefront sensing is relatively fast (typically ～1s for biological imaging) and conceptually simple. However, it relies on the photons that have not been scattered (ballistic photons) and thus are best suited for the transparent specimens.

[0005] In indirect approaches, iterative algorithms are adopted to find the optimal corrective wavefront. For example, modal AO techniques make use of a deformable mirror that iterates through low-order deformations, and pupil segmentation approaches acquire images through segments of the objective back aperture to estimate the phase gradient in order to correct aberrations. The indirect approaches are usually time-consuming and can only deal with low-order aberrations. To flexibly correct both low-and high-order aberrations in vivo with high signal noise ratio (SNR) , a sensorless technique termed analogue lock-in phase-detection for focus sensing and shaping (ALPHA-FSS or α-FSS) was recently developed. By utilizing a lock-in amplification scheme to detect the interference signal between two beams with slightly frequency difference, ALPHA-FSS can successfully suppress the noise in PSF measurement and recover the accurate amplitude and phase of the PSF, which contains information of the aberration brought by the biological samples. However, it typically takes 1-3s of one round of wavefront measurement. This time consumption for aberration detection and correction makes its accuracy sensitive to the artifacts of the sample movement for in-vivo experiment, which normally changes at speed of sub second. Moreover, the strong beam needs to be pointed to the center of the guide star during the time of probing, which is likely to cause photobleaching on the fluorophores if the measurement time is long. According to the principle of ALPHA-FSS, the time comes mainly from the raster scanning of the weak beam relative to the strong beam since each pixel of PSF requires a dwelling time.

[0006] Therefore, there is a need for an optical wavefront sensing method that enables rapid, accurate, and minimally invasive aberration measurement.Summary of Invention:

[0007] It is an objective of the present invention to provide a system and a method to address the aforementioned issues in the prior arts. In the present invention, a novel approach is developed to accelerate the detection process by employing multi-frequency modulation and digital lock-in detection scheme to simultaneously decoding the complex E-field at different position, which enables both accurate and much faster detection of the aberrated Point Spread Function (PSF) . By using the provided invented method of the present invention, the time to probe the aberrated point spread function can be reduced up to 8X folds in current setup and potentially reduced to larger than 8X folds with more channels of modulation device, which significantly overcomes the sensitivity to motion artifacts and photobleaching for in-vivo wavefront measurement and correction.

[0008] At this point, in optical microscopy of heterogeneous sample, both imaging resolution and depth are drastically degraded by aberrations induced the sample and imaging system itself. This disclosed invention aims at fast and accurately measuring and correcting the optical aberrations encountered in multiphoton microscopy. Specifically, a non-invasive method is developed to measure the aberrated electric-field (E-field) PSF of excitation laser inside the sample in a short time. It is shown that this technology can be integrated into a standard multi-photon microscope for in-vivo biological imaging. The performance of this method is illustrated on a sample with mouse skull on fluorescent beads and the result demonstrates that this technology can ensure both the speed and accuracy of the aberration correction, which effectively restores near-diffraction-limited imaging resolution.

[0009] An object of the present invention is to increase the speed of identifying the wavefront distortions of in vivo multiphoton microscopy while maintaining its accuracy, thereby providing adaptive optics (AO) corrections to system and / or sample induced aberrations in a higher refresh rate. The physical principle for wavefront correction is based on the measurement of the amplitude and phase of the E-field PSF. If the PSF information is known, the overall wavefront distortion is the Fourier transform of the PSF and can be corrected by using a wavefront corrector.

[0010] Accordingly, the present invention includes steps of:

[0011] (1) providing a plurality of optical beams including at least a first optical beam and a group of second optical beams, followed by modulating the group of second optical beams with different frequencies, where the intensity of the first beam is higher than each beam of the group of second optical beams;

[0012] (2) combining the first optical beam and the group of second optical beams to provide a combined optical beam, where the first optical beam and the group of second optical beams are at least partially superimposed in time;

[0013] (3) focusing the combined optical beam into the sample, followed by detecting a first signal excited by the combined optical beam in the sample;

[0014] (4) scanning the second group of beams together relative to the first beam within a frame covering the distorted PSF under a down-sampled scheme;

[0015] (5) demodulating the first signal by multiple lock-in amplifiers or digital FFT calculation to obtain a second group of signals at each modulation frequency including performing a plurality of measurements of the spatial positions of the first optical beam with respect to the group of second optical beams; and

[0016] (6) identifying and correcting the optical aberrations by the second group of signals through obtaining the electric-field point spread function.

[0017] In accordance with a first aspect of the present invention, a multiplexing adaptive optics method for rapid, high-resolution imaging in deep tissue is provided. The method includes steps as follows: providing a first optical beam and a group of second optical beams; modulating the second optical beams at distinct optical frequencies, respectively, wherein each of the second optical beams has an intensity lower than that of the first optical beam; combining the first optical beam and the group of the second optical beams with the first optical beam and the second optical beams being at least temporally overlapped with each other to form a composite excitation beam; focusing the composite excitation beam into a sample with each focus of the group of second optical beams spatially separated at a distance in the focal plane within the sample; detecting a first signal excited by the composite excitation beam from the sample; demodulating the first signal with reference signals to compute phase and amplitude information corresponding to each modulation frequency of the second optical beams and to obtain a second signal, wherein the formation of the second signal comprises a plurality of measurements of spatial positions of the first optical beam relative to the second optical beams; obtaining, for each of the second optical beams, a respective down-sampled electric-field point spread function representing a localized optical response at a distinct focal position within the sample, wherein each of the second optical beams is spatially separated and modulated at a distinct frequency; and merging the down-sampled electric-field point spread functions together to compute a full-sampled point spread function of the composite excitation beam, thereby identifying and correcting optical aberrations within the sample.

[0018] In accordance with a second aspect of the present invention, a multiplexing adaptive optics system configured for rapid, high-resolution imaging in deep tissue is provided. The multiplexing adaptive optics system includes an optical beam generating device and an optical beam deflector, an optical phase modulator, a focusing device, a detection device, and a demodulation device. The optical beam generating device and the optical beam deflector are collectively configured to generate a first optical beam and a group of second optical beams, wherein each of the second optical beams has lower intensity than that of the first optical beam. The optical beam deflector spatially separates the second optical beams by deflecting them at distinct angles according to their frequency components such that the second optical beams are encoded with distinct optical frequencies. The optical phase modulator is configured to apply phase modulation to the second optical beams to encode temporal interference information. The focusing device is configured to focus a composite excitation beam comprising the first optical beam and the second optical beams into the sample at a plurality of spatially distinct positions such that focuses of the group of the second optical beams are arranged at distinct positions separated by a distance in the focal plane within the sample. The detection device is configured to detect a first signal emitted from a sample in response to excitation by the composite excitation beam. The demodulation device is configured to demodulate the first signal to obtain a second signal, in which at least one down-sampled electric-field point spread function of the group of the second optical beams is obtained from the second signal by the demodulation device, thereby combining and identifying the down-sampled point spread function and then correct optical aberrations within the sample.Brief Description of Drawings:

[0019] Embodiments of the invention are described in more details hereinafter with reference to the drawings, in which:

[0020] FIG. 1 illustrates a block diagram of a multiplexing adaptive optics system according to some embodiments of the present invention;

[0021] FIG. 2 is a schematic diagram of an optical system with a phase modulator according to one embodiment of the present invention;

[0022] FIG. 3 is a schematic diagram illustrating the principle of Multiplexing ALPHA-FSS;

[0023] FIG. 4 shows the CCD image of the multiplexed beams when scanning in direction perpendicular to the beam deflection angle according to one embodiment of the present invention;

[0024] FIG. 5 shows the PSF probed using dual beam Multiplexing ALPHA-FSS;

[0025] FIG. 6 is the PSF and correction wavefront measured on an awake mouse free to move using single beam ALPHA-FSS;

[0026] FIG. 7 is the PSF and correction wavefront measured on an awake mouse free to move using Multiplexing ALPHA-FSS;

[0027] FIG. 8 is the image of neuron dendrite of awake mouse free to running on a rotation wheel;

