Anti-VEGF-a antibodies and uses thereof

Abstract

Provided herein are anti-VEGF-A (vascular endothelial growth factor A) antibodies, antigen-binding fragments, and the uses thereof.

Description

ANTI-VEGF-A ANTIBODIES AND USES THEREOF

[0001] CLAIM OF PRIORITY

[0002] This application claims the benefit of PCT Application No. PCT / CN2024 / 127938, filed on October 29, 2024. The entire content of the foregoing is incorporated herein by reference.TECHNICAL FIELD

[0003] This disclosure relates to anti-VEGF-A (vascular endothelial growth factor A) antibodies, antigen-binding fragments, and the uses thereof.BACKGROUND

[0004] Therapeutic antibodies are one of the fastest growing classes of therapeutic compounds, rapidly outpacing the growth of small-molecule drugs. For example, monoclonal antibodies have revolutionized cancer therapy. However, delivery to tumor cells in vivo is hampered by the large size of conventional antibodies. The minimal target recognition module of a conventional antibody is composed of two non-covalently associated variable domains (VH and VL) . The inherent hydrophobic interaction of VH and VL domains limits the stability and solubility of engineered antibodies, often causing aggregation and / or mispairing of V-domains.

[0005] The discovery of heavy-chain antibodies has given rise to unprecedented opportunities in impacting cancer therapy. These unique forms of camelid-derived antibodies lack the entire light chain and the CH1 domain and are only composed of a single variable domain termed VHH. Recombinant VHHs are small (15-20 kDa) and strictly monomeric; they bind their target with nM affinity as well as with being stable in a broad pH and temperature ranges. Molecular manipulation is also easier with VHH; this facilitates the production of multivalent formats of monoclonal antibodies compared with conventional recombinant antibodies and their fragments, which is problematic due to aggregation and reduced affinity. Moreover, VHH often binds to epitopes that are less immunogenic for conventional antibodies.

[0006] Usually, the therapeutic antibodies are human or humanized antibodies. The human or humanized antibodies can be generated by humanization of a rodent antibody (e.g., a mouse antibody) or by using phage libraries. However, these animals or phage libraries usually cannot produce heavy chain antibodies. Instead, heavy chain antibodies are often obtained from camelid heavy chain antibodies. These camelid heavy chain antibodies need to be humanized. The humanization process may adversely affect the binding affinity and introduce immunogenic epitopes to the antibodies. Iterative and time-consuming experiments are often required to improve the properties of these antibodies. And in some cases, these antibodies can also be immunogenic in patients, leading to attenuation of their efficacy over time. Therefore, there is a need to develop more forms of antibodies to treat or prevent human diseases.SUMMARY

[0007] The present disclosure relates to an antibody or antigen-binding fragment thereof that binds to vascular endothelial growth factor A (VEGF-A) , comprising: a heavy chain single variable domain (VHH) comprising complementarity determining regions (CDRs) 1, 2, and 3, in some embodiments, the VHH CDR1 comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to a selected VHH CDR1 amino acid sequence, the VHH CDR2 comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to a selected VHH CDR2 amino acid sequence, and the VHH CDR3 comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to a selected VHH CDR3 amino acid sequence; in some embodiments, the selected VHH CDRs 1, 2, and 3 amino acid sequences are one of the following:

[0008] (1) the selected VHH CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 1, 2, and 3, respectively; and

[0009] (2) the selected VHH CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 4, 5, and 6, respectively.

[0010] In some embodiments, the VHH comprises CDRs 1, 2, 3 with the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 1, 2, and 3, respectively. In some embodiments, the VHH comprises CDRs 1, 2, 3 with the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 4, 5, and 6, respectively.

[0011] In one aspect, the disclosure is related to an antibody or antigen-binding fragment thereof that binds to VEGF-A comprising a heavy chain single variable region (VHH) comprising an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 7 or 12.

[0012] In some embodiments, the VHH comprises the sequence of SEQ ID NO: 7.

[0013] In some embodiments, the VHH comprises the sequence of SEQ ID NO: 12.

[0014] In some embodiments, the antibody or antigen-binding fragment specifically binds to a human VEGF-A, a monkey VEGF-A, a mouse VEGF-A, or a chimeric VEGF-A. In some embodiments, the antibody or antigen-binding fragment is a human or humanized antibody or antigen-binding fragment thereof. In some embodiments, the antibody or antigen-binding fragment is a multi-specific antibody (e.g., a bispecific antibody) .

[0015] In one aspect, the disclosure is related to an antibody or antigen-binding fragment thereof comprising the VHH CDRs 1, 2, 3, of the antibody or antigen-binding fragment thereof as described herein.

[0016] In some embodiments, the antibody or antigen-binding fragment comprises a human IgG Fc (e.g., a human IgG1 Fc) . In some embodiments, the antibody or antigen-binding fragment comprises two or more heavy chain single variable domains.

[0017] In one aspect, the disclosure is related to a nucleic acid comprising a polynucleotide encoding the antibody or antigen-binding fragment thereof as described herein. In some embodiments, the nucleic acid is cDNA.

[0018] In one aspect, the disclosure is related to a vector comprising one or more of the nucleic acids as described herein.

[0019] In one aspect, the disclosure is related to a cell comprising the vector as described herein. In some embodiments, the cell is a CHO cell.

[0020] In one aspect, the disclosure is related to a cell comprising one or more of the nucleic acids described herein.

[0021] In one aspect, the disclosure is related to a method of producing an antibody or an antigen-binding fragment thereof, the method comprising (a) culturing the cell as described herein under conditions sufficient for the cell to produce the antibody or the antigen-binding fragment thereof; and (b) collecting the antibody or the antigen-binding fragment thereof produced by the cell.

[0022] In one aspect, the disclosure is related to an antibody-drug conjugate comprising the antibody or antigen-binding fragment thereof as described herein covalently bound to a therapeutic agent. In some embodiments, the therapeutic agent is a cytotoxic or cytostatic agent.

[0023] In one aspect, the disclosure is related to a method of treating a subject having a cancer, retinal condition or immune disorder, the method comprising administering a therapeutically effective amount of a composition comprising the antibody or antigen-binding fragment thereof, or the antibody-drug conjugate as described herein, to the subject. In some embodiments, the cancer is gastric cancer, hepatocellular carcinoma, colon carcinoma, rectal carcinoma, colorectal cancer, glioma, lung cancer (e.g., non-small cell lung cancer) , or breast cancer. In some embodiments, the retinal condition is age-related macular degeneration, retinal vein occlusion or diabetic macular edema. In some embodiments, the immune disorder is rheumatoid arthritis, psoriasis or Grave's Disease. In some embodiments, the subject described herein is a human subject.

[0024] In one aspect, the disclosure is related to a pharmaceutical composition comprising the antibody or antigen-binding fragment thereof as described herein, and a pharmaceutically acceptable carrier.

[0025] In one aspect, the disclosure is related to a pharmaceutical composition comprising the antibody drug conjugate as described herein, and a pharmaceutically acceptable carrier.

[0026] In one aspect, the disclosure is related to an antibody or antigen-binding fragment thereof that cross-competes with the antibody or antigen-binding fragment thereof as described herein.

[0027] Unless otherwise defined, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which this invention belongs. Methods and materials are described herein for use in the present invention; other, suitable methods and materials known in the art can also be used. The materials, methods, and examples are illustrative only and not intended to be limiting. All publications, patent applications, patents, sequences, database entries, and other references mentioned herein are incorporated by reference in their entirety. In case of conflict, the present specification, including definitions, will control.

[0028] Other features and advantages of the invention will be apparent from the following detailed description and figures, and from the claims.DESCRIPTION OF DRAWINGS

[0029] FIG. 1 lists CDR sequences of heavy chain variable region of anti-VEGF-A antibody according to Kabat numbering and IMGT numbering.

[0030] FIG. 2 lists amino acids sequences discussed in the disclosure.

[0031] FIG. 3 shows the binding curve of anti-VEGF-A antibody 2D1 to human VEGF-A protein. Bevacizumab analog was used as a reference antibody.

[0032] FIG. 4 shows the blocking curve of anti-VEGF-A antibody 2D1. Bevacizumab analog was used as a reference antibody.

[0033] FIG. 5 shows anti-VEGF-A antibody 2D1 inhibited VEGF-A-induced HUVECs proliferation. Bevacizumab analog was used as a reference antibody.

[0034] FIG. 6 shows the average tumor volumes in different groups of B-NDG mice that were injected with U-87 MG cells, and were treated with PBS or antibodies.

[0035] FIG. 7 shows the average tumor volumes in different groups of B-NDG mice that were engrafted with patient-derived colorectal tumor fragments (2 mm×2 mm×2 mm) , and were treated with antibodies.

[0036] FIG. 8 shows the average tumor volumes in different groups of B-NDG mice that were engrafted with patient-derived colorectal tumor fragments (2 mm×2 mm×2 mm) , and were treated with antibodies.DETAILED DESCRIPTION

[0037] A heavy-chain antibody (or heavy chain-only antibody) is an antibody which has only heavy chains (generally two heavy chains) and lacks the two light chains usually found in antibodies. Naturally occurring heavy-chain antibodies have been discovered in cartilaginous fishes (e.g., shark) and camelids (e.g., llama) . For example, in cartilaginous fishes, the immunoglobulin new antigen receptor (IgNAR) is a heavy-chain antibody. IgNAR shows significant structural differences to other antibodies. It has five constant domains (CH) per chain instead of the usual three, several disulfide bonds in unusual positions, and the complementarity-determining region 3 (CDR3) forms an extended loop covering the site which binds to a light chain in other antibodies. These differences, in combination with the phylogenetic age of the cartilaginous fishes, have led to the hypothesis that IgNAR could be more closely related to a primordial antigen-binding protein than the mammalian immunoglobulins.

[0038] The only mammals with heavy-chain (IgG-like) antibodies are camelids such as dromedaries, camels, llamas and alpacas. Like all mammals, camelids (e.g., llamas) can produce conventional antibodies made of two heavy chains and two light chains bound together with disulfide bonds in a Y shape (e.g., IgG1) . However, they also produce two unique subclasses of IgG: IgG2 and IgG3, also known as heavy chain IgG. These antibodies are made of only two heavy chains, which lack the CH1 region but still bear an antigen-binding domain (e.g., VHH) at their N-terminus. Conventional Ig require the association of variable regions from both heavy and light chains to allow a high diversity of antigen-antibody interactions. Although isolated heavy and light chains still show this capacity, they exhibit very low affinity when compared to paired heavy and light chains. The unique feature of heavy chain IgG is the capacity of their monomeric antigen binding regions to bind antigens with specificity, affinity and especially diversity that are comparable to conventional antibodies without the need of pairing with another region. This feature is mainly due to a couple of major variations within the amino acid sequence of the variable region of the two heavy chains, which induce deep conformational changes when compared to conventional Ig. Major substitutions in the variable regions prevent the light chains from binding to the heavy chains, but also prevent unbound heavy chains from being recycled by the Immunoglobulin Binding Protein.

[0039] The single variable domain of these heavy-chain antibodies (designated VHH, sdAb, or nanobody) is the smallest antigen-binding domain generated by adaptive immune systems. The Complementarity Determining Region 3 (CDR3) of the variable region of these antibodies has often been found to be twice as long as the conventional ones. This results in an increased interaction surface with the antigen as well as an increased diversity of antigen-antibody interactions, which compensates the absence of the light chains. With a long complementarity-determining region 3 (CDR3) , VHHs can extend into crevices on proteins that are not accessible to conventional antibodies, including functionally interesting sites such as the active site of an enzyme or the receptor-binding canyon on a virus surface. Moreover, an additional cysteine residue allows the structure to be more stable, thus increasing the strength of the interaction.

[0040] VHHs offer numerous other advantages compared to conventional antibodies carrying variable domains (VH and VL) of conventional antibodies, including higher stability, solubility, expression yields, and refolding capacity, as well as better in vivo tissue penetration. Moreover, in contrast to the VH domains of conventional antibodies, VHH do not display an intrinsic tendency to bind to light chains. This facilitates the induction of heavy chain antibodies in the presence of a functional light chain loci. Further, since VHH do not bind to VL domains, it is much easier to reformat VHHs into bispecific antibody constructs than constructs containing conventional VH-VL pairs or single domains based on VH domains.

[0041] A notable difference between the camelid VHH and the human VH domain is the length and orientation of the CDR3 loop. The CDR3 corresponds to the unique region of the antibody molecule that is encoded by a DNA element newly generated during B-cell development. Genetic recombination results in the fusion of a D-element with flanking V-and J-elements. During recombination further genetic diversity is generated by addition and / or deletion of nucleotides at the junctions. Thereby, the CDR3 loop provides the major contribution to antibody diversity and specificity. A limited number of variable region genes (IGHV, IGHD, and IGHJ) in some early transgenic heavy chain antibody animals, results in some antigens not being recognized by these animals, despite potent antigen response by wildtype animals (Janssens, Rick, et al., "Generation of heavy-chain-only antibodies in mice. " Proceedings of the National Academy of Sciences 103.41 (2006) : 15130-15135) . The present disclosure provides fully humanized heavy chain antibodies generated by genetically modified animals that have complete human heavy chain antibody repertoires.

