Bispecific antibody against il-6r and TL1a and use thereof

Abstract

Provided is a bispecific antibody, comprising: a first domain that specifically binds interleukin-6 receptor (IL-6R), and a second domain that specifically binds TNF- like ligand la (TL1 A). Also provided is a method of the bispecific antibodies for the treatment or prevention of diseases associated with IL-6R and / or TL1 A.

Description

BISPECIFIC ANTIBODY AGAINST IL-6R AND TL1A AND USE THEREOFFIELD OF THE INVENTION

[0001] The present disclosure relates to a bispecific antibody against IL-6R and TL1A and use thereof.BACKGROUND OF THE INVENTION

[0002] Interleukin-6 (IL-6) is a multifunctional cytokine discovered in the 1980s and is produced by various types of cells such as T-cells, B-cells, monocytes, fibroblasts, osteoblasts, keratin-forming cells, endothelial cells, mesangial cells and some tumor cells. IL-6 transmits different biological signals to various tissues and cells by interacting with different IL-6 receptors on the cell surface and then via downstream signaling pathways.

[0003] Interleukin-6 (IL-6) binds to two receptors, one is the specific receptor IL-6R (80 kDa type I transmembrane protein) and the other is gp130, which is a common receptor subunit for members of the IL-6 family of cytokines. The gp130 can be expressed in all cells, but the expression of interleukin-6 receptor (IL-6R) is more restricted and is found mainly in hepatocytes, neutrophils, monocytes and CD4+ T cells. IL-6 plays an important role in immune regulation, hematopoiesis, inflammation and tumor formation. IL-6 is involved in the treatment of a disease or condition and has been the target of drug discovery for the treatment of that disease or condition.

[0004] TL1A, also known as TNFSF15 and VEGI, is a member of the tumor necrosis factor superfamily. It was first identified in 2002 and is expressed in a variety of cells. TL1A regulates different immune cells to produce inflammatory cytokines and chemokines. TL1A activates the TRADD pathway by binding to the receptor DR3. TRADD can promote PI3K, MAPKs, NF-κB, and other pathways by regulating TRAF2 and RIP1, thereby exerting pro-inflammatory effects. It also participates in apoptosis and necrotic cell death through activating the FADD, RIP3, and Caspase-8 / 3 / 7 pathways.

[0005] TL1A is associated with a variety of autoimmune diseases, including rheumatoid arthritis (RA) , inflammatory bowel disease (IBD) , psoriasis (PSA) , primary biliary cirrhosis (PBC) , systemic lupus erythematosus (SLE) , and ankylosing spondylitis (AS) , and TL1A shows abnormal expression in all these diseases.

[0006] Diseases such as ulcerative colitis and Crohn's disease are very prevalent and the number of available therapies is limited, and there are some patients who do not respond to initial treatment or whose response disappears over time. Currently, the only therapy for patients who do not respond to first-line treatment is surgery, that is stricturoplasty (shaping of the bowel) or resection (removal of the bowel) . Surgical treatment of IBD is invasive, and some patients who undergo surgery experience postoperative risks such as anastomotic fistula, infection, and bleeding. The pathogenesis of IBD is thought to involve an uncontrolled immune response that may be triggered by certain environmental factors in genetically susceptible hosts. The heterogeneity of disease pathogenesis and clinical course, combined with the different responses to treatment and its associated side effects, suggests that a targeted therapeutic approach to treating these diseases is an ideal therapeutic strategy. Therefore, novel therapeutic approaches that specifically target the pathogenesis of IBD, drugs that inhibit TL1A activity, have become popular targets for the development of IBD therapies. There exists a huge clinical demand for IBD with broad market potential.

[0007] However, currently, no similar dual-target drugs have been approved for marketing at home or abroad to date.SUMMARY OF THE INVENTION

[0008] In order to address one of the technical problems existing in the prior art, the present disclosure provides a bispecific antibody, which can better maintain the activity of each individual monoclonal antibody, and can simultaneously and specifically bind to both interleukin-6 receptor (IL-6R) and TNF-like ligand 1a (TL1A) targets. When binding to two different cell surface antigens, it potentially increases binding specificity and reduces side effects caused by off-target effects. Compared to combination therapy with monoclonal antibodies, it can effectively reduce the cost of treatment.

[0009] One aspect of the present disclosure provides a bispecific antibody, comprising: a first domain that specifically binds interleukin-6 receptor (IL-6R) , and a second domain that specifically binds TNF-like ligand 1a (TL1A) .

[0010] In some embodiments, the first domain is an antibody or a functional fragment thereof that specifically binds IL-6R.

[0011] In some embodiments, the second domain is an antibody or a functional fragment thereof that specifically binds TL1A.

[0012] In some embodiments, the first domain comprises a Fab fragment, a Fab' fragment, a F (ab') 2 fragment, a Fv fragment, a scFv fragment, a nanobody, a heavy chain variable region (VH) fragment and / or a light chain variable region (VL) fragment of an antibody that specifically binds IL-6R.

[0013] In some embodiments, the second domain comprises a Fab fragment, a Fab' fragment, a F (ab') 2 fragment, a Fv fragment, a scFv fragment, a nanobody, a heavy chain variable region (VH) fragment and / or a light chain variable region (VL) fragment of an antibody that specifically binds TL1A.

[0014] In some embodiments, the first domain and the second domain are connected either directly or via a linker.

[0015] In some embodiments, the linker has an amino acid sequence as shown in a general formula (GnS) m, wherein n and m are integers from 1 to 10, respectively; more preferably, n is an integer from 1 to 4, and m is an integer from 1 to 3, or an amino acid sequence having an insertion, substitution or deletion of 1, 2 or 3 amino acids as compared to the amino acid sequence shown in the general formula (GnS) m. In some embodiments of the present disclosure, the linker comprises at least 6 amino acids.

[0016] In some embodiments, the bispecific antibody comprises a first domain and a second domain connected in any manner.

[0017] In some embodiments, the bispecific antibody comprises a first domain-second domain from the N-terminus to the C-terminus.

[0018] In some embodiments, the bispecific antibody comprises a second domain-first domain from the N-terminus to the C-terminus.

[0019] In some embodiments, the first domain comprises the following three heavy chain variable region complementary determining regions (HCDRs) :

[0020] HCDR1, having an amino acid sequence of HCDR1 contained in a heavy chain variable region as shown in SEQ ID NO: 5, or an amino acid sequence having a substitution, deletion, or addition of one or more amino acids compared to the amino acid sequence of HCDR1 contained in the heavy chain variable region;

[0021] HCDR2, having an amino acid sequence of HCDR2 contained in a heavy chain variable region as shown in SEQ ID NO: 5, or an amino acid sequence having a substitution, deletion, or addition of one or more amino acids compared to the amino acid sequence of HCDR2 contained in the heavy chain variable region;

[0022] HCDR3, having an amino acid sequence of HCDR3 contained in a heavy chain variable region as shown in SEQ ID NO: 5, or an amino acid sequence having a substitution, deletion, or addition of one or more amino acids compared to the amino acid sequence of HCDR3 contained in the heavy chain variable region.

[0023] In some embodiments, the first domain comprises the following three light chain variable region complementary determining regions (LCDRs) :

[0024] LCDR1, having an amino acid sequence of LCDR1 contained in a light chain variable region as shown in SEQ ID NO: 6, or an amino acid sequence having a substitution, deletion, or addition of one or more amino acids compared to the amino acid sequence of LCDR1 contained in the light chain variable region;

[0025] LCDR2, having an amino acid sequence of LCDR2 contained in a light chain variable region as shown in SEQ ID NO: 6, or an amino acid sequence having a substitution, deletion, or addition of one or more amino acids compared to the amino acid sequence of LCDR2 contained in the light chain variable region;

[0026] LCDR3, having an amino acid sequence of LCDR3 contained in a light chain variable region as shown in SEQ ID NO: 6, or an amino acid sequence having a substitution, deletion, or addition of one or more amino acids compared to the amino acid sequence of LCDR3 contained in the light chain variable region.

[0027] In some embodiments, the first domain comprises the HCDR1-HCDR3 and / or the LCDR1-LCDR3 which are defined by IMGT numbering system, Kabat numbering system, Chothia numbering system, Contact numbering system, or a combination thereof.

[0028] In some embodiments, the first domain comprises the following heavy chain variable regions and / or light chain variable regions, wherein HCDR1-HCDR3 and / or LCDR1-LCDR3 are defined according to the IMGT numbering system: a heavy chain variable region containing the following three HCDRs: an HCDR1 with a sequence of SEQ ID NO: 43, an HCDR2 with a sequence of SEQ ID NO: 44, an HCDR3 with a sequence of SEQ ID NO: 45; and / or, a light chain variable region containing the following three LCDRs: LCDR1 with a sequence of SEQ ID NO: 46, LCDR2 with a sequence of YTS, and LCDR3 with a sequence of SEQ ID NO: 47.

[0029] In some embodiments, the first domain comprises the following heavy chain variable regions and / or light chain variable regions, wherein HCDR1-HCDR3 and / or LCDR1-LCDR3 are defined according to Kabat numbering system: a heavy chain variable region comprising the following three HCDRs: an HCDR1 with a sequence of SEQ ID NO: 48, an HCDR2 with a sequence of SEQ ID NO: 49, and an HCDR3 with a sequence of SEQ ID NO: 50; and / or, a light chain variable region containing the following three LCDRs: LCDR1 with a sequence of SEQ ID NO: 51, LCDR2 with a sequence of SEQ ID NO: 52, and LCDR3 with a sequence of SEQ ID NO: 47.