[0028] FIG. 9 is the signal intensity of the neuron dendrites at center of the three pictures in FIG. 8;

[0029] FIG. 10 is the circuit diagram of multiple lock-in amplifier-based demodulation method;

[0030] FIG. 11 is the circuit diagram of digital FFT based demodulation method;

[0031] FIG. 12 is the principle of digital FFT based demodulation method;

[0032] FIG. 13 shows the single prism based angular dispersion compensation method for AOD in Multiplexing ALPHA-FSS according to one embodiment of the present invention;

[0033] FIG. 14 shows the angular dispersion of a single prism at different incidence angle;

[0034] FIG. 15 is the simulation result showing beam expansion ratio of single prism at different incidence angle;

[0035] FIG. 16 is the schematic diagram of dual prism angular dispersion compensation;

[0036] FIG. 17 is the simulation result showing residual angular dispersion after a double prism configuration with Brewster incidence angle;

[0037] FIG. 18 is the CCD Image of deflected multiple beams after angular dispersion compensation through a dual-prism configuration;

[0038] FIG. 19 is the diagram of optimizing frequency arrangement strategy;

[0039] FIG. 20 is the measured PSF with tracing method on when guide star is moving;

[0040] FIG. 21 is the measured PSF without tracing method on when guide star is moving;

[0041] FIG. 22 provides an optical system with an optical routing and beam multiplexing layout according to some embodiments of the present invention; and

[0042] FIG. 23 illustrates a schematic diagram for a signal processing and demodulation architecture on the computing unit of the system of FIG. 22 according to one embodiment of the present invention.Detailed Description of the Invention:

[0043] In the following description, multiplexing adaptive optics systems and methods for rapid high-resolution imaging in deep tissue and the likes are set forth as preferred examples. It will be apparent to those skilled in the art that modifications, including additions and / or substitutions may be made without departing from the scope and spirit of the invention. Specific details may be omitted so as not to obscure the invention; however, the disclosure is written to enable one skilled in the art to practice the teachings herein without undue experimentation.

[0044] Recent developments in adaptive optics for multiphoton microscopy have introduced approaches capable of correcting sample-and system-induced aberrations; one such technique is ALPHA-FSS, a method that enables the measurement of electric-field point spread functions (E-field PSFs) through interference signal demodulation. ALPHA-FSS has demonstrated the ability to retrieve accurate wavefront distortion profiles for in vivo samples. However, in prior implementations, a complete correction cycle typically required several seconds to complete. This prolonged duration raised concerns regarding photobleaching caused by the femtosecond laser exposure, and also rendered the system sensitive to sample motion artifacts on the micron scale, thereby compromising focus sensing accuracy and image quality.

[0045] To address these limitations, in the present invention, a multiplexed implementation of ALPHA-FSS is employed. This multiplexing scheme introduces a group of weak beams, each modulated at a distinct frequency and incident angle, allowing parallel demodulation of interference signals to reconstruct the aberrated E-field PSF at high speed. Once the E-field PSFs are measured, the wavefront distortions can be extracted via Fourier transform and corrected in real time using the wavefront correction device. The objective of this approach is to reduce the response time required for adaptive optics correction in multiphoton microscopy, enabling rapid and reliable compensation for aberrations in dynamic or light-sensitive biological specimens.

[0046] This method / system is compatible with standard multiphoton microscope platforms and is suitable for in-vivo biological imaging. Experimental validation has been conducted on samples including fluorescent beads beneath an intact mouse skull and in-vivo transgenic mouse models. The results confirm that the disclosed technique enables both high-speed and high-accuracy aberration correction, thereby restoring near-diffraction-limited resolution at substantial imaging depths.

[0047] FIG. 1 illustrates a block diagram of a multiplexing adaptive optics system 100 according to some embodiments of the present invention. The system 100 is configured for rapid, high-resolution imaging in deep tissue. The multiplexing adaptive optics system 100 is operable to perform in-situ detection and wavefront correction within a sample 200. The sample 200 may comprise biological tissue or any other heterogeneous optical medium exhibiting spatially varying refractive indices that induce optical aberrations. By compensating for these aberrations in real time, the multiplexing adaptive optics system 100 enables diffraction-limited resolution at imaging depths where conventional multiphoton microscopy typically degrades.

[0048] The multiplexing adaptive optics system 100 includes an optical beam generating device 102, an optical beam deflector 104, an optical phase modulator 106, an optical beam scanning device 108, an optical beam combination device 110, a wavefront correction device 112, a guiding device 114, a focusing device 116, a detection device 120, a demodulation device 130, a reference signal generating device 132, and an optical path adjusting device 134. It should be understood that the arrangement of components in the multiplexing adaptive optics system 100 as shown and described is exemplary and not intended to limit the optical configuration of the system. In practical implementations, one or more additional optical elements, such as lenses, mirrors, beam splitters, wave plates, or relay optics, may be positioned between any of the listed components to achieve desired beam shaping, alignment, or path folding. The interconnection and spatial layout of the components may be adapted based on system constraints or optical performance considerations without departing from the scope of the present invention.

[0049] The optical beam generating device 102 is configured to provide a plurality of optical beams including at least a first optical beam L1 with higher intensity and a group of second optical beams L2 with lower intensity. The optical beam generating device 102 is cable of modulating the group of the second optical beams L2 at different frequencies for each second optical beam, in which the intensity of each second optical beam L2 is lower than the first optical beam L1.

[0050] In one embodiment, the optical beam generating device 102 includes a light source and a beam splitting device. The light source is configured to generate optical beams (e.g., a combination source of the first optical beam L1 and the second optical beams L2) . The beam splitting device is configured to split the optical beams into the first optical beam L1 and the group of the second optical beams L2. In various embodiments, the beam splitting device is selected from a group of a polarized beam splitter, non-polarized beam splitter, acoustic optical modulator, acoustic optical deflector, combinations thereof. For example, the optical beam generating device 102 comprises a femtosecond pulsed laser and a beam splitting structure. The splitting may be realized using a polarization beam splitter (PBS) , non-polarizing beam splitter, or through an acousto-optic deflector (AOD) driven by multiple frequency signals to produce first-order diffracted beams.

[0051] In one embodiment, the optical beam generating device 102 includes an AOD configured to diffract an incident beam into multiple first-order beams by driving the AOD with a set of radio-frequency (RF) signals at distinct modulation frequencies. Each RF frequency generates a corresponding diffracted beam with a specific angular deviation and optical frequency shift. By applying multiple RF tones simultaneously, the AOD outputs a group of second optical beams L2 that are spatially separated and each encoded with a unique frequency component. The intensity of each diffracted beam is controlled to be lower than that of the undiffracted (zero-order) beam, which forms the first optical beam L1. In this manner, the group of the second optical beams L2 is modulated at different frequencies and directed for further spatial manipulation and phase modulation downstream.

[0052] The optical beam deflector 104 is optically coupled to the optical beam generating device 102 and is configured to introduce angular separation across the group of the weak beams (i.e., the second optical beams L2) , such that each beam is deflected at a different angle corresponding to its modulation frequency. In one embodiment, the optical beam deflector 104 is realized by an AOD driven by a set of discrete RF frequencies. This results in spatially separated diffraction orders, forming a linear array of weak beams in the focal plane. In one embodiment, the optical beam deflector 104 serve as a beam splitting device for the optical beam generating device 102. That is, by using a combination of the optical beam generating device 102 and the optical beam deflector 104, the output includes one high-intensity beam (e.g., L1) and a group of frequency-encoded weak beams (e.g., L2) , in which the frequency-encoded weak beams are deflected at different angles, respectively.

[0053] The optical phase modulator 106 is coupled to the optical beam deflector 104 (e.g., electrically coupled with the optical beam deflector 104) and is configured to impose a time-dependent phase shift on the group of the weak beams (i.e., the second optical beams L2) for the modulation purpose. The modulation may be implemented as a linear sweep from –π to +π and may be realized via indirect means such as adjusting the drive signals to the AOD (e.g., the optical beam deflector 104) . Alternatively, discrete phase control elements such as electro-optical modulators (EOMs) , piezo-controlled delay mirrors, or MEMS-based tunable optics may be employed.