[0042] As used herein, the term “antibody” refers to any antigen-binding molecule that contains at least one (e.g., one, two, three, four, five, or six) complementary determining region (CDR) (e.g., any of the three CDRs from an immunoglobulin light chain or any of the three CDRs from an immunoglobulin heavy chain) and is capable of specifically binding to an epitope. Non-limiting examples of antibodies include: monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, multi-specific antibodies (e.g., bi-specific antibodies) , single-chain antibodies, heavy chain antibodies, chimeric antibodies, human antibodies, and humanized antibodies. In some embodiments, an antibody can contain an Fc region of a human antibody. The term antibody also includes derivatives, e.g., bi-specific antibodies, single-chain antibodies, diabodies, linear antibodies, and multi-specific antibodies formed from antibody fragments.

[0043] As used herein, the term “antigen-binding fragment” refers to a portion of a full-length antibody, wherein the portion is capable of specifically binding to an antigen. In some embodiments, the antigen-binding fragment contains at least one variable domain (e.g., a variable domain of a heavy chain or a variable domain of light chain) . Non-limiting examples of antibody fragments include, e.g., Fab, Fab’ , F(ab’ ) 2, and Fv fragments.

[0044] As used herein, the term “human antibody” refers to an antibody that is encoded by a nucleic acid (e.g., rearranged human immunoglobulin heavy or light chain locus) present in a human. In some embodiments, a human antibody is collected from a human or produced in a human cell culture (e.g., human hybridoma cells) . In some embodiments, a human antibody is produced in a non-human cell (e.g., a mouse or hamster cell line) . In some embodiments, a human antibody is produced in a bacterial or yeast cell. In some embodiments, a human antibody is produced in a transgenic non-human animal (e.g., a mouse) containing an unrearranged or rearranged human immunoglobulin locus (e.g., heavy or light chain human immunoglobulin locus) .

[0045] As used herein, the term “chimeric antibody” refers to an antibody that contains a sequence present in at least two different antibodies (e.g., antibodies from two different mammalian species such as a human and a mouse antibody) . A non-limiting example of a chimeric antibody is an antibody containing the variable domain sequences (e.g., all or part of a light chain and / or heavy chain variable domain sequence) of a human antibody and the constant domains of a non-human antibody. Additional examples of chimeric antibodies are described herein and are known in the art.

[0046] As used herein, the term “humanized antibody” refers to a non-human antibody which contains sequence derived from a non-human (e.g., mouse) immunoglobulin and contains sequences derived from a human immunoglobulin.

[0047] As used herein, the term “single-chain antibody” refers to a single polypeptide that contains at least two immunoglobulin variable domains (e.g., a variable domain of a mammalian immunoglobulin heavy chain or light chain) that is capable of specifically binding to an antigen.

[0048] As used herein, the term “heavy-chain antibody” refers to an antibody molecule which is composed only of heavy chains (generally two) and does not have any light chains.

[0049] As used herein, the term “VHH” refers to the variable domain derived from a heavy-chain antibody. The VHH can specifically recognize an antigen without the need to be paired with a VL. In some embodiments, the VHH (also known as sdAb or nanobody) described herein is derived from any of the humanized heavy-chain antibody described herein. In some embodiments, the VHH, sdAb, or nanobody described herein is derived from the heavy chain antibody produced by any of genetically modified non-human animal.

[0050] As used herein, the terms “subject” and “patient” are used interchangeably throughout the specification and describe an animal, human or non-human. Veterinary and non-veterinary applications are contemplated by the present disclosure. Human patients can be adult humans or juvenile humans (e.g., humans below the age of 18 years old) . In addition to humans, patients include but are not limited to mice, rats, hamsters, guinea-pigs, rabbits, ferrets, cats, dogs, and primates. Included are, for example, non-human primates (e.g., monkey, chimpanzee, gorilla, and the like) , rodents (e.g., rats, mice, gerbils, hamsters, ferrets, rabbits) , lagomorphs, swine (e.g., pig, miniature pig) , equine, canine, feline, bovine, and other domestic, farm, and zoo animals.

[0051] As used herein, when referring to an antibody, the phrases “specifically binding” and “specifically binds” mean that the antibody interacts with its target molecule preferably to other molecules, because the interaction is dependent upon the presence of a particular structure (i.e., the antigenic determinant or epitope) on the target molecule; in other words, the reagent is recognizing and binding to molecules that include a specific structure rather than to all molecules in general. An antibody that specifically binds to the target molecule may be referred to as a target-specific antibody.

[0052] As used herein, the terms “polypeptide, ” “peptide, ” and “protein” are used interchangeably to refer to polymers of amino acids of any length of at least two amino acids.

[0053] As used herein, the terms “polynucleotide, ” “nucleic acid molecule, ” and “nucleic acid sequence” are used interchangeably herein to refer to polymers of nucleotides of any length of at least two nucleotides, and include, without limitation, DNA, RNA, DNA / RNA hybrids, and modifications thereof.

[0054] Antibodies and Antigen Binding Fragments

[0055] The present disclosure provides antibodies and antigen-binding fragments thereof (e.g., heavy chain antibodies, humanized heavy chain antibodies, or multi-specific antibodies) that are produced by the methods described herein.

[0056] In general, conventional antibodies are made up of two classes of polypeptide chains, light chains and heavy chains. A non-limiting antibody of the present disclosure can be an intact, four-immunoglobulin-chain antibody comprising two heavy chains and two light chains. The heavy chain of the antibody can be of any isotype including IgM, IgG, IgE, IgA, or IgD or subclasses including IgG1, IgG2, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgG4, IgE1, IgE2, etc. The light chain can be a kappa light chain or a lambda light chain. An antibody can comprise two identical copies of a light chain and two identical copies of a heavy chain. The heavy chains, which each contain one variable domain (or variable region, VH) and multiple constant domains (or constant regions) , bind to one another via disulfide bonding within their constant domains to form the “stem” of the antibody. The light chains, which each contain one variable domain (or variable region, VL) and one constant domain (or constant region) , each bind to one heavy chain via disulfide binding. The variable region of each light chain is aligned with the variable region of the heavy chain to which it is bound. The variable regions of both the light chains and heavy chains contain three hypervariable regions sandwiched between more conserved framework regions (FR) .

[0057] These hypervariable regions, known as the complementary determining regions (CDRs) , form loops that comprise the principle antigen binding surface of the antibody. The four framework regions largely adopt a beta-sheet conformation and the CDRs form loops connecting, and in some cases forming part of, the beta-sheet structure. The CDRs in each chain are held in close proximity by the framework regions and, with the CDRs from the other chain, contribute to the formation of the antigen-binding region.

[0058] Methods for identifying the CDR regions of an antibody by analyzing the amino acid sequence of the antibody are well known, and a number of definitions of the CDRs are commonly used. The Kabat definition is based on sequence variability, and the Chothia definition is based on the location of the structural loop regions. These methods and definitions are described in, e.g., Martin, "Protein sequence and structure analysis of antibody variable domains, " Antibody engineering, Springer Berlin Heidelberg, 2001. 422-439; Abhinandan, et al. "Analysis and improvements to Kabat and structurally correct numbering of antibody variable domains, " Molecular immunology 45.14 (2008) : 3832-3839; Wu, T. T. and Kabat, E. A. (1970) J. Exp. Med. 132: 211-250; Martin et al., Methods Enzymol. 203: 121-53 (1991) ; Morea et al., Biophys Chem. 68 (1-3) : 9-16 (Oct. 1997) ; Morea et al., J Mol Biol. 275 (2) : 269-94 (Jan . 1998) ; Chothia et al., Nature 342 (6252) : 877-83 (Dec. 1989) ; Ponomarenko and Bourne, BMC Structural Biology 7: 64 (2007) ; each of which is incorporated herein by reference in its entirety.

[0059] The CDRs are important for recognizing an epitope of an antigen. As used herein, an “epitope” is the smallest portion of a target molecule capable of being specifically bound by the antigen binding domain of an antibody. The minimal size of an epitope may be about three, four, five, six, or seven amino acids, but these amino acids need not be in a consecutive linear sequence of the antigen’s primary structure, as the epitope may depend on an antigen’s three-dimensional configuration based on the antigen’s secondary and tertiary structure.

[0060] In some embodiments, the antibody is an intact immunoglobulin molecule (e.g., IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG2c, IgG3, IgG4, IgM, IgD, IgE, IgA) . The IgG subclasses (IgG1, IgG2, IgG3, and IgG4) are highly conserved, differ in their constant region, particularly in their hinges and upper CH2 domains. The sequences and differences of the IgG subclasses are known in the art, and are described, e.g., in Vidarsson, et al., "IgG subclasses and allotypes: from structure to effector functions. " Frontiers in immunology 5 (2014) ; Irani, et al., "Molecular properties of human IgG subclasses and their implications for designing therapeutic monoclonal antibodies against infectious diseases. " Molecular immunology 67.2 (2015) : 171-182; Shakib, Farouk, ed., "The human IgG subclasses: molecular analysis of structure, function and regulation. " Elsevier, 2016; each of which is incorporated herein by reference in its entirety. The heavy chain constant regions in the heavy chain antibodies can be derived from any immunoglobulin molecules described herein (e.g., IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG2c, IgG3, IgG4, IgM, IgD, IgE, IgA) .

[0061] The antibody can also be an immunoglobulin molecule that is derived from any species (e.g., human, rodent, mouse, rat, camelid) . Antibodies disclosed herein also include, but are not limited to, polyclonal, monoclonal, monospecific, multi-specific antibodies, and chimeric antibodies that include an immunoglobulin binding domain fused to another polypeptide. The term “antigen binding domain” or “antigen binding fragment” is a portion of an antibody that retains specific binding activity of the intact antibody, i.e., any portion of an antibody that is capable of specific binding to an epitope on the intact antibody’s target molecule. It includes, e.g., Fab, Fab', F (ab') 2, and variants of these fragments. Thus, in some embodiments, an antibody or an antigen binding fragment thereof can be, e.g., a scFv, a Fv, a Fd, a dAb, a bispecific antibody, a bispecific scFv, a diabody, a linear antibody, a single-chain antibody molecule, a multi-specific antibody formed from antibody fragments, and any polypeptide that includes a binding domain which is, or is homologous to, an antibody binding domain. Non-limiting examples of antigen binding domains include, e.g., the heavy chain and / or light chain CDRs of an intact antibody, the heavy and / or light chain variable regions of an intact antibody, full length heavy or light chains of an intact antibody, or an individual CDR from either the heavy chain or the light chain of an intact antibody.

[0062] In some embodiments, the antigen binding fragment can form a part of a chimeric antigen receptor (CAR) . In some embodiments, the chimeric antigen receptor are fusions of VHH as described herein, fused to CD3-zeta transmembrane and endodomain.

[0063] The antibodies and antigen-binding fragments thereof (e.g., humanized antibodies or chimeric antibodies) that are produced by the methods described herein have various advantages. In some embodiments, no further optimization is required to obtain desired properties (e.g., binding affinities, thermal stabilities, and / or limited aggregation) .

[0064] In some implementations, the antibody (or antigen-binding fragments thereof) specifically binds to a target with a dissociation rate (koff) of less than 0.1 s-1, less than 0.01 s-1, less than 0.001 s-1, less than 0.0001 s-1, or less than 0.00001 s-1. In some embodiments, the dissociation rate (koff) is greater than 0.01 s-1, greater than 0.001 s-1, greater than 0.0001 s-1, greater than 0.00001 s-1, or greater than 0.000001 s-1.

[0065] In some embodiments, kinetic association rates (kon) are greater than 1 x 102 / Ms, greater than 1 x 103 / Ms, greater than 1 x 104 / Ms, greater than 1 x 105 / Ms, or greater than 1 x 106 / Ms. In some embodiments, kinetic association rates (kon) are less than 1 x 105 / Ms, less than 1 x 106 / Ms, or less than 1 x 107 / Ms.