[0030] In some embodiments, the first domain comprises the following heavy chain variable regions and / or light chain variable regions, wherein HCDR1-HCDR3 and / or LCDR1-LCDR3 are defined according to Chothia numbering system: a heavy chain variable region containing the following three HCDRs: an HCDR1 with a sequence of SEQ ID NO: 53, an HCDR2 with a sequence of SEQ ID NO: 54, and an HCDR3 with a sequence of SEQ ID NO: 50; and / or, a light chain variable region containing the following three LCDRs: LCDR1 with a sequence of SEQ ID NO: 51, LCDR2 with a sequence of SEQ ID NO: 52, and LCDR3 with a sequence of SEQ ID NO: 47.

[0031] In some embodiments, the first domain comprises the following heavy chain variable regions and / or light chain variable regions, wherein HCDR1-HCDR3 and / or LCDR1-LCDR3 are defined according to Contact numbering system: a heavy chain variable region comprising the following three HCDRs: an HCDR1 with a sequence of SEQ ID NO: 55, an HCDR2 with a sequence of SEQ ID NO: 56, and an HCDR3 with a sequence of SEQ ID NO: 57; and / or, a light chain variable region containing the following three LCDRs: LCDR1 with a sequence of SEQ ID NO: 58, LCDR2 with a sequence of SEQ ID NO: 59, and LCDR3 with a sequence of SEQ ID NO: 60.

[0032] In some embodiments, the first domain comprises: a heavy chain variable region having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 5, an amino acid sequence having a substitution, deletion, or addition of one or more amino acids compared thereto, or an amino acid sequence having at least 80%, at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 97%, at least 98%, or at least 99%sequence identity thereto; and a light chain variable region, having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 6, an amino acid sequence having a substitution, deletion, or addition of one or more amino acids compared thereto, or an amino acid sequence having at least 80%, at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 97%, at least 98%, or at least 99%sequence identity thereto.

[0033] In some embodiments, the second domain comprises the following three heavy chain variable region complementary determining regions (HCDRs) :

[0034] HCDR1, having an amino acid sequence of HCDR1 contained in a heavy chain variable region as shown in SEQ ID NO: 1 or 3, or an amino acid sequence having a substitution, deletion, or addition of one or more amino acids compared to the amino acid sequence of HCDR1 contained in the heavy chain variable region;

[0035] HCDR2, having an amino acid sequence of HCDR2 contained in a heavy chain variable region as shown in any one of SEQ ID NO: 1 or 3, or an amino acid sequence having a substitution, deletion, or addition of one or more amino acids compared to the amino acid sequence of HCDR2 contained in the heavy chain variable region;

[0036] HCDR3, having an amino acid sequence of HCDR3 contained in a heavy chain variable region as shown in any one of SEQ ID NO: 1 or 3, or an amino acid sequence having a substitution, deletion, or addition of one or more amino acids compared to the amino acid sequence of HCDR3 contained in the heavy chain variable region.

[0037] In some embodiments, the second domain comprises the following three light chain variable region complementary determining regions (LCDRs) :

[0038] LCDR1, having an amino acid sequence of LCDR1 contained in a light chain variable region as shown in SEQ ID NO: 2 or 4, or an amino acid sequence having a substitution, deletion, or addition of one or more amino acids compared to the amino acid sequence of LCDR1 contained in the light chain variable region;

[0039] LCDR2, having an amino acid sequence of LCDR2 contained in a light chain variable region as shown in SEQ ID NO: 2 or 4, or an amino acid sequence having a substitution, deletion, or addition of one or more amino acids compared to the amino acid sequence of LCDR2 contained in the light chain variable region;

[0040] LCDR3, having an amino acid sequence of LCDR3 contained in a light chain variable region as shown in SEQ ID NO: 2 or 4, or an amino acid sequence having a substitution, deletion, or addition of one or more amino acids compared to the amino acid sequence of LCDR3 contained in the light chain variable region.

[0041] In some embodiments, the second domain comprises HCDR1, HCDR2, and HCDR3 contained in the heavy chain variable region as shown in SEQ ID NO: 1, and LCDR1, LCDR2, and LCDR3 contained in the light chain variable region as shown in SEQ ID NO: 2.

[0042] In some embodiments, the second domain comprises HCDR1, HCDR2, and HCDR3 contained in the heavy chain variable region as shown in SEQ ID NO: 3, and LCDR1, LCDR2, and LCDR3 contained in the light chain variable region as shown in SEQ ID NO: 4.

[0043] In some embodiments, the second domain comprises the HCDR1-HCDR3 and / or the LCDR1-LCDR3 which are defined by IMGT numbering system, Kabat numbering system, Chothia numbering system, Contact numbering system, or a combination thereof.

[0044] In some embodiments, the second domain comprises the following heavy chain variable regions and / or light chain variable regions, wherein HCDR1-HCDR3 and / or LCDR1-LCDR3 are defined according to IMGT numbering system: (a) a heavy chain variable region containing the following three HCDRs: HCDR1 with a sequence of SEQ ID NO: 7, HCDR2 with a sequence of SEQ ID NO: 8, and HCDR3 with a sequence of SEQ ID NO: 9; and / or, a light chain variable region containing the following three LCDRs: LCDR1 with a sequence of SEQ ID NO: 10, LCDR2 with a sequence of YAT, and LCDR3 with a sequence of SEQ ID NO: 11; or (b) a heavy chain variable region containing the following three HCDRs: HCDR1 with a sequence of SEQ ID NO: 25, HCDR2 with a sequence of SEQ ID NO: 26, and HCDR3 with a sequence of SEQ ID NO: 27; and / or, a light chain variable region containing the following three LCDRs: LCDR1 with a sequence of SEQ ID NO: 28, LCDR2 with a sequence of DAS, and LCDR3 with a sequence of SEQ ID NO: 29.

[0045] In some embodiments, the second domain comprises the following heavy chain variable regions and / or light chain variable regions, wherein HCDR1-HCDR3 and / or LCDR1-LCDR3 are defined according to Kabat numbering system: (a) a heavy chain variable region comprising the following three HCDRs: an HCDR1 with a sequence of SEQ ID NO: 12, an HCDR2 with a sequence of SEQ ID NO: 13, and an HCDR3 with a sequence of SEQ ID NO: 14; and / or, a light chain variable region containing the following three LCDRs: LCDR1 with a sequence of SEQ ID NO: 15, LCDR2 with a sequence of SEQ ID NO: 16, and LCDR3 with a sequence of SEQ ID NO: 11; or (b) a heavy chain variable region containing the following three HCDRs: HCDR1 with a sequence of SEQ ID NO: 30, HCDR2 with a sequence of SEQ ID NO: 31, and HCDR3 with a sequence of SEQ ID NO: 32; and / or, a light chain variable region containing the following three LCDRs: LCDR1 with a sequence of SEQ ID NO: 33, LCDR2 with a sequence of SEQ ID NO: 34, and LCDR3 with a sequence of SEQ ID NO: 29.

[0046] In some embodiments, the second domain comprises the following heavy chain variable regions and / or light chain variable regions, wherein HCDR1-HCDR3 and / or LCDR1-LCDR3 are defined according to Chothia numbering system: (a) a heavy chain variable region containing the following three HCDRs: an HCDR1 with a sequence of SEQ ID NO: 17, an HCDR2 with a sequence of SEQ ID NO: 18, and an HCDR3 with a sequence of SEQ ID NO: 14; and / or, a light chain variable region containing the following three LCDRs: LCDR1 with a sequence of SEQ ID NO: 15, LCDR2 with a sequence of SEQ ID NO: 16, and LCDR3 with a sequence of SEQ ID NO: 11; or (b) a heavy chain variable region containing the following three HCDRs: HCDR1 with a sequence of SEQ ID NO: 35, HCDR2 with a sequence of SEQ ID NO: 36, and HCDR3 with a sequence of SEQ ID NO: 32; and / or, a light chain variable region containing the following three LCDRs: LCDR1 with a sequence of SEQ ID NO: 33, LCDR2 with a sequence of SEQ ID NO: 34, and LCDR3 with a sequence of SEQ ID NO: 29.

[0047] In some embodiments, the second domain comprises the following heavy chain variable regions and / or light chain variable regions, wherein HCDR1-HCDR3 and / or LCDR1-LCDR3 are defined according to Contact numbering system: (a) a heavy chain variable region comprising the following three HCDRs: an HCDR1 with a sequence of SEQ ID NO: 23, an HCDR2 with a sequence of SEQ ID NO: 32, and an HCDR3 with a sequence of SEQ ID NO: 25; and / or, a light chain variable region containing the following three LCDRs: LCDR1 with a sequence of SEQ ID NO: 26, LCDR2 with a sequence of SEQ ID NO: 27, and LCDR3 with a sequence of SEQ ID NO: 28; or (b) a heavy chain variable region containing the following three HCDRs: HCDR1 with a sequence of SEQ ID NO: 19, HCDR2 with a sequence of SEQ ID NO: 20, and HCDR3 with a sequence of SEQ ID NO: 21; and / or, a light chain variable region containing the following three LCDRs: LCDR1 with a sequence of SEQ ID NO: 22, LCDR2 with a sequence of SEQ ID NO: 23, and LCDR3 with a sequence of SEQ ID NO: 24.

[0048] In some embodiments, the second domain comprises: a heavy chain variable region having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 1 or 3, an amino acid sequence having a substitution, deletion, or addition of one or more amino acids compared thereto, or an amino acid sequence having at least 80%, at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 97%, at least 98%, or at least 99%sequence identity thereto; and a light chain variable region, having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 2 or 4, an amino acid sequence having a substitution, deletion, or addition of one or more amino acids compared thereto, or an amino acid sequence having at least 80%, at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 97%, at least 98%, or at least 99%sequence identity thereto.

[0049] In some embodiments, the second domain comprises a heavy chain variable region having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 1 and a light chain variable region having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 2.

[0050] In some embodiments, the second domain comprises a heavy chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 3 and a light chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 4.