[0054] The optical beam scanning device 108 is optically coupled to the optical beam deflector 104 and is configured to control the spatial displacement of the group of the second optical beams L2 relative to the first optical beam L1. In one embodiment, a raster or multiplexed pattern is applied. In various embodiments, the optical beam scanning device 108 may include a galvanometric mirror or an electrically tunable lens (ETL) to steer the weak beams (i.e., the second optical beams L2) across a small field of view. This scanning enables the sampling of the electric-field PSF across spatial locations.

[0055] The optical beam combination device 110 is optically coupled with the optical beam deflector 104 and the optical beam scanning device 108 and is configured to spatially and temporally superimpose the first optical beam L1 and the group of the second optical beams L2 to generate a composite excitation beam. The optical beam combination device 110 may be implemented using a PBS, dichroic mirror, or non-polarizing beam combiner. The spatially separated weak beams (i.e., the group of the second optical beams L2) are aligned to converge with the strong beam (i.e., the first optical beam L1) , such that all beams can be focused simultaneously into the imaging sample with overlapping temporal profiles.

[0056] The optical path adjusting device 134 is configured to vary the optical path of one of the optical beams such that the first optical beam L1 and the group of the second optical beams L2 are available to temporally superimposed at the sample 200. Specifically, the optical path adjusting device 134 is operatively coupled to the optical beam deflector 104, the optical beam scanning device 108, and the optical beam combination device 110. In some embodiments, the optical path adjusting device 134 may include one or more optical elements, such as mirrors or lenses (e.g., relay optics or folded beam paths) , arranged to lengthen or shorten the optical path of the first optical beam relative to the group of the second optical beams. By adjusting the propagation distance or introducing a fixed or tunable delay in the optical path of the first optical beam L1 (e.g., the undiffracted beam) , the optical path adjusting device 134 enables synchronization of arrival time between the first and second optical beams at the focal region within the sample 200.

[0057] The wavefront correction device 112 is optically coupled with the optical beam combination device 110 and is configured to modify the wavefront of the composite optical beam formed from the first and second optical beams L1 and L2. For example, the wavefront correction device 112 is configured to impose a conjugate phase profile to the composite optical beam to compensate for optical aberrations. The wavefront correction device 112 may comprise a spatial light modulator (SLM) , deformable mirror (DM) , digital micromirror device, or other programmable wavefront shaping elements.

[0058] The guiding device 114 is optically coupled with the wavefront correction device 112 and is configured to direct the optical beams, output from the wavefront correction device 112, toward the focusing device 116 for delivery into the sample 200. The guiding device 114 is further configured to receive light / optical beams returning from the sample 200 via the focusing device 116 and redirect the reflected or emitted signal toward a separate detection path without allowing it to propagate back to the wavefront correction device 112. By this manner, the guiding device 114 facilitates one-way forward propagation of the excitation beam toward the sample, and one-way diversion of the return signal for downstream collection and analysis, thereby optically isolating the correction path from the detection path.

[0059] The focusing device 116 is optically coupled with the guiding device 114 and is configured to focus the composite excitation beam, including the first optical beam L1 and the group of second optical beams L2, into the sample 200. The focusing device 116 may comprise a high-numerical-aperture objective lens, optionally mounted on a piezo-actuated z-stage for axial positioning. The focusing arrangement allows each of the second optical beams L2 to interrogate distinct lateral positions relative to the first optical beam L1, such that the focuses of the second optical beams are spatially separated by a defined lateral distance in the focal plane within the sample 200, thereby enabling multiplexed sampling of the aberrated electric-field PSF. That is, each of the second optical beams L2 is focused at a unique spatial position to generate a corresponding segment of the E-field PSF. Upon focal excitation, nonlinear optical signals (e.g., multiphoton fluorescence) are generated from the sample 200. These signals constitute a first signal that is collected by the detection device 120 for subsequent demodulation and analysis.

[0060] The detection device 120 is configured to receive and convert the first signal, which is generated by nonlinear excitation within the sample 200 and reflected or emitted back through the focusing device 116. The first signal is directed by the guiding device 114 toward the detection device 120, such that it is diverted from returning to the wavefront correction device 112. The detection device 120 may comprise a photomultiplier tube (PMT) or other high-sensitivity, low-noise optical detector, optionally coupled with an amplifier to enhance signal strength prior to analog-to-digital conversion. The detected signal contains frequency-multiplexed interference information and is transmitted to the demodulation device 130 for subsequent phase and amplitude extraction.

[0061] The demodulation device 130 is configured to demodulate the first signal to obtain a second signal. The first signal, which originates from nonlinear optical interactions within the sample 200, is detected by the detection device 120 after being guided through the focusing device 116 and redirected by the guiding device 114. The demodulation device 130 cooperates with the detection device 120 by receiving the first signal and processing it to extract spatially resolved information.

[0062] The second signal comprises the phase and amplitude of the down-sampled E-field PSF corresponding to the group of the second optical beams L2. These E-field PSF values are measured at a plurality of spatial positions of the first optical beam L1 relative to the group of the second optical beams L2, enabled by controlled spatial scanning or angular multiplexing. In some embodiments, demodulation is performed using reference signals generated by the reference signal generating device 132, and may employ either digital Fourier transform (FFT) or lock-in detection techniques. The demodulation device 130 may include a data acquisition board, one or more hardware lock-in amplifiers, a PC-based FFT module, or any combination thereof. The extracted E-field PSF information is used to calculate a corrective wavefront profile, which is then transmitted to other components / modules of the system 100 to update its modulation state, thereby completing a closed-loop aberration correction cycle.

[0063] The reference signal generating device 132 is coupled with the demodulation device 130 and is configured to generate reference signals for use in the demodulation of the first signal through either lock-in amplification or digital computation. In one embodiment, the reference signal generating device 132 comprises a multi-channel direct digital synthesizer (DDS) that outputs multiple RF sinewaves, each corresponding to a distinct modulation frequency applied to the group of the second optical beams L2. The reference signals are simultaneously provided to the optical phase modulator 106 (for example, driving with multiple tones) and to the demodulation device 130 for coherent signal detection. The reference signal generating device 132 operates in synchronization with both the modulation and demodulation paths, achieving desired temporal coherence between the modulated optical beams and the reference channels used for signal extraction. By providing frequency-matched reference inputs to the demodulation device 130, the reference signal generating device 132 enables accurate retrieval of phase and amplitude components of the E-field PSF, thereby supporting closed-loop aberration correction across the system.

[0064] The components described above are configured to operate in concert to implement a method for identifying and correcting optical aberrations within a sample under optical microscopy. Through coordinated modulation, beam delivery, signal detection, and demodulation, the multiplexing adaptive optics system 100 enables the execution of a high-speed aberration correction workflow. The following descriptions provide a method in further detail, as enabled by the aforementioned hardware configuration.

[0065] In the present invention, a method for identifying and correcting optical aberrations within a sample under optical microscopy at high speed is provided. More particularly, the method implements a multiplexed adaptive optics system incorporating frequency-modulated optical beams and signal demodulation to achieve in-situ aberration correction through down-sampled E-field PSF reconstruction.

[0066] The optical beam generating device 102 provides a first optical beam L1 of higher intensity and a group of second optical beams L2 of lower intensity. The group of the second optical beams L2 are modulated at different frequencies, wherein each second optical beam L2 is encoded with a distinct frequency component. The modulation of the second optical beams L2 is performed by the optical phase modulator 106. The modulation can include phase modulation, intensity modulation, or combinations thereof. For phase modulation, at least one measurement is performed for each spatial position of the first optical beam L1 relative to each of the second optical beams L2. For intensity modulation, at least two measurements are performed per spatial position, with the relative phase between L1 and L2 altered between measurements. The optical beam deflector 104 introduces angular separation to the group of second optical beams L2, enabling spatial distinction at the focal plane. The optical beam scanning device 108 controls the spatial displacement of the second optical beams L2 with respect to the first optical beam L1.