[0066] Affinities can be deduced from the quotient of the kinetic rate constants (KD=koff / kon) . In some embodiments, KD is less than 1 x 10-6 M, less than 1 x 10-7 M, less than 1 x 10-8 M, less than 1 x 10-9 M, less than 1 x 10-10 M, less than 1 x 10-11 M, less than 1 x 10-12 M, or less than 1 x 10-13 M. In some embodiments, the KD is less than 50 nM, 40 nM, 30 nM, 20 nM, 15 nM, 10 nM, 9 nM, 8 nM, 7 nM, 6 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM, or 1 nM. In some embodiments, KD is greater than 1 x 10-7 M, greater than 1 x 10-8 M, greater than 1 x 10-9 M, greater than 1 x 10-10 M, greater than 1 x 10-11 M, or greater than 1 x 10-12 M. In some embodiments, the antibody binds to a target with KD less than or equal to about 0.9 nM, 0.8 nM, 0.7 nM, 0.6 nM, 0.5 nM, 0.4 nM, 0.3 nM, 0.2 nM, or 0.1 nM.

[0067] In some embodiments, thermal stabilities are determined. The antibodies or antigen binding fragments as described herein can have a Tm greater than 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, or 95 ℃.

[0068] In various embodiments, substitutions are performed to a parental heavy chain antibody sequence to make a variant heavy chain antibody. In general, a heavy chain antibody variant of a parental heavy chain antibody has an antigen binding affinity that is at least 10%, at least 20%, at least 30%, at least 40%, at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 80%, at least 90%or at least 100% (e.g., at least 150%, at least 200%, at least 500%, at least 1000%, or up to at least 10, 000%) of the binding affinity of the parental heavy chain antibody to a particular antigen. In some embodiments, a variant heavy chain antibody will comprise a single substitution as compared to a parental heavy chain antibody. However, in other embodiments, several amino acids, e.g., up to about 5 or 10 or more, are substituted as compared to the parental heavy chain antibody sequence that are derived from other human heavy chain sequences that share identity at a given position. In various embodiments, the resultant variant heavy chain antibody is tested to confirm that the desired binding affinity and / or specificity has not been significantly decreased by the replacement residues. In some embodiments, an improved variant heavy chain antibody is produced by the substitution of amino acids from a different human heavy chain sequence. In various embodiments, the VHH is at least 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to a parental VHH.

[0069] The VHH described herein can be used to make multi-specific (e.g., bispecific antibodies) . In one aspect, the present disclosure provides a multi-specific antibody comprising: a first antigen binding portion and a second antigen binding portion. In some embodiments, the first antigen binding portion comprises a heavy chain variable domain (VH) and a light chain variable domain (VL) , wherein the VH and VL together form an antigen-binding site that specifically binds a first epitope. In some embodiments, the first antigen binding portion comprises a VHH that specifically binds a first epitope. In some embodiments, the second antigen binding portion comprises a VHH that specifically binds a second epitope. In some embodiments, the first epitope and the second epitope are from the same antigen. In some embodiments, the first epitope and the second epitope are from different antigens.

[0070] In some embodiments, the first antigen binding portion is a full-length antibody consisting of two heavy chains and two light chains. In some embodiments, the first antigen binding portion is an antibody fragment comprising a heavy chain comprising the VH and a light chain comprising the VL. In some embodiments, the second antigen binding portion comprises a single polypeptide chain. In some embodiments, the C terminus of the second antigen binding portion is fused to the N-terminus of at least one heavy chain of the first antigen binding portion. In some embodiments, the C terminus of the second antigen binding portion is fused to the N-terminus of at least one light chain of the first antigen binding portion. In some embodiments, the N terminus of the second antigen binding portion is fused to the C-terminus of at least one heavy chain of the first antigen binding portion. In some embodiments, the N terminus of the second antigen binding portion is fused to the C-terminus of at least one light chain of the first antigen binding portion. In some embodiments, the second antigen binding portion is a Fab-like domain comprising a first polypeptide chain comprising a first VHH fused to a CH1 domain, and a second polypeptide chain comprising a second VHH fused to a CL domain.

[0071] In some embodiments, the antibody or antigen-binding fragment thereof is a tri-specific antibody. In some embodiments, the tri-specific antibody is a tri-specific VHH-Fc. In some embodiments, the tri-specific antibody comprises the same VHHs. In some embodiments, the tri-specific antibody comprises different VHHs. In some embodiments, the VHHs bind to the same epitope. In some embodiments, the VHHs bind to different epitopes.

[0072] In some embodiments, the antibody or antigen-binding fragment thereof has four or more than four VHHs. In some embodiments, in order to increase developability, at least four VHHs are combined without the addition of IgG Fc domain to construct tetra-specific VHHs. These molecules would have the added advantage of increased affinity and avidity towards the antigen compared to bi-and tri-specific VHH-Fcs, despite lacking the Fc effector functions.

[0073] In some embodiments, these the antibody or antigen-binding fragment thereof (e.g., comprising 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, or more than 10) has a functional Fc.

[0074] In some embodiments, the heavy-chain antibody has a VHH domain that includes CDR1, CDR2, and CDR3. In some embodiments, the CDR3 length is between 6-23, e.g., 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 or 23. In some embodiments, the CDR3 length is at least 6, at least 7, at least 8, at least 9, at least 10, at least 11, at least 12, at least 13, at least 14, at least 15, at least 16, at least 17, at least 18, at least 19, at least 20, at least 21, at least 22, or at least 23.

[0075] Vascular endothelial growth factor A (VEGF-A)

[0076] VEGF-A, also known as vascular permeability factor (VFP) , a homodimeric glycoprotein of approximately 45 kDa, is one member of the VEGF family of growth factors, largely known for its ability to promote endothelial proliferation and its role as a potent angiogenic factor. In humans, VEGF-A gene locus is on chromosome 6p21.1 and contains eight exons and seven introns. Through alternative splicing, human VEGF-A is represented by multiple isoforms. The four major expressed variants are 121, 165, 189 and 206 amino acids long, with the VEGF-A165 representing the predominant species of VEGF-A. The larger isoforms, VEGF-A165, VEGF-A189 and VEGF-A206, are basic and bind to isolated heparin and heparin proteoglycans distributed on cellular surfaces and extracellular matrices. The VEGF short form, VEGF-A121, is acidic and is more freely diffusible. VEGF isoforms, with their differences in biotransport, sequestration and receptor binding, induce a spectrum of vascular phenotypes from the malformed, edematous, hypovascular networks of VEGF-A121 due to dilated and poorly branched vessel generation to the stable, thin and branching vessels of VEGF-A189. These vascular phenotypes are related to the ability of VEGF-A isoforms to induce the sprouting, migratory phenotype. VEGF-A165 is the first isoform characterized and as a potent stimulator of angiogenesis. Its expression is adequate neonatal growth and has been well documented in tissues during physiological and / or pathological conditions.

[0077] The physiological effects of VEGF-A are driven by the binding to two homologous VEGF-A receptors. These receptors are known as VEGFR1 (also known as FLT1 in mice) and VEGFR2 (also known as KDR or FLK1 in mice) . They are encoded by separate genes and are members of the class IV receptor tyrosine kinase family. They have seven immunoglobulin-like domains in the extracellular domain, a single transmembrane region, and a consensus tyrosine kinase sequence that is interrupted by a kinase-insert domain and are expressed mainly on ECs and haematopoietic cells, although a lower level of expression has been reported also in other cell types. Binding to VEGFR2 mediates most of VEGF-A's iconic functions: endothelial cell proliferation and angiogenesis, while binding to VEGFR1 promotes immune cell migration into the parenchyma as well as serving a regulatory role, modulating the effects of VEGFR2. The effects of VEGF-A-VEGFR can be further modulated by neuropilin (Nrp) 1 and 2. Nrp1 and Nrp2 are single pass transmembrane proteins that act as co-receptors to VEGFR1 and 2. Nrp1 and Nrp2 have short enzymatically inactive intracellular domains that bind secondary proteins to enhance VEGF-A signaling. Activated VEGFR can still function without the neuropilin co-receptors, although the strength of the signal is decreased. VEGF-A is constitutively expressed at low levels and is quickly upregulated during wound healing in cases of blood vessel damage, neuronal damage, or ischemia.

[0078] The consistently high expression of VEGF-A and its receptors in human tumours and numerous studies in mouse models showing robust tumour suppression using VEGF pathway inhibitors provided a rationale for targeting this pathway. Bevacizumab, a fully humanized IgG1 molecule of 148 kDa binding VEGF-A isoforms, was approved by the FDA for the treatment of advanced colon cancer and has since been approved for the treatment of several other cancer types. VEGFRs have also been targeted for the development of anti-angiogenic therapies. Ramucirumab, a human anti-VEGFR2 antibody, was approved for the treatment of gastric cancer, lung cancer (e.g., non-small cell lung cancer) , colorectal cancer and hepatocellular carcinoma.

[0079] In 1994, high VEGF levels were measured in eye fluids from patients with proliferative retinopathies secondary to diabetes and other conditions. Additionally, high VEGF-A expression was reported in tissues associated with neovascular age-related macular degeneration (AMD) , and VEGF inhibitors were shown to suppress angiogenesis in models of retinal ischaemia and choroidal neovascularization. This body of evidence provided a rationale for testing anti-VEGF agents in intraocular neovascular disorders. Indeed, several anti-VEGF agents were tested and then approved for the treatment of these diseases. Bevacizumab is widely used off-label for the treatment of neovascular AMD, diabetic macular oedema and retinal vein occlusion, although it only has FDA approval for the treatment of cancer. Other anti-VEGF agents that have been recently approved by the FDA as therapeutics for multiple intraocular neovascular disorders include Brolucizumab, a single-chain variable fragment that targets VEGF-A, and Faricimab, a bispecific antibody that targets VEGF-A and angiopoietin 2.

[0080] A detailed review of VEGF-A and its functions can be found in Pérez-Gutiérrez L, Ferrara N, “Biology and therapeutic targeting of vascular endothelial growth factor A. ” Nat Rev Mol Cell Biol. 2023 Nov; 24 (11) : 816-834; and Arrigo A, Aragona E, Bandello F, “VEGF-targeting drugs for the treatment of retinal neovascularization in diabetic retinopathy. ” Ann Med. 2022 Dec; 54 (1) : 1089-1111; each of which is incorporated by reference in its entirety.

[0081] The present disclosure provides anti-VEGF-A antibodies, antigen-binding fragments thereof, and methods of using these anti-VEGF-A antibodies and antigen-binding fragments to block the neovascular stimulus and VEGF-induced increased vascular permeability, treat cancers and neovascular eye disorders such as age-related macular degeneration, diabetic macular edema, retinal vein occlusion and ischaemic retinal disorders.

[0082] Heavy chain single variable domain (VHH) antibodies

[0083] Monoclonal and recombinant antibodies are important tools in medicine and biotechnology. Like all mammals, camelids (e.g., llamas) can produce conventional antibodies made of two heavy chains and two light chains bound together with disulfide bonds in a Y shape (e.g., IgG1) . However, they also produce two unique subclasses of IgG: IgG2 and IgG3, also known as heavy chain IgG. These antibodies are made of only two heavy chains, which lack the CH1 region but still bear an antigen-binding domain at their N-terminus called VHH (or nanobody) . Conventional Ig require the association of variable regions from both heavy and light chains to allow a high diversity of antigen-antibody interactions. Although isolated heavy and light chains still show this capacity, they exhibit very low affinity when compared to paired heavy and light chains. The unique feature of heavy chain IgG is the capacity of their monomeric antigen binding regions to bind antigens with specificity, affinity and especially diversity that are comparable to conventional antibodies without the need of pairing with another region. This feature is mainly due to a couple of major variations within the amino acid sequence of the variable region of the two heavy chains, which induce deep conformational changes when compared to conventional Ig. Major substitutions in the variable regions prevent the light chains from binding to the heavy chains, but also prevent unbound heavy chains from being recycled by the immunoglobulin binding proteins.

[0084] The single variable domain of these antibodies (designated VHH, sdAb, or nanobody) is the smallest antigen-binding domain generated by adaptive immune systems. The third Complementarity Determining Region (CDR3) of the variable region of these antibodies has been found to be twice as long as the conventional ones. This results in an increased interaction surface with the antigen as well as an increased diversity of antigen-antibody interactions, which compensates the absence of the light chains. With a long complementarity-determining region 3 (CDR3) , VHHs can extend into crevices on proteins that are not accessible to conventional antibodies, including functionally interesting sites such as the active site of an enzyme or the receptor-binding canyon on a virus surface.

[0085] VHHs offer numerous other advantages compared to conventional antibodies carrying variable domains (VH and VL) of conventional antibodies, including higher stability, solubility, expression yields, and refolding capacity, as well as better in vivo tissue penetration and internalization. Moreover, in contrast to the VH domains of conventional antibodies, VHH do not display an intrinsic tendency to bind to light chains. Since VHH do not bind to VL domains, it is much easier to reformat VHHs into multi-specific (e.g., bispecific antibody) constructs than constructs containing conventional VH-VL pairs or single domains based on VH domains.

[0086] The disclosure provides e.g., anti-VEGF-A antibodies, the modified antibodies thereof, the chimeric antibodies thereof, and the humanized antibodies thereof.