[0051] In some embodiments, the bispecific antibody has an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO:61 and 62, an amino acid sequence having a substitution, deletion, or addition of one or more amino acids compared thereto, or an amino acid sequence having at least 80%, at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 97%, at least 98%, or at least 99%sequence identity thereto. In some embodiments, the bispecific antibody has an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 63 and 64, an amino acid sequence having a substitution, deletion, or addition of one or more amino acids compared thereto, or an amino acid sequence having at least 80%, at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 97%, at least 98%, or at least 99%sequence identity thereto. In some embodiments, the bispecific antibody has an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 65 and 66, an amino acid sequence having a substitution, deletion, or addition of one or more amino acids compared thereto, or an amino acid sequence having at least 80%, at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 97%, at least 98%, or at least 99%sequence identity thereto. In some embodiments, the bispecific antibody has an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 67 and 68, an amino acid sequence having a substitution, deletion, or addition of one or more amino acids compared thereto, or an amino acid sequence having at least 80%, at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 97%, at least 98%, or at least 99%sequence identity thereto. In some embodiments, the bispecific antibody has an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 69 and 70, an amino acid sequence having a substitution, deletion, or addition of one or more amino acids compared thereto, or an amino acid sequence having at least 80%, at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 97%, at least 98%, or at least 99%sequence identity thereto. In some embodiments, the bispecific antibody has an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 71 and 72, an amino acid sequence having a substitution, deletion, or addition of one or more amino acids compared thereto, or an amino acid sequence having at least 80%, at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 97%, at least 98%, or at least 99%sequence identity thereto.

[0052] Another aspect of the present disclosure provides an isolated nucleic acid molecule encoding a bispecific antibody of the present disclosure.

[0053] In some embodiments, the isolated nucleic acid molecule comprises a nucleotide sequence as shown in SEQ ID NO: 79 and 80, or a nucleotide sequence having at least 80%, at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 97%, at least 98%, or at least 99%sequence identity thereto. In some embodiments, the isolated nucleic acid molecule comprises a nucleotide sequence as shown in SEQ ID NO: 81 and 82, or a nucleotide sequence having at least 80%, at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 97%, at least 98%, or at least 99%sequence identity thereto. In some embodiments, the isolated nucleic acid molecule comprises a nucleotide sequence as shown in SEQ ID NO: 83 and 84, or a nucleotide sequence having at least 80%, at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 97%, at least 98%, or at least 99%sequence identity thereto. In some embodiments, the isolated nucleic acid molecule comprises a nucleotide sequence as shown in SEQ ID NO: 85 and 86, or a nucleotide sequence having at least 80%, at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 97%, at least 98%, or at least 99%sequence identity thereto. In some embodiments, the isolated nucleic acid molecule comprises a nucleotide sequence as shown in SEQ ID NO: 87 and 88, or a nucleotide sequence having at least 80%, at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 97%, at least 98%, or at least 99%sequence identity thereto. In some embodiments, the isolated nucleic acid molecule comprises a nucleotide sequence as shown in SEQ ID NO: 89 and 90, or a nucleotide sequence having at least 80%, at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 97%, at least 98%, or at least 99%sequence identity thereto.

[0054] In some embodiments, the bispecific antibody of the present disclosure forms a dimer. In some embodiments, the bispecific antibody of the present disclosure forms a homodimer. In some embodiments, the bispecific antibody of the present disclosure forms a heterodimer.

[0055] A further aspect of the present disclosure provides an expression vector comprising an isolated nucleic acid molecule of the present disclosure.

[0056] In some embodiments, the expression vector comprises an expression vector derived from an adenovirus, an adeno-associated virus, a lentivirus, or other acceptable expression vectors.

[0057] A further aspect of the present disclosure provides a host cell comprising an isolated nucleic acid molecule as described herein or an expression vector as described herein.

[0058] A further aspect of the present disclosure provides a chimeric antigen receptor comprising an extracellular antigen-binding fragment, a transmembrane domain, and an intracellular signaling domain, wherein the extracellular antigen-binding fragment comprises a bispecific antibody as described herein.

[0059] A further aspect of the present disclosure provides a conjugate comprising a bispecific antibody as described herein; and a conjugated moiety.

[0060] In some embodiments, the conjugated moiety is selected from the group consisting of a detectable label, a radioisotope, a fluorescent substance, a luminescent substance, a colored substance, an enzyme, polyethylene glycol (PEG) , a nuclide, a nucleic acid, a small-molecule toxin, a peptide with binding activity, a protein, a receptor, a ligand, and other active substances that inhibit growth of tumor cells, and promote apoptosis or necrosis of tumor cells.

[0061] A further aspect of the present disclosure provides a pharmaceutical composition comprising a bispecific antibody as described herein, and a pharmaceutically acceptable carrier.

[0062] In some embodiments, the pharmaceutical composition comprises an isolated nucleic acid molecule as described herein, and a pharmaceutically acceptable carrier.

[0063] In some embodiments, the pharmaceutical composition comprises an expression vector as described herein, and a pharmaceutically acceptable carrier.

[0064] In some embodiments, the pharmaceutical composition is a form of a tablet, a pulvis, a granule, a pill, an injection, a suspension, a powder, an emulsion, an aerosol, a gel, an eye drop, a sustained-release agent, or a sustained-release implant. In some embodiments, the pharmaceutical compositions may be formulated into an injectable formulation. In some embodiments, the formulation is suitable for intravitreal injections, subcutaneous, intracutaneous, intramuscular, intravenous, intrathecal, or intraspinal administration.

[0065] A further aspect of the present disclosure provides a pharmaceutical cartridge, the cartridge comprising a pharmaceutical composition as described herein, wherein the pharmaceutical composition is encapsulated in a container.

[0066] In some embodiments, the container is a glass ampoule, a glass vial, a plastic ampoule, a plastic vial, a plastic bag, or a prefilled syringe.

[0067] In some embodiments, the present disclosure relates to a pharmaceutical unit dosage form suitable for parenteral administration to a human, the pharmaceutical unit dosage form comprising a pharmaceutical composition as described herein in a suitable container. In some embodiments, the suitable container is a prefilled syringe. In some embodiments, the prefilled syringe comprises an injection needle.

[0068] A further aspect of the present disclosure provides a kit comprising a bispecific antibody as described herein and, optionally, an instruction for use.

[0069] A further aspect of the present disclosure provides use of a bispecific antibody as described herein, an isolated nucleic acid molecule as described herein, an expression vector as described herein, a chimeric antigen receptor as described herein, a conjugate as described herein, or a pharmaceutical composition as described herein in the preparation of a medicament for preventing or treating TL1A and / or IL-6R related diseases.

[0070] A further aspect of the present disclosure provides a method of treating or preventing TL1A and / or IL-6R related diseases, the method comprising administering to a subject a therapeutically effective amount of a bispecific antibody described herein, an isolated nucleic acid molecule described herein, an expression vector described herein, a chimeric antigen receptor described herein, a conjugate described herein, or a pharmaceutical composition described herein.

[0071] In some embodiments, the diseases comprise one or more of an inflammatory disease, an immune system disease, and a cancer-related disease.

[0072] In some embodiments, the diseases include one or more of inflammatory bowel disease, allergy / asthma, arthritis, rheumatoid arthritis (including, for example, moderate to severe active rheumatoid arthritis in adults) , psoriatic arthritis, systemic juvenile idiopathic arthritis (JIA) , osteoarthritis, psoriasis arthropica, ankylosing spondylitis (including, for example, active ankylosing spondylitis) , spondyloarthropathy, psoriasis, inflammatory bowel disease (IBD) , ulcerative colitis (UC, including, for example, moderate and severe ulcerative colitis) , Crohn's disease (CD) , Lyme arthritis, graft-versus-host disease (GVHD) , meningoencephalitis, immune-mediated inflammatory diseases of the central and peripheral nervous system, pancreatitis, graft-versus-host disease, arteritis, cardiovascular inflammation, neuromyelitis optica, Castleman's disease, systemic juvenile giant cell arteritis, giant cell arteritis, atherosclerosis, eosinophilic esophagitis, atopic dermatitis, primary sclerosing cholangitis, vasculitis, autoimmune thyroiditis, eczema, scleroderma, infection-associated endotoxic shock, aortitis graft rejection, cardiac disease, bone resorption, Paget's disease, osteoporosis, primary biliary cirrhosis, atherosclerosis, septicemia, periodontitis, hypochlorhydia, cytokine release syndrome (CRS) , systemic lupus erythematosus (SLE) , cutaneous lupus erythematosus, immune-related adverse events (irAE) , thyroid eye disease (TED) , chronic kidney disease (CKD) , Sjogren syndrome, multiple sclerosis, systemic sclerosis-associated interstitial lung disease, polymyalgia rheumatica, myocardial infarction, uveitis, encephalomyelitis, myasthenia gravis, familial Mediterranean fever, Schnitzler's syndrome, transplant rejection, graft-versus-host disease, hematopoietic stem cell transplantation, kidney transplantation, heart transplantation, bladder syndrome / interstitial cystitis, urinary tract dysfunction, systemic sclerosis-associated interstitial lung disease (SSc-ILD) , novel coronavirus pneumonia-associated cytokine storm (CRS) , severe or life-threatening cytokine storm induced by CAR-T cells (CRS) , acute myelogenous leukemia, Behcet syndrome, esophageal adenocarcinoma, hepatocellular carcinoma, pancreatic carcinoma, non-small cell lung cancer, lung cancer, renal cancer, intestinal cancer, cervical cancer, glioma, metastatic esophageal squamous cell carcinoma, esophageal carcinoma, oral squamous cell carcinoma, uroepithelial cell carcinoma, head and neck tumors, cancers of the nervous system, B-cell malignancies and aging, breast cancer, ovarian cancer, uroepithelial carcinoma, prostate cancer, rectal cancer, colon cancer, bladder cancer, solid tumors (renal cell carcinoma) , hematopoietic and lymphocytic tumors, malignant solid tumors, adamantinomatous craniopharyngiomas, melanoma, recurrent glioblastoma, leukemias and lymphomas, amyotrophic lateral sclerosis, ALS, schizophrenia, major depressive disorder, diabetes mellitus, osteodystrophia fibrosa, obesity, hemophagocytic lymphohistiocytic hyperplasia, idiopathic retroperitoneal fibrosis, alopecia areata, pulmonary fibrosis, cystic fibrosis, gastrointestinal disorders associated with cystic fibrosis, irritable bowel syndrome, pelvic inflammatory disorders, Alzheimer's disease, Castleman's disease, dermatomyositis, Peyronie's disease, celiac disease, gallbladder disorders, pilonidal disease, peritonitis, surgical adhesions, surgical trauma, stroke, eczematous dermatitis, psoriasis, and Sjogren syndrome.