[0067] The optical beam combination device 110 spatially and temporally superimposes the first optical beam L1 and the group of the second optical beams L2 to form a combined excitation beam. The optical path adjusting device 134 can adjust the optical path length such that the optical beams are at least partially temporally overlapped at the focal region of a sample 200. The composite excitation beam is directed to the sample 200 through the wavefront correction device 112, the guiding device 114, and focused by the focusing device 116. In this regard, the focusing device 116 focuses the composite excitation beam into the sample 200 such that each second optical beam L2 is focused at a spatially distinct location in the focal plane within the sample 200.

[0068] The composite excitation beam excites nonlinear optical signals within the sample 200. These signals, constituting a first signal, are collected by the detection device 120 after being directed through the guiding device 114. The detection device 120 converts the first signal into an electrical signal containing frequency-multiplexed interference information.

[0069] The demodulation device 130 demodulates the first signal and obtains a second signal, which comprises the phase and amplitude of the down-sampled E-field PSF associated with each second optical beam L2. The demodulation is based on computing the recorded signal phase and amplitude at each modulation frequency of the second optical beams. The demodulation may be performed using reference signals generated by the reference signal generating device 132. The reference frequencies of the reference signals used in the computation-based demodulation may be the modulation frequencies, harmonic frequencies, or combinations thereof. Multiple lock-in amplifiers may be employed to resolve multiple signals simultaneously.

[0070] More specifically, the second signal is computed by performing a plurality of measurements of the spatial positions of the first optical beam L1 with respect to the second optical beams L2. The down-sampled E-field PSF for each beam is obtained and merged to reconstruct a full-sampled PSF of the excitation beam. This reconstructed PSF is then used to identify and correct optical aberrations within the sample.

[0071] In some embodiments, the multiplexing adaptive optics system 100 may further include a computing unit (e.g., a computer or a processor) for receiving the aberration information and updates the wavefront profile to compensate for detected aberrations. This correction cycle may be repeated iteratively by re-performing the demodulation and PSF reconstruction until a satisfactory aberration estimation is achieved.

[0072] In some embodiments, one of the optical beams (e.g., L1) is designated for imaging, while the group of optical beams (e.g., L2) are temporally or spatially gated to prevent sample damage or interference. The gating may be realized via modulation control using the optical phase modulator 106, or through beam steering or shuttering mechanisms implemented within the scanning device 108 or guiding device 114. The configuration by this point allows the imaging beam to interact with the sample while isolating the probing beams, thereby improving signal fidelity and reducing photodamage.

[0073] After executing the aberration correction process, the system yields a spatially resolved E-field PSF that characterizes optical distortions present in the sample. This reconstructed PSF is used to compute a corrective wavefront, which is dynamically applied to the wavefront correction device 112 to reshape the phase profile of the composite beam prior to its delivery to the sample. In parallel, the optical phase modulator 106 which receives frequency-specific reference signals from the reference signal generating device 132 is responsible for modulating the group of the second optical beams L2, enabling multiplexed phase tagging of each beam. These modulated beams propagate through the beam deflector 104 and are combined with the first optical beam L1 for subsequent delivery to the sample 200.

[0074] For example, the sample 200 may comprise intact mouse brain tissue or other live biological specimens exhibiting spatially varying refractive indices. With accurate aberration correction applied via the wavefront correction device 112, and frequency-multiplexed excitation achieved through the optical phase modulator 106, the system enables visualization of fine structures such as synaptic boutons, dendritic spines, and neural vasculature deep within the tissue. The resulting corrected imaging data can be further utilized for quantitative morphological assessment, neural activity mapping, or longitudinal in vivo studies under physiological conditions.

[0075] The following provides implementation details, underlying operational principles, and validation results regarding the use of the disclosed system to correct the optical aberrations encountered in multiphoton microscopy.

[0076] FIG. 2 is a schematic diagram of an optical system 300 with a phase modulator according to one embodiment of the present invention. The optical system 300 is arranged according to a multiphoton microscopy ALPHA-FSS system with several important modifications. Specifically, rather than using one strong stationary beam and one weak scanning beam for PSF probing, the number of the weak beam is increased multiple times. Each weak beam has a slightly different frequency with respect to each other. The multiple beams including the strong stationary beam are then focused into the specimens to excite nonlinear optical signals (e.g. two-or three-photon excited fluorescence, second-or third-harmonic generation, coherent Raman scattering, et al) , which is detected by a photodetector (e.g. photomultiplier tube, PMT) .

[0077] As described above, a beam deflector and an optical phase modulator (e.g., the beam deflector 104 and the optical phase modulator 106) are incorporated into the system to implement a multi-frequency phase modulation method, which is described in further detail below.

[0078] (I) Multi-frequency phase modulation method

[0079] In ALPHA-FSS, a weak scanning beam is raster scanned over a small field of view (FOV) to interfere with a strong stationary beam. At the same time, the phase of the weak scanning beam is modulated linearly at a fixed frequency. By demodulating the multi-photon fluorescence signal excited by the interference of the scanning and stationary beams using an analog lock-in amplifier, the E-field PSF can be directly obtained, and the desired corrective wavefront can be derived using phase conjugation of the measured PSF. It should be noted that most of the time in ALPHA-FSS is spent on the point-by-point scanning of the E-field PSF. To expedite this process, it is proposed to use multiple weak beams with slightly different frequencies and angles, which can simultaneously probe multiple points of the E-field PSF.

[0080] FIG. 3 is a schematic diagram illustrating the principle of Multiplexing ALPHA-FSS, in which an acousto-optic modulator (AOM) is used to split the beam into multiple beams, each having a distinct spatial deflection angle and frequency shift. According to the illustration, the weak beams can be generated using an AOM. The AOM is driven by a series of sine waves at equally spaced frequencies, each corresponding to one weak beam. The angular interval of these beams is determined by the 1st order diffraction angle of the AOM, which can be calculated by where λ is the wavelength of the excitation laser, Δf is the frequency interval of the AOM driving signals, and v is the acoustic velocity in the AOM. Two 4f telescope systems in the ALPHA-FSS system relay the diffracted beams from the AOM to the back focal plane of the objective lens, which converts the angular difference into a focal point difference. And, finally, a linear distributed array of focal points can be obtained. The spatial interval may be chosen as the half of the radius of the Airy disc, which is:

[0081] where fobj is the focal length of objective lens, M is the angular magnification of the 4f relay systems between the AOM and the objective back focal plane, and NA is the numerical aperture of the objective lens. From the above equation, we can derive the frequency interval of the AOM driving signals, Δf.

[0082] FIG. 4 shows the CCD image of the multiplexed beams when scanning in direction perpendicular to the beam deflection angle according to one embodiment of the present invention. As shown in FIG. 4, various numbers of weak beams are obtained by driving the AOM with the corresponding number of sine waves. To display the separated beams clearly, the separated beams are vertically scanned to form a series of parallel lines on a CCD. In the 8-beam experiment, the frequency interval of the AOM driving signal is equivalent to the spatial interval approaching the diffraction limit. As a result, the 8 beams cannot be distinguished as clearly as in the 2 / 4 beam experiments. It should be emphasized that the diffraction efficiencies of the 8 beams from the AOM are deliberately set to a low level because ALPHA-FSS requires them to be much weaker than the stationary beam. This minimizes or even eliminates the intermodulation and interferences between the 8 weak beams.

[0083] Next, an example of two scanning weak beams is taken to illustrate the physical principle of beam Multiplexing ALPHA-FSS. When two weak beams Escan1 and Escan2 interfere with a strong stationary beam Estat , the excitation of the 3P fluorescence signal at scanning coordinate xx is given by equation (2) . I (x) ∝∫O (x′) |Estat (x′) +Escan1 (x′-x) +Escan2 (x′-x) |4dx′… (2)

[0084] where Estat, Escan1, and Escan2 are the complex-valued E-field PSF of the stationary and two scanning beams, and O (x′) is the real-valued object function related to the fluorophore distribution in the focal plane. Since both weak beams are generated by an AOM, the phases of Escan1 and Escan2 are linearly modulated at frequency ω1 and ω2 with respect to Estat, like that of ALPHA-FSS. And the focal points of these two beams are spatially separated by half the radius of the Airy disc. If the scanning beams are set to be much weaker than the stationary beam (i.e.,  ), the 2P excited fluorescence becomes:

[0085] The fluorescence signal I (x, t) can be then demodulated using two lock-in amplifiers in parallel at frequencies ω1 and ω2, outputting the orthogonal X (i.e., in-phase) and Y (i.e., quadrature) .