[0087] The CDR sequences for 2D1 and 2D1-Q1E, and derived antibodies (e.g., humanized antibodies) include CDRs of the VHH domain as set forth in SEQ ID NOs: 1, 2, and 3, respectively, as defined by IMGT numbering. The CDRs can also be defined by Kabat system. Under the Kabat numbering, the CDRs of the VHH domain are set forth in SEQ ID NOs: 4, 5, and 6, respectively.

[0088] The amino acid sequence for the VHH domain of 2D1 is set forth in SEQ ID NO: 7.

[0089] The amino acid sequence for the VHH domain of 2D1-Q1E is set forth in SEQ ID NO: 12.

[0090] The amino acid sequences for various modified or humanized VHH are also provided. As there are different ways to modify or humanize a heavy-chain antibody (e.g., a sequence can be modified with different amino acid substitutions) , the VHH domain of a heavy-chain antibody can have more than one version of humanized sequences.

[0091] In some embodiments, the humanized VHH domain is at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%identical to sequence of SEQ ID NO: 7.

[0092] In some embodiments, the humanized VHH domain is at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%identical to sequence of SEQ ID NO: 12.

[0093] Furthermore, in some embodiments, the antibodies or antigen-binding fragments thereof described herein can also contain one, two, or three VHH CDRs selected from the group of SEQ ID NOs: 1-3 and SEQ ID NOs: 4-6.

[0094] In some embodiments, the antibodies can have a heavy chain single variable domain (VHH) comprising complementarity determining regions (CDRs) 1, 2, 3, wherein the CDR1 region comprises or consists of an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, or 95%identical to a selected VHH CDR1 amino acid sequence, the CDR2 region comprises or consists of an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, or 95%identical to a selected VHH CDR2 amino acid sequence, and the CDR3 region comprises or consists of an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, or 95%identical to a selected VHH CDR3 amino acid sequence. The selected VHH CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are shown in FIG. 1.

[0095] In some embodiments, the antibody or an antigen-binding fragment described herein can contain a heavy chain single variable domain (VHH) containing one, two, or three of VHH CDR1 with zero, one or two amino acid insertions, deletions, or substitutions; VHH CDR2 with zero, one or two amino acid insertions, deletions, or substitutions; VHH CDR3 with zero, one or two amino acid insertions, deletions, or substitutions, wherein VHH CDR1, VHH CDR2, and VHH CDR3 are selected from the CDRs in FIG. 1.

[0096] In some embodiments, the antibody or an antigen-binding fragment described herein can contain a heavy chain single variable domain (VHH) containing one, two, or three of the CDRs of SEQ ID NO: 1 with zero, one or two amino acid insertions, deletions, or substitutions; SEQ ID NO: 2 with zero, one or two amino acid insertions, deletions, or substitutions; SEQ ID NO: 3 with zero, one or two amino acid insertions, deletions, or substitutions.

[0097] In some embodiments, the antibody or an antigen-binding fragment described herein can contain a heavy chain single variable domain (VHH) containing one, two, or three of the CDRs of SEQ ID NO: 4 with zero, one or two amino acid insertions, deletions, or substitutions; SEQ ID NO: 5 with zero, one or two amino acid insertions, deletions, or substitutions; SEQ ID NO: 6 with zero, one or two amino acid insertions, deletions, or substitutions.

[0098] The insertions, deletions, and substitutions can be within the CDR sequence, or at one or both terminal ends of the CDR sequence. In some embodiments, the CDR is determined based on Kabat numbering scheme. In some embodiments, the CDR is determined based on Chothia numbering scheme. In some embodiments, the CDR is determined based on a combination numbering scheme. In some embodiments, the CDR is determined based on IMGT numbering scheme.

[0099] The disclosure also provides antibodies or antigen-binding fragments thereof that bind to VEGF-A (e.g., human VEGF-A) . The antibodies or antigen-binding fragments thereof contain a heavy chain single variable region (VHH) comprising or consisting of an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, or 95%identical to a selected VHH sequence. In some embodiments, the selected VHH sequence is SEQ ID NO: 7. In some embodiments, the selected VHH sequence is SEQ ID NO: 12.

[0100] To determine the percent identity of two amino acid sequences, or of two nucleic acid sequences, the sequences are aligned for optimal comparison purposes (e.g., gaps can be introduced in one or both of a first and a second amino acid or nucleic acid sequence for optimal alignment and non-homologous sequences can be disregarded for comparison purposes) . The amino acid residues or nucleotides at corresponding amino acid positions or nucleotide positions are then compared. When a position in the first sequence is occupied by the same amino acid residue or nucleotide as the corresponding position in the second sequence, then the molecules are identical at that position. The percent identity between the two sequences is a function of the number of identical positions shared by the sequences, taking into account the number of gaps, and the length of each gap, which need to be introduced for optimal alignment of the two sequences. For purposes of illustration, the comparison of sequences and determination of percent identity between two sequences can be accomplished, e.g., using a Blossum 62 scoring matrix with a gap penalty of 12, a gap extend penalty of 4, and a frameshift gap penalty of 5.

[0101] The disclosure also provides nucleic acid comprising a polynucleotide encoding a polypeptide comprising an immunoglobulin heavy chain single variable domain (VHH) . The VHH comprises CDRs as shown in FIG. 1, or has sequences as shown in FIG. 2.

[0102] The antibodies and antigen-binding fragments can also be antibody variants (including derivatives and conjugates) of antibodies or antibody fragments and multi-specific (e.g., bi-specific) antibodies or antibody fragments. Additional antibodies provided herein are polyclonal, monoclonal, multi-specific (multimeric, e.g., bi-specific) , human antibodies, chimeric antibodies (e.g., human-mouse chimera) , single-chain antibodies, intracellularly-made antibodies (i.e., intrabodies) , and antigen-binding fragments thereof.

[0103] In some embodiments, the antibodies or antigen-binding fragments thereof comprises an Fc domain that can be originated from various types (e.g., IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, and IgY) , class (e.g., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, and IgA2) , or subclass. In some embodiments, the Fc domain is originated from an IgG antibody or antigen-binding fragment thereof. In some embodiments, the Fc domain comprises one, two, three, four, or more heavy chain constant regions.

[0104] The present disclosure also provides an antibody or antigen-binding fragment thereof that cross-competes with any antibody or antigen-binding fragment as described herein. The cross-competing assay is known in the art, and is described e.g., in Moore et al., "Antibody cross-competition analysis of the human immunodeficiency virus type 1 gp120 exterior envelope glycoprotein. " Journal of virology 70.3 (1996) : 1863-1872, which is incorporated herein reference in its entirety.

[0105] In one aspect, the present disclosure also provides an antibody or antigen-binding fragment thereof that binds to the same epitope or region as any antibody or antigen-binding fragment as described herein. The epitope binning assay is known in the art, and is described e.g., in Estep et al., "High throughput solution-based measurement of antibody-antigen affinity and epitope binning. " MAbs. Vol. 5. No. 2. Taylor &Francis, 2013, which is incorporated herein reference in its entirety.

[0106] In some embodiments, the antibody or antigen-binding fragment thereof comprises a heavy chain single variable domain (VHH) CDR1 selected from SEQ ID NOs: 1 and 4.

[0107] In some embodiments, the antibody or antigen-binding fragment thereof comprises a heavy chain single variable domain (VHH) CDR2 selected from SEQ ID NOs: 2 and 5.

[0108] In some embodiments, the antibody or antigen-binding fragment thereof comprises a heavy chain single variable domain (VHH) CDR3 selected from SEQ ID NOs: 3 and 6.

[0109] Antibody characteristics

[0110] VEGF-A is one member of the VEGF family of growth factors. The physiological effects of VEGF-A are driven by the binding to two homologous VEGF-A receptors. These receptors are known as VEGFR1 and VEGFR2. Binding to VEGFR2 mediates most of VEGF-A’s iconic functions: endothelial cell proliferation and angiogenesis, while binding to VEGFR1 promotes immune cell migration into the parenchyma as well as serving a regulatory role, modulating the effects of VEGFR2. The consistently high expression of VEGF-A and its receptors in human tumours make VEGF-A an attractive target for antibody-mediated therapy.

[0111] In some embodiments, the antibodies or antigen-binding fragments thereof described herein cannot block the binding between VEGF-A and VEGFR. In some embodiments, the antibodies or antigen-binding fragments thereof described herein can block the binding between VEGF-A and VEGFR. In some embodiments, the antibodies or antigen-binding fragments thereof described herein can be conjugated to anti-cancer agents that are internalized by receptor-mediated endocytosis. In some embodiments, the antibodies or antigen-binding fragments thereof described herein can disrupt the function of the ligand. In some embodiments, the antibodies or antigen-binding fragments thereof described herein can inhibit endothelial cell proliferation.

[0112] The disclosure provides antibodies or antigen-binding fragments thereof comprising a human Fc domain, which induce Fc-dependent effector functions by at least or about at least or about 1 fold, at least or about 2 folds, at least or about 3 folds, at least or about 4 folds, at least or about 5 folds, at least or about 6 folds, at least or about 7 folds, at least or about 8 folds, at least or about 9 folds, at least or about 10 folds, at least or about 20 folds, at least or about 30 folds, at least or about 40 folds, at least or about 50 folds, or at least or about 100 folds as compared when no antibodies or antigen-binding fragments thereof as described herein are present.

[0113] The disclosure provides antibodies or antigen-binding fragments thereof comprising a human Fc domain, which induce host immune response by at least or about at least or about 1 fold, at least or about 2 folds, at least or about 3 folds, at least or about 4 folds, at least or about 5 folds, at least or about 6 folds, at least or about 7 folds, at least or about 8 folds, at least or about 9 folds, at least or about 10 folds, at least or about 20 folds, at least or about 30 folds, at least or about 40 folds, at least or about 50 folds, or at least or about 100 folds as compared when no antibodies or antigen-binding fragments thereof as described herein are present.

[0114] In some embodiments, provided herein is an antibody or antigen-binding fragment thereof comprising a single heavy chain. In some embodiments, provided herein is an antibody or antigen-binding fragment thereof comprising a pair of heavy chains. In some embodiments, the heavy chain pair is linked by disulfide bonds. In some embodiments, the heavy chain pair comprises knob-in-hole modifications. In some embodiments, the heavy chain comprises a human IgG Fc domain. In some embodiments, the antibody or antigen-binding fragment thereof comprises in each heavy chain at least 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10 VHH domains. In some embodiments, the VHH domains in each heavy chain specifically bind to the same epitope. In some embodiments, the VHH domains in each heavy chain specifically bind to different epitopes. In some embodiments, the VHH domains in each heavy chain bind to at least 1, 2, 3, 4, or 5 different epitopes.

[0115] In some embodiments, the antibody or antigen-binding fragment thereof is a bi-specific antibody, or tri-specific antibody. In some embodiments, the antibody or antigen-binding fragment thereof can specifically bind to at least 4, 5, or 6 antigens.

[0116] In some embodiments, the antibody or antigen-binding fragment thereof specifically binds to VEGF-A with a dissociation rate (koff) of less than 0.1 s-1, less than 0.01 s-1, less than 0.001 s-1, less than 0.0001 s-1, or less than 0.00001 s-1. In some embodiments, the dissociation rate (koff) is greater than 0.01 s-1, greater than 0.001 s-1, greater than 0.0001 s-1, greater than 0.00001 s-1, or greater than 0.000001 s-1.

[0117] In some embodiments, kinetic association rates (kon) is greater than 1 × 102 / Ms, greater than 1 ×103 / Ms, greater than 1 × 104 / Ms, greater than 1 × 105 / Ms, or greater than 1 × 106 / Ms. In some embodiments, kinetic association rates (kon) is less than 1 × 105 / Ms, less than 1 × 106 / Ms, or less than 1 ×107 / Ms.

[0118] Affinities can be deduced from the quotient of the kinetic rate constants (KD=koff / kon) . In some embodiments, KD is less than 1 × 10-6 M, less than 1 × 10-7 M, less than 1 × 10-8 M, less than 1 × 10-9 M, less than 1 × 10-10 M, less than 1 × 10-11 M, less than 1 × 10-12 M, or less than 1 × 10-13 M. In some embodiments, the KD is less than 50 nM, 30 nM, 20 nM, 15 nM, 10 nM, 9 nM, 8 nM, 7 nM, 6 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM, or 1 nM. In some embodiments, KD is greater than 1 x 10-7 M, greater than 1 x 10-8 M, greater than 1 x 10-9 M, greater than 1 x 10-10 M, greater than 1 x 10-11 M, or greater than 1 x 10-12 M.

[0119] General techniques for measuring the affinity of an antibody for an antigen include, e.g., ELISA, RIA, and surface plasmon resonance (SPR) . In some embodiments, the antibody binds to human VEGF-A, monkey VEGF-A, mouse VEGF-A, or chimeric VEGF-A. In some embodiments, the antibody does not bind to human VEGF-A, monkey VEGF-A, mouse VEGF-A, or chimeric VEGF-A.