[0073] The present disclosure provides a bispecific antibody that specifically binds both IL-6R and TL1A. This bispecific antibody simultaneously targets both IL-6R and TL1A and can block the IL6 / IL6R signaling pathway and TL1A / DR3 signaling pathway with a synergistic effect.DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

[0074] In order to make the objectives, technical solutions and advantages of the present disclosure clearer and more understandable, the present disclosure is described in further detail below in connection with examples. The specific examples described herein are for the sole purpose of explaining the present disclosure and are not intended to constitute any limitation of the present disclosure. In addition, in the following description, descriptions of publicly known structures and techniques are omitted to avoid unnecessary confusion about the concepts of the present disclosure.

[0075] Interleukin-6 (IL-6) is a multifunctional cytokine discovered in the 1980s and was previously known as hepatocyte stimulating factor, B-cell stimulating factor 2, cytotoxic T-cell differentiation factor, B-cell differentiation factor, hybridoma / plasmacytoma growth factor, monocyte granulocyte inducer type 2, and thrombopoietin. Interleukin-6 (IL-6) is produced by various types of cells such as T-cells, B-cells, monocytes, fibroblasts, osteoblasts, keratin-forming cells, endothelial cells, mesangial cells and some tumor cells. IL-6 contains four α-helical domains that have a motif of four cysteine residues necessary for tertiary structure. IL-6 transmits different biological signals to various tissues and cells by interacting with different IL-6 receptors on the cell surface and then via downstream signaling pathways.

[0076] Interleukin-6 (IL-6) binds to two receptors, one is the specific receptor IL-6R (80 kDa type I transmembrane protein) and the other is gp130, which is a common receptor subunit for members of the IL-6 family of cytokines. A gp130 can be expressed in all cells, but the expression of interleukin-6 receptor (IL-6R) is more restricted and is found mainly in hepatocytes, neutrophils, monocytes and CD4+ T cells. Dimerization of the interleukin IL-6 receptor gp130 initiates cellular events including activation of the JAK-STAT3 pathway and ras-mediated MAP kinase signaling.

[0077] TL1A, also known as TNFSF15 and VEGI, is a member of the tumor necrosis factor superfamily. It was first identified in 2002 and is expressed in a variety of cells. These cells such as monocytes (Mo) and macrophages, endothelial cells, dendritic cells, chondrocytes and synovial fibroblasts produce TL1A. TL1A regulates different immune cells to produce inflammatory cytokines and chemokines. TL1A activates the TRADD pathway by binding to the receptor DR3. TRADD can promote PI3K, MAPKs, NF-κB, and other pathways by regulating TRAF2 and RIP1, thereby exert pro-inflammatory effects. It also participates in apoptosis and necrotic cell death through activating the FADD, RIP3, and Caspase-8 / 3 / 7 pathways.

[0078] TL1A, as a member of the tumor necrosis factor superfamily, mediates inflammation and fibrosis and is a key mediator of intestinal diseases. During the development of inflammatory bowel disease, TL1A affects epithelial-mesenchymal transition (EMT) in IBD patients through the TGF-b / Smad3 pathway, leading to colonic fibrosis and inflammatory responses; TL1A / DR3 can maintain the homeostatic level of intestinal Treg cells and thus play an immunosuppressive role. A recent study concluded that DR3 / TL1A can also increase the expression of DR3 through Th1, Th2, and Th17, and that αDR3 activates the p38 signaling pathway of ILC3 and thus promotes GM-CSF secretion, and that the increased secretion of GM-CSF further recruits inflammatory myeloid cells to the intestinal tract, and intestinal infiltration of inflammatory myeloid cells ultimately results in increased IL-23 expression and increased intestinal inflammation. As a central regulator of mucosal immune response, allergy and autoimmunity, TL1A / DR3 plays a key role in autoimmune and autoinflammatory diseases, and the inhibition of TL1A is also an effective strategy in the treatment of autoimmune and inflammatory diseases.

[0079] TL1A is associated with a variety of autoimmune diseases, including rheumatoid arthritis (RA) , inflammatory bowel disease (IBD) , psoriasis (PSA) , primary biliary cirrhosis (PBC) , systemic lupus erythematosus (SLE) , and ankylosing spondylitis (AS) , and TL1A shows abnormal expression in all these diseases. Currently, indications for drug studies are mainly for inflammatory bowel diseases including Crohn's disease and ulcerative colitis.

[0080] The present disclosure is based on the monoclonal antibody screened for targeting IL-6R and TL1A, and further accomplishes the expression of the bispecific antibody by co-transfection of host cells with dual plasmids. The activity analyzes and affinity assays are performed on the target proteins obtained by transient transfection after conventional purification to obtain the bifunctional fusion proteins, and screen for bispecific antibodies capable of simultaneously targeting IL-6R and TL1A. The bispecific antibodies of the present disclosure are directed against both the TL1A target and IL-6R-p19 target. CN2024104525229 and CN2024104373245 are incorporated herein by reference in their entirety.

[0081] Compared with a monoclonal antibody, a bispecific antibody adds a specific antigen-binding site, which makes it more specific and more accurate in targeting tumor cells, and reduces the adverse effects of off-target toxicity, and can perform a special function to play a biological function that is difficult to achieve with monoclonal antibodies. Compared with monoclonal antibody combination therapies, it can also effectively reduce the cost of treatment and break the current upper limit of the therapeutic efficacy in the treatment of autoimmune diseases such as IBD and rheumatoid arthritis.

[0082] The sequences of the heavy chain variable region, the light chain variable region and their CDRs involved in the bispecific antibodies of the present disclosure are shown in Tables 1 and 2.

[0083] Table 1

[0084] Table 2

[0085] Definition

[0086] Unless otherwise defined, all technical or scientific terms used in the present disclosure have the same meaning as commonly used in the field to which the present disclosure belongs. For the purpose of interpreting this description, the following definitions will be applied and, where appropriate, terms used in the singular form will also include the plural form and vice versa.

[0087] The expressions "a" and "an" as used herein include the plural unless the context clearly indicates otherwise. For example, reference to "a cell" includes a plurality of such cells and equivalents thereof as may be known to those skilled in the art, and the like.

[0088] The term "about" as used herein indicates a range of ±20%of the subsequent value. In some embodiments, the term "about" indicates a range of ±10%of the subsequent value. In some embodiments, the term "about" indicates a range of ±5%of the subsequent value.

[0089] The term "affinity" or "binding affinity" as used herein refers to the overall strength of non-covalent interactions between a single binding site of a molecule (e.g., a bispecific antibody or a bispecific binding molecule) and its binding ligand (e.g., an antigen) . Binding affinity can usually be expressed in terms of the dissociation constant (KD) , which is the ratio of the rate of dissociation (kd) to the rate of binding (ka) , i.e. KD= kd  / ka. The affinity can be measured by conventional methods known in the art, such as surface plasmon resonance (SPR) .

[0090] The term "specific recognition" or "specific binding" as used herein refers to antibodies exhibiting selectivity in recognizing and binding to ligands or receptors, and can be distinguished from unwanted or non-specific binding. In one embodiment, as measured by SPR, for example, the degree of binding of the bispecific antibody of the present disclosure to unrelated proteins is less than about 10%of the degree of binding to IL-6R and TL1A. In certain embodiments, the bispecific antibodies provided by the present disclosure bind to both IL-6R and TL1A with a KD of 10-7M or less, e.g., 10-10M to 10-11M.

[0091] The term "substitution" as used herein for amino acids refers to the replacement of at least one amino acid residue in an amino acid sequence by a different "replacing" amino acid residue. The term "insertion" as used herein for amino acids refers to the incorporation of at least one additional amino acid into an amino acid sequence. While inserts typically consist of inserting 1 or 2 amino acid residues, it is also possible to prepare larger "peptide inserts" , e.g., inserting about 3 to 5 or even up to about 10, 15 or 20 amino acid residues. As disclosed above, the inserted residues may be naturally occurring or non-naturally occurring. The term "deletion" as used herein for amino acids refers to the removal of at least one amino acid residue from an amino acid sequence.

[0092] The bispecific antibodies or the fragments thereof of the present disclosure may comprise conservative amino acid substitutions at one or more amino acid residues, e.g., at essential or non-essential amino acid residues. "Conservative amino acid substitution" is the replacement of an amino acid residue by another amino acid residue with a similar side chain. Families of amino acid residues with similar side chains have been defined in the art and include basic side chains (e.g., lysine, arginine, histidine) , acidic side chains (e.g., aspartic acid, glutamic acid) , uncharged polar side chains (e.g., glycine, asparagine, glutamine, serine, threonine, tyrosine, cysteine) , non-polar side chains (e.g., alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, methionine, tryptophan) , β-branched side chains (e.g., threonine, valine, isoleucine) , and aromatic side chains (e.g., tyrosine, phenylalanine, tryptophan, histidine) . Thus, an essential or non-essential amino acid residue in a bispecific antibody or linker herein is preferably replaced with another amino acid residue from the same side chain family. In certain embodiments, the amino acid chain segments may be replaced with chain segments that are structurally similar and have different order and / or composition of side chain family members. Alternatively, in certain embodiments, mutations may be introduced randomly along all or a portion of the coding sequence, such as by saturation mutagenesis, and the resulting mutants may be incorporated into the bispecific antibodies of the present disclosure and screened with respect to the ability of these polypeptides to bind to a desired target.