[0086] Then, the E-field PSF can be computed by equation (4) :

[0087] The Estat and Escan are approximately equivalent to the E-field PSF EPSF (x) within a small lateral range defined by the memory effect. Thus, the E-field PSF can be expressed as equation (5) :

[0088] where |Escan1| and |Escan2| are the intensity of the electrical field, which can be calibrated experimentally. As demonstrated by the equations above, the E-field PSF can be derived at two coordinates x and x+Δx simultaneously. In the original ALPHA-FSS, the weak beam must be raster scanned line by line. By using the beam multiplexing approach, it is only necessary to scan the two weak beams simultaneously and merge the output signals from two lock-in amplifiers to obtain the same E-field PSF as that of the original single-beam ALPHA-FSS, in only half of the measurement time. Once the E-field PSF is available, the corrective phase pattern displayed on spatial light modulator (SLM) will be the conjugate phase of the Fourier-transform of the E-field PSF and then high-resolution AO imaging can be performed. It should be noted that the principle of beam multiplexing ALPHA-FSS discussed above is based on two scanning weak beams and only for simplicity and ease of understanding. It can be generalized to any number of weak beams in the system as-described.

[0089] To evaluate the efficacy of the proposed beam Multiplexing ALPHA-FSS, an experiment is conducted by imaging fluorescent beads embedded in agarose below an intact skull excised from an adult mouse. In order to measure the wavefront distortions, the strong beam is parked at the center of a fluorescent bead, while two weak beams are used to scan a 16×16 μm2 FOV to capture the complex E-field PSF.

[0090] FIG. 5 shows the PSF probed using dual beam Multiplexing ALPHA-FSS, where Part (A) is the down-sampling scanned PSF of the first beam, Part (B) is the down-sampling scanned PSF of the second beam, Part (C) is the merged PSF using the down-sampling scanned PSF of the two beams, and Part (D) is the PSF probed using traditional one beam ALPHA-FSS. As the illustration of FIG. 5, owing to the phase-sensitive detection scheme and beam multiplexing, the E-field PSF scattered and distorted by the intact skull can be obtained accurately and rapidly. Part (A) and Part (B) are the complex E-field PSF measured by beam ωs+ω1 and ωs+ω1. Part (C) is a PSF merged from Part (A) and Part (B) . This experiment is repeated using the one beam ALPHA-FSS at the same imaging location. As can be seen, the measured complex PSF in Part (D) is nearly identical to that shown in Part (C) . The aberration of the intact skull is further corrected using the PSF measured by two methods. As shown in FIG. 5, the present invented beam multiplexing approach produces the similar performance as the original single beam ALPHA -FSS, in only half the time.

[0091] The performance of multiplexing ALPHA-FSS is further validated on an awake, freely moving mouse placed on a rotation wheel by measuring and correcting sample-induced aberrations under locomotion conditions, where conventional ALPHA-FSS typically fails.

[0092] FIG. 6 is the PSF and correction wavefront measured on an awake mouse free to move using single beam ALPHA-FSS, where left figure is the magnitude of the PSF and middle figure is the phase of the PSF, right figure is the corresponding correction pattern. As is seen in FIG. 6, without Multiplexing ALPHA-FSS, the measured PSF is severely distorted by the by the mouse locomotion because the strong stationary beam lost the guide star during the measurement.

[0093] FIG. 7 is the PSF and correction wavefront measured on an awake mouse free to move using Multiplexing ALPHA-FSS, where left figure is the magnitude of the PSF and middle figure is the phase of the PSF, right figure is the corresponding correction pattern. As is seen in FIG. 7, with the help of Multiplexing ALPHA-FSS, the PSF can be accurately and quickly measured before the guide star moves away.

[0094] FIG. 8 is the image of neuron dendrite of awake mouse free to running on a rotation wheel without AO correction (left) , with single beam ALPHA-FSS AO correction (mid) and with Multiplexing ALPHA-FSS AO correction (right) . FIG. 9 is the signal intensity of the neuron dendrites at center of the three pictures in FIG. 8. Image acquired without AO correction (Sys) , with single beam ALPHA-FSS AO correction (SP AO) , with Multiplexing ALPHA-FSS AO correction (MP AO) . By applying the correction pattern calculated through the two PSF, the correction pattern calculated using the Multiplexing ALPHA-FSS PSF can largely improve the image intensity and resolution while the single beam ALPHA-FSS PSF results in decrease of image quality. This fact strongly proves that Multiplexing ALPHA-FSS is an effective and unique method for measuring and correcting the sample induced aberrations when sample is moving fast.

[0095] As described above, a demodulation device (e.g., the demodulation device 130) is incorporated into the system to implement a multi-frequency demodulation method, which is described in further detail below.

[0096] (II) Multi-frequency demodulation method

[0097] Since Multiplexing ALPHA-FSS splits the beam into a few beams with different modulation frequencies, it is required to demodulating these different frequencies with corresponding reference sine wave to acquire the E-field of each beam. To solve this problem, two types of methods are invented. One method is based on multiple lock-in amplifiers and the other method is based on digital Fourier transform analysis. In the first method, each lock-in amplifier board is supplied with the signal and the corresponding reference of the target frequency. The circuit for the multiplexing demodulation process can be described in the FIG. 10, in which FIG. 10 is the circuit diagram of multiple lock-in amplifier-based demodulation method.

[0098] As seen in the circuit diagram, the RF driver’s driving signal is mixed with the laser’s synchronization signal, resulting in a reference containing components of the modulation frequency. Each generated reference signal is sent to one lock-in amplifier (LIA) board as the reference source. Since the fluorescence signal is modulated with the corresponding frequency, the signal amplified by the current amplifier is fed to each LIA independently. The output port of the LIA contains the value of the in-phase part X and quadrature part Y, which can be used to calculate the amplitude and phase of the signal. A data acquisition board is required to sample the data and record it in the computer.

[0099] FIG. 11 is the circuit diagram of digital FFT based demodulation method. FIG. 12 is the principle of digital FFT based demodulation method, where amplitude and phase of the reference and the signal are calculated respectively. In the second method (digital Fourier transform analysis) , the RF drive signal with combination of fi is mixed with the synchronization signal of the laser and sampled by the data acquisition board. The fluorescence signal containing the interference information is first amplified by PMT and current amplifier then sampled by data acquisition board. The sampled reference and signal are stored in the computer and used for calculation of demodulation.

[0100] With the recorded signal and reference, the phase and amplitude of the signal can be calculated by in through demodulation. Briefly, the fast Fourier transform (FFT) of both the signal and reference is calculated, which can be expressed as equation (6) :

[0101] The complex amplitude after FFT can be expressed as equation (7) :

[0102] where As (f) and Ar (f) are the real amplitude of the signal and reference,  and are the phase of the signal and reference.

[0103] Next, the exact frequency fi of the individual reference can be distinguished by finding the accurate frequency of the peak amplitude. The amplitude of each frequency in the signal is thus calculated as As (fi) and the phase of each frequency in the signal is calculated as Since the calculated phase is the instantaneous phase of the recorded signal, the phase of the reference is required to connect the optical path of each beam with the phase of the signal. The relative phase of each frequency is thus calculated by equation (8) :

[0104] With the amplitude As (fi) and phase the complex E-field of the PSF at each scanning position can be calculated as equation (9) :

[0105] Thus, the correction wavefront can be calculated as described in previous section.

[0106] Given that Multiplexing ALPHA-FSS requires multiple weak beams with slight angular deflection in space and shifts in optical frequency, the following content provides details on the component (e.g., the beam deflector 104) used to achieve the generation of such multiple weak beams. The details on the component can be applied to the beam deflector 104 for optical deflection.