[0120] In some embodiments, thermal stabilities are determined. The antibodies or antigen-binding fragments as described herein can have a Tm (melting temperature) greater than 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, or 95 ℃. In some embodiments, Tm is less than 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, or 95 ℃. The antibodies or antigen-binding fragments as described herein can have a Tagg (aggregation temperature, e.g., Tagg at 266 nm (Tagg266) or Tagg at 473 nm (Tagg473) ) great than 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, or 95 ℃. In some embodiments, Tagg is less than 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, or 95 ℃.

[0121] In some embodiments, the Fc region is human IgG1, human IgG2, human IgG3, or human IgG4.

[0122] In some embodiments, the antibodies or antigen binding fragments thereof have a functional Fc region. In some embodiments, the antibodies or antigen binding fragments thereof comprise a human IgG1 Fc region. In some embodiments, the human IgG1 Fc region comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 8.

[0123] In some embodiments, the antibodies or antigen binding fragments do not have an Fc region. For example, the antibody or antigen-binding fragment thereof is a polypeptide comprising one or more VHH domains that are interconnected by linker peptides. In some embodiments, the antibody comprises at least 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10 VHH domain. In some embodiments, the VHH domains specifically bind to the same epitope. In some embodiments, the VHH domains bind to different epitopes. In some embodiments, the VHH domains bind to at least 1, 2, 3, 4, or 5 different epitopes.

[0124] Methods of making anti-VEGF-A antibodies

[0125] Variants of the antibodies or antigen-binding fragments described herein can be prepared by introducing appropriate nucleotide changes into the DNA encoding a human, humanized, or chimeric antibody, or antigen-binding fragment thereof described herein, or by peptide synthesis. Such variants include, for example, deletions, insertions, or substitutions of residues within the amino acids sequences that make-up the antigen-binding site of the antibody or an antigen-binding domain. In a population of such variants, some antibodies or antigen-binding fragments will have increased affinity for the target protein, e.g., VEGF-A. Any combination of deletions, insertions, and / or combinations can be made to arrive at an antibody or antigen-binding fragment thereof that has increased binding affinity for the target. The amino acid changes introduced into the antibody or antigen-binding fragment can also alter or introduce new post-translational modifications into the antibody or antigen-binding fragment, such as changing (e.g., increasing or decreasing) the number of glycosylation sites, changing the type of glycosylation site (e.g., changing the amino acid sequence such that a different sugar is attached by enzymes present in a cell) , or introducing new glycosylation sites. In some embodiments, the heavy-chain antibody or antigen-binding fragment thereof described herein is obtained by immunizing any of the genetically modified animals (e.g., mice with complete human heavy chain variable domain substitution in situ, combined with a modified constant region) described e.g., in PCT / CN2022 / 119188.

[0126] Humanized antibodies include antibodies having variable and constant regions derived from (or having the same amino acid sequence as those derived from) human germline immunoglobulin sequences of human immunoglobulin scaffold sequences. Humanized antibodies may include amino acid residues not encoded by human germline immunoglobulin sequences (e.g., mutations introduced by random or site-specific mutagenesis in vitro or by somatic mutation in vivo) . Accordingly, “humanized” antibodies are chimeric antibodies wherein sequences from a non-human species are substituted by the corresponding human sequences.

[0127] Ordinarily, amino acid sequence variants of the human, humanized, or chimeric anti-VEGF-A antibody will contain an amino acid sequence having at least 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%percent identity with a sequence present in the VHH domain of the original antibody.

[0128] Identity or homology with respect to an original sequence is usually the percentage of amino acid residues present within the candidate sequence that are identical with a sequence present within the human, humanized, or chimeric anti-VEGF-A antibody or fragment, after aligning the sequences and introducing gaps, if necessary, to achieve the maximum percent sequence identity, and not considering any conservative substitutions as part of the sequence identity.

[0129] Additional modifications to the anti-VEGF-A antibodies or antigen-binding fragments can be made. For example, a cysteine residue (s) can be introduced into the Fc region, thereby allowing interchain disulfide bond formation in this region. The homodimeric antibody thus generated may have any increased half-life in vitro and / or in vivo. Homodimeric antibodies with increased half-life in vitro and / or in vivo can also be prepared using heterobifunctional cross-linkers as described, for example, in Wolff et al., "Monoclonal antibody homodimers: enhanced antitumor activity in nude mice. " Cancer research 53.11 (1993) : 2560-2565. Alternatively, an antibody can be engineered which has dual Fc regions.

[0130] In some embodiments, a covalent modification can be made to the anti-VEGF-A antibody or antigen-binding fragment thereof. These covalent modifications can be made by chemical or enzymatic synthesis, or by enzymatic or chemical cleavage. Other types of covalent modifications of the antibody or antibody fragment are introduced into the molecule by reacting targeted amino acid residues of the antibody or fragment with an organic derivatization agent that is capable of reacting with selected side chains or the N-or C-terminal residues.

[0131] In some embodiments, antibody variants are provided having a carbohydrate structure that lacks fucose attached (directly or indirectly) to an Fc region. For example, the amount of fucose in such antibody composition may be from 1%to 80%, from 1%to 65%, from 5%to 65%or from 20%to 40%. The amount of fucose is determined by calculating the average amount of fucose within the sugar chain at Asn297, relative to the sum of all glycostructures attached to Asn 297 (e.g. complex, hybrid and high mannose structures) as measured by MALDI-TOF mass spectrometry, as described in WO 2008 / 077546, for example. Asn297 refers to the asparagine residue located at about position 297 in the Fc region (Eu numbering of Fc region residues; or position 314 in Kabat numbering) ; however, Asn297 may also be located about ±3 amino acids upstream or downstream of position 297, i.e., between positions 294 and 300, due to minor sequence variations in antibodies. Such fucosylation variants may have improved ADCC function. In some embodiments, to reduce glycan heterogeneity, the Fc region of the antibody can be further engineered to replace the Asparagine at position 297 with Alanine (N297A) .

[0132] The present disclosure also provides recombinant vectors (e.g., an expression vectors) that include an isolated polynucleotide disclosed herein (e.g., a polynucleotide that encodes a polypeptide disclosed herein) , host cells into which are introduced the recombinant vectors (i.e., such that the host cells contain the polynucleotide and / or a vector comprising the polynucleotide) , and the production of recombinant antibody polypeptides or fragments thereof by recombinant techniques.

[0133] As used herein, a “vector” is any construct capable of delivering one or more polynucleotide (s) of interest to a host cell when the vector is introduced to the host cell. An “expression vector” is capable of delivering and expressing the one or more polynucleotide (s) of interest as an encoded polypeptide in a host cell into which the expression vector has been introduced. Thus, in an expression vector, the polynucleotide of interest is positioned for expression in the vector by being operably linked with regulatory elements such as a promoter, enhancer, and / or a poly-A tail, either within the vector or in the genome of the host cell at or near or flanking the integration site of the polynucleotide of interest such that the polynucleotide of interest will be translated in the host cell introduced with the expression vector.

[0134] A vector can be introduced into the host cell by methods known in the art, e.g., electroporation, chemical transfection (e.g., DEAE-dextran) , transformation, transfection, and infection and / or transduction (e.g., with recombinant virus) . Thus, non-limiting examples of vectors include viral vectors (which can be used to generate recombinant virus) , naked DNA or RNA, plasmids, cosmids, phage vectors, and DNA or RNA expression vectors associated with cationic condensing agents.

[0135] In some implementations, a polynucleotide disclosed herein (e.g., a polynucleotide that encodes a polypeptide disclosed herein) is introduced using a viral expression system (e.g., vaccinia or other pox virus, retrovirus, or adenovirus) , which may involve the use of a non-pathogenic (defective) , replication competent virus, or may use a replication defective virus. In the latter case, viral propagation generally will occur only in complementing virus packaging cells. Suitable systems are disclosed, for example, in Fisher-Hoch et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 317-321; Flexner et al., 1989, Ann. N.Y. Acad Sci. 569: 86-103; Flexner et al., 1990, Vaccine, 8: 17-21; U.S. Pat. Nos. 4,603,112, 4,769,330, and 5,017,487; WO 89 / 01973; U.S. Pat. No. 4,777,127; GB 2,200,651; EP 0,345,242; WO 91 / 02805; Berkner-Biotechniques, 6: 616-627, 1988; Rosenfeld et al., 1991, Science, 252: 431-434; Kolls et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 215-219; Kass-Eisler et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 11498-11502; Guzman et al., 1993, Circulation, 88: 2838-2848; and Guzman et al., 1993, Cir. Res., 73: 1202-1207. Techniques for incorporating DNA into such expression systems are well known to those of ordinary skill in the art. The DNA may also be “naked, ” as described, for example, in Ulmer et al., 1993, Science, 259: 1745-1749, and Cohen, 1993, Science, 259: 1691-1692. The uptake of naked DNA may be increased by coating the DNA onto biodegradable beads that are efficiently transported into the cells.

[0136] For expression, the DNA insert comprising an antibody-encoding or polypeptide-encoding polynucleotide disclosed herein can be operatively linked to an appropriate promoter (e.g., a heterologous promoter) , such as the phage lambda PL promoter, the E. coli lac, trp and tac promoters, the SV40 early and late promoters and promoters of retroviral LTRs, to name a few. Other suitable promoters are known to the skilled artisan. In some embodiments, the promoter is a cytomegalovirus (CMV) promoter. The expression constructs can further contain sites for transcription initiation, termination and, in the transcribed region, a ribosome binding site for translation. The coding portion of the mature transcripts expressed by the constructs may include a translation initiating at the beginning and a termination codon (UAA, UGA, or UAG) appropriately positioned at the end of the polypeptide to be translated.

[0137] As indicated, the expression vectors can include at least one selectable marker. Such markers include dihydrofolate reductase or neomycin resistance for eukaryotic cell culture and tetracycline or ampicillin resistance genes for culturing in E. coli and other bacteria. Representative examples of appropriate hosts include, but are not limited to, bacterial cells, such as E. coli, Streptomyces, and Salmonella typhimurium cells; fungal cells, such as yeast cells; insect cells such as Drosophila S2 and Spodoptera Sf9 cells; animal cells such as CHO, COS, Bowes melanoma, and HK 293 cells; and plant cells. Appropriate culture mediums and conditions for the host cells described herein are known in the art.

[0138] Non-limiting vectors for use in bacteria include pQE70, pQE60 and pQE-9, available from Qiagen; pBS vectors, Phagescript vectors, Bluescript vectors, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A, available from Stratagene; and ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 available from Pharmacia. Non-limiting eukaryotic vectors include pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1 and pSG available from Stratagene; and pSVK3, pBPV, pMSG and pSVL available from Pharmacia. Other suitable vectors will be readily apparent to the skilled artisan.

[0139] Non-limiting bacterial promoters suitable for use include the E. coli lacI and lacZ promoters, the T3 and T7 promoters, the gpt promoter, the lambda PR and PL promoters and the trp promoter. Suitable eukaryotic promoters include the CMV immediate early promoter, the HSV thymidine kinase promoter, the early and late SV40 promoters, the promoters of retroviral LTRs, such as those of the Rous sarcoma virus (RSV) , and metallothionein promoters, such as the mouse metallothionein-I promoter.

[0140] In the yeast Saccharomyces cerevisiae, a number of vectors containing constitutive or inducible promoters such as alpha factor, alcohol oxidase, and PGH can be used.

[0141] Introduction of the construct into the host cell can be affected by calcium phosphate transfection, DEAE-dextran mediated transfection, cationic lipid-mediated transfection, electroporation, transduction, infection or other methods. Such methods are described in many standard laboratory manuals, such as Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology (1986) , which is incorporated herein by reference in its entirety.

[0142] Transcription of DNA encoding an antibody of the present disclosure by higher eukaryotes may be increased by inserting an enhancer sequence into the vector. Enhancers are cis-acting elements of DNA, usually about from 10 to 300 bp that act to increase transcriptional activity of a promoter in a given host cell-type. Examples of enhancers include the SV40 enhancer, which is located on the late side of the replication origin at base pairs 100 to 270, the cytomegalovirus early promoter enhancer, the polyoma enhancer on the late side of the replication origin, and adenovirus enhancers.

[0143] For secretion of the translated protein into the lumen of the endoplasmic reticulum, into the periplasmic space or into the extracellular environment, appropriate secretion signals may be incorporated into the expressed polypeptide. The signals may be endogenous to the polypeptide or they may be heterologous signals.