[0093] The term "antibody" as used herein includes an intact antibody and any antigen-binding fragment (i.e., "antigen-binding portion" , "antigen-binding polypeptide" , or "immunoconjugator" ) or their single chains. "Antibody" is a glycoprotein comprising a glycoprotein of at least two heavy (H) chains and at least two light (L) chains interconnected by disulfide bonds, or an antigen-binding portion thereof. Each heavy chain includes a heavy chain variable region (VH) and a heavy chain constant region (CH) . Each light chain includes a light chain variable region (VL) and a light chain constant region (CL) . The VH and VL regions each contain three regions that are highly variable in terms of amino acid composition and arrangement order, called hypervariable region or complementarity determining region (CDR) , that is CDRl, CDR2 and CDR3. The regions in the VH and VL regions other than the CDR region is relatively conserved in terms of amino acid composition and arrangement order and are called framework region (FR) . VH or VL each has four framework regions, denoted by FR1, FR2, FR3, and FR4, respectively.

[0094] There are five major classes of immunoglobulins, IgA, IgD, IgE, IgG, and IgM, and these major classes can be further categorized into subclasses (isotypes) such as IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, and IgA2. The heavy chain constant domains corresponding to the different classes of immunoglobulins are called α, δ, ε, γ, and μ, respectively. The CL lengths of the different types (κ or λ) of immunoglobulins are essentially the same, but the CH lengths of the different classes of immunoglobulins are different, e.g., IgG, IgA, and IgD include CH1, CH2, and CH3, whereas IgM and IgE include CHl, CH2, CH3, and CH4. The hinge region, located between CH1 and CH2, is rich in proline and easily stretches and bends, thus changing the distance between antigen-binding sites and facilitating antibody binding to antigenic epitopes located in different positions. The hinge region is susceptible to hydrolysis by papain, pepsin, etc., producing different hydrolyzed fragments. The position of Ig that is hydrolyzed by papain is at the proximal N terminus of the hinge region, where the two heavy chains are connected by disulfide bonds, which cleaves Ig into two identical Fab segments and one Fc segment. The Fab segment is a fragment antigen binding (Fab) and consists of an intact light chain and the VH and CH1 domains of a heavy chain.

[0095] The term "homodimer" as used herein refers to a formation from a bispecific antibody of the present disclosure, including two identical bispecific antibodies of the present disclosure. The term "heterodimer" as used herein refers to a formation from a bispecific antibody of the present disclosure, including two different bispecific antibodies of the present disclosure.

[0096] The term "individual" or "subject” as used herein refers to a mammal, including, but not limited to, human and non-human mammals, e.g., a mammal including, but not limited to, a domesticated animal (e.g., a cow, horse, dog, sheep, goat, cat, and dog) , primate (e.g., human and monkey) , and rodent (e.g., rabbit, mouse, and rat) .

[0097] The range of values as used herein should be understood as having been enumerated for all numbers within that range. For example, the range of 1 to 20 should be understood to include any number, combination of numbers, or subrange from the following groups: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, or 20.

[0098] The term “linker” as used herein refers to a (peptide) linker of natural and / or synthetic origin, consisting of linear amino acids. The respective domains in the bispecific antibodies of the present disclosure may be connected by a linker, wherein each linker is fused and / or otherwise connected (e.g., via a peptide bond) to at least two polypeptides or domains. In some embodiments, the amino acid sequences of all linkers present in the bispecific antibodies of the present disclosure are identical. In other embodiments, the amino acid sequences of at least two linkers present in the bispecific antibodies of the present disclosure are different. The linker should be of a length suitable for linking two or more monomeric domains in such a way that the linker is able to ensure that the different domains to which it is linked are correctly folded and appropriately presented so as to exert its biological activity function. In various embodiments, the linker has a flexible conformation. Suitable flexible linkers include, for example, having glycine, glutamine and / or serine residues. In some embodiments, the amino acid residues in the linker may be arranged in small repeating units of up to 5 amino acids.

[0099] “Percentage (%) sequence identity” relative to a reference amino acid sequence refers to the percentage of amino acid residues in the candidate sequence that are identical to amino acid residues in the reference amino acid sequence after aligning of the sequences and (as needed) introduction of gaps to obtain the maximum percentage of sequence identity, without regard to any conservative substitutions as part of the sequence identity. To determine the percentage of amino acid sequence identity, alignments can be performed in various ways within the scope of the art, such as using BLAST, ALIGN, or Megalign (DNASTAR) software. Those skilled in the art may determine appropriate parameters for aligning sequences, including any algorithms required to achieve optimal alignment over the full length of the sequences being compared.

[0100] The term “pharmaceutically acceptable carrier” as used herein refers to a component in a pharmaceutical formulation, other than the active ingredient, that is non-toxic to a subject. Pharmaceutically acceptable carriers include, but are not limited to, buffers, excipients, stabilizers, or preservatives.

[0101] The term “treatment” as used herein refers to the alleviation and / or amelioration of the disorder and / or diseases or symptoms associated with it, as well as the prevention of worsening of the disorder’s symptoms. Desired therapeutic effects include, but are not limited to, prevention of disease occurrence or recurrence, remission of symptoms, reduction of any direct or indirect pathological outcome of the disease, prevention of metastasis, slowing of the rate of progression of the disease, amelioration or alleviation of symptoms, and alleviation or amelioration of prognosis. It should be understood, however, that the treatment of a disease or symptom does not require the complete elimination of the diseases, or the symptoms associated with it.

[0102] The term "effective amount" as used herein refers to the amount that is effective in the necessary dosage and time period to achieve the desired therapeutic or prophylactic effect.

[0103] Examples are provided below to aid in understanding the present disclosure. It should be understood, however, that these Examples are intended to illustrate the present disclosure only, and do not constitute any limitation. The actual scope of protection of the present disclosure is set forth in the claims. It should be understood that any modifications and changes can be made without departing from the spirit of the present disclosure.

[0104] Example 1 Construction of expression plasmid

[0105] The bispecific antibodies of this example are against the IL-6R target and the TL1A target. Among them, the anti-TL1A monoclonal antibody was the VDJ013 intact molecule or VDJ013-PLT344 intact molecule, and the anti-IL-6R monoclonal antibody was the VDJ020-14 intact molecule, and the anti-IL-6R×TL1A bispecific antibody was formed by connecting the VDJ013 or the VDJ013-PLT344 intact molecule or their scFv with the VDJ020-14 intact molecule or its scFv by a linker. The heavy chain gene and light chain gene of the bispecific antibody were cloned into pCDNA3.4 vector, respectively, to construct the heavy chain recombinant plasmid and light chain recombinant plasmid of the bispecific antibody, respectively, and the expression of the bispecific antibody was achieved by double-plasmid co-transfection of the host cells, as shown in Table 3.

[0106] Table 3

[0107] Example 2 Transient expression of bispecific antibodies

[0108] Expi-CHO-Scells with a density of 2×106 cells / ml were placed in an erlenmeyer flask, and cultured at 100 rpm, 37℃ and 5%CO2 for 20-25 h, and when the cell density reached about 5×106 cells / ml, and the cells were in the logarithmic growth phase with a viability of more than 95%, they were used for transfection experiments. The recombinant plasmid obtained in Example 1 was added to Trans Buffer A (Medium Bank) and gently mixed, and polyetherimide (PEI) was added to Trans Buffer A and gently mixed. The diluted PEI solution was added to the corresponding diluted plasmid, for mixing gently and incubating at room temperature for 5 min. The mixed solution was charged into an erlenmeyer flask containing Expi-CHO-Scells and cultured in a shaker at 100 rpm, 37℃, and 5%CO2.24 h after transfection, the transfected cells were cultured in a shaker at 100 rpm, 32℃, and 5%CO2.10-14 d after transfection, the cell cultures were collected by centrifugation at 3000 rpm for 15 min.

[0109] Example 3 Purification and identification of bispecific antibodies

[0110] Six bispecific antibodies and control monoclonal antibodies were subjected to purification and purity identification. The cell culture supernatant obtained in Example 1 was first subjected to affinity chromatography using a HiTrap MabSelect Sure prepacked column. The column was rinsed with pure water and equilibrated with PB buffer, then the supernatant was loaded onto the chromatography column for binding. After loading, the column was rinsed with PB buffer to the baseline, and the protein was eluted with 0.1 M citrate eluent. After neutralizing with 1 M Tris-HCl, the eluted protein was concentrated appropriately and loaded onto the Superdex200 well equilibrated with PBS for further purification. The collected bispecific antibodies were concentrated to a certain concentration and then identified by SDS-PAGE electrophoresis. The expression level and SEC-HPLC identification results are shown in Table 4.

[0111] The results in Table 4 indicate that the bispecific antibodies VDJ013-9, VDJ013-10, VDJ013-11, VDJ013-12, VDJ013-23, and VDJ013-24 all had higher expression level and purity.

[0112] Table 4. Expression level and SEC-HPLC purity identification of antibody

[0113] Example 4 Biological activity assay of bispecific antibodies for TL1A target

[0114] The engineering was performed using pNFκB-TA-luc-CP (Beyotime) and pGL4.48 (Promega) as templates, and the plasmid containing NF-KB Luc2p Hygromycin gene was constructed by replacing the SBE gene of pGL4.48 with the NF-KB gene of pNFκB-TA-luc-CP.

[0115] The Human TL1A gene (containing amino acids Leu72-Leu251, Uniprot: O95150-1) was cloned into pCDNA3.4 vector, to construct human TL1A plasmid with a his tag, and a human TL1A stimulating factor (hTL1A) was obtained via transient expression of the plasmid in HEK293 cells and purification by a nickel column.