[0107] (III) Equipment selection for Multiplexing ALPHA-FSS

[0108] The main difference between original ALPHA-FSS and Multiplexing ALPHA-FSS is that Multiplexing ALPHA-FSS requires multiple weak beams with slightly deflection angle in space and frequency shift in optical frequency. This can be done by acousto-optic modulator (AOM) as described in previous section. However, commercial AOM is mainly designed for fast response time, meaning that the speed of sound wave in the crystal is fast. This leads to the small angular deviation coefficient of commercial AOM, which makes the deviation angle too small for practical use of Multiplexing ALPHA-FSS. To solve this problem, acoustic-optical deflector (AOD) can be used, which has larger angular deviation coefficient.

[0109] The most commonly acoustic-optical deflector is manufactured in off-axis shear mode and the light goes through anisotropic interaction with the crystal, leading to the perpendicular polarization of the zeroth order beam and the 1st diffraction order beam. To make the two beams interfere with each other, a half waveplate is used to adjust the polarization to the same direction. The problem brought by the large angular deviation coefficient of AOD is the dispersion. As is described before, the relation between the deviation angle and the acoustic drive frequency is where λ is the wavelength of the light, f is the RF drive frequency, and v is the speed of acoustic wave in the crystal. Since femtosecond laser used in multiphoton microscopy are broadband laser, it suffers from large temporal dispersion and angular dispersion when entering AOD. The temporal dispersion results in increased pulse duration, reducing the excitation efficiency of multiphoton fluorescence signal. It can be compensated by a prism pair placed central symmetrically. Angular dispersion leads to the elongation of focus after the objective, which reduces the accuracy of PSF measurement.

[0110] FIG. 13 shows the single prism based angular dispersion compensation method for AOD in Multiplexing ALPHA-FSS according to one embodiment of the present invention. A single prism and another AOD device is used to compensate for the AOD-induced angular dispersion. Briefly, the prism or an AOD device is placed at an angle that deviates the beam into the same direction of the AOD. For the application of this invented multi-frequency ALPHA-FSS, another AOD cannot be used because the required purpose is to control the frequency of 1st order beam by the modulation AOD. For the prism compensation method, since a prism has a negative angular dispersion while the AOD has a positive angular dispersion  the angular dispersion can be compensated.

[0111] The angular dispersion induced by the compensating prism is determined by the material of the prism, the angular dispersion of the beam before entering the prism, and the incidence angle of the beam. The angular dispersion brought by the AOD can be calculated as:

[0112] In one embodiment, f=80MHz,  are set.

[0113] Therefore, the relation between the angular dispersion and the incidence angle can be represented in FIG. 14, which is the angular dispersion of a single prism at different incidence angle.

[0114] As is shown in FIG. 14, the incidence angle of the beam needs to be around 75 degrees to compensate all the angular dispersion. Since the dispersion compensation prism is normally designed to give 1 magnification and 0 reflection at Brewster angle and the Brewster angle can be calculated as the beam will be magnified in one direction after passing the prism at 75° incidence angle. When incidence angle is not at Brewster angle, the transmission of the prism will be reduced and the beam will expand in one direction, resulting in worse performance of the system.

[0115] FIG. 15 is the simulation result showing beam expansion ratio of single prism at different incidence angle. The reflectance and beam expansion ratio can be calculated based on geometric optics. At 75° incidence angle, 10%power of the incident beam will be reflected and the beam diameter will be expanded around 2.4X in one direction. The 10%reflectance reduces the system transmission, and the beam expansion leads to asymmetric point spread function.

[0116] To solve this problem, a dual-prism compensation method is proposed, which uses two prisms placed both at Brewster angle to compensate most of the AOD-induced angular dispersion. FIG. 16 is the schematic diagram of dual prism angular dispersion compensation.

[0117] FIG. 17 is the simulation result showing residual angular dispersion after a double prism configuration with Brewster incidence angle. The final dispersion is only -0.01rad / μm after dual SF10 prism placed at Brewster angle in theory, which is small enough for approximation of the stationary imaging beam.

[0118] By adjusting the incidence angle to Brewster angle, the beam diameter after passing the two prisms remains and the reflectance is 0 in theory. FIG. 18 is the CCD Image of deflected multiple beams after angular dispersion compensation through a dual-prism configuration. The experiment result shown in FIG. 18 proves that the dual-prism compensation method is effective in compensating the angular dispersion brought by AOD.

[0119] In some embodiments, the optical beam deflector 104 is implemented using an AOD configured to deflect incident optical beams into multiple first-order diffracted beams at different angles and frequencies. The AOD is driven by a plurality of RF tones, each corresponding to a distinct weak beam in the group of the second optical beams L2. This configuration enables frequency-encoded spatial multiplexing required for high-speed phase-modulated interference signal measurement in Multiplexing ALPHA-FSS. Due to the inherent angular dispersion introduced by the AOD, in some embodiments, the optical beam deflector 104 further comprises a dispersion compensation module optically coupled downstream of the AOD. The dispersion compensation module includes a pair of prisms arranged at Brewster angles to compensate for the angular dispersion and maintain collimation of the frequency-multiplexed beams. The dual-prism configuration preserves the beam quality of each weak beam across the spatial field and ensures accurate PSF sampling at the focal plane.

[0120] (IV) Reducing Intermodulation method

[0121] Because of nonlinearity in the system such as nonlinear acousto-optic interaction, multiphoton excitation and circuit nonlinearity, intermodulation noise exists when multiple frequencies are involved, which contributes to noise and disturbs the detected signal.

[0122] Among all the intermodulation terms in the nonlinear process, third order intermodulation (two-tone intermodulation) contributes most to the disturbance because its frequency is close to the target frequency and amplitude is relatively larger compared with the higher order intermodulation. In small signal approximation, the third order intermodulation in nonlinear acousto-optic interaction is proportional to the second power of the diffraction efficiency. Therefore, the intermodulation in this process can be reduced by lowering the drive power on the AOD. In some embodiments, since the intensity ration between the zeroth order beam and the 1st order beam is 10: 1, the reduce of the RF drive power will not influence much of the ALPHA-FSS.

[0123] In the process of two-photon excitation, the fluorescence signal excited by multiple frequencies can be simplified as equation (11) : {I (x1, x2, …, x8) ∝∫O (x′) |Escan (x′) +∑EPSF (x′-xi) exp(-jωit) |4dx′… (11)

[0124] Take expansion on the formula, the intermodulation terms with different frequencies can be found. The frequency components in the fluorescence signal can be further simplified as equation (12) : ωk+ω1-ωm-ωn… (12)

[0125] where ωk, ω1, ωm, ωn are any frequencies chosen from {ωi, 0} .

[0126] Based on this simplified model, the intermodulation term resulted from the multiphoton excitation can be well calculated. Since our target frequency for demodulation is ωi, the intermodulation terms close to the target frequency must be avoided to reduce the noise.

[0127] A frequency arrangement strategy in combination with searching algorithm is thus developed to solve this problem.

[0128] FIG. 19 is the diagram of optimizing frequency arrangement strategy. Briefly, the frequency distance between adjacent frequencies is first set two a constant. From analysis above, it can be found that the intermodulation term of adjacent frequencies will lies in another target frequency, resulting in the increased noise. Thus, the next step is to increase the frequency distance so that it increases along with the index of the drive frequency. In other words, the frequency distance is not kept constant but increases with the drive frequency. This results in a non-uniform arrangement {ωi} , and the third order intermodulation between any adjacent frequencies will not lies in the target frequency. To further reduce the intermodulation, a global searching algorithm can be used. Briefly, the strategy {ωi} is first selected as the base plan. Next, a small frequency adjustment Δωi is added to ωi and the new strategy {ωi+Δωi} is analyzed by the methods above to distinguish the intermodulation terms distribution. The intermodulation noise level is recorded, and the best new strategy is chosen according to the lowest noise level.

[0129] In some embodiments, the optical beam deflector 104 and the optical phase modulator 106 cooperate to implement a frequency-multiplexed modulation strategy that minimizes intermodulation artifacts. In some embodiments, the modulation frequencies assigned to the group of the second optical beams are selected such that no two frequencies are integer multiples of each other, or alternatively, are chosen as coprime numbers. This configuration reduces cross-product terms within the detection bandwidth. The optical phase modulator 106, operating under a multi-channel DDS, generates distinct RF signals with precise frequency spacing and amplitude control. Furthermore, the optical beam deflector 104 may be driven in a temporal grouping mode, where only a subset of frequency-encoded beams is active during a single measurement cycle. It reduces simultaneous beam interference and improves signal demodulation quality. Such temporal control is implemented via modulation timing logic embedded in the phase modulator 106 or its controller, which gates RF outputs accordingly.