[0144] The polypeptide (e.g., antibody) can be expressed in a modified form, such as a fusion protein (e.g., a GST-fusion) or with a histidine-tag, and may include not only secretion signals, but also additional heterologous functional regions. For instance, a region of additional amino acids, particularly charged amino acids, may be added to the N-terminus of the polypeptide to improve stability and persistence in the host cell, during purification, or during subsequent handling and storage. Also, peptide moieties can be added to the polypeptide to facilitate purification. Such regions can be removed prior to final preparation of the polypeptide. The addition of peptide moieties to polypeptides to engender secretion or excretion, to improve stability and to facilitate purification, among others, are familiar and routine techniques in the art.

[0145] The disclosure also provides a nucleic acid sequence that is at least 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%identical to any nucleotide sequence as described herein, and an amino acid sequence that is at least 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%identical to any amino acid sequence as described herein. In some embodiments, the disclosure relates to nucleotide sequences encoding any peptides that are described herein, or any amino acid sequences that are encoded by any nucleotide sequences as described herein. In some embodiments, the nucleic acid sequence is less than 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 500, or 600 nucleotides. In some embodiments, the amino acid sequence is less than 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, or 200 amino acid residues.

[0146] In some embodiments, the amino acid sequence (i) comprises an amino acid sequence; or (ii) consists of an amino acid sequence, wherein the amino acid sequence is any one of the sequences as described herein.

[0147] In some embodiments, the nucleic acid sequence (i) comprises a nucleic acid sequence; or (ii) consists of a nucleic acid sequence, wherein the nucleic acid sequence is any one of the sequences as described herein.

[0148] In some embodiments, the antibody or antigen-binding fragment thereof is expressed in yeast, insect cells, or mammalian cells (e.g., CHO cells) .

[0149] Methods of treatment and diagnosis

[0150] The anti-VEGF-A antibodies or antibody or antigen-binding fragments thereof of the present disclosure can be used for various therapeutic purposes. In one aspect, the disclosure provides methods for treating a cancer, a retinal condition or an immune disorder in a subject, methods of identifying a subject having a cancer, a retinal condition or an immune disorder, methods of reducing the risk of developing a cancer, a retinal condition or an immune disorder, or methods of reducing the risk of developing additional symptoms in a subject. In some embodiments, the treatment can halt, slow, retard, or inhibit progression of a cancer, a retinal condition or an immune disorder. In some embodiments, the treatment can result in the reduction of in the number, severity, and / or duration of one or more symptoms of a cancer, a retinal condition or an immune disorder in a subject. In some embodiments, the cancer is gastric cancer, hepatocellular carcinoma, colon carcinoma, rectal carcinoma, colorectal cancer, glioma, lung cancer (e.g., non-small cell lung cancer) , or breast cancer. In some embodiments, the retinal condition is age-related macular degeneration, retinal vein occlusion or diabetic macular edema. In some embodiments, the immune disorder is rheumatoid arthritis, psoriasis or Grave's Disease. In some embodiments, the subject described herein is a human subject.

[0151] In one aspect, the disclosure features methods that include administering a therapeutically effective amount of an antibody or antigen-binding fragment thereof disclosed herein to a subject in need thereof (e.g., a subject having, or identified or diagnosed as having, a cancer, a retinal condition or an immune disorder) .

[0152] In some embodiments, the compositions and methods disclosed herein can be used for treatment of patients at risk for a cancer, a retinal condition or an immune disorder. Patients with a cancer, a retinal condition or an immune disorder) can be identified with various methods known in the art.

[0153] In some embodiments, the cancer is gastric cancer, hepatocellular carcinoma, colon carcinoma, rectal carcinoma, colorectal cancer, glioma, lung cancer (e.g., non-small cell lung cancer) , or breast cancer. In some embodiments, the retinal condition is age-related macular degeneration, retinal vein occlusion or diabetic macular edema. In some embodiments, the immune disorder is rheumatoid arthritis, psoriasis or Grave's Disease.

[0154] In one aspect, the disclosure is related to methods of decreasing the rate of tumor growth, including contacting a tumor cell with an effective amount of a composition including the antibody or antigen-binding fragment thereof, or the antibody-drug conjugate described herein. In one aspect, the disclosure is related to methods of killing a tumor cell, including contacting a tumor cell with an effective amount of a composition including the antibody or antigen-binding fragment thereof, or the antibody-drug conjugate described herein.

[0155] As used herein, by an “effective amount” is meant an amount or dosage sufficient to effect beneficial or desired results including halting, slowing, retarding, or inhibiting progression of a disease, e.g., a cancer. An effective amount will vary depending upon, e.g., an age and a body weight of a subject to which the antibody, antigen binding fragment, antibody-encoding polynucleotide, vector comprising the polynucleotide, and / or compositions thereof is to be administered, a severity of symptoms and a route of administration, and thus administration can be determined on an individual basis.

[0156] An effective amount can be administered in one or more administrations. By way of example, an effective amount of an antibody or an antigen binding fragment thereof is an amount sufficient to ameliorate, stop, stabilize, reverse, inhibit, slow and / or delay progression of a disease in a patient. As is understood in the art, an effective amount of an antibody or antigen binding fragment may vary, depending on, inter alia, patient history as well as other factors such as the type (and / or dosage) of antibody used.

[0157] Effective amounts and schedules for administering the antibodies, antibody-encoding polynucleotides, and / or compositions disclosed herein may be determined empirically, and making such determinations is within the skill in the art. Those skilled in the art will understand that the dosage that must be administered will vary depending on, for example, the mammal that will receive the antibodies, antibody-encoding polynucleotides, and / or compositions disclosed herein, the route of administration, the particular type of antibodies, antibody-encoding polynucleotides, antigen binding fragments, and / or compositions disclosed herein used and other drugs being administered to the mammal. Guidance in selecting appropriate doses for antibody or antigen binding fragment can be found in the literature on therapeutic uses of antibodies and antigen binding fragments, e.g., Handbook of Monoclonal Antibodies, Ferrone et al., eds., Noges Publications, Park Ridge, N. J., 1985, ch. 22 and pp. 303-357; Smith et al., Antibodies in Human Diagnosis and Therapy, Haber et al., eds., Raven Press, New York, 1977, pp. 365-389.

[0158] A typical daily dosage of an effective amount of an antibody is 0.01 mg / kg to 100 mg / kg. In some embodiments, the dosage can be less than 100 mg / kg, 10 mg / kg, 9 mg / kg, 8 mg / kg, 7 mg / kg, 6 mg / kg, 5 mg / kg, 4 mg / kg, 3 mg / kg, 2 mg / kg, 1 mg / kg, 0.5 mg / kg, or 0.1 mg / kg. In some embodiments, the dosage can be greater than 10 mg / kg, 9 mg / kg, 8 mg / kg, 7 mg / kg, 6 mg / kg, 5 mg / kg, 4 mg / kg, 3 mg / kg, 2 mg / kg, 1 mg / kg, 0.5 mg / kg, 0.1 mg / kg, 0.05 mg / kg, or 0.01 mg / kg. In some embodiments, the dosage is about 10 mg / kg, 9 mg / kg, 8 mg / kg, 7 mg / kg, 6 mg / kg, 5 mg / kg, 4 mg / kg, 3 mg / kg, 2 mg / kg, 1 mg / kg, 0.9 mg / kg, 0.8 mg / kg, 0.7 mg / kg, 0.6 mg / kg, 0.5 mg / kg, 0.4 mg / kg, 0.3 mg / kg, 0.2 mg / kg, or 0.1 mg / kg.

[0159] In any of the methods described herein, the at least one antibody, antigen-binding fragment thereof, or pharmaceutical composition (e.g., any of the antibodies, antigen-binding fragments, or pharmaceutical compositions described herein) and, optionally, at least one additional therapeutic agent can be administered to the subject at least once a week (e.g., once a week, twice a week, three times a week, four times a week, once a day, twice a day, or three times a day) . In some embodiments, at least two different antibodies and / or antigen-binding fragments are administered in the same composition (e.g., a liquid composition) . In some embodiments, at least one antibody or antigen-binding fragment and at least one additional therapeutic agent are administered in the same composition (e.g., a liquid composition) . In some embodiments, the at least one antibody or antigen-binding fragment and the at least one additional therapeutic agent are administered in two different compositions (e.g., a liquid composition containing at least one antibody or antigen-binding fragment and a solid oral composition containing at least one additional therapeutic agent) . In some embodiments, the at least one additional therapeutic agent is administered as a pill, tablet, or capsule. In some embodiments, the at least one additional therapeutic agent is administered in a sustained-release oral formulation.

[0160] In some embodiments, the one or more additional therapeutic agents can be administered to the subject prior to, or after administering the at least one antibody, antigen-binding antibody fragment, or pharmaceutical composition (e.g., any of the antibodies, antigen-binding antibody fragments, or pharmaceutical compositions described herein) . In some embodiments, the one or more additional therapeutic agents and the at least one antibody, antigen-binding antibody fragment, or pharmaceutical composition (e.g., any of the antibodies, antigen-binding antibody fragments, or pharmaceutical compositions described herein) are administered to the subject such that there is an overlap in the bioactive period of the one or more additional therapeutic agents and the at least one antibody or antigen-binding fragment (e.g., any of the antibodies or antigen-binding fragments described herein) in the subject.

[0161] In some embodiments, the subject can be administered the at least one antibody, antigen-binding antibody fragment, or pharmaceutical composition (e.g., any of the antibodies, antigen-binding antibody fragments, or pharmaceutical compositions described herein) over an extended period of time (e.g., over a period of at least 1 week, 2 weeks, 3 weeks, 1 month, 2 months, 3 months, 4 months, 5 months, 6 months, 7 months, 8 months, 9 months, 10 months, 11 months, 12 months, 1 year, 2 years, 3 years, 4 years, or 5 years) . A skilled medical professional may determine the length of the treatment period using any of the methods described herein for diagnosing or following the effectiveness of treatment (e.g., the observation of at least one symptom of the disease) . As described herein, a skilled medical professional can also change the identity and number (e.g., increase or decrease) of antibodies or antigen-binding antibody fragments (and / or one or more additional therapeutic agents) administered to the subject and can also adjust (e.g., increase or decrease) the dosage or frequency of administration of at least one antibody or antigen-binding antibody fragment (and / or one or more additional therapeutic agents) to the subject based on an assessment of the effectiveness of the treatment (e.g., using any of the methods described herein and known in the art) .

[0162] In some embodiments, one or more additional therapeutic agents can be administered to the subject. The additional therapeutic agent can comprise one or more inhibitors selected from the group consisting of an inhibitor of B-Raf, an EGFR inhibitor, an inhibitor of a MEK, an inhibitor of ERK, an inhibitor of K-Ras, an inhibitor of c-Met, an inhibitor of anaplastic lymphoma kinase (ALK) , an inhibitor of a phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) , an inhibitor of an Akt, an inhibitor of mTOR, a dual PI3K / mTOR inhibitor, an inhibitor of Bruton's tyrosine kinase (BTK) , and an inhibitor of Isocitrate dehydrogenase 1 (IDH1) and / or Isocitrate dehydrogenase 2 (IDH2) .

[0163] In some embodiments, the additional therapeutic agent can comprise one or more inhibitors selected from the group consisting of an inhibitor of HER3, an inhibitor of LSD1, an inhibitor of MDM2, an inhibitor of BCL2, an inhibitor of CHK1, an inhibitor of activated hedgehog signaling pathway, and an agent that selectively degrades the estrogen receptor.

[0164] In some embodiments, the additional therapeutic agent can comprise one or more therapeutic agents selected from the group consisting of Trabectedin, nab-paclitaxel, Trebananib, Pazopanib, Cediranib, Palbociclib, fluoropyrimidine, IFL, regorafenib, Reolysin, Alimta, Zykadia, Sutent, temsirolimus, axitinib, everolimus, sorafenib, Votrient, IMA-901, AGS-003, cabozantinib, Vinflunine, an Hsp90 inhibitor, Ad-GM-CSF, Temazolomide, IL-2, IFNa, vinblastine, Thalomid, dacarbazine, cyclophosphamide, lenalidomide, azacytidine, bortezomid, amrubicine, carfilzomib, pralatrexate, and enzastaurin.

[0165] In some embodiments, the additional therapeutic agent can comprise one or more therapeutic agents selected from the group consisting of an adjuvant, a TLR agonist, tumor necrosis factor (TNF) alpha, IL-1, HMGB1, an IL-10 antagonist, an IL-4 antagonist, an IL-13 antagonist, an IL-17 antagonist, an HVEM antagonist, an ICOS agonist, a treatment targeting CX3CL1, a treatment targeting CXCL9, a treatment targeting CXCL10, a treatment targeting CCL5, an LFA-1 agonist, an ICAM1 agonist, and a Selectin agonist.

[0166] In some embodiments, the additional therapeutic agent can comprise one or more therapeutic agents selected from the group consisting of a platelet-derived growth factor (PDGF) antagonist,  (verteporfm) in combination with photodynamic therapy, an antioxidant, a complement system antagonist, a visual cycle modifier, a tissue factor antagonist, an alpha-adrenergic receptor agonist, an amyloid beta antagonist, an SIP antagonist, and a ROBO4 antagonist.