[0116] The plasmid containing the NF-κB Luc2p Hygromycin gene was transferred into TF-1 cells to construct a TF-1-NF-κB luciferase reporter gene assay cell strain. TF-1-NF-κB-luciferase reporter gene cells were plated at 60,000 cells per well and then cultured overnight under starved condition. On the following day, 1.0 μg / mL of human TL1A stimulating factor working solution was formulated and the antibody samples were diluted with it. Antibodies with different concentration gradients were added to the positive wells containing plated cells and incubated at 37 ℃ for 4 hours. Finally, 100 μL of One-Lite reagent (Vazyme) was added to each well and incubated at room temperature for 5 minutes before reading the chemiluminescence values with a TECAN multifunctional microplate reader. And the data were plotted using Prism 5 (GraphPad) software to calculate the IC50 value, and the results are shown in Table 5.

[0117] The results in Table 5 indicate that the bispecific antibodies VDJ013-9, VDJ013-10, VDJ013-11, VDJ013-12, VDJ013-23, and VDJ013-24 have comparable biological activity for TL1A targets compared to the monoclonal antibodies VDJ013 and VDJ013-PLT344.

[0118] Table 5. Biological activity assay of bispecific antibodies for TL1A target

[0119] Example 5 Biological activity assay of bispecific antibodies for IL-6R target

[0120] The HEK293-IL6 luciferase reporter gene cell line was constructed by transfecting the pGL4.47 [luc2P SIE Hygro] plasmid from Promega into HEK293 cells (ATCC) . The HEK293-IL6-res reporter gene cells were digested with trypsin, gently mixed by pipetting, and centrifuged, and the supernatant was discarded. The cells were resuspended and counted. The cell density was adjusted to 5×105cells / mL and added to the corresponding wells at 80μL / well. hIL6 (R&D, 206-IL -010 / CF) was diluted to 50ng / mL and added to the sample wells and positive control wells at 10μL / well, while basal medium was added to the negative control wells at 10μL / well. The antibodies were diluted to different concentration gradients with the medium and were added to the corresponding wells in a 96-well plate at 10μl / well, with duplicates for each concentration. The basal medium was added to accordingly to positive and negative control groups, at 10μl / well respectively. The cell plates were incubated in a 37℃, 5%CO2 cell incubator for 22h. On the following day, One Lite assay reagent was thawed, mixed and warmed to room temperature. It was then added to the above 96-well plate at 100 μl / well. The plates were mixed on a shaker for 3 min, and luminescence values were read using a multifunctional microplate reader. And the data were plotted using Prism 5 (GraphPad) software to calculate the IC50 value and relative biological activities, and the results are shown in Table 6.

[0121] The results in Table 6 indicate that the biological activity of the bispecific antibodies VDJ013-9, VDJ013-10, VDJ013-11, VDJ013-12, VDJ013-23, VDJ013-24 and VDJ013-20 for IL6R target is comparable to that of the monoclonal antibodies.

[0122] Table 6. Biological activity assay of bispecific antibodies for IL-6R target

[0123] Example 6 Relative binding activity assay of bispecific antibodies for TL1A target

[0124] ELISA method was used to detect the binding ability of bispecific antibodies to hTL1A. The hTL1A (same as Example 4) was diluted to 3 μg / ml, and at 100 μL / well, coated onto the wells at 4℃overnight. On the following day, the plates were washed and blocked with 5%skimmed milk for 2 h, Then the plates were washed, added with the antibody samples with different concentration gradients and incubated at 37℃ for 1 h. The plates were washed, 100 μL of HRP-labeled goat anti-human IgG secondary antibody (Solarbio, K0031G-HRP) was added to each plate, and the plates were incubated at 37℃ for 30 min. TMB substrate solution was then added for color development at 37℃ for 5 minutes, and finally 50 μL of H2SO4 was added to stop the reaction. The OD450 values were subsequently read using a TECAN multifunctional microplate reader, the data were plotted using Prism 5 (GraphPad) software, and the results are shown in Table 7.

[0125] The results in Table 7 indicate that the bispecific antibodies VDJ013-9, VDJ013-10, VDJ013-11, VDJ013-12, VDJ013-23, and VDJ013-24 all have higher binding activity to the TL1A target.

[0126] Table 7. Relative binding activity assay of bispecific antibodies for TL1A target

[0127] Example 7 Relative binding activity assay of bispecific antibodies for IL-6R target

[0128] Human IL-6R gene (NP_000556.1) was cloned into pCDNA3.4 vector to construct a human IL-6R plasmid with his tag. A human IL6R (hIL6R) was obtained by transiently expressing the human IL-6R plasmid in HEK293, and purifying by nickel column.

[0129] ELISA was used to detect the binding ability of bispecific antibodies to hIL6R. The hIL6R was diluted to 1 μg / mL, and at 100 μL / well, coated onto the wells at 4℃ overnight. On the following day, the plates were washed and blocked with 5%skimmed milk for 2h. Then the plate was washed, and added with the antibody samples with different concentration gradients and incubated at 37℃ for 1h. The plates were washed, 100 μL of HRP-labeled goat anti-human IgG secondary antibody (Solarbio, K0031G-HRP) was added to each plate, and the plates were incubated at 37℃ for 30 min. TMB substrate solution was then added for color development at 37℃ for 10 minutes, and finally 50 μL of H2SO4 was added to stop the reaction. The OD450 values were subsequently read using a TECAN multifunctional microplate reader, the data were plotted using Prism 5 (GraphPad) software to calculate the EC50 value and the relative binding activities, and the results are shown in Table 8.

[0130] The results in table 8 indicate that the bispecific antibodies VDJ013-9, VDJ013-10, VDJ013-11, VDJ013-12, VDJ013-23, and VDJ013-24 all have high binding activity to the IL-6R target.

[0131] Table 8. Relative binding activity assay of bispecific antibodies for IL-6R target

[0132] Example 8 Affinity assay of bispecific antibodies for TL1A target

[0133] The affinity of six bispecific antibodies respectively for hTL1A proteins was assayed by Bio-Layer Interferometry (BLI) . Antibodies were all diluted to 5 μg / mL, and hTL1A (same as Example 4) was serially diluted from 50 nM to 3.125 nM by doubling dilution. The antibodies were loaded onto an hFc probe (Gator) at a speed of 400 rpm, and then diluted different gradients of hTL1A were bound to the antibody-attached hFc probe. The probes with antigen-antibody complexes bound were placed into analyte-free Q buffer (10 nM PBS (pH 7.4) + 0.02%Tween + 0.2%BSA) to dissociate the bound antigen-antibody complexes. The hFc probe was immersed in Regeneration buffer (10 nM glycine, pH 1.7) to remove any residual bound analyte, and then the probe was regenerated and stored. The affinity data were obtained by integrating the fitted lines for each concentration using the analysis software provided with the Gator system, and the results are shown in Table 9.

[0134] The results in table 9 indicate that the bispecific antibodies VDJ013-9, VDJ013-10, VDJ013-11, VDJ013-12, VDJ013-23, and VDJ013-24 all have high affinity for hTL1A.

[0135] Table 9 Affinity assay of antibodies for hTL1A

[0136] Example 9 Affinity assay of bispecific antibodies for IL-6R target

[0137] The affinity of six bispecific antibodies respectively for hIL-6R (same as Example 7) was assayed by Bio-Layer Interferometry (BLI) . Antibodies were all diluted to 15 μg / mL, and hIL-6R proteins were serially diluted from 50 nM to 1.56 nM by doubling dilution. The antibodies were loaded onto an hFc probe at a speed of 400 rpm, and then diluted different gradients of hIL-6R were bound to the antibody-attached hFc probe (Gator) . The probes with antigen-antibody complexes bound were placed into analyte-free Q buffer (10 nM PBS (pH 7.4) + 0.02%Tween + 0.2%BSA) to dissociate the bound antigen-antibody complex. The probe was immersed in Regeneration buffer (10 nM glycine, pH 1.7) to remove any residual bound analyte, and then the hFc probe was regenerated and stored. The affinity data were obtained by integrating the fitted lines for each concentration using the analysis software provided with the Gator system, and the results are shown in Table 10.

[0138] The results in table 10 indicate that the bispecific antibodies VDJ013-9, VDJ013-10, VDJ013-11, VDJ013-12, VDJ013-23, and VDJ013-24 all have high affinity for hIL-6R.

[0139] Table 10 Affinity assay of antibodies for IL-6R

[0140] The sequences involved in the present examples are as follows:

[0141] The technical solutions of the present disclosure are not limited to the limitations of the above specific examples, and all technical deformations made according to the technical solutions of the present disclosure shall fall within the scope of protection of the present disclosure.