[0130] (V) Relative phase and amplitude calibration method

[0131] Since there are different modulation frequencies in Multiplexing ALPHA-FSS, the demodulated phase of each frequency is not the same. Therefore, phase calibration needs to be performed to make the detected phase relative to the same initial value before merging the measured subframe point spread function. To simplify the process and reduces the error of calibration, we first use one beam ALPHA-FSS to measure a reference full frame PSF. Two-beam multiplexing is subsequently applied, with a frequency difference selected to induce a one-pixel lateral shift in the PSF frame. By this way, two subframes of PSF with one pixel shift are acquired. The raw detected phase of each frame has an initial phase difference which is unknown needs to be calibrated. Next, a global phase is added to the second subframe and the two subframes are merged to form a full frame. By changing the global phase from 0 to 2π, the phase of each full frame will change from chaos to a continue contour that is the same as the reference full frame PSF. In this way, the phase difference is acquired by selecting phase that gives the best similarity between the merged PSF and the reference PSF. Measuring all phase difference between adjacent modulation frequencies results in a raw look up table Next, a full look up table is calculated by adding the raw phase difference to provide the phase difference of each frequency relative to the initial frequency. When merging the PSF in practical use, the measured phase difference is added to each frequency and the phase of full frame PSF will be relative to the same initial frequency.

[0132] Because the diffraction efficiency of each modulation frequency is not completely the same and there is transmission difference in the electrical circuit, the measured amplitude of each subframe PSF is not the same. Therefore, it’s necessary to calibrate the amplitude to form a correct PSF. Briefly, the average amplitude of each subframe PSF is calculated as Ai. Next, the relative amplitude ratio of each frequency is calculated by using equation (13) :

[0133] where ri is the amplitude ratio relative to the first subframe PSF.

[0134] When merging the subframe, ri is multiplied to the amplitude of each pixel of corresponding subframe PSF and the calibrated PSF is acquired.

[0135] In some embodiments, the demodulation device 130 is further configured to perform relative phase and amplitude calibration across the group of the second optical beams L2. Such calibration may improve the accuracy of E-field point spread function reconstruction by compensating for phase delay and amplitude variation among different modulation channels.

[0136] (VI) Guide star tracing method

[0137] For in-vivo PSF measurement at awake live sample condition, the guide start is moving in the FOV, which requires tracking of guide star to make sure the measured PSF is correct. In detail, a tracing image Itr (x, y) with FOV of around 16μm is acquired at frame rate of around 50Hz to increase the tracing accuracy. Next, the approximate target guide star position is acquired by calculating the convolution of a gaussian kernel Kg (x, y) and the tracing image Itr (x, y) and select the position [x0, y0] with maximum convolution value. This step is efficient in avoiding the sidelobe of biological samples. Then a small box of image Isubtr (x, y) is cropped on the tracing image Itr (x, y) at position [x0, y0] . Finally, an iterated center algorithm is applied on the cropped tracing image to get the target guide star position [xt, yt] . The iterated center algorithm is described as follows.

[0138] Briefly, the center of mass (COM) of an image is calculated using the equation (14) :

[0139] Next, a subframe image is cropped with half size of previous image and centered at Cx, Cy. A new centre of the subframe C′x, C′yis iteratively calculated using the same formula. In this way, the COM is acquired iteratively to avoid the error brought by the background noise.

[0140] To evaluate the performance of the guide star tracing method, PSF measurement is performed using Multiplexing ALPHA-FSS method on a moving guide star after guide star tracing. Briefly, a motorized nanostage is used to generate a linear movement of the guide star in the imaging FOV and use the guide star tracing method to calculate the center of the guide star. A PSF is quickly measured right after the new center location is adjusted. FIG. 20 is the measured PSF with tracing method on when guide star is moving, and FIG. 21 is the measured PSF without tracing method on when guide star is moving. The PSF remains correct when the tracing method is on while the guide star is lost without the help of guide star tracing.

[0141] The foregoing describes one example of a practically realizable system architecture along with its operating principles and considerations. In other embodiments, alternative system configurations may be adopted as described below.

[0142] In contrast to the previously described embodiment, the configuration illustrated in FIG. 22 provides an optical system 400 with an optical routing and beam multiplexing layout according to some embodiments of the present invention. The optical system 400 is provided, which remains compatible with the same working principles described previously. In this arrangement, the optical beam generating path incorporates an AOD directly following a laser source, in which the AOD is driven by a set of radio-frequency tones generated by a DDS. The AOD diffracts the input beam into a strong zero-order beam and multiple first-order beams, each associated with a specific frequency shift and angular deflection.

[0143] These frequency-shifted beams are relayed through optical lenses and a scanner before being directed toward a wavefront modulation element (e.g., spatial light modulator, SLM) . Through the beam combining optics (e.g., PBS, mirrors, dichroic mirror) , the multiplexed beam array is ultimately directed into the sample via a high numerical aperture objective lens.

[0144] The frequency difference and angle of deflection introduced by the AOD establish distinct propagation directions for each modulated beam. These differences are optically mapped into the sample volume such that each beam is brought to focus at a different axial position, denoted as planes P1, P2, and P3 in the lower-right inset. These positions correspond to a set of effective excitation planes, distributed along the depth (z) direction of the sample. The axial spacing is determined by the combination of AOD angular dispersion, the downstream relay optics, and the focal properties of the objective lens. The resulting nonlinear signal is collected by a PMT and analyzed via frequency-domain demodulation, such as digital lock-in or FFT, to extract the amplitude and phase of the E-field PSF at each depth.

[0145] FIG. 23 illustrates a schematic diagram for a signal processing and demodulation architecture on the computing unit (e.g., personal computer; PC) of the system 400 of FIG. 22 according to one embodiment of the present invention. The architecture includes three functionally distinct modules: a reference generation module, a signal collection module, and a digital phase demodulation module.

[0146] In the reference generation module, a DDS generates a set of radio-frequency signals corresponding to the modulation frequencies applied to the weak optical beams. These frequencies are mixed with the laser repetition signal to produce a synchronized reference waveform. The output is filtered to remove high-frequency components and is digitized via a data acquisition (DAQ) interface for downstream analysis. Simultaneously, the signal collection module acquires the modulated fluorescence signal emitted from the sample using a PMT. The analog signal from the PMT is amplified and digitized in synchrony with the reference signal, ensuring temporal coherence between modulation and detection.

[0147] The digital phase demodulation module, executed on the PC, processes both the reference and signal waveforms. Each signal is transformed from the time domain into the frequency domain using Fourier transformation. From the frequency spectrum, the phase and amplitude corresponding to each modulation frequency are extracted. The reference phase is used as a baseline to compute the relative phase of each detected signal. Additionally, amplitude values are corrected using pre-calibrated normalization factors to account for channel-to-channel gain differences or optical path imbalance. The resulting phase and amplitude values are then combined to reconstruct the complex electric field for each optical path. This demodulated electric field data represents the spatially sampled PSFs corresponding to each weak beam in the system. These PSFs are used in subsequent steps for optical aberration analysis and wavefront correction, completing the closed-loop adaptive optics process.

[0148] In summary, the proposed multiplexing ALPHA-FSS framework offers a substantial advancement over conventional single-point adaptive optics approaches by enabling rapid, parallelized acquisition of aberration information. Through the coordinated use of frequency-multiplexed beam deflection and phase modulation, the system overcomes key limitations such as long correction time, motion sensitivity, and sample photodamage. By reconstructing the electric-field PSF across multiple spatial locations simultaneously and applying real-time corrections via the wavefront correction device, the proposed method achieves robust aberration compensation suitable for deep tissue imaging. These improvements highlight the practicality and performance advantages of the present system, establishing it as a highly efficient solution for high-resolution, in-vivo optical microscopy.