[0167] In some embodiments, carboplatin, nab-paclitaxel, paclitaxel, cisplatin, pemetrexed, gemcitabine, FOLFOX, or FOLFIRI are administered to the subject.

[0168] In some embodiments, the additional therapeutic agent is an anti-PD-1 antibody, an anti-PD-L1 antibody, an anti-LAG-3 antibody, an anti-TIGIT antibody, an anti-4-1BB antibody, an anti-CTLA-4 antibody, an anti-CD40 antibody, an anti-OX40 antibody, or an anti-GITR antibody.

[0169] Pharmaceutical Compositions and Routes of Administration

[0170] Also provided herein are pharmaceutical compositions that contain at least one (e.g., one, two, three, or four) of the antibodies or antigen-binding fragments described herein. Two or more (e.g., two, three, or four) of any of the antibodies or antigen-binding fragments described herein can be present in a pharmaceutical composition in any combination. The pharmaceutical compositions may be formulated in any manner known in the art.

[0171] Pharmaceutical compositions are formulated to be compatible with their intended route of administration (e.g., intravenous, intraarterial, intramuscular, intradermal, subcutaneous, or intraperitoneal) . The compositions can include a sterile diluent (e.g., sterile water or saline) , a fixed oil, polyethylene glycol, glycerine, propylene glycol or other synthetic solvents, antibacterial or antifungal agents, such as benzyl alcohol or methyl parabens, chlorobutanol, phenol, ascorbic acid, thimerosal, and the like, antioxidants, such as ascorbic acid or sodium bisulfite, chelating agents, such as ethylenediaminetetraacetic acid, buffers, such as acetates, citrates, or phosphates, and isotonic agents, such as sugars (e.g., dextrose) , polyalcohols (e.g., mannitol or sorbitol) , or salts (e.g., sodium chloride) , or any combination thereof. Liposomal suspensions can also be used as pharmaceutically acceptable carriers (see, e.g., U. S. Patent No. 4, 522, 811) . Preparations of the compositions can be formulated and enclosed in ampules, disposable syringes, or multiple dose vials. Where required (as in, for example, injectable formulations) , proper fluidity can be maintained by, for example, the use of a coating, such as lecithin, or a surfactant. Absorption of the antibody or antigen-binding fragment thereof can be prolonged by including an agent that delays absorption (e.g., aluminum monostearate and gelatin) . Alternatively, controlled release can be achieved by implants and microencapsulated delivery systems, which can include biodegradable, biocompatible polymers (e.g., ethylene vinyl acetate, polyanhydrides, polyglycolic acid, collagen, polyorthoesters, and polylactic acid; Alza Corporation and Nova Pharmaceutical, Inc. ) .

[0172] Compositions containing one or more of any of the antibodies or antigen-binding fragments described herein can be formulated for parenteral (e.g., intravenous, intraarterial, intramuscular, intradermal, subcutaneous, or intraperitoneal) administration in dosage unit form (i.e., physically discrete units containing a predetermined quantity of active compound for ease of administration and uniformity of dosage) .

[0173] Toxicity and therapeutic efficacy of compositions can be determined by standard pharmaceutical procedures in cell cultures or experimental animals (e.g., monkeys) . One can, for example, determine the LD50 (the dose lethal to 50%of the population) and the ED50 (the dose therapeutically effective in 50%of the population) : the therapeutic index being the ratio of LD50: ED50. Agents that exhibit high therapeutic indices are preferred. Where an agent exhibits an undesirable side effect, care should be taken to minimize potential damage (i.e., reduce unwanted side effects) . Toxicity and therapeutic efficacy can be determined by other standard pharmaceutical procedures.

[0174] Data obtained from cell culture assays and animal studies can be used in formulating an appropriate dosage of any given agent for use in a subject (e.g., a human) . A therapeutically effective amount of the one or more (e.g., one, two, three, or four) antibodies or antigen-binding fragments thereof (e.g., any of the antibodies or antibody fragments described herein) will be an amount that treats the disease in a subject in a subject, or a subject identified as being at risk of developing the disease, decreases the severity, frequency, and / or duration of one or more symptoms of a disease in a subject (e.g., a human) . The effectiveness and dosing of any of the antibodies or antigen-binding fragments described herein can be determined by a health care professional or veterinary professional using methods known in the art, as well as by the observation of one or more symptoms of disease in a subject (e.g., a human) . Certain factors may influence the dosage and timing required to effectively treat a subject (e.g., the severity of the disease or disorder, previous treatments, the general health and / or age of the subject, and the presence of other diseases) .

[0175] Exemplary doses include milligram or microgram amounts of any of the antibodies or antigen-binding fragments described herein per kilogram of the subject’s weight (e.g., about 1 μg / kg to about 500 mg / kg; about 100 μg / kg to about 500 mg / kg; about 100 μg / kg to about 50 mg / kg; about 10 μg / kg to about 5 mg / kg; about 10 μg / kg to about 0.5 mg / kg; or about 1 μg / kg to about 50 μg / kg) . While these doses cover a broad range, one of ordinary skill in the art will understand that therapeutic agents, including antibodies and antigen-binding fragments thereof, vary in their potency, and effective amounts can be determined by methods known in the art. Typically, relatively low doses are administered at first, and the attending health care professional or veterinary professional (in the case of therapeutic application) or a researcher (when still working at the development stage) can subsequently and gradually increase the dose until an appropriate response is obtained. In addition, it is understood that the specific dose level for any particular subject will depend upon a variety of factors including the activity of the specific compound employed, the age, body weight, general health, gender, and diet of the subject, the time of administration, the route of administration, the rate of excretion, and the half-life of the antibody or antibody fragment in vivo.

[0176] The pharmaceutical compositions can be included in a container, pack, or dispenser together with instructions for administration. The disclosure also provides methods of manufacturing the antibodies or antigen binding fragments thereof for various uses as described herein.

[0177] EXAMPLES

[0178] The invention is further described in the following examples, which do not limit the scope of the invention described in the claims.

[0179] EXAMPLE 1. Generating human anti-VEGF-A antibody

[0180] Fc-tagged human VEGF-A protein (SEQ ID NO: 11) was used to emulsified with adjuvants, and was used to immunize mice (e.g., the mice with complete human heavy chain variable domain substitution in situ, combined with a modified constant region. The mice are described e.g., in PCT / CN2022 / 119188, which is incorporated herein by reference in its entirety) . The antibody immune response was monitored by an antigen-specific immunoassay.

[0181] When a desired immune response was achieved, antigen-specific immune cells were isolated from the immunized mice to further obtain anti-VEGF-A antibodies or to obtain the heavy chain variable region sequences of the anti-VEGF-A antibodies. For example, single cell technology (e.g., using  Optofluidic System, Berkeley Lights Inc. ) was used to screen and find plasma cells that secrete antigen-specific monoclonal antibodies. Reverse transcription and PCR sequencing were used to obtain antibody variable region sequences. The obtained variable region sequences were used for antibody expression to verify the binding activity to VEGF-A using FACS. Because the lack of the CH1 domain, the heavy chain variable region (VH) of the obtained antibodies is also referred to as a heavy chain single variable domain (VHH) .

[0182] Specifically, the obtained VHH sequences were respectively connected to a human IgG1 constant region (e.g., the hinge region, CH2 domain and CH3 domain) . 2D1 is an exemplary antibody obtained by this method. The heavy chain CDR1-3 sequences are shown in FIG. 1.

[0183] In addition, a 2D1 mutant (designated 2D1-Q1E) was generated by replacing the glutamine at position 1 in the VHH framework region of 2D1 with glutamic acid. The VHH region sequences of 2D1 and 2D1-Q1E are shown in FIG. 2.

[0184] Bevacizumab, a humanized IgG1 antibody targeting human VEGF-A, was the first approved angiogenesis inhibitor and approved in a range of solid tumor indications. The heavy chain and light chain sequences of Bevacizumab are set forth in SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10, respectively.

[0185] EXAMPLE 2. Binding activity of anti-VEGF-A antibody to VEGF-A protein

[0186] Binding activity of anti-VEGF-A antibodies to human VEGF-A protein (hVEGF165, ACROBiosystems, Cat#: VE5-H4210) was detected by ELISA. Detailed methods are as follows. First, hVEGF165 was diluted to 0.5 μg / mL using PBS (phosphate buffer saline) and then coated on 96-well plates with 100 μL / well, followed by incubation at 4 ℃ overnight. The plates were washed and then blocked with 2%BSA (bovine serum albumin) at 37℃ for 2 h. Serially diluted sample anti-VEGF-A antibodies were added to the 96-well plates. After incubation at 37℃ for 1 h, 100 μL secondary antibody (1:3000 diluted anti-hIgG Fc-HRP) was added to each well and the plates were incubated at 37℃ for 1 h. After washing with PBST for 5 times, TMB was added to 96-well plates with 100 μL / well, followed by incubation at 4℃ in the dark for 15 minutes. Stop solution was added with 100 μL / well and the optical density (OD) of each well was read at 450 nm and 570 nm. Standard OD=OD450 -OD570.

[0187] The standard OD values were used to generate a fitting curve with respect to the antibody concentrations. More specifically, logarithm of antibody concentrations was calculated and was used as the X-axis variable, while the corresponding OD value was used as the Y-axis variable. Bevacizumab analog was used as a reference antibody. Human IgG1 was used as an isotype control (ISO) . An exemplary binding curve of 2D1 was generated by PRISM.

[0188] As shown in FIG. 3, 2D1 exhibited better binding activity to VEGF-Aprotein compared with the reference antibody Bevacizumab analog, with EC50 of 0.029 μg / mL and 0.056 μg / mL, respectively.

[0189] EXAMPLE 3. Binding affinity of anti-VEGF-A antibody

[0190] The binding affinities of the anti-VEGF-A antibodies to hVEGF165 were also verified by Biolayer Interferometry (BLI) using ForteBio Octet system.

[0191] Purified anti-VEGF-A antibody was captured on the Protein A chip (Series S Sensor Chip Protein A) for the detection. Anti-VEGF-A antibody (10 μg / mL) was loaded at 10 μL / min to bind to hVEGF165 (200 nM) . The flow rate was 30 μL / min. The binding and dissociation time were set to 180 seconds and 400 seconds, respectively. The chip was regenerated after the last injection of each titration with a glycine solution (pH 1.7) at 30 μL / min for 30 seconds. Human IgG1 was used as an ISO control.

[0192] Kinetic association rates (kon) and dissociation rates (koff) were obtained simultaneously by fitting the data globally to a 1: 1 Langmuir binding model (Karlsson, R. Roos, H. Fagerstam, L. Petersson, B., 1994. Methods Enzymology 6.99-110) using Octet data analysis program (DataAnalysis11) . Affinities were deduced from the quotient of the kinetic rate constants (KD=koff / kon) .

[0193] As a person of ordinary skill in the art would understand, the same method with appropriate adjustments for parameters (e.g., antibody concentration) was performed for each tested antibody. The results are summarized in the table below. 2D1 could bind to human VEGF-A with high affinity.

[0194] Table 1 “ / ” means no binding

[0195] EXAMPLE 4. Blocking effect of anti-VEGF-A antibody

[0196] Blockade of VEGF-A binding to VEGFR2 by anti-VEGF-A antibody was tested using ELISA. Briefly, His-tagged human KDR / VEGFR2 protein (Kactus Biosystems, Cat#: VGF-HM4R2) was diluted to 2 μg / mL and coated on 96-well plates with 100 μL / well, followed by incubation at 37℃ for 2 h. The plates were washed and then blocked with 2%BSA at 37℃ for 2 h. His-tagged biotinylated human VEGF-A Protein (hVEGF165-His, ACROBiosystems, Cat#: VE5-H82Q0) was diluted to 0.05 μg / mL, and then mixed with serially diluted sample anti-VEGF-A antibody at a volume ratio of 1: 1.100 μL mixture were added to the plate, followed by incubation at 37℃ for 1 h. Then, 100 μL secondary antibody (1: 3000 diluted Streptavidin-HRP) was added to the plates and incubated at 37℃ for 1 h. After washing with PBST, TMB was added to 96-well plates with 100 μL / well, followed by incubation at 4℃in the dark for 15 minutes. Stop solution was added with 100 μL / well and the optical density (OD) of each well was read at 450 nm and 570nm. Standard OD=OD450 -OD570.

[0197] The standard OD values were used to generate a fitting curve with respect to the antibody concentrations. More specifically, logarithm of antibody concentrations was calculated and was used as the X-axis variable, while the corresponding OD value was used as the Y-axis variable.