Claims

1.A bispecific antibody, comprising: a first domain that specifically binds interleukin-6 receptor (IL-6R) , and a second domain that specifically binds TNF-like ligand 1a (TL1A) .2.The bispecific antibody according to claim 1, characterized in that, the first domain is an antibody or a functional fragment thereof that specifically binds IL-6R; and / orthe second domain is an antibody or a functional fragment thereof that specifically binds TL1A.3.The bispecific antibody according to claim 1 or 2, characterized in that, the first domain comprises a Fab fragment, a Fab' fragment, a F (ab') 2 fragment, a Fv fragment, a scFv fragment, a nanobody, a heavy chain variable region (VH) fragment and / or a light chain variable region (VL) fragment of an antibody that specifically binds IL-6R; and / orthe second domain comprises a Fab fragment, a Fab' fragment, a F (ab') 2 fragment, a Fv fragment, a scFv fragment, a nanobody, a heavy chain variable region (VH) fragment and / or a light chain variable region (VL) fragment of an antibody that specifically binds TL1A.4.The bispecific antibody according to any one of claims 1 to 3, characterized in that, the first domain and the second domain are connected either directly or via a linker.preferably, the linker has an amino acid sequence as shown in a general formula (GnS) m, wherein n and m are integers from 1 to 10, respectively; more preferably, n is an integer from 1 to 4, and m is an integer from 1 to 3; or an amino acid sequence having an insertion, substitution or deletion of 1, 2 or 3 amino acids as compared to the amino acid sequence shown in the general formula (GnS) m.5.The bispecific antibody according to any one of claims 1 to 4, characterized in that, the first domain comprises: the following three heavy chain variable region complementary determining regions (HCDRs) :HCDR1, having an amino acid sequence of HCDR1 contained in a heavy chain variable region as shown in SEQ ID NO: 5, or an amino acid sequence having a substitution, deletion, or addition of one or more amino acids compared to the amino acid sequence of HCDR1 contained in the heavy chain variable region;HCDR2, having an amino acid sequence of HCDR2 contained in a heavy chain variable region as shown in SEQ ID NO: 5, or an amino acid sequence having a substitution, deletion, or addition of one or more amino acids compared to the amino acid sequence of HCDR2 contained in the heavy chain variable region;HCDR3, having an amino acid sequence of HCDR3 contained in a heavy chain variable region as shown in SEQ ID NO: 5, or an amino acid sequence having a substitution, deletion, or addition of one or more amino acids compared to the amino acid sequence of HCDR3 contained in the heavy chain variable region; and / orthe following three light chain variable region complementary determining regions (LCDRs) :LCDR1, having an amino acid sequence of LCDR1 contained in a light chain variable region as shown in SEQ ID NO: 6, or an amino acid sequence having a substitution, deletion, or addition of one or more amino acids compared to the amino acid sequence of LCDR1 contained in the light chain variable region;LCDR2, having an amino acid sequence of LCDR2 contained in a light chain variable region as shown in SEQ ID NO: 6, or an amino acid sequence having a substitution, deletion, or addition of one or more amino acids compared to the amino acid sequence of LCDR2 contained in the light chain variable region;LCDR3, having an amino acid sequence of LCDR3 contained in a light chain variable region as shown in SEQ ID NO: 6, or an amino acid sequence having a substitution, deletion, or addition of one or more amino acids compared to the amino acid sequence of LCDR3 contained in the light chain variable region;preferably, the HCDR1-HCDR3 and / or the LCDR1-LCDR3 are defined by IMGT numbering system, Kabat numbering system, Chothia numbering system, Contact numbering system or a combination thereof.6.The bispecific antibody according to any one of claims 1 to 5, characterized in that, the first domain comprises:(1) the following heavy chain variable regions and / or light chain variable regions, wherein HCDR1-HCDR 3 and / or LCDR1-LCDR 3 are defined by IMGT numbering system:a heavy chain variable region containing the following three HCDRs: HCDR1 with a sequence of SEQ ID NO: 43, HCDR2 with a sequence of SEQ ID NO: 44, and HCDR3 with a sequence of SEQ ID NO: 45; and / or, a light chain variable region containing the following three LCDRs: LCDR1 with a sequence of SEQ ID NO: 46, LCDR2 with a sequence of YTS, and LCDR3 with a sequence of SEQ ID NO: 47;or(2) the following heavy chain variable regions and / or light chain variable regions, wherein HCDR1-HCDR3 and / or LCDR1-LCDR3 are defined by Kabat numbering system:a heavy chain variable region containing the following three HCDRs: HCDR1 with a sequence of SEQ ID NO: 48, HCDR2 with a sequence of SEQ ID NO: 49, and HCDR3 with a sequence of SEQ ID NO: 50; and / or, a light chain variable region containing the following three LCDRs: LCDR1 with a sequence of SEQ ID NO: 51, LCDR2 with a sequence of SEQ ID NO: 52, and LCDR3 with a sequence of SEQ ID NO: 47;or(3) the following heavy chain variable regions and / or light chain variable regions, wherein HCDR1-HCDR3 and / or LCDR1-LCDR3 are defined by Chothia numbering system:a heavy chain variable region containing the following three HCDRs: HCDR1 with a sequence of SEQ ID NO: 53, HCDR2 with a sequence of SEQ ID NO: 54, and HCDR3 with a sequence of SEQ ID NO: 50; and / or, a light chain variable region containing the following three LCDRs: LCDR1 with a sequence of SEQ ID NO: 51, LCDR2 with a sequence of SEQ ID NO: 52, and LCDR3 with a sequence of SEQ ID NO: 47;or(4) the following heavy chain variable regions and / or light chain variable regions, wherein HCDR1-HCDR3 and / or LCDR1-LCDR3 are defined by Contact numbering system:a heavy chain variable region containing the following three HCDRs: HCDR1 with a sequence of SEQ ID NO: 55, HCDR2 with a sequence of SEQ ID NO: 56, and HCDR3 with a sequence of SEQ ID NO: 57; and / or, a light chain variable region containing the following three LCDRs: LCDR1 with a sequence of SEQ ID NO: 58, LCDR2 with a sequence of SEQ ID NO: 59, and LCDR3 with a sequence of SEQ ID NO: 60.7.The bispecific antibody according to any one of claims 1 to 6, characterized in that, the first domain comprises:a heavy chain variable region, having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 5, an amino acid sequence having a substitution, deletion, or addition of one or more amino acids compared thereto, or an amino acid sequence having at least 80%sequence identity thereto; anda light chain variable region, having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 6, an amino acid sequence having a substitution, deletion, or addition of one or more amino acids compared thereto, or an amino acid sequence having at least 80%sequence identity thereto.8.The bispecific antibody according to any one of claims 1 to 7, characterized in that, the second domain comprises:(1) the following three heavy chain variable region complementary determining regions (HCDRs) :HCDR1, having an amino acid sequence of HCDR1 contained in a heavy chain variable region as shown in SEQ ID NO: 1 or 3, or an amino acid sequence having a substitution, deletion, or addition of one or more amino acids compared to the amino acid sequence of HCDR1 contained in the heavy chain variable region;HCDR2, having an amino acid sequence of HCDR2 contained in a heavy chain variable region as shown in any one of SEQ ID NO: 1 or 3, or an amino acid sequence having a substitution, deletion, or addition of one or more amino acids compared to the amino acid sequence of HCDR2 contained in the heavy chain variable region;HCDR3, having an amino acid sequence of HCDR3 contained in a heavy chain variable region as shown in any one of SEQ ID NO: 1 or 3, or an amino acid sequence having a substitution, deletion, or addition of one or more amino acids compared to the amino acid sequence of HCDR3 contained in the heavy chain variable region; and / or(2) the following three light chain variable region complementary determining regions (LCDRs) :LCDR1, having an amino acid sequence of LCDR1 contained in a light chain variable region as shown in SEQ ID NO: 2 or 4, or an amino acid sequence having a substitution, deletion, or addition of one or more amino acids compared to the amino acid sequence of LCDR1 contained in the light chain variable region;LCDR2, having an amino acid sequence of LCDR2 contained in a light chain variable region as shown in SEQ ID NO: 2 or 4, or an amino acid sequence having a substitution, deletion, or addition of one or more amino acids compared to the amino acid sequence of LCDR2 contained in the light chain variable region;LCDR3, having an amino acid sequence of LCDR3 contained in a light chain variable region as shown in SEQ ID NO: 2 or 4, or an amino acid sequence having a substitution, deletion, or addition of one or more amino acids compared to the amino acid sequence of LCDR3 contained in the light chain variable region;preferably, the second domain comprises:HCDR1, HCDR2, and HCDR3 contained in the heavy chain variable region as shown in SEQ ID NO: 1, and LCDR1, LCDR2, and LCDR3 contained in the light chain variable region as shown in SEQ ID NO: 2; or HCDR1, HCDR2 and HCDR3 contained in the heavy chain variable region as shown in SEQ ID NO: 3, and LCDR1, LCDR2 and LCDR3 contained in the light chain variable region as shown in SEQ ID NO: 4;preferably, the HCDR1-HCDR3 and / or the LCDR1-LCDR3 are defined by IMGT numbering system, Kabat numbering system, Chothia numbering system, Contact numbering system or a combination thereof.9.The bispecific antibody according to any one of claims 1 to 8, characterized in that, the second domain comprises:(1) the following heavy chain variable regions and / or light chain variable regions, wherein HCDR1-HCDR 3 and / or LCDR1-LCDR 3 are defined by IMGT numbering system:(a) a heavy chain variable region containing the following three HCDRs: HCDR1 with a sequence of SEQ ID NO: 7, HCDR2 with a sequence of SEQ ID NO: 8, and HCDR3 with a sequence of SEQ ID NO: 9; and / or, a light chain variable region containing the following three LCDRs: LCDR1 with a sequence of SEQ ID NO: 10, LCDR2 with a sequence of YAT, and LCDR3 with a sequence of SEQ ID NO: 11; or(b) a heavy chain variable region containing the following three HCDRs: HCDR1 with a sequence of SEQ ID NO: 25, HCDR2 with a sequence of SEQ ID NO: 26, and HCDR3 with a sequence of SEQ ID NO: 27; and / or, a light chain variable region