[0149] The functional units and modules of the apparatuses and methods in accordance with the embodiments disclosed herein may be implemented using computing devices, computer processors, or electronic circuitries including but not limited to application specific integrated circuits (ASIC) , field programmable gate arrays (FPGA) , microcontrollers, and other programmable logic devices configured or programmed according to the teachings of the present disclosure. Computer instructions or software codes executing in the computing devices, computer processors, or programmable logic devices can readily be prepared by practitioners skilled in the software or electronic art based on the teachings of the present disclosure.

[0150] All or portions of the methods in accordance with the embodiments may be executed in one or more computing devices including server computers, personal computers, laptop computers, mobile computing devices such as smartphones and tablet computers.

[0151] The embodiments may include computer storage media, transient and non-transient memory devices having computer instructions or software codes stored therein, which can be used to program or configure the computing devices, computer processors, or electronic circuitries to perform any of the processes of the present invention. The storage media, transient and non-transient memory devices can be included, but are not limited to, floppy disks, optical discs, Blu-ray Disc, DVD, CD-ROMs, and magneto-optical disks, ROMs, RAMs, flash memory devices, or any type of media or devices suitable for storing instructions, codes, and / or data.

[0152] Each of the functional units and modules in accordance with various embodiments also may be implemented in distributed computing environments and / or Cloud computing environments, wherein the whole or portions of machine instructions are executed in distributed fashion by one or more processing devices interconnected by a communication network, such as an intranet, Wide Area Network (WAN) , Local Area Network (LAN) , the Internet, and other forms of data transmission medium.

[0153] The foregoing description of the present invention has been provided for the purposes of illustration and description. It is not intended to be exhaustive or to limit the invention to the precise forms disclosed. Many modifications and variations will be apparent to the practitioner skilled in the art.

[0154] The embodiments were chosen and described in order to best explain the principles of the invention and its practical application, thereby enabling others skilled in the art to understand the invention for various embodiments and with various modifications that are suited to the particular use contemplated.

Claims

1.A multiplexing adaptive optics method for rapid, high-resolution imaging in deep tissue, comprising:providing a first optical beam and a group of second optical beams;modulating the second optical beams at distinct optical frequencies, respectively, wherein each of the second optical beams has an intensity lower than that of the first optical beam;combining the first optical beam and the group of the second optical beams with the first optical beam and the second optical beams being at least temporally overlapped with each other to form a composite excitation beam;focusing the composite excitation beam into a sample with each focus of the group of second optical beams spatially separated at a distance in the focal plane within the sample;detecting a first signal excited by the composite excitation beam from the sample;demodulating the first signal with reference signals to compute phase and amplitude information corresponding to each modulation frequency of the second optical beams and to obtain a second signal, wherein the formation of the second signal comprises a plurality of measurements of spatial positions of the first optical beam relative to the second optical beams;obtaining, for each of the second optical beams, a respective down-sampled electric-field point spread function representing a localized optical response at a distinct focal position within the sample, wherein each of the second optical beams is spatially separated and modulated at a distinct frequency; andmerging the down-sampled electric-field point spread functions together to compute a full-sampled point spread function of the composite excitation beam, thereby identifying and correcting optical aberrations within the sample.2.The method of claim 1, wherein the modulating the second optical beams comprises phase modulation, intensity modulation, or combinations thereof.3.The method of claim 2, wherein the phase modulation comprises performing at least one measurement for each spatial position of the first optical beam relative to the second optical beams.4.The method of claim 2, wherein the intensity modulation includes performing at least two measurements for each spatial position of the first optical beam relative to the second optical beams, and wherein a relative phase between the first optical beam and the second optical beams is varied between the two measurements.5.The method of claim 1, wherein the correcting the optical aberrations comprises updating a wavefront profile based on the full-sampled point spread function.6.The method of claim 1, wherein the reference signals have reference frequencies used in demodulating the first signal and selected from a group of modulation frequencies, harmonic frequencies, or combinations thereof.7.The method of claim 1, wherein the first optical beam is used for imaging the sample while the second optical beams are modulated or gated to prevent excitation during image acquisition.8.The method of claim 1, further comprising repeating the demodulating and the computing of the full-sampled point spread function until convergence to an accurate estimation of the optical aberration.9.The method of claim 1, wherein a plurality of second optical beams are modulated at distinct frequencies using phase modulation, intensity modulation, or combinations thereof to produce a plurality of detection signals, and wherein the detection signals are demodulated using multiple lock-in amplifiers or by applying computation-based demodulation at the respective modulation frequencies.10.A multiplexing adaptive optics system configured for rapid, high-resolution imaging in deep tissue, comprising:an optical beam generating device and an optical beam deflector collectively configured to generate a first optical beam and a group of second optical beams, wherein each of the second optical beams has lower intensity than that of the first optical beam, and wherein the optical beam deflector spatially separates the second optical beams by deflecting them at distinct angles according to their frequency components such that the second optical beams are encoded with distinct optical frequencies;an optical phase modulator configured to apply phase modulation to the second optical beams to encode temporal interference information;a focusing device configured to focus a composite excitation beam comprising the first optical beam and the second optical beams into the sample at a plurality of spatially distinct positions such that focuses of the group of the second optical beams are arranged at distinct positions separated by a distance in the focal plane within the sample;a detection device configured to detect a first signal emitted from a sample in response to excitation by the composite excitation beam; anda demodulation device configured to demodulate the first signal to obtain a second signal, wherein at least one down-sampled electric-field point spread function of the group of the second optical beams is obtained from the second signal by the demodulation device, thereby combining and identifying the down-sampled point spread function and then correct optical aberrations within the sample.11.[Rectified under Rule 91, 27.08.2025]The multiplexing adaptive optics system of claim 10, wherein the second signal comprises phase and amplitude of the down-sampled electric field point spread function of the group of the second optical beams, which are measured for a plurality of spatial positions of the first optical beam with respect to the group of the second optical beams.12.The multiplexing adaptive optics system of claim 11, further comprising:a computing unit configured to generate a full-sampled point spread function of the composite excitation beam based on the down-sampled electric-field point spread function and to determine the optical aberrations based on the full-sampled point spread function.13.The multiplexing adaptive optics system of claim 10, further comprising:an optical beam combination device configured to combine the first optical beam and the second optical beams into the composite excitation beam; andan optical path adjusting device configured to adjust an optical path length of at least one of the first and second optical beams such that the first optical beam and the second optical beams are temporally overlapped in the sample.14.The multiplexing adaptive optics system of claim 10, wherein the optical beam deflector serves as an optical splitting device selected from a polarized beam splitter, non-polarized beam splitter, acoustic optical modulator, acoustic optical deflector, or combinations thereof.15.The multiplexing adaptive optics system of claim 10, wherein the optical phase modulator is configured to apply at least one of phase modulation, intensity modulation, or combinations thereof to the second optical beams.16.The multiplexing adaptive optics system of claim 15, wherein the optical phase modulator performs the phase modulation including a linear function in time over the full phase ranging from –π to π, and wherein the optical phase modulator performs the phase modulation by selecting from a group of altering the optical path length, shifting the optical frequency of the group of the second optical beams, or combinations thereof, and the optical phase modulator is selected from a group of an electro optical intensity modulator, acoustic optical modulator, photoelastic modulator, optical chopper, or combinations thereof.17.The multiplexing adaptive optics system of claim 16, wherein the altering the optical path length is performed by selecting from a group of electro-optical phase modulator, piezo stage MEMS mirror, or combinations thereof, and wherein the shifting the optical frequency is performed by selecting from a group of acoustic optical modulator, acoustic optical deflector, acoustic optical frequency shifter, or combinations thereof.18.The multiplexing adaptive optics system of claim 10, further comprising:a reference signal generating device configured to generate reference signals corresponding to the modulation frequencies of the second optical beams, wherein the reference signals are used by the demodulation device to perform lock-in detection or digital computation for extracting phase and amplitude information from the first signal.19.The multiplexing adaptive optics system of claim 10, wherein the demodulation device is further configured to perform signal extraction using a plurality of lock-in amplifiers or a computation-based method utilizing modulation frequencies and harmonic components.

Images