[0198] As shown in FIG. 4, 2D1 exhibited a strong VEGF-A blocking effect compared with the reference antibody Bevacizumab analog, with IC50 of 0.033 μg / mL and 0.266 μg / mL respectively.

[0199] EXAMPLE 5. Developability analysis of anti-VEGF-A antibody

[0200] Developability of anti-VEGF-A antibody 2D1 was evaluated. Specifically, the following tests were performed: (1) observing the solution appearance and presence of visible non-soluble objects; (2) detecting the purity changes of antibodies by Size-Exclusion Ultra Performance Liquid Chromatography (SEC-UPLC) (indicated as the percentage of the main peak area to the sum of all peak areas (Purity, %) ) ; (3) detecting changes in the apparent hydrophobicity of the antibodies using the Hydrophobic Interaction Chromatography-High Performance Liquid Chromatography (HIC-HPLC) method (indicated as the retention time of the main peak (HIC, min) ; (4) detecting the specificity of the antibodies using the Cross-Interaction Chromatography (CIC) method (indicated as the retention time (CIC, min) ) ; (5) detecting the colloidal stabilities of the antibodies by the stand-up monolayer chromatography (SMAC) method (indicated as the retention time (SMAC, % / min) ) ; and (6) detecting the thermal stability of antibodies via the UNcle system (indicated as the melting temperature (Tm) , onset temperature (Tonset) and aggregation temperature (Tagg) ) .

[0201] In the SEC-UPLC experiments, the Agilent 1290 chromatograph system (connected with XBridgeTM Protein BEH SEC column ( Waters Corporation) ) was used. The antibody samples were diluted to 1 mg / mL with purified water. The following parameters were used: mobile phase: 25 mM phosphate buffer (PB) (pH 6.8) + 0.3 M NaCl; flow rate: 1.8 mL / min; column temperature: 25 ℃; detection wavelength: 280 nm; injection volume: 10 μL; sample tray temperature: 6 ℃; and running time: 7 minutes.

[0202] In the HIC-HPLC experiments, the Agilent 1260 chromatograph system (connected with ProPacTM HIC-10 column (4.6 × 100 mm, Thermo Scientific) ) was used, and samples were diluted using mobile phase A to 0.5 mg / mL. The following parameters were used: mobile phase A: 0.9 M ammonium sulfate, 0.1 M PB, 10%acetonitrile pH 6.5; mobile phase B: 0.1 M PB, 10%acetonitrile pH 6.5; flow rate: 0.8 mL / min; gradient: 0 min 100%A, 2 min 100%A, 32 min 100%B, 34 min 100%B, 35 min 100%A, and 45 min 100%A; column temperature: 30 ℃; detection wavelength: 280 nm; injection volume: 10 μg; sample tray temperature: about 6 ℃; and running time: 45 minutes.

[0203] In the CIC assay, a CIC column was prepared by coupling human polyclonal IgGs (Sigma, Cat #: I4506) onto a HiTrap NHS-activated resin (GE Healthcare, Cat #: 17-0716-01) followed by passivation with ethanolamine according to published procedures. The column was then connected to Agilent 1260 chromatograph system and run at 0.1 mL / min using 1× PBS as the mobile phase until a flat baseline was reached. 10 μg of antibodies at 1 mg / mL in PBS were then injected. Peak retention times on the column were monitored at 280 nm; running time: 50 minutes.

[0204] In the SMAC assay, Zenix column (4.6 mm × 30 cm, Sepax, Cat #: 213300-4630) was connected to the column compartment, and place the appropriate line in the mobile phase. Equilibrate column for 60 min at 0.350 mL / min flow rate with mobile phase buffer. Load antibodies into the injection sequence. Mobile Phase A: 150 mM Sodium Phosphate pH 7.0; flow rate: 0.35 mL / min; running time: 25 min; column temperature: 30℃; detection wavelength: 280 nm, 220 nm.

[0205] In the UNcle experiments, 8 μL protein sample was loaded into the Uni tube, and the system operated at a thermal temperature from 25℃ to 95℃ at a heating rate of 1℃ / min. The particle size and polydispersity were detected by dynamic light scattering (DLS) before heating. The protein stability was characterized by differential scanning full spectrum fluorescence (DSF) , static light scattering (SLS) and dynamic light scattering (DLS) .

[0206] Detailed results are summarized in the table below, which showed that 2D1 had good physical and chemical properties.

[0207] Table 2

[0208] EXAMPLE 6. HUVECs proliferation test

[0209] Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) were seeded into a 96-well plate at a density of 1.5×104 cells / well. After incubation at 37 ℃, 5%CO2 for 24 h, 20 nM VEGF-A protein (ACROBiosystems, Cat#: VE5-H4210) was added to the 96-well plate with 200 μL / well, and then anti-VEGF-A antibody with concentration of 1 μg / mL or 25 μg / mL was added to the plate. After incubation at 37 ℃, 5%CO2 for 72 h, cell proliferation was quantified using the WST-1 Cell Proliferation and Cytotoxicity Assay Kit (Beyotime, Cat #: C0036) according to the manufacturer's instructions. Bevacizumab analog was used as a reference antibody. Group with only HUVECs was used as a negative control. Group with only HUVECs and VEGF-A was used as a positive control.

[0210] As shown in FIG. 5, 2D1 exhibited strong inhibitory activity on VEGF-A-induced HUVECs proliferation in a dose-dependent manner.

[0211] EXAMPLE 7. Anti-Tumor Activity in U-87 MG xenograft model

[0212] The antibodies were tested for their effect on tumor growth in vivo in a U-87 MG xenograft model. Specifically, about 5×106 U-87 MG cells were injected subcutaneously in B-NDG mice (Biocytogen Pharmaceuticals (Beijing) Co., Ltd., Cat#: B-CM-002) . When the tumor volume reached about 80-120 mm3, the mice were randomly placed into different groups based on tumor volumes. The mice were then injected with PBS or antibodies by intravenosus (i.v. ) administration. Details of the administration scheme are shown in the table below.

[0213] Table 3

[0214] The lengths of the long axis and the short axis of the tumor were measured, and the tumor volume was calculated as 0.5 × (long axis) × (short axis) 2. The tumor growth inhibition (TGI) was calculated using the following formula: TGI (%) = [1- (Ti-T0)  /  (Vi-V0) ] × 100. Ti is the average tumor volume in the treatment group on day i. T0 is the average tumor volume in the treatment group on day zero. Vi is the average tumor volume in the control group on day i. V0 is the average tumor volume in the control group on day zero. T-test was performed for statistical analysis. P < 0.05 is a threshold to indicate significant difference.

[0215] The tumor volumes were measured twice a week. As shown in FIG. 6, 2D1 inhibited tumor growth in a dose-dependent manner, and it exhibited better anti-tumor activity than Bevacizumab analog at the same dosage.

[0216] EXAMPLE 8. Anti-Tumor Activity in colorectal cancer PDX model

[0217] The anti-tumor activity of antibodies was tested in vivo in a colorectal cancer PDX model. Specifically, colorectal tumor fragments (2 mm×2 mm×2 mm) were engrafted in the right flank of B-NDG mice. When the tumor volume reached about 200-300 mm3, the mice were randomly placed into different groups based on tumor volumes. The mice were then injected with human IgG1 (ISO, G1) , Bevacizumab analog (G2) , or 2D1-Q1E (G3) by i.v. administration. The frequency of administration was twice a week (3 administrations in total) .

[0218] The tumor volumes were measured twice a week. As shown in FIG. 7, 2D1-Q1E (G3) exhibited better anti-tumor activity than that of the positive control group Bevacizumab analog (G2) , with TGI%of 42.9%and 78.2%respectively on Day 18.

[0219] In another experiment, colorectal cancer PDX model mice were injected with ISO (G1) , 2D1 (G2) , or Bevacizumab analog (G3) by i.v. administration. The frequency of administration was once a week (3 administrations in total) . The tumor volumes were measured twice a week. As shown in FIG. 8, the anti-tumor activity of 2D1 (G2) at a dose of 3mg / kg was superior to that of Bevacizumab analog (G3) at a dose of 6mg / kg.

[0220] OTHER EMBODIMENTS

[0221] It is to be understood that while the invention has been described in conjunction with the detailed description thereof, the foregoing description is intended to illustrate and not limit the scope of the invention, which is defined by the scope of the appended claims. Other aspects, advantages, and modifications are within the scope of the following claims.

Claims

1.An antibody or antigen-binding fragment thereof that binds to vascular endothelial growth factor A (VEGF-A) , comprising:a heavy chain single variable domain (VHH) comprising complementarity determining regions (CDRs) 1, 2, and 3, wherein the VHH CDR1 region comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to a selected VHH CDR1 amino acid sequence, the VHH CDR2 region comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to a selected VHH CDR2 amino acid sequence, and the VHH CDR3 region comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to a selected VHH CDR3 amino acid sequence;wherein the selected VHH CDRs 1, 2, and 3 amino acid sequences are one of the following:(1) the selected VHH CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 1, 2, and 3, respectively; and(2) the selected VHH CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 4, 5, and 6, respectively.2.The antibody or antigen-binding fragment thereof of claim 1, wherein the VHH comprises CDRs 1, 2, 3 with the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 1, 2, and 3, respectively.3.The antibody or antigen-binding fragment thereof of claim 1, wherein the VHH comprises CDRs 1, 2, 3 with the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 4, 5, and 6, respectively.4.An antibody or antigen-binding fragment thereof that binds to VEGF-Acomprising a heavy chain single variable region (VHH) comprising an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 7 or 12.5.The antibody or antigen-binding fragment thereof of claim 4, wherein(1) the VHH comprises the sequence of SEQ ID NO: 7; or(2) the VHH comprises the sequence of SEQ ID NO: 12.6.The antibody or antigen-binding fragment thereof of any one of claims 1-5, wherein the antibody or antigen-binding fragment specifically binds to a human VEGF-A.7.The antibody or antigen-binding fragment thereof of any one of claims 1-6, wherein the antibody or antigen-binding fragment is a human or humanized antibody or antigen-binding fragment thereof.8.The antibody or antigen-binding fragment thereof of any one of claims 1-7, wherein the antibody or antigen-binding fragment is a multi-specific antibody (e.g., a bispecific antibody) .9.An antibody or antigen-binding fragment thereof comprising the VHH CDRs 1, 2, 3, of the antibody or antigen-binding fragment thereof of any one of claims 1-8.10.The antibody or antigen-binding fragment thereof of any one of claims 1-9, wherein the antibody or antigen-binding fragment comprises a human IgG Fc (e.g., a human IgG1 Fc) .11.The antibody or antigen-binding fragment thereof of any one of claims 1-10, wherein the antibody or antigen-binding fragment comprises two or more heavy chain single variable domains.12.A nucleic acid comprising a polynucleotide encoding the antibody or antigen-binding fragment thereof any one of claims 1-11.13.The nucleic acid of claim 12, wherein the nucleic acid is cDNA.14.A vector comprising one or more of the nucleic acids of claim 12 or 13.15.A cell comprising the vector of claim 14.16.The cell of claim 15, wherein the cell is a CHO cell.17.A cell comprising one or more of the nucleic acids of claim 12 or 13.18.A method of producing an antibody or an antigen-binding fragment thereof, the method comprising(a) culturing the cell of any one of claims 15-17 under conditions sufficient for the cell to produce the antibody or the antigen-binding fragment thereof; and(b) collecting the antibody or the antigen-binding fragment thereof produced by the cell.19.An antibody-drug conjugate comprising the antibody or antigen-binding fragment thereof of any one of claims 1-11 covalently bound to a therapeutic agent.20.The antibody drug conjugate of claim 19, wherein the therapeutic agent is a cytotoxic or cytostatic agent.21.A method of treating a subject having a cancer, retinal condition or immune disorder, the method comprising administering a therapeutically effective amount of a composition comprising the antibody or antigen-binding fragment thereof of any one of claims 1-11, or the antibody-drug conjugate of claim 19 or 20, to the subject.22.The method of claim 21, wherein the cancer is gastric cancer, hepatocellular carcinoma, colon carcinoma, rectal carcinoma, colorectal cancer, glioma, lung cancer (e.g., non-small cell lung cancer) , or breast cancer.23.The method of claim 21, wherein the retinal condition is age-related macular degeneration, retinal vein occlusion or diabetic macular edema.24.The method of claim 21, wherein the immune disorder is rheumatoid arthritis, psoriasis or Grave's Disease.25.The method of any one of claims 21-24, wherein the subject is a human subject.26.A pharmaceutical composition comprising the antibody or antigen-binding fragment thereof of any one of claims 1-11, and a pharmaceutically acceptable carrier.27.A pharmaceutical composition comprising the antibody drug conjugate of claim 19 or 20, and a pharmaceutically acceptable carrier.28.An antibody or antigen-binding fragment thereof that cross-competes with the antibody or antigen-binding fragment thereof of any one of claims 1-11.

Images