containing the following three LCDRs: LCDR1 with a sequence of SEQ ID NO: 28, LCDR2 with a sequence of DAS, and LCDR3 with a sequence of SEQ ID NO: 29;or(2) the following heavy chain variable regions and / or light chain variable regions, wherein HCDR1-HCDR3 and / or LCDR1-LCDR3 are defined by Kabat numbering system:(a) a heavy chain variable region containing the following three HCDRs: HCDR1 with a sequence of SEQ ID NO: 12, HCDR2 with a sequence of SEQ ID NO: 13, and HCDR3 with a sequence of SEQ ID NO: 14; and / or, a light chain variable region containing the following three LCDRs: LCDR1 with a sequence of SEQ ID NO: 15, LCDR2 with a sequence of SEQ ID NO: 16, and LCDR3 with a sequence of SEQ ID NO: 11; or(b) a heavy chain variable region containing the following three HCDRs: HCDR1 with a sequence of SEQ ID NO: 30, HCDR2 with a sequence of SEQ ID NO: 31, and HCDR3 with a sequence of SEQ ID NO: 32; and / or, a light chain variable region containing the following three LCDRs: LCDR1 with a sequence of SEQ ID NO: 33, LCDR2 with a sequence of SEQ ID NO: 34, and LCDR3 with a sequence of SEQ ID NO: 29;or(3) the following heavy chain variable regions and / or light chain variable regions, wherein HCDR1-HCDR3 and / or LCDR1-LCDR3 are defined by Chothia numbering system:(a) a heavy chain variable region containing the following three HCDRs: HCDR1 with a sequence of SEQ ID NO: 17, HCDR2 with a sequence of SEQ ID NO: 18, and HCDR3 with a sequence of SEQ ID NO: 14; and / or, a light chain variable region containing the following three LCDRs: LCDR1 with a sequence of SEQ ID NO: 15, LCDR2 with a sequence of SEQ ID NO: 16, and LCDR3 with a sequence of SEQ ID NO: 11; or(b) a heavy chain variable region containing the following three HCDRs: HCDR1 with a sequence of SEQ ID NO: 35, HCDR2 with a sequence of SEQ ID NO: 36, and HCDR3 with a sequence of SEQ ID NO: 32; and / or, a light chain variable region containing the following three LCDRs: LCDR1 with a sequence of SEQ ID NO: 33, LCDR2 with a sequence of SEQ ID NO: 34, and LCDR3 with a sequence of SEQ ID NO: 29;or(4) the following heavy chain variable regions and / or light chain variable regions, wherein HCDR1-HCDR3 and / or LCDR1-LCDR3 are defined by Contact numbering system:(a) a heavy chain variable region containing the following three HCDRs: HCDR1 with a sequence of SEQ ID NO: 23, HCDR2 with a sequence of SEQ ID NO: 32, and HCDR3 with a sequence of SEQ ID NO: 25; and / or, a light chain variable region containing the following three LCDRs: LCDR1 with a sequence of SEQ ID NO: 26, LCDR2 with a sequence of SEQ ID NO: 27, and LCDR3 with a sequence of SEQ ID NO: 28; or(b) a heavy chain variable region containing the following three HCDRs: HCDR1 with a sequence of SEQ ID NO: 19, HCDR2 with a sequence of SEQ ID NO: 20, and HCDR3 with a sequence of SEQ ID NO: 21; and / or, a light chain variable region containing the following three LCDRs: LCDR1 with a sequence of SEQ ID NO: 22, LCDR2 with a sequence of SEQ ID NO: 23, and LCDR3 with a sequence of SEQ ID NO: 24.10.The bispecific antibody according to any one of claims 1 to 9, characterized in that, the second domain comprises:a heavy chain variable region, having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 1 or 3, an amino acid sequence having a substitution, deletion, or addition of one or more amino acids compared thereto, or an amino acid sequence having at least 80%sequence identity thereto; anda light chain variable region, having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 2 or 4, an amino acid sequence having a substitution, deletion, or addition of one or more amino acids compared thereto, or an amino acid sequence having at least 80%sequence identity thereto;preferably, the second domain comprises a heavy chain variable region having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 1 and a light chain variable region having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 2;preferably, the second domain comprises a heavy chain variable region having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 3 and a light chain variable region having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 4.11.An isolated nucleic acid molecule, encoding a bispecific antibody according to any one of claims 1 to 10.12.An expression vector, comprising an isolated nucleic acid molecule according to claim 11.13.A host cell, comprising an isolated nucleic acid molecule according to claim 11 or an expression vector according to claim 12.14.A chimeric antigen receptor, comprising an extracellular antigen-binding fragment, a transmembrane domain, and an intracellular signaling domain, wherein the extracellular antigen-binding fragment comprises a bispecific antibody according to any one of claims 1-10.15.A conjugate, comprising a bispecific antibody according to any one of claims 1 to 10; and a conjugated moiety;preferably, the conjugated moiety is selected from the group consisting of a detectable label, a radioisotope, a fluorescent substance, a luminescent substance, a colored substance, an enzyme, a polyethylene glycol (PEG) , a nuclide, a nucleic acid, a small-molecule toxin, a peptide with binding activity, a protein, a receptor, a ligand, and other active substances that inhibit growth of tumor cells, and promote apoptosis or necrosis of tumor cells.16.A pharmaceutical composition comprising a bispecific antibody according to any one of claims 1 to 10, an isolated nucleic acid molecule according to claim 11, or an expression vector according to claim 12, and a pharmaceutically acceptable carrier;preferably, the pharmaceutical composition is selected from the group consisting of a form of a tablet, a pulvis, a granule, a pill, an injection, a suspension, a powder, an emulsion, an aerosol, a gel, an eye drop, a sustained-release agent, or a sustained-release implant.17.A pharmaceutical cartridge comprising a pharmaceutical composition according to claim 16, wherein the pharmaceutical composition is encapsulated in a container,preferably, the container is selected from the group consisting of a glass ampoule, a glass vial, a plastic ampoule, a plastic vial, a plastic bag, or a prefilled syringe.18.A kit comprising the bispecific antibody according to any one of claims 1 to 10, and optionally, an instruction for use.19.Use of a bispecific antibody according to any one of claims 1 to 10, an isolated nucleic acid molecule according to claim 11, an expression vector according to claim 12, a chimeric antigen receptor according to claim 14, a conjugate according to claim 15, or a pharmaceutical composition according to claim 16, in the preparation of a medicament for preventing or treating TL1A and / or IL-6R related diseases.20.A method of treating or preventing TL1A and / or IL-6R related diseases, comprising administering to a subject a therapeutically effective amount of a bispecific antibody according to any one of claims 1 to 10, an isolated nucleic acid molecule according to claim 11, an expression vector according to claim 12, a chimeric antigen receptor according to claim 14, a conjugate according to claim 15, or a pharmaceutical composition according to claim 16.21.The method according to claim 20, characterized in that, the disease comprises one or more of an inflammatory disease, an immune system disease, and a cancer-related disease,preferably, the diseases include one or more of inflammatory bowel disease, allergy / asthma, arthritis, rheumatoid arthritis, psoriatic arthritis, systemic juvenile idiopathic arthritis (JIA) , osteoarthritis, psoriasis arthropica, ankylosing spondylitis, spondyloarthropathy, psoriasis, inflammatory bowel disease (IBD) , ulcerative colitis (UC) , Crohn's disease (CD) , Lyme arthritis, graft-versus-host disease (GVHD) , meningoencephalitis, immune-mediated inflammatory diseases of the central and peripheral nervous system, pancreatitis, graft-versus-host disease, arteritis, cardiovascular inflammation, neuromyelitis optica, Castleman's disease, systemic juvenile giant cell arteritis, giant cell arteritis, atherosclerosis, eosinophilic esophagitis, atopic dermatitis, primary sclerosing cholangitis, vasculitis, autoimmune thyroiditis, eczema, scleroderma, infection-associated endotoxic shock, aortitis graft rejection, cardiac disease, bone resorption, Paget's disease, osteoporosis, primary biliary cirrhosis, atherosclerosis, septicemia, periodontitis, hypochlorhydia, cytokine release syndrome (CRS) , systemic lupus erythematosus (SLE) , cutaneous lupus erythematosus, immune-related adverse events (irAE) , thyroid eye disease (TED) , chronic kidney disease (CKD) , Sjogren syndrome, multiple sclerosis, systemic sclerosis-associated interstitial lung disease, polymyalgia rheumatica, myocardial infarction, uveitis, encephalomyelitis, myasthenia gravis, familial Mediterranean fever, Schnitzler's syndrome, transplant rejection, graft-versus-host disease, hematopoietic stem cell transplantation, kidney transplantation, heart transplantation, bladder syndrome / interstitial cystitis, urinary tract dysfunction, systemic sclerosis-associated interstitial lung disease (SSc-ILD) , novel coronavirus pneumonia-associated cytokine storm (CRS) , severe or life-threatening cytokine storm induced by CAR-T cells (CRS) , acute myelogenous leukemia, Behcet syndrome, esophageal adenocarcinoma, hepatocellular carcinoma, pancreatic carcinoma, non-small cell lung cancer, lung cancer, renal cancer, intestinal cancer, cervical cancer, glioma, metastatic esophageal squamous cell carcinoma, esophageal carcinoma, oral squamous cell carcinoma, uroepithelial cell carcinoma, head and neck tumors, cancers of the nervous system, B-cell malignancies and aging, breast cancer, ovarian cancer, uroepithelial carcinoma, prostate cancer, rectal cancer, colon cancer, bladder cancer, solid tumors (renal cell carcinoma) , hematopoietic and lymphocytic tumors, malignant solid tumors, adamantinomatous craniopharyngiomas, melanoma, recurrent glioblastoma, leukemias and lymphomas, amyotrophic lateral sclerosis, ALS, schizophrenia, major depressive disorder, diabetes mellitus, osteodystrophia fibrosa, obesity, hemophagocytic lymphohistiocytic hyperplasia, idiopathic retroperitoneal fibrosis, alopecia areata, pulmonary fibrosis, cystic fibrosis, gastrointestinal disorders associated with cystic fibrosis, irritable bowel syndrome, pelvic inflammatory disorders, Alzheimer's disease, Castleman's disease, dermatomyositis, Peyronie's disease, celiac disease, gallbladder disorders, pilonidal disease, peritonitis, surgical adhesions, surgical trauma, stroke, eczematous dermatitis, psoriasis, and Sjogren syndrome.